JP2005073595A - 核酸試料調製法及び核酸増幅法 - Google Patents

Abstract

【課題】遠心機などの高価な装置を用いることなく、生体、食品、環境などに由来する試料の細胞、細菌、ウイルスなどの核酸試料を調製する安価かつ簡便な方法を提供する。
【解決手段】核酸試料を調製すべき生体試料を第１のフィルターを用いて濾過する第１濾過工程と、得られた濾液において核酸を抽出する抽出工程と、抽出された核酸を含む液を前記第１のフィルターより小さい孔径を有する第２のフィルターを用いて濾過する第２濾過工程とを含む、核酸試料調製法。
【選択図】図１

Description

本発明は、核酸増幅反応を阻害する成分を含む試料から、核酸を増幅・検出・同定する際に、試料から安価にかつ迅速に核酸の調製を行うことを必要とする分野に関する。

従来の細菌検査法では、試料中の細菌を、直接的に或いは増殖後に選択培地に撒いて数日かけて培養し、形成したコロニーの生化学検査によって菌の同定をする方法が主流となっている。しかし、培養法による検査法は、操作が煩雑であり、判定に熟練を要する上に潜伏感染者を発見するには感度が不十分であるため、偽陰性と判定される例も少なくないと推測された。

最近ではこの培養法に変わる方法として、試料から分離した菌から抽出した核酸をＰＣＲ法やＬＡＭＰ法などの核酸増幅法を用いて増幅・検出・同定する検査方法が行われている。核酸増幅法を用いる検査法は、高感度かつ高特異性であるため、適切なプライマーを用いれば、試料中に存在する少量の標的物をわずか数時間で検出することが可能である。

しかしながら、検査すべき試料中に核酸増幅反応を阻害する成分が多量に含まれていると、試料からこれらの阻害成分を事前に除去しなければならない。例えば糞便の前処理法として、国際公開ＷＯ００／０８１３６号パンフレットに記載されているように、遠心操作による糞便洗浄等の工程を必要とする。遠心操作を用いる方法は、少量検体を実験室レベルで処理するのには適しているが、実地に多数検体を処理しなくてはならない検査機関では、多大な手間と時間が必要となる。このため、核酸増幅法を用いた検査法の導入が進んでいないのが現状である。

国際公開ＷＯ００／０８１３６号パンフレット

本発明の目的は、遠心機などの高価な装置を用いることなく、生体、食品、環境などに由来する試料中の細胞、細菌、ウイルスなどの核酸を調製する安価かつ簡便な方法を提供することである。

本発明は、以下の発明を含む。
（１）核酸試料を調製すべき生体試料を第１のフィルターを用いて濾過する第１濾過工程と、
得られた濾液において核酸を抽出する抽出工程と、
抽出された核酸を含む液を前記第１のフィルターより小さい孔径を有する第２のフィルターを用いて濾過する第２濾過工程とを含む、核酸試料調製法。

（２）前記第１濾過工程の前に前記生体試料を懸濁用液に懸濁させる、前記（１）に記載の核酸試料調製法。
（３）前記核酸がＤＮＡである、前記（１）又は（２）に記載の核酸試料調製法。
（４）前記核酸がＲＮＡである、前記（１）又は（２）に記載の核酸試料調製法。
（５）前記抽出工程を加熱処理によって行う、前記（１）〜（４）のいずれかに記載の核酸試料調製法。
（６）前記第１のフィルターの孔径が１μｍ〜１００μｍである、前記（１）〜（５）のいずれかに記載の核酸試料調製法。
（７）前記第２のフィルターの孔径が０．２２μｍ〜０．４５μｍである、前記（１）〜（６）のいずれかに記載の核酸試料調製法。

（８）（１）〜（７）のいずれかに記載の核酸試料調製法によって得られた核酸試料を使用する核酸増幅法。

本発明によると、遠心機などの高価な装置を用いることなく、生体、食品、環境などに由来する試料の細胞、細菌、ウイルスなどの核酸試料を調製する安価かつ簡便な方法を提供することができる。さらに本発明によると、安価かつ簡便に、しかも短時間で核酸増幅反応用の核酸試料を得ることができる。

本発明の核酸試料調製法において、核酸試料を調製すべき生体試料としては、生体、食品、環境などに由来するものを用いることができる。具体的には、生物の組織、体液、分泌物、排泄物等が挙げられ、さらに具体的には、痰、血液、糞便、尿などが挙げられる。本発明においては、このような生体試料から、細胞、真菌、細菌、ウイルス等の核酸を抽出する。

上記生体試料は、あらかじめ必要に応じて適当な懸濁用液に懸濁させ、懸濁液とすることができる。懸濁用液としては、菌等を生かしたまま保存することができるものが好ましい。このような溶液としては、キャリーブレア培地やＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）等が挙げられる。ここで、キャリーブレア培地は、チオグリコール酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩を含んだ、寒天をベースとした培地であり、しばしば採便管に用いられる。懸濁させる生体試料の量としては、懸濁液全体に対して生体試料の量が２０重量％程度であることが好ましい。

このような生体試料又は生体試料の懸濁液（以下、単に試料と記載する）には通常、夾雑物が多量に含まれている。ここで夾雑物には、試料の操作や核酸の増幅などの障害となる物質が含まれる。夾雑物として比較的大きいものとしては、消化物の残骸や食物繊維などが挙げられる。夾雑物として比較的小さいものとしては、剥離粘膜細胞や腸内細菌の残骸、その他不消化物などが挙げられる。本発明においては、このような夾雑物を除去し、核酸増幅反応に使用することができる核酸抽出液、すなわち核酸試料を得る。すなわち本発明の核酸試料調製法においては、後述の第１濾過工程、抽出工程及び第２濾過工程を行う。

第１濾過工程においては、試料を濾過し、試料中に含まれる比較的大きな夾雑物を除去する。本工程において用いられるフィルター（第１のフィルター）としては、メッシュフィルターであることが好ましい。メッシュフィルターの材質としては、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル、ポリエチレン、フルオロカーボンなどの樹脂が有効であるが、これらに限定されない。フィルターの孔径としては、１μｍ〜１００μｍが好ましい。このようにして、比較的大きな夾雑物が除去された試料の濾液を得る。

抽出工程においては、第１濾過工程で得られた濾液において、核酸を抽出する。本発明においては、抽出方法として加熱処理による方法を用いることが好ましい。加熱処理の条件としては、９０℃〜１００℃、１〜２０分の条件で行うことが好ましい。具体的には、濾液をチューブにとり、ヒートブロックやサーマルサイクラーなどで加熱処理を行うことができる。このようにして、第１濾過工程で得られた濾液が核酸抽出処理された液を得る。

第２濾過工程においては、抽出工程で得られた抽出処理液を濾過し、第１濾過工程で除去されなかった比較的小さな夾雑物を除去する。また、抽出工程において生じた核酸以外の物質も除去する。核酸以外の物質としては、例えば、細胞壁、核膜、核以外のその他各種細胞内器官、などが挙げられる。本工程において用いられるフィルター（第２のフィルター）としては、メンブレンフィルターであることが好ましい。メンブレンの材質としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。フィルターの孔径としては、０．２２μｍ〜０．４５μｍが好ましい。このようにして、抽出処理液の濾液を得る。この濾液には、抽出された核酸が含まれている。

以上のようにして、核酸試料を調製することができる。本発明においてはＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸を得ることができる。本発明によって調製された核酸試料は、核酸増幅反応に用いることができる程度にまで精製されている。従って、第２濾過工程で得られた濾液はそのまま特別な処理を行うことなく、核酸増幅反応に用いるための核酸試料として用いることができる。一方、第２濾過工程で得られた濾液をさらに精製して、核酸増幅反応に用いるための核酸試料として用いることもできる。すなわち本発明は、前記の核酸試料調製法によって得られた核酸試料を用いた核酸増幅方法でもある。

本発明の核酸増幅反応においては、上述の核酸試料調製法によって得られた核酸試料を核酸増幅反応液に添加して核酸増幅を行う。核酸増幅反応としては、ＰＣＲ(Polymerase chain reaction)、ＬＡＭＰ(Loop-mediated isothermal amplification)などの各種増幅反応を採用することができる。添加する核酸試料の量は、例えば前記の第２濾過工程で得られた濾液を直接核酸増幅反応に用いる場合は、核酸増幅反応液に対し５〜２０重量％程度となるように添加することが適当である。

以上のように、本発明によると、遠心機などの高価な装置を用いる必要があった核酸増幅反応用核酸試料の調製を、短時間で安価かつ簡便に行うことができる。従って、多数の検体を従来のように多大な手間や時間をかけることなく処理することが可能である。

本実施例において、試料の中でも特に阻害物が多量に含まれている糞便から、ベロ毒素生産性大腸菌Ｏ１５７の抽出を行う方法を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。

２０重量％のＰＢＳベースの糞便懸濁液１０ｍｌに、４．２×１０⁵ＣＦＵのＯ１５７生菌を添加した。図１に、本実施例において行われた操作を示す。図１が示すように、Ｏ１５７を添加した２０重量％糞便懸濁液１ｍｌを、直径２５ｍｍ、孔径４５μｍのポリプロピレン製のメッシュフィルターを装着した２ｍｌプラスチックシリンジに注いだ。その後、プランジャーの圧力で、糞便懸濁液をメッシュフィルターで濾過した。濾液を０．６μｌチューブに１００μｌ分取し、１００℃で５分間（５min）加熱して熱抽出を行い、５分間氷冷した。熱抽出液７０μｌをとり、直径１３ｍｍ、孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターに直接添加した。その後、プラスチックシリンジを装着し、プランジャーの圧力で濾過した。このとき得られた濾液約１５μｌから５μｌ分取し、下記の組成を有するＰＣＲ反応液５０μｌに添加した。段階希釈したＯ１５７生菌を添加した糞便懸濁液を使用して、それぞれについて同様の操作を行った。

（ＰＣＲ反応溶液の組成）
粗精製ＤＮＡ用Ampdirect（島津製作所製、遺伝子増幅用試薬）１０μｌ
ｄＮＴＰ 終濃度各２００μＭ
プライマー 終濃度各０．６μＭ
TaKaRa Taq HotStart version（宝酒造製）１．２５Ｕ／５０μｌ

それぞれの反応液を、９５℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃２０秒を１サイクルとし、４５サイクルの条件で核酸増幅を行った。反応終了後、反応液の一部を電気泳動してエチジウムブロマイド染色により増幅生成物を確認した。このとき得られた電気泳動図を図２に示す。また、表１に、図２の電気泳動図における各レーン（lane）におけるそれぞれの反応液（reaction buffer）あたりのＯ１５７菌のＣＦＵ、及び糞便（stool）１ｇあたりのＯ１５７菌のＣＦＵを示す。

図２及び上記表１から、検出感度を算出した。すなわち、第７レーンまでＯ１５７（１７１ｂｐ）が検出されていることから、反応液中３個、すなわち、糞便１ｇ中３３００個の菌を検出することができた。

本発明の実施の一形態を表した図である。 本実施例における電気泳動の結果である。

Claims (8)

1. 核酸試料を調製すべき生体試料を第１のフィルターを用いて濾過する第１濾過工程と、
   得られた濾液において核酸を抽出する抽出工程と、
   抽出された核酸を含む液を前記第１のフィルターより小さい孔径を有する第２のフィルターを用いて濾過する第２濾過工程とを含む、核酸試料調製法。
2. 前記第１濾過工程の前に前記生体試料を懸濁用液に懸濁させる、請求項１に記載の核酸試料調製法。
3. 前記核酸がＤＮＡである、請求項１又は２に記載の核酸試料調製法。
4. 前記核酸がＲＮＡである、請求項１又は２に記載の核酸試料調製法。
5. 前記抽出工程を加熱処理によって行う、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸試料調製法。
6. 前記第１のフィルターの孔径が１μｍ〜１００μｍである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸試料調製法。
7. 前記第２のフィルターの孔径が０．２２μｍ〜０．４５μｍである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸試料調製法。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸試料調製法によって得られた核酸試料を使用する核酸増幅法。

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