JP2004538238A - Epitope or mimotope derived from the C-epsilon-2 domain of IgE, antagonists and therapeutic uses thereof - Google Patents

Abstract

The present invention relates to the provision of a novel drug for treating, preventing or ameliorating an allergic disease. In particular, the novel agents are isolated peptides that incorporate an epitope or mimotope of the surface exposed region of the IgE Cs2 domain. The present invention has found that these novel areas may be targets for passive and active immunoprophylaxis or immunotherapy. The invention further relates to medicaments containing them, processes for the preparation of pharmaceutical compositions, and their use in medicine. Also an aspect of the present invention comprises ligands capable of binding the surface-exposed IgE regions of the present invention, particularly monoclonal antibodies, and their use in medicine as passive immunotherapy or immunoprevention. is there.

Description

【００１８】
このようなエピトープを含むペプチドは、本発明の好ましい一側面を構成する。このエピトープと同じ特性を有するミモトープと、免疫応答を生じさせ、ＩｇＥ分子内でＩｇＥ Ｃε２エピトープと交差反応するミモトープを含む免疫原も、本発明の一部である。
【００１９】
したがって本発明には、天然のＩｇＥエピトープそのものを含む単離されたペプチドと、その任意のミモトープとが含まれる。ミモトープとは、天然のＩｇＥエピトープを認識する抗体が認識することのできるくらいに（ゲイセン， Ｈ．Ｍ．他、『抗原としての合成ペプチド』、ワイリー社、チチェスター、チバ財団シンポジウム１１９、１３０−１４９ページ、１９８６年；ゲイセン， Ｈ．Ｍ．、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第２３巻、第７号、７０９−７１５ページ、１９８６年）；あるいは、適切なキャリヤーと結合させたときに、天然のＩｇＥエピトープと交差反応する抗体を産生させることができるくらいに、天然のＩｇＥエピトープと十分に似ているものと定義する。
【００２０】
本発明のミモトープは、ペプチドからなるもの、または非ペプチドのものが可能である。上で同定した表面露出ＩｇＥエピトープのペプチド・ミモトープは、天然のエピトープとは配列が異なっていてもよいし、天然のエピトープと配列が正確に一致していてもよい。そのような分子はエピトープのミモトープとして記述する。というのも、２つの分子が同じ配列を有するとはいえ、ミモトープはＣε２ドメイン構造全体に提示されるわけではなく、そうであるからにはミモトープが天然のＩｇＥエピトープとはわずかに異なった立体配置を取ることもできるからである。同定された上記の１次配列（Ｐ１〜Ｐ７）が、ＩｇＥの３次構造において、ＩｇＥの１次配列では離れているかもしれない他の領域と隣接することも、当業者には明らかであろう。そのため、例えばＰ１のミモトープは、Ｐ１の区画と、互いに離れたこれらアミノ酸残基からなる区画を含んでいる、または似ているという点を考慮すると、連続でも不連続でもよい。
【００２１】
本発明で利用することのできる好ましい表面露出領域は、ループ構造を伴う領域を含んでいる。したがって本発明のペプチドまたはミモトープは、Ｎ末端延長部またはＣ末端延長部を有するループを含むことができる。この末端延長部としては、隣接するβシートからの天然のアミノ酸残基が可能である。その実例として、Ｐ１はＩｇＥのＣε２ドメインのＣ−Ｄループを含んでおり、Ｐ２はＤ−Ｅループを含んでおり、Ｐ３はＥ−Ｆループを含んでおり、Ｐ４はＦ−Ｇループを含んでおり、Ｐ５はＡ−Ｂループを含んでおり、Ｐ６はＢ−Ｃループを含んでいる。したがって、これらループのミモトープは本発明の一側面を構成する。
【００２２】
特に好ましい薬は、エピトープＰ１とそのミモトープに基づいている。このエピトープを含むペプチドとそのミモトープは、キャリヤーと結合したときに、ヒト好塩基球からのヒスタミン放出を抑制することのできる抗ＩｇＥ免疫応答を誘導する能力を有する。さらに、この免疫応答はアナフィラキシー非誘発性である。Ｐ１のミモトープは、主として、免疫原にしたときに免疫応答を引き起こしうる任意のものであると記述される。この免疫応答により、ＩｇＥのＣε２ドメインにおいてＰ１を認識することができる。
【００２３】
Ｐ１は、Ｃε２ドメインのＣ−Ｄループに対応する。折り畳まれている免疫グロブリンのＣ−Ｄループ構造は、Ｃβ鎖の終端とＤβ鎖の始端を結合する鎖に対応している（『タンパク質の構造入門』、第２版、３０４ページ、ブランデンとトゥーズ、ガーランド出版、ニューヨーク、ＩＳＢＮ ０ ８１５３ ２３０５−０）。この結合鎖は、ＩｇＥ分子のアミノ酸残基番号トリプトファン２６８〜セリン２８０にほぼ対応している。したがって、ＩｇＥのＣε２ドメインのＣ−Ｄループのミモトープと、ＩｇＥのＣε２ドメインのＣ−Ｄループに結合することのできるリガンドは、本発明の好ましい一側面を構成する。
【００２４】
上で同定したＩｇＥのエピトープのペプチド・ミモトープに対し、選択したアミノ酸の付加、欠失、置換の操作を施すことにより、特定の目的に向けた設計にすることができる。したがって、本発明のペプチドを修飾して、タンパク質キャリヤーに容易に共役するようにできる。例えば、化学的共役法の中には、ＩｇＥのエピトープに対する末端システインを含めることが望ましいものがあろう。さらに、キャリヤー・タンパク質と共役したペプチドに、このペプチドの共役した末端から離れた疎水性末端を含め、このペプチドの共役していない自由な末端が、キャリヤー・タンパク質の表面と会合したままにすることも望ましかろう。こうするとペプチドの立体配座の自由度が小さくなり、したがってこのペプチドが、ＩｇＥ分子全体で見られるようなＩｇＥペプチドの立体配座と非常によく似た立体配座として提示される確率が大きくなる。例えばペプチドを変化させて、Ｎ末端にはシステインを、Ｃ末端には疎水性アミド化された尾部を持つようにすることができる。また、１つまたはそれ以上のアミノ酸のＤ立体異性体を付加または置換することにより、例えばペプチドの安定性を増す有利な誘導体を作り出すことができる。当業者であれば、そのように修飾されたペプチドまたはミモトープは、構成要素であるアミノ酸残基が必ずしも天然の２０種類のアミノ酸には限定されない、全体または一部が非ペプチドのミモトープが可能であることが理解できよう。さらに、このようなペプチドは、従来技術で知られている方法により環状化して、そのペプチドを、ペプチド配列がＩｇＥ分子全体の中にあるときの形と非常に似た立体配座にすることができる。
【００２５】
ジスルフィド架橋の形成を可能にする２つのシステイン残基を含む好ましい環状化ペプチドの具体例としては、ＰＴ１０７９（配列ＩＤ番号１４）、ＰＴ１０７９ｇｓ（配列ＩＤ番号１５）、ＰＴ１０７８（配列ＩＤ番号１６）、Ｐ１５ｑ（配列ＩＤ番号１１）が挙げられる。
【００２６】
さらに、当業者であれば、本発明のミモトープまたは免疫原は、単離されたエピトープよりも長くすることが可能であり、また、この明細書に開示した配列を含んでいてもよいことが理解できよう。したがって、本発明のミモトープは、Ｎ末端および／またはＣ末端の一端または両端に、他の多数の天然の残基からなる延長部を有することが可能である。ペプチド・ミモトープは、天然のＩｇＥ配列とは配列の方向が逆転しているレトロ配列にすることもできる。あるいは、ペプチド・ミモトープの配列の全部または少なくとも一部がＤ立体異性体のアミノ酸（反転配列）となっていることも可能である。また、ペプチド配列は、配列の方向が逆転していてアミノ酸がＤ立体異性体の形態であるレトロ−反転も可能である。このようなレトロ・ペプチド、またはレトロ−反転ペプチドは非自己であり、免疫系における自己寛容の問題を解決することができる（例えばＰ１５ｒ。以下の説明を参照のこと）。
【００２７】
また、ペプチド・ミモトープは、本発明のＩｇＥエピトープに結合することのできる抗体を用い、ファージ提示技術などの方法を利用して同定することができる（ＥＰ ０ ５５２ ２６７ Ｂ１）。この方法により、天然ペプチドの構造と似ているために抗天然ペプチド抗体と結合できるが、天然のＩｇＥペプチドとは必ずしも配列が有意なホモロジーではない多数のペプチド配列が生み出される。この方法は、免疫原性の諸特性が増強された（ＩｇＥ受容体または抗ＩｇＥ抗体へのアフィニティ結合特性がより大きいとか、ＩｇＥに結合するポリクローナル免疫応答をより大きなアフィニティで誘導することができるなどの）ペプチドを同定できるようにすることが可能であるとか、天然のペプチド配列を用いることに付随する可能性のある潜在的な自己抗原寛容のあらゆる問題を解決できるといった大きな利点を有する。さらに、この方法により、認識されたミモトープ配列に共通する化学的特性に関し、それぞれの天然ペプチドについて認識パターンを同定することができる。
【００２８】
修飾されたペプチド・ミモトープの好ましい具体例と、ミモトープに由来するバクテリオファージの具体例としては、以下のものがある：
【００２９】
【表２】

【００３０】
他のミモトープにおいては、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、またはＰ７のアミノ酸残基は、それぞれ、非常によく似たアミノ酸で置換することができる。例えばＡは、以下の表に示したようにＶ、Ｌ、またはＩで置換することができる：
【００３１】
【表３】

【００３２】
表面が露出したＣε２ ＩｇＥエピトープに結合できるリガンドと、そのリガンドを含む薬理学的組成物は、本発明の一部をなす。そのようなリガンドは、受動的な予防法または治療法で用いることができる。例えばアレルギー疾患を改善するために、そのリガンドを患者に投与する。このような有用なリガンドの具体例としては、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が挙げられる。例えば、アレルギーの予防または治療のため、ある動物の体内に誘導された抗体を精製して別の動物に受動的投与することができる。本発明のペプチドは、モノクローナル抗体ハイブリドーマ（例えばケーラーとミルステイン、Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻、４９５ページ、１９７５年の技術を用いる）、ヒト化されたモノクローナル抗体、またはＣＤＲ移植されたモノクローナルを従来技術を用いて産生させるのにも用いることができる。したがって、本発明の関連する一側面として、ＩｇＥのＣε２ドメインの表面露出エピトープと結合できるリガンドがある。このようなリガンドの具体例としては抗体（またはＦａｂ断片）が挙げられる。このような抗体は、受動的な免疫防御または免疫療法で使用したり、ＩｇＥペプチド・ミモトープの同定に用いたりすることができる。
【００３３】
“抗体”という用語は、この明細書では、有効な抗原結合特異性を有する分子を指すのに用いる。当業者であれば、この用語には、同じ機能または非常によく似た機能を果たす抗体断片であるポリペプチドまたは抗体誘導体であるポリペプチドも含めうることが容易に理解できよう。そこでこのような抗体断片または抗体誘導体は、この明細書で用いる抗体という用語に含めるつもりである。
【００３４】
好ましいリガンドはモノクローナル抗体である。特に好ましいリガンドは、Ｐ１のリガンドであり、それはモノクローナル抗体であることが好ましい。例えばＰＴｍＡｂ００１１は、ブダペスト条約に基づく特許寄託としてＥＣＡＣＣ（欧州細胞培養物コレクション、ワクチン研究・製造研究所、公衆衛生研究部門、応用微生物学研究センター、ポートン・ダウン、ソールズベリー、ウィルトシャー、ＳＰ４ ＯＪＧ、イギリス）に１９９９年３月８日に登録番号９９０３０８０５号として寄託されたマウスのＩｇＧ１タイプのモノクローナル抗体の参照名である。
【００３５】
例えばＰＴｍＡｂ００１１はＣε２のＣ−Ｄループを認識する。ＰＴｍＡｂ００１１はまた、ヒト好塩基球の表面の高アフィニティ受容体と結合したとき、脱顆粒を起こすことなくＩｇＥを認識することができる。ＰＴｍＡｂ００１１はさらに、ＩｇＥがＦｃεＲ１αに結合するのを妨げることにより非アレルギー性好塩基球の受動的感作を阻止し、アレルギー性好塩基球においてＬｏｌＰ１によってトリガーされるヒスタミンの放出を抑制することができる。Ｃε２のＣ−Ｄループを認識する別のモノクローナル抗体はＰＴｍＡｂ０００５である（シグマ・ケミカルズ社からカタログ番号Ｉ６５１０、クローン番号ＧＥ−１として入手可能）。本発明により、このモノクローナル抗体が薬理学的組成物中に含まれた形で提供される。
【００３６】
Ｐ１のリガンドは、バクテリオファージ選別法において新しいＰ１ミモトープを同定するのに用いられている。例えばＰ１を認識することのできるモノクローナル抗体は、以下の配列を発現するバクテリオファージと結合する：
【００３７】
【表４】

【００３８】
Ｃε２ ＩｇＥのＣ−Ｄループの他のペプチド・ミモトープは、ＰＴｍＡｂ００１１とＰＴｍＡｂ０００５を用いたバクテリオファージ選別法によって同定されている。そのようなミモトープの具体例としては以下のものが挙げられる：
【００３９】
【表５】

【００４０】
したがって、ＰＴｍＡｂ０００５またはＰＴｍＡｂ００１１と結合できるＣε２ ＩｇＥのミモトープと、このミモトープを含む免疫原は、本発明の重要な一側面を構成する。ＰＴｍＡｂ０００５またはＰＴｍＡｂ００１１と結合することのできるミモトープを含むワクチンは、アレルギー治療に有効である。
【００４１】
Ｐ１のミモトープについての幅広い定義を制限することなく、これらのファージ配列および他のファージ配列から、Ｐ１様ペプチドの部分集合についてコアとなるパターンを同定した。このパターンはＰ１のミモトープの部分集合であり、各位置のアミノ酸を、以下のような特定の抗Ｐ１モノクローナル抗体が認識するのに望ましい化学的性質という観点から見たミモトープの記述になっている。
【００４２】
ｙ ｈ ｘ ｄ ｈ ｈ ａ ｎ ａ ｎ ｘ ｙ
ここに、
ｙ．．． ．．．ｙは環状にすることができる。
【００４３】
ｈは疎水性である（システイン、プロリン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、メチオニン、フェニルアラニン）。
【００４４】
ｄはイオン結合を与える（アルギニン、リシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、トリプトファン、チロシン、トレオニン、セリン）。
【００４５】
ａは酸性である（アスパラギン酸、グルタミン酸）。
【００４６】
ｎはイオン的に中性／非極性である（アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニンを除くすべて）。
【００４７】
ｘは任意のアミノ酸である（ｎ＝０〜３）。
【００４８】
したがって、一実施態様では、Ｐ１のミモトープは、上記の一般的なコア構造ｙ ｈ ｘ ｄ ｈ ｈ ａ ｎ ａ ｎ ｘ ｙで記述することができる。ペプチドＰ１またはそのミモトープは、いずれかの端部に他のアミノ酸が隣接して、共役を助けたり、他の任意の目的を果たしていたりしてもよい。
【００４９】
Ｐ１の特に好ましいミモトープは、Ｐ１５ｓ（配列ＩＤ番号１７）である。この配列の残基の中でＱとＭと最初のＤが、ＰＴｍＡｂ００１１とＰＴｍＡｂ０００５の結合活性にとって極めて重要であることがわかっている（実施例を参照のこと）。したがって、Ｐ１５ｓに対するミモトープの配列は、
Ｑ、Ｘ_１、Ｍ、Ｄ、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３
となる（本質的ではない残基は、（上に概説したように）似たようなアミノ酸で置換した）。ここにＸ_１はＶ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ａの中から選択し、Ｘ_２はＤまたはＥであり、Ｘ_３はＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｆの中から選択する。
【００５０】
ＰＴｍＡｂ０００５とＰＴｍＡｂ００１１を使用してＩｇＥの新規なミモトープを同定し、続いてそれをアレルギー治療に使用することも、本発明の重要な１つの側面を構成する。ＰＴｍＡｂ０００５は市販されているため、本発明の組成物にはならない。しかしＰＴｍＡｂ０００５を含む薬理学的組成物と、それを利用したＰ１のミモトープの同定法は、本発明の２つの重要な側面を構成する。
【００５１】
Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５のミモトープも、本発明の重要な一側面を構成する。例えばＰ１６とＰ１７は、それぞれＰ２とＰ３のミモトープである。これらのペプチドは、キャリヤー上に適切に提示されたときには、どちらもアナフィラキシー非誘発性である強力な抗ＩｇＥ抗体反応を誘導することができる。
【００５２】
好ましい一実施態様では、同定された上記エピトープを含むペプチド、あるいはペプチド性または非ペプチド性ミモトープを含む本発明のペプチドは、サイズが小さくて、Ｃε２ドメイン全体から選択した領域と似ている。したがってペプチド性ミモトープは、アミノ酸の長さが１００個未満、好ましくは７５個未満、さらに好ましくは５０個未満、最も好ましくは４〜２５個となっているはずであることが予想される。好ましいペプチド・ミモトープの具体例はＰＴ１０７９とＰ１５ｑである。これらは、アミノ酸の長さがそれぞれ２１個と１３個である。非ペプチド・ミモトープは、モル体積に関しては対応するペプチド・ミモトープと似たようなサイズであることが予想される。
【００５３】
当業者にとっては、特定の構造体の状態がミモトープであることを確認するのにさまざまな技術を利用できることは明らかであろう。そうした技術としては、以下のものがある。ミモトープと推定されるものを調べてその免疫原性を確かめることができるため、そのミモトープと推定されるものによって培養した抗血清は、天然のＩｇＥ分子と交差反応するとともに、アレルギー・エフェクター細胞からのアレルギー・メディエーターの放出を阻止する機能も有する。このような反応の特異性は、抗血清の活性を、ミモトープそのものまたは天然のＩｇＥ、および／またはＩｇＥのＣε２内の表面に露出したエピトープと結合することが知られている特異的モノクローナル抗体で阻害するという競合実験によって確かめることができる。競合アッセイで使用するこのようなモノクローナル抗体の具体例としては、例えば、ＰＴｍＡｂ０００５とＰＴｍＡｂ００１１が挙げられる。これらを用いると、ミモトープと推定されるものがＩｇＥのＣε２ドメインのＣ−Ｄループのミモトープであるかどうかを確認することができよう。
【００５４】
本発明の一実施態様では、ＩｇＥのエピトープまたはミモトープを含む上記の少なくとも１つのペプチドをキャリヤー分子と結合させ、ワクチン・プロトコルのための免疫原を作る。キャリヤー分子は天然のＩｇＥ分子とは関係がないことが好ましい。ペプチドまたはミモトープは、化学的共有結合によって、または遺伝子工学で作った融合パートナーを発現させることによって、あるいはまたリンカー配列によって、結合させることができる。
【００５５】
免疫誘導性キャリヤーとペプチドを共有結合させるには、従来技術において周知の方法を用いることができる。例えば、直接的共有結合のためには、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、または（Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］）スクシンイミドエステルを用いることが可能である。その際、一般に市販されているＣＤＡＰやＳＰＤＰなどのヘテロ二機能性リンカーを（製造者の指示に従って）利用する。結合反応の後、免疫原は、透析法、ゲル濾過法、分画法などによって容易に単離し、精製することができる。
【００５６】
本発明の免疫原で使用するキャリヤーのタイプは、当業者には容易にわかるであろう。キャリヤーの機能は、ＩｇＥペプチドに対する免疫応答の誘導を促進するためにサイトカインの協力を提供することである。本発明で用いることのできるキャリヤーのリストには、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの血清アルブミン、破傷風毒素（ＴＴ）やジフテリア毒素（ＤＴ）などの不活性化した細菌毒素またはこれらの組み換え断片（例えば、ＴＴの断片Ｃのドメイン１、またはＤＴのトランスロケーション・ドメイン）、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）などが含まれるが、これだけに限定されるわけではない。また、ミモトープまたはエピトープは、リポソーム・キャリヤーに直接共役させることもできる。なおこのキャリヤーは、Ｔ細胞を助けることのできる免疫原をさらに含んでいてもよい。ペプチドとキャリヤーの比は、約１：１〜２０：１であることが好ましく、各キャリヤーは３〜１５個のペプチドを含んでいることが好ましい。
【００５７】
本発明の一実施態様では、好ましいキャリヤーは、ヘモフィルス・インフルエンザに由来するプロテインＤである（ＥＰ ０ ５９４ ６１０ Ｂ１）。プロテインＤは、ヘモフィルス・インフルエンザに由来するＩｇＤ結合タンパク質であり、フォースグレンがこれについて特許を取得している（ＷＯ ９１／１８９２６につき、ＥＰ ０ ５９４ ６１０ Ｂ１として特許取得）。場合によっては、例えば組み換え免疫原発現系において、プロテインＤの断片、例えばプロテインＤの１／３（プロテインＤのＮ末端の１００〜１１０個のアミノ酸を含む（ＧＢ９７１７９５３．５））を用いることが望ましかろう。
【００５８】
本発明のＩｇＥペプチドを提示する別の好ましい方法では、組み換え融合分子が関係する。例えばＥＰ ０ ４２１ ６３５ Ｂは、キメラになったヘパドナウイルスのコア抗原粒子を用いてウイルス様粒子内で外来性ペプチド配列を提示する方法を記述している。そのようなわけで、本発明の抗原は、Ｂ型肝炎コア抗原からなるキメラ粒子内に提示されるＩｇＥペプチドを含むことができる。さらに、組み換え融合タンパク質は、本発明のミモトープと、インフルエンザ・ウイルスのＮＳ１などのキャリヤー・タンパク質を含むことができる。組み換えによって発現する本発明の任意のタンパク質をコードする核酸も、本発明の一側面を構成する。
【００５９】
本発明で用いるペプチドは、従来技術で周知の固相法を用いて容易に合成することができる。適切な合成は、“Ｔ−ｂｏｃ”法または“Ｆ−ｍｏｃ”法を用いて行なうことができる。環状ペプチドは、周知の“Ｆ−ｍｏｃ”法とポリアミド樹脂を用いた固相法により、完全に自動化された装置内で合成することができる。また、当業者であれば、この方法を手で実施するのに必要な実験手続きを知っているであろう。固相合成の技術と方法は、ＩＲＬによってオックスフォード大学出版から発行されたＥ． アサートンとＲ．Ｃ． シェパード著、『固相ペプチド合成：実践的方法』、１９８９年に記載されている。また、ペプチドは、ミモトープをコードしている核酸分子を細菌または哺乳類の細胞系列の中で発現させた後、その発現したミモトープを精製するという操作を含む組み換え法によっても産生させることができる。ペプチドやタンパク質を組み換え発現させる技術は従来から知られており、マニアティス， Ｔ．、フリッチ， Ｅ．Ｆ．、サムブルック他、『分子クローニング、実験室マニュアル』、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、１９８９年に記載されている。
【００６０】
本発明の免疫原は、ミモトープなどの上記ペプチドを含むことができる。また本発明の免疫原としては、免疫学的交差活性誘導体、またはその断片が可能である。本発明の免疫原、ペプチド、ミモトープ、またはこれらの誘導体をコードする核酸の一部も本発明の一部を構成する。さらに、本発明の免疫原は、同じ免疫原内に、２種類以上のエピトープ、すなわちＰ１とＰ２を含むことができる。あるいはミモトープそのものが、２種類以上のエピトープを含むことができる。
【００６１】
したがって本発明により、（上で説明したように）本発明のエピトープまたはミモトープを含む新規なペプチドを用いてアレルギーを予防または治療するための薬理学的組成物の製造方法が提供される。本発明のミモトープまたはペプチドを含む免疫原と、キャリヤー分子も、アレルギーの免疫防御または治療のためのワクチンで使用するのに提供される。したがって、本発明のミモトープ、ペプチド、または免疫原は、医学と、アレルギー疾患の治療または予防において使用するのに提供される。従って、アレルギーを患っている患者またはアレルギーになりやすい患者に本発明のワクチンまたは薬を投与する操作を含むアレルギー治療法が提供される。
【００６２】
本発明のワクチンは、アジュバントも含んでいることが好ましい。本発明のワクチンにとって適切なアジュバントは、ＩｇＥペプチド免疫原に対する抗体応答を増大させることのできるアジュバントである。アジュバントは従来技術でよく知られている（『ワクチンの設計 − サブユニットとアジュバントのアプローチ』、１９９５年、薬理学のバイオテクノロジー、第６巻、パウエル， Ｍ．Ｆ．とニューマン， Ｍ．Ｊ．編、プレナム・プレス、ニューヨークとロンドン、ＩＳＢＮ ０−３０６−４４８６７−Ｘ）。本発明の免疫原とともに用いるのが好ましいアジュバントとしては、アルミニウム塩またはカルシウム塩（例えば水酸化物塩、リン酸塩）が挙げられる。他のアジュバントとしては、サポニン・アジュバントであるＱＳ２１（アメリカ合衆国特許第５，０５７，５４０号）と３Ｄ−ＭＰＬ（イギリス国第２２２０ ２１１号）がある。
【００６３】
本発明のワクチンは、一般に、開始用量と追加用量の投与がある。追加用量は、１回ごとの投与間隔を十分にあけるか、好ましくは、毎年投与するか、抗体の循環レベルが所望のレベルよりも下がった時期に投与することを想定している。追加用量は、元のキャリヤー分子が存在しないペプチドで構成されている可能性がある。このような追加投与物は、別のキャリヤーを含んでいてもよいし、まったくキャリヤーを含んでいなくてもよい。
【００６４】
本発明のさらに別の側面では、医学で使用される本明細書記載のワクチンが提供される。
【００６５】
本発明のワクチン調製物は、このワクチンを全身経路または粘膜経路を通じて投与することにより、アレルギーになりやすい哺乳類、またはアレルギーになっている哺乳類を保護または治療するのに用いることができる。投与法としては、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射、皮下注射、または、経口／消化器、呼吸器、泌尿生殖器といった経路の粘膜への投与が可能である。好ましい投与経路は経皮経路であり、例えば皮膚パッチによる。
【００６６】
１回のワクチン用量に含まれるタンパク質の量は、典型的なワクチンにおける重大なマイナスの副作用なしに免疫防御応答を誘導する量を選択する。そのような量は、どの特異的免疫原を用いるかと、どのようにその特異的免疫原を提示するかによって異なるであろう。一般に、１回の用量は、タンパク質を１〜１０００μｇ、好ましくは１〜５００μｇ、さらに好ましくは１〜１００μｇ、最も好ましくは１〜５０μｇ含むことになる。個々のワクチンの最適量は、被検対象内における適切な免疫応答を観察することを含め、標準的な研究によって確認する。被検対象は、最初のワクチンの後、１回ごとの投与間隔を十分にあけた１回〜数回の追加免疫処置を受ける可能性がある。
【００６７】
リガンドを含む上記の薬理学的組成物も、本発明の一側面を構成する。本発明により、医学におけるリガンドの使用法と、アレルギーを治療するための薬の製造におけるリガンドの使用法も提供される。
【００６８】
本発明のさまざまな側面は、診断でも利用することができる。例えば、本発明のさまざまなペプチドを認識する一群のリガンドは、患者から採取した血清中の抗ＩｇＥの力価を調べるのに用いることができる。さらに、ペプチドそのものは、循環する抗ＩｇＥをタイプ分けするのに用いることができる。ある種の状況では、例えばアトピー患者の体内を循環する抗ＩｇＥのレベルを調べることが適切であろう。すると、本発明のペプチドとポリクローナル／モノクローナル抗体を用いてアトピーの診断を行なうことができる。さらに、ペプチドを用いて、患者の血液から循環する抗ＩｇＥをアフィニティ除去した後、その血液を再びその患者に注入することができる。
【００６９】
免疫防御またはアレルギーの治療のため、ＩｇＥの構造についてのコンピュータ・モデルを用いてＩｇＥの表面露出ペプチドを同定する操作を含むペプチド免疫原同定法も本発明の一部を構成する。次にこれら領域を免疫原にして、医学で利用する。したがって、アレルギーの免疫防御と治療で用いるペプチドを同定する際にＰＴｍＡｂ０００５とＰＴｍＡｂ００１１を使用することは、本発明の一部を構成する。
【００７０】
ワクチン調製物は、全体像が、ヴォラー他編、『ワクチンの新しい潮流と展開』、ユニヴァーシティ・パーク・プレス、バルチモア、メリーランド州、アメリカ合衆国、１９７８年に記載されている。巨大分子に対するタンパク質の共役は、リカイトのアメリカ合衆国特許第４，３７２，９４５号と、アーモア他のアメリカ合衆国特許第４，４７４，７５７号に開示されている。
【００７１】
ＩｇＥのアミノ酸残基のナンバリング・システムは、ドリントン， Ｋ．Ｊ．とベンニッチ， Ｈ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ．、第４１巻、３−２５ページ、１９７８年；ベンニッチ， Ｈ．とバー−リンダストローム， Ｈ． フォン、Ｐｒｏｇ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１１巻、４９−５８ページ、１９７８年に記載されているシステムであることがしばしばある。しかし、その後ヒトＩｇＥの遺伝子およびｃＤＮＡ配列が決定された（マックス， Ｅ．Ｅ．他、Ｃｅｌｌ、第２９巻、６９１−６９９ページ、１９８２年；フラナガン， Ｊ．Ｇ．とラビッツ， Ｔ．Ｈ．、前掲文献、１９８２年；ケンテン， Ｊ．Ｈ．他、前掲文献、１９８２年）ことにより、余分なロイシンがＣε２内の２７３番目の位置（カバート・ナンバリング）にあることが明らかになった。このことは初期の文献には報告されていない。本発明で利用するナンバリング・システムは、したがって、ドリントン， Ｋ．Ｊ．とベンニッチ， Ｈ．によるものとは異なる可能性がある。
【００７２】
本発明を以下の実施例に基づいて説明するが、本発明がこれら実施例に限定されることはない。
【００７３】
第１部 本発明のミモトープと免疫原
実施例１．
１．１ 表面が露出したエピトープの同定、化学的共役、血清学的方法
ＩｇＥのＣε２ドメインの表面露出エピトープを、パドランとデイヴィス（Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第２３巻、１０６３−１０７５ページ、１９８６年）が記述しているヒトＩｇＥのモデル構造を用いて同定した。連続的なペプチドと溶媒にさらしたペプチドの両方を同定した。これは、分子シミュレーション・ソフトウエア（ＭＳＩ）を用いてＩｇＥの各アミノ酸の近づきやすさを計算し、近づくことが可能な表面を５残基移動ウインドウで平均し、その５マーの平均値が８０平方オングストロームよりも大きいＩｇＥペプチドの領域を同定することによって実現した。テスト結果を図１に示す。
【００７４】
結果
図１から、また１９９０年のヘルムらのモデル（ＰＤＢ（タンパク質データバンク、構造生物情報学のための共同研究所）に１９９０年１０月２日に提出された２ＩｇＥモデル構造）を利用して同じ方法を繰り返した結果から、ＩｇＥに対する抗体を作るための免疫原として使用できる多数の天然ペプチドが存在していることがわかる。
【００７５】
【表６】

【００７６】
これらペプチド、またはそのミモトープを合成し、それをキャリヤーと共役させるか、あるいはそれを肝炎コア抗体構造体にして、ウイルス様粒子を発現する組み換えペプチドを作る。
【００７７】
１．２ スクシンイミド−マレイミド交差リンカーを用いたＩｇＥペプチド／プロテインＤ複合体の合成
スクシンイミド−マレイミド交差リンカーを用いてプロテインＤをＩｇＥペプチドに直接共役させることにより、本発明の抗原を作ることができる。この化学反応を利用すると、スクシンイミド基の固定を通じてキャリヤー残基のＮＨ_２活性化を制御することが可能になる。マレイミド基はシステイン結合部位である。したがって、以下の実施例の目的を達成するためには、共役するはずのＩｇＥペプチドのＮ末端にシステインを付加する必要がある。
【００７８】
結合剤は選択的ヘテロ二機能性交差リンカーであり、その一端は、スクシンイミジルエステルによってタンパク質キャリヤーのアミノ基を活性化し、他端は、マレイミド基によってペプチドのスルフヒドリル基を結合させる。反応経路は以下の通りである。
【００７９】
ａ．リシンとスクシンイミジルエステルの反応によるタンパク質の活性化
【００８０】
【化１】

【００８１】
ｂ．マレイミド基との反応による、活性化したタンパク質とペプチド中のシステインの結合
【００８２】
【化２】

【００８３】
１．３ ＩｇＥペプチド−プロテインＤ複合体の調製
プロテインＤを、ｐＨが７．２で濃度が２．５ｍｇ／ｍｌのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に溶解させる。結合剤（Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル − ＧＭＢＳ）をＤＭＳＯの中に１０２．５ｍｇ／ｍｌの割合で溶かし、タンパク質溶液に添加する。割合としては、１ｍｇのプロテインＤにつき、ＧＭＢＳを１．０２５ｍｇ用いる。反応溶液を室温で１時間培養する。副産物を脱塩ステップで除去し、セファクリル２００ＨＲ透過ゲルの上に載せる。使用する溶離液は、ｐＨが６．８の０．１％リン酸緩衝溶液−トゥイーン８０（商標）である。活性化したタンパク質を回収し、貯蔵する。ペプチド（表１に記載のもの、あるいはその誘導体またはミモトープ）を４ｍｇ／ｍｌの割合で０．１Ｍの酢酸に溶かし、ジスルフィド結合が形成されないようにする。活性化した１分子のプロテインＤにつき２〜２０個のペプチドというモル比にして結合を行なわせる。ペプチド溶液をゆっくりとタンパク質に添加し、得られる混合物を２５℃で１時間培養する。結合中はｐＨを６．６に維持する。２５℃でｐＨを６．５にしてシステインを３０分間添加する（１ｍｇの活性化したプロテインＤにつき０．１ｍｇのシステインを、０．１Ｍの酢酸に４ｍｇ／ｍｌとなるように溶かす）ことにより停止ステップを実施する。１５０ｍＭのＮａＣｌ＋０．１％のトゥイーン８０に対して２回透析を行ない、過剰なシステインまたはペプチドを除去する。
【００８４】
最終ステップは、０．２２μｍの膜を使った滅菌濾過である。最終生成物は透明な濾過性溶液であり、それを４℃で保存する。ペプチド／プロテインＤの最終的な比は、アミノ酸分析によって測定する。
【００８５】
同様の方法で、本発明のペプチドを、ＢＳＡを含むキャリヤーと共役させることができる。
【００８６】
Ｐ１のミモトープが合成されてＣＬＥＤＧＱＶＭＤＶＤＬＬ（Ｐ１５、配列ＩＤ番号８）が得られた。これを、上記の方法を利用してプロテインＤとＢＳＡの両方に共役させた。
【００８７】
１．４ ＥＬＩＳＡ法
抗ペプチドＥＬＩＳＡまたは抗ペプチド・キャリヤーＥＬＩＳＡ
抗ペプチド免疫応答および抗キャリヤー免疫応答を、以下に概略を示すＥＬＩＳＡ法で調べた。マイクロタイター・プレート（ナンク社）を、２μｇ／ｍｌのストレプトアビジンを含むＰＢＳ（４℃、一晩）中にて特異的抗原でコーティングし（続いてビオチン化したペプチド（１μＭ）で３７℃にて１時間培養し）た。３×ＰＢＳ−０．１％のトゥイーン２０で洗浄する。３７℃で１時間にわたり、ＰＢＳ−１％のＢＳＡ−０．１％のトゥイーン２０（飽和緩衝溶液）でプレートを飽和させる。添加その１として、抗体＝（飽和緩衝溶液中に）２ステップで希釈した血清を添加し、３７℃で１時間３０分培養する。３×ＰＢＳ−０．１％のトゥイーン２０で洗浄する。添加その２として、ＨＲＰと結合した抗マウスＩｇ（または抗マウス・アイソタイプ特異的モノクローナル抗体）を添加する。３７℃で１時間培養する。５×ＰＢＳ−０．１％のトゥイーン２０で洗浄する。暗所で室温にて１０分間ＴＭＢ（バイオラド社）を用いることにより、見えなかったものを見えるようにする。０．４ＮのＨ_２ＳＯ_４を用いて反応を止める。
【００８８】
マウス血清における抗ヒトＩｇＥの反応性の検出方法（ＩｇＥプレート結合ＥＬＩＳＡ）
ｐＨが９．６のカルボン酸塩／ジカルボン酸塩コーティング用緩衝溶液の中で、３７℃で１時間、または４℃で一晩かけて、ＥＬＩＳＡプレートを、１μｇ／ｍｌのヒトのキメラＩｇＥでコーティングする。５％ｗ／ｖのマーヴェル粉ミルクを含むＰＢＳ／０．０５％のトゥイーン２０を用い、３７℃で１時間かけて非特異的結合部位をブロックする。ＰＢＳ／０．０５％のトゥイーン２０／１％ｗ／ｖのＢＳＡ／４％のウシ胎仔血清の中でさまざまな濃度に順次希釈したマウス血清を３７℃で１時間にわたって添加する。ポリクローナル血清の結合をヤギ抗マウスＩｇＧ−ビオチン（１／２０００）で検出し、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰ（１／１０００）で検出する。共役した抗体を、ＴＭＢ基質を用いて４５０ｎｍで検出する。ＰＴｍＡｂ００１１の標準曲線をそれぞれのプレートに含めておき、血清サンプル中の抗ＩｇＥの活性をμｇ／ｍｌの単位で計算できるようにする。
【００８９】
マウス血清中で抗ヒト受容体と結合したＩｇＥの活性の検出方法
ｐＨが９．６のカルボン酸塩／ジカルボン酸塩コーティング緩衝溶液の中で、３７℃で１時間、または４℃で一晩かけて、ＥＬＩＳＡプレートを、０．５μｇ／ｍｌの組み換えヒトＦｃεＲ１αでコーティングする。５％ｗ／ｖのマーヴェル粉ミルクを含むＰＢＳ／０．０５％のトゥイーン２０を用い、３７℃で１時間かけて非特異的結合部位をブロックする。次に、１μｇ／ｍｌのヒトＩｇＥを３７℃で１時間にわたって添加する。次に、ＰＢＳ／０．０５％のトゥイーン２０／１％ｗ／ｖのＢＳＡ／４％のウシ胎仔血清の中でさまざまな濃度に順次希釈したマウス血清を３７℃で１時間にわたって添加する。ポリクローナル血清の結合をヤギ抗マウスＩｇＧ−ビオチン（１／２０００）で検出し、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰ（１／１０００）で検出する。共役した抗体を、ＴＭＢ基質を用いて４５０ｎｍで検出する。ＰＴｍＡｂ００１１の標準曲線をそれぞれのプレートに含めておき、血清サンプル中の抗ＩｇＥの活性をμｇ／ｍｌの単位で計算できるようにする。
【００９０】
ミモトープ・ペプチド、可溶性ＩｇＥ、またはＰＴｍＡｂ００１１がＩｇＥと結合する際の競合
あらかじめブロックしたポリスチレン製９６ウエル・プレートの中で、マウスのポリクローナル血清の１種類の希釈液を、１種類の濃度のミモトープ・ペプチド、またはヒトＩｇＥと混合する。この混合物を３７℃で１時間培養し、次に、ＩｇＥでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに３７℃で１時間かけて添加する。ポリクローナル血清の結合をヤギ抗マウスＩｇＧ−ビオチン（１／２０００）で検出し、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰ（１／１０００）で検出する。共役した抗体を、ＴＭＢ基質を用いて４５０ｎｍで検出する。血清とＰＴｍＡｂ００１１がＩｇＥとの結合において競合するようにするため、血清とＰＴｍＡｂ００１１−ビオチンの混合物を、ＩｇＥでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに添加する。ＰＴｍＡｂ００１１の結合を、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（１／１０００）で検出する。
【００９１】
１．５ ヒト好塩基球アッセイ
ヒト好塩基球（ＨＢＡ）を用いて２種類のアッセイを行なった。１つは、モノクローナル抗体のアナフィラキシー誘発性を調べるためであり、単離したＰＢＭＣに抗体を添加する操作を行なう。もう１つは、あらかじめＨＢＡを培養し、ＬｏｌＰＩ（強力なアレルゲン）によって引き起こされるヒスタミン放出をモノクローナル抗体が抑制することを測定するためである。
【００９２】
アレルギーのドナーから静脈穿刺によって血液を回収し、０．１容積の２．７％ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）を収容したチューブに入れる。次にこの血液を、０．１％ヒト血清アルブミン（ＨＢＨ／ＨＳＡ）を含む等容積のＨＢＨ溶媒を用いて１／２に希釈する。得られる細胞分散液を、５０容積％フィコール−パックの上に層をなすようにして載せ、４００ｇで室温にて３０分間遠心分離する。境界面の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）層を回収し、ペレットを廃棄する。細胞をＨＢＨ／ＨＳＡの中で１回洗浄し、数を数え、細胞密度が１ｍｌにつき２．０×１０^６個となるようにしてＨＢＨ／ＨＳＡの中に再び分散させる。この細胞分散液１００μｌを、希釈した試験サンプルまたはモノクローナル抗体を１００μｌ含むＶ底の９６ウエル・プレートに添加する。それぞれの試験サンプルをさまざまな希釈度でテストするが、テストは、各希釈度について６つのウエルで行なう。ウエルの内容物をプレート撹拌装置を用いて軽く混合してから、１２０ｒｐｍの撹拌速度で３７℃にて３０分間培養する。
【００９３】
各血清希釈物につき、３つのウエルにはＬｏｌＰＩ抽出物を１０μｌ添加し（最終希釈度１／１００００）てトリガーとし、３つのウエルにはアナフィラキシー誘発性を調べるためにＨＢＨ／ＨＳＡを１０μｌ添加する。ウエルの内容物を再びプレート撹拌装置を用いて混合してから、１２０ｒｐｍの撹拌速度で３７℃にてさらに３０分間培養する。培養を終えてから、５００ｇで５分間遠心分離する。上澄みを除去し、市販されているヒスタミンＥＩＡ測定キット（イムノテック社）を用いてヒスタミン・アッセイを行なう。試験サンプルを含まない対照のウエルをルーチン作業に含め、自発的放出とトリガーによる放出を調べる。細胞と０．０５％のイゲパル洗浄剤を含むウエルもルーチン作業に含め、細胞の全ヒスタミンを調べる。
【００９４】
結果は以下のように表記する。
【００９５】
アナフィラキシー誘発アッセイ
試験サンプルに起因するヒスタミン放出＝（試験サンプルで処理した細胞から放出されたヒスタミンの％）−（自発的なヒスタミン放出の％）。
【００９６】
遮断アッセイ
ヒスタミン放出の抑制度は、以下の式を用いて計算することができる：
抑制％＝［１−（試験サンプルで処理した細胞から放出されたヒスタミン＊）／（抗原で刺激した細胞から放出されたヒスタミン＊）×１００］。
＊自発的放出が補正された数値。
【００９７】
実施例２．Ｐ１５複合体（Ｐ１５−ＢＳＡまたはＰ１５−ＰＤ）を用いてマウスを免疫処置することによって抗ヒトＩｇＥ抗体の産生が誘導される
１．４に記載したミモトープＰ１５（２５μｇタンパク質／用量）を含む複合体を、ＷＯ９５／１７２１０に記載されているＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬを含む水中油乳剤をアジュバントとして、１０匹のＢａｌｂＣマウスからなる複数のグループに投与した。追加投与は、２１日目と４２日目に行ない、血清は４２日目と５６日目に回収することができる。抗ペプチドと抗プレートが結合したＩｇＥに対する免疫応答は、実施例１に記載した方法で調べた。
【００９８】
結果
３回目のワクチン接種から１４日目に測定した抗ペプチド応答と抗ＩｇＥ応答の結果を表２に示す。
【００９９】
【表７】

【０１００】
実施例３．複合体で免疫処置した後にマウスに誘導される抗ＩｇＥはアナフィラキシー非誘発性である
複合体で免疫処置したマウスからの完全血清またはそのマウスから精製したＩｇＧについての何種類かの希釈液は、アレルギー患者から採取したばかりの末梢血に由来する好塩基球の存在下でテストすることができる。
【０１０１】
アナフィラキシー誘発性は、以下に説明するように、テストする抗体によって放出が誘導されたヒスタミンを測定することによって評価できる。
【０１０２】
・赤血球をグルコース・デキストラン勾配の上で末梢血から除去する。
【０１０３】
・細胞を洗浄し、テストするサンプル（例えばアレルゲン、抗体、アレルゲン＋抗体など）でコーティングする。
【０１０４】
・培養の後、上澄みを回収し、ヒスタミンの放出を製造者の指示に従って測定する（イムノテック社、ヒスタミン酵素イムノアッセイ・キット）。
【０１０５】
Ｐ１５−ＢＳＡまたはＰ１５−ＰＤとともに生成したどの抗血清もアナフィラキシー誘発性ではなかった。
【０１０６】
実施例４．複合体で免疫処置した後にマウスに誘導される抗ＩｇＥは、アレルゲンがアレルギー患者からの好塩基球に働きかけることで誘導される、ＩｇＥを媒介としたヒスタミン放出を阻止することができる
ヒスタミンの放出は、複合体で免疫処置したマウスからの完全血清またはそのマウスから精製したＩｇＧについての何種類かの希釈液の存在下または不在下で、何種類かの濃度のアレルゲンを用いてトリガーした好塩基球サンプルにおいて測定することができる。抗血清中の抗Ｐ１５抗体の阻止活性は、アレルゲンによって誘導されたヒスタミン放出の抑制を測定することによって評価した。ヒスタミンの放出と抑制は、実施例３に記載したようにして測定した。Ｐ１５はＰ１のミモトープであるため、ＰＴｍＡｂ００１１を対照として用いた。というのも、ＰＴｍＡｂ００１１は同じエピトープ（Ｐ１）に結合することがわかっているからである。結果を表３に示す。
【０１０７】
【表８】

【０１０８】
実施例５．Ｐ２とＰ３のミモトープの免疫原性
実施例１．２に記載した方法を用いて以下のミモトープをＢＳＡと共役させ、実施例２に記載したのと同じ処方およびスケジュールに従って、その複合体を用いてマウスを免疫処置した。
【０１０９】
【表９】

【０１１０】
最後に免疫処置した後にマウスから採血し、ＩｇＥプレートが結合したＥＬＩＳＡの中の抗ＩｇＥ活性をテストした。個々の結果、結果の平均（Ａｖ）、幾何平均（ＧＭ）を以下の表にまとめてある（ＳＤ＝標準偏差）。
【０１１１】
【表１０】

【０１１２】
実施例６．Ｐ１のミモトープの製造と、その免疫原性／機能活性
６．１ 免疫原の製造
Ｐ１のミモトープは、ファージ提示法、またはＩｇＥのＣε２ドメインのＣ−Ｄループの分子モデリングによる合理的設計のいずれかによって得られたものであった。以下のペプチドを合成し、ＢＳＡ−ペプチド複合体とＨｅｐＢコア−抗原組み換え構造体の両方を作った。
【０１１３】
【表１１】

【０１１４】
ペプチド／タンパク質キャリヤー構造体を以下のようにして製造した。アシルヒドラジン・ペプチド誘導体を化学合成経路１（図２）に示したようにして固相上で調製した。このペプチド誘導体は、ポリアミドまたはポリエチレングリコール−ポリスチレン（ＰＥＧ−ＰＳ）の支持体を用いる周知の“Ｆｍｏｃ”法を利用し、完全に自動化された装置内で従来技術で周知の技術により、容易に調製することができる（固相合成のための技術と方法は、ＩＲＬによってオックスフォード大学出版から発行されたＥ． アサートンとＲ．Ｃ． シェパード著、『固相ペプチド合成：実践的方法』、１９８９年に記載されている）。酸を媒介とした開裂により、直線状で、保護されておらず、修飾されたペプチドが得られた。このペプチドは容易に酸化する。このペプチドを精製することにより、ジスルフィド結合によって修飾されたエピトープを得ることができよう。なお修飾には、『分子生物学におけるいろいろな方法』、第５巻：『ペプチド合成のプロトコル』（Ｍ．Ｗ． ペンニントンとＢ．Ｍ． ダン編）の中で、Ｄ． アンドローが書いた第７章、９１−１７１ページに概略が記載されている方法を用いる。
【０１１５】
このようにして合成されたペプチドは、次に、以下の方法を用いてタンパク質キャリヤー（ここではウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））と共役させることができる。
【０１１６】
６．２ 修飾されたキャリヤーの合成
アリールアルデヒド基の導入には、化学合成経路２（図３。詳細についてはＷＯ９８／１７６２８を参照のこと）に示したようにして調製したスクシンイミド活性エステル（ＢＡＬ−ＯＳｕ）を用いた。ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）のアミノ基を約５０％置換すると、修飾された可溶性タンパク質が常に得られた。ＢＳＡをさらに置換すると、溶けない構造体が得られた。同じモル数のＢＳＡとＢＡＬ−ＯＳｕをＤＭＳＯ／緩衝溶液の中で２時間混合した（化学合成経路３、図３を参照）。自由なアミノ基を探すフルオレスカミン・テストによって判定したところ、実験的に得られたこのプロトコルにより、ＢＳＡが約５０％置換された。
【０１１７】
６．３ ペプチド−ＢＳＡ構造体
修飾されたペプチドと誘導体化したＢＳＡを単純に組み合わせることにより、透析によって容易に単離することのできるペプチド−ＢＳＡ構造体が得られた（化学合成経路４、図４）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分子量の増加を確認した。
【０１１８】
６．４ 肝炎コア抗原構造体
ＥＰ ０ ４２１ ６３５Ｂに記載されている分子生物学の方法を用いて肝炎コア抗原組み換え構造体（ＨＢＣ）も調製した。ＨＢＣの実験において、ＰＴ１０７９を修飾し、末端のリシンを除去した。
【０１１９】
【表１２】

【０１２０】
ＰＴｍＡｂ０００５とＰＴｍＡｂ００１１を用いたＢＩＡコア実験により、Ｐ１−ミモトープ・ペプチドの発現を確認した。免疫原性は、ＨＢＣをほんの３μｇ／用量を投与するだけで生じた。
【０１２１】
６．５ 免疫原性の研究
ミモトープ／ＨＢＣ構造体とミモトープ／ＢＳＡ構造体を精製してワクチンにするとともに、ＷＯ９５／１７２１０に記載されているＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬを含む水中油乳剤をアジュバントとして使用した（２５μｇのＢＳＡ複合体／用量）。このワクチンを１０匹のＢａｌｂＣマウスからなる複数のグループに投与した。追加投与は、１４日目と２８日目に行ない、血清は４２日目に回収した。抗プレートに結合したＩｇＥと受容体指向性ＩｇＥに対する免疫応答は、実施例１．４に記載した方法で調べた。また、アレルギー性好塩基球からのヒスタミン放出抑制における抗血清の活性は、実施例１．５に記載した方法で測定した。
【０１２２】
６．６ 結果
ＢＳＡ構造体とＨＢＣ構造体はすべて、ＩｇＥが直接ＥＬＩＳＡプレートに結合したときと、高アフィニティ・レポーターのほうを向いたときに、高力価の抗ＩｇＥ抗体を誘導した。さらに、これら応答はすべて、自由なＩｇＥとミモトープそのものが競合し、非特異的ペプチドによっては競合しないという点で特異的であることが確認された。これら免疫原によって誘導される抗ＩｇＥは、アレルギーのドナー（ライムギ、ＬｏｌＰ１）に由来するヒト好塩基球からのヒスタミン放出を抑制することができる。
【０１２３】
Ｃ６７−８の結果については、図５、図６、図１３、図１５を参照のこと。ＰＴ１０７８の結果については、図９、図１０、図１４、図１５を参照のこと。ＰＴ１０７９の結果については、図７、図８、図１４、図１５を参照のこと。ＰＴ１０７９ｇｓの結果については、図１１、図１２、図１５を参照のこと。
【０１２４】
さらに、これらペプチド・ミモトープによって生じた免疫応答は、アナフィラキシー誘発性ではなかった。
【０１２５】
【表１３】

【０１２６】
第２部 本発明のエピトープおよびミモトープと結合するリガンド
ペプチド免疫原について第１部で説明した。ペプチド免疫原は、ワクチンの形態で哺乳類に投与すると、免疫応答を引き起こす。この免疫応答により、（ａ）ＩｇＥを認識し、（ｂ）インビトロでヒスタミン放出を抑制することができる。第２部では、本発明のエピトープまたはミモトープと結合することのできるリガンドと、その機能について説明する。ＩｇＥのＣε２のＣ−Ｄループを認識するＰＴｍＡｂ０００５とＰＴｍＡｂ００１１という２種類のモノクローナル抗体が同定されている。このペプチドのミモトープは、第１部において、免疫原性があり、活性ワクチン接種において機能を発揮することが示された。このセクションでは、これらモノクローナル抗体のキャラクテリゼーションについて説明し、これらモノクローナル抗体が受動的ワクチン接種において有効である証拠を示す。
【０１２７】
抗体の標的となるエピトープは、ファージ選別法を用いて、すなわち複数のバクテリオファージ標的の配列アラインメントを用いて同定し、それに続けてドメイン・マッピングと位置指定突然変異誘発によってその同定結果を洗練し、確認した。抗体の機能活性は、インビトロにおける抗ＩｇＥの認識とアレルギー・メディエーターの放出抑制を調べるだけでなく、サルにおけるインビボでの受動的皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）研究によっても確認した。
【０１２８】
実施例７
７．１ モノクローナル抗体標的のファージマッピング
ファージｇＶＩＩＩｐのＮ末端にＸＣＸ_１５、ＸＣＸ_１０またはＸＡＸ_１０ペプチド配列（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を表示する３つの異なるファージライブラリーを用いてモノクローナル抗体の結合部位をマッピングするために、ファージ表示ライブラリーを用いた。表６および７は、それぞれ抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体ＰＴｍＡｂ０００５を有するペプチド配列に関する選択の結果を示す。ペプチドおよびヒトＩｇＥ間のアミノ酸パターン類似性は、ＩｇＥのＣε２ドメイン中のｃ−ｄループとの強力な相同適合を明示する。ファージ回復から生成される相同パターンは、Ｑｈｈａｈａｈ（ここで、ｈ＝疎水性アミノ酸およびａ＝アミノ酸）であり、これは、ヒトＩｇＥ Ｃε２ドメインのＣ−Ｄループ中の配列ＱＶＭＤＶＤＬ（配列番号１７）と一列に整列した。
【０１２９】
ファージパニング実験から得られ、ＰＴｍＡｂ０００５に対して最高アフィニティーを有するペプチドであるＩｇＥＣ６７も、エピトープマッピングした。これは、ＰＣＲ突然変異誘発により無作為突然変異を誘導し、小繊維状ファージタンパク質ｇＩＩＩｐ表示に関してヒューズ５ベクター中でサブクローニングすることにより実施した。ＩｇＥＣ６７突然変異体を、表８に示したようにＰＴｍＡｂ０００５との結合の順に等級付けした。これらのならびにその他の結果は、Ｃε２エピトープと整列したＩｇＥＣ６７内のアミノ酸の重要性を確証した。例えば、Ｌ８Ｐ、Ｄ１０Ｇ、Ｌ１１Ｍ、Ｅ１２ＧおよびＬ１３Ｒ突然変異体はすべて、抗ＩｇＥ ＰＴｍＡｂ０００５との結合を低減した（データは示されていない）。その他の部位における突然変異は、ＰＴｍＡｂ０００５に対するアフィニティーにほとんど影響を及ぼさなかった。
【０１３０】
最高アフィニティーＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１ファージ表示由来ペプチドから無作為サブライブラリーを作製して、前に記載された方法（Ｙｕ， Ｊ． ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｇ．Ｐ．（１９９６）“Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄｓ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２６７， ３−２７）を適応することにより、抗体に対するペプチドのアフィニティーを強化した。これは、無作為ＰＣＴ工程による大コートタンパク質（ｇＶＩＩＩｐ）繊維状ファージ表示ベクターから低コピー数小ファージコートタンパク質（ｇＩＩＩｐ）表示ベクターへのＤＮＡサブクローニング転移を包含する。サブライブラリーは、最高アフィニティーＰＴｍＡｂ０００５配位子ＩｇＥＣ６７およびＩｇＥＣ６７−８を含めたいくつかのファージ配列から作製される。Ｃ６７およびＣ６７−８に対するアフィニティー成熟化配列を、それぞれ表８および９に示す。表に含まれるのは、等級順位、それに利用可能な場合にはＢＩＡコアアフィニティーもである。ペプチド発現ファージが免疫原として用いられる場合には、ＩｇＥＣ６７−８は、マウスにおける抗ヒトＩｇＥ応答を誘導可能である。
【０１３１】
７．２ ドメインマッピングによる標的の確証
ＩｇＥ定常ドメインに関してＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１の結合特異性をマッピングするために、多数の構築物を生成した。以下の構築物を生成した：Ｃε２−４、Ｃε２−３、Ｃε３−４、Ｃε３−４Ｌ（Ｃε３−４＋ドメインＣε２およびＣε３間のリンカー配列）およびＣε２単独。
【０１３２】
ヒトＩｇＥ Ｆｅの種々のドメイン（単数または複数）を包含する断片を、キメラヒトＩｇＥを発現するハイブリドーマ株ＪＷ８／５／１３から得られるｃＤＮＡを用いてクローニングした（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， ＭＳ ｅｔ ａｌ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４， ２６８−２７０； Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ， Ｍ ｅｔ ａｌ（１９８７）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６， １３５１−６１）。適切なプライマー対およびＪＷ／８／５／３ｃＤＮＡを鋳型として用いて、ＩｇＥ Ｆｅ断片を増幅した。ｃε２−４断片は、アミノ酸（ａａ）Ｓ２２５−Ｋ５４７をコードする。ｃε３−４断片は、ａａＧ３３５−５４７をコードする。ｃε３−４Ｌ断片（ドメイン３−４＋ｃε２をｃε３に連結するリンカー配列）は、ａａＥ３２２−Ｋ５４７をコードする。ｃε２−３断片は、ａａＳ２２５−Ｇ４３６をコードする。ｃε２断片は、ａａＳ２２５−Ｓ３２４をコードする。構築物はすべて、検出および精製目的のためのＣＯＯＨ末端ヘキサヒスチジン尾を含有する。発現断片の分泌を指図するためにＣＤ３３由来リーダーコード配列を有する枠内で真核生物発現ベクター中でこれらの断片をクローニングした。これは、哺乳類細胞株中での発現を可能にした。ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から得た。クローン化断片を発現するために、適切なクローンをＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクトして、その結果生じた状態調節化培地をトランスフェクションの４８〜６０時間後に収穫した。
【０１３３】
ＥＬＩＳＡ検定により、ＥＬＩＳＡプレートに構築物を結合し、その後モノクローナル抗体を用いたインキュベーション、ならびに抗マウス抗体による暴露により、発現化ＩｇＥドメインとのＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１の結合を検査した。さらに、変性構築物との結合を、ウエスタンブロットの周知の技法により検査した。
【０１３４】
ＰＴｍＡｂ０００５に関する結果は、それらのネイティブ形態でのＣε２−４、Ｃε２−３およびＣε２−との強い結合を示し、ウエスタンブロットにおける変性後も、Ｃε２−４およびＣε２と結合した。Ｃε３−４またはＣε３−４Ｌとの結合は、いずれの検定においても観察されなかった。
【０１３５】
ＰＴｍＡｂ００１１は、それらのネイティブ形態でＣε２−４、Ｃε２−３およびＣε２とも結合し、さらにそれらの変性形態でＣε２−４およびＣε２と結合した。
【０１３６】
したがって、抗体が、ＩｇＥのＣε２ドメイン中に存在する標的エピトープを認識したことは明らかである。
【０１３７】
７．３ 特定部位の突然変異誘発による標的の確証
ドメインマッピング試験は、両ｍＡｂがＣε２ドメイン単独と結合し得る、ということを実証した。ファージ表示化ペプチドライブラリーのバイオパニングから得られた配列の分析は、ＰＴｍＡｂ０００５由来配列がＰ１との顕著な類似性を示すことを明示した。この領域は、ＩｇＥモデル構造におけるＣε２のＣ−Ｄβ鎖間にループを形成する。特定部位の突然変異誘発試験に着手して、ＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１に関するエピトープとしてこの配列を有効なものにした。
【０１３８】
パネルファージ配列の分析およびＩｇＥモデル構造（Ｈｅｌｍ ｅｔ ａｌ １９９０，上記）とヒトＩｇＧ１Ｆｃの既知の構造（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｆｅｒ， Ｊ．， １９８１， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０， ２３６１−２３７０）との比較により、抗体認識に関与すると思われる３つの残基の同定がなされた。これらの残基は、グルタミン（Ｑ）２７３、メチオニン（Ｍ）２７５およびアスパラギン酸（Ｄ）２７６である。これらを各々、アラニン（Ａ）および以下に示すような少なくとも１つのその他のアミノ酸残基に変えた。
【０１３９】
Ｑ２７３：ＡおよびＥ（グルタミン酸）
Ｍ２７５：ＱおよびＫ（リシン）
Ｄ２７６：ＡおよびＮ（アスパラギン）
アラニン突然変異は、標的残基の構造および化学的性質をともに変えたが、一方、多の突然変異は構造を保持し（できるだけ近く）、しかし例えばＱ２７３Ｅを変えた。ここで、グルタミン酸は、本質的にはグルタミンと同一構造を有するが、しかし中性の代わりに負に荷電する。
【０１４０】
Ｃε２−４構築物中で、各突然変異を別々に生成した。各突然変異体ポリペプチドを野生型（ＷＴ）Ｃε２−４と同様レベルに発現させ、ＥＬＩＳＡベースの検定において、ＷＴｃε２−４と同様に効率的に、各々を組換え体ＦｃεＲ１αエクトドメインに結合させ得た。同時に、これらのデータは、突然変異は発現系におけるポリペプチドの生成／分泌に影響を及ぼさないが、ｃε２−４断片の構造に相対的に影響を及ぼさないということを実証した。
【０１４１】
突然変異はすべて、ＰＴｍＡｂ０００５との結合を〜５０％だけ低減するＤ２７６Ｎ以外は、本質的にはＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１の両方と結合することを阻害する（表１０）。Ｃε２内の代替的グルタミン残基、Ｑ３１７の突然変異は、これらの実験における対照として作用するよう実行した。Ｑ３１７ＥおよびＱ３１７Ｋ突然変異体を生成し、Ｃε２−４を認識するＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１の能力に影響を及ぼさないことを見出した。同様に、ＦｃεＲ１αの認識にも影響を及ぼさなかった。
【０１４２】
したがって、ＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１の結合活性は、Ｃε２のＣ−Ｄループ内の突然変異により特異的に影響される。
【０１４３】
要するに、配列Ｐ１は、ＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１の両方に関する主要結合決定基を含む。
【０１４４】
【表１４】

【０１４５】
７．４ ＩｇＥ Ｃε２のＣ−Ｄループの精製モデル作製
ヒトＩｇＥの正確な構造はまだ確定されていない（モデルは利用可能であるが）ので、詳細なレベルでの検査後には、このモデル構造に誤差が存在すると思われる。したがって本発明は、ヒトＩｇＧ１のＣγ２の等価領域でのこのループのマッピングにより、ＩｇＥのＣε２ループ領域のこのモデルを精製した（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｆｅｒ Ｊ １９８１上記）。
【０１４６】
構造的特徴の境界についてのこの新しい情報から、合成した場合に全ＩｇＥ分子の情況においてＣε２のＣ−Ｄループのものと非常によく似た配座を適応すべきである環化ペプチドを設計した。このペプチド、Ａｃ−ＣＬＥＤＧＶＱＭＤＶＤＬＣＰＲＥＡＡＥＧＤＫ（Ａｃ）−ＮＨ_２を、ＰＴ１０７９（配列番号１４）と名付けた。
【０１４７】
ＢＩＡｃｏｒｅ技法を用いてＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１の両方に対するＰＴ１０７９のアフィニティーを測定し、これらのモノクローナル抗体の両方に対する非常に強い認識（それぞれ〜２０ ｎＭおよび〜２５０ ｎＭの見掛けのアフィニティーでＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１の両方により認識される）を示すことを見出した。環化のＶが１つのアミノ酸残基のみによりシフト去れ、それにより１つのアミノ酸残基だけ環化部位間のペプチドの長さを減少する対照であるＰＴ１０７９の誘導体ペプチド（ＰＴ１０７８）は、ＰＴｍＡｂ０００５またはＰＴｍＡｂ００１１とのペプチドの結合を低減した。さらに、ループ領域がＰＴ１０７９と同数の残基を有するようさらに別の残基が付加されるようにＰＴ１０７８を修飾したが、しかしながら、この修飾はＰＴｍＡｂ０００５またはＰＴｍＡｂ００１１との結合を修復できなかった。したがって、全ＩｇＥ分子の情況においてネイティブ標的と非常によく似た形状に適応するよう本発明のペプチドの表示を修正することの重要性を示している。
【０１４８】
【化３】

【０１４９】
要約
ここで説明した作業は、モノクローナル抗体ＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１がＰ１を特異的に認識することを示す。これらの抗体は、高アフィニティーでモノクローナル抗体により認識されるＩｇＥのＣε２ドメインのｃ−ｄループのミモトープを同定するために、ファージ表示試験に用いられてきた。
【０１５０】
７．５ ＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１の特徴の機能的特徴
以下の実験は、ＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１の機能的特徴を記載する。したがって、これらの抗体の標的の使用は、ＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１様免疫応答を誘導する。したがって、これらのペプチドベースの免疫原を用いたワクチン接種は、同一機能特徴を有する。
【０１５１】
実施例８
８．１ 材料および方法
８．１．１ ＦｃεＲＩα結合検定（プロテインＡプレート）
この検定では、ＩｇＥに対する高アフィニティー受容体のα鎖のエクトドメイン（αエクトドメイン）の組換え体形態を用いて、キメラＩｇＥを結合する。αエクトドメインのカルボキシル末端を人ＩｇＧ１Ｆｃ配列と融合させる。これは、組換え体分子をＦｃ領域を介してプロテインＡ被覆微小滴定プレートに結合させる。それゆえ、大多数のαエクトドメイン分子は結合配位子に対して利用可能であるべきであり、そしてＩｇＥ−受容体相互作用の分析のための系を提供する。以下に記載するフォーマットは、抗ＩｇＥ抗体の（高アフィニティー）受容体遮断活性の検出を目的とする。
【０１５２】
８．１．２ 高アフィニティー受容体のα鎖エクトドメインとのＩｇＥの結合の検出のためのＥＬＩＳＡプロトコール
遮断緩衝液（ＰＢＳ／５％ＢＳＡ／０．０５％トゥイーン２０）中で０．２５μｇ／ｍｌに稀釈した１００μｌ／ウエルのα−エクト−Ｉｇ融合タンパク質でプロテインＡプレートを被覆する。３７℃で１時間インキュベートする。キメラＩｇＥを１０％ブタ血清中で０．０３１２５μｇ／ｍｌに稀釈する。このＩｇＥ溶液中で抗ＩｇＥ抗体を適切な試験濃度（単数または複数）に稀釈する。室温で１時間インキュベートする。プレート洗浄機を用いて、ＰＢＳ／０．０５％トゥイーン２０で３回、プレートを洗浄する。１００μｌ／ウエルのＩｇＥ：抗ＩｇＥ溶液（各抗ＩｇＥ濃度を４回検定する）を付加する。３７℃で１時間インキュベートする。プレート洗浄機を用いて、ＰＢＳ／０．０５％トゥイーン２０で３回、プレートを洗浄する。遮断溶液中で１：６０００稀釈溶液に稀釈した１００μｌ／ウエルのヤギ抗マウスλ鎖ＨＲＰＯ複合抗体を付加する。３７℃で１時間インキュベートする。プレート洗浄機を用いて、ＰＢＳ／０．０５％トゥイーン２０で３回、プレートを洗浄する。２００μｌ／ウエルのＯＰＤ基質を付加し、暗所で室温で２〜１０分間インキュベートする。２５μｌの２５％Ｈ_２ＳＯ_４の付加により反応を停止する。プレート振盪機−ＳＬＯＷ速で停止反応物を混合する。４９０ ｎｍでＯＤを読み取る。
【０１５３】
ＩｇＥのその受容体との結合の抑制％に関する数値を算定し得る。１０％ブタ血清単独中にＩｇＥを含有した（即ち、非抗ＩｇＥ）一組のウエルの平均から、ＩｇＥに関する最大結合値を確定する。
【０１５４】
したがって、％抑制値は、以下のように算定される：
（最大ＩｇＥ値−抗ＩｇＥ複製物の平均値）／最大ＩｇＥ値ｘ１００
８．１．３ ＦｃεＲＩα結合検定（縮小エクトドメイン）
本検定は、本質的には前検定と同一であるが、但し、ＦｃεＲＩαエクトドメイン／ＩｇＧ構築物をタンパク質分解酵素Ｘ因子で処理して、２つの部分を開裂する。プロテインＡビーズを用いてＩｇＧ Ｆｃ部分を除去し、ストレプタビジンビーズを用いてＸ因子を除去し、したがって、本質的純粋α鎖エクトドメイン生成物を残す。この検定フォーマットでは、αエクトドメインはプラスチック微小滴定プレートに結合される。その他の検定詳細はすべて、前記の党利である。
【０１５５】
８．１．４ ＣＤ２３−結合検定（ＦｃεＲＩＩ、低アフィニティー受容体）
ＲＰＭＩ８８６６細胞または一次ヒトＢ細胞で、本検定を実施した。２つのフォーマットを用い得る：即ち、ＦｃεＲＩＩと会合したＩｇＥと結合するｍＡｂの検出のためのものと、ｍＡｂがＦｃεＲＩＩと会合するＩｇＥを妨害するか否かを分析する第二のものであった。最初の検定に関しては、ＰＢＳ、１％ＦＢＳ、０．１％ＮａＮ_３中で氷上で１時間、キメラＩｇＥ（１μｇ／ｍｌ）を細胞に負荷した。余分量のＩｇＥを除去し、抗ＩｇＥｍＡｂを付加した。ＦＩＴＣ複合化ラット抗マウスＩｇＧ_１抗体で結合ｍＡｂを明らかにした。第二検定に関しては、細胞に付加する前に、静かに混合しながら室温で１時間、抗ＩｇＥｍＡｂとともにキメラＩｇＥ（１μｇ／ｍｌ）を予備インキュベートした。混合物を細胞とともに氷上で１時間インキュベートし、次に洗浄して非結合ＩｇＥを除去した。ＦＩＴＣ−ヤギ抗ヒトＩｇＥで結合ＩｇＥを検出し、あるいはＦＩＴＣ−複合化ラット抗マウスＩｇＧ_１抗体で結合抗ＩｇＥｍＡｂを検出した。ＰＢＭＣで試験を実施した場合、ＰＥ−複合化抗ＣＤ１９抗体により構成Ｂ細胞を同定した。フローサイトメトリーにより、試料を分析した。
【０１５６】
８．２ 結果
ＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１に関する結果を、図１６〜２１に示す。図１６は、プレート結合ＩｇＥとのモノクローナル抗体の濃度依存性結合を示す。図１７は、ＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１によるＦｃεＲ１α／ＩｇＧ構築物と結合するＩｇＥの濃度依存性抑制を示す。図１８は、抗体ＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１による、プラスチックプレートに直接結合されたＦｃεＲＩαの縮小エクトドメインに結合するＩｇＥの抑制を示す。図１９は、抗体ＰＴｍＡｂ０００５（クローンＧＥ−１）およびＰＴｍＡｂ００１１によるＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）と結合するＩｇＥの抑制の欠如を示す。図２０および２１は、抗体ＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１によるアレルギー性ヒト血中好塩基球からのヒスタミン放出の濃度依存性遮断を示す。
【０１５７】
ＰＴｍＡｂ００１１はヒトＩｇＥに対する特異性を有するマウスモノクローナル抗体であり、その他のヒトＩｇアイソタイプまたはラット／マウスＩｇＥとの交差反応性を示さない。ＰＴｍＡｂ００１１は、無作為配向でＥＬＩＳＡプレートに結合される場合、ネイティブおよび熱処理ＩｇＥの療法と結合し、これは、ＩｇＥ上のその認識部位が熱不安定性であることを示す。ＰＴｍＡｂ００１１は、抗原を介してＥＬＩＳＡプレートに結合される場合、ＩｇＥも認識する。このｍＡｂが、ヒトＩｇＥと高アフィニティーＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のα鎖結合構成成分との間の相互作用を完全に遮断し得る、ということは重要である。しかしながら、このｍＡｂは、ＦｃεＲＩに前結合される場合、依然としてヒトＩｇＥを認識し、これは、ｍＡｂ結合部位が受容体結合時に損失されないことを示す。
【０１５８】
実施例９
９．１ 正常および抗原配向化ＥＬＩＳＡによるＰＴｍＡｂ００１１のＩｇＥ結合特性の分析
実施例１に記載したように、ヒトキメラＩｇＥ、骨髄腫ＩｇＥ、ヒトＩｇアイソタイプまたは齧歯類ＩｇＥでプレートをコーティングすることにより（ｐＨ９．６炭酸塩／重炭酸塩コーティング緩衝液中１μｇ／ｍｌ）、正常ＩｇＥ結合ＥＬＩＳＡ法を実施した。抗原配向化ＥＬＩＳＡに関しては、キメラＩｇＥ（１μｇ／ｍｌ）の付加前に、飽和濃度でＮＰ−ＢＳＡを被覆した。あるいは、可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖を被覆（０．２５μｇ／ｍｌ）し、その後、キメラＩｇＥを付加した。実験１に記載した通りに、残りのＥＬＩＳＡを実行した（マウス抗ヒトＩｇＥｍＡｂの検出のためのＥＬＩＳＡプロトコール）。
【０１５９】
９．２ 結果
図２２は、無作為配向様式でＥＬＩＳＡプレートに結合される場合、ＰＴｍＡｂ００１１がヒト／マウスキメラＩｇＥおよびヒト骨髄腫ＩｇＥの両方と結合することを説明する。同様に、抗原配向化ＩｇＥとの結合（即ち、得れと結合ＮＰ−ＢＳＡに結合されるＩｇＥ）は、用量依存性である。一連の期間の間の５６℃での熱処理後のキメラＩｇＥを認識するその能力に関しても、ＰＴｍＡｂ００１１を分析した。図２２は、ＩｇＥに関するＰＴｍＡｂ００１１の結合能力が熱処理により影響されないことを示す。
【０１６０】
ＰＴｍＡｂ００１１が、高アフィニティーＩｇＥ受容体のα鎖構成成分とのＩｇＥの相互作用を抑制し得るか否かを確定するために、ｍＡｂ特性化をさらに拡張した（図２３）。プレート結合ＦｃεＲＩα鎖への付加前のＰＴｍＡｂ００１１の予備インキュベーションは、ＦｃεＲＩα鎖とのＩｇＥの相互作用の用量依存性抑制を生じた。ＰＴｍＡｂ００１１は同様に（図２４）、用量依存様式で、ＦｃεＲＩα鎖関連ＩｇＥを認識する。
【０１６１】
実施例１０
１０．１ 一次ヒトＢ細胞からのＩｇＥ分泌の分析
ＩＬ−４および抗ＣＤ４０を補充した培地中の９６Ｕウエルプレート中で２ ｘ １０^５細胞／ウエルでＰＢＭＣをプレート化した。ＰＴｍＡｂ００１１またはアイソタイプ適合化対照ｍＡｂを付加し、細胞を１４日間インキュベートした後、ＩｇＥ分析のために上清を収穫した。０．５ Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中のウサギ抗ヒトＩｇＥ抗体（１０μｇ／ｍｌ）でＥＬＩＳＡプレートをコーティングすることにより、全ＩｇＥレベルを測定した。洗浄したプレートをＰＢＳ、０．０５％トゥイーン２０、５％ＢＳＡで遮断した。細胞上清およびＩｇＥ標準の両方を飽和量のＰＴｍＡｂ００１１（１０μｇ／ｍｌ）とともに室温で１時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートに付加して、ＩｇＥ／抗ＩｇＥ複合体を生成させた。インキュベーションおよび洗浄過程後、ＨＲＰ−ヒツジ抗ヒトＩｇＥで、その後ＯＰＤ基質により、結合ＩｇＥを検出した。次に、細胞上清中のＩｇＥのレベルを、標準曲線と比較して概算した。
【０１６２】
１０．２ 結果
１０μｇ／ｍｌ〜０．５μｇ／ｍｌの用量範囲に亘るＰＴｍＡｂ００１１を用いてＩｇＥを予備インキュベートし、ヒトＢ細胞株ＲＰＭＩ８８６６に及ぼすＦｃεＲＩＩとのその後のＩｇＥ結合に及ぼすその作用に関して検査した。図２５は、ＰＴｍＡｂ００１１によるＩｇＥの予備インキュベーションがＦｃεＲＩＩとのＩｇＥ結合を強化することを説明する。非Ｐ１特異的モノクローナル抗体（ＰＴｍＡｂ００１７）はＦｃεＲＩＩ受容体とのＩｇＥの結合を強化しなかった。ＰＴｍＡｂ００１１は、一次Ｂ細胞上でのＦｃεＲＩＩとのＩｇＥ結合を強化する（図２６）。
【０１６３】
１０．３ 一次ヒトＢ細胞からのＩｇＥ分泌に及ぼすＰＴｍＡｂ００１１の作用
ＩｇＥ分泌へのＢ細胞アイソタイプ切り換えを促すために、付加的ＩＬ−４および抗ＣＤ４０抗体の存在下で、末梢血単核球をＰＴｍＡｂ００１１とともに培養した。全ＩｇＥレベル、即ち遊離ＩｇＥおよびＰＴｍＡｂ００１１複合化ＩｇＥの測定を可能にするＥＬＩＳＡ検定を開発した。このような定量を成し遂げるために、分泌ＩｇＥを飽和レベルのＰＴｍＡｂ００１１とともに予備インキュベートして、すべてのＩｇＥを複合体化させた。飽和レベルのＰＴｍＡｂ００１１と複合体化されていたＩｇＥの標準曲線と比較して、組織培養上清内の全ＩｇＥを定量した。図２７は、３つの異なるドナーにおいて、ＰＴｍＡｂ００１１（１μｇ／ｍｌ）を用いた一次Ｂ細胞のインキュベーションが全レベルの分泌ＩｇＥにおける有意の低減を生じたことを説明する。このような抑制は、アイソタイプ適合化対照抗体では観察されなかった。
【０１６４】
１０．４ ヒト好塩基球からのヒスタミン放出の確定
２つの検定フォーマットを適応させた。非アレルギー性ドナーからのＰＢＭＣを１μｇ／ｍｌのキメラＩｇＥで３７℃で３０分間受動的に感作し、洗浄して、モノクローナル抗体で３７℃で３０分間処理した。あるいは、ＬｏｌＰ１−感受性ドナーからのＰＢＭＣをモノクローナル抗体で３７℃で３０分間、直接処理した。遠心分離により反応を停止させた。特異的イムノアッセイ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ ２５６２）により、細胞上清中のヒスタミン放出を確定した。０．５％イゲパル洗剤で溶解した細胞中で、全細胞性ヒスタミン含量を確定した。
【０１６５】
１０．５ 好塩基球遮断検定
モノクローナル抗体およびＩＬ−３の存在下で３７℃で３０分間、キメラＩｇＥを用いた非アレルギー性ドナーからのＰＢＭＣのインキュベーションにより、ヒト好塩基球におけるＦｃεＲ１とのキメラＩｇＥの結合を遮断する抗ＩｇＥ抗体の能力を確定した。細胞を洗浄し、３７℃でさらに３０分間、ＮＰ−ＢＰＡによりヒスタミン放出を触発した。遠心分離により反応を停止させて、ヒスタミン放出を前記と同様に測定した。
【０１６６】
１０．６ アレルギー性好塩基球抑制検定
ＬｏｌＰ１で触発する前に、３７℃で３０分間、ＬｏｌＰ１感受性ドナーからのＰＢＭＣをモノクローナル抗体とともに予備インキュベートすることにより、アレルゲン触発化脱顆粒化を抑制する抗ＩｇＥ抗体の能力を調べた。
【０１６７】
１０．７ ヒト肺マスト細胞からのトリプターゼ放出の確定
ヒアルロニダーゼ、プロナーゼおよびＤＮアーゼを包含するカクテルによる酵素的消化により、ヒト肺組織から粗製マスト細胞懸濁液を調製した。細胞は、直接用いるか、または抗ＩｇＥ抗体での処理の前にキメラＩｇＥで予備感作した。顆粒酵素トリプターゼの比色検定により、マスト細胞脱顆粒化を確定した。
【０１６８】
１０．８ ヒトＦｃεＲ１αでトランスフェクトしたＲＢＬ細胞からのβヘキソサミニダーゼ放出の確定
シェフィール°大学のＢ． Ｈｅｌｍ博士から、トランスフェクト化細胞株ＲＢＬ Ｊ４１を入手した。マウスモノクローナルＩｇＥ抗ＤＮＰまたはヒトキメラＩｇＥ抗ＮＰで細胞を受動的感作し、抗ヒトＩｇＥ抗体で触発した。β−ヘキソサミニダーゼ放出の比色検定により、脱顆粒化を測定した。
【０１６９】
１０．９ 結果
１０．９．１ ヒト好塩基球中の抗ＩｇＥモノクローナル抗体のアナフィラクトゲン性
多数の異なる抗モノクローナル抗体を、アレルギー性および非アレルギー性好塩基球からのヒスタミン放出を触発するそれらの能力に関して検定した（図２８）。その他の抗体と対照をなして、ＰＴｍＡｂ００１１は、一貫して有意のヒスタミン放出を生じ得ない。
【０１７０】
１０．９．２ ヒト肺マスト細胞における抗ＩｇＥモノクローナル抗体のアナフィラクトゲン性
ＰＴｍＡｂ００１１は、感作および非感作ヒト肺マスト細胞の両方においても有意量のトリプターゼを放出し得ない（図２９）。ポリクローナル抗ヒトＩｇＥは、これらの細胞において６０〜７０％放出を示す。
【０１７１】
１０．９．３ ヒトＦｃεＲ１αでトランスフェクトしたＲＢＬ細胞における抗ＩｇＥモノクローナル抗体のアナフィラクトゲン性
キメラヒトＩｇＥ抗ＮＰで受動的感作したＲＢＬ Ｊ４１細胞は、抗ＮＰ−ＢＳＡで、ならびにポリクローナル抗ヒトＩｇＥで触発され得たが、しかしＰＴｍＡｂ００１１ではされなかった（図３０）。これに対比して、細胞をマウスＩｇＥ抗ＤＮＰで感作した場合には、両抗ヒトＩｇＥ抗体は作用を伴わなかった。細胞は、抗原ＤＮＰ−ＢＳＡにより依然として触発され得た。
【０１７２】
１０．９．４ 好塩基球遮断検定
ＰＴｍＡｂ００１１は、非アレルギー性好塩基球におけるＦｃεＲ１とのＩｇＥの結合を遮断し、したがってＮＰ−ＢＳＡ抗原によるその後の触発を抑制し得た。この活性のＩＣ_５０値は、約６０ ｎｇ／ｍｌであった（図３１）。ＰＴｍＡｂ００１１は、４０ ｎｇ／ｍｌのＩＣ_５０値でアレルギー性好塩基球からのＬｏｌＰ１−触発性ヒスタミン放出も強力に抑制し得た（図３１）。
【０１７３】
実施例１１ サル受動的皮膚アナフィラキシー試験
ＰＴｍＡｂ０００５およびＰＴｍＡｂ００１１を、ｉｎ ｖｉｖｏ活性に関しても試験した。要するに、アフリカミドリザルの局所的皮膚マスト細胞をそぎ取って、両腕への１００ ｎｇの抗ＮＰＩｇＥ（ヒトＩｇＥ抗ニトロフェニルアセチル（ＮＰ）、Ｓｅｒｏｔｅｃｈから購入）の皮内投与により感作した。２４時間後、試験したモノクローナル抗体の用量範囲を、片腕のヒトＩｇＥと同じ注射部位に注射した。同一動物の反対腕の対照部位に、リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または非特異的ヒトＩｇＥ（ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対して特異的である）を投与した。５時間後、１０ ｍｇのＢＳＡ−ＮＰ複合体（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入）を静注により投与した。１５〜３０分後、対照動物は、アナフィラキシーからの容易に観察可能なほぼ環状の浮腫を発症し、これはミリメートルで測定可能である。結果は、３匹のサルの群の平均浮腫直径で、またはＰＢＳ対照との比較における抑制パーセンテージとして表される。ヒトＩｇＥのＣε４ドメイン中のペプチド４９６〜５０６を認識するＤｅｃ７ＢはＥＰ０４７７２３１Ｂに記載されており、陽性対照として用いられた。
【０１７４】
【表１５】

【０１７５】
【表１６】

【０１７６】
【表１７】

【０１７７】
【表１８】

【０１７８】
【表１９】

【０１７９】
【表２０】

【０１８０】
【表２１】

【０１８１】
【表２２】

【０１８２】
【表２３】

【０１８３】
【表２４】

【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、パドランとデイヴィスの１９８６年のモデルを用いたＩｇＥのアミノ酸表面の露出を示す。
【図２】
図２は、化学合成経路１の図であり、固相ペプチド合成を示す。
【図３】
図３は、化学合成経路２と３の図であり、修飾されたキャリヤーの調製を示す。
【図４】
図４は、化学合成経路４の図であり、ペプチド／キャリヤー複合体の形成を示す。
【図５】
図５は、Ｃ６７−８抗ＩｇＥのデータである。（Ａ）２５μｇのＢＳＡ−ＩｇＥ Ｃ６７−８（ＰＴＬ化学反応を利用して共役させた）または３μｇのＨｅｐＢコア−ＩｇＥ Ｃ６７−８構造体を用いて免疫処置したＢａｌｂ Ｃマウスに由来する血清の抗プレート結合ＩｇＥ反応性。（Ｂ）２５μｇのＢＳＡ−ＩｇＥ Ｃ６７−８（ＰＴＬ化学反応を利用して共役させた）または３μｇのＨｅｐＢコア−ＩｇＥ Ｃ６７−８構造体を用いて免疫処置したＢａｌｂ Ｃマウスに由来する血清の抗受容体結合ＩｇＥ反応性。
【図６】
図６は、可溶性ＩｇＥとＩｇＥ Ｃ６７−８ペプチドを用いた競合アッセイの図である。ＢＳＡ−ＩｇＥ Ｃ６７−８またはＨＢＣ−ＩｇＥ Ｃ６７−８で免疫処置したマウスに由来する血清を、可溶性ＩｇＥ（１０μｇ／ｍｌ）またはＩｇＥ Ｃ６７−８ペプチド（２５μＭ）または無関係なペプチドＰＴ３２６（２５μＭ）を用いてあらかじめ培養し、ＩｇＥでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに添加した。データは、平均±測定の標準誤差（ｎ＝１０）である。
【図７】
図７は、ＰＴ１０７９抗ＩｇＥのデータである。（Ａ）２５μｇのＢＳＡ−ＰＴ１０７９（ＰＴＬ化学反応を利用して共役させた）または３μｇのＨｅｐＢコア−ＰＴ１０７９構造体を用いて免疫処置したＢａｌｂ Ｃマウスに由来する血清の抗プレート結合ＩｇＥ反応性。（Ｂ）２５μｇのＢＳＡ−ＰＴ１０７９（ＰＴＬ化学反応を利用して共役させた）または３μｇのＨｅｐＢコア−ＰＴ１０７９構造体を用いて免疫処置したＢａｌｂ Ｃマウスに由来する血清の抗受容体結合ＩｇＥ反応性。
【図８】
図８は、可溶性ＩｇＥとＰＴ１０７９ペプチドを用いた競合アッセイの図である。ＢＳＡ−１０７９またはＨＢＣ−ＰＴ１０７９で免疫処置したマウスに由来する血清を、可溶性ＩｇＥ（１０μｇ／ｍｌ）またはＰＴ１０７９ペプチド（２５μＭ）または無関係なペプチドＰＴ３２６（２５μＭ）を用いてあらかじめ培養し、ＩｇＥでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに添加した。データは、平均±測定の標準誤差（ｎ＝１０）である。
【図９】
図９は、ＰＴ１０７８抗ＩｇＥのデータである。（Ａ）２５μｇのＢＳＡ−ＰＴ１０７８（ＰＴＬ化学反応を利用して共役させた）を用いて免疫処置したＢａｌｂ Ｃマウスに由来する血清の抗プレート結合ＩｇＥ反応性。（Ｂ）２５μｇのＢＳＡ−ＰＴ１０７８（ＰＴＬ化学反応を利用して共役させた）を用いて免疫処置したＢａｌｂ Ｃマウスに由来する血清の抗受容体結合ＩｇＥ反応性。
【図１０】
図１０は、可溶性ＩｇＥとＰＴ１０７８ペプチドを用いた競合アッセイの図である。ＢＳＡ−１０７８で免疫処置したマウスに由来する血清を、可溶性ＩｇＥ（１０μｇ／ｍｌ）またはＰＴ１０７８ペプチド（２５μＭ）または無関係なペプチドＰＴ３２６（２５μＭ）を用いてあらかじめ培養し、ＩｇＥでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに添加した。データは、平均±測定の標準誤差（ｎ＝１０）である。
【図１１】
図１１は、ＰＴ１０７９ｇｓ抗ＩｇＥのデータである。（Ａ）３μｇのＨＢＣ−ＰＴ１０７９ｇｓを用いて免疫処置したＢａｌｂ Ｃマウスに由来する血清の抗プレート結合ＩｇＥ反応性。（Ｂ）３μｇのＨＢＣ−ＰＴ１０７９ｇｓを用いて免疫処置したＢａｌｂ Ｃマウスに由来する血清の抗受容体結合ＩｇＥ反応性。
【図１２】
図１２は、可溶性ＩｇＥとＰＴ１０７９ペプチドを用いた競合アッセイの図である。ＨＢＣ−ＰＴ１０７９ｇｓで免疫処置したマウスに由来する血清を、可溶性ＩｇＥ（１０μｇ／ｍｌ）またはＰＴ１０７９ペプチド（２５μＭ）または無関係なペプチドＰＴ３２６（２５μＭ）を用いてあらかじめ培養し、ＩｇＥでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに添加した。データは、平均±測定の標準誤差（ｎ＝１０）である。
【図１３】
図１３は、マウスＢＳＡ−Ｃ６７−８で誘導した抗血清の抑制活性を示す。ＬｏｌＰ１感受性ドナーからの細胞をマウス血清（１／５０に希釈）で処理し、次にＬｏｌＰ１でヒスタミンの放出を開始させた。データは、平均±測定の標準誤差（ｎ＝１０）である。
【図１４】
図１４は、ＢＳＡ−ＰＴ１０７８とＢＳＡ−ＰＴ１０７９で誘導したマウス血清の抑制活性を示す。ＬｏｌＰ１感受性ドナーからの細胞をマウス血清で処理し（ＢＳＡ抗血清とＢＳＡ−ＰＴ１０７８抗血清は１／５０に希釈；ＢＳＡ−ＰＴ１０７９抗血清は１／１２５０に希釈）、次にＬｏｌＰ１でヒスタミンの放出を開始させた。データは、平均±測定の標準誤差（ｎ＝１０）である。
【図１５】
図１５は、ＨＢＣ−Ｃ６７−８、ＨＢＣ−ＰＴ１０７８、ＨＢＣ−ＰＴ１０７９、ＨＢＣ−ＰＴ１０７９ｇｓで誘導したマウス血清の抑制活性を示す。ＬｏｌＰ１感受性ドナーからの細胞をマウス血清で処理し（ＨＢＣ野生型（ｗｔ）とＨＢＣ−−ＩｇＥ Ｃ６７−８抗血清は１／５０に希釈；ＨＢＣ−ＰＴ１０７９とＨＢＣ−ＰＴ１０７９ｇｓ抗血清は１／１２５０に希釈）、次にＬｏｌＰ１でヒスタミンの放出を開始させた。データは、平均±測定の標準誤差（ｎ＝１０）である。
【図１６】
図１６は、ＩｇＥに対する抗体ＰＴｍＡｂ０００５とＰＴｍＡｂ００１１の結合が濃度に依存することを示す。
【図１７】
図１７は、対照と比較すると、抗体ＰＴｍＡｂ０００５とＰＴｍＡｂ００１１によって、Ｆｃε１α／ＩｇＧ構造体に対するＩｇＥの結合の抑制が濃度に依存するようになっていることを示す。
【図１８】
図１８は、対照と比較すると、抗体ＰＴｍＡｂ０００５によって、プラスチック・プレートに直接結合したＦｃεＲ１αの切断された外ドメインに対するＩｇＥの結合の抑制が濃度に依存するようになっていることを示す。
【図１９】
図１９は、抗体ＰＴｍＡｂ０００５（ＧＥ−１）とＰＴｍＡｂ００１１によってＩｇＥがＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）に結合する様子を示す。
【図２０】
図２０は、アレルギーの人の血液中にある好塩基球からのヒスタミン放出が、対照と比較すると抗体ＰＴｍＡｂ０００５とＰＴｍＡｂ００１１の濃度に依存して抑制されることを示す。
【図２１】
図２１は、アレルギーの人の血液中にある好塩基球からＬｏｌＰ１によってトリガーされるヒスタミンの放出が、ＰＴｍＡｂ０００５とＰＴｍＡｂ００１１の両方によって抑制されることを示す。
【図２２】
図２２は、さまざまなＩｇＥに結合するＰＴｍＡｂ００１１を示す；（Ａ）キメラＩｇＥに結合するＰＴｍＡｂ００１１；（Ｂ）ミエローマＩｇＥに結合するＰＴｍＡｂ００１１；（Ｃ）抗原指向性ＩｇＥに結合するＰＴｍＡｂ００１１；（Ｄ）熱で変性したＩｇＥに結合するＰＴｍＡｂ００１１。
【図２３】
図２３は、ＦｃεＲ１αに対するＩｇＥの結合がＰＴｍＡｂ００１１によって抑制される様子を示す。
【図２４】
図２４は、受容体と結合したＩｇＥに対するＰＴｍＡｂ００１１の結合を示す。
【図２５】
図２５は、（Ａ）ＩｇＥ上のＰＴｍＡｂ００１１が、ＲＰＭＩ８８６６細胞上のＦｃεＲＩＩへの結合に及ぼす影響を示す。ＲＰＭＩ８８６６細胞（１×１０^６／ｍｌ）を、キメラＩｇＥ（１μｇ／ｍｌ）および抗ＩｇＥ ｍＡｂ（１０〜０μｇ／ｍｌ）とともに氷の上で１時間培養した。ＩｇＥと抗ＩｇＥは、室温で１時間あらかじめ培養してから細胞に添加した。結合したＩｇＥは、ＦＩＴＣ−ヤギ抗ヒトＩｇＥを用いて検出した。その結果として、ゲートを通った１０，０００の注目事象をフロー・サイトメトリー分析によって測定した、複製サンプルの平均チャネル蛍光発光（ＭＣＦ）を示す。（Ｂ）非Ｐ１特異的抗体ＰＴｍＡｂ００１７。
【図２６】
図２６は、ＩｇＥ上のＰＴｍＡｂ００１１が、一次ヒトＢ細胞上のＦｃεＲＩＩへの結合に及ぼす影響を示す。末梢血単核細胞（１×１０^６／ｍｌ）を、キメラＩｇＥ（１μｇ／ｍｌ）と、抗ＩｇＥ ｍＡｂ（１０〜０μｇ／ｍｌ；オープン）またはアイソタイプが一致した同じ濃度の対照ｍＡｂ（固体）とともに、氷の上で１時間培養した。ＩｇＥと抗ＩｇＥは、室温で１時間あらかじめ培養してから細胞に添加した。結合したＩｇＥは、ＦＩＴＣ−ヤギ抗ヒトＩｇＥを用いて検出し、ＰＥが共役した抗ＣＤを用いて一次Ｂ細胞を明らかにした。その結果として、ゲートを通った５，０００の注目事象をフロー・サイトメトリー分析によって測定した、複製サンプルの平均チャネル蛍光発光（ＭＣＦ）を示す。
【図２７】
図２７は、一次ヒトＢ細胞から分泌されるＩｇＥに対するＰＴｍＡｂ００１１の効果を示す。末梢血単核細胞（２×１０^５／ｍｌ）を、ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）と抗ＣＤ４０抗体（１μｇ／ｍｌ）を追加した培地で培養した。ＰＴｍＡｂ００１１またはアイソタイプが一致した対照のｍＡｂを１４日間にわたって添加し（１μｇ／ｍｌ）、上澄みの細胞を回収し、ＥＬＩＳＡによってＩｇＥの全含有量を分析した。結果は、いかなる抗体も存在していない状態で分泌されるＩｇＥ量を％で表示してある。
【図２８】
図２８は、アレルギーのヒト好塩基球（Ａ）と非アレルギーのヒト好塩基球（Ｂ）における抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体のアナフィラキシー誘発性を示す。１μｇ／ｍｌのキメラＩｇＥを用いて受動感作した、アレルギーのドナーまたは非アレルギーのドナーからのＰＢＭＣを、ｍＡｂｓを用いて３７℃で３０分間処理した。ヒスタミン放出を特異的ＥＩＡによって測定した。データは、それぞれ異なるドナーを用いて行なった別々の３回の実験の平均である。
【図２９】
図２９は、感作したヒト肺マスト細胞（Ａ）と非感作のヒト肺マスト細胞（Ｂ）における抗ヒトＩｇＥ抗体のアナフィラキシー誘発性を示す。感作した、または感作していない未精製ヒト肺マスト細胞の分散液を、抗体を用いて３７℃で４５分間処理した。上澄みへのトリプターゼの放出を比色アッセイで測定した。データは、代表的な１つの実験を２回繰り返した結果の平均である。
【図３０】
図３０は、ヒトＦｃεＲＩ（Ａ）とマウスＦｃεＲＩ（Ｂ）からのＲＢＬ Ｊ４１細胞における抗ヒトＩｇＥ抗体のアナフィラキシー誘発性を示す。ＲＢＬ Ｊ４１細胞は、ヒトのキメラＩｇＥまたはマウスＩｇＥを用いて感作し、抗体を用いて３７℃で３０分間処理した。上澄みへのβヘキソサミニダーゼの放出を比色アッセイで測定した。データは、代表的な１つの実験を３回繰り返した結果の平均である。
【図３１】
図３１は、ヒト好塩基球においてアレルゲンが引き金となるヒスタミン放出がＰＴｍＡｂ００１１によって抑制される様子を示す。ＰＢＭＣは、ＰＴｍＡｂ００１１だけを用いて（アレルギー・アッセイ（Ａ））、またはＰＴｍＡｂ００１１とＩｇＥを用いて（遮断アッセイ（Ｂ））３７℃で３０分間培養した。次に抗原を用いて細胞を３７℃で３０分間トリガーし、特異的ＥＩＡによりヒスタミン放出を測定した。データは、それぞれ異なるドナーを用いて行なった別々の３回の実験の平均±測定の標準誤差である。
【図３２】
図３２は、ＰＴｍＡｂ００１１とＰＴｍＡｂ０００５によってサルの皮膚において受動的皮膚アナフィラキシーが抑制される様子を示す。モノクローナル抗体Ｄｅｃ７Ｂ（スタンワース・デカペプチド）を対照として用いた。[0001]
The present invention relates to the provision of novel therapeutic, preventive, and ameliorating agents for allergic diseases. In particular, the novel drug is an isolated peptide comprising an epitope or mimotope of the surface exposed region of the IgE Cs2 domain. The inventors have discovered that these novel areas may be targets for passive and active immune defense or immunotherapy. The invention further relates to a method for producing a drug or pharmacological composition comprising these regions and to the application of the drug or pharmacological composition to medicine. Also, a ligand capable of binding to the surface-exposed IgE region of the present invention, especially a monoclonal antibody, and the use of the ligand in medical treatment or immune defense as passive immunotherapy constitutes an aspect of the present invention. Non-peptide mimotopes are also an embodiment of the present invention.
[0002]
In an allergic response, symptoms commonly associated with allergies are caused by the release of allergy mediators such as histamine from immune cells into surrounding tissues and vasculature. Histamine is normally stored in mast cells and basophils and is released by interacting with allergen-specific IgE. The role of IgE in the development of allergic responses such as asthma, food allergies, atopic dermatitis, type I hypersensitivity and allergic rhinitis is well known. B cells, upon encountering antigens such as pollen and dust allergens, initiate the synthesis of allergen-specific IgE. Then, the allergen-specific IgE binds to the FcεRI receptor (high-affinity IgE receptor) on the surface of basophils and mast cells. Subsequent encounter with any allergen initiates the release of histamine from mast cells or basophils by cross-linking of the IgE / FcεRI complex around it (Sutton and Gould, Nature, 366, 421-428). Page, 1993; EP 0 477 231 B1).
[0003]
Like any immunoglobulin, IgE contains two heavy chains and two light chains. The Hε chain is composed of five domains. That is, one variable region (VH) and four constant regions (Cε1 to Cε4). IgE has a molecular weight of about 190,000 daltons and the heavy chain consists of about 550 amino acids in length. The structure of IgE has been described by Padran and Davis (Mol. Immunol., 23, 1063-1075, 1986), and Helm et al. (PDB (Protein Data Bank, Collaborative Laboratory for Structural Bioinformatics; http: // 2 dbE model structure, filed Oct. 2, 1990) on pdb-browsers.ebi.ac.uk). The second domain, Cε2, contains substantially the amino acid numbers 226-328 of IgE (Flananagan, JG and Rabitz, TH, EMBO J. 1, 655-660, 1982; Kenten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6661-6665 (1982)) may contain additional amino acids. By comparison with the known structure of IgG1, the starting point of the Cε3 domain was deduced to be serine 337.
[0004]
A number of passive or active immunotherapies have been studied to prevent IgE-mediated histamine release mechanisms, with varying success. These methods involve the passive administration of antibodies or peptides derived from IgE that compete for binding to the FcεRI or FcεRII receptor (low affinity IgE receptor) to allow the IgE or allergen / IgE complex to be administered. Includes operations that prevent binding to these receptors. In addition, some investigators have reported that the use of specific peptides derived from IgE in active immunizations promotes an immune response that suppresses histamine release.
[0005]
It has been reported that the domains of IgE involved in the binding of IgE to the corresponding receptor are Cs3 and Cs4 (Sutton, BJ and Gould, HJ, Nature, 366, 421). -Page 428, 1993; WO 97/31948). Thus, previous treatment strategies have focused on these two domains.
[0006]
Researchers who have worked in the field so far have encountered a number of issues and issues to consider as they devise new allergy treatments as the research progresses. One of the most serious problems revolves around the involvement of IgE cross-links in the histamine release signal. In most cases, anti-IgE antibodies generated during active vaccination can themselves trigger histamine release because they crosslink the surrounding IgE-receptor complex without allergens. This phenomenon is called anaphylaxis. In fact, many commercially available anti-IgE monoclonal antibodies commonly used in IgE detection assays are anaphylactic and therefore useless and potentially dangerous to administer to patients.
[0007]
Whether an antibody is anaphylactic or not depends on the location of the target epitope on the surface of the IgE molecule. However, based on what is currently known in the field, despite the great interest and great efforts of researchers, little or no properties of any antibody or epitope can be predicted. There is little or no predictability of whether the clinical effect on the patient will be positive or negative.
[0008]
Thus, in order to be safe and effective, antibodies administered passively, or induced by inoculation, are regions of IgE that can interfere with the histamine trigger pathway without causing anaphylaxis itself. Must be combined with The present invention has achieved all of these objects, and the present invention provides a drug capable of producing a non-anaphylaxis-inducing antibody that suppresses histamine release. This drug can be the basis for active vaccination. The drug can also be used to generate suitable antibodies for passive immunotherapy. The drug itself can be administered passively to achieve a therapeutic effect.
[0009]
Much work has been done by those skilled in the art to identify specific anti-IgE antibodies that actually have some positive effect on IgE-mediated allergic responses (WO 90/15878, WO 89/04834, WO 93 05810). Many attempts have also been made to identify epitopes recognized by these effective antibodies, generate peptide mimotopes of that epitope, and use them as immunogens to produce anti-IgE antibodies.
[0010]
WO 97/31948 describes an example of this type of study. The application further describes an IgE peptide from the Cs3 and Cs4 domains conjugated to a carrier molecule for active vaccination. These immunogens can be used in vaccination studies. It is also said that these immunogens can produce antibodies, which in turn suppress histamine release in vivo. This application describes a monoclonal antibody (BSW17) that is said to be able to bind IgE peptides contained in the Cε3 domain and useful for the purpose of active vaccination.
[0011]
In EP 0 477 231 B1, there is an IgE Cε4 domain (residues 497-506, also known as Stanworth decapeptide) coupled to keyhole limpet hemocyanin (KLH) used in active vaccination immune protection. Immunogens have been described. WO 96/14333 is a sequel to the work described in EP 0 477 231 B1.
[0012]
Other methods are based on identifying peptides that compete with IgE for binding to high or low affinity receptors on the surface of basophils or mast cells (WO 93/04173, WO 98/24808, EP 0 303 625 B1, EP 0 341 290).
[0013]
In the present invention, a novel surface exposed epitope of the IgE Cs2 domain is identified. This epitope can be used as a target for active or passive immune defense or treatment of allergic disease states. The present invention provides a peptide comprising the isolated epitope, and also provides a newly identified mimotope of this epitope. The mimotope itself can be used in the treatment of allergies or in immunogens in the context of active vaccination for immune protection or treatment. Preferably, the isolated epitopes or mimotopes of the invention are used to elicit self-anti-IgE antibodies in immunogens for active vaccination protocols. This self-anti-IgE antibody itself limits, reduces or eliminates allergic responses or symptoms in the vaccinated patient. The mimotopes or immunogens of the present invention can also be administered passively to a patient to limit, reduce or eliminate an allergic response or allergic symptoms in a vaccinated patient. .
[0014]
An isolated peptide comprising an epitope of the present invention is immunogenic when properly presented (eg, on a carrier) and is a self-antibody that has the ability to induce anaphylaxis and improve allergic responses in vivo. IgE antibodies can be induced. Preferably, an epitope or mimotope of the invention is derived only from the Cε2 domain and not from any other domain. That is, the epitope or mimotope of the present invention is preferably not found in the Cε1, Cε3, or Cε4 domains. In particular, in one preferred embodiment, the epitope or mimotope of the invention is derived from the domain encoded by serine 222-alanine 329 of human IgE.
[0015]
Specific epitopes of the Cε2 domain that have been found to be particularly suitable for use in the mimotopes or immunogens of the present invention are those epitopes that have been found to be surface exposed by the present inventors. The surface of which region of IgE is exposed can be known from the model structure (Padran and Davis, Mol. Immunol., 23, 1063-1075, 1986: Helm et al., PDB (protein data bank, structural biological information) 2IgE model structure submitted to the Joint Research Institute for Science) on October 2, 1990). The inventors of the present invention have also found that the epitopes useful in the present invention are well exposed on the surface. From this observation, the inventors have devised a method for providing other suitable epitopes. This epitope is an epitope with a region that has been found to be very accessible from calculations for a five residue migration window. The inventor has calculated by using molecular simulation software (MSI) over a five residue migration window that the preferred region of the Cε2 domain is greater than 50 square angstroms, preferably greater than 80 square angstroms. It has been found that it has an accessible surface with
[0016]
Specific examples of such surface exposed Cε2 IgE epitopes are as follows:
[0017]
[Table 1]

[0018]
Peptides containing such epitopes constitute a preferred aspect of the present invention. A mimotope having the same properties as this epitope and an immunogen comprising a mimotope that elicits an immune response and cross-reacts with the IgE Cε2 epitope within the IgE molecule are also part of the invention.
[0019]
Thus, the present invention includes an isolated peptide comprising the native IgE epitope itself and any mimotope thereof. Mimotopes are defined as antibodies that recognize natural IgE epitopes (Gaysen, HM, et al., “Synthetic peptides as antigens”, Wiley, Chichester, Ciba Foundation Symposium 119, 130-149). Gaysen, HM, Mol. Immunol., 23, 7, 709-715, 1986); or, when combined with a suitable carrier, a natural IgE epitope. Defined as sufficiently similar to a native IgE epitope that antibodies capable of cross-reacting with the antibody can be produced.
[0020]
The mimotopes of the present invention can be composed of peptides or non-peptides. The peptide mimotopes of the surface-exposed IgE epitope identified above may differ in sequence from the native epitope or may be in exact sequence with the native epitope. Such molecules are described as epitope mimotopes. Because, although the two molecules have the same sequence, the mimotope is not presented in the entire Cε2 domain structure, so that the mimotope takes a slightly different configuration than the native IgE epitope Because you can do it. It will also be apparent to one of skill in the art that the above identified primary sequence (P1-P7) is flanked by other regions in the tertiary structure of IgE that may be separated in the primary sequence of IgE. Would. Thus, for example, the P1 mimotope may be continuous or discontinuous, considering that it contains or resembles a compartment of P1 and a compartment consisting of these amino acid residues separated from each other.
[0021]
Preferred surface-exposed regions that can be used in the present invention include regions with a loop structure. Thus, a peptide or mimotope of the invention can include a loop having an N-terminal extension or a C-terminal extension. The terminal extension can be a natural amino acid residue from an adjacent β-sheet. Illustratively, P1 contains the CD loop of the IgE Cε2 domain, P2 contains the DE loop, P3 contains the EF loop, and P4 contains the FG loop. Where P5 contains the AB loop and P6 contains the BC loop. Therefore, the mimotopes of these loops constitute one aspect of the present invention.
[0022]
Particularly preferred drugs are based on epitope P1 and its mimotope. Peptides containing this epitope and their mimotopes have the ability, when bound to a carrier, to induce an anti-IgE immune response that can inhibit histamine release from human basophils. In addition, this immune response is non-anaphylactic. The P1 mimotope is described primarily as anything that can elicit an immune response when rendered immunogenic. This immune response allows recognition of P1 in the Cε2 domain of IgE.
[0023]
P1 corresponds to the CD loop of the Cε2 domain. The folded CD loop structure of the folded immunoglobulin corresponds to the chain joining the end of the Cβ chain and the beginning of the Dβ chain (“Introduction to Protein Structures”, 2nd edition, p. 304, Branden and Toe's). Garland Publishing, New York, ISBN 0 8153 2305-0). This binding chain corresponds approximately to amino acid residue numbers tryptophan 268 to serine 280 of the IgE molecule. Thus, a mimotope of the CD loop of the IgE Cs2 domain and a ligand capable of binding to the CD loop of the IgE Cs2 domain constitute a preferred aspect of the invention.
[0024]
The peptide mimotope of the IgE epitope identified above can be designed for a specific purpose by adding, deleting, or substituting selected amino acids. Thus, the peptides of the present invention can be modified to be easily conjugated to a protein carrier. For example, in some chemical conjugation methods it may be desirable to include a terminal cysteine for the epitope of IgE. In addition, the unconjugated free ends of the peptide remain associated with the surface of the carrier protein, including the hydrophobic end remote from the conjugated end of the peptide, to the peptide conjugated to the carrier protein. Would also be desirable. This reduces the conformational freedom of the peptide and therefore increases the probability that the peptide will be presented in a conformation very similar to that of the IgE peptide as found throughout the IgE molecule . For example, the peptide can be altered to have a cysteine at the N-terminus and a hydrophobic amidated tail at the C-terminus. Also, the addition or substitution of D stereoisomers of one or more amino acids can produce advantageous derivatives, for example, that increase the stability of the peptide. Those skilled in the art will appreciate that such modified peptides or mimotopes can be wholly or partially non-peptide mimotopes in which the constituent amino acid residues are not necessarily limited to the naturally occurring 20 amino acids. You can understand. In addition, such peptides can be cyclized by methods known in the art to bring the peptide into a conformation that is very similar to the shape of the peptide sequence when present in an entire IgE molecule. it can.
[0025]
Specific examples of preferred cyclized peptides containing two cysteine residues that allow the formation of disulfide bridges include PT1079 (SEQ ID NO: 14), PT1079gs (SEQ ID NO: 15), PT1078 (SEQ ID NO: 16), P15q (SEQ ID NO: 11).
[0026]
Further, those skilled in the art will appreciate that the mimotopes or immunogens of the invention can be longer than the isolated epitope and may include the sequences disclosed herein. I can do it. Thus, the mimotopes of the present invention can have extensions of many other natural residues at one or both N- and / or C-terminal ends. Peptide mimotopes can also be retro-sequences in which the sequence is reversed from the native IgE sequence. Alternatively, all or at least a part of the sequence of the peptide mimotope may be a D stereoisomer amino acid (inverted sequence). The peptide sequence can also be retro-inverted, where the direction of the sequence is reversed and the amino acids are in the D stereoisomeric form. Such retro-peptides, or retro-inverted peptides, are non-self and can solve the problem of self-tolerance in the immune system (eg P15r; see description below).
[0027]
Further, the peptide mimotope can be identified using an antibody capable of binding to the IgE epitope of the present invention and using a method such as phage display technology (EP 0 552 267 B1). This method yields a number of peptide sequences that can bind anti-natural peptide antibodies because they resemble the structure of the natural peptide, but are not necessarily significantly homologous in sequence to the natural IgE peptide. This method has enhanced immunogenic properties, such as greater affinity binding properties to IgE receptors or anti-IgE antibodies, and the ability to induce polyclonal immune responses that bind IgE with greater affinity. Has the great advantage of being able to identify peptides and to solve any potential autoantigen tolerance problems that may be associated with the use of native peptide sequences. In addition, this method allows the identification of a recognition pattern for each native peptide with respect to chemical properties common to the recognized mimotope sequences.
[0028]
Preferred examples of modified peptide mimotopes and examples of bacteriophages derived from mimotopes include:
[0029]
[Table 2]

[0030]
In other mimotopes, the amino acid residues at P1, P2, P3, P4, P5, P6, or P7 can each be replaced with very similar amino acids. For example, A can be replaced with V, L, or I as shown in the following table:
[0031]
[Table 3]

[0032]
Ligands capable of binding a surface exposed Cs2 IgE epitope and pharmacological compositions comprising the ligands form part of the invention. Such ligands can be used in passive prophylaxis or therapy. The ligand is administered to a patient, for example, to ameliorate an allergic disease. Specific examples of such useful ligands include monoclonal or polyclonal antibodies. For example, for the prevention or treatment of allergy, antibodies induced in one animal can be purified and passively administered to another animal. The peptides of the present invention can be prepared using monoclonal antibody hybridomas (e.g., using the technique of Kohler and Milstein, Nature, 256, 495, 1975), humanized monoclonal antibodies, or CDR-grafted monoclonals. It can also be used to produce. Accordingly, one related aspect of the invention is a ligand capable of binding to a surface exposed epitope of the IgE Cε2 domain. Specific examples of such ligands include antibodies (or Fab fragments). Such antibodies can be used in passive immune defense or immunotherapy, or for identification of IgE peptide mimotopes.
[0033]
The term "antibody" is used herein to refer to a molecule having effective antigen binding specificity. One of ordinary skill in the art will readily appreciate that the term may include polypeptides that are antibody fragments or polypeptides that are antibody derivatives that perform the same or very similar function. Thus, such antibody fragments or antibody derivatives are intended to be included in the term antibody as used herein.
[0034]
Preferred ligands are monoclonal antibodies. A particularly preferred ligand is a ligand for P1, which is preferably a monoclonal antibody. For example, PTmAb0011 is a patent deposit under the Budapest Treaty as ECACC (European Cell Culture Collection, Institute for Vaccine Research and Production, Public Health Research Division, Center for Applied Microbiology, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, UK) The reference name of a mouse IgG1 type monoclonal antibody deposited on Mar. 8, 1999 as Accession No. 9903805.
[0035]
For example, PTmAb0011 recognizes the CD loop of Ce2. PTmAb0011 can also recognize IgE when bound to a high affinity receptor on the surface of human basophils without degranulation. PTmAb0011 can also prevent passive sensitization of non-allergic basophils by preventing IgE from binding to FcεR1α and suppress LolP1-triggered histamine release in allergic basophils . Another monoclonal antibody that recognizes the CD loop of Cε2 is PTmAb0005 (available from Sigma Chemicals as catalog number I6510, clone number GE-1). According to the present invention, the monoclonal antibody is provided in a form contained in a pharmacological composition.
[0036]
P1 ligands have been used to identify new P1 mimotopes in bacteriophage selection methods. For example, a monoclonal antibody capable of recognizing P1 binds to a bacteriophage expressing the following sequence:
[0037]
[Table 4]

[0038]
Other peptide mimotopes of the CD loop of Cs2 IgE have been identified by bacteriophage selection using PTmAb0011 and PTmAb0005. Specific examples of such mimotopes include:
[0039]
[Table 5]

[0040]
Thus, a Cε2 IgE mimotope capable of binding to PTmAb0005 or PTmAb0011 and an immunogen containing this mimotope form an important aspect of the present invention. Vaccines containing mimotopes that can bind to PTmAb0005 or PTmAb0011 are effective in treating allergies.
[0041]
Without limiting the broad definition of the P1 mimotope, a core pattern was identified from these and other phage sequences for a subset of P1-like peptides. This pattern is a subset of the mimotope of P1 and describes the mimotope in terms of the amino acid at each position in terms of the chemical properties desired to be recognized by the specific anti-P1 monoclonal antibody as follows.
[0042]
yhxdhhhananxxy
here,
y. . . . . . y can be annular.
[0043]
h is hydrophobic (cysteine, proline, glycine, alanine, valine, isoleucine, leucine, tryptophan, methionine, phenylalanine).
[0044]
d provides an ionic bond (arginine, lysine, histidine, glutamine, asparagine, tryptophan, tyrosine, threonine, serine).
[0045]
a is acidic (aspartic acid, glutamic acid).
[0046]
n is ionically neutral / non-polar (all except aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine).
[0047]
x is an arbitrary amino acid (n = 0 to 3).
[0048]
Thus, in one embodiment, the mimotope of P1 can be described by the general core structure yhxdhhanananxy described above. Peptide P1 or its mimotope may be flanked on either end by other amino acids to aid conjugation or serve any other purpose.
[0049]
A particularly preferred mimotope of P1 is P15s (SEQ ID NO: 17). Of the residues of this sequence, Q, M and the first D have been found to be critical for the binding activity of PTmAb0011 and PTmAb0005 (see Examples). Thus, the sequence of the mimotope for P15s is:
Q, X₁, M, D, X₁, X₂, X₃
(Non-essential residues were replaced with similar amino acids (as outlined above)). X here₁Selects from V, I, L, M, F, A, and X₂Is D or E, X₃Selects from L, I, V, M, A, and F.
[0050]
The identification of novel IgE mimotopes using PTmAb0005 and PTmAb0011 and their subsequent use in the treatment of allergy also constitutes an important aspect of the present invention. Since PTmAb0005 is commercially available, it does not constitute the composition of the present invention. However, a pharmacological composition containing PTmAb0005 and its use to identify a P1 mimotope constitute two important aspects of the present invention.
[0051]
The P2, P3, P4, P5 mimotopes also constitute an important aspect of the present invention. For example, P16 and P17 are mimotopes of P2 and P3, respectively. Both of these peptides, when properly presented on a carrier, can induce a potent anti-IgE antibody response that is non-anaphylactic.
[0052]
In one preferred embodiment, a peptide comprising the above identified epitope, or a peptide of the invention comprising a peptidic or non-peptidic mimotope, is small in size and resembles a region selected from the entire Cε2 domain. Thus, it is expected that the peptidic mimotope should be less than 100 amino acids in length, preferably less than 75, more preferably less than 50, and most preferably 4 to 25 amino acids. Specific examples of preferred peptide mimotopes are PT1079 and P15q. These are 21 and 13 amino acids in length, respectively. Non-peptide mimotopes are expected to be similar in size to the corresponding peptide mimotopes in terms of molar volume.
[0053]
It will be apparent to one skilled in the art that a variety of techniques can be used to confirm that a particular structural state is a mimotope. Such techniques include: Since the immunogenicity can be confirmed by examining the putative mimotope, antisera cultured with the putative mimotope cross-react with natural IgE molecules, as well as from allergic effector cells. It also has the function of blocking the release of allergies and mediators. The specificity of such reactions is inhibited by the activity of the antisera with mimotopes themselves or with native IgE and / or with specific monoclonal antibodies known to bind to surface exposed epitopes within the Cε2 of IgE. Can be confirmed by a competition experiment. Specific examples of such monoclonal antibodies used in competition assays include, for example, PTmAb0005 and PTmAb0011. Using these, it would be possible to confirm whether the putative mimotope was the mimotope of the CD loop of the Igε Cε2 domain.
[0054]
In one embodiment of the invention, at least one of the above-mentioned peptides comprising an epitope of IgE or a mimotope is conjugated to a carrier molecule to create an immunogen for a vaccine protocol. Preferably, the carrier molecule is unrelated to the native IgE molecule. The peptides or mimotopes can be linked by chemical covalent bonds, or by expressing a genetically engineered fusion partner, or alternatively by a linker sequence.
[0055]
For covalently binding the peptide to the immunity-inducing carrier, well-known methods in the prior art can be used. For example, for direct covalent bonding, carbodiimide, glutaraldehyde, or (N- [γ-maleimidobutyryloxy]) succinimide ester can be used. Here, a commercially available heterobifunctional linker such as CDAP or SPDP is used (according to the manufacturer's instructions). After the binding reaction, the immunogen can be easily isolated and purified by dialysis, gel filtration, fractionation and the like.
[0056]
The type of carrier used in the immunogens of the present invention will be readily apparent to one skilled in the art. The function of the carrier is to provide cytokine cooperation to facilitate the induction of an immune response to the IgE peptide. A list of carriers that can be used in the present invention includes keyhole limpet hemocyanin (KLH), serum albumin such as bovine serum albumin (BSA), and inactivated bacterial toxins such as tetanus toxin (TT) and diphtheria toxin (DT). Or a recombinant fragment thereof (eg, domain 1 of fragment C of TT or translocation domain of DT), a purified protein derivative of tuberculin (PPD), and the like, but are not limited thereto. Also, mimotopes or epitopes can be conjugated directly to the liposome carrier. Note that the carrier may further include an immunogen capable of assisting T cells. Preferably, the ratio of peptide to carrier is about 1: 1 to 20: 1, and preferably each carrier contains 3 to 15 peptides.
[0057]
In one embodiment of the invention, the preferred carrier is protein D from Haemophilus influenzae (EP 0 594 610 B1). Protein D is an IgD binding protein derived from Haemophilus influenzae, which has been patented by Forth Glen (WO 91/18926 as EP 0 594 610 B1). In some cases, for example, in a recombinant immunogen expression system, it is desirable to use a fragment of protein D, for example, 1/3 of protein D (including the N-terminal 100-110 amino acids of protein D (GB97179953.5)). I guess.
[0058]
Another preferred method of presenting the IgE peptides of the invention involves a recombinant fusion molecule. For example, EP 0 421 635 B describes a method for displaying foreign peptide sequences in virus-like particles using chimeric hepadnavirus core antigen particles. As such, the antigens of the invention can include an IgE peptide presented within a chimeric particle consisting of a hepatitis B core antigen. Further, the recombinant fusion protein can comprise a mimotope of the invention and a carrier protein such as NS1 of influenza virus. Nucleic acids encoding any of the proteins of the invention that are expressed recombinantly also constitute one aspect of the invention.
[0059]
The peptide used in the present invention can be easily synthesized using a solid phase method known in the prior art. Suitable syntheses can be performed using the “T-boc” or “F-moc” method. Cyclic peptides can be synthesized in a fully automated apparatus by the well-known "F-moc" method and the solid phase method using a polyamide resin. Also, one skilled in the art would know the experimental procedures required to perform this method manually. Techniques and methods for solid phase synthesis are described by ERL in Oxford University Press. Atherton and R.A. C. Shepard, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Method, 1989. Peptides can also be produced by recombinant methods that involve expressing a nucleic acid molecule encoding a mimotope in a bacterial or mammalian cell line and then purifying the expressed mimotope. Techniques for recombinantly expressing peptides and proteins have been known in the art, see Maniatis, T. et al. Flitch, E .; F. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
[0060]
An immunogen of the invention can include the above peptides, such as mimotopes. The immunogen of the present invention may be an immunologically cross-active derivative or a fragment thereof. Some of the nucleic acids encoding the immunogens, peptides, mimotopes, or derivatives thereof of the present invention also form part of the present invention. Further, the immunogen of the present invention can include more than one epitope, P1 and P2, within the same immunogen. Alternatively, the mimotope itself can contain more than one type of epitope.
[0061]
Accordingly, the present invention provides a method for producing a pharmacological composition for preventing or treating allergy using the novel peptide comprising the epitope or mimotope of the present invention (as described above). An immunogen comprising a mimotope or peptide of the invention and a carrier molecule are also provided for use in a vaccine for immune protection or treatment of allergy. Accordingly, the mimotopes, peptides, or immunogens of the present invention are provided for use in medicine and in the treatment or prevention of allergic diseases. Accordingly, there is provided a method of treating allergy comprising administering the vaccine or drug of the present invention to a patient suffering from or prone to allergy.
[0062]
The vaccine of the present invention preferably also contains an adjuvant. Suitable adjuvants for the vaccines of the present invention are those that can increase the antibody response to an IgE peptide immunogen. Adjuvants are well known in the art (Vaccine Design-Subunit and Adjuvant Approach, 1995, Biotechnology of Pharmacology, Volume 6, Powell, MF and Newman, MJ. Ed., Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X). Adjuvants that are preferably used with the immunogens of the present invention include aluminum salts or calcium salts (eg, hydroxide salts, phosphates). Other adjuvants include the saponin adjuvants QS21 (U.S. Pat. No. 5,057,540) and 3D-MPL (British No. 2220 211).
[0063]
The vaccines of the invention will generally have a starting dose and a booster dose. It is envisaged that the additional doses will be given at well spaced intervals between doses, preferably annually, or at a time when the circulating levels of the antibody have fallen below the desired levels. The additional dose may consist of the peptide without the original carrier molecule. Such additional doses may include another carrier or no carrier at all.
[0064]
In yet another aspect of the invention, there is provided a vaccine as described herein for use in medicine.
[0065]
The vaccine preparations of the present invention can be used to protect or treat allergic or allergic mammals by administering the vaccine through a systemic or mucosal route. The administration method can be intramuscular injection, intraperitoneal injection, intradermal injection, subcutaneous injection, or administration to the mucosa by oral / digestive, respiratory, genitourinary routes. The preferred route of administration is the transdermal route, for example by a dermal patch.
[0066]
The amount of protein included in a single vaccine dose will be selected to induce an immune protective response without the significant negative side effects of a typical vaccine. Such amounts will vary depending on which specific immunogen is used and how to present that specific immunogen. In general, a single dose will contain 1-1000 μg, preferably 1-500 μg, more preferably 1-100 μg, most preferably 1-50 μg of protein. The optimal amount of an individual vaccine is confirmed by standard studies, including observing an appropriate immune response within the subject. The subject may receive one to several boosters with sufficient dosing intervals after the initial vaccine.
[0067]
The above-described pharmacological composition comprising a ligand also constitutes one aspect of the present invention. The present invention also provides the use of the ligand in medicine and in the manufacture of a medicament for treating allergy.
[0068]
Various aspects of the invention can also be used in diagnostics. For example, a panel of ligands that recognize various peptides of the invention can be used to determine anti-IgE titers in sera collected from patients. In addition, the peptides themselves can be used to type circulating anti-IgE. In certain situations, for example, it may be appropriate to determine the level of anti-IgE circulating in the body of an atopic patient. Then, atopy can be diagnosed using the peptide of the present invention and the polyclonal / monoclonal antibody. In addition, the peptide can be used to affinity remove circulating anti-IgE from the patient's blood and then infused into the patient again.
[0069]
Peptide immunogen identification methods that include the use of computer models of IgE structure to identify surface exposed peptides of IgE for immune protection or treatment of allergy also form part of the invention. These regions are then used as immunogens for medical use. Therefore, the use of PTmAb0005 and PTmAb0011 in identifying peptides for use in immune defense and therapy of allergy forms part of the present invention.
[0070]
Vaccine preparations are described in full by Woller et al., New Trends and Evolution of Vaccines, University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Conjugation of proteins to macromolecules is disclosed in U.S. Pat. No. 4,372,945 to Lykite and U.S. Pat. No. 4,474,757 to Armor et al.
[0071]
The numbering system for the amino acid residues of IgE is described by Dorrington, K .; J. And Bennich, H.C. , Immunol. Rev .. 41, 3-25, 1978; Bennich, H .; And Bar-Lindustrom, H.C. Fong, Prog. Immunol. , Vol. 11, pp. 49-58, 1978. However, the gene and cDNA sequences of human IgE were subsequently determined (Max, EE et al., Cell, 29: 691-699, 1982; Flanagan, JG and Rabitz, TH. Kenten, J. H. et al., Supra, 1982), revealed that an extra leucine was located at the 273rd position (covered numbering) in Cε2. This has not been reported in earlier literature. The numbering system utilized in the present invention is therefore described in Dorrington, K .; J. And Bennich, H.C. May be different from
[0072]
The present invention will be described based on the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0073]
Part 1. Mimotopes and immunogens of the invention
Embodiment 1 FIG.
1.1 Identification of surface exposed epitopes, chemical conjugation, serological methods
The surface exposed epitope of the IgE Cs2 domain was identified using the model structure of human IgE described by Padran and Davis (Mol. Immunol., 23, 1063-1075, 1986). Both continuous and solvent exposed peptides were identified. This means that the accessibility of each amino acid of IgE is calculated using molecular simulation software (MSI), and the accessible surface is averaged in a 5-residue moving window, and the average value of the 5-mer is 80%. This was achieved by identifying regions of the IgE peptide that were larger than square angstroms. The test results are shown in FIG.
[0074]
result
From FIG. 1 and again using the 1990 Helm et al. Model (2IgE model structure submitted to the PDB (Protein Data Bank, a Collaborative Laboratory for Structural Bioinformatics) on Oct. 2, 1990). The results of repeating the method indicate that there are a number of natural peptides that can be used as immunogens to raise antibodies against IgE.
[0075]
[Table 6]

[0076]
These peptides, or their mimotopes, are synthesized and conjugated to carriers or made into hepatitis core antibody constructs to produce recombinant peptides expressing virus-like particles.
[0077]
1.2 Synthesis of IgE Peptide / Protein D Complex Using Succinimide-Maleimide Crosslinker
Antigens of the invention can be made by conjugating protein D directly to an IgE peptide using a succinimide-maleimide crosslinker. Using this chemical reaction, the NH of the carrier residue is immobilized through the fixation of the succinimide group.₂Activation can be controlled. The maleimide group is a cysteine binding site. Therefore, it is necessary to add cysteine to the N-terminus of the IgE peptide to be conjugated in order to achieve the purpose of the following examples.
[0078]
The binding agent is a selective heterobifunctional crosslinker, one end of which activates the amino group of the protein carrier with a succinimidyl ester and the other end connects the sulfhydryl group of the peptide with a maleimide group. The reaction route is as follows.
[0079]
a. Activation of protein by reaction of lysine with succinimidyl ester
[0080]
Embedded image

[0081]
b. Binding of cysteine in activated proteins to peptides by reaction with maleimide groups
[0082]
Embedded image

[0083]
1.3 Preparation of IgE peptide-protein D complex
Protein D is dissolved in phosphate buffered saline (PBS) at a pH of 7.2 and a concentration of 2.5 mg / ml. The binder (N- [γ-maleimidobutyryloxy] succinimide ester-GMBS) is dissolved in DMSO at a rate of 102.5 mg / ml and added to the protein solution. As the ratio, 1.025 mg of GMBS is used for 1 mg of protein D. The reaction solution is incubated at room temperature for 1 hour. By-products are removed in a desalting step and loaded on Sephacryl 200 HR permeation gel. The eluent used is 0.1% phosphate buffer solution-Tween 80 (TM) with a pH of 6.8. Recover and store the activated protein. Peptides (listed in Table 1, or their derivatives or mimotopes) are dissolved at 4 mg / ml in 0.1 M acetic acid to prevent disulfide bonds from forming. The binding is carried out in a molar ratio of 2 to 20 peptides per activated molecule of protein D. The peptide solution is slowly added to the protein and the resulting mixture is incubated at 25 ° C. for 1 hour. The pH is maintained at 6.6 during the coupling. Stop by adding cysteine for 30 minutes at 25 ° C. with a pH of 6.5 (0.1 mg of cysteine is dissolved in 0.1 M acetic acid to 4 mg / ml per 1 mg of activated protein D). Perform the steps. Dialysis is performed twice against 150 mM NaCl + 0.1% Tween 80 to remove excess cysteine or peptide.
[0084]
The final step is a sterile filtration using a 0.22 μm membrane. The final product is a clear, filterable solution, which is stored at 4 ° C. The final peptide / protein D ratio is determined by amino acid analysis.
[0085]
In a similar manner, a peptide of the invention can be conjugated to a carrier comprising BSA.
[0086]
The P1 mimotope was synthesized to yield CLEDGQVMDVDLL (P15, SEQ ID NO: 8). This was conjugated to both protein D and BSA using the method described above.
[0087]
1.4 ELISA method
Anti-peptide ELISA or anti-peptide carrier ELISA
The anti-peptide and anti-carrier immune responses were examined by the ELISA method outlined below. Microtiter plates (Nanck) were coated with specific antigen in PBS (4 ° C., overnight) containing 2 μg / ml streptavidin (followed by biotinylated peptide (1 μM) at 37 ° C.). Cultured for 1 hour). Wash with 3 × PBS-0.1% Tween 20. Saturate the plate with PBS-1% BSA-0.1% Tween 20 (saturation buffer) for 1 hour at 37 ° C. As an addition 1, antibody = serum diluted in two steps (in a saturated buffer solution) is added, and the cells are cultured at 37 ° C for 1 hour and 30 minutes. Wash with 3 × PBS-0.1% Tween 20. As addition 2, anti-mouse Ig bound to HRP (or an anti-mouse isotype-specific monoclonal antibody) is added. Incubate at 37 ° C for 1 hour. Wash with 5 × PBS-0.1% Tween 20. What was not visible is made visible by using TMB (Bio-Rad) for 10 minutes at room temperature in the dark. 0.4N H₂SO₄Stop the reaction with.
[0088]
Method for detecting anti-human IgE reactivity in mouse serum (IgE plate binding ELISA)
Coat ELISA plates with 1 μg / ml human chimeric IgE at 37 ° C. for 1 hour or 4 ° C. overnight in carboxylate / dicarboxylate coating buffer solution at pH 9.6. I do. Non-specific binding sites are blocked using PBS / 0.05% Tween 20 with 5% w / v Marvel milk powder for 1 hour at 37 ° C. Mice sera serially diluted to various concentrations in PBS / 0.05% Tween 20/1% w / v BSA / 4% fetal calf serum are added over 1 hour at 37 ° C. Polyclonal serum binding is detected with goat anti-mouse IgG-biotin (1/2000) and then with streptavidin-HRP (1/1000). The conjugated antibody is detected at 450 nm using TMB substrate. A standard curve of PTmAb0011 is included in each plate so that the activity of anti-IgE in serum samples can be calculated in μg / ml.
[0089]
Method for detecting the activity of IgE bound to anti-human receptor in mouse serum
Coat ELISA plates with 0.5 μg / ml recombinant human FcεR1α in carboxylate / dicarboxylate coating buffer solution at pH 9.6 for 1 hour at 37 ° C. or overnight at 4 ° C. I do. Non-specific binding sites are blocked using PBS / 0.05% Tween 20 with 5% w / v Marvel milk powder for 1 hour at 37 ° C. Next, 1 μg / ml human IgE is added at 37 ° C. over 1 hour. Next, mouse sera serially diluted to various concentrations in PBS / 0.05% Tween 20/1% w / v BSA / 4% fetal calf serum are added over 1 hour at 37 ° C. Polyclonal serum binding is detected with goat anti-mouse IgG-biotin (1/2000) and then with streptavidin-HRP (1/1000). The conjugated antibody is detected at 450 nm using TMB substrate. A standard curve of PTmAb0011 is included in each plate so that the activity of anti-IgE in serum samples can be calculated in μg / ml.
[0090]
Competition for binding of mimotope peptide, soluble IgE, or PTmAb0011 to IgE
One dilution of mouse polyclonal serum is mixed with one concentration of mimotope peptide or human IgE in a pre-blocked 96-well polystyrene plate. The mixture is incubated at 37 ° C. for 1 hour, and then added to the IgE-coated ELISA plate at 37 ° C. for 1 hour. Polyclonal serum binding is detected with goat anti-mouse IgG-biotin (1/2000) and then with streptavidin-HRP (1/1000). The conjugated antibody is detected at 450 nm using TMB substrate. To allow serum and PTmAb0011 to compete for binding to IgE, a mixture of serum and PTmAb0011-biotin is added to an IgE-coated ELISA plate. PTmAb0011 binding is detected with streptavidin-HRP (1/1000).
[0091]
1.5 Human basophil assay
Two types of assays were performed using human basophils (HBA). One is to examine the anaphylaxis-inducing property of the monoclonal antibody, and an operation of adding the antibody to the isolated PBMC is performed. The other is to measure the inhibition of histamine release caused by LolPI (a strong allergen) by a monoclonal antibody by pre-culturing HBA.
[0092]
Blood is collected by venipuncture from an allergic donor and placed in a tube containing 0.1 volume of 2.7% EDTA (pH 7.0). The blood is then diluted に with an equal volume of HBH solvent containing 0.1% human serum albumin (HBH / HSA). The resulting cell dispersion is layered on a 50% by volume Ficoll-pack and centrifuged at 400 g for 30 minutes at room temperature. Collect the peripheral blood mononuclear cell (PBMC) layer at the interface and discard the pellet. The cells were washed once in HBH / HSA, counted and the cell density was 2.0 × 10 5 per ml.⁶And dispersed again in HBH / HSA. Add 100 μl of this cell dispersion to a V-bottom 96-well plate containing 100 μl of diluted test sample or monoclonal antibody. Each test sample is tested at various dilutions, with the test being performed in six wells for each dilution. The contents of the wells are mixed gently using a plate stirrer and then incubated at 37 ° C. for 30 minutes at a stirring speed of 120 rpm.
[0093]
For each serum dilution, three wells receive 10 μl of LolPI extract (final dilution 1/10000) as a trigger, and three wells receive 10 μl of HBH / HSA for anaphylactic induction. The contents of the wells are mixed again using a plate stirrer and then incubated at 37 ° C. with a stirring speed of 120 rpm for a further 30 minutes. After the culture, centrifuge at 500 g for 5 minutes. The supernatant is removed, and a histamine assay is performed using a commercially available histamine EIA measurement kit (Immunotech). Control wells without test sample are included in routine work to determine spontaneous and triggered release. Wells containing cells and 0.05% Igepal detergent are also included in routine work and cells are examined for total histamine.
[0094]
The result is described as follows.
[0095]
Anaphylaxis induction assay
Histamine release due to test sample = (% histamine released from cells treated with test sample)-(% spontaneous histamine release).
[0096]
Blocking assay
The degree of inhibition of histamine release can be calculated using the following formula:
% Inhibition = [1- (histamine * released from cells treated with test sample) / (histamine * released from antigen-stimulated cells) × 100].
* Value corrected for spontaneous release.
[0097]
Embodiment 2. FIG. Immunization of mice with the P15 complex (P15-BSA or P15-PD) induces production of anti-human IgE antibodies
A complex comprising 10 BalbC mice was prepared by using the complex containing mimotope P15 described in 1.4 (25 μg protein / dose) as an adjuvant with an oil-in-water emulsion containing QS21 and 3D-MPL described in WO95 / 17210. Group. Booster administration occurs on days 21 and 42, and serum can be collected on days 42 and 56. The immune response to IgE to which the anti-peptide and anti-plate were bound was examined by the method described in Example 1.
[0098]
result
Table 2 shows the results of the anti-peptide response and anti-IgE response measured on day 14 after the third vaccination.
[0099]
[Table 7]

[0100]
Embodiment 3 FIG. Anti-IgE induced in mice after immunization with conjugate is non-anaphylactic
Test several dilutions of whole serum from mice immunized with the conjugate or of IgG purified from the mice in the presence of basophils from peripheral blood freshly collected from allergic patients Can be.
[0101]
Anaphylactic properties can be assessed by measuring the histamine induced release by the antibody being tested, as described below.
[0102]
-Red blood cells are removed from peripheral blood on a glucose dextran gradient.
[0103]
Wash the cells and coat them with the sample to be tested (eg allergen, antibody, allergen + antibody, etc.).
[0104]
-After culturing, collect the supernatant and measure the release of histamine according to the manufacturer's instructions (Immunotech, histamine enzyme immunoassay kit).
[0105]
None of the antisera raised with P15-BSA or P15-PD was anaphylactic.
[0106]
Embodiment 4. FIG. Anti-IgE induced in mice after immunization with the conjugate can block IgE-mediated histamine release induced by allergens acting on basophils from allergic patients
Histamine release is triggered with allergens at several concentrations in the presence or absence of whole serum from mice immunized with the conjugate or of several dilutions of IgG purified from the mice. Can be measured in a basophil sample. The inhibitory activity of the anti-P15 antibody in the antiserum was assessed by measuring the suppression of allergen-induced histamine release. Histamine release and inhibition were measured as described in Example 3. Since P15 is a mimotope of P1, PTmAb0011 was used as a control. This is because PTmAb0011 is known to bind to the same epitope (P1). Table 3 shows the results.
[0107]
[Table 8]

[0108]
Embodiment 5 FIG. Immunogenicity of P2 and P3 mimotopes
The following mimotopes were conjugated to BSA using the method described in Example 1.2, and mice were immunized with the conjugate according to the same formulation and schedule as described in Example 2.
[0109]
[Table 9]

[0110]
Mice were bled after the last immunization and tested for anti-IgE activity in an IgE plate bound ELISA. The individual results, the mean of the results (Av) and the geometric mean (GM) are summarized in the table below (SD = standard deviation).
[0111]
[Table 10]

[0112]
Embodiment 6 FIG. Production of P1 mimotopes and their immunogenic / functional activities
6.1 Production of immunogen
The P1 mimotope was obtained either by phage display or rational design by molecular modeling of the CD loop of the IgE Cs2 domain. The following peptides were synthesized to make both the BSA-peptide conjugate and the HepB core-antigen recombinant structure.
[0113]
[Table 11]

[0114]
A peptide / protein carrier structure was produced as follows. Acylhydrazine peptide derivatives were prepared on a solid phase as shown in Chemical Synthesis Route 1 (FIG. 2). This peptide derivative is readily prepared by techniques well known in the art utilizing the well-known "Fmoc" method using a polyamide or polyethylene glycol-polystyrene (PEG-PS) support in a fully automated apparatus. (Techniques and methods for solid phase synthesis are described in IRL, Oxford University Press, E. Atherton and RC Shepard, Solid Phase Peptide Synthesis: Practical Methods, 1989. Has been described). Acid-mediated cleavage resulted in a linear, unprotected, modified peptide. This peptide oxidizes easily. By purifying the peptide, an epitope modified by disulfide bonds could be obtained. The modifications are described in “Various Methods in Molecular Biology”, Volume 5: “Peptide Synthesis Protocol” (ed by MW Pennington and BM Dan). Use the method outlined in Chapter 7, pages 91-171 written by Androw.
[0115]
The peptide thus synthesized can then be conjugated to a protein carrier (here bovine serum albumin (BSA)) using the following method.
[0116]
6.2 Synthesis of Modified Carrier
For the introduction of the aryl aldehyde group, a succinimide active ester (BAL-OSu) prepared as shown in Chemical Synthesis Route 2 (FIG. 3; see WO 98/17628 for details) was used. Substitution of about 50% of the amino groups of BSA (bovine serum albumin) always resulted in a modified soluble protein. Further substitution of BSA resulted in an insoluble structure. The same moles of BSA and BAL-OSu were mixed in DMSO / buffer solution for 2 hours (Chemical Synthesis Route 3, see FIG. 3). This protocol, obtained experimentally, resulted in approximately 50% displacement of BSA as determined by the fluorescamine test for free amino groups.
[0117]
6.3 Peptide-BSA structure
A simple combination of the modified peptide and the derivatized BSA resulted in a peptide-BSA structure that could be easily isolated by dialysis (chemical synthesis route 4, FIG. 4). The increase in molecular weight was confirmed using SDS-PAGE.
[0118]
6.4 Hepatitis core antigen structure
Hepatitis core antigen recombinant construct (HBC) was also prepared using the method of molecular biology described in EP 0 421 635B. In HBC experiments, PT1079 was modified to remove terminal lysine.
[0119]
[Table 12]

[0120]
BIA core experiments using PTmAb0005 and PTmAb0011 confirmed the expression of the P1-mimotope peptide. Immunogenicity occurred with only 3 μg / dose of HBC administered.
[0121]
6.5 Immunogenicity studies
The mimotope / HBC and mimotope / BSA constructs were purified into vaccines and an oil-in-water emulsion containing QS21 and 3D-MPL as described in WO 95/17210 was used as adjuvant (25 μg BSA complex / dose). The vaccine was administered to groups of 10 BalbC mice. Booster administrations were performed on days 14 and 28, and serum was collected on day 42. The immune response to IgE bound to the antiplate and to receptor-directed IgE was examined as described in Example 1.4. Further, the activity of the antiserum in suppressing histamine release from allergic basophils was measured by the method described in Example 1.5.
[0122]
6.6 Results
The BSA and HBC constructs all induced high titers of anti-IgE antibodies when IgE was directly bound to the ELISA plate and when facing the high affinity reporter. Furthermore, all of these responses were confirmed to be specific in that free IgE competed with the mimotope itself, and not with non-specific peptides. Anti-IgE induced by these immunogens can suppress histamine release from human basophils derived from allergic donors (rye, LolP1).
[0123]
See FIG. 5, FIG. 6, FIG. 13, and FIG. 15 for the result of C67-8. See FIGS. 9, 10, 14, and 15 for the results of PT1078. See FIGS. 7, 8, 14, and 15 for the results of PT1079. See FIG. 11, FIG. 12, and FIG. 15 for the results of PT1079gs.
[0124]
Furthermore, the immune response generated by these peptide mimotopes was not anaphylactic.
[0125]
[Table 13]

[0126]
Part 2. Ligands that bind to the epitopes and mimotopes of the invention
Peptide immunogens were described in Part 1. Peptide immunogens elicit an immune response when administered to a mammal in the form of a vaccine. This immune response allows (a) to recognize IgE and (b) to suppress histamine release in vitro. The second part describes ligands that can bind to the epitopes or mimotopes of the present invention and their functions. Two types of monoclonal antibodies, PTmAb0005 and PTmAb0011, that recognize the CD loop of IgE Cε2 have been identified. The mimotope of this peptide was shown in part 1 to be immunogenic and to function in active vaccination. This section describes the characterization of these monoclonal antibodies and provides evidence that these monoclonal antibodies are effective in passive vaccination.
[0127]
The epitope targeted by the antibody is identified using phage selection, i.e., using a sequence alignment of multiple bacteriophage targets, followed by domain mapping and site-directed mutagenesis to refine the identification results, confirmed. The functional activity of the antibody was confirmed not only by examining anti-IgE recognition and suppression of allergic mediator release in vitro, but also by passive cutaneous anaphylaxis (PCA) studies in monkeys in vivo.
[0128]
Example 7
7.1 Phage mapping of monoclonal antibody targets
XCX at the N-terminus of phage gVIIIp_Fifteen, XCX₁₀Or XAX₁₀A phage display library was used to map the binding sites of the monoclonal antibodies using three different phage libraries displaying the peptide sequence, where X is any amino acid. Tables 6 and 7 show the results of the selection for peptide sequences with the anti-human IgE monoclonal antibody PTmAb0005, respectively. Amino acid pattern similarity between the peptide and human IgE demonstrates a strong homologous match with the cd loop in the IgE Cε2 domain. The homology pattern generated from phage recovery is Qhhahah, where h = hydrophobic amino acids and a = amino acids, which correspond to the sequence QVMDVDL (SEQ ID NO: 17) in the CD loop of the human IgE Cε2 domain. Aligned in a row.
[0129]
IgEC67, a peptide obtained from phage panning experiments and having the highest affinity for PTmAb0005, was also epitope mapped. This was performed by inducing random mutations by PCR mutagenesis and subcloning in the Hughes 5 vector for the fibrillar phage protein gIIIp display. IgEC67 mutants were graded in the order of binding to PTmAb0005 as shown in Table 8. These and other results confirmed the importance of amino acids within IgEC67 aligned with the Cε2 epitope. For example, the L8P, D10G, L11M, E12G and L13R mutants all had reduced binding to anti-IgE PTmAb0005 (data not shown). Mutations at other sites had little effect on affinity for PTmAb0005.
[0130]
Random sublibraries were generated from peptides derived from the highest affinity PTmAb0005 and PTmAb0011 phage display and described in the previously described method (Yu, J. and Smith, GP (1996) "Affinity maturing of phage-displayed peptides"). The peptide affinity for antibodies was enhanced by adapting "Methods in Enzymology, 267, 3-27). This involves DNA subcloning transfer from a large coat protein (gVIIIp) filamentous phage display vector to a low copy number small phage coat protein (gIIIp) display vector by a random PCT step. A sub-library is generated from several phage sequences, including the highest affinity PTmAb0005 ligands IgEC67 and IgEC67-8. The affinity maturation sequences for C67 and C67-8 are shown in Tables 8 and 9, respectively. Included in the table are the rank rankings and, where available, the BIA core affinity. When peptide expressing phage is used as an immunogen, IgEC67-8 is capable of inducing an anti-human IgE response in mice.
[0131]
7.2 Target validation by domain mapping
A number of constructs were generated to map the binding specificity of PTmAb0005 and PTmAb0011 for the IgE constant domain. The following constructs were generated: Cs2-4, Cs2-3, Cs3-4, Cs3-4L (Cs3-4 + linker sequence between domains Cs2 and Cs3) and Cs2 alone.
[0132]
Fragments encompassing the various domain (s) of human IgE Fe were cloned using cDNA obtained from hybridoma strain JW8 / 5/13 expressing chimeric human IgE (Neuberger, MS et al (1985) Nature 314). , 268-270; Bruggemann, M et al (1987) J Exp Med 166, 1351-61). The IgE Fe fragment was amplified using the appropriate primer pair and the JW / 8/5/3 cDNA as a template. The cε2-4 fragment encodes the amino acid (aa) S225-K547. The cε3-4 fragment encodes aaG335-547. The cε3-4L fragment (linker sequence linking domain 3-4 + cε2 to cε3) encodes aaE322-K547. The cε2-3 fragment encodes aaS225-G436. The cε2 fragment encodes aaS225-S324. All constructs contain a COOH-terminated hexahistidine tail for detection and purification purposes. These fragments were cloned in a eukaryotic expression vector in frame with a CD33-derived leader coding sequence to direct secretion of the expressed fragments. This allowed expression in mammalian cell lines. The vector was obtained from pcDNA3.1 + (Invitrogen). To express the cloned fragment, the appropriate clone was transfected into COS-7 cells and the resulting conditioned medium was harvested 48-60 hours after transfection.
[0133]
The ELISA assay bound the construct to an ELISA plate and then tested the binding of PTmAb0005 and PTmAb0011 to the expressed IgE domain by incubation with a monoclonal antibody and exposure to an anti-mouse antibody. In addition, binding to the denatured construct was examined by the well-known technique of Western blot.
[0134]
The results for PTmAb0005 showed strong binding to Cs2-4, Cs2-3 and Cs2- in their native form, and still bound to Cs2-4 and Cs2 after denaturation in Western blots. No binding to Ce3-4 or Ce3-4L was observed in any of the assays.
[0135]
PTmAb0011 also bound in its native form to Cs2-4, Cs2-3 and Cs2, and further bound in its modified form to Cs2-4 and Cs2.
[0136]
Thus, it is clear that the antibody recognized the target epitope present in the IgE Cε2 domain.
[0137]
7.3 Target validation by site-directed mutagenesis
Domain mapping studies demonstrated that both mAbs could bind to the Cε2 domain alone. Analysis of the sequence obtained from biopanning of the phage-displayed peptide library revealed that the PTmAb0005-derived sequence showed significant similarity to P1. This region forms a loop between the C-Dβ chains of Cε2 in the IgE model structure. Site-directed mutagenesis studies were undertaken to validate this sequence as an epitope for PTmAb0005 and PTmAb0011.
[0138]
Analysis of panel phage sequences and comparison of the IgE model structure (Helm et al 1990, supra) with the known structure of human IgG1Fc (Deisenhoffer, J., 1981, Biochemistry, 20, 2361-2370) indicates that it is involved in antibody recognition. The identification of three possible residues was made. These residues are glutamine (Q) 273, methionine (M) 275 and aspartic acid (D) 276. Each of these was changed to alanine (A) and at least one other amino acid residue as shown below.
[0139]
Q273: A and E (glutamic acid)
M275: Q and K (lysine)
D276: A and N (asparagine)
Alanine mutations changed both the structure and chemistry of the target residue, while many mutations retained the structure (as close as possible) but changed, for example, Q273E. Here, glutamic acid has essentially the same structure as glutamine, but is negatively charged instead of neutral.
[0140]
Each mutation was generated separately in the Cε2-4 construct. Each mutant polypeptide can be expressed at levels similar to wild-type (WT) Cε2-4 and each can bind to the recombinant FcεR1α ectodomain as efficiently as WTcε2-4 in an ELISA-based assay. Was. Together, these data demonstrated that the mutation did not affect the production / secretion of the polypeptide in the expression system, but did not relatively affect the structure of the cε2-4 fragment.
[0141]
All mutations essentially inhibit binding to both PTmAb0005 and PTmAb0011 except D276N, which reduces binding to PTmAb0005 by ５０50% (Table 10). Mutation of an alternative glutamine residue within Cε2, Q317, was performed to serve as a control in these experiments. The Q317E and Q317K mutants were generated and found not to affect the ability of PTmAb0005 and PTmAb0011 to recognize Cε2-4. Similarly, it did not affect recognition of FcεR1α.
[0142]
Thus, the binding activity of PTmAb0005 and PTmAb0011 is specifically affected by mutations in the CD loop of Ce2.
[0143]
In short, sequence P1 contains the major binding determinants for both PTmAb0005 and PTmAb0011.
[0144]
[Table 14]

[0145]
7.4 Preparation of a Purified Model of IgE Ce2 CD Loop
Since the exact structure of human IgE has not yet been determined (although models are available), it is likely that there will be errors in this model structure after inspection at a detailed level. The present invention therefore purified this model of the IgE Cε2 loop region by mapping this loop in the equivalent region of human IgG1 Cγ2 (Deisenhofer J 1981 supra).
[0146]
From this new information on the boundaries of structural features, we designed cyclized peptides that, when synthesized, should conform to a conformation very similar to that of the CD loop of Cε2 in the context of all IgE molecules. . This peptide, Ac-CLEDGVQMDVDLCPREAEGDK (Ac) -NH₂Was designated as PT1079 (SEQ ID NO: 14).
[0147]
The affinity of PT1079 for both PTmAb0005 and PTmAb0011 was measured using the BIAcore technique and very strong recognition for both of these monoclonal antibodies (recognized by both PTmAb0005 and PTmAb0011 with apparent affinities of 〜20 nM and ２５０250 nM, respectively). To be shown). A derivative peptide of PT1079 (PT1078), a control in which the cyclization V is shifted away by only one amino acid residue, thereby reducing the length of the peptide between the cyclization sites by one amino acid residue, is PTmAb0005 or PTmAb0011. And reduced peptide binding. In addition, PT1078 was modified so that additional residues were added so that the loop region had the same number of residues as PT1079, however, this modification failed to restore binding to PTmAb0005 or PTmAb0011. Thus, the importance of modifying the representation of the peptides of the present invention to adapt to a shape very similar to the native target in the context of whole IgE molecules is shown.
[0148]
Embedded image

[0149]
wrap up
The work described here indicates that the monoclonal antibodies PTmAb0005 and PTmAb0011 specifically recognize P1. These antibodies have been used in phage display studies to identify mimotopes of the cd loop of the Cs2 domain of IgE that are recognized by monoclonal antibodies with high affinity.
[0150]
7.5 Functional features of PTmAb0005 and PTmAb0011
The following experiment describes the functional characteristics of PTmAb0005 and PTmAb0011. Thus, the use of targets for these antibodies induces PTmAb0005 and PTmAb0011-like immune responses. Thus, vaccination with these peptide-based immunogens has the same functional characteristics.
[0151]
Example 8
8.1 Materials and Methods
8.1.1 FcεRIα Binding Assay (Protein A Plate)
In this assay, chimeric IgE is bound using a recombinant form of the ectodomain of the α chain of the high affinity receptor for IgE (α ectodomain). The carboxyl terminus of the α ectodomain is fused to a human IgG1 Fc sequence. This binds the recombinant molecule to the protein A-coated microtiter plate via the Fc region. Therefore, the majority of α-ectodomain molecules should be available for binding ligands and provide a system for analysis of IgE-receptor interactions. The format described below is for the detection of (high affinity) receptor blocking activity of anti-IgE antibodies.
[0152]
8.1.2 ELISA Protocol for Detection of IgE Binding to the High-Affinity Receptor α-Chain Ectodomain
Coat the Protein A plate with 100 μl / well α-Ect-Ig fusion protein diluted to 0.25 μg / ml in blocking buffer (PBS / 5% BSA / 0.05% Tween 20). Incubate at 37 ° C. for 1 hour. The chimeric IgE is diluted to 0.03125 μg / ml in 10% porcine serum. The anti-IgE antibody is diluted in this IgE solution to the appropriate test concentration (s). Incubate for 1 hour at room temperature. Wash the plate three times with PBS / 0.05% Tween 20 using a plate washer. Add 100 μl / well of IgE: anti-IgE solution (assay each anti-IgE concentration four times). Incubate at 37 ° C. for 1 hour. Wash the plate three times with PBS / 0.05% Tween 20 using a plate washer. Add 100 μl / well of goat anti-mouse lambda chain HRPO conjugated antibody diluted to 1: 6000 dilution solution in blocking solution. Incubate at 37 ° C. for 1 hour. Wash the plate three times with PBS / 0.05% Tween 20 using a plate washer. Add 200 μl / well OPD substrate and incubate in the dark for 2-10 minutes at room temperature. 25 μl of 25% H₂SO₄The reaction is stopped by addition of. Mix stop reaction on plate shaker-SLOW speed. Read the OD at 490 nm.
[0153]
A number can be calculated for the percent inhibition of IgE binding to its receptor. The maximum binding value for IgE is determined from the average of a set of wells containing IgE in 10% porcine serum alone (ie, non-anti-IgE).
[0154]
Therefore, the% inhibition value is calculated as follows:
(Maximum IgE value−Average value of anti-IgE replicate) / Maximum IgE value × 100
8.1.3 FcεRIα binding assay (reduced ectodomain)
This assay is essentially the same as the previous assay, except that the FcεRIα ectodomain / IgG construct is treated with proteolytic enzyme factor X to cleave the two parts. The IgG Fc portion is removed using Protein A beads and Factor X using Streptavidin beads, thus leaving an essentially pure α-chain ectodomain product. In this assay format, the alpha ectodomain is bound to a plastic microtiter plate. All other test details are party interests as described above.
[0155]
8.1.4 CD23-binding assay (FcεRII, low affinity receptor)
The assay was performed on RPMI 8866 cells or primary human B cells. Two formats can be used: one for the detection of mAb binding to IgE associated with FcεRII and the second to analyze whether the mAb interferes with IgE associated with FcεRII. For the first assay, PBS, 1% FBS, 0.1% NaN₃Cells were loaded with chimeric IgE (1 μg / ml) for 1 hour on ice in ice. Excess IgE was removed and anti-IgE mAb was added. FITC-conjugated rat anti-mouse IgG₁The antibody revealed bound mAb. For the second assay, chimeric IgE (1 μg / ml) was preincubated with the anti-IgE mAb for 1 hour at room temperature with gentle mixing before adding to the cells. The mixture was incubated with the cells for 1 hour on ice and then washed to remove unbound IgE. FITC-goat anti-human IgE detects bound IgE or FITC-conjugated rat anti-mouse IgG₁Antibody detected bound anti-IgEmAb. When testing was performed on PBMC, PE-conjugated anti-CD19 antibodies identified constituent B cells. Samples were analyzed by flow cytometry.
[0156]
8.2 Results
The results for PTmAb0005 and PTmAb0011 are shown in FIGS. FIG. 16 shows the concentration-dependent binding of monoclonal antibodies to plate-bound IgE. FIG. 17 shows the concentration-dependent suppression of IgE binding to the FcεR1α / IgG construct by PTmAb0005 and PTmAb0011. FIG. 18 shows the inhibition of IgE binding to the reduced ectodomain of FcεRIα directly bound to a plastic plate by antibodies PTmAb0005 and PTmAb0011. FIG. 19 shows the lack of suppression of IgE binding to FcεRII (CD23) by antibodies PTmAb0005 (clone GE-1) and PTmAb0011. 20 and 21 show the concentration-dependent blockade of histamine release from basophils in allergic human blood by the antibodies PTmAb0005 and PTmAb0011.
[0157]
PTmAb0011 is a mouse monoclonal antibody with specificity for human IgE and does not show cross-reactivity with other human Ig isotypes or rat / mouse IgE. PTmAb0011 binds to native and heat-treated IgE therapies when bound to the ELISA plate in a random orientation, indicating that its recognition site on IgE is thermolabile. PTmAb0011 also recognizes IgE when bound to an ELISA plate via an antigen. It is important that this mAb can completely block the interaction between human IgE and the α-chain binding component of the high affinity IgE receptor (FcεRI). However, this mAb still recognizes human IgE when pre-bound to FcεRI, indicating that the mAb binding site is not lost upon receptor binding.
[0158]
Example 9
9.1 Analysis of IgE binding properties of PTmAb0011 by normal and antigen oriented ELISA
By coating the plates with human chimeric IgE, myeloma IgE, human Ig isotype or rodent IgE (1 μg / ml in pH 9.6 carbonate / bicarbonate coating buffer) as described in Example 1 A normal IgE binding ELISA was performed. For antigen-directed ELISA, NP-BSA was coated at a saturating concentration before addition of chimeric IgE (1 μg / ml). Alternatively, soluble human FcεRIα chain was coated (0.25 μg / ml), followed by addition of chimeric IgE. The remaining ELISA was performed as described in Experiment 1 (ELISA protocol for detection of mouse anti-human IgE mAb).
[0159]
9.2 Result
FIG. 22 illustrates that PTmAb0011 binds to both human / mouse chimeric IgE and human myeloma IgE when bound to ELISA plates in a random orientation fashion. Similarly, binding to antigen-oriented IgE (ie, IgE bound to the resulting conjugated NP-BSA) is dose-dependent. PTmAb0011 was also analyzed for its ability to recognize chimeric IgE after heat treatment at 56 ° C. for a series of periods. FIG. 22 shows that the binding ability of PTmAb0011 for IgE is not affected by heat treatment.
[0160]
The mAb characterization was further extended to determine if PTmAb0011 could suppress the interaction of IgE with the α-chain component of the high affinity IgE receptor (FIG. 23). Preincubation of PTmAb0011 prior to addition to plate-bound FcεRIα chain resulted in a dose-dependent suppression of IgE interaction with FcεRIα chain. PTmAb0011 similarly (FIG. 24) recognizes FcεRIα chain-related IgE in a dose-dependent manner.
[0161]
Example 10
10.1 Analysis of IgE secretion from primary human B cells
2 x 10 in 96 U well plates in medium supplemented with IL-4 and anti-CD40⁵PBMC were plated in cells / well. PTmAb0011 or an isotype matched control mAb was added and the cells were incubated for 14 days before harvesting the supernatant for IgE analysis. Total IgE levels were measured by coating ELISA plates with rabbit anti-human IgE antibody (10 μg / ml) in 0.5 M carbonate / bicarbonate buffer (pH 9.6). Washed plates were blocked with PBS, 0.05% Tween 20, 5% BSA. Both the cell supernatant and the IgE standard were incubated with a saturating amount of PTmAb0011 (10 μg / ml) for 1 hour at room temperature before being added to an ELISA plate to generate an IgE / anti-IgE complex. After the incubation and washing steps, bound IgE was detected with HRP-sheep anti-human IgE followed by OPD substrate. Next, the level of IgE in the cell supernatant was estimated relative to a standard curve.
[0162]
10.2 Result
IgE was pre-incubated with PTmAb0011 over a dose range of 10 μg / ml to 0.5 μg / ml and tested for its effect on subsequent IgE binding to FcεRII on human B cell line RPMI8866. FIG. 25 illustrates that pre-incubation of IgE with PTmAb0011 enhances IgE binding to FcεRII. A non-P1-specific monoclonal antibody (PTmAb0017) did not enhance IgE binding to the FcεRII receptor. PTmAb0011 enhances IgE binding to FcεRII on primary B cells (FIG. 26).
[0163]
10.3 Effect of PTmAb0011 on IgE secretion from primary human B cells
Peripheral blood mononuclear cells were cultured with PTmAb0011 in the presence of additional IL-4 and anti-CD40 antibodies to facilitate B cell isotype switching to IgE secretion. An ELISA assay was developed that allowed measurement of total IgE levels, ie, free IgE and PTmAb0011 conjugated IgE. To achieve such quantification, secreted IgE was pre-incubated with saturating levels of PTmAb0011 to allow all IgE to complex. Total IgE in tissue culture supernatant was quantified relative to a standard curve of IgE complexed with saturating levels of PTmAb0011. FIG. 27 illustrates that incubation of primary B cells with PTmAb0011 (1 μg / ml) resulted in a significant reduction in total levels of secreted IgE in three different donors. No such suppression was observed with the isotype matched control antibody.
[0164]
10.4 Determination of histamine release from human basophils
Two assay formats were adapted. PBMCs from non-allergic donors were passively sensitized with 1 μg / ml chimeric IgE at 37 ° C. for 30 minutes, washed and treated with monoclonal antibodies at 37 ° C. for 30 minutes. Alternatively, PBMC from a LolP1-sensitive donor were directly treated with the monoclonal antibody at 37 ° C. for 30 minutes. The reaction was stopped by centrifugation. Histamine release in the cell supernatant was determined by a specific immunoassay (Immunotech 2562). Total cellular histamine content was determined in cells lysed with 0.5% Igepal detergent.
[0165]
10.5 Basophil block assay
Anti-IgE antibody that blocks binding of chimeric IgE to FcεR1 in human basophils by incubation of PBMC from a non-allergic donor with chimeric IgE for 30 min at 37 ° C. in the presence of monoclonal antibody and IL-3 Abilities were determined. Cells were washed and histamine release was triggered by NP-BPA for an additional 30 minutes at 37 ° C. The reaction was stopped by centrifugation and histamine release was measured as above.
[0166]
10.6 Allergic basophil suppression assay
The ability of anti-IgE antibodies to suppress allergen-triggered degranulation was examined by pre-incubating PBMC from a LolP1-sensitive donor with a monoclonal antibody for 30 minutes at 37 ° C. before triggering with LolP1.
[0167]
10.7 Determination of tryptase release from human lung mast cells
Crude mast cell suspension was prepared from human lung tissue by enzymatic digestion with a cocktail containing hyaluronidase, pronase and DNase. Cells were used directly or pre-sensitized with chimeric IgE prior to treatment with anti-IgE antibodies. Mast cell degranulation was confirmed by a colorimetric assay for the granular enzyme tryptase.
[0168]
10.8 Determination of β-hexosaminidase release from RBL cells transfected with human FcεR1α
Sheffield University B. The transfected cell line RBL J41 was obtained from Dr. Helm. Cells were passively sensitized with mouse monoclonal IgE anti-DNP or human chimeric IgE anti-NP and triggered with anti-human IgE antibodies. Degranulation was measured by a colorimetric assay of β-hexosaminidase release.
[0169]
10.9 Results
10.9.1 Anaphylactogenicity of anti-IgE monoclonal antibodies in human basophils
A number of different anti-monoclonal antibodies were assayed for their ability to trigger histamine release from allergic and non-allergic basophils (FIG. 28). In contrast to other antibodies, PTmAb0011 cannot consistently produce significant histamine release.
[0170]
10.9.2 Anaphylactogenicity of anti-IgE monoclonal antibodies in human lung mast cells
PTmAb0011 is unable to release significant amounts of tryptase in both sensitized and unsensitized human lung mast cells (FIG. 29). Polyclonal anti-human IgE shows 60-70% release in these cells.
[0171]
10.9.3 Anaphylactogenicity of Anti-IgE Monoclonal Antibodies in RBL Cells Transfected with Human FcεR1α
RBL J41 cells passively sensitized with chimeric human IgE anti-NP could be triggered with anti-NP-BSA, as well as with polyclonal anti-human IgE, but not with PTmAb0011 (FIG. 30). In contrast, when cells were sensitized with mouse IgE anti-DNP, both anti-human IgE antibodies had no effect. Cells could still be triggered by the antigen DNP-BSA.
[0172]
10.9.4 Basophil block assay
PTmAb0011 was able to block IgE binding to FcεR1 in non-allergic basophils and thus suppress subsequent triggering by the NP-BSA antigen. IC of this activity₅₀The value was about 60 ng / ml (FIG. 31). PTmAb0011 has an IC of 40 ng / ml₅₀By the value, LolP1-inducible histamine release from allergic basophils could also be strongly suppressed (FIG. 31).
[0173]
Example 11 Monkey Passive Cutaneous Anaphylaxis Test
PTmAb0005 and PTmAb0011 were also tested for in vivo activity. In brief, topical skin mast cells of African green monkeys were scraped and sensitized by intradermal administration of 100 ng of anti-NPigE (human IgE anti-nitrophenylacetyl (NP), purchased from Serotech) to both arms. Twenty-four hours later, the dose range of the tested monoclonal antibody was injected into one arm at the same injection site as human IgE. Control sites on the opposite arm of the same animal are phosphate-buffered saline (PBS) or non-specific human IgE (specific for human cytomegalovirus (CMV) or human immunodeficiency virus (HIV) ) Was administered. Five hours later, 10 mg of BSA-NP conjugate (purchased from Biosearch Laboratories) was administered intravenously. After 15-30 minutes, control animals develop easily observable near-ring edema from anaphylaxis, which can be measured in millimeters. Results are expressed as the mean edema diameter of a group of three monkeys, or as a percentage of inhibition compared to a PBS control. Dec7B, which recognizes peptides 496-506 in the Cε4 domain of human IgE, has been described in EP 0 477 231 B and was used as a positive control.
[0174]
[Table 15]

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[Table 16]

[0176]
[Table 17]

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[Table 18]

[0178]
[Table 19]

[0179]
[Table 20]

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[Table 21]

[0181]
[Table 22]

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[Table 23]

[0183]
[Table 24]

[Brief description of the drawings]
FIG.
FIG. 1 shows the amino acid surface exposure of IgE using the Padran and Davis 1986 model.
FIG. 2
FIG. 2 is a diagram of Chemical Synthesis Pathway 1, illustrating solid phase peptide synthesis.
FIG. 3
FIG. 3 is a diagram of Chemical Synthesis Routes 2 and 3, showing the preparation of the modified carrier.
FIG. 4
FIG. 4 is a diagram of chemical synthesis pathway 4, showing the formation of a peptide / carrier complex.
FIG. 5
FIG. 5 shows C67-8 anti-IgE data. (A) Anti-serum of serum from Balb C mice immunized with 25 μg BSA-IgE C67-8 (conjugated using PTL chemistry) or 3 μg HepB core-IgE C67-8 construct. Plate bound IgE reactivity. (B) Antibodies from serum from Balb C mice immunized with 25 μg BSA-IgE C67-8 (conjugated using PTL chemistry) or 3 μg HepB core-IgE C67-8 construct. Receptor bound IgE reactivity.
FIG. 6
FIG. 6 is a diagram of a competition assay using soluble IgE and IgE C67-8 peptide. Serum from mice immunized with BSA-IgE C67-8 or HBC-IgE C67-8 was purified using soluble IgE (10 μg / ml) or IgE C67-8 peptide (25 μM) or irrelevant peptide PT326 (25 μM). And pre-cultured and added to an IgE-coated ELISA plate. Data are means ± standard error of the measurement (n = 10).
FIG. 7
FIG. 7 shows data of PT1079 anti-IgE. (A) Anti-plate-bound IgE reactivity of serum from Balb C mice immunized with 25 μg BSA-PT1079 (conjugated using PTL chemistry) or 3 μg HepB core-PT1079 construct. (B) Anti-receptor binding IgE reactivity of serum from Balb C mice immunized with 25 μg BSA-PT1079 (conjugated using PTL chemistry) or 3 μg HepB core-PT1079 construct. .
FIG. 8
FIG. 8 is a diagram of a competition assay using soluble IgE and the PT1079 peptide. Serum from mice immunized with BSA-1079 or HBC-PT1079 was pre-cultured with soluble IgE (10 μg / ml) or PT1079 peptide (25 μM) or irrelevant peptide PT326 (25 μM) and coated with IgE. Added to ELISA plate. Data are means ± standard error of the measurement (n = 10).
FIG. 9
FIG. 9 shows data of PT1078 anti-IgE. (A) Anti-plate bound IgE reactivity of serum from Balb C mice immunized with 25 μg BSA-PT1078 (conjugated using PTL chemistry). (B) Anti-receptor bound IgE reactivity of serum from Balb C mice immunized with 25 μg BSA-PT1078 (conjugated using PTL chemistry).
FIG. 10
FIG. 10 is a diagram of a competition assay using soluble IgE and PT1078 peptide. Serum from mice immunized with BSA-1078 was pre-cultured with soluble IgE (10 μg / ml) or PT1078 peptide (25 μM) or irrelevant peptide PT326 (25 μM) and added to an IgE-coated ELISA plate did. Data are means ± standard error of the measurement (n = 10).
FIG. 11
FIG. 11 shows data of PT1079gs anti-IgE. (A) Anti-plate bound IgE reactivity of sera from Balb C mice immunized with 3 μg of HBC-PT1079gs. (B) Anti-receptor binding IgE reactivity of serum from Balb C mice immunized with 3 μg of HBC-PT1079gs.
FIG.
FIG. 12 is a diagram of a competition assay using soluble IgE and the PT1079 peptide. Serum from mice immunized with HBC-PT1079gs was pre-cultured with soluble IgE (10 μg / ml) or PT1079 peptide (25 μM) or irrelevant peptide PT326 (25 μM) and added to an IgE-coated ELISA plate did. Data are means ± standard error of the measurement (n = 10).
FIG. 13
FIG. 13 shows the inhibitory activity of antiserum induced by mouse BSA-C67-8. Cells from a LolP1 sensitive donor were treated with mouse serum (diluted 1/50) and then histamine release was initiated with LolP1. Data are means ± standard error of the measurement (n = 10).
FIG. 14
FIG. 14 shows the inhibitory activity of mouse serum induced by BSA-PT1078 and BSA-PT1079. Cells from LolP1 sensitive donors were treated with mouse serum (BSA antiserum and BSA-PT1078 antiserum diluted 1/50; BSA-PT1079 antiserum diluted 1/1250) and then histamine release with LolP1. Started. Data are means ± standard error of the measurement (n = 10).
FIG.
FIG. 15 shows the inhibitory activity of mouse serum induced by HBC-C67-8, HBC-PT1078, HBC-PT1079, and HBC-PT1079gs. Cells from LolP1 sensitive donors were treated with mouse serum (HBC wild-type (wt) and HBC--IgEC C67-8 antiserum diluted 1/50; HBC-PT1079 and HBC-PT1079gs antiserum to 1/1250). Histamine release was then initiated with LolP1. Data are means ± standard error of the measurement (n = 10).
FIG.
FIG. 16 shows that the binding of antibodies PTmAb0005 and PTmAb0011 to IgE is concentration dependent.
FIG.
FIG. 17 shows that the antibodies PTmAb0005 and PTmAb0011 make concentration-dependent inhibition of IgE binding to the Fcε1α / IgG construct as compared to controls.
FIG.
FIG. 18 shows that, compared to controls, antibody PTmAb0005 renders concentration-dependent inhibition of IgE binding to the truncated ectodomain of FcεR1α directly bound to plastic plates.
FIG.
FIG. 19 shows how IgE binds to FcεRII (CD23) by the antibodies PTmAb0005 (GE-1) and PTmAb0011.
FIG.
FIG. 20 shows that histamine release from basophils in the blood of allergic persons is suppressed depending on the concentrations of antibodies PTmAb0005 and PTmAb0011 as compared to controls.
FIG. 21
FIG. 21 shows that histamine release triggered by LolP1 from basophils in the blood of allergic individuals is suppressed by both PTmAb0005 and PTmAb0011.
FIG. 22
FIG. 22 shows PTmAb0011 binding to various IgEs; (A) PTmAb0011 binding to chimeric IgE; (B) PTmAb0011 binding to myeloma IgE; (C) PTmAb0011 binding to antigen-directed IgE; (D) heat. PTmAb0011 that binds to IgE denatured with.
FIG. 23
FIG. 23 shows how the binding of IgE to FcεR1α is suppressed by PTmAb0011.
FIG. 24
FIG. 24 shows the binding of PTmAb0011 to IgE bound to the receptor.
FIG. 25
FIG. 25 shows (A) the effect of PTmAb0011 on IgE on binding to FcεRII on RPMI 8866 cells. RPMI 8866 cells (1 × 10⁶/ Ml) was incubated with chimeric IgE (1 μg / ml) and anti-IgE mAb (10-0 μg / ml) for 1 hour on ice. IgE and anti-IgE were pre-cultured at room temperature for 1 hour and then added to the cells. Bound IgE was detected using FITC-goat anti-human IgE. As a result, the mean channel fluorescence (MCF) of duplicate samples is shown, where 10,000 gated events of interest were measured by flow cytometry analysis. (B) Non-P1-specific antibody PTmAb0017.
FIG. 26
FIG. 26 shows the effect of PTmAb0011 on IgE on binding to FcεRII on primary human B cells. Peripheral blood mononuclear cells (1 × 10⁶/ Ml) was incubated for 1 hour on ice with chimeric IgE (1 μg / ml) and anti-IgE mAb (10-0 μg / ml; open) or isotype-matched control mAb (solid) at the same concentration. IgE and anti-IgE were pre-cultured at room temperature for 1 hour and then added to the cells. Bound IgE was detected using FITC-goat anti-human IgE, and primary B cells were revealed using PE-conjugated anti-CD. The results show the mean channel fluorescence (MCF) of duplicate samples, as measured by flow cytometry analysis of 5,000 gated events of interest.
FIG. 27
FIG. 27 shows the effect of PTmAb0011 on IgE secreted from primary human B cells. Peripheral blood mononuclear cells (2 × 10⁵/ Ml) was cultured in a medium supplemented with IL-4 (10 ng / ml) and an anti-CD40 antibody (1 µg / ml). PTmAb0011 or isotype matched control mAb was added (1 μg / ml) over 14 days, supernatant cells were collected and analyzed for total IgE content by ELISA. The results are expressed in% IgE secreted in the absence of any antibodies.
FIG. 28
FIG. 28 shows anaphylaxis-inducing properties of anti-human IgE monoclonal antibodies in allergic human basophils (A) and non-allergic human basophils (B). PBMC from allergic or non-allergic donors passively sensitized with 1 μg / ml chimeric IgE were treated with mAbs at 37 ° C. for 30 minutes. Histamine release was measured by specific EIA. Data are the average of three separate experiments, each performed with a different donor.
FIG. 29
FIG. 29 shows anaphylaxis-inducing activity of anti-human IgE antibodies in sensitized human lung mast cells (A) and non-sensitized human lung mast cells (B). Dispersions of sensitized or unsensitized crude human lung mast cells were treated with antibodies at 37 ° C. for 45 minutes. Release of tryptase into the supernatant was measured by a colorimetric assay. Data are the average of two replicates of one representative experiment.
FIG. 30
FIG. 30 shows the anaphylaxis of anti-human IgE antibodies in RBL J41 cells from human FcεRI (A) and mouse FcεRI (B). RBL J41 cells were sensitized with human chimeric IgE or mouse IgE and treated with antibodies at 37 ° C. for 30 minutes. Release of β-hexosaminidase into the supernatant was measured by a colorimetric assay. Data are the average of three replicates of one representative experiment.
FIG. 31
FIG. 31 shows how histamine release triggered by allergen in human basophils is suppressed by PTmAb0011. PBMCs were incubated for 30 minutes at 37 ° C. with PTmAb0011 alone (allergy assay (A)) or with PTmAb0011 and IgE (blocking assay (B)). The cells were then triggered with antigen for 30 minutes at 37 ° C. and histamine release was measured by specific EIA. Data are means ± standard error of measurement of three separate experiments, each performed with a different donor.
FIG. 32
FIG. 32 shows the suppression of passive cutaneous anaphylaxis in monkey skin by PTmAb0011 and PTmAb0005. The monoclonal antibody Dec7B (Stanworth decapeptide) was used as a control.

Claims (41)

A peptide comprising an isolated surface-exposed epitope of the IgE Cs2 domain, or a mimotope thereof. The peptide according to claim 1, wherein the surface-exposed epitope of Cε2 is P1 (SEQ ID NO: 1), or a mimotope thereof. 2. The peptide according to claim 1, wherein the surface exposed epitope of Cε2 is P2 (SEQ ID NO: 2), or a mimotope thereof. The peptide according to claim 1, wherein the surface-exposed epitope of Cε2 is P3 (SEQ ID NO: 3), or the mimotope thereof. The peptide according to claim 1, wherein the surface-exposed epitope of Cε2 is P4 (SEQ ID NO: 4), or a mimotope thereof. The peptide according to claim 1, wherein the surface-exposed epitope of Cε2 is P5 (SEQ ID NO: 5), or the mimotope thereof. 2. The peptide according to claim 1, wherein the surface exposed epitope of Cε2 is P6 (SEQ ID NO: 6), or a mimotope thereof. 2. The peptide according to claim 1, wherein the surface exposed epitope of Cε2 is P7 (SEQ ID NO: 7), or a mimotope thereof. The mimotope according to any one of claims 1 to 8, which is a peptide. The peptide according to claim 1, wherein the isolated epitope is obtained from a loop structure of the IgE Cs2 domain. The peptide according to claim 10, wherein the loop structure of the IgE Cs2 domain is an AB or CD loop. The mimotope of P1 has the general formula:
hxdhhananxy
Wherein h is a hydrophobic amino acid residue, d is an ionic bond donor amino acid residue, a is a produced amino acid residue, n is an ionic neutral / non-polar amino acid residue, and x is an amino acid)
The peptide according to claim 2, which is a peptide of the formula: The mimotope of P1 has the general formula:
Q, X ₁ , M, D, X ₁ , X ₂ , X ₃
Wherein X ₁ is selected from V, I, L, M, F or A, X ₂ is selected from D or E, and X ₃ is L, I, V, M, A or F Selected from)
The peptide according to claim 2, which is a peptide of the formula: The mimotope of P1 is selected from the group consisting of P15q (SEQ ID NO: 11), PT1079 (SEQ ID NO: 13), PT1079GS (SEQ ID NO: 15), PT1078 (SEQ ID NO: 16), PT15 (SEQ ID NO: 8). peptide. The peptide according to claim 3, wherein the mimotope of P2 is P16 (SEQ ID NO: 24). The peptide according to claim 4, wherein the mimotope of P3 is P17 (SEQ ID NO: 26). An immunogen for the treatment of allergy comprising a peptide or mimotope according to any of claims 1 to 16, further comprising a carrier molecule. 18. The immunogen according to claim 17, wherein the carrier molecule is selected from protein D or hepatitis B core antigen. 19. An immunogen according to claim 17 or claim 18, wherein the immunogen is a chemical complex of the peptide or mimotope of claim 1 or expressed as a fusion protein. 20. An immunogen according to any of claims 17 to 19, wherein the peptide or peptide mimotope is presented within the primary sequence of the carrier. A vaccine for the treatment of allergy comprising an immunogen according to any of claims 17 to 20, further comprising an adjuvant. A ligand capable of recognizing the surface-exposed epitope of the IgE Cs2 domain, wherein the ligand is not PTmAb0005. 23. The ligand of claim 22, which is PTmAb0011 deposited under deposit number 9930805 under the Budapest Treaty Patent Deposit at ECACC on March 8, 1999. A pharmaceutical composition comprising a ligand capable of recognizing the surface-exposed epitope of the IgE Cs2 domain. 25. The pharmaceutical composition of claim 24, wherein the ligand is capable of recognizing the CD loop of the IgE Cs2 domain. 26. The pharmaceutical composition according to claim 25, wherein the ligand is a monoclonal antibody selected from PTmAb0005 or PTmAb0011. The peptide according to any one of claims 1 to 16 for use in medicine. The vaccine according to claim 21, which is used for medical treatment. An immunogen according to any of claims 17 to 20 for use in medicine. Use of a peptide according to any of claims 1 to 16 in the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of allergy. A ligand capable of recognizing a surface-exposed epitope of the Cε2 domain of IgE for use in medicine. Use of a ligand capable of recognizing the surface exposed epitope of the IgE Cs2 domain in the manufacture of a medicament for the treatment of allergy. 33. Use of a ligand according to claim 31 or 32 which is PTmAb0005 or PTmAb0011. Use of PTmAb0005 or PTmAb0011 in the identification of P1 mimotopes. A peptide that can be recognized by PTmAb0005 or PTmAb0011. An immunogen comprising the peptide of claim 35. Use of a peptide according to claims 1 to 16 in diagnosis or in the affinity purification of circulating anti-IgE antibodies from blood. A method for producing a vaccine, comprising producing an immunogen according to any of claims 17 to 20 and formulating the immunogen with an adjuvant. 17. A method of treating a patient suffering from or suspected of having an allergy, comprising administering to a patient the peptide of any of claims 1-16. 22. A method of treating a patient suffering from or suspected of having an allergy, comprising administering to the patient the vaccine of claim 21. 27. A method of treating a patient suffering from or suspected of having an allergy, comprising administering to the patient a pharmaceutical composition according to any of claims 24-26.

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