JP2004508349A - 調節されたアミン基密度と空間を提供する分子層を表面に含む基質及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明はバイオチップ等に有益な基板に関し、アミンの面密度が低い分子層を備えていて、カルボキシ酸を有するＮ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄとして表される化学式（１）の化合物を提供し、基板に備わる表面が有する分子層を作る反応は基板のアミノシリル化表面のアミン基と化学式（１）で表され錐形になっている化合物とで行われ、その製造方法も提供する。

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はバイオチップ等の基質として用いることができる低密度アミン基を含有する分子層を表面に含む基質に関し、特に低密度アミン基を含有する分子層を形成するための化合物及びその製造方法とその化合物を利用して製造される低密度アミン基を含有する分子層を表面に含む基質及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
基質表面のシラン化、特にアミノシラン化は酵素、抗体のような生体分子の固定化、無機触媒の固定化、電極の改質、クロマトグラフィ及びイオン性高分子、非線形光学的発色団、フラーレン、ポルフィリン、遷移金属着物並びに無機コロイド性粒子を含有する様々な形態の分子の自己組織化用ビルディングファンデーション形成などの多くの分野に適用されている。
【０００３】
基質表面に形成されたアミノシラン分子層の化学的物理的性質は非常に重要であるが、これは固定化されたり自己組織化される分子の形態及び表面密度に影響を与え、最終的に形成された機能性薄膜の構造及び性質を決定する因子であるためである。
【０００４】
一方、現在まで知られたことによれば、固体支持体の表面にアミン基を形成する時のアミン基の個数は１００Å^２当り１乃至１０個である。表面にアミン基を有する固体基質はＤＮＡチップやバイオチップを製造する基板として使用が可能である。しかし、表面に１００Å^２当り１乃至１０個のアミン密度を有する基質は表面にＤＮＡオリゴヌクレオチドを付けたり効果が異なるバイオ分子を固定させる時、分子間の立体障害が大きいため良好に固定できない。また、ＤＮＡチップの場合には表面に固定された単一鎖ＤＮＡの混成化が円滑に進められてチップの効率が高まるので、表面に固定させた単一鎖ＤＮＡ間の距離が相当な間隔を維持しなければならない。
【０００５】
このためにターロヴなど（Ｔａｒｌｏｖ ｅｔ ａｌ．）は表面反応に要求される自己組織化分子の濃度を低くすることによって密度を調節した研究結果を報告した（Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２０，　 ９７８７（１９９８））。しかし、このような方法は表面の直接的な改質でない濃度による間接的な改質であり、作用基がある分子同士凝集する現象も起こることがあるため分布が不均一である。つまり、単一鎖ＤＮＡ間の距離を均一に調節するのは難しいという短所がある。したがって、混成化効率と濃度の最適条件を探すことが重要である。また、一定の濃度以上の単一鎖ＤＮＡの導入が難しいことが短所として指摘される。
【０００６】
他の例として、オカハタなど（Ｏｋａｈａｔａ ｅｔ ａｌ．）はビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）とアビジン（Ａｖｉｄｉｎ）の結合を利用して表面にＤＮＡを導入した（Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２０， ８５３７（１９９８））。これらはまず、ＱＣＭ（Ｑｕａｒｔｚ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ）表面に金を蒸着した後、チオールとアビジンを作用基として有するスペーサ（隔離部材）を合成し、末端にビオチンを有する単一鎖ＤＮＡを導入した。この方法において、信号は混成化が進められることによって変わるＱＣＭの周波数である。しかし、この方法も表面の直接的な構造調節でなく、間接的なビオチン−アビジンの結合を利用したものであり、ＱＣＭを利用するために多様な制約を伴うことが短所である。ＤＮＡだけでなく蛋白質の場合においても螺旋構造を構成するためには余裕空間が必要である。
【０００７】
ホワイトセルなど（Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）はアミノトリチオール（ａｍｉｎｏｔｒｉｔｈｉｏｌ）を金の表面に単一層として積載しポリアラニン（ｐｏｌｙａｌａｎｉｎｅ）が螺旋構造を構成できるようにした。また、ポリフェニル−アラニン（ｐｏｌｙｐｈｅｎｙｌ−ａｌａｎｉｎｅ）の場合、単一層としては空間が不足で、螺旋構造を構成できないので二重に積層して余裕空間をさらにひろめて螺旋構造を構成するようにした（Ｓｃｉｎｅｃｅ ２６１， ７３（１９９３））。表面を直接変形して蛋白質を導入したこの方法はＤＮＡの場合にも適用が可能であるように見えるが、蛋白質の二重螺旋よりＤＮＡの二重螺旋がさらに大きい直径（Ａ型は２５．５Åであり、Ｂ型は２３．７Å）を有するのでここで利用したものよりもさらに大きなデンドリマーを表面に導入しなければならない。また、ここで利用したデンドリマーは硫黄が導入されていて金の表面にだけ適用できる限界がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は前記従来の技術の問題点を考慮して、低密度のアミン基を含有する分子層を表面に含む基質を製造する時、有用な化合物及びその製造方法を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明の他の目的は、アミン基の密度が低くてもアミン基間の距離が一定になった分子層を表面に含む基質及びその製造方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の更に他の目的は、多重イオン結合により一層安定な形態の分子薄膜を基質表面に形成する方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の更に他の目的は、表面上にアミン基の密度が低くてアミン基間の距離が一定になった分子層を表面に含有していて、基質表面に所望の分子を固定するのが容易な基質及びその製造方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の更に他の目的は、ＤＮＡチップやバイオチップを開発するのに有用であり、基質表面に所望の分子を固定し、これらの性質を明らかにする表面研究に使用できる基質及びその製造方法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は前記目的を達成するために、下記の化学式（１）で表示される化合物を提供する。
【化１０】

前記式において、Ｒはフェニル（ｐｈｅｎｙｌ）であるか、ニトロ（ｎｉｔｒｏ）基、ハロゲン（ｈａｌｏｇｅｎ）、またはシアノ（ｃｙａｎｏ）基に置換されたフェニル（ｐｈｅｎｙｌ）、ナフチル（ｎａｐｈｔｙｌ）、またはアントリル（ａｎｔｈｒｙｌ）である。
【００１４】
また、本発明は前記化学式（１）で表示されるカルボキシ酸を有する誘導体の製造方法において、
ａ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとアクリロニトリルをシアノエチレーション反応させてトリス［（シアノエトキシ）メチル］アミノメタンを製造する段階と、
ｂ）前記トリス［（シアノエトキシ）メチル］アミノメタンに濃い塩酸溶液を加え、還流させてトリス［（カルボキシエトキシ）エチル］メチル］アミノメタンを製造する段階と、
ｃ）前記トリス［（カルボキシエトキシ）エチル］メチル］アミノメタンにメタノールの添加でエステル化反応させ、トリス［（（メトキシカルボニル）エトキシ）メチル］アミノメタンを製造する段階と、
ｄ）前記トリス［（（メトキシカルボニル）エトキシ）メチル］アミノメタンに下記の化学式（２）で表示される化合物を加えるプロテクティング（保護）反応によって下記の化学式（３）で表示される化合物を製造する段階
ＲＯＣＯＣｌ　　　　　　（２）
（前記式において、Ｒはフェニルであるか、ニトロ基、ハロゲン、またはシアノ基に置換されたフェニル、ナフチル、またはアントリル）
と、
【化１１】

（前記式において、Ｒはフェニルであるか、ニトロ基、ハロゲン、またはシアノ基に置換されたフェニル、ナフチル、またはアントリル）
と、
ｅ）前記化学式（３）で表示される化合物に水酸化ナトリウム溶液を加え、加水分解させて下記の化学式（４）で表示される化合物を製造する段階
【化１２】

（前記式において、Ｒはフェニルであるか、ニトロ基、ハロゲン、またはシアノ基に置換されたフェニル、ナフチル、またはアントリル）
と、
ｆ）前記化学式（４）で表示される化合物とトリス［（（メトキシカルボニル）エトキシ）メチル］アミノメタンをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）に溶かし、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ；ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ；ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）を添加し反応させ、下記の化学式（５）で表示される化合物を製造する段階
【化１３】

（前記式において、Ｒはフェニルであるか、ニトロ基、ハロゲン、またはシアノ基に置換されたフェニル、ナフチル、またはアントリル）
と、
ｇ）前記化学式（５）で表示される化合物に水酸化ナトリウム溶液を加えて加水分解させ、前記化学式１で表示される化合物を製造する段階と、を含む化学式（１）で表示される化合物の製造方法を提供する。
【００１５】
また、本発明はアミノシラン化された基質表面のアミン基と三角錐形態の前記化学式（１）で表示されるカルボキシ酸を有する誘導体化合物を反応させて製造される分子層を表面に含む基質を提供する。
【００１６】
また、本発明は調節されたアミン基密度と空間を含有する分子層を表面に含む基質の製造方法において、
ａ）アミノシランの分子層を表面に含む基質を提供する段階と、
ｂ）前記分子層に含まれているアミン基をカルボキシ酸を有する誘導体と反応させる段階と、を含む基質の製造方法を提供する。
【００１７】
また、前記ｂ）段階の誘導体は末端にカルボキシ酸及びアミン作用基を同時に含むのが好ましく、前記誘導体が前記化学式（１）で表示される化合物がさらに好ましい。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明はアミン作用基間の距離が相当にあって、一定の分子層を基質上に形成される基質を提供するために、アミノシラン化された基質表面層のアミン基とカルボキシ酸を有する誘導体とを反応させて基質を製造する。特に、一定の間隔のアミン基を有する分子層の形成のために分子量が一定の前記化学式（１）の高分子誘導体を合成して使用するが、この高分子は１個のアミン基と９個のカルボキシ酸作用基を有する三角錐形態のハイパーブランチ分子である。言い換えれば、本発明はアミノシラン化された基質表面のアミン基と三角錐形態を有する高分子である化学式（１）の化合物を反応させて基質表面上にアミン基の密度が低くてその距離が一定である分子層を形成できるようにしたものである。
【００１９】
このために本発明は、前記化学式（１）で示す化合物を製造する。合成される前記化学式（１）の化合物のＲはフェニル（ｐｈｅｎｙｌ）であるか、ニトロ基（ｎｉｔｒｏ）、ハロゲン（ｈａｌｏｇｅｎ）、またはシアノ基（ｃｙａｎｏ）に置換されたフェニル（ｐｈｅｎｙｌ）、ナフチル（ｎａｐｈｔｈｙｌ）、またはアントリル（ａｎｔｈｒｙｌ）である。つまり、Ｒはベンゼン環のフェニルであるか、ベンゼン環の水素が各々、または同時に電子を惹きつける作用基に置換された２−ニトロベンジル、３−ニトロベンジル、４−ニトロベンジル、２−フルオロベンジル、３−フルオロベンジル、４−フルオロベンジル、２−クロロベンジル、３−クロロベンジル、４−クロロベンジル、２−臭素ベンジル、３−臭素ベンジル、４−臭素ベンジル、２−ヨードベンジル、３−ヨードベンジル、４−ヨードベンジル、２−シアノベンジル、３−シアノベンジル、４−シアノベンジルなどであってもよく、ベンゼン環が変形された１−ナフチル、２−ナフチルまたは９−アントリルなどであってもよい。
【００２０】
下記反応式（６）及び反応式（７）は前記化学式（１）の化合物を合成する方法を示す反応式である。
【化１４】

前記反応式（６）において、
ａはＣＨ_２＝ＣＨＣＮ、ＫＯＨ、ｐ−ジオキサンを加えて２５℃で４８時間反応させることであり、
ｂは濃い塩酸を加えて３時間還流（ｒｅｆｌｕｘ）させることであり、
ｃはＭｅＯＨを加えて２５℃で２４時間攪拌反応させることであり、
ｄは化学式（２）の化合物、ＮａＨＣＯ_３、Ｈ_２Ｏを加え、２５℃で１２時間反応させることであり、
ｅは１Ｎ ＮａＯＨを加えて２５℃で１２時間反応させることである。
【００２１】
【化１５】

【００２２】
前記反応式（７）において、ａはＤＣＣ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、及びＤＭＦを加え、２５℃で４８時間反応させることであり、ｂは１Ｎ ＮａＯＨを加えて２５℃で１２時間反応させることである。
【００２３】
前記化学式（１）の化合物の中で代表的な化学式（１）のＲがフェニルである下記の化学式（１ａ）で表示されるＮ−（ベンジルオキシカルボニル）−トリス［（（Ｎ’−（カルボニル）−トリス（（カルボキシエトキシ）メチル）メチルアミノ）エトキシ）メチル］アミノメタン（以下、Ｎ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄ）である。
【００２４】
【化１６】

【００２５】
以下では、前記化学式（１ａ）で表示されるＮ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄ化合物を中心にして説明する。化学式（１）の化合物の残りの化合物は化学式（１ａ）で表示されるＮ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄ化合物と原料選択にだけ差があって、同一な方法で製造することができ、その特性も基質表面上で同一な様相を示す。
【００２６】
本発明は基質表面に形成されるアミノシラン分子層のアミン基をＮ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄのような構造を有する化学式（１）で表示される化合物と反応させ、基質表面のアミン基密度を適切に減少させることができる。その中で、このようなＮ−ＣＢＺ−［１］ ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄは末端のアミン作用基がＣＢＺ（ｃａｒｂｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙ）で保護されている。
【００２７】
前記アミン作用基が保護されたＮ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄは表面反応途中にアミン作用基が他の分子から損傷されず、また、合成過程中に発生する副反応を最少化するための形態として考案された。ＣＢＺは脱保護が容易で、反応後、再び一次アミン作用基に戻すことができる。
【００２８】
前記化学式（１ａ）のＮ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄを合成することにおいて最も重要な部分である反復単位（ｒｅｐｅａｔｉｎｇ ｕｎｉｔ）は商業的に多く利用され、比較的に値段が安いトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）を基本として合成する。言及していない化学式（１）の残りの化合物を製造する時も同一である。
【００２９】
まず、ブルソン（Ｂｒｕｓｏｎ）の方法を利用してトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとアクリロニトリル（ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ）をシアノエチレーション（ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）反応させ、トリス［（シアノエトキシ）メチル］アミノメタンを合成する。合成に用いられるトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン及び水酸化カリウムは吸湿性が強いので真空下で充分に乾燥させて反応に使用しなければならず、水酸化カリウムの量が反応において重要な部分である。水酸化カリウムは反応に使用したトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの５乃至２０重量％まで多様に用い、そのうち１５重量％が最も適切である。水酸化カリウムの量があまり多ければアクリロニトリルの高分子化が増加し、量が少なければシアノエチレーション反応が進められない。反応が完了した後、^１３Ｃ ＮＭＲの１１８．５ｐｐｍで確認した結果、ニトリルの特徴的なピークが現れ、これはニューコム（Ｎｅｗｋｏｍｅ）などが合成した化合物のスペクトルと一致した。
【００３０】
合成されたトリス［（シアノエトキシ）メチル］アミノメタンは有機溶媒によく溶けるのでコラムクロマトグラフィで分離してもよいが、他の分離過程無しに濃い塩酸溶液で３時間程度還流させれば、トリス［（カルボキシエトキシ）メチル］アミノメタンが得られる。ニトリル作用基がカルボキシ酸に変わりながら副産物として塩化アンモニウムが塩の形態で多量に得られる。アセトンに溶かして塩化アンモニウム塩をろ過した後、減圧蒸留してから、^１３Ｃ ＮＭＲの１１８．５ｐｐｍで確認した結果、ニトリルの特徴的なピークがなくなり、その代りにカルボキシ酸の１７６．２ｐｐｍのピークが得られる。前記化合物トリス［（カルボキシエトキシ）メチル］アミノメタンを保護するために各種の保護試薬を使用してみたが、末端のカルボキシ酸がアミン作用基と水素結合していて反応が進められなかった。したがって、末端のカルボキシ酸もやはり保護する過程が要求される。
【００３１】
合成されたトリス［（カルボキシエトキシ）メチル］アミノメタンは酸性を帯びる油状の化合物であり、メタノールを添加するとエステル化反応が進行する。この方法によれば非常に簡単にトリス［（（メトキシカルボニル）エトキシ）メチル］アミノメタンが合成され、末端のカルボキシ酸が保護される。ニューコム等はこのような面倒なことをなくすためにトリス［（（メトキシカルボニル）エトキシ）メチル］アミノメタンをエタノールに入れて塩酸ガスを注入する方法を利用したが、収率が低く、塩酸ガスを使用するので主義を要する反応であった。これに反し、エステル化反応を利用した本発明の方法はガスを使用せずに塩酸溶液を利用するのでニューコムなどの方法より一層簡単で安全であり、収率も遥かに高かった。トリス［（（メトキシカルボニル）エトキシ）メチル］アミノメタンは^１３Ｃ ＮＭＲでエステルとメトキシ基に起因した各々１７６．２ｐｐｍ、５１．６ｐｐｍのピークが確認される。
【００３２】
デンドリマー製造のための反復単位はトリス［（（メトキシカルボニル）エトキシ）メチル］アミノメタンが利用され、コア単位はトリス［（（メトキシカルボニル）エトキシ）メチル］アミノメタンを保護して使用する。アミンを保護するためにジ−ｔ−ブチルジカーボネートとクロロ蟻酸ベンジルを使用した。２種類の試薬とも保護過程は容易に進められた。しかし、ジ−ｔ−ブチルジカーボネートを利用したＢＯＣ（ｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）基の場合、エステルをカルボキシ酸に変える過程で問題が発生することがある。
【００３３】
反応が完結された後、合成されたＮ−（ＢＯＣ）−トリス［（カルボキシエトキシ）メチル］アミノメタンを分離する過程で使用する希塩酸溶液でＢＯＣ基が壊れ、再びトリス［（カルボキシエトキシ）メチル］アミノメタンの形態に戻ってしまう。加水分解を防止するために塩酸を使用せずに水溶液状態でそのままＤＣＣ（Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）を利用してカップリングさせてみたが、反応が全く進められなかったので、ＢＯＣに関連した問題点を解決することができなかった。収率が低い理由としてはＤＣＣなどを利用するペプチド結合形成が水溶液では典型的に非常に低い収率を示す反応であるためと推測される。
【００３４】
クロロ蟻酸ベンジルを利用するＣＢＺはワークアップする時に用いられる塩酸に対して非常に安定で、反応が終わった後、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−トリス［（カルボキシエトキシ）メチル］アミノメタンを有機層として分離するのが容易である。Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−トリス［（カルボキシエトキシ）メチル］アミノメタンは^１３Ｃ ＮＭＲでＣＢＺに起因した１２８．７ｐｐｍ、１２８．２ｐｐｍ、及びカーバメート（ｃａｒｂａｍａｔｅ）に起因した１５５．２ｐｐｍなどのピークを示した。
【００３５】
Ｎ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄの合成で最も低い収率（３３．３％）を示したカップリングは４．５当量のトリス［（（メトキシカルボニル）エトキシ）メチル］アミノメタンとＮ−（ベンジルオキシカルボニル）−トリス［（カルボキシエトキシ）メチル］アミノメタンをＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）に溶かした後、各々３当量のＤＣＣ、ＨＯＢＴなどを添加して４８時間程度攪拌すればよい。反応が進められればＤＭＦに溶けないジシクロヘキシル尿素が発生する。
【００３６】
このように合成されたＮ−（ベンジルオキシカルボニル）−トリス［（（Ｎ’−（カルボニル）−トリス（（（メトキシカルボニル）エトキシ）メチル）メチルアミノ）エトキシ）メチル］アミノメタンは^１３Ｃ ＮＭＲでエステルとアミドに起因した１７２．３ｐｐｍ、１７１．３ｐｐｍの特徴的なピークを観察することができた。また、これらのサイズ比が１：３程度に現れた。そして、質量分析スペクトル（ＦＡＢ）の結果は分子量が１５５６（Ｍ^＋＋１）である所でＮ−（ベンジルオキシカルボニル）−トリス［（（Ｎ’−（カルボニル）−トリス（（（メトキシカルボニル）エトキシ）メチル）メチルアミノ）エトキシ）メチル］アミノメタンが合成された証拠となった。
【００３７】
Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−トリス［（（Ｎ’ −（カルボニル）−トリス（（（メトキシカルボニル）エトキシ）メチル）メチルアミノ）エトキシ）メチル］アミノメタンを１ＮのＮａＯＨ溶液で加水分解すれば、末端がカルボキシ酸になるＮ−（ベンジルオキシカルボニル）−トリス［（（Ｎ’−（カルボニル）−トリス（（カルボキシエトキシ）メチル）メチルアミノ）エトキシ）メチル］アミノメタンが得られる。Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−トリス［（（Ｎ’−（カルボニル）−トリス（（カルボキシエトキシ）メチル）メチルアミノ）エトキシ）メチル］アミノメタンの質量分析スペクトル結果、１４２９（Ｍ^＋）である所でピークが観察され、反応が進められたことが分かった。以外にも前記化合物の赤外線分光法と元素分析による結果を表１乃至６に示した。
【００３８】
【表１】

【００３９】
【表２】

【００４０】
【表３】

【００４１】
【表４】

【００４２】
【表５】

【００４３】
【表６】

【００４４】
以下、基質表面に調節されたアミン基密度を有する分子層を形成する方法について説明する。
【００４５】
本発明の化学式（１）の化合物は他の化合物の助けなく基質に自己組織化（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）されて付着できる。
【００４６】
まず、基質表面をきれいに洗浄した後、これを乾燥する。その後、乾燥された基質をアミノシラン化合物と溶媒からなった溶液に所定時間浸してアミノシラン化をさせる。ここで、アミノシラン化合物としては酸性の副産物を形成しない物質で、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−アミノプロピルエトキシジメチルシランなどがある。また、アミノシラン化合物を溶解するための溶媒としてトルエンを使用する。そして前記ベースとして用いられる基質は特に限定されず、シリコンウエハー、ガラス、シリカ、溶融シリカなどであってもよい。
【００４７】
アミノシラン化反応が完結されれば、基質を溶媒で洗浄した後、これを乾燥する。その後、表面がアミノシラン化された基質をＮ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄを含む溶媒に浸漬して不活性ガス雰囲気を維持する。反応時間は１２時間程度が適当で、室温で反応させる。
【００４８】
一方、Ｎ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄは末端のアミン作用基が保護されているのでアミン基を基質表面に露出されるようにするためには保護基を除去する過程が必要である。保護基の除去は基質を高純度トリフルオロ酢酸に浸漬した後、室温で超音波処理する過程が必要である。この後、脱保護過程が完結されれば基質表面を多量の溶媒、例えばメタノールで洗浄し、基質表面に物理的に吸着されたトリフルオロ酢酸及び分離ずみ保護基を除去する。
【００４９】
前記過程によって図１及び図２に示されたような分子層を有する基質が得られる。
【００５０】
図１を眺めると、Ｎ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄは末端のカルボキシ酸がアミノシラン化された基質表面のアミンとイオン結合で強く結合し、アミノシラン化された基質表面に強く吸着されている。この結合の安定性は図３に示した。広範囲なｐＨで安定性を示し、特に、中性のｐＨで相当に安定で分子薄膜の有用性が高い。そして、図２を見ると基質最上部表面上の保護されたアミン作用基群は全て一次アミンに変形されて大きな反応性を示す。
【００５１】
本発明によって得られる表面に適切なアミン基密度を有する固体基質はアミン作用基の密度が０．０５乃至０．３ａｍｉｎｅｓ／ｎｍ^２を示し、それぞれのアミン基は非常に均一に分布されており、これを利用してＤＮＡチップやバイオチップを製造するのに有利である。
【００５２】
したがって、本発明の固体基質はＤＮＡチップやバイオチップを開発するのに重要な機能を遂行できる。例えば、ＤＮＡチップはオリゴヌクレオチドを固体基質上部に固定させようとする時、基質表面に調節された個数のアミン基を有するならば導入される生分子相互間の立体障害が少ないため円滑に導入され、強く結合できる。これはチップの安定度を高めることができ、チップを製造する過程を一層容易に提供する。
【００５３】
また、バイオチップの場合のように酵素や他のバイオ分子群を固定させようとする時にも基質表面の作用基密度が調節されるならば基質表面に円滑に固定できるので、チップの生産効率を向上させることができる。この他にも基質表面に所望の分子群を固定し、これらの性質を明らかにする表面研究に重要な表面基質として使用が可能である。また、このような方法によって提供される充分な空間はそれぞれの生分子が効率的なセンサーとして作用するのに大きく寄与できる。
【００５４】
以下の実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。但し、実施例は本発明を例示するためのものであり、これらだけに限定するわけではない。
【００５５】
実施例１
１）トリス［（シアノエトキシ）メチル］アミノメタン（Ｔｒｉｓ［（ｃｙａｎｏｅｔｈｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）の合成
丸底フラスコ（２ｌ）にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（２０．２ｇ、１６７ｍｍｏｌ）と触媒量の水酸化カリウム（３．０ｇ、５３ｍｍｏｌ）を入れ、１２時間程度真空下で乾燥させる。パラ−ジオキサン（ｐ−ｄｉｏｘａｎｅ）溶媒を５００ｍｌ入れた後、試料が溶けるまで攪拌する。３．５当量のアクリロニトリル（３８．５ｍｌ、５８５ｍｍｏｌ）を注射器ポンプでゆっくり注入する。反応の進行程度は薄い膜クロマトグラフィを通じて確認し、反応が完結すれば水とクロロホルムで抽出する。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥してろ過した後、有機溶媒を蒸発させる。展開溶媒（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ：ｍｅｔｈａｎｏｌ＝４：１（ｖ／ｖ）、Ｒ_ｆ ；０．６４）を利用してコラムクロマトグラフィすれば、粘度のある黄色液体が得られる。数回に掛けて分離した時、得られた総量は３４．８ｇであった（３４．８ｇ、収率７４．３％）。
【００５６】
２）トリス［（（メトキシカルボニル）エトキシ）メチル］アミノメタン（Ｔｒｉｓ［（（ｍｅｔｈｏｘｙ−ｃａｒｂｏｎｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）の合成
トリス［（シアノエトキシ）メチル］アミノメタン（２．０ｇ、７．１ｍｍｏｌ）を丸底フラスコ（５００ｍｌ）に入れ、過量の濃塩酸を２０ｍｌ程度添加して３時間還流させる。真空下で溶媒を除去すれば白色の沈殿と共に濃い褐色の粘りのある液体が形成される。これをアセトンに溶かしてろ過する。白色沈殿は塩化アンモニウム塩であり、ろ過された液体は回転蒸留器（ｒｏｔａｒｙ ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）を利用して減圧蒸留し、溶媒を除去する。褐色の粘りのある液体を水とクロロホルムで抽出して水層を採取する。水層を減圧蒸留した後、メタノールに溶かしてエステル化させる。２４時間程度メタノール中で攪拌した後、トリエチルアミンを過量添加し、アルカリ溶液に作る。溶液を減圧蒸留した後、水を入れてクロロホルムで抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥してろ過する。溶媒を除去した後、純粋な化合物を得るために展開溶媒（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ：ｍｅｔｈａｎｏｌ＝８：１（ｖ／ｖ）、Ｒ_ｆ ；０．２５）を利用してコラムクロマトグラフィすれば、粘度のある黄色液体が得られる（２．３３ｇ、収率８０．６％）。
【００５７】
３）Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−トリス［（（メトキシカルボニル）エトキシ）メチル］アミノメタン（Ｎ−（Ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−ｔｒｉｓ［（（ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）の合成
トリス［（（メトキシカルボニル）エトキシ）メチル］アミノメタン（１．０ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの水に溶かした後、０℃に冷却しながら重炭酸ナトリウムを０．３ｇ添加して攪拌する。１時間程度過ぎて溶液がさらにアルカリ化されればクロロ蟻酸ベンジル（０．５０ｍｌ、３．５ｍｍｏｌ）をゆっくり過量に添加する。反応が終われば水に溶けない油が沈んでいるように見え、これをエチルアセテートで抽出する。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥してろ過する。溶媒を減圧蒸留で除去した後、展開溶媒（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ：ｈｅｘａｎｅ＝１：１（ｖ／ｖ）、Ｒ_ｆ ；０．４６）を利用してコラムクロマトグラフィすれば、粘度のある黄色液体が得られる（１．０１ｇ、収率７７．３％）。
【００５８】
４）Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−トリス［（カルボキシエトキシ）メチル］アミノメタン（Ｎ−（Ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−ｔｒｉｓ［（ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）の合成
Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−トリス［（（メトキシカルボニル）エトキシ）メチル］アミノメタン（２．０ｇ、３．７ｍｍｏｌ）を５ｍｌのメタノールに溶かした後、過量の１．０Ｎ水酸化ナトリウム（１５ｍｌ、１５０ｍｍｏｌ）を加えて攪拌する。水酸化ナトリウムを加えれば、最初には白く濁って徐々にきれいな溶液状態となる。攪拌して１２時間程度過ぎれば溶媒を減圧蒸留で除去した後、水とクロロホルムを入れて抽出する。有機層は捨てて水層だけ採取し、０℃で希塩酸溶液で酸性化させる（ｐＨ１〜２）。ｐＨ用紙で酸度を確認した後、エチルアセテートで抽出する。抽出した溶液を減圧蒸留し、展開溶媒（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ：ｍｅｔｈａｎｏｌ＝２：１（ｖ／ｖ）、Ｒ_ｆ；０．７２）を利用してコラムクロマトグラフィすれば、粘度のある黄色液体が得られる（１．５２ｇ、収率８２．４％）。
【００５９】
５）Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−トリス［（（Ｎ’−（カルボニル）−トリス（（（メトキシカルボニル）エトキシ）メチル）メチルアミノ）エトキシ）メチル］アミノメタン（Ｎ−（Ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−ｔｒｉｓ［（（Ｎ’−（ｃａｒｂｏｎｙｌ）−ｔｒｉｓ（（（ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−ｅｔｈｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）の合成
Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−トリス［（カルボキシエトキシ）メチル］アミノメタン（１．３７ｇ、２．９ｍｍｏｌ）にジシクロヘキシルカルボジイミド（ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ；ＤＣＣ；１．７７ｇ、８．６６ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ；ＨＯＢＴ；１．１７ｇ、８．６６ｍｍｏｌ）を各々３当量ずつ入れ、２５ｍｌジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶媒中で攪拌する。この溶液にトリス［（（メトキシカルボニル）エトキシ）メチル］アミノメタン（５．００ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）を４．５当量入れて４８時間反応させる。反応が進められれば溶媒に溶けないジシクロヘキシル尿素が発生して固体状態で漂う。反応が終われば溶媒を減圧蒸留及び真空下で除去し、残ったものを二塩化メチレンに溶かした後、ろ過する。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥してろ過する。溶媒を減圧蒸留で除去した後、展開溶媒（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ：ｍｅｔｈａｎｏｌ＝４：１（ｖ／ｖ）、Ｒ_ｆ；０．８２）を利用しコラムクロマトグラフィすれば、粘度の非常に強い黄色液体が得られる（１．５０ｇ、３３．３％）。
【００６０】
６）Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−トリス［（（Ｎ’−（カルボニル）−トリス（（カルボキシエトキシ）メチル）メチルアミノ）エトキシ）メチル］アミノメタンの合成
Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−トリス［（（Ｎ’−（カルボニル）−トリス（（（メトキシカルボニル）エトキシ）メチル）メチルアミノ）エトキシ）メチル］アミノメタン（２．００ｇ、１．２８ｍｍｏｌ）を５ｍｌメタノールに溶かした後、過量の１．０Ｎ水酸化ナトリウム（１５ｍｌ、１５０ｍｍｏｌ）を加えて攪拌する。水酸化ナトリウムを加えれば、最初には白く濁って徐々にきれいな溶液状態となる。攪拌して２４時間過ぎれば溶媒を減圧蒸留した後、水とクロロホルムで抽出する。有機層は捨てて水層だけを採取し、０℃で希塩酸溶液で酸性化させる（ｐＨ≒１〜２）。ｐＨ用紙で酸度を確認した後、塩化ナトリウム（２．０ｇ）を入れてエチルアセテートで抽出する。抽出した溶液を減圧下で溶媒を揮発させれば、粘度のある黄色液体が得られる（１．３４ｇ、収率７３．３％）。
【００６１】
実施例２
きれいに洗浄されたシリカ基質を２０ｍＴｏｒｒの真空中で乾燥した。
窒素雰囲気下で丸底フラスコに（３−アミノプロピル）ジエトキシメチルシランのトルエン溶液（１０^−３Ｍ）を入れた後、前記乾燥されたシリカ基質を浸漬させて常温で反応させた。
【００６２】
前記シラン化反応が完結すれば、基質をトルエンで洗浄し、約１２０℃のオーブンで３０分間乾燥した。各基質を常温に冷却させた後、トルエン、トルエンとメタノールの混合溶液（１：１体積比）次いでメタノールに順次に浸漬して３分間超音波洗浄を行った。この基質を約２０ｍＴｏｒｒの真空中で乾燥した後、表面がアミノシラン化された基質を前記実施例１で製造されたＮ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄを含む溶媒に浸漬し、不活性ガス雰囲気を維持する。これを室温で１２時間反応させた。
【００６３】
反応が完結されれば製造された基質をメタノール、メタノール及び水の混合溶液（１：１体積比）、水、メタノールに順次に浸漬して３分間超音波洗浄をし、真空乾燥した。
【００６４】
その後、ＣＢＺ作用基を除去するためにシリカ基質をトリフルオロ酢酸に浸漬し、これを室温で３０分間超音波洗浄した。超音波洗浄が終われば基質を多量のメタノールで洗浄した後、メタノールを利用して１０分間超音波処理した。
【００６５】
前記Ｎ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄと反応させる前後のアミノシラン分子層の厚さ及びアミン基の表面密度を測定した。その結果、アミノシラン分子層の厚さは約８Åであり、作用基の表面密度は３．５ａｍｉｎｅｓ／ｎｍ^２であった。
【００６６】
Ｎ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄを反応させた後の厚さは１０Å内外が増えた１８乃至１９Åであり、作用基の表面密度は０．１８ａｍｉｎｅｓ／ｎｍ^２で、大いに減少したことが分かる。この時、反応性アミン基の表面密度は９−アントラルデヒド（９−Ａｎｔｈｒａｌｄｅｈｙｄｅ別名Ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ−９−ｃａｌｂｏｘａｌｄｅｈｙｄｅ）を利用し、これは以前に使用した４−ニトロベンズアルデヒドより水吸光係数が６倍程度大きな物質である。表面のアミン基密度が顕著に低くなるので、従来の４−ニトロベンズアルデヒドでは密度計酸が不可能であり、９−アントラルデヒドを使用した。
【００６７】
また、表面の形態をＡＦＭ（Ａｔｏｍｉｃ Ｆｏｒｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）装備を利用して観察した結果、アミノシラン化された表面の構造と大きな差がなかった。これはハイパーブランチ分子が表面に単一層で形成されたことを意味し、塊りができた部分が観察されず、目標としたように均一な分子薄膜が形成されたことを意味する。
【００６８】
一方、Ｎ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄが導入された薄膜の安定性を測定するために中性の水で３０分、１時間、２時間、４時間間隔で超音波洗浄をしたが、厚さには変化がなかった。また、２４時間、４８時間を中性の水中に放置した後、測定した厚さもやはり特別な差がなかった。
【００６９】
様々なｐＨを有する水の中で測定した薄膜の安定性を図３に示した。ｐＨ４乃至９までは非常に安定な状態を示し、途中でｐＨ３よりも酸性条件で、そしてｐＨ１０よりも塩基性条件では急速に厚さが減ることが確認された。結局、生理的酸性度を含む広い領域のｐＨで安定であることが分かった。
【００７０】
また、高い温度の水の中でも安定である。様々な温度の水の中で表面の厚さの変化を図４に示した。４０℃から１００℃まで１０℃間隔で温度を変えながら水溶液に３０分間浸しておいたが、厚さには差がなかった。結局、１００℃の水の中で４時間以上浸しておいた時に薄膜の厚さが減ることが確認できた。このような熱的安定性はバイオチップの基質として使用するのに適する。
【００７１】
前記図３及び図４の厚さ単位はÅである。
【００７２】
実施例３
基質としてシリカの代りに溶融シリカを使用することを除いては実施例２と同様な方法で基質を処理した。製造された溶融シリカ基質は前記実施例２のシリカ基質と同一な様相を示した。
【００７３】
具体的な試験結果は下記のようである。
【００７４】
（アミノシリレーション）
二首２５０ｍｌ丸フラスコが真空に空気を排出し、窒素で充填した。連続的に無水トルエン（２０ｍｌ）とカップリング剤（０．２ｍｌ）を隔膜を通して加えた。洗浄された基質をこの用に３時間入れた。典型的に、４個以上の基質が基質の間で物理的オーバーラップを避けるためにフラスコに入れられた。自己組織化後に、基質はフラスコから取り出し、トルエンで洗浄してガラスバイアルに入れた。前記バイアルをオーブンに入れ、３０分間１１０℃で加熱した。前記プレートがトルエン、トルエン−メタノール（１：１（ｖ／ｖ））に順次に浸るようにし、それぞれの洗浄段階では３分間超音波洗浄した。洗浄されたプレートのそれぞれの片をバイアルに入れ、それぞれのバイアルはＯ−環が付けられた大きなスクリューキャップを有するガラス容器に入れ、ひきつづき容器は乾燥のために真空にした（３０乃至４０ｍＴｏｒｒ）。
【００７５】
（“ｎｏｎａｐｕｓ”の自己組織化、Ｎ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄ）
二首２５０ｍｌ丸いフラスコが真空に空気を排出し、窒素で充填した。Ｎ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄの或る程度の量を混合溶媒（ＤＭＦ：脱イオン水＝１：１（Ｖ／Ｖ））に溶解して溶液２０ｍｌを製造した。この溶液を前記窒素が充填されたフラスコに入れ、順次に前記で準備されたアミノシリレートされた基質を溶液に入れた。常温で自己組織化されれば、それぞれの基質片を特定時間後に取り出した。
【００７６】
取り出した後、これらは豊富な量の脱イオン水で洗浄した。それぞれの基質は脱イオン水、脱イオン水−メタノール（１：１（Ｖ／Ｖ））、次いでメタノールで順次に３分間超音波洗浄した。超音波洗浄後、それぞれの基質片をバイアルに入れ、それぞれのバイアルはＯ−環が付けられた大きなスクリューキャップを有するガラス容器に入れ、ひきつづき容器は乾燥のために真空にした（３０乃至４０ｍＴｏｒｒ）。
【００７７】
（無水酢酸による残留アミンの無力化）
Ｎ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄのカルボキシ酸などとイオン結合せずに残っているかもしれない基質表面の残留アミン基は以降の全ての反応過程で妨害要素として作用するので、脱保護反応に先立って残留アミン基を無水酢酸で処理し、残留アミン基の反応性を除去すれば付着がさらに好ましい。この工程は必要時に実施する。
【００７８】
４−（ジメチルアミノ）ピリジン（１ｍｇ、８．２μｍｏｌ）が入った二首２５０ｍｌ丸フラスコを真空にし、窒素で充填した。連続的に無水メチレンクロライド（２０ｍｌ）と無水酢酸（１ｍｌ、１１ｍｍｏｌ）を隔膜を通して加えた。前記自己組織化された基質のいくつの片を常温で１２時間前記溶液に入れておいた。反応後、それぞれのプレートを取り出してメチレンクロライドで洗浄し、ガラスバイアルに入れた。前記バイアルを順次的な方法でメチレンクロライド、メタノール、次いでメチレンクロライドの順で満たして各段階で３分間超音波洗浄した。超音波洗浄後、各基質の片をバイアルに入れ、それぞれのバイアルはＯ−環が付けられた大きなスクリューキャップを有するガラス容器に入れ、ひきつづき容器は乾燥のために真空にした（３０乃至４０ｍＴｏｒｒ）。
【００７９】
（厚さと吸収）
アミノシリン化された基質はＮ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄで自己組織化される時、その平衡の水接触角が以外に７０（±２゜）から６５（±２゜）まで減少した。特に、さらに小さい接触角は分子層最上のフェニル基の疏水性を反映することではない。もし、疏水性尾基を有するコンパクトな分子層であれば、大いに増加した水接触角が観察されなければならない。その観察はＮ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄの特徴的な分子構造と調和するものである。それは分子の錐形態は水がアミド及びエーテル基を含有する自己組織化された層の極性部分、おそらくカルボキシル酸とプロトン化されるアミン、に達するためである。したがって、ＣＢＺ保護基のフェニルは自己組織化による水接触角を増加させない。
【００８０】
溶融シリカ基質は紫外―可視光に透明であるために組立は分光光度計でモニターされる。実際に、２６０ｎｍで０．００１（±０．０００３）の吸収増加が自己組織化によって観察され、この増加値は機器の精密度を考慮する時、確かである。Ｎ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄのメタノールでのλｍａｘが２５８ｎｍである時、表面上の酸の吸収はむしろ広い。フェニル発色団が距離（ｃａ．２０〜３０Å）によってそれぞれ分離されて相互引力を避けるのに充分であるとしても、前記吸収バンドが広くなる理由は明確でない。無水酢酸で処理した後、基質の吸収バンドは変化しなかった。不変性は前記組立てられたＮ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄが無水酢酸で処理される間アミノシリル化された表面から脱着しないことを意味する。
【００８１】
アミノシリル化された基質の厚さは８（±２）Åであり、反面、Ｎ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄで自己組織化されたものは１８（±２）Åまで増加した。
【００８２】
（自己組織化された分子層のｐＨ安定性）
Ｎ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄの自己組織化後に、そのプレートを２．０乃至１１．０の様々な範囲のｐＨの水が入ったバイアルに浸漬した。溶液のｐＨは０．１Ｎ ＮａＯＨ、０．１Ｎ ＨＣｌ、またはこれらの組み合わせの適当な量を加えて調整した。典型的に、一つまたは二つのプレートは特定ｐＨのバイアルに入れた。室温で３時間放置した後、そのプレートを溶液から取り出し、脱イオン水で洗浄した。そのプレートを脱イオン水、脱イオン水とメタノールの混合物（１：１（ｖ／ｖ））、次いでメタノールに順次的な方法で入れ、各々３分間超音波洗浄した。超音波洗浄後に、各基質の片をバイアルに入れ、それぞれのバイアルをＯ−環が付加された大きなスクリューキャップを有するガラス容器に入れ、最後にその容器を真空で乾燥した（３０乃至４０ｍＴｏｒｒ）。無水酢酸で残留アミンを無力化した後、キャップがかぶせられた分子層のｐＨ安定性も同じ方法で実験した。
【００８３】
カルボキシル酸と１次アミンの間のイオン相互作用は組立に利用されるためにその引力はカルボキシル基がプロトン化されることにおける強い酸と塩基の全条件で不足しており、各々ＲＮＨ_３ ^＋がジプロトン化される。酢酸とＲＮＨ_３ ^＋の平衡定数Ｋａは各々１．８×１０^−５とｃａ１０^{−１０．５}であり、自己組織化された分子またはアミノシリレートされた表面のイオン水は４．７または１０．５のｐＨで半分減少する。イオン密度の減少ははっきりと引力を減少させると予想される。分子層の厚さは脱イオン水でプレートを洗浄し、連続的にメタノールで洗浄した後、測定した。図５の符号（●：黒丸）は以前のＮ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄ層の厚さを示し、符号（○：白丸）は無水酢酸で処理された後のものを示す。図５を見れば、分子層はｐＨ４乃至９で安定であった。平衡定数ｐＫａを含んで考慮すれば、イオン相互作用はカルボキシル酸がプロトン化させることを開始したり、ＲＮＨ_３ ^＋基がジプロトン化を開始すれば直ちに、そのまま分子層を維持するという程度には充分強くない。しかし、ｐＨ安定性の観点は大部分のバイオメディカル適用に充分な幅になることができる。
【００８４】
（水での自己組織化された分子層の熱的安定性）
Ｎ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄの自己組織化後に、そのプレートを脱イオン水が入った試験管に入れた。その試験管を温度が調節される油槽に入れた。特に、そのプレートの片が入った試験管を特定温度で３０分間加熱した。１００℃で加熱時間は段々に増加させた。沸騰状態での水の損失を注意して補償した。加熱後、そのプレートを脱イオン水で洗い、また、連続的にメタノールで洗いし、真空チャンバー（３０乃至４０ｍＴｏｒｒ）中で排出した。無水酢酸で残留アミンの反応性を除去した後、キャップがかぶせられた分子層のｐＨ安定性も同じ方法で実験した。
【００８５】
脱イオン化された水での分子層の熱安定性を様々な温度で実験した。基質を特定温度で３０分間加熱した後、有機フィルムの厚さを測定した。図６で符号（●）と符号（○）は各々無水酢酸で処理する前と後のＮ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄ分子層の厚さ示す。両分子層は１００℃まで安定であり、単に１００℃で加熱時間を増加させた時、厚さが減少しただけである。例えば、１００℃で６時間の加熱で６Å厚さが減少した。この実験のように９個所のイオン性相互作用を通じて形成される分子層は１００℃、１乃至２時間水で加熱して充分に残っている程度に強い。
【００８６】
（自己組織化されたハイパーブランチされたカルボン酸からのＣＢＺの脱保護）
他の適用のためにＣＢＺを脱保護することが重要である。ここで、条件は表面上の分子を元の状態に維持させるように充分に柔軟でなければならない。常温で３０分間高純度トリフルオロ酢酸に基質を浸漬することはＣＢＺ保護基を脱保護する効果がある。分光学的分析でＮ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄが特定の条件で表面上に維持されることを確認した。解釈すれば、万一基質が酸性環境でさらに長い時間残っているならば、自己組織化される分子は表面から離脱する。脱保護によって、有機層の厚さは典型的に２乃至３Åまで減少し、脱保護後のＡＦＭ像（図７、図８）と吸収スペクトラムはほとんど変化がなかった。したがって、トリフルオロ酢酸がＣＢＺ保護基を加水分解し、自己組織化体それ自体の干渉なくハイパーブランチされた分子上で反応性１次アミンを生成するということが証明された。
【００８７】
（１次アミンの表面密度）
＜イミンの形成＞
９−アントラルデヒド（１０ｍｇ、４８μｍｏｌ）が入った二首丸底２５０ｍｌが真空化された後、窒素が充填された。連続的に無水エタノール（２０ｍｌ）が隔膜を通じて加えられた。基質が５０℃の温度で１２時間その溶液に放置された。典型的に２個乃至４個の基質が試験に使用された。イミン形成後に、プレートは溶液から出してメタノールで洗いされた。次に、プレートはメタノールが入ったビーカーに入れ、３分間超音波洗浄された。新鮮な溶媒で最後の超音波洗浄工程を３回反復実施した後、それぞれのプレートをバイアルに入れた結果、バイアルを入れたガラス容器が乾燥のために真空された（３０乃至４０ｍＴｏｒｒ）。
【００８８】
＜加水分解＞
イミン形成された基質が脱イオン水（３ｍｌ）が１０ｍｌ試験管に入れられて５０℃で１８時間放置された。加水分解後に、プレートは溶液から取り出し、正確な溶液の体積と９−アントラルデヒド蛍光強度が測定された。
【００８９】
実験室で設定されたように、４−ニトロベンズアルデヒドが表面上の自由１次アミンの表面密度を測定するのに用いられた。４−ニトロベンズアルデヒドの分子吸着度（１．４５Ｘ１０^４Ｌ／ｃｍ・ｍｏｌ）は正確に１．０ａｍｉｎｅｓ／ｎｍ^２程度高くて、密度の検出には非常に充分である。さらに低い密度であれば、さらに大きい分子吸着度を有する分子が使用されなければならない。利点において、分子吸着度が８．７０×１０^４Ｌ／ｃｍ・ｍｏｌである９−アントラルデヒドが適している。１．０ａｍｉｎｅｓ／ｎｍ^２未満の密度で、アントラセン部分が占めるさらに大きい空間は全体アミン誘導体形成に問題とならなかった。
【００９０】
調整反応のために９−アントラルデヒドのイミン形成がアミノシリレートされた表面で実験された。無水溶媒でのイミン形成と水での加水分解は典型的な条件で成功的である。しかし、アントラセン部分が占めるさらに大きな空間のために、測定されたアミノシリレート層上の自由１次アミンの表面密度は４−ニトロベンズアルデヒドで測定したものより低い。また、表面アミンの９５％以上が用いられた条件で無水酢酸によってブロックされたことが観察された。他の調節反応で、９−アントラルデヒドのイミン形成が無水酢酸で処理する前と後のＣＢＺが保護されたＮ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄ分子層に対して実験された。キャップがかぶせられなかった基質に対するイミンの測定可能な程度はイミン形成に有用な自由アミン基に残る一方、分光器で前記アミンはキャップがかぶせられなかった基質で発見されなかった。したがって、この操作実験は表面上に残る全ての活性１次アミン基が無水酢酸で処理されてキャップがかぶせられる。
【００９１】
最後に、表面上に適用された９−アントラルデヒドはＣＢＺ基を脱保護するためにトリフルオロ酢酸で処理された。図９のように、明確な２５９ｎｍ付近の吸収増加がイミン形成によって観察された。イミン−誘導された表面は加水分解のために脱イオン水に浸るようにし、大部分のイミンは加水分解されて９−アントラルデヒドを作った。さらに信憑性のある計算のために９−アントラルデヒドの蛍光体が用いられた。較正計算曲線（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）は蛍光体の強度が濃度に比例することを示す（図１０）。フルオロ孔（ｆｌｕｏｒｏ ｐｈｏｒｅ）の蛍光を測定することは０．１乃至０．２５ａｍｉｎｅｓ／ｎｍ^２の表面密度を与えた。言い換えれば、それぞれのハイパーブランチされた分子は４乃至１０ｎｍ^２を占める。
【００９２】
【発明の効果】
本発明によれば基質表面でのアミン基密度を適切に減少させることができる。このように表面に調節されたアミン基密度を有する固体基質はＤＮＡチップやバイオチップを開発するのに重要な機能をする。また、本発明によって製作された薄膜は広いｐＨの範囲で安定であり、高い温度でも相当な安定性を有する。これは９個のカルボキシ酸が表面と多重結合を構成することに起因する。単一結合や３点結合の場合、それほど安定でない結合をするが、９点結合はこれとは比較できない程度の高い安定性を有する。この他にも基質表面に所望の分子を固定し、これらの性質を明らかにする表面研究に重要な表面基質として使用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の化学式（１ａ）の化合物を使用して調節されたアミン基密度と空間を含有する分子層を表面に含む基質を製造する過程を示した概略図である。
【図２】
本発明の化学式（１ａ）の化合物を使用して調節されたアミン基密度と空間を含有する分子層を表面に含む基質を製造する過程を図１に引き続いて示した概略図である。
【図３】
実施例２において製造される調節されたアミン基密度と空間を含有する分子層を表面に含む基質の様々なｐＨに対する安定度を示したグラフである。
【図４】
実施例２において製造される調節されたアミン基密度と空間を含有する分子層を表面に含む基質の熱に対する安定度を示したグラフである。
【図５】
実施例３において製造される調節されたアミン基密度と空間を含有する分子層を表面に含む基質の熱に対する安定度を示したグラフである。
【図６】
実施例２において製造される調節されたアミン基密度と空間を含有する分子層を表面に含む基質の様々なｐＨに対する安定度を示したグラフである。
【図７】
ニートトリフルオロ酢酸によってＣＢＺ基が脱保護される前のＡＦＭイメージである。
【図８】
ニートトリフルオロ酢酸によってＣＢＺ基が脱保護された後のＡＦＭイメージである。
【図９】
化学式（１ａ）の化合物層の紫外−可視スペクトラムである。ここで、ａはＣＢＺ基の脱保護後であり、ｂは９−アントラルデヒドにイミンを形成した後であり、ｃは加水分解後である。
【図１０】
２０、４０、６０、８０、１０ｍＭのそれぞれの濃度での蛍光体スペクトラムである。ここで、内部は較正計算曲線で、蛍光体強度対９−アントラルデヒドの濃度関係である。

Claims (15)

1. 下記の化学式（１）で表示される化合物であって、
   

   

   前記式で、Ｒはフェニルであるか、ニトロ基、ハロゲン、またはシアノ基に置換されたフェニル、ナフチル、またはアントリルである、化合物。
2. 下記の化学式（１ａ）で表示される、請求項１に記載のＮ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄ化合物。
   

   
3. 下記の化学式（１）で表示されるカルボキシ酸を有する誘導体の製造方法において、
   

   

   （前記式で、Ｒはフェニルであるか、ニトロ基、ハロゲン、またはシアノ基に置換されたフェニル、ナフチル、またはアントリル）、
   ａ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとアクリロニトリルをシアノエチレーション反応させてトリス［（シアノエトキシ）メチル］アミノメタンを製造する段階と、
   ｂ）前記トリス［（シアノエトキシ）メチル］アミノメタンに濃い塩酸溶液を加え、還流させてトリス［（カルボキシエトキシ）エチル］メチル］アミノメタンを製造する段階と、
   ｃ）前記トリス［（カルボキシエトキシ）エチル］メチル］アミノメタンにメタノールの添加にエステル化反応させてトリス［（（メトキシメトキシカルボニル）エトキシ）メチル］アミノメタンを製造する段階と、
   ｄ）前記トリス［（（メトキシカルボニル）エトキシ）メチル］アミノメタンに下記の化学式（２）で表示される化合物を加えるプロテクティング（保護）反応によって下記の化学式（３）で表示される化合物を製造する段階と、
   ＲＯＣＯＣｌ　　　　　　（２）
   （前記式で、Ｒはフェニルであるか、ニトロ基、ハロゲン、またはシアノ基に置換されたフェニル、ナフチル、またはアントリル）
   

   

   （前記式で、Ｒはフェニルであるか、ニトロ基、ハロゲン、またはシアノ基に置換されたフェニル、ナフチル、またはアントリル）、
   ｅ）前記化学式（３）で表示される化合物に水酸化ナトリウム溶液を加え、加水分解させて下記の化学式（４）で表示される化合物を製造する段階と、
   

   

   （前記式で、Ｒはフェニルであるか、ニトロ基、ハロゲン、またはシアノ基に置換されたフェニル、ナフチル、またはアントリル）、
   ｆ）前記化学式（４）で表示される化合物とトリス［（（メトキシカルボニル）エトキシ）メチル］アミノメタンをジメチルホルムアミドに溶かし、ジシクロヘキシルカルボジイミド、及びヒドロキシベンゾトリアゾールを添加して反応させ、下記の化学式（５）で表示される化合物を製造する段階と、
   

   

   （前記式で、Ｒはフェニルであるか、ニトロ基、ハロゲン、またはシアノ基に置換されたフェニル、ナフチル、またはアントリル）、及び
   ｇ）前記化学式（５）で表示される化合物に水酸化ナトリウム溶液を加えて加水分解させ、前記化学式（１）で表示される化合物を製造する段階とを含む化学式（１）で表示されるカルボキシ酸を有する誘導体の製造方法。
4. 前記ｄ）段階の化学式（２）で表示される化合物がクロロ蟻酸ベンジルである、請求項３に記載の化学式（１）で表示されるカルボキシ酸を有する誘導体の製造方法。
5. アミノシラン化された基質表面のアミン基と三角錐形態の下記の化学式（１）で表示されるカルボキシ酸を有する誘導体化合物を反応させて製造される分子層を表面に含む基質であって、
   

   

   前記式で、Ｒはフェニルであるか、ニトロ基、ハロゲン、またはシアノ基に置換されたフェニル、ナフチル、またはアントリルである、基質。
6. 前記基質表面のアミン基密度が０．０５乃至０．３ａｍｉｎｅｓ／ｎｍ^２である、請求項５に記載の基質。
7. 調節されたアミン基密度と空間を含有する分子層を表面に含む基質の製造方法において、
   ａ）アミノシランの分子層を表面に含む基質を提供する段階と、
   ｂ）前記分子層に含まれているアミン基をカルボキシ酸を有する誘導体と反応させる段階と、を含む基質の製造方法。
8. 前記ｂ）段階の誘導体が末端にカルボキシ酸及びアミン作用基を同時に含む、請求項７に記載の基質の製造方法。
9. 前記ｂ）段階の誘導体が下記の化学式（１）で表示される化合物である、請求項７または８に記載の基質の製造方法であって、
   

   

   前記式で、Ｒはフェニルであるか、ニトロ基、ハロゲン、またはシアノ基に置換されたフェニル、ナフチル、またはアントリルである、基質の製造方法。
10. 前記誘導体が下記の化学式（１ａ）で表示されるＮ−ＣＢＺ−［１］ａｍｉｎｅ−［９］ａｃｉｄ化合物である、請求項９に記載の基質の製造方法。
    

    
11. 前記ｂ）段階の反応は誘導体がイオン結合でアミノシラン化された基質表面に結合して薄膜を形成する、請求項７に記載の基質の製造方法。
12. 前記ｂ）段階の反応は不活性雰囲気下で実施される、請求項７に記載の基質の製造方法。
13. ｃ）前記反応済み基質の表面層にトリフルオロ酢酸を加えて誘導体を脱保護させる段階をさらに含む、請求項７に記載の基質の製造方法。
14. 前記基質表面のアミン基密度が０．０５乃至０．３ａｍｉｎｅｓ／ｎｍ^２である、請求項７に記載の基質の製造方法。
15. 前記ａ）の基質がシリコンウエハー、ガラス、シリカ、及び溶融シリカからなる群から選択される、請求項７に記載の基質の製造方法。

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