JP2004113234A

JP2004113234A - 植物の遺伝子に生じた特徴的な塩基配列、及びそれを利用する方法

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Publication number: JP2004113234A
Application number: JP2002327515A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiro Sato; 佐藤　和広; Kazuyoshi Takeda; 武田　和義; Yuji Obara; 小原　雄治
Original assignee: Okayama University NUC
Current assignee: Okayama University NUC
Priority date: 2002-09-27
Filing date: 2002-09-27
Publication date: 2004-04-15

Abstract

【課題】オオムギの遺伝子に生じた一塩基多型（ＳＮＰ）、及びその利用方法を提供する。
【解決手段】オオムギ品種である「Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ」、「はるな二条」、「赤神力」由来のｃＤＮＡクローンを大量シーケンシングし、品種間で一塩基多型（ＳＮＰ）が認められる部位のうち特に非同義置換を生ぜしめるＳＮＰを見出した。この非同義置換ＳＮＰは、品種固有の表現型に関与する可能性が高いことから様々な用途に利用できる。例えば、上記非同義置換ＳＮＰを含む領域から合成したオリゴヌクレオチドは、オオムギの遺伝子上にある多型部位の塩基を判定する道具として利用でき、これにより遺伝学的品種識別やいずれのタイプの遺伝子を有するかの判定などが可能となる。また、このオリゴヌクレオチドを遺伝子単離用または一塩基多型検出用のプローブとして用い、新規な形質転換体を生産・選別することもできる。
【選択図】　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、オオムギの遺伝子に関する。より詳細には、オオムギの品種間における遺伝子の塩基配列の相違を明らかにし、オオムギの遺伝子の品種間における塩基配列の特徴を明らかにし、もってオオムギの品種の検定や同定に利用することにより、オオムギなどの植物の品種改良を効率的に行えるようにするものである。
【０００２】
本発明のオオムギの遺伝子の品種間における塩基配列の特徴としては、オオムギの品種の相違に関連する一塩基多型（ＳＮＰ：ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）に関するものであり、本発明はこのような遺伝子の特徴を利用するためのヌクレオチドやそれを用いた方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
ムギやイネなどの穀物植物は人類の食糧源として古くから栽培されてきた植物である。我が国では、ムギはイネ科の冬作物としてコムギとオオムギの総称として用いられてきているが、諸外国ではコムギ、オオムギ、ライムギ、及びエンバクに類別されている。
【０００４】
オオムギは、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）に属する植物であり、その原産地は中央アジアであるとされている。オオムギはその後の品種改良などにより、穂の条性、粒の皮裸性、穂軸の脆さの程度などに基づいて、カワムギとハダカムギという分け方や、六条種と二条種という分け方をされてきている。一般には、ハダカムギという場合には六条種ハダカムギのことを言い、二条種カワムギはビールムギとも呼ばれている。
【０００５】
オオムギの用途で最も多いのは飼料用である。飼料用オオムギの多くは子実利用であるが、中近東やオーストラリアの内陸ではオオムギを放牧地に栽培して飼料とするグレージングとしても利用されている。また特殊な利用形態として、キプロスでは脱落性の系統を選抜して栽培し、成熟後脱落する種子から自然に再生する草地を利用している。飼料オオムギの育種目標は耐病性や耐倒伏性などの収量関連の形質であり、品質に関する育種は少ない。オオムギを食用に用いているのは主にアジア地域であり、現在でもヒマラヤ周辺地域では六条ハダカムギを主食として用いている。これらの地域では在来種が主に栽培されており、標高が高く乾燥していることもあって病害の発生は少なく、収量性も比較的高い。また、粉食にする場合は穀粒の外観はほとんど選抜の対象にならないので、穂の形態や粒色に極めて多様な変異をしたものも利用されている。
【０００６】
我が国での食用オオムギは六条種であり、特にハダカムギには粒形が米粒に近い渦性という半矮性のオオムギが西日本を中心に用いられてきた。このようなハダカムギの代表的なものとして、収量性が高く、かつ耐湿性があり、病害虫に抵抗性のある品種「赤神力」が挙げられる。この品種は、昭和３０年頃には非常に多く栽培されていた品種であり、現在の品種改良分野においても育種母本として頻繁に使用されている。例えば、昭和５８年に奨励品種に指定された「ユウナギハダカ」は増収性が高く、耐湿性があり、病害虫に比較的強い抵抗性を示す品種であり、この品種は「赤神力」と「香川裸１号」との交配によって生み出された優れた品種である。
【０００７】
一方、ビールオオムギに求められる事項としては一般的に、１）外観は淡黄色で光沢があり粒は大きく斉一であること、２）発芽力が旺盛で斉一であること（発芽率９５％以上）、３）澱粉価が高く、蛋白質含有量が適当であること、４）酵素力が強いこと、５）βグルカン、ポリフェノールなどの含有量が適当なことである。現在、これらの事項を満たしているビールオオムギとして最も優れているとされている品種は「はるな二条」である。「はるな二条」は、ビールオオムギとして世界最高水準の品質を誇り、育種母本としても各国で広く利用されている。この品種は、「Ｇ６５」と「Ｋ−３」の交配系統に「成城１５号」を交配して育成された固定品種であり、ビールオオムギの品質の指標となっている。しかしながら、脱粒性、耐倒伏性および原麦収量に劣り、さらに、縞萎縮病、赤かび病、うどんこ病などの抵抗性が弱いという欠点もある。そのため、抵抗性のある品種との交配がしばしば行われ、例えば、耐病性のある「ニシノゴールド」は、縞萎縮病抵抗性品種である「木石港３」と、「アズマゴールデン」との戻し交配で得られた「南系Ｂ４７１８」とを交配させ、さらに基幹品種である「はるな二条」との２回の交配で得られた品種である。これは単一遺伝子の縞萎縮病抵抗性の導入操作でありながら、２０年もの歳月を要した例でもある。
【０００８】
近年は収量もさることながら、求められる品質が高度であり、品質の規格化がすすみ、需要者との合意の上で新品種の育成や普及をはかるようになってきており、イネをはじめ多種多様な作物で遺伝子導入による改良が行われている。しかしながら、オオムギは、プロトプラストからの再分化が難しいことや、ゲノムサイズがイネの１０倍以上もあることなどから、画期的かつ本質的な技術、特に遺伝的な解析が停滞している作物の一つである。
【０００９】
オオムギの染色体数はすべて２ｎ＝１４で相互に交配可能であるため、「あまぎ二条」、「はるな二条」、「にらさき二条」、「なす二条」、「とね二条」、「みょうぎ二条」、「こまき二条」、「きぬか二条」、「タカホゴールデン」などの多くの品種が交配育種法により産み出されてきた。
【００１０】
しかし、従来の交配育種法は、相補的に有用な形質を持つ個体を交配し選抜することで、複数の有用な形質を新たに組み合わせる方法であり、交配育種法では目的とする遺伝子以外の形質も同時に導入されるので、不要な形質を除去し、優良な形質のみを固定するためには何世代もの長い時間と試行錯誤が必要であった。さらに、どのような組み合わせが出現するかを予測することができないために多数の個体を栽培しなければならず、育種のために広大な面積が必要とされていた。
【００１１】
他方、近年の遺伝子工学を用いた育種法では、交雑を重ねる必要がないため、従来よりも短期間で目的に適した農作物に改良することができる。例えば、特定の形質に関わる遺伝子をクローニングし、植物体に導入して形質転換植物を作成することも可能となる。理論的には、導入する遺伝子の機能と表現型との関係は明確であり、望ましい形質のみを導入することができ、かつ目的に沿って計画的な品種の改良が行えることになる。
【００１２】
遺伝子マーカーを用いた育種も、遺伝子工学を用いた育種の一つである。遺伝子マーカーは有用遺伝子と連鎖し、その形質が発現するときに必ず現れるＤＮＡのバンドのことである。遺伝子マーカーを得るための手法としては、ＲＦＬＰ法、ＲＡＰＤ法、ＡＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法などがある。例えば、ＲＡＰＤ法では、任意配列のＤＮＡをプライマーに用い、ＰＣＲを行いＤＮＡを増幅する。ＤＮＡのバンドパターンを検出するために、増幅したＤＮＡを染色後、寒天のゲルで電気泳動し、ＤＮＡのバンドパターンを解析する。そして、特異的な多型バンドについて調査し、有用形質と同じ動きをするバンドであれば、遺伝子マーカーとしての利用が可能となる。交配育種法において遺伝子マーカーによる選抜を行えば、育種労力の軽減、育種の早期化を図ることが可能となる。
【００１３】
上記の遺伝子マーカーは異なる形質を持つ品種間の遺伝子多型を見るものであり、第１世代とも呼べる遺伝子多型マーカーである。この遺伝子マーカーをひとつひとつ探していくには莫大な労力を要する。またゲノム中に存在する遺伝子マーカーの数は数万が上限であり、遺伝学的に得られる情報も有限である。
【００１４】
２１世紀型多型マーカーとして、一塩基多型（以下、単にＳＮＰともいう。）が注目されている。ＳＮＰとは品種間において１個の塩基が他の塩基に置き換わっているものであり、ゲノム中に数万〜数百万のＳＮＰがあると考えられている。ＳＮＰはこのように数が多いながら、判定が非常に容易であり、結果を（０，１）のデジタル化信号にすることができるため情報処理化も容易である。また、高速かつ大量のＳＮＰタイピング技術が実用化されつつあり、タイピングのオートメーション化も視野に入って来ていることから、極めて有用で利用しやすい多型マーカーとしてＳＮＰは注目を集めている。
【００１５】
ゲノム中のＳＮＰの全てが必ずしも重要な意義を有するものではなく、蛋白質の翻訳領域におけるアミノ酸の変化を伴うＳＮＰ（ｃＳＮＰ（ｃｏｄｉｎｇ　ＳＮＰ））や、プロモーター領域やイントロンなどの遺伝子の発現量に影響を及ぼす調節領域でのＳＮＰ（ｒＳＮＰ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ＳＮＰ））などは表現型の変化を伴う可能性が極めて高く重要なＳＮＰと考えられている。また、蛋白質の翻訳領域におけるアミノ酸の変化を伴わないＳＮＰ（ｓＳＮＰ（ｓｉｌｅｎｔ　ＳＮＰ））や、構造遺伝子と関連していない部位のＳＮＰ（ｇＳＮＰ（ｇｅｎｏｍｅ　ＳＮＰ））などは表現型との関連性が少ないと考えられており重要性は低い。したがって、多数のＳＮＰの中でもｃＳＮＰやｒＳＮＰのみに着目すれば、品種間の多型マーカーとして極めて有用なものとなる。
【００１６】
オオムギで発現する遺伝子とその有用な形質との関係についての概観を得るためには、有用な形質を持つオオムギ、例えば育種母本として利用されている「はるな二条」や「赤神力」と、野生オオムギの品種間での構造遺伝子に関連する部位でのＳＮＰを調査することが効率的である。このようにオオムギの品種間で安定的に認められるｃＳＮＰやｒＳＮＰを見出すことが出来れば、オオムギの遺伝子マッピングや品種改良などに役立つことが期待され、例えば、交配育種法において、不要な形質の導入の少ない品種を選抜して有望個体を絞り込むマーカーとして用いることができる。
【００１７】
全発現遺伝子の解析から得られたＳＮＰのセットであれば、そのＳＮＰの幾つかは有用形質に係わるものであることが容易に推定される。従って、このＳＮＰのセットを品種改良に用いるマーカーとして用いることが可能である。
【００１８】
しかし、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ）のゲノムサイズは、約５，０００Ｍｂｐとイネの１０倍以上あり、構造遺伝子との関連性も明確にされていないことから、ゲノム解析の結果からオオムギのＳＮＰ解析をすることは困難な状況になっている。
【００１９】
なお、本発明者らが後述のオオムギのＥＳＴプロジェクトにおいて明らかにしたＥＳＴ配列データの一部は、データバンクに登録済である（下記の非特許文献１参照）。
【００２０】
【非特許文献１】
電気通信回線『国立遺伝学研究所　生命情報・ＤＤＢＪ研究センター　日本ＤＮＡデータバンク』（アクセッション番号：ＡＶ９３８０８０他）
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、詳細には育種母本として利用されている「はるな二条」及び「赤神力」、並びに野生オオムギとの品種間での構造遺伝子に関連する部位での遺伝子の塩基配列の特徴点を明らかにすることを目的としている。
【００２２】
また、本発明は、このような品種間の遺伝子の塩基配列の特徴を、遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ：ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）により明らかにし、当該ＳＮＰの部位を含むオリゴヌクレオチドの有用性を開示すると共に、当該ＳＮＰを品種間の多型マーカーなどとして広く利用する方法を提供することを目的とするものである。さらに、本発明の目的は当該ＳＮＰを利用した育種方法を開示するものである。
【００２３】
【課題を解決するための手段】
オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ）のゲノムサイズは、約５，０００Ｍｂｐとイネの１０倍以上あり、構造遺伝子との関連性も明確にされていないことから、ゲノム解析の結果からオオムギのＳＮＰ解析をすることは困難な状況であるが、本発明者らは、オオムギのｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡ配列を用いたＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇ）プロジェクトの結果から、ＳＮＰの解析を行うことを検討してきたところ、ＥＳＴの中に品種間における多数のＳＮＰが安定的に認められることを見出した。
【００２４】
即ち、本発明者らは、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ）のＥＳＴプロジェクトにおいて、複数の品種の組織から抽出されたｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡをクローン化し、次いでオーバーラップした挿入断片を有する一連のクローン群をアセンブリして、ひとつのクローンとしての配列（以下、このようにしてアセンブリされた配列を「コンティグ」（ＣＯＮＴＩＧ）と総称する。）になるように解析してきた。しかし、正確に解析を進めてきても１種類の塩基に確定し得ない箇所が生じることを見出し、これがオオムギの品種による塩基の種類の相違（ＳＮＰ）であることを確認した。そして、このコンティグ配列は、ｃＤＮＡライブラリーから作製されたものであることから、オオムギが有するゲノムのうち実際に発現する領域（エクソンの一部または全部）に相当するものであり、ＳＮＰの中でもｃＳＮＰに相当する可能性が極めて高いものである。本発明者らは、得られたコンティグ配列についてさらに解析を進めて、特に非同義置換を生ぜしめる一塩基多型を選別し、オオムギの品種間における重要なＳＮＰを見出した。
【００２５】
即ち、本発明は、配列番号１〜５３４の何れかに表されるＤＮＡ配列において、塩基の表記が「ユニバーサルコード」で記載されている多型部位のうち、非同義置換を生ぜしめる多型部位の少なくとも一つを含む７ヌクレオチド以上の連続したＤＮＡ配列、またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、及び当該オリゴヌクレオチドの少なくとも一つを含んでなる、遺伝子に生じた一塩基多型を検定又は同定するための組成物に関する。
【００２６】
また、本発明は、配列番号１〜５３４の何れかに表されるＤＮＡ配列において、塩基の表記が「ユニバーサルコード」で記載されている多型部位のうち、非同義置換を生ぜしめる多型部位、またはその相補部位の少なくとも一つに基づいて、被検体の遺伝子に生じた一塩基多型を検定又は同定する方法に関する。
【００２７】
さらに、本発明は、配列番号１〜５３４の何れかに表されるＤＮＡ配列において、塩基の表記が「ユニバーサルコード」で記載されている多型部位のうち、非同義置換を生ぜしめる多型部位、またはその相補部位の少なくとも一つを含有する遺伝子を単離する工程と、得られた遺伝子を遺伝子操作技術を用いて対象とする細胞に導入する工程とを含む形質転換体の生産方法、及びその方法により生産された形質転換体に関する。
【００２８】
また、本発明は、配列番号１〜５３４の何れかに表されるＤＮＡ配列において、塩基の表記が「ユニバーサルコード」で記載されている多型部位のうち、非同義置換を生ぜしめる多型部位、またはその相補部位の少なくとも一つを含有する遺伝子を持つ親植物Ａと、この遺伝子を有さない、あるいはこの遺伝子に一塩基多型が生じたアリルを有する親植物Ｂとを交配させて雑種の植物を作出する工程と、次いで、当該雑種の植物の中から前記遺伝子を持つものを、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも一つを用いて、又は請求項３に記載の検定方法を用いて選抜する工程とを含んでなる形質転換体の生産方法、及びその方法により生産された形質転換体に関する。
【００２９】
そして、本発明は、配列番号１〜５３４の何れかに表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチドにおける、塩基の表記が「ユニバーサルコード」で記載されている多型部位のうち、非同義置換を生ぜしめる多型部位の少なくとも一つを含む領域、またはその相補領域の少なくとも一方を増幅し得るように設計されたプライマーに関する。
【００３０】
本発明における「非同義置換を生ぜしめる多型部位」とは、以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに該当する多型部位のことをいう。
（ａ）当該多型部位の塩基の相違に応じて、当該多型部位を含むコドンによりコードされるアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、または、当該多型部位を含むコドンが停止コドンに変化することとなる多型部位。
（ｂ）当該多型部位の相補部位における塩基の相違に応じて、その相補部位を含むコドンによりコードされるアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、または、その相補部位を含むコドンが停止コドンに変化することとなる多型部位。
【００３１】
つまり、上記（ａ）は、配列表に記されるＤＮＡ配列がセンス鎖であり、多型部位そのものがアミノ酸の非同義置換を生ぜしめる場合である。一方、上記（ｂ）は、その相補配列がセンス鎖であり、多型部位の相補部位がアミノ酸の非同義置換を生ぜしめる場合である。
【００３２】
本発明における「ユニバーサルコード」とは、前記した「コンティグ」（ＣＯＮＴＩＧ）においてアセンブリの結果、特定の１種類の塩基に確定することができなかった部位において、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴの４種の塩基のうちの２種以上の塩基のいずれかであることを１文字で表現するためのコードであり、各文字は次のように定義される。
【００３３】
Ｒ　＝　Ａ　又は　Ｇ　：
Ｙ　＝　Ｃ　又は　Ｔ　：
Ｍ　＝　Ａ　又は　Ｃ　：
Ｋ　＝　Ｇ　又は　Ｔ　：
Ｓ　＝　Ｇ　又は　Ｃ　：
Ｗ　＝　Ａ　又は　Ｔ　：
Ｈ　＝　Ａ　又は　Ｔ　又は　Ｃ　：
Ｂ　＝　Ｇ　又は　Ｔ　又は　Ｃ　：
Ｖ　＝　Ｇ　又は　Ａ　又は　Ｃ　：
Ｄ　＝　Ｇ　又は　Ａ　又は　Ｔ　：
Ｎ　＝　Ａ　又は　Ｃ　又は　Ｇ　又は　Ｔ。
【００３４】
本明細書（配列表を含む）においては、「はるな二条」、「赤神力」、および野生型オオムギにおける塩基の相違を、前記で定義した「ユニバーサルコード」により表現している。
【００３５】
また、本発明における「多型」とは、ＤＮＡ上（ｃＤＮＡ上またはゲノムＤＮＡ上）の対応する位置に存在する塩基が、オオムギの品種間、より詳細には本発明においては「はるな二条（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　ｖａｒ．の一品種名）」、「赤神力（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　ｖａｒ．の一品種名）」、および野生型オオムギの間で互いに異なることをいう。換言すれば、上記「多型」とは、特定の遺伝子とそのアリルとの間（あるいはそれぞれの相補配列間）に認められる多型をいい、特に、本発明では、オオムギ品種間で安定的に保存された、ＤＮＡ配列中にある一塩基多型それぞれを指すものとする。
【００３６】
本発明における「多型」は、オオムギの品種「はるな二条」と「赤神力」、「野生型オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　ｓｓｐ．　ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ（岡山大学資源生物科学研究所　大麦・野生植物資源研究センターの登録番号ＯＵＨ６０２））（以下、Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍと称する）」との組み合わせにより見出されたものである。「はるな二条」は、ビール醸造用の二条オオムギとして広く普及する栽培品種であり、「赤神力」は、食用の六条オオムギとして知られる栽培品種である。また、「Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ」は、西アジア原産の二条オオムギに属するオオムギの祖先型と目される野生オオムギ（祖先野生型）である。つまり、これら三品種のオオムギは、同属同種ではあるが遺伝子的な隔たりがあり、この遺伝子の相違が「はるな二条」や「赤神力」の有用な形質を特徴付けるものである。より具体的には、例えば、多型部位における塩基の相違により、「Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ」に環境抵抗性遺伝子（病虫害抵抗性遺伝子、不良環境耐性遺伝子など）が発現し、「はるな二条」や「赤神力」にそのアリルが発現する可能性が考えられる。また、「はるな二条」に良好な醸造特性に関与する遺伝子が発現し、「赤神力」に特有の遺伝子が発現し、「Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ」にそのアリルが発現している可能性が考えられる。
【００３７】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、後に詳述するように、オオムギの「はるな二条」、「赤神力」、及び「Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ」の各組織から抽出したｍＲＮＡをもとにそれぞれｃＤＮＡライブラリーを作製し、その後数万にも及ぶｃＤＮＡクローンのシークエンス解析を行った。また、シークエンス解析の結果から各クローンのクラスタリングとアセンブリを行い、今回１３１３個のコンティグ配列を得た。さらに、このようにして得られたコンティグ配列をもとにオオムギの品種間で塩基の相違が認められる一塩基多型（ＳＮＰ）を検出・同定するとともに、これらＳＮＰの中から特に非同義置換を生ぜしめる９３９個の一塩基多型（ｃＳＮＰ）を選別した。
【００３８】
そこで、これら９３９個の非同義置換を生ぜしめるＳＮＰ（以下、「非同義置換ＳＮＰ」という）、及びこれら非同義置換ＳＮＰの少なくとも１つを含む領域から合成されるオリゴヌクレオチドを本発明の実施の形態として以下説明することにする。
【００３９】
（Ａ）オオムギの品種間で見出された非同義置換ＳＮＰ
配列表の配列番号１〜５３４には、上記９３９個の非同義置換ＳＮＰが見出されたコンティグ配列が示される。説明の便宜上、以下、これら５３４個のコンティグ配列を、それぞれコンティグ（１）〜コンティグ（５３４）という。
【００４０】
各コンティグ（１）〜（５３４）中の塩基が前記した「ユニバーサルコード」で示されている箇所は、オオムギの品種間で見出された一塩基多型（ＳＮＰ）の部位であり、非同義置換ＳＮＰのみならず、その他のＳＮＰ（ｒＳＮＰやｓＳＮＰなど）についても、各コンティグ（１）〜（５３４）中に「ユニバーサルコード」で表記されている。このうち何れのＳＮＰが非同義置換ＳＮＰに該当するかについては、下記の表１〜表３９に示される。
【００４１】
【表１】

【００４２】
【表２】

【００４３】
【表３】

【００４４】
【表４】

【００４５】
【表５】

【００４６】
【表６】

【００４７】
【表７】

【００４８】
【表８】

【００４９】
【表９】

【００５０】
【表１０】

【００５１】
【表１１】

【００５２】
【表１２】

【００５３】
【表１３】

【００５４】
【表１４】

【００５５】
【表１５】

【００５６】
【表１６】

【００５７】
【表１７】

【００５８】
【表１８】

【００５９】
【表１９】

【００６０】
【表２０】

【００６１】
【表２１】

【００６２】
【表２２】

【００６３】
【表２３】

【００６４】
【表２４】

【００６５】
【表２５】

【００６６】
【表２６】

【００６７】
【表２７】

【００６８】
【表２８】

【００６９】
【表２９】

【００７０】
【表３０】

【００７１】
【表３１】

【００７２】
【表３２】

【００７３】
【表３３】

【００７４】
【表３４】

【００７５】
【表３５】

【００７６】
【表３６】

【００７７】
【表３７】

【００７８】
【表３８】

【００７９】
【表３９】

上記の表１〜表３９における各項目には、それぞれ以下に示す事項が記載されている。
【００８０】
「ｃｔｇ＿ＩＤ」　　：該当するコンティグの塩基配列が示される配列表の配列番号
「ｓｎｐ＿位置」　：各コンティグ配列上のＳＮＰの位置（多型部位）
「塩基」　　　：各ＳＮＰの位置における塩基の種類について、「はるな」には「はるな二条」のものを、「野生型」には「Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ」のものを、「赤神力」には「赤神力」のものをそれぞれ記載
「アミノ酸」　：各ＳＮＰ（多型部位またはその相補部位）を含むコドンによりコードされるアミノ酸について、「はるな」には「はるな二条」のものを、「野生型」には「Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ」のものを、「赤神力」には「赤神力」のものをそれぞれ記載（読み枠（ｆｒａｍｅ）の決定方法については後述する）
「置換有無」　：上記の「はるな」、「野生型」、「赤神力」に記載されたアミノ酸が同じアミノ酸である場合は、アミノ酸の置換が生じないものと判定して「Ｓ」と記載。一方、少なくとも二品種間でアミノ酸が相違する場合は、アミノ酸の置換が生じ得るものと判定して「Ｒ」と記載
「領域内判定」　：上記「Ｒ」と判定された各ＳＮＰについて、後述の方法により決定した翻訳領域（コード領域）の領域内に存在する場合は「ｉｎ」と記載。一方、領域外に存在する場合は「ｏｕｔ」と記載
「評価」　　　：上記「置換有無」欄において「Ｒ」と判定され、かつ、上記「領域内判定」欄において「ｉｎ」と判定されたＳＮＰをノンサイレント（非同義置換）と判定して「○」を記載。
【００８１】
このように、表１〜表３９の「評価」欄において「○」と判定されたＳＮＰが本発明の非同義置換ＳＮＰに相当するものである。コンティグ（１）〜（５３４）中には合計１９８９個のＳＮＰが見出されたが、このうち９３９個のＳＮＰが非同義置換ＳＮＰと判定された。
【００８２】
なお、各コンティグ（１）〜（５３４）の相補配列側にもオオムギの品種間で一塩基多型が認められるが、必要に応じて、コンティグ側のＳＮＰをコンティグ側一塩基多型（コンティグ側ＳＮＰ）と称し、上記相補配列中のＳＮＰを相補側一塩基多型（相補側ＳＮＰ）と称する。また、コンティグ側ＳＮＰが認められるヌクレオチドを多型部位と称する場合に、二本鎖ＤＮＡにおいて当該多型部位と塩基対を形成するヌクレオチドを相補部位（相補側多型部位）と称する。これら多型部位、相補部位はｃＤＮＡ上で見出されたものであるが、特に断りのない限り、ゲノムＤＮＡ上の対応領域も多型部位、相補部位と総称する。さらに、本発明において、「相補（的）」、「相補部位」、「相補配列」、「相補領域」等の用語は、特に断りのない限り、対象とするＤＮＡ配列（ＤＮＡ領域）と完全にハイブリダイズする関係、部位、配列、領域、すなわち、互いの塩基配列がワトソン−クリック塩基対（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ　ｂａｓｅ−ｐａｉｒｉｎｇ）　に完全に従っている関係、部位、配列、領域を指す。
【００８３】
上記の相補側／コンティグ側ＳＮＰの何れか一方はセンス側（遺伝子側）ＳＮＰに相当し、他方はアンチセンス側ＳＮＰに相当する。これらセンス側／アンチセンス側ＳＮＰはいずれも、１）同一品種内では実質的に認められず、かつ、異なる品種間で安定して認められ、また、２）センス側ＳＮＰはＥＳＴ（ｃＤＮＡ断片）中に存在し、非同義置換を生ぜしめるものであり、品種固有の表現型（形質）に関与する可能性が高いことから、様々な用途に利用可能である。
【００８４】
具体的には、例えば、このＳＮＰを品種識別の用途に供することができる。また、このＳＮＰの存在がオオムギの品種間で表現型に相違をもたらす場合（つまり、遺伝子と、当該遺伝子に一塩基多型が生じたアリルとで与える表現型が異なる場合）には、品種識別の用途に加え、例えば、１）この表現型に関与する遺伝子を取得するマーカー（遺伝子取得用マーカー）として、２）戻し交雑の際に反復親（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ　ｐａｒｅｎｔ）と交配すべき候補雑種を選別するマーカー（候補雑種選別用マーカー）として、３）遺伝子導入の成否を判定するマーカー（導入成否判定用マーカー）として、４）戻し交雑や遺伝子工学的手法などにより取得した新品種を選別するマーカー（新品種選別用マーカー）として、使用可能である。
【００８５】
また、上記多型部位またはその相補部位を含んでなる本発明にかかるオリゴヌクレオチドは、例えば、１）多型部位または相補部位における塩基の検定（ＳＮＰタイピング）用のプローブまたはプライマーとして、２）多型部位またはその相補部位を含んでなる遺伝子取得用／遺伝子同定用のプローブまたはプライマーとして、使用可能である。なお、本発明にかかるオリゴヌクレオチドの利用方法および作製方法の詳細については、後述する。
【００８６】
（Ｂ）コンティグ配列の作製法と非同義置換ＳＮＰの検出・同定法
次に、前記してきたコンティグ配列の作製方法について説明する。
【００８７】
まず、オオムギの複数品種（例えば、本発明においては「Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ」、「はるな二条」及び「赤神力」）の組織からそれぞれのｃＤＮＡライブラリーを常法にしたがって製造する。例えば、組織の全ＲＮＡを粗抽出し、全ＲＮＡから全ｍＲＮＡ（ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ）を精製し、このｍＲＮＡを鋳型とするファーストストランドｃＤＮＡを合成し、さらに、セカンドストランドｃＤＮＡの合成を行う。次いで、得られた二本鎖ｃＤＮＡを適切なベクターにライゲーションし、このベクターを宿主内にパッケージングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。なお、必要により二本鎖ｃＤＮＡを適当な長さに切断してもよい。
【００８８】
次いで、得られたクローンを抽出し、各ｃＤＮＡクローンのシークエンス解析を行う。各クローンのシークエンス解析で明らかとなったｃＤＮＡの塩基配列に基づいて、相互にオーバーラップする塩基配列を有するか否かでクローンをクラスタリングし、クラスタリングされた一連のクローン群が有する挿入断片（ｃＤＮＡ）のオーバーラップ部分を見つけて繋ぎ合わせて（アセンブリし）、上記コンティグを得るとともに、ＳＮＰの検出が可能なように挿入断片を整列化する（マルチプルアライメントする）。
【００８９】
上記全ＲＮＡが抽出されるオオムギの組織としては、芽、葉を構成する各種組織が好適に使用されるが、特にこれに限定されない。また、オオムギの実生から上記組織を取得する場合、実生の栽培方法やその生育ステージなども特に限定されない。なお、実生の栽培方法に関しては、オオムギを実験材料とする場合の標準法（細胞工学別冊　植物細胞工学シリーズ１４　植物のゲノム研究プロトコール　頁１９３〜１９５　秀潤社（２０００　年）　参照）が特に好適に採用される。
【００９０】
なお、全ＲＮＡの抽出は、一般には、オオムギの芽生え期の芽または葉を構成する組織を用いて行われるが、この理由として、組織の摩砕が比較的容易であり、多糖類などの不純物の混合割合が比較的少なく、また、種子から短期間で育成可能である点が挙げられる。また、オオムギの各品種が有する固有の形質の発現時期にあわせて、当該オオムギの組織から全ＲＮＡを抽出してもよい。
【００９１】
オオムギの組織から全ＲＮＡを抽出する工程〜クローンのシークエンス解析までの各ステップは、一般的に採用される方法、例えば、育種学研究第２巻別１　２８頁（２０００　年）、ゲノム解析ラボマニュアル　ｐ６３−ｐ７７　：シュプリンガー・フェアラーク東京（１９９８年）に記載の方法を採用して容易に行うことができる。なお、解析結果の信用性を確保する目的で、より好ましくは、１）オオムギの品種毎に、全ＲＮＡ抽出用の個体を複数用意する、２）各クローンを複数個ずつシークエンス解析に供する、３）所定以上の長さを有する挿入断片（ｃＤＮＡ）につき５’端および３’端の双方から配列を解析する、ことの少なくとも一つを行うことが好ましい。また、各クローンが有する挿入断片については、いずれも再シークエンシングにより配列の確認を行うことがさらに好ましい。
【００９２】
次いで、各クローンのシークエンス解析により得られた挿入断片の塩基配列を、互いにオーバーラップする配列部分をもとにアセンブリして各コンティグを作製する。あわせて、コンティグ配列を構成するクローンの挿入断片をマルチプルアライメントして、異なるクローン間（品種間）での対応する塩基の相違（ここではＳＮＰ）を検出可能とする。
【００９３】
挿入断片のシークエンス解析におけるベースコーリング、オーバーラップする挿入断片のアセンブリ、及びマルチプルアライメントは、例えば、公知のＳＮＰ検出ソフトウエアや配列編集ソフトウエアを用いて行うことができる。これらソフトウエアにインストールされた代表的なプログラムには、Ｔｒａｃｅ−Ｄｉｆｆ（Ｂｏｎｆｉｅｌｄ．Ｊ．Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２６：ｐ３４０４−３４０８，１９９８）、Ｐｏｌｙｂａｙｅｓ（Ｍａｒｔｈ．Ｇ．Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．２３：ｐ４５２−４５６，１９９９）、Ｐｏｌｙｐｈｒｅｄ（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ．Ｄ．Ａ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２５：ｐ２７４５−２７５１，１９９７）　などがあり、これらは何れも、ベースコーリングツールとしてフェレッド（Ｐｈｒｅｄ）を、アセンブリツールとしてフェラップ（Ｐｈｒａｐ）を採用したフェレッド／フェラップ（Ｐｈｒｅｄ　／Ｐｈｒａｐ）タイプのものである（実験医学　Ｖｏｌ．１８　Ｎｏ．１４（９月号），２０００：ｐ１８９０−１８９２　参照）。
【００９４】
また、ベースコーリング時の各塩基の読み取りエラー確率を一定と仮定し（Ｐｈｒｅｄ　スコア（Ｑｕａｌｉｔｙ　ｖａｌｕｅ）　を一定値とし）、アセンブリツールとしてＰｈｒａｐ　を採用して、互いにオーバーラップする挿入断片をアセンブリすることもできる。
【００９５】
コンティグの作製に際しては、当該コンティグを構成する全クローン間で挿入断片の塩基配列を比較し、（１）塩基の相違が見られた部位では、アセンブリ後の品質精度が最も高い、例えば、Ｐｈｒａｐ　スコア（Ｑｕａｌｉｔｙ　ｖａｌｕｅ）　が最も高い塩基をコンティグ上の代表塩基として選択する処理を行う。（２）ただし、赤神力由来の複数のシークエンスデータ、Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ由来の複数のシークエンスデータ、および、はるな二条由来の複数のシークエンスデータからなる３群のシークエンスデータのうち、少なくとも２群のシークエンスデータ間で塩基の相違が見られる場合には、これら塩基を示すユニバーサルコードをコンティグ上の塩基として採用する。
【００９６】
そして、本発明では、特に信頼性が高いと推定される上記（２）の場合にのみ品種間のＳＮＰと称する。なお、上記（２）の場合には、Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ由来の複数の挿入断片群、赤神力由来の複数の挿入断片群、および、はるな二条由来の複数の挿入断片群から選択される少なくとも２以上の挿入断片群間で、対応する塩基に相違が見られる場合以外にも、Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ由来の単一挿入断片を３’側・５’側双方から読んだシークエンスデータ、赤神力由来の単一挿入断片を３’側・５’側双方から読んだシークエンスデータ、および、はるな二条由来の単一挿入断片を３’側・５’側双方から読んだシークエンスデータから選択される、少なくとも２以上のシークエンスデータ間で、対応する塩基に相違が見られる場合も含まれる。またもちろん、上記オオムギ三品種の何れか由来の単一挿入断片を３’側・５’側双方から読んだシークエンスデータと、他品種の複数の挿入断片のシークエンスデータとの間で、対応する塩基に相違が見られる場合も含まれる。ただし、上記の方法によりコンティグ上でＳＮＰと判定された箇所が三つ以上連続する場合には、信頼性の観点からこれらを本発明のＳＮＰとは取り扱わない。
【００９７】
さらに、上記の方法によりコンティグ上でＳＮＰと判定されたものの中から、非同義置換ＳＮＰを次のようにして選別した。まず、作製した各コンティグについて公知の方法により相同性検索を行い（結果については後述する）、何れかの読み枠（ｆｒａｍｅ）にしたがって翻訳されたアミノ酸配列が、既知タンパク質（既知遺伝子がコードするタンパク質を含む）のアミノ酸配列と一定以上の相同性が認められる場合に、その読み枠を当該コンティグの読み枠と決定した。
【００９８】
次に、その読み枠にしたがって翻訳されたアミノ酸配列において、品種間の塩基の相違に応じてアミノ酸の非同義置換を生ぜしめるＳＮＰ、つまり、前記した表１〜表３９の「置換有無」欄において「Ｒ」と判定された各ＳＮＰについて、翻訳領域（コード領域）内に存在するか否か検討した。具体的には、上記「Ｒ」と判定された各ＳＮＰの位置から５’側上流をさかのぼり、開始コドンよりも先に停止コドンが現れた場合には、そのＳＮＰは翻訳領域外と判定した。残余のＳＮＰは翻訳領域内と判定し、これにより非同義置換ＳＮＰを決定したが、これら各ＳＮＰの上流および下流における開始コドンおよび停止コドンの有無をさらに詳細に検討し、各コンティグの翻訳領域を決定した。その結果を以下の表４０〜表６７に示す。
【００９９】
【表４０】

【０１００】
【表４１】

【０１０１】
【表４２】

【０１０２】
【表４３】

【０１０３】
【表４４】

【０１０４】
【表４５】

【０１０５】
【表４６】

【０１０６】
【表４７】

【０１０７】
【表４８】

【０１０８】
【表４９】

【０１０９】
【表５０】

【０１１０】
【表５１】

【０１１１】
【表５２】

【０１１２】
【表５３】

【０１１３】
【表５４】

【０１１４】
【表５５】

【０１１５】
【表５６】

【０１１６】
【表５７】

【０１１７】
【表５８】

【０１１８】
【表５９】

【０１１９】
【表６０】

【０１２０】
【表６１】

【０１２１】
【表６２】

【０１２２】
【表６３】

【０１２３】
【表６４】

【０１２４】
【表６５】

【０１２５】
【表６６】

【０１２６】
【表６７】

表４０〜表６７中、「ｃｔｇ＿ＩＤ」および「ｓｎｐ＿位置」の欄は、前記の表１〜表３９と同じである。「ｆｒａｍｅ」の欄には、前記したように相同性検索の結果に基づいて各コンティグについて決定した読み枠が記される。ここで、ｆｒａｍｅが「＋」とは、コンティグ配列がセンス鎖と判定された場合であり、「−」とは、その相補配列がセンス鎖と判定された場合である。また、「＋１」「＋２」「＋３」とは、それぞれ、コンティグ配列の５’側第１番目、第２番目、第３番目の塩基から読み枠を設定していくことを意味し、「−１」「−２」「−３」とは、それぞれ、その相補配列の５’側第１番目、第２番目、第３番目の塩基から読み枠を設定していくことを意味する。
【０１２７】
表４０〜表６７中の「Ｑ＿ｓｔａｒｔ」の欄には、各コンティグのセンス鎖（ｆｒａｍｅ「＋」の場合はコンティグ配列、ｆｒａｍｅ「―」の場合はその相補配列）の塩基配列において、相同性検索の結果、既知配列との相同性が認められた領域の開始位置（即ち、当該領域の最も５’側の位置）が示される。したがって、ｆｒａｍｅ「―」の場合、開始位置とは、相補配列において相同性が認められた領域の最も５’側の位置であるが、この場合「Ｑ＿ｓｔａｒｔ」欄には、相補配列上の開始位置について、相補配列の３’側から数えて何番目に位置するかが示される。
【０１２８】
表４０〜表６７中の各コンティグの「翻訳領域」については、非同義置換ＳＮＰと判定されたＳＮＰのセンス鎖上の位置と、決定された読み枠（ｆｒａｍｅ）とに基づいて、開始コドン（ＡＴＧ）と停止コドンとの間に非同義置換ＳＮＰが挟まれる領域を翻訳領域と決定した。表４０〜表６７中には、こうして決定した各コンティグの翻訳領域の「開始位置」および「終了位置」が示される。ただし、非同義置換ＳＮＰの位置から５’側上流に開始コドンが現れない場合、読み枠「＋１」、「−１」のときはセンス鎖５’側１番目の塩基を、「＋２」、「−２」のときはセンス鎖５’側２番目の塩基を、「＋３」、「−３」のときはセンス鎖５’側３番目の塩基を、それぞれ翻訳領域の「開始位置」と判定した。一方、非同義置換ＳＮＰの位置から３’側下流に停止コドンが現れない場合は、決定された読み枠にしたがって翻訳領域が最長となる位置を翻訳領域の「終了位置」と判定した。このように、決定した翻訳領域は、必ずしもタンパク質の全長をコードする領域を示すものではない。
【０１２９】
なお、コンティグのｆｒａｍｅが「―」の場合は、表４０〜表６７中の「開始位置」および「終了位置」には、それぞれの位置について、相補配列の５’側から数えて何番目に位置するかが示される。
【０１３０】
また、コンティグ（８）、コンティグ（１０）、コンティグ（１０１）、及びコンティグ（３８６）については、既知配列との相同性を詳細に比較検討した結果、前記「Ｑ＿ｓｔａｒｔ」欄に記載した開始位置（換言すれば、既知配列との相同性が認められた領域の開始位置）を翻訳領域の「開始位置」とした。
【０１３１】
また、表４０〜表６７中の「翻訳領域の番号」の欄は、上記の方法により翻訳領域と判定された領域が一つのコンティグに複数存在する場合に、各翻訳領域に順番に番号を付したものである（翻訳領域が１つの場合は、その翻訳領域に番号「１」を付している）。
【０１３２】
上記の方法により各コンティグの翻訳領域と判定された領域がコードするアミノ酸配列が、配列表に示される。以下の表６８〜表７８は、それぞれのアミノ酸配列について、配列表中の何れの配列番号に記載されているかを示すものである。
【０１３３】
【表６８】

【０１３４】
【表６９】

【０１３５】
【表７０】

【０１３６】
【表７１】

【０１３７】
【表７２】

【０１３８】
【表７３】

【０１３９】
【表７４】

【０１４０】
【表７５】

【０１４１】
【表７６】

【０１４２】
【表７７】

【０１４３】
【表７８】

表６８〜表７８中、「ｃｔｇ＿ＩＤ」の欄は、前記の表１〜表３９と同じである。「アミノ酸配列」の欄には、各コンティグの翻訳領域がコードするアミノ酸配列を記載した配列表の配列番号が示される。なお、１つのアミノ酸配列について、翻訳領域（コード領域）の塩基配列と並列記載したものと、アミノ酸配列単独で記載したものとの両方が配列表に示される。また、配列表に示されるアミノ酸配列は、前記「ユニバーサルコード」で示される多型部位またはその相補部位の塩基を、以下のａ）〜ｃ）の基準にしたがって選択し、決定したものである。
【０１４４】
ａ）　「はるな」、「野生型」、「赤神力」の３品種のうち、翻訳領域上のすべてのＳＮＰの塩基が決定している品種の各塩基を、各ＳＮＰの塩基として選択する。翻訳領域上のすべてのＳＮＰの塩基が決定している品種が二種類以上存在する場合は、「野生型」＞「赤神力」＞「はるな」の優先順位に従って品種を選択する。
【０１４５】
ｂ）　ただし、翻訳領域内に「アミノ酸→ＳＴＯＰ（停止コドン）」の置換を生じさせるＳＮＰがある場合は、ＳＴＯＰを生じさせる方の塩基を持つ品種は選択せずに、上記優先順位が１つ下の品種の各塩基を、各ＳＮＰの塩基として選択する。
【０１４６】
ｃ）　翻訳領域内に「アミノ酸→ＳＴＯＰ（停止コドン）」の置換を生じさせるＳＮＰがあり、他の品種の塩基も翻訳領域内に「アミノ酸→ＳＴＯＰ（停止コドン）」の置換を生じさせてしまう場合は、翻訳領域上のすべてのＳＮＰの塩基が決定している品種のうち、上記優先順位の高い方の品種の各塩基を、各ＳＮＰの塩基として選択する。
【０１４７】
なお、配列表に示される各アミノ酸配列は、前記した翻訳領域の判定結果に基づくものであり、必ずしもタンパク質の全長を示すものではない。
【０１４８】
上記の表６８〜表７８には、各コンティグについて、「クローン数」と「クローン配列」とがあわせて示される。「クローン数」の欄には、各コンティグを作製・構築するもととなったｃＤＮＡクローンの総数が示される。「クローン配列」の欄には、これらｃＤＮＡクローンの各塩基配列を記載した配列表の配列番号が示される。例えば、コンティグ（１）は、配列番号１６６１〜１６７５に示される各ｃＤＮＡクローンを整列化（マルチプルアラインメント）させることにより得られた配列である。
【０１４９】
（Ｃ）相同性検索結果
前記したように、本発明者らは、作製した各コンティグについて公知の方法により相同性検索を行った。その結果を以下の表７９〜表１１０に示す。
【０１５０】
【表７９】

【０１５１】
【表８０】

【０１５２】
【表８１】

【０１５３】
【表８２】

【０１５４】
【表８３】

【０１５５】
【表８４】

【０１５６】
【表８５】

【０１５７】
【表８６】

【０１５８】
【表８７】

【０１５９】
【表８８】

【０１６０】
【表８９】

【０１６１】
【表９０】

【０１６２】
【表９１】

【０１６３】
【表９２】

【０１６４】
【表９３】

【０１６５】
【表９４】

【０１６６】
【表９５】

【０１６７】
【表９６】

【０１６８】
【表９７】

【０１６９】
【表９８】

【０１７０】
【表９９】

【０１７１】
【表１００】

【０１７２】
【表１０１】

【０１７３】
【表１０２】

【０１７４】
【表１０３】

【０１７５】
【表１０４】

【０１７６】
【表１０５】

【０１７７】
【表１０６】

【０１７８】
【表１０７】

【０１７９】
【表１０８】

【０１８０】
【表１０９】

【０１８１】
【表１１０】

表７９〜表１１０中の「ｃｔｇ＿ＩＤ」の欄は、前記表１〜表３９と同じである。「相同性検索結果」の欄には、各コンティグについて、一定以上の相同性が認められた既知遺伝子または既知タンパク質の名称およびアクセッション番号などが示される。
【０１８２】
（Ｄ）本発明のオリゴヌクレオチド等の利用方法（有用性）
本発明のオリゴヌクレオチドは、前述してきたコンティグ上の非同義置換ＳＮＰの少なくとも一つを含む７ヌクレオチド以上の連続したＤＮＡ配列、またはその相補配列からなるものであり、以下に説明するとおり、種々の有用性を有するものである。
【０１８３】
まず、本発明のオリゴヌクレオチドは、オオムギの品種の相違に起因する上記多型部位またはその相補部位を含むため、当該オリゴヌクレオチドやこのオリゴヌクレオチドを含んでなる組成物は、種々のオオムギ品種間に存在する一塩基多型を検定する目的で利用可能である。また、これによりオオムギの遺伝学的品種識別や、当該オオムギがいずれのタイプ（遺伝子型）の遺伝子を有するかの判定等を迅速かつ簡便に行うことが可能になる。
【０１８４】
例えば、上記オリゴヌクレオチドを基盤（担体）上に固定化してＤＮＡチップ（本発明にかかる組成物の一形態）を構成すれば、オオムギの遺伝子における一塩基多型を検定するオリゴヌクレオチドプローブとして利用できる。この場合、オリゴヌクレオチドの長さは、一塩基多型を検定することができる長さであれば特に制限はないが、７〜５０ヌクレオチド、あるいは１０〜３０ヌクレオチドが好ましく、１５〜２５ヌクレオチドがより好ましい。
【０１８５】
また、上記遺伝子における一塩基多型の検定は、上記多型部位またはその相補部位を含むＤＮＡを用いて行う他にも、該ＤＮＡから得られたＲＮＡを介して間接的に行うこともできる。よって、ＤＮＡチップを用いたハイブリダイズ試験のターゲットには、後述する被検体由来のＤＮＡおよびＲＮＡが使用可能であり、一般的には、該ＤＮＡとしてｃＤＮＡやゲノムＤＮＡが、該ＲＮＡとしてｍＲＮＡやｃＲＮＡが使用される。
【０１８６】
さらに、本発明にかかるオリゴヌクレオチドに相当するＤＮＡ断片を上記被検体から取得し、これを直接的に解析して、被検体の遺伝子における一塩基多型を検定することもできる。具体的には、例えば、配列番号１〜５３４の何れかに表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドにおける、前記「ユニバーサルコード」で示された多型部位の少なくとも一つを含む領域、またはその相補領域の少なくとも一方を増幅し得るように設計されたプライマーを用い、被検体由来のＤＮＡを増幅することで、前記被検体の遺伝子に生じた一塩基多型を検定してもよい。
【０１８７】
上記プライマーには、ＰＣＲプライマーのように、前記多型部位の少なくとも一つを含む領域、およびその相補領域の双方を増幅するプライマーに加え、ＲＣＡプライマーのようにそのいずれか一方を増幅するプライマーも含まれる。また、得られた増幅ＤＮＡ断片は、例えば、１）直接シークエンシングして解析する、２）多型部位、および／または、その相補部位の塩基に応じて異なるパターンで切断する制限酵素を用いて消化し、生じた断片の長さを解析する、３）本発明にかかるオリゴヌクレオチドとのハイブリダイズ試験により解析する、などの方法で解析することができる。なお、上記制限酵素には、二本鎖ＤＮＡ上の特定配列を認識して切断する制限酵素（クラスＩＩ制限酵素）に加え、一本鎖ＤＮＡ上の特定配列を認識して切断する制限酵素（クラスＩ制限酵素、およびクラスＩＩ制限酵素の一部）も含まれる。
【０１８８】
なお、遺伝子は通常、その相補配列と結合した二本鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡであってもよい）として存在するから、本発明において「遺伝子における一塩基多型（センス側一塩基多型）を検定する」とは、当該遺伝子の相補配列における一塩基多型（アンチセンス側一塩基多型）の検定を介して、これに相補するセンス側一塩基多型を検定する場合も包含されている。また「一塩基多型を検定する」とは、多型部位または相補部位の塩基の種類まで特定（同定または検出）すること以外に、当該塩基の種類を限定すること（例えば、「少なくともアデニンではない」など）も含む概念である。
【０１８９】
上記の「被検体」とは、本発明にかかるオリゴヌクレオチドと同一あるいは相補的な塩基配列を部分配列または全長とする遺伝子を持つあらゆる生物を指し、オオムギ以外では、他のオオムギ属植物や、オオムギ属と近縁なコムギ連（ＴＲＩＴＩＣＥＡＥ）の植物、例えば、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ属）植物、タルホコムギ属（Ａｅｇｉｌｏｐｓ属）植物、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ属）植物、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ属）植物などが特に好適なものとして挙げられる。なお、本発明では、「Ｗ．Ｄ．Ｃｌａｙｔｏｎ　ａｎｄ　Ｓ．Ａ．Ｒｅｎｖｏｉｚｅ：　ＫＥＷ　ＢＵＬＬＥＴＩＮ　ＡＤＤＩＴＩＯＮＡＬ　ＳＥＲＩＥＳ　ＸＩＩ，　ＧＥＮＥＲＡ　ＧＲＡＭＩＮＵＭ，　Ｇｒａｓｓｅｓｏｆ　ｔｈｅ　Ｗｏｒｌｄ　（第３刷）：ｐ１４６−１５８（１９９９年：キュー王立植物園編）」に記載の分類体系を基本的に採用する。
【０１９０】
さらに、本発明にかかるオリゴヌクレオチドを形質転換体の作製に利用し、有用遺伝子が導入された実用系統を開発することができる。例えば、当該オリゴヌクレオチドをプローブとして、またはプライマーとして若しくは当該オリゴヌクレオチドの領域を得るためのプライマーを用いて有用遺伝子を単離し、次いで、この有用遺伝子を遺伝子操作技術を用いて対象とする細胞に導入して、形質転換体を生産することも可能である。なお、上記オリゴヌクレオチドを遺伝子単離用のプローブとして利用する場合、その長さはプローブとして充分な長さがあればよく、例えば、７〜５００、５１〜５００、あるいは７０〜４００ヌクレオチドが好ましく、９０〜３００ヌクレオチドがより好ましい。
【０１９１】
また、例えば、本発明にかかるオリゴヌクレオチドを部分配列または全長とする遺伝子を有する親植物Ａと、この遺伝子を有さない、あるいはこの遺伝子に一塩基多型（特に表現型に影響を与えるもの）が生じたアリルを有する親植物Ｂとが交配可能な場合に、親植物Ａ・Ｂを交配させて雑種の植物を作出し（作出工程）、次いで、本発明にかかるオリゴヌクレオチドまたはＳＮＰの検定方法を用いて、これら雑種の植物の中から上記遺伝子を持つものを選抜して（選抜工程）、所望する形質転換体（形質転換植物）を生産することができる。なお、上記アリルとは、ある有用遺伝子に少なくとも一つの一塩基多型が生じ、これにより有用形質の発現が抑制される、または消失するものであることがより好ましい。また、上記有用遺伝子の種類は特に限定されるものではないが、通常の育種の場合と同様、例えば、栽培オオムギの祖先野生型オオムギが有する有用遺伝子（環境抵抗性遺伝子など）が特に好適である。
【０１９２】
前述したように、本発明にかかるオリゴヌクレオチドは、塩基の表記が「ユニバーサルコード」で記載されている多型部位のうち、非同義置換を生ぜしめる多型部位の少なくとも一つを含む７ヌクレオチド以上の連続したＤＮＡ配列、またはその相補配列からなるものを特に指す。なお、このオリゴヌクレオチドは、１本鎖として存在する場合に限らず、相補鎖と水素結合し２本鎖として存在するものであってもよい。また、当該オリゴヌクレオチドは、ＲＣＡ法（後述する）によるＳＮＰタイピング用のバドロックプローブや、ベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列に挿入された状態で存在するものであってもよい。
【０１９３】
上記のオリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡクローンが有する挿入断片を整列化して得られたコンティグまたはその相補配列の一部あるいは全長であり、ｃＤＮＡはもちろんゲノムＤＮＡ上にも同一の配列が存在する可能性が極めて高い。よって、例えば、（１）遺伝子に生じた一塩基多型を検定するプローブまたはプライマー（ＳＮＰタイピング用のプローブまたはプライマー）として、また、（２）遺伝子を取得（単離）するためのプローブまたはプライマーとして利用可能であり、以下の説明では、上記（１）の用途に利用されるものをオリゴヌクレオチドＡ、（２）の用途に利用されるものをオリゴヌクレオチドＢと称する。
【０１９４】
オリゴヌクレオチドＡは、例えば、オオムギのゲノム内に品種間安定的に保存されたＳＮＰを検出する際に使用されるものであり、ａ）オオムギの品種間で遺伝子上にＳＮＰが存在する部位、または、この部位に相補的な部位（相補部位）を少なくとも一つ含み、かつ、ｂ）ＳＮＰを検定するためのハイブリダイズ用プローブまたはプライマーとして適切な長さを有すればよい。これらａ），ｂ）の条件を満たす限りにおいて、オリゴヌクレオチドＡの長さは特に限定されないが、一般には、７〜５０ヌクレオチドの範囲内、あるいは１０〜３０ヌクレオチドの範囲内であることがより好ましく、配列として十分な特異性を示す１５〜２５ヌクレオチドの範囲内であることがさらに好ましい。
【０１９５】
なお、オリゴヌクレオチドＡが、上記多型部位またはその相補部位を２つ以上含んでなる場合には、当該多型部位またはその相補部位の塩基を全て「はるな二条」型、「赤神力」型あるいは「Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ」型の何れか一方に固定して、オリゴヌクレオチドＡの塩基配列を規定すればよい。
【０１９６】
一方、オリゴヌクレオチドＢは、各コンティグあるいはその相補配列を部分配列または全長とする遺伝子およびそのホモログを取得するためのプローブ、あるいはプライマーとして使用される。よって、オリゴヌクレオチドＢは、上記多型部位または相補部位の少なくとも一つを含む７ヌクレオチド以上の長さであれば特に限定されるものではないが、５１〜５００ヌクレオチド、あるいは７０〜４００ヌクレオチドの長さであることがより好ましく、９０〜３００ヌクレオチドの長さであることがさらに好ましい。なお、本発明にかかるオリゴヌクレオチドの中には、上記（１）・（２）の双方の用途に利用されるものもあるので、上記オリゴヌクレオチドＡ・Ｂが塩基配列として同一の場合もある。
【０１９７】
（Ｅ）本発明にかかるオリゴヌクレオチドの作製方法
本発明にかかるオリゴヌクレオチドの製造方法は特に限定されるものではなく、一般的な方法が採用される。例えば、当該オリゴヌクレオチドを、それを有する生物のゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、またはｃＤＮＡライブラリーから適切な制限酵素で切り出し、精製すればよい。また、配列番号１〜５３４の何れかに表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドにおける、非同義置換ＳＮＰに当たる多型部位の少なくとも一つを含む領域、またはその相補領域の少なくとも一方を増幅し得るように設計されたプライマーを用い、上記生物のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行うことで、本発明のオリゴヌクレオチドを単離してもよい。さらに、当該オリゴヌクレオチドを公知の方法により合成することもできる。
【０１９８】
上記オリゴヌクレオチド取得用のプライマーの長さは、ミスマッチによる標的領域以外の増幅が起こらない限りにおいて特に限定されるものではない。例えば、増幅反応がＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）　である場合には、一般に１５〜２５、あるいは１５〜３０ヌクレオチドの範囲内の長さの一組のプライマーセットが用いられる。プライマーの配列についても、特に限定されるものではなく、ＤＮＡ配列上の特異的、特徴的な配列領域をもとに任意に設計すればよい。
【０１９９】
また、ＰＣＲ反応の反応条件も通常の条件に従って行えばよい（Ｓａｉｋｉ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２３０，　１３５０−１３５４（１９８５）；ＰＣＲ　テクノロジー、宝酒造（株）１９９０年発行；　等参照）。より具体的には、標的二本鎖ＤＮＡ（鋳型を含む）の熱変性工程は、９０℃〜９６℃、より好ましくは９４℃〜９６℃の温度範囲内で、約１分間〜３分間、より好ましくは約１分間〜２分間行えばよい。また、プライマーのアニーリング工程は、４０℃〜６０℃、より好ましくは５５℃〜６０℃の温度範囲内で、約１分間〜３分間、より好ましくは約１分間〜約２分間行えばよい。さらに、ＤＮＡポリメラーゼによる鎖伸長工程は、７０℃〜７４℃、より好ましくは７２℃〜７４℃の温度範囲内で、約１分間〜４分間、より好ましくは約２分間〜３分間行えばよい。
【０２００】
上記熱変性工程、アニーリング工程、および鎖伸長工程を一サイクルとするＰＣＲ反応のサイクル数も特に限定されないが、通常は２０〜４０サイクル、より好ましくは２５〜３５サイクル行えばよい。その他、使用するＤＮＡポリメラーゼの種類（Ｔａｑ　ポリメラーゼなどの耐熱性ポリメラーゼ）・量、試薬の種類・量、鋳型となるＤＮＡの抽出法（例えばＣ−ＴＡＢ法）などは従来と同様であり、詳細な説明を省略する。なお、上記ＰＣＲ反応の範疇には、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　ＰＣＲ）　反応のような変法も含まれる。また、ＰＣＲ反応では、多型部位を含む二本鎖ＤＮＡ断片が取得されるが、例えば、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ　ｃｉｒｃｌｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）　法などの単鎖増幅法を用い、適切なプライマー・鋳型（多型部位またはその相補部位を含む環状一本鎖ＤＮＡ）セットで反応を行えば、上記多型部位またはその相補部位の何れか一方を含む一本鎖ＤＮＡ断片（本発明のオリゴヌクレオチド）を取得可能となる（Ｌｉｚａｒｄｉ　ＰＭ　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ　１９，２２５，１９９８）。
【０２０１】
本発明にかかるオリゴヌクレオチドＡ・Ｂを取得するための上記生物としては、「Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ」、「赤神力」および「はるな二条」などのオオムギ品種や、その他のオオムギ属植物が特に好適であるが、これらの他に、当該オリゴヌクレオチドと同一あるいは相補的な塩基配列を部分配列または全長とする遺伝子を持つあらゆる生物が採用される。オオムギ属植物以外の上記生物としては、オオムギ属と近縁なコムギ連の植物、例えば、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ属）　植物、タルホコムギ属（Ａｅｇｉｌｏｐｓ属）　植物、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ属）　植物、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ属）植物などが好適なものとして挙げられる。
【０２０２】
（Ｆ）本発明のオリゴヌクレオチドを用いたＳＮＰのタイピング法
次に、本発明のオリゴヌクレオチドをＳＮＰのタイピング法に適用する場合について説明する。
【０２０３】
被検体の遺伝子上にある一塩基多型の検定（ＳＮＰのタイピング）は、本発明にかかるオリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。この方法は、（Ａ）被検体である生物由来のＤＮＡ（ｃＤＮＡでもよい）から上記オリゴヌクレオチドを単離し、当該オリゴヌクレオチド上の多型部位またはその相補部位における塩基を直接検定する方法（直接法と称する）、および、（Ｂ）本発明にかかるオリゴヌクレオチドＡが有する多型部位または相補部位を用いて、被検体由来の遺伝子上にある一塩基多型を間接的に検定する方法（間接法と称する）、に大別される。つまり、上記（Ａ）・（Ｂ）の方法はいずれも、本発明にかかるオリゴヌクレオチドが有する上記多型部位またはその相補部位の塩基に基づいて、被検体の遺伝子に生じた一塩基多型を検定する方法である。
【０２０４】
なお、上記「被検体」とは、特に好適には、「Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ」、「赤神力」または「はるな二条」などのオオムギ品種や、その他のオオムギ属植物が挙げられるが、本発明にかかるオリゴヌクレオチドと同一あるいは相補的な塩基配列を部分配列または全長とする遺伝子を有する生物であればその種類は特に限定されない。このような遺伝子を持つ可能性が高い生物として、具体的には、例えば、上記のコムギ属植物、タルホコムギ属植物、ライムギ属植物、ドクムギ属植物などのコムギ連の植物が挙げられる。また、交配や遺伝子工学的手法で、これら生物の持つ上記遺伝子が導入された（または導入が試みられた）形質転換体も、上記被検体の範疇である。
【０２０５】
また、遺伝子は通常、その相補配列と結合した二本鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡであってもよい）として存在する。よって、本発明において「遺伝子における一塩基多型を検定する」とは、当該遺伝子の相補配列における一塩基多型の検定を介して、これに相補するセンス側一塩基多型を検定する場合も含むものとする。
【０２０６】
以下、上記直接法についてより具体的に説明する。直接法は、例えば、配列番号１〜５３４の何れかに表されるＤＮＡ配列上にある多型部位の少なくとも一つを含む領域、またはその相補領域の少なくとも一方を増幅し得るように設計されたプライマー（本発明にかかるプライマー）を用いて、被検体由来のＤＮＡ（ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）を増幅して増幅ＤＮＡ断片（本発明にかかるオリゴヌクレオチド）を取得し、次いで、この増幅ＤＮＡ断片を直接的に解析することで遺伝子に生じたＳＮＰを検定する方法である。なお、ここで使用する増幅反応の具体例および条件などは、前記「（Ｅ）本発明にかかるオリゴヌクレオチドの作製方法」にて説明したとおりである。
【０２０７】
直接法の一例として、より具体的には、１）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ　Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｌａｓｅｒ　Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ　Ｏｆ　Ｆｌｉｇｈｔ／Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）　法などを利用して、得られた増幅ＤＮＡ断片の質量の違いなどからＳＮＰをタイピングしてもよく、２）この増幅ＤＮＡ断片をシークエンシングして多型部位またはその相補部位の塩基を直接決定してもよく、３）この増幅ＤＮＡ断片を、上記多型部位またはその相補部位の少なくとも一方の塩基の種類に応じて異なるパターンで切断する制限酵素で消化し、生じた断片の長さの相違によりＳＮＰを直接タイピングしてもよい（いわゆるＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｒｉｓｍ）法）　。なお、３）の方法では、取得される増幅ＤＮＡ断片が一本鎖（ＲＣＡ　法等による）であるか二本鎖であるかに応じて、一本鎖ＤＮＡ上の特定配列を認識して切断する制限酵素（クラスＩ制限酵素、およびクラスＩＩ制限酵素の一部）と、二本鎖ＤＮＡ上の特定配列を認識して切断する制限酵素（クラスＩＩ制限酵素）とを選択すればよい。
【０２０８】
なお、上記２）、３）の方法は極めて一般的な方法であるので、特に、上記１）の方法についてのみ以下に説明する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法を利用したＳＮＰのタイピングの一例では、上記多型部位を含む領域、またはその相補領域を増幅可能に設計されたプライマーを用い、被検体のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行う。次いで、得られた増幅ＤＮＡ断片を鋳型としてプライマー伸長反応を行うことにより、上記多型部位または相補部位を３’端として含む伸長反応生成物を得る。次いで、多型部位または相補部位の塩基が異なることにより生じる伸長反応生成物の質量の相違をマススペクトロメータにより測定し、当該部位の塩基をタイピングする（「ポストシークエンスのゲノム科学（１）　ＳＮＰ遺伝子多型の戦略　第一刷（中山書店）１０６　頁〜１１７　頁」）参照）。なお、複数のＳＮＰを同時に検定する場合には、マルチプレックスな条件で行うことができる。
【０２０９】
一方、上記間接法は、本発明にかかるオリゴヌクレオチドＡを用いたＳＮＰタイピング法であり、具体的には、例えば、１）被検体由来のＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む概念）またはＲＮＡを調製する工程、２）オリゴヌクレオチドＡを取得する工程、３）オリゴヌクレオチドＡと、１）で調製したＲＮＡまたはＤＮＡとが完全にハイブリダイズするか否かを調べる工程を含んでなる。そして、両者が完全にハイブリダイズした場合には、被検体の遺伝子が有する多型部位（またはその相補部位）が、オリゴヌクレオチドＡの対応する塩基と相補的な塩基からなると確定され、一方、不完全にハイブリダイズするかハイブリダイズしない場合には、多型部位（またはその相補部位）がオリゴヌクレオチドＡの対応する塩基と非相補的な塩基のいずれかからなると判断される。
【０２１０】
なお、いうまでもないが、オリゴヌクレオチドＡが上記多型部位の少なくとも一つを含むＤＮＡ配列である場合、このＤＮＡ配列は、自身と相補的なゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡと完全にハイブリダイズし、一方、オリゴヌクレオチドＡが該ＤＮＡ配列の相補配列である場合、当該相補配列は、自身と相補的なｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ゲノムＤＮＡと完全にハイブリダイズする。
【０２１１】
上記被検体由来のＤＮＡとは、このＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法やＲＣＡ法などにより得られる増幅ＤＮＡ断片も含む概念である。また、被検体由来のＤＮＡまたはＲＮＡは、一般には、その生体、すなわち、各種器官、各種組織、細胞、プロトプラスト、スフェロプラスト、カルスなどから抽出したものが用いられるが、場合によっては加工食品（飲料でもよい）、化石など被検体の生体以外から抽出したものが用いられる。
【０２１２】
被検体由来のＤＮＡまたはＲＮＡの調製には、一般的なＤＮＡまたはＲＮＡの抽出法を採用すればよい。また、ＤＮＡまたはＲＮＡ抽出用の組織の種類、被検体の栽培（生育）方法やその生育ステージなども特に限定されるものではない。ＤＮＡまたはＲＮＡとして、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを調製する場合には、例えば、上記コンティグを作製する際に用いた方法を採用すればよい。また、ｃＲＮＡを調製する場合には、上記ｃＤＮＡを適切なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写する一般法を利用すればよい。また、ハイブリダイズ用のターゲットとなるこれらＤＮＡ・ＲＮＡ、および／または、オリゴヌクレオチドＡ（プローブ）は、通常、ビオチン標識、各種蛍光標識などで予め標識してハイブリダイズの状態を確認可能としておくが、ハイブリダイズの状態をインターカレートの挿入、その他の方法により確認する場合には、上記ターゲットおよび／またはプローブを予め標識しておく必要は特にない。
【０２１３】
なお、被検体由来のＤＮＡまたはＲＮＡ（ターゲット）と、オリゴヌクレオチドＡ（プローブ）とをハイブリダイズさせる条件は、オリゴヌクレオチドＡの長さなどを考慮した上で、各方法で採用される一般的な条件に従えばよい（ＤＮＡマイクロアレイ　初版第３刷　ｐ６７−８３（宝酒造株式会社　発行）など参照）。
【０２１４】
また、一般には、基盤（担体）上にオリゴヌクレオチドＡ（プローブ）を固定化してなるＤＮＡチップ（組成物）を製造し、上記ハイブリダイゼーションを行う。なお、本発明において「ＤＮＡチップ」とは、ここでは主として合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型ＤＮＡチップを意味するが、ＰＣＲ産物等のｃＤＮＡをプローブに用いる貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイをも包含する概念である。
【０２１５】
なお、ＤＮＡチップの製造には公知の方法を採用すればよく、オリゴヌクレオチドＡとして合成オリゴヌクレオチドを使用する場合には、フォトリソグラフィー技術と固相法ＤＮＡ合成技術との組み合わせにより基盤上で該オリゴヌクレオチドを合成すればよく、一方、オリゴヌクレオチドＡとしてｃＤＮＡを用いる場合には、アレイ機を用いて基盤上に貼り付ければよい。また、一般的なＤＮＡチップと同様、パーフェクトマッチプローブ（オリゴヌクレオチドＡ）と、該パーフェクトマッチプローブにおいて多型部位（または相補部位）以外で一塩基置換されたミスマッチプローブとを配置してＳＮＰの検定精度をより向上させてもよい。さらに、異なる遺伝子上のＳＮＰを並行して検定するために、複数種のオリゴヌクレオチドＡを同一の基盤上に固定してＤＮＡチップを構成してもよい。
【０２１６】
また、間接法の他の例として、Ｉｎｖａｄｅｒ　法を利用したＳＮＰのタイピングも挙げられる（「ポストシークエンスのゲノム科学（１）　ＳＮＰ遺伝子多型の戦略第一刷（中山書店）９８頁〜１０５　頁」参照）。一例では、コンティグ（１）〜（５３４）の何れかの一部であって多型部位の一つを３’端として含む配列の相補配列をオリゴヌクレオチドＡ（プローブ領域）とし、さらに、このオリゴヌクレオチドＡの５’端側に、ある共通配列（フラップ領域）を連結してアレルプローブを作製する。次いで、当該コンティグの一部であって上記多型部位を３’端（ただし３’端の塩基の種類は任意）として含むインベーダープローブと、アレルプローブとを被検体のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡにハイブリダイズさせ、次いで、アレルプローブがゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡに完全にマッチ（完全にハイブリダイズ）する場合にのみフラップ領域を切り出す酵素（ｃｌｅｖａｓｅ）　を用いてフラップ領域の切り出しを試みる。次いで、切り出されたフラップ領域と、このフラップ領域に相補結合可能、かつ蛍光色素およびクエンチャーによりラベルされたプローブ（ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｅｎｅｒｇｙ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ）プローブ）とをハイブリダイズさせ、上記酵素（ｃｌｅｖａｓｅ）　による蛍光色素の切り出しを行う。多型部位のＳＮＰタイピングは、発生する蛍光量が、上記ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡとアレルプローブとが完全にハイブリダイズするか否かで異なることを利用して行う。
【０２１７】
さらに、上記間接法には、オリゴヌクレオチドＡと、被検体由来のＤＮＡとのハイブリダイズ（アニーリング）を試み、両者が完全にハイブリダイズしたか否かをＤＮＡの増幅反応により確認する方法が含まれる。これらの方法として、具体的には、例えば、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法、ＲＣＡ法などを利用した公知のＳＮＰタイピング法が挙げられる（「ポストシークエンスのゲノム科学（１）　ＳＮＰ遺伝子多型の戦略　第一刷（中山書店）９４頁〜９７頁、１１８　頁〜１２７　頁」参照）。
【０２１８】
ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法を利用したＳＮＰタイピングの一例では、コンティグ（１）〜（５３４）の何れかの一部であって、多型部位の一つを含む約２０ヌクレオチドからなる配列の相補配列をオリゴヌクレオチドＡとし、このオリゴヌクレオチドＡの５’端、３’端を順に蛍光色素、クエンチャー（消光物質）によりラベルしてＴａｑＭａｎプローブを作製する。なお、この状態のＴａｑＭａｎプローブは、クエンチャーの働きにより蛍光を発しない。次いで、当該コンティグにおける上記多型部位を含む領域およびその相補領域を増幅可能に設計されたＰＣＲプライマーと、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼとを用い、上記ＴａｑＭａｎプローブを被検体のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡにハイブリダイズさせた状態でＰＣＲ反応を行う。Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼは５’ヌクレアーゼ活性を有するので、ＴａｑＭａｎプローブが被検体のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡに実際にハイブリダイズしていれば、蛍光色素が切り出されて蛍光が観測される。よって、上記多型部位に相補する塩基を適宜選択してＴａｑＭａｎプローブを作製すれば、被検体のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡにおける多型部位の塩基の種類を、蛍光を発するか否か（すなわち両者が完全にハイブリダイズするか否か）で判定可能となる。
【０２１９】
また、ＲＣＡ法を利用したＳＮＰタイピングの一例では、まず、被検体のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ上の多型部位を含む周辺約２０ヌクレオチドずつの配列に対する相補配列が両端部に配され、この２つの相補配列をバックボーンと呼ばれる特定配列により連結した一本鎖プローブ（バドロックプローブ）を作製する。また、バドロックプローブは、その一端（通常３’端）に、上記多型部位の塩基に相補的な塩基が位置するように設計される。次いで、被検体のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型としてバドロックプローブをライゲーションし、適切なプライマーとＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせを用いて増幅反応を行う。
【０２２０】
ここで、鋳型となるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの多型部位の塩基と、バドロックプローブの一端の塩基とが実際に相補的である場合には、バドロックプローブのライゲーション（ここでは環状化）及び増幅反応が起こり、多型部位の塩基をタイピングすることができる。一方、非相補的である場合には、このライゲーション及び増幅反応が起こらない。なお、ＲＣＡ法は一定温度（通常約６５℃）でのＤＮＡ増幅反応が可能であるので、サンプルの大量解析に特に好適である。また、上記バドロックプローブは、環状化した場合にのみオリゴヌクレオチドＡとなる配列（両端部に配された上記相補配列）を含有するが、このような配列も本発明にかかるオリゴヌクレオチドＡの範疇に含まれる。
【０２２１】
また、オリゴヌクレオチドＡをＰＣＲプライマーの一つとし、当該オリゴヌクレオチドＡと被検体由来のＤＮＡとのハイブリダイズ（アニーリング）、及び、ＰＣＲ法による増幅反応を試み、増幅ＤＮＡ断片が生じるか否か（すなわち両者が完全にハイブリダイズするか否か）でＳＮＰをタイピングする方法（例えば、ＡＳＡ（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）　法）も上記間接法の一例である。
【０２２２】
間接法で使用されるＳＮＰタイピング用キットはいずれもオリゴヌクレオチドＡを含んでなるため、本発明にかかる組成物に相当する。つまり、本発明にかかる組成物には、１）ＤＮＡチップのようにオリゴヌクレオチドＡが担体に固定化されてなるものも、２）ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法用、Ｉｎｖａｄｅｒ　法用、ＲＣＡ法用などのＳＮＰタイピング用キットのように、一般にオリゴヌクレオチドＡが固定化されていないものも含まれる。
【０２２３】
すでに説明したように、上記オリゴヌクレオチドＡを用いた方法、およびその他のＳＮＰタイピング法を用いれば、種々のオオムギ属植物（特に、オオムギ品種である「Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ」、「赤神力」および「はるな二条」）について上記多型部位またはその相補部位の塩基を判定することができる。多型部位またはその相補部位における塩基の種類は、オオムギの同一品種内で実質的に同一であり、特定の異なる品種間で相違が見られるので、オオムギの品種識別が可能となる。
【０２２４】
例えば、本発明にかかるＳＮＰタイピング法のいずれかを用いて、「Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ」、「赤神力」および「はるな二条」由来のＤＮＡ上における多型部位、例えば、コンティグ（６）（配列番号６に示すＤＮＡ配列）上の１０８３番目のヌクレオチド（多型部位）に相当する部位の塩基を同定した結果、アデニンの場合には「Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ」と、チミンの場合には「はるな二条」または「赤神力」と判定される。
【０２２５】
なお、オオムギや、オオムギ属植物以外でも同様のＳＮＰが認められる可能性が高い生物（ＳＮＰタイピング用の被検体の例示参照）については、品種識別ができる可能性がある。また、これら多型部位（またはその相補部位）を２つ以上組み合わせて品種識別を行う、あるいは、他の遺伝子マーカーと併せて品種識別を行えば、識別精度がより一層向上する。なお、ＳＮＰなど遺伝子上の多型情報を用いた品種識別は、例えば、オオムギ粒、オオムギ加工食品（デンプンなど）の品質精度の検定（異種オオムギ混入有無の確認）など、肉眼では困難な作業に特に効果が大きい。
【０２２６】
（Ｇ）遺伝子マーカーとしてのＳＮＰの利用
また、遺伝子とそのアリルとで上記多型部位（相補部位の場合もある）における塩基が相違し、その結果、異なる表現型を与える場合には、（１）所望する表現型に関与する遺伝子またはアリルの一方を取得する、（２）当該遺伝子またはアリルの一方を有する植物を選別する、などの目的で、ＳＮＰを遺伝子マーカーとして使用できる。以下、上記（１）・（２）のケースにつき詳細に説明するが、便宜上、多型部位の塩基が「赤神力」型、「はるな二条」型、または「Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ」型の遺伝子の何れか一つを単に「遺伝子」と称し、当該「遺伝子」と多型部位の塩基が異なる（遺伝子型が異なる）ものをその「アリル」と称する。また、遺伝子とそのアリルとでは、遺伝子がより有用な表現型を与える（すなわち有用遺伝子である）と仮定する。
【０２２７】
上記（１）の場合には、一般に、アリルまたは遺伝子の一方のみにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドＢをプローブとして使用し、例えば、オオムギのゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを公知の方法によりスクリーニングして上記遺伝子（有用遺伝子）を取得（単離）すればよい。あるいは、このようなオリゴヌクレオチドＢをプライマーとする遺伝子増幅法（ＰＣＲ法など）を用いて、例えば、オオムギのゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから当該遺伝子を含むクローンを同定し、この遺伝子を取得すればよい。
【０２２８】
単離した上記遺伝子は、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されて、当該遺伝子を発現する形質転換体が生産される。上記の遺伝子工学的手法として、具体的には、例えば、プロトプラスト共存培養法やリーフディスク法などアグロバクテリウム属細菌の感染を利用する方法、並びに、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、リポソーム法、ＤＮＡ直接導入法、適切なベクター系を用いた導入法、などが挙げられ、上記対象細胞の種類に応じて最適なものを選択すればよい。
【０２２９】
上記対象細胞としては、大腸菌などの原核細胞、または植物細胞などの真核細胞が使用されるが、導入される遺伝子がオオムギ由来であることから、好ましくは植物細胞が、より好ましくはコムギ連の植物細胞が、特に好ましくはオオムギを含むオオムギ属植物の細胞が使用される。また、原核細胞を選択する場合には、上記遺伝子としてｃＤＮＡを選択すればよい。
【０２３０】
なお、上記遺伝子とそのアリルとで与える表現型が実質的に同一の場合や、当該遺伝子のホモログを取得する場合などには、これらを非選択的に単離可能なオリゴヌクレオチドＢを遺伝子取得用のプローブまたはプライマーとしてもよい。また、当該遺伝子、そのアリル、そのホモログは、オオムギ属植物（特に、オオムギ品種である「Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ」、「赤神力」または「はるな二条」）から好適に単離されるが、その他、本発明にかかるオリゴヌクレオチド（より好ましくは各コンティグまたはその相補配列）を部分配列または全長とする遺伝子、あるいはそのホモログを持つ生物からも単離可能である。
【０２３１】
また、上記遺伝子（有用遺伝子）の種類は特に限定されないが、栽培オオムギの祖先野生型オオムギ（Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）が有する有用遺伝子などが特に好適であり、当該有用遺伝子が導入される上記対象細胞は、栽培オオムギの細胞が特に好適である。
【０２３２】
一方、上記（２）の場合には、すでに説明したＳＮＰタイピング法のいずれかに従って多型部位（または相補部位）の塩基を特定し、これをもとに所望の遺伝子またはアリルの何れか（一般には有用遺伝子である「遺伝子」の方）を備えた植物を選別すればよい。また、このような植物の選抜作業は、例えば、１）上記有用遺伝子を持つ交配親を選抜する際、２）戻し交雑の過程で得られた雑種（形質転換体；形質転換植物）群から、戻し親にさらに交配すべき雑種候補または当該有用遺伝子が安定的に保持された新品種を選別する際、など植物育種の分野において主に行われる。
【０２３３】
以下、交配により形質転換体を生産する具体的な方法につき説明を行う。交配に供される両親（親植物Ａ・Ｂとする）の組み合わせは、一方（親植物Ａ）が上記遺伝子（以下、有用遺伝子と称する）を有し、他方（親植物Ｂ）がこの有用遺伝子を有さない、あるいは当該有用遺伝子のアリルを有する関係にあり、かつ、互いに交配可能な植物種であればよい。
【０２３４】
換言すれば、親植物Ａとしては、本発明にかかるオリゴヌクレオチド（より好ましくは各コンティグまたはその相補配列）を部分配列または全長とする有用遺伝子を持つ植物であれば特に限定されるものではないが、当該有用遺伝子を持つ可能性が高いという観点から、コムギ連の植物がより好ましく、オオムギ属植物（例えば、オオムギ品種である「Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ」、「赤神力」または「はるな二条」）がさらに好ましく、中でも、栽培オオムギにない遺伝子を有する祖先野生型オオムギ（Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）が特に好ましい。
【０２３５】
一方、親植物Ｂとしては、上記有用遺伝子を持たない、あるいは有用遺伝子のアリルを有し、かつ親植物Ａと交配可能な植物であれば特に限定されるものではないが、コムギ連の植物（親植物Ａの好適な一例）と交配が容易であるという観点から、コムギ連の植物がより好ましく、オオムギを含むオオムギ属植物がさらに好ましい。なお、いうまでもないが、親植物Ａ・Ｂは互いに異なる品種である。また、コムギ連に属する異種植物間の交配は、オオムギ属植物、コムギ属植物、ライムギ属などの間で知られている（最新バイオテクノロジー全書（１）　穀物・いも・牧草類の増殖と育種　１１２　頁　農業図書（株）１９９２年発行　参照）。
【０２３６】
さらに、親植物Ａが「Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ（祖先野生型オオムギ）」で、親植物Ｂが「はるな二条」型、または「赤神力」型の多型部位を持つ栽培オオムギである組み合わせは、交雑が容易であり、かつ、雑種後代が不稔となる虞もないので特に好適である（同種異品種間の交雑のため）。また、栽培品種の遺伝的背景下でのみ良好に発現する、祖先野生型植物の遺伝子の存在も知られているので、祖先野生型オオムギと栽培オオムギとを交雑する意義は極めて大きい。
【０２３７】
また、上記「交配」が戻し交雑の場合、上記の親植物Ａ・Ｂは、順に、一回親・反復親（戻し親）の関係にある植物であってもよく、あるいは、順に、戻し交雑の結果得られた雑種と、この雑種を戻し交雑する反復親との関係であってもよい。
【０２３８】
上記「交配」の目的は、親植物Ｂの遺伝学的背景を持ち、かつ、親植物Ａが有する有用遺伝子が導入された実用系統の選別・確立を行う点にある。換言すれば、親植物Ｂの劣悪形質が排除され、親植物Ａの有用特性のみが導入された実用系統の選別・確立を行う点にある。よって、交配の過程では、親植物Ａ・Ｂの交配により作出された雑種の植物群から、当該有用遺伝子を有する雑種を選抜する工程（選抜工程）が適宜行われる。
【０２３９】
上記の選抜工程では、上記有用遺伝子が、本発明にかかるオリゴヌクレオチドを部分配列または全長として有することを利用する。例えば、親植物Ｂが上記有用遺伝子のアリルを有する場合には、すでに説明したＳＮＰタイピング法の何れかを用いて、得られた雑種の植物群から好適な雑種を選抜すればよい。このような遺伝子マーカーを用いた選抜方法は、上記雑種を育成して表現型を実際に確認する必要がなく、例えば、当該雑種の種子を用いた選抜が可能なので、迅速かつ簡便であるという利点を有する。
【０２４０】
また、親植物Ｂが上記有用遺伝子やそのアリルを有しない場合には、上記ＳＮＰタイピング法を用いる以外に、上記雑種由来のＤＮＡまたはＲＮＡと、本発明にかかるオリゴヌクレオチド（ＳＮＰ検出用のオリゴヌクレオチドＡ以外も含む）とがハイブリダイズするか否かで有用遺伝子の導入を確認することもできる。
【０２４１】
なお、上記の選抜工程で選抜される雑種は、例えば、１）戻し交雑の過程で、戻し親にさらに交配すべき雑種候補や、２）上記有用遺伝子が安定的に保持された新品種、に相当するが、これらの雑種は、実質的に、親植物Ａから上記有用遺伝子のみを受け継いでいる（親植物Ａの劣悪形質は受け継がない）ことが望まれる。したがって、本発明で述べたＳＮＰ以外の遺伝子マーカー（他の遺伝子上にあるＳＮＰでもよい）も用いて、親植物Ａ・Ｂの持つ様々な染色体部分を同定可能な分子マップ（染色体マップ）を作製し、このマップ情報を基に、得られた雑種群（染色体置換系統群）から上記有用遺伝子のみが実質的に導入された雑種を選別することが特に好ましい。なお、分子マップは、例えば、親植物Ａ・Ｂの倍加半数体系統群から作製すればよい。
【０２４２】
また、上記「形質転換体あるいは形質転換植物」とは、交配や遺伝子工学的手法を用いて作出され、上記有用遺伝子を有する雑種を指す。また、形質転換体、形質転換植物の範疇には、生物個体；根、茎、葉、生殖器官（花器官および種子を含む）などの各種器官；各種組織；細胞；などが含まれ、さらにはプロトプラスト、スフェロプラスト、誘導カルス、再生個体およびその子孫、なども含まれるものとする。
【０２４３】
【実施例】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施例の記載に限定されるものではない。
【０２４４】
〔実施例１：オオムギからのｍＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡライブラリーの作製〕オオムギとして「赤神力」、「はるな二条」、および「Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ（ＯＵＨ６０２）」（野生型オオムギ）を用いた。これらオオムギの種子は、細胞工学別冊　植物細胞工学シリーズ１４　植物のゲノム研究プロトコール　１９３　〜１９５　頁（秀潤社（２０００　年）　参照）の記載に従って発芽・生育させ、ＲＮＡ抽出用の材料を得た。なお、「はるな二条」については、発芽時の芽、幼苗の葉身、および止葉期の上位３葉を材料とし、「赤神力」については、栄養成長期の葉身を材料とした。また、「Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ（ＯＵＨ６０２）」については、止葉期の上位３葉を材料とした。
【０２４５】
次いで、セパソールＲＮＡ（Ｓｅｐａｓｏｌ　ＲＮＡ）（ナカライテスク社製）を用い、キットの説明書記載の方法に従って、上記材料から全ＲＮＡを抽出した。さらに、ｍＲＮＡ精製キット（ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）（ａｍｅｒｓｈａｍ　ｐｈａｒｍａｃｉａ　ｂｉｏｔｅｃｈ社製）　を用い、キットの説明書記載の方法に従って、全ＲＮＡからｍＲＮＡのみを抽出した。
【０２４６】
ｃＤＮＡライブラリーの作製は、λＺＡＰ　−ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　社製）　を用い、以下に示す変更点（ａ）及び（ｂ）を除いて「ゲノム解析ラボマニュアル　ｐ６３−ｐ７５　：シュプリンガー・フェアラーク東京（１９９８年発行）」に記載された方法に従って行った。
【０２４７】
（ａ）ｃＤＮＡ末端の平滑化ステップにおける２回目の遠心分離工程（ゲノム解析ラボマニュアル　ｐ７１　参照）では、ｃＤＮＡを含んだ水層に、酢酸ナトリウム溶液（３Ｍ）２０μｌと１００％エタノール４００μＬとを加えてボルテックスで十分に混ぜた後、−２０℃で一晩静置（オーバーナイト）し、次いで、４℃、１５，０００ｒｐｍ　の条件で６０分間遠心分離するように条件を変更した。
【０２４８】
（ｂ）ＸｈｏＩによる切断ステップ（ゲノム解析ラボマニュアル　ｐ７２参照）にて得られた反応液は、−２０℃で一晩静置後に、４０℃、１５，０００ｒｐｍの条件で６０分間遠心分離を行った。その後、上澄みを捨てて完全にペレットを乾かした後、これをＳＴＥ（１×）１４μｌに溶解させ、さらに、カラムローディングダイ（ｃｏｌｕｍｎ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｄｙｅ）３．５μＬを加えてベクターへのライゲーションステップに供した。
【０２４９】
なお、作製したｃＤＮＡライブラリーのタイターは１０^６ｐｆｕ　以上であり、また、インサートチェックレディー（Ｉｎｓｅｒｔ　Ｃｈｅｃｋ　−Ｒｅａｄｙ−）（ＴＯＹＯＢＯ　社製）　を用い、キット記載の方法により測定した、クローン内の平均インサート（ｃＤＮＡ挿入断片）サイズは、平均約１．５ｋｂ、最大６ｋｂ以上とみられた。
【０２５０】
〔実施例２：ｃＤＮＡ挿入断片の解析〕
マスエキサイション（Ｍａｓｓ　ｅｘｃｉｓｉｏｎ）法（ＺＡＰ−ｃＤＮＡ　Ｇｉｇａｐａｃｋ　ＩＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）Ｇｏｌｄ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ　インストラクションマニュアル参照）により、ｃＤＮＡライブラリーから切り出した各クローンをＬＢ培地で一晩培養し、プラスミドＤＮＡを抽出した。
【０２５１】
次いで、上記プラスミドＤＮＡが有するｃＤＮＡ挿入断片について、５’末端側および３’末端側の双方からシークエンス解析を行った。シークエンス解析には、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　ＴＭ３７００遺伝子分析機（ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　ＴＭ　３７００　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ）（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）　を用いた。さらに、シークエンス解析の結果から各クローンの重複程度を調べるために、クローンのクラスタリングを行った。あわせて、各クローンが有する挿入断片をアセンブリして、各コンティグ（１）〜（５３４）を作製した。また、これらの挿入断片をマルチプルアライメントして、異なるクローン間でのＳＮＰを検出した。
【０２５２】
クローンのクラスタリング、挿入断片のアセンブリ、及びＳＮＰ検出用のソフトウエアとしては、ｄｙｎａｃｌｕｓｔ　ＳＮＰ　ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ｄｙｎａｃｌｕｓｔ　ｖｅｒ．　４追加モジュール：株式会社　ダイナコム製）を使用した。より詳細には、当該ソフトウエア内蔵のｂｌａｓｔｎプログラムを用い、Ｅｘｐｅｃｔ　Ｖａｌｕｅを１ｅ^？１０　に設定して、クローンのクラスタリングを行った。また、ベースコーリング時の各塩基の読み取りエラー確率を一定とし（Ｐｈｒｅｄ　スコア＝１５（デフォルト値））、アセンブリツールとしてＰｈｒａｐ　を採用して、表１１１及び表１１２に示すパラメータ設定に従い挿入断片をアセンブリした。
【０２５３】
【表１１１】

【０２５４】
【表１１２】

【０２５５】
【発明の効果】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、以上のように、配列番号１〜５３４の何れかに表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドの一部または全長であって、ユニバーサルコードで示された多型部位のうち、非同義置換を生ぜしめる多型部位の少なくとも一つを含む７ヌクレオチド以上の連続したＤＮＡ配列、またはその相補配列からなる構成である。
【０２５６】
上記のオリゴヌクレオチドは、オオムギの品種の相違に起因する上記多型部位またはその相補部位を含むため、例えば、種々のオオムギ品種間に存在する一塩基多型を検定する目的で利用可能である。また、オオムギの遺伝学的品種識別や、当該オオムギがいずれのタイプの遺伝子を有するかの判定等が可能になるという効果を奏する。
【０２５７】
さらに、上記のオリゴヌクレオチドをプローブまたはプライマーとして有用遺伝子を単離し、この有用遺伝子を遺伝子操作技術を用いて対象とする細胞に導入する方法、あるいは、親植物を交配させて得られた雑種の植物のうち有用遺伝子を持つものを、上記のオリゴヌクレオチドを用いて選抜する方法により、所望する形質転換体を生産することができるという効果を奏する。
【０２５８】
【配列表】

Claims

配列番号１〜５３４の何れかに表されるＤＮＡ配列において、塩基の表記が「ユニバーサルコード」で記載されている多型部位のうち、非同義置換を生ぜしめる多型部位の少なくとも一つを含む７ヌクレオチド以上の連続したＤＮＡ配列、またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド。
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも一つを含んでなる、遺伝子に生じた一塩基多型を検定又は同定するための組成物。
配列番号１〜５３４の何れかに表されるＤＮＡ配列において、塩基の表記が「ユニバーサルコード」で記載されている多型部位のうち、非同義置換を生ぜしめる多型部位、またはその相補部位の少なくとも一つに基づいて、被検体の遺伝子に生じた一塩基多型を検定又は同定する検定方法。
配列番号１〜５３４の何れかに表されるＤＮＡ配列において、塩基の表記が「ユニバーサルコード」で記載されている多型部位のうち、非同義置換を生ぜしめる多型部位、またはその相補部位の少なくとも一つを含有する遺伝子を単離する工程と、得られた遺伝子を遺伝子操作技術を用いて対象とする細胞に導入する工程とを含む形質転換体の生産方法。
配列番号１〜５３４の何れかに表されるＤＮＡ配列において、塩基の表記が「ユニバーサルコード」で記載されている多型部位のうち、非同義置換を生ぜしめる多型部位、またはその相補部位の少なくとも一つを含有する遺伝子を持つ親植物Ａと、この遺伝子を有さない、あるいはこの遺伝子に一塩基多型が生じたアリルを有する親植物Ｂとを交配させて雑種の植物を作出する工程と、次いで、当該雑種の植物の中から前記遺伝子を持つものを、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも一つを用いて、又は請求項３に記載の検定方法を用いて選抜する工程とを含んでなる形質転換体の生産方法。
請求項４または５に記載の方法により生産された形質転換体。
配列番号１〜５３４の何れかに表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチドにおける、塩基の表記が「ユニバーサルコード」で記載されている多型部位のうち、非同義置換を生ぜしめる多型部位の少なくとも一つを含む領域、またはその相補領域の少なくとも一方を増幅し得るように設計されたプライマー。