JP2004538008A - 方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、プリオン病に対する被験者の感受性を決定する方法であって、（ａ）前記被験者からのサンプルを提供するステップと、（ｂ）前記サンプルのヒト白血球抗原に対する特異性を決定するステップとを含み、前記サンプルがＤＱ７ヒト白血球抗原に対する特異性を有する場合は、前記被験者がプリオン病に対して低い感受性を有し、前記サンプルがＤＱ７ヒト白血球抗原に対する特異性を有さない場合は、前記被験者がプリオン病に対して高い感受性を有する、と決定する方法に関する。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は方法に関する。特に本発明は、プリオン病に対する被験者の感受性を決定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プリオンは、核酸を含まない伝染性の粒子である。最も顕著なプリオン病は、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、ヒツジのスクレーピー、及びヒトのクロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）である。ＣＪＤの最も一般的な症状発現は、個体中で自然に発生する散発性ＣＪＤ（ｓＣＪＤ）である。医原性ＣＪＤ（ｉＣＪＤ）は、偶発的な感染から生じる疾患である。家族性ＣＪＤ（ｆＣＪＤ）は、家系中で稀に発生し、ヒトＰｒＰ遺伝子の突然変異によって引き起こされる、ＣＪＤの１つの形態である。ヒトの「新しい変異型」ＣＪＤ（ｖＣＪＤ）は、他の型のＣＪＤに関して見られるものと異なる、ＰｒＰ糖型のパターンと関連があるＣＪＤの異なる系統型である。ＢＳＥがウシ類から伝わって、ヒトのｖＣＪＤをもたらした可能性があることが示唆されている。
【０００３】
プリオンは、ＰｒＰScと呼ばれる、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）の改変されたイソ型のみで構成されているようである。正常細胞のＰｒＰ（ＰｒＰCと呼ばれる）は、翻訳後プロセスによってＰｒＰScに転換される。このプロセス中、ＰｒＰCの構造が変化し、ＰｒＰの生理化学的性質の変化を伴う。ＰｒＰScのアミノ酸配列は、遺伝子が複製し続ける哺乳動物宿主の、ＰｒＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列によって決まる。
【０００４】
ｖＣＪＤなどのプリオン病の疫学は、依然として確かなものではない。Ａｔｔｗｏｏｄ（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９：８：２８３は、ＢＳＥが実際に、食物を汚染することによってｖＣＪＤを引き起こしている可能性が高いことが、研究によって現在確認されていると報告している。約１００万頭の汚染されたウシが、ヒトの食物連鎖中に入りこんでいると考えられ、したがって、ｖＣＪＤの大規模な将来の蔓延が予想される。Ｂｅａｌｅ（２００１）Ｊ Ｒ Ｓｏｃ Ｍｅｄ ９４：２０７〜２０９は、プリオン感染からプリオン病までの長い潜伏期によって、実験作業が緩慢且つ困難なものになっていると報告している。
【０００５】
プリオン感受性を予測することが望ましい。プリオン感受性は多因性条件のものであると考えられる。プリオン感受性を予想するための従来技術の試みはわずかであり、それらは主にｓＣＪＤ及びｆＣＪＤに焦点を当てたものである。プリオン感受性を予想する方法が必要とされている。
【０００６】
ある従来技術の研究は、ｖＣＪＤ病をＰｒＰ配列多型と相関付けている（ＰｒＰ Ｍｅｔ１２９、Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他、１９９６ Ｌａｎｃｅｔ ｖｏｌ ３４８ ｐ．５６を参照のこと）。
【０００７】
本発明は、従来技術に関する問題点を克服しようとするものである。
【非特許文献１】
Ａｔｔｗｏｏｄ（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９：８：２８３
【非特許文献２】
Ｂｅａｌｅ（２００１）Ｊ Ｒ Ｓｏｃ Ｍｅｄ ９４：２０７〜２０９
【非特許文献３】
Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他、１９９６ Ｌａｎｃｅｔ ｖｏｌ ３４８ ｐ．５６
【非特許文献４】
Ｒｏｉｔｔ、Ｂｒｏｓｔｏｆｆ及びＭａｌｅ編‘Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ’、１９９６ ４th Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｍｏｓｂｙ Ｔｉｍｅｓ Ｍｉｒｒｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ刊行
【非特許文献５】
Ｂｏｄｍｅｒ他、１９９４ Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｖｏｌ ４４ ｐｐ １〜１８
【非特許文献６】
Ｖｉｃｔｏｒ Ａ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ他による、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ
【非特許文献７】
Ｔｏｄｄ他（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：５９９〜６０４
【非特許文献８】
Ｋｗｏｋ他（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：１０２７〜１０３０
【非特許文献９】
Ｔｏｄｄ他（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：１０９４〜１０９８
【非特許文献１０】
Ｇｉｏｒｄａ他（１９９１）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３３ ４０４〜４０８
【非特許文献１１】
Ｙｕｎｉｓ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１ ７７４７〜７７５１
【非特許文献１２】
Ｄｅｌｇａｄｏ他（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．９３：８５６９〜８５７１
【非特許文献１３】
Ａｒｉｆ他（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｍｅｔａｂ．８４ １０５６〜１０６０
【非特許文献１４】
Ｍｉｌｌｅｒ他（１９８８）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６，１２１５
【非特許文献１５】
Ｋａｔｚ他（１９８７）ＪＰｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ ５８：６０７〜６１０
【非特許文献１６】
Ｂｉｄｗｅｌｌ（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ９，１８〜２３
【非特許文献１７】
Ａｎｇｅｌｉｎｉ他（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，４４８９〜４４９３
【非特許文献１８】
Ｂｕｎｃｅ他（１９９５）Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４６，３５５〜３６７
【特許文献１】
ＷＯ ９８／１６８３４
【非特許文献１９】
Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９１）Ｌａｎｃｅｔ ３３７，１４４１〜１４４２
【非特許文献２０】
Ｐａｌｍｅｒ他（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２，３４０〜３４２
【非特許文献２１】
Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９６）Ｌａｎｃｅｔ ３４８，５６
【非特許文献２２】
Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）
【非特許文献２３】
Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）４ｔｈ Ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ
【非特許文献２４】
Ｓｃｏｔｔ他（１９８９），Ｃｅｌｌ ５９，８４７〜８５７
【非特許文献２５】
Ｓｃｏｔｔ他（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，１，９８６〜９９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ型のＤＱ７が、プリオン病に対する感受性と関連があるという、驚くべき発見に基づくものである。ＤＱ７を有する被験者はプリオン病に対して低い感受性を有し、一方ＤＱ７ ＨＬＡ型を有していない被験者は、プリオン病に対して高い感受性を示す。
【０００９】
したがって、本明細書では、被験者中のＤＱ７の欠如が、プリオン病に対して高い感受性と相関関係があることを開示する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第一の態様では、本発明は、プリオン病に対する被験者の感受性を決定する方法であって、前記被験者からのサンプルを提供するステップと、前記サンプルのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に対する特異性を決定するステップとを含み、前記サンプルがＤＱ７ヒト白血球抗原に対する特異性を有する場合は、前記被験者がプリオン病に対して低い感受性を有し、前記サンプルがＤＱ７ヒト白血球抗原に対する特異性を有さない場合は、前記被験者がプリオン病に対して高い感受性を有すると決定する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
サンプルは、ＨＬＡ型の分類を行うことができる任意の組織又は体液であってよい。
【００１２】
「ＨＬＡ特異性を決定する」とは、ＨＬＡ特異性又はＨＬＡ型を解明することを意味する。このプロセスは一般に、「ＨＬＡ型分類」と呼ばれる。用語「ＨＬＡ特異性」及び「ＨＬＡ型」は、本明細書では互換的に使用する。
【００１３】
サンプルをＨＬＡ型分類する（すなわち、ＨＬＡ特異性を決定する）ときは、充分な情報を集めて、そのサンプルがＤＱ７であるか、それともＤＱ７ではないかを決定しなければならない。用語「ＤＱ７」は、無数の基本的な免疫学教本（たとえば、Ｒｏｉｔｔ、Ｂｒｏｓｔｏｆｆ及びＭａｌｅ編集「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、１９９６ ４th Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｍｏｓｂｙ Ｔｉｍｅｓ Ｍｉｒｒｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ刊を参照のこと；Ｂｏｄｍｅｒ他、１９９４ Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｖｏｌ ４４ ｐｐ １〜１８も参照のこと）に記載されている、よく知られているＨＬＡ型を指す。
【００１４】
当業者に知られている任意の適切な手段によって、サンプルをＨＬＡ型分類することができる。このような手段には、血清型の分類、ＤＮＡの配列決定、配列特異的オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）、又は配列特異的プライマーによるＰＣＲ（ＰＣＲ−ＳＳＰ）などの核酸に基づく方法、又は任意の他の適切な方法がある。ＨＬＡの型分類については、以下でより詳細に論じる。核酸に基づく方法を使用して、サンプルをＨＬＡ型分類することが好ましい。したがって、他の態様では、本発明は、前に記載した方法であって、ヒト白血球抗原に対する特異性を核酸に基づく方法によって決定する方法に関する。ＰＣＲ−ＳＳＰを使用して、サンプルをＨＬＡ型分類することが好ましい。したがって、他の態様では、本発明は、前に記載した方法であって、核酸に基づく方法が配列特異的プライマーによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ−ＳＳＰ）を含む方法に関する。
【００１５】
他の態様では、本発明は、前に記載した方法であって、プリオン病がｖＣＪＤである方法に関する。
【００１６】
他の態様では、本発明は、前に記載した方法であって、サンプルが体液又は組織であるか、或いはそれに由来するものである方法に関する。
【００１７】
他の態様では、本発明は、前に記載した方法であって、体液又は組織が血液である方法に関する。
【００１８】
他の態様では、本発明は、前に記載した方法であって、サンプルが体液又は組織から抽出した核酸であるか、或いはそれに由来するものである方法に関する。
【００１９】
プリオン
本明細書では、用語「プリオン」は、当分野におけるその通常の意味を有するものであり、核酸を含まないタンパク質性感染粒子を指す。
【００２０】
動物及びヒトのプリオン病は、異常な形状の宿主コード化タンパク質、ＰｒＰScの堆積によって特徴付けられる。ヒトのプリオン病には、遺伝性、散発性及び後天性の形態がある。クロイツフェルト−ヤコブ病の変異型（ｖＣＪＤ）は１９９６年に同定され、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）プリオン感染物質に曝されることによって生じる。ｖＣＪＤは、散発性及び他の形態のＣＪＤのそれとは異なる病因を有しており、リンパ細網組織内でのＰｒＰScの蓄積が顕著である。
【００２１】
プリオン病、即ち伝達性海綿状脳症は、核酸を含まない新規な感染物質によって引き起こされる神経変性疾患である。２つの新たな関連プリオン病；ウシ類のＢＳＥ及びヒトのｖＣＪＤの出現に刺激され、分子ベースでの疾患の病因に関する熱心な研究努力が行われている。このｖＣＪＤが、食事又は他の形でのＢＳＥ物質への暴露の結果として生じたものであることは、分子学的及び生物学的な系統の型分類研究によって支持されており、多くの個体が感染している可能性がある。ｖＣＪＤの特徴的な病因は、推定経口感染経路、又はプリオン系統に特異的な作用に関係している可能性がある。リンパ細網系（ＬＲＳ）の関与も、ヒツジのスクレーピー及びネズミモデルのスクレーピーにおいて見られ、この場合は濾胞樹状細胞に、潜伏期の初期、神経学的徴候の発症の充分前に、ＰｒＰScが蓄積することが示されている。ＬＲＳ中でのプリオン複製が、末梢部分への少量の感染物質の接種に続く神経への侵入の前提条件である可能性がある。
【００２２】
プリオンに関する背景知識は、Ｖｉｃｔｏｒ Ａ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ他によって、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍに示されている。プリオンに関する以下の情報は、この情報源から抜き出したものである。
【００２３】
プリオンタンパク質遺伝子の突然変異は、ゲルストマン−ストロイスラー症候群（ＧＳＤ）、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、及び家族性致死性不眠症と関係があり、異常なイソ型のプリオンタンパク質は、これらの疾患において、又クールー及びヒツジのスクレーピーにおいて、感染物質として働くことができる。
【００２４】
Ｐｒｕｓｉｎｅｒ（１９８２、１９８７）は、プリオンが、核酸を含まない新しいクラスの感染物質であることを示唆した用語プリオンは、Ｐｒｕｓｉｎｅｒ（１９８２）によって考案されたもので、「タンパク質感染物質」に由来する）。プリオン病は、接種により伝染し、或いは常染色体優性障害として遺伝する、神経変性疾患である。Ｐｒｕｓｉｎｅｒ（１９９４）は、伝達性海綿状脳症の病因を概説し、プロテアーゼ耐性イソ型プリオンタンパク質がこれらの疾患の病因において重要であることを示した。Ｍｅｓｔｅｌ（１９９６）は、感染性タンパク質の存在に関する、賛成及び反対の証拠、並びに賛成及び反対の意見を概説した。
【００２５】
Ｔａｇｌｉａｖｉｎｉ他（１９９１）は、インディアナ州のある一族の２人の患者から単離したアミロイド斑中心部から抽出したタンパク質を、精製し特徴付けした。彼らは、ＧＳＤアミロイドの主要成分がＰｒＰの１１ｋＤの分解産物であり、そのＮ末端は、ヒトＰｒＰのｃＤＮＡ由来のアミノ酸配列の、位置５８におけるグリシン残基に対応することを発見した。さらに、アミロイド画分は、外見上完全なＮ末端及びアミロイドＰ成分を有する、大きなＰｒＰ断片を含んでいた。Ｔａｇｌｉａｖｉｎｉ他（１９９１）は、これらの発見を、疾患のプロセスがＰｒＰのタンパク質分解をもたらし、アミロイド形成ペプチドを生成させ、それが重合して不溶性繊維になることを示すものと解釈した。家系中で構造遺伝子の突然変異は発見されていないので、ＰｒＰの一次構造以外の要因が、アミロイド形成プロセスにおいて重要な役割を果たしている可能性がある。
【００２６】
１つの解釈は、プリオンがシアロ糖タンパク質であり、その合成がこの障害の主な原因である感染物質によって刺激されるということであり、Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ他（１９８７）は、ＰｒＰペプチドがＣＪＤの感染物質ではないことを示唆する証拠を示した。Ｐａｂｌｏｓ−Ｍｅｎｄｅｚ他（１９９３）は、「プリオン病の回りくどい歴史」を概説し、プリオンが感染性である、すなわちプリオンは細胞傷害性の代謝産物であるという概念に対する、代替案を示唆した。
【００２７】
この筆者達は、代謝産物であるＰｒＰのプロセッシングの研究、及びこのタンパク質の出現を増大させる物質の試験が、彼らの仮説を試験するための有用な方法であろうことを示唆した。彼らのモデルによって、ＰｒＰの異化作用を阻害することができる物質によって、ＰｒＰの蓄積がもたらされるであろうと予言された。トランスジェニックマウス中のＰｒＰ合成が高まると、実験におけるスクレーピーの潜伏期が短くなる。Ｐａｂｌｏｓ−Ｍｅｎｄｅｚ他（１９９３）の仮説は、ＰｒＰの合成経路ではなく分解経路の細胞内での混乱を示唆するものであった。
【００２８】
Ｆｏｒｌｏｎｉ他（１９９３）は、ＰｒＰペプチド１０６〜１２６は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで重合してアミロイド様繊維になる高い固有の能力を有することを見出した。彼らは、主なラット海馬回の培養物をこのペプチドに対応するミクロモル濃度のペプチドに慢性的に曝すことによって、ニューロン死がもたらされることも示した。彼らは、このペプチドの神経毒性作用に、アポトーシス機構が関与していることを示唆した。
【００２９】
伝達性海綿状脳症の感染性病原物質は、正常なプロテアーゼ感受性ＰｒＰタンパク質から翻訳後に誘導される、プロテアーゼ耐性のある、不溶形のＰｒＰタンパク質であることが示唆されている（Ｂｅｙｒｅｕｔｈｅｒ及びＭａｓｔｅｒｓ、１９９４）。Ｋｏｃｉｓｋｏ他（１９９４）は、精製成分から構成された無細胞系における、正常なＰｒＰタンパク質のプロテアーゼ耐性ＰｒＰタンパク質への転換を報告した。ＰｒＰの正常形から病原形へのこの選択的転換には、既存の病原性ＰｒＰの存在が必要であった。この筆者達は、この転換は、新しいＰｒＰタンパク質の生合成、そのアミノ関連グリコシル化、又はその正常なグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーの存在を必要としないことを示した。これによって、病原性ＰｒＰタンパク質が、それと正常なＰｒＰタンパク質の間の特異的なタンパク質間相互作用から形成することができるという、直接的な証拠が与えられた。
【００３０】
Ｒｉｖｅｒａ他（１９８９）は、その核型がテロメア融合１５ｐ；２０ｐから生じる偽二動原体染色体を示す、重度の進行性神経障害を有する１３才の男子を記載した。リンパ球では、異常染色体の動原体の狭窄部は常に染色体２０のそれであり、一方線維芽細胞では、２つの動原体が交互に狭窄していた。この筆者達は、動原体の不活性化が、改変された形状の機能的ＤＮＡ配列が動原体特異的タンパク質との正常な結合を妨げることから生じることを示唆した。彼らは又、クロイツフェルト−ヤコブ病において見られるような、海綿状神経膠ジストロフィーを連想させる患者の障害が、プリオンタンパク質の突然変異体の存在に付随する可能性があると仮定した。
【００３１】
Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９０）は、家族性であれ散発性であれ「プリオン病」が、より適切な診断用語となる可能性があることを示唆した。ＧＳＤ症を有するインディアナ州の一族が、Ｆａｒｌｏｗ他（１９８９）及びＧｈｅｔｔｉ他（１９８９）によって報告された。遺伝的予想においてＰｒＰ遺伝子分析を使用することは、浸透度に関する不確かさ、及び任意の遺伝性の後期発症神経変性障害の前駆症状試験の複雑さから生じる、潜在的な問題点を有する。しかしながら、Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９１）は、その分析が、遺伝性プリオン病を有する家系の遺伝に関するカウンセリングの向上においてある役割を果たし、リスクのある人のＣＪＤ又はＧＳＤの前駆症状の診断又は排除を可能にすると結論付けした。
【００３２】
Ｇａｊｄｕｓｅｋ（１９９１）は、今日までに発見されたＰＲＮＰ突然変異体のチャートを与えた：１個のアミノ酸変化を引き起こす５個の異なる突然変異体、及び５，６，７，８，又は９個のオクタペプチドリピートの５個の挿入体。彼は又、アミロイド症をもたらすトランスサイレチン遺伝子（ＴＴＲ；１７６３００）中で同定された１８個の異なるアミノ酸置換体の表も与え、この２クラスの疾患の挙動の相似点を指摘した。
【００３３】
Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇ他（１９９１）は、アルツハイマー病を有する７６家系、おそらく散発性である１２７症例のアルツハイマー病、１６症例のダウン症候群、及び２５６の正常な対照において、ＣＪＤ及びＧＳＳＤと関連する、ＰＲＮＰ遺伝子及びＰＲＮＰ挿入突然変異体のコドン１０２、１１７、及び２００における、ミスセンス突然変異を探したが、これらの突然変異を肯定するものは無かった。Ｊｅｎｄｒｏｓｋａ他（１９９４）は、組織片の免疫染色を使用して、特発性のパーキンソン病（ＰＤ；１６８６００）、多系統萎縮症、びまん性レビー小体病（１２７７５０）、スチール−リチャードソン−オルスゼフスキー症候群（２６０５４０）、皮質基底核変性症、及びピック病（１７２７００）を含めた、９０症例のさまざまな運動障害において、病原性プリオンタンパク質の検出を試みた。これらの脳標本のいずれにおいても、病原性プリオンタンパク質は同定されなかったが、クロイツフェルト−ヤコブ病を有する４つの対照ではそのタンパク質は容易に検出された。Ｐｅｒｒｙ他（１９９５）はＳＳＣＰを使用して、５４家系からの８２人のアルツハイマー病患者（３０の家族性の症例を含む）、及び３９人の年齢一致対照における、プリオン遺伝子座の突然変異をスクリーニングした。Ｐｅｒｒｙ他は、コドン６８の周辺に、後期発症アルツハイマー病家系の２人の罹患した同胞及び１人の子孫において、５個のグリシン−プロリンが豊富なオクタリピートのうち１個の除去をもたらす２４ｂｐの欠失を発見した。しかしながら、同系中の他の罹患者はこの欠失を共有しておらず、この欠失は後期発症アルツハイマー病家系からの、６人の非罹患メンバーのうち３人の年齢一致対照においても検出された。別のオクタリピートの欠失が、同じアルツハイマー病家系からの他の３人でも検出され、そのうち２人が罹患していた。他の突然変異は発見されなかった。Ｐｅｒｒｙ他（１９９５）は、彼らの調査において、プリオンタンパク質の突然変異とアルツハイマー病を関連付ける証拠は存在しないと結論付けた。
【００３４】
Ｈｓｉａｏ他（１９９０）は、分析した家系の３人のメンバーにおいて、ＰｒＰ遺伝子のオープンリーディングフレームにおける突然変異を発見できなかったが、Ｈｓｉａｏ他（１９９２）は、後になって、フェニルアラニン１９８からセリンへの突然変異を実証した；１７６６４０．００１１を参照のこと。
【００３５】
Ｐａｌｍｅｒ及びＣｏｌｌｉｎｇｅ（１９９３）は、プリオンタンパク質遺伝子の突然変異及び多型について概説した。
【００３６】
Ｃｈａｐｍａｎ他（１９９６）は、プリオンタンパク質遺伝子の、コドン２００における病原性リシンの突然変異がヘテロ接合性であり（１７６６４０．０００６）、コドン１２９におけるメチオニンがホモ接合性である患者の、致死性不眠症及び重大な視床の病態を実証した。Ｃｈａｐｍａｎ他は、この表現型と、コドン１７８における突然変異に関連する表現型と類似性を強調した（１７６６４０．００１０）。
【００３７】
Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９６）は、広範囲のヒトプリオン病の症例を調査して、異なる天然プリオン系統型を示す可能性がある、プロテアーゼ耐性ＰｒＰのパターンを同定した。Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他は、「新しい変異型」ＣＪＤからのプロテアーゼ耐性ＰｒＰを研究して、他の形態のＣＪＤと分子的基準によって区別することができる、異なる系統型であるかどうか決定した。Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９６）は、散発性ＣＪＤ及び医原性ＣＪＤ（通常は死体脳からの成長ホルモンの投与による）が、ウエスタンブロットにおいてプロテアーゼ耐性ＰｒＰの３個の異なるパターンと関連付けられることを実証した。型１及び２は散発性ＣＪＤで見られ、医原性ＣＪＤのいくつかの症例で見られる。３型は、末梢経路がプリオンに曝された、後天性のプリオン病で見られる。Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９６）は、ウエスタンブロット法において、「新しい変異型」ＣＪＤが、特徴的なパターンのＰｒＰのグリコシル化が関与するプロテアーゼ耐性ＰｒＰの独特で高度に一貫性のある出現と関連することを報告した。ＣＪＤが近交系マウスに伝播することによって、接種性ＣＪＤに特徴的なＰｒＰパターンが生じた。ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）プリオンの伝播によって、「新しい変異型」ＣＪＤのそれと非常に類似したＰｒＰの糖型比のパターンが生じた。Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９６）は、マカクの実験的ＢＳＥ、及び家ネコにおける自然の後天性ＢＳＥからのＰｒＰが、実験的なネズミのＢＳＥ及び「新しい変異型」ＣＪＤのそれと区別できない、糖型のパターンを示すことを見出した。Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９６）の報告は、Ａｇｕｚｚｉ及びＷｅｉｓｓｍａｎｎ（１９９６）によって概説され、彼らは、Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９６）が、ＢＳＥに関係する「新しい変異型」ＣＪＤの神経病原的及び臨床的特徴を概説したと結論付けた。
【００３８】
Ｐｒｕｓｉｎｅｒ（１９９６）は、プリオン病の分子生物学及び遺伝学の包括的な概説を与えた。Ｃｏｌｌｉｎｇｅ（１９９７）も同様に、この話題を概説した。彼は３種類のヒトプリオン病を認めた：（１）後天型、クールー及び医原性ＣＪＤを含む；（２）散発型、典型的及び非典型的な形のＣＪＤを含む；（３）遺伝型、家族性ＣＪＤ、ゲルストマン−ストロイスラー症候群、家族性致死性不眠症、及びさまざまな非典型的痴呆を含む。Ｃｏｌｌｉｎｇｅ（１９９７）は、その時までに報告された１２の病原性突然変異を表にした。疾患の表現型をコードするタンパク質の能力が、生物学において重要な非メンデル型の遺伝を表すことが示されたので、Ｃｏｌｌｉｎｇｅ（１９９７）は、進化においてこの方法がある範囲の種において他のタンパク質に使用されなかったとすれば、驚くべきことであると思われるとコメントした。彼は、酵母菌中でのプリオン様機構の同定について言及した（Ｗｉｃｋｎｅｒ、１９９４；Ｔｅｒ Ａｖａｎｅｓｙａｎ他、１９９４）。
【００３９】
Ｈｏｒｗｉｃｈ及びＷｅｉｓｓｍａｎ（１９９７）は、関連する伝達性神経変性疾患の群における、プリオンタンパク質の中心的役割について概説した。そのデータから、プリオンタンパク質がこの疾患プロセスに必要とされること、及び、プリオンタンパク質のその正常な可溶性アルファらせん構造から不溶性ベータシート状態への構造転換が、その疾患の発生及び感染性と密接に関係することが実証された。この転換プロセスに関して多くのことが依然として明らかではないと、彼らは指摘した。
【００４０】
Ｍａｌｌｕｃｃｉ他（１９９９）は、初老性痴呆、失調、及び他の神経精神病的特徴が常染色体優性遺伝として分離されている、ある大きな英国の家系を記載した。脱髄性疾患、アルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤコブ病、及びゲルストマン−ストロイスラー症候群の診断が、特定の個人で異なる回数行われてきた。Ｍａｌｌｕｃｃｉ他（１９９９）は、同じ一族の一部である可能性があるアイルランドの家系も記載しており、その中で、罹患者における、多発性硬化症、痴呆、皮質基底核変性症、及び「新しい変異型」ＣＪＤの診断が考慮された。分子的研究により、ＰＲＮＰ遺伝子のアラニン１７からバリンへの突然変異によって、この障害がプリオン病として同定された。彼らは、これらの一族に見られる表現型の発現の多様性を強調し、「新しい変異型」ＣＪＤが疑われる症例を含めて、非典型的な初老性痴呆又は神経精神病的特徴、及び失調を示す任意の個人におけるＰＲＮＰ分析により、遺伝性プリオン病を除外すべきであると提案した。Ｈｅｇｄｅ他（１９９９）は、伝播性プリオン病と遺伝性プリオン病は、共通の神経変性経路を共有することを実証した。Ｈｅｇｄｅ他（１９９９）は、異常に折りたたまれたイソ型である、蓄積したＰｒＰScが、神経変性疾患を引き起こすのに有効かどうかが、宿主コード化ＰｒＰがＣｔｍＰｒＰと呼ばれる膜貫通形になりやすいかどうかに依存することを観察した。さらに、伝播性プリオン病におけるＰｒＰSc蓄積の時間行程の直後に、ＣｔｍＰｒＰの生成が増大する。したがって、ＰｒＰScの蓄積によって、ＣｔｍＰｒＰの生成又は代謝に慣用する事象がｔｒａｎｓに調節されるようである。Ｈｅｇｄｅ他（１９９９）は、これらのデータ全体から、ＣｔｍＰｒＰ仲介の神経変性の事象が、遺伝性及び感染性プリオン病の病因において共通のステップを表す可能性があることが示唆されると結論付けた。
【００４１】
ＰｒＰc、すなわち細胞の非病原性イソ型ＰｒＰは、ニューロン中で強く発現される遍在する糖タンパク質である。Ｍｏｕｉｌｌｅｔ−Ｒｉｃｈａｒｄ他（２０００）は、ネズミ１Ｃ１１のニューロン化モデルを使用して、抗体仲介クロスリンクを介したＰｒＰc依存性シグナル伝達を調べた。１Ｃ１１クローンは、ニューロン関連の機能が欠けた上皮の形態を有する、関連する神経外胚葉の子孫である。誘導すると、１Ｃ１１細胞はニューロン様の形態を発現し、セロトニン作動性又はノルアドレナリン作動性細胞に分化し得る。２つの分化経路間の選択は、使用する誘導物質の組に依存する。ＰｒＰcを特異的抗体と結合させると、セロトニン作動性細胞とノルアドレナリン作動性細胞の両方で、チロシンキナーゼＦＹＮ（１３７０２５）のリン酸化レベルの著しい低下が誘導された。ＰｒＰcとＦＹＮの結合は、カベオリン−１（６０１０４７）に依存した。Ｍｏｕｉｌｌｅｔ−Ｒｉｃｈａｒｄ他（２０００）は、クラトリン（１１８９６０を参照のこと）が、この結合に寄与している可能性もあることを示唆した。１Ｃ１１細胞系がＰｒＰc依存性のＦＹＮの活性化を誘発する能力は、その完全に分化したセロトニン作動性又はノルアドレナリン作動性の子孫に限られていた。さらに、ＰｒＰcのシグナル活性は主に神経突起で生じた。Ｍｏｕｉｌｌｅｔ−Ｒｉｃｈａｒｄ他（２０００）は、ＰｒＰcがシグナル伝達タンパク質である可能性があることを示唆した。
【００４２】
マッピング
プリオン関連タンパク質のヒト遺伝子は、体細胞のハイブリダイゼーションとｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの組合せによって（Ｓｐａｒｋｅｓ他、１９８６）、又分類した染色体からのＤＮＡのスポットブロッティングによって（Ｌｉａｏ他、１９８６）、２０ｐ１２−ｐｔｅｒに位置付けられている。Ｒｏｂａｋｉｓ他（１９８６）も、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、ＰＲＮＰ遺伝子座を２０ｐに帰属させた。
【００４３】
細胞間の２０ｐの欠失を分析することによって、Ｓｃｈｎｉｔｔｇｅｒ他（１９９２）は、以下の順の遺伝子座：ｐｔｅｒ−−ＰＲＮＰ−−ＳＣＧ１（１１８９２０）−−ＢＭＰ２Ａ（１１２２６１）――ＰＡＸ１（１６７４１１）−−ｃｅｎを実証した。Ｐｕｃｋｅｔｔ他（１９９１）は、ＰＲＮＰ遺伝子の５’−プライマー、高度のヘテロ接合性を有し、染色体２０のｐｔｅｒ−ｐ１２領域用の有用なマーカーとして働くことができると思われるＲＦＬＰを同定した。
【００４４】
Ｒｉｅｋ他（１９９８）は、マウスのプリオンタンパク質の微細ＮＭＲ構造を使用して、遺伝性のヒト伝達性海綿状脳症の構造的基盤を調べた。細胞形のマウスのプリオンタンパク質中では、疾患特異的なサブドメインの存在を示すと思われる、突然変異部位の空間的クラスタリングは観察されなかった。残基１２８と１７８の間の水素結合が、ヒトＰＲＮＰにおける位置１２９での多型の、アスパラギン酸１７８からアスパラギン（Ｄ１７８Ｎ；１７６６４０．０００７）への突然変異によって分離される疾患の表現型に対する、観察された非常に特異的な影響の構造的基礎を与えた。全体として、このＮＭＲ構造は、疾患関連アミノ酸の置換の一部だけが、細胞形のＰＲＮＰの低い安定性をもたらすことを暗示し、突然変異タンパク質の微妙な構造的差異が、分子内シグナリングにさまざまな異なる方法で影響を与える可能性があることを示している。
【００４５】
Ｗｉｎｄｌ他（１９９９）は、ドイツのクロイツフェルト−ヤコブ病監視団体に付記された、プリオン病の疑いがある、５７８人の患者のＰＲＮＰ遺伝子のコード領域中の突然変異及び多型を、４．５年にわたって調べた。彼らは、以前に病原性として報告されたミスセンス突然変異をもつ、４０の症例を発見した。これらの中では、Ｄ１７８Ｎ突然変異が最も一般的であった。これらの症例のすべてにおいて、Ｄ１７８Ｎはコドン１２９におけるメチオニンと結合しており、その結果、典型的な家族性致死性不眠症の遺伝型がもたらされた。２つの新規なミスセンス突然変異、及びいくつかのサイレント多型が発見された。その図１に、Ｗｉｎｄｌ他（１９９９）は、ＰＲＮＰのコード領域における知られている病原性突然変異を図示した。
【００４６】
歴史
Ａｇｕｚｚｉ及びＢｒａｎｄｎｅｒ（１９９９）は「プリオンの遺伝学」を概説したが、これが用語の点で矛盾するかどうかという問題を提起した。なぜなら、伝達性海綿状脳症を引き起こす不可解な物質として彼らが定義したプリオンは、非遺伝性病理の典型であるからである。Ｇｒｉｆｆｉｔｈ（１９６７）によって最初に提出された、タンパク質のみの仮説では、プリオンの感染性は、現在ＰＲＮＰと呼ばれている異常な形態の細胞タンパク質である、スクレーピータンパク質と同一であると述べている。複製は、スクレーピーのプリオンが細胞のプリオンを召集し、それを別のスクレーピープリオンに転換することによって起こる。新たに形成されたスクレーピープリオンは、転換サイクルに加わり、スクレーピープリオンのより速やかな蓄積をもたらす事象の連鎖反応が生じる。この仮説は、Ｐｒｕｓｉｎｅｒ（１９８２）が病原性タンパク質を精製し、Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ及び彼の同僚（Ｏｅｓｃｈ他１９８５；Ｂａｓｌｅｒ他１９８６）が、スクレーピータンパク質及びその正常細胞の相当物ＰＲＮＰをコードする遺伝子をクローニングした後に、広く承認され受け入れられた。Ｗｅｉｓｓｍａｎｎのグループ（Ｂｕｅｌｅｒ他１９９３）が、タンパク質のみの仮説によって予想されたように、Ｐｒｎｐの遺伝的切断により、プリオンに曝したときマウスが実験的スクレーピーから保護されることを示すと、さらなる勢いを得た。Ａｇｕｚｚｉ及びＢｒａｎｄｎｅｒ（１９９９）は、家族性の形のプリオン病とプリオン遺伝子の突然変異との関連の発見を、重要な画期的事件である（Ｈｓｉａｏ他１９８９）と考えた。
【００４７】
動物モデル
プリオンの構造遺伝子（Ｐｒｎ−ｐ）は、マウス染色体２に位置付けられている。Ｐｒｎ−ｐと密接に関連する、第２のネズミ遺伝子座、Ｐｒｎ−ｉによって、マウスにおけるスクレーピーの潜伏期の長さが決まる（Ｃａｒｌｓｏｎ他１９８６）。Ｐｉｄ−１で表される、スクレーピーの潜伏期を調節する別の遺伝子は、マウス染色体１７上に位置している。Ｓｃｏｔｔ他（１９８９）は、ゴールデンハムスターからのプリオンタンパク質遺伝子を収容したトランスジェニックマウスは、ハムスタースクレーピーのプリオンを接種すると、ハムスターに特徴的なスクレーピー感染性、潜伏期、及びプリオンタンパク質のアミロイド斑を示すことを実証した。Ｈｓｉａｏ他（１９９４）は、高レベルの突然変異体Ｐ１０１Ｌプリオンタンパク質を発現する、２系統のトランスジェニックマウスにおいて、実験用ネズミのスクレーピーと区別できない、神経病及び中枢神経系の病状が発現したことを見出した。ヒトプリオンタンパク質中のアミノ酸１０２は、マウスプリオンタンパク質中のアミノ酸１０１に対応する。したがって、Ｐ１０１Ｌのネズミにおける突然変異は、ヒト中でゲルストマン−ストロイスラー症候群を引き起こす、プロリン１０２からロイシンへの突然変異（１７６６４０．０００２）と同等であった。Ｈｓｉａｏ他（１９９４）は、Ｐ１０１Ｌ導入遺伝子を低レベルで発現するマウス、及び高レベルの突然変異Ｐ１０１Ｌプリオンタンパク質を発現するトランスジェニックマウスからの脳抽出物を注射したゴールデンハムスターへの、神経変性の連続的伝染を報告した。高発現トランスジェニックマウスは、低レベルの感染性プリオンしかその脳内に蓄積しなかったが、接種を受けたレシピエントへの疾患の連続的伝染によって、プリオン形成がこれらの非接種動物の脳内で新たに起きたことが立証され、プリオンが外来性の核酸を欠いているとの追加の証拠が与えられた。
【００４８】
ＰｒＰノックアウトマウスに関する研究は、Ｂｕｅｌｅｒ他（１９９４）、Ｍａｎｓｏｎ他（１９９４）、及びＳａｋａｇｕｃｈｉ他（１９９６）によって報告されてきている。Ｓａｋａｇｕｃｈｉ他（１９９６）は、彼らによって生成されたＰｒＰノックアウトマウスは、７０週齢までは見た目は正常であり、その時点でマウスは、小脳性失調の徴候を絶えず示し始めたことを報告した。組織学的研究によって、小脳回の大部分におけるプルキンエ細胞の過剰な損失が明らかになった。小脳の萎縮、及び第４脳室の拡張が示された。同様の病状変化は、Ｂｕｅｌｅｒ他（１９９４）及びＭａｎｓｏｎ他（１９９４）によって作成されたＰｒＰノックアウトマウスでは示されなかった。Ｓａｋａｇｕｃｈｉ他（１９９６）は、結果の違いは系統の違い、又はＰｒＰ遺伝子中でのノックアウトの程度の違いによるものである可能性があると指摘した。特に、記載したＰｒＰノックアウトマウスの３つの系統すべてにおいて、プリオン感染に対する感受性が失われた。
【００４９】
Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９４）は、そのＰｒＰ欠損マウスの研究に基づいて、プリオンタンパク質が正常なシナプス機能に必要であると結論付けた。彼らは、遺伝性プリオン病は、翻訳後に改変された形の細胞のＰｒＰであるＰｒＰcの生成による、顕性不活性な作用から生じる可能性があり、最終的に機能的ＰｒＰ（ＰｒＰc）の漸次的喪失をもたらすと仮定した。Ｔｏｂｌｅｒ他（１９９６）は、ＰｒＰ欠損マウスの概日リズム及び睡眠の変化を報告し、これらの変化が致死性家族性不眠症における睡眠の変化との興味深い類似性を示すことを強調した。
【００５０】
ＰｒＰを欠いたマウスは正常に成長したが、スクレーピー耐性であった；ＰｒＰ導入遺伝子を導入することによって、疾患に対する感受性が回復した。この活性に必要なＰｒＰの領域を同定するために、Ｓｈｍｅｒｌｉｎｇ他（１９９８）は、アミノ基部が欠失したＰｒＰを発現するＰｒＰノックアウトマウスを作製した。驚くべきことに、欠失部分が短いＰｒＰではなく、残基３２〜１２１又は３２〜１３４が欠失したＰｒＰが、生後わずか１〜３カ月で小脳顆粒層に限定された、重度の失調及びニューロン死を引き起こした。野生型ＰｒＰ遺伝子を１コピー導入することによって、この欠陥は完全に無くなった。Ｓｈｍｅｒｌｉｎｇ他（１９９８）は、これらの短縮ＰｒＰは非機能的であり、ＰｒＰ様機能を有する他の分子いくつかと共通のリガンドについて競合する可能性があると推測した。
【００５１】
Ｔｅｌｌｉｎｇ他（１９９６）は、プリオン病における根本的事象は、細胞のプリオンタンパク質の高次構造の変化であり、これによってタンパク質が病原性のイソ型ＰｒＰScに転換されるという見解を支持する、観察結果を報告した。彼らは、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）では、脱グリコシル化後のＰｒＰScのプロテアーゼ耐性断片は１９ｋＤの大きさであり、一方他の遺伝性及び散発性プリオン病由来の断片は２１ｋＤであることを見出した。ＦＦＩ患者の脳からの抽出物は、接種の約２００日後に、キメラヒト−マウスＰｒＰ遺伝子を発現するトランスジェニックマウスに疾患を伝染させ、１９ｋＤのＰｒＰSc断片の形成を誘導したが、一方家族性及び散発性クロイツフェルト−ヤコブ病患者の脳からの抽出物は、これらのマウス中で２１ｋＤのＰｒＰSc断片を産生させた。Ｔｅｌｌｉｎｇ他（１９９６）の結果は、ＰｒＰScの高次構造が発生期のＰｒＰScの形成を指示する際の鋳型として働くことを示し、多様性がＰｒＰScの高次構造中に暗号化されている、プリオンの系統を説明するための機構を示唆した。
【００５２】
Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ（１９９７）は、「科学上の最も刺激的な概念のいくつかが表面上は関連がない現象の予期せぬ衝突から生まれている」と指摘した。彼女が論じた問題の例は、酵母菌の遺伝学における２つの不可解な問題点が、プリオンの仮説と類似の仮説によって説明できると思われるという、Ｗｉｃｋｎｅｒ（１９９４）による提案であった。２つの酵母菌の突然変異によって、表現型の遺伝が、異なる核酸の遺伝ではなく、異なるタンパク質高次構造の遺伝に基づくこともときにはあるという、説得力のある例が与えられた。したがって酵母菌によって、プリオン様プロセスを研究するための重要な新しいツールが与えられる可能性がある。さらに彼女は、プリオンは必ずしも病原性ではないことを示唆した。実際彼女は、マクロ分子の自己促進型の構造変化が、広くさまざまな正常な生物学的プロセス、クロマチン構造の変化と関連があるものなどの後成的現象だけではなく、いくつかの正常な、発生上調節される事象の根底にあると示唆した。
【００５３】
Ｈｅｇｄｅ他（１９９８）は、幾何学的形状の相対比を変えるＰｒＰ突然変異体を発現するトランスジェニックマウスにおける、異なる幾何学的形状のＰｒＰの役割を研究した。１つの形は小胞体内腔に完全に転位しており、ＰｒＰ−Ｓｅｃと呼ばれる。２つの他の形が、カルボキシ末端から内腔（ＰｒＰ−Ｃｔｍ）又はアミノ末端から内腔（ＰｒＰ−Ｎｔｍ）の方向で、小胞体に広がっている。高レベルのＰｒＰ−Ｃｔｍをもたらした突然変異体を収容するＦ２生成マウスは、５８＋／−１１日に神経変性の発症を示した。ＰｒＰの過剰発現がその原因ではなかった。神経病理学的検査から、スクレーピーで見られた変化と同様の変化が示されたが、ただしＰｒＰScの不在下においてであった。ＰｒＰ−Ｃｔｍの発現のレベルは、疾患の重度と相関関係があった。
【００５４】
Ｓｕｐａｔｔａｐｏｎｅ他（１９９９）は、野生型ＰｒＰ（Ｐｒｎｐ−／−）が欠損したトランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおける、２つの大きな欠失があるアミノ酸１０６個の集合型ＰｒＰの発現によって、プリオン増殖が支持されたことを報告した。完全長のＰｒＰScを含むＲｏｃｋｙ Ｍｏｕｎｔａｉｎ研究所（ＲＭＬ）のプリオンによって、約３００日後にＴｇ（ＰｒＰ１０６）Ｐｒｎｐ−／−マウスにおいて疾患が生じ、一方、ＰｒＰSc106を含むＲＭＬ１０６プリオンの伝播によって、反復移動により約６６日後にＴｇ（ＰｒＰ１０６）Ｐｒｎｐ−／−マウスにおいて疾患が生じた。この人工的な、ＲＭＬプリオンの移動の伝播の障害は、約１６５日後にスクレーピーが進行したＴｇ（ＰｒＰ１０６）Ｐｒｎｐ＋／−マウスにおける、野生型マウスのＰｒＰcの同時発現によって減少し、野生型マウスのＰｒＰが途中で作用して、ＲＭＬ１０６プリオンの複製が促進されることが示唆された。精製ＰｒＰSc106はプロテアーゼ耐性であり、糸状体を形成し、非変性洗浄剤に不溶であった。
【００５５】
Ｋｕｗａｈａｒａ他（１９９９）は、Ｐｒｎｐ−／−及びＰｒｎｐ＋／＋マウスからの海馬細胞系を確立した。１４日齢のマウス胚からの培養物を確立した。研究した６つの細胞系はすべて、神経前駆体細胞の系統に属していたが、それらはその発生段階が異なっていた。Ｋｕｗａｈａｒａ他（１９９９）は、細胞の培養物から血清を除去することによって、Ｐｒｎｐ＋／＋細胞中ではなくＰｒｎｐ−／−細胞のアポトーシスが引き起こされたことを発見した。プリオンタンパク質又はＢＣＬ２遺伝子の形質導入によって、血清を含まない条件下においてＰｒｎｐ−／−細胞のアポトーシスが抑制された。Ｐｒｎｐ−／−細胞はＰｒｎｐ＋／＋細胞より、短い神経突起を延長させたが、ＰｒＰの発現によってその長さは増大した。Ｋｕｗａｈａｒａ他（１９９９）は、これらの発見によって、野生型プリオンタンパク質の機能の損失は、部分的にはプリオン病の病因の根底にあるという概念が、支持されたと結論付けた。この筆者達は、ＢＣＬ２遺伝子の形質導入をすぐに試みた。なぜなら、ＢＣＬ２は以前に、酵母菌の２ハイブリッド系においてプリオンタンパク質と相互作用することが示されたからである。これらの結果によって、哺乳動物細胞においても、ＢＣＬ２とＰｒＰの間の何らかの相互作用が示唆された。
【００５６】
スクレーピー感染したマウスでは、循環性Ｂ及びＴリンパ球ではなく脾臓リンパ球と結合したプリオンが発見され、ストロマ中では、それは濾胞樹状細胞を含む。成熟した濾胞樹状細胞の形成及び維持には、膜結合リンホトキシンα／βを発現するＢ細胞の存在が必要である。可溶性リンホトキシンβ受容体でマウスを処理することによって、脾臓からの成熟した濾胞樹状細胞の消失がもたらされる。Ｍｏｎｔｒａｓｉｏ他（２０００）は、この処理によって脾臓でのプリオンの蓄積がなくなり、腹膜内スクレーピー感染の後の神経侵襲が遅れることを実証した。Ｍｏｎｔｒａｓｉｏ他（２０００）は、彼らのデータによって、濾胞樹状細胞が脾臓内のプリオン複製の主要部位である、証拠が与えられたと結論付けた。
【００５７】
Ｃｈｉｅｓａ他（１９９８）は、１４個のオクタペプチドリピートを含む突然変異プリオンタンパク質を発現したトランスジェニックマウスの系を生成させ、ヒトのそのタンパク質の相同体は、遺伝性のプリオンによる痴呆と関係がある。この挿入体は、その時までにＰＲＮＰ遺伝子において同定された最大のものであり、進行性の痴呆及び失調によって、及び小脳及び大脳基底核中のＰｒＰ含有アミロイド斑の存在によって特徴付けられる、プリオン病と関係があった（Ｏｗｅｎ他１９９２；Ｄｕｃｈｅｎ他１９９３；Ｋｒａｓｅｍａｎｎ他１９９５）。突然変異タンパク質を発現するマウスは、導入遺伝子配列がそれぞれ同型又は半接合性であったかどうかに応じて、６５又は２４０日齢で失調が顕著である神経病が進行した。誕生から始まり、突然変異ＰｒＰは、スクレーピーのイソ型ＰｒＰと似たプロテアーゼ耐性で洗浄剤不溶性の形に転換され、マウスの生存期間中にわたって多くの脳領域中に、この形のものが劇的に蓄積した。ＰｒＰが蓄積すると、小脳中で顆粒細胞の大規模なアポトーシスが起こった。
【００５８】
主要組織適合複合体
本明細書では、用語「主要組織適合複合体」（ＭＨＣ）は、当分野におけるその通常の意味を有し、さまざまな細胞の表面上で「同定マーカー」として機能する、細胞抗原のファミリーをコードする１組の遺伝子を指す。Ｔリンパ球は、その固有の受容体を介してこれらの細胞と相互作用して、その適応免疫機能を果たす。
【００５９】
ＭＨＣは、ネズミ及びヒトＭＨＣ中にコードされた、３クラスの分子（Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ）に分けられる。クラスＩ及びＩＩの分子は、異なる構造体を示す。クラスＩＩＩのＭＨＣは、機能が確立されていないか或いは構造的類似性がない２０を超える遺伝子の、多様な集合体を含む。
【００６０】
ＭＨＣクラスＩＩの分子に関する背景知識は、Ｖｉｃｔｏｒ Ａ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ他によって、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍに示されている。ＭＨＣクラスＩＩの分子に関する以下の情報は、この源から抜粋しているものである。
【００６１】
ヘテロマーである主要組織適合複合体のクラスＩＩのタンパク質、α及びβサブユニットの遺伝子は、６ｐ２１．３領域中に集合している。Ｔｏｄｄ他（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：５９９〜６０４は、クラスＩＩの遺伝子座の地図を示した。彼らは、ＤＱ分子、特にβ鎖の残基５７の構造によって、インシュリン依存性糖尿病をもたらすインシュリン生成島細胞に対する、自己免疫応答が指定されることを示唆した。ＨＬＡ−Ｄ領域内の約１４のクラスＩＩのＨＬＡ遺伝子の中で、ＤＱ３．２−β遺伝子は、ＨＬＡ−ＤＲ４とインシュリン依存性糖尿病の充分に文書化された関係の原因であり、この疾患と最も相関関係がある１つの対立遺伝子である。Ｋｗｏｋ他（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：１０２７〜１０３０は、アミノ酸４５は、ＤＱ３．２−β遺伝子及びその非糖尿病型対立遺伝子、ＤＱ３．１−βを特徴とする血清学的エピトープを生成させるのに、重要であることを見出した。Ｔｏｄｄ他（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：１０９４〜１０９８は、日本人の中では、ＩＤＤＭはＨＬＡ−ＤＲよりもＨＬＡ−ＤＱと強く関係しており；ＤＱＡ１遺伝子座のＡ３対立遺伝子が、疾患と最も強く関係しており；白人及び黒人のＩ型糖尿病に対する感受性と関係がある、ＤＱＢ１遺伝子座のＤＱｗ８対立遺伝子は、日本人の患者では頻度が増大せず；白人のＩ型糖尿病に対する低い感受性と関係がある、アスパラギン酸５７をコードするＤＱＢ１対立遺伝子は、４９人の日本人患者のうちの１人を除く全員に、及び３１人の対照全員に、少なくとも異型の状態で存在したことを見出した。４０％の患者が、アスパラギン酸５７をコードするＤＱＢ１対立遺伝子が同型であり、これに対し対照では３５％が同型であった。日本人におけるアスパラギン酸５７をコードするＤＱＢ１対立遺伝子の高い頻度は、日本でのＩ型糖尿病の珍しさに原因がある可能性がある。
【００６２】
ＨＬＡクラスＩＩの膜内外ヘテロ二量体の非常に高い多型は、そのα鎖及びβ鎖の最も外側のドメイン中に存在する数個の超可変領域によるものである。アミノ酸配列のいくつかの変化は、疾患感受性の関連、及びプロセッシングされた抗原をＴ細胞に提示する能力において重要である。Ｂ細胞のｃＤＮＡライブラリーをＤＱ−βプローブを用いてスクリーニングすることによって、Ｇｉｏｒｄａ他（１９９１）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３３ ４０４〜４０８は、ＨＬＡ−ＤＱｗ７、−ＤＱｗ８、及び−ＤＱｗ９対立遺伝子のβ鎖に対応するｃＤＮＡを得た。配列分析によって、ただ１個のアミノ酸の変化をもたらした、６箇所のヌクレオチド位置におけるＤＱｗ８とＤＱｗ９の間の違いが明らかになった。ＤＱｗ９は、位置５７にアラニンではなくアスパラギン酸をコードしている。ＤＱｗ７はこの位置においてＤＱｗ９と同じであるが、９個の他のアミノ酸が異なる。
【００６３】
瘢痕性類天疱瘡（ＣＰ）は、重層扁平上皮、及びときには皮膚由来の多数の粘膜を冒す、慢性的な自己免疫性の水疱性疾患である。ＣＰは、疾患の症状発現の範囲が広い。口内天疱瘡（ＯＰ）を有する患者は、その病的変化が口内粘膜に限られる、良性の一過性疾患を有する。他方で、再発及び寛解によって示される慢性疾患である、眼部瘢痕性類天疱瘡を有する患者は、眼部に関する関連、及びおそらくは他の粘膜に関する関連もある。あらゆる臨床型は、類似の抗基底帯自己抗体の存在によって特徴付けられる。１つの形のＣＰ又は他のＣＰの進行を決定する要因は、知られていない。Ｙｕｎｉｓ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１ ７７４７〜７７５１は、ＯＰを有する２２人の白人患者及びその家系（１９家系）のＤＮＡを試験することによって、クラスＩＩの対立遺伝子を研究した。これらの結果を、１７人のＯＣＰ患者及びその家系の対照から得られた結果、及び骨髄移植に関して研究した４２人の対照白人家系の結果と比較した。これらの結果によって、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１は、口内及び眼部形のＣＰに関する感染性のマーカーであることが示された。ＯＰ及びＯＣＰ中に存在するＤＱＢ１対立遺伝子のアミノ酸配列を分析することによって、位置５７及び位置７１〜７７におけるアミノ酸残基も、マーカーである可能性があることが示唆された。
【００６４】
Ｄｅｌｇａｄｏ他（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．９３：８５６９〜８５７１は、水泡性天疱瘡を有する２１人の患者、眼部瘢痕性類天疱瘡を有する１７人の患者、及び口内天疱瘡を有する２２人の患者において高精度で型分類したＭＨＣクラスＩＩの遺伝子座、ＨＬＡ−ＤＲＢ１及びＨＬＡ−ＤＱＢ１を、２１８のハプロタイプの正常な個人の一群と比較した。彼らは、３つの疾患はＤＱＢ１＊０３０１と有意な関係があったことを見出した（それぞれＰ＝０．００５、Ｐが０．０００１未満、及びＰ＝０．００１）。位置７１〜７７からの特定のアミノ酸配列を共有していた、対立遺伝子ＤＱＢ１＊０３０２、＊０３０３、及び＊０６の頻度も増大した（Ｐ＝０．０１）。これらの発見によって、３つの臨床的に異なる変形の天疱瘡における自己免疫応答は、皮膚の基底膜、結膜、又は口内粘膜由来のペプチドと結合した、クラスＩＩ領域のＤＱＢ１のＴ細胞による認識と関連があることが示唆された。
【００６５】
早発卵巣不全（ＰＯＦ）は、非常に症例の多い自己免疫性の病因を有する。Ａｒｉｆ他（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｍｅｔａｂ．８４ １０５６〜１０６０は、アスパラギン酸−５７をコードするＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝型は、ＰＯＦにおいて３−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによる自己免疫と関連があることを見出した。２つのＨＬＡ−ＤＱＢ１対立遺伝子、位置５７においてアスパラギン酸コドンを共有する＊０３０１及び＊０６０３、は３−β−ＨＳＤ自己抗体に関して陽性の関係を示した。３−β−ＨＳＤ自己抗体を有する２１人中１８人（８６％）のＰＯＦ患者は、１３４人中９２人の対照被験者と比較して、ＤＱ−β−アスパラギン酸５７をコードする遺伝型を有しており、２１例中９例（４３％）は、１３４人中１７人（１３％）の対照被験者と比較して、コドン５７の遺伝型が同型であった。これらの確率値は、多重検定の補正後は有意ではなかった。この筆者達は、ＰＯＦ、３−β−ＨＳＤ自己免疫、及び異なるＨＬＡ−ＤＱ分子間の関係を彼らが実証したことによって、３−β−ＨＳＤに対する自己抗体は自己免疫性卵巣不全のマーカーである可能性があるという仮説が支持され、アスパラギン酸５７−β鎖を有するＨＬＡ−ＤＱ分子による、自己抗原性又は外来性ペプチドのＴリンパ球に対する提示は、この疾患の病因において重要であることが示唆されたと結論付けた。
【００６６】
ヒト白血球抗原
本明細書では、用語ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、当分野におけるその通常の意味を有するものであり、染色体６の短いアーム上の密接に関連がある遺伝子によってコードされた、細胞表面の糖タンパク質を指す。
【００６７】
本発明の特に興味深いＨＬＡ型は、ＨＬＡのクラスＩＩ型のＤＱ７である。
【００６８】
感受性
本発明によれば、プリオン病に対する被験者の感受性を決定する方法が提供される。
【００６９】
用語「感受性」はプリオン病に対する被験者の感受性、可能性、敏感性、傾向又は許容性を指す。
【００７０】
被験者からのサンプルがＤＱ７特異性があるＨＬＡを有する場合、これは被験者がプリオン病に対して低い感受性を有することを示し；且つ被験者からのサンプルがＤＱ７特異性があるＨＬＡを有さない場合、したがってこれは、被験者はプリオン病に対して高い感受性を有することを示す。
【００７１】
サンプル
「サンプル」は、ＨＬＡをＤＱ７に型分類することができる、任意の物理的物体であってよい。
【００７２】
サンプルは体液又は組織であるか、或いはそれに由来することが好ましい。体液は血液、血清などであるか、或いはそれに由来することがさらに好ましい。
【００７３】
好ましい実施形態では、サンプルは核酸を含む。非常に好ましい実施形態では、サンプルは血液から抽出した核酸を含む。
【００７４】
抽出
本発明の好ましい実施形態では、Ｍｉｌｌｅｒ他（１９８８）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６，１２１５中に記載されたような塩析によって、ＤＮＡなどの核酸を血液細胞から単離する。
【００７５】
本発明の非常に好ましい実施形態では、ＤＮＡなどの核酸を、ＤＮＡ抽出キット（Ｄｙｎａｌ、Ｍｅｒｓｅｙｓｉｄｅ、ＵＫ）などの市販のキットを使用して、血液細胞から単離する。この手順では、２ｍｌのチューブ中の２００μｌの抗凝固処理した全血を、１ｍｌの赤血球細胞溶解バッファー１（５ｍｌの濃縮物＋４４ｍｌの蒸留水＋１ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８）と、溶液が透明になるまで混合させる。この溶液を、１０，０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離して、白血球細胞をペレット状にし、上澄みを捨てる。チューブを攪拌し、１ｍｌの赤血球細胞溶解バッファー２（５ｍｌの濃縮物＋４５ｍｌの蒸留水）を加える。この溶液を１０秒間遠心分離し、上澄みを捨てる。２００μｌの再懸濁Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＤＮＡ抽出物を、白血球細胞のペレットに加える。チューブから含有物をすぐに吸引し、清潔な２ｍｌのチューブに移す。磁気バーを有するＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）−Ｑ中の適所に、チューブを置き、３０秒後に上澄みを捨てる。磁気バーを除去し、１ｍｌの蒸留水を加える。磁石を交換し、３０秒後に上澄みを捨てる。複合体をさらに２回洗浄し、ＤＮＡを含むチューブの含有物を２００μｌの蒸留水に再懸濁させる。
【００７６】
ＤＱ７
サンプル中のＤＱ７特異性を有するＨＬＡを、任意の適切な方法を使用して、決定又は型分類することができる。たとえば、血清学に基づく方法を使用して、サンプルをＨＬＡに型分類することができる。ＤＮＡに基づく方法を使用して、サンプルをＨＬＡに型分類することが好ましい。
【００７７】
血清学的方法は、モノクローナル又はポリクローナル抗体による抗原捕獲に基づくものであってよく、リンパ球の表面上の検出可能なレベルのＨＬＡタンパク質の存在を必要とする。たとえばリンパ球を、密度勾配遠心分離によって単離し、２５０単位のヘパリンナトリウムと混合させた１０ｍｌの血液からなるＭａｃｏｙの５ａ培地などの培地で、２回洗浄することができる。したがってＢ細胞は、ナイロン−ウールを使用して分離することができる。Ｔ細胞が欠失し、Ｂ細胞が豊富なリンパ球は、Ｋａｔｚ他（１９８７）ＪＰｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ ５８：６０７〜６１０に従った長期のインキュベーションによる細胞障害性試験によって、ＤＱに型分類することができる。
【００７８】
用語「ＤＮＡに基づく方法」は、それを使用してＤＱ７特異性を有するＨＬＡをサンプルが有するかどうかを決定することができる、任意のＤＮＡに基づく方法を指す。ＤＮＡに基づく方法を使用して、ＨＬＡ ＤＱ７の特異性を意味する遺伝子座をサンプルが含むかどうかを、決定することが好ましい。ＨＬＡ ＤＱ７の特異性を意味する対立遺伝子を、サンプルが含むかどうかを決定するために、ＤＮＡに基づく方法を使用することがより好ましい。ＨＬＡ ＤＱ７の特異性を意味するＤＱＢｌ＊０３０対立遺伝子、ＤＱＢ１＊０３０１１、ＤＱＢ１＊０３０１２、ＤＱＢ１＊０３０４、及び／又はＤＱＢｌ＊０３０９などを、サンプルが含むかどうかを決定するために、ＤＮＡに基づく方法を使用することがより好ましい。
【００７９】
ＨＬＡの型分類を行うためのＤＮＡに基づく方法は、Ｂｉｄｗｅｌｌ（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ９，１８〜２３、及びＡｎｇｅｌｉｎｉ他（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，４４８９〜４４９３によって概説されてきている。
【００８０】
ＲＥＬＩ ＳＳＯ ＨＬＡ−ＤＱＢ１ Ｔｅｓｔ（Ｄｙｎａｌ、Ｍｅｒｓｅｙｓｉｄｅ、ＵＫ）などの市販のキットを使用して、ＳＳＯを行うことができる。
【００８１】
ＲＥＬＩ ＳＳＯ ＨＬＡ−ＤＱＢ１ Ｔｅｓｔ用に、３０μｌのマスター混合物（１０％グリセロール、ＫＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣ１、＜０．００１％ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、ビオチン化プライマー、＜０．０１％ ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）（Ｔａｑポリメラーゼ）及び０．０５％アジ化ナトリウム）を、次に１５μｌの６ｍＭ ＭｇＣｌ2、及び１５μｌの対照ＤＮＡ（ＤＱＢ１＊０３０１１対立遺伝子などの対立遺伝子を含む）、陰性対照（１５μｌの滅菌蒸留水）、又は１５μｌの試験するサンプルを、それぞれのＰＣＲチューブに等分する。ＰＣＲ増幅は、以下のようにプログラムされたサーマルサイクラーを使用して行う：９５℃で１５秒間、６０℃で４５秒間、７２℃で１５秒間の３５サイクル；７２℃に５分間、その後１５℃に永久的に保つ。プログラムの終了時に、チューブを除去し、６０μｌの変性溶液（３％ ＥＤＴＡ、１．６％ ＮａＯＨ及びチモールブルー）を加え、次に１０分間室温でインキュベーションする。検出が１〜２時間以内で行われる場合、変性反応の混合物は室温で保存することができる。それ以外の場合は、検出ステップが行われるまで、変性反応の混合物を２〜８℃で（１週間を超えずに）保存しなければならない。
【００８２】
検出ステップ用に、３つのバッファーが必要とされる：（１）作業用ハイブリダイゼーションバッファー、５５ｍｌのＳＳＰＥ濃縮物（ＮａＣｌを含むリン酸ナトリウム溶液、ＥＤＴＡ及び１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ １５０（登録商標））、２１３ｍｌの蒸留水、及び６．９ｍｌのＳＤＳ濃縮物（ＳＤＳ及び１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ １５０（登録商標））を混合させることによって調製するもの；（２）作業用洗浄バッファー、６５ｍｌのＳＳＰＥ濃縮物、１２２８．５ｍｌの蒸留水、及び６．５ｍｌのＳＤＳ濃縮物を混合させることによって調製するもの、２７５ｍｌを厳密洗浄バッファー用に使用し、１０２５ｍｌを周囲洗浄バッファー用に使用する；（３）作業用クエン酸バッファー、３０ｍｌのクエン酸濃縮物（クエン酸ナトリウム溶液）を５７０ｍｌの蒸留水で希釈することによって調製するもの。
【００８３】
ハイブリダイゼーションバッファー及び厳密洗浄バッファーを、使用前に５０℃に暖め、水浴を同じ温度に設定する。ＨＬＡ−ＤＱＢ１に型分類した試料を、型分類用トレーのそれぞれのウエル中に置く。５ｍｌの予め暖めたハイブリダイゼーションバッファーをそれぞれのウエルに加え、次に７０μｌの変性した増幅サンプル又は対照をそれぞれのウエルに加える。型分類用トレーの上に蓋を置き、５０℃において３０分間６０ｒｐｍで、トレーをインキュベートする。それぞれのウエルの含有物を除去し、５ｍｌの周囲洗浄バッファーを加える。それぞれのウエルの含有物を除去し、５ｍｌの厳密洗浄バッファーを、５０℃において１５分間６０ｒｐｍで加える。作業用複合溶液を、５．３ｍｌの周囲洗浄バッファーを１６μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体（ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体、ＮａＣｌ及び１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ １５０（登録商標）を含むＡＣＥＳ溶液中のもの）に加えることによって、アッセイするそれぞれの試料用に調製する。トレーを水浴から除去し、それぞれのウエルから含有物を除去する。５ｍｌの作業用複合溶液をそれぞれのウエルに加え、トレーを１５分間６０ｒｐｍで混合する。含有物をウエルから除去し、５ｍｌの周囲洗浄バッファーを、それぞれのウエルに５分間６０ｒｐｍで加える。周囲洗浄バッファーのステップを１回繰り返す。含有物をウエルから除去し、５ｍｌのクエン酸バッファーを、５分間６０ｒｐｍで加える。作業用基質（基質Ａ（０．０１％ Ｈ2Ｏ2、及び０．１％ ＰｒｏＣｌｉｎ１５０（登録商標）を含むクエン酸溶液）と、基質Ｂ（４０％ジメチルホルムアミドに溶けた０．１％ ３，３’，５，５’−テトラメチルベンズイミド）の混合物）を、計算式［４．４ｍｌ×試料の数］を使用して、必要とされる基質Ａの量を計算することによって調製する。必要とされる基質Ｂの量は、計算式［１．１ｍｌ×試料の数］によって決定する。ウエルの含有物を除去し、５ｍｌの作業用基質を１０分間６０ｒｐｍで加える。ウエルの含有物を除去し、５ｍｌの蒸留水を５分間６０ｒｐｍで加える。このステップは２回繰り返す。５ｍｌのクエン酸バッファーをそれぞれのウエルに加え、キットと共に含まれるＨＬＡ−ＤＱＢ１オーバーレイ及びスコアシートを使用して、試料を手作業で処理する。対照線より大きな強度を有するそれぞれの青線に関しては、陽性シグナルが記録される。その型を、キットと共に含まれるＤｙｎａｌ ＲＥＬＩ ＳＳＯ ＨＬＡ−ＤＱＢの説明表と比較する。
【００８４】
サンプルがＤＱＢＩ＊０３０対立遺伝子、ＤＱＢ１＊０３０１１、ＤＱＢ１＊０３０１２、ＤＱＢ１＊０３０４、及び／又はＤＱＢＩ＊０３０９などを含むとき、陽性の結果が得られる。１個又は複数個のこれらの対立遺伝子の存在は、ＤＱ７型のＨＬＡを意味する。具体的には、ＤＱ７特異性を有するＨＬＡに関する陽性の結果は、対照線より大きな強度を有する青線が、たとえばレーン７、レーン１１、レーン１７、レーン２２及び２３（ＤＱＢＩ＊０３０１１、ＤＱＢ１＊０３０１２及びＤＱＢＩ＊０３０９）、及び／又はレーン２５及び／又はレーン７、レーン１１、レーン１６、レーン２２〜２３及びレーン２５（ＤＱＢＩ＊０３０４）に存在するときに得られる。
【００８５】
Ｂｕｎｃｅ他（１９９５）Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４６，３５５〜３６７に従って、或いはＡｌｌＳｅｔ ＳＳＰ ＤＱＢ１＊０３ Ｔｅｓｔ（Ｄｙｎａｌ、Ｍｅｒｓｅｙｓｉｄｅ、ＵＫ）などの市販のキットを使用して、ＳＳＰを行うことができる。
【００８６】
ＤＮＡ抽出キット（Ｄｙｎａｌ、Ｍｅｒｓｅｙｓｉｄｅ、ＵＫ）などの前述した方法を使用して、精製ＤＮＡを作製することができる。
【００８７】
５μｌの供給されたプライマー溶液を、それぞれのＰＣＲチューブに分配する。１つのＤＱＢ１＊０３型分類（１１のＰＣＲ反応混合物）を行うために、以下のＰＣＲ混合物を作製する：１１２μｌのＤｙｎａｌ ＡｌｌＳｅｔ ＳＳＰマスター混合物（Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ＫＣＩ、ゼラチン、ＭｇＣｌ２、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、グリセロール及びクレゾールレッド）；２６．６μｌのサンプルＤＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）；１．１２μｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ。含有物を混合させ、１０μｌのＰＣＲ混合物をそれぞれのウエルに分配する。使用するＰＣＲサイクルのパラメータは：９４℃で２分間；９４℃で１０秒間及び６５℃で６０秒間の１０サイクル；９４℃で１０秒間、６１℃で５０秒間及び７２℃で３０秒間の２０サイクルである。
【００８８】
ＨＬＡ ＤＱ７特異性を意味する、ＤＱＢＩ＊０３０対立遺伝子、ＤＱＢ１＊０３０１１、ＤＱＢ１＊０３０１２、ＤＱＢ１＊０３０４、及び／又はＤＱＢＩ＊０３０９などをサンプルが含むとき、陽性の結果が得られる。したがって、たとえばチューブ１（ＰＣＲ産物１４０ｂｐ）、及びチューブ２（ＰＣＲ産物１２５ｂｐ）（ＤＱＢ１＊０３０１及びＤＱＢ１＊０３０２）、及び／又はチューブ１及びチューブ５（１３０ｂｐ）（ＤＱＢ１＊０３０４）、及び／又はチューブ１、チューブ２、及びチューブ１０（ＰＣＲ産物１２０ｂｐ）（ＤＱＢ１＊０３０９）中で陽性シグナルが得られるとき、ＤＱ７特異性を有するＨＬＡが同定される。
【００８９】
本発明の他の実施形態では、哺乳動物、家畜哺乳動物など、たとえばヒツジ及び／又はウシの、プリオン感受性を決定することができる。この実施形態では、ＤＮＡに基づく方法は、ＤＮＡの塩基配列決定であることが好ましい。ＤＮＡの塩基配列決定を使用して、家畜哺乳動物のＭＨＣの同等なＨＬＡ ＤＱ７特異性を意味する、１個又は複数個のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列、１個又は複数個の遺伝子座及び／又は１個又は複数個の対立遺伝子などを同定することができる。たとえば、ＨＬＡ ＤＱ７特異性を意味するＤＱＢｌ＊０３０対立遺伝子の配列は、データベース、たとえばヒトからのＤＱＢｌ＊０３０対立遺伝子の５’側面領域（受託番号ＡＦ２１７４２０）；ヒトからのＤＱＢｌ＊０３０４対立遺伝子の第１のドメイン、エクソン２（受託番号Ｍ７４８４２）において、公に入手可能である。家畜からのヌクレオチド及びアミノ酸配列のデータベースを調べて、ＨＬＡ ＤＱ７特異性を意味する配列と相同性がある配列を同定することができる。したがって、同等のＨＬＡ ＤＱ７特異性を決定することによりプリオン病に対する家畜の感受性を決定するために、本発明の方法を使用することもできることは、当業者により明らかであろう。
【００９０】
本発明の方法を、プリオン病に対する被験者の感受性を決定する他の方法（ＰｒＰ Ｍｅｔ１２９型分類、又はＤＱ７が好ましい例である血液系マーカーの他の組合せなど）と組み合わせて、これによってそれぞれの被験者に関する第２の情報を有利に与えることができることは、当業者には明らかであろう。１つのこのような方法では、ＰｒＰ１２９の遺伝型を、ＷＯ ９８／１６８３４、Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９１）Ｌａｎｃｅｔ ３３７，１４４１〜１４４２、Ｐａｌｍｅｒ他（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２，３４０〜３４２、及びＣｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９６）Ｌａｎｃｅｔ ３４８，５６中に記載されたように決定する。ＰｒＰのアミノ酸１２９における多型は同定されてきており（メチオニン又はバリンに関して）、このことが、その大部分が多形残基１２９におけるメチオニンが同型である、ｖＣＪＤを有する患者の一団の、散発性及び後天性のヒトプリオン病に対する遺伝的感受性に寄与している。したがって、ＰｒＰメチオニン１２９を有し、さらにＨＬＡ型ＤＱ７が欠けている被験者は、プリオン病に対して最も高い感受性を有し、逆も然りであると予想することができる。方法を組み合わせることによって、プリオン病に対する被験者の感受性の、さらに確固たる指標を与えることができる。
【００９１】
本明細書では、用語「家畜」は、任意の飼育動物を指す。家畜は、１匹又は複数匹のブタ、ヒツジ、ウシ又は雄牛であることが好ましい。家畜はウシ、雄牛又はヒツジであることがより好ましい。
【００９２】
ヌクレオチド配列
本発明の態様は、データベース中の利用可能なヌクレオチド配列の使用を含むことができる。
【００９３】
本明細書では、用語「ヌクレオチド配列」は、用語「ポリヌクレオチド」と同義である。
【００９４】
ヌクレオチド配列は、ゲノム又は合成又は組み換え起源の、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。ヌクレオチド配列は、センス鎖又はアンチセンス鎖又はこれらの組合せである、二本鎖又は一本鎖であってよい。
【００９５】
一般的な組み換えＤＮＡ法の技術
一般に、本明細書で述べる技法は当分野でよく知られているが、特にＳａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）、及びＡｕｓｕｂｅｌ他、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）４ｔｈ Ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃを、参照することができる。
【００９６】
他の態様では、本発明は、プリオン病に対する感受性が低い、家畜などの哺乳動物の繁殖に関する。ＨＬＡ ＤＱ７特異性が同等である１個又は複数個のＭＨＣ分子を有する家畜を、繁殖させることができる。ＨＬＡ ＤＱ７特異性が同等である１個又は複数個のＭＨＣ分子を有するこれらの子孫を選択し、他の繁殖プログラムにおいて使用することができる。近親交配、近親外交配、又は当業者に知られている任意の他の繁殖法を含めた、さまざまな繁殖法を使用することができる。
【００９７】
他の態様では、本発明は、ゲノムに挿入されたＨＬＡ ＤＱ７特異性が同等である、１個又は複数個のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列を有する、家畜などのトランスジェニック哺乳動物に関する。したがって、このトランスジェニック哺乳動物は、プリオン病に対して低い感受性を有する可能性がある。同等なＨＬＡ ＤＱ７特異性を意味するＭＨＣ分子、１個又は複数個の遺伝子座及び／又は１個又は複数個の対立遺伝子などを、（１）１つの胚から他の胚への細胞の移動；（２）レトロウイルスに感染させた細胞の導入；（３）Ｓｃｏｔｔ他（１９８９），Ｃｅｌｌ ５９，８４７〜８５７、及びＳｃｏｔｔ他（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，１，９８６〜９９７により記載された方法に従った、
受精卵の前核へのｃＤＮＡのマイクロインジェクション；（４）１匹の動物への多数の卵の移植などの、当業者によく知られているいくつかの技法を使用して、哺乳動物に導入することができる。したがって、知られている手順を使用して、生じる子孫がトランスジェニック哺乳動物であるかどうかを決定する。
【００９８】
他の態様では、本発明は、同等なＨＬＡ ＤＱ７特異性を意味する１個又は複数個のＭＨＣ分子、１個又は複数個の遺伝子座及び／又は１個又は複数個の対立遺伝子などを有し、そのゲノムが欠失しているトランスジェニックマウスなどのトランスジェニック哺乳動物に関する可能性もあり、したがって、このトランスジェニック哺乳動物は、プリオン病に対して高い感受性を有する。
【００９９】
以下の実施例を参照しながら、本発明を例示する。
【実施例１】
【０１００】
プリオン病に対する感受性と関係があるＤＱ７特異性を有するＨＬＡの同定
ＤＮＡ抽出キット（Ｄｙｎａｌ、Ｍｅｒｓｅｙｓｉｄｅ、ＵＫ；製品番号６３３．ＸＸ）を使用して、ｖＣＪＤ感染した４９人のヒト患者及び１９７人の対照ヒト患者から、ＤＮＡを単離する。２ｍｌのチューブ中のそれぞれの患者からの２００μｌの抗凝固処理した全血を、１ｍｌの赤血球細胞溶解バッファー１（５ｍｌの濃縮物＋４４ｍｌの蒸留水＋１ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８）と、溶液が透明になるまで混合させる。この溶液を、１０，０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離して、白血球細胞をペレット状にし、上澄みを捨てる。チューブを攪拌し、１ｍｌの赤血球細胞溶解バッファー２（５ｍｌの濃縮物＋４５ｍｌの蒸留水）を加える。この溶液を１０秒間遠心分離し、上澄みを捨てる。２００μｌの再懸濁Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＤＮＡ抽出物を、白血球細胞のペレットに加え、チューブの含有物をすぐに吸引し、清潔な２ｍｌのチューブに移す。磁気バーを有するＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）−Ｑ中の適所に、チューブを置き、３０秒後に上澄みを捨てる。磁気バーを除去し、１ｍｌの蒸留水を加える。磁石を交換し、３０秒後に上澄みを捨てる。複合体をさらに２回洗浄し、２４６の血液サンプルから抽出したＤＮＡを、２００μｌの蒸留水に再懸濁させる。
【０１０１】
ＲＥＬＩ ＳＳＯ ＨＬＡ−ＤＱＢＩ Ｔｅｓｔ（Ｄｙｎａｌ、Ｍｅｒｓｅｙｓｉｄｅ、ＵＫ；製品番号８２０．ＸＸ）を使用して、ＨＬＡの型分類を行う。
【０１０２】
３０μｌのマスター混合物（１０％グリセロール、ＫＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣ１、＜０．００１％ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、ビオチン化プライマー、＜０．０１％ ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）（Ｔａｑポリメラーゼ）及び０．０５％アジ化ナトリウム）を、次に１５μｌの６ｍＭ ＭｇＣｌ2、及び１５μｌの対照ＤＮＡ（ＤＱＢ１＊０３０対立遺伝子を含む）、陰性対照（滅菌蒸留水）、又は２４６の血液サンプルそれぞれから抽出したＤＮＡを、それぞれのＰＣＲチューブに等分する（前述のＤＮＡ抽出キットを使用して）。ＰＣＲ増幅は、以下のようにプログラムされたサーマルサイクラーを使用して行う：９５℃で１５秒間、６０℃で４５秒間、７２℃で１５秒間の３５サイクル；７２℃に５分間、その後１５℃に永久的に保つ。プログラムの終了時に、チューブを除去し、６０μｌの変性溶液（３％ ＥＤＴＡ、１．６％ ＮａＯＨ及びチモールブルー）を加え、次に１０分間室温でインキュベーションする。
【０１０３】
検出ステップ用に、３つのバッファーを使用する：（１）作業用ハイブリダイゼーションバッファー、５５ｍｌのＳＳＰＥ濃縮物（ＮａＣｌを含むリン酸ナトリウム溶液、ＥＤＴＡ及び１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ １５０（登録商標））、２１３ｍｌの蒸留水、及び６．９ｍｌのＳＤＳ濃縮物（ＳＤＳ及び１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ １５０（登録商標））を混合させることによって調製するもの；（２）作業用洗浄バッファー、６５ｍｌのＳＳＰＥ濃縮物、１２２８．５ｍｌの蒸留水、及び６．５ｍｌのＳＤＳ濃縮物を混合させることによって調製するもの、２７５ｍｌを厳密洗浄バッファー用に使用し、１０２５ｍｌを周囲洗浄バッファー用に使用する；（３）作業用クエン酸バッファー、３０ｍｌのクエン酸濃縮物（クエン酸ナトリウム溶液）を５７０ｍｌの蒸留水で希釈することによって調製するもの。
【０１０４】
ハイブリダイゼーションバッファー及び厳密洗浄バッファーを、使用前に５０℃に暖め、水浴を同じ温度に設定する。ＨＬＡ−ＤＱＢ１に型分類した試料を、型分類用トレーのそれぞれのウエル中に置く。５ｍｌの予め暖めたハイブリダイゼーションバッファーをそれぞれのウエルに加え、次に７０μｌの変性した増幅サンプル又は対照をそれぞれのウエルに加える。型分類用トレーの上に蓋を置き、５０℃において３０分間６０ｒｐｍで、トレーをインキュベートする。それぞれのウエルの含有物を除去し、５ｍｌの周囲洗浄バッファーを加える。それぞれのウエルの含有物を除去し、５ｍｌの厳密洗浄バッファーを、５０℃において１５分間６０ｒｐｍで加える。作業用複合溶液を、５．３ｍｌの周囲洗浄バッファーを１６μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体（ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体、ＮａＣｌ及び１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ １５０（登録商標）を含むＡＣＥＳ溶液中のもの）に加えることによって、アッセイするそれぞれの試料用に調製する。トレーを水浴から除去し、それぞれのウエルから含有物を除去する。５ｍｌの作業用複合溶液をそれぞれのウエルに加え、トレーを１５分間６０ｒｐｍで混合する。含有物をウエルから除去し、５ｍｌの周囲洗浄バッファーを、それぞれのウエルに５分間６０ｒｐｍで加える。周囲洗浄バッファーのステップを１回繰り返す。含有物をウエルから除去し、５ｍｌのクエン酸バッファーを、５分間６０ｒｐｍで加える。作業用基質（基質Ａ（０．０１％ Ｈ2Ｏ2、及び０．１％ ＰｒｏＣｌｉｎ １５０（登録商標）を含むクエン酸溶液）と、基質Ｂ（４０％ジメチルホルムアミドに溶けた０．１％ ３，３’，５，５’−テトラメチルベンズイミド）の混合物）を、計算式［４．４ｍｌ×試料の数］を使用して、必要とされる基質Ａの量を計算することによって調製する。必要とされる基質Ｂの量は、計算式［１．１ｍｌ×試料の数］によって決定する。ウエルの含有物を除去し、５ｍｌの作業用基質を１０分間６０ｒｐｍで加える。ウエルの含有物を除去し、５ｍｌの蒸留水を５分間６０ｒｐｍで加える。このステップは２回繰り返す。５ｍｌのクエン酸バッファーをそれぞれのウエルに加える。
【０１０５】
キットと共に含まれるＨＬＡ−ＤＱＢ１オーバーレイ及びスコアシートを使用して、試料を手作業で処理する。対照線より大きな強度を有するそれぞれの青線に関しては、陽性シグナルが記録される。その型を、キットと共に含まれるＤｙｎａｌ ＲＥＬＩ ＳＳＯ ＨＬＡ−ＤＱＢの説明表と比較する。
【０１０６】
以下の結果が得られる：
【０１０７】
ｖＣＪＤ感染した患者（１２．２％）と対照患者（３５．５％）の間の、ＨＬＡ ＤＱ７特異性の結果の比較によると、ＤＱ７特異性を有するＨＬＡはｖＣＪＤを有する患者においてより少ない。したがって、ｖＣＪＤを有する被験者中のＤＱ７特異性を有するＨＬＡの存在は、対照患者中より少ない。
【０１０８】
したがって、被験者中のＤＱ７特異性を有するＨＬＡの存在は、プリオン病に対して低い感受性と関連があり；被験者中のＤＱ７特異性を有するＨＬＡの不在は、プリオン病に対して高い感受性と関連があることが実証される。
【実施例２】
【０１０９】
ＤＮＡに基づく方法（ＳＳＯ）を使用する、プリオン病に対する被験者の感受性の決定
ヒト患者由来のサンプルに、ＤＮＡ抽出及びＨＬＡ型分類を、実施例１に記載したのと同様に行う。
【０１１０】
以下の対照反応物を使用する：（１）陽性対照＝ｖＣＪＤを有する患者から抽出したＤＮＡ；（２）陰性対照＝蒸留水。
【０１１１】
キットと共に含まれるＨＬＡ−ＤＱＢ１オーバーレイ及びスコアシートを使用して、ＨＬＡ−ＤＱＢ１に型分類された試料を手作業で処理する。対照線より大きな強度を有するそれぞれの青線に関しては、陽性シグナルが記録される。その型を、キットと共に含まれるＤｙｎａｌ ＲＥＬＩ ＳＳＯ ＨＬＡ−ＤＱＢの説明表と比較する。
【０１１２】
試験するヒト患者に関して、陽性シグナル（すなわち、対照線より大きな強度を有する青線）が、レーン７、レーン１１、レーン１７、レーン２２〜２３、及びレーン２５に存在する。したがって、被験者はＤＱＢ１＊０３０１（ＤＱＢ１＊０３０１１／ＤＱＢ１＊０３０１２）及びＤＱＢ１＊０３０９を有し、したがってＤＱ７特異性を有するＨＬＡを有する。
【０１１３】
陽性対照に関しては、陽性シグナル（すなわち、対照線より大きな強度を有する青線）が、レーン７、レーン１１、レーン１７、レーン２２〜２３、及びレーン２５に存在する。したがってこの対照は、ＨＬＡ ＤＱ７特異性を意味するＤＱＢ１＊０３０１（ＤＱＢＩ＊０３０１１／ＤＱＢ１＊０３０１２）及びＤＱＢｌ＊０３０９を有する。
【０１１４】
陰性対照に関しては、陽性シグナルは得られない。
【０１１５】
したがって、ヒト患者はＤＱ７特異性を有するＨＬＡを有する、すなわち、ヒト患者はｖＣＪＤに対して低い感受性を有することが実証される。
【実施例３】
【０１１６】
ＤＮＡに基づく方法（ＳＳＯ）を使用する、プリオン病に対する被験者の感受性の決定。
【０１１７】
ＤＮＡ抽出及びＨＬＡ型分類を、実施例１に記載したのと同様にヒト患者に行う。使用した対照は実施例２と同じである。
【０１１８】
キットと共に含まれるＨＬＡ−ＤＱＢ１オーバーレイ及びスコアシートを使用して、ＨＬＡ−ＤＱＢ１に型分類された試料を手作業で処理する。対照線より大きな強度を有するそれぞれの青線に関しては、陽性シグナルが記録される。その型を、キットと共に含まれるＤｙｎａｌ ＲＥＬＩ ＳＳＯ ＨＬＡ−ＤＱＢの説明表と比較する。陽性シグナル（すなわち、対照線より大きな強度を有する青線）は、ＨＬＡ ＤＱ７特異性を意味するＤＱＢ１＊０３０対立遺伝子に関しては得られない。
【０１１９】
陽性対照及び陰性対照に関する結果は、実施例２と同じである。
【０１２０】
したがって、ヒト患者はＤＱ７特異性を有するＨＬＡを有さない、すなわち、ヒト患者はｖＣＪＤに対して高い感受性を有することが実証される。
【実施例４】
【０１２１】
ＤＮＡに基づく方法（ＳＳＯ）を使用する、プリオン病に対する被験者の感受性の決定
ＤＮＡ抽出を、実施例１に従いヒト患者に行う。使用した対照は実施例２と同じである。
【０１２２】
Ａｌ１Ｓｅｔ ＳＳＰ ＤＱＢ１＊０３ Ｔｅｓｔ（Ｄｙｎａｌ、Ｍｅｒｓｅｙｓｉｄｅ、ＵＫ；製品番号５８１．ＸＸ）を使用する。５μｌの供給されたプライマー溶液を、それぞれのＰＣＲチューブに分配する。１つのＤＱＢ１＊０３型分類（１１のＰＣＲ反応混合物）を行うために、以下のＰＣＲ混合物を作製する：１１２μｌのＤｙｎａｌ ＡｌｌＳｅｔ ＳＳＰマスター混合物（Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ＫＣＩ、ゼラチン、ＭｇＣｌ2、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、グリセロール及びクレゾールレッド）；２６．６μｌのサンプルＤＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）；１．１２μｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ。含有物を混合させ、１０μｌのＰＣＲ混合物をそれぞれのウエルに分配する。使用するＰＣＲサイクルのパラメータは：９４℃で２分間；９４℃で１０秒間及び６５℃で６０秒間の１０サイクル；９４℃で１０秒間、６１℃で５０秒間及び７２℃で３０秒間の２０サイクルである。
【０１２３】
チューブ１（ＰＣＲ産物１４０ｂｐ）及びチューブ２（ＰＣＲ産物１２５ｂｐ）に関して陽性シグナルが、すなわちＨＬＡ ＤＱ７特異性を意味するＤＱＢＩ＊０３０１（ＤＱＢ１＊０３０１１及びＤＱＢ１＊０３０１２）に関する陽性の結果が得られる。
【０１２４】
陽性対照に関しては、チューブ１（ＰＣＲ産物１４０ｂｐ）及びチューブ２（ＰＣＲ産物１２５ｂｐ）に関して陽性シグナルが、すなわちＨＬＡ ＤＱ７特異性を意味するＤＱＢＩ＊０３０１（ＤＱＢ１＊０３０１１及びＤＱＢ１＊０３０１２）に関する陽性の結果が得られる。
【０１２５】
陰性対照に関しては、陽性シグナルは得られない。
【０１２６】
したがって、ヒト患者はＤＱ７特異性を有するＨＬＡを有する、すなわち、ヒト患者はｖＣＪＤに対して低い感受性を有することが実証される。
【実施例５】
【０１２７】
ＤＮＡに基づく方法（ＳＳＯ）を使用する、プリオン病に対する被験者の感受性の決定
ヒト患者に、ＤＮＡ抽出を実施例１に従って行い、及びＨＬＡ型分類を実施例３に従い行う。使用した対照は実施例４と同じである。
【０１２８】
ＨＬＡ ＤＱ７特異性を意味する任意のＤＱＢ１＊０３０対立遺伝子に関して、陽性シグナルは得られない。
【０１２９】
対照に関する結果は、実施例４と同じである。
【０１３０】
したがって、ヒト患者はＤＱ７特異性を有するＨＬＡを有さない、すなわち、患者はｖＣＪＤに対して高い感受性を有することが実証される。
【実施例６】
【０１３１】
この実施例は、ｖＣＪＤを有する患者におけるＨＬＡクラスＩＩ型ＤＱ７（ＤＱＢ１＊０３０１／４／９）の有意に低下した頻度を例示するものであり、一方で散発性ＣＪＤの発生率は、対照群のそれと同等であった。
【０１３２】
理論に拘束するものではないが、この分子マーカーはそれ自体がｖＣＪＤ感染性と直接関連がある可能性があり、或いは密接に関連している遺伝子がこの影響の原因である可能性がある。
【０１３３】
この実施例は、正常な対照及び散発性ＣＪＤとの比較用に、ｖＣＪＤ患者のＨＬＡ型を決定するための研究を示す。散発性ＣＪＤの病因、ＣＪＤの主な識別診断は依然として明らかではないが、そのランダムな世界的分布、及び集合性がないこと、又は局所的なスクレーピーの蔓延との関連が、後天的病因に対して論じられる。プリオンタンパク質遺伝子の体細胞突然変異、又はＰｒＰScの自発的形成が、より可能性の高い原因であると考えられる。
【０１３４】
ｖＣＪＤ患者の組織から抽出した３２のＤＮＡサンプルに関する最初の研究を行い、１２例の散発性ＣＪＤからのサンプルと比較した。組織サンプルは、親族の承諾を得て、死体解剖において得た。これらのサンプルを、配列特異的プライマーによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ−ＳＳＰ）法（Ｂｕｎｃｅ他）を使用して低い／中精度で、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤＲＢ及びＤＱＢ１にＨＬＡ型分類した。この研究において使用したサンプルはすべて、イギリスのコーカソイドからのものであると確認した。１９７の一連の死体臓器ドナーの一群からのＨＬＡ頻度を、対照値として使用した。
【０１３５】
対照の頻度の統計的にのみ有意な偏差が、ＤＱＢ１遺伝子座にみられた；３２人のｖＣＪＤ患者中わずか２人が、両側検定であるフィッシャーの正確検定によって、１９７人の対照中の７０人（３５．５％）と比較して、ＤＱＢ１＊０３０１／４／９（ＤＱ７）に陽性であり、０．０００４という非補正ｐ値が報告された。散発性ＣＪＤの場合、５０％の患者がＤＱ７であり（６／１２）、対照と有意に異なるわけではなかった（ｐ＝０．３６）。この発見の後、他の１８人のｖＣＪＤ及び１４人の散発性ＣＪＤ患者を、市販のＰＣＲ−ＳＳＯＰキット（Ｒｅｌｉ（商標）、Ｄｙｎａｌ ＵＫ）のみを使用して、ＨＬＡ−ＤＱＢ１に型分類した。表１は、５０人のｖＣＪＤ患者、２６人の散発性ＣＪＤ患者、及び１９７人の対照における、ＨＬＡ−ＤＱ型の表現型頻度の割合を示す。それぞれの被験者のＤＱＢ１対立遺伝子を考慮することにより、ＨＬＡ−ＤＱ型を指定した。ＨＬＡ−ＤＱ７の頻度は、ｖＣＪＤ患者において有意に低いままの状態であり（ｐ＝０．００１０）、５０人中わずか６人がこの表現型を有していた。散発性ＣＪＤ群におけるＨＬＡ−ＤＱ頻度は、対照の頻度に匹敵した状態であった。
【０１３６】
現在、研究されているｖＣＪＤの犠牲者はすべて、ＰＲＮＰ遺伝子中の共通の多型に関してメチオニンが同型である。約３８％の正常な英国人の個体群は、この遺伝型を有する。われわれのデータによって、ＤＱ７の存在は、３．３のＤＱ７に陰性である個人の相対的な危険に対して、いくらか防御性があることが示唆される。
【０１３７】
したがって、ＰＲＮＰ遺伝型分類と共に、ｖＣＪＤの疑いがある患者をＤＱ７型分類することが、診断における有用なツールであることが実証される。
【０１３８】
ｖＣＪＤの確固たる組織に基づく診断は扁桃生検によって行うことができるが、本発明の血液に基づく診断が、好ましいことは明らかである。
【０１３９】
理論に縛られること望まずに、ＤＱ７とｖＣＪＤの防御的関係に関する、分子的基盤は明らかではない。ＭＨＣクラスＩＩの分子自体が、疾患の病因における直接的な役割を果たしているか、或いは、ＤＱＢ遺伝子座と関連がある遺伝子が関連していることが考えられる。ＭＨＣクラスＩＩの考えられる役割は、その物体周辺にＰｒＰScを偶然に有していることである可能性があり、或いは実際に、腸からリンパ細網系では、ＤＱ７分子の役割はあまり有効ではない。或いは、ＨＬＡ−ＤＱ７分子は、推定病原性ペプチドを提示する際に、より有効である可能性があり、このようにして免疫応答を開始させる。本発明の作業によって、疾患の病因におけるＭＨＣクラスＩＩの分子の重要な役割を明らかにすることができる。したがって、治療的介入の標的が開示される。
【０１４０】
【表１】
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上記の本明細書で述べたすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込んである。本発明の記載した方法及び系のさまざまな変更形態及び変形形態が、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。特定の好ましい実施形態に関して本発明を記載してきたが、特許請求する本発明は、このような特定の実施形態に過度に制限されるべきではないことは理解されなければならない。実際、分子生物学又は関連分野の当業者には明らかである、本発明を実施するために記載した方法のさまざまな変更形態が、以下の特許請求の範囲内のものであると考えられる。
【０００１】
本発明は方法に関する。特に本発明は、プリオン病に対する被験者の感受性を決定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プリオンは、核酸を含まない伝染性の粒子である。最も顕著なプリオン病は、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、ヒツジのスクレーピー、及びヒトのクロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）である。ＣＪＤの最も一般的な症状発現は、個体中で自然に発生する散発性ＣＪＤ（ｓＣＪＤ）である。医原性ＣＪＤ（ｉＣＪＤ）は、偶発的な感染から生じる疾患である。家族性ＣＪＤ（ｆＣＪＤ）は、家系中で稀に発生し、ヒトＰｒＰ遺伝子の突然変異によって引き起こされる、ＣＪＤの１つの形態である。ヒトの「新しい変異型」ＣＪＤ（ｖＣＪＤ）は、他の型のＣＪＤに関して見られるものと異なる、ＰｒＰ糖型のパターンと関連があるＣＪＤの異なる系統型である。ＢＳＥがウシ類から伝わって、ヒトのｖＣＪＤをもたらした可能性があることが示唆されている。
【０００３】
プリオンは、ＰｒＰScと呼ばれる、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）の改変されたイソ型のみで構成されているようである。正常細胞のＰｒＰ（ＰｒＰCと呼ばれる）は、翻訳後プロセスによってＰｒＰScに転換される。このプロセス中、ＰｒＰCの構造が変化し、ＰｒＰの生理化学的性質の変化を伴う。ＰｒＰScのアミノ酸配列は、遺伝子が複製し続ける哺乳動物宿主の、ＰｒＰ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列によって決まる。
【０００４】
ｖＣＪＤなどのプリオン病の疫学は、依然として確かなものではない。Ａｔｔｗｏｏｄ（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９：８：２８３は、ＢＳＥが実際に、食物を汚染することによってｖＣＪＤを引き起こしている可能性が高いことが、研究によって現在確認されていると報告している。約１００万頭の汚染されたウシが、ヒトの食物連鎖中に入りこんでいると考えられ、したがって、ｖＣＪＤの大規模な将来の蔓延が予想される。Ｂｅａｌｅ（２００１）Ｊ Ｒ Ｓｏｃ Ｍｅｄ ９４：２０７〜２０９は、プリオン感染からプリオン病までの長い潜伏期によって、実験作業が緩慢且つ困難なものになっていると報告している。
【０００５】
プリオン感受性を予測することが望ましい。プリオン感受性は多因性条件のものであると考えられる。プリオン感受性を予想するための従来技術の試みはわずかであり、それらは主にｓＣＪＤ及びｆＣＪＤに焦点を当てたものである。プリオン感受性を予想する方法が必要とされている。
【０００６】
ある従来技術の研究は、ｖＣＪＤ病をＰｒＰ配列多型と相関付けている（ＰｒＰ Ｍｅｔ１２９、Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他、１９９６ Ｌａｎｃｅｔ ｖｏｌ ３４８ ｐ．５６を参照のこと）。
【０００７】
本発明は、従来技術に関する問題点を克服しようとするものである。
【非特許文献１】
Ａｔｔｗｏｏｄ（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９：８：２８３
【非特許文献２】
Ｂｅａｌｅ（２００１）Ｊ Ｒ Ｓｏｃ Ｍｅｄ ９４：２０７〜２０９
【非特許文献３】
Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他、１９９６ Ｌａｎｃｅｔ ｖｏｌ ３４８ ｐ．５６
【非特許文献４】
Ｒｏｉｔｔ、Ｂｒｏｓｔｏｆｆ及びＭａｌｅ編‘Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ’、１９９６ ４th Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｍｏｓｂｙ Ｔｉｍｅｓ Ｍｉｒｒｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ刊行
【非特許文献５】
Ｂｏｄｍｅｒ他、１９９４ Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｖｏｌ ４４ ｐｐ １〜１８
【非特許文献６】
Ｖｉｃｔｏｒ Ａ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ他による、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ
【非特許文献７】
Ｔｏｄｄ他（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：５９９〜６０４
【非特許文献８】
Ｋｗｏｋ他（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：１０２７〜１０３０
【非特許文献９】
Ｔｏｄｄ他（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：１０９４〜１０９８
【非特許文献１０】
Ｇｉｏｒｄａ他（１９９１）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３３ ４０４〜４０８
【非特許文献１１】
Ｙｕｎｉｓ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１ ７７４７〜７７５１
【非特許文献１２】
Ｄｅｌｇａｄｏ他（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．９３：８５６９〜８５７１
【非特許文献１３】
Ａｒｉｆ他（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｍｅｔａｂ．８４ １０５６〜１０６０
【非特許文献１４】
Ｍｉｌｌｅｒ他（１９８８）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６，１２１５
【非特許文献１５】
Ｋａｔｚ他（１９８７）ＪＰｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ ５８：６０７〜６１０
【非特許文献１６】
Ｂｉｄｗｅｌｌ（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ９，１８〜２３
【非特許文献１７】
Ａｎｇｅｌｉｎｉ他（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，４４８９〜４４９３
【非特許文献１８】
Ｂｕｎｃｅ他（１９９５）Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４６，３５５〜３６７
【特許文献１】
ＷＯ ９８／１６８３４
【非特許文献１９】
Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９１）Ｌａｎｃｅｔ ３３７，１４４１〜１４４２
【非特許文献２０】
Ｐａｌｍｅｒ他（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２，３４０〜３４２
【非特許文献２１】
Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９６）Ｌａｎｃｅｔ ３４８，５６
【非特許文献２２】
Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）
【非特許文献２３】
Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）４ｔｈ Ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ
【非特許文献２４】
Ｓｃｏｔｔ他（１９８９），Ｃｅｌｌ ５９，８４７〜８５７
【非特許文献２５】
Ｓｃｏｔｔ他（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，１，９８６〜９９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ型のＤＱ７が、プリオン病に対する感受性と関連があるという、驚くべき発見に基づくものである。ＤＱ７を有する被験者はプリオン病に対して低い感受性を有し、一方ＤＱ７ ＨＬＡ型を有していない被験者は、プリオン病に対して高い感受性を示す。
【０００９】
したがって、本明細書では、被験者中のＤＱ７の欠如が、プリオン病に対して高い感受性と相関関係があることを開示する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第一の態様では、本発明は、プリオン病に対する被験者の感受性を決定する方法であって、前記被験者からのサンプルを提供するステップと、前記サンプルのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に対する特異性を決定するステップとを含み、前記サンプルがＤＱ７ヒト白血球抗原に対する特異性を有する場合は、前記被験者がプリオン病に対して低い感受性を有し、前記サンプルがＤＱ７ヒト白血球抗原に対する特異性を有さない場合は、前記被験者がプリオン病に対して高い感受性を有すると決定する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
サンプルは、ＨＬＡ型の分類を行うことができる任意の組織又は体液であってよい。
【００１２】
「ＨＬＡ特異性を決定する」とは、ＨＬＡ特異性又はＨＬＡ型を解明することを意味する。このプロセスは一般に、「ＨＬＡ型分類」と呼ばれる。用語「ＨＬＡ特異性」及び「ＨＬＡ型」は、本明細書では互換的に使用する。
【００１３】
サンプルをＨＬＡ型分類する（すなわち、ＨＬＡ特異性を決定する）ときは、充分な情報を集めて、そのサンプルがＤＱ７であるか、それともＤＱ７ではないかを決定しなければならない。用語「ＤＱ７」は、無数の基本的な免疫学教本（たとえば、Ｒｏｉｔｔ、Ｂｒｏｓｔｏｆｆ及びＭａｌｅ編集「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、１９９６ ４th Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｍｏｓｂｙ Ｔｉｍｅｓ Ｍｉｒｒｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ刊を参照のこと；Ｂｏｄｍｅｒ他、１９９４ Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｖｏｌ ４４ ｐｐ １〜１８も参照のこと）に記載されている、よく知られているＨＬＡ型を指す。
【００１４】
当業者に知られている任意の適切な手段によって、サンプルをＨＬＡ型分類することができる。このような手段には、血清型の分類、ＤＮＡの配列決定、配列特異的オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）、又は配列特異的プライマーによるＰＣＲ（ＰＣＲ−ＳＳＰ）などの核酸に基づく方法、又は任意の他の適切な方法がある。ＨＬＡの型分類については、以下でより詳細に論じる。核酸に基づく方法を使用して、サンプルをＨＬＡ型分類することが好ましい。したがって、他の態様では、本発明は、前に記載した方法であって、ヒト白血球抗原に対する特異性を核酸に基づく方法によって決定する方法に関する。ＰＣＲ−ＳＳＰを使用して、サンプルをＨＬＡ型分類することが好ましい。したがって、他の態様では、本発明は、前に記載した方法であって、核酸に基づく方法が配列特異的プライマーによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ−ＳＳＰ）を含む方法に関する。
【００１５】
他の態様では、本発明は、前に記載した方法であって、プリオン病がｖＣＪＤである方法に関する。
【００１６】
他の態様では、本発明は、前に記載した方法であって、サンプルが体液又は組織であるか、或いはそれに由来するものである方法に関する。
【００１７】
他の態様では、本発明は、前に記載した方法であって、体液又は組織が血液である方法に関する。
【００１８】
他の態様では、本発明は、前に記載した方法であって、サンプルが体液又は組織から抽出した核酸であるか、或いはそれに由来するものである方法に関する。
【００１９】
プリオン
本明細書では、用語「プリオン」は、当分野におけるその通常の意味を有するものであり、核酸を含まないタンパク質性感染粒子を指す。
【００２０】
動物及びヒトのプリオン病は、異常な形状の宿主コード化タンパク質、ＰｒＰScの堆積によって特徴付けられる。ヒトのプリオン病には、遺伝性、散発性及び後天性の形態がある。クロイツフェルト−ヤコブ病の変異型（ｖＣＪＤ）は１９９６年に同定され、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）プリオン感染物質に曝されることによって生じる。ｖＣＪＤは、散発性及び他の形態のＣＪＤのそれとは異なる病因を有しており、リンパ細網組織内でのＰｒＰScの蓄積が顕著である。
【００２１】
プリオン病、即ち伝達性海綿状脳症は、核酸を含まない新規な感染物質によって引き起こされる神経変性疾患である。２つの新たな関連プリオン病；ウシ類のＢＳＥ及びヒトのｖＣＪＤの出現に刺激され、分子ベースでの疾患の病因に関する熱心な研究努力が行われている。このｖＣＪＤが、食事又は他の形でのＢＳＥ物質への暴露の結果として生じたものであることは、分子学的及び生物学的な系統の型分類研究によって支持されており、多くの個体が感染している可能性がある。ｖＣＪＤの特徴的な病因は、推定経口感染経路、又はプリオン系統に特異的な作用に関係している可能性がある。リンパ細網系（ＬＲＳ）の関与も、ヒツジのスクレーピー及びネズミモデルのスクレーピーにおいて見られ、この場合は濾胞樹状細胞に、潜伏期の初期、神経学的徴候の発症の充分前に、ＰｒＰScが蓄積することが示されている。ＬＲＳ中でのプリオン複製が、末梢部分への少量の感染物質の接種に続く神経への侵入の前提条件である可能性がある。
【００２２】
プリオンに関する背景知識は、Ｖｉｃｔｏｒ Ａ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ他によって、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍに示されている。プリオンに関する以下の情報は、この情報源から抜き出したものである。
【００２３】
プリオンタンパク質遺伝子の突然変異は、ゲルストマン−ストロイスラー症候群（ＧＳＤ）、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、及び家族性致死性不眠症と関係があり、異常なイソ型のプリオンタンパク質は、これらの疾患において、又クールー及びヒツジのスクレーピーにおいて、感染物質として働くことができる。
【００２４】
Ｐｒｕｓｉｎｅｒ（１９８２、１９８７）は、プリオンが、核酸を含まない新しいクラスの感染物質であることを示唆した用語プリオンは、Ｐｒｕｓｉｎｅｒ（１９８２）によって考案されたもので、「タンパク質感染物質」に由来する）。プリオン病は、接種により伝染し、或いは常染色体優性障害として遺伝する、神経変性疾患である。Ｐｒｕｓｉｎｅｒ（１９９４）は、伝達性海綿状脳症の病因を概説し、プロテアーゼ耐性イソ型プリオンタンパク質がこれらの疾患の病因において重要であることを示した。Ｍｅｓｔｅｌ（１９９６）は、感染性タンパク質の存在に関する、賛成及び反対の証拠、並びに賛成及び反対の意見を概説した。
【００２５】
Ｔａｇｌｉａｖｉｎｉ他（１９９１）は、インディアナ州のある一族の２人の患者から単離したアミロイド斑中心部から抽出したタンパク質を、精製し特徴付けした。彼らは、ＧＳＤアミロイドの主要成分がＰｒＰの１１ｋＤの分解産物であり、そのＮ末端は、ヒトＰｒＰのｃＤＮＡ由来のアミノ酸配列の、位置５８におけるグリシン残基に対応することを発見した。さらに、アミロイド画分は、外見上完全なＮ末端及びアミロイドＰ成分を有する、大きなＰｒＰ断片を含んでいた。Ｔａｇｌｉａｖｉｎｉ他（１９９１）は、これらの発見を、疾患のプロセスがＰｒＰのタンパク質分解をもたらし、アミロイド形成ペプチドを生成させ、それが重合して不溶性繊維になることを示すものと解釈した。家系中で構造遺伝子の突然変異は発見されていないので、ＰｒＰの一次構造以外の要因が、アミロイド形成プロセスにおいて重要な役割を果たしている可能性がある。
【００２６】
１つの解釈は、プリオンがシアロ糖タンパク質であり、その合成がこの障害の主な原因である感染物質によって刺激されるということであり、Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ他（１９８７）は、ＰｒＰペプチドがＣＪＤの感染物質ではないことを示唆する証拠を示した。Ｐａｂｌｏｓ−Ｍｅｎｄｅｚ他（１９９３）は、「プリオン病の回りくどい歴史」を概説し、プリオンが感染性である、すなわちプリオンは細胞傷害性の代謝産物であるという概念に対する、代替案を示唆した。
【００２７】
この筆者達は、代謝産物であるＰｒＰのプロセッシングの研究、及びこのタンパク質の出現を増大させる物質の試験が、彼らの仮説を試験するための有用な方法であろうことを示唆した。彼らのモデルによって、ＰｒＰの異化作用を阻害することができる物質によって、ＰｒＰの蓄積がもたらされるであろうと予言された。トランスジェニックマウス中のＰｒＰ合成が高まると、実験におけるスクレーピーの潜伏期が短くなる。Ｐａｂｌｏｓ−Ｍｅｎｄｅｚ他（１９９３）の仮説は、ＰｒＰの合成経路ではなく分解経路の細胞内での混乱を示唆するものであった。
【００２８】
Ｆｏｒｌｏｎｉ他（１９９３）は、ＰｒＰペプチド１０６〜１２６は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで重合してアミロイド様繊維になる高い固有の能力を有することを見出した。彼らは、主なラット海馬回の培養物をこのペプチドに対応するミクロモル濃度のペプチドに慢性的に曝すことによって、ニューロン死がもたらされることも示した。彼らは、このペプチドの神経毒性作用に、アポトーシス機構が関与していることを示唆した。
【００２９】
伝達性海綿状脳症の感染性病原物質は、正常なプロテアーゼ感受性ＰｒＰタンパク質から翻訳後に誘導される、プロテアーゼ耐性のある、不溶形のＰｒＰタンパク質であることが示唆されている（Ｂｅｙｒｅｕｔｈｅｒ及びＭａｓｔｅｒｓ、１９９４）。Ｋｏｃｉｓｋｏ他（１９９４）は、精製成分から構成された無細胞系における、正常なＰｒＰタンパク質のプロテアーゼ耐性ＰｒＰタンパク質への転換を報告した。ＰｒＰの正常形から病原形へのこの選択的転換には、既存の病原性ＰｒＰの存在が必要であった。この筆者達は、この転換は、新しいＰｒＰタンパク質の生合成、そのアミノ関連グリコシル化、又はその正常なグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーの存在を必要としないことを示した。これによって、病原性ＰｒＰタンパク質が、それと正常なＰｒＰタンパク質の間の特異的なタンパク質間相互作用から形成することができるという、直接的な証拠が与えられた。
【００３０】
Ｒｉｖｅｒａ他（１９８９）は、その核型がテロメア融合１５ｐ；２０ｐから生じる偽二動原体染色体を示す、重度の進行性神経障害を有する１３才の男子を記載した。リンパ球では、異常染色体の動原体の狭窄部は常に染色体２０のそれであり、一方線維芽細胞では、２つの動原体が交互に狭窄していた。この筆者達は、動原体の不活性化が、改変された形状の機能的ＤＮＡ配列が動原体特異的タンパク質との正常な結合を妨げることから生じることを示唆した。彼らは又、クロイツフェルト−ヤコブ病において見られるような、海綿状神経膠ジストロフィーを連想させる患者の障害が、プリオンタンパク質の突然変異体の存在に付随する可能性があると仮定した。
【００３１】
Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９０）は、家族性であれ散発性であれ「プリオン病」が、より適切な診断用語となる可能性があることを示唆した。ＧＳＤ症を有するインディアナ州の一族が、Ｆａｒｌｏｗ他（１９８９）及びＧｈｅｔｔｉ他（１９８９）によって報告された。遺伝的予想においてＰｒＰ遺伝子分析を使用することは、浸透度に関する不確かさ、及び任意の遺伝性の後期発症神経変性障害の前駆症状試験の複雑さから生じる、潜在的な問題点を有する。しかしながら、Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９１）は、その分析が、遺伝性プリオン病を有する家系の遺伝に関するカウンセリングの向上においてある役割を果たし、リスクのある人のＣＪＤ又はＧＳＤの前駆症状の診断又は排除を可能にすると結論付けした。
【００３２】
Ｇａｊｄｕｓｅｋ（１９９１）は、今日までに発見されたＰＲＮＰ突然変異体のチャートを与えた：１個のアミノ酸変化を引き起こす５個の異なる突然変異体、及び５，６，７，８，又は９個のオクタペプチドリピートの５個の挿入体。彼は又、アミロイド症をもたらすトランスサイレチン遺伝子（ＴＴＲ；１７６３００）中で同定された１８個の異なるアミノ酸置換体の表も与え、この２クラスの疾患の挙動の相似点を指摘した。
【００３３】
Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇ他（１９９１）は、アルツハイマー病を有する７６家系、おそらく散発性である１２７症例のアルツハイマー病、１６症例のダウン症候群、及び２５６の正常な対照において、ＣＪＤ及びＧＳＳＤと関連する、ＰＲＮＰ遺伝子及びＰＲＮＰ挿入突然変異体のコドン１０２、１１７、及び２００における、ミスセンス突然変異を探したが、これらの突然変異を肯定するものは無かった。Ｊｅｎｄｒｏｓｋａ他（１９９４）は、組織片の免疫染色を使用して、特発性のパーキンソン病（ＰＤ；１６８６００）、多系統萎縮症、びまん性レビー小体病（１２７７５０）、スチール−リチャードソン−オルスゼフスキー症候群（２６０５４０）、皮質基底核変性症、及びピック病（１７２７００）を含めた、９０症例のさまざまな運動障害において、病原性プリオンタンパク質の検出を試みた。これらの脳標本のいずれにおいても、病原性プリオンタンパク質は同定されなかったが、クロイツフェルト−ヤコブ病を有する４つの対照ではそのタンパク質は容易に検出された。Ｐｅｒｒｙ他（１９９５）はＳＳＣＰを使用して、５４家系からの８２人のアルツハイマー病患者（３０の家族性の症例を含む）、及び３９人の年齢一致対照における、プリオン遺伝子座の突然変異をスクリーニングした。Ｐｅｒｒｙ他は、コドン６８の周辺に、後期発症アルツハイマー病家系の２人の罹患した同胞及び１人の子孫において、５個のグリシン−プロリンが豊富なオクタリピートのうち１個の除去をもたらす２４ｂｐの欠失を発見した。しかしながら、同系中の他の罹患者はこの欠失を共有しておらず、この欠失は後期発症アルツハイマー病家系からの、６人の非罹患メンバーのうち３人の年齢一致対照においても検出された。別のオクタリピートの欠失が、同じアルツハイマー病家系からの他の３人でも検出され、そのうち２人が罹患していた。他の突然変異は発見されなかった。Ｐｅｒｒｙ他（１９９５）は、彼らの調査において、プリオンタンパク質の突然変異とアルツハイマー病を関連付ける証拠は存在しないと結論付けた。
【００３４】
Ｈｓｉａｏ他（１９９０）は、分析した家系の３人のメンバーにおいて、ＰｒＰ遺伝子のオープンリーディングフレームにおける突然変異を発見できなかったが、Ｈｓｉａｏ他（１９９２）は、後になって、フェニルアラニン１９８からセリンへの突然変異を実証した；１７６６４０．００１１を参照のこと。
【００３５】
Ｐａｌｍｅｒ及びＣｏｌｌｉｎｇｅ（１９９３）は、プリオンタンパク質遺伝子の突然変異及び多型について概説した。
【００３６】
Ｃｈａｐｍａｎ他（１９９６）は、プリオンタンパク質遺伝子の、コドン２００における病原性リシンの突然変異がヘテロ接合性であり（１７６６４０．０００６）、コドン１２９におけるメチオニンがホモ接合性である患者の、致死性不眠症及び重大な視床の病態を実証した。Ｃｈａｐｍａｎ他は、この表現型と、コドン１７８における突然変異に関連する表現型と類似性を強調した（１７６６４０．００１０）。
【００３７】
Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９６）は、広範囲のヒトプリオン病の症例を調査して、異なる天然プリオン系統型を示す可能性がある、プロテアーゼ耐性ＰｒＰのパターンを同定した。Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他は、「新しい変異型」ＣＪＤからのプロテアーゼ耐性ＰｒＰを研究して、他の形態のＣＪＤと分子的基準によって区別することができる、異なる系統型であるかどうか決定した。Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９６）は、散発性ＣＪＤ及び医原性ＣＪＤ（通常は死体脳からの成長ホルモンの投与による）が、ウエスタンブロットにおいてプロテアーゼ耐性ＰｒＰの３個の異なるパターンと関連付けられることを実証した。型１及び２は散発性ＣＪＤで見られ、医原性ＣＪＤのいくつかの症例で見られる。３型は、末梢経路がプリオンに曝された、後天性のプリオン病で見られる。Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９６）は、ウエスタンブロット法において、「新しい変異型」ＣＪＤが、特徴的なパターンのＰｒＰのグリコシル化が関与するプロテアーゼ耐性ＰｒＰの独特で高度に一貫性のある出現と関連することを報告した。ＣＪＤが近交系マウスに伝播することによって、接種性ＣＪＤに特徴的なＰｒＰパターンが生じた。ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）プリオンの伝播によって、「新しい変異型」ＣＪＤのそれと非常に類似したＰｒＰの糖型比のパターンが生じた。Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９６）は、マカクの実験的ＢＳＥ、及び家ネコにおける自然の後天性ＢＳＥからのＰｒＰが、実験的なネズミのＢＳＥ及び「新しい変異型」ＣＪＤのそれと区別できない、糖型のパターンを示すことを見出した。Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９６）の報告は、Ａｇｕｚｚｉ及びＷｅｉｓｓｍａｎｎ（１９９６）によって概説され、彼らは、Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９６）が、ＢＳＥに関係する「新しい変異型」ＣＪＤの神経病原的及び臨床的特徴を概説したと結論付けた。
【００３８】
Ｐｒｕｓｉｎｅｒ（１９９６）は、プリオン病の分子生物学及び遺伝学の包括的な概説を与えた。Ｃｏｌｌｉｎｇｅ（１９９７）も同様に、この話題を概説した。彼は３種類のヒトプリオン病を認めた：（１）後天型、クールー及び医原性ＣＪＤを含む；（２）散発型、典型的及び非典型的な形のＣＪＤを含む；（３）遺伝型、家族性ＣＪＤ、ゲルストマン−ストロイスラー症候群、家族性致死性不眠症、及びさまざまな非典型的痴呆を含む。Ｃｏｌｌｉｎｇｅ（１９９７）は、その時までに報告された１２の病原性突然変異を表にした。疾患の表現型をコードするタンパク質の能力が、生物学において重要な非メンデル型の遺伝を表すことが示されたので、Ｃｏｌｌｉｎｇｅ（１９９７）は、進化においてこの方法がある範囲の種において他のタンパク質に使用されなかったとすれば、驚くべきことであると思われるとコメントした。彼は、酵母菌中でのプリオン様機構の同定について言及した（Ｗｉｃｋｎｅｒ、１９９４；Ｔｅｒ Ａｖａｎｅｓｙａｎ他、１９９４）。
【００３９】
Ｈｏｒｗｉｃｈ及びＷｅｉｓｓｍａｎ（１９９７）は、関連する伝達性神経変性疾患の群における、プリオンタンパク質の中心的役割について概説した。そのデータから、プリオンタンパク質がこの疾患プロセスに必要とされること、及び、プリオンタンパク質のその正常な可溶性アルファらせん構造から不溶性ベータシート状態への構造転換が、その疾患の発生及び感染性と密接に関係することが実証された。この転換プロセスに関して多くのことが依然として明らかではないと、彼らは指摘した。
【００４０】
Ｍａｌｌｕｃｃｉ他（１９９９）は、初老性痴呆、失調、及び他の神経精神病的特徴が常染色体優性遺伝として分離されている、ある大きな英国の家系を記載した。脱髄性疾患、アルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤコブ病、及びゲルストマン−ストロイスラー症候群の診断が、特定の個人で異なる回数行われてきた。Ｍａｌｌｕｃｃｉ他（１９９９）は、同じ一族の一部である可能性があるアイルランドの家系も記載しており、その中で、罹患者における、多発性硬化症、痴呆、皮質基底核変性症、及び「新しい変異型」ＣＪＤの診断が考慮された。分子的研究により、ＰＲＮＰ遺伝子のアラニン１７からバリンへの突然変異によって、この障害がプリオン病として同定された。彼らは、これらの一族に見られる表現型の発現の多様性を強調し、「新しい変異型」ＣＪＤが疑われる症例を含めて、非典型的な初老性痴呆又は神経精神病的特徴、及び失調を示す任意の個人におけるＰＲＮＰ分析により、遺伝性プリオン病を除外すべきであると提案した。Ｈｅｇｄｅ他（１９９９）は、伝播性プリオン病と遺伝性プリオン病は、共通の神経変性経路を共有することを実証した。Ｈｅｇｄｅ他（１９９９）は、異常に折りたたまれたイソ型である、蓄積したＰｒＰScが、神経変性疾患を引き起こすのに有効かどうかが、宿主コード化ＰｒＰがＣｔｍＰｒＰと呼ばれる膜貫通形になりやすいかどうかに依存することを観察した。さらに、伝播性プリオン病におけるＰｒＰSc蓄積の時間行程の直後に、ＣｔｍＰｒＰの生成が増大する。したがって、ＰｒＰScの蓄積によって、ＣｔｍＰｒＰの生成又は代謝に慣用する事象がｔｒａｎｓに調節されるようである。Ｈｅｇｄｅ他（１９９９）は、これらのデータ全体から、ＣｔｍＰｒＰ仲介の神経変性の事象が、遺伝性及び感染性プリオン病の病因において共通のステップを表す可能性があることが示唆されると結論付けた。
【００４１】
ＰｒＰc、すなわち細胞の非病原性イソ型ＰｒＰは、ニューロン中で強く発現される遍在する糖タンパク質である。Ｍｏｕｉｌｌｅｔ−Ｒｉｃｈａｒｄ他（２０００）は、ネズミ１Ｃ１１のニューロン化モデルを使用して、抗体仲介クロスリンクを介したＰｒＰc依存性シグナル伝達を調べた。１Ｃ１１クローンは、ニューロン関連の機能が欠けた上皮の形態を有する、関連する神経外胚葉の子孫である。誘導すると、１Ｃ１１細胞はニューロン様の形態を発現し、セロトニン作動性又はノルアドレナリン作動性細胞に分化し得る。２つの分化経路間の選択は、使用する誘導物質の組に依存する。ＰｒＰcを特異的抗体と結合させると、セロトニン作動性細胞とノルアドレナリン作動性細胞の両方で、チロシンキナーゼＦＹＮ（１３７０２５）のリン酸化レベルの著しい低下が誘導された。ＰｒＰcとＦＹＮの結合は、カベオリン−１（６０１０４７）に依存した。Ｍｏｕｉｌｌｅｔ−Ｒｉｃｈａｒｄ他（２０００）は、クラトリン（１１８９６０を参照のこと）が、この結合に寄与している可能性もあることを示唆した。１Ｃ１１細胞系がＰｒＰc依存性のＦＹＮの活性化を誘発する能力は、その完全に分化したセロトニン作動性又はノルアドレナリン作動性の子孫に限られていた。さらに、ＰｒＰcのシグナル活性は主に神経突起で生じた。Ｍｏｕｉｌｌｅｔ−Ｒｉｃｈａｒｄ他（２０００）は、ＰｒＰcがシグナル伝達タンパク質である可能性があることを示唆した。
【００４２】
マッピング
プリオン関連タンパク質のヒト遺伝子は、体細胞のハイブリダイゼーションとｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの組合せによって（Ｓｐａｒｋｅｓ他、１９８６）、又分類した染色体からのＤＮＡのスポットブロッティングによって（Ｌｉａｏ他、１９８６）、２０ｐ１２−ｐｔｅｒに位置付けられている。Ｒｏｂａｋｉｓ他（１９８６）も、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、ＰＲＮＰ遺伝子座を２０ｐに帰属させた。
【００４３】
細胞間の２０ｐの欠失を分析することによって、Ｓｃｈｎｉｔｔｇｅｒ他（１９９２）は、以下の順の遺伝子座：ｐｔｅｒ−−ＰＲＮＰ−−ＳＣＧ１（１１８９２０）−−ＢＭＰ２Ａ（１１２２６１）――ＰＡＸ１（１６７４１１）−−ｃｅｎを実証した。Ｐｕｃｋｅｔｔ他（１９９１）は、ＰＲＮＰ遺伝子の５’−プライマー、高度のヘテロ接合性を有し、染色体２０のｐｔｅｒ−ｐ１２領域用の有用なマーカーとして働くことができると思われるＲＦＬＰを同定した。
【００４４】
Ｒｉｅｋ他（１９９８）は、マウスのプリオンタンパク質の微細ＮＭＲ構造を使用して、遺伝性のヒト伝達性海綿状脳症の構造的基盤を調べた。細胞形のマウスのプリオンタンパク質中では、疾患特異的なサブドメインの存在を示すと思われる、突然変異部位の空間的クラスタリングは観察されなかった。残基１２８と１７８の間の水素結合が、ヒトＰＲＮＰにおける位置１２９での多型の、アスパラギン酸１７８からアスパラギン（Ｄ１７８Ｎ；１７６６４０．０００７）への突然変異によって分離される疾患の表現型に対する、観察された非常に特異的な影響の構造的基礎を与えた。全体として、このＮＭＲ構造は、疾患関連アミノ酸の置換の一部だけが、細胞形のＰＲＮＰの低い安定性をもたらすことを暗示し、突然変異タンパク質の微妙な構造的差異が、分子内シグナリングにさまざまな異なる方法で影響を与える可能性があることを示している。
【００４５】
Ｗｉｎｄｌ他（１９９９）は、ドイツのクロイツフェルト−ヤコブ病監視団体に付記された、プリオン病の疑いがある、５７８人の患者のＰＲＮＰ遺伝子のコード領域中の突然変異及び多型を、４．５年にわたって調べた。彼らは、以前に病原性として報告されたミスセンス突然変異をもつ、４０の症例を発見した。これらの中では、Ｄ１７８Ｎ突然変異が最も一般的であった。これらの症例のすべてにおいて、Ｄ１７８Ｎはコドン１２９におけるメチオニンと結合しており、その結果、典型的な家族性致死性不眠症の遺伝型がもたらされた。２つの新規なミスセンス突然変異、及びいくつかのサイレント多型が発見された。その図１に、Ｗｉｎｄｌ他（１９９９）は、ＰＲＮＰのコード領域における知られている病原性突然変異を図示した。
【００４６】
歴史
Ａｇｕｚｚｉ及びＢｒａｎｄｎｅｒ（１９９９）は「プリオンの遺伝学」を概説したが、これが用語の点で矛盾するかどうかという問題を提起した。なぜなら、伝達性海綿状脳症を引き起こす不可解な物質として彼らが定義したプリオンは、非遺伝性病理の典型であるからである。Ｇｒｉｆｆｉｔｈ（１９６７）によって最初に提出された、タンパク質のみの仮説では、プリオンの感染性は、現在ＰＲＮＰと呼ばれている異常な形態の細胞タンパク質である、スクレーピータンパク質と同一であると述べている。複製は、スクレーピーのプリオンが細胞のプリオンを召集し、それを別のスクレーピープリオンに転換することによって起こる。新たに形成されたスクレーピープリオンは、転換サイクルに加わり、スクレーピープリオンのより速やかな蓄積をもたらす事象の連鎖反応が生じる。この仮説は、Ｐｒｕｓｉｎｅｒ（１９８２）が病原性タンパク質を精製し、Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ及び彼の同僚（Ｏｅｓｃｈ他１９８５；Ｂａｓｌｅｒ他１９８６）が、スクレーピータンパク質及びその正常細胞の相当物ＰＲＮＰをコードする遺伝子をクローニングした後に、広く承認され受け入れられた。Ｗｅｉｓｓｍａｎｎのグループ（Ｂｕｅｌｅｒ他１９９３）が、タンパク質のみの仮説によって予想されたように、Ｐｒｎｐの遺伝的切断により、プリオンに曝したときマウスが実験的スクレーピーから保護されることを示すと、さらなる勢いを得た。Ａｇｕｚｚｉ及びＢｒａｎｄｎｅｒ（１９９９）は、家族性の形のプリオン病とプリオン遺伝子の突然変異との関連の発見を、重要な画期的事件である（Ｈｓｉａｏ他１９８９）と考えた。
【００４７】
動物モデル
プリオンの構造遺伝子（Ｐｒｎ−ｐ）は、マウス染色体２に位置付けられている。Ｐｒｎ−ｐと密接に関連する、第２のネズミ遺伝子座、Ｐｒｎ−ｉによって、マウスにおけるスクレーピーの潜伏期の長さが決まる（Ｃａｒｌｓｏｎ他１９８６）。Ｐｉｄ−１で表される、スクレーピーの潜伏期を調節する別の遺伝子は、マウス染色体１７上に位置している。Ｓｃｏｔｔ他（１９８９）は、ゴールデンハムスターからのプリオンタンパク質遺伝子を収容したトランスジェニックマウスは、ハムスタースクレーピーのプリオンを接種すると、ハムスターに特徴的なスクレーピー感染性、潜伏期、及びプリオンタンパク質のアミロイド斑を示すことを実証した。Ｈｓｉａｏ他（１９９４）は、高レベルの突然変異体Ｐ１０１Ｌプリオンタンパク質を発現する、２系統のトランスジェニックマウスにおいて、実験用ネズミのスクレーピーと区別できない、神経病及び中枢神経系の病状が発現したことを見出した。ヒトプリオンタンパク質中のアミノ酸１０２は、マウスプリオンタンパク質中のアミノ酸１０１に対応する。したがって、Ｐ１０１Ｌのネズミにおける突然変異は、ヒト中でゲルストマン−ストロイスラー症候群を引き起こす、プロリン１０２からロイシンへの突然変異（１７６６４０．０００２）と同等であった。Ｈｓｉａｏ他（１９９４）は、Ｐ１０１Ｌ導入遺伝子を低レベルで発現するマウス、及び高レベルの突然変異Ｐ１０１Ｌプリオンタンパク質を発現するトランスジェニックマウスからの脳抽出物を注射したゴールデンハムスターへの、神経変性の連続的伝染を報告した。高発現トランスジェニックマウスは、低レベルの感染性プリオンしかその脳内に蓄積しなかったが、接種を受けたレシピエントへの疾患の連続的伝染によって、プリオン形成がこれらの非接種動物の脳内で新たに起きたことが立証され、プリオンが外来性の核酸を欠いているとの追加の証拠が与えられた。
【００４８】
ＰｒＰノックアウトマウスに関する研究は、Ｂｕｅｌｅｒ他（１９９４）、Ｍａｎｓｏｎ他（１９９４）、及びＳａｋａｇｕｃｈｉ他（１９９６）によって報告されてきている。Ｓａｋａｇｕｃｈｉ他（１９９６）は、彼らによって生成されたＰｒＰノックアウトマウスは、７０週齢までは見た目は正常であり、その時点でマウスは、小脳性失調の徴候を絶えず示し始めたことを報告した。組織学的研究によって、小脳回の大部分におけるプルキンエ細胞の過剰な損失が明らかになった。小脳の萎縮、及び第４脳室の拡張が示された。同様の病状変化は、Ｂｕｅｌｅｒ他（１９９４）及びＭａｎｓｏｎ他（１９９４）によって作成されたＰｒＰノックアウトマウスでは示されなかった。Ｓａｋａｇｕｃｈｉ他（１９９６）は、結果の違いは系統の違い、又はＰｒＰ遺伝子中でのノックアウトの程度の違いによるものである可能性があると指摘した。特に、記載したＰｒＰノックアウトマウスの３つの系統すべてにおいて、プリオン感染に対する感受性が失われた。
【００４９】
Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９４）は、そのＰｒＰ欠損マウスの研究に基づいて、プリオンタンパク質が正常なシナプス機能に必要であると結論付けた。彼らは、遺伝性プリオン病は、翻訳後に改変された形の細胞のＰｒＰであるＰｒＰcの生成による、顕性不活性な作用から生じる可能性があり、最終的に機能的ＰｒＰ（ＰｒＰc）の漸次的喪失をもたらすと仮定した。Ｔｏｂｌｅｒ他（１９９６）は、ＰｒＰ欠損マウスの概日リズム及び睡眠の変化を報告し、これらの変化が致死性家族性不眠症における睡眠の変化との興味深い類似性を示すことを強調した。
【００５０】
ＰｒＰを欠いたマウスは正常に成長したが、スクレーピー耐性であった；ＰｒＰ導入遺伝子を導入することによって、疾患に対する感受性が回復した。この活性に必要なＰｒＰの領域を同定するために、Ｓｈｍｅｒｌｉｎｇ他（１９９８）は、アミノ基部が欠失したＰｒＰを発現するＰｒＰノックアウトマウスを作製した。驚くべきことに、欠失部分が短いＰｒＰではなく、残基３２〜１２１又は３２〜１３４が欠失したＰｒＰが、生後わずか１〜３カ月で小脳顆粒層に限定された、重度の失調及びニューロン死を引き起こした。野生型ＰｒＰ遺伝子を１コピー導入することによって、この欠陥は完全に無くなった。Ｓｈｍｅｒｌｉｎｇ他（１９９８）は、これらの短縮ＰｒＰは非機能的であり、ＰｒＰ様機能を有する他の分子いくつかと共通のリガンドについて競合する可能性があると推測した。
【００５１】
Ｔｅｌｌｉｎｇ他（１９９６）は、プリオン病における根本的事象は、細胞のプリオンタンパク質の高次構造の変化であり、これによってタンパク質が病原性のイソ型ＰｒＰScに転換されるという見解を支持する、観察結果を報告した。彼らは、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）では、脱グリコシル化後のＰｒＰScのプロテアーゼ耐性断片は１９ｋＤの大きさであり、一方他の遺伝性及び散発性プリオン病由来の断片は２１ｋＤであることを見出した。ＦＦＩ患者の脳からの抽出物は、接種の約２００日後に、キメラヒト−マウスＰｒＰ遺伝子を発現するトランスジェニックマウスに疾患を伝染させ、１９ｋＤのＰｒＰSc断片の形成を誘導したが、一方家族性及び散発性クロイツフェルト−ヤコブ病患者の脳からの抽出物は、これらのマウス中で２１ｋＤのＰｒＰSc断片を産生させた。Ｔｅｌｌｉｎｇ他（１９９６）の結果は、ＰｒＰScの高次構造が発生期のＰｒＰScの形成を指示する際の鋳型として働くことを示し、多様性がＰｒＰScの高次構造中に暗号化されている、プリオンの系統を説明するための機構を示唆した。
【００５２】
Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ（１９９７）は、「科学上の最も刺激的な概念のいくつかが表面上は関連がない現象の予期せぬ衝突から生まれている」と指摘した。彼女が論じた問題の例は、酵母菌の遺伝学における２つの不可解な問題点が、プリオンの仮説と類似の仮説によって説明できると思われるという、Ｗｉｃｋｎｅｒ（１９９４）による提案であった。２つの酵母菌の突然変異によって、表現型の遺伝が、異なる核酸の遺伝ではなく、異なるタンパク質高次構造の遺伝に基づくこともときにはあるという、説得力のある例が与えられた。したがって酵母菌によって、プリオン様プロセスを研究するための重要な新しいツールが与えられる可能性がある。さらに彼女は、プリオンは必ずしも病原性ではないことを示唆した。実際彼女は、マクロ分子の自己促進型の構造変化が、広くさまざまな正常な生物学的プロセス、クロマチン構造の変化と関連があるものなどの後成的現象だけではなく、いくつかの正常な、発生上調節される事象の根底にあると示唆した。
【００５３】
Ｈｅｇｄｅ他（１９９８）は、幾何学的形状の相対比を変えるＰｒＰ突然変異体を発現するトランスジェニックマウスにおける、異なる幾何学的形状のＰｒＰの役割を研究した。１つの形は小胞体内腔に完全に転位しており、ＰｒＰ−Ｓｅｃと呼ばれる。２つの他の形が、カルボキシ末端から内腔（ＰｒＰ−Ｃｔｍ）又はアミノ末端から内腔（ＰｒＰ−Ｎｔｍ）の方向で、小胞体に広がっている。高レベルのＰｒＰ−Ｃｔｍをもたらした突然変異体を収容するＦ２生成マウスは、５８＋／−１１日に神経変性の発症を示した。ＰｒＰの過剰発現がその原因ではなかった。神経病理学的検査から、スクレーピーで見られた変化と同様の変化が示されたが、ただしＰｒＰScの不在下においてであった。ＰｒＰ−Ｃｔｍの発現のレベルは、疾患の重度と相関関係があった。
【００５４】
Ｓｕｐａｔｔａｐｏｎｅ他（１９９９）は、野生型ＰｒＰ（Ｐｒｎｐ−／−）が欠損したトランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおける、２つの大きな欠失があるアミノ酸１０６個の集合型ＰｒＰの発現によって、プリオン増殖が支持されたことを報告した。完全長のＰｒＰScを含むＲｏｃｋｙ Ｍｏｕｎｔａｉｎ研究所（ＲＭＬ）のプリオンによって、約３００日後にＴｇ（ＰｒＰ１０６）Ｐｒｎｐ−／−マウスにおいて疾患が生じ、一方、ＰｒＰSc106を含むＲＭＬ１０６プリオンの伝播によって、反復移動により約６６日後にＴｇ（ＰｒＰ１０６）Ｐｒｎｐ−／−マウスにおいて疾患が生じた。この人工的な、ＲＭＬプリオンの移動の伝播の障害は、約１６５日後にスクレーピーが進行したＴｇ（ＰｒＰ１０６）Ｐｒｎｐ＋／−マウスにおける、野生型マウスのＰｒＰcの同時発現によって減少し、野生型マウスのＰｒＰが途中で作用して、ＲＭＬ１０６プリオンの複製が促進されることが示唆された。精製ＰｒＰSc106はプロテアーゼ耐性であり、糸状体を形成し、非変性洗浄剤に不溶であった。
【００５５】
Ｋｕｗａｈａｒａ他（１９９９）は、Ｐｒｎｐ−／−及びＰｒｎｐ＋／＋マウスからの海馬細胞系を確立した。１４日齢のマウス胚からの培養物を確立した。研究した６つの細胞系はすべて、神経前駆体細胞の系統に属していたが、それらはその発生段階が異なっていた。Ｋｕｗａｈａｒａ他（１９９９）は、細胞の培養物から血清を除去することによって、Ｐｒｎｐ＋／＋細胞中ではなくＰｒｎｐ−／−細胞のアポトーシスが引き起こされたことを発見した。プリオンタンパク質又はＢＣＬ２遺伝子の形質導入によって、血清を含まない条件下においてＰｒｎｐ−／−細胞のアポトーシスが抑制された。Ｐｒｎｐ−／−細胞はＰｒｎｐ＋／＋細胞より、短い神経突起を延長させたが、ＰｒＰの発現によってその長さは増大した。Ｋｕｗａｈａｒａ他（１９９９）は、これらの発見によって、野生型プリオンタンパク質の機能の損失は、部分的にはプリオン病の病因の根底にあるという概念が、支持されたと結論付けた。この筆者達は、ＢＣＬ２遺伝子の形質導入をすぐに試みた。なぜなら、ＢＣＬ２は以前に、酵母菌の２ハイブリッド系においてプリオンタンパク質と相互作用することが示されたからである。これらの結果によって、哺乳動物細胞においても、ＢＣＬ２とＰｒＰの間の何らかの相互作用が示唆された。
【００５６】
スクレーピー感染したマウスでは、循環性Ｂ及びＴリンパ球ではなく脾臓リンパ球と結合したプリオンが発見され、ストロマ中では、それは濾胞樹状細胞を含む。成熟した濾胞樹状細胞の形成及び維持には、膜結合リンホトキシンα／βを発現するＢ細胞の存在が必要である。可溶性リンホトキシンβ受容体でマウスを処理することによって、脾臓からの成熟した濾胞樹状細胞の消失がもたらされる。Ｍｏｎｔｒａｓｉｏ他（２０００）は、この処理によって脾臓でのプリオンの蓄積がなくなり、腹膜内スクレーピー感染の後の神経侵襲が遅れることを実証した。Ｍｏｎｔｒａｓｉｏ他（２０００）は、彼らのデータによって、濾胞樹状細胞が脾臓内のプリオン複製の主要部位である、証拠が与えられたと結論付けた。
【００５７】
Ｃｈｉｅｓａ他（１９９８）は、１４個のオクタペプチドリピートを含む突然変異プリオンタンパク質を発現したトランスジェニックマウスの系を生成させ、ヒトのそのタンパク質の相同体は、遺伝性のプリオンによる痴呆と関係がある。この挿入体は、その時までにＰＲＮＰ遺伝子において同定された最大のものであり、進行性の痴呆及び失調によって、及び小脳及び大脳基底核中のＰｒＰ含有アミロイド斑の存在によって特徴付けられる、プリオン病と関係があった（Ｏｗｅｎ他１９９２；Ｄｕｃｈｅｎ他１９９３；Ｋｒａｓｅｍａｎｎ他１９９５）。突然変異タンパク質を発現するマウスは、導入遺伝子配列がそれぞれ同型又は半接合性であったかどうかに応じて、６５又は２４０日齢で失調が顕著である神経病が進行した。誕生から始まり、突然変異ＰｒＰは、スクレーピーのイソ型ＰｒＰと似たプロテアーゼ耐性で洗浄剤不溶性の形に転換され、マウスの生存期間中にわたって多くの脳領域中に、この形のものが劇的に蓄積した。ＰｒＰが蓄積すると、小脳中で顆粒細胞の大規模なアポトーシスが起こった。
【００５８】
主要組織適合複合体
本明細書では、用語「主要組織適合複合体」（ＭＨＣ）は、当分野におけるその通常の意味を有し、さまざまな細胞の表面上で「同定マーカー」として機能する、細胞抗原のファミリーをコードする１組の遺伝子を指す。Ｔリンパ球は、その固有の受容体を介してこれらの細胞と相互作用して、その適応免疫機能を果たす。
【００５９】
ＭＨＣは、ネズミ及びヒトＭＨＣ中にコードされた、３クラスの分子（Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ）に分けられる。クラスＩ及びＩＩの分子は、異なる構造体を示す。クラスＩＩＩのＭＨＣは、機能が確立されていないか或いは構造的類似性がない２０を超える遺伝子の、多様な集合体を含む。
【００６０】
ＭＨＣクラスＩＩの分子に関する背景知識は、Ｖｉｃｔｏｒ Ａ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ他によって、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍに示されている。ＭＨＣクラスＩＩの分子に関する以下の情報は、この源から抜粋しているものである。
【００６１】
ヘテロマーである主要組織適合複合体のクラスＩＩのタンパク質、α及びβサブユニットの遺伝子は、６ｐ２１．３領域中に集合している。Ｔｏｄｄ他（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：５９９〜６０４は、クラスＩＩの遺伝子座の地図を示した。彼らは、ＤＱ分子、特にβ鎖の残基５７の構造によって、インシュリン依存性糖尿病をもたらすインシュリン生成島細胞に対する、自己免疫応答が指定されることを示唆した。ＨＬＡ−Ｄ領域内の約１４のクラスＩＩのＨＬＡ遺伝子の中で、ＤＱ３．２−β遺伝子は、ＨＬＡ−ＤＲ４とインシュリン依存性糖尿病の充分に文書化された関係の原因であり、この疾患と最も相関関係がある１つの対立遺伝子である。Ｋｗｏｋ他（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：１０２７〜１０３０は、アミノ酸４５は、ＤＱ３．２−β遺伝子及びその非糖尿病型対立遺伝子、ＤＱ３．１−βを特徴とする血清学的エピトープを生成させるのに、重要であることを見出した。Ｔｏｄｄ他（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：１０９４〜１０９８は、日本人の中では、ＩＤＤＭはＨＬＡ−ＤＲよりもＨＬＡ−ＤＱと強く関係しており；ＤＱＡ１遺伝子座のＡ３対立遺伝子が、疾患と最も強く関係しており；白人及び黒人のＩ型糖尿病に対する感受性と関係がある、ＤＱＢ１遺伝子座のＤＱｗ８対立遺伝子は、日本人の患者では頻度が増大せず；白人のＩ型糖尿病に対する低い感受性と関係がある、アスパラギン酸５７をコードするＤＱＢ１対立遺伝子は、４９人の日本人患者のうちの１人を除く全員に、及び３１人の対照全員に、少なくとも異型の状態で存在したことを見出した。４０％の患者が、アスパラギン酸５７をコードするＤＱＢ１対立遺伝子が同型であり、これに対し対照では３５％が同型であった。日本人におけるアスパラギン酸５７をコードするＤＱＢ１対立遺伝子の高い頻度は、日本でのＩ型糖尿病の珍しさに原因がある可能性がある。
【００６２】
ＨＬＡクラスＩＩの膜内外ヘテロ二量体の非常に高い多型は、そのα鎖及びβ鎖の最も外側のドメイン中に存在する数個の超可変領域によるものである。アミノ酸配列のいくつかの変化は、疾患感受性の関連、及びプロセッシングされた抗原をＴ細胞に提示する能力において重要である。Ｂ細胞のｃＤＮＡライブラリーをＤＱ−βプローブを用いてスクリーニングすることによって、Ｇｉｏｒｄａ他（１９９１）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３３ ４０４〜４０８は、ＨＬＡ−ＤＱｗ７、−ＤＱｗ８、及び−ＤＱｗ９対立遺伝子のβ鎖に対応するｃＤＮＡを得た。配列分析によって、ただ１個のアミノ酸の変化をもたらした、６箇所のヌクレオチド位置におけるＤＱｗ８とＤＱｗ９の間の違いが明らかになった。ＤＱｗ９は、位置５７にアラニンではなくアスパラギン酸をコードしている。ＤＱｗ７はこの位置においてＤＱｗ９と同じであるが、９個の他のアミノ酸が異なる。
【００６３】
瘢痕性類天疱瘡（ＣＰ）は、重層扁平上皮、及びときには皮膚由来の多数の粘膜を冒す、慢性的な自己免疫性の水疱性疾患である。ＣＰは、疾患の症状発現の範囲が広い。口内天疱瘡（ＯＰ）を有する患者は、その病的変化が口内粘膜に限られる、良性の一過性疾患を有する。他方で、再発及び寛解によって示される慢性疾患である、眼部瘢痕性類天疱瘡を有する患者は、眼部に関する関連、及びおそらくは他の粘膜に関する関連もある。あらゆる臨床型は、類似の抗基底帯自己抗体の存在によって特徴付けられる。１つの形のＣＰ又は他のＣＰの進行を決定する要因は、知られていない。Ｙｕｎｉｓ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１ ７７４７〜７７５１は、ＯＰを有する２２人の白人患者及びその家系（１９家系）のＤＮＡを試験することによって、クラスＩＩの対立遺伝子を研究した。これらの結果を、１７人のＯＣＰ患者及びその家系の対照から得られた結果、及び骨髄移植に関して研究した４２人の対照白人家系の結果と比較した。これらの結果によって、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１は、口内及び眼部形のＣＰに関する感染性のマーカーであることが示された。ＯＰ及びＯＣＰ中に存在するＤＱＢ１対立遺伝子のアミノ酸配列を分析することによって、位置５７及び位置７１〜７７におけるアミノ酸残基も、マーカーである可能性があることが示唆された。
【００６４】
Ｄｅｌｇａｄｏ他（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．９３：８５６９〜８５７１は、水泡性天疱瘡を有する２１人の患者、眼部瘢痕性類天疱瘡を有する１７人の患者、及び口内天疱瘡を有する２２人の患者において高精度で型分類したＭＨＣクラスＩＩの遺伝子座、ＨＬＡ−ＤＲＢ１及びＨＬＡ−ＤＱＢ１を、２１８のハプロタイプの正常な個人の一群と比較した。彼らは、３つの疾患はＤＱＢ１＊０３０１と有意な関係があったことを見出した（それぞれＰ＝０．００５、Ｐが０．０００１未満、及びＰ＝０．００１）。位置７１〜７７からの特定のアミノ酸配列を共有していた、対立遺伝子ＤＱＢ１＊０３０２、＊０３０３、及び＊０６の頻度も増大した（Ｐ＝０．０１）。これらの発見によって、３つの臨床的に異なる変形の天疱瘡における自己免疫応答は、皮膚の基底膜、結膜、又は口内粘膜由来のペプチドと結合した、クラスＩＩ領域のＤＱＢ１のＴ細胞による認識と関連があることが示唆された。
【００６５】
早発卵巣不全（ＰＯＦ）は、非常に症例の多い自己免疫性の病因を有する。Ａｒｉｆ他（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｍｅｔａｂ．８４ １０５６〜１０６０は、アスパラギン酸−５７をコードするＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝型は、ＰＯＦにおいて３−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによる自己免疫と関連があることを見出した。２つのＨＬＡ−ＤＱＢ１対立遺伝子、位置５７においてアスパラギン酸コドンを共有する＊０３０１及び＊０６０３、は３−β−ＨＳＤ自己抗体に関して陽性の関係を示した。３−β−ＨＳＤ自己抗体を有する２１人中１８人（８６％）のＰＯＦ患者は、１３４人中９２人の対照被験者と比較して、ＤＱ−β−アスパラギン酸５７をコードする遺伝型を有しており、２１例中９例（４３％）は、１３４人中１７人（１３％）の対照被験者と比較して、コドン５７の遺伝型が同型であった。これらの確率値は、多重検定の補正後は有意ではなかった。この筆者達は、ＰＯＦ、３−β−ＨＳＤ自己免疫、及び異なるＨＬＡ−ＤＱ分子間の関係を彼らが実証したことによって、３−β−ＨＳＤに対する自己抗体は自己免疫性卵巣不全のマーカーである可能性があるという仮説が支持され、アスパラギン酸５７−β鎖を有するＨＬＡ−ＤＱ分子による、自己抗原性又は外来性ペプチドのＴリンパ球に対する提示は、この疾患の病因において重要であることが示唆されたと結論付けた。
【００６６】
ヒト白血球抗原
本明細書では、用語ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、当分野におけるその通常の意味を有するものであり、染色体６の短いアーム上の密接に関連がある遺伝子によってコードされた、細胞表面の糖タンパク質を指す。
【００６７】
本発明の特に興味深いＨＬＡ型は、ＨＬＡのクラスＩＩ型のＤＱ７である。
【００６８】
感受性
本発明によれば、プリオン病に対する被験者の感受性を決定する方法が提供される。
【００６９】
用語「感受性」はプリオン病に対する被験者の感受性、可能性、敏感性、傾向又は許容性を指す。
【００７０】
被験者からのサンプルがＤＱ７特異性があるＨＬＡを有する場合、これは被験者がプリオン病に対して低い感受性を有することを示し；且つ被験者からのサンプルがＤＱ７特異性があるＨＬＡを有さない場合、したがってこれは、被験者はプリオン病に対して高い感受性を有することを示す。
【００７１】
サンプル
「サンプル」は、ＨＬＡをＤＱ７に型分類することができる、任意の物理的物体であってよい。
【００７２】
サンプルは体液又は組織であるか、或いはそれに由来することが好ましい。体液は血液、血清などであるか、或いはそれに由来することがさらに好ましい。
【００７３】
好ましい実施形態では、サンプルは核酸を含む。非常に好ましい実施形態では、サンプルは血液から抽出した核酸を含む。
【００７４】
抽出
本発明の好ましい実施形態では、Ｍｉｌｌｅｒ他（１９８８）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６，１２１５中に記載されたような塩析によって、ＤＮＡなどの核酸を血液細胞から単離する。
【００７５】
本発明の非常に好ましい実施形態では、ＤＮＡなどの核酸を、ＤＮＡ抽出キット（Ｄｙｎａｌ、Ｍｅｒｓｅｙｓｉｄｅ、ＵＫ）などの市販のキットを使用して、血液細胞から単離する。この手順では、２ｍｌのチューブ中の２００μｌの抗凝固処理した全血を、１ｍｌの赤血球細胞溶解バッファー１（５ｍｌの濃縮物＋４４ｍｌの蒸留水＋１ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８）と、溶液が透明になるまで混合させる。この溶液を、１０，０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離して、白血球細胞をペレット状にし、上澄みを捨てる。チューブを攪拌し、１ｍｌの赤血球細胞溶解バッファー２（５ｍｌの濃縮物＋４５ｍｌの蒸留水）を加える。この溶液を１０秒間遠心分離し、上澄みを捨てる。２００μｌの再懸濁Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＤＮＡ抽出物を、白血球細胞のペレットに加える。チューブから含有物をすぐに吸引し、清潔な２ｍｌのチューブに移す。磁気バーを有するＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）−Ｑ中の適所に、チューブを置き、３０秒後に上澄みを捨てる。磁気バーを除去し、１ｍｌの蒸留水を加える。磁石を交換し、３０秒後に上澄みを捨てる。複合体をさらに２回洗浄し、ＤＮＡを含むチューブの含有物を２００μｌの蒸留水に再懸濁させる。
【００７６】
ＤＱ７
サンプル中のＤＱ７特異性を有するＨＬＡを、任意の適切な方法を使用して、決定又は型分類することができる。たとえば、血清学に基づく方法を使用して、サンプルをＨＬＡに型分類することができる。ＤＮＡに基づく方法を使用して、サンプルをＨＬＡに型分類することが好ましい。
【００７７】
血清学的方法は、モノクローナル又はポリクローナル抗体による抗原捕獲に基づくものであってよく、リンパ球の表面上の検出可能なレベルのＨＬＡタンパク質の存在を必要とする。たとえばリンパ球を、密度勾配遠心分離によって単離し、２５０単位のヘパリンナトリウムと混合させた１０ｍｌの血液からなるＭａｃｏｙの５ａ培地などの培地で、２回洗浄することができる。したがってＢ細胞は、ナイロン−ウールを使用して分離することができる。Ｔ細胞が欠失し、Ｂ細胞が豊富なリンパ球は、Ｋａｔｚ他（１９８７）ＪＰｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ ５８：６０７〜６１０に従った長期のインキュベーションによる細胞障害性試験によって、ＤＱに型分類することができる。
【００７８】
用語「ＤＮＡに基づく方法」は、それを使用してＤＱ７特異性を有するＨＬＡをサンプルが有するかどうかを決定することができる、任意のＤＮＡに基づく方法を指す。ＤＮＡに基づく方法を使用して、ＨＬＡ ＤＱ７の特異性を意味する遺伝子座をサンプルが含むかどうかを、決定することが好ましい。ＨＬＡ ＤＱ７の特異性を意味する対立遺伝子を、サンプルが含むかどうかを決定するために、ＤＮＡに基づく方法を使用することがより好ましい。ＨＬＡ ＤＱ７の特異性を意味するＤＱＢｌ＊０３０対立遺伝子、ＤＱＢ１＊０３０１１、ＤＱＢ１＊０３０１２、ＤＱＢ１＊０３０４、及び／又はＤＱＢｌ＊０３０９などを、サンプルが含むかどうかを決定するために、ＤＮＡに基づく方法を使用することがより好ましい。
【００７９】
ＨＬＡの型分類を行うためのＤＮＡに基づく方法は、Ｂｉｄｗｅｌｌ（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ９，１８〜２３、及びＡｎｇｅｌｉｎｉ他（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，４４８９〜４４９３によって概説されてきている。
【００８０】
ＲＥＬＩ ＳＳＯ ＨＬＡ−ＤＱＢ１ Ｔｅｓｔ（Ｄｙｎａｌ、Ｍｅｒｓｅｙｓｉｄｅ、ＵＫ）などの市販のキットを使用して、ＳＳＯを行うことができる。
【００８１】
ＲＥＬＩ ＳＳＯ ＨＬＡ−ＤＱＢ１ Ｔｅｓｔ用に、３０μｌのマスター混合物（１０％グリセロール、ＫＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣ１、＜０．００１％ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、ビオチン化プライマー、＜０．０１％ ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）（Ｔａｑポリメラーゼ）及び０．０５％アジ化ナトリウム）を、次に１５μｌの６ｍＭ ＭｇＣｌ2、及び１５μｌの対照ＤＮＡ（ＤＱＢ１＊０３０１１対立遺伝子などの対立遺伝子を含む）、陰性対照（１５μｌの滅菌蒸留水）、又は１５μｌの試験するサンプルを、それぞれのＰＣＲチューブに等分する。ＰＣＲ増幅は、以下のようにプログラムされたサーマルサイクラーを使用して行う：９５℃で１５秒間、６０℃で４５秒間、７２℃で１５秒間の３５サイクル；７２℃に５分間、その後１５℃に永久的に保つ。プログラムの終了時に、チューブを除去し、６０μｌの変性溶液（３％ ＥＤＴＡ、１．６％ ＮａＯＨ及びチモールブルー）を加え、次に１０分間室温でインキュベーションする。検出が１〜２時間以内で行われる場合、変性反応の混合物は室温で保存することができる。それ以外の場合は、検出ステップが行われるまで、変性反応の混合物を２〜８℃で（１週間を超えずに）保存しなければならない。
【００８２】
検出ステップ用に、３つのバッファーが必要とされる：（１）作業用ハイブリダイゼーションバッファー、５５ｍｌのＳＳＰＥ濃縮物（ＮａＣｌを含むリン酸ナトリウム溶液、ＥＤＴＡ及び１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ １５０（登録商標））、２１３ｍｌの蒸留水、及び６．９ｍｌのＳＤＳ濃縮物（ＳＤＳ及び１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ １５０（登録商標））を混合させることによって調製するもの；（２）作業用洗浄バッファー、６５ｍｌのＳＳＰＥ濃縮物、１２２８．５ｍｌの蒸留水、及び６．５ｍｌのＳＤＳ濃縮物を混合させることによって調製するもの、２７５ｍｌを厳密洗浄バッファー用に使用し、１０２５ｍｌを周囲洗浄バッファー用に使用する；（３）作業用クエン酸バッファー、３０ｍｌのクエン酸濃縮物（クエン酸ナトリウム溶液）を５７０ｍｌの蒸留水で希釈することによって調製するもの。
【００８３】
ハイブリダイゼーションバッファー及び厳密洗浄バッファーを、使用前に５０℃に暖め、水浴を同じ温度に設定する。ＨＬＡ−ＤＱＢ１に型分類した試料を、型分類用トレーのそれぞれのウエル中に置く。５ｍｌの予め暖めたハイブリダイゼーションバッファーをそれぞれのウエルに加え、次に７０μｌの変性した増幅サンプル又は対照をそれぞれのウエルに加える。型分類用トレーの上に蓋を置き、５０℃において３０分間６０ｒｐｍで、トレーをインキュベートする。それぞれのウエルの含有物を除去し、５ｍｌの周囲洗浄バッファーを加える。それぞれのウエルの含有物を除去し、５ｍｌの厳密洗浄バッファーを、５０℃において１５分間６０ｒｐｍで加える。作業用複合溶液を、５．３ｍｌの周囲洗浄バッファーを１６μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体（ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体、ＮａＣｌ及び１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ １５０（登録商標）を含むＡＣＥＳ溶液中のもの）に加えることによって、アッセイするそれぞれの試料用に調製する。トレーを水浴から除去し、それぞれのウエルから含有物を除去する。５ｍｌの作業用複合溶液をそれぞれのウエルに加え、トレーを１５分間６０ｒｐｍで混合する。含有物をウエルから除去し、５ｍｌの周囲洗浄バッファーを、それぞれのウエルに５分間６０ｒｐｍで加える。周囲洗浄バッファーのステップを１回繰り返す。含有物をウエルから除去し、５ｍｌのクエン酸バッファーを、５分間６０ｒｐｍで加える。作業用基質（基質Ａ（０．０１％ Ｈ2Ｏ2、及び０．１％ ＰｒｏＣｌｉｎ１５０（登録商標）を含むクエン酸溶液）と、基質Ｂ（４０％ジメチルホルムアミドに溶けた０．１％ ３，３’，５，５’−テトラメチルベンズイミド）の混合物）を、計算式［４．４ｍｌ×試料の数］を使用して、必要とされる基質Ａの量を計算することによって調製する。必要とされる基質Ｂの量は、計算式［１．１ｍｌ×試料の数］によって決定する。ウエルの含有物を除去し、５ｍｌの作業用基質を１０分間６０ｒｐｍで加える。ウエルの含有物を除去し、５ｍｌの蒸留水を５分間６０ｒｐｍで加える。このステップは２回繰り返す。５ｍｌのクエン酸バッファーをそれぞれのウエルに加え、キットと共に含まれるＨＬＡ−ＤＱＢ１オーバーレイ及びスコアシートを使用して、試料を手作業で処理する。対照線より大きな強度を有するそれぞれの青線に関しては、陽性シグナルが記録される。その型を、キットと共に含まれるＤｙｎａｌ ＲＥＬＩ ＳＳＯ ＨＬＡ−ＤＱＢの説明表と比較する。
【００８４】
サンプルがＤＱＢＩ＊０３０対立遺伝子、ＤＱＢ１＊０３０１１、ＤＱＢ１＊０３０１２、ＤＱＢ１＊０３０４、及び／又はＤＱＢＩ＊０３０９などを含むとき、陽性の結果が得られる。１個又は複数個のこれらの対立遺伝子の存在は、ＤＱ７型のＨＬＡを意味する。具体的には、ＤＱ７特異性を有するＨＬＡに関する陽性の結果は、対照線より大きな強度を有する青線が、たとえばレーン７、レーン１１、レーン１７、レーン２２及び２３（ＤＱＢＩ＊０３０１１、ＤＱＢ１＊０３０１２及びＤＱＢＩ＊０３０９）、及び／又はレーン２５及び／又はレーン７、レーン１１、レーン１６、レーン２２〜２３及びレーン２５（ＤＱＢＩ＊０３０４）に存在するときに得られる。
【００８５】
Ｂｕｎｃｅ他（１９９５）Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４６，３５５〜３６７に従って、或いはＡｌｌＳｅｔ ＳＳＰ ＤＱＢ１＊０３ Ｔｅｓｔ（Ｄｙｎａｌ、Ｍｅｒｓｅｙｓｉｄｅ、ＵＫ）などの市販のキットを使用して、ＳＳＰを行うことができる。
【００８６】
ＤＮＡ抽出キット（Ｄｙｎａｌ、Ｍｅｒｓｅｙｓｉｄｅ、ＵＫ）などの前述した方法を使用して、精製ＤＮＡを作製することができる。
【００８７】
５μｌの供給されたプライマー溶液を、それぞれのＰＣＲチューブに分配する。１つのＤＱＢ１＊０３型分類（１１のＰＣＲ反応混合物）を行うために、以下のＰＣＲ混合物を作製する：１１２μｌのＤｙｎａｌ ＡｌｌＳｅｔ ＳＳＰマスター混合物（Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ＫＣＩ、ゼラチン、ＭｇＣｌ２、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、グリセロール及びクレゾールレッド）；２６．６μｌのサンプルＤＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）；１．１２μｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ。含有物を混合させ、１０μｌのＰＣＲ混合物をそれぞれのウエルに分配する。使用するＰＣＲサイクルのパラメータは：９４℃で２分間；９４℃で１０秒間及び６５℃で６０秒間の１０サイクル；９４℃で１０秒間、６１℃で５０秒間及び７２℃で３０秒間の２０サイクルである。
【００８８】
ＨＬＡ ＤＱ７特異性を意味する、ＤＱＢＩ＊０３０対立遺伝子、ＤＱＢ１＊０３０１１、ＤＱＢ１＊０３０１２、ＤＱＢ１＊０３０４、及び／又はＤＱＢＩ＊０３０９などをサンプルが含むとき、陽性の結果が得られる。したがって、たとえばチューブ１（ＰＣＲ産物１４０ｂｐ）、及びチューブ２（ＰＣＲ産物１２５ｂｐ）（ＤＱＢ１＊０３０１及びＤＱＢ１＊０３０２）、及び／又はチューブ１及びチューブ５（１３０ｂｐ）（ＤＱＢ１＊０３０４）、及び／又はチューブ１、チューブ２、及びチューブ１０（ＰＣＲ産物１２０ｂｐ）（ＤＱＢ１＊０３０９）中で陽性シグナルが得られるとき、ＤＱ７特異性を有するＨＬＡが同定される。
【００８９】
本発明の他の実施形態では、哺乳動物、家畜哺乳動物など、たとえばヒツジ及び／又はウシの、プリオン感受性を決定することができる。この実施形態では、ＤＮＡに基づく方法は、ＤＮＡの塩基配列決定であることが好ましい。ＤＮＡの塩基配列決定を使用して、家畜哺乳動物のＭＨＣの同等なＨＬＡ ＤＱ７特異性を意味する、１個又は複数個のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列、１個又は複数個の遺伝子座及び／又は１個又は複数個の対立遺伝子などを同定することができる。たとえば、ＨＬＡ ＤＱ７特異性を意味するＤＱＢｌ＊０３０対立遺伝子の配列は、データベース、たとえばヒトからのＤＱＢｌ＊０３０対立遺伝子の５’側面領域（受託番号ＡＦ２１７４２０）；ヒトからのＤＱＢｌ＊０３０４対立遺伝子の第１のドメイン、エクソン２（受託番号Ｍ７４８４２）において、公に入手可能である。家畜からのヌクレオチド及びアミノ酸配列のデータベースを調べて、ＨＬＡ ＤＱ７特異性を意味する配列と相同性がある配列を同定することができる。したがって、同等のＨＬＡ ＤＱ７特異性を決定することによりプリオン病に対する家畜の感受性を決定するために、本発明の方法を使用することもできることは、当業者により明らかであろう。
【００９０】
本発明の方法を、プリオン病に対する被験者の感受性を決定する他の方法（ＰｒＰ Ｍｅｔ１２９型分類、又はＤＱ７が好ましい例である血液系マーカーの他の組合せなど）と組み合わせて、これによってそれぞれの被験者に関する第２の情報を有利に与えることができることは、当業者には明らかであろう。１つのこのような方法では、ＰｒＰ１２９の遺伝型を、ＷＯ ９８／１６８３４、Ｃｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９１）Ｌａｎｃｅｔ ３３７，１４４１〜１４４２、Ｐａｌｍｅｒ他（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２，３４０〜３４２、及びＣｏｌｌｉｎｇｅ他（１９９６）Ｌａｎｃｅｔ ３４８，５６中に記載されたように決定する。ＰｒＰのアミノ酸１２９における多型は同定されてきており（メチオニン又はバリンに関して）、このことが、その大部分が多形残基１２９におけるメチオニンが同型である、ｖＣＪＤを有する患者の一団の、散発性及び後天性のヒトプリオン病に対する遺伝的感受性に寄与している。したがって、ＰｒＰメチオニン１２９を有し、さらにＨＬＡ型ＤＱ７が欠けている被験者は、プリオン病に対して最も高い感受性を有し、逆も然りであると予想することができる。方法を組み合わせることによって、プリオン病に対する被験者の感受性の、さらに確固たる指標を与えることができる。
【００９１】
本明細書では、用語「家畜」は、任意の飼育動物を指す。家畜は、１匹又は複数匹のブタ、ヒツジ、ウシ又は雄牛であることが好ましい。家畜はウシ、雄牛又はヒツジであることがより好ましい。
【００９２】
ヌクレオチド配列
本発明の態様は、データベース中の利用可能なヌクレオチド配列の使用を含むことができる。
【００９３】
本明細書では、用語「ヌクレオチド配列」は、用語「ポリヌクレオチド」と同義である。
【００９４】
ヌクレオチド配列は、ゲノム又は合成又は組み換え起源の、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。ヌクレオチド配列は、センス鎖又はアンチセンス鎖又はこれらの組合せである、二本鎖又は一本鎖であってよい。
【００９５】
一般的な組み換えＤＮＡ法の技術
一般に、本明細書で述べる技法は当分野でよく知られているが、特にＳａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）、及びＡｕｓｕｂｅｌ他、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）４ｔｈ Ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃを、参照することができる。
【００９６】
他の態様では、本発明は、プリオン病に対する感受性が低い、家畜などの哺乳動物の繁殖に関する。ＨＬＡ ＤＱ７特異性が同等である１個又は複数個のＭＨＣ分子を有する家畜を、繁殖させることができる。ＨＬＡ ＤＱ７特異性が同等である１個又は複数個のＭＨＣ分子を有するこれらの子孫を選択し、他の繁殖プログラムにおいて使用することができる。近親交配、近親外交配、又は当業者に知られている任意の他の繁殖法を含めた、さまざまな繁殖法を使用することができる。
【００９７】
他の態様では、本発明は、ゲノムに挿入されたＨＬＡ ＤＱ７特異性が同等である、１個又は複数個のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列を有する、家畜などのトランスジェニック哺乳動物に関する。したがって、このトランスジェニック哺乳動物は、プリオン病に対して低い感受性を有する可能性がある。同等なＨＬＡ ＤＱ７特異性を意味するＭＨＣ分子、１個又は複数個の遺伝子座及び／又は１個又は複数個の対立遺伝子などを、（１）１つの胚から他の胚への細胞の移動；（２）レトロウイルスに感染させた細胞の導入；（３）Ｓｃｏｔｔ他（１９８９），Ｃｅｌｌ ５９，８４７〜８５７、及びＳｃｏｔｔ他（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，１，９８６〜９９７により記載された方法に従った、
受精卵の前核へのｃＤＮＡのマイクロインジェクション；（４）１匹の動物への多数の卵の移植などの、当業者によく知られているいくつかの技法を使用して、哺乳動物に導入することができる。したがって、知られている手順を使用して、生じる子孫がトランスジェニック哺乳動物であるかどうかを決定する。
【００９８】
他の態様では、本発明は、同等なＨＬＡ ＤＱ７特異性を意味する１個又は複数個のＭＨＣ分子、１個又は複数個の遺伝子座及び／又は１個又は複数個の対立遺伝子などを有し、そのゲノムが欠失しているトランスジェニックマウスなどのトランスジェニック哺乳動物に関する可能性もあり、したがって、このトランスジェニック哺乳動物は、プリオン病に対して高い感受性を有する。
【００９９】
以下の実施例を参照しながら、本発明を例示する。
【実施例１】
【０１００】
プリオン病に対する感受性と関係があるＤＱ７特異性を有するＨＬＡの同定
ＤＮＡ抽出キット（Ｄｙｎａｌ、Ｍｅｒｓｅｙｓｉｄｅ、ＵＫ；製品番号６３３．ＸＸ）を使用して、ｖＣＪＤ感染した４９人のヒト患者及び１９７人の対照ヒト患者から、ＤＮＡを単離する。２ｍｌのチューブ中のそれぞれの患者からの２００μｌの抗凝固処理した全血を、１ｍｌの赤血球細胞溶解バッファー１（５ｍｌの濃縮物＋４４ｍｌの蒸留水＋１ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８）と、溶液が透明になるまで混合させる。この溶液を、１０，０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離して、白血球細胞をペレット状にし、上澄みを捨てる。チューブを攪拌し、１ｍｌの赤血球細胞溶解バッファー２（５ｍｌの濃縮物＋４５ｍｌの蒸留水）を加える。この溶液を１０秒間遠心分離し、上澄みを捨てる。２００μｌの再懸濁Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＤＮＡ抽出物を、白血球細胞のペレットに加え、チューブの含有物をすぐに吸引し、清潔な２ｍｌのチューブに移す。磁気バーを有するＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）−Ｑ中の適所に、チューブを置き、３０秒後に上澄みを捨てる。磁気バーを除去し、１ｍｌの蒸留水を加える。磁石を交換し、３０秒後に上澄みを捨てる。複合体をさらに２回洗浄し、２４６の血液サンプルから抽出したＤＮＡを、２００μｌの蒸留水に再懸濁させる。
【０１０１】
ＲＥＬＩ ＳＳＯ ＨＬＡ−ＤＱＢＩ Ｔｅｓｔ（Ｄｙｎａｌ、Ｍｅｒｓｅｙｓｉｄｅ、ＵＫ；製品番号８２０．ＸＸ）を使用して、ＨＬＡの型分類を行う。
【０１０２】
３０μｌのマスター混合物（１０％グリセロール、ＫＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣ１、＜０．００１％ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、ビオチン化プライマー、＜０．０１％ ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）（Ｔａｑポリメラーゼ）及び０．０５％アジ化ナトリウム）を、次に１５μｌの６ｍＭ ＭｇＣｌ2、及び１５μｌの対照ＤＮＡ（ＤＱＢ１＊０３０対立遺伝子を含む）、陰性対照（滅菌蒸留水）、又は２４６の血液サンプルそれぞれから抽出したＤＮＡを、それぞれのＰＣＲチューブに等分する（前述のＤＮＡ抽出キットを使用して）。ＰＣＲ増幅は、以下のようにプログラムされたサーマルサイクラーを使用して行う：９５℃で１５秒間、６０℃で４５秒間、７２℃で１５秒間の３５サイクル；７２℃に５分間、その後１５℃に永久的に保つ。プログラムの終了時に、チューブを除去し、６０μｌの変性溶液（３％ ＥＤＴＡ、１．６％ ＮａＯＨ及びチモールブルー）を加え、次に１０分間室温でインキュベーションする。
【０１０３】
検出ステップ用に、３つのバッファーを使用する：（１）作業用ハイブリダイゼーションバッファー、５５ｍｌのＳＳＰＥ濃縮物（ＮａＣｌを含むリン酸ナトリウム溶液、ＥＤＴＡ及び１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ １５０（登録商標））、２１３ｍｌの蒸留水、及び６．９ｍｌのＳＤＳ濃縮物（ＳＤＳ及び１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ １５０（登録商標））を混合させることによって調製するもの；（２）作業用洗浄バッファー、６５ｍｌのＳＳＰＥ濃縮物、１２２８．５ｍｌの蒸留水、及び６．５ｍｌのＳＤＳ濃縮物を混合させることによって調製するもの、２７５ｍｌを厳密洗浄バッファー用に使用し、１０２５ｍｌを周囲洗浄バッファー用に使用する；（３）作業用クエン酸バッファー、３０ｍｌのクエン酸濃縮物（クエン酸ナトリウム溶液）を５７０ｍｌの蒸留水で希釈することによって調製するもの。
【０１０４】
ハイブリダイゼーションバッファー及び厳密洗浄バッファーを、使用前に５０℃に暖め、水浴を同じ温度に設定する。ＨＬＡ−ＤＱＢ１に型分類した試料を、型分類用トレーのそれぞれのウエル中に置く。５ｍｌの予め暖めたハイブリダイゼーションバッファーをそれぞれのウエルに加え、次に７０μｌの変性した増幅サンプル又は対照をそれぞれのウエルに加える。型分類用トレーの上に蓋を置き、５０℃において３０分間６０ｒｐｍで、トレーをインキュベートする。それぞれのウエルの含有物を除去し、５ｍｌの周囲洗浄バッファーを加える。それぞれのウエルの含有物を除去し、５ｍｌの厳密洗浄バッファーを、５０℃において１５分間６０ｒｐｍで加える。作業用複合溶液を、５．３ｍｌの周囲洗浄バッファーを１６μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体（ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体、ＮａＣｌ及び１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ １５０（登録商標）を含むＡＣＥＳ溶液中のもの）に加えることによって、アッセイするそれぞれの試料用に調製する。トレーを水浴から除去し、それぞれのウエルから含有物を除去する。５ｍｌの作業用複合溶液をそれぞれのウエルに加え、トレーを１５分間６０ｒｐｍで混合する。含有物をウエルから除去し、５ｍｌの周囲洗浄バッファーを、それぞれのウエルに５分間６０ｒｐｍで加える。周囲洗浄バッファーのステップを１回繰り返す。含有物をウエルから除去し、５ｍｌのクエン酸バッファーを、５分間６０ｒｐｍで加える。作業用基質（基質Ａ（０．０１％ Ｈ2Ｏ2、及び０．１％ ＰｒｏＣｌｉｎ １５０（登録商標）を含むクエン酸溶液）と、基質Ｂ（４０％ジメチルホルムアミドに溶けた０．１％ ３，３’，５，５’−テトラメチルベンズイミド）の混合物）を、計算式［４．４ｍｌ×試料の数］を使用して、必要とされる基質Ａの量を計算することによって調製する。必要とされる基質Ｂの量は、計算式［１．１ｍｌ×試料の数］によって決定する。ウエルの含有物を除去し、５ｍｌの作業用基質を１０分間６０ｒｐｍで加える。ウエルの含有物を除去し、５ｍｌの蒸留水を５分間６０ｒｐｍで加える。このステップは２回繰り返す。５ｍｌのクエン酸バッファーをそれぞれのウエルに加える。
【０１０５】
キットと共に含まれるＨＬＡ−ＤＱＢ１オーバーレイ及びスコアシートを使用して、試料を手作業で処理する。対照線より大きな強度を有するそれぞれの青線に関しては、陽性シグナルが記録される。その型を、キットと共に含まれるＤｙｎａｌ ＲＥＬＩ ＳＳＯ ＨＬＡ−ＤＱＢの説明表と比較する。
【０１０６】
以下の結果が得られる：
【０１０７】
ｖＣＪＤ感染した患者（１２．２％）と対照患者（３５．５％）の間の、ＨＬＡ ＤＱ７特異性の結果の比較によると、ＤＱ７特異性を有するＨＬＡはｖＣＪＤを有する患者においてより少ない。したがって、ｖＣＪＤを有する被験者中のＤＱ７特異性を有するＨＬＡの存在は、対照患者中より少ない。
【０１０８】
したがって、被験者中のＤＱ７特異性を有するＨＬＡの存在は、プリオン病に対して低い感受性と関連があり；被験者中のＤＱ７特異性を有するＨＬＡの不在は、プリオン病に対して高い感受性と関連があることが実証される。
【実施例２】
【０１０９】
ＤＮＡに基づく方法（ＳＳＯ）を使用する、プリオン病に対する被験者の感受性の決定
ヒト患者由来のサンプルに、ＤＮＡ抽出及びＨＬＡ型分類を、実施例１に記載したのと同様に行う。
【０１１０】
以下の対照反応物を使用する：（１）陽性対照＝ｖＣＪＤを有する患者から抽出したＤＮＡ；（２）陰性対照＝蒸留水。
【０１１１】
キットと共に含まれるＨＬＡ−ＤＱＢ１オーバーレイ及びスコアシートを使用して、ＨＬＡ−ＤＱＢ１に型分類された試料を手作業で処理する。対照線より大きな強度を有するそれぞれの青線に関しては、陽性シグナルが記録される。その型を、キットと共に含まれるＤｙｎａｌ ＲＥＬＩ ＳＳＯ ＨＬＡ−ＤＱＢの説明表と比較する。
【０１１２】
試験するヒト患者に関して、陽性シグナル（すなわち、対照線より大きな強度を有する青線）が、レーン７、レーン１１、レーン１７、レーン２２〜２３、及びレーン２５に存在する。したがって、被験者はＤＱＢ１＊０３０１（ＤＱＢ１＊０３０１１／ＤＱＢ１＊０３０１２）及びＤＱＢ１＊０３０９を有し、したがってＤＱ７特異性を有するＨＬＡを有する。
【０１１３】
陽性対照に関しては、陽性シグナル（すなわち、対照線より大きな強度を有する青線）が、レーン７、レーン１１、レーン１７、レーン２２〜２３、及びレーン２５に存在する。したがってこの対照は、ＨＬＡ ＤＱ７特異性を意味するＤＱＢ１＊０３０１（ＤＱＢＩ＊０３０１１／ＤＱＢ１＊０３０１２）及びＤＱＢｌ＊０３０９を有する。
【０１１４】
陰性対照に関しては、陽性シグナルは得られない。
【０１１５】
したがって、ヒト患者はＤＱ７特異性を有するＨＬＡを有する、すなわち、ヒト患者はｖＣＪＤに対して低い感受性を有することが実証される。
【実施例３】
【０１１６】
ＤＮＡに基づく方法（ＳＳＯ）を使用する、プリオン病に対する被験者の感受性の決定。
【０１１７】
ＤＮＡ抽出及びＨＬＡ型分類を、実施例１に記載したのと同様にヒト患者に行う。使用した対照は実施例２と同じである。
【０１１８】
キットと共に含まれるＨＬＡ−ＤＱＢ１オーバーレイ及びスコアシートを使用して、ＨＬＡ−ＤＱＢ１に型分類された試料を手作業で処理する。対照線より大きな強度を有するそれぞれの青線に関しては、陽性シグナルが記録される。その型を、キットと共に含まれるＤｙｎａｌ ＲＥＬＩ ＳＳＯ ＨＬＡ−ＤＱＢの説明表と比較する。陽性シグナル（すなわち、対照線より大きな強度を有する青線）は、ＨＬＡ ＤＱ７特異性を意味するＤＱＢ１＊０３０対立遺伝子に関しては得られない。
【０１１９】
陽性対照及び陰性対照に関する結果は、実施例２と同じである。
【０１２０】
したがって、ヒト患者はＤＱ７特異性を有するＨＬＡを有さない、すなわち、ヒト患者はｖＣＪＤに対して高い感受性を有することが実証される。
【実施例４】
【０１２１】
ＤＮＡに基づく方法（ＳＳＯ）を使用する、プリオン病に対する被験者の感受性の決定
ＤＮＡ抽出を、実施例１に従いヒト患者に行う。使用した対照は実施例２と同じである。
【０１２２】
Ａｌ１Ｓｅｔ ＳＳＰ ＤＱＢ１＊０３ Ｔｅｓｔ（Ｄｙｎａｌ、Ｍｅｒｓｅｙｓｉｄｅ、ＵＫ；製品番号５８１．ＸＸ）を使用する。５μｌの供給されたプライマー溶液を、それぞれのＰＣＲチューブに分配する。１つのＤＱＢ１＊０３型分類（１１のＰＣＲ反応混合物）を行うために、以下のＰＣＲ混合物を作製する：１１２μｌのＤｙｎａｌ ＡｌｌＳｅｔ ＳＳＰマスター混合物（Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ＫＣＩ、ゼラチン、ＭｇＣｌ2、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、グリセロール及びクレゾールレッド）；２６．６μｌのサンプルＤＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）；１．１２μｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ。含有物を混合させ、１０μｌのＰＣＲ混合物をそれぞれのウエルに分配する。使用するＰＣＲサイクルのパラメータは：９４℃で２分間；９４℃で１０秒間及び６５℃で６０秒間の１０サイクル；９４℃で１０秒間、６１℃で５０秒間及び７２℃で３０秒間の２０サイクルである。
【０１２３】
チューブ１（ＰＣＲ産物１４０ｂｐ）及びチューブ２（ＰＣＲ産物１２５ｂｐ）に関して陽性シグナルが、すなわちＨＬＡ ＤＱ７特異性を意味するＤＱＢＩ＊０３０１（ＤＱＢ１＊０３０１１及びＤＱＢ１＊０３０１２）に関する陽性の結果が得られる。
【０１２４】
陽性対照に関しては、チューブ１（ＰＣＲ産物１４０ｂｐ）及びチューブ２（ＰＣＲ産物１２５ｂｐ）に関して陽性シグナルが、すなわちＨＬＡ ＤＱ７特異性を意味するＤＱＢＩ＊０３０１（ＤＱＢ１＊０３０１１及びＤＱＢ１＊０３０１２）に関する陽性の結果が得られる。
【０１２５】
陰性対照に関しては、陽性シグナルは得られない。
【０１２６】
したがって、ヒト患者はＤＱ７特異性を有するＨＬＡを有する、すなわち、ヒト患者はｖＣＪＤに対して低い感受性を有することが実証される。
【実施例５】
【０１２７】
ＤＮＡに基づく方法（ＳＳＯ）を使用する、プリオン病に対する被験者の感受性の決定
ヒト患者に、ＤＮＡ抽出を実施例１に従って行い、及びＨＬＡ型分類を実施例３に従い行う。使用した対照は実施例４と同じである。
【０１２８】
ＨＬＡ ＤＱ７特異性を意味する任意のＤＱＢ１＊０３０対立遺伝子に関して、陽性シグナルは得られない。
【０１２９】
対照に関する結果は、実施例４と同じである。
【０１３０】
したがって、ヒト患者はＤＱ７特異性を有するＨＬＡを有さない、すなわち、患者はｖＣＪＤに対して高い感受性を有することが実証される。
【実施例６】
【０１３１】
この実施例は、ｖＣＪＤを有する患者におけるＨＬＡクラスＩＩ型ＤＱ７（ＤＱＢ１＊０３０１／４／９）の有意に低下した頻度を例示するものであり、一方で散発性ＣＪＤの発生率は、対照群のそれと同等であった。
【０１３２】
理論に拘束するものではないが、この分子マーカーはそれ自体がｖＣＪＤ感染性と直接関連がある可能性があり、或いは密接に関連している遺伝子がこの影響の原因である可能性がある。
【０１３３】
この実施例は、正常な対照及び散発性ＣＪＤとの比較用に、ｖＣＪＤ患者のＨＬＡ型を決定するための研究を示す。散発性ＣＪＤの病因、ＣＪＤの主な識別診断は依然として明らかではないが、そのランダムな世界的分布、及び集合性がないこと、又は局所的なスクレーピーの蔓延との関連が、後天的病因に対して論じられる。プリオンタンパク質遺伝子の体細胞突然変異、又はＰｒＰScの自発的形成が、より可能性の高い原因であると考えられる。
【０１３４】
ｖＣＪＤ患者の組織から抽出した３２のＤＮＡサンプルに関する最初の研究を行い、１２例の散発性ＣＪＤからのサンプルと比較した。組織サンプルは、親族の承諾を得て、死体解剖において得た。これらのサンプルを、配列特異的プライマーによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ−ＳＳＰ）法（Ｂｕｎｃｅ他）を使用して低い／中精度で、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤＲＢ及びＤＱＢ１にＨＬＡ型分類した。この研究において使用したサンプルはすべて、イギリスのコーカソイドからのものであると確認した。１９７の一連の死体臓器ドナーの一群からのＨＬＡ頻度を、対照値として使用した。
【０１３５】
対照の頻度の統計的にのみ有意な偏差が、ＤＱＢ１遺伝子座にみられた；３２人のｖＣＪＤ患者中わずか２人が、両側検定であるフィッシャーの正確検定によって、１９７人の対照中の７０人（３５．５％）と比較して、ＤＱＢ１＊０３０１／４／９（ＤＱ７）に陽性であり、０．０００４という非補正ｐ値が報告された。散発性ＣＪＤの場合、５０％の患者がＤＱ７であり（６／１２）、対照と有意に異なるわけではなかった（ｐ＝０．３６）。この発見の後、他の１８人のｖＣＪＤ及び１４人の散発性ＣＪＤ患者を、市販のＰＣＲ−ＳＳＯＰキット（Ｒｅｌｉ（商標）、Ｄｙｎａｌ ＵＫ）のみを使用して、ＨＬＡ−ＤＱＢ１に型分類した。表１は、５０人のｖＣＪＤ患者、２６人の散発性ＣＪＤ患者、及び１９７人の対照における、ＨＬＡ−ＤＱ型の表現型頻度の割合を示す。それぞれの被験者のＤＱＢ１対立遺伝子を考慮することにより、ＨＬＡ−ＤＱ型を指定した。ＨＬＡ−ＤＱ７の頻度は、ｖＣＪＤ患者において有意に低いままの状態であり（ｐ＝０．００１０）、５０人中わずか６人がこの表現型を有していた。散発性ＣＪＤ群におけるＨＬＡ−ＤＱ頻度は、対照の頻度に匹敵した状態であった。
【０１３６】
現在、研究されているｖＣＪＤの犠牲者はすべて、ＰＲＮＰ遺伝子中の共通の多型に関してメチオニンが同型である。約３８％の正常な英国人の個体群は、この遺伝型を有する。われわれのデータによって、ＤＱ７の存在は、３．３のＤＱ７に陰性である個人の相対的な危険に対して、いくらか防御性があることが示唆される。
【０１３７】
したがって、ＰＲＮＰ遺伝型分類と共に、ｖＣＪＤの疑いがある患者をＤＱ７型分類することが、診断における有用なツールであることが実証される。
【０１３８】
ｖＣＪＤの確固たる組織に基づく診断は扁桃生検によって行うことができるが、本発明の血液に基づく診断が、好ましいことは明らかである。
【０１３９】
理論に縛られること望まずに、ＤＱ７とｖＣＪＤの防御的関係に関する、分子的基盤は明らかではない。ＭＨＣクラスＩＩの分子自体が、疾患の病因における直接的な役割を果たしているか、或いは、ＤＱＢ遺伝子座と関連がある遺伝子が関連していることが考えられる。ＭＨＣクラスＩＩの考えられる役割は、その物体周辺にＰｒＰScを偶然に有していることである可能性があり、或いは実際に、腸からリンパ細網系では、ＤＱ７分子の役割はあまり有効ではない。或いは、ＨＬＡ−ＤＱ７分子は、推定病原性ペプチドを提示する際に、より有効である可能性があり、このようにして免疫応答を開始させる。本発明の作業によって、疾患の病因におけるＭＨＣクラスＩＩの分子の重要な役割を明らかにすることができる。したがって、治療的介入の標的が開示される。
【０１４０】
【表１】
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上記の本明細書で述べたすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込んである。本発明の記載した方法及び系のさまざまな変更形態及び変形形態が、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。特定の好ましい実施形態に関して本発明を記載してきたが、特許請求する本発明は、このような特定の実施形態に過度に制限されるべきではないことは理解されなければならない。実際、分子生物学又は関連分野の当業者には明らかである、本発明を実施するために記載した方法のさまざまな変更形態が、以下の特許請求の範囲内のものであると考えられる。
Claims (7)
- プリオン病に対する被験者の感受性を決定する方法であって、
（ａ）前記被験者からのサンプルを提供するステップと、
（ｂ）前記サンプルのヒト白血球抗原に対する特異性を決定するステップとを含み、
前記サンプルがＤＱ７ヒト白血球抗原に対する特異性を有する場合は、前記被験者がプリオン病に対して低い感受性を有し、
前記サンプルがＤＱ７ヒト白血球抗原に対する特異性を有さない場合は、前記被験者がプリオン病に対して高い感受性を有する、
と決定する方法。 - ヒト白血球抗原に対する特異性を核酸に基づく方法によって決定することを特徴とする請求項１記載の方法。
- 前記核酸に基づく方法が、配列特異的プライマーによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ−ＳＳＰ）を含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
- プリオン病がｖＣＪＤであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の方法。
- サンプルが体液又は組織であるか、或いはそれに由来するものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の方法。
- 体液又は組織が血液であることを特徴とする請求項５記載の方法。
- サンプルが体液又は組織から抽出した核酸であるか、或いはそれに由来するものであることを特徴とする請求項５又は６記載の方法。
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