JP2004117048A - 表面プラズモン共鳴を利用する測定装置およびそれに用いる測定用基板 - Google Patents
表面プラズモン共鳴を利用する測定装置およびそれに用いる測定用基板 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】測定用基板を回転させて測定することが可能な測定装置およびそれに用いる測定用基板を提供する。
【解決手段】図１に示すように、ＳＰＲ測定装置１０は、光ビームを出射する半導体レーザー等からなる光源１と、光学プリズム２と、光学プリズム２を保持する手段（不図示）と、光検出器３と、回転ステージ４とを備えており、回転ステージ４上には、円盤状の基板５を搭載して、ＣＤ、レコード等のように基板５を回転させることができる構成となっている。回転ステージ４上には、円盤状の基板５が搭載されたとき、光学プリズム２の上方に測定ウェル１５の底部の金属薄膜１５ａが位置するように、光学プリズム２の上方にわずかな間隙を介して基板５が配置される。
【選択図】 図１
【解決手段】図１に示すように、ＳＰＲ測定装置１０は、光ビームを出射する半導体レーザー等からなる光源１と、光学プリズム２と、光学プリズム２を保持する手段（不図示）と、光検出器３と、回転ステージ４とを備えており、回転ステージ４上には、円盤状の基板５を搭載して、ＣＤ、レコード等のように基板５を回転させることができる構成となっている。回転ステージ４上には、円盤状の基板５が搭載されたとき、光学プリズム２の上方に測定ウェル１５の底部の金属薄膜１５ａが位置するように、光学プリズム２の上方にわずかな間隙を介して基板５が配置される。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被検試料の状態を高感度で測定することが可能な、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：以下、ＳＰＲと称する）を利用する測定装置およびそれに用いる測定用基板に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生体分子間の相互作用を、蛍光物質または放射線物質などで標識することなく、リアルタイムでモニターすることができる測定装置として、金属表面に生じる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用する測定装置（以下、ＳＰＲ測定装置と称する）が開発されている。
【０００３】
ＳＰＲ測定装置は、下記非特許文献１に報告されているように、プリズムと金属との間に空間を有するように配置された構成（オット（Ｏｔｔｏ）配置）を備えるものと、下記非特許文献２に報告されているように、プリズムに薄膜状の金属を直接接触するように配置された構成（クレッシュマン（Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ）配置）を備えるものとがある。一般に、ＳＰＲ測定装置では、例えば、特開平６−１６７４４３号公報に開示されているように、クレッシュマン配置と呼ばれる構成を有する測定装置が最もよく用いられている。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｏｔｔｏ，Ａ、Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｘｃｉｔｉｎｇ ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍａｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ．、Ｐｈｙｓ．Ｓｔａｔ．Ｓｏｌ．、２６，Ｋ９９―Ｋ１０１、１９６８年
【非特許文献２】
Ｅ．Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ、Ｚ．Ｐｈｙｓｉｋ、２４１，３１３、１９７１年
図１３は、クレッシュマン配置で構成された従来のＳＰＲ測定装置を示す模式的な断面図である。ＳＰＲ測定装置１００は、光源１０１と、測定試料を保持するための金属薄膜１０２と、金属薄膜１０２の下面に接触して設けられた光学プリズム１０３と、光検出器１０４とを備える。
【０００５】
クレッシュマン配置とは、図１３に示すように、光学プリズム１０３が金属薄膜１０２に直接接触するように配置されている構成を指す。なお、金属薄膜１０２と光学プリズム１０３との密着性を高めるために、金属薄膜１０２と光学プリズム１０３との間にマッチングオイルが塗布されている。クレッシュマン配置で構成されたＳＰＲ測定装置１００では、光源１０１から出射された光ビームが、光学プリズム１０３を経て金属薄膜１０２の下面において反射し、再び光学プリズム１０３を経て光検出器１０４で受光される。光ビームを光学プリズム１０３を介して金属薄膜１０２の下面に対して全反射となる角度以上の入射角で入射させると、金属薄膜１０２の上面に表面プラズモンが誘起される（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ））。この場合、金属薄膜１０２の下面に入射する光ビームのエネルギーは表面プラズモンに移行するため、反射する光ビームのエネルギーは減少する。反射する光ビームのエネルギーが最小になる入射角θを特に共鳴角と呼ぶ。
【０００６】
共鳴角は、金属薄膜１０２の上面に接している誘電体の屈折率（一般的には誘電率）に依存して変化する。そこで、例えば、相互作用する２つの生体分子のうちの一方を金属薄膜１０２の上面に固定し、もう一方の分子を含む試料溶液を、マイクロ流路系を介して金属薄膜１０２の上面上に一定の流速で送液する構成とした場合、２つの生体分子間の結合および解離に伴って金属薄膜１０２の上面での微小な質量変化が生じる。このことによって、金属薄膜１０２の上面に接している誘電体（すなわち相互作用する２つの生体分子）の誘電率が変化し、共鳴角が変化する。このため、２つの生体分子間の相互作用を、共鳴角の変化量として表すことができる。
【０００７】
従って、ＳＰＲ測定装置１００を用いて、共鳴角の経時変化を解析することによって、２つの生体分子間の相互作用を解析することができる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、クレッシュマン配置で構成された従来のＳＰＲ測定装置１００においては、光学プリズム１０３に金属薄膜１０２を直接接触しているため、光学プリズム１０３上で金属薄膜１０２を移動させることは、光学プリズム１０３と金属薄膜１０２との摩擦などにより困難であるという不具合がある。
【０００９】
本発明は、上記不具合を解決するためになされたものであり、測定用基板を回転させることによって、特別な装置を用いることなく金属薄膜上に試料となる液体、ゲル状物質などを送液しながら測定することが可能な測定装置およびそれに用いる測定用基板を提供するものである。また、本発明は、多数の試料を同時に測定することが可能、つまり、ハイスループットが可能な測定装置およびそれに用いる測定用基板を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の測定装置は、光ビームを金属薄膜に照射し、上記金属薄膜の表面に表面プラズモン共鳴が誘起される光ビームの共鳴角の変化を測定するための表面プラズモン共鳴を利用する測定装置であって、光ビームを出射する光源と、光検出器と、金属薄膜を有する基板を設置し、回転させるための回転ステージとを備える。
【００１１】
本発明によれば、金属薄膜を有する基板を回転させながら、金属薄膜の表面に表面プラズモン共鳴が誘起される光ビームの共鳴角の変化を測定することができる。特に、金属薄膜の表面に液体、ゲル状物質などを流しながら測定する必要がある場合、回転によって生じる遠心力を利用して、特別な装置を用いることなく金属薄膜上に試料となる液体、ゲル状物質などを送ることができる。
【００１２】
上記回転ステージは、回転速度を調節することができる構成とすることが好ましい。
【００１３】
このことによって、金属薄膜上を通過する液体、ゲル状物質などの速度をコントロールすることができる。つまり、従来のＳＰＲ測定装置では必要とされる、金属薄膜上の液体、ゲル状物質などの流速を精密にコントロールするためのポンプなどの複雑な装置が、本発明の測定装置では不要である。従って、測定装置の部品点数が著しく減少し、製造コストを大幅に低減することができる。
【００１４】
上記設置部は、回転軸の角度を調節することができる構成とすることが好ましい。
【００１５】
このことによって、金属薄膜の主面に対する光ビームの入射角を変化させることができる。従って、金属薄膜の主面からの反射光強度が最小になる共鳴角に基づいて、金属薄膜に表面プラズモンを誘起させ、その反射光を光検出器で検出することができる。
【００１６】
上記基板の温度を制御する温度制御部をさらに備えることが好ましい。
【００１７】
このことによって、基板の測定雰囲気の温度を調節することができる。このため、様々な温度条件下での測定が可能になる。
【００１８】
金属薄膜を有する基板が上記回転ステージ上に設置されたときに、上記金属薄膜の主面に対向し、上記基板に離間して配置されるように設けられた光学プリズムをさらに備え、上記光源から出射される光ビームは、上記光学プリズムを介して上記金属薄膜に照射され、上記金属薄膜の主面によって反射された後、上記光学プリズムを介して光検出器に入射する構成とすることが好ましい。
【００１９】
このことによって、光ビームの金属薄膜の主面に対する入射角を小さくとることができる。
【００２０】
上記光学プリズムと上記基板との間隙の長さは、１００ｎｍ以下であることが好ましい。
【００２１】
第１および第２のビームスプリッターと、ミラーとをさらに備え、上記第１および第２のビームスプリッターと上記ミラーとは、上記光源から出射された光ビームが、上記第１のビームスプリッターによって分割され、分割されたそれぞれの光ビームは上記金属薄膜と上記ミラーとで反射され、上記第２のビームスプリッターによって合成され、上記光検出器に入射するように配置されている構成とすることが好ましい。
【００２２】
このことによって、分割された光ビームの間に生じた位相差を利用して、上記金属薄膜の裏面の物質状態を視覚化することができる。
【００２３】
上記光検出器は、ＣＣＤアレイを備えている構成としてもよい。
【００２４】
本発明の測定用基板は、光ビームを金属薄膜に照射することによって、上記金属薄膜の表面に表面プラズモン共鳴が誘起される光ビームの共鳴角の変化を測定するための表面プラズモン共鳴を利用する測定装置に用いられる円形状の測定用基板であって、液体を貯留するための少なくとも１つの第１ウェルと、上記少なくとも１つの第１ウェルに接続された少なくとも１つの第１流路と、上記少なくとも１つの第１流路に接続され、金属薄膜を備える少なくとも１つの第２ウェルとを備え、上記第２ウェル内には、上記金属薄膜が露出している。
【００２５】
本発明によれば、第１ウェルに液体またはゲル状物質などを導入し、測定用基板を回転させることによって、遠心力を利用して特別な装置を用いることなく、金属薄膜上に液体を送ることができる。従って、表面プラズモン共鳴を利用する測定装置の装置構成を簡略化できる。
【００２６】
上記少なくとも１つの第１ウェルは、第１の円の周上に位置するように設けられた複数の第１ウェルであり、上記少なくとも１つの第１流路は、上記複数の第１ウェルのそれぞれに接続された複数の第１流路であり、上記少なくとも１つの第２ウェルは、上記第１の円と同心円であり、且つ、上記第１の円よりも大きい直径を有する第２の円周上に位置するように設けられた複数の第２ウェルである構成としてもよい。
【００２７】
このことによって、各第１ウェルに液体を導入し、測定用基板を回転させることによって、遠心力を利用して特別な装置を用いることなく、各第２ウェルに液体を送ることができる。このため、各第２ウェルの金属薄膜上において同時に表面プラズモン共鳴を利用する測定を行なうことができる。従って、測定時間の大幅な短縮を図ることができる。
【００２８】
上記第２の円と同心円であり、且つ、上記第２の円よりも小さい直径を有する第３の円周上に位置するように設けられた複数の第３ウェルと、上記複数の第２ウェルのそれぞれと、上記複数の第３ウェルのそれぞれとを互いに接続する第２流路とをさらに備える構成としてもよい。
【００２９】
上記構成において、被検試料を含む液体を第１ウェルに導入し、被検試料と相互作用する反応物質を含む液体を第３ウェルに導入し、続いて測定用基板を回転させることによって、被検試料と反応物質との相互作用の状態を、表面プラズモン共鳴を利用して測定することが可能である。
【００３０】
上記少なくとも１つの第１流路には、標的試料を抽出または精製するための抽出・精製部が設けられている構成としてもよい。
【００３１】
上記金属薄膜は、クロムまたはニッケルからなる下層膜とその上に形成された金、銀およびアルミニウムのいずれか１つからなる上層膜との積層膜であってもよい。
【００３２】
上記金属薄膜は、チタン酸化膜とその上に形成されたシリカ層とからなる積層膜となっており、上記シリカ層の厚さは、光ビームが上記チタン酸化膜に対して高率で共役反射するように設計されていてもよい。
【００３３】
このことによって、被検試料の状態の測定感度を上げることができる。
【００３４】
本発明の測定用基板は、光ビームを金属薄膜に照射することによって、上記金属薄膜の表面に表面プラズモン共鳴が誘起される光ビームの共鳴角の変化を測定するための表面プラズモン共鳴を利用する測定装置に用いられる円形状の測定用基板であって、第１の円の周上に位置するように設けられた、液体を貯留するための複数の第１ウェルと、上記複数の第１ウェルに接続された複数の第１流路と、上記複数の第１流路に接続され、上記第１の円と同心円であり、且つ、上記第１の円よりも大きい直径を有する第２の円周上に位置するように設けられた、金属薄膜を備える複数の第２ウェルとを備え、上記複数の第２ウェルのそれぞれの内部には、上記金属薄膜が露出している。
【００３５】
本発明によれば、各第１ウェルに液体を導入し、測定用基板を回転させることによって、遠心力を利用して特別な装置を用いることなく、各第２ウェルに液体を送ることができる。このため、複数の被検試料について、各第２ウェルの金属薄膜上において同時に表面プラズモン共鳴を利用する測定を行なうことができる。従って、測定時間の大幅な短縮を図ることができる。
【００３６】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態を説明する。なお、本明細書中では、煩雑さを避けるために、各実施形態に共通する構成要素には同じ参照符号を用いることとする。
【００３７】
（実施形態１）
本実施形態のＳＰＲ測定装置を、図を参照しながら説明する。
【００３８】
図１は、本実施形態のＳＰＲ測定装置の構成を表す断面図である。図２は、本実施形態のＳＰＲ測定装置に用いられる基板を表す上面図である。
【００３９】
図１に示すように、本実施形態のＳＰＲ測定装置１０は、光ビームを出射する半導体レーザー等からなる光源１と、光学プリズム２と、光学プリズム２を保持する手段（不図示）と、光検出器３と、回転ステージ４とを備えており、回転ステージ４上には、円盤状の基板５を搭載して、ＣＤ、レコード等のように基板５を回転させることができる構成となっている。
【００４０】
図２に示すように、基板５には、測定ユニット１１が設けられている。図３（ａ）は、図２に示す測定ユニットを拡大して表している上面図であり、図３（ｂ）は、図３（ａ）に示したＸ−Ｘ線に沿った断面図である。
【００４１】
図３（ａ）に示すように、測定ユニット１１は、試料溶液、溶媒などの液体を導入するための導入ウェル１２および１４と、導入ウェル１２に導入された液体を混合する混合ウェル１３と、測定ウェル１５と、排出ウェル１６とを有する。また、測定ユニット１１には、導入ウェル１２と混合ウェル１３とを接続する流路１７と、混合ウェル１３と測定ウェル１５とを接続する流路１８と、導入ウェル１４と測定ウェル１５とを接続する流路１９と、測定ウェル１５と排出ウェル１６とを接続する流路が設けられている。さらに、流路１８にはカラム部２１が設けられており、試料溶液に含まれる標的試料を抽出および精製することができる構成となっている。なお、本実施形態では、カラム部２１を設けた構成としているが、カラム部２１を必ず設けられている必要はない。試料溶液の状態に応じてカラム部２１を設けなくとも構わない。
【００４２】
図３（ｂ）に示すように、本実施形態の基板５では、流路１７、１８および２０には、開閉部材２２ａ、２２ｂおよび２２ｃが設けられている。図示していないが、流路１９にも同様の開閉部材が設けられている。各開閉部材は、基板５の回転速度に応じて昇降する。従って、基板５の回転速度を調節することによって、各ウェルをそれぞれ密閉することができる。
【００４３】
また、図３（ｂ）に示すように、測定ウェル１５の底部は、ガラス、プラスチックなどの透明の部材で形成された光透過部（不図示）と、光透過部の上に形成された金属薄膜１５ａとで構成されており、金属薄膜１５ａの上面は測定ウェル１５内に露出している。金属薄膜１５ａは、光透過部の上に蒸着されたクロムまたはニッケルなどからなる下層膜と、下層膜の上に蒸着された金、銀、アルミニウムなどからなる上層膜との積層膜である。下層膜の膜厚は約１〜１０ｎｍであり、上層膜の膜厚は約５０ｎｍ〜５００ｎｍである。金属薄膜１５ａの上面上には、相互作用する２つの分子（例えば、生体分子）のうちの一方を固定することが可能である。
【００４４】
以上に説明したＳＰＲ測定装置１０に、基板５を搭載し、２つの分子間の相互作用を測定する際の動作を、図１〜図３を参照しながら説明する。なお、ここでは、相互作用する２つの生体分子のうちの一方を金属薄膜１５ａの上面上に固定し、もう一方の分子を含む溶液を、金属薄膜１５ａの上面上に一定の流速で送液する場合を説明する。
【００４５】
まず、図２および図３に示す基板５において、相互作用する２つの生体分子のうちの一方（以下、第１分子と称する）を含む第１分子溶液を導入ウェル１２に導入し、相互作用する２つの生体分子のもう一方（以下、第２分子と称する）を含む第２分子溶液を導入ウェル１４に導入する。
【００４６】
次に、ＳＰＲ測定装置１０の回転ステージ４上に、基板５を搭載する。このとき、図１に示すように、本実施形態のＳＰＲ測定装置１０では、基板５を回転ステージ４上に搭載したとき、光学プリズム２の上方に測定ウェル１５の底部の金属薄膜１５ａが位置するように、光学プリズム２の上方にわずかな間隙を介して基板５が配置される。光学プリズム２と基板５との間の僅かな間隙は１００ｎｍ以下にすることが好ましい。つまり、本実施形態のＳＰＲ測定装置１０では、光学プリズム２と金属薄膜１５ａとがオット配置となるように構成されている。
【００４７】
次に、基板５を、流路１９の開閉部材（不図示）が下降し、導入ウェル１４と測定ウェル１５とが開通する回転速度で回転させる。なお、このとき他の流路は全て閉鎖されている。このことによって、第２分子溶液は流路１９を通じて移動し、測定ウェル１５に導入され、測定ウェル１５の底部に設けられた金属薄膜１５ａの上面上に第２分子が保持される。
【００４８】
次に、基板５の回転速度を高くし、流路１７、１８および２０の開閉部材２２ａ、２２ｂおよび２２ｃが下降し、導入ウェル１２、混合ウェル１３、測定ウェル１５および１６が開通する回転速度で基板５を回転させる。このことによって、第１分子溶液は流路１７、混合ウェル１３および流路１８を通じて移動し、測定ウェル１５に導入される。また、測定ウェル１５を通過した第１および第２分子溶液は、流路２０を通じて排出ウェル１６に排出される。
【００４９】
続いて、本実施形態の基板５の回転速度を維持することによって、第１分子溶液を一定の流速で流し続けることができる。また、回転速度を調節することによって、各流路および測定ウェル１５の金属薄膜１５ａ上を通過する液体の速度をコントロールすることができる。このように、本実施形態では、金属薄膜１５ａ上の流速を精密にコントロールするためのポンプなどの複雑な装置が不要である。
【００５０】
次に、本実施形態のＳＰＲ測定装置１０では、光源１から出射された光ビームが、光学プリズム２を経て測定ウェル１５に設けられた金属薄膜１５ａの下面において反射し、再び光学プリズム２を経て光検出器３で受光される。このとき、光ビームが表面プラズモンを誘起して、反射した光ビームの強度が最も減少する入射角、つまり共鳴角を検出する。
【００５１】
本実施形態のＳＰＲ測定装置１０では、回転ステージ４の回転軸の傾きを制御することが可能である。さらに、回転ステージ４の回転軸の傾きの変化に連動して、光学プリズム２の上方に測定ウェル１５の底部の金属薄膜１５ａが位置し、且つ、光学プリズム２の上方にわずかな間隙を介して基板５が配置されるように、光学プリズム２の配置を光学プリズム２を保持する手段（不図示）によって制御することも可能である。このため、ＳＰＲ測定装置１０は、金属薄膜１５ａに対する光ビームの入射角を変化させることができる。従って、金属薄膜１５ａの下面からの反射光強度が最小になる共鳴角に基づいて、金属薄膜１５ａの上面に表面プラズモンを誘起させ、その反射光を光検出器３で検出することにより被検試料（すなわち、本実施形態では第１分子）の特性を測定することができる。
【００５２】
本実施形態では、ＳＰＲ測定装置１０の光学プリズム２と、基板５の金属薄膜１５ａとが分離されている。このため、上面上に被検試料を配置した状態の金属薄膜１５ａを光学プリズム２の上方で移動させることが可能である。そこで、本実施形態では、基板５を回転させる構成となっている。このことによって、回転によって生じる遠心力を利用して、特別な装置を用いることなく、金属薄膜１５ａの上面上に液体を送ることができる。
【００５３】
さらに、基板５の回転速度を調節することによって、各流路および各測定ウェル１５の金属薄膜１５ａ上を通過する液体の速度をコントロールすることができる。つまり、従来のＳＰＲ測定装置では必要とされる、金属薄膜１５ａ上の流速を精密にコントロールするためのポンプなどの複雑な装置が、本実施形態のＳＰＲ測定装置１０では不要である。従って、ＳＰＲ測定装置の部品点数が著しく減少し、製造コストを大幅に低減することができる。
【００５４】
また、本実施形態では、基板５に複数の測定ユニット１１が設けられており、基板を回転させることによって、各測定ユニット１１のそれぞれの測定ウェル１５について、同時に測定することが可能である。従って、測定時間の大幅な短縮を図ることができる。例えば、本実施形態のように４つの測定ユニット１１を備える基板５を用いれば、１つの試料毎に測定を行なう従来のＳＰＲ測定装置に比べて約４倍高速化できる。勿論、測定ユニットの数が多くなるほど短縮の効率も上昇する。
【００５５】
本実施形態では、基板５の各流路に開閉部材を設けているが、これに限定されず、例えば、基板５の回転速度に応じて開閉する逆流防止弁を設けてもよい。つまり、基板５の回転速度に応じて開閉する手段であれば、いかなる手段を用いてもよい。
【００５６】
光源１としては、具体的には、半導体レーザー、波長可変レーザー、ヘリウムネオンレーザーなどのレーザーなどが組み込まれた装置、および発光ダイオード、面発光ダイオードなどが組み込まれた装置を用いることができる。
【００５７】
光学プリズム２としては、本実施形態の三角プリズムの他、円錐形状、半球形状の光学プリズムを用いてもよい。また、光学プリズム２を設ける構成を示したが、光学プリズム２を設けない構成とすることも可能である。但し、光学プリズム２を設けることによって、光ビームの金属薄膜１５ａの下面に対する入射角を小さくとることができるので、光学プリズム２を設ける構成とすることが好ましい。
【００５８】
また、光検出器３としては、具体的には、ＣＣＤアレイ、ＣＭＯＳイメージセンサなどが組み込まれた装置を用いることができる。
【００５９】
本実施形態では、基板５は、ガラスで形成されているが、プラスチックなどの透明な材料で形成されていてもよい。また、基板５の厚さは、回転速度の制御のしやすさを考慮して、１μｍ〜１０ｍｍ程度であることが好ましい。
【００６０】
オット配置で構成された従来のＳＰＲ測定装置においては、金属薄膜に限らず、バルクの金属であっても、その表面上の物質状態を測定することが可能である。
【００６１】
しかし、金属薄膜と光学プリズムとの間に間隙が存在するため、最適な表面プラズモン共鳴が生じる条件（反射光強度の入射角依存性を表す曲線が、深い谷を有し、半値幅が狭い（すなわち、鋭い吸収ピークを示す）曲線となる条件）を得るためには、光学プリズムと金属薄膜との距離をナノメートルレベルで制御する必要がある。このため、ＳＰＲ測定装置の構成が難しく、また被検試料と反応物質との間の結合、解離に伴う金属薄膜表面での微量な質量変化（すなわち、共鳴角の変化）を捕らえるための十分な感度を得ることが難しい。
【００６２】
そこで、本実施形態のＳＰＲ測定装置１０では、光学プリズム２と金属薄膜１５ａを有する基板５との間の僅かな間隙を一定に保つことが好ましい。
【００６３】
具体的には、光学プリズム２と基板５との間の僅かな間隙を一定に保つために、光学プリズム２を保持する手段（不図示）に、ＨＤＤの磁気ヘッド等と同様の構造を採用することが好ましい。
【００６４】
（実施形態２）
本実施形態のＳＰＲ測定装置を、図４を参照しながら説明する。
【００６５】
図４は、本実施形態のＳＰＲ測定装置の構成を表す断面図である。
【００６６】
図４に示すように、本実施形態のＳＰＲ測定装置４０は、光ビームを出射する半導体レーザー等からなる光源１と、コーナーキューブ型の光学プリズム２’と、光学プリズム２’を保持する手段（不図示）と、光検出器３と、回転ステージ４とを備えており、回転ステージ４上には、円盤状の基板５を搭載して、ＣＤ、レコード等のように基板５を回転させることができる構成となっている。
【００６７】
図４に示すように、本実施形態のＳＰＲ測定装置４０でも、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０と同様に、基板５を回転ステージ４上に搭載したとき、光学プリズム２’の上方に測定ウェル１５の底部の金属薄膜１５ａが位置するように、光学プリズム２’の上方にわずかな間隙を介して基板５が配置される。なお、基板５は上記実施形態１で述べたものであり、ここでは説明を省略する。
【００６８】
つまり、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０とほぼ同様の構成であるが、光学プリズム２の代わりにコーナーキューブ型の光学プリズム２’が設けられており、光学プリズム２’に対する光ビームの入射方向と出射方向とがほぼ同じ方向であり、光源１と光検出器３とがほぼ同じ位置に設けられている点でのみ異なる。
【００６９】
本実施形態のＳＰＲ測定装置４０は、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０とほぼ同様の構成であるので、上記実施形態１と同様の効果が得られる。
【００７０】
さらに、本実施形態のＳＰＲ測定装置４０では、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０に比べて、装置内の光ビームが通過する領域が限定される。このため、装置構成が非常に簡単になり、他の測定装置に設けられる部品の配置を自由度が向上する。つまり、本実施形態のＳＰＲ測定装置４０では、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０に比べて、設計の自由度が非常に高い。
【００７１】
（実施形態３）
図５は、本実施形態のＳＰＲ測定装置の構成を表す断面図である。
【００７２】
図５に示すように、本実施形態のＳＰＲ測定装置５０は、光ビームを出射する半導体レーザー等からなる光源１と、光学プリズム２と、光学プリズム２を保持する手段（不図示）と、ＣＣＤアレイを備える光検出器３’と、回転ステージ４と、アナライザー５５とを備えており、回転ステージ４上には、円盤状の基板５を搭載して、ＣＤ、レコード等のように基板５を回転させることができる構成となっている。
【００７３】
図５に示すように、本実施形態のＳＰＲ測定装置５０でも、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０と同様に、基板５を回転ステージ４上に搭載したとき、光学プリズム２の上方に測定ウェル１５の底部の金属薄膜１５ａが位置するように、光学プリズム２の上方にわずかな間隙を介して基板５が配置される。なお、基板５は上記実施形態１で述べたものであり、ここでは説明を省略する。
【００７４】
また、本実施形態のＳＰＲ測定装置５０には、基板５を回転ステージ４上に搭載したときに、光学プリズム２と、回転ステージ４と、基板５とを覆い、基板５の測定雰囲気を調節することができる温度制御部５４が設けられている。
【００７５】
さらに、光源１と光学プリズム２との間には、偏光板５１ａと、ビームスプリッター５２ａとが設けられており、光学プリズム２と光検出器３’との間には、ビームスプリッター５２ｂと、偏光板５１ｂとが設けられている。また、ミラー５３が設けられており、ビームスプリッター５２ａおよび５２ｂと、金属薄膜１５ａと、ミラー５３とは、光ビームの進路が長方形状になるように配置されている。
【００７６】
つまり、本実施形態のＳＰＲ測定装置５０は、Ｍａｃｈ−Ｚｅｎｄｅｒ干渉計を採用した構成となっている。
【００７７】
光源１から出射される光ビームは、偏光板５１ａを通過し、ビームスプリッター５２ａによって２方向に分離される。
【００７８】
分離された光ビームの一方は、光学プリズム２を通過し、金属薄膜１５ａの下面で反射され、再び光学プリズム２を通過し、ビームスプリッター５２ｂに達する。
【００７９】
分離された光ビームのもう一方は、ミラー５３で反射された後、ビームスプリッター５２ｂに達する。
【００８０】
２方向に分離された光ビームは、ビームスプリッター５２ｂによって再合成される。再合成された光ビームは、光検出器３’に到達する。
【００８１】
光ビームが光検出器３’に到達すると、検出結果がアナライザー５５に転送される。アナライザー５５は、金属薄膜１５ａの下面で反射された光ビームと、ミラー５３で反射された光ビームとの位相のずれを分析する。
【００８２】
本実施形態のＳＰＲ測定装置５０は、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０とほぼ同様の構成であるので、上記実施形態１と同様の効果が得られる。
【００８３】
さらに、本実施形態のＳＰＲ測定装置５０によれば、金属薄膜１５ａの下面で反射された光ビームと、ミラー５３で反射された光ビームとの位相のずれを分析することができる。このことによって、金属薄膜１５ａの上面の物質状態を視覚化することができる。
【００８４】
なお、本実施形態では、ビームスプリッター５２ａおよび５２ｂと、金属薄膜１５ａと、ミラー５３とは、光ビームの進路が長方形状になるように配置されているが、これに限定されない。ビームスプリッター５２ａおよび５２ｂと、金属薄膜１５ａと、ミラー５３とは、光源１から出射された光ビームが、ビームスプリッター５２ａによって分割され、分割されたそれぞれの光ビームは金属薄膜１５ａとミラー５３とで反射され、ビームスプリッター５２ｂによって合成され、光検出器３’に入射するように配置されていればよい。
【００８５】
また、温度制御部５４によって、基板５の測定雰囲気の温度を調節することができる。このため、様々な温度条件下での測定が可能になる。本実施形態では温度制御部５４を設ける構成としているが、勿論、必要に応じて温度制御部５４を設ける構成としてもよい。
【００８６】
（実施形態４）
図６は、本実施形態のＳＰＲ測定装置の構成を表す断面図である。
【００８７】
図６に示すように、本実施形態のＳＰＲ測定装置６０は、光ビームを出射する半導体レーザー等からなる光源１と、光学プリズム２と、光学プリズム２を保持する手段（不図示）と、ＣＣＤアレイを備える光検出器３’と、回転ステージ４とを備えており、回転ステージ４上には、円盤状の基板５を搭載して、ＣＤ、レコード等のように基板５を回転させることができる構成となっている。
【００８８】
図６に示すように、本実施形態のＳＰＲ測定装置６０でも、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０と同様に、基板５を回転ステージ４上に搭載したとき、光学プリズム２の上方に測定ウェル１５の底部の金属薄膜１５ａが位置するように、光学プリズム２の上方にわずかな間隙を介して基板５が配置される。なお、基板５は上記実施形態１で述べたものであり、ここでは説明を省略する。
【００８９】
さらに、光源１と光学プリズム２との間には、偏光板５１ａと、ビームスプリッター５２ａとが設けられており、光学プリズム２と光検出器３との間には、ビームスプリッター５２ｂと、偏光板５１ｂとが設けられている。また、ミラー５３が設けられており、ビームスプリッター５２ａおよび５２ｂと、金属薄膜１５ａと、ミラー５３とは、光ビームの進路が長方形状になるように配置されている。
【００９０】
また、本実施形態のＳＰＲ測定装置６０では、光検出器３に接続されたアナライザー５５と、アナライザー５５に接続されたＰＣ６１とを備えている。
【００９１】
つまり、本実施形態のＳＰＲ測定装置６０は、Ｍａｃｈ−Ｚｅｎｄｅｒ干渉計を採用した上記実施形態のＳＰＲ測定装置５０とほぼ同じ構成となっており、基板５の測定雰囲気を調節することができる温度制御部５４が設けられておらず、ＣＣＤアレイによって得られるイメージデータを解析するＰＣ６１を備える点でのみ異なる。
【００９２】
光源１から出射される光ビームは、偏光板５１ａを通過し、ビームスプリッター５２ａによって２方向に分離される。
【００９３】
分離された光ビームの一方は、光学プリズム２を通過し、金属薄膜１５ａの下面で反射され、再び光学プリズム２を通過し、ビームスプリッター５２ｂに達する。
【００９４】
分離された光ビームのもう一方は、ミラー５３で反射された後、ビームスプリッター５２ｂに達する。
【００９５】
２方向に分離された光ビームは、ビームスプリッター５２ｂによって再合成される。再合成された光ビームは、光検出器３’に到達する。
【００９６】
本実施形態のＳＰＲ測定装置６０は、上記実施形態３のＳＰＲ測定装置５０とほぼ同様の構成であるので、上記実施形態３と同様の効果が得られる。
【００９７】
さらに、本実施形態のＳＰＲ測定装置６０によれば、金属薄膜１５ａの下面で反射された光ビームと、ミラー５３で反射された光ビームとの位相のずれを分析することができる。また、本実施形態では、ＣＣＤアレイを備える光検出器３’によって、金属薄膜１５ａの上面上の被検試料のイメージデータを取得し、このイメージデータをＰＣ６１で解析することによって、例えばＰＣ６１に備え付けられたモニターに被検試料の金属薄膜１５ａの上面上での状態をイメージとして表示することができる。
【００９８】
なお、本実施形態では、ビームスプリッター５２ａおよび５２ｂと、金属薄膜１５ａと、ミラー５３とは、光ビームの進路が長方形状になるように配置されているが、これに限定されない。ビームスプリッター５２ａおよび５２ｂと、金属薄膜１５ａと、ミラー５３とは、光源１から出射された光ビームが、ビームスプリッター５２ａによって分割され、分割されたそれぞれの光ビームは金属薄膜１５ａとミラー５３とで反射され、ビームスプリッター５２ｂによって合成され、光検出器３’に入射するように配置されていればよい。
【００９９】
上述の実施形態１〜４では、本発明のＳＰＲ測定装置の基本的な構成を説明したが、以下の実施形態では、より具体的なＳＰＲ測定装置の構成を説明する。
【０１００】
（実施形態５）
図７は、本実施形態のＳＰＲ測定装置の構成を表す断面図である。
【０１０１】
図７に示すように、本実施形態のＳＰＲ測定装置７０は、光ビームを出射する半導体レーザー等からなる光源１と、光学プリズム２と、光学プリズム２を保持する手段（不図示）と、光検出器３と、回転ステージ４とを備えており、回転ステージ４上には、円盤状の基板５を搭載して、ＣＤ、レコード等のように基板５を回転させることができる構成となっている。
【０１０２】
また、光検出器３には、アナライザー５５が接続されており、アナライザー５５にはＰＣ６１が接続されている。
【０１０３】
図７に示すように、本実施形態のＳＰＲ測定装置７０でも、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０と同様に、基板５を回転ステージ４上に搭載したとき、光学プリズム２の上方に測定ウェル１５の底部の金属薄膜１５ａが位置するように、光学プリズム２の上方にわずかな間隙を介して基板５が配置される。なお、基板５は上記実施形態１で述べたものであり、ここでは説明を省略する。
【０１０４】
特に本実施形態では、光源１は、半導体レーザー７１と、コリメーターレンズ７２および７３と、偏光板７４とから構成されており、図７に示すように、平行光となった光ビームが光学プリズム２に入射するようになっている。
【０１０５】
さらに、光検出器３は、コリメーターレンズ７５および７７と、絞り７６と、ＣＣＤアレイ７８とを備えている。
【０１０６】
本実施形態のＳＰＲ測定装置７０は、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０とほぼ同様の構成であるので、上記実施形態１と同様の効果が得られる。
【０１０７】
さらに、本実施形態では、光ビームが金属薄膜１５ａの下面で反射され、コリメーターレンズ７５および７７と、絞り７６とで集光され、ＣＣＤアレイ７８に到達する。ＣＣＤアレイ７８は、金属薄膜１５ａの上面上の被検試料のイメージデータを取得し、このイメージデータをＰＣ６１で解析することによって、例えばＰＣ６１に備え付けられたモニターに被検試料の金属薄膜１５ａの上面上での状態をイメージとして表示することができる。
【０１０８】
（実施形態６）
図８は、本実施形態のＳＰＲ測定装置の構成を表す断面図である。
【０１０９】
図８に示すように、本実施形態のＳＰＲ測定装置８０は、光ビームを出射する発光ダイオード等からなる光源１と、光学プリズム２と、光学プリズム２を保持する手段（不図示）と、光検出器３と、回転ステージ４とを備えており、回転ステージ４上には、円盤状の基板５を搭載して、ＣＤ、レコード等のように基板５を回転させることができる構成となっている。
【０１１０】
また、光検出器３には、アナライザー５５が接続されており、アナライザー５５にはＰＣ６１が接続されている。
【０１１１】
図８に示すように、本実施形態のＳＰＲ測定装置８０でも、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０と同様に、基板５を回転ステージ４上に搭載したとき、光学プリズム２の上方に測定ウェル１５の底部の金属薄膜１５ａが位置するように、光学プリズム２の上方にわずかな間隙を介して基板５が配置される。なお、基板５は上記実施形態１で述べたものであり、ここでは説明を省略する。
【０１１２】
特に本実施形態では、光源１は、発光ダイオード８１と、偏光板８２と、コリメータレンズ８３とから構成されており、図８に示すように、光ビームが光学プリズム２に入射し、金属薄膜１５ａ上で集光されるようになっている。
【０１１３】
さらに、光検出器３は、コリメーターレンズ８４と、イメージセンサ８５（具体的には、ＣＭＯＳイメージセンサなど）とを備えている。
【０１１４】
本実施形態のＳＰＲ測定装置７０は、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０とほぼ同様の構成であるので、上記実施形態１と同様の効果が得られる。
【０１１５】
（実施形態７）
上述の実施形態１〜６では、本発明のＳＰＲ測定装置の基本的な構成を説明した。本実施形態では、上記実施形態１で説明した基板５の代わりにＳＰＲ測定装置に用いることができる別の基板を図９を参照しながら説明する。
【０１１６】
本実施形態の基板５’は、図２および図３に示した上記実施形態１の基板５とほぼ同じ構成であるが、測定ウェル１５の構造が異なる。
【０１１７】
図９は、本実施形態の基板の測定ウェルの断面図である。
【０１１８】
上記実施形態１〜６に示した基板５では、金、銀、アルミニウムなどの金属材料から形成されているが、本実施形態の基板５’では、図９に示すように、金属薄膜１５ａが、チタン酸化膜９２とその上に形成されたシリカ層９１とからなる積層膜となっている。
【０１１９】
チタン酸化膜９２の厚さは１ｍｍ以下とすることが好ましい。また、シリカ層９１の厚さは、光ビームの波長に応じて、チタン酸化膜９１に対して高率に共役反射（全反射）するように設計されている。
【０１２０】
本実施形態の基板を用いることによって、さらに共鳴角の測定を高感度で行なうことができる。
【０１２１】
【実施例】
（実施例１）
被検試料としてマウス海馬由来粗製膜分画を、反応物質としてカルバコールを用いて、上記実施形態１の測定用基板および測定装置を用いて共鳴角の変化の測定を行った。
【０１２２】
マウス海馬からの粗製膜分画の調整は次のように行った。マウスより全脳を氷冷下に摘出し、全脳をさらにシャーベット状のＥａｒｌｅ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（以下、ＥＢＳＳと称する：５．３ｍＭのＫＣｌ、１１７ｍＭのＮａＣｌ、２６ｍＭのＮａＨＣＯ３、１ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、および５．６ｍＭのＧｌｕｃｏｓｅの混合溶液）中に３分間放置した。なお、ここで使用したＥＢＳＳは、シャーベット状にする前に予め９５％Ｏ２＋５％ＣＯ２の混合気体を５分間通気しておいた。
【０１２３】
次に、３分間放置後、海馬だけを摘出し、はさみで砕片化後、０．０２％トリプシン−０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＥＢＳＳで３７℃、５分間処理を行った。このあと、先端を火であぶって滑らかにしたガラスピペットでピペッティングを行ない、細胞懸濁液を調製した。
【０１２４】
細胞懸濁液を調製した後、直ちに６００Ｇで１０分間遠心し、上清を捨て、細胞の沈殿を１０ｍｌのＥＢＳＳで２回洗浄した。次に、１ｍｌのＥＢＳＳに細胞の沈殿を懸濁した。その後、得られた懸濁液を、３７℃で３０分間静置した。次に、懸濁液に、９０％（ｗ／ｖ）ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｉｎ ＥＢＳＳを添加して懸濁液中のｇｌｙｃｅｒｏｌの濃度が約３０％となるように調製した。
【０１２５】
次に、０．６ｍｌのＥＢＳＳに上記懸濁液を添加し、さらに０．１ｍｌの９０％ｇｌｙｃｅｒｏｌを加えて混合し、５分間室温静置した。次に、０．１ｍｌの９０％ｇｌｙｃｅｒｏｌを加えての混合と、５分間の室温静置とを２回繰り返し、その後、１０分間氷冷（０〜４℃）した。
【０１２６】
次に、上記混合液に６００Ｇ、４℃にて１０分間遠心操作を行ない、細胞を回収した。続いて、得られた細胞にＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ＨＥＰＥＳ；１０ｍＭ、ＣａＣｌ２；１ｍＭ、ＭｇＳＯ４；１ｍＭ）を加え、５分間静置し細胞を爆発させた。そして、４℃にて１０分間洗浄を行ない、上清を別のチューブに集めた（ペレットは核、細胞のほかの断片を含み、細胞膜は上清中に存在する。）。０．１ｍｌの４０％（ｗ／ｗ）ｓｕｃｒｏｓｅの上に上清を静かに載せて、２０，０００Ｇ、４℃にて９０分間遠心し、沈殿（細胞膜は、水とｓｕｃｒｏｓｅの界面に存在する）を集めた。この沈殿をＥＢＳＳに再懸濁し、細胞膜溶液を調製した。
【０１２７】
続いて、上記実施形態１に示した基板５の金属薄膜１５ａの上面の処理を次のように行なった。
【０１２８】
まず、導入ウェルからジメチルホルムアミドに溶解した１０ｍＭのＤｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｕｎｄｅｃａｎｏａｔｅ）を導入し、回転ステージ４を回転制御して金属薄膜１５ａ上へ移動させた状態で一晩放置した。その後、導入ウェルからジメチルホルムアミドを注入し、回転ステージ４を制御して基板５を回転させて、金属薄膜１５ａおよび各流路の洗浄を行ない、排出ウェル１６から余分なジメチルホルムアミドを除いた。さらに基板５を回転させることによって金属薄膜１５ａの上面を完全に風乾させた。さらに、フィブロネクチンを導入し、回転ステージ４を回転制御して金属薄膜１５ａ上に移動させた状態で一晩放置した。
【０１２９】
続いて、ＳＰＲ測定装置１０全体を３７℃に保温し、上述の細胞膜溶液を基板５の導入ウェル１２から導入し、回転させることにより試料を移動させ、２０分間静置して、細胞膜分画を金属薄膜１５ａの上面上に固定した。その後、反応物質であるカルバコール（５ｎＭおよび１００ｎＭ）を導入ウェル１４から注入し、回転ステージ４にて回転を行なうことにより、反応物質を金属薄膜１５ａの上面上に２０分間送液させたところ、反射光強度の変化（すなわち、共鳴角の変化）が観測された。その結果を図１０に示す。
【０１３０】
図１０に示すように、反応物質であるカルバコールの濃度に依存して、反射光強度、すなわち共鳴角が変化していることがわかる。このことから、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０において、被検試料と反応物質との相互作用を測定することが可能であることがわかる。
【０１３１】
最後に、導入ウェル１４から０．３５ＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭ塩酸を注入して基板５を回転させることによって、金属薄膜１５ａの再生を行った。再生を行なったところ、カルバコールが金属薄膜１５ａから離脱する様子が観察された。また、再度カルバコールを導入して共鳴角の変化を測定したところ、図１０と同様の変化が再び観測された。このように、反応物質を再度、金属薄膜１５ａ上に固定することができた。
【０１３２】
（実施例２）
本実施例でも、上記実施形態１の測定用基板および測定装置を用い、基板５の金属薄膜１５ａの上面上にイオンセンシング膜を形成した。イオンセンシング膜として、Ｋ．Ｋｕｒｉｈａｒａらの方法（Ｋ．Ｋｕｒｉｈａｒａ、Ｅ．Ｈｉｒａｙａｍａ、Ｋ．Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｓ．Ｓａｓａｋｉ、Ｄ．ＣｉｔｔｅｒｉｏおよびＫ．Ｓｕｚｕｋｉ、Ｐｉｔｔｃｏｎ、２０００年、１３２３ページ）に準じて、イオン認識分子であるイオノフォアとｐＨ感応色素とを、液膜である可塑化ポリ塩化ビニルに保持したものを用いた。
【０１３３】
具体的には、可塑剤ＮＰＯＥとポリ塩化ビニルとを２対１の質量比で混合し、イオン認識分子として、Ｍｇ選択性イオノフォアＣ１４−Ｋ２２Ｂ５（同仁化学研究所製）、ｐＨ感応色素としてカチオン性色素を使用した。このイオンセンシング膜によって、マグネシウムイオンだけが、選択的に分子認識される。カチオン性色素は、電荷が中性からプラスになると、６３０ｎｍ波長に吸収が現れる性質を有する。さらにイオンセンシング膜が機能するように、イオン認識分子と、ｐＨ感応色素と、アニオン添加剤とをそれぞれ等モル混合した。
【０１３４】
本実施例で使用したイオンセンシング膜は、具体的には、５０ｍｇのポリ塩化ビニルと、１００ｍｇのＤＯＳと、５μｍｏｌのイオノフォアＣ１４−Ｋ２２Ｂ５と、カチオン性色素と、アニオン添加剤とを混合し、厚さ約５０ｎｍの金薄薄膜１５ａの上面上にスピンコーティング装置を使って、厚さ１．５μｍのイオンセンシング膜を形成した。
【０１３５】
このようにして形成されたイオンセンシング膜は、マグネシウムイオン濃度が高くなるにつれて、６３０ｎｍの波長の光吸収が増加する。この光吸収を定量することにより、マグネシウムイオン濃度を決定できる。そこで、実際に上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０を用いて、共鳴角と反射高強度とを測定した。なお、ＳＰＲ測定装置１０の光源１として、６６０ｎｍ付近の波長の光ビームを放射する半導体レーザーを用いた。図１１にマグネシウムイオン濃度に対する共鳴角の変化と反射高強度の変化とを示す。図１１に示すように、マグネシウムイオン濃度が増大するに従って、共鳴角（反射光強度が極小になる入射角）における反射光強度が増加し、同時に共鳴角の高角度側へのシフトが観測された。
【０１３６】
従来のＳＰＲ測定法においては低分子物質については、検出が困難であったが、本実施例で示すように、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０と、金属薄膜１５ａの上面上にイオンセンシング膜が形成された基板５と用いることにより、イオンのような非常に小さい原子または分子を検出することができる。
【０１３７】
なお、本実施例ではイオンセンシング膜を金属薄膜１５ａの上面上に形成したが、これに限定されない。例えば、自己組織単分子膜（ＳＡＭ膜）、生体分子親和性膜（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ポリＬリジン、ポリオルニチン、ポリエチレンイミンなどで形成される膜）などを金属薄膜１５ａの上面上に公知の方法で形成してもよい。
【０１３８】
（実施例３）
本実施例では、被検試料としてラット血管平滑筋細胞粗製膜分画を基板５の金属薄膜１５ａの上面上に固定し、上記実施形態１の測定用基板および測定装置を用いて測定を行なった。
【０１３９】
ラット血管平滑筋細胞粗製膜画分の調整を次のように行なった。
【０１４０】
まず、１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ：ウシ胎児血清）および抗生物質を含有したＤＭＥＭ倍地が貯留された７５ｃｍ２フラスコ４本を用いて、５％の二酸化炭素ガスを通気した３７度の高温槽にてラット平滑筋細胞を培養した。８０％のコンフルエンシーに達したところで、７５ｃｍ２フラスコ４本の内部の培地をＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地に交換して、一晩３７度の恒温槽にて培養を行った。
【０１４１】
その後、４℃にて保存していたＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）でラット平滑筋細胞を２回洗浄し、予め氷冷しておいたダウンスホモジナイザーにてラット平滑筋細胞をホモジナイズした。ホモジナイズ液を１５ｍｌのポリプロピレンチューブに移し、１０００ｇにて１０分間遠心を行った後、上清を４℃、１０００００ｇにて４５分間遠心を行った。
【０１４２】
遠心後に得られた沈殿物を２Ｘｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを含む７５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む溶液に溶解した。
【０１４３】
まず、導入ウェルからジメチルホルムアミドに溶解した１０ｍＭのＤｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｕｎｄｅｃａｎｏａｔｅ）を導入し、回転ステージ４を回転制御して金属薄膜１５ａ上へ移動させた状態で一晩放置した。その後、導入ウェル１２からジメチルホルムアミドを注入し、回転ステージ４を制御して基板５を回転させて、金属薄膜１５ａおよび各流路の洗浄を行ない、排出ウェル１６から余分なジメチルホルムアミドを除いた。さらに基板５を回転させることによって金属薄膜１５ａの上面を完全に風乾させた。
【０１４４】
続いて、１０ｍＭのβ−ｏｌｅｏｙｌ−γ−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ（以下ＰＣＯＰ）と上記方法にて調整したラット平滑筋細胞粗製膜分画との混合溶液を超音波処理することによって混合し、導入ウェル１２から注入し、上述のように処理された基板５の金属薄膜１５ａに保持されるように回転ステージ４により基板５を回転させた後、２０分間静置することによって、ラット平滑筋細胞粗製膜分画を金属薄膜１５ａ上に固定した。その後、反応物質である１００ｎＭおよび１０μＭのノルエピネフリン溶液を導入ウェル１４から導入し、回転ステージ４で基板５を回転させることによって、ノルエピネフリン溶液を２０分間送液し、反射光強度の変化を観測した。その結果を図１２に示す。
【０１４５】
図１２に示すように、反応物質であるノルエピネフリンの濃度に依存して、反射光強度、すなわち共鳴角が変化していることがわかる。このことから、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０において、被検試料と反応物質との相互作用を測定することが可能であることがわかる。
【０１４６】
【発明の効果】
本発明によれば、測定用基板を回転させて測定することが可能な測定装置およびそれに用いる測定用基板を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施形態１のＳＰＲ測定装置の構成を表す断面図である。
【図２】図２は、実施形態１のＳＰＲ測定装置に用いられる基板を表す上面図である。
【図３】図３（ａ）は、図２に示す測定ユニットを拡大して表している上面図であり、図３（ｂ）は、図３（ａ）に示したＸ−Ｘ線に沿った断面図である。
【図４】図４は、実施形態２のＳＰＲ測定装置の構成を表す断面図である。
【図５】図５は、実施形態３のＳＰＲ測定装置の構成を表す断面図である。
【図６】図６は、実施形態４のＳＰＲ測定装置の構成を表す断面図である。
【図７】図７は、実施形態５のＳＰＲ測定装置の構成を表す断面図である。
【図８】図８は、実施形態６のＳＰＲ測定装置の構成を表す断面図である。
【図９】図９は、実施形態７の基板の測定ウェルの断面図である。
【図１０】図１０は、マウス海馬由来粗製膜分画と、カルバコール（５ｎＭおよび１００ｎＭ）との相互作用を、反射光強度の変化によって観測した結果を示す図である。
【図１１】図１１は、マグネシウムイオン濃度に対する共鳴角の変化と反射高強度の変化とを示す図である。
【図１２】図１２は、ラット平滑筋細胞粗製膜分画と、ノルエピネフリン（１００ｎＭおよび１０μＭ）との相互作用を、反射光強度の変化によって観測した結果を示す図である。
【図１３】図１３は、クレッシュマン配置で構成された従来のＳＰＲ測定装置を示す模式的な断面図である。
【符号の説明】
１ 光源
２、２’ 光学プリズム
３、３’ 光検出器
４ 回転ステージ
５、５’ 基板
１０、４０、５０、６０、７０ ＳＰＲ測定装置
１１ 測定ユニット
１２、１４ 導入ウェル
１３ 混合ウェル
１５ 測定ウェル
１５ａ 金属薄膜
１６ 排出ウェル
１７、１８、１９、２０ 流路
２１ カラム部
２２ａ、２２ｂ、２２ｃ 開閉部材
５１ａ、５１ｂ 偏光板
５２ａ、５２ｂ ビームスプリッター
５３ ミラー
５４ 温度制御部
５５ アナライザー
６１ ＰＣ
７１ 半導体レーザー
７２、７３、７５、７７ コリメーターレンズ
７４ 偏光板
７６ 絞り
７８ ＣＣＤアレイ
８１ 発光ダイオード
８２ 偏光板
８３、８４ コリメータレンズ
８５ イメージセンサ
９１ シリカ層
９２ チタン酸化膜
【発明の属する技術分野】
本発明は、被検試料の状態を高感度で測定することが可能な、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：以下、ＳＰＲと称する）を利用する測定装置およびそれに用いる測定用基板に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生体分子間の相互作用を、蛍光物質または放射線物質などで標識することなく、リアルタイムでモニターすることができる測定装置として、金属表面に生じる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用する測定装置（以下、ＳＰＲ測定装置と称する）が開発されている。
【０００３】
ＳＰＲ測定装置は、下記非特許文献１に報告されているように、プリズムと金属との間に空間を有するように配置された構成（オット（Ｏｔｔｏ）配置）を備えるものと、下記非特許文献２に報告されているように、プリズムに薄膜状の金属を直接接触するように配置された構成（クレッシュマン（Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ）配置）を備えるものとがある。一般に、ＳＰＲ測定装置では、例えば、特開平６−１６７４４３号公報に開示されているように、クレッシュマン配置と呼ばれる構成を有する測定装置が最もよく用いられている。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｏｔｔｏ，Ａ、Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｘｃｉｔｉｎｇ ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍａｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ．、Ｐｈｙｓ．Ｓｔａｔ．Ｓｏｌ．、２６，Ｋ９９―Ｋ１０１、１９６８年
【非特許文献２】
Ｅ．Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ、Ｚ．Ｐｈｙｓｉｋ、２４１，３１３、１９７１年
図１３は、クレッシュマン配置で構成された従来のＳＰＲ測定装置を示す模式的な断面図である。ＳＰＲ測定装置１００は、光源１０１と、測定試料を保持するための金属薄膜１０２と、金属薄膜１０２の下面に接触して設けられた光学プリズム１０３と、光検出器１０４とを備える。
【０００５】
クレッシュマン配置とは、図１３に示すように、光学プリズム１０３が金属薄膜１０２に直接接触するように配置されている構成を指す。なお、金属薄膜１０２と光学プリズム１０３との密着性を高めるために、金属薄膜１０２と光学プリズム１０３との間にマッチングオイルが塗布されている。クレッシュマン配置で構成されたＳＰＲ測定装置１００では、光源１０１から出射された光ビームが、光学プリズム１０３を経て金属薄膜１０２の下面において反射し、再び光学プリズム１０３を経て光検出器１０４で受光される。光ビームを光学プリズム１０３を介して金属薄膜１０２の下面に対して全反射となる角度以上の入射角で入射させると、金属薄膜１０２の上面に表面プラズモンが誘起される（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ））。この場合、金属薄膜１０２の下面に入射する光ビームのエネルギーは表面プラズモンに移行するため、反射する光ビームのエネルギーは減少する。反射する光ビームのエネルギーが最小になる入射角θを特に共鳴角と呼ぶ。
【０００６】
共鳴角は、金属薄膜１０２の上面に接している誘電体の屈折率（一般的には誘電率）に依存して変化する。そこで、例えば、相互作用する２つの生体分子のうちの一方を金属薄膜１０２の上面に固定し、もう一方の分子を含む試料溶液を、マイクロ流路系を介して金属薄膜１０２の上面上に一定の流速で送液する構成とした場合、２つの生体分子間の結合および解離に伴って金属薄膜１０２の上面での微小な質量変化が生じる。このことによって、金属薄膜１０２の上面に接している誘電体（すなわち相互作用する２つの生体分子）の誘電率が変化し、共鳴角が変化する。このため、２つの生体分子間の相互作用を、共鳴角の変化量として表すことができる。
【０００７】
従って、ＳＰＲ測定装置１００を用いて、共鳴角の経時変化を解析することによって、２つの生体分子間の相互作用を解析することができる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、クレッシュマン配置で構成された従来のＳＰＲ測定装置１００においては、光学プリズム１０３に金属薄膜１０２を直接接触しているため、光学プリズム１０３上で金属薄膜１０２を移動させることは、光学プリズム１０３と金属薄膜１０２との摩擦などにより困難であるという不具合がある。
【０００９】
本発明は、上記不具合を解決するためになされたものであり、測定用基板を回転させることによって、特別な装置を用いることなく金属薄膜上に試料となる液体、ゲル状物質などを送液しながら測定することが可能な測定装置およびそれに用いる測定用基板を提供するものである。また、本発明は、多数の試料を同時に測定することが可能、つまり、ハイスループットが可能な測定装置およびそれに用いる測定用基板を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の測定装置は、光ビームを金属薄膜に照射し、上記金属薄膜の表面に表面プラズモン共鳴が誘起される光ビームの共鳴角の変化を測定するための表面プラズモン共鳴を利用する測定装置であって、光ビームを出射する光源と、光検出器と、金属薄膜を有する基板を設置し、回転させるための回転ステージとを備える。
【００１１】
本発明によれば、金属薄膜を有する基板を回転させながら、金属薄膜の表面に表面プラズモン共鳴が誘起される光ビームの共鳴角の変化を測定することができる。特に、金属薄膜の表面に液体、ゲル状物質などを流しながら測定する必要がある場合、回転によって生じる遠心力を利用して、特別な装置を用いることなく金属薄膜上に試料となる液体、ゲル状物質などを送ることができる。
【００１２】
上記回転ステージは、回転速度を調節することができる構成とすることが好ましい。
【００１３】
このことによって、金属薄膜上を通過する液体、ゲル状物質などの速度をコントロールすることができる。つまり、従来のＳＰＲ測定装置では必要とされる、金属薄膜上の液体、ゲル状物質などの流速を精密にコントロールするためのポンプなどの複雑な装置が、本発明の測定装置では不要である。従って、測定装置の部品点数が著しく減少し、製造コストを大幅に低減することができる。
【００１４】
上記設置部は、回転軸の角度を調節することができる構成とすることが好ましい。
【００１５】
このことによって、金属薄膜の主面に対する光ビームの入射角を変化させることができる。従って、金属薄膜の主面からの反射光強度が最小になる共鳴角に基づいて、金属薄膜に表面プラズモンを誘起させ、その反射光を光検出器で検出することができる。
【００１６】
上記基板の温度を制御する温度制御部をさらに備えることが好ましい。
【００１７】
このことによって、基板の測定雰囲気の温度を調節することができる。このため、様々な温度条件下での測定が可能になる。
【００１８】
金属薄膜を有する基板が上記回転ステージ上に設置されたときに、上記金属薄膜の主面に対向し、上記基板に離間して配置されるように設けられた光学プリズムをさらに備え、上記光源から出射される光ビームは、上記光学プリズムを介して上記金属薄膜に照射され、上記金属薄膜の主面によって反射された後、上記光学プリズムを介して光検出器に入射する構成とすることが好ましい。
【００１９】
このことによって、光ビームの金属薄膜の主面に対する入射角を小さくとることができる。
【００２０】
上記光学プリズムと上記基板との間隙の長さは、１００ｎｍ以下であることが好ましい。
【００２１】
第１および第２のビームスプリッターと、ミラーとをさらに備え、上記第１および第２のビームスプリッターと上記ミラーとは、上記光源から出射された光ビームが、上記第１のビームスプリッターによって分割され、分割されたそれぞれの光ビームは上記金属薄膜と上記ミラーとで反射され、上記第２のビームスプリッターによって合成され、上記光検出器に入射するように配置されている構成とすることが好ましい。
【００２２】
このことによって、分割された光ビームの間に生じた位相差を利用して、上記金属薄膜の裏面の物質状態を視覚化することができる。
【００２３】
上記光検出器は、ＣＣＤアレイを備えている構成としてもよい。
【００２４】
本発明の測定用基板は、光ビームを金属薄膜に照射することによって、上記金属薄膜の表面に表面プラズモン共鳴が誘起される光ビームの共鳴角の変化を測定するための表面プラズモン共鳴を利用する測定装置に用いられる円形状の測定用基板であって、液体を貯留するための少なくとも１つの第１ウェルと、上記少なくとも１つの第１ウェルに接続された少なくとも１つの第１流路と、上記少なくとも１つの第１流路に接続され、金属薄膜を備える少なくとも１つの第２ウェルとを備え、上記第２ウェル内には、上記金属薄膜が露出している。
【００２５】
本発明によれば、第１ウェルに液体またはゲル状物質などを導入し、測定用基板を回転させることによって、遠心力を利用して特別な装置を用いることなく、金属薄膜上に液体を送ることができる。従って、表面プラズモン共鳴を利用する測定装置の装置構成を簡略化できる。
【００２６】
上記少なくとも１つの第１ウェルは、第１の円の周上に位置するように設けられた複数の第１ウェルであり、上記少なくとも１つの第１流路は、上記複数の第１ウェルのそれぞれに接続された複数の第１流路であり、上記少なくとも１つの第２ウェルは、上記第１の円と同心円であり、且つ、上記第１の円よりも大きい直径を有する第２の円周上に位置するように設けられた複数の第２ウェルである構成としてもよい。
【００２７】
このことによって、各第１ウェルに液体を導入し、測定用基板を回転させることによって、遠心力を利用して特別な装置を用いることなく、各第２ウェルに液体を送ることができる。このため、各第２ウェルの金属薄膜上において同時に表面プラズモン共鳴を利用する測定を行なうことができる。従って、測定時間の大幅な短縮を図ることができる。
【００２８】
上記第２の円と同心円であり、且つ、上記第２の円よりも小さい直径を有する第３の円周上に位置するように設けられた複数の第３ウェルと、上記複数の第２ウェルのそれぞれと、上記複数の第３ウェルのそれぞれとを互いに接続する第２流路とをさらに備える構成としてもよい。
【００２９】
上記構成において、被検試料を含む液体を第１ウェルに導入し、被検試料と相互作用する反応物質を含む液体を第３ウェルに導入し、続いて測定用基板を回転させることによって、被検試料と反応物質との相互作用の状態を、表面プラズモン共鳴を利用して測定することが可能である。
【００３０】
上記少なくとも１つの第１流路には、標的試料を抽出または精製するための抽出・精製部が設けられている構成としてもよい。
【００３１】
上記金属薄膜は、クロムまたはニッケルからなる下層膜とその上に形成された金、銀およびアルミニウムのいずれか１つからなる上層膜との積層膜であってもよい。
【００３２】
上記金属薄膜は、チタン酸化膜とその上に形成されたシリカ層とからなる積層膜となっており、上記シリカ層の厚さは、光ビームが上記チタン酸化膜に対して高率で共役反射するように設計されていてもよい。
【００３３】
このことによって、被検試料の状態の測定感度を上げることができる。
【００３４】
本発明の測定用基板は、光ビームを金属薄膜に照射することによって、上記金属薄膜の表面に表面プラズモン共鳴が誘起される光ビームの共鳴角の変化を測定するための表面プラズモン共鳴を利用する測定装置に用いられる円形状の測定用基板であって、第１の円の周上に位置するように設けられた、液体を貯留するための複数の第１ウェルと、上記複数の第１ウェルに接続された複数の第１流路と、上記複数の第１流路に接続され、上記第１の円と同心円であり、且つ、上記第１の円よりも大きい直径を有する第２の円周上に位置するように設けられた、金属薄膜を備える複数の第２ウェルとを備え、上記複数の第２ウェルのそれぞれの内部には、上記金属薄膜が露出している。
【００３５】
本発明によれば、各第１ウェルに液体を導入し、測定用基板を回転させることによって、遠心力を利用して特別な装置を用いることなく、各第２ウェルに液体を送ることができる。このため、複数の被検試料について、各第２ウェルの金属薄膜上において同時に表面プラズモン共鳴を利用する測定を行なうことができる。従って、測定時間の大幅な短縮を図ることができる。
【００３６】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態を説明する。なお、本明細書中では、煩雑さを避けるために、各実施形態に共通する構成要素には同じ参照符号を用いることとする。
【００３７】
（実施形態１）
本実施形態のＳＰＲ測定装置を、図を参照しながら説明する。
【００３８】
図１は、本実施形態のＳＰＲ測定装置の構成を表す断面図である。図２は、本実施形態のＳＰＲ測定装置に用いられる基板を表す上面図である。
【００３９】
図１に示すように、本実施形態のＳＰＲ測定装置１０は、光ビームを出射する半導体レーザー等からなる光源１と、光学プリズム２と、光学プリズム２を保持する手段（不図示）と、光検出器３と、回転ステージ４とを備えており、回転ステージ４上には、円盤状の基板５を搭載して、ＣＤ、レコード等のように基板５を回転させることができる構成となっている。
【００４０】
図２に示すように、基板５には、測定ユニット１１が設けられている。図３（ａ）は、図２に示す測定ユニットを拡大して表している上面図であり、図３（ｂ）は、図３（ａ）に示したＸ−Ｘ線に沿った断面図である。
【００４１】
図３（ａ）に示すように、測定ユニット１１は、試料溶液、溶媒などの液体を導入するための導入ウェル１２および１４と、導入ウェル１２に導入された液体を混合する混合ウェル１３と、測定ウェル１５と、排出ウェル１６とを有する。また、測定ユニット１１には、導入ウェル１２と混合ウェル１３とを接続する流路１７と、混合ウェル１３と測定ウェル１５とを接続する流路１８と、導入ウェル１４と測定ウェル１５とを接続する流路１９と、測定ウェル１５と排出ウェル１６とを接続する流路が設けられている。さらに、流路１８にはカラム部２１が設けられており、試料溶液に含まれる標的試料を抽出および精製することができる構成となっている。なお、本実施形態では、カラム部２１を設けた構成としているが、カラム部２１を必ず設けられている必要はない。試料溶液の状態に応じてカラム部２１を設けなくとも構わない。
【００４２】
図３（ｂ）に示すように、本実施形態の基板５では、流路１７、１８および２０には、開閉部材２２ａ、２２ｂおよび２２ｃが設けられている。図示していないが、流路１９にも同様の開閉部材が設けられている。各開閉部材は、基板５の回転速度に応じて昇降する。従って、基板５の回転速度を調節することによって、各ウェルをそれぞれ密閉することができる。
【００４３】
また、図３（ｂ）に示すように、測定ウェル１５の底部は、ガラス、プラスチックなどの透明の部材で形成された光透過部（不図示）と、光透過部の上に形成された金属薄膜１５ａとで構成されており、金属薄膜１５ａの上面は測定ウェル１５内に露出している。金属薄膜１５ａは、光透過部の上に蒸着されたクロムまたはニッケルなどからなる下層膜と、下層膜の上に蒸着された金、銀、アルミニウムなどからなる上層膜との積層膜である。下層膜の膜厚は約１〜１０ｎｍであり、上層膜の膜厚は約５０ｎｍ〜５００ｎｍである。金属薄膜１５ａの上面上には、相互作用する２つの分子（例えば、生体分子）のうちの一方を固定することが可能である。
【００４４】
以上に説明したＳＰＲ測定装置１０に、基板５を搭載し、２つの分子間の相互作用を測定する際の動作を、図１〜図３を参照しながら説明する。なお、ここでは、相互作用する２つの生体分子のうちの一方を金属薄膜１５ａの上面上に固定し、もう一方の分子を含む溶液を、金属薄膜１５ａの上面上に一定の流速で送液する場合を説明する。
【００４５】
まず、図２および図３に示す基板５において、相互作用する２つの生体分子のうちの一方（以下、第１分子と称する）を含む第１分子溶液を導入ウェル１２に導入し、相互作用する２つの生体分子のもう一方（以下、第２分子と称する）を含む第２分子溶液を導入ウェル１４に導入する。
【００４６】
次に、ＳＰＲ測定装置１０の回転ステージ４上に、基板５を搭載する。このとき、図１に示すように、本実施形態のＳＰＲ測定装置１０では、基板５を回転ステージ４上に搭載したとき、光学プリズム２の上方に測定ウェル１５の底部の金属薄膜１５ａが位置するように、光学プリズム２の上方にわずかな間隙を介して基板５が配置される。光学プリズム２と基板５との間の僅かな間隙は１００ｎｍ以下にすることが好ましい。つまり、本実施形態のＳＰＲ測定装置１０では、光学プリズム２と金属薄膜１５ａとがオット配置となるように構成されている。
【００４７】
次に、基板５を、流路１９の開閉部材（不図示）が下降し、導入ウェル１４と測定ウェル１５とが開通する回転速度で回転させる。なお、このとき他の流路は全て閉鎖されている。このことによって、第２分子溶液は流路１９を通じて移動し、測定ウェル１５に導入され、測定ウェル１５の底部に設けられた金属薄膜１５ａの上面上に第２分子が保持される。
【００４８】
次に、基板５の回転速度を高くし、流路１７、１８および２０の開閉部材２２ａ、２２ｂおよび２２ｃが下降し、導入ウェル１２、混合ウェル１３、測定ウェル１５および１６が開通する回転速度で基板５を回転させる。このことによって、第１分子溶液は流路１７、混合ウェル１３および流路１８を通じて移動し、測定ウェル１５に導入される。また、測定ウェル１５を通過した第１および第２分子溶液は、流路２０を通じて排出ウェル１６に排出される。
【００４９】
続いて、本実施形態の基板５の回転速度を維持することによって、第１分子溶液を一定の流速で流し続けることができる。また、回転速度を調節することによって、各流路および測定ウェル１５の金属薄膜１５ａ上を通過する液体の速度をコントロールすることができる。このように、本実施形態では、金属薄膜１５ａ上の流速を精密にコントロールするためのポンプなどの複雑な装置が不要である。
【００５０】
次に、本実施形態のＳＰＲ測定装置１０では、光源１から出射された光ビームが、光学プリズム２を経て測定ウェル１５に設けられた金属薄膜１５ａの下面において反射し、再び光学プリズム２を経て光検出器３で受光される。このとき、光ビームが表面プラズモンを誘起して、反射した光ビームの強度が最も減少する入射角、つまり共鳴角を検出する。
【００５１】
本実施形態のＳＰＲ測定装置１０では、回転ステージ４の回転軸の傾きを制御することが可能である。さらに、回転ステージ４の回転軸の傾きの変化に連動して、光学プリズム２の上方に測定ウェル１５の底部の金属薄膜１５ａが位置し、且つ、光学プリズム２の上方にわずかな間隙を介して基板５が配置されるように、光学プリズム２の配置を光学プリズム２を保持する手段（不図示）によって制御することも可能である。このため、ＳＰＲ測定装置１０は、金属薄膜１５ａに対する光ビームの入射角を変化させることができる。従って、金属薄膜１５ａの下面からの反射光強度が最小になる共鳴角に基づいて、金属薄膜１５ａの上面に表面プラズモンを誘起させ、その反射光を光検出器３で検出することにより被検試料（すなわち、本実施形態では第１分子）の特性を測定することができる。
【００５２】
本実施形態では、ＳＰＲ測定装置１０の光学プリズム２と、基板５の金属薄膜１５ａとが分離されている。このため、上面上に被検試料を配置した状態の金属薄膜１５ａを光学プリズム２の上方で移動させることが可能である。そこで、本実施形態では、基板５を回転させる構成となっている。このことによって、回転によって生じる遠心力を利用して、特別な装置を用いることなく、金属薄膜１５ａの上面上に液体を送ることができる。
【００５３】
さらに、基板５の回転速度を調節することによって、各流路および各測定ウェル１５の金属薄膜１５ａ上を通過する液体の速度をコントロールすることができる。つまり、従来のＳＰＲ測定装置では必要とされる、金属薄膜１５ａ上の流速を精密にコントロールするためのポンプなどの複雑な装置が、本実施形態のＳＰＲ測定装置１０では不要である。従って、ＳＰＲ測定装置の部品点数が著しく減少し、製造コストを大幅に低減することができる。
【００５４】
また、本実施形態では、基板５に複数の測定ユニット１１が設けられており、基板を回転させることによって、各測定ユニット１１のそれぞれの測定ウェル１５について、同時に測定することが可能である。従って、測定時間の大幅な短縮を図ることができる。例えば、本実施形態のように４つの測定ユニット１１を備える基板５を用いれば、１つの試料毎に測定を行なう従来のＳＰＲ測定装置に比べて約４倍高速化できる。勿論、測定ユニットの数が多くなるほど短縮の効率も上昇する。
【００５５】
本実施形態では、基板５の各流路に開閉部材を設けているが、これに限定されず、例えば、基板５の回転速度に応じて開閉する逆流防止弁を設けてもよい。つまり、基板５の回転速度に応じて開閉する手段であれば、いかなる手段を用いてもよい。
【００５６】
光源１としては、具体的には、半導体レーザー、波長可変レーザー、ヘリウムネオンレーザーなどのレーザーなどが組み込まれた装置、および発光ダイオード、面発光ダイオードなどが組み込まれた装置を用いることができる。
【００５７】
光学プリズム２としては、本実施形態の三角プリズムの他、円錐形状、半球形状の光学プリズムを用いてもよい。また、光学プリズム２を設ける構成を示したが、光学プリズム２を設けない構成とすることも可能である。但し、光学プリズム２を設けることによって、光ビームの金属薄膜１５ａの下面に対する入射角を小さくとることができるので、光学プリズム２を設ける構成とすることが好ましい。
【００５８】
また、光検出器３としては、具体的には、ＣＣＤアレイ、ＣＭＯＳイメージセンサなどが組み込まれた装置を用いることができる。
【００５９】
本実施形態では、基板５は、ガラスで形成されているが、プラスチックなどの透明な材料で形成されていてもよい。また、基板５の厚さは、回転速度の制御のしやすさを考慮して、１μｍ〜１０ｍｍ程度であることが好ましい。
【００６０】
オット配置で構成された従来のＳＰＲ測定装置においては、金属薄膜に限らず、バルクの金属であっても、その表面上の物質状態を測定することが可能である。
【００６１】
しかし、金属薄膜と光学プリズムとの間に間隙が存在するため、最適な表面プラズモン共鳴が生じる条件（反射光強度の入射角依存性を表す曲線が、深い谷を有し、半値幅が狭い（すなわち、鋭い吸収ピークを示す）曲線となる条件）を得るためには、光学プリズムと金属薄膜との距離をナノメートルレベルで制御する必要がある。このため、ＳＰＲ測定装置の構成が難しく、また被検試料と反応物質との間の結合、解離に伴う金属薄膜表面での微量な質量変化（すなわち、共鳴角の変化）を捕らえるための十分な感度を得ることが難しい。
【００６２】
そこで、本実施形態のＳＰＲ測定装置１０では、光学プリズム２と金属薄膜１５ａを有する基板５との間の僅かな間隙を一定に保つことが好ましい。
【００６３】
具体的には、光学プリズム２と基板５との間の僅かな間隙を一定に保つために、光学プリズム２を保持する手段（不図示）に、ＨＤＤの磁気ヘッド等と同様の構造を採用することが好ましい。
【００６４】
（実施形態２）
本実施形態のＳＰＲ測定装置を、図４を参照しながら説明する。
【００６５】
図４は、本実施形態のＳＰＲ測定装置の構成を表す断面図である。
【００６６】
図４に示すように、本実施形態のＳＰＲ測定装置４０は、光ビームを出射する半導体レーザー等からなる光源１と、コーナーキューブ型の光学プリズム２’と、光学プリズム２’を保持する手段（不図示）と、光検出器３と、回転ステージ４とを備えており、回転ステージ４上には、円盤状の基板５を搭載して、ＣＤ、レコード等のように基板５を回転させることができる構成となっている。
【００６７】
図４に示すように、本実施形態のＳＰＲ測定装置４０でも、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０と同様に、基板５を回転ステージ４上に搭載したとき、光学プリズム２’の上方に測定ウェル１５の底部の金属薄膜１５ａが位置するように、光学プリズム２’の上方にわずかな間隙を介して基板５が配置される。なお、基板５は上記実施形態１で述べたものであり、ここでは説明を省略する。
【００６８】
つまり、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０とほぼ同様の構成であるが、光学プリズム２の代わりにコーナーキューブ型の光学プリズム２’が設けられており、光学プリズム２’に対する光ビームの入射方向と出射方向とがほぼ同じ方向であり、光源１と光検出器３とがほぼ同じ位置に設けられている点でのみ異なる。
【００６９】
本実施形態のＳＰＲ測定装置４０は、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０とほぼ同様の構成であるので、上記実施形態１と同様の効果が得られる。
【００７０】
さらに、本実施形態のＳＰＲ測定装置４０では、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０に比べて、装置内の光ビームが通過する領域が限定される。このため、装置構成が非常に簡単になり、他の測定装置に設けられる部品の配置を自由度が向上する。つまり、本実施形態のＳＰＲ測定装置４０では、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０に比べて、設計の自由度が非常に高い。
【００７１】
（実施形態３）
図５は、本実施形態のＳＰＲ測定装置の構成を表す断面図である。
【００７２】
図５に示すように、本実施形態のＳＰＲ測定装置５０は、光ビームを出射する半導体レーザー等からなる光源１と、光学プリズム２と、光学プリズム２を保持する手段（不図示）と、ＣＣＤアレイを備える光検出器３’と、回転ステージ４と、アナライザー５５とを備えており、回転ステージ４上には、円盤状の基板５を搭載して、ＣＤ、レコード等のように基板５を回転させることができる構成となっている。
【００７３】
図５に示すように、本実施形態のＳＰＲ測定装置５０でも、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０と同様に、基板５を回転ステージ４上に搭載したとき、光学プリズム２の上方に測定ウェル１５の底部の金属薄膜１５ａが位置するように、光学プリズム２の上方にわずかな間隙を介して基板５が配置される。なお、基板５は上記実施形態１で述べたものであり、ここでは説明を省略する。
【００７４】
また、本実施形態のＳＰＲ測定装置５０には、基板５を回転ステージ４上に搭載したときに、光学プリズム２と、回転ステージ４と、基板５とを覆い、基板５の測定雰囲気を調節することができる温度制御部５４が設けられている。
【００７５】
さらに、光源１と光学プリズム２との間には、偏光板５１ａと、ビームスプリッター５２ａとが設けられており、光学プリズム２と光検出器３’との間には、ビームスプリッター５２ｂと、偏光板５１ｂとが設けられている。また、ミラー５３が設けられており、ビームスプリッター５２ａおよび５２ｂと、金属薄膜１５ａと、ミラー５３とは、光ビームの進路が長方形状になるように配置されている。
【００７６】
つまり、本実施形態のＳＰＲ測定装置５０は、Ｍａｃｈ−Ｚｅｎｄｅｒ干渉計を採用した構成となっている。
【００７７】
光源１から出射される光ビームは、偏光板５１ａを通過し、ビームスプリッター５２ａによって２方向に分離される。
【００７８】
分離された光ビームの一方は、光学プリズム２を通過し、金属薄膜１５ａの下面で反射され、再び光学プリズム２を通過し、ビームスプリッター５２ｂに達する。
【００７９】
分離された光ビームのもう一方は、ミラー５３で反射された後、ビームスプリッター５２ｂに達する。
【００８０】
２方向に分離された光ビームは、ビームスプリッター５２ｂによって再合成される。再合成された光ビームは、光検出器３’に到達する。
【００８１】
光ビームが光検出器３’に到達すると、検出結果がアナライザー５５に転送される。アナライザー５５は、金属薄膜１５ａの下面で反射された光ビームと、ミラー５３で反射された光ビームとの位相のずれを分析する。
【００８２】
本実施形態のＳＰＲ測定装置５０は、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０とほぼ同様の構成であるので、上記実施形態１と同様の効果が得られる。
【００８３】
さらに、本実施形態のＳＰＲ測定装置５０によれば、金属薄膜１５ａの下面で反射された光ビームと、ミラー５３で反射された光ビームとの位相のずれを分析することができる。このことによって、金属薄膜１５ａの上面の物質状態を視覚化することができる。
【００８４】
なお、本実施形態では、ビームスプリッター５２ａおよび５２ｂと、金属薄膜１５ａと、ミラー５３とは、光ビームの進路が長方形状になるように配置されているが、これに限定されない。ビームスプリッター５２ａおよび５２ｂと、金属薄膜１５ａと、ミラー５３とは、光源１から出射された光ビームが、ビームスプリッター５２ａによって分割され、分割されたそれぞれの光ビームは金属薄膜１５ａとミラー５３とで反射され、ビームスプリッター５２ｂによって合成され、光検出器３’に入射するように配置されていればよい。
【００８５】
また、温度制御部５４によって、基板５の測定雰囲気の温度を調節することができる。このため、様々な温度条件下での測定が可能になる。本実施形態では温度制御部５４を設ける構成としているが、勿論、必要に応じて温度制御部５４を設ける構成としてもよい。
【００８６】
（実施形態４）
図６は、本実施形態のＳＰＲ測定装置の構成を表す断面図である。
【００８７】
図６に示すように、本実施形態のＳＰＲ測定装置６０は、光ビームを出射する半導体レーザー等からなる光源１と、光学プリズム２と、光学プリズム２を保持する手段（不図示）と、ＣＣＤアレイを備える光検出器３’と、回転ステージ４とを備えており、回転ステージ４上には、円盤状の基板５を搭載して、ＣＤ、レコード等のように基板５を回転させることができる構成となっている。
【００８８】
図６に示すように、本実施形態のＳＰＲ測定装置６０でも、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０と同様に、基板５を回転ステージ４上に搭載したとき、光学プリズム２の上方に測定ウェル１５の底部の金属薄膜１５ａが位置するように、光学プリズム２の上方にわずかな間隙を介して基板５が配置される。なお、基板５は上記実施形態１で述べたものであり、ここでは説明を省略する。
【００８９】
さらに、光源１と光学プリズム２との間には、偏光板５１ａと、ビームスプリッター５２ａとが設けられており、光学プリズム２と光検出器３との間には、ビームスプリッター５２ｂと、偏光板５１ｂとが設けられている。また、ミラー５３が設けられており、ビームスプリッター５２ａおよび５２ｂと、金属薄膜１５ａと、ミラー５３とは、光ビームの進路が長方形状になるように配置されている。
【００９０】
また、本実施形態のＳＰＲ測定装置６０では、光検出器３に接続されたアナライザー５５と、アナライザー５５に接続されたＰＣ６１とを備えている。
【００９１】
つまり、本実施形態のＳＰＲ測定装置６０は、Ｍａｃｈ−Ｚｅｎｄｅｒ干渉計を採用した上記実施形態のＳＰＲ測定装置５０とほぼ同じ構成となっており、基板５の測定雰囲気を調節することができる温度制御部５４が設けられておらず、ＣＣＤアレイによって得られるイメージデータを解析するＰＣ６１を備える点でのみ異なる。
【００９２】
光源１から出射される光ビームは、偏光板５１ａを通過し、ビームスプリッター５２ａによって２方向に分離される。
【００９３】
分離された光ビームの一方は、光学プリズム２を通過し、金属薄膜１５ａの下面で反射され、再び光学プリズム２を通過し、ビームスプリッター５２ｂに達する。
【００９４】
分離された光ビームのもう一方は、ミラー５３で反射された後、ビームスプリッター５２ｂに達する。
【００９５】
２方向に分離された光ビームは、ビームスプリッター５２ｂによって再合成される。再合成された光ビームは、光検出器３’に到達する。
【００９６】
本実施形態のＳＰＲ測定装置６０は、上記実施形態３のＳＰＲ測定装置５０とほぼ同様の構成であるので、上記実施形態３と同様の効果が得られる。
【００９７】
さらに、本実施形態のＳＰＲ測定装置６０によれば、金属薄膜１５ａの下面で反射された光ビームと、ミラー５３で反射された光ビームとの位相のずれを分析することができる。また、本実施形態では、ＣＣＤアレイを備える光検出器３’によって、金属薄膜１５ａの上面上の被検試料のイメージデータを取得し、このイメージデータをＰＣ６１で解析することによって、例えばＰＣ６１に備え付けられたモニターに被検試料の金属薄膜１５ａの上面上での状態をイメージとして表示することができる。
【００９８】
なお、本実施形態では、ビームスプリッター５２ａおよび５２ｂと、金属薄膜１５ａと、ミラー５３とは、光ビームの進路が長方形状になるように配置されているが、これに限定されない。ビームスプリッター５２ａおよび５２ｂと、金属薄膜１５ａと、ミラー５３とは、光源１から出射された光ビームが、ビームスプリッター５２ａによって分割され、分割されたそれぞれの光ビームは金属薄膜１５ａとミラー５３とで反射され、ビームスプリッター５２ｂによって合成され、光検出器３’に入射するように配置されていればよい。
【００９９】
上述の実施形態１〜４では、本発明のＳＰＲ測定装置の基本的な構成を説明したが、以下の実施形態では、より具体的なＳＰＲ測定装置の構成を説明する。
【０１００】
（実施形態５）
図７は、本実施形態のＳＰＲ測定装置の構成を表す断面図である。
【０１０１】
図７に示すように、本実施形態のＳＰＲ測定装置７０は、光ビームを出射する半導体レーザー等からなる光源１と、光学プリズム２と、光学プリズム２を保持する手段（不図示）と、光検出器３と、回転ステージ４とを備えており、回転ステージ４上には、円盤状の基板５を搭載して、ＣＤ、レコード等のように基板５を回転させることができる構成となっている。
【０１０２】
また、光検出器３には、アナライザー５５が接続されており、アナライザー５５にはＰＣ６１が接続されている。
【０１０３】
図７に示すように、本実施形態のＳＰＲ測定装置７０でも、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０と同様に、基板５を回転ステージ４上に搭載したとき、光学プリズム２の上方に測定ウェル１５の底部の金属薄膜１５ａが位置するように、光学プリズム２の上方にわずかな間隙を介して基板５が配置される。なお、基板５は上記実施形態１で述べたものであり、ここでは説明を省略する。
【０１０４】
特に本実施形態では、光源１は、半導体レーザー７１と、コリメーターレンズ７２および７３と、偏光板７４とから構成されており、図７に示すように、平行光となった光ビームが光学プリズム２に入射するようになっている。
【０１０５】
さらに、光検出器３は、コリメーターレンズ７５および７７と、絞り７６と、ＣＣＤアレイ７８とを備えている。
【０１０６】
本実施形態のＳＰＲ測定装置７０は、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０とほぼ同様の構成であるので、上記実施形態１と同様の効果が得られる。
【０１０７】
さらに、本実施形態では、光ビームが金属薄膜１５ａの下面で反射され、コリメーターレンズ７５および７７と、絞り７６とで集光され、ＣＣＤアレイ７８に到達する。ＣＣＤアレイ７８は、金属薄膜１５ａの上面上の被検試料のイメージデータを取得し、このイメージデータをＰＣ６１で解析することによって、例えばＰＣ６１に備え付けられたモニターに被検試料の金属薄膜１５ａの上面上での状態をイメージとして表示することができる。
【０１０８】
（実施形態６）
図８は、本実施形態のＳＰＲ測定装置の構成を表す断面図である。
【０１０９】
図８に示すように、本実施形態のＳＰＲ測定装置８０は、光ビームを出射する発光ダイオード等からなる光源１と、光学プリズム２と、光学プリズム２を保持する手段（不図示）と、光検出器３と、回転ステージ４とを備えており、回転ステージ４上には、円盤状の基板５を搭載して、ＣＤ、レコード等のように基板５を回転させることができる構成となっている。
【０１１０】
また、光検出器３には、アナライザー５５が接続されており、アナライザー５５にはＰＣ６１が接続されている。
【０１１１】
図８に示すように、本実施形態のＳＰＲ測定装置８０でも、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０と同様に、基板５を回転ステージ４上に搭載したとき、光学プリズム２の上方に測定ウェル１５の底部の金属薄膜１５ａが位置するように、光学プリズム２の上方にわずかな間隙を介して基板５が配置される。なお、基板５は上記実施形態１で述べたものであり、ここでは説明を省略する。
【０１１２】
特に本実施形態では、光源１は、発光ダイオード８１と、偏光板８２と、コリメータレンズ８３とから構成されており、図８に示すように、光ビームが光学プリズム２に入射し、金属薄膜１５ａ上で集光されるようになっている。
【０１１３】
さらに、光検出器３は、コリメーターレンズ８４と、イメージセンサ８５（具体的には、ＣＭＯＳイメージセンサなど）とを備えている。
【０１１４】
本実施形態のＳＰＲ測定装置７０は、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０とほぼ同様の構成であるので、上記実施形態１と同様の効果が得られる。
【０１１５】
（実施形態７）
上述の実施形態１〜６では、本発明のＳＰＲ測定装置の基本的な構成を説明した。本実施形態では、上記実施形態１で説明した基板５の代わりにＳＰＲ測定装置に用いることができる別の基板を図９を参照しながら説明する。
【０１１６】
本実施形態の基板５’は、図２および図３に示した上記実施形態１の基板５とほぼ同じ構成であるが、測定ウェル１５の構造が異なる。
【０１１７】
図９は、本実施形態の基板の測定ウェルの断面図である。
【０１１８】
上記実施形態１〜６に示した基板５では、金、銀、アルミニウムなどの金属材料から形成されているが、本実施形態の基板５’では、図９に示すように、金属薄膜１５ａが、チタン酸化膜９２とその上に形成されたシリカ層９１とからなる積層膜となっている。
【０１１９】
チタン酸化膜９２の厚さは１ｍｍ以下とすることが好ましい。また、シリカ層９１の厚さは、光ビームの波長に応じて、チタン酸化膜９１に対して高率に共役反射（全反射）するように設計されている。
【０１２０】
本実施形態の基板を用いることによって、さらに共鳴角の測定を高感度で行なうことができる。
【０１２１】
【実施例】
（実施例１）
被検試料としてマウス海馬由来粗製膜分画を、反応物質としてカルバコールを用いて、上記実施形態１の測定用基板および測定装置を用いて共鳴角の変化の測定を行った。
【０１２２】
マウス海馬からの粗製膜分画の調整は次のように行った。マウスより全脳を氷冷下に摘出し、全脳をさらにシャーベット状のＥａｒｌｅ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（以下、ＥＢＳＳと称する：５．３ｍＭのＫＣｌ、１１７ｍＭのＮａＣｌ、２６ｍＭのＮａＨＣＯ３、１ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、および５．６ｍＭのＧｌｕｃｏｓｅの混合溶液）中に３分間放置した。なお、ここで使用したＥＢＳＳは、シャーベット状にする前に予め９５％Ｏ２＋５％ＣＯ２の混合気体を５分間通気しておいた。
【０１２３】
次に、３分間放置後、海馬だけを摘出し、はさみで砕片化後、０．０２％トリプシン−０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＥＢＳＳで３７℃、５分間処理を行った。このあと、先端を火であぶって滑らかにしたガラスピペットでピペッティングを行ない、細胞懸濁液を調製した。
【０１２４】
細胞懸濁液を調製した後、直ちに６００Ｇで１０分間遠心し、上清を捨て、細胞の沈殿を１０ｍｌのＥＢＳＳで２回洗浄した。次に、１ｍｌのＥＢＳＳに細胞の沈殿を懸濁した。その後、得られた懸濁液を、３７℃で３０分間静置した。次に、懸濁液に、９０％（ｗ／ｖ）ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｉｎ ＥＢＳＳを添加して懸濁液中のｇｌｙｃｅｒｏｌの濃度が約３０％となるように調製した。
【０１２５】
次に、０．６ｍｌのＥＢＳＳに上記懸濁液を添加し、さらに０．１ｍｌの９０％ｇｌｙｃｅｒｏｌを加えて混合し、５分間室温静置した。次に、０．１ｍｌの９０％ｇｌｙｃｅｒｏｌを加えての混合と、５分間の室温静置とを２回繰り返し、その後、１０分間氷冷（０〜４℃）した。
【０１２６】
次に、上記混合液に６００Ｇ、４℃にて１０分間遠心操作を行ない、細胞を回収した。続いて、得られた細胞にＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ＨＥＰＥＳ；１０ｍＭ、ＣａＣｌ２；１ｍＭ、ＭｇＳＯ４；１ｍＭ）を加え、５分間静置し細胞を爆発させた。そして、４℃にて１０分間洗浄を行ない、上清を別のチューブに集めた（ペレットは核、細胞のほかの断片を含み、細胞膜は上清中に存在する。）。０．１ｍｌの４０％（ｗ／ｗ）ｓｕｃｒｏｓｅの上に上清を静かに載せて、２０，０００Ｇ、４℃にて９０分間遠心し、沈殿（細胞膜は、水とｓｕｃｒｏｓｅの界面に存在する）を集めた。この沈殿をＥＢＳＳに再懸濁し、細胞膜溶液を調製した。
【０１２７】
続いて、上記実施形態１に示した基板５の金属薄膜１５ａの上面の処理を次のように行なった。
【０１２８】
まず、導入ウェルからジメチルホルムアミドに溶解した１０ｍＭのＤｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｕｎｄｅｃａｎｏａｔｅ）を導入し、回転ステージ４を回転制御して金属薄膜１５ａ上へ移動させた状態で一晩放置した。その後、導入ウェルからジメチルホルムアミドを注入し、回転ステージ４を制御して基板５を回転させて、金属薄膜１５ａおよび各流路の洗浄を行ない、排出ウェル１６から余分なジメチルホルムアミドを除いた。さらに基板５を回転させることによって金属薄膜１５ａの上面を完全に風乾させた。さらに、フィブロネクチンを導入し、回転ステージ４を回転制御して金属薄膜１５ａ上に移動させた状態で一晩放置した。
【０１２９】
続いて、ＳＰＲ測定装置１０全体を３７℃に保温し、上述の細胞膜溶液を基板５の導入ウェル１２から導入し、回転させることにより試料を移動させ、２０分間静置して、細胞膜分画を金属薄膜１５ａの上面上に固定した。その後、反応物質であるカルバコール（５ｎＭおよび１００ｎＭ）を導入ウェル１４から注入し、回転ステージ４にて回転を行なうことにより、反応物質を金属薄膜１５ａの上面上に２０分間送液させたところ、反射光強度の変化（すなわち、共鳴角の変化）が観測された。その結果を図１０に示す。
【０１３０】
図１０に示すように、反応物質であるカルバコールの濃度に依存して、反射光強度、すなわち共鳴角が変化していることがわかる。このことから、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０において、被検試料と反応物質との相互作用を測定することが可能であることがわかる。
【０１３１】
最後に、導入ウェル１４から０．３５ＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭ塩酸を注入して基板５を回転させることによって、金属薄膜１５ａの再生を行った。再生を行なったところ、カルバコールが金属薄膜１５ａから離脱する様子が観察された。また、再度カルバコールを導入して共鳴角の変化を測定したところ、図１０と同様の変化が再び観測された。このように、反応物質を再度、金属薄膜１５ａ上に固定することができた。
【０１３２】
（実施例２）
本実施例でも、上記実施形態１の測定用基板および測定装置を用い、基板５の金属薄膜１５ａの上面上にイオンセンシング膜を形成した。イオンセンシング膜として、Ｋ．Ｋｕｒｉｈａｒａらの方法（Ｋ．Ｋｕｒｉｈａｒａ、Ｅ．Ｈｉｒａｙａｍａ、Ｋ．Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｓ．Ｓａｓａｋｉ、Ｄ．ＣｉｔｔｅｒｉｏおよびＫ．Ｓｕｚｕｋｉ、Ｐｉｔｔｃｏｎ、２０００年、１３２３ページ）に準じて、イオン認識分子であるイオノフォアとｐＨ感応色素とを、液膜である可塑化ポリ塩化ビニルに保持したものを用いた。
【０１３３】
具体的には、可塑剤ＮＰＯＥとポリ塩化ビニルとを２対１の質量比で混合し、イオン認識分子として、Ｍｇ選択性イオノフォアＣ１４−Ｋ２２Ｂ５（同仁化学研究所製）、ｐＨ感応色素としてカチオン性色素を使用した。このイオンセンシング膜によって、マグネシウムイオンだけが、選択的に分子認識される。カチオン性色素は、電荷が中性からプラスになると、６３０ｎｍ波長に吸収が現れる性質を有する。さらにイオンセンシング膜が機能するように、イオン認識分子と、ｐＨ感応色素と、アニオン添加剤とをそれぞれ等モル混合した。
【０１３４】
本実施例で使用したイオンセンシング膜は、具体的には、５０ｍｇのポリ塩化ビニルと、１００ｍｇのＤＯＳと、５μｍｏｌのイオノフォアＣ１４−Ｋ２２Ｂ５と、カチオン性色素と、アニオン添加剤とを混合し、厚さ約５０ｎｍの金薄薄膜１５ａの上面上にスピンコーティング装置を使って、厚さ１．５μｍのイオンセンシング膜を形成した。
【０１３５】
このようにして形成されたイオンセンシング膜は、マグネシウムイオン濃度が高くなるにつれて、６３０ｎｍの波長の光吸収が増加する。この光吸収を定量することにより、マグネシウムイオン濃度を決定できる。そこで、実際に上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０を用いて、共鳴角と反射高強度とを測定した。なお、ＳＰＲ測定装置１０の光源１として、６６０ｎｍ付近の波長の光ビームを放射する半導体レーザーを用いた。図１１にマグネシウムイオン濃度に対する共鳴角の変化と反射高強度の変化とを示す。図１１に示すように、マグネシウムイオン濃度が増大するに従って、共鳴角（反射光強度が極小になる入射角）における反射光強度が増加し、同時に共鳴角の高角度側へのシフトが観測された。
【０１３６】
従来のＳＰＲ測定法においては低分子物質については、検出が困難であったが、本実施例で示すように、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０と、金属薄膜１５ａの上面上にイオンセンシング膜が形成された基板５と用いることにより、イオンのような非常に小さい原子または分子を検出することができる。
【０１３７】
なお、本実施例ではイオンセンシング膜を金属薄膜１５ａの上面上に形成したが、これに限定されない。例えば、自己組織単分子膜（ＳＡＭ膜）、生体分子親和性膜（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ポリＬリジン、ポリオルニチン、ポリエチレンイミンなどで形成される膜）などを金属薄膜１５ａの上面上に公知の方法で形成してもよい。
【０１３８】
（実施例３）
本実施例では、被検試料としてラット血管平滑筋細胞粗製膜分画を基板５の金属薄膜１５ａの上面上に固定し、上記実施形態１の測定用基板および測定装置を用いて測定を行なった。
【０１３９】
ラット血管平滑筋細胞粗製膜画分の調整を次のように行なった。
【０１４０】
まず、１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ：ウシ胎児血清）および抗生物質を含有したＤＭＥＭ倍地が貯留された７５ｃｍ２フラスコ４本を用いて、５％の二酸化炭素ガスを通気した３７度の高温槽にてラット平滑筋細胞を培養した。８０％のコンフルエンシーに達したところで、７５ｃｍ２フラスコ４本の内部の培地をＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地に交換して、一晩３７度の恒温槽にて培養を行った。
【０１４１】
その後、４℃にて保存していたＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）でラット平滑筋細胞を２回洗浄し、予め氷冷しておいたダウンスホモジナイザーにてラット平滑筋細胞をホモジナイズした。ホモジナイズ液を１５ｍｌのポリプロピレンチューブに移し、１０００ｇにて１０分間遠心を行った後、上清を４℃、１０００００ｇにて４５分間遠心を行った。
【０１４２】
遠心後に得られた沈殿物を２Ｘｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを含む７５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む溶液に溶解した。
【０１４３】
まず、導入ウェルからジメチルホルムアミドに溶解した１０ｍＭのＤｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｕｎｄｅｃａｎｏａｔｅ）を導入し、回転ステージ４を回転制御して金属薄膜１５ａ上へ移動させた状態で一晩放置した。その後、導入ウェル１２からジメチルホルムアミドを注入し、回転ステージ４を制御して基板５を回転させて、金属薄膜１５ａおよび各流路の洗浄を行ない、排出ウェル１６から余分なジメチルホルムアミドを除いた。さらに基板５を回転させることによって金属薄膜１５ａの上面を完全に風乾させた。
【０１４４】
続いて、１０ｍＭのβ−ｏｌｅｏｙｌ−γ−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ（以下ＰＣＯＰ）と上記方法にて調整したラット平滑筋細胞粗製膜分画との混合溶液を超音波処理することによって混合し、導入ウェル１２から注入し、上述のように処理された基板５の金属薄膜１５ａに保持されるように回転ステージ４により基板５を回転させた後、２０分間静置することによって、ラット平滑筋細胞粗製膜分画を金属薄膜１５ａ上に固定した。その後、反応物質である１００ｎＭおよび１０μＭのノルエピネフリン溶液を導入ウェル１４から導入し、回転ステージ４で基板５を回転させることによって、ノルエピネフリン溶液を２０分間送液し、反射光強度の変化を観測した。その結果を図１２に示す。
【０１４５】
図１２に示すように、反応物質であるノルエピネフリンの濃度に依存して、反射光強度、すなわち共鳴角が変化していることがわかる。このことから、上記実施形態１のＳＰＲ測定装置１０において、被検試料と反応物質との相互作用を測定することが可能であることがわかる。
【０１４６】
【発明の効果】
本発明によれば、測定用基板を回転させて測定することが可能な測定装置およびそれに用いる測定用基板を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施形態１のＳＰＲ測定装置の構成を表す断面図である。
【図２】図２は、実施形態１のＳＰＲ測定装置に用いられる基板を表す上面図である。
【図３】図３（ａ）は、図２に示す測定ユニットを拡大して表している上面図であり、図３（ｂ）は、図３（ａ）に示したＸ−Ｘ線に沿った断面図である。
【図４】図４は、実施形態２のＳＰＲ測定装置の構成を表す断面図である。
【図５】図５は、実施形態３のＳＰＲ測定装置の構成を表す断面図である。
【図６】図６は、実施形態４のＳＰＲ測定装置の構成を表す断面図である。
【図７】図７は、実施形態５のＳＰＲ測定装置の構成を表す断面図である。
【図８】図８は、実施形態６のＳＰＲ測定装置の構成を表す断面図である。
【図９】図９は、実施形態７の基板の測定ウェルの断面図である。
【図１０】図１０は、マウス海馬由来粗製膜分画と、カルバコール（５ｎＭおよび１００ｎＭ）との相互作用を、反射光強度の変化によって観測した結果を示す図である。
【図１１】図１１は、マグネシウムイオン濃度に対する共鳴角の変化と反射高強度の変化とを示す図である。
【図１２】図１２は、ラット平滑筋細胞粗製膜分画と、ノルエピネフリン（１００ｎＭおよび１０μＭ）との相互作用を、反射光強度の変化によって観測した結果を示す図である。
【図１３】図１３は、クレッシュマン配置で構成された従来のＳＰＲ測定装置を示す模式的な断面図である。
【符号の説明】
１ 光源
２、２’ 光学プリズム
３、３’ 光検出器
４ 回転ステージ
５、５’ 基板
１０、４０、５０、６０、７０ ＳＰＲ測定装置
１１ 測定ユニット
１２、１４ 導入ウェル
１３ 混合ウェル
１５ 測定ウェル
１５ａ 金属薄膜
１６ 排出ウェル
１７、１８、１９、２０ 流路
２１ カラム部
２２ａ、２２ｂ、２２ｃ 開閉部材
５１ａ、５１ｂ 偏光板
５２ａ、５２ｂ ビームスプリッター
５３ ミラー
５４ 温度制御部
５５ アナライザー
６１ ＰＣ
７１ 半導体レーザー
７２、７３、７５、７７ コリメーターレンズ
７４ 偏光板
７６ 絞り
７８ ＣＣＤアレイ
８１ 発光ダイオード
８２ 偏光板
８３、８４ コリメータレンズ
８５ イメージセンサ
９１ シリカ層
９２ チタン酸化膜
Claims (15)
- 光ビームを金属薄膜に照射し、上記金属薄膜の表面に表面プラズモン共鳴が誘起される光ビームの共鳴角の変化を測定するための表面プラズモン共鳴を利用する測定装置であって、
光ビームを出射する光源と、
金属薄膜を備える基板を設置し、回転させるための回転ステージと、
光検出器とを備える測定装置。 - 請求項１に記載の測定装置において、
上記回転ステージは、回転速度を調節することができることを特徴とする測定装置。 - 請求項１に記載の測定装置において、
上記回転ステージは、回転軸の角度を調節することができることを特徴とする測定装置。 - 請求項１に記載の測定装置において、
上記基板の温度を制御する温度制御部をさらに備えることを特徴とする測定装置。 - 請求項１に記載の測定装置において、
金属薄膜を有する基板が上記回転ステージ上に設置されたときに、上記金属薄膜の主面に対向し、上記基板に離間して配置されるように設けられた光学プリズムをさらに備え、
上記光源から出射される光ビームは、上記光学プリズムを介して上記金属薄膜に照射され、上記金属薄膜の主面によって反射された後、上記光学プリズムを介して光検出器に入射することを特徴とする測定装置。 - 請求項５に記載の測定装置において、
上記光学プリズムと上記基板との間隙の長さは、１００ｎｍ以下であることを特徴とする測定装置。 - 請求項５に記載の測定装置において、
第１および第２のビームスプリッターと、ミラーとをさらに備え、
上記第１および第２のビームスプリッターと上記ミラーとは、上記光源から出射された光ビームが、上記第１のビームスプリッターによって分割され、分割されたそれぞれの光ビームは上記金属薄膜と上記ミラーとで反射され、上記第２のビームスプリッターによって合成され、上記光検出器に入射するように配置されていることを特徴とする測定装置。 - 請求項１に記載の測定装置において、
上記光検出器は、ＣＣＤアレイを備えていることを特徴とする測定装置。 - 光ビームを金属薄膜に照射することによって、上記金属薄膜の表面に表面プラズモン共鳴が誘起される光ビームの共鳴角の変化を測定するための表面プラズモン共鳴を利用する測定装置に用いられる円形状の測定用基板であって、
液体を貯留するための少なくとも１つの第１ウェルと、
上記少なくとも１つの第１ウェルに接続された少なくとも１つの第１流路と、上記少なくとも１つの第１流路に接続され、金属薄膜を備える少なくとも１つの第２ウェルとを備え、
上記第２ウェル内には、上記金属薄膜が露出していることを特徴とする測定用基板。 - 請求項９に記載の測定用基板において、
上記少なくとも１つの第１ウェルは、第１の円の周上に位置するように設けられた複数の第１ウェルであり、
上記少なくとも１つの第１流路は、上記複数の第１ウェルのそれぞれに接続された複数の第１流路であり、
上記少なくとも１つの第２ウェルは、上記第１の円と同心円であり、且つ、上記第１の円よりも大きい直径を有する第２の円周上に位置するように設けられた複数の第２ウェルであることを特徴とする測定用基板。 - 請求項１０に記載の測定用基板において、
上記第２の円と同心円であり、且つ。上記第２の円よりも小さい直径を有する第３の円周上に位置するように設けられた複数の第３ウェルと、
上記複数の第２ウェルのそれぞれと、上記複数の第３ウェルのそれぞれとを互いに接続する第２流路とをさらに備えることを特徴とする測定用基板。 - 請求項９に記載の測定用基板において、
上記少なくとも１つの第１流路には、標的試料を抽出または精製するための抽出・精製部が設けられていることを特徴とする測定用基板。 - 請求項９に記載の測定用基板において、
上記金属薄膜は、クロムまたはニッケルからなる下層膜とその上に形成された金、銀およびアルミニウムのいずれか１つからなる上層膜との積層膜であることを特徴とする測定用基板。 - 請求項９に記載の測定用基板において、
上記金属薄膜は、チタン酸化膜とその上に形成されたシリカ層とからなる積層膜となっており、
上記シリカ層の厚さは、光ビームが上記チタン酸化膜に対して高率で共役反射するように設計されていることを特徴とする測定用基板。 - 光ビームを金属薄膜に照射することによって、上記金属薄膜の表面に表面プラズモン共鳴が誘起される光ビームの共鳴角の変化を測定するための表面プラズモン共鳴を利用する測定装置に用いられる円形状の測定用基板であって、
第１の円の周上に位置するように設けられた、液体を貯留するための複数の第１ウェルと、
上記複数の第１ウェルに接続された複数の第１流路と、
上記複数の第１流路に接続され、上記第１の円と同心円であり、且つ、上記第１の円よりも大きい直径を有する第２の円周上に位置するように設けられた、金属薄膜を備える複数の第２ウェルとを備え、
上記複数の第２ウェルのそれぞれの内部には、上記金属薄膜が露出していることを特徴とする測定用基板。
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| JP2002277693A JP2004117048A (ja) | 2002-09-24 | 2002-09-24 | 表面プラズモン共鳴を利用する測定装置およびそれに用いる測定用基板 |
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- 2002-09-24 JP JP2002277693A patent/JP2004117048A/ja active Pending
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