JP2004113035A

JP2004113035A - IgA NEPHROPATHY DIAGNOSIS USING GENETIC POLYMORPHISM ANALYSIS AND KIT FOR IgA NEPHROPATHY DIAGNOSIS

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Publication number: JP2004113035A
Application number: JP2002278080A
Authority: JP
Inventors: Fumitake Shimojo; 下条　文武; Kazue Narita; 成田　一衛
Original assignee: TOYOBO GENE ANALYSIS KK
Current assignee: TOYOBO GENE ANALYSIS KK
Priority date: 2002-09-24
Filing date: 2002-09-24
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2022-09-24
Also published as: JP4502570B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To accurately forecast the prognosis of a disease on the correlation of the disease with genetic polymorphism, and set the more accurate administration standard of a treating medicine. <P>SOLUTION: The method for forecasting the prognosis of the disease involves a process for detecting/identifying the genetic polymorphism of the structural gene of a human gene. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト遺伝子の構造遺伝子の遺伝子多型を検出・同定する検定方法、検定キット、並びに該遺伝子に関連する疾患の診断及び該遺伝子をコードする蛋白質に作用する薬物の薬効の大きさを予測する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アンジオテンシン変換酵素（アンジオテンシンＩをアンジオテンシンＩＩに変換する酵素：以下ＡＣＥと略す）は、血圧調節に関わる蛋白質であり、１９８９年ＥｈｌｅｒｓらによりＡＣＥをコードする遺伝子がクローニングされた。ＡＣＥは２６個のエクソンと２５個のイントロンから構成されておりＡＣＥ遺伝子には種々の多型が存在している（現在、ＡＣＥ遺伝子には１３個の遺伝子多型が存在していることが知られている）。特に、イントロン１６に存在するアルー配列挿入・欠失多型と種々の疾患との関係が報告されている。それらの疾患には冠動脈疾患、ＩｇＡ腎症、糖尿病性腎症などがある。
【０００３】
本邦における透析患者の内、慢性糸球体腎炎を原疾患とするものが約４０％を占め、その約５０％はＩｇＡ腎症患者と考えられている。そのため、ＩｇＡ腎症は糖尿病性腎症と同様に透析に至る末期腎不全患者の主因のひとつとして重要視されている。しかしながら、慢性腎不全への進行及びＡＣＥ阻害薬の有効性を正確に検定する方法やキット、さらにはこれらの検定により早期にかかる疾患の罹患を診断する方法は得られていないのが現状である。
【０００４】
ＩｇＡ腎症患者は約４０％が末期腎不全へ進行することが知られている。ＹｏｓｈｉｄａらはＡＣＥ遺伝子のアルー配列挿入・欠失多型に着目し欠失多型ホモ接合型がＩｇＡ腎症の腎不全移行に対する危険因子であり、欠失多型ホモ接合型はＡＣＥ阻害薬による腎保護効果が他のアルー配列挿入・欠失多型に比べ高いことを報告している（非特許文献１参照）。しかし、他の研究ではこの報告を否定するものもあり、腎不全への移行には、アルー配列挿入・欠失多型ホモ接合型以外の多型が関与する可能性が伺える。具体的にどのような多型が危険因子であるのか、またＡＣＥ阻害薬による腎保護効果と遺伝子多型との間にどのような関係があるのか、等不明な点が依然多く残されている。
【０００５】
【非特許文献１】
「ザ　ジャーナル　オブ　クリニカル　インベスティゲーション（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」，（米国），１９９５年，第９６巻，ｐ．２１６２−２１６９
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、遺伝子多型解析を用いて、ＩｇＡ腎症の予後をより正確に予測し、またＡＣＥ阻害薬およびアンジオテンシン受容体拮抗薬のより正確な投与基準を設定することを目的とし、そのための方法ならびにそのための検定キットを提供することを目的とする。ひいては慢性腎不全患者を低減することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
レニン−アンジオテンシン系は、血圧調節の主要因子であり、アンジオテンシンＩＩは腎疾患の進行因子でもあることが知られている。したがって、レニン−アンジオテンシン系を阻害するＡＣＥ阻害薬やアンジオテンシン受容体拮抗薬は、腎保護作用があることが報告されており、ＩｇＡ腎症においてもＡＣＥ阻害薬およびアンジオテンシン受容体拮抗薬が多用されている。上述のようにアルー配列挿入・欠失多型ホモ接合型がＩｇＡ腎症の腎不全への進行の危険因子である可能性については既に報告されているが、それを否定する報告もあり、またそれ以外の多型と腎症（腎不全）との関係については何の知見も得られていない。そこで本発明者らは、ＡＣＥ遺伝子配列に存在するアルー配列挿入・欠失多型以外の遺伝子多型と個々の血漿ＡＣＥ活性との関係をもとに、さらに遺伝子多型と腎機能の予後との関連、ＡＣＥ阻害薬の治療効果との関連について調べた。
本発明者らは、血漿ＡＣＥ濃度に影響するＡ２４０Ｔ多型及びＧ２３５０Ａ多型に関して研究を行った。その結果、エクソン１７に存在するＧ２３５０Ａ多型が最もＡＣＥ濃度に影響することが判明した。また、アルー配列挿入・欠失多型は血中循環ＡＣＥ濃度を反映しないことも明確にした。
【０００８】
本発明者らは、上記の知見及び考察を基に、さらに検討を重ね、本発明を完成するに至ったものである。即ち、本発明者らは以下の発明を提供するものである。
（１）アンジオテンシン変換酵素構造遺伝子の遺伝子多型を検出・同定する方法。
（２）構造遺伝子の遺伝子多型において、多型が野生型と少なくとも単一ヌクレオチド置換で異なる遺伝子である上記（１）に記載の方法。
（３）アンジオテンシン変換酵素構造遺伝子の遺伝子多型を検出・同定する工程を含む、腎疾患患者における末期腎不全の発症頻度を予測する方法。
（４）構造遺伝子の遺伝子多型において、多型が野生型と少なくとも単一ヌクレオチド置換で異なる遺伝子である上記（３）に記載の方法。
（５）遺伝子多型部位がエクソンの部位に存在する、上記（３）または（４）に記載の方法。
（６）アンジオテンシン変換酵素構造遺伝子の多型が、野生型の転写開始点から下流の２３５０ｂｐ位におけるグアニンが、アデニンに置換されている遺伝子である、上記（３）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）遺伝子多型を、遺伝子増幅法又は遺伝子伸長法を用いて検出することを特徴とする、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）アンジオテンシン変換酵素構造遺伝子の遺伝子多型を検出・同定する工程を含む、アンジオテンシン変換酵素を含む血圧調節機構に関与する蛋白質に作用する薬物の投与効果を予測する方法。
（９）構造遺伝子の遺伝子多型において、多型が野生型と少なくとも単一ヌクレオチド置換で異なる遺伝子である上記（８）に記載の方法。
（１０）遺伝子多型部位がエクソンの部位に存在する、上記（８）または（９）に記載の方法。
【０００９】
（１１）遺伝子多型を、遺伝子増幅法又は遺伝子伸長法を用いて検出することを特徴とする、上記（８）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）前記薬物が、アンジオテンシン変換酵素阻害薬またはアンジオテンシン受容体拮抗薬である、上記（８）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）前記アンジオテンシン変換酵素阻害薬またはアンジオテンシン受容体拮抗薬が、腎保護作用を有するものである、上記（１２）に記載の方法。
（１４）上記（８）〜（１３）のいずれかに記載の方法を用いて、アンジオテンシン変換酵素を含む血圧調節機構に関与する蛋白質に作用する薬物の投与効果を予測し、得られた結果をもとにして薬物の投与方法を設定することを特徴とする、薬物の投与方法を決定する方法。
（１５）前記薬物が、アンジオテンシン変換酵素阻害薬またはアンジオテンシン受容体拮抗薬である、上記（１４）に記載の方法。
（１６）前記アンジオテンシン変換酵素阻害薬またはアンジオテンシン受容体拮抗薬が、腎保護作用を有するものである、上記（１５）に記載の方法。
（１７）ヒト遺伝子の構造遺伝子の遺伝子多型を検出・同定する為の検定キットであって、
（ｉ）構造遺伝子の遺伝子多型検出用プライマー、
（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、
（ｉｉｉ）４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、および
（ｉｖ）構造遺伝子の野生型検出用プローブ及び変異型検出用プローブ
を含む、キット。
（１８）ヒト遺伝子の構造遺伝子の遺伝子多型を検出・同定する為の検定キットであって、
（ｉ）構造遺伝子の野生型用プライマー、多型用プライマー及び共通のリバースプライマー、
（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および
（ｉｉｉ）４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）
を含む、キット。
（１９）更に
（ｖ）各遺伝子多型を検出する手段
を含む、上記（１８）に記載のキット。
（２０）（ｖ）各遺伝子多型を検出する手段が、
（ｖ−１）構造遺伝子の野生型検出用プローブ及び変異型検出用プローブ
を含む、上記（１９）に記載のキット。
【００１０】
（２１）更に、（ｖ）各遺伝子多型を検出する手段として、
（ｖ−２）分子量マーカー
を含む上記（２０）に記載のキット。
（２２）各プライマー、ｄＮＴＰまたは各プローブの少なくとも１つが、予め標識されていてもよい、上記（１７）〜（２１）のいずれかに記載のキット。
（２３）構造遺伝子の遺伝子多型において、多型が野生型と少なくとも単一ヌクレオチド置換で異なる遺伝子である上記（１７）〜（２２）のいずれかに記載のキット。
（２４）遺伝子多型部位がエクソンの部位に存在する、上記（１７）〜（２３）のいずれかに記載のキット。
（２５）該遺伝子が、アンジオテンシン変換酵素構造遺伝子である上記（１７）〜（２４）のいずれかに記載のキット。
（２６）アンジオテンシン変換酵素構造遺伝子の多型が、野生型の転写開始点から下流の２３５０ｂｐ位におけるグアニンが、アデニンに置換されている遺伝子である、上記（２５）に記載のキット。
（２７）アンジオテンシン変換酵素構造遺伝子の遺伝子多型を検出・同定する工程を含む、アンジオテンシン変換酵素構造遺伝子に関連する疾患の診断の予測方法及びアンジオテンシン変換酵素阻害薬又はアンジオテンシン受容体拮抗薬の投与基準の決定方法。
（２８）アンジオテンシン変換酵素構造遺伝子に関連する疾患が進行性の慢性糸球体腎炎である上記（２７）に記載の方法。
（２９）アンジオテンシン変換酵素構造遺伝子に関連する疾患がＩｇＡ腎症である上記（２７）に記載の方法。
（３０）アンジオテンシン変換酵素構造遺伝子の遺伝子多型において、多型が野生型と少なくとも単一ヌクレオチド置換で異なる遺伝子である上記（２７）〜（２９）のいずれかに記載の方法。
【００１１】
（３１）遺伝子多型部位がエクソンの部位に存在する、上記（３０）に記載の方法。
（３２）アンジオテンシン変換酵素構造遺伝子の多型が、野生型の転写開始点から下流の２３５０ｂｐ位におけるグアニンが、アデニンにより置換されている遺伝子である、上記（３１）に記載の方法。
（３３）遺伝子多型を、遺伝子増幅法又は遺伝子伸長法を用いて検出することを特徴とする、上記（２７）〜（３２）のいずれかに記載の方法。
【００１２】
本発明において、「遺伝子多型」とは遺伝子中のある部位において、ホモ接合体における２種以上の塩基が存在することをいい、一方を野生型、それとは異なる塩基を有する遺伝子を多型という。また「遺伝子多型部位」とは、野生型と多型が存在している遺伝子多型の位置をいう。
構造遺伝子においては、エクソンの部位またはイントロンの部位に遺伝子多型部位が存在していてもよい。好ましくは、遺伝子多型部位はエクソンの部位に存在する。
本発明の好ましい実施態様は、構造遺伝子の遺伝子多型において、多型が野生型と少なくとも単一ヌクレオチド置換で異なるホモ接合体である。
遺伝子としては、構造遺伝子に遺伝子多型が存在していれば特に限定されないが、疾患と関連すると考えられている遺伝子が好ましい。例えば、ＡＣＥをコードする遺伝子が挙げられる。
【００１３】
すでに、ヒトＡＣＥ構造遺伝子のＤＮＡ配列は公知であり、構造遺伝子については、例えば、Ｈｏｗａｒｄら（Ｍｏｌｅｃ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１０（１９９０）　４２９４−４３０２頁）に示されている。本発明においては、文献に示されている構造遺伝子の配列を野生型と定義する。
ＡＣＥ構造遺伝子の多型は、構造遺伝子の野生型の配列と異なる配列を有するものであれば特に限定されないが、野生型の２３５０（ｂｐ）位におけるグアニンが、アデニンにより置換されているものが好ましい。ここで、２３５０位とは、転写開始点から下流の２３５０番目の塩基を意味する。
該ＡＣＥ遺伝子は、血圧調節に関わる因子でありアンジオテンシノーゲンをアンジオテンシンに変換する作用を有する。この遺伝子は心筋肥大症、高血圧並びに腎疾患に関与していることが報告されており、例えば該発明の遺伝子多型の検出は、ＩｇＡ腎症患者の慢性腎不全移行の予測並びにＡＣＥ阻害薬の投与方法、投与時機等を提起し、臨床ならびに診断分野において有用である。
【００１４】
（遺伝子多型を検出・同定する工程）
本発明において、遺伝子多型としては、１塩基多型、挿入、欠失多型などの態様が挙げられる。
本発明において遺伝子多型を検出・同定する方法は、検出すべき遺伝子の遺伝子型が明らかにされ、これが特定される方法であれば特に限定されるものではなく、その検出のための方法を適宜に選択、採用し、若しくは該方法を適宜修飾して採用することができる。
例えば、多型の検出・同定を目的とする被験者のＤＮＡを対象として、特定遺伝子の構造遺伝子多型を検出する方法としては、サザンハイブリダイゼーション法やドットハイブリダイゼーション法（Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　９８：　５０３−５１７，　１９７５等参照）、ジデオキシ塩基配列決定法、ＤＮＡの増幅手法を組み合わせた各種の検出法；例えばＰＣＲ−制限酵素断片長多型分析法（ＲＦＬＰ：　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ），ＰＣＲ−単鎖高次構造多型分析法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　８６：　２７６６−２７７０，　１９８９等参照）、ＰＣＲ−特異的配列オリゴヌクレオチド法（ＳＳＯ：　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ＰＣＲ−ＳＳＯとドットハイブリダイゼーション法を用いる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド法（Ｎａｔｕｒｅ，　３２４：　１６３−１６６，　１９８６等参照）、ＡＲＭＳ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１９８９，　２５０３−２５１６　（１９８９））、ＡＳＰＣＲ（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　１９８９，　ｖｏｌ．８６，　２７５７−２７６０）等が好適に用いられる。
【００１５】
尚、上記において、対象となるＤＮＡは、ヒトＤＮＡの全長ＤＮＡであってもよいが、必ずしもその必要はなく、ヒトＤＮＡの少なくとも上記本発明にかかる遺伝子の遺伝子多型位置を含む部分ＤＮＡであればよい。
また、対象となるＤＮＡは、ヒトに由来するものである限り特に制限されることなく、ヒトＤＮＡを含む例えば血液、毛髪、生体材料組織、手術切除組織、細胞株等の生体試料から広く採取され得る。
上記試料からＤＮＡを抽出する方法は、常法に従って行えばよく、例えば、自動核酸分離装置ＮＡ−１０００（倉敷紡績（株））、ゲノム抽出キット（キアゲン（株））を用いて行うことができる。
【００１６】
本発明のヒトＤＮＡ多型の検出ならびに同定は、より好適には、少量のＤＮＡ試料を用いて簡便且つ容易にしかも感度及び精度の高い検出が可能であるという理由から、遺伝子増幅法、具体的にはＰＣＲ法若しくはそれに準じたＤＮＡ増幅法を組み合わせた方法や、遺伝子伸長法により実施することができる。これらは、所望ＤＮＡ断片を増幅または伸長し、得られた増幅ＤＮＡまたは伸長ＤＮＡの当該多型部位を含む塩基配列を解析することにより実施することができる。遺伝子伸長法においては、予め、ＤＮＡ断片を増幅させておいてもよい。
上記増幅法としては特に限定されるものではないが、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ；特公平４−６７９６０号公報、特公平４−６７９５７号公報）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ；Ｎａｔｕｒｅ，　第３５０巻、第９１頁（１９９１））、ＬＣＲ（ＷＯ０８９／１２６９６、特開平２−２９３４号など）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ　Ｄｉｓｐｌａｃｍｅｎｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　第２０巻、第１６９１頁（１９９２））、ＲＣＲ（ＷＯ９０／０１０６９）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｍｅｔｈｏｄ；Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　第３１巻、第３２７０頁（１９９３））などが挙げられ、いずれにおいても適用することが可能である。遺伝子伸長法としては、ＡＲＭＳ法の記載に基づいて行うことができる。
【００１７】
また、ここで用いられる塩基配列の解析は、特に制限はなく上記した各種の測定手法において採用されている方法、例えば塩基配列の配列決定、ハイブリダイゼーションや制限酵素の利用によるもの、電気泳動等により好ましく行い得る。ハイブリダイゼーション法によれば、検出を目的とする遺伝子多型部位を含む位置に野生型、多型特異的プローブ（野生型検出用プローブ及び／又は変異型検出用プローブ）を設定し、各プローブでの反応性の有無により野生型または多型配列のいずれかを有するかを解析できる。
【００１８】
本発明の検出方法の一つとしては、まず、ヒト生体試料からＤＮＡを抽出し、該遺伝子の少なくとも多型配列を有するかどうかが疑われる遺伝子断片を、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）と共に、遺伝子多型検出用プライマーとして、遺伝子多型部位を含まないプライマー（フォワードプライマーとリバースプライマー）を用いて被験ＤＮＡから増幅し、多量に且つ濃縮されたサンプルを得る。次いで、増幅ＤＮＡサンプルに野生型と多型配列を有するプローブ（野生型検出用プローブ及び変異型検出用プローブ）を作用させ、どちらのプローブが作用したかを測定することにより、本発明にかかわる遺伝子多型の存在を検定することができる。
または、上記濃縮されたサンプルに、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）と共に、遺伝子多型検出用プライマーとして、遺伝子多型部位を含むプライマー、即ち、野生型用プライマー及び／または多型用プライマーを用いて被験ＤＮＡを伸長させる。次いで、伸長ＤＮＡサンプルに野生型と多型配列を有するプローブ（野生型検出用プローブ及び／または変異型検出用プローブ）を作用させ、どちらのプローブが作用したかを測定することにより、本発明にかかる遺伝子多型の存在を検定することができる。または電気泳動によって伸長されたかどうか検出してもよい。
【００１９】
または、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）と共に、野生型用プライマー、多型用プライマー及び共通のリバースプライマーを用いて、遺伝子を増幅させることによって検定することもできる。これは検出を所望する遺伝子多型部位を有する所望のＤＮＡ断片を特異的に増幅するように適宜設定したプライマーの採用により行い得る。具体的には、特定の遺伝子多型部位を含む遺伝子断片が増幅されたか否かによって、遺伝子多型を検出する方法であるが、特定の遺伝子多型部位を含む染色体又は断片を含む核酸試料に、野生型用プライマーと多型用プライマー（フォワードプライマーに相当）を同時にまたはそれぞれ別々に用いて、リバースプライマーと共に増幅反応を行うことにより多型を検出する方法である。ここでフォワードプライマーは上鎖（ｕｐｐｅｒ　ｓｔｒａｎｄ）に相同でも下鎖（ｌｏｗｅｒ　ｓｔｒａｎｄ）に相同であってもよいが、好ましくは上鎖（ｕｐｐｅｒ　ｓｔｒａｎｄ）に相同であって、リバースプライマーはその反対である。
【００２０】
本発明において、野生型用プライマーとは、通常の表現型を有している上鎖又は下鎖の遺伝子多型部位を含む遺伝子断片に相同な配列を有するプライマーであって、多型用プライマーとは、野生型とは異なる配列を有している上鎖又は下鎖の遺伝子多型部位を含む遺伝子断片に相同な配列を有するプライマーである。本発明においては、より具体的には、構造遺伝子の野生型用プライマー、多型用プライマー及び共通のリバースプライマー、プロモーター遺伝子の野生型用プライマー、多型用プライマー及び共通のリバースプライマーを使用する。
野生型用プライマーと多型用プライマーは、好ましくは、３’末端近傍に遺伝子多型部位を有するのが好ましい。
遺伝子の増幅におけるプライマーは、被験者のヒトＤＮＡに由来するＤＮＡを鋳型として、少なくとも当該所望の遺伝子多型部位を含む領域を有する部分ＤＮＡを増幅できるように設計されたものであり、これは、ヒトＤＮＡに特異的であって、他の遺伝子と相同でなければ（例えば、繰り返し配列やパリンドローム配列でないこと等が重要）特に制限されることなく、ＤＮＡの合成の態様、合成するＤＮＡの領域及び塩基長等に応じて適宜選択することができる。
【００２１】
本発明におけるプライマーの塩基長は、当該ＤＮＡに特異的なプライマーとして機能し得る限り特に制限されず、通常１５〜３５程度、好ましくは２０〜３０程度であることができる。
また、増幅されるＤＮＡ領域も、特に限定されないが、引き続く塩基配列の解析に好適に利用できるように設定するのがよく、例えばハイブリダイゼーション法を利用する場合は、プローブとの反応が容易に確認できるように設定するのがよい。
従って、本発明は、被験者のヒトＤＮＡに由来するＤＮＡを鋳型として、少なくとも本発明の特定の遺伝子多型部位を含む領域を有する所望の部分ＤＮＡを合成できるように設計した上記各プライマーをも提供する。
尚、ここでいうＤＮＡの合成とは、特定のＤＮＡ（センス鎖、アンチセンス鎖）を鋳型として、その配列に相補的な配列を有するＤＮＡを伸長及び増幅することを広く含む概念である。
【００２２】
上記したプライマーを含む本発明のＤＮＡは、所望により、ＤＮＡ自動合成機等を利用して本発明で開示する塩基配列に従って合成することができる。
増幅または伸長したＤＮＡを遺伝子多型部位の塩基配列を解析する方法としては、より具体的には、上記のごとく、電気泳動を行ってもよいし、塩基配列決定法に従って行ってもよいし、質量分析を行ってもよいし、更にはプローブを用いたハイブリダイゼーション法によって行ってもよい。
プローブを用いたハイブリダイゼーション法としては、伸長または増幅された特定の核酸に、該核酸配列中に含まれる遺伝子多型部位の配列に特異的なプローブ（野生型検出用プローブまたは変異型検出用プローブ）を用いて、ハイブリダイゼーションをおこなって検出してもよいし、２種以上のプローブ（野生型検出用プローブ及び変異型検出用プローブ）を同時にまたは別々に作用させ、各々のプローブにより得られる検出シグナルの比を求めることによって行うこともできる。
本発明で使用されるプローブは、遺伝子多型部位を含みその種類により検出シグナルが異なれば良いが、好ましくは連続した少なくとも１５塩基、より好ましくは連続した少なくとも１８塩基からなる塩基配列が必要である。上限としては４０塩基程度、好ましくは２０〜３０塩基程度である。プローブは特定核酸配列と相補鎖を形成すればＤＮＡでもＲＮＡでもＰＮＡでもよく、化学合成または生物学的な方法により調製することができる。例えば、パーキンエルマー社のＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いてホスホアミダイト法により合成できる。精製はＦＰＬＣでＭＯＮＯ−Ｑカラムや逆相カラムにて実施しても良い。他の合成方法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスファイト法等がある。
【００２３】
上記各プライマー、ｄＮＴＰ、各プローブは、予め標識されていてもよい。または、リンカーアームを有していてもよい。具体的には、合成時にビオチン、リンカーアーム、蛍光物質等を有するヌクレオチドまたはオリゴｄＧＴＰ、オリゴｄＡＴＰ、オリゴｄＴＴＰ、オリゴｄＣＴＰ等を５’末端または３’末端に付加し修飾基を導入しても良い。あるいはビオチン、リンカーアーム、蛍光物質等を有するヌクレオチドをオリゴヌクレオチド配列中のヌクレオチドの替わりに置換して合成し修飾基を導入しても良い。あるいは合成したヌクレオチドに後から^３２Ｐ、^３５Ｓなどの放射性物質、ＡＬＰ、ＰＯＤなどの酵素、ＦＩＴＣ、ＨＥＸ、６−ＦＡＭ、ＴＥＴなどの蛍光物質など、公知のオリゴヌクレオチドの標識物を導入しても良い。
また本発明において、プローブで検出する前に、予め試料中に含まれる遺伝子多型部位を含む特定の核酸配列を増幅させておいてもよい。
【００２４】
より具体的には、例えば、ビオチン等で標識したプライマーを用いて核酸配列を伸長または増幅した後、伸長または増幅核酸を１本鎖にし、例えば、マイクロタイタープレートのような固相に結合させた野生型検出用プローブまたは変異型検出用プローブとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしなかった核酸を洗いだし、プローブとハイブリダイズした核酸のプライマーの標識によりハイブリダイズしたか否かを検出し、各プローブの検出シグナルの比により遺伝子多型が野生型か多型もしくは混合型であるのかを検出・同定する方法が挙げられる。
本発明の検定方法は、構造遺伝子における遺伝子多型が存在するか否かを検出することによって行う。
【００２５】
また、本発明の構造遺伝子における遺伝子多型検出法において採用され得る各種の操作、例えば、ＤＮＡ又はＤＮＡ断片の合成、ＤＮＡの切断、削除、付加又は結合を目的とする酵素処理、ＤＮＡの単離、精製、複製、選択、ＤＮＡ断片の増幅などはいずれも常法に従うことができ（分子遺伝学実験法、共立出版（株）１９８３年発行；ＰＣＲテクノロジー、宝酒造（株）１９９０年発行等参照）、また必要に応じてこれらを適宜修飾して用いることができる。
上記ＡＣＥ構造遺伝子の遺伝子多型を検出・同定する方法を用いて、腎疾患患者における末期腎不全の発症頻度を予測すること、ＡＣＥを介する血圧調節機構に関与する薬物の投与効果を予測すること、ならびにこれらの予測に基づき該薬物の投与方法等を決定することが可能になる。
【００２６】
（検定キット）
本発明によって明らかにされた、構造遺伝子の遺伝子多型を検出・同定し、両遺伝子多型およびその組み合わせを検定することで、関連する症状または薬物投与による疾患の予後を予測する診断にあたっては、本発明のキットを使用することが好ましい。
かかる検定キットは、被験者のヒトＤＮＡに由来するＤＮＡを鋳型として、本発明における特定の遺伝子多型部位を含むＤＮＡ領域を合成できるように設計された前記のプライマーを必須成分として含有することを特徴とするものである。当該プライマーは、本発明の遺伝子多型の検出方法に応じて適宜選択することができる。
本発明の試薬キットは、上記プライマー成分に加えて、本発明にかかる変異の存在の検出に応じた一乃至数個の試薬を組み合わせたものであってもよい。かかる試薬は、採用される検出方法に応じて適宜選択採用されるが、例えば、ＤＮＡ合成基質類、ＤＮＡ合成酵素類等を挙げることができる。更に、当該試薬キットには、測定の実施の便益のために適当な緩衝液、洗浄液等が含まれていてもよい。
具体的には、本発明のキットは、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む。
【００２７】
より具体的には、本発明のキットには、ヒト遺伝子の構造遺伝子の遺伝子多型を検出・同定する為の検定キットであって、
（ｉ）構造遺伝子の遺伝子多型検出用プライマー、
（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、
（ｉｉｉ）４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、
（ｉｖ）構造遺伝子の野生型検出用プローブ及び変異型検出用プローブ
を含むキットが含まれる。
（ｉ）の構造遺伝子の遺伝子多型検出用プライマーにおける各遺伝子多型検出用プライマーとしては、各々、遺伝子多型部位を含まないプライマー、即ち、フォワードプライマー及びリバースプライマーの組み合わせであってもよいし、遺伝子多型部位を含むプライマー、即ち、野生型用プライマー及び多型用プライマーの組み合わせであってもよい。
（ｉｖ）構造遺伝子の野生型検出用プローブ及び変異型検出用プローブとしては、上記の通りである。
また、本発明のキットには、ヒト遺伝子の構造遺伝子の遺伝子多型を検出・同定する為の検定キットであって、
（ｉ）構造遺伝子の野生型用プライマー、多型用プライマー及び共通のリバースプライマー
（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ並びに
（ｉｉｉ）４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）
を含むキットが含まれる。
（ｉ）構造遺伝子の野生型用プライマー、多型用プライマー及び共通のリバースプライマーとしては、各々、検出を所望する遺伝子多型部位を有する所望のＤＮＡ断片を特異的に増幅するように適宜設定できる。野生型用プライマーと多型用プライマーは、好ましくは、３’末端近傍に遺伝子多型部位を有するのが好ましい。
【００２８】
さらに、上記キットは、（ｖ）各遺伝子多型を検出する手段ならびに当該手段に必要な試薬を含んでいてもよい。例えば、電気泳動法に必要な分子量マーカー（ｖ−１）、またはハイブリダイゼーションに必要な各種プローブ（ｖ−２）を含んでいてもよい。
該プローブとしては、具体的には、構造遺伝子の遺伝子多型を検出するための、野生型検出用プローブ及び／または変異型検出用プローブが挙げられる。それらは上述の通りである。
【００２９】
また、本発明のキットにおいては、各プライマー、ｄＮＴＰ、各プローブは、予め標識されていてもよい。または、リンカーアームを有していてもよい。
本発明の検定キットの好ましい実施態様は、構造遺伝子における検出すべき遺伝子多型が、野生型と少なくとも単一ヌクレオチド置換で異なるものを検出できるキットである。
本発明の検定キットの好ましい実施態様は、ＡＣＥ構造遺伝子の遺伝子多型が、２３５０ｂｐ位におけるグアニン（野生型）がアデニンにより置換されているものを検出できるキットである。
本発明によれば、後述するが、遺伝子多型、特に２３５０ｂｐの遺伝子多型とＩｇＡ腎症およびその予後、ならびにＡＣＥ阻害薬の腎保護効果とは関連性があり、従って、ＡＣＥ遺伝子配列における多型検出用試薬を有効成分として含有する検定キットを利用すれば、ＩｇＡ腎症患者に使用するＡＣＥ阻害薬投薬基準を決定する診断に使用することができる。
【００３０】
ＡＣＥ遺伝子に関連する疾患の診断及びＡＣＥ阻害薬またはアンジオテンシン受容体拮抗薬の投与量決定の予測方法
本発明は、ヒト遺伝子のＡＣＥ構造遺伝子の遺伝子多型を検出・同定する工程を含む、該遺伝子に関する疾患の診断及びＡＣＥ阻害薬アンジオテンシン受容体拮抗薬の投与量決定の予測方法を提供する。ＡＣＥ遺伝子に関連する疾患としては具体的には慢性糸球体腎炎、特にＩｇＡ腎症が挙げられる。本発明において、ＡＣＥ阻害薬の投与量の予測とは、患者（ＩｇＡ腎症患者等）にＡＣＥ阻害薬又はアンジオテンシン受容体拮抗薬を投与する時期を調節することにより患者（ＩｇＡ腎症患者等）の腎保護効果を期待し慢性腎不全移行を回避、延長することを可能にする診断を意味する。
具体的には、例えば、ＡＣＥの遺伝子型を検定することで、患者（ＩｇＡ腎症患者等）の慢性腎不全移行の危険性を診断すること並びにＡＣＥ阻害薬又はアンジオテンシン受容体拮抗薬による腎保護効果を有する患者を選別診断するのに有用である。
本発明において用いられるＡＣＥ阻害薬ならびにアンジオテンシン受容体拮抗薬としては通常当分野で用いられる種々の医薬が挙げられる。
当該遺伝子診断は、好適には、被験者のヒトＤＮＡのＡＣＥ構造遺伝子の遺伝子型が、野生型であるのか、あるいは２３５０ｂｐ位におけるグアニンがアデニンにより置換されているかどうかを検出することによって行われる。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
参考例１
本発明を完成するにあたり、本発明者等は新潟大学医学部に来院あるいは入院している組織学的にＩｇＡ腎症と診断された患者２８０名について、年齢、性別、身長、体重、及び各種血液検査を測定した。各測定値を表１に示す。
【００３２】
【表１】

【００３３】
表１はＡＣＥ阻害薬の投与を受けている患者群と受けていない患者群の臨床所見を示す。年齢、性別、血清クレアチニン値、クレアチニンクリアランスは腎生検時並びに経過観察期間において両群での差を認めなかった。しかし、尿蛋白量及び収縮期血圧値はＡＣＥ阻害薬投与群が非投与群より優位に高値を示した。また、末期腎不全発生率はＡＣＥ阻害薬非投与群が投与群に比し優位に高値を示した（図１Ａ）。同様な結果がアンジオテンシン受容体拮抗薬を投与した場合にも得られた。
【００３４】
実施例１　ＡＣＥ遺伝子の塩基多型検出
（１）ＡＣＥ遺伝子２３５０位の多型を検出するプライマーの合成
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ｇａｃｇａａｔｇｔｇａｔｇｇｃｃａｃａ：以下、プライマー１と示す）および配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ｇａｃｇａａｔｇｔｇａｔｇｇｃｃａｃｇ：以下、プライマー２と示す）および配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ｇａｃｇａａｔｇｔｇａｔｇｇｃｃａｃａｔ：以下、プライマー３と示す）および配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ｇａｃｇａａｔｇｔｇａｔｇｇｃｃａｃｇｔ：以下、プライマー４と示す）および配列番号５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ｔｔｇａｔｇａｇｔｔｃｃａｃｇｔａｔｔｔｃｇ：以下、プライマー５と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。
プライマー１は３’末端が野生型（Ａ）のヌクレオチド配列を有し、プライマー２は３’末端が多型（Ｇ）のヌクレオチド配列を有し、プライマー３は３’末端から２番目が野生型（Ａ）のヌクレオチド配列を有し、プライマー４は３’末端から２番目が多型（Ｇ）のヌクレオチド配列を有する。プライマー５はプライマー１〜４のいずれとも対になるリバースプライマーである。
【００３５】
（２）ＰＣＲ法によるＡＣＥ遺伝子多型の解析
ヒト白血球からフェノール・クロロホルム法により抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトＡＣＥ遺伝子多型を解析した。
▲１▼試薬
以下の試薬を含む２５μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ反応液
プライマー１〜４のいずれか　　　　　　　５　　ｐｍｏｌ
プライマー５　　　　　　　　　　　　　　５　　ｐｍｏｌ
×１０緩衝液
（６０ｍＭトリス　硫酸，ｐＨ８．８）　　　２．５μｌ
２ｍＭ　ｄＮＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．５μｌ
２５ｍＭ　ＭｇＳＯ_４　　　　　　　　　　　１　　μｌ
ＫＯＤｐｌｕｓ　ＤＮＡポリメラーゼ　　　　　０．２Ｕ
抽出ＤＮＡ溶液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００ｎｇ
蒸留水で全量２５μＬにした。
増幅条件
９４℃・２分
９４℃・１５秒、５５℃・３０秒、６８℃、３０秒（３５サイクル）
６８℃・２分
▲２▼　検出
得られたＰＣＲ産物を常法に従ってアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色して増幅産物のバンドを検出した。得られた結果は野生型特異的プライマーでの増幅では野生型のみが、多型特異的プライマーでは変異型のみが増幅した。また、ヘテロの検体では野生型と変異型がそれぞれ増幅することを電気泳動で確認した。
【００３６】
上記のように、ＫＯＤｐｌｕｓ　ＤＮＡポリメラーゼとプライマーの３’末端から２番目の塩基に多型を含むプライマーによってのみ試料の遺伝子型を明確に判定することができた。
【００３７】
実施例２　ＡＣＥ　Ａ２３５０Ｇ遺伝子多型とＩｇＡ腎症の長期的腎機能予後の関係
実施例１で得られたヒトＡＣＥ遺伝子の塩基多型検出結果とＩｇＡ患者の末期腎不全の相関関係を図１に示す。ＡＣＥ遺伝子の２３５０位のアデニンホモ接合多型を持つＩｇＡ腎症患者はグアニンホモ接合多型及びヘテロ接合多型を持つ同患者に比べ末期腎不全になる危険率が高いことが分かる（図１Ｂ）。このことは、２３５０位のアデニンホモ接合多型が末期腎不全の危険因子となることを示すものである。
【００３８】
実施例３　ＡＣＥ構造遺伝子の塩基多型とＡＣＥ阻害薬投与における腎保護効果との相関
実施例１で得られたヒトＡＣＥ遺伝子の塩基多型検出結果とＡＣＥ阻害薬の腎保護効果の相関関係を図２に示す。
図２から分かるように、ＡＣＥ遺伝子の２３５０位がアデニンホモ接合多型となっているＩｇＡ腎症の患者はグアニンホモ接合多型及びヘテロ接合多型の遺伝子多型をもつ同患者よりもＡＣＥ阻害薬の投与を受けている場合、慢性腎不全に移行する期間が遅いことが明らかとなった。このことは、ＩｇＡ腎症患者の治療を実施するに当たり、ＡＣＥ阻害薬の投与効果（腎保護効果）を予測する上で、該遺伝子多型を調べることにより、より的確な診断、予測が可能となった。
具体的には、アデニンホモ接合多型を持つＩｇＡ腎症患者は末期腎不全の危険率が高く、それら患者へのＡＣＥ阻害薬の投与は腎保護効果を示し、末期腎不全危険率を低下させる効果がある。同様な結果が、アンジオテンシン受容体拮抗薬を用いた場合にも得られた。
【００３９】
【発明の効果】
上述したように本発明の方法は、構造遺伝子の遺伝子多型、例えば、個体がＡＣＥ構造遺伝子の特定の多型についてホモ接合型であるかまたはヘテロ接合型であるかを決定することにより、ＩｇＡ腎症患者の末期腎不全の危険にある素因の診断に有用である。なおかつ、該患者へのＡＣＥ阻害薬あるいはアンジオテンシン受容体拮抗薬の投与による腎保護効果を予測することを可能にする。
【００４０】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：ヒトＡＣＥ遺伝子の野生型配列と相同な配列を有するオリゴヌクレオチド
配列番号２：ヒトＡＣＥ遺伝子の２３５０番目が多型な配列と相同な配列を有するオリゴヌクレオチド
配列番号３：ヒトＡＣＥ遺伝子の配列と相同な配列を有するオリゴヌクレオチド
配列番号４：ヒトＡＣＥ遺伝子の２３５０番目が多型な配列と相同な配列を有するオリゴヌクレオチド
配列番号５：ヒトＡＣＥ遺伝子の配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド
【００４１】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａは、ＩｇＡ腎症患者の末期腎不全発症の頻度とＡＣＥ阻害薬投与との相関関係を示した図である。図中、点線は、ＡＣＥ阻害薬を投与した場合、実線は、ＡＣＥ阻害薬を投与しなかった場合の結果を示す。
図１Ｂは、ヒトＡＣＥ構造遺伝子のＩｇＡ腎症患者の末期腎不全発症の頻度と遺伝子多型との相関関係を示した図である。図中、点線は、ヘテロ接合多型かグアニンホモ接合多型の場合の結果を示し、実線はアデニンホモ接合多型の場合の結果を示している。
それぞれ、縦軸は末期腎不全を発症していない患者の割合（％）を、横軸は観察期間（月）を示している。
【図２】図２Ａは、アデニンホモ接合多型のＩｇＡ腎症患者における末期腎不全発症の頻度とＡＣＥ阻害薬投与との相関関係を示した図である。図中、点線は、ＡＣＥ阻害薬を投与した場合、実線は、ＡＣＥ阻害薬を投与しなかった場合の結果を示す。
図２Ｂは、ヘテロ接合多型かまたはグアニンホモ接合多型のＩｇＡ腎症患者における末期腎不全発症の頻度とＡＣＥ阻害薬投与との相関関係を示した図である。図中、点線は、ＡＣＥ阻害薬を投与した場合、実線は、ＡＣＥ阻害薬を投与しなかった場合の結果を示す。
それぞれ、縦軸は末期腎不全を発症していない患者の割合（％）を、横軸は観察期間（月）を示している。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention provides an assay method and an assay kit for detecting and identifying a genetic polymorphism of a structural gene of a human gene, and a method for diagnosing a disease associated with the gene and determining the efficacy of a drug acting on a protein encoding the gene. How to predict.
[0002]
[Prior art]
Angiotensin converting enzyme (enzyme for converting angiotensin I to angiotensin II: hereinafter referred to as ACE) is a protein involved in blood pressure regulation. In 1989, a gene encoding ACE was cloned by Ehlers et al. ACE is composed of 26 exons and 25 introns, and various polymorphisms exist in the ACE gene (at present, it is known that 13 gene polymorphisms exist in the ACE gene). Has been). In particular, the relationship between the Aru sequence insertion / deletion polymorphism present in intron 16 and various diseases has been reported. These diseases include coronary artery disease, IgA nephropathy, diabetic nephropathy and the like.
[0003]
About 40% of dialysis patients in Japan have chronic glomerulonephritis as a primary disease, and about 50% of them are considered to be IgA nephropathy patients. Therefore, IgA nephropathy is regarded as one of the main causes of end-stage renal failure patients who reach dialysis, like diabetic nephropathy. However, at present, there is no method or kit for accurately assaying the progression to chronic renal failure and the efficacy of an ACE inhibitor, and no method for diagnosing the disease at an early stage by using these assays. .
[0004]
It is known that about 40% of IgA nephropathy patients progress to end-stage renal failure. Yoshida et al. Focused on the ACE gene insertion / deletion polymorphism and found that the deletion polymorphism homozygous was a risk factor for the transfer of IgA nephropathy to renal failure, and the deletion polymorphism homozygous was caused by an ACE inhibitor. It has been reported that the renal protective effect is higher than other Aru sequence insertion / deletion polymorphisms (see Non-Patent Document 1). However, other studies have denied this report, suggesting that the transition to renal failure may involve polymorphisms other than the homozygous insertion / deletion polymorphism. There are still many unclear points such as what kind of polymorphism is a risk factor and what is the relationship between the renal protective effect of ACE inhibitors and gene polymorphisms. .
[0005]
[Non-patent document 1]
"The Journal of Clinical Investigation", (USA), 1995, vol. 96, p. 2162-2169
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention aims to use polymorphism analysis to more accurately predict the prognosis of IgA nephropathy and to set more accurate administration criteria for ACE inhibitors and angiotensin receptor antagonists. It is an object to provide a method and an assay kit therefor. The purpose is to reduce patients with chronic renal failure.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The renin-angiotensin system is a major factor in regulating blood pressure, and angiotensin II is known to be also a progression factor in renal disease. Therefore, ACE inhibitors and angiotensin receptor antagonists that inhibit the renin-angiotensin system have been reported to have renal protective effects, and ACE inhibitors and angiotensin receptor antagonists are frequently used in IgA nephropathy. I have. As described above, it has been already reported that the Aru sequence insertion / deletion polymorphism homozygous homozygous form may be a risk factor for progression of IgA nephropathy to renal failure, but some reports have denied it. No information has been obtained on the relationship between other polymorphisms and nephropathy (renal failure). Therefore, the present inventors, based on the relationship between individual plasma ACE activity and polymorphisms other than the Aru sequence insertion / deletion polymorphisms present in the ACE gene sequence, further evaluated the prognosis of gene polymorphism and renal function. The relationship between ACE inhibitors and the therapeutic effect of ACE inhibitors was examined.
The present inventors have studied A240T and G2350A polymorphisms that affect plasma ACE levels. As a result, it was found that the G2350A polymorphism present in exon 17 most affects the ACE concentration. It was also clarified that the Aru sequence insertion / deletion polymorphism did not reflect the circulating ACE concentration.
[0008]
The present inventors have further studied based on the above findings and considerations, and have completed the present invention. That is, the present inventors provide the following inventions.
(1) A method for detecting and identifying a gene polymorphism of an angiotensin converting enzyme structural gene.
(2) The method according to the above (1), wherein in the polymorphism of the structural gene, the polymorphism differs from the wild type by at least a single nucleotide substitution.
(3) A method for predicting the frequency of onset of end-stage renal failure in a renal disease patient, the method including a step of detecting and identifying a gene polymorphism of an angiotensin converting enzyme structural gene.
(4) The method according to (3) above, wherein the polymorphism in the structural gene polymorphism is a gene that differs from the wild type by at least a single nucleotide substitution.
(5) The method according to the above (3) or (4), wherein the gene polymorphism site is located at an exon site.
(6) The gene according to any of (3) to (5) above, wherein the polymorphism of the angiotensin converting enzyme structural gene is a gene in which guanine at 2350 bp downstream from the wild-type transcription initiation site is replaced with adenine. The described method.
(7) The method according to any one of (1) to (6) above, wherein the gene polymorphism is detected using a gene amplification method or a gene extension method.
(8) A method for predicting the administration effect of a drug acting on a protein involved in a blood pressure regulating mechanism including an angiotensin converting enzyme, the method including a step of detecting and identifying a gene polymorphism of an angiotensin converting enzyme structural gene.
(9) The method according to (8), wherein the polymorphism in the structural gene polymorphism is a gene that differs from the wild type by at least a single nucleotide substitution.
(10) The method according to the above (8) or (9), wherein the polymorphic site is located at the exon site.
[0009]
(11) The method according to any of (8) to (10) above, wherein the gene polymorphism is detected using a gene amplification method or a gene extension method.
(12) The method according to any of (8) to (11) above, wherein the drug is an angiotensin converting enzyme inhibitor or an angiotensin receptor antagonist.
(13) The method according to (12) above, wherein the angiotensin converting enzyme inhibitor or angiotensin receptor antagonist has a renal protective effect.
(14) Using the method according to any one of the above (8) to (13), the effect of administering a drug acting on a protein involved in a blood pressure regulating mechanism including an angiotensin converting enzyme is predicted, and the obtained result is obtained. A method for determining a drug administration method, comprising setting a drug administration method based on the method.
(15) The method according to (14) above, wherein the drug is an angiotensin converting enzyme inhibitor or an angiotensin receptor antagonist.
(16) The method according to (15) above, wherein the angiotensin converting enzyme inhibitor or angiotensin receptor antagonist has a renal protective action.
(17) A test kit for detecting and identifying a gene polymorphism of a structural gene of a human gene,
(I) a primer for detecting a gene polymorphism in a structural gene,
(Ii) DNA polymerase,
(Iii) four deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), and
(Iv) Probe for detecting wild type and mutant type of structural gene
A kit comprising:
(18) a test kit for detecting and identifying a gene polymorphism of a structural gene of a human gene,
(I) a primer for a wild-type structural gene, a primer for a polymorphism and a common reverse primer,
(Ii) DNA polymerase, and
(Iii) Four types of deoxynucleotide triphosphate (dNTP)
A kit comprising:
(19) Further
(V) Means for detecting each gene polymorphism
The kit according to the above (18), comprising:
(20) (v) the means for detecting each gene polymorphism comprises:
(V-1) Probe for detecting wild type and mutant type of structural gene
The kit according to the above (19), comprising:
[0010]
(21) Further, (v) as means for detecting each gene polymorphism,
(V-2) Molecular weight marker
The kit according to the above (20), comprising:
(22) The kit according to any of (17) to (21), wherein at least one of each primer, dNTP or each probe may be labeled in advance.
(23) The kit according to any one of (17) to (22) above, wherein the polymorphism in the structural gene polymorphism differs from the wild type by at least a single nucleotide substitution.
(24) The kit according to any one of the above (17) to (23), wherein the gene polymorphism site is present at an exon site.
(25) The kit according to any one of the above (17) to (24), wherein the gene is an angiotensin converting enzyme structural gene.
(26) The kit according to (25) above, wherein the polymorphism of the angiotensin converting enzyme structural gene is a gene in which guanine at 2350 bp downstream from the wild-type transcription initiation site has been replaced with adenine.
(27) A method for predicting the diagnosis of a disease associated with an angiotensin converting enzyme structural gene, including a step of detecting and identifying a gene polymorphism of an angiotensin converting enzyme structural gene, and administration standards for an angiotensin converting enzyme inhibitor or an angiotensin receptor antagonist How to determine.
(28) The method according to (27) above, wherein the disease associated with the angiotensin converting enzyme structural gene is progressive chronic glomerulonephritis.
(29) The method according to (27) above, wherein the disease associated with the angiotensin converting enzyme structural gene is IgA nephropathy.
(30) The method according to any one of (27) to (29) above, wherein in the polymorphism of the structural gene of an angiotensin converting enzyme, the polymorphism differs from the wild type by at least a single nucleotide substitution.
[0011]
(31) The method according to the above (30), wherein the polymorphic site is located at an exon site.
(32) The method according to (31) above, wherein the polymorphism of the angiotensin converting enzyme structural gene is a gene in which guanine at 2350 bp downstream from the wild-type transcription initiation site has been replaced by adenine.
(33) The method according to any of (27) to (32) above, wherein the gene polymorphism is detected using a gene amplification method or a gene extension method.
[0012]
In the present invention, “gene polymorphism” refers to the presence of two or more bases in a homozygote at a certain site in a gene, one of which is referred to as a wild type, and a gene having a base different from that is referred to as polymorphism . The “gene polymorphism site” refers to the position of a gene polymorphism where a wild type and a polymorphism are present.
In the structural gene, a polymorphism site may be present at an exon site or an intron site. Preferably, the polymorphic site is located at an exon.
In a preferred embodiment of the present invention, in the genetic polymorphism of the structural gene, the polymorphism is a homozygote which differs from the wild type by at least a single nucleotide substitution.
The gene is not particularly limited as long as the structural gene has a gene polymorphism, but a gene considered to be associated with a disease is preferable. For example, a gene encoding ACE can be mentioned.
[0013]
The DNA sequence of the human ACE structural gene has already been known, and the structural gene is described in, for example, Howard et al. (Molec. Cell. Biol. 10 (1990) 4294-4302). In the present invention, the sequence of the structural gene shown in the literature is defined as wild type.
The polymorphism of the ACE structural gene is not particularly limited as long as it has a sequence different from that of the wild type of the structural gene, but it is preferable that the guanine at the 2350 (bp) position of the wild type is replaced by adenine. . Here, the position 2350 means the 2350th base downstream from the transcription start point.
The ACE gene is a factor involved in blood pressure regulation and has an effect of converting angiotensinogen to angiotensin. This gene has been reported to be involved in myocardial hypertrophy, hypertension and renal disease. For example, the detection of the gene polymorphism of the present invention predicts the transfer of chronic renal failure in IgA nephropathy patients and the use of ACE inhibitors It proposes an administration method, administration timing, etc., and is useful in the clinical and diagnostic fields.
[0014]
(Step of detecting and identifying polymorphism)
In the present invention, examples of the gene polymorphism include single nucleotide polymorphism, insertion, and deletion polymorphism.
In the present invention, a method for detecting and identifying a gene polymorphism is not particularly limited as long as the genotype of the gene to be detected is clarified and the method is specified. And the method may be appropriately modified and adopted.
For example, as a method for detecting a structural gene polymorphism of a specific gene in a subject's DNA for the purpose of detecting / identifying the polymorphism, a Southern hybridization method or a dot hybridization method (J. Mol. Biol.98: See 503-517, 1975, etc.), dideoxy base sequencing, and various detection methods combining DNA amplification techniques; for example, PCR-restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP: Restriction fragment length polymorphism), PCR- Single-chain higher-order structural polymorphism analysis (Proc. Natl. Acad. Sci., USA,86: 2766-2770, 等 1989, etc.), PCR-specific sequence oligonucleotide method (SSO: Specific sequence oligonucleotide), allele-specific oligonucleotide method using PCR-SSO and dot hybridization method (Nature,).324: 163-166, 1986, etc.), ARMS method (Nucleic Acids Res., 1989, 2503-2516 (1989)), ASPCR (Proc. Natl. Acad. Sci., 1989, vol. 86, 2757-1760), etc. Is preferably used.
[0015]
In the above, the target DNA may be full-length DNA of human DNA, but is not necessarily required to be a partial DNA containing at least the polymorphism position of the gene of the present invention. Just fine.
The target DNA is not particularly limited as long as it is derived from humans, and is widely collected from biological samples containing human DNA, such as blood, hair, biomaterial tissues, surgically resected tissues, cell lines, and the like. obtain.
The method of extracting DNA from the above sample may be performed according to a conventional method, for example, using an automatic nucleic acid separation device NA-1000 (Kurashiki Spinning Co., Ltd.) and a genome extraction kit (Qiagen Co., Ltd.). .
[0016]
The detection and identification of the human DNA polymorphism of the present invention is more preferably performed by a gene amplification method, specifically, because a small amount of a DNA sample can be used for simple and easy detection with high sensitivity and accuracy. Can be performed by a method combining a PCR method or a DNA amplification method according to the method, or a gene extension method. These can be carried out by amplifying or extending a desired DNA fragment and analyzing the base sequence containing the polymorphic site in the obtained amplified DNA or extended DNA. In the gene extension method, a DNA fragment may be amplified in advance.
Examples of the amplification method include, but are not particularly limited to, PCR (Polymerase chain reaction; Japanese Patent Publication No. 4-67960 and Japanese Patent Publication No. 4-67957) and NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification method; Nature, 350, page 91 (1991)), LCR (WO089 / 12696, JP-A-2-2934, etc.), SDA (Strand Displacement Amplification; Nucleic Acids Res., Vol. 20, page 1691 (1992)), RCR (WO90 / 01069), TMA (Transscription \ Mated \ Amplification \ Method) J. Clin. Microbiol., Vol. 31, No. 3270, pp (1993)) and the like, can be applied in any. The gene extension method can be performed based on the description of the ARMS method.
[0017]
The analysis of the base sequence used herein is not particularly limited, and may be any of the methods employed in the above-described various measurement methods, for example, sequencing of the base sequence, hybridization or use of a restriction enzyme, electrophoresis, or the like. It can be done preferably. According to the hybridization method, wild-type and polymorphism-specific probes (probes for detection of wild-type and / or probes for detection of mutant type) are set at positions including gene polymorphism sites for detection, and Can be analyzed for the presence or absence of the wild-type or polymorphic sequence depending on the presence or absence of the reactivity.
[0018]
As one of the detection methods of the present invention, first, DNA is extracted from a human biological sample, and a gene fragment suspected of having at least a polymorphic sequence of the gene is subjected to DNA polymerase, four types of deoxynucleotide triphosphates. Amplification from the test DNA is performed using a primer (forward primer and reverse primer) not containing a gene polymorphism site as a gene polymorphism detection primer together with an acid (dNTP) to obtain a large and concentrated sample. Then, a probe having a wild type and a polymorphic sequence (a probe for detecting a wild type and a probe for detecting a mutant type) is caused to act on the amplified DNA sample, and which of the probes is acted on is measured. The presence of a polymorphism can be tested.
Alternatively, a DNA polymerase, four types of deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), and a primer containing a gene polymorphism site as a primer for detecting a gene polymorphism, that is, a primer for wild-type and / or The test DNA is extended using the primer for polymorphism. Next, a probe having a wild type and a polymorphic sequence (a probe for detecting a wild type and / or a probe for detecting a mutant type) is allowed to act on the extended DNA sample, and which of the probes is acted on is measured. The presence of such a genetic polymorphism can be assayed. Or you may detect by electrophoresis whether it was extended.
[0019]
Alternatively, the assay can be performed by amplifying a gene using a wild-type primer, a polymorphism primer, and a common reverse primer together with a DNA polymerase and four types of deoxynucleotide triphosphates (dNTPs). This can be performed by using primers appropriately set so as to specifically amplify a desired DNA fragment having a polymorphic site desired to be detected. Specifically, a method for detecting a gene polymorphism depending on whether or not a gene fragment containing a specific gene polymorphism site has been amplified. A method for detecting a polymorphism by performing an amplification reaction together with a reverse primer using a wild-type primer and a polymorphism primer (corresponding to a forward primer) simultaneously or separately, respectively. Here, the forward primer may be homologous to the upper strand (upper strand) or homologous to the lower strand (lower strand), but is preferably homologous to the upper strand (upper strand) and the reverse primer is the opposite. .
[0020]
In the present invention, a wild-type primer is a primer having a sequence homologous to a gene fragment containing an upper-chain or lower-chain gene polymorphism site having a normal phenotype, and a polymorphism primer. Is a primer having a sequence homologous to a gene fragment containing an upper chain or lower chain gene polymorphism site having a sequence different from that of the wild type. In the present invention, more specifically, a wild-type primer of a structural gene, a polymorphic primer and a common reverse primer, a wild-type primer of a promoter gene, a polymorphic primer and a common reverse primer are used.
The primer for wild type and the primer for polymorphism preferably have a gene polymorphism site near the 3 'end.
Primers in gene amplification are designed to amplify a partial DNA having at least a region containing the desired gene polymorphism site, using a DNA derived from human DNA of a subject as a template. It is specific to DNA and not homologous to other genes (for example, it is important that it is not a repetitive sequence or a palindromic sequence). It can be appropriately selected according to the base length and the like.
[0021]
The base length of the primer in the present invention is not particularly limited as long as it can function as a primer specific to the DNA, and can be generally about 15 to 35, preferably about 20 to 30.
Also, the DNA region to be amplified is not particularly limited, but is preferably set so as to be suitably used for subsequent nucleotide sequence analysis. For example, when a hybridization method is used, the reaction with the probe is easily confirmed. It is better to set it up.
Therefore, the present invention also provides each of the above primers designed so that a desired partial DNA having at least a region containing the specific polymorphic site of the present invention can be synthesized using a DNA derived from human DNA of a subject as a template. I do.
The term “synthesis of DNA” as used herein is a concept that broadly includes extending and amplifying a DNA having a sequence complementary to a specific DNA (sense strand, antisense strand) as a template.
[0022]
The DNA of the present invention containing the above-mentioned primers can be synthesized according to the nucleotide sequence disclosed in the present invention using a DNA automatic synthesizer or the like, if desired.
As a method of analyzing the base sequence of the amplified or elongated DNA at the polymorphic site of the gene, more specifically, as described above, electrophoresis may be performed, or may be performed according to a base sequence determination method, Mass spectrometry may be performed, and furthermore, hybridization may be performed using a probe.
As a hybridization method using a probe, a probe specific to the sequence of a gene polymorphism site contained in the extended or amplified specific nucleic acid (a probe for detecting a wild type or a probe for detecting a mutant type) is used. ) May be used to carry out hybridization, or two or more probes (wild-type detection probe and mutant-type detection probe) may act simultaneously or separately, and the detection obtained by each probe may be used. It can also be done by determining the signal ratio.
The probe used in the present invention may contain a gene polymorphism site and have a different detection signal depending on its type, but preferably has a nucleotide sequence consisting of at least 15 consecutive nucleotides, more preferably at least 18 consecutive nucleotides. . The upper limit is about 40 bases, preferably about 20 to 30 bases. The probe may be DNA, RNA or PNA as long as it forms a complementary strand with the specific nucleic acid sequence, and can be prepared by chemical synthesis or biological methods. For example, it can be synthesized by a phosphoramidite method using a DNA synthesizer 391 manufactured by Perkin Elmer. Purification may be performed by FPLC using a MONO-Q column or a reversed-phase column. Other synthesis methods include a phosphoric triester method, an H-phosphonate method, and a thiophosphite method.
[0023]
Each of the above primers, dNTPs, and each probe may be labeled in advance. Alternatively, it may have a linker arm. Specifically, a nucleotide having a biotin, a linker arm, a fluorescent substance, or an oligo dGTP, an oligo dATP, an oligo dTTP, an oligo dCTP, or the like may be added to the 5 ′ end or the 3 ′ end during synthesis to introduce a modifying group. . Alternatively, a nucleotide having biotin, a linker arm, a fluorescent substance, or the like may be substituted for the nucleotide in the oligonucleotide sequence and synthesized to introduce a modifying group. Or later on the synthesized nucleotide³²P,³⁵Known oligonucleotide labels such as radioactive substances such as S, enzymes such as ALP and POD, and fluorescent substances such as FITC, HEX, 6-FAM, and TET may be introduced.
In the present invention, a specific nucleic acid sequence containing a polymorphism site contained in a sample may be amplified in advance before detection with a probe.
[0024]
More specifically, for example, after extending or amplifying a nucleic acid sequence using a primer labeled with biotin or the like, the extended or amplified nucleic acid is made into a single strand and, for example, bound to a solid phase such as a microtiter plate. Hybridize with a wild-type detection probe or a mutant-type detection probe, wash out the unhybridized nucleic acid, and detect whether or not the nucleic acid hybridized with the probe was hybridized by labeling the primer. A method for detecting / identifying whether a gene polymorphism is a wild type, a polymorphism, or a mixed type based on the ratio of detection signals is exemplified.
The test method of the present invention is performed by detecting whether or not a genetic polymorphism in a structural gene exists.
[0025]
In addition, various operations that can be employed in the method for detecting a gene polymorphism in a structural gene of the present invention, for example, synthesis of DNA or DNA fragment, enzyme treatment for the purpose of cutting, deleting, adding or binding DNA, and isolation of DNA Purification, replication, selection, amplification of DNA fragments, and the like can all be performed in accordance with a conventional method (see Molecular Genetics Experiment, published by Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., 1983; PCR Technology, Takara Shuzo Co., Ltd., 1990, etc.) These can be appropriately modified and used as necessary.
Predicting the incidence of end-stage renal failure in renal disease patients using the method for detecting and identifying the gene polymorphism of the ACE structural gene, and predicting the administration effect of a drug involved in ACE-mediated blood pressure regulation mechanism , And a method of administering the drug based on these predictions.
[0026]
(Test kit)
The present invention has revealed, by detecting and identifying structural gene polymorphisms, by testing both gene polymorphisms and combinations thereof, in the diagnosis to predict the prognosis of related symptoms or disease due to drug administration, It is preferred to use the kit of the invention.
Such an assay kit contains, as an essential component, the above-mentioned primer designed to synthesize a DNA region containing a specific polymorphism site in the present invention, using a DNA derived from human DNA of a subject as a template. It is assumed that. The primer can be appropriately selected according to the method for detecting a gene polymorphism of the present invention.
The reagent kit of the present invention may be a combination of one or several reagents corresponding to the detection of the presence of the mutation according to the present invention, in addition to the above-mentioned primer components. Such a reagent is appropriately selected and employed depending on the detection method to be employed, and examples thereof include DNA synthesis substrates and DNA synthases. Further, the reagent kit may contain an appropriate buffer, washing solution, etc. for the benefit of performing the measurement.
Specifically, the kit of the present invention contains primers, DNA polymerase, and four types of deoxynucleotide triphosphates (dNTPs).
[0027]
More specifically, the kit of the present invention is a test kit for detecting and identifying a genetic polymorphism of a structural gene of a human gene,
(I) a primer for detecting a gene polymorphism in a structural gene,
(Ii) DNA polymerase,
(Iii) four types of deoxynucleotide triphosphates (dNTPs),
(Iv) Probe for detecting wild type and mutant type of structural gene
And a kit containing
Each of the primers for detecting a gene polymorphism in the primer for detecting a gene polymorphism in the structural gene of (i) may be a primer not containing a gene polymorphism site, that is, a combination of a forward primer and a reverse primer. And a primer containing a gene polymorphism site, that is, a combination of a wild-type primer and a polymorphism primer.
(Iv) The wild-type and mutant-type detection probes for the structural gene are as described above.
Further, the kit of the present invention is a test kit for detecting and identifying a genetic polymorphism of a structural gene of a human gene,
(I) Primers for wild type and polymorphism of structural gene and common reverse primer
(Ii) DNA polymerase and
(Iii) Four types of deoxynucleotide triphosphate (dNTP)
And a kit containing
(I) The primer for wild type, the primer for polymorphism, and the common reverse primer of the structural gene can be appropriately set so as to specifically amplify a desired DNA fragment having a gene polymorphic site desired to be detected. . The primer for wild type and the primer for polymorphism preferably have a gene polymorphism site near the 3 'end.
[0028]
Further, the kit may include (v) means for detecting each gene polymorphism and reagents necessary for the means. For example, it may contain a molecular weight marker (v-1) required for electrophoresis or various probes (v-2) required for hybridization.
Specific examples of the probe include a wild-type detection probe and / or a mutant-type detection probe for detecting a genetic polymorphism of a structural gene. They are as described above.
[0029]
In the kit of the present invention, each primer, dNTP, and each probe may be labeled in advance. Alternatively, it may have a linker arm.
A preferred embodiment of the assay kit of the present invention is a kit that can detect a polymorphism to be detected in a structural gene that differs from a wild type by at least a single nucleotide substitution.
A preferred embodiment of the assay kit of the present invention is a kit capable of detecting a gene polymorphism in an ACE structural gene in which guanine at 2350 bp (wild type) is replaced by adenine.
According to the present invention, as will be described later, the gene polymorphism, particularly the gene polymorphism of 2350 bp, is associated with IgA nephropathy and its prognosis, and the renal protective effect of ACE inhibitors. The use of an assay kit containing a type detection reagent as an active ingredient can be used for diagnosis to determine ACE inhibitor dosing standards for use in IgA nephropathy patients.
[0030]
Method for diagnosing disease related to ACE gene and predicting dose of ACE inhibitor or angiotensin receptor antagonist
The present invention provides a method for diagnosing a disease relating to the gene and predicting the dose of an ACE inhibitor angiotensin receptor antagonist, which comprises a step of detecting and identifying a gene polymorphism of an ACE structural gene of a human gene. Specific examples of the disease associated with the ACE gene include chronic glomerulonephritis, particularly IgA nephropathy. In the present invention, the prediction of the dose of an ACE inhibitor is performed by adjusting the timing of administering an ACE inhibitor or an angiotensin receptor antagonist to a patient (IgA nephropathy patient or the like). Is a diagnosis that is expected to have a renal protective effect and to avoid or prolong the transition to chronic renal failure.
Specifically, for example, the risk of transition to chronic renal failure in a patient (IgA nephropathy patient or the like) can be diagnosed by assaying the genotype of ACE, and renal protection by an ACE inhibitor or an angiotensin receptor antagonist can be performed. It is useful for screening patients who have an effect.
Examples of the ACE inhibitor and the angiotensin receptor antagonist used in the present invention include various drugs usually used in the art.
The genetic diagnosis is preferably performed by detecting whether the genotype of the ACE structural gene of the human DNA of the subject is wild-type or whether guanine at the 2350 bp position is replaced by adenine.
[0031]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. The present invention is not particularly limited by the examples.
Reference Example 1
In completing the present invention, the present inventors examined the age, gender, height, weight, and various blood tests of 280 patients histologically diagnosed with IgA nephropathy who are visiting or hospitalized at Niigata University School of Medicine. Was measured. Table 1 shows the measured values.
[0032]
[Table 1]

[0033]
Table 1 shows the clinical findings of a group of patients receiving and not receiving an ACE inhibitor. Age, gender, serum creatinine level, and creatinine clearance did not differ between the two groups at the time of renal biopsy and the follow-up period. However, urine protein and systolic blood pressure were significantly higher in the ACE inhibitor-administered group than in the non-administered group. The incidence of end-stage renal failure was significantly higher in the ACE inhibitor non-administration group than in the administration group (FIG. 1A). Similar results were obtained when angiotensin receptor antagonists were administered.
[0034]
Example 1 Detection of base polymorphism in ACE gene
(1) Synthesis of primer for detecting polymorphism at position 2350 of ACE gene
Using a DNA synthesizer type 392 manufactured by PerkinElmer, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (gacgaatgtgatgggccaca: hereinafter, referred to as primer 1) and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 were obtained by the phosphoramidite method. Oligonucleotide (gacgaatgtgatgccccacg: hereinafter referred to as primer 2) and an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 (gacgaatgtgatggccccat: hereinafter referred to as primer 3) and an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 4 ( gacgaatgtgatggccacgt: hereinafter, referred to as primer 4) and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 5 (ttgatg gttccacgtatttcg: below, were synthesized show a primer 5). The synthesis was performed according to the manual, and deprotection of various oligonucleotides was performed overnight at 55 ° C. with aqueous ammonia. Oligonucleotide purification was carried out using an OPC column from PerkinElmer.
Primer 1 has a nucleotide sequence of a wild type (A) at the 3 ′ end, primer 2 has a nucleotide sequence of a polymorphism (G) at the 3 ′ end, and primer 3 has a wild type (G) at the second from the 3 ′ end. The primer 4 has the nucleotide sequence of (A), and the second primer from the 3 ′ end has the nucleotide sequence of polymorphism (G). Primer 5 is a reverse primer paired with any of primers 1-4.
[0035]
(2) Analysis of ACE gene polymorphism by PCR method
Using a DNA solution extracted from human leukocytes by the phenol / chloroform method as a sample, the following reagents were added, and the human ACE gene polymorphism was analyzed under the following conditions.
(1) Reagent
A 25 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD DNA polymerase reaction solution
Any of primers 1-4 {5} pmol
Primer 5 5 pmol
× 10 buffer
(60 mM Tris sulfuric acid, pH 8.8) 2.5 μl
2 mM dNTP 2.5 μl
25mM MgSO₄1 μl
KODplus DNA polymerase 0.2 U
Extracted DNA solution 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 100ng
The total volume was adjusted to 25 μL with distilled water.
Amplification conditions
94 ° C for 2 minutes
94 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 30 seconds (35 cycles)
68 ° C for 2 minutes
▲ 2 ▼ Detection
The obtained PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis according to a conventional method, and ethidium bromide staining was performed to detect a band of the amplification product. As a result, only wild-type was amplified by amplification with wild-type specific primers, and only mutant was amplified by polymorphism-specific primers. Further, it was confirmed by electrophoresis that the wild type and the mutant type were amplified in the hetero sample.
[0036]
As described above, the genotype of the sample could be clearly determined only by the KODplus DNA polymerase and the primer containing the polymorphism at the second base from the 3 'end of the primer.
[0037]
Example 2 Relationship between ACE A2350G gene polymorphism and long-term renal function prognosis of IgA nephropathy
FIG. 1 shows the correlation between the nucleotide polymorphism detection result of the human ACE gene obtained in Example 1 and end-stage renal failure in IgA patients. It can be seen that patients with IgA nephropathy having the adenine homozygous polymorphism at position 2350 of the ACE gene have a higher risk of end-stage renal failure than those with guanine homozygous polymorphism and heterozygous polymorphism (FIG. 1B). This indicates that the adenine homozygous polymorphism at position 2350 is a risk factor for end-stage renal failure.
[0038]
Example 3 相関 Correlation between base polymorphism of ACE structural gene and renal protective effect by administration of ACE inhibitor
FIG. 2 shows the correlation between the detection result of the nucleotide polymorphism of the human ACE gene obtained in Example 1 and the renal protective effect of the ACE inhibitor.
As can be seen from FIG. 2, patients with IgA nephropathy having an adenine homozygous polymorphism at position 2350 of the ACE gene are more likely to have an ACE inhibitor drug than those having the guanine homozygous and heterozygous polymorphisms. When receiving the drug, it was found that the period of transition to chronic renal failure was slow. This suggests that in performing treatment of patients with IgA nephropathy, more accurate diagnosis and prediction can be made by examining the gene polymorphism in predicting the administration effect (renal protective effect) of an ACE inhibitor. became.
Specifically, IgA nephropathy patients with adenine homozygous polymorphism have a high risk of end-stage renal failure, and administration of an ACE inhibitor to these patients shows a renal protective effect and an effect of reducing the risk of end-stage renal failure. There is. Similar results were obtained with an angiotensin receptor antagonist.
[0039]
【The invention's effect】
As described above, the methods of the present invention provide a method for determining IgA polymorphisms in a structural gene by determining whether an individual is homozygous or heterozygous for a particular polymorphism in the ACE structural gene. It is useful for diagnosing predisposition to end-stage renal failure in patients with nephropathy. In addition, the present invention makes it possible to predict the renal protective effect of the administration of an ACE inhibitor or an angiotensin receptor antagonist to the patient.
[0040]
[Sequence List Free Text]
SEQ ID NO: 1: oligonucleotide having a sequence homologous to the wild-type sequence of human ACE gene
SEQ ID NO: 2: oligonucleotide having a sequence homologous to the polymorphic sequence at position 2350 of the human ACE gene
SEQ ID NO: 3: oligonucleotide having a sequence homologous to the sequence of human ACE gene
SEQ ID NO: 4: oligonucleotide having a sequence homologous to the polymorphic sequence at position 2350 of the human ACE gene
SEQ ID NO: 5: oligonucleotide having sequence complementary to human ACE gene sequence
[0041]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1A is a diagram showing a correlation between the frequency of onset of end-stage renal failure in IgA nephropathy patients and ACE inhibitor administration. In the figure, the dotted line shows the results when the ACE inhibitor was administered, and the solid line shows the results when the ACE inhibitor was not administered.
FIG. 1B is a diagram showing a correlation between the frequency of the onset of end-stage renal failure in a human ACE structural gene IgA nephropathy patient and a genetic polymorphism. In the figure, the dotted line shows the result in the case of the heterozygous polymorphism or the guanine homozygous polymorphism, and the solid line shows the result in the case of the adenine homozygous polymorphism.
The vertical axis indicates the percentage (%) of patients who did not develop end-stage renal failure, and the horizontal axis indicates the observation period (months).
FIG. 2A is a graph showing the correlation between the frequency of the onset of end-stage renal failure and the administration of an ACE inhibitor in IgA nephropathy patients with adenine homozygous polymorphism. In the figure, the dotted line shows the results when the ACE inhibitor was administered, and the solid line shows the results when the ACE inhibitor was not administered.
FIG. 2B is a diagram showing the correlation between the frequency of the onset of end-stage renal failure and the administration of an ACE inhibitor in IgA nephropathy patients with a heterozygous polymorphism or a guanine homozygous polymorphism. In the figure, the dotted line shows the results when the ACE inhibitor was administered, and the solid line shows the results when the ACE inhibitor was not administered.
The vertical axis indicates the percentage (%) of patients who did not develop end-stage renal failure, and the horizontal axis indicates the observation period (months).

Claims

A method for detecting and identifying a gene polymorphism of an angiotensin converting enzyme structural gene.

The method according to claim 1, wherein the polymorphism in the structural gene polymorphism is a gene that differs from the wild type by at least a single nucleotide substitution.

A method for predicting the incidence of end-stage renal failure in a renal disease patient, comprising a step of detecting and identifying a gene polymorphism of an angiotensin converting enzyme structural gene.

The method according to claim 3, wherein the polymorphism in the structural gene polymorphism is a gene that differs from the wild type by at least a single nucleotide substitution.

The method according to claim 3 or 4, wherein the polymorphic site is located at a site of an exon.

The method according to any one of claims 3 to 5, wherein the polymorphism of the angiotensin converting enzyme structural gene is a gene in which guanine at 2350 bp downstream from the wild-type transcription initiation site is replaced with adenine.

The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the gene polymorphism is detected using a gene amplification method or a gene extension method.

A method for predicting the administration effect of a drug acting on a protein involved in a blood pressure regulating mechanism including an angiotensin converting enzyme, the method including a step of detecting and identifying a gene polymorphism of an angiotensin converting enzyme structural gene.

The method according to claim 8, wherein the polymorphism in the structural gene polymorphism is a gene that differs from the wild type by at least a single nucleotide substitution.

The method according to claim 8 or 9, wherein the polymorphic site is located at a site of an exon.

The method according to any one of claims 8 to 10, wherein the gene polymorphism is detected using a gene amplification method or a gene extension method.

The method according to any one of claims 8 to 11, wherein the drug is an angiotensin converting enzyme inhibitor or an angiotensin receptor antagonist.

13. The method according to claim 12, wherein the angiotensin converting enzyme inhibitor or angiotensin receptor antagonist has a renal protective effect.

Using the method according to any one of claims 8 to 13, the effect of administering a drug acting on a protein involved in a blood pressure regulating mechanism including an angiotensin converting enzyme is predicted, and the effect of the drug is evaluated based on the obtained results. A method for determining a drug administration method, comprising setting an administration method.

15. The method of claim 14, wherein the drug is an angiotensin converting enzyme inhibitor or an angiotensin receptor antagonist.

The method according to claim 15, wherein the angiotensin converting enzyme inhibitor or angiotensin receptor antagonist has a renal protective effect.

An assay kit for detecting and identifying a genetic polymorphism of a structural gene of a human gene,
(I) a primer for detecting a gene polymorphism in a structural gene,
(Ii) DNA polymerase,
(Iii) A kit comprising: four types of deoxynucleotide triphosphates (dNTPs); and (iv) a probe for detecting a wild type and a mutant type of a structural gene.

An assay kit for detecting and identifying a genetic polymorphism of a structural gene of a human gene,
(I) a primer for a wild-type structural gene, a primer for a polymorphism and a common reverse primer,
(Ii) DNA polymerase, and (iii) four deoxynucleotide triphosphates (dNTPs)
A kit comprising:

The kit according to claim 18, further comprising (v) means for detecting each gene polymorphism.

(V) means for detecting each gene polymorphism,
(V-1) The kit according to claim 19, comprising a probe for detecting a wild type and a probe for detecting a mutant type of the structural gene.

Further, (v) as means for detecting each gene polymorphism,
(V-2) The kit according to claim 20, comprising a molecular weight marker.

The kit according to any one of claims 17 to 21, wherein at least one of each primer, dNTP or each probe may be labeled in advance.

The kit according to any one of claims 17 to 22, wherein in the polymorphism of the structural gene, the polymorphism is a gene that differs from a wild type by at least a single nucleotide substitution.

The kit according to any one of claims 17 to 23, wherein the polymorphic site is located at a site of an exon.

The kit according to any one of claims 17 to 24, wherein the gene is an angiotensin converting enzyme structural gene.

26. The kit according to claim 25, wherein the polymorphism of the angiotensin converting enzyme structural gene is a gene in which guanine at the 2350 bp position downstream of the wild-type transcription initiation site has been replaced with adenine.

A method for predicting the diagnosis of a disease associated with an angiotensin converting enzyme structural gene and a method for determining the administration standard of an angiotensin converting enzyme inhibitor or an angiotensin receptor antagonist, comprising detecting and identifying a gene polymorphism of an angiotensin converting enzyme structural gene .

The method according to claim 27, wherein the disease associated with the angiotensin converting enzyme structural gene is progressive chronic glomerulonephritis.

The method according to claim 27, wherein the disease associated with the angiotensin converting enzyme structural gene is IgA nephropathy.

30. The method according to any one of claims 27 to 29, wherein in the polymorphism of the angiotensin converting enzyme structural gene, the polymorphism is a gene that differs from a wild type by at least a single nucleotide substitution.

31. The method of claim 30, wherein the polymorphic site is at a site of an exon.

32. The method according to claim 31, wherein the polymorphism of the angiotensin converting enzyme structural gene is a gene in which guanine at 2350 bp downstream from the wild-type transcription initiation site has been replaced by adenine.

The method according to any one of claims 27 to 32, wherein the gene polymorphism is detected using a gene amplification method or a gene extension method.