JP2004526670A

JP2004526670A - 密着結合した上皮を介した担体ベクター

Info

Publication number: JP2004526670A
Application number: JP2002542322A
Authority: JP
Inventors: ジョリオット，アライン; デュポン，エドモンド; プロシアンツ，アライン
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2000-11-20
Filing date: 2001-11-20
Publication date: 2004-09-02
Anticipated expiration: 2021-11-20
Also published as: CA2427896A1; FR2816845B1; EP1351648B1; WO2002039947A2; US8242088B2; CA2427896C; AU2002221994A1; WO2002039947A3; FR2816845A1; JP4860896B2; EP1351648A2; US20040029281A1

Abstract

この発明は、密着結合した上皮、例えば血液−脳関門を介して対象分子を担持するための、導入ドメイン及び核輸出配列からなるペプチドベクターに関する。

Description

【０００１】
この発明は、血液−脳関門、より一般的には、２つの区画間に緊密な障壁を形成する上皮を介して活性分子を輸送できる新規なベクターに関する。
【０００２】
血液−脳関門（ＢＢＢ）の機能は、血液組成中の経験的な変動から脳を維持すること、及び潜在的に毒性の物質に対して神経細胞を保護することである。それは、中枢神経系を洗浄する毛細管の内皮レベルにある。この内皮は、身体の他の毛細管とは区別される特定の性質を有する。それは、他の多数の毛細管に見られる性質を欠いている。さらに、その構成細胞は、互いに緊密に結合している。これらの「密着結合」は、（１０００オーム／ｃｍ^２オーダーの）高い耐電性も有しており、そのためにイオンの受動拡散にさえ有効な障害となっている。
【０００３】
したがって、血液−脳関門は、天然には少数の物質を通過させるに過ぎない極めて選択的なフィルターを構成している。これらは主に：
− 低分子量の脂肪親和性分子で、受動拡散によって血液−脳関門を通過することができる；
− 神経細胞の機能に必須の栄養素（特に糖、アミノ酸、神経ペプチド、ビタミンなど）を構成する低分子量の親水性分子である。これらの分子は、特定の輸送体を介して血液−脳関門を通過する；
− 高分子量分子（例えばポリペプチドホルモン）で、これは、内皮細胞表面に存在する特定のレセプターに結合後、血液−脳関門を通過する。
【０００４】
血液−脳関門の不浸透性は、脳への多くの医薬品の透過の主たる障壁となっている。
これを改善するために、幾つかの方策が提案されている：
１）髄腔内注射又は注入による、中枢神経系における所望の分子の直接投与。この方法には、極めて侵襲性で、実施が難しいという欠点がある。関連する手法は、被投与物質を生じ、この結果、「ミニポンプ」のように作用して、物質をその場で分配するように遺伝学的に改質された細胞の中枢神経系への移植からなる。その潜在的な利点にもかかわらず、この手法は、合成でき、細胞によって分泌される薬剤に依然として限定されるであろう。
【０００５】
２）浸透ショック又はある物質（例えばブラディキニン又はアンギオテンシン）の作用によって一般に生じ、幾つかの成分の細胞外ドメインとの相互作用によって密着結合を過渡的に解放する、ＢＢＢの瞬間的な開口。この手法は、非選択的であり、かつ血中に存在する多くの他の分子が被輸送分子として同時に通過することを可能にする欠点を有する。
３）血液−脳関門を通過するための天然のメカニズムの使用。しかし、受動拡散は、脂肪親和性であるか、又は薬理特性を変えずに脂肪親和性になることのできる低分子量物質にのみ用いることができる。特異的な輸送体は、輸送体によって天然に輸送される物質に十分近い構造を有する分子にのみ用いることができる。特定のレセプターの場合、被輸送分子とこれらのレセプターに対する天然のリガンドを結合することが提案される。この手法の主たる欠点は、多少望ましくない副作用を生じることのできる、これらのリガンドに特異的な生物活性にある。
【０００６】
近年、血液−脳関門を介する輸送用ベクターとして導入ペプチド（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｓ）を使用することが提案されている。導入ペプチドは、特異的な輸送体又はレセプターの存在から独立して、生細胞に透過能力を付与する「導入ドメイン」として言及される配列からなるペプチドである。
導入ペプチドに関する論説は、最近ＬＩＤＧＲＥＮら［ＴｉＰＳ，２１，９９−１０２，（２０００）］；ＳＣＨＷＡＲＺＥ及びＤＯＷＤＹ［ＴｉＰＳ，２１，４５−４８，（２０００）］；ＳＣＨＷＡＲＺＥら［ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，２９０−２９５，（２０００）］；ＰＲＯＣＨＩＡＮＴＺ［ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，１２，４００−４０６，（２０００）］によって公表されている。
【０００７】
導入ペプチドの一例として、特に以下が挙げられる：
− ホメオドメインの第三ヘリックス由来ペプチドであるペネトラチン；ペネトラチンファミリーのペプチドは、例えばＪＯＬＩＯＴら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１８６４−１８６８，（１９９１）］；ＤＥＲＯＳＳＩら［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４，１０４４４−１０４５０，（１９９４）］；ＢＲＵＧＩＤＯＵら［Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．，２１４，６８５−６９３，（１９９５）］の文献及び米国特許５，８８８，７６２号、米国特許６，０８０，７２４号又はＰＣＴ出願ＷＯ／００／０１４１７号にも記載されている；
− ＨＩＶ１Ｔａｔタンパク質、特に該タンパク質の４８〜６０フラグメント由来のペプチド；かかるペプチドは、例えばＦＡＷＥＬＬら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９１，６６４−６６８，（１９９４）］又はＶＩＶＥＳら［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１６０１０−１６０１７，（１９９７）］によって記載されている；
【０００８】
− ＨＳＶＶＰ２２タンパク質由来のペプチド；かかるペプチドは、例えばＥＬＬＩＯＴＴ及びＯ’ＨＡＲＥ［Ｃｅｌｌ，８８，２２３−２３３，（１９９７）］によって記載される；
− 核の局在配列に任意に結合する、シグナル配列由来のペプチド；かかるペプチドは、例えばＬＩＮら［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１４２５５−１４２５８，（１９９５）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，５３０５−５３０８，（１９９６）］、ＬＩＵら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１１８１９−１１８２４，（１９９６）］、ＭＯＲＲＩＳら［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２５，２７３０−２７３６，（１９９７）］、ＣＨＡＬＯＩＮら［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６，１１１７９−１１１８７，（１９９７）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４３，６０１−６０８，（１９９８）］、ＺＨＡＮＧら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，９１８４−９１８９，（１９９８）］によって記載される；
− 神経ペプチドの一部、ガラニン及び蜂毒（ｗａｓｐｖｅｎｏｍ）ペプチドの融合由来の輸送体［ＰＯＯＧＡら、ＦＡＳＥＢＪ．，１２，６７−７７，（１９９８）；Ａｎｎ．ＮｅｗＹｏｒｋＡｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６３，４５０−４５３，（１９９８）］。
【０００９】
ＳＣＨＷＡＲＺＥら［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５，１５６９−１５７２，（１９９９）］は、Ｔａｔタンパク質の導入ドメインに結合したβ−ガラクトシダーゼを、脳を含む身体の全組織中で、腹膜投与後に検出できることを観察した。
ＲＯＵＳＳＥＬＬＥら［Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，５７，６７９−６８６，（２０００）］も、Ｄ−ペネトラチン又はＳｙｎＢ１ペプチドとのドキソルビシンの結合は、血液−脳関門を介するその通過を増大させることを報告している。
導入ペプチドの使用は血液−脳関門を介する通過を増大させると思われるが、にもかかわらず、これは依然として極めて低い。
【００１０】
さらに、先の研究で、発明者のチームは、ホメオドメインタンパク質Ｅｎｇｒａｉｌｅｄで、このタンパク質の核からの退出及び分泌区画へのその通過に寄与する核輸出配列の存在を立証している［ＪＯＬＩＯＴら、ＣｕｒｒＢｉｏｌ，８，８５６−８６３，（１９９８）；ＭＡＩＺＥＬら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２６，３１８３−３１９０，（１９９９）］。この配列は、その構造及び分子での位置に関して、シグナルペプチド型の従来の分泌配列と異なる。
【００１１】
したがって、発明者らは、この核輸出配列が、全Ｅｎｇｒａｉｌｅｄタンパク質の状況外で機能的であるかどうかを調べた。この目的をもって、導入ドメイン（ペネトラチン、この場合ｐＡｎｔｐペプチドの第三ヘリックスからなる）のみからなるペプチドと、この導入ドメインの他にＥｎｇｒａｉｌｅｄタンパク質の核輸出配列を含むペプチド（ＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔ）の透過ならびに細胞内分布の性質を比較した。３７℃で細胞に透過後、導入ドメインのみからなるペプチドは、核に、また拡散して細胞質に位置しているが、核輸出配列も含むペプチドは主に細胞質の小胞区画に位置していることが認められた。４℃で細胞に透過後、導入ドメインのみからなるペプチド、またそれに加えて核輸出配列も含むペプチドは、依然として核に位置していた。細胞を３７℃に導くと、導入ドメインと核輸出配列からなるペプチドが、小胞区画に入り、エネルギー依存性の核輸出メカニズムを反映することが認められる。
【００１２】
また、発明者らは、核輸出配列の添加が、ペネトラチンの小胞区画との相互作用能を変えるかどうかも研究した。この目的で、２つのペプチドのそれぞれを精製膜画分とインキュベートし、トリプシンで処理した。次いで、導入ドメインのみを含むペプチド（ペネトラチン）はトリプシンによってほぼ完全に分解されるが、導入ドメインと核輸出配列からなるペプチド（ＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔ）はトリプシンの作用に対して保護されることが観察された。同一の分画及び保護実験を、生細胞による内面化後に行った；ペネトラチンの分解とＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドの保護も観察された。膜とインキュベートしたペネトラチンのみが保護されないという事実は、核輸出配列の役割が核からの退出に限定されないが、槽内区画へのペプチドの接近と該区画でのその蓄積を可能にすることを示唆している。
【００１３】
小胞区画への通過がペプチドの有効な外面化を生じるかどうか、またこの外面化が密着結合した上皮を介した通過を促進できるかどうかを決定するため、発明者らは、密着結合した上皮を再生する、細胞層で被覆された微小孔膜によって分離される２つの区画からなる実験モデルを用いた。区画の１つは、細胞の先端極と接触しており、他方は側底極と接触している。この結果、導入ドメインのみからなるペネトラチンペプチドが側底区画に加えられると、細胞へのこのペプチドの進入が、先端区画への通過には少量であるが、認められることが分かった。同一ペプチドを先端区画に加えると、それも細胞に進入する；他方、側底区画への通過は認められない。
【００１４】
同一の実験を、ＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドの場合に行った；側底区画から先端区画への通過は極めて増大されるが、先端区画から側底区画への通過はわずかに残っているか、又は存在しない。
さらに、発明者らは、４℃と３７℃で２つの区画の一方又は他方にあるペネトラチンとＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドの進入と退出を比較した。これらのペプチドの一方又は他方の進入は４℃と３７℃で起こるが、ＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔの退出は４℃で阻害されることが認められ、進入と退出のメカニズムは異なることが確認された。
【００１５】
したがって、導入ドメインと核輸出配列との組み合わせは、側底／先端方向に密着結合した上皮を介する輸送効率を増大させると思われる。
本発明の対象は、密着結合した上皮、特に血液−脳関門ならびに脈絡膜叢を介する対象分子の輸送用ベクターとしての、導入ドメインを構成する少なくとも１つのアミノ酸配列及び核輸出配列を構成するアミノ酸配列からなるペプチドの使用である。
【００１６】
特に、本発明の対象は、密着結合した上皮、特に血液−脳関門ならびに脈絡膜叢を介する診断上又は治療上の対象分子の輸送用ベクターを製造するための、導入ドメインを構成する少なくとも１つのアミノ酸配列及び核輸出配列を構成する少なくとも１つのアミノ酸配列の使用である。
本発明の実施に使用できる導入ドメインは、それ自体公知であり、特に上記の先行技術の文献に記載されている。
導入ドメインは、核局在配列（ＮＬＳ）からなってもよく、又はそれからなっていなくてもよい。
【００１７】
「核局在配列」は、導入ドメインでの存在時、細胞への進入後に核へのその接近を可能にする配列として定義される。
核局在配列からなる導入ドメインを構成するペプチドの非限定的な一例として、特に以下が挙げられる：
（ｉ）ＨＩＶ１Ｔａｔタンパク質のフラグメント４８〜６０からなるペプチド；
（ｉｉ）ＮＦｋＢのＮＬＳとＫ−ＦＧＦのシグナルペプチド間の融合物；
（ｉｉｉ）ＳＶ４０Ｔ抗原のＮＬＳとＫ−ＦＧＦのシグナルペプチド間の融合物；
（ｉｖ）ペネトラチン。
【００１８】
核局在配列を含まない導入ドメインを構成するペプチドの非限定的な一例として、特に以下が挙げられる：
（ｉ）両親媒性ペプチドＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）；
（ｉｉ）ペネトラチンのある変異体［ＤＥＲＯＳＳＩら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１８１８８−１８１９３，（１９９６）］。
導入ドメインが核局在配列を含まない時、望ましくは、異種核局在配列と任意に組み合わさっていてもよい。
「核輸出配列」（ＮＥＳ）の表現は、細胞核を残し、分泌区画に進入させる能力を該配列からなるペプチドに付与し得るいずれかのペプチド配列を意味することを意図する。
【００１９】
それ自体公知の核輸出配列は、この発明の実施に使用できる。３タイプの核輸出配列が現在記載されている（論評には、例えばＮＡＫＩＥＬＮＹ及びＤＲＥＹＦＵＳＳ，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ９，４２０−４２９，１９９７参照）：ホメオドメインタンパク質であるものに含まれる、多数のタンパク質に存在する、大きな割合の脂肪族疎水性アミノ酸（ロイシン又はイソロイシン、ならびにバリン又はアラニン）からなる約１０アミノ酸の配列である、「ロイシン−リッチ」な核輸出配列；ｈｎＲＮＰＡ１のＭ９配列［ＭＩＣＨＡＥＬら、Ｃｅｌｌ，８３，４１５−４２２，（１９９５）］；ｈｎＲＮＰＫのＫＮＳ（「ｈｎＲＮＰＫ核シャトル（ｎｕｃｌｅａｒｓｈｕｔｔｌｉｎｇ）ドメイン」）配列［ＭＩＣＨＡＥＬら、ＥＭＢＯＪ．，１６，３５８７−３５９８，（１９９７）］。
【００２０】
この発明の好ましい具体例によれば、ロイシン−リッチな核輸出配列、特にホメオドメインタンパク質の核輸出配列が利用される。本発明の実施に特に使用できるホメオドメインタンパク質の核輸出配列は、これらのタンパク質において第三ヘリックスのＮ末端に位置するか、又は部分的にそれを覆う約１０〜１５アミノ酸の配列である。一例として、少なくともＡＱＥＬＧＬＮＥＳＱＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）の配列（１−文字コード）、有利には少なくともＳＬＡＱＥＬＧＬＮＥＲＱＩＫＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）の配列（１−文字コード）からなる「Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ」タンパク質の核輸出配列を利用してもよい。
【００２１】
核輸出配列と導入ドメインは、直接隣合って、別のアミノ酸配列で分離されて、又は少なくとも部分的に重複していてもよい。
この発明は、密着結合した上皮、特に血液−脳関門を介して、輸送可能な診断上又は治療上の対象分子を、ホメオドメインタンパク質を含む導入ペプチドによって生細胞に輸送するのに使用できる。つまり、それは、特に抗腫瘍剤として使用される核酸、ポリペプチド、ペプチド／核酸又はヌクレオチド類似体の輸送に使用することができる。
【００２２】
この発明の実施のため、被輸送分子は、結合が導入ドメイン又は核輸出配列の機能性を変えない条件で、ベクターペプチド上のいずれかに結合できる。分子は、例えば導入ドメインと核輸出配列間のペプチドのＮ−末端、Ｃ−末端又は内部に結合できる。
被輸送分子とベクターペプチドとの結合は、導入ペプチドへの結合に使用されるのと同一の方法を用いて、直接あるいはリンカーを介して行うことができる。種々の適当な方法がそれ自体知られており、特に上記の先行技術の文献に記載されている。
この発明は、密着結合した上皮を介する導入ドメインと核輸出ドメインからなるペプチドの通過を例示する非限定的な例に言及する、以下のさらなる記載から、さらに明らかに理解されるであろう。
【００２３】
実施例１：ｐＡＮＴＰペプチドの導入ドメインとＥＮＧＲＡＩＬＥＤタンパク質の核輸出配列からなるペプチドの細胞内位置
以下のビオチニル化ペプチドを合成する：
Ｂｉｏｔ−ＱＳＬＡＱＥＬＧＬＮＥＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＣＯＯＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）
このペプチド（以降、ＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔとして言及）は、部分的に重複した、ＥＮＧＲＡＩＬＥＤタンパク質の核輸出配列を含む配列：
ＱＳＬＡＱＥＬＧＬＮＥＲＱＩＫＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）
とｐＡｎｔｐペプチド（ドロソフィリア・アンテナペディアのタンパク質のホメオドメイン）の第三ヘリックスからなるペネトラチン配列：
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）
を含む。
【００２４】
アミノペンタノンのアーム（ａｒｍ）腕を介して結合するビオチンで、そのＮ−末端をラベルする。
対照として、ペネトラチン配列のみからなるビオチニル化ペプチド：
Ｂｉｏｔ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＣＯＯＨ（以降、Ｐｅｎｅｔ−１とする）
も合成した。
２ペプチドそれぞれを、３７℃で１時間懸濁液中のラットの胚脳細胞（Ｅ１７、１０^７細胞／ｍｌ）と１０μＭの濃度でインキュベートした。
細胞を溶解し、以下のプロトコルにしたがって分画した：
【００２５】
細胞を、プロテアーゼインヒビターのカクテルを含む２００μｌの１０ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液、３ｍＭＭｇＣｌ_２、ｐＨ７に溶解する。溶解は、１ｍｌシリンジに取付けたＧ２６ニードルをとおして１０回細胞を前後に押して行う。
０．２５Ｍと１．７Ｍの不連続のシュクロースクッションをとおして抽出物を遠心分離（１時間、１５００００ｇ、４℃）した後、核をペレットに回収し、膜画分を０．２５Ｍ／１．７Ｍ界面に回収する。
これらの各画分の一部を以下のプロトコルにしたがってトリプシンで処理した：１００μｇ／ｍｌトリプシンの存在下で４℃で１時間リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中でインキュベーション；１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を５分１００℃で加えて、反応を止める。
【００２６】
トリプシンで処理していないか又は処理した画分を、ＳＤＳの存在下、２２％ポリアクリルアミドゲルで変性条件下に電気泳動して分析した。
Ｐｅｎｅｔ−１及びＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔのペプチドを、ＤＥＲＯＳＳＩら［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１８１８８−１８１９３，（１９９６）］により記載されるプロトコルにしたがってストレプトアビジン−ペルオキシダーゼで顕在化した。
結果を図１に示す。
トリプシン未処理（−）では、Ｐｅｎｅｔ−１及びＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドが、核画分（核）及び膜画分（Ｍｂ）と結合することが認められる。
トリプシン処理（＋）は、核画分と膜画分でＰｅｎｅｔ−１ペプチドの分解を誘導する。他方、ＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドの場合、膜画分に分解は認められず、分解に対する部分的な保護が核画分に認められる。この保護は、核周囲膜でのこの画分のわずかな汚染をおそらく反映している。
【００２７】
実験の第二系列では、培養中の細胞を溶解し、上記プロトコルにしたがって、ペプチドと事前にインキュベーションすることなく、膜画分を精製した。
２つのペプチドＰｅｎｅｔ−１及びＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔそれぞれは、３７℃で１時間１０^７個のニューロン由来の膜画分の調製物（上記）と１０μＭの濃度でインキュベートし、次いで上記のプロトコルにしたがってトリプシンで処理した。
インキュベート後、ペプチド／膜調製混合物を、上記プロトコルにしたがってトリプシンで処理した。
同時に、２つのペプチドＰｅｎｅｔ−１及びＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔのそれぞれを、膜調製物と事前にインキュベーションすることなく、同一条件下、トリプシンで処理した。
【００２８】
トリプシン溶解物を、上記のように電気泳動により分析した。
結果を図２に示す。
膜調製物（Ａ）とのインキュベーションがなければ、Ｐｅｎｅｔ−１及びＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドの全体的な分解が、トリプシン処理（＋）後に認められる。
膜調製物（Ｂ）とのインキュベーション後、Ｐｅｎｅｔ−１ペプチドの部分的な保護（保護されるペプチド量については、３０％未満と評価できる）及びＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドの視覚上、全体的な保護が、トリプシン処理（＋）後に認められる。
これらの結果は、核の存在とは独立して、核輸出配列が膜内区画へのペプチドの接近、及び／又はこの区画でのその維持を促進することを示している。
【００２９】
実施例２：密着結合した上皮を介する、ｐＡＮＴＰペプチドの導入ドメインとＥＮＧＲＡＩＬＥＤタンパク質の核輸出配列からなるペプチドの通過
密着結合した上皮を介するＰｅｎｅｔ及びＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドの通過は、図３に示す装置（ＴＲＡＮＳＷＥＬＬシステム、ＣＯＲＮＩＮＧ−ＣＯＳＴＡＲ）を用いて評価した。
この装置は、微小孔ポリエステル膜（３）によって分離される２つの区画（１、２）からなり、そこでＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ−ＤａｒｂｙＣａｎｉｎｅＫｉｄｎｅｙ）細胞からなる上皮（４）がつくられる。細胞を播種し、集密するまで成長させる。
【００３０】
微小孔膜及び細胞の側底極と接触した区画（１）を、側底区画とする。細胞の先端極と接触した区画（２）を、先端区画とする。
各区画を、プロテアーゼインヒビター混合物を補充した、以下からなる培地で満たす：Ｅａｒｌｅ塩を有する最少必須培地（ＭＥＭ）、２ｍＭグルタミン、２ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７、５Ｕ／ｍｌペニシリン、５μｇ／ｍｌストレプトマイシン。
各実験について、密着結合の完全性を、２つの区画間の抵抗を測定して制御する（Ｒ＞２０００Ω／ｃｍ^２）。
さらに、上皮の堅牢性を、先端区画又は側底区画のいずれかにトリチュレート化イヌリン（６．５×１０^５ｃｐｍ／区画）を加え、１８０分後に他の区画中の放射活性を測定することによっても確認した。これらの条件下、トリチュレート化イヌリンの通過は、先端／側底方向あるいは側底／先端方向のいずれでも認められなかった。
【００３１】
ビオチニル化Ｐｅｎｅｔ−１ペプチド又はビオチニル化ＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチド（それぞれ１０μＭ濃度で用いられる）を、先端区画又は側底区画に置く。他の区画は、ビオチニル化ペプチドの捕捉を可能にするストレプトアビジンを、１０μＭの濃度で含む。３７℃又は４℃で３０分インキュベーション後、出発区画中の培地と最終区画中の培地を標本にする。
ペプチドを、１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加えて沈降させ、沸騰ラエムリ培地に溶解する。細胞を０．５ＭＮａＣｌ溶液ですすぎ、次いで沸騰ラエムリ培地に溶解する。開始区画、最終区画又は細胞内のＰｅｎｅｔ−１又はＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドの有無を、上記実施例１に示すようにストレプトアビジン−ペルオキシダーゼで顕在化して検出する。
【００３２】
結果を図４Ａと４Ｂに示す。
図４Ａは、開始区画が側底区画である時、３０分インキュベートした後のＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔ及びＰｅｎｅｔ−１ペプチドの電気泳動分析を示す。３７℃ （左パネル）で、細胞への２つのペプチドの透過と極めて少量のＰｅｎｅｔ−１ペプチドの先端区画への通過が認められる；他方、先端区画へのＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドの通過は、極めて大きい。通過が、ペプチドの分解を全く伴わないことも観察される。４℃（右パネル）で、細胞への２つのペプチドの透過も観察される；他方、２つのペプチドは、いずれも先端区画には通過しない。
図４Ｂは、開始区画が先端区画である時、３０分インキュベートした後のＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔ及びＰｅｎｅｔ−１ペプチドの電気泳動分析を示す。３７℃で、４℃でのように、２つのペプチドの細胞への透過が認められるが、側底区画への通過は認められない。
【００３３】
同一実験を開始区画中１０％濃度のウシ血清の存在下で行うと、同一の結果が認められ、これは、通過が血清成分によって阻害されないことを示している。
これらの結果は、２つのペプチドは上皮の２つの面で内在化されるが、核輸出配列の存在は上皮を介するＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドの通過を実質的に増すこと、及びこの通過は分極化され、側底／先端方向にのみ生じることを立証している。
さらに、温度は、進入には影響しない（４℃と３７℃で生じる）が、退出は温度依存性であり（４℃で阻害される）、これは、これらの２つの現象が異なる過程に対応していることを示している。
【００３４】
実験の別系列で、ゴルジ体の関与するタンパク質分泌を阻害するブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）のＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドの通過に対する作用を研究した。
ビオチニル化ＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチド（１０μＭ）を、ブレフェルジンＡ（１０ μＭ）の存在下又は不在下、４℃又は３７℃で１時間上記の条件下、側底区画でインキュベートした。
インキュベーションの最後に、側底区画と先端区画の内容物ならびに細胞の内容物を上記のように分析し、ＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドの存在を検出した。
【００３５】
結果を図５に示す。
これらの結果から、ＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドは４℃（左パネル）で進入するが、ブレフェルジンＡの存在下（＋）又は不在下（−）であろうと、この温度では再退出しないことが確認される。他方、３７℃（右パネル）では、ＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドの退出が、ブレフェルジンＡの存在下（＋）又は不在下（−）で認められる。
これらの結果は、ＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドによる上皮の横断は、ゴルジ体を介した通過を伴わないことを示している。
【００３６】
実施例３：血液−脳関門を介するＮＥＳ−ＰＥＮＥＴのインビボ通過
ビオチニル化ＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチド（５０μｇ／ＰＢＳ５０μｌ）又はＰＢＳ（５０μｌ）を、マウスの尾部静脈に注入する；このマウスを、注射から１時間後に殺す。脳を除き、４％パラホルムアルデヒドで固定し、２０％シュクロースを含むＰＢＳ溶液中４℃で一晩浸漬して凍結防止した。脳の前面切片（１０μＭ厚）を次いでクリオスタットで切断する。次いで、ストレプトアビジン−フルオレセイン複合体を用いてこれらの切片にペプチドを顕在化し、共焦顕微鏡で次いで蛍光発光を分析する。
結果を図６に示す（Ａ：ＰＢＳ；Ｂ：ＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチド）。これらの結果は、ビオチニル化ＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドは、極めて有意に血液−脳関門を横切り、皮質及び皮質下の領域に達することを示している。
【００３７】
実施例４：種々のタイプの導入ドメインを含むペプチドの細胞下局在と経上皮通過に対する核輸出配列の影響
上記のＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドの細胞内局在化と密着結合した上皮を介する横断を、実施例１に記載されるＥｎｇｒａｉｌｅｄタンパク質の核輸出配列からなるペプチド（以降、ＮＥＳ−Ｐｅｎ３Ｐとする）、及びＡｎｔｐホメオドメインの４５、５０及び５５位置にそれぞれ位置するＩｌｅ、Ｇｌｎ及びＬｙｓ残基を３個のプロリン残基で置換することによる、ｐＡｎｔｐペプチドの第三ヘリックス由来のペネトラチン配列（以降、Ｐｅｎ３Ｐとする）のそれらと比較した。Ｐｅｎ３Ｐペプチドは細胞に透過するが、核には透過しない。当初ＤＥＲＯＳＳＩら［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，３０，１８１８８−１８１９３，（１９９６）］に記載されたＰｅｎ３Ｐ配列は、ＲＱＰＫＩＷＦＰＮＲＲＫＰＷＫＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）である。
【００３８】
ビオチニル化ＮＥＳ−Ｐｅｎ３Ｐペプチドの配列は、以下のとおりである：
Ｂｉｏｔ−ＱＳＬＡＱＥＬＧＬＮＥＲＱＰＫＩＷＦＰＮＲＲＫＰＷＫＫ−ＣＯＯＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）。
ビオチニル化したＰｅｎｅｔ、ＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔ、Ｐｅｎ３Ｐ及びＮＥＳ−Ｐｅｎ３Ｐのペプチドを、１００μＭの濃度でＭＤＣＫ細胞の培養物に加える。４℃で２時間インキュベーション後、０．５Ｍ濃度でＮａＣｌを含む４℃に予備冷却した培地で細胞をすすぐ；次いで、それらを４％パラホルムアルデヒド溶液で固定する（環境温度で５分）か、あるいはパラホルムアルデヒドで固定する前に、３０分無ペプチドの培養培地で３７℃でチェイス（ｃｈａｓｅ）に付す。次いで、メタノールを用いてそれらを−２０℃で５分浸透させ、５％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ中で１時間予備インキュベートする。ペプチドを、ストレプトアビジン−フルオレセイン複合体を用いて顕在化する。次に、蛍光発光を、共焦顕微鏡により分析する。
【００３９】
Ｐｅｎｅｔペプチドは４℃で進入する；この温度では、細胞質標識が拡散し、３７℃に移した後に弱化する強力な核標識が認められる。
ＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドは４℃で進入するこの温度では、顕著な細胞質又は核の局在化のない標識の拡散が認められる。３７℃に移した後、細胞質内小胞との標識の強い結合（実施例２参照）が認められる。これは、おそらく先立っていないゴルジ−分泌区画（ｎｏｎ−ｐｏｓｔ−ｇｏｌｇｉａｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）に対応する、
Ｐｅｎ３Ｐペプチドは４℃で進入する；ＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドの場合のように、細胞質及び核の標識の拡散がこの温度で認められる。他方、ＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドとは異なって、この標識は３７℃で修飾されない。
【００４０】
ＮＥＳ−Ｐｅｎ３Ｐペプチドは、４℃で進入する；ＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドの場合のように、細胞質及び核の標識の拡散がこの温度で認められる。３７℃では、ＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔで観察されたものと同様に、細胞質内小胞との標識の強い結合が認められる。
さらに、密着結合した上皮を介するペプチドの通過を、上記実施例２に記載の装置を用いて評価した。
ビオチニル化ペプチド（１０μＭ）を、３７℃で３０分上記の条件下、側底区画でインキュベートする。インキュベーションの最後に、側底区画と先端区画の内容物ならびに細胞の内容物を、実施例２に記載のように分析する。
【００４１】
細胞へのＰｅｎ３Ｐ及びＮＥＳ−Ｐｅｎ３Ｐペプチドの透過、ならびに先端区画へのごくわずかなＰｅｎｅｔ３Ｐペプチドの通過が認められる；他方、先端区画へのＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔ３Ｐペプチドの通過は、かなり大きい。
これらの結果は、分泌区画への方向付けと、密着結合した上皮を介する通過が、ペプチドの核への方向付けを事前に要求しないことを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】
トリプシン未処理（−）では、Ｐｅｎｅｔ−１及びＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドが、核画分（核）及び膜画分（Ｍｂ）と結合することが認められる。
トリプシン処理（＋）は、核画分と膜画分でＰｅｎｅｔ−１ペプチドの分解を誘導する。
【図２】
膜調製物（Ａ）とのインキュベーションがなければ、Ｐｅｎｅｔ−１及びＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドの全体的な分解が、トリプシン処理（＋）後に認められる。
膜調製物（Ｂ）とのインキュベーション後、Ｐｅｎｅｔ−１ペプチドの部分的な保護（保護されるペプチド量については、３０％未満と評価できる）及びＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドの視覚上、全体的な保護が、トリプシン処理（＋）後に認められる。
【図３】
この装置は、微小孔ポリエステル膜（３）によって分離される２つの区画（１、２）からなり、そこでＭＤＣＫ細胞からなる上皮（４）がつくられる。
【図４】
図４Ａは、開始区画が側底区画である時、３０分インキュベートした後のＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔ及びＰｅｎｅｔ−１ペプチドの電気泳動分析を示す。図４Ｂは、開始区画が先端区画である時、３０分インキュベートした後のＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔ及びＰｅｎｅｔ−１ペプチドの電気泳動分析を示す。
【図５】
これらの結果から、ＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドは４℃（左パネル）で進入するが、ブレフェルジンＡの存在下（＋）又は不在下（−）であろうと、この温度では再退出しないことが確認される。他方、３７℃（右パネル）では、ＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドの退出が、ブレフェルジンＡの存在下（＋）又は不在下（−）で認められる。
【図６】
これらの結果は、ビオチニル化ＮＥＳ−Ｐｅｎｅｔペプチドは、極めて有意に血液−脳関門を横切り、皮質及び皮質下の領域に達することを示している。

Claims

密着結合した上皮を介する診断上又は治療上の対象分子の輸送用ベクターを製造するための、導入ドメインを構成する少なくとも１つのアミノ酸配列及び核輸出配列を構成するアミノ酸配列からなるペプチドの使用
密着結合した上皮が、血液−脳関門又は脈絡膜叢であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
導入ドメインが、
− ホメオドメインの第三ヘリックス由来の導入ドメイン；
− ＨＩＶ１Ｔａｔタンパク質由来の導入ドメイン；
− ＨＳＶＶＰ２２タンパク質由来の導入ドメイン；
− シグナル配列由来の導入ドメイン；
− 輸送体の導入ドメイン
から選択されることを特徴とする請求項１及び２のいずれか１つに記載の使用。
ロイシン−リッチな核輸出配列が使用されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載の使用。
核輸出配列が、ホメオドメインタンパク質の核輸出配列であることを特徴とする請求項４に記載の使用。
核輸出配列が、少なくともペプチド配列ＡＱＥＬＧＬＮＥＳＱＩからなることを特徴とする請求項５に記載の使用。
核輸出配列が、少なくともペプチド配列ＳＬＡＱＥＬＧＬＮＥＲＱＩＫＩからなることを特徴とする請求項６に記載の使用。
輸送される診断上又は治療上の対象分子が、核酸、ポリペプチド、ペプチド／核酸及びヌクレオチド類似体から選択されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１つに記載の使用。