JP2005046064A - ヒト癌細胞の運動と浸潤を阻害するＡｒｆ６ｓｉＲＮＡ - Google Patents
ヒト癌細胞の運動と浸潤を阻害するＡｒｆ６ｓｉＲＮＡ Download PDFInfo
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Abstract
【課題】 癌の浸潤、転移を防止する薬剤を提供する。
【解決手段】 ヒトＡｒｆ６のｍＲＮＡの翻訳領域のヌクレオチド配列に由来する２１〜２３のヌクレオチドよりなるセンス鎖、およびこれに相補的なヌクレオチドよりなるアンチセンス鎖よりなり、両鎖はそれぞれの３’末端にＵＵ配列を結合する、癌細胞の運動と浸潤を阻害するヒトＡｒｆ６のｓｉＲＮＡを癌患者に投与する。
【選択図】なし
【解決手段】 ヒトＡｒｆ６のｍＲＮＡの翻訳領域のヌクレオチド配列に由来する２１〜２３のヌクレオチドよりなるセンス鎖、およびこれに相補的なヌクレオチドよりなるアンチセンス鎖よりなり、両鎖はそれぞれの３’末端にＵＵ配列を結合する、癌細胞の運動と浸潤を阻害するヒトＡｒｆ６のｓｉＲＮＡを癌患者に投与する。
【選択図】なし
Description
本発明は、癌細胞の運動と浸潤を阻害することによって癌の転移を防止することのできるＡｒｆ６のｓｉＲＮＡに関する。
癌をより効率的に診断治療する為には、その発症や悪性獲得の分子的機構の解明が欠かせない。しかしながら、人類の癌に対する知識や、さらには、癌化する前の正常細胞の増殖制御の基本的仕組みそのものの理解がまだまだ不十分である。特に悪性癌の大きな脅威の主な原因はその浸潤・転移性にある。上皮癌の場合、転移の多くは癌細胞の組織への浸潤を介しておこる。細胞の浸潤や転移をもたらす基本的分子機序やその応用による癌の浸潤の阻害する手立てに関して、世界レベルにおいてもまだまだ研究開発の途上であった（Hanahan, D. & Weinberg, R. A. (2000). The hallmarks of cancer.
Cell 100: 57-70；Kong et al. (2003). A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell 3: 537-549）。
Ａｒｆ６はＲａｓスーパーファミリーに属する低分子量Ｇ蛋白質である。主として、細胞形質膜成分のエンドソ−マルリサイクリングや細胞膜受容体のリサイクリングの制御に関与すると考えられている（Moss, J. & Vaughan, M. (1998) Molecules in the ARF orbit. J. Biol. Chem. 273, 21431-21434; Roth, M. G. (2000) Arf. in “GTPases”, eds. Hall, A. (Oxford University Press), pp176-197）。Ａｒｆ６が癌細胞の運動性に関係するか否かについては未知である。
Moss, J. & Vaughan, M. (1998) Molecules in the ARF orbit. J. Biol. Chem. 273, 21431-21434
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Ａｒｆ６はＲａｓスーパーファミリーに属する低分子量Ｇ蛋白質である。主として、細胞形質膜成分のエンドソ−マルリサイクリングや細胞膜受容体のリサイクリングの制御に関与すると考えられている（Moss, J. & Vaughan, M. (1998) Molecules in the ARF orbit. J. Biol. Chem. 273, 21431-21434; Roth, M. G. (2000) Arf. in “GTPases”, eds. Hall, A. (Oxford University Press), pp176-197）。Ａｒｆ６が癌細胞の運動性に関係するか否かについては未知である。
Moss, J. & Vaughan, M. (1998) Molecules in the ARF orbit. J. Biol. Chem. 273, 21431-21434
本発明は、上にも記したようにまだまだ不完全である癌治療に関して、その浸潤性を抑制できる手立てを示すことである。本発明は、そのことにより、癌に対する今までに無い新しくより効果的な治療法を提供することを課題とする。
本発明者は、上記課題を解決する為鋭意研究をおこなった。その結果、癌細胞をＡｒｆ６のｍＲＮＡに特異的に作用するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）により処理し、Ａｒｆ６の発現を著しく低下させることにより、癌細胞の運動や浸潤活性を阻止できることを見出した。また、Ａｒｆ６の活性変異体を強制発現させることによっても、癌細胞の運動と浸潤活性を阻害できることを見出し、これらの発見に基いて本発明を完成させた。
本発明は、配列番号１に示すヒトＡｒｆ６の翻訳領域のｍＲＮＡのヌクレオチド配列に由来する２１〜２３個のヌクレオチドよりなるセンス鎖、およびこれに相補的なヌクレオチドよりなるアンチセンス鎖よりなり、両鎖はそれぞれの３’末端にＵＵ配列を結合する、癌細胞の運動と浸潤を阻害するヒトＡｒｆ６のｓｉＲＮＡに関する。
対象となる癌はあらゆる臓器の上皮組織由来の癌であるが、乳癌が最も好ましい。
本発明は、配列番号１に示すヒトＡｒｆ６の翻訳領域のｍＲＮＡのヌクレオチド配列に由来する２１〜２３個のヌクレオチドよりなるセンス鎖、およびこれに相補的なヌクレオチドよりなるアンチセンス鎖よりなり、両鎖はそれぞれの３’末端にＵＵ配列を結合する、癌細胞の運動と浸潤を阻害するヒトＡｒｆ６のｓｉＲＮＡに関する。
対象となる癌はあらゆる臓器の上皮組織由来の癌であるが、乳癌が最も好ましい。
（１）ｓｉＲＮＡの選定
本発明の好ましいｓｉＲＮＡを例示すると、
１）センス鎖が配列番号１の１６２−１８３の２２のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖がこれに相補的なヌクレオチドよりなり、両鎖はそれぞれの３’末端にＵＵ配列を結合するｓｉＲＮＡ；
２）センス鎖が配列番号１の２２３−２４３の２１のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖がこれに相補的なヌクレオチドよりなり、両鎖はそれぞれの３’末端にＵＵ配列を結合するｓｉＲＮＡ；
３）センス鎖が配列番号１の２７１−２９１の２１のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖がこれに相補的なヌクレオチドよりなり、両鎖はそれぞれの３’末端にＵＵ配列を結合するｓｉＲＮＡ；
４）センス鎖が配列番号１の３０９−３５０の４２のヌクレオチドのうち連続する２１〜２３のヌクレオチドよりなり、アンチセンス鎖がこれに相補的なヌクレオチドよりなり、両鎖はそれぞれの３’末端にＵＵ配列を結合するｓｉＲＮＡ、このうち好ましいものは
センス鎖が配列番号１の３０９−３２９の２１のヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡである；
５）センス鎖が配列番号１の３９２−４２６の３５のヌクレオチドのうち連続する２１〜２３のヌクレオチドよりなり、アンチセンス鎖がこれに相補的なヌクレオチドよりなり、両鎖はそれぞれの３’末端にＵＵ配列を結合するｓｉＲＮＡ；
６）センス鎖が配列番号１の４８９−５２８の４０のヌクレオチドのうち連続する２１〜２３のヌクレオチドよりなり、アンチセンス鎖がこれに相補的なヌクレオチドよりなり、両鎖はそれぞれの３’末端にＵＵ配列を結合するｓｉＲＮＡ；
を挙げることができる。これらのｓｉＲＮＡは他のＡｒｆアイソフォームやヒトに存在する遺伝子に相同性が低く、ｓｉＲＮＡ法によるＡｒｆ６の発現抑制に効果的である。
本発明の好ましいｓｉＲＮＡを例示すると、
１）センス鎖が配列番号１の１６２−１８３の２２のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖がこれに相補的なヌクレオチドよりなり、両鎖はそれぞれの３’末端にＵＵ配列を結合するｓｉＲＮＡ；
２）センス鎖が配列番号１の２２３−２４３の２１のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖がこれに相補的なヌクレオチドよりなり、両鎖はそれぞれの３’末端にＵＵ配列を結合するｓｉＲＮＡ；
３）センス鎖が配列番号１の２７１−２９１の２１のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖がこれに相補的なヌクレオチドよりなり、両鎖はそれぞれの３’末端にＵＵ配列を結合するｓｉＲＮＡ；
４）センス鎖が配列番号１の３０９−３５０の４２のヌクレオチドのうち連続する２１〜２３のヌクレオチドよりなり、アンチセンス鎖がこれに相補的なヌクレオチドよりなり、両鎖はそれぞれの３’末端にＵＵ配列を結合するｓｉＲＮＡ、このうち好ましいものは
センス鎖が配列番号１の３０９−３２９の２１のヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡである；
５）センス鎖が配列番号１の３９２−４２６の３５のヌクレオチドのうち連続する２１〜２３のヌクレオチドよりなり、アンチセンス鎖がこれに相補的なヌクレオチドよりなり、両鎖はそれぞれの３’末端にＵＵ配列を結合するｓｉＲＮＡ；
６）センス鎖が配列番号１の４８９−５２８の４０のヌクレオチドのうち連続する２１〜２３のヌクレオチドよりなり、アンチセンス鎖がこれに相補的なヌクレオチドよりなり、両鎖はそれぞれの３’末端にＵＵ配列を結合するｓｉＲＮＡ；
を挙げることができる。これらのｓｉＲＮＡは他のＡｒｆアイソフォームやヒトに存在する遺伝子に相同性が低く、ｓｉＲＮＡ法によるＡｒｆ６の発現抑制に効果的である。
（２）ｓｉＲＮＡの製造方法
ｓｉＲＮＡ”２本鎖のオリゴリボヌクレオチドである。先ずセンス鎖オリゴリボヌクレオチドおよびアンチセンス鎖オリゴリボヌクレオチドをそれぞれ合成する。一般的に、保護基のついた４種類のリボヌクレオチドを用い、合成機を使用した有機合成で合成する。ＲＮＡは、４種類のヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）がホスホジエステル結合によって連なったポリマー分子で、合成はアミダイドに、バックボーンを形成する糖の２’末端に２’−ビス（アセトキシエトキシ）−メチルエーテル（２’−ＡＣＥ）保護基をつけ、１塩基ずつリン酸結合（カップリング）させる。生成された一本鎖ＲＮＡは、１００ｍＭ ＴＥＭＥＤ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ３．８）バッファーで、６０℃、３０分反応させることにより脱保護を行い、ＨＰＬＣを用いて品質チェックを行う。高い純度のＲＮＡを必要とする場合は、さらに変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ゲルからＲＮＡを精製したり、ＨＰＬＣで精製を行う。
次に両鎖をアニーリングさせる。濃度約５０μＭ（５０ｐｍｏｌ／μＬ）の両鎖の水溶液を調製し、各々の水溶液と５ｘアニーリング用緩衝液（５００ｍＭ 酢酸カリウム，１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ ７．４，１０ｍＭ 酢酸マグネシウム）を混合した溶液を９０℃で１分間加熱し、その後、３７℃６０分間保温する。このことにより、センスとアンチセンスオリゴヌクレオチドは互いにアニーリングし２重鎖となる。
ｓｉＲＮＡ”２本鎖のオリゴリボヌクレオチドである。先ずセンス鎖オリゴリボヌクレオチドおよびアンチセンス鎖オリゴリボヌクレオチドをそれぞれ合成する。一般的に、保護基のついた４種類のリボヌクレオチドを用い、合成機を使用した有機合成で合成する。ＲＮＡは、４種類のヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）がホスホジエステル結合によって連なったポリマー分子で、合成はアミダイドに、バックボーンを形成する糖の２’末端に２’−ビス（アセトキシエトキシ）−メチルエーテル（２’−ＡＣＥ）保護基をつけ、１塩基ずつリン酸結合（カップリング）させる。生成された一本鎖ＲＮＡは、１００ｍＭ ＴＥＭＥＤ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ３．８）バッファーで、６０℃、３０分反応させることにより脱保護を行い、ＨＰＬＣを用いて品質チェックを行う。高い純度のＲＮＡを必要とする場合は、さらに変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ゲルからＲＮＡを精製したり、ＨＰＬＣで精製を行う。
次に両鎖をアニーリングさせる。濃度約５０μＭ（５０ｐｍｏｌ／μＬ）の両鎖の水溶液を調製し、各々の水溶液と５ｘアニーリング用緩衝液（５００ｍＭ 酢酸カリウム，１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ ７．４，１０ｍＭ 酢酸マグネシウム）を混合した溶液を９０℃で１分間加熱し、その後、３７℃６０分間保温する。このことにより、センスとアンチセンスオリゴヌクレオチドは互いにアニーリングし２重鎖となる。
（３）ｓｉＲＮＡの製剤化
ｓｉＲＮＡはリポフェクション法を用いて製剤化できる。通常ホスファチジルセリン（ＰＳ）からなるリポソームが用いられる。この陰電荷を有するリン脂質（ＰＳ）のかわりに、より安定したリポソームを作りやすいＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）という陽イオン性脂質（商品名：トランスフェクタム、リポフェクトアミン）を用いることが好ましい。これら陽イオン脂質と陰電荷をもつｓｉＲＮＡとの複合体を形成させると、正に荷電しているリポソームが、負に荷電している細胞の表面に吸着し、細胞膜と融合することでｓｉＲＮＡを細胞内に導入することができる。
ｓｉＲＮＡはリポフェクション法を用いて製剤化できる。通常ホスファチジルセリン（ＰＳ）からなるリポソームが用いられる。この陰電荷を有するリン脂質（ＰＳ）のかわりに、より安定したリポソームを作りやすいＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）という陽イオン性脂質（商品名：トランスフェクタム、リポフェクトアミン）を用いることが好ましい。これら陽イオン脂質と陰電荷をもつｓｉＲＮＡとの複合体を形成させると、正に荷電しているリポソームが、負に荷電している細胞の表面に吸着し、細胞膜と融合することでｓｉＲＮＡを細胞内に導入することができる。
ｓｉＲＮＡの製造
（ｉ)センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの製造
以下の配列を有する２３マーのセンスＲＮＡ：
GCA CCG CAU UAU CAA UGA CCG UU （配列番号２）
及び以下の配列を有する２３マーのアンチセンスＲＮＡ：
CGG UCA UUG AUA AUG CGG UGC UU （配列番号３）
を次の方法で製造した。
２’−ＡＣＥ保護基のついたアミダイドを用い、ＧＥＮＳＥＴ ＯＬＩＧＯＳ社製のオリジナル合成機（UltraFast Parallel Synthesizer）を使用し、アミダイド法による有機合成を行った。１００ｍＭ ＴＥＭＥＤ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ３．８）バッファーで、６０℃、３０分反応させることにより脱保護を行った後、ＨＰＬＣにより２３マ−のセンスＲＮＡアンチセンスＲＮＡを精製した。
（ｉｉ）アニーリングによるｓｉＲＮＡの製造
（ｉ）で製造したセンスとアンチセンスオリゴヌクレオチドそれぞれ５０μＭ（５０ｐｍｏｌ／μｌ）の濃度になるように水溶液を調製した。各々の水溶液３０μｌずつと５×アニーリング緩衝液（５００ｍＭ 酢酸カリウム，１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．４，１０ｍＭ 酢酸マグネシウム）１５μｌを混合した（合計７５μｌ）。溶液を９０℃で１分間加熱し、その後、３７℃６０分間保温した。このことにより、センスとアンチセンスオリゴヌクレオチドは互いにアニーリングし２重鎖となる。その際、２重鎖オリゴヌクレオチドの濃度は２０μＭ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）であった。
（ｉ)センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの製造
以下の配列を有する２３マーのセンスＲＮＡ：
GCA CCG CAU UAU CAA UGA CCG UU （配列番号２）
及び以下の配列を有する２３マーのアンチセンスＲＮＡ：
CGG UCA UUG AUA AUG CGG UGC UU （配列番号３）
を次の方法で製造した。
２’−ＡＣＥ保護基のついたアミダイドを用い、ＧＥＮＳＥＴ ＯＬＩＧＯＳ社製のオリジナル合成機（UltraFast Parallel Synthesizer）を使用し、アミダイド法による有機合成を行った。１００ｍＭ ＴＥＭＥＤ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ３．８）バッファーで、６０℃、３０分反応させることにより脱保護を行った後、ＨＰＬＣにより２３マ−のセンスＲＮＡアンチセンスＲＮＡを精製した。
（ｉｉ）アニーリングによるｓｉＲＮＡの製造
（ｉ）で製造したセンスとアンチセンスオリゴヌクレオチドそれぞれ５０μＭ（５０ｐｍｏｌ／μｌ）の濃度になるように水溶液を調製した。各々の水溶液３０μｌずつと５×アニーリング緩衝液（５００ｍＭ 酢酸カリウム，１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．４，１０ｍＭ 酢酸マグネシウム）１５μｌを混合した（合計７５μｌ）。溶液を９０℃で１分間加熱し、その後、３７℃６０分間保温した。このことにより、センスとアンチセンスオリゴヌクレオチドは互いにアニーリングし２重鎖となる。その際、２重鎖オリゴヌクレオチドの濃度は２０μＭ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）であった。
癌細胞へのｓｉＲＮＡの導入
室温にてリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ））とＡｒｆ６ ｓｉＲＮＡとの複合体を形成させた。用いるリポフェクトアミンの量や複合体の形成法は製造元の指示に従った。具体的には、４５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００と７５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）とを室温にて５分間保温し、その後、２００ｐｍｏｌの２重鎖オリゴヌクレオチドを含む７５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合した。室温にてリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ））とＡｒｆ６ ｓｉＲＮＡとの複合体を形成させた。この混合液（１．５ｍｌ）を８．５ｍｌの増殖培地で培養している１ｘ１０６個のヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に添加して、細胞内へのｓｉＲＮＡの導入を行った。
室温にてリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ））とＡｒｆ６ ｓｉＲＮＡとの複合体を形成させた。用いるリポフェクトアミンの量や複合体の形成法は製造元の指示に従った。具体的には、４５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００と７５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）とを室温にて５分間保温し、その後、２００ｐｍｏｌの２重鎖オリゴヌクレオチドを含む７５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合した。室温にてリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ））とＡｒｆ６ ｓｉＲＮＡとの複合体を形成させた。この混合液（１．５ｍｌ）を８．５ｍｌの増殖培地で培養している１ｘ１０６個のヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に添加して、細胞内へのｓｉＲＮＡの導入を行った。
Ａｒｆ６ ｓｉＲＮＡ処理によるＡｒｆ６蛋白質の発現抑制
実施例１の方法でＡｒｆ６ ｓｉＲＮＡを調製し、実施例２の方法で２０ｎＭの濃度にてヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に導入した。その後、そのままの状態で増殖培地で２４時間培養した。２４時間後に細胞抽出液を調製し、常法通り電気泳動法にて分離後、抗Ａｒｆ６抗体を用いたウエスタンブロット法によりＡｒｆ６蛋白質の発現量を測定し、Ａｒｆ６ ｓｉＲＮＡの効果を検討した。ｓｉＲＮＡ処理した細胞（＋）と処理しない細胞（−）、それぞれの抽出液２０μｇを用いた。対照として、抗βアクチン抗体を用いた免疫ブロットの結果を下段に示す。Ａｒｆ６ ｓｉＲＮＡ処理をすることによりＡｒｆ６の発現量が１０分の１以下に抑制された（図１参照）。
実施例１の方法でＡｒｆ６ ｓｉＲＮＡを調製し、実施例２の方法で２０ｎＭの濃度にてヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に導入した。その後、そのままの状態で増殖培地で２４時間培養した。２４時間後に細胞抽出液を調製し、常法通り電気泳動法にて分離後、抗Ａｒｆ６抗体を用いたウエスタンブロット法によりＡｒｆ６蛋白質の発現量を測定し、Ａｒｆ６ ｓｉＲＮＡの効果を検討した。ｓｉＲＮＡ処理した細胞（＋）と処理しない細胞（−）、それぞれの抽出液２０μｇを用いた。対照として、抗βアクチン抗体を用いた免疫ブロットの結果を下段に示す。Ａｒｆ６ ｓｉＲＮＡ処理をすることによりＡｒｆ６の発現量が１０分の１以下に抑制された（図１参照）。
Ａｒｆ６ ｓｉＲＮＡ処理によるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の浸潤活性の阻害
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に実施例２と同様にＡｒｆ６ ｓｉＲＮＡを導入し、浸潤活性を調べた。浸潤活性は、ｓｉＲＮＡ導入後２０時間培養した細胞を蛍光色素（Ａｌｅｘａ−５９４）にて標識したゼラチン上に移し、その後１５時間におけるゼラチンの分解活性を下に記載の方法に従って測定することにより評価した。浸潤活性は、ｓｉＲＮＡ導入後２０時間培養した細胞を蛍光色素（Ａｌｅｘａ−５９４）にて標識したゼラチン上に移し、その後１５時間におけるゼラチンの分解活性を測定した。具体的には、ゼラチンの分解活性のある細胞は、その細胞下のゼラチンが失われ、それに共なって蛍光顕微鏡でゼラチンを見た場合、暗い部分として観察される。暗い部分が観察される細胞をゼラチン分解活性があるものとして評価した。ｍｏｃｋはｓｉＲＮＡ非添加下で同様の操作をした対照である。Ａｒｆ６ ｓｉＲＮＡ導入によりＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の浸潤活性は１０分の１以下に抑制された。対照との差は、統計的有意差検定によりＰ＜０．００１であった（図２）。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に実施例２と同様にＡｒｆ６ ｓｉＲＮＡを導入し、浸潤活性を調べた。浸潤活性は、ｓｉＲＮＡ導入後２０時間培養した細胞を蛍光色素（Ａｌｅｘａ−５９４）にて標識したゼラチン上に移し、その後１５時間におけるゼラチンの分解活性を下に記載の方法に従って測定することにより評価した。浸潤活性は、ｓｉＲＮＡ導入後２０時間培養した細胞を蛍光色素（Ａｌｅｘａ−５９４）にて標識したゼラチン上に移し、その後１５時間におけるゼラチンの分解活性を測定した。具体的には、ゼラチンの分解活性のある細胞は、その細胞下のゼラチンが失われ、それに共なって蛍光顕微鏡でゼラチンを見た場合、暗い部分として観察される。暗い部分が観察される細胞をゼラチン分解活性があるものとして評価した。ｍｏｃｋはｓｉＲＮＡ非添加下で同様の操作をした対照である。Ａｒｆ６ ｓｉＲＮＡ導入によりＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の浸潤活性は１０分の１以下に抑制された。対照との差は、統計的有意差検定によりＰ＜０．００１であった（図２）。
Ａｒｆ６ ｓｉＲＮＡ処理によるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の運動活性の阻害
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に実施例２と同様にＡｒｆ６ ｓｉＲＮＡを導入し、運動活性を調べた。運動活性はｓｉＲＮＡ導入後２０時間培養した細胞を、下面にコラーゲンを塗布したＢｏｙｄｅｎ Ｃｈａｍｂｅｒに移し、常法通り、その後３時間における下面への移動を測定することにより評価した。ｍｏｃｋはｓｉＲＮＡ非添加下で同様の操作をした対照である。Ａｒｆ６ ｓｉＲＮＡ導入によりＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の運動活性は約４分の１に抑制された。対照との差は、統計的有意差検定によりＰ＜０．００１であった（図３）。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に実施例２と同様にＡｒｆ６ ｓｉＲＮＡを導入し、運動活性を調べた。運動活性はｓｉＲＮＡ導入後２０時間培養した細胞を、下面にコラーゲンを塗布したＢｏｙｄｅｎ Ｃｈａｍｂｅｒに移し、常法通り、その後３時間における下面への移動を測定することにより評価した。ｍｏｃｋはｓｉＲＮＡ非添加下で同様の操作をした対照である。Ａｒｆ６ ｓｉＲＮＡ導入によりＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の運動活性は約４分の１に抑制された。対照との差は、統計的有意差検定によりＰ＜０．００１であった（図３）。
Ａｒｆ６の強制発現およびその変異体ｃＤＮＡ発現によるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の浸潤活性の阻害
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞にＡｒｆ６の野生型（ＷＴ）もしくは変異型（Ｑ６７Ｌ，Ｔ２７Ｎ）のｃＤＮＡを導入発現し、浸潤活性を調べた。導入にはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いた。浸潤活性は、遺伝子導入後１４時間培養した細胞を蛍光色素（Ａｌｅｘａ−５９４）にて標識したゼラチン上に移し、その後１５時間におけるゼラチンの分解活性を常法に従って測定することにより評価した。ｍｏｃｋは遺伝子非添加下で同様の操作をした対照である。それぞれの試行において、浸潤活性の有意な阻害が認められ、対照との差は統計的有意差検定によりＰ＜０．００１であった（図４）。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞にＡｒｆ６の野生型（ＷＴ）もしくは変異型（Ｑ６７Ｌ，Ｔ２７Ｎ）のｃＤＮＡを導入発現し、浸潤活性を調べた。導入にはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いた。浸潤活性は、遺伝子導入後１４時間培養した細胞を蛍光色素（Ａｌｅｘａ−５９４）にて標識したゼラチン上に移し、その後１５時間におけるゼラチンの分解活性を常法に従って測定することにより評価した。ｍｏｃｋは遺伝子非添加下で同様の操作をした対照である。それぞれの試行において、浸潤活性の有意な阻害が認められ、対照との差は統計的有意差検定によりＰ＜０．００１であった（図４）。
Ａｒｆ６ の強制発現およびその変異体ｃＤＮＡ発現によるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の運動活性の阻害
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞にＡｒｆ６の野生型（ＷＴ）もしくは変異型（Ｑ６７Ｌ，Ｔ２７Ｎ）のｃＤＮＡを導入発現し、運動活性を調べた。導入にはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いた。運動活性は、遺伝子導入後２０時間培養した細胞を下面にコラーゲンを塗布したＢｏｙｄｅｎ Ｃｈａｍｂｅｒに移し、常法通り、その後３時間における下面への移動を測定することにより評価した。ｍｏｃｋは遺伝子非添加下で同様の操作をした対照である。それぞれの試行において、運動活性の有意な阻害が認められ、対照との差は統計的有意差検定によりＰ＜０．００１であった（図５）。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞にＡｒｆ６の野生型（ＷＴ）もしくは変異型（Ｑ６７Ｌ，Ｔ２７Ｎ）のｃＤＮＡを導入発現し、運動活性を調べた。導入にはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いた。運動活性は、遺伝子導入後２０時間培養した細胞を下面にコラーゲンを塗布したＢｏｙｄｅｎ Ｃｈａｍｂｅｒに移し、常法通り、その後３時間における下面への移動を測定することにより評価した。ｍｏｃｋは遺伝子非添加下で同様の操作をした対照である。それぞれの試行において、運動活性の有意な阻害が認められ、対照との差は統計的有意差検定によりＰ＜０．００１であった（図５）。
本発明によって、浸潤性、運動性を効果的に抑制できる具体的手立てが示された。特にｓｉＲＮＡは低分子化合物であり、実際に薬物としての生体へ投与できる。今回、浸潤を抑制できるｓｉＲＮＡ配列を示したことにより、今後、癌、特に乳癌のより有効な治療法の開発を促すことができる。
Claims (8)
- 配列番号１に示すヒトＡｒｆ６のｍＲＮＡの翻訳領域のヌクレオチド配列に由来する２１〜２３個のヌクレオチドよりなるセンス鎖、およびこれに相補的なヌクレオチドよりなるアンチセンス鎖よりなり、両鎖はそれぞれの３’末端にＵＵ配列を結合する、癌細胞の運動と浸潤を阻害するヒトＡｒｆ６のｓｉＲＮＡ。
- センス鎖が配列番号１の１６２−１８３の２２個のヌクレオチドを有する請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
- センス鎖が配列番号１の２２３−２４３の２１個のヌクレオチドを有する請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
- センス鎖が配列番号１の２７１−２９１の２１個のヌクレオチドを有する請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
- センス鎖が配列番号１の３０９−３５０の４２個のヌクレオチドのうち連続する２１〜２３個のヌクレオチドを有する請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
- センス鎖が配列番号１の３０９−３２９の２１個のヌクレオチドを有する請求項５に記載のｓｉＲＮＡ。
- センス鎖が配列番号１の３９２−４２６の３５個のヌクレオチドのうち連続する２１〜２３個のヌクレオチドを有する請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
- センス鎖が配列番号１の４８９−５２８の４０個のヌクレオチドのうち連続する２１〜２３個のヌクレオチドを有する請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2011067420A1 (en) * | 2009-12-04 | 2011-06-09 | Vib Vzw | Arf6 as a new target for treating alzheimer's disease |
-
2003
- 2003-07-29 JP JP2003281976A patent/JP2005046064A/ja active Pending
Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2011067420A1 (en) * | 2009-12-04 | 2011-06-09 | Vib Vzw | Arf6 as a new target for treating alzheimer's disease |
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