【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、造血幹細胞が活性化しているか否かの指標となる細胞表面マーカーに関する。更に、その細胞表面マーカーを分析することによる癌化学療法剤の骨髄毒性を予測する方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
造血幹細胞は、赤血球、白血球、血小板、Ｔリンパ球及びＢリンパ球などの全ての成熟血球細胞へ分化する能力（多分化能）とともに、細胞分裂により自己と同じ能力を持った細胞を複製する能力（自己複製能）を併せ持つ細胞である（非特許文献１）。
【０００３】
細胞表面上の発現マーカーを指標とした場合、マウスでは、分化抗原マーカー（Ｌｉｎ）陰性または弱陽性で、ｃ−Ｋｉｔ（ｃ−ｋｉｔと記述される場合もある）陽性およびＳｃａ―１陽性である細胞群に造血幹細胞が含まれている（非特許文献２）。一方、ヒトでは、Ｌｉｎ陰性あるいは弱陽性でＣＤ３４陽性との表現型を示す細胞群に造血幹細胞が含まれている（非特許文献３）とされている。分化抗原マーカーは系統特異的抗原（Ｌｉｎｅａｇｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ）とも呼称され、たとえば、マウスでは、赤血球マーカーであるＴｅｒ１１９、顆粒球マーカーであるＧｒ−１などが知られている（非特許文献４）。
【０００４】
これらの細胞表面マーカーにより分離された細胞群は、単一な細胞群ではなく、様々な性質を有する細胞が含まれている細胞集団である。造血幹細胞はこの中に含まれている一部の細胞群であると考えられている（非特許文献１）。造血幹細胞は、通常生体内においては、細胞分裂をしない休止（ｒｅｓｔｉｎｇ）状態にあるが、インビトロで、サイトカインの刺激や５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ、５−ＦＵ）処理により活性化する（非特許文献５）。活性化はリバーシブル（可逆的）な状態と考えられていて、休止状態の造血幹細胞に戻ることもある（非特許文献５）。また、自己複製能を失い、造血前駆細胞へ分化もするが、その詳しい分子機序は明らかではない。造血前駆細胞は、長期にわたる骨髄再構築能という造血幹細胞としての性質を失っており、造血幹細胞とは全く性質の異なる細胞群である（非特許文献６）。
【０００５】
抗癌剤による化学療法は、重要な癌の治療方法の一つである。しかしながら、抗癌剤（癌化学療法剤）による治療において、抗癌剤が癌細胞のみならず骨髄の細胞にも殺作用を示すことから、長期の癌化学療法では、末梢血の白血球数が減少し、免疫能が低下するという副作用がしばしば観察され、問題となっている。抗癌剤の副作用である白血球数減少の程度を予測することが出来れば、適確に輸血を行ったり抗癌剤の投与量や投与間隔をコントロールしたりすることが可能となり、副作用の発現を予防し、さらに安全に抗癌剤を使用することができると考えられている。
【０００６】
一般に、抗癌剤による末梢血白血球数の減少に先立ち、造血前駆細胞数の減少が観察され、これを補うために造血幹細胞が活性化することが知られている（非特許文献７、非特許文献８）。
【０００７】
以上の知見に基づき、本発明者は、抗癌剤の投与により活性化した造血幹細胞の数あるいは比率が明らかになれば、それに引き続いておこる骨髄毒性や白血球数の減少を予測することができると考える。
【０００８】
骨髄毒性や白血球数が減少することが予測できれば、前もっての輸血によりこれらの副作用を軽減させることも可能になると考える。
【０００９】
また、実際に白血球数が減少し、重篤な副作用が観察されるより前に、癌化学療法剤の投与量を減らしたり、投与間隔を空けたりすることが可能となり、副作用の発現頻度の減少や程度の軽減ができるようになると考える。
【００１０】
すなわち、投与量や投与期間を適正にコントロールし、より安全に癌化学療法剤を使用することができるようになると考える。
【００１１】
【非特許文献１】大沢匡毅、他３名，「実験医学」，１９９９年，第１７巻，第９号，ｐ．１０４８−１０５５
【非特許文献２】オカダ（Ｏｋａｄａ Ｓ）ら，「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」，１９９２年，第８０巻，ｐ．３０４４−３０５０
【非特許文献３】バーティア（Ｂｈａｔｉａ Ｍ）ら，「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」，１９９７年，第９４巻，ｐ．５３２０−５３２５
【非特許文献４】ランダールとワイズマン（Ｒａｎｄａｌｌ Ｔ．＆Ｗｅｉｓｓｍａｎ Ｉ．），「ステム・セルズ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ）」，１９９８年，第１６巻，ｐ．３８−４８
【非特許文献５】グーデル（Ｇｏｏｄｅｌ， Ｍ．），「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」，１９９９年，第９４巻，ｐ．２５４５−２５４７
【非特許文献６】コンドウ（Ｋｏｎｄｏ Ｍ．）ら，「セル（Ｃｅｌｌ）」，１９９７年，第９１巻，ｐ．６６１−６７２
【非特許文献７】ヴェトヴィッカ（Ｖｅｔｖｉｃｋａ Ｖ．）ら，「ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）」，１９８６年，第１３７巻，ｐ．２４０５−２４１０
【非特許文献８】ハリソンとレーナー（Ｈａｒｒｉｓｏｎ Ｄ．＆Ｌｅｒｎｅｒ Ｃ．），「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」，１９９１年，第７８巻，ｐ．１２３７−１２４０
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、造血幹細胞の活性化の指標として有用な細胞表面マーカーを提供することである。さらに、癌化学療法剤の骨髄毒性を予測する方法等を提供することである。
【００１３】
【課題解決のための手段】
上記課題を解決するために、本発明者は、造血幹細胞において各種細胞表面マーカーの発現を検討した結果、驚くべきことに、ＣＤ１３５とも称されるＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３が造血幹細胞活性化の指標として使用可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、
造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を指標として、造血幹細胞が活性化しているか否かを判定する方法、
に関する。
【００１５】
また、本発明は、
造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を指標として用いることを特徴とする、骨髄毒性の評価方法および／または骨髄毒性の予測方法、
さらに、
造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を指標として用いることを特徴とする、癌化学療法剤による、骨髄毒性の評価方法および／または骨髄毒性の予測方法、
あるいは、
造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を指標として用いることを特徴とする、癌化学療法剤による末梢血白血球数の減少の予測方法、
に関する。
【００１６】
および、本発明は、
造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を指標として用いることを特徴とする、癌化学療法剤の骨髄毒性を予防する方法、
また、
造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を指標として用いて輸血方法を決定することを特徴とする、癌化学療法剤の骨髄毒性の予防方法、
さらに、
造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を指標として癌化学療法剤の投与方法および／または投与期間を決定することを特徴とする、癌化学療法剤の骨髄毒性の予防方法、
に関する。
【００１７】
あるいは、本発明は、
造血幹細胞が、ヒト造血幹細胞である、上記のいずれかに記載の方法、
および、
セルソーターまたはフローサイトメーターで造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を分析する、上記のいずれかに記載の方法、
また、
上記のいずれかの方法で使用する、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）分析用キット、
に関する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
造血幹細胞は、前述したように、自己複製能を有し、さらに、全ての血球系の細胞に分化することができる細胞である（非特許文献1）。造血幹細胞であることは、実験的に長期にわたる骨髄再構築能があることで示される（非特許文献１）。本明細書の実施例においては、致死量の放射線を照射したマウスで長期(６ヶ月)にわたりドナー由来の血球系細胞の生存が観察される場合に、造血幹細胞であると判断した。本発明は、自己複製能と多分化能などの造血幹細胞の基本的な性質を有する限り、本実施例に限定されるものではなく、全ての造血幹細胞を対象とするものである。
【００１９】
簡便には、造血幹細胞は、骨髄、末梢血、臍帯血等を、複数の細胞表面マーカーをみ合わせて分析し、分離することにより、同定、採取することができる。このようなマーカーの例としては、マウスではＬｉｎ、Ｓｃａ−１、ｃ−ｋｉｔ、ヒトではＬｉｎ、ＣＤ３４が挙げられる。言うまでもなく、造血幹細胞の同定に用いることができる細胞表面マーカーはこれらに限られるものではない。
【００２０】
本発明においては、血液、特に、骨髄や末梢血から取得した造血幹細胞を好適に用いることができる。これらの生体材料から、フローサイトメーター等の細胞分離装置と前記の細胞表面マーカーを特異的に認識する抗体を用いて、造血幹細胞を同定、採取すればよい。例えば、マウスについては、Ｌｉｎ陰性または弱陽性であって、Ｓｃａ−１陽性であり、さらにｃ−ｋｉｔ陽性である細胞群に造血幹細胞が存在する。ヒトの場合はＬｉｎ陰性または弱陽性でＣＤ３４陽性である細胞群を造血幹細胞と同定できる。
【００２１】
胎児肝キナーゼ２（ｆｅｔａｌ ｌｉｖｅｒ ｋｉｎａｓｅ―２、Ｆｌｋ−２）／フムス様チロシンキナーゼ３（ｆｍｓ−ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ ３、Ｆｌｔ３）はＣＤ１３５と同一の分子であり、マクロファージコロニー刺激因子受容体（Ｍ−ＣＳＦ受容体）や血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦ受容体）と同じく３型チロシンキナーゼ受容体に属し、初期造血に関与することが知られている（ザイグラー（Ｚｅｉｇｌｅｒ）ら，「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」，１９９４年，第８４巻，ｐ．２４２２−２４３０）。マウス成体の骨髄に局在する造血幹細胞ではＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３は発現していない（アドルフソン（Ａｄｏｌｆｓｏｎ）ら，「イムニティー（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」，２００１年，第１５巻，p．６５９−６６９、クリステンセンとワイスマン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ Ｊ．＆Ｗｅｉｓｓｍａｎ Ｉ．），「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」，２００１年，第９８巻，ｐ．１４５４１−１４５４６）。一方、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３のリガンドは造血前駆細胞を強く刺激してその数を増加させる（ライマン（Ｌｙｍａｎ）ら，「セル（Ｃｅｌｌ）」，１９９３年，第７５巻，ｐ．１５５７−１１６７）。
【００２２】
骨髄細胞については、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３を細胞表面に発現している細胞には自己増殖能がなく、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３を細胞表面に発現していない細胞に長期骨髄構築能があること、すなわち、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３をマーカーとして細胞を分析することにより、造血幹細胞群とそれ以外の細胞群を分離できることが報告されている（クリステンセンとワイスマン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ Ｌ．＆Ｗｅｉｓｓｍａｎ Ｉ．），「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」，２００１年，第９８巻，１４５４１−１４５４６）。しかしながら、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３を分析することにより、活性化した造血幹細胞を同定できることは示されていない。
【００２３】
活性化した造血幹細胞とは、サイトカイン等の刺激を受けたり、５−ｆｌｕｏｒｕｒａｃｉｌ（５−ＦＵ）処理により、細胞周期（セルサイクル）に入った造血幹細胞を意味する（非特許文献５）。
【００２４】
マウスの骨髄より得た造血幹細胞については、Ｌｉｎ弱陽性または陰性でｃ−ｋｉｔ陽性Ｓｃａ−１陽性の細胞群中、活性化した造血幹細胞はＣＤ３４陽性の分画に認められることが報告されている（サトウ（Ｓａｔｏ Ｔ．）ら，「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」，１９９９年，第９４巻，ｐ．２５４８−２５５４）。一方、ヒトの造血幹細胞については、ＣＤ３４陽性は造血幹細胞のマーカーである（非特許文献１）ので、ＣＤ３４を分析することにより造血幹細胞が活性化しているか否かを判定することはできない。ヒトの造血幹細胞については、活性化の指標となるマーカーは知られておらず、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３を指標として用いる本発明によって初めて、造血幹細胞が活性化しているかどうか判定する方法が提供される。
【００２５】
造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３の分析は、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３に特異的な抗体を用いる免疫学的手法により行うことができる。Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３に特異的な抗体は市販されているので、例えば、フローサイトメーター等の細胞分離装置を用いれば簡便に分析することができる。同じアイソタイプのネガティブコントロールの抗体を用いた結果と比較して、これより強い蛍光強度を示した細胞をＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞と同定すればよい。
【００２６】
前述のとおり、癌化学療法に伴う骨髄毒性である末梢血白血球数の減少に先立ち、造血前駆細胞の減少が観察され、この造血前駆細胞の減少を補うために、活性化した造血幹細胞の割合が高くなることが知られている（非特許文献７、非特許文献８）。この現象は、末梢血白血球数の減少より早い時期から観察される。したがって、本発明に従い、癌化学療法剤の投与を受けた患者から採取した造血幹細胞においてＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３の発現を分析して活性化している造血幹細胞の比率を算出し、これが増加していた場合には、将来的に骨髄毒性が発現することを評価あるいは予測することができる。また、末梢血白血球の数が減少することを予測できる。このような癌化学療法剤の骨髄特性を評価・予測したり、末梢血白血球数の減少を予測する方法は本発明に含まれる。
【００２７】
また、癌化学療法に基づいた骨髄毒性に限らず、いかなる原因によって生じた骨髄毒性についても、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３の発現を指標として用いることにより評価・予測することができる。
【００２８】
さらに、本発明に従いＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３の発現を上述の方法で分析し、白血球数の減少を予測した結果に基づいて、骨髄毒性が生じることが懸念された場合には、事前に輸血を実施すればよい。輸血量や輸血時期等は、これらの予測結果に基づいて決定すればよい。また、癌化学療法剤の投与量を少なくする、あるいは、投与間隔を空ける等、投与方法をコントロールすることもできる。さらに輸血と投与方法のコントロールを適宜組み合わせて行うこともできる。
【００２９】
その結果、骨髄毒性を予防することや、末梢血白血球数の減少など副作用の程度を軽減させることができるようになる。本発明の方法により、有効な癌化学療法を患者に施すことができる。
【００３０】
本発明は、ヒト以外の哺乳類由来の造血幹細胞についても言うまでも無く適用できるが、ヒトの造血幹細胞についてが好適である。
【００３１】
本発明において、細胞表面マーカーの分析は、それぞれの細胞表面マーカーに特異的な抗体と、セルソーターやフローサイトメーターと称される細胞分取装置を用いて行うのが簡便であるが、これに限るものではなく、他の装置や方法を用いて分析してもよい。
【００３２】
また、上記目的のために造血幹細胞上のＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３の発現を分析するのに用いることができるキットも、本発明に含まれる。これらは、通常の造血幹細胞マーカーを分析する試薬とともにＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３を分析するために使用する試薬をさらに含むものである。
【００３３】
【実施例】
以下に、実施例で本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限られるものではない。
（実施例１）
（骨髄細胞の採取）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙ５．１マウス（ジャクソンラボラトリーズ社）の大腿骨と脛骨より採取した骨髄細胞を５％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ ＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ、以下ＦＢＳと略す。免疫生物研究所）を含む、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｓ、以下ＨＢＳＳと略す。ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）に懸濁後、２２ゲージの注射針を付けた１ｍｌのシリンジを用いて細胞浮遊液とした。ポアサイズ４０μmのナイロンメッシュ（ファルコン社）を通過して細胞塊を除去した後、１１００ｒｐｍで５分間遠心することにより細胞を洗浄した。得られた細胞をＨＢＳＳに再度懸濁し、単細胞浮遊液を得た。
【００３４】
（分化抗原陰性または弱陽性細胞の精製）
上記単細胞浮遊液から、マウス造血前駆細胞調製用のＳｔｅｍ ＳｅｐTM（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて、添付のマニュアルに従って分化抗原陰性または弱陽性細胞を調製した。すなわち、まず、上記単細胞浮遊液に分化抗原に対するビオチン標識抗体カクテルを加え、氷上で２０分間反応後、ＨＢＳＳで洗浄し、１１００ｒｐｍで５分間遠心した。得られた細胞をＨＢＳＳに再懸濁し、ビオチン標識抗体結合用Ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ抗体複合体を加え、氷上で４０分間反応後、磁気コロイドを加え、さらに４０分間反応させた。ＭＡＣＳ−ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ．社）で細胞懸濁液を処理し、標識細胞を吸着させ、未標識の分化抗原陰性および弱陽性細胞を回収した。
【００３５】
（セルソーターによる造血幹細胞の精製）
造血幹細胞はｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性の細胞集団である。そこで、回収した上記分化抗原陰性または弱陽性細胞を、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）で標識した抗マウスｃ−ｋｉｔ抗体（ファーミジェン社）、ＰＥ(フィコエリスリン、ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ)−Ｃｙ５で標識した抗マウスＳｃａ−１抗体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ社）、およびＰＥで標識した抗マウスＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３抗体（ファーミジェン社）で染色後、ＥＰＩＣＳ−Ｅｌｉｔｅ（ベックマンコールター社）により、ｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性と、ｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞を得た。得られたｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性とｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞の比率は、約３：２であった（図１）。
【００３６】
（分離した造血幹細胞のマウスへの移植）
２５００個のｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞と、１7００個のｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞をＨＢＳＳに懸濁し、ここにＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙ５．２マウス（日本クレア社）から採取した５×１０５個の新鮮骨髄細胞を加えて１１００ｒｐｍで５分間遠心した。得られた細胞を４００μｌの１ｍMＨＥＰＥＳ含有ＨＢＳＳに懸濁し、致死量放射線（８００レントゲン）を照射したＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙ５．２マウスに尾静脈より移植した。それぞれ3匹のマウスに対し移植を実施した。
【００３７】
（移植した細胞に由来する白血球の検出）
移植後６ヶ月経過したマウスの尾末端から、ヘパリンコート毛細管を用いて約２５μｌの末梢血を採取し、ただちに、１０ユニット／ｍｌのヘパリンを含む５００μｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−）、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）に懸濁した。１１００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去後、細胞を５００μｌのＨＢＳＳに懸濁した。ここに、ＰＢＳ（−）で１０倍に希釈したＦＩＴＣ標識抗マウスＬｙ５．１抗体（ファーミジェン社）を１０μｌ添加し、遮光条件下、氷中で３０分間放置した。１１００rpmで５分間遠心して細胞を回収し、ここに１５５ｍＭ塩化アンモニウム、１０ｍＭ重炭酸カリウム、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液を５００μｌ加え、溶血した。この溶血操作を２回行った。得られた細胞を、ＨＢＳＳで洗浄した後、２μｇ／ｍｌ ７−アミノアクチノマイシンＤ、０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０.０５%アジ化ナトリウム、０.０２%ＥＤＴＡを含むＨＢＳＳに懸濁してＥＰＩＣＳ−ＸＬフローサイトメータ−にてＬｙ５．１の発現を分析し、Ｌｙ５．１を発現している細胞の割合を算出した。結果を表１に示す。
【００３８】
表１．Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３の発現分析による造血幹細胞活性の分析
【００３９】
表１に示したように、ｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞を移植したマウスにはドナー由来の白血球が多く認められ、ｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞を移植したマウスにはドナー由来の白血球はほとんど認められなかった。したがって、成体マウス骨髄中においては、造血幹細胞はＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性の分画に存在することが確認できた。これらの成績は、すでに論文にて報告されている結果とほぼ同じであった。（アドルフソン（Ａｄｏｌｆｓｏｎ Ｊ．）ら，「イムニティー（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」，２００１年，第１５巻，p.６５９−６６９、クリステンセンとワイスマン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ Ｊ．＆Ｗｅｉｓｓｍａｎ Ｉ．），「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」，２００１年，第９８巻，ｐ．１４５４１−１４５４６）
【００４０】
（実施例２）
（サイトカインによるインビトロでの造血幹細胞の活性化）
実施例１と同じ手法で、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙ５．１マウスの骨髄から、ＥＰＩＣＳ−Ｅｌｉｔｅを用いてｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞を分離、調製した。これらの細胞を、１０μg/mlのゲンタマイシンを含有する５％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、組織培養用６ウェルプレートに１ウェルあたり２．７×１０4個を播種し、５%ＣＯ２存在下３７℃で培養した。ただし、培養液にステムセルファクター（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ、ＳＣＦ、Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）とインターロイキン１１（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ―１１、ＩＬ−１１、Ｐｅｐｒｏ ｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）を、いずれも１００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加して培養した。
【００４１】
（造血幹細胞の精製）
６日間培養後、増殖した細胞を、セルスクレイパーを用いて回収した。得られた細胞をＰＥ標識抗マウスＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３抗体で実施例１と同様の方法で染色し、ＥＰＩＣＳ−Ｅｌｉｔｅを用いてＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞と陽性細胞を分離、取得した。Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞とＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞の存在比率は、約４：１であった（図２）。
【００４２】
（インビトロで活性化した造血幹細胞のマウスへの移植）
これらＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞とＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞を実施例１に記載した方法に従って、致死量放射線を照射したＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙ５．２マウスに移植した。ただし、一匹あたり、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞は２．２×１０4個、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞は５．３×１０３個を移植した。それぞれ4匹のマウスに移植を実施した。
【００４３】
（移植した細胞に由来する白血球の検出）
移植後６ヶ月が経過したマウスから実施例１と同様に末梢血を採取し、Ｌｙ５．１の発現を分析した。結果を表２に示す。サイトカインの存在下インビトロで培養しＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞に変化した細胞を移植したマウスにもドナー由来の白血球が認められた。以上の結果から、成体マウス骨髄中では、造血幹細胞はＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性である（実施例１）が、これらをインビトロにおいてＳＣＦとＩＬ−１１で活性化した場合、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞にも造血幹細胞としての性質が確認されること、すなわち、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性のフェノタイプを示す造血幹細胞が出現することがわかった。これらの結果は、造血幹細胞のＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３の発現を分析することにより、活性化した造血幹細胞を同定することができることを示している。したがって、造血幹細胞におけるＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３の発現を分析すれば、どれくらいの割合の造血幹細胞が活性化しているのかを知ることができる。
【００４４】
表２．インビトロで活性化後の造血幹細胞活性の分析
【００４５】
（実施例３）
（インビトロで活性化した造血幹細胞の移植後のフェノタイプ変化）
実施例２と同様の方法で、ｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞を、ＳＣＦとＩＬ−１１の存在下インビトロで６日間培養後、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞と陽性細胞を分離したところ、それぞれの細胞数の比は約２：１であった。そこで、Ｗ４１／W４１マウス（ジャクソンラボラトリーズ）から取得した１.０×１０６個の骨髄細胞とともに、1匹あたり、ＦＬＫ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞は８×１０４個、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞は４×１０４個を、それぞれ４匹の致死量放射線を照射したＬｙ５．２マウスに移植した。移植から６ヵ月後、末梢血中のＬｙ５．１を分析する（表３）と、実施例２とほぼ同様の結果が得られ、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性および陽性細胞の両方に造血幹細胞としての活性が認められた。
【００４６】
表３．活性化造血幹細胞上のＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３の発現
【００４７】
そこで、インビトロでＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性からＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性に変化した細胞を移植したマウスから骨髄を採取し、実施例１で記載したようにＬｉｎ弱陽性または陰性細胞を精製した。そして、Ｌｙ５．１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞とＬｙ５．１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞に分離すると、それぞれの細胞数の比は、約１：５であった（図3）。そこで、一匹あたり、Ｌｙ５．１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞は５×１０４個、Ｌｙ５．１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞は１×１０４個を、Ｗ４１/Ｗ４１マウスから取得した１.０×１０６個の骨髄細胞とともに致死量放射線を照射したＬｙ５．２マウスに移植した。６ヵ月後に末梢血を採取し、Ｌｙ５．１の発現を分析した。
【００４８】
表４．Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性造血幹細胞のＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞への変化
【００４９】
その結果、表４に示すようにＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性分画にのみ造血幹細胞としての活性が強く検出され、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性分画の細胞中の造血幹細胞としての活性は低いことがわかった。以上の結果から、インビトロで活性化されＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞に変化した造血幹細胞は、移植されたマウスの生体中でその表現型をＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性へと再度変化することがわかった。
【００５０】
これらの結果により、自己複製能と多分化能を併せ持った造血幹細胞は、インビトロで活性化したときにはＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性にも変化するが、移植後生体内ではＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性フェノタイプへと戻ることが確認された。
【００５１】
（実施例４）
５−ＦＵ等の抗癌剤の投与を受けた患者の末梢血あるいは骨髄から、定法にしたがって造血幹細胞を分離する。例えば、Ｌｉｎ陰性あるいは弱陽性でＣＤ３４陽性の細胞を分画する。得られた造血幹細胞について、さらに、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３に対する蛍光標識抗体とフローサイトメーターを用いて、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３を発現している細胞の比率を算出する。あるいは、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３を発現している細胞の平均蛍光強度を算出する。発現している細胞の比率が高いほど、あるいは、平均蛍光強度が高いほど、重篤な骨髄毒性が生じる可能性が高いと考えられる。その場合は、輸血を行ったり、投与量を少なくしたり、投与間隔をあけたりする。このような処置を施すことにより、骨髄毒性の程度は軽減する。あるいは、骨髄毒性の発症を予防することができる。
【００５２】
【発明の効果】
本発明において、造血幹細胞表面上のＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３の発現を分析することにより、当該造血幹細胞が活性化しているか否かが判明する。活性化している造血幹細胞が同定できれば、癌化学療法剤で問題となっている末梢血白血球数の減少を未然に予測することができる。そして、投与量や投与期間をコントロールし、適切にこれらの薬剤を投与することができる。また、タイミングよく、輸血を実施することができ、骨髄毒性の程度を軽減したり、発症を未然に防止したりすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】８週令のＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙ５．１マウスの骨髄より採取した細胞を、実施例１に記載した方法に従って各種蛍光色素で標識した抗マウス細胞表面抗原抗体で染色し、フローサイトメーターにて分析した結果を示す。Ｌｉｎ弱陽性または陰性でｃ−ｋｉｔ陽性かつＳｃａ−１陽性の分画を、さらにＰＥ標識したＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３で分析したヒストグラムである。
【図２】図１のＬｉｎ弱陽性または陰性ｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性でＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性の分画を、実施例２に記載した方法に従って６日間サイトカイン存在下で培養した細胞をＰＥ標識抗マウスＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３抗体で染色した結果を示す。濃いグレーで示したヒストグラムがサイトカイン存在下で培養した細胞の分析結果であり、白抜きのヒストグラムがＰＥ標識したアイソタイプコントロール抗体で染色した分析結果である。Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞をサイトカイン存在下で培養するとＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞が生じていることがわかる。
【図３】実施例２に記載した方法に従って、ｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞をインビトロで活性化した後、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞を分取し、Ｗ４１/Ｗ４１マウスから取得した１.０×１０６個の骨髄細胞とともに致死量の放射線を照射したＬｙ５．２マウスに移植した。６ヵ月後、ドナー由来の細胞におけるＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３の発現を調べるために、それらのマウス骨髄からＬｉｎ弱陽性または陰性細胞を分離し、ＦＩＴＣ標識抗マウスＬｙ５．１抗体およびＰＥ標識抗マウスＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３抗体で染色した細胞の分析結果を示す。[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to a cell surface marker serving as an indicator of whether hematopoietic stem cells are activated. Further, the present invention relates to a method for predicting bone marrow toxicity of a cancer chemotherapeutic agent by analyzing the cell surface marker.
[0002]
[Prior art]
Hematopoietic stem cells have the ability to differentiate into all mature blood cells such as erythrocytes, leukocytes, platelets, T lymphocytes and B lymphocytes (multipotent) and the ability to replicate cells that have the same ability as themselves by cell division. (Self-renewal ability) (Non-Patent Document 1).
[0003]
When the expression marker on the cell surface is used as an index, mice are negative or weakly positive for differentiation antigen marker (Lin), positive for c-Kit (sometimes described as c-kit), and positive for Sca-1. Hematopoietic stem cells are included in the cell group (Non-Patent Document 2). On the other hand, in humans, it is said that hematopoietic stem cells are included in a cell group showing a phenotype of Lin negative or weak positive and CD34 positive (Non-Patent Document 3). The differentiation antigen marker is also called a lineage specific antigen (Lineage Specific Antigen), and for example, in mice, Ter119 which is an erythrocyte marker and Gr-1 which is a granulocyte marker are known (Non-Patent Document 4).
[0004]
The cell group separated by these cell surface markers is not a single cell group but a cell group containing cells having various properties. Hematopoietic stem cells are considered to be a part of the cell group contained therein (Non-Patent Document 1). Hematopoietic stem cells are usually in a resting state that does not undergo cell division in vivo, but are activated in vitro by cytokine stimulation and 5-fluorouracil (5-FU) treatment (Non-patented). Reference 5). Activation is considered to be a reversible (reversible) state and may return to resting hematopoietic stem cells (Non-Patent Document 5). It also loses its ability to self-renew and differentiates into hematopoietic progenitor cells, but the detailed molecular mechanism is not clear. Hematopoietic progenitor cells have lost the property of hematopoietic stem cells, ie, the ability to reconstitute bone marrow over a long period of time, and are a group of cells having completely different properties from hematopoietic stem cells (Non-Patent Document 6).
[0005]
Chemotherapy with anticancer drugs is one of important cancer treatment methods. However, in the treatment with an anticancer drug (cancer chemotherapeutic agent), the anticancer drug kills not only cancer cells but also cells of the bone marrow. The side effect of decreasing is often observed and poses a problem. If the degree of leukocyte reduction, which is a side effect of anticancer drugs, can be predicted, it will be possible to perform blood transfusion and control the dose and administration interval of anticancer drugs properly, prevent the occurrence of side effects, and It is believed that anticancer drugs can be used safely.
[0006]
In general, prior to the reduction in the number of peripheral blood leukocytes by an anticancer drug, a decrease in the number of hematopoietic progenitor cells is observed, and it is known that hematopoietic stem cells are activated to compensate for this (Non-Patent Documents 7 and 8). ).
[0007]
Based on the above findings, the present inventor believes that if the number or ratio of hematopoietic stem cells activated by administration of an anticancer agent becomes clear, it is possible to predict subsequent bone marrow toxicity and a decrease in the number of leukocytes.
[0008]
If it can be predicted that bone marrow toxicity and white blood cell count will decrease, it is possible that these side effects can be reduced by blood transfusion in advance.
[0009]
In addition, before the number of leukocytes actually decreases and serious side effects are observed, it becomes possible to reduce the dose of the cancer chemotherapeutic agent or to increase the interval between administrations, thereby reducing the frequency of occurrence of side effects I think that it will be possible to reduce the degree.
[0010]
That is, it is considered that the dose and the administration period can be appropriately controlled, and the cancer chemotherapeutic agent can be used more safely.
[0011]
[Non-Patent Document 1] Masatake Osawa and three others, "Experimental Medicine", 1999, Vol. 17, No. 9, p. 1048-1055
[Non-Patent Document 2] Okada S et al., "Blood", 1992, Vol. 80, p. 3044-3050
[Non-Patent Document 3] Bhatia M et al., "Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ", 1997, Vol. 94, p. 5320-5325
[Non-patent Document 4] Randall T. & Weissman I. "Stem Cells", 1998, Vol. 16, p. 38-48
[Non-Patent Document 5] Goodel, M., "Blood", 1999, Vol. 94, p. 2545-2547
[Non-Patent Document 6] Kondo M. et al., "Cell", 1997, Vol. 91, p. 661-672
Non-Patent Document 7: Vetvicka V. et al., "Journal of Immunology (J. Immunol.)", 1986, Vol. 137, p. 2405-2410
[Non-Patent Document 8] Harrison and Lerner C., "Blood", 1991, Vol. 78, p. 1237-1240
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
The problem to be solved by the present invention is to provide a cell surface marker useful as an indicator of hematopoietic stem cell activation. It is another object of the present invention to provide a method for predicting bone marrow toxicity of a cancer chemotherapeutic agent.
[0013]
[Means for solving the problem]
In order to solve the above problems, the present inventors examined the expression of various cell surface markers in hematopoietic stem cells. As a result, surprisingly, Flk-2 / Flt3, also called CD135, was used as an indicator of hematopoietic stem cell activation. The inventors have found that they can be used, and have completed the present invention.
[0014]
That is, the present invention
A method for determining whether hematopoietic stem cells are activated, using Flk-2 / Flt3 (CD135) expressed in hematopoietic stem cells as an index,
About.
[0015]
Also, the present invention
A method for evaluating bone marrow toxicity and / or a method for predicting bone marrow toxicity, wherein Flk-2 / Flt3 (CD135) expressed in hematopoietic stem cells is used as an index;
further,
A method for evaluating bone marrow toxicity and / or a method for predicting bone marrow toxicity by a cancer chemotherapeutic agent, wherein Flk-2 / Flt3 (CD135) expressed on hematopoietic stem cells is used as an index;
Or
A method for predicting a decrease in peripheral blood leukocyte count by a cancer chemotherapeutic agent, wherein Flk-2 / Flt3 (CD135) expressed on hematopoietic stem cells is used as an index,
About.
[0016]
And the present invention
A method for preventing bone marrow toxicity of a cancer chemotherapeutic agent, comprising using Flk-2 / Flt3 (CD135) expressed in hematopoietic stem cells as an indicator,
Also,
A method for preventing bone marrow toxicity of a cancer chemotherapeutic agent, comprising determining a blood transfusion method using Flk-2 / Flt3 (CD135) expressed in hematopoietic stem cells as an index,
further,
A method for preventing bone marrow toxicity of a cancer chemotherapeutic agent, wherein the method and / or the period of administration of the cancer chemotherapeutic agent are determined using Flk-2 / Flt3 (CD135) expressed in hematopoietic stem cells as an index,
About.
[0017]
Alternatively, the present invention provides
Hematopoietic stem cells are human hematopoietic stem cells, the method according to any of the above,
and,
The method according to any of the above, wherein Flk-2 / Flt3 (CD135) expressed in hematopoietic stem cells is analyzed using a cell sorter or a flow cytometer.
Also,
A kit for Flk-2 / Flt3 (CD135) analysis, which is used in any of the above methods;
About.
[0018]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
As described above, hematopoietic stem cells are cells that have a self-renewal ability and can further differentiate into all blood cell lines (Non-Patent Document 1). Hematopoietic stem cells are experimentally shown to have long-term bone marrow remodeling ability (Non-Patent Document 1). In the examples of the present specification, a mouse that was irradiated with a lethal dose of radiation was judged to be a hematopoietic stem cell when the survival of blood cells derived from the donor was observed over a long period (6 months). The present invention is not limited to this example, and is intended for all hematopoietic stem cells, as long as it has basic properties of hematopoietic stem cells such as self-renewal ability and pluripotency.
[0019]
Conveniently, hematopoietic stem cells can be identified and collected by analyzing and separating bone marrow, peripheral blood, umbilical cord blood, etc., using a plurality of cell surface markers. Examples of such markers include Lin, Sca-1, c-kit for mice, and Lin and CD34 for humans. Needless to say, cell surface markers that can be used for identification of hematopoietic stem cells are not limited to these.
[0020]
In the present invention, hematopoietic stem cells obtained from blood, in particular, bone marrow or peripheral blood can be suitably used. From these biomaterials, hematopoietic stem cells may be identified and collected using a cell separation device such as a flow cytometer and an antibody that specifically recognizes the cell surface marker. For example, for a mouse, hematopoietic stem cells are present in a cell group that is Lin negative or weakly positive, Sca-1 positive, and c-kit positive. In the case of humans, cells that are Lin negative or weakly positive and CD34 positive can be identified as hematopoietic stem cells.
[0021]
Fetal liver kinase-2 (Flk-2) / hums-like tyrosine kinase 3 (fms-like tyrosine kinase 3, Flt3) are the same molecules as CD135, and have macrophage colony stimulating factor receptor (M-CSF receptor). ) And platelet-derived growth factor receptor (PDGF receptor) and belong to the type 3 tyrosine kinase receptor and are known to be involved in early hematopoiesis (Zeigler et al., "Blood", 1994, Vol. 84, pp. 2422-2430). Flk-2 / Flt3 is not expressed in hematopoietic stem cells localized in the bone marrow of adult mice (Adolfson et al., "Immunity", 2001, Vol. 15, p. 659-669, Christensen). And Christensen J. & Weissman I., "Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (Proc. Natl. Acad. Sci. USA). 2001, Vol. 98, pp. 14541-14546). On the other hand, Flk-2 / Flt3 ligands strongly stimulate hematopoietic progenitor cells to increase their number (Lyman et al., "Cell", 1993, 75, pp. 1557-1167). .
[0022]
Regarding bone marrow cells, cells expressing Flk-2 / Flt3 on the cell surface have no self-proliferating ability, and cells not expressing Flk-2 / Flt3 on the cell surface have long-term bone marrow building ability. That is, it has been reported that by analyzing cells using Flk-2 / Flt3 as a marker, hematopoietic stem cell groups and other cell groups can be separated (Christensen L. and Weissman I.), "Proceedings. Of the National Academy of Sciences of the United States of America (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 2001, Vol. 98, 14541-14546). However, it has not been shown that Flk-2 / Flt3 analysis can identify activated hematopoietic stem cells.
[0023]
Activated hematopoietic stem cells refer to hematopoietic stem cells that have been stimulated with cytokines or the like and have entered the cell cycle (cell cycle) by 5-fluorouracil (5-FU) treatment (Non-Patent Document 5).
[0024]
With regard to hematopoietic stem cells obtained from mouse bone marrow, it has been reported that activated hematopoietic stem cells are found in the CD34-positive fraction in the group of c-kit-positive and Sca-1-positive cells that are weakly or negatively Lin-positive. (Sato T. et al., "Blood", 1999, Vol. 94, p. 2548-2554). On the other hand, with respect to human hematopoietic stem cells, CD34 positivity is a marker for hematopoietic stem cells (Non-Patent Document 1), so it is not possible to determine whether hematopoietic stem cells are activated by analyzing CD34. For human hematopoietic stem cells, a marker as an indicator of activation is not known, and the present invention using Flk-2 / Flt3 as an index provides, for the first time, a method for determining whether hematopoietic stem cells are activated. .
[0025]
Analysis of Flk-2 / Flt3 expressed in hematopoietic stem cells can be performed by an immunological technique using an antibody specific to Flk-2 / Flt3. Since antibodies specific to Flk-2 / Flt3 are commercially available, they can be easily analyzed using, for example, a cell separation device such as a flow cytometer. Compared to the results obtained using the negative control antibody of the same isotype, cells showing higher fluorescence intensity may be identified as Flk-2 / Flt3 positive cells.
[0026]
As described above, a decrease in hematopoietic progenitor cells was observed prior to a decrease in peripheral blood leukocyte count, which is a myelotoxicity associated with cancer chemotherapy.To compensate for this decrease in hematopoietic progenitor cells, the proportion of activated hematopoietic stem cells was reduced. It is known to be higher (Non-Patent Documents 7 and 8). This phenomenon is observed earlier than the decrease in peripheral blood leukocyte count. Therefore, according to the present invention, the expression of Flk-2 / Flt3 in hematopoietic stem cells collected from a patient who received a cancer chemotherapeutic agent was analyzed to calculate the ratio of activated hematopoietic stem cells, which was increased. In such a case, it is possible to evaluate or predict the occurrence of bone marrow toxicity in the future. In addition, a decrease in the number of peripheral blood leukocytes can be predicted. Methods for evaluating and predicting the bone marrow properties of such cancer chemotherapeutic agents and for predicting a decrease in peripheral blood leukocyte count are included in the present invention.
[0027]
In addition, not only bone marrow toxicity based on cancer chemotherapy but also bone marrow toxicity caused by any cause can be evaluated and predicted by using the expression of Flk-2 / Flt3 as an index.
[0028]
Further, according to the present invention, the expression of Flk-2 / Flt3 is analyzed by the above-described method, and based on the result of predicting a decrease in the number of white blood cells, if there is a concern that bone marrow toxicity will occur, blood transfusion is performed in advance. do it. The transfusion amount, transfusion time, and the like may be determined based on these prediction results. In addition, the administration method can be controlled, for example, by reducing the dose of the cancer chemotherapeutic agent or by increasing the administration interval. Furthermore, blood transfusion and administration method control can be appropriately combined and performed.
[0029]
As a result, it becomes possible to prevent bone marrow toxicity and reduce the degree of side effects such as a decrease in the number of peripheral blood leukocytes. The method of the present invention allows effective cancer chemotherapy to be administered to a patient.
[0030]
The present invention can be applied, of course, to hematopoietic stem cells derived from mammals other than humans, but is preferably applied to human hematopoietic stem cells.
[0031]
In the present invention, the analysis of cell surface markers is conveniently performed using an antibody specific to each cell surface marker and a cell sorter called a cell sorter or a flow cytometer, but is not limited thereto. Instead, the analysis may be performed using another device or method.
[0032]
Also included in the invention are kits that can be used to analyze Flk-2 / Flt3 expression on hematopoietic stem cells for the above purpose. These further include a reagent used for analyzing Flk-2 / Flt3 together with a reagent for analyzing a normal hematopoietic stem cell marker.
[0033]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
(Example 1)
(Collection of bone marrow cells)
Bone marrow cells collected from the femur and tibia of C57BL / 6J-Ly5.1 mouse (Jackson Laboratories) contain 5% fetal bovine serum (Fetal Bovine Serum, hereinafter abbreviated as FBS; Hanks Balanced Salt Solution) containing (Hanss Balanced Salt Solutions, hereinafter abbreviated as HBSS; GIBCO-BRL), and then used as a cell suspension using a 1 ml syringe fitted with a 22-gauge injection needle. After passing through a nylon mesh having a pore size of 40 μm (Falcon) to remove cell clumps, the cells were washed by centrifugation at 1100 rpm for 5 minutes. The obtained cells were resuspended in HBSS to obtain a single cell suspension.
[0034]
(Purification of differentiation antigen negative or weak positive cells)
Stem Sep for preparing mouse hematopoietic progenitor cells from the single cell suspension TM Using (Stem Cell Technologies Inc.), differentiated antigen negative or weakly positive cells were prepared according to the attached manual. That is, first, a biotin-labeled antibody cocktail against the differentiation antigen was added to the above single cell suspension, reacted on ice for 20 minutes, washed with HBSS, and centrifuged at 1100 rpm for 5 minutes. The obtained cells were resuspended in HBSS, and a tetrameric antibody complex for binding to a biotin-labeled antibody was added. After reacting on ice for 40 minutes, a magnetic colloid was added and the reaction was continued for another 40 minutes. The cell suspension was treated with a MACS-LS column (Miltenyi Biotec.) To adsorb labeled cells, and unlabeled differentiated antigen negative and weakly positive cells were collected.
[0035]
(Purification of hematopoietic stem cells by cell sorter)
Hematopoietic stem cells are a c-kit positive / Sca-1 positive cell population. Therefore, the collected differentiation-negative or weakly positive cells are labeled with anti-mouse c-kit antibody (Pharmigen) labeled with Fluorescein Isothiocyanate (FITC), and anti-mouse Sca labeled with PE (phycoerythrin, phycoerythrin) -Cy5. -1 antibody (Cedarlane) and PE-labeled anti-mouse Flk-2 / Flt3 antibody (Pharmigen), and then c-kit positive, Sca-1 positive and EPICS-Elite (Beckman Coulter). Flk-2 / Flt3 negative and c-kit positive / Sca-1 positive / Flk-2 / Flt3 positive cells were obtained. The ratio of the obtained c-kit positive / Sca-1 positive / Flk-2 / Flt3 negative and c-kit positive / Sca-1 positive / Flk-2 / Flt3 positive cells was about 3: 2 (FIG. 1).
[0036]
(Transplantation of isolated hematopoietic stem cells into mice)
2500 c-kit positive / Sca-1 positive / Flk-2 / Flt3 negative cells and 1700 c-kit positive / Sca-1 positive / Flk-2 / Flt3 positive cells were suspended in HBSS, and 5 × 10 collected from C57BL / 6J-Ly5.2 mouse (CLEA Japan) 5 Fresh bone marrow cells were added and centrifuged at 1100 rpm for 5 minutes. The obtained cells were suspended in 400 μl of HBSS containing 1 mM HEPES, and transplanted from the tail vein into C57BL / 6J-Ly5.2 mice irradiated with lethal radiation (800 X-ray). Transplantation was performed on three mice each.
[0037]
(Detection of leukocytes derived from transplanted cells)
Six months after the transplantation, about 25 μl of peripheral blood was collected from the tail end of the mouse using a heparin-coated capillary, and immediately 500 μl of a phosphate buffer (PBS (−), GIBCO, containing 10 units / ml of heparin). -BRL). After centrifugation at 1100 rpm for 5 minutes and removal of the supernatant, the cells were suspended in 500 μl of HBSS. 10 μl of a FITC-labeled anti-mouse Ly5.1 antibody (Pharmigen) diluted 10-fold with PBS (−) was added thereto, and the mixture was allowed to stand on ice for 30 minutes under light-shielded conditions. The cells were collected by centrifugation at 1100 rpm for 5 minutes, and 500 μl of a 155 mM ammonium chloride, 10 mM potassium bicarbonate, 0.1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution was added thereto to lyse the cells. This hemolysis operation was performed twice. After the obtained cells were washed with HBSS, the cells were washed with HBSS containing 2 μg / ml 7-aminoactinomycin D, 0.2% bovine serum albumin (BSA), 0.05% sodium azide, and 0.02% EDTA. After suspension, the expression of Ly5.1 was analyzed using an EPICS-XL flow cytometer, and the proportion of cells expressing Ly5.1 was calculated. Table 1 shows the results.
[0038]
Table 1. Analysis of hematopoietic stem cell activity by expression analysis of Flk-2 / Flt3
[0039]
As shown in Table 1, a large number of donor-derived leukocytes were observed in mice transplanted with c-kit positive, Sca-1 positive, Flk-2 / Flt3 negative cells, and c-kit positive, Sca-1 positive, Mice transplanted with Flk-2 / Flt3-positive cells hardly showed leukocytes from the donor. Therefore, it was confirmed that hematopoietic stem cells were present in the Flk-2 / Flt3-negative fraction in adult mouse bone marrow. These results were similar to those already reported in the paper. (Adolfson J., et al., "Immunity", 2001, Vol. 15, p. 659-669, Christensen J. & Weissman I., "Proceedings of the Weedsman." National Academy of Sciences of the United States of America (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 2001, Vol. 98, pp. 14541-14546)
[0040]
(Example 2)
(Activation of hematopoietic stem cells in vitro by cytokines)
In the same manner as in Example 1, c-kit positive, Sca-1 positive, Flk-2 / Flt3 negative cells were separated and prepared from bone marrow of C57BL / 6J-Ly5.1 mouse using EPICS-Elite. These cells were suspended in 5% FBS-RPMI1640 containing 10 μg / ml gentamicin, and 2.7 × 10 6 per well in a 6-well plate for tissue culture. Four Seeded, 5% CO 2 The cells were cultured at 37 ° C in the presence. However, a stem cell factor (Stem cell factor, SCF, Pepro Tech Inc.) and interleukin-11 (Interleukin-11, IL-11, Peprotech Inc.) were all added to the culture solution at a concentration of 100 ng / ml. Cultured.
[0041]
(Purification of hematopoietic stem cells)
After culturing for 6 days, the proliferated cells were collected using a cell scraper. The obtained cells were stained with a PE-labeled anti-mouse Flk-2 / Flt3 antibody in the same manner as in Example 1, and Flk-2 / Flt3-negative cells and positive cells were separated and obtained using EPICS-Elite. The ratio of Flk-2 / Flt3-negative cells to Flk-2 / Flt3-positive cells was about 4: 1 (FIG. 2).
[0042]
(Transplantation of hematopoietic stem cells activated in vitro into mice)
These Flk-2 / Flt3-negative cells and Flk-2 / Flt3-positive cells were transplanted into lethally irradiated C57BL / 6J-Ly5.2 mice according to the method described in Example 1. However, Flk-2 / Flt3-negative cells were 2.2 × 10 Four , Flk-2 / Flt3 positive cells were 5.3 × 10 3 Individuals were transplanted. Transplantation was performed on four mice each.
[0043]
(Detection of leukocytes derived from transplanted cells)
Peripheral blood was collected from mice 6 months after transplantation in the same manner as in Example 1, and the expression of Ly5.1 was analyzed. Table 2 shows the results. Donor-derived leukocytes were also observed in mice transplanted with Flk-2 / Flt3-positive cells that had been cultured in vitro in the presence of cytokines and changed to Flk-2 / Flt3-positive cells. From the above results, in adult mouse bone marrow, hematopoietic stem cells are Flk-2 / Flt3 negative (Example 1), but when activated by SCF and IL-11 in vitro, they are Flk-2 / Flt3 positive. It was found that the properties of hematopoietic stem cells were also confirmed in the cells, that is, that hematopoietic stem cells showing Flk-2 / Flt3 positive phenotype appeared. These results indicate that activated hematopoietic stem cells can be identified by analyzing the expression of Flk-2 / Flt3 on hematopoietic stem cells. Therefore, by analyzing the expression of Flk-2 / Flt3 in hematopoietic stem cells, it is possible to know what percentage of hematopoietic stem cells are activated.
[0044]
Table 2. Analysis of hematopoietic stem cell activity after activation in vitro
[0045]
(Example 3)
(Phenotype change after transplantation of hematopoietic stem cells activated in vitro)
In the same manner as in Example 2, c-kit positive, Sca-1 positive, Flk-2 / Flt3 negative cells were cultured in vitro in the presence of SCF and IL-11 for 6 days, and then Flk-2 / Flt3 negative cells. And positive cells were separated, and the ratio of the respective cell numbers was about 2: 1. Then, W 41 / W 41 1.0 × 10 obtained from mouse (Jackson Laboratories) 6 8 × 10 5 FLK-2 / Flt3-negative cells per animal 4 Cells, 4 × 10 5 Flk-2 / Flt3 positive cells 4 Individuals were implanted into four lethal radiation-irradiated Ly5.2 mice, respectively. Six months after transplantation, analysis of Ly5.1 in peripheral blood (Table 3) gave almost the same results as in Example 2, with both Flk-2 / Flt3 negative and positive cells as hematopoietic stem cells. Activity was observed.
[0046]
Table 3. Expression of Flk-2 / Flt3 on activated hematopoietic stem cells
[0047]
Therefore, bone marrow was collected from mice transplanted with cells in which Flk-2 / Flt3 negative changed to Flk-2 / Flt3 positive in vitro, and Lin weakly positive or negative cells were purified as described in Example 1. When the cells were separated into Ly5.1-positive / Flk-2 / Flt3-positive cells and Ly5.1-positive / Flk-2 / Flt3-negative cells, the ratio of the respective cell numbers was about 1: 5 (FIG. 3). . Therefore, 5 × 10 5 Ly5.1-positive / Flk-2 / Flt3-negative cells per animal 4 1 × 10 5 Ly5.1-positive / Flk-2 / Flt3-positive cells 4 , W 41 / W 41 1.0 × 10 obtained from mouse 6 The mice were transplanted together with a single bone marrow cell into a Ly5.2 mouse irradiated with lethal radiation. Six months later, peripheral blood was collected and analyzed for Ly5.1 expression.
[0048]
Table 4. Conversion of Flk-2 / Flt3-positive hematopoietic stem cells to Flk-2 / Flt3-negative cells
[0049]
As a result, as shown in Table 4, the activity as a hematopoietic stem cell was strongly detected only in the Flk-2 / Flt3-negative fraction, and the activity as a hematopoietic stem cell in the Flk-2 / Flt3-positive fraction was low. all right. From the above results, it is found that the hematopoietic stem cells activated in vitro and changed to Flk-2 / Flt3-positive cells again change their phenotype to Flk-2 / Flt3-negative in the living body of the transplanted mice. Was.
[0050]
According to these results, hematopoietic stem cells having both self-renewal ability and pluripotency also change to Flk-2 / Flt3-positive when activated in vitro, but become Flk-2 / Flt3-negative phenotype in vivo after transplantation. It was confirmed that it would return.
[0051]
(Example 4)
Hematopoietic stem cells are separated from peripheral blood or bone marrow of a patient who has received an anticancer drug such as 5-FU according to a standard method. For example, Lin-negative or weakly positive and CD34-positive cells are fractionated. With respect to the obtained hematopoietic stem cells, the ratio of cells expressing Flk-2 / Flt3 is further calculated using a fluorescence-labeled antibody against Flk-2 / Flt3 and a flow cytometer. Alternatively, the average fluorescence intensity of cells expressing Flk-2 / Flt3 is calculated. It is considered that the higher the ratio of the expressing cells or the higher the average fluorescence intensity, the higher the possibility of severe bone marrow toxicity. In such a case, blood transfusion is performed, the dose is reduced, or the administration interval is increased. Such treatment reduces the degree of bone marrow toxicity. Alternatively, the development of myelotoxicity can be prevented.
[0052]
【The invention's effect】
In the present invention, by analyzing the expression of Flk-2 / Flt3 on the surface of hematopoietic stem cells, it is determined whether or not the hematopoietic stem cells are activated. If the activated hematopoietic stem cells can be identified, a decrease in peripheral blood leukocyte count, which is a problem with cancer chemotherapeutic agents, can be predicted. Then, the dose and the administration period can be controlled to appropriately administer these drugs. In addition, blood transfusion can be performed in a timely manner, the degree of bone marrow toxicity can be reduced, and onset can be prevented.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows cells collected from bone marrow of 8-week-old C57BL / 6J-Ly5.1 mice stained with anti-mouse cell surface antigen-antibodies labeled with various fluorescent dyes according to the method described in Example 1. The results of analysis with a meter are shown. It is a histogram in which the Lin-positive or negative, c-kit positive, and Sca-1 positive fractions were further analyzed by PE-labeled Flk-2 / Flt3.
FIG. 2 shows cells obtained by culturing the Lin weakly positive or negative c-kit positive / Sca-1 positive and Flk-2 / Flt3 negative fraction of FIG. 1 in the presence of cytokines for 6 days according to the method described in Example 2. Shows the results of staining with a PE-labeled anti-mouse Flk-2 / Flt3 antibody. The dark gray histogram shows the results of analysis of cells cultured in the presence of cytokines, and the white histogram shows the results of analysis stained with the PE-labeled isotype control antibody. When Flk-2 / Flt3-negative cells were cultured in the presence of cytokines, it was found that Flk-2 / Flt3-positive cells were generated.
FIG. 3 In accordance with the method described in Example 2, c-kit positive, Sca-1 positive, Flk-2 / Flt3 negative cells are activated in vitro, and then Flk-2 / Flt3 positive cells are sorted out. W 41 / W 41 1.0 × 10 obtained from mouse 6 The mice were transplanted together with a single bone marrow cell into a Ly5.2 mouse irradiated with a lethal dose of radiation. Six months later, to examine the expression of Flk-2 / Flt3 in donor-derived cells, weakly positive or negative Lin cells were isolated from their mouse bone marrow, and FITC-labeled anti-mouse Ly5.1 antibody and PE-labeled anti-mouse Flk were used. 2 shows the analysis results of cells stained with -2 / Flt3 antibody.