JP2005031664A - レーザ走査型顕微鏡の操作方法 - Google Patents

Abstract

【課題】レーザ走査顕微鏡による生体試料の走査を迅速で準リアルタイム的に行なう。
【解決手段】少なくとも２つの検出画像または検出画像領域が互いに比較され、色および／または強度の時間的および／または位置的な変化が、照明および／または検出および／またはスキャナ制御のための、および／または調節可能な別な顕微鏡部品のための制御信号を生成する、レーザ走査型顕微鏡の操作方法および試料の捕捉方法、ならびに試料および／または試料領域の位置的および／または時間的変化の捕捉のための捕捉手段と、捕捉された変化に依存して照明および／または検出の制御および／またはスキャナ制御のための、および／または別な光学的および／または電子的な顕微鏡部品の制御のための制御手段とを有するレーザ走査型顕微鏡。
【選択図】図１

Description

本発明は、レーザ走査型顕微鏡による特に生体試料の走査における、迅速で準リアルタイム的に行われる変更に関する。

好ましい相互作用をする主要システム部品が図１に示されている。
レーザ走査型顕微鏡の光学部品の描画には、典型例としてＤＥ １９７０２７５３ Ａ１が参考になる。
図１には典型例として、各種の光学的および電子的部品Ｋ１およびＫ２が示されている。Ｋ１は、たとえば検出モジュールまたはスキャナ制御装置とすることができる。Ｋ２は、波長依存下での照明光の迅速な切り替え、もしくはそれの強度変更のための少なくとも１基の照明レーザおよび１基のＡＯＴＦを有する照明モジュールである。
各種の試料領域について、各種の波長および／または強度の迅速な切り替えのできるレーザ走査型顕微鏡がＤＥ １９８２９９８１に記述されている。

以下では、次の表現はそれぞれ下記の概念を意味している ：
試料： 全体単位としてのプレパラート
試料領域： たとえば１画像内で捕捉できる試料部分
画像： プレパラートの部分的な、または全体としての結像
画像領域： より大きな画像の中の部分領域
対象物： 画像領域内において境界で区切られた構造部分、たとえば検査すべき生物細胞
ＲＯＩ： ユーザ定義による関心域、画像領域参照
走査範囲： 技術的に定義付けされた画像領域；この場合、結像されない走査範囲周辺は受動的にも能動的にも走査されない。
走査ライン： 任意長の線形ライン；階段積み長方形を構成するライン相互配列によって走査範囲が形成される。

図の部品Ｋ１，Ｋ２および図示されていない別の部品がデジタル・インターフェースＩ１，Ｉ２を通じてコンピュータＲに接続されているが、コンピュータとしてはＣＰＵプロセッサを含んでいるのが有利である。
コンピュータＲは、レーザ走査型顕微鏡のユーザ向け表示手段および入力手段を含むアプリケーションＰＣに接続されている。
フェニーリ（Ｆｅｎｉｌｉ）、デ・ボーニ（Ｄｅ Ｂｏｎｉ）、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｐｒｏｔｏｃ １１／２００３，１０１−１１０ページ トラハテンベルク（Ｔｒａｃｈｔｅｎｂｅｒｇ）他、Ｎａｔｕｒｅ ４２０／２００２，７５１−７５２ページ ツィンマー（Ｚｉｍｍｅｒ）他、ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ．Ｉｍａｇｉｎｇ １０／２００２，１２１２−１２２１ページ チャン（Ｃｈｅｎ）他、Ｌｅａｒｎ．Ｍｅｍ．７／２０００，４３３−４４１ページ ウー（Ｗｏｏ）他、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５４３／２００２，４３９−４５３ページ

本発明に基づくスキャンシステムは、試料上または試料中で起こる現象に反応する。その場合、順次撮影された画像または画像領域が互いに比較され、スペクトル変化または強度変化が捕捉されて、それらの結果が機器パラメータの制御に利用される。
これは、迅速に進行する現象をより的確に、より正確に捕捉できるようにするためにスキャン速度を高める場合に行われる。この場合分解能は小さくなることがある。

そのほか、試料の輝度変化に対しては、たとえばレーザ光線による試料の褪色に対しては、感度を高めることで対応することができる。

また別の場合、周期的に進行する過程を捕捉することができ、画像撮影はそれにより時間同期させることができる。これらの過程は画像中で、または外部でも起こり得る（たとえば脈拍等）。

さらに別の場合、試料たとえば液体中に存在する細胞の同形移動が捕捉でき、試料中の画像撮影領域全体を追跡することができる。

画像撮影領域はある決まった試料形状にも適合させることができ、試料形状の変化と共に変更させることができる（ＲＯＩ、関心域）。
走査はスキャナ制御によりＲＯＩ内部のみで行うのが有利である。

試料中の反応開始を知らせる輝度パルスまたは閃光などの変化を、あらかじめ定めた撮影条件およびスキャンパラメータによる撮影または撮影シリーズを発動させるためのスタート信号として利用することができる。

試料領域内の変化が、分解能が低くなるかもしれない大きな全景画像から、アクティブな試料領域のみを捕捉する高い分解能の小画像カットへの切り替えへの端緒となることがある。

試料内で進行中のプロセス速度は、スピーディに進行する現象を十分な時間的分解能で捕捉できるように、スキャン速度の適合化に利用することができ、一方空間分解能は、その場合相応に下げることができよう。画像データ撮影の間は、撮影を制御するリアルタイムシステムにより、然るべき方法で試料の動力学特性に対応させる。

生成された画像データは、それより画像データ撮影用制御信号を得るために解析される。これらの制御信号は外部信号（トリガ、デジタル化したパラメータ）との組み合わせによって得ることもできよう。

影響要因としては少なくとも以下のパラメータがある ：
スキャン領域の大きさ、位置、回転、ズーム
データ撮影の速度
スキャンモード（スポット、ライン、フレーム、スタック）
スキャンされた画像の数
２データ撮影間の時間
データ・フィルタリングの様式
照明の強度
検出された信号の増幅

これらのリアクションすべてについての技術的前提条件は、図に基づき記述したようなシステムであって、スキャナの制御変更に必要な信号を既に進行走査過程中に算出するための適切なソフトおよびハードウェア部品から成るシステムである。たとえばラインから構成されたスキャンフィールドの場合：
スキャナ制御のための信号計算は、スキャン対象全体について前もって行うのでなく、小単位（走査ライン）ずつ行う。
測定中に実際のスキャナの状態（位置、速度、加速度）および望ましいスキャナの移動から、新しい走査ラインを算出する。
これによって測定中柔軟かつ迅速に新しい要求に対応できる。

スキャナによる対象物トラッキング
関心のある対象物は１枚の画像中で定義される。この対象物の位置が画像データ撮影中に比較的長い時空間にわたって変化する場合、画像データ撮影の位置は追跡調整される。これは３空間座標のすべてについて行うことができる。
走査される信号の強度追跡調整
目的は、検出された信号の強度を画像データ撮影中、比較的長い時空間にわたり、前もって定義付けされた領域内に一定に保持することである。強度が変化すれば（たとえば色素の褪色によって）、適切な方法でそれに対応させる。
照明強度の追跡調整
ＰＭＴ電圧の引き上げまたは増幅
データ撮影速度の低減
検出信号の強度に対する参照強度は、関心の対象である試料構造の褪色を避けるため、本来の測定が行われる領域以外の試料位置で測定することができる。
画像情報による画像撮影の発動
画像データは常に定義付けされた領域内で撮影され、画像情報が解析される。前もって定められたパラメータ（たとえば平均グレー値）が変われば、試料全体の画像データ撮影が惹起される。
スキャナによるオートフォーカス
試料上で参照位置が定義付けされ、それがフォーカスポジションの決定、もしくは追跡調整に利用される。この参照位置は、フォーカスポジションを追跡調整する際に試料の関心領域の褪色を避けるため、スキャン領域外に置くことができる。
フォーカスポジションの追跡調整には、ｚ平面内での測定可能な参照（たとえばカバーガラス反射）に対するｚ方向の相対的なずれが利用される。

１．本発明の有利な応用性の１つは、生体試料の方向づけられた状態変化に対する反応性である。この場合、スキャン領域が追跡される。またはズームもしくは関心域（ＲＯＩ）がアクティブ化される。
フェニーリ（Ｆｅｎｉｌｉ）、デ・ボーニ（Ｄｅ Ｂｏｎｉ）、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｐｒｏｔｏｃ １１／２００３，１０１−１１０ページは、培養中の生体合胞体の顕微鏡結像について記述しているが、ここでは個々の細胞が状態変化を起こす場合にも継続的に高分解能で表示されなければならない。
トラハテンベルク（Ｔｒａｃｈｔｅｎｂｅｒｇ）他、Ｎａｔｕｒｅ ４２０／２００２，７５１−７５２ページは、レーザ走査型顕微鏡法による数週間の長時間実験における脳構造の反復結像について記述しているが、この場合では結像構造の保持もしくは再現には、試料の状態変化が補償されなければならない。
ツィンマー（Ｚｉｍｍｅｒ）他、ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ．Ｉｍａｇｉｎｇ １０／２００２，１２１２−１２２１ページは、培養中の遊走生体細胞の時間シリーズ撮影による追処理、およびそれによる自動検知および追跡について記述している。画像撮影中にこうした修正を直接実施するのは有利に働こう。

２．別の有利な応用例は、生体試料内の規則的な状態逸脱との、または興味深い動力学的過程との同期である。この場合、画像品質の改善のために、画像検査は、たとえば生体動物の脈拍と同期させる。
チャン（Ｃｈｅｎ）他、Ｌｅａｒｎ．Ｍｅｍ．７／２０００，４３３−４４１ページは、レーザ走査型顕微鏡法による時間ごと、日ごとの長時間実験における脳構造の結像について記述しており、その場合、結像構造を保持するために、脈拍または呼吸による規則的な試料移動が補償されなければならない。

３．また別な有利な応用例は、長時間イメージングにおける生体試料の動力学的変化、たとえばＣａ２＋濃度の上昇に対する対応である。この場合、試料の時間的な蛍光動力学特性に依存してスキャン速度を適合させる。
ウー（Ｗｏｏ）他、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５４３／２００２，４３９−４５３ページは、ラピッド共焦点顕微鏡法によるラット細胞内の迅速なＣａ２＋反応の表示について記述している。この場合、速度に基づき非常に大きなデータレコードが作り出される。試料内反応の動力学状況に応じてデータ記録速度を制御することが、長期実験における経済的なデータ処理を可能にしよう。
ツィンマー（Ｚｉｍｍｅｒ）他、ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ．Ｉｍａｇｉｎｇ １０／２００２，１２１２−１２２１ページは、培養中の遊走生体細胞の時間シリーズ撮影による解析について記述している。画像撮影中の細胞移動に応じた撮影率の適合性が優位点となろう。

４．さらに別の有利な、リアルタイム制御スキャナの応用例は、画像品質の潜行性変化、たとえば色素の褪色、レーザ導線の揺れ、ｐＨ変化等に対する反応である。この場合、全体の輝度配分または試料外部の参照個所との関係で検出感度を適合させる。
チャン（Ｃｈｅｎ）他、Ｌｅａｒｎ．Ｍｅｍ．７／２０００，４３３−４４１ページは、レーザ走査型顕微鏡法により時間ごとまたは日ごとの長時間実験における脳構造の撮影について記述しているが、この場合人為的要素を最小限にするため、色素の褪色または環境起因性の濁りによる光効率の変化が補償されねばならない。
フェニーリ（Ｆｅｎｉｌｉ）、デ・ボーニ（Ｄｅ Ｂｏｎｉ）、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｐｒｏｔｏｃ １１／２００３，１０１−１１０ページは、培養中の生体合胞体の顕微鏡撮影について記述しているが、この場合、発育過程における個々の細胞が高分解能で表示されねばならない。レーザ出力のブレなど外的影響に対する感度の適合性が優位点となろう。

レーザ走査顕微鏡の構成図

符号の説明

Ｒ リアルタイムコンピュータ
Ｉ１，Ｉ２ デジタル・インターフェース
Ｋ１，Ｋ２ ハードウェア部品

Claims (17)

1. レーザ走査型顕微鏡の操作方法であって、少なくとも２つの検出画像または検出画像領域が互いに比較され、色および／または強度の時間的および／または位置的な変化が、照明および／または検出および／またはスキャナ制御のための、および／または調節可能な別の顕微鏡部品のための制御信号を生成する方法。
2. レーザ走査型顕微鏡による試料の捕捉方法であって、少なくとも２つの撮影画像または撮影画像領域が互いに比較され、少なくとも１つの試料領域内で波長および／または強度に変化が現れた場合、照明制御および／または検出制御の変更および／またはスキャナ制御の変更および／または調節可能な別の顕微鏡部品の制御変更が行われるという方法。
3. 試料および／または試料領域の位置的および／または時間的変化の捕捉のための捕捉手段と、捕捉された変化に依存して照明および／または検出の制御および／またはスキャナ制御のための、および／または別の光学的および／または電子的な顕微鏡部品の制御のための制御手段とを有するレーザ走査型顕微鏡。
4. ユーザ用の入力手段および表示手段がインターフェースを通じてプロセッサと結合していて、そのプロセッサがインターフェースを通じて少なくとも照明および／または検出および／またはスキャナ制御のための顕微鏡部品と結合している、請求項３に記載の配置。
5. 試料上の輝度変化が撮像条件変更のための制御信号を発動させる、先行請求項のうちの１項に記載のレーザ走査型顕微鏡の操作方法。
6. 試料上または試料中で周期的に進行する現象が、同期された画像撮影のための少なくとも１つの制御信号を発動させる、先行請求項のうちの１項に記載のレーザ走査型顕微鏡の操作方法。
7. 試料または試料領域の移動時に、走査範囲の移動箇所が追跡される、先行請求項のうちの１項に記載のレーザ走査型顕微鏡の操作方法。
8. 試料上または試料中の反応が画像撮影または画像撮影シリーズの開始のための制御信号を発動させる、先行請求項のうちの１項に記載のレーザ走査型顕微鏡の操作方法。
9. 試料領域内の変化が、走査領域の大きさ変更のための制御信号を発動させる、先行請求項のうちの１項に記載のレーザ走査型顕微鏡の操作方法。
10. 試料上または試料中の変化速度がスキャン速度変更のための制御信号を生成する、先行請求項のうちの１項に記載のレーザ走査型顕微鏡の操作方法。
11. 細胞培養中に少なくとも１つの移動性細胞を捕捉するための、先行請求項のうちの１項に記載の方法。
12. 長時間検査において脳構造を捕捉するための、先行請求項のうちの１項に記載の方法。
13. 脈拍を捕捉するための、先行請求項のうちの１項に記載の方法。
14. 呼吸を捕捉するための、先行請求項のうちの１項に記載の方法。
15. 生体試料内の時間的変化、たとえばＣａ２＋濃度の変化を捕捉するための、先行請求項のうちの１項に記載の方法。
16. 試料内の色素の褪色に適合させるための、先行請求項のうちの１項に記載の方法。
17. 試料内の濁りに適合させるための、先行請求項のうちの１項に記載の方法。

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