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JP2003533988A - リンパ球の活性化の調節、および下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ｐｔｔｇ）発現および／または機能を標的とすることによる潜在的な免疫調節剤のスクリーニング - Google Patents

リンパ球の活性化の調節、および下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ｐｔｔｇ）発現および／または機能を標的とすることによる潜在的な免疫調節剤のスクリーニング

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JP2003533988A
JP2003533988A JP2001585324A JP2001585324A JP2003533988A JP 2003533988 A JP2003533988 A JP 2003533988A JP 2001585324 A JP2001585324 A JP 2001585324A JP 2001585324 A JP2001585324 A JP 2001585324A JP 2003533988 A JP2003533988 A JP 2003533988A
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JP
Japan
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pttg
peptide
cells
seq
expression
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Withdrawn
Application number
JP2001585324A
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English (en)
Inventor
ストイカ、ロスティスラブ
ホーウィッツ、グレゴリー、エイ
ザーン、シュン
メルメッド、シュロモ
Original Assignee
セダーシナイ メディカル センター
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Publication date
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Priority claimed from US09/730,469 external-priority patent/US20030018001A1/en
Priority claimed from US09/777,422 external-priority patent/US20020147162A1/en
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Abstract

(57)【要約】 ヒト起源の細胞を含む哺乳動物Ｔリンパ球細胞の新生物細胞増殖および／または形質転換をインビトロまたはインビボで阻害する方法を記載する。また、ＰＴＴＧ発現および／またはＰＴＴＧ１タンパク質機能を調節することによって、Ｔリンパ球の活性化を免疫調節、即ち、阻害または誘導する方法を記載する。哺乳動物Ｔリンパ球の活性化を調節する新規免疫抑制または免疫増強剤のための物質をスクリーニングするインビトロの方法が記載される。また、有用な組成物およびキットを記載する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） 本出願全体を通して、種々の文献は括弧で参照される。本発明に関する分野の
技術の現状をより詳細に説明するために、これらの文献の開示内容はその全体が
、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】 （１．発明の分野） 本発明は、ヒトリンパ球活性化を調節する方法およびその潜在的な免疫抑制剤
をスクリーニングするインビトロの方法における使用に関する。
【０００３】 （２．関連技術） 下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）は、下垂体腫瘍および造血系と結腸の
新生物で高度に発現されている（ザング（Zhang, X.）ら、「ヒト下垂体腫瘍形
質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）の構造、発現および機能」、Mol. Endocrinol. 13:15
6-66 [1999a]；ザング（Zhang, X.）ら、「下垂体腺腫における下垂体腫瘍形質
転換遺伝子（ＰＴＴＧ）発現」、J. Clin. Endocrinol. Metab. 84:761-67 [199
9b]；ヒーネイ（Heaney, A.P.）ら、「結腸直腸腫瘍における下垂体腫瘍形質転
換遺伝子」、Lancet 355:712-15 [2000]；ドミングエ（Dominguez, A.）ら、「
ラットｐｔｔｇのヒト同族体であるｈｐｔｔｇは造血系新生物で過剰発現される
。ｈＰＴＴＧの転写活性化機能の証拠」、Oncogene 17:2187-93 [1998]；サエズ
（Saez, C.）ら、「ｈｐｔｔｇは下垂体腺腫と他の原発性上皮新生物で過剰発現
される」、Oncogene 18:5473-6 [1999]）。ＰＴＴＧ１は、多くの正常なヒト組
織では低レベルで発現される（チェン（Chen. L.）ら、「ヒト下垂体腫瘍形質転
換遺伝子（ｈＰＴＴＧ）ファミリーの同定：分子構造、発現、および染色体局在
化」、Gene 248:41-50 [2000]；ヒーネイ（Heaney A.P.）ら、[2000]）。
【０００４】 ＰＴＴＧ発現レベルは、下垂体腫瘍と結腸直腸腫瘍の侵襲性と正相関（ザング
（Zhang, X.）ら、[1999b]；ヒーネイ（Heaney A.P.）ら、[2000]）し、エスト
ロゲンにより誘導される（ヒーネイ（Heaney A.P.）ら、「プロラクチノーマ病
因におけるエストロゲン誘導下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）の早期関与
と繊維芽細胞増殖因子発現」、Nat. Med. 5:1317-21 [1999]）。腫瘍細胞では、
ＰＴＴＧ ｍＲＮＡとタンパク質発現は細胞サイクル依存性であり、Ｇ２／Ｍ期
にピークに達する」（ユー（Yu, R.）ら、「下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴ
Ｇ）は胎盤ＪＥＧ−３細胞分裂と生存を制御する：生きた細胞イメージングから
の証拠」、Mol. Endocrinol. 14:1137-1146 [2000]）。ＰＴＴＧ作用の機構は、
はっきりしていない。ＰＴＴＧは繊維芽細胞増殖因子分泌をアップレギュレート
（ザング（Zhang, X.）ら、[1999a]）し、ＤＮＡ転写をトランス活性化する」（
ドミングエ（Dominguez, A.）ら、[1998]；ワング（Wang, Z.）ら、下垂体腫瘍
形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）トランス活性化および形質転換活性」、J. Biol. C
hem. 275:7459-61 [2000]）。
【０００５】 ＰＴＴＧは、セキュリン（securin）タンパク質をコードし、その発現は、細
胞形質転換を引き起こし、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の産生を誘導
し、インビトロおよびインビボでエストロゲンにより制御され、染色分体分離を
阻害する（ペイ（Pei, L.）とメルメド（Melmed S.）、「下垂体腫瘍形質転換遺
伝子の単離と性状解析」、Mol. Endocrinol. 11:433-441 [1997]；ザング（Zhan
g, X.）ら、「ヒト下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）の構造、発現、およ
び機能」、Mol. Endocrinol. 13:156-166 [1999a]；ヒーネイ（Heaney A.P.）ら
、「プロラクチノーマ病因におけるエストロゲン誘導下垂体腫瘍形質転換遺伝子
（ＰＴＴＧ）の早期関与と繊維芽細胞増殖因子発現」、Nature Med. 5:1317-132
1 [1999]；ゾウ（Zou, J.）ら、「形質転換と腫瘍発生に関与する脊椎動物姉妹
染色分体分離インヒビターの同定」、Science 285:418-422 [1999]）。
【０００６】 染色分体分離の制御を乱すことにより、ＰＴＴＧ過剰発現はまた、異数性（す
なわち、正常の染色体数より１つまたは数個の染色体が多いかまたは少ない細胞
）を引き起こす（ゾウ（Zou, J.）ら、[1999]；ユウ（Yu, R.）ら、[2000]）。
分裂中期の最後にセキュリンは、後期促進複合体により分解され、セパリン（se
parin）の緊張性阻害を解放し、これは次に、コヘジン（cohesin）（姉妹染色分
体を一緒に保持するタンパク質）の分解を仲介する。非分解性ＰＴＴＧの過剰発
現は、染色分体分離を中断し（ゾウ（Zou, J.）ら、[1999]）、ＰＴＴＧの過剰
発現は、アポトーシスを引き起こし有糸分裂を阻害する（ユウ（Yu, R.）ら、[2
000]）。ＰＴＴＧのセキュリン機能は、ＰＴＴＧが正常な増殖細胞でも発現され
ていることを示唆する。成体動物とヒトでは、ＰＴＴＧ ｍＲＮＡは睾丸（急速
に分裂する生殖体を含有する臓器）に最も多い（ザング（Zhang, X.）ら、[1999
a]；ワング（Wang, Z.）ら、[2000]）。
【０００７】 ＰＴＴＧ遺伝子ファミリーは、染色体５ｑ３３上に位置する、ヒトＰＴＴＧ１
を含む高い配列相同性を有する少なくとも３つの遺伝子を含有する（プレザント
（Prezant, T.R.）ら、「ヒトプロト癌遺伝子ｈＰＴＴＧのイントロンの無い同
族体は下垂体腫瘍で発現される：ｈＰＴＴＧファミリーの証拠」。J. Clin. End
ocrinol. Metab. 84:1149-52 [1999]）。マウスＰＴＴＧは、ヒトＰＴＴＧ１と
６６％のヌクレオチド塩基配列相同性を共有し、形質転換能力も示す（ワング（
Wang, Z.）とメルメド（Melmed S.）、「マウス下垂体腫瘍形質転換遺伝子（Ｐ
ＴＴＧ）とそのプロモーターの性状解析」、Endocrinology [印刷中：2000]）。
点突然変異がプロリンリッチな領域に導入された時の、インビトロ形質転換、イ
ンビボ腫瘍発生、およびトランス活性化により証明されるように、ＰＴＴＧ１の
形質転換活性に決定的に重要なタンパク質Ｃ末端の近くでプロリンリッチな領域
が同定された（ザング（Zhang, X.）ら、[1999a]）。プロリンリッチなドメイン
は、ＳＨ３結合部位として機能して、タンパク質チロシンキナーゼのシグナル伝
達を仲介することがある（ポーソン（Pawson, T.）、「タンパク質モジュールと
シグナル伝達ネットワーク」、Nature 373:573-580 [1995]；クリヤン（Kuriyan
, J.）とコウバーン（Cowburn, D.）、「真核生物シグナル伝達におけるモジュ
ラーペプチド認識ドメイン」、Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:259-2
88 [1997]）。
【０００８】 乳癌と卵巣癌は、ホルモン依存性悪性腫瘍のモデルである。エストロゲンとプ
ロゲステロンは、特異的核受容体を介して作用し、乳腺と卵巣組織の正常な成長
およびこれらの分化機能に必要である。古典的エストロゲン長−エストロゲン受
容体（ＥＲ）相互作用と、その後のエストロゲン応答性成分へのＥＲ結合による
遺伝子転写の制御以外に、現在は、転写調節が膜ＥＲにより仲介されることが明
らかになっている（レビン（Levin E.R.）、「原形質膜エストロゲン受容体の細
胞機能」、TEM 10:374-77 [1999]）。この作用は、細胞外シグナル制御キナーゼ
／分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ経路（ＥＲＫ／ＭＡＰＫ）のようなサ
イトゾルシグナル伝達の修飾を必要とする。
【０００９】 乳癌と卵巣癌では、これらのシグナル伝達作用を介する分子機構がはっきり解
明されていないが、エストロゲンとプロゲスチンン刺激細胞サイクル進行の主要
な下流標的としてｃ−ｍｙｃとシクリンＤ１が同定されている。シクリンの量を
制御する以外に、特異的ＣＤＫインヒビター（例えば、ｐ２１）の動員がエスト
ロゲンにより障害され、エストロゲンに制御される追加のまだ不明の成分が、哺
乳動物上皮細胞増殖と分化のレギュレーターのようである（サザーランド（Suth
erland, R.L.）ら、「エストロゲンとプロテスチンは細胞サイクル進行を制御す
る」、J. Mammary Gland Biol. Neoplasia 3:63-72 [1998]）。
【００１０】 いくつかの研究が、いくつかの遺伝子（クレアチンキナーゼＢ、ｃ−ｍｙｃ、
レチノイン酸受容体α、熱ショックタンパク質２７を含む）のエストロゲン応答
性の付与における、ＳＰ１と半部位ＥＲＥの関与を記載した（ウー−ペング（Wu
-Peng X.）ら、「ラットクレアチンキナーゼＢ遺伝子のエストロゲン制御を仲介
する部位の限定」、Mol. Endocrinol. 6:231-240 [1992]；ヅビク（Dubik, D.）
とシュー（Shiu, R.）、「ｃ−ｍｙｃ癌遺伝子発現のエストロゲン活性化の機構
」、Oncogene 7:1587-1594 [1992]）。半部位ＥＲＥとＳＰ１のこの共同相互作
用が最近、プロゲステロン受容体で開示された（ペトクス（Petx, L.）とナルヅ
リ（Nardulli, A.M.）、「Ｓｐ１結合部位とエストロゲン応答成分半部位はヒト
プロゲステロン受容体Ａプロモーターの制御に関与する」、Mol. Endocrinol. 1
4:972-85 [2000]）。複合プロモーターに関して、ＥＲＥは一般に多くのコピー
で乱され、他の転写因子の結合モチーフ内に入れられる（ポーター（Porter, W.
）ら、「転写因子Ｓｐ１とエストロゲン受容体との機能的相乗作用」、Mol. End
o. 11:1569-80 [1997]）。マウスとヒトＰＴＴＧプロモーター上のＳＰ１部位は
、トランス活性化活性に決定的に重要であり、ＳＰ１成分の突然変異性破壊また
は既知のＳＰ１オリゴとの競合が、ＰＴＴＧプロモーター活性の最大９０％の喪
失を引き起こすことが証明されている（ワング（Wang, Z.）らとメルメド（Melm
ed S.）、「ＳＰ１は細胞形質転換中の下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）
プロモーターを活性化する」、J. Biol. Chem. [2000]；カカー（Kakar S.S.）
、ヒト下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）のプロモーターの分子クローニン
グ、遺伝子構成および同定」、Gene 240:317-324 [1999]）。
【００１１】 多くの固形腫瘍において、腫瘍の血管分布は予後と反比例し、ｂＦＧＦとＶＥ
ＧＦ発現が予後を予測させることが報告されている（タカハシ（Takahashi Y.）
ら、「血管内皮増殖因子とその受容体ＫＤＲの発現は、ヒト結腸癌の血管分布、
転移、および増殖に比例する」、Cancer Res 55:3964-68 [1995]）。乳癌におけ
る血管形成の定量は、独立の予後因子として使用することができる（ウェイドナ
ー（Weidner, N.）ら、「腫瘍血管形成：早期乳癌における新しい重要な独立の
予後因子」、J. Natl. Cancer Inst. 84:1875-1887 [1992]；ホラク（Horak, E.
R.）ら、「乳癌の結節転移と生存の指標としての血小板／内皮細胞接着分子抗体
により測定した血管形成」、Lancet 340:1120-1124 [1992]）。腫瘍増殖、進行
、および転移が血管へのアクセスに依存するのみでなく、子宮頸部上皮内新生組
織形成II（ＣＩＮII）からＣＩＮIIIの場合のように、軽度異形成からの移行の
間に、「血管形成スイッチ」が活性化され、組織血管形成表現型の変化が組織学
的組織移行の前に起きることが明らかである（ハナハン（Hanahan, D.）とフォ
ークマン（Folkman, J.）、「腫瘍発生中の血管形成スイッチのパターンと出現
機構」、Cell 86:353-64 [1996]）。
【００１２】 既存の血管からの新しい血管の形成に至る血管形成のイベントの順序は、高度
に制御され（ジャイン（Jain, RK）ら、「定量血管形成測定法：進歩と問題」、
Nat Med. 3:1203-1208 [1997]；ダーランド（Darland DC）とダモア（D'Amore P
A）、1999 「血管成熟：血管成長が成熟する」、J. Clin Invest. 103:157-158
[1999]）、血管内皮細胞による血管基底膜の溶解と新しい管腔と周皮細胞の形
成を含む。腫瘍関連血管形成の間に、癌細胞によるまたは間接マクロファージ刺
激による血管形成因子の持続的産生は、異常制御未成熟血管増殖を引き起こす（
フォークマン（Folkman, J.）とシング（Shing, Y.）、「血管形成」、J. Biol.
Chem. 267:10931-10934 [1992]）。多くのインビトロとインビボ測定法は、血
管形成の研究に有用である（例えば、ジャイン（Jain, RK）ら、[1997]；アウア
バッハ（Auerbach, R.）ら、「血管形成の測定法：総説」、Pharmacol Ther. 51
:1-11 [1991]）。
【００１３】 いくつかのサイトカインや増殖因子（塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）
および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む）は、パラクリン作用モードでイン
ビボの血管形成を調節する（ビクファルビ（Bikfalvi, A.）ら、「繊維芽細胞増
殖因子−２の生物学的役割」、Endocr. Rev. 18:26-45 [1997]；フェッララ（Fe
rrara, N.）とデービス−シミス（Davis-Smyth, T.）、「血管内皮増殖因子の生
物学」、Endocr Rev 18:4-25 [1997]）。サイトゾル画分中のｂＦＧＦとＶＥＧ
Ｆレベルは腫瘍内血管形成に大きく関連する。（「ヒト原発性乳癌における血管
形成因子血管内皮細胞増殖因子、酸性および塩基性繊維芽細胞増殖因子、腫瘍増
殖因子−１、血小板由来内皮細胞増殖因子、胎盤増殖因子、およびプレイオトロ
ピンの発現とその血管形成との関係」、Cancer Res. 57:963-69 [1997]；リンダ
ーホルム（Linderholm, B.）ら、「血管内皮増殖因子は結節陰性乳癌において高
い予測価値がある」、J. Clin. Oncol. 16:3121-28 [1998]）。ｂＦＧＦとＶＥ
ＧＦは血管形成に対して相乗作用を有し、ｂＦＧＦは、オートクリンおよびパラ
クリン作用を介してＶＥＧＦの内皮細胞発現を調節する（セゲッチ（Seghezzi,
G.）ら、繊維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）は、生成している毛細管の内皮
細胞中の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）発現を誘導する：血管形成に寄与するオ
トクリン機構」、J. Cell. Biol. 141(7):1659-73 [1998]）。
【００１４】 ＰＴＴＧはｂＦＧＦ ｍＲＮＡとタンパク質分泌を制御し、この機能は、保存
されたＣ末端Ｐ−Ｘ−Ｘ−Ｐモチーフを必要とする（ザング（Zhang, X.）ら、[
1999a]）。また、ラット下垂体ｐｔｔｇは、インビボとインビトロでエストロゲ
ンにより制御され、ラット下垂体ｐｔｔｇ ｍＲＮＡの最大の誘導は、ｂＦＧＦ
、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）誘導、および下垂体血管形成に一致して、下垂
体形質転換（正常細胞から肥大／過形成細胞へ）の早期にインビボで起きた（ヒ
ーネイ（Heaney A.P.）ら、[1999]）。
【００１５】 Ｔリンパ球（「Ｔ細胞」）は、それらが胸腺由来であり、胸腺のプロセッシン
グを経ることになるため、いわゆるリンパ球の類である。Ｔリンパ球細胞は免疫
系の重要な成分である。抗原に対するとき、活性化Ｔ細胞は、静止期の状態から
急速な増殖に入る。活性化Ｔ細胞は、移植拒絶、並びに喘息性、アレルギー性お
よび自己免疫の状態または疾病に顕著に寄与する（例えば、イ（Yi, S.）ら、「
ＣＤ８＋Ｔ細胞は膵小島の異種移植片を拒絶することができる」、Transplantat
ion 70(6):896-906 [2000]；ハン（Han, W.R.）ら、「抗ＣＤ４抗体トランスジ
ェニックマウスにおける延長された同種移植片生存：他のＣＤ４欠損マウスと比
較されたresidulaヘルパーＴ細胞の不足」、Transplantation 70(1):168-74 [20
00]；ウチダ（Uchida, T.）ら、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の不一致皮膚異
種移植片拒絶における役割」、Transplantation 68(11):1721-27 [1999]；クリ
ーガー（Krieger, N.R.）ら、「ＣＤ４およびＣＤ８ノックアウトマウスにおけ
るラット膵小島ajnd皮膚異種移植片生存」、J. Autoimmun. 10(3):309-15 [1997
]；シメオノビック（Simeonovic, C.J.）ら、「ＣＤ４＋Ｔ細胞のproisletおよ
び小島の同種移植片拒絶への寄与における差異は構成的クラスIIＭＨＣ同種抗原
発現に相関する」、Cell Transplant 5(5):525-41 [1996]；ケニョン（Kenyon,
N.J.）ら、「アレルギー性および喘息性被験者における末梢血管単核細胞による
増大されたサイトカイン生成」、Ann. Allergy. Asthma. Immunol. 85(2):115-2
0 [2000]；ワング（Wang, H.B.）ら、「腫瘍壊死因子レセプター１は実験的自己
免疫重症筋無力症に決定的に関連する」、Int. Immunol. 12(10):1381-1388 [20
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応性リンパ球の養子転移はＬＤＬレセプター欠損マウスにおける早期アテローム
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プター異常」、Curr. Opin. Rheumatol. 12(5):420-4 [2000]）。 結果として、免疫抑制剤（即ち、免疫系を抑制する効果を有する化学療法剤）
、シクロスポリン、ラパマイシンまたはタクロリムスなどは、移植片生存を増大
するために、またはインターロイキンおよび他のサイトカインの影響によって仲
介される重篤なアレルギー性もしくは自己免疫応答を阻害するために、治療とし
て典型的に用いられる。ほぼ頻繁に、これらの免疫抑制剤は、血流中の白血球細
胞の絶対数を減少させ、幾つかの作用メカニズムのいずれかによって作用し得る
。古典的な細胞毒性免疫抑制剤は、ＤＮＡ合成を阻害することによって作用する
。他は、サプレッサーＴ細胞個体群の活性化を通して、またはヘルパー細胞の活
性化を阻害することによって、作用し得る。多くの免疫抑制剤は、幾人かの患者
において、それらの使用を不快なおよび／または危険なものとするという広範な
毒性効果を有する。それ故、新しい、毒性の少ない免疫抑制剤を探索するニーズ
がある。 免疫抑制剤の幾つかのスクリーニング法が開発されている。例えば、ワイス（
Weiss）ら（「新規免疫抑制剤の培養Ｔ細胞を用いる同定のためのスクリーニン
グアッセイ」、米国特許第5,474,897号）は、Ｔ細胞におけるＣＤ２８シグナル
伝達経路を阻害することによって免疫抑制を誘導することができる化合物を同定
するための方法を教授する。しかし、免疫細胞に存在する多経路という余分なも
ののために、ＣＤ２８経路のみに向けられた方法の有用性が制限される。 モチマサ（Mochimasa）ら（「免疫抑制剤をスクリーニングするための方法」
、ＪＰ7322891Ａ２およびＪＰ7322892Ａ２）は、カルシウム感受性酵母細胞を用
いるスクリーニング方法を教授する。しかしながら、酵母細胞は、哺乳動物のＴ
リンパ球細胞のモデルとしては比較的貧弱なものである。 故に、潜在的な免疫抑制剤をスクリーニングするための信頼できる方法にはニ
ーズが残っている。 また、現在利用できる薬理学的方法より標的が絞られ、狭い範囲で作用する免
疫抑制の付加的な処置方法が特に望まれており、それに対するニーズは残ってい
る。 これらのおよび他の利点は、本明細書に記載の本発明により提供される。
【００１６】 （発明の要約） 本発明は、新生物細胞増殖および／またはの形質転換を阻害するのに有用な組
成物に関し、その組成物はまた、正常哺乳動物Ｔリンパ球細胞の活性化を調節す
る、即ち阻害するまたは誘導するためにも有用である。これらの組成物は、ＰＴ
ＴＧ１特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、そのアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドは、いずれかのＰＴＴＧ特異的ゲノムまたはｍＲＮＡ配列（スプラ
イス変異体を含む）を標的とし、機能的ＰＴＴＧタンパク質の発現を防止するよ
うに選択することができる。ＰＴＴＧカルボキシ末端ペプチドを含む組成物、ま
たは第１のＰＴＴＧカルボキシ末端ペプチドセグメントと第２の細胞性取り込み
増強ペプチドセグメントとを含有するキメラもしくは融合タンパク質を含む組成
物が含まれる。本発明はまた、ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチド、
例えばＰＴＴＧ−ＣペプチドまたはまたはアンチセンスＰＴＴＧ−Ｃ関連オリゴ
ヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物に関する。また本発明
には、ＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチド（ＰＴＴＧ−Ｃペプチドをコードする
核酸を含む）を含有する発現ベクターを含む組成物が含まれる。本発明のＰＴＴ
Ｇ−Ｃペプチドおよび本発明のＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドは、新生物細
胞増殖および／または形質転換を阻害するのに、または哺乳動物Ｔリンパ球の活
性化を阻害するのに有用な医薬組成物、薬剤の製造において有用であり、本発明
のＰＴＴＧ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＴＴＧ−Ｃペプチドおよ
びＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドを含有する。
【００１７】 本発明においてまた、他の細胞成分から単離することができるＰＴＴＧカルボ
キシ末端（ＰＴＴＧ−Ｃ）ペプチドおよびＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドも
提供される。本発明のＰＴＴＧ−Ｃペプチドは、抗ＰＴＴＧ抗体を産生するため
の免疫原として生物測定法において、およびそのようなペプチドおよび／または
抗体を含有する治療用組成物において有用である。また、本発明のＰＴＴＧ−Ｃ
関連ポリヌクレオチドの実施態様を含有し、本発明のＰＴＴＧ−Ｃペプチドを発
現する哺乳動物細胞を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。
【００１８】 この組成物と方法は、インビトロであってもインビボであっても、活性化され
たＴリンパ球および形質転換されたリンパ球を含む哺乳動物Ｔリンパ球細胞の新
生物細胞増殖および／または形質転換を阻害するのに有用である。本発明の組成
物および方法は、異種移植片または同種移植片拒絶を防止または阻害するのに、
およびアレルギー性、喘息性および／または自己免疫状態、例えば全身性エリテ
マトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫重症筋無力症、慢性関節リウマチ、自己免疫脳
脊髄炎、乾癬、アテローム性動脈硬化症および他の自己免疫疾患を治療するのに
有用である。本発明の方法および組成物はまた、白血病、またはいずれかの血液
性もしくはリンパ球産生性新生物、例えばホジキン病などのＴ細胞新形成の治療
においても有用である。 特に、本発明はまた、ヒト細胞を含む哺乳動物Ｔリンパ球細胞の活性化を、イ
ンビトロまたはインビボのいずれかにおいて、阻害する方法に関する。本発明の
方法は、Ｔリンパ球細胞におけるＰＴＴＧ発現および／または内因性のＰＴＴＧ
機能を阻害し、それによってＴリンパ球細胞の活性化が阻害されることに関連す
る。本発明の方法は、任意のＰＴＴＧ特異的ゲノム配列またはｍＲＮＡ配列（ス
プライス変種を含む）を標的として、機能性ＰＴＴＧタンパク質の発現を防止す
るように選択することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、ＰＴＴ
Ｇ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを、Ｔリンパ球細胞に送達することに
より行われる。あるいはこの方法は、Ｔリンパ球中の内因性ＰＴＴＧタンパク質
分子上のＳＨ３結合部位への特異的結合を阻止することにより、ＳＨ３介在シグ
ナル伝達を妨害することにより、行うことができる。あるいはこの方法は、ＳＳ
ＣＡ、８１８２、サイクリックＡＭＰ反応性成分、エストロゲン反応性成分、イ
ンシュリン反応性成分、ＳＰ１およびＧＣボックス等のＰＴＴＧプロモーターに
おいて同定されていた幾つかの制御領域のいずれかに指向するアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを標的とすることによってＰＴＴＧ発現を阻害することによって
行うことができる。 あるいは、哺乳動物Ｔリンパ球の活性化を阻害する方法の実施態様は、ＰＴＴ
Ｇカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドからなる、またはＰＴＴＧカルボキシ末
端ペプチド（ＰＴＴＧ−Ｃ）もしくはその生物学的に機能的な断片からなる組成
物を哺乳動物Ｔリンパ球細胞に送達することによって、Ｔリンパ球細胞における
ＰＴＴＧ発現および／または内因性のＰＴＴＧ機能を阻害することに関連する。
ポリヌクレオチドまたはペプチドは、そのポリヌクレオチドまたはペプチドを細
胞に入り込ませ、それによってリンパ球細胞の活性化が阻害されるのに充分な量
と条件下で、細胞性取り込み増強物質と複合体を形成する。 哺乳動物Ｔリンパ球の活性化を調節する本発明の方法は、Ｔリンパ球の活性化
を増大または誘導するための実施態様を包含し、その実施態様は、エストロゲン
および／またはリンパ球性分裂促進剤（lymphocytic mitogen）を含む、ＰＴＴ
Ｇ発現および／またはＰＴＴＧタンパク質機能を増大する組成物を、細胞に送達
することを含む。組成物を、機能的なＰＴＴＧタンパク質の発現を細胞内で生体
内以上のレベルまで増大するＰＴＴＧコードポリヌクレオチドからなる発現ベク
ターを含むＴリンパ球細胞に送達することは、本発明の範囲内で二者択一的に熟
慮される。
【００１９】 本発明はまた、新しい免疫抑制剤のための物質をスクリーニングするインビト
ロの方法に関する。物質は、純粋なまたは単離された化合物および化合物の混合
物、例えば、植物、動物、細菌、原生生物または菌の抽出物などの生物学的サン
プルからの抽出物を含む。本発明の方法は、リンパ球を培養し、培養リンパ球を
潜在的な免疫抑制剤に既知のリンパ球アクチベーターの存在下で曝露し、および
潜在的な免疫抑制剤に曝露していない対照リンパ球に比較してリンパ球中のＰＴ
ＴＧ１の発現レベルにおける変化を検出し、ＰＴＴＧ１発現のダウンレギュレー
ションは、潜在的な免疫抑制剤が保持する免疫抑制能力を示すことを含む。 同様に、本発明は、Ｔリンパ球の活性化を増大する新しい免疫増強剤のための
物質をスクリーニングするインビトロの方法に関する。本発明の方法は、リンパ
球を培養し、培養Ｔリンパ球を潜在的な免疫増強剤に曝露し、および潜在的な免
疫増強剤に曝露していない対照リンパ球に比較してリンパ球中のＰＴＴＧ１の発
現レベルにおける変化を検出し、ＰＴＴＧ１発現のアップレギュレーションは、
潜在的な免疫抑制剤が保持する免疫増強能力を示すことを含む。
【００２０】 本発明はまた、、インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、ヒト細胞お
よび哺乳動物Ｔリンパ球を含むいずれかの哺乳動物細胞の新生物細胞増殖および
／または形質転換を阻害する方法に関する。下垂体腫瘍形質転換遺伝子タンパク
質（ＰＴＴＧ）１の未変性のカルボキシ末端部分は、ＰＴＴＧ１タンパク質機能
に決定的に重要であり、驚くべきことに、下垂体腫瘍形質転換遺伝子カルボキシ
末端ペプチド（ＰＴＴＧ−Ｃ）分子は、下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ１
）発現および／またはＰＴＴＧ１機能を、優性陰性（dominant negative）的に
ダウンレギュレートする能力を有するという発見に基づく。ある実施態様におい
て本発明は、ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に送
達して、ＰＴＴＧ１の内因性発現と機能とを阻害する遺伝子ベースの処理に関す
る。他の実施態様は、ＰＴＴＧ−Ｃペプチドを細胞に送達して、内因性ＰＴＴＧ
１発現および／またはＰＴＴＧ１機能を阻害する、ペプチドベースの処理に関す
る。
【００２１】 哺乳動物細胞の新生物細胞増殖および／または形質転換を阻害する方法の有用
な遺伝子ベースの実施態様は、ＰＴＴＧカルボキシ末端ペプチドをコードする配
列を規定するか、または縮重配列を規定するか、またはこれらのいずれかに相補
的な配列を規定する塩基配列を含むＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドを含む組
成物を、細胞に送達することを含む。この方法において好ましくは細胞性取り込
み増強物質と複合体を形成したＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドは
、細胞に入って、細胞の新生物細胞増殖および／または形質転換を阻害するのに
充分な量と条件下で、送達される。
【００２２】 あるいは、哺乳動物細胞の新生物細胞増殖および／または形質転換を阻害する
方法の有用なペプチドベースの実施態様は、好ましくは細胞性取り込み増強物質
と複合体を形成した、ＰＴＴＧ−Ｃカルボキシ末端ペプチド（ＰＴＴＧ−Ｃ）、
またはその生物学的機能性断片を含む組成物を、細胞に入って、細胞の新生物細
胞増殖および／または形質転換を阻害するのに充分な量と条件下で、哺乳動物細
胞に送達することを含む。
【００２３】 ＰＴＴＧ１タンパク質は、重要な血管形成アクチベーターであるｂＦＧＦの発
現をさらに仲介するため、インビボで行われる新生物細胞増殖および／または形
質転換を阻害する本発明の方法はまた、腫瘍血管形成を阻害する方法を包含する
。ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦを含む血管形成アクチベーターは、ほとんどのヒト癌
細胞により発現され分泌される（プレート（Plate K.H.）ら、Nature 359:845-4
8 [1992]；シュルツ−ヘクター（Schultz-Hector, S.）とハガエ（Haghayegh, S
.）、Cancer Res. 53:1444-49 [1993]；ヤマナカ（Yamanaka, Y.）ら、Cancer R
es. 53:5289-96 [1993]；ブエンシング（Buensing, S.）ら、Anticancer Res. 1
5:2331-34 [1995]）。本発明のＰＴＴＧ−Ｃペプチドは、癌細胞（例えば、ヒー
ラ細胞）によるｂＦＧＦ産生を劇的に低下させるという本明細書に記載の発見は
、本発明の方法において、本発明のＰＴＴＧ−Ｃペプチドは、腫瘍増殖に必須で
ある新しい血管の増殖を障害することができることを示す。従って、腫瘍血管形
成を阻害する方法は、インビボにおける新生物細胞増殖をさらに阻害する。
【００２４】 また、ＰＴＴＧタンパク質に、またはさらに詳しくはＰＴＴＧ−Ｃペプチドに
特異的に免疫反応する抗体が提供される。本発明の抗体は、ＰＴＴＧ−Ｃペプチ
ドに特異的に結合する。これらの抗ＰＴＴＧ−Ｃ特異的抗体は、ある試料（例え
ば、組織試料、生体液、ウェスタンブロットなど）に存在するＰＴＴＧタンパク
質またはＰＴＴＧ−Ｃペプチドのレベルを測定するための測定法において有用で
ある。抗体はまた、粗細胞抽出物などからＰＴＴＧタンパク質またはＰＴＴＧ−
Ｃペプチドを精製するのに使用することができる。さらにこれらの抗体は、イン
ビボでのＰＴＴＧタンパク質の生物作用に対抗またはこれを補足するのに治療的
に有効と考えられる。すなわちこの抗体は、哺乳動物Ｔリンパ球の活性化を阻害
するのに有用である。 また、本発明の方法の実施を促進する有用なキットが産生される。
【００２５】 （発明の詳細な説明） 本発明は、ヒトリンパ球細胞を含む哺乳動物Ｔリンパ球細胞の活性化を阻害す
る方法に関する。リンパ系の幹細胞に由来するいずれのＴリンパ球変種が含まれ
る。Ｔリンパ球変種は、ヘルパー（例えばＣＤ４ヘルパー細胞）、サプレッサー
（例えばＣＤ８サプレッサー細胞）および細胞毒性Ｔ細胞、並びに、静止期、活
性化または増殖期（例えばＴリンパ芽球）いずれかの未処置（naive）またはメ
モリーＴ細胞として当技術分野で周知のものを含む。それらは、Ｔリンパ球発現
αβレセプターまたはγδレセプター、並びにＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４および
／またはＣＤ８を含む。活性化Ｔリンパ球は、とりわけ、ＣＴＬＡ４および／ま
たはＣＤ４０リガンドの増大された発現によって典型的に同定される。それらは
また、非活性化細胞によって発現されないＭＨＣクラスIIおよび他の抗原マーカ
ーを発現する。それらは、形態学的に、非活性化Ｔ細胞より大きいものとして当
業者には知られている。活性化Ｔリンパ球の他の生理学的および／または電気生
理学的性質も、当技術分野で知られている（例えば改変カルシウムイオン流動）
。 本発明は、哺乳動物細胞（特に限定されないが、結腸、乳房組織、または卵巣
組織由来の細胞を含む）のＰＴＴＧ１介在新生物細胞増殖および／または形質転
換を阻害する方法に関する。細胞は、上皮細胞、血管細胞、白血球細胞および任
意の他の型の哺乳動物細胞を含む。
【００２６】 本発明の方法の目的において、哺乳動物細胞は、任意の哺乳動物（例えば非ヒ
ト霊長類、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ブタ、ヒ
ツジ、ウマ、イヌ、ネコ、厚皮動物など）に由来するヒトまたは非ヒト起起源の
細胞である。哺乳動物細胞は、インビボ、すなわち哺乳動物被験体またはヒト被
験体内にあっても、またはインビトロ、すなわち細胞は培養細胞でもよい。
【００２７】 本発明の目的において「新生物細胞増殖」には、哺乳動物被験体または細胞培
養物の新生物（悪性または良性）、過形成、細胞学的異形成および／または前癌
状態細胞の成長または増殖がある。過形成細胞成長または増殖には、例えば良性
の前立腺過形成で一般的にあるような、組織中の正常配置で正常細胞数の異常な
増殖または増加がある。細胞学的異形成および／または前癌状態細胞の成長また
は増殖には、核型が異常であるが組織内では非悪性の腫瘍細胞の、細胞数の増加
がある。例としては、一部の前立腺過形成／異形成および頚部過形成／異形成が
ある。
【００２８】 新生物細胞成長および／または増殖、すなわち異常に構成された組織には、悪
性および非悪性の新生物がある。悪性新生物には、任意の組織で起きる原発性、
再発性、および／または転移癌（例えば、下垂体、視床下部、肺、腎臓、副腎、
尿管、膀胱、尿道、乳房、前立腺、睾丸、頭蓋、脳、脊椎、胸郭、腹膜、卵巣、
子宮、胃、肝臓、大腸、結腸、直腸、骨、リンパ系、皮膚、または被験体の任意
の他の臓器もしくは組織で発生する、癌腫、肉腫、リンパ腫、中皮腫、黒色腫、
神経膠腫、腎芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、乏突起細胞腫、星状細胞腫、上衣細胞
腫、原始神経外胚葉腫、異型髄膜腫、悪性髄膜腫、または神経芽腫）がある。
【００２９】 新生物細胞増殖および／または形質転換を阻害する本発明の方法の一部の遺伝
子ベースの実施態様において、ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドを
含む本発明の組成物が、細胞に送達される。「ＰＴＴＧカルボキシ末端関連」ポ
リヌクレオチドは、ＰＴＴＧ、特にＰＴＴＧ１の３’コード領域に特異的な配列
を規定する、塩基（例えば、アデニン［Ａ］、チミン［Ｔ］、ウラシル［Ｕ］、
グアニン［Ｇ］、および／またはシトシン［Ｃ］）の連続的配列を有するポリヌ
クレオチドである。３’末端は、未変性のＰＴＴＧをコードするｃＤＮＡコード
配列のほぼ中央から、停止コドンの最後まで延びる。ＰＴＴＧカルボキシ末端関
連ポリヌクレオチドは、後に詳述するように、哺乳動物ＰＴＴＧタンパク質（す
なわち、ＰＴＴＧ−Ｃペプチド）のカルボキシ末端部分をコードする配列、また
はそのＰＴＴＧ特異的断片、もしくは縮重コード配列、もしくはこれらのいずれ
かに相補的な配列でもよい。
【００３０】 ある好適な実施態様において本発明の組成物は、核酸構築体（例えば、プラス
ミドまたはウイルス発現ベクター）を含有し、これは、センスまたはアンチセン
ス配向でポリヌクレオチドを含有し、ここからＰＴＴＧ特異的ｍＲＮＡ転写体が
細胞中で発現される。別の好適な実施態様において、核酸構築体は、哺乳動物Ｐ
ＴＴＧカルボキシ末端（ＰＴＴＧ−Ｃ）ペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含有し、これは、本明細書に記載の任意のＰＴＴＧ−Ｃペプチドまたはその機
能性断片でもよい。特に「ＰＴＴＧ−Ｃ」は、本明細書において「ＰＴＴＧ１−
Ｃ」と同義である。さらに別の好適な実施態様において核酸構築体は、本明細書
に記載の哺乳動物ＰＴＴＧ２ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、センス
配向で含有する。
【００３１】 組成物はまた、適宜１つ以上のヘルパープラスミドまたはウイルスを含有して
もよい。プラスミドまたはウイルス発現ベクターは、転写単位中にポリヌクレオ
チドに機能的に連結したプロモーター領域を含む核酸構築体である。
【００３２】 本明細書においてプロモーター領域は、機能的に連結しているＤＮＡの転写を
制御するＤＮＡのセグメントを意味する。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラ
ーゼ認識、結合および転写開始に充分な特異的配列を含む。さらにプロモーター
領域は、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合および転写開始を調節する配列を含む
。これらの配列は、ｃｉｓ作用性でも、ｔｒａｓ作用性因子に応答性でもよい。
制御の性質に依存して、プロモーターは構成性または制御性でもよい。本発明で
の使用が企図されるプロモーターの例には、ＳＶ４０早期プロモーター、サイト
メガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ステ
ロイド誘導性プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモ
ーターなどがある。
【００３３】 本明細書において「発現」とは、ポリ核酸が転写されてｍＲＮＡになり、翻訳
されてペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質になる過程を意味する。ポリ核
酸がゲノムＤＮＡから得られるなら、発現は、適切な真核宿主細胞または生物が
選択されるなら、ｍＲＮＡのスプライシングを含んでよい。
【００３４】 本明細書において「機能的に連結」という用語は、制御性およびエフェクター
ヌクレオチド配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止
部位、および他のシグナル配列）との、ＤＮＡの機能的関係を意味する。例えば
プロモーターへのＤＮＡの機能的連結は、ＤＮＡを特異的に認識し、結合し、か
つ転写するＲＮＡポリメラーゼにより、プロモーターからそのようなＤＮＡの転
写が開始されるような、ＤＮＡとプロモーターとの物理的および機能的関係を意
味する。従って「機能的に連結」とは、転写単位内で、プロモーター配列が、コ
ード配列の上流（すなわち、その５’）に位置し、コード配列は、プロモーター
に対して３’であり、またはプロモーターに対して３’である遺伝子または読み
とり枠の配列内にあり、かつ発現はそれにより調和して制御されることを意味す
る。プロモーターとコード配列の両方とも、５’から３’へ配向しており、従っ
てインビトロで、すべての必要な酵素、転写因子、補助因子、アクチベーター、
および反応物質の存在下で、好ましい物理的条件（例えば、適当なｐＨと温度）
で、転写が起きることができる。これは、任意の特定の細胞中で、条件が転写を
促進することを意味しない。例えば、異なる組織からの異種細胞型では、組織特
異的プロモーターからの転写は好ましくない。
【００３５】 「核酸」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ
）を包含し、ＤＮＡは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはゲノムＤＮＡ（例えば、
ＰＴＴＧタンパク質をコードする遺伝子）でもよい。「ポリヌクレオチド」は、
リボシルまたはデオキシリボシル残基の間でホスホジエステル結合により形成さ
れる「骨格」を含有する核酸を包含する。ポリヌクレオチドはまた、核酸類似体
、例えば当該分野で公知の代替結合を有するポリヌクレオチドを含む。例として
は、ホスホロチオエート結合（例えば、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌク
レオチド；Ｓ−オリゴヌクレオチド）、混合ホスホロチオエートとホスホジエス
テル結合（例えば、Ｓ−Ｏ−オリゴデオキシヌクレオチドとホスホジエステル／
ホスホロチオエート２’−Ｏ−メチル−オリゴリボヌクレオチド；ゾウ（Zhou,
W.）ら、「ホスホロチオエート関連の副作用が低下した第２世代アンチセンス物
質としての混合骨格オリゴヌクレオチド」、Bioorg. Med. Chem. Lett. 8(22):3
269-74 [1998]）、メチルホスホネート−ホスホジエステル修飾（ＭＰ−Ｏ−オ
リゴヌクレオチド；ザオ（Zhao, Q.）ら、「アンチセンスホスホジエステル、ホ
スホロチオエートおよび混合ホスホロチオエートとメチルホスホネートオリゴヌ
クレオチドの細胞結合と取り込みの比較」、Antisense Res. Dev. 3(1):53-66 [
1993]）、またはモルホリノオリゴヌクレオチド（例えば、シュマジュク（Schma
juk, G.）ら、「異なる骨格を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。スプラ
イシング経路の改変と取り込みの効率」、J. Biol. Chem. 274(31):21783-89 [1
999]）がある。
【００３６】 またポリヌクレオチドには、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン残基を含む偽
型ペプチドまたはポリアミド骨格を有する核酸類似体、すなわちペプチド核酸（
ＰＮＡ）が含まれる（例えば、ニールセン（Nielsen, P.E.）、「ペプチド核酸
：新しい遺伝子治療薬への道」、Pharmacol. Toxicol. 86(1):3-7 [2000]；スー
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を特異的に低下させる」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(12):7053-58 [1999]
）。
【００３７】 ポリヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスポリヌクレオチドを含む。「
ポリヌクレオチド」はまた、「オリゴヌクレオチド」を包含する。
【００３８】 本明細書においてＰＴＴＧ特異的ポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレ
オチド配列は、ＰＴＴＧ特異的ヌクレオチド塩基配列に特異的に結合するもので
ある。「特異的に結合する」という用語は、ポリヌクレオチド配列が、相補的塩
基配列を認識し、相補的塩基対の間で水素結合を形成することにより、それと２
本鎖セグメントを形成する能力を包含する。従って相補的配列は、例えばセンス
配列またはコード配列に対してアンチセンス配列を含む。
【００３９】 ＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドのある実施態様またはＰＴＴＧ−２をコー
ドするポリヌクレオチドの実施態様において、ｍＲＮＡ転写体が産生されて、こ
れが翻訳されると翻訳生成物（例えば、ＰＴＴＧ１タンパク質、ＰＴＴＧカルボ
キシ末端ペプチド（ＰＴＴＧ−Ｃ）またはＰＴＴＧ２ペプチド）を産生すること
ができるように、ポリヌクレオチドは転写単位内でセンス配向にある。
【００４０】 他の実施態様において、転写により、生理的条件下で、天然に存在するセンス
ＰＴＴＧ ｍＲＮＡ分子に相補的でかつハイブリダイズ可能な転写体が得られ、
そこからの翻訳を阻害または阻止するように、ＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチ
ドはアンチセンス配向にある。すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、
標的ｍＲＮＡ配列に結合して、例えばＲＮａｓｅＩ消化によりｍＲＮＡの分解を
誘導することにより、翻訳制御因子またはリボゾームの結合を妨害してｍＲＮＡ
標的配列の翻訳を阻害することにより、または標的ｍＲＮＡを分解するかもしく
は化学的に修飾する他の化学構造（例えば、リボザイム配列または反応性化学基
）を含めることにより、標的ｍＲＮＡ配列を不活性化する。例えばｍＲＮＡまた
はゲノムＤＮＡのＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドセグメントを標
的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＴＴＧ１の発現を阻害するのに
有効である。
【００４１】 アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する遺伝子ベースの治療法は、当該分
野で公知である（例えば、ライト（Rait, A.）ら、「ホスホロチオエート保護が
最も少ないオリゴヌクレオチドと１−Ｏ−ヘキサデシルグリセロールとの３’末
端結合体：放射線耐性細胞中の合成と抗ｒａｓ活性」、Bioconjug Chem., 11(2)
:153-60 [2000]；ステントン（Stenton, G.R.）ら、「エアゾル化したｓｙｋア
ンチセンスは、ｓｙｋ発現、マクロファージからのメディエーター放出、および
肺感染を抑制する」、J. Immunol., 164(7):3790-7 [2000]；スズキ（Suzuki, J
.）ら、「アンチセンスＢｃｌ−ｘオリゴヌクレオチドは、マウス心臓同種移植
片中のアポトーシスを誘導し心房新内膜形成を防止する」、Cardiovas. Res., 4
5(3):783-7 [2000]；キム（Kim, J.W.）ら、「グリセロアルデヒド−３−ホスフ
ェート脱水素酵素遺伝子のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは細胞増殖
を阻害し、ヒト子宮頚癌細胞株でアポトーシスを誘導する」、Antisense Nuclei
c Acid Drug Dev., 9(6):507-13 [1999]；ハン（Han, D.C.）ら、「アンチセン
スＴＧＦ−ベータ１オリゴデオキシヌクレオチドによる治療は、糖尿病マウスの
腎臓重量とマトリックスｍＲＮＡを低下させる」、Am. J. Physiol. Renal Phys
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の治療候補としてのＨＭＧ１（Ｙ）タンパク質合成のアデノウイルス介在抑制」
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レオチドダウンレギュレーション」、Int. J. Cancer, 77(4):567-71 [1998]；
エンゲルハード（Engelhard, H.H.）、「アンチセンスオリゴデオキシヌクレオ
チド技術：悪性脳腫瘍の治療のための使用可能性」、Cancer Control, 5(2):163
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マウイルス１６Ｅ６型遺伝子に対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド
による頚部腫瘍細胞の増殖阻害」、Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 9(5):4
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ス血管内皮増殖因子の移動はインビボの腫瘍増殖を阻害する」、Cencer Res., 5
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原に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドとＫｉ−６７はメサンギウム細胞増
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送達されるアンチセンス表皮増殖因子受容体はヒト胃癌の腫瘍増殖を阻止する」
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M.G.）ら、「ＭＭＴＶ−ｎｅｕトランスジェニックマウスからの乳腺腫のイン
ビトロおよびインビボのアンチセンス介在増殖阻害」、Gene Ther., 5(3):388-9
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抗腫瘍活性」、Nat. Med., 2(6):668-75 [1996]）。
【００４２】 本発明の他の実施態様において、本発明の組成物は、発現ベクターに含有され
ていないＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチド（例えば、合成アンチセ
ンスオリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチ
ド）を含む。ｍＲＮＡを認識しこれに選択的に結合するように設計された合成ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドまたは他のアンチセンス化学構造体は、ＰＴＴＧ
コード鎖、例えば配列番号１、３、１０、１５、１８または１９（後述の表１〜
６）に示すコード配列、の部分に相補的になるように構築される。本発明の方法
において、ＰＴＴＧの３’コード領域の少なくとも一部の翻訳発現を防ぐことに
より、アンチセンスＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドは、新生物細
胞増殖および／または形質転換の仲介に機能するＰＴＴＧタンパク質の発現を防
ぐのに有用である。
【００４３】 新生物細胞増殖および／または形質転換を阻害する方法の好適な実施態様にお
いて、組成物はまた、本明細書にさらに記載する取り込み増強物質を含む。ＰＴ
ＴＧ特異的ポリヌクレオチドと複合体を形成した取り込み増強物質を含有する本
発明の組成物は、細胞膜を通過して、物理的および化学的性質により細胞の細胞
質に入ることができるように設計される。さらに本組成物は、特異的細胞取り込
み機構（これは、選択細胞集団内でのみ下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）
特異的ポリヌクレオチドを取り込む）により認識されるように標的化することに
より、いくつかの選択された細胞集団にのみ送達されるように設計することがで
きる。例えば組成物は、ある細胞型にのみ見いだされる受容体に結合する受容体
アゴニストを含むことができる。
【００４４】 本発明の組成物はまた、１つ以上の薬剤学的に許容される担体を含有してもよ
い。本明細書において「許容される担体」は、任意の標準的薬剤担体を包含する
。担体は、有機もしくは無機担体もしくは賦形剤、例えば水およびエマルジョン
（例えば、水／油もしくは油／水エマルジョン）および種々の型の湿潤剤でもよ
い。活性成分は、輸液、錠剤、ペレット剤、カプセル剤、液剤、エマルジョン剤
、懸濁剤、および使用に適した任意の他の型のための、非毒性の薬剤学的に許容
される担体で調製される組成物中に含まれる。そのような担体はまた、グルコー
ス、乳糖、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプンペースト、マグネ
シウム３ケイ酸塩、尿素、中程度の鎖長のトリグリセリド、デキストラン、通常
の食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水および製剤の製造での使用に適した他の担体
を、固体、半固体、または液体型で含む。さらに、補助剤、安定剤、増粘剤、お
よび着色剤および香料が、適宜使用できる。
【００４５】 ＰＴＴＧ特異的ポリヌクレオチド（ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオ
チドまたはＰＴＴＧ２をコードするポリヌクレオチドを含む）は、既知の哺乳動
物ＰＴＴＧ特異的ヌクレオチド配列（例えば、ＰＴＴＧ１、ＰＴＴＧ２、ＰＴＴ
Ｇ３、またはＰＴＴＧ４配列）との、塩基配列類似性または相同性により決定さ
れる。塩基配列相同性は、例えばナショナルセンター・フォー・バイオテクノロ
ジーインフォメーション（ＮＣＢＩ：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）のジーン
バンク（GenBank）データベースのようなデータベースを、パワーブラスト（Pow
erBLAST）、キューブラスト（QBLAST）、プサイブラスト（PSI-BLAST）、ファイ
ブラスト（PHI-BLAST）、ギャップトまたはアンギャップトブラストのようなコ
ンピューターアルゴリズム、またはベイヤーカレッジオブメディシン（Bayor Co
llege of Medicine）サーバー（www.hgsc.bcm.tmc.edu/seq＿data）を介する「
アライン（Align）」プログラムを使用して、塩基配列類似性検索を行うことに
より決定される（例えば、アルトチュル（Altchul, S.F.）ら、「ギャップトブ
ラスト（Gapped BLAST）とプサイブラスト（PSI-BLAST）；新しい世代のタンパ
ク質データベース検索プログラム」、Nucleic Acids Res. 25(17):3389-402 [19
97]；ザング（Zhang, J.）とマデン（Madden, T.L.）、「パワーブラスト（Powe
rBLAST）；対話型および自動配列解析および自動化のための新しいネットワーク
ブラスト（BLAST）アプリケーション」、Genome Res. 7(6):649-56 [1997]；マ
デン（Madden, T.L.）ら、「ネットワークブラスト（BLAST）サーバーの応用」
、Methods Enzymol. 266:131-41 [1996]；アルトチュル（Altschul, S.F.）ら、
「基礎的ローカルアライメント検索ツール」、J. Mol. Biol. 215(3):403-10 [1
990]）。
【００４６】 好ましくは、ＰＴＴＧ特異的ポリヌクレオチド配列は、少なくとも５〜３０の
連続的ヌクレオチドの長さであり、さらに好ましくは少なくとも６〜１５の連続
的ヌクレオチドの長さであり、最も好ましくは少なくとも７〜１０の連続的ヌク
レオチドの長さである。好ましくは本発明のＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌ
クレオチドは、少なくとも約４５の連続的ヌクレオチドの長さである。
【００４７】 ＰＴＴＧ特異的コード配列の好適な例は、ヒトＰＴＴＧ１（ｈＰＴＴＧ１また
はＰＴＴＧ１）の配列を含む。ＰＴＴＧ１ペプチドは、ヒトＰＴＴＧ１遺伝子配
列、配列番号３のヌクレオチド９５〜７００位の読みとり枠によりコードされる
（下の表１）。
【００４８】 表１．ｈＰＴＴＧ１遺伝子配列
【００４９】 ＰＴＴＧ１の３’コード領域は、以下の１６８ヌクレオチド配列を含み、これ
は、以下の表２に示す配列番号３のヌクレオチド５３３〜７００位に対応する。
【００５０】 表２．ｈＰＴＴＧ１の３’コード領域の部分
【００５１】 ＰＴＴＧ特異的コード配列の別の有用な例は、配列番号１のヌクレオチド２９
３〜８８９位を含むラットＰＴＴＧペプチドをコードする配列である（下の表３
）。
【００５２】 表３．ラットＰＴＴＧ１配列
【００５３】 ラットＰＴＴＧの３’コード領域は以下の１６８ヌクレオチド配列を含有し、
これは、表４に示す配列番号１のヌクレオチド７２２〜８８９位に対応する。
【００５４】 表４．ラットＰＴＴＧの３’コード領域の部分
【００５５】 ＰＴＴＧ特異的コード配列の別の有用な例は、配列番号１５のヌクレオチド３
０４〜８９１位を含む、マウスＰＴＴＧ１ペプチドをコードする配列である（下
の表５）。
【００５６】 表５．マウスＰＴＴＧ１配列
【００５７】 マウスＰＴＴＧ１の３’コード領域は、以下の１６８ヌクレオチド配列を含有
し、これは、表６に示す配列番号１５のヌクレオチド７２４〜８９１位に対応す
る。
【００５８】 表６．マウスＰＴＴＧ１の３’コード領域の部分
【００５９】 配列番号１０、１８または１９のヌクレオチド配列、縮重コード配列、または
これらのいずれかに相補的な配列を含む本発明のＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオ
チドは、有用なＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドを単に例示するた
めである。他の有用なＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドは、少なく
とも４５ヌクレオチドの長さの、配列番号１０、１８または１９のいずれかの機
能性断片、縮重コード配列、またはこれらのいずれかに相補的な配列であり、そ
の細胞内の存在は、内因性ＰＴＴＧ発現および／またはＰＴＴＧ機能（この機能
は日常的なスクリーニングにより測定することができる）をダウンレギュレート
するように機能することができる。
【００６０】 ゲノムＤＮＡ（染色体ウォーキングにより得られる）から決定されるヒトＰＴ
ＴＧ２遺伝子配列（配列番号６２；ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ＡＦ
１１６５３８．２）を、以下の表６ａに示す。すなわち、ＰＴＴＧ特異的コード
配列の別の例は、ヒトＰＴＴＧ２タンパク質のコード配列であり、これは、（配
列番号６２）のヌクレオチド３８３〜３８５位の転写開始部位で開始し、（配列
番号６２）のヌクレオチド９５６〜９５８位の停止コドンまで延長している。こ
のｈＰＴＴＧ２コード配列を、表６ａで下線を引き、本明細書において配列番号
６３として規定する。
【００６１】 表６ａ．ヒトＰＴＴＧ２遺伝子配列
【００６２】 本明細書において「縮重」という用語は、参照核酸（例えば、配列番号１、３
、１０、１５、１８、１９、６２または６３）とは、少なくとも１つのヌクレオ
チドが異なるが、参照核酸と同じアミノ酸をコードするコドンを意味する。例え
ばトリプレット「ＵＣＵ」、「ＵＣＣ」、「ＵＣＡ」および「ＵＣＧ」により特
定されるコドンは、同じアミノ酸セリンをコードするため、これらは互いに縮重
である。すなわち、例えば配列番号６４と同じアミノ酸配列をコードするポリヌ
クレオチドは、ｈＰＴＴＧ２コード配列配列番号６３について縮重配列を有する
と言われる。
【００６３】 他の有用なＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドには、配列番号１、配列番号３
、配列番号１０、配列番号１５、配列番号１８、または配列番号１９に示す配列
とは配列が異なるが、細胞中で発現された時同じ表現型を与える核酸または他の
ポリヌクレオチドを含む。表現型が類似の核酸はまた、「機能的に同等の核酸」
と呼ばれる。本明細書において「機能的に同等の核酸」という用語は、わずかな
変化であり結果として配列に変化の無いことを特徴とする核酸であって、本明細
書で開示し詳述したヌクレオチド配列のいずれかと比較して、実質的に同様に機
能して、新生物細胞増殖および／または形質転換に関して機能的ＰＴＴＧタンパ
ク質、または新生物細胞増殖および／または形質転換の阻害に関して機能的なＰ
ＴＴＧ−Ｃペプチド、および／または免疫原性に関して機能的なポリペプチド生
成物を産生する核酸を包含する。そのようなポリヌクレオチドは、参照配列と実
質的に同じコード配列を有することができ、配列番号２、配列番号４、配列番号
９、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７に記載のアミノ酸配列、または
、配列番号２、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号１６もしくは
配列番号１７を含む、より大きなアミノ酸配列をコードする。
【００６４】 他の有用なＰＴＴＧ２をコードするポリヌクレオチドは、（Ａ）基本的に（配
列番号６４）のアミノ酸残基１〜１９１、または（配列番号６４）の少なくとも
アミノ酸残基１〜１８０を含むその機能性断片からなるペプチド；または（Ｂ）
（Ａ）のいずれかと少なくとも約９５％の配列相同性を有し、かつ細胞中で発現
された時、新生物細胞増殖および／または形質転換の阻害に関して、同じ表現型
を与える哺乳動物ＰＴＴＧ２ペプチドを、コードする核酸または他のポリヌクレ
オチドを含む。これは基本的に、配列番号６４の連続的アミノ酸残基１〜１８０
、配列番号６４の１〜１８１、配列番号６４の１〜１８２、配列番号６４の１〜
１８３、配列番号６４の１〜１８４、配列番号６４の１〜１８５、配列番号６４
の１〜１８６、配列番号６４の１〜１８７、配列番号６４の１〜１８８、配列番
号６４の１〜１８９、および配列番号６４の１〜１９０からなるペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを含む。
【００６５】 本明細書において「実質的に同じヌクレオチド配列」という用語は、参照ポリ
ヌクレオチドと充分な同一性を有し、その結果、穏和な厳密性ハイブリダイゼー
ション条件下で参照ヌクレオチドにハイブリダイズするＤＮＡを意味する。他の
実施態様において、参照ヌクレオチド配列として「実質的に同じヌクレオチド配
列」を有するＤＮＡは、参照ヌクレオチド配列に関して、少なくとも約６０％の
同一性を有する。参照ヌクレオチド配列と少なくとも７０％、さらに好ましくは
少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％の同一性を有するＤＮ
Ａが、好ましい。
【００６６】 好適な実施態様において、機能的に同等の核酸は、本明細書に記載のポリペプ
チドまたはペプチド断片と同じであるか、保存的アミノ酸置換を有するポリペプ
チドまたはペプチド断片をコードするか、または配列番号２、配列番号４、配列
番号９、または配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号６
４を含むより大きいポリペプチド、または本発明の方法の実施態様に従って、新
生物細胞増殖および／または形質転換の阻害に関して、生物学的に機能的な断片
である前記のいずれかの断片をコードする。例えば、保存的変化には、非極性残
基の別の非極性残基による置換、荷電残基の同様の荷電残基による置換を含む。
これらの変化には、タンパク質の３次構造を実質的に変化させることのない、当
業者に公知のものがある。
【００６７】 有用なポリペプチドは当該分野で公知の種々の方法により産生され、例えばＰ
ＣＲや他の類似の増幅法により、配列番号１、３、１０、１５、１８、１９、６
２、６３の種々の領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー、または機能的
に同等のポリヌクレオチド配列を使用して行われる。種々の長さのポリヌクレオ
チドまたはオリゴヌクレオチドを産生するための他の合成法もまた公知である。
【００６８】 本方法の実施態様において、好適なポリヌクレオチドは、中程度にストリンジ
ェントな、好ましくは高ストリンジェントな条件で、配列番号１、３、１０、１
５、１８、１９、６２、６３、６５、６６または６８に記載の核酸配列の、実質
的にすべての配列、または実質的な部分（すなわち、一般には少なくとも１５〜
３０ヌクレオチド）、または相補的配列とハイブリダイズする。
【００６９】 「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」という用語は本明細書におい
て、ポリ核酸または他のポリヌクレオチドのアニーリングしたハイブリッド、ま
たは少なくとも部分的にアニーリングしたハイブリッドが安定である条件を意味
する。当業者に公知なように、ハイブリッドの安定性はハイブリッドの融点（Ｔ
m）に反映される。一般的にハイブリッドの安定性は、ナトリウム濃度と温度の
関数である。一般的にハイブリダイゼーション反応は、比較的低いストリンジェ
ントな条件下で行われ、次に異なる（しかし高い）ストリンジェンシーで洗浄さ
れる。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーへの参照は、そのような洗浄
条件に関する。
【００７０】 本明細書において「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」と
いう用語は、標的ＤＮＡが、標的ＤＮＡと約６０％の配列同一性もしくは相同性
、好ましくは約７５％の同一性、さらに好ましくは約８５％の同一性を有する相
補的核酸に結合することを可能にする条件を意味し、約９０％より大きいことが
特に好ましい。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、５０％ホルムア
ミド、５×デンハルツ（Denhart's）溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４
２℃でハイブリダイゼーションし、次に０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳで６
５℃で洗浄することと同等である。
【００７１】 本明細書において「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」という用
語は、０．０１８Ｍ ＮａＣｌ、６５℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配
列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する（０．０１８Ｍ
ＮａＣｌ、６５℃でハイブリッドが安定でないなら、本明細書において企図され
るように、高ストリンジェンシー条件下で安定ではないであろう）。高ストリン
ジェンシー条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×デンハルツ溶液、５×Ｓ
ＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２℃でハイブリダイゼーションし、次に０．１×Ｓ
ＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで６５℃で洗浄することにより与えられる。
【００７２】 「低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」という用語は、１０％ホル
ムアミド、５×デンハルツ溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２℃でハイ
ブリダイゼーションし、次に１×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、５０℃で洗浄する
ことと同等の条件である。デンハルツ溶液とＳＳＰＥ（例えば、モレキュラーク
ローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）、
コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laborat
ory Press）を参照）は、他の適当なハイブリダイゼーション緩衝液のように、
当業者に公知である。
【００７３】 ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドまたはＰＴＴＧをコードするポ
リヌクレオチドは、哺乳動物ＰＴＴＧ配列間の、比較的高い配列相同性の程度の
ために、細胞に関して同源でもよいが、必ずしも必要ではない。細胞に関して異
種哺乳動物起源のＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドまたはＰＴＴＧ
をコードするポリヌクレオチドもまた有用である。すなわち、例えば、本発明の
方法において、ヒトＰＴＴＧ−Ｃをコードする配列またはＰＴＴＧ２をコードす
る配列は、非ヒト哺乳動物起源の細胞（例えば、マウスまたはラット細胞）中の
内因性ＰＴＴＧ発現および／またはＰＴＴＧ機能をダウンレギュレートするよう
に機能し、その逆も真である。
【００７４】 哺乳動物細胞の新生物細胞増殖および／または形質転換の阻害法の好適な実施
態様において、ポリヌクレオチドは、細胞に入るのに充分な量と条件下で、細胞
取り込み増強物質と複合体を形成する。本明細書において「取り込み増強」物質
は、外因性ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡセグメント、核酸類似体、もしくは
核酸構築体を、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞およびさらに好ましくはヒト
細胞への取り込みを増強するための組成物を意味する。この増強は、細胞をトラ
ンスフェクションまたは形質導入するプロセスにおいて、取り込み増強物質の非
存在下でのポリヌクレオチド取り込みに対して測定される。取り込み増強物質と
の複合体形成は、一般に細胞内へのポリヌクレオチドの取り込みを増強し、およ
び／または細胞質を通過する間にヌクレアーゼによるその分解を低下させる。
【００７５】 本方法の好適な実施態様において、ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオ
チドまたはＰＴＴＧ−ＣペプチドまたはＰＴＴＧ２をコードするポリヌクレオチ
ドまたはＰＴＴＧ２ペプチドは、取り込み増強物質と複合体を形成する。「複合
体を形成する」とは、ポリヌクレオチドまたはペプチドが、細胞取り込み増強物
質および／またはその残基を含む他の成分の間の化学結合に由来する、複合体、
混合物または付加物の成分もしくはメンバーであることを意味する。化学結合は
、複合体の成分をその任意の部分または残基で連結する、共有結合、イオン結合
、水素結合、疎水結合、またはこれらの結合型の任意の組合せの性質を有し、成
分はいろいろな種類の１つ以上の残基を有することができるものを意味する。複
合体のすべての成分が、他のすべての成分に結合する必要は無いが、各成分は、
複合体の少なくとも１つの他の成分との少なくとも１つの化学結合を有する。成
分には、特に限定されないが、極性、非極性、または界面活性の分子化合物；イ
オン、例えば特に限定されないが、Ｎａ+、Ｋ+、Ｌｉ+、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、Ｆｅ2 + 、Ｆｅ3+、Ｚｎ2+、Ｃｕ+、Ｃｕ2+、および／またはＮＨ4+のような陽イオン、
または特に限定されないがＣｌ-、Ｂｒ-、Ｆｌ-、ＮＯ3 -、ＮＯ2 -、ＨＣＯ3 -、
ＣＯ3 2-、ＳＯ4 2-、および／またはＰＯ4 3-のような陰イオン；生物分子、例え
ばタンパク質、オリゴペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、核酸、核
酸構築体、プラスミド、ウイルス粒子；および／または有機ポリおよびコポリマ
ーがある。
【００７６】 ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドまたはＰＴＴＧ−Ｃペプチドま
たはＰＴＴＧ２をコードするポリヌクレオチドまたはＰＴＴＧ２ペプチドは、細
胞性取り込み増強物質に直接結合できるが、必ずしも必要ではない。例えば、ポ
リヌクレオチドは、発現ベクターまたは他の核酸構築体中に含有され、このベク
ターまたは他の構築体は、本発明の目的のために、ＰＴＴＧカルボキシ末端関連
ポリヌクレオチドまたはＰＴＴＧをコードするポリヌクレオチドに直接結合して
いないベクターまたは構築体のある残基または一部で、取り込み増強物質に結合
しており、ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドまたはＰＴＴＧをコー
ドするポリヌクレオチドは、まだ取り込み増強物質と「複合体を形成」している
が、化学結合により取り込み増強物質に直接結合していない。ポリヌクレオチド
および取り込み増強物質が両方とも、同じ複合体の成分またはメンバーである限
り、間接化学結合で充分である。ＰＴＴＧ−ＣまたはＰＴＴＧ２ペプチドを用い
る例は、第１のＰＴＴＧ−ＣペプチドセグメントまたはＰＴＴＧ２ペプチドセグ
メントを、第２の細胞取り込み増強ペプチドセグメントおよび／または輸送能力
のあるペプチドセグメントに連結する第３のペプチド配列である。間接的に結合
した第１および第２のペプチドセグメントは、本発明の目的のために「複合体を
形成」している。
【００７７】 通常ポリヌクレオチドと複合体を形成した取り込み増強物質の例は、陽イオン
性脂質またはポリ陽イオン性脂質があり、これは、陽イオン性脂質またはポリ陽
イオン性脂質−ＤＮＡまたはリポソーム−ＤＮＡ複合体（「リポプレックス（li
poplexes」）を形成することができる。そのようなリポプレックス（lipoplexes
」は、場合により、血清アルブミンで被覆されるか、またはトランスフェクショ
ン効率をさらに増強するために、大きなコロイド的に不安定な複合体として調製
される；カルシウム２陽イオン（Ｃａ2+）の存在はまた、脂質ベースのトランス
フェクション効率を増強する。（例えば、シモーズ（Simoes, S.）ら、「ヒト血
清アルブミンはリポプレックス（lipoplexes」によりＤＮＡトランスフェクショ
ンを増強し、血清により阻害に対する耐性を与える」、Biochim. Biophys. Acta
1463(2):459-69 [2000]；ツレク（Turek, J.）ら、「リポプレックス（lipople
xes」のサイズを増加させる調製物は、トランスフェクションの血清結合阻害を
防止する」、J. Gene Med. 2(1):32-40 [2000]；ズダム（Zudam, N.J.）ら、「
陽イオン性リポソームのラメラ性とリポプレックスの調製モードはトランスフェ
クション効率に影響を与える」、Biochim. Biophys. Acta 1419(2):207-20 [199
9]；ラム（Lam, A.M.）とクリス（Cullis, P.R.）、「カルシウムは、プラスミ
ドＤＮＡ−陽イオン性リポソーム複合体のトランスフェクション能を増強する」
、Biochim. Biophys. Acta 1463(2):279-290 [2000]）。
【００７８】 本発明の組成物は、陽イオン性リポソーム、トランスフェリンまたはフシゲニ
ック（fusigenic）ペプチドまたはポリ（エチルイミン）の陰性荷電した３成分
複合体を含むことができる（例えば、シモーズ（Simoes, S.）ら、「ＤＮＡ、陽
イオン性リポソーム、およびトランスフェリンまたはフシゲニック（fusigenic
）ペプチドの陰性荷電した３成分複合体による遺伝子送達」、Gene Ther. 5(7):
955-64 [1998]）。本発明のポリヌクレオチドと複合体を形成したリポソーム性
取り込み増強物質はまた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＦｕＧＥＮＥ６
などの中に封入することができる」、（例えば、サラボラック（Saravolac, E.G
.）ら、「最適トランスフェクション活性のための異なる陽イオン性リポソーム
濃度からなる安定化プラスミド−脂質粒子中のプラスミドＤＮＡの封入」、J. D
rug Target 7(6):423-37 [2000]；ユー（Yu, R.Z.）ら、「ステルス（stealth）
リポソームに封入されたＨａ−ｒａｓのアンチセンスオリゴヌクレオチドインヒ
ビターのサルでの薬物動態と組織分布」、Pharm. Res. 16(8):1309-15 [1999]；
タオ（Tao, M.）ら、「ヒーラ細胞中のトランスフェクション試薬、ＦｕＧＥＮ
Ｅ６−アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトテロメラ
ーゼ活性の特異的阻害」、FEBS Lett 454(3):312-6 [1999]）。
【００７９】 ある実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの取り込みはまた、
生体適合性ポリマー性またはコポリマー性ナノ粒子（例えば、アルギン酸塩、ア
ミノアルキルメタクリレート、メチルメタクリレート、ポリメチルメタクリレー
ト、メチルアミノエチル−メタクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート（
例えば、ポリヘキシルシアノアクリレート））との複合体形成により増強される
。（例えば、アイニー（Aynie, I.）ら、「アンチセンスオリゴヌクレオチドの
新しい送達系の候補としてのスポンジ様アルギン酸塩ナノ粒子」、Antisense Nu
cleic Acid Drug Dev. 9(3):301-12 [1999]；チマー（Zimmer, A.）、「担体と
してポリヘキシルシアノアクロレートナノ粒子を用いるアンチセンスオリゴヌク
レオチド送達」、Methods 18(3):286-95, 322 [1999]；バートン（Berton, M.）
ら、「疎水性アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体を使用する高度に充填され
た担体」、Eur. J. Pharm. Sci. 9(2):163-70 [1999]；ゾーベル（Zobel, H.P.
）ら、「コロイド性薬剤運搬システムとしてのアミノアルキルメタクリレートナ
ノ粒子の評価。第II部：アンチセンスオリゴヌクレオチドを充填したコポリマー
ナノ粒子の性状解析」、Eur. J. Pharm. Biopharm. 48(1):1-12 [1999]；ファッ
タル（Fattal, E.）ら、「オリゴヌクレオチドの送達のための生分解性ポリアル
キルシアノアクリレートナノ粒子」、J. Controlled Release 53(1-3):137-43 [
1998]）。
【００８０】 ポリヌクレオチドと複合体を形成するための他の有用な取り込み増強物質には
、星形のポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーがある。（例えば、ヨー
（Yoo, H.）ら、「アンチセンスオリゴヌクレオチドの送達物質としてのＰＡＭ
ＡＭデンドリマー」、Pharm. Res. 16(12):1799-804[1999]；ビエリンスカ（Bie
linska, A.U.）ら、「インビトロとインビボでの固相トランスフェクションのた
めの膜ベースのデンドリマー／ＤＮＡ複合体の応用」、Biomaterials 21(9):877
-87 [2000]；ビエリンスカ（Bielinska, A.U.）ら、「ポリアミドアミンデンド
リマーと複合体を形成するＤＮＡ：トランスフェクションの意味」、Bioconjug.
Chem. 10(5):843-50 [1999]；ビエリンスカ（Bielinska, A.U.）ら、「星形Ｐ
ＡＭＡＭＡデンドリマーを使用してトランスフェクションしたアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドまたはアンチセンス発現プラスミドを使用するインビトロ遺伝子
発現の制御」、Nucleic Acids Res. 24(11):2176-82 [1996]；クコウスカ−ラタ
ッロ（Kubowska-Latallo, J.F.）ら、「星形ポリアミドアミンデンドリマーを使
用する哺乳動物細胞への遺伝物質の効率的な移動」、Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 93(10):4897-902 [1996]；デロング（Delong, R.）ら、「ポリアミドアミン
星形デンドリマーとのオリゴヌクレオチドの複合体の性状解析と細胞内送達への
作用」、J. Pharm. Sci. 86(8):762-64 [1997]）。
【００８１】 他の好適な取り込み増強物質には、リポフェクチン、リポフェクタミン、ＤＩ
ＭＲＩＥ Ｃ、スーパーフェクト、エフェクチン（キアゲン（Qiagen））、ユニ
フェクチン、マキシフェクチン、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム；
ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル
−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオ
レオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオク
タデシルアンモニウムブロミド）、ＤＨＤＥＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジ−ヘキサデシル−
Ｎ，Ｎ−ジヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＨＤＥＡＢ（Ｎ−ｎ−ヘ
キサデシル−Ｎ，Ｎ−ジヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ポリブレン
、またはポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、および／またはペプチド、例えば
ポリリジン、プロタミン、ｐＫ１７、ペプチドＫ８、およびペプチドｐ２がある
。（例えば、フェルコールジュニア（Ferkol, Jr.）ら、米国特許第５，９７２
，９００号および５，９７２，９０１号；ベイセ（Vaysse, L.）とアーベイラー
（Arveiler, B.）、「合成ペプチドを使用するトランスフェクション：３つのＤ
ＮＡ圧縮性ペプチドの比較と遠心分離の効果」、Biochim. Biophys. Acta 1474(
2):244-50 [2000]；ニー（Ni, Y.H.）ら、「プロタミンは、培養ヒト肝癌細胞株
中のリポソーム介在遺伝子移動の効率を増強する」、J. Formos. Med. Assoc. 9
8(8):562-66 [1999]；バナージー（Banerjee, R.）ら、「リポソーム遺伝子送達
で使用するための新規シリーズの非グリセロールベースの陽イオン性トランスフ
ェクション脂質」、J. Med. Chem. 42(21):4292-99 [1999]；ゴドベイ（Godbey,
W.T.）ら、「ポリ（エチレンイミン／ＤＮＡ複合体の改良されたパッキングは
トランスフェクション効率を上昇させる」、Gene Ther. 6(8):1380-88 [1999]；
キチラー（Kichler, A.）ら、「リポスペルミン／ＤＮＡ粒子のトランスフェク
ション効率へのＤＮＡ複合体形成培地の影響」、Gene Ther. 5(6):855-60 [1998
]；ビルチャー（Birchaa, J.C.）ら、「脂質ベースの遺伝子送達複合体の物理化
学的性状解析とトランスフェクション効率」、Int. J. Pharm. 183(2):195-207
[1999]）。これらの非ウイルス細胞取り込み増強物質は、ウイルス由来のトラン
スフェクションまたは形質導入物質に通常関連するサイズの制限無しで、脊椎動
物ゲノムへの異種移植片ＤＮＡ配列の安定な組み込みを促進するという利点を有
する。
【００８２】 別の例（ウイルス性細胞性取り込み増強物質）は、アデノウイルス増強トラン
スフェリン−ポリリジン介在遺伝子送達系であり、これはクリエル（Curiel）ら
により記載され特許化されている（クリエル（Curiel D.T.）ら、「トランスフ
ェリン−ポリリジン介在遺伝子送達のアデノウイルス増強」、PNAS USA 88:8850
-8854 (1991)。ＤＮＡの送達は、トランスフェリン受容体により仲介されるエン
ドサイトーシスに依存する（ワグナー（Wagner）ら、「細胞へのＤＮＡ取り込み
のための担体としてのトランスフェリンポリ陽イオン結合体」、PNAS (USA) 87
:3410-3414 (1990)。さらにこの方法は、アデノウイルスが細胞小胞（例えば、
エンドソーム）を破壊し、そこに捕捉されている内容物を放出する能力に依存す
る。このシステムは、他の方法に対して２，０００倍も哺乳動物細胞への遺伝子
送達を増強することができる。
【００８３】 ヒトＴリンパ球へのポリヌクレオチドの送達に特に有用な取り込み増強物質は
、「テームド（tamed）」（すなわち、免疫不全の発病と病原性に必要な未変性
のウイルス遺伝子が欠如している）ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）ベクター
であり、これはＣＤ４分子を介する取り込みを仲介する。ＣＤ４および／または
他のＴリンパ球マーカーに結合する種々のそのようなテームドウイルスベクター
もまた、当該分野で公知である。
【００８４】 組成物の各成分の量は、例えば哺乳動物細胞のトランスフェクションまたは形
質導入による、遺伝子修飾が最適化されるように選択される。そのような最適化
は、日常的な実験以上は必要無い。ポリヌクレオチド対脂質の比は広く、好まし
くは約１：１であるが、使用される脂質取り込み増強物質とポリヌクレオチドの
形に依存して他の有効な比率を使用してもよい。（例えば、バナージー（Banerj
ee, R.）ら、[1999]；ジャースケライネン（Jaaskelainen, I.）ら、「膜活性成
分を有し小さい複合体サイズを有する脂質担体は、アンチセンスホスホロチオエ
ートオリゴヌクレオチドの効率的な細胞送達に必要である」、Eur. J. Pharm. S
ci. 10(3):187-193 [2000]；サクライ（Sakurai, F.）ら、「プラスミドＤＮＡ
／陽イオン性リポソーム複合体と以後の遺伝子発現の物理化学的特徴、細胞取り
込みおよび細胞内輸送へのＤＮＡ／リポソーム混合比の作用」、J. Controlled
Release 66(2-3):255-69 [2000]）。
【００８５】 本発明において、細胞に送達される本発明のポリヌクレオチドの適当な量は、
インビボで腫瘍組織１グラム当たり約０．１ナノグラム〜約１ミリグラムであり
、インビトロで５０００細胞当たり約０．１ナノグラム〜約１マイクログラムで
ある。特定のＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチド、またはＰＴＴＧ２をコードす
るポリヌクレオチド、および／または細胞形、および／または治療を受けている
種々の哺乳動物被験体についての適当な量は、日常的な実験で決定することがで
きる。例えば、悪性腫瘍細胞株（例えば、ＭＣＦ−７またはヒーラ）は一般に、
非悪性腫瘍細胞株より効率的に、本発明のＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドに
よりトランスフェクションされる。また個々の癌患者の間で、ある治療処方に対
して大きな変動があり、従って各患者について本発明の方法を、医師が適宜変更
できることは、当業者には理解されるであろう。
【００８６】 ある好適な実施態様においてポリヌクレオチドは、当該分野で公知の適当な発
現ベクター（例えばレンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターな
どのレトロウイルスベクター）を使用して、インビボまたはインビトロで哺乳動
物細胞中に供給することができる（例えば、アンダーソン（Anderson, W.F.）、
「癌に対する遺伝子治療スコア」、Nat. Med. 6(8):862-63 [2000]）。さらに、
ＰＴＴＧのインビボ発現を阻害するために、ＰＴＴＧ−Ｃペプチドをコードする
ＤＮＡのアンチセンス鎖の発現ベクターによる導入が企図される。
【００８７】 適切な発現ベクターは当該分野で公知であり、制御配列（例えば、ＤＮＡの発
現を制御することができるプロモーター領域）に機能的に連結したＤＮＡを発現
することができるベクターがある。すなわち発現ベクターは、組換えＤＮＡまた
はＲＮＡを意味し、適切な宿主細胞に導入されると、挿入されたＤＮＡを発現す
る、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターである。適切な
発現ベクターは、当業者に公知であり、真核細胞および／または原核細胞中で複
製可能なもの、および宿主細胞ゲノム中に組み込まれるエピソームとなるものが
ある。
【００８８】 例えば真核生物発現ベクターには、クローン化ウシパピローマウイルスゲノム
、マウスレトロウイルスのクローン化ゲノム、および真核生物カセット、例えば
ｐＳＶ−２ｇｐｔシステム（ムリガン（Mulligan）とバーグ（Berg）、1979, Na
ture 277:108-114）、オカヤマ−バーグ（Okayama-Berg）クローニングシステム
（Mol. Cell Biol. 2:161-170, 1982)、ｐＧＡＬ４、ｐＣＩ（例えば、ｐＣＩ−
ｎｅｏ）があり、形質転換哺乳動物細胞中で目的のタンパク質の少なくとも一部
の発現を実質的に確保させるジェネティクスインスチチュート（Genetics Insti
tute）により記載された発現クローニングベクター（Science 228:810-815, 198
5）が、利用可能である。
【００８９】 特に好適なものは、哺乳動物細胞のトランスフェクションのために、ＰＴＴＧ
−ＣをコードするＤＮＡセグメントまたはＰＴＴＧ２をコードするＤＮＡセグメ
ントのような、本発明のＰＴＴＧをコードするＤＮＡに連結できる制御成分を含
有するものである。その例には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター
ベースのベクター、例えばｐｃＤＮＡ１（インビトロゲン社（Invitrogen Corp.
）、サンジエゴ、カリホルニア州）、ＭＭＴＶプロモーターベースのベクター、
例えばｐＭＡＭＮｅｏ（クロンテク（Clontech）、パロアルト、カリホルニア州
）とｐＭＳＧ（ファルマシア（Pharmacia）、ピスカタウェイ（Piscataway）、
ニュージャージー州）、およびＳＶ４０プロモーターベースのベクター、例えば
ｐＳＶβ（クロンテク（Clontech）、パロアルト、カリホルニア州）である。反
応ある実施態様において、哺乳動物細胞を異種ＰＴＴＧ特異的核酸で形質導入す
るのに、アデノウイルス−トランスフェリン／ポリリジン−ＤＮＡ（ＴｆＡｄｐ
ｌ−ＤＮＡ）ベクター複合体（ワグナー（Wagner）ら、1992, PNAS, USA, 89:60
99-6103；クリエル（Curiel）ら、1992, Hum. Gene Therapy, 3:147-154；ガオ
（Gao）ら、1993, Hum. Gene Ther., 4:14-24）が使用される。ＴｆＡｄｐｌ−
ＤＮＡ複合体において、本明細書に記載の任意のプラスミド発現ベクターが使用
される。
【００９０】 さらにベクターは、多くのウイルスビリオン（例えばレトロウイルス、ヘルペ
スウイルス、アデノウイルス）によりパッケージングされて、「ウイルスベクタ
ー」を形成することを可能にする、適切なパッケージングシグナルを含有しても
よい。
【００９１】 本明細書において「ウイルス」とは、哺乳動物細胞へのポリヌクレオチドの送
達を促進することができる、任意のウイルスまたはそのトランスフェクション性
断片を意味する。本明細書での使用に適したウイルスの例には、アデノウイルス
、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、例えばヒト免疫不全症ウイルス、レン
チウイルス、おたふくかぜウイルス、およびこれらのウイルスのいずれかのトラ
ンスフェクション性断片、および生殖細胞の細胞質による、およびそこへの放出
による所望のＤＮＡセグメントの取り込みを促進する他のウイルスＤＮＡセグメ
ント、およびこれらの混合物がある。好適なウイルスベクターは、モロニーマウ
ス白血病ウイルスと、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）−モロ
ニーマウス白血病ウイルスと呼ばれるモロニーウイルス由来のレトロウイルスベ
クターである。最も好適なウイルスベクターは、ＨＩＶウイルス由来の偽型（Ｖ
ＳＶ−Ｇ）レンチウイルスベクターである（ナルジニ（Naldini）ら、[1996]）
。またおたふくかぜウイルスは、精原細胞を含む未成熟精子細胞に対する親和性
があるため特に適している。上記ウイルスのすべては、これらを非病原性または
抗原性を小さくするための修飾を必要することがある。しかし他の公知のウイル
スベクターもまた、本発明の範囲において有用である。
【００９２】 ウイルスベースの系は、比較的高レベルの異種核酸を種々の細胞中に導入でき
るという利点を有する。哺乳動物細胞（例えば血管組織セグメント）中に本発明
のＰＴＴＧ特異的ポリヌクレオチドを導入するのに適したウイルスベクターは、
当該分野で公知である。これらのウイルスベクターには、例えば単純ヘルペスウ
イルスベクター（例えば、ゲラー（Geller）ら、1988, Science, 241:1667-1669
）、ワクシニアウイルスベクター（例えば、ピッチニ（Piccini）ら、1987, Met
h. in Enzymology, 153:545-563）；サイトメガロウイルスベクター（マカルス
キー（Mocarski）ら、「ウイルスベクター」中、グルツマン（Y. Gluzman）とヒ
ューズ（S.H. Huges）編、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spr
ing Harbor Laboratory）、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor
）、ニューヨーク州、1988、78-84頁）、モロニーマウス白血病ウイルスベクタ
ー（ダノス（Danos）ら、1980, PNAS, USA, 85:6469）、アデノウイルスベクタ
ー（例えば、ローガン（Logan）ら、1984, PNAS, USA, 81:3655-3659；ジョーン
ズ（Jones）ら、1979, Cell, 17:683-689；バークナー（Berkner）、1988, Biot
echniques, 6:616-626；コッテン（Cotten）ら、1992, PNAS, USA, 89:6094-609
8；グラハム（Graham）ら、1991, Meth. Mol. Biol., 7:109-127）、アデノ関連
ウイルスベクター、レトロウイルスベクター（例えば、米国特許第４，４０５，
７１２号および４，６５０，７６４号を参照）などがある。特に好適なウイルス
ベクターは、アデノウイルスベクターとレトロウイルスベクターである。
【００９３】 本明細書において「レトロウイルスベクター」とは、２つのレトロウイルスＬ
ＴＲの間に位置する異種遺伝子をコードする発現カセットを有する、公知の遺伝
子移動プラスミドを意味する。レトロウイルスベクターは一般に、レトロウイル
スベクターまたはレトロウイルスベクターを鋳型として使用して転写されるＲＮ
Ａが、適切なパッケージング細胞株中のウイルスビリオンにパッケージングされ
ることを可能にする、適切なパッケージングシグナルを含有する（例えば、米国
特許第４，６５０，７６４号を参照）。レトロウイルスベクターには、レンチウ
イルスベクター、例えばＨＩＶ由来ベクターがある。
【００９４】 本発明での使用に適したレトロウイルスベクターは、例えば米国特許出願第５
，２５２，４７９号、およびＷＩＰＯ公報ＷＯ９２／０７５７３、ＷＯ９０／０
６９９７、ＷＯ８９／０５３４５、ＷＯ９２／０５２６６およびＷＯ９２／１４
８２９（参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されており、これ
らは、そのようなレトロウイルスベクターを使用して、核酸をヒト細胞に効率的
に導入する方法を記載する。他のレトロウイルスベクターには、例えばマウス乳
癌ウイルスベクター（例えば、シャックルフォード（Shackleford）ら、1988、P
NAS, USA, 85:9655-9659）などがある。
【００９５】 最も好適な実施態様は、遺伝子治療のために開発され（ナルジニ（Naldini）
ら、「レンチウイルスベクターによる非分裂細胞のインビボ遺伝子送達と安定な
形質導入」、Science 272-267 [1996]）、哺乳動物細胞を形質導入するのに使用
される偽型レトロウイルスベクター系を使用する。この遺伝子送達系は、３プラ
スミド発現系により作成されたレトロウイルス粒子を使用する。この系では、パ
ッケージング構築体は、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前早期プロモー
ターを含有し、すべてのウイルスタンパク質の発現をさせる。この構築体の設計
は、ウイルスパッケージング、逆転写、およびこれらの転写体の組み込みに決定
的に重要なｃｉｓ作用性配列を排除する。第２のプラスミドは、異種エンベロー
プタンパク質（ｅｎｖ）、すなわち水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のＧ糖
タンパク質をコードする。第３のプラスミドである形質導入ベクター（ｐＨＲ’
）は、パッケージング、逆転写および組み込みに必要なヒト免疫不全症ウイルス
（ＨＩＶ）のｃｉｓ作用性配列、ならびに異種相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をクロ
ーニングするためのユニークな制限部位を含有する。例えば、緑の蛍光タンパク
質（ＧＦＰ）、増強緑の蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、青い蛍光タンパク質、黄
色の蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、および／または別のあらかじめ選
択された生成物をコードする遺伝子のような遺伝子選択マーカーは、ＨＲ’ベク
ターのｈＣＭＶプロモーターの下流にクローン化され、転写単位を形成するよう
に機能的に連結される。ＶＳＶ−Ｇ偽型レトロウイルスベクター系は、異なる種
からの細胞を含む広範な細胞に感染することができ、ゲノム中に組み込むことが
できる。一部のレトロウイルス（すなわち、ＨＩＶのようなレンチウイルス）は
、非分裂細胞に感染する能力を有する。レンチウイルスは、異種ＤＮＡ配列に対
する限定された能力を有し、このベクターのサイズ制限は７〜７．５キロ塩基で
ある（ヴェルマ（Verma, I.M.）とソミア（Somia, N.）、「遺伝子治療−約束、
問題および展望」、Nature 389:239-242 [1997]）。レンチウイルスを用いるイ
ンビボの実験は、発現が他のレトロウイルスベクターのような止まることはなく
、脳、筋肉、肝臓または膵島細胞中のインビボ発現は、少なくとも６ヶ月にわた
って維持され、これまで試験した中で最も長い時間である（ヴェルマ（Verma, I
.M.）とソミア（Somia, N.）；アンダーソン（Anderson, WF.）、Human Gene Th
erapy, Nature（増刊）392:25-30 [1998]）。
【００９６】 本発明において「遺伝子送達（またはトランスフェクション）混合物」は、例
えば上記の有効量の取り込み増強物質と混合した適切なベクターと一緒の、セン
スまたはアンチセンス配向の、選択されたＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌク
レオチドを意味する（例えば、クラーク（Clark）ら、「ポリ陽イオンと陽イオ
ン性脂質は、腫瘍細胞でのアデノウイルス形質導入とトランス遺伝子発現を増強
する」、Cancer Gene Ther. 6(5):437-46 [1999]）。例えば、アデノウイルス−
、レトロウイルス−、レンチウイルス−介在形質導入の効率は、感染中にポリブ
レンのような陽イオン性脂質を含めることにより大幅に上昇する。
【００９７】 新生物細胞増殖および／または形質転換を阻害するための本発明の方法のある
ペプチドベースの実施態様は、ＰＴＴＧカルボキシ末端ペプチド（これは、本明
細書において「ＰＴＴＧ−Ｃ」または「ＰＴＴＧ１−Ｃ」、または「ＰＴＴＧ
Ｃ末端ペプチド」と同義である）を含む本発明の組成物を送達することを含む。
【００９８】 他のペプチドベースの実施態様において、本明細書にさらに記載のＰＴＴＧ２
ペプチドが送達される。
【００９９】 「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、本明細
書において同義で使用される。本明細書において「ＰＴＴＧ」という用語は、以
前はまた「下垂体腫瘍特異的遺伝子」（ＰＴＳＧ）タンパク質としても知られて
いた、ＰＴＴＧタンパク質の哺乳動物ファミリーのタンパク質メンバーを意味す
る。
【０１００】 インビボでＰＴＴＧ１タンパク質は、例えばヌードマウス（例えば、ＮＩＨ３
Ｔ３などにトランスフェクションされた時）で腫瘍形成を誘導する能力を有する
ことにより特徴付けられる。ＰＴＴＧタンパク質は、１次転写体の代替スプライ
シングにより作成されたｍＲＮＡによりコードされる天然に存在するその対立遺
伝子を含有し、少なくとも１つの生物活性を保持するその断片をさらに含む。
【０１０１】 「生物学的に活性」または「機能的」という用語は、本発明のＰＴＴＧタンパ
ク質、ペプチド、またはその断片の修飾するのに本明細書で使用される時、ＰＴ
ＴＧに起因する少なくとも１つの機能的特徴を示すポリペプチドを意味する。例
えばＰＴＴＧ１の１つの生物活性は、細胞をインビトロ（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３
など）で形質転換する能力である。ＰＴＴＧ１の別の生物活性は、本明細書に記
載の哺乳動物Ｔリンパ球の活性化を調節する能力である。さらに別のＰＴＴＧ１
の生物活性は、ヌードマウス（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などにトランスフェク
ションされた時）で新生物細胞増殖（例えば、腫瘍発生）を誘導する能力である
。
【０１０２】 一方、本発明のＰＴＴＧ−Ｃペプチド（完全長の未変性のＰＴＴＧタンパク質
とは異なる）およびＰＴＴＧ２タンパク質（本明細書で初めて開示された）は、
優性陰性的にＰＴＴＧ１介在トランス活性化と腫瘍発生を阻害する生物活性を有
する。「優性陰性」は、例えば遺伝子の１つのコピーが突然変異表現型作用を与
えると遺伝的に記載されたものと類似の優性作用を有し、シグナル伝達経路のよ
うな生物学的プロセスを防止するかまたは陰性の影響を有するという意味で陰性
作用を有する。すなわち、ＰＴＴＧカルボキシ末端ペプチドとＰＴＴＧ２ペプチ
ドは、細胞内ＰＴＴＧ１発現および／または内因性ＰＴＴＧ１機能をダウンレギ
ュレートする能力を有する。本発明の方法は、ＰＴＴＧ−ＣまたはＰＴＴＧ２ペ
プチドが、ＰＴＴＧ１発現および／またはＰＴＴＧ１機能に対してその生物活性
を示す特定の生化学的、遺伝的および／または生理学的機構に限定されず、その
ような機構のすべてまたはいずれかは、本発明においてＰＴＴＧ−ＣまたはＰＴ
ＴＧ２の生物活性に寄与することができる。
【０１０３】 ＰＴＴＧペプチドまたはＰＴＴＧ−Ｃペプチドの別の生物活性は、ＰＴＴＧお
よび／またはＰＴＴＧ−Ｃに特異的に結合するポリクローナル抗体およびモノク
ローナル抗体の産生のための免疫原として作用する能力である。すなわち、ＰＴ
ＴＧまたはＰＴＴＧ−Ｃをコードする本発明の核酸は、本明細書に記載の特定の
ＰＴＴＧタンパク質を特異的に認識（すなわち、特異的に結合）する抗体により
特異的に認識されるポリペプチドをコードするであろう。そのような活性は、当
業者に公知の任意の方法により測定される。例えば、ＰＴＴＧ ｃＤＮＡにより
コードされる試験ポリペプチドを使用して、抗体を産生させ、次にこれを、タン
パク質に結合する能力について測定する。もし抗体が試験ポリペプチドとタンパ
ク質に同じ親和性で結合するなら、ポリペプチドは、免疫原性について必要な生
物活性を有する。
【０１０４】 インビトロでもインビトロでも、哺乳動物の乳癌または卵巣癌の新生物細胞増
殖および／または形質転換を阻害する本発明の方法のある実施態様において、有
用なＰＴＴＧ−Ｃペプチドはまた、より大きなＰＴＴＧ−Ｃ分子の任意の断片を
包含し、この断片は、内因性ＰＴＴＧ１発現および／または内因性ＰＴＴＧ１機
能をダウンレギュレートするＰＴＴＧ−Ｃの生物活性を保持している。有用なＰ
ＴＴＧ−Ｃペプチドは好ましくは（しかし、排他的ではない）、約１５〜約６０
の連続的アミノ酸残基の長さであり、ＰＸＸＰモチーフ（ここで、プロリン（Ｐ
）残基の間のＸは、プロリンを含む任意のアミノ酸残基である）を有するペプチ
ドセグメントである１つ以上のプロリンリッチな領域を含む。ＰＴＴＧ−Ｃペプ
チドのプロリンリッチな領域は、ＳＨ３結合部位候補である。
【０１０５】 ＰＴＴＧ１タンパク質分子のＳＨ３結合部位は、細胞内ＰＴＴＧ１発現および
／またはＰＴＴＧ１タンパク質機能を阻害するための、有用な標的である。細胞
内ＰＴＴＧ１発現および／または内因性ＰＴＴＧ１機能のダウンレギュレーショ
ンまたは阻害は、内因性ＰＴＴＧ１タンパク質分子上に通常存在するＳＨ３結合
部位への特異的結合を阻止することにより行われ、こうして、細胞内でのＳＨ３
介在シグナル伝達を妨害する。
【０１０６】 最も好ましくは、ＰＴＴＧ−Ｃペプチドは、「ｈＰＴＴＧ１」または「ＰＴＴ
Ｇ１」タンパク質と呼ぶヒトＰＴＴＧから得られる。未変性のヒトＰＴＴＧ１タ
ンパク質は、２０２アミノ酸の長さであり、以下のアミノ酸配列を有する（下表
７；ヒトＰＴＴＧ１配列 配列番号３のヌクレオチド９５〜７００位によりコー
ドされる、および縮重配列）。ｈＰＴＴＧ１と生物活性を共有する他の哺乳動物
ＰＴＴＧ分子（例えば、ラットＰＴＴＧおよびマウスＰＴＴＧ）もまた、ＰＴＴ
Ｇ１タンパク質の範疇にあると考えられる。
【０１０７】 表７．ｈＰＴＴＧ１アミノ酸配列
【０１０８】 ヒトＰＴＴＧ１ペプチドはまた、配列番号４のアミノ酸配列をコードする任意
の縮重コード配列によりコードされる。 好適なＰＴＴＧ−Ｃは、配列番号４のアミノ酸残基１４７〜２０２に対応する
アミノ酸配列を有する（下表８；配列番号３のヌクレオチド５３３〜７００位ま
たは配列番号１０の１〜１６８位および縮重配列によりコードされる）。
【０１０９】 表８．ヒトＰＴＴＧ−Ｃアミノ酸配列。
【０１１０】 配列番号４のアミノ酸残基１６３〜１７３の間には少なくとも２つのプロリン
リッチな領域が存在し、そしてこれらは、配列番号９のアミノ酸残基１７〜２７
に対応し、配列番号１０のヌクレオチド４９〜８１および縮重配列によりコード
される。プロリンリッチな領域は、配列番号４のアミノ酸残基１６３〜１６７お
よび１７０〜１７３に見い出され、配列番号９のアミノ酸残基１７〜２０および
２４〜２７に対応する。配列番号９の他の有用な小ペプチド断片は、新生物の細
胞増殖および／または細胞の形質転換を阻害するその有効性に関して日常的な手
段により試験される。
【０１１１】 ＰＴＴＧタンパク質の別の例は、下記アミノ酸配列を有するラットＰＴＴＧで
ある（下の表９；配列番号１のヌクレオチド２９３〜８８９位および縮重配列に
よりコードされる）。
【０１１２】 表９．ラットＰＴＴＧアミノ酸配列。
【０１１３】 ラットＰＴＴＧ−Ｃペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基１４４〜１９９、
すなわち、配列番号１６を含む（下の表１０；配列番号１のヌクレオチド７２２
〜８８９位または配列番号１８の１〜１６８位及び縮重配列によりコードされる
）。
【０１１４】 表１０．ラットＰＴＴＧ−Ｃアミノ酸配列。
【０１１５】 配列番号１６のアミノ酸配列は、アミノ酸残基１７〜２０、２４〜２７、およ
び３４〜３７にプロリンリッチな領域を含む（配列番号２のアミノ酸残基１６０
〜１６３、１６７〜１７０、および１７７〜１８０に対応する）。
【０１１６】 ＰＴＴＧタンパク質の別の例は、下記アミノ酸配列を有するマウスＰＴＴＧで
ある（下の表１１；配列番号１５のヌクレオチド３０４〜８９１位および縮重配
列によりコードされる）。
【０１１７】 表１１．マウスＰＴＴＧアミノ酸配列。
【０１１８】 マウスＰＴＴＧ−Ｃペプチドは、配列番号１４のアミノ酸残基１４１〜１９６
、すなわち、配列番号１７を含む（下の表１２；配列番号１５のヌクレオチド７
２４〜８９１位または配列番号１９の１〜１６８位および縮重配列によりコード
される）。
【０１１９】 表１２．マウスＰＴＴＧ−Ｃアミノ酸配列。
【０１２０】 配列番号１７のアミノ酸配列は、アミノ酸残基１７〜２０にプロリンリッチな
領域を含む（配列番号１４のアミノ酸残基１５７〜１６０に対応する）。 好適なＰＴＴＧ−Ｃペプチドは、以下を含む： （Ａ）（配列番号９）、（配列番号１６）、または（配列番号１７）のアミノ
酸配列を有するペプチド；または （Ｂ）（Ａ）の配列のいずれかと少なくとも約６０％の配列相同性を有する哺
乳動物ＰＴＴＧ−Ｃペプチド；または （Ｃ）少なくとも１５の連続的アミノ酸残基を有し、内因性ＰＴＴＧ１発現お
よび／またはＰＴＴＧ１機能をダウンレギュレートするように機能する、（Ａ）
または（Ｂ）のペプチド断片。最も好ましくは、（Ｃ）の断片は、１つ以上のプ
ロリンリッチな領域を含む。
【０１２１】 当業者であれば、他の有用なＰＴＴＧ−Ｃペプチドにおいて、ＰＴＴＧ１また
はＰＴＴＧ−Ｃの生物学的活性を実質的に変質させることなく、多数の前記のＰ
ＴＴＧ、ＰＴＴＧ１、またはＰＴＴＧ−Ｃアミノ酸配列のいずれかの残基を、他
の化学的、立体的および／または電子的に類似した残基で置換できることは認識
できよう。さらに配列番号２、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番
号１６、または配列番号１７（例えば、スプライス変種）中と実質的に同じコー
ド配列を含む、より大きなポリペプチド配列が企図される。
【０１２２】 ヒトＰＴＴＧ２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号６４）は、下の表１２ａ
に列挙される（ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ＡＦ１１６５３８．２；
配列番号６３または配列番号６２のヌクレオチド３８３〜９５８位、および縮重
配列によりコードされる）。
【０１２３】 表１２ａ．ｈＰＴＴＧ２アミノ酸配列。
【０１２４】 好適なＰＴＴＧ２ペプチドは、（Ａ）基本的に（配列番号６４）のアミノ酸残
基１〜１９１、または（配列番号６４）の少なくとも連続的アミノ酸残基１〜１
８０を含むその機能性断片からなるペプチド（すなわち、配列番号６４の連続的
アミノ酸残基１〜１８０、配列番号６４の１〜１８１、配列番号６４の１〜１８
２、配列番号６４の１〜１８３、配列番号６４の１〜１８４、配列番号６４の１
〜１８５、配列番号６４の１〜１８６、配列番号６４の１〜１８７、配列番号６
４の１〜１８８、配列番号６４の１〜１８９、及び配列番号６４の１〜１９０）
である。また、有用なＰＴＴＧ２ペプチドには、（Ｂ）（Ａ）の任意のペプチド
と少なくとも約９５％の配列相同性を有する哺乳動物ＰＴＴＧ２ペプチドが含ま
れる。重要なことには、有用なペプチドは、ｈＰＴＴＧ２のプロリンリッチな領
域（すなわち、ＰＸＸＰモチーフ）を含み、そしてこれらは、配列番号６４のヌ
クレオチド１６３〜１６６位及び配列番号６４のヌクレオチド１７０〜１７３位
に見い出される。
【０１２５】 本明細書において、「実質的に同じアミノ酸配列」という用語は、本明細書に
記載されるアミノ酸（「参照配列」）のいずれかに対して、少なくとも約６０％
の配列相同性または同一性を有し、そして記載される参照配列により定義される
タンパク質に特有な、これらに匹敵する機能的および生物学的活性（特に新生物
細胞増殖および／または形質転換またはその阻害に関して）を保持している、ア
ミノ酸配列を意味する。さらに好ましくは、「実質的に同じアミノ酸配列」を有
するタンパク質は、参照アミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％、さらに好
ましくは約９０％のアミノ酸同一性を有し、約９５％を超えるアミノ酸配列の同
一性が特に好ましい。しかし、スプライス変種として生じるか、または保存的ア
ミノ酸置換により修飾される、記載されるレベルに足りない配列同一性を含むポ
リペプチドもまた、本発明の範囲に包含される。配列相同性の程度は、例えばナ
ショナルセンター・フォー・バイオテクノロジーインフォメーション（ＮＣＢＩ
：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）のジーンバンク（GenBank）データベースのよ
うなデータベースを、パワーブラスト（PowerBLAST）、キューブラスト（QBLAST
）、プサイブラスト（PSI-BLAST）、ファイブラスト（PHI-BLAST）、ギャップト
またはアンギャップトブラストのようなコンピューターアルゴリズム、またはベ
イヤーカレッジオブメディシン（Bayor College of Medicine）サーバー（www.h
gsc.bcm.tmc.edu/seq＿data）を介する「アライン（Align）」プログラムを使用
して、アミノ酸配列類似性検索を行うことにより決定される（例えば、アルトチ
ュル（Altchul, S.F.）ら、「ギャップトブラスト（Gapped BLAST）とプサイブ
ラスト（PSI-BLAST）；新しい世代のタンパク質データベース検索プログラム」
、Nucleic Acids Res. 25(17):3389-402 [1997]；ザング（Zhang, J.）とマデン
（Madden, T.L.）、「パワーブラスト（PowerBLAST）；対話型および自動配列解
析および自動化のための新しいネットワークブラスト（BLAST）アプリケーショ
ン」、Genome Res. 7(6):649-56 [1997]；マデン（Madden, T.L.）ら、「ネット
ワークブラスト（BLAST）サーバーの応用」、Methods Enzymol. 266:131-41 [19
96]；アルトチュル（Altschul, S.F.）ら、「基礎的ローカルアライメント検索
ツール」、J. Mol. Biol. 215(3):403-10 [1990]）。
【０１２６】 また、それぞれＰＴＴＧタンパク質またはＰＴＴＧ−Ｃペプチドという用語に
は、その生物学的に機能性または活性なペプチド類似体が包含される。ペプチド
「類似体」という用語は、本明細書に具体的に示される配列と実質的に同一であ
るアミノ酸残基配列を有する任意のポリペプチドを含むが、ここでは１つ以上の
残基が、機能的に類似した残基で保存的に置換されており、そしてこれらは、そ
れぞれＰＴＴＧ（ＰＴＴＧ１またはＰＴＴＧ２）またはＰＴＴＧ−Ｃの生物学的
活性（特に、本明細書に前記されているように、新生物細胞増殖および／または
形質転換またはその阻害に関して、あるいは哺乳動物のリンパ細胞を免疫抑制す
ることに関して）を模倣する能力を示す。保存的置換の例は、イソロイシン、バ
リン、ロイシンまたはメチオニンのような非極性（疎水性）残基を別のもので置
換、一極性（親水性）残基を別のもので置換（アルギニンとリジンの間、グルタ
ミンとアスパラギンの間、グリシンとセリンの間など）、リジン、アルギニンま
たはヒスチジンのような一塩基性残基を別のもので置換、あるいはアスパラギン
酸またはグルタミン酸のような一酸性残基を別のもので置換を含む。
【０１２７】 「保存的置換」という用語はまた、非誘導体化残基に代わる化学誘導体化残基
の使用を含む（このようなポリペプチドが、必須の生物学的活性を示すならば）
。
【０１２８】 「化学誘導体」とは、機能性側鎖の反応により化学的に誘導体化された、１つ
以上の残基を有する被験ポリペプチドを意味する。このような誘導体化分子は、
例えば、遊離アミノ基が誘導体化されて、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニ
ル基、カルボベンゾオキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル
基またはホルミル基を形成している分子を含む。遊離カルボキシル基が誘導体化
されて、塩、メチルおよびエチルエステルまたは他の型のエステルあるいはヒド
ラジドを形成してもよい。遊離ヒドロキシル基が誘導体化されて、Ｏ−アシルま
たはＯ−アルキル誘導体を形成してもよい。ヒスチジンのイミダゾール窒素が誘
導体されて、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成してもよい。また、化学誘導
体として、２０種の標準アミノ酸の１つ以上の天然アミノ酸誘導体を含むペプチ
ドが含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンをプロリンに置換してもよい；
５−ヒドロキシリジンをリジンに置換してもよい；３−メチルヒスチジンをヒス
チジンに置換してもよい；ホモセリンをセリンに置換してもよい；そしてオルニ
チンをリジンに置換してもよい。本発明のポリペプチドはまた、必須のＰＴＴＧ
またはＰＴＴＧ−Ｃ生物学的活性が維持される限り、配列が本明細書に示される
ポリペプチドの配列に対して、１つ以上の残基の付加および／または欠失のある
任意のポリペプチドを含む。
【０１２９】 新生物細胞増殖および／または形質転換を阻害する本発明の方法のペプチドに
基づく実施態様では、ＰＴＴＧ−Ｃペプチドを含む組成物が細胞に送達される。
細胞に送達すべき本発明のＰＴＴＧ−Ｃペプチドの適切な量は、本発明により、
好ましくはインビボで腫瘍組織１グラム当たり約０．１ナノグラム〜約１ミリグ
ラム、あるいはインビトロで５０００細胞当たり約０．１ナノグラム〜約１マイ
クログラムの範囲である。ＰＴＴＧ−Ｃペプチドの特定の種類および／または細
胞型および／または治療を受けている種々の哺乳動物被験体についての適切な量
は、日常的な実験で決定することができる。
【０１３０】 標的細胞への送達及び移入の方法は、公知である。例えば、本組成物は、好ま
しくは（しかし必須ではなく）ＰＴＴＧ−Ｃペプチドの他に、ＰＴＴＧ−Ｃペプ
チドが細胞性取り込み増強物質と複合体を形成した複合体を含む。例えば、ＰＴ
ＴＧ−Ｃペプチドは、哺乳動物細胞へのＰＴＴＧ−Ｃの送達のために、複合体中
で細胞性取り込み増強および／または移入コンピテントペプチドセグメントに共
有結合することができる；さらに、核内局在ペプチドをこの複合体に含ませて、
ＰＴＴＧ−Ｃを核に向かわせることができる。（例えば、リン（Lin）ら、「生
物学的活性分子を細胞内に移入させる方法」、米国特許第６，０４３，３３９号
）。本明細書において使用されるとき「移入コンピテントペプチド」は、一般に
約１０個〜約５０個以上のアミノ酸残基の長さのアミノ酸の配列であり、そして
疎水性の脂溶性部分を持つように、その多くの（一般的には約５５〜６０％）残
基が疎水性である。この疎水性部分は、シグナルペプチドの共通の主要なモチー
フであり、そしてしばしば細胞から分泌されるタンパク質のシグナルペプチドの
中心部分として認識される。シグナルペプチドは、細胞膜を貫通して、細胞内タ
ンパク質を移出させることができる。本方法において有用なシグナルペプチドは
また、「移入コンピテント」である（すなわち、細胞の外側から細胞の内側へ細
胞膜を貫通することができる）。
【０１３１】 好適な実施態様において、ＰＴＴＧ−ＣペプチドまたはＰＴＴＧ２ペプチドは
、キメラまたは融合タンパク質の第１のＰＴＴＧ−Ｃペプチドセグメントまたは
ＰＴＴＧ２ペプチドセグメントを形成する。キメラまたは融合タンパク質は、少
なくとも第１のＰＴＴＧ−ＣペプチドセグメントまたはＰＴＴＧ２ペプチドセグ
メントと、第２の細胞性取り込み増強および／または移入コンピテントペプチド
セグメントとを含む。キメラまたは融合タンパク質の第２のセグメントは、イン
ビトロであろうとインビボであろうと、ハイブリッド分子を、ＰＴＴＧを過剰発
現する新生物細胞に入り込ませる、シグナルペプチドのような、細胞性取り込み
増強および／または移入コンピテントペプチドセグメントである。ヒト免疫不全
症ウイルス（ＨＩＶ）ＴＡＴタンパク質（シュヴァルツ（Schwarze, S.R.）ら、
「インビボタンパク質形質導入：生物学的活性タンパク質のマウスへの送達」、
Science 285:1569-72 [1999]）のような、第２のペプチドセグメントは、細胞内
に浸潤し、そして一旦細胞に入ると、融合タンパク質のＰＴＴＧ−Ｃペプチドセ
グメントまたはＰＴＴＧ２ペプチドセグメントは、細胞内で活性になって、内因
性ＰＴＴＧ１発現および／またはＰＴＴＧ１機能を阻害する。有用な摂取強化性
ペプチドセグメントの別の例は、カポジ（Kaposi）線維芽細胞増殖因子（Ｋ−Ｆ
ＧＦ）からのシグナルペプチドである。摂取強化性ペプチドセグメントの他の有
用な例は、フェリチンペプチド、またはラクトアルブミン−αペプチド（後者は
、胸部または乳房由来の細胞を標的とするのに特に有用である）からなる。しか
し選択した標的哺乳動物細胞の内側に細胞膜を通って移動できる、任意の細胞性
取り込み増強および／または移入コンピテントペプチドセグメントを本発明によ
り使用することができる。キメラまたは融合タンパク質はまた、第１および第２
セグメントの間に介在するセグメントであってよいリンカーセグメントのような
、追加のセグメントを含んでもよい。追加のセグメントはあるいは、適宜末端セ
グメントであってもよい。
【０１３２】 ＰＴＴＧ−ＣまたはＰＴＴＧ２キメラまたは融合タンパク質の使用を伴う方法
の実施態様において、細胞性取り込み増強および／または移入コンピテントペプ
チドセグメントは、取り込み増強物質であってよい。あるいは、またはさらに、
細胞性取り込み増強物質は、リポフェクチン、リポフェクタミン、ＤＯＴＡＰ、
およびその他の本明細書で前記した、脂質またはリポソーム取り込み増強物質で
あってよい。カチオン性（またはポリカチオン性）脂質またはリポソームはまた
、シグナルペプチドおよび負に荷電した生物学的活性分子と、これらの成分を混
合して、電荷会合させることにより、複合体を形成してもよい。アニオン性リポ
ソームは、一般にリポソーム内に細胞に送達すべき物質を封入するために利用さ
れる。カチオン性リポソーム封入性物質を形成するための手順は、当該分野では
標準的であり、当業者であれば、本発明の複合体を封入するために本明細書にお
いて容易に利用することができる。例えば、本発明のＰＴＴＧ−Ｃペプチド断片
またはＰＴＴＧ２ペプチドと複合体を形成したリポソーム取り込み増強物質は、
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＦｕＧＥＮＥ６などに封入することができ
る。
【０１３３】 インビボで哺乳動物細胞への本発明の組成物（ＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオ
チドまたはＰＴＴＧ−Ｃペプチドまたは活性断片またはＰＴＴＧ２をコードする
ポリヌクレオチドまたはＰＴＴＧ２ペプチドのどれかを含む）の送達に関して、
本組成物は、ヒト被験者を含む治療を必要とする被験哺乳動物に、任意の従来の
送達経路によって投与される。好ましくは、ＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチド
もしくはＰＴＴＧ２をコードするポリヌクレオチド、またはＰＴＴＧ−Ｃもしく
はＰＴＴＧ２ペプチド（細胞性取り込み増強および／または移入コンピテントペ
プチド（例えば、シグナルまたは局在ペプチド）と複合体を形成していようとい
まいと）が、静脈内、動脈内、腹腔内に注入されるか、または腫瘍内への直接注
入により、または微量注入法により細胞内に投与される。腫瘍内への本発明の組
成物の直接注入は、インビボでの乳癌または卵巣腫瘍には好ましい。従来の定位
法は、腫瘍または細胞への直接注入には有用であろう。鼻内、直腸内、または膣
内送達経路による投与もまた有用であろう。カテーテルまたはステントによる投
与もまた、ＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドまたはＰＴＴＧ２をコードするポ
リヌクレオチドまたはＰＴＴＧ−ＣもしくはＰＴＴＧ２ペプチドを含む複合体を
送達するのに有用であろう。
【０１３４】 他の好適な実施態様では、ＰＴＴＧ−ＣまたはＰＴＴＧ２ペプチド、またはＰ
ＴＴＧ−Ｃ−またはＰＴＴＧ２−キメラまたは融合タンパク質を封入する、生分
解性ポリマーのミクロスフェアまたはナノスフェア（例えば、ポリラクチド−コ
−グリコリド；ＰＬＧＡ）の制御放出製剤が、被験哺乳動物に経口投与される。
（例えば、ジュー（Zhu, G.）ら、「注射用ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）
に封入されたタンパク質の安定化」、Nature Biotechnology 18:52-57 [2000]）
。
【０１３５】 ある実施態様では、単離したおよび結晶化したＰＴＴＧ−ＣまたはＰＴＴＧ２
ペプチドを、ペプチドのタンパク分解をインビボで阻害する多官能性架橋剤で架
橋することができる。（ナヴィア（Navia, M.A.）、「架橋タンパク質結晶を経
口投与することによるタンパク質療法の方法」、米国特許第６，０１１，００１
号）。
【０１３６】 哺乳動物の胸部または卵巣細胞の新生物細胞増殖および／または形質転換を阻
害する方法のいくつかの有用な実施態様は、ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌ
クレオチド（いくつかの実施態様では、発現ベクター中に含まれる）、またはＰ
ＴＴＧカルボキシ末端（ＰＴＴＧ−Ｃ）ペプチドまたはその生物学的機能性断片
を細胞に送達するのと同時に、またはその後に、さらに細胞障害性化学療法剤を
投与することを含む。細胞内ＰＴＴＧ−Ｃペプチドの存在が、その細胞を細胞障
害性化学療法剤に対して過剰感作にするため、医師は、細胞障害性化学療法剤の
一般的な有効用量を、従来の用量に比較して、約１０〜１００倍低下させること
ができ、それによって非悪性組織に対する細胞障害性化学療法剤からの傷害を最
小にすることができる。
【０１３７】 その結果、さらにＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドまたはＰＴＴ
Ｇカルボキシ末端（ＰＴＴＧ−Ｃ）ペプチド（またはその生物学的機能性断片）
を含む本発明の組成物を、インビボで被験者の細胞に送達することを特徴とする
方法の他の実施態様では、抗癌薬物療法からの全身性毒性作用は、低い有効用量
の細胞障害性化学療法剤での治療を受ける特定の被験者では低下する。従って、
被験者にとっての生活の質および生存の見込みを改善することができる。
【０１３８】 細胞障害性化学療法剤は、特に限定されないが、パクリタキセル（タキソール
）、５−フルオロウラシル、シスプラチン、カルボプラチン、メソトレキセート
、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、または
特に限定されないが、ブスルファン（１，４−ブタンジオールジメタンスルホネ
ート；ミレラン（Myleran）、グラクソ・ウェルカム（Glaxo Wellcome））、ク
ロランブシル、シクロホスファミド、メルファラン、またはエチルエタンスルホ
ン酸のような細胞障害性アルキル化剤を含む。細胞障害性化学療法剤は、従来法
により、しかし所定の細胞障害性化学療法剤について従来の用量よりも約１０〜
１００倍低い有効用量で、細胞に投与される。細胞障害性化学療法剤の投与は、
生物学的活性ＰＴＴＧ−Ｃペプチドが、細胞内になお存在する限り、本発明の組
成物の送達と同時であっても、またはその後であってもよい。
【０１３９】 ＰＴＴＧ（ＰＴＴＧ１）が介在する新生物細胞増殖および／または形質転換を
阻害する本発明の方法では、哺乳動物細胞は、ＰＴＴＧ１タンパク質をコードす
る遺伝子であるＰＴＴＧ１を過剰発現する細胞である。細胞によるＰＴＴＧ１過
剰発現の検出は本発明の方法の実施に必須でも必要でもないが、過剰発現を含む
ＰＴＴＧ１発現のレベルは、当業者には検出可能である。ＰＴＴＧ１発現の検出
は、例えば、本明細書に記載される本発明の抗ＰＴＴＧ−Ｃ抗体、または他の抗
ＰＴＴＧ特異的抗体を使用して、ＰＴＴＧ１タンパク質の免疫化学的測定法によ
って達成される。あるいは、生物的試料（例えば、組織生検材料）に存在するＰ
ＴＴＧ特異的ｍＲＮＡの増幅を使用して、ＰＴＴＧ１発現を検出することができ
る。これは、ＰＴＴＧ１特異的増幅産物の存在または非存在について、増幅およ
び増幅産物の解析の既知の分子生物学的手法によって行われる。ＰＴＴＧ１遺伝
子特異的増幅産物が存在すれば、この知見は、ＰＴＴＧ１遺伝子の発現を示し、
本明細書に定義される被験者における新生物の細胞内成長の存在の診断となる。
しかし、陰性（ＰＴＴＧ特異的増幅産物がない）の解釈には、解析は好ましくは
ハウスキーピング遺伝子（例えば、β−アクチン、ホスホフルクトキナーゼ（Ｐ
ＦＫ）、グリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、またはホス
ホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子）に特異的な核酸の対照増幅によっ
て行われる。ハウスキーピング遺伝子の発現が試料中に検出されさえすれば、Ｐ
ＴＴＧ遺伝子発現が存在しないことは確実に容認される。使用される増幅および
解析方法の感度の上昇に伴い、正常細胞分裂の検出可能なバックグラウンドから
、新生物、過形成、細胞学的異形成、または前癌状態細胞の成長もしくは増殖を
充分に区別するために、ハウスキーピング遺伝子の発現に対するＰＴＴＧ遺伝子
発現のレベルを測定することは、ますます望ましくなっている。ＰＴＴＧ発現対
ハウスキーピング遺伝子発現の比は、例えば、リアルタイムＰＣＲ法または密度
計測による測定および増幅後の電気泳動バンドの解析によって求められる。ＰＴ
ＴＧ１発現対ハウスキーピング遺伝子発現の比が、正常細胞標準範囲を超えるか
、および／または異常（例えば、新生物性）細胞標準範囲に接近したら、これは
、新生物、過形成、細胞学的異形成、または前癌状態細胞の成長もしくは増殖の
特徴である、ＰＴＴＧ１遺伝子産物の過剰発現を示している。
【０１４０】 生物的試料中のＰＴＴＧ特異的ｍＲＮＡは、適切な増幅方法により増幅される
。例えば、逆転写酵素介在ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を利用して、
ＰＴＴＧ特異的核酸が増幅される。簡単に述べると、２つの酵素を増幅プロセス
において使用するが、試料中のＰＴＴＧ特異的ｍＲＮＡ鋳型からＰＴＴＧ特異的
ｃＤＮＡを転写するために逆転写酵素を使用し、そしてｃＤＮＡを増幅してＰＴ
ＴＧ遺伝子特異的増幅産物を生成するために、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例え
ば、Ｔａｑポリメラーゼ）およびＰＴＴＧ特異的プライマーを使用する。有限サ
イクルのＰＣＲの使用によって、半定量的結果が得られる。（例えば、ゲルファ
ンド（Gelfand）ら、「熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ−高温逆転写による逆転写
」、米国特許第５，３１０，６５２号；５，３２２，７７０号；ゲルファンド（
Gelfand）ら、「温度選択的ＲＴ−ＰＣＲにおける異例のヌクレオチド置換」、
米国特許第５，６１８，７０３号）。
【０１４１】 あるいは、単一酵素のＲＴ−ＰＣＲを利用して、ＰＴＴＧ遺伝子特異的核酸を
増幅する。現在単一反応において逆転写とポリメラーゼ機能の両方を実行するた
めに、単一酵素が存在する。例えば、パーキン・エルマー（Perkin Elmer）の組
換えサームス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）（ｒＴｔｈ）酵素（ロ
シュ・モレキュラー（Roche Molecular））、または他の類似酵素が市販されて
いる。
【０１４２】 リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＰＴＴＧ特異的核酸を増幅することが
できる。簡単に述べると、これは、ＰＴＴＧ遺伝子発現とハウスキーピング遺伝
子（すなわち、正常細胞と異常（例えば、悪性腫瘍）細胞で、ほぼ同じレベルで
発現される遺伝子、例えば、β−アクチン、ホスホフルクトキナーゼ、グリセロ
アルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、またはホスホグリセリン酸キ
ナーゼをコードする遺伝子）の発現との比に基づく、定量的遺伝子解析である。
ＰＴＴＧとハウスキーピング遺伝子の発現の比は、正常細胞と異常細胞の基準と
して日常的に確立されるが、この基準的発現比は、所定の試料中の「ハウスキー
ピング」遺伝子の発現に対するＰＴＴＧ遺伝子の発現が、「正常」であるか「上
昇している」か（後者は、「過剰発現」を示し、新生物、過形成、細胞学的異形
成、または前癌状態細胞の成長もしくは増殖の存在の診断である）を決定する比
較に使用される。この実施態様において、この比は診断にとって重要であり、定
量的遺伝子発現解析を構成する。この実施態様は、パーキン・エルマーＡＢＩプ
リズム７７００（Perkin Elmer ABI Prism 7700）、いわゆるライトサイクラー
（Light Cycler）（ロシュ・モレキュラー（Roche Molecular））、および／ま
たは他の類似装置のような市販の装置により行われる、いわゆるリアルタイム定
量的ＰＣＲを利用する。場合により、例えば、ｒＴｔｈ酵素を利用する単一酵素
ＲＴ−ＰＣＲ法をリアルタイムＰＣＲシステムに使用することができる。好まし
くは、増幅および解析は、尿沈降物試料からのｍＲＮＡの自動抽出、これに続く
リアルタイムＰＣＲ、およびＴａｑＭａｎまたはモレキュラービーコン（Molecu
lar Beacon）プローブのようなプローブを用いる増幅産物の蛍光検出により、自
動式で行われる。一般的にはこの装置は、さらに別の増幅または解析工程なしに
ＰＣＲ中またはその直後に、定量解析結果を提供するソフトウェアを含む。
【０１４３】 あるいは、転写介在増幅（ＴＭＡ）を利用して、ＰＴＴＧ遺伝子特異的核酸を
増幅する。（例えば、カミサンゴ（K. Kamisango）ら、「転写介在増幅およびハ
イブリダイゼーション保護測定法によるＢ型肝炎ウイルスの定量的検出」、J. C
lin. Microbiol. 37(2):310-14 [1999]；ヒロセ（M. Hirose）ら、「転写介在増
幅およびハイブリダイゼーション保護測定法によるテロメラーゼ活性の新しい測
定法」、Clin. Chem. 44(12) 2446-52 [1998]）。ｃＤＮＡの増幅のためにＲＴ
−ＰＣＲを利用するよりも、ＴＭＡではＰＴＴＧ特異的（標的配列）ＲＮＡを認
識するプローブを使用する；次の工程において、プローブ中に組み立てたプロモ
ーター配列から、ＲＮＡポリメラーゼは反復的にｃＤＮＡ中間体を転写し、事実
上、元のＲＮＡ転写体および作成される任意の新しいコピーを、ＲＴ−ＰＣＲの
感度に近い感度レベルで増幅する。この反応は、ＰＣＲのような異なる温度を通
るサイクルではなく、等温（１つの温度）で起こる。
【０１４４】 他の有用な増幅方法は、逆転写酵素介在リガーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＬＣＲ）を
含むが、これは、ＲＴ−ＰＣＲと類似した有用性を持つ。ＲＴ−ＬＣＲは、逆転
写酵素がｍＲＮＡからｃＤＮＡを生成し、次にＤＮＡリガーゼが、標的ｃＤＮＡ
に結合した後、近接した合成オリゴヌクレオチドを連結することに依存する。
【０１４５】 被験体のＰＴＴＧ遺伝子特異的核酸セグメントの増幅は、本明細書に提供され
るように、ＰＴＴＧ遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーおよびプライマ
ーセットを用いて達成される。
【０１４６】 場合により、高処理量解析は、複数のプライマーセット、例えば、ＰＴＴＧ遺
伝子特異的核酸に対するプライマーだけでなく、追加の診断情報が得られるハウ
スキーピング遺伝子（対照）、またはＭＡＧもしくはテロメラーゼのような他の
潜在的診断マーカー（例えば、腫瘍遺伝子）の増幅発現産物に対するプライマー
も同様に利用して、当該分野では公知のＰＣＲ多重化法により達成されるであろ
う。（例えば、リン（Z. Lin）ら、「多数の遺伝子座での複数の遺伝子型測定法
」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(6):2582-87 [1996]；デメトリュー（Demet
riou）ら、「肝臓新生物疾患を引き起こす遺伝子の検出のための方法とプローブ
」、米国特許第５，８６６，３２９号）。
【０１４７】 ハイブリダイゼーション解析は、厳密性の適切な条件下で、相補的ヌクレオチ
ド配列を含む１本鎖ＰＴＴＧ特異的核酸増幅産物とハイブリダイズする、１つ以
上のＰＴＴＧ特異的プローブを利用する、増幅産物を解析する好ましい方法であ
る。ハイブリダイゼーションとは、染色体ＤＮＡにおいて天然に存在する結合と
類似した水素結合による、核酸の相補鎖（すなわち、センス：アンチセンス鎖、
またはプローブ：標的ＤＮＡ）の相互の結合を意味する。増幅産物は、一般的に
はセルロースまたはニトロセルロース膜のような基質上に沈着され、次に標識Ｐ
ＴＴＧ特異的プローブと（場合により電気泳動後に）ハイブリダイズされる。従
来のドットブロット、サザン、ノーザン、もしくは蛍光インサイチュー（ＦＩＳ
Ｈ）ハイブリダイゼーションプロトコール、液中ハイブリダイゼーション、ハイ
ブリダイゼーション保護測定法、または他の半定量もしくは定量ハイブリダイゼ
ーション解析法は、本発明のＰＴＴＧ遺伝子特異的プローブと一緒に便利に利用
される。好ましいプローブに基づくハイブリダイゼーション条件は、約３７℃の
温度、約２０％のホルムアミド濃度、および約５×標準食塩クエン酸液（ＳＳＣ
；２０×ＳＳＣは、３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７
．０を含有する）の塩濃度を特徴とする。このような条件により、完全な相同性
を必要とすることなく、プローブ配列と実質的な類似性を有する配列の同定が可
能になる。「実質的な類似性」という句は、少なくとも５０％の相同性を共有す
る配列を意味する。所定のプローブを標的ＤＮＡとハイブリダイズさせるために
使用される厳密性レベルは、当業者であれば容易に変化させることができる。好
ましくは、ハイブリダイゼーション条件は、プローブとの相同性の程度が低い配
列に対して識別しながら、プローブと少なくとも約６０％の相同性を有する配列
の同定を可能にするように選択される。本明細書において、「プローブ」とは、
１本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または核酸類似体である。本発明のプローブは、
好ましくは７〜５００個のヌクレオチド長、さらに好ましくは１４〜１５０個の
ヌクレオチド長、そして最も好ましくは少なくとも５０個のヌクレオチド長であ
る。本プローブは、適切な厳密性のハイブリダイゼーション条件下で目的のＰＴ
ＴＧ特異的１本鎖核酸にハイブリダイズするように、その長さの少なくとも一部
について、少なくとも７〜１５個の近接するヌクレオチド長のＰＴＴＧ特異的ヌ
クレオチド配列を含む。ＰＴＴＧ特異的ヌクレオチド配列の例は、好ましくは（
しかし必須ではなく）その５’および／または３’コード領域を含む、配列番号
１、３、１０、１５、１８、１９、６２、６３、６５、６６、または６８のいず
れかに記載される。さらに、本発明のＰＴＴＧ特異的ヌクレオチド配列の全ｃＤ
ＮＡコード領域、または配列番号１、３、１０、１５、１８、１９、またはこれ
らのいずれかに相補的なヌクレオチド配列に対応する全配列をプローブとして使
用することができる。例えば、特に限定されないが、配列番号８のような本発明
のオリゴヌクレオチドプライマー配列を含むプローブを、ＰＴＴＧ特異的核酸増
幅産物を検出または解析するためのプローブとして使用するために標識すること
ができる。本発明の単離したＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドのいずれも、プ
ローブまたはプライマーとして使用することができる。
【０１４８】 あるいは、増幅産物を解析するための電気泳動は、従来のスラブまたは毛細管
電気泳動の種々の方法のいずれかを用いて、迅速かつ高感度に行われるが、これ
と共に、医師は場合により、特に限定されないが、放射性核種、ＵＶ吸収または
レーザー励起蛍光を含む、核酸断片検出の任意の促進手段の利用を選択すること
ができる。（カパーニク（K. Kaparnik）ら、「レーザー励起蛍光検出を伴う毛
細管電気泳動によるＩｇＥ受容体遺伝子における（ＣＡ）１８ミクロサテライト
リピートの迅速検出」、Electrophoresis 19(2):249-55 [1998]；イノウエ（H.
Inoue）ら、「電界強度の段階的勾配を用いる毛細管電気泳動によるＤＮＡ配列
決定産物の強化分離法」、J. Chromatogr. A. 802(1):179-84 [1998]；ドビチ（
N.J. Dovichi）、「毛細管電気泳動によるＤＮＡ配列決定」、Electrophoresis
18(12-13):2393-99 [1997]；アラカワ（H. Arakawa）ら、「レーザー励起蛍光検
出を伴う毛細管電気泳動による１本鎖コンフォメーション多形の解析」、J. Pha
rm. Biomed. Anal. 15(9-10):1537-44 [1997]；ババ（Y. Baba）、「毛細管電気
泳動による疾患惹起遺伝子およびＤＮＡに基づく薬物の解析。ヒトの疾患のＤＮ
Ａ診断および遺伝子治療に向かって」、J. Chromatogr. B. Biomed. Appl. 687(
2):271-302 [1996]；チャン（K.C. Chan）ら、「短い毛細管を用いるＤＮＡ断片
の高速電気泳動分離」、J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 695(1):13-15
[1997]）。プローブは、当該分野において公知の方法により標識することができ
る。
【０１４９】 本明細書において、種々の文法上の語形での「標識」、「トレーサー」、およ
び「指示手段」という用語は、検出可能なシグナルの生成に直接または間接に関
係する単一原子および分子を意味する。任意の標識または表示手段は、ＰＴＴＧ
特異的プローブ、プライマー、または増幅産物、またはＰＴＴＧタンパク質、ペ
プチド、ペプチド断片、または抗ＰＴＴＧ抗体分子に結合させることができる。
この標識は、単独で、または追加の試薬と共に使用することができる。このよう
な標識は、これら自体当該分野において公知である。この標識は、変性すること
なく抗体または抗原に化学結合して、有用な免疫蛍光トレーサーである蛍光色素
（染料）を形成する蛍光標識剤であってよい。免疫蛍光解析法の説明は、「道具
としての抗体」、マーチャロニス（Marchalonis）ら編、ジョン・ワイリー＆サ
ンズ社（John Wiley & Sons, Ltd.）中のデルカ（DeLuca）の「免疫蛍光解析」
、189-231 (1982)（これは、参照することにより本明細書に組み込まれる）に見
い出される。特に限定されないが、ＳＹＢＲグリーンＩ、Ｙ１０−ＰＲＯ−１、
チアゾールオレンジ、Ｈｅｘ（すなわち、６−カルボキシ−２’，４’，７’，
４，７−ヘキサクロロフルオレセイン）、ピコグリーン、エダン（edans）、フ
ルオレセイン、ＦＡＭ（すなわち、６−カルボキシフルオレセイン）、またはＴ
ＥＴ（すなわち、４，７，２’，７’−テトラクロロ−６−カルボキシフルオレ
セイン）を含む多様な蛍光染料のいずれも、場合により標識として使用すること
ができる。（例えば、スケイズヴォル（J. Skeidsvoll）とウエランド（P.M. Ue
land）、「モノマー染料ＳＹＢＲグリーンＩを用いるレーザー励起蛍光検出を伴
う毛細管電気泳動による２本鎖ＤＮＡの解析」、Anal. Biochem. 231(20):359-6
5 [1995]；イワハナ（H. Iwahana）ら、「ＰＣＲ産物の内部蛍光標識法を用いる
複数の蛍光ベースのＰＣＲ−ＳＳＣＰ解析」、Biotechniques 21(30):510-14, 5
16-19 [1996]）。
【０１５０】 標識はまた、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダー
ゼ、β−ガラクトシダーゼなどのような酵素であってもよい。あるいは、放射性
核種が標識として利用される。基体への標識の結合、すなわち、核酸プローブ、
抗体、ポリペプチド、およびタンパク質の標識法は、当該分野において公知であ
る。例えば、本発明の抗体は、培地に提供される放射標識アミノ酸の代謝的摂取
により標識することができる。例えば、ガルフレ（Galfre）ら、Meth. Enzymol.
, 73:3-46 (1981)を参照のこと。活性化官能基によるタンパク質結合またはカッ
プリングの従来手段は特に適用可能である。例えば、オーラミーズ（Aurameas）
ら, Scand. J. Immunol., Vol. 8, 増刊. 7:7-23 (1978)、ロッドウェル（Rodwe
ll）ら, Biotech., 3:889-894 (1984)、および米国特許第４，４９３，７９５号
を参照されたい。
【０１５１】 本発明のさらに別の実施態様では、本発明のＰＴＴＧポリペプチドとの特異的
反応性を有する抗ＰＴＴＧ抗体が提供される。ＰＴＴＧタンパク質、ＰＴＴＧ−
Ｃペプチド、またはＰＴＴＧ−Ｃの免疫原性断片を選択的または特異的に結合す
る抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、またはＦ（ｖ）断片
もまた、「抗体」の定義に包含される。
【０１５２】 本発明の抗体は、ＰＴＴＧポリペプチド、タンパク質またはその一部（ＰＴＴ
Ｇ−ＣペプチドまたはＰＴＴＧ−Ｃの免疫原性断片など）を抗原として使用して
、当該分野において既知の方法により産生することができる。例えば、ポリクロ
ーナルおよびモノクローナル抗体は、例えば、ハーロー（Harlow）とレーン（La
ne）、「抗体：実験室マニュアル」（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー（Cold Spring Harbor Laboratory）[1988]）（これは、参照することに
より本明細書に組み込まれる）に記載されるように、当該分野において公知の方
法により産生することができる。単離もしくは精製ＰＴＴＧタンパク質、ＰＴＴ
Ｇ−Ｃペプチド、および免疫原性ＰＴＴＧ−Ｃ断片は、このような特異的抗体を
生成する上で免疫原として使用することができる。
【０１５３】 ＰＴＴＧタンパク質、ＰＴＴＧ−Ｃペプチド、またはそのポリペプチド類似体
は、例えば、本明細書に記載される組換え発現系、沈降、ゲル濾過、イオン交換
、逆相および親和性クロマトグラフィーなどを含む、種々の既知の生化学的手段
により精製または単離される。他の公知の方法は、ドイッチャー（Deutscher）
ら、「タンパク質精製へのガイド：酵素学における方法、１８２巻」、（アカデ
ミック出版（Academic Press）、[1990]）（これは、参照することにより本明細
書に組み込まれる）に記載されている。単離ＰＴＴＧタンパク質またはＰＴＴＧ
−Ｃペプチドは、通常は天然のインビボ環境に関連する細胞成分および／または
混入物を含まない。
【０１５４】 単離ＰＴＴＧ（ＰＴＴＧ１、ＰＴＴＧ２、またはＰＴＴＧ３）タンパク質また
はＰＴＴＧ−Ｃペプチドもまた、化学合成することができる。例えば、合成ポリ
ペプチドは、製造業者が提供する化学を利用して、アプライド・バイオシステム
ズ社（Applied Biosystems, Inc.）のモデル４３０Ａまたは４３１Ａ自動ペプチ
ド合成機（フォスターシティー、カリホルニア州）を使用して産生することがで
きる。あるいは、ＰＴＴＧは、天然の供給源から単離または精製することができ
、そしてＰＴＴＧ−Ｃペプチドは、ＰＴＴＧから（またはキメラタンパク質から
）適切なプロテアーゼを使用して単離することができる。
【０１５５】 あるいは、ＰＴＴＧ（例えば、ＰＴＴＧ１、ＰＴＴＧ２、またはＰＴＴＧ３）
またはＰＴＴＧ−Ｃポリペプチドは、組換え法により誘導、例えば、本明細書に
記載される本発明の方法により、ＰＴＴＧ−Ｃをコードするポリペプチドまたは
ＰＴＴＧ２をコードするポリペプチドを発現するように遺伝子修飾された哺乳動
物細胞により産生することができる。組換え法は、例えば、サムブルーク（Samb
rook）ら、上記、(1989)に記載されるように、公知である。本発明のＰＴＴＧま
たはＰＴＴＧ−Ｃポリペプチドを調製するための手段の例は、目的のＰＴＴＧタ
ンパク質またはＴＰ−Ｃペプチドをコードする核酸を、細菌細胞、酵母細胞、両
生類細胞（すなわち、卵母細胞）、または哺乳動物細胞（本明細書に後述される
本発明の哺乳動物宿主細胞など）のような適切な宿主細胞で、当該分野において
公知の方法を使用して発現させ、そして発現したポリペプチドを再度公知の方法
を使用して回収することである。
【０１５６】 目的の種々のＰＴＴＧ−Ｃ断片の免疫原性は、日常的なスクリーニングにより
測定される。あるいは、合成ＰＴＴＧ（例えば、ＰＴＴＧ１、ＰＴＴＧ２、また
はＰＴＴＧ３）またはＰＴＴＧ−Ｃポリペプチドまたはその断片を調製（市販の
合成機を使用して）して、免疫原として使用することができる。アミノ酸配列は
、当該分野において公知の方法により解析して、これらが、対応するポリペプチ
ドの疎水性ドメインをコードするか、または親水性ドメインをコードするかを決
定することができる。キメラ、ヒト化、ＣＤＲグラフトまたは二官能性抗体のよ
うな改変抗体もまた、当該分野において公知の方法により産生することができる
。このような抗体はまた、ハイブリドーマ、化学合成または組換え法（例えば、
サムブルーク（Sambrook）ら、上記、およびハーロー（Harlow）とレーン（Lane
）、上記に記載される）により産生することができる。抗ペプチドおよび抗融合
タンパク質抗体の両方とも使用することができる。（例えば、バホウス（Bahout
h）ら、Trends Pharmacol. Sci. 12:338 [1991]；アウスベル（Ausubel）ら、「
分子生物学における現行プロトコール」（ジョン・ワイリーとサンズ（John Wil
ey and Sons）、これは、参照することにより本明細書に組み込まれる）、ニュ
ーヨーク州、[1989]を参照のこと）。
【０１５７】 こうして産生される抗体は、特に、組織または血管内液のような、哺乳動物（
好ましくはヒト）の生物的試料中に存在するＰＴＴＧタンパク質、ＰＴＴＧ−Ｃ
ペプチド、またはその免疫原性断片のレベルを検出するために、診断または検定
の方法および系において使用することができる。これは、例えば、ＰＴＴＧ発現
のレベルを測定するのに有用である。このような抗体はまた、本発明のＰＴＴＧ
タンパク質またはＰＴＴＧ−Ｃペプチドの免疫親和性または親和性クロマトグラ
フィー精製のために使用することができる。さらに、細胞の表面上または細胞内
（核内など）のいずれかのＰＴＴＧタンパク質またはＰＴＴＧ−Ｃペプチドの存
在を検出するための方法が、本明細書において企図されるが、この方法は、細胞
をＰＴＴＧタンパク質またはＰＴＴＧ−Ｃペプチドに特異的に結合する抗体と、
ＰＴＴＧタンパク質またはＰＴＴＧ−Ｃペプチドへの抗体の特異的結合が可能な
条件下で接触させて、ＰＴＴＧまたはＰＴＴＧ−Ｃに結合した抗体の存在を検出
し、それによって細胞の表面上または細胞内のＰＴＴＧまたはＰＴＴＧ−Ｃポリ
ペプチドの存在を検出することを特徴とする。このようなポリペプチドの検出に
関して、抗体は、インビトロ診断もしくは測定方法、またはインビボイメージン
グ方法のために使用することができる。
【０１５８】 試料中の標的ＰＴＴＧまたはＰＴＴＧ−Ｃポリペプチドのインビトロ検出に有
用な免疫学的方法は、例えば、当該分野において公知のＥＬＩＳＡ、免疫蛍光測
定法（ＩＦＡ）、パンデックス（Pandex）微蛍光測定法、凝集測定法、フローサ
イトメトリー、血清診断測定法および免疫組織化学染色法を含む。例えば、検出
可能なマーカーを、直接または間接的に抗体に結合させることができる。有用な
マーカーは、例えば、放射性核種、酵素、蛍光原、色素原、および化学発光標識
物を含む。
【０１５９】 本発明の抗ＰＴＴＧまたは抗ＰＴＴＧ−Ｃ抗体はまた、本明細書において、生
存動物、ヒト、もしくは生物学的組織、またはそこから単離された液体中のＰＴ
ＴＧ１ポリペプチドの活性を調節するための使用が企図される。従って、担体と
、本発明のＰＴＴＧポリペプチドへの結合から、天然のリガンドまたは他のＰＴ
ＴＧ結合タンパク質を阻止するのに有効な、ＰＴＴＧポリペプチドに対する特異
性を有するある量の抗体を含む組成物が本明細書において企図される。例えば、
細胞の表面上に存在し、そして配列番号２、４、９、１４、１６、または１７に
示されるアミノ酸配列を含むＰＴＴＧポリペプチドの細胞表面エピトープのアミ
ノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する、ＰＴＴＧ１ポリペプチド分子の
エピトープに対するモノクローナル抗体は、この目的に有用であろう。
【０１６０】 本発明はまた、本明細書に記載の本発明のＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチド
含有組成物を含む、リンパ球および非リンパ球細胞（例えば、胸部または卵巣細
胞）を含む、トランスフェクション、形質導入、またはそれ以外の形質転換され
た哺乳動物宿主細胞に関する。本発明の細胞は、被験哺乳動物に含まれるか、ま
たはインビトロで培養される。好適な実施態様には、本発明のＰＴＴＧ−Ｃ関連
ポリヌクレオチドを転写単位中に含む、発現ベクターを含む哺乳動物宿主細胞が
含まれる。好ましくは、この細胞により生成物が発現されるが、この生成物は、
最も好ましくは（しかし必須ではなく）、ＰＴＴＧ１介在新生物性細胞増殖およ
び／または形質転換をダウンレギュレートするように機能する、生物学的活性Ｐ
ＴＴＧ−Ｃペプチドである。適切な宿主細胞をトランスフェクション、形質導入
、または形質転換するインビトロおよびインビボ方法は、一般的に当該分野で公
知である。細胞をインビトロで培養する方法も公知である。トランスフェクショ
ン、形質導入、または形質転換法の例には、例えば、ウイルスベクターを利用す
る感染（例えば、米国特許第４，４０５，７１２号および４，６５０，７６４号
を参照のこと）、リン酸カルシウムトランスフェクション（米国特許第４，３９
９，２１６号および４，６３４，６６５号を参照のこと）、デキストラン硫酸ト
ランスフェクション、電気穿孔法、リポフェクチン（例えば、米国特許第４，３
９４，４４８号および４，６１９，７９４号を参照のこと）、サイトフェクショ
ン（cytofection）、微粒子衝撃などを含む。異種核酸は、場合により染色体外
（すなわち、エピソームの）維持を可能にする配列を含んでもよいか、または異
種ＤＮＡは、宿主のゲノムへの組み込みを引き起こしてもよい（宿主細胞におけ
る安定な維持を確保するための代替手段として）。
【０１６１】 本発明はさらに、ＰＴＴＧポリペプチド（特に、本明細書に前記される、ＰＴ
ＴＧ−Ｃペプチドおよびその機能性断片）をコードする外因性核酸を発現できる
本発明の哺乳動物細胞を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。本
明細書において、「外因性核酸」という用語は、宿主本来のものではないか、ま
たは本来の環境以外での宿主に（例えば、遺伝子改変ＤＮＡ作成体の一部として
）存在する、核酸配列を意味する。トランスジェニック非ヒト哺乳動物を作り出
す方法は、当該分野において公知である。一般的には、受精卵の前核にインビト
ロで外来の、すなわち異種もしくは同種のＤＮＡもしくはハイブリッドＤＮＡ分
子を微量注入して、次に微量注入した受精卵を偽妊娠の雌の生殖管に移して分娩
まで妊娠させる。（例えば、クリムペンフォート（P.J.A. Krimpenfort）ら、「
成熟Ｔ細胞が涸渇したトランスジェニックマウスおよびトランスジェニックマウ
スの作成方法」、米国特許第５，１７５，３８４号および５，４３４，３４０号
；クリムペンフォート（P.J.A. Krimpenfort）ら、「成熟リンパ球系細胞が涸渇
したトランスジェニックマウス」、米国特許第５，５９１，６６９号）。あるい
は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の産生方法は、発現ベクターを用いる雌
性または雄性生殖細胞の遺伝子修飾でもよく、次にこの生殖細胞を使用して接合
体を産生し、これを妊娠、分娩させる。生じる子を所望の表現型に関して選択さ
れる。これらの子は、さらに繁殖またはクローン化して、所望の表現型を持つト
ランスジェニック動物の追加の世代を生みだすことができる。本発明のトランス
ジェニック非ヒト哺乳動物は、好ましくは（しかし必須ではなく）、新生物細胞
増殖および／または形質転換を阻害する方法の実施に使用するために採取できる
、比較的大量のＰＴＴＧ−Ｃペプチドを産生する、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマな
どのような大型動物である。
【０１６２】 最も好ましくは、トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、本発明のＰＴＴＧ−
Ｃペプチドが分泌される乳汁を産生する雌である。そしてＰＴＴＧ−Ｃペプチド
は、この乳汁から精製される。（例えば、クリスタ（Christa, L.）ら、「乳汁
分泌トランスジェニックマウスの乳腺におけるヒト肝癌−腸−膵／膵関連タンパ
ク質（ＨＩＰＰＡＰ）遺伝子の高発現、乳汁への分泌およびＨＩＰ／ＰＡＰレク
チンの精製」、Eur. J. Biochem. 267(6):1665-71 [2000]；ソボレブ（Sobolev,
A.S.）ら、「マウスおよびヒツジ乳腺のインビボでの受容体介在性トランスフ
ェクション」、J. Biol. Chem. 273(14):7928-33 [1998]；チャン（Zhang, K.）
ら、「ヒト第IX凝固因子のための乳腺特異的発現ベクターの作成およびそのヤギ
乳汁への分泌発現」、Chin. J. Biotechnol. 13(4):271-6 [1997]；クラーク（C
lark, A.J.）、「トランスジェニック動物の乳腺における遺伝子発現」、Bioche
m. Soc. Symp. 63:133-40 [1998]；ニーマン（Niemann, H.）ら、「トランスジ
ェニックヒツジの乳腺におけるヒト第VIII血液凝固因子の発現」、Transgenic R
es. 8(3):237-47 [1999]）。
【０１６３】 好適なトランスジェニック雌哺乳動物を入手するための方法は、一般的には、
例えば適切なβ−ラクトグロブリンプロモーターにより調節される転写単位内に
、ＰＴＴＧ−Ｃペプチドをコードするポリ核酸が、乳分泌シグナルペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドと、キメラとして結合している発現ベクターでのトラ
ンスフェクションを利用するものであるが、このため乳特異的発現によって、キ
メラポリペプチドが得られ、ここから所望のＰＴＴＧ−Ｃペプチドセグメントが
タンパク質分解で取りだされて精製される。
【０１６４】 本発明はまた、新生物の細胞増殖処理用キットに関する。このキットは、新生
物細胞増殖および／または形質転換を阻害する本発明の方法を実施するのに有用
である。このキットは、少なくとも１つの本発明の組成物を含む材料または成分
の集合である。すなわち、いくつかの実施態様では、このキットは、前記のよう
に、ＰＴＴＧ−Ｃ関連ポリヌクレオチドおよび／またはＰＴＴＧ−Ｃペプチドを
含む。他の実施態様では、このキットは基本的に、（配列番号６４）の少なくと
もアミノ酸残基１〜１８０を含む（配列番号６４）のアミノ酸残基１〜１９１、
またはその断片よりなるペプチドのような、哺乳動物ＰＴＴＧ２ペプチドをコー
ドするＤＮＡセグメントを含むポリヌクレオチド、例えば、（配列番号６３）よ
りなるポリヌクレオチドもしくはその縮重配列、またはｈＰＴＴＧ２と少なくと
も約９５％の配列相同性を有する哺乳動物ＰＴＴＧ２ペプチドまたは機能性断片
をコードするポリヌクレオチドを含む。あるいは、このキットは基本的に、（配
列番号６４）の少なくともアミノ酸残基１〜１８０を含む（配列番号６４）のア
ミノ酸残基１〜１９１よりなるペプチドもしくはその断片、または（配列番号６
４）の少なくともアミノ酸残基１〜１８０を含む、ｈＰＴＴＧ２と少なくとも約
９５％の配列相同性を有する哺乳動物ＰＴＴＧ２ペプチドもしくはその機能性断
片を含む、組成物を含んでもよい。
【０１６５】 本発明のキットに形成される成分の正確な性質は、その意図される目的に依存
する。例えば、キットのいくつかの実施態様は、培養哺乳動物細胞を治療する目
的のために設定される。他の実施態様は、インビボで哺乳動物細胞を治療する目
的のために、すなわち治療を必要とする被験哺乳動物（例えば、悪性腫瘍の被験
動物）を治療するために設定される。好適な実施態様は、乳癌または卵巣癌の治
療に向けられる。最も好適な実施態様では、キットは特にヒト被験者の治療を目
的として設定される。ＰＴＴＧ２ペプチドまたはＰＴＴＧ２ペプチド断片または
ＰＴＴＧ２ペプチドまたは断片をコードするポリヌクレオチドを含む実施態様、
キットはまた、新生物細胞増殖および／または形質転換を阻害するための組成物
の使用説明書を含む。
【０１６６】 キットのいくつかの実施態様は、ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリペプチドに
機能的に連結した培養ＨＩＶベクターを含む組成物；およびＴリンパ球の新生物
細胞増殖および／または形質転換を阻害するための該組成物の使用説明書を含む
、新生物細胞増殖および／または形質転換の治療のためのキットを含む。
【０１６７】 また、本発明には、ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドに機能的に
連結した培養ＨＩＶベクターを含む組成物；およびＴリンパ球の活性化を阻害す
る組成物の使用説明書を含む、免疫抑制療法のためのキットが含まれる。
【０１６８】 使用説明書がキットに含まれる。「使用説明書」は、一般的には、試薬濃度ま
たは少なくとも１つの測定法パラメーター（例えば、一般的には意図される目的
のための、混合すべき試薬と試料の相対量、試薬／試料混合物の維持時間、温度
、緩衝液条件など）を説明する具体的な表現を含む。
【０１６９】 場合により、キットはまた、希釈液、緩衝液、薬剤学的に許容される担体、検
体容器、シリンジ、ステント、カテーテル、ピペット操作用または測定用器具、
試料の濃縮、沈降、または分画用の用具、または本発明の抗体、および／または
プライマーおよび／または対照用プローブのような、他の有用な成分を含む。
【０１７０】 キットに集成される材料または成分は、その操作性および有用性を維持する任
意の便利かつ適切な方法で貯蔵されて、医師に提供することができる。例えば、
成分は、溶解、脱水、または凍結乾燥された形態にすることができる；これらは
、室温、冷蔵温度または凍結温度で提供することができる。
【０１７１】 成分は、一般的には適切なパッケージング材料に入れられる。本明細書におい
て、「パッケージング材料」という用語は、本発明の核酸プローブまたはプライ
マーなどのようなキットの内容物を収容するために使用される１つ以上の物理構
造を意味する。パッケージング材料は、公知の方法によって、好ましくは無菌で
混入物を含まない環境を提供するように作成される。
【０１７２】 キットに利用されるパッケージング材料は、ポリヌクレオチドに基づくか、ま
たはペプチドに基づく系で通常使用されるものである。本明細書において、「パ
ッケージ」という用語は、個々のキット成分を保持することができる、ガラス、
プラスチック、紙、箔などのような、適切な固体マトリックスまたは材料を意味
する。すなわち、例えば、パッケージは、核酸またはペプチド成分を含む適切な
量の本発明の組成物を入れるために使用されるガラスバイアルであってよい。パ
ッケージング材料は、一般に内容物および／またはキットの目的および／または
その成分を表示する外側のラベルを有する。
【０１７３】 本発明は、以下の非限定例を参照することにより、さらに詳細に説明されるが
、これらは他に記載がなければ、例えば、マニアティス（Maniatis）ら、「分子
クローニング：実験室マニュアル」、コールドスプリングハーバーラボラトリー
プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、コールドスプリングハーバ
ー、ニューヨーク州、米国(1982)；サムブルーク（Sambrook）ら、「分子クロー
ニング：実験室マニュアル（第２版）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、コールドスプリ
ングハーバー、ニューヨーク州、米国(1989)；デービス（Davis）ら、「分子生
物学における基本的方法」、エルゼビア・サイエンス出版（Elsevier Science P
ublishing, Inc.）、ニューヨーク州、米国(1986)；または「酵素学における方
法：分子クローニング法へのガイド、第１５２巻」、バーガー（S.L. Berger）
とキマール（A.R. Kimmerl）編、アカデミック出版（Academic Press Inc.）、
サンジエゴ、米国(1987)に記載されるように、標準法を用いて実行した。
【０１７４】 （例） 例１：ＰＴＴＧ ｃＤＮＡの単離 下垂体腫瘍発生に関与する分子機構を解明するために、差別ディスプレイ（di
fferential display）ＰＣＲを使用して、下垂体腫瘍細胞中で差別的に発現され
るｍＲＮＡを同定した（例えば、ライジンガー（Risinger）ら、1994, Molec. C
arcinogenesis, 11:13-18；およびクー（Qu）ら、1996, Nature, 380:243-247）
。ＧＣおよびＧＨ4 下垂体腫瘍細胞株（それぞれ、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−８２と＃
ＣＣＬ−８２．１）、および骨原性肉腫細胞株ＵＭ１０８（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−
１６６３）を、１０％胎児牛血清補足ＤＭＥＭ中で増殖させた。正常なスプラー
グ−ドーレイ（Sprague-Dawley）ラットの下垂体を、新たに切り出した。アール
エヌイージー（RNeasy）（登録商標）キット（キアゲン（Qiagen））を使用して
、製造業者の説明書に従って、組織培養細胞と下垂体組織から総ＲＮＡを抽出し
た。ＲＮＡ調製物中の微量のＤＮＡ汚染物質を、ＤＮａｓｅ１（ゲンハンターコ
ーポレーション（GenHunter Corportion））消化により除去した。ＭＭＬＶ逆転
写酵素（ゲンハンターコーポレーション（GenHunter Corportion））と３つの固
定プライマー（anchored primers）の１つ（ゲンハンターコーポレーション（Ge
nHunter Corportion））を使用して、２００ngの総ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し
た。作成したｃＤＮＡを、ＰＣＲディスプレイで使用した。
【０１７５】 ３つの下流の固定プライマーＡＡＧＣＴ11Ｎ（配列番号１３；ここで、ＮはＡ
、Ｇ、またはＣでもよい）を、ＰＣＲディスプレイのための４０個の上流の任意
のプライマーとともに使用した。１２０個のプライマー対を使用して、下垂体腫
瘍対正常下垂体でｍＲＮＡ発現をスクリーニングした。逆転写反応から作成した
ｃＤＮＡの１０分の１を、アンプリタク（AmpliTaq）ＤＮＡポリメラーゼ（パー
キンエルマー（Perkin Elmer））を使用して、１０mMトリス（ｐＨ８．４）、５
０mM ＫＣｌ、１．５mM ＭｇＣｌ2 、０．００１％ゼラチン、２μM ｄＮＴ
Ｐ、０．２μMの各プライマー、および１μl［32Ｓ］ｄＡＴＰを含有する総量２
０μl中で増幅した。ＰＣＲサイクルは、９４℃で３０秒、４０℃で２分、７２
℃で３０秒を４０サイクル行った。生成物を、６％配列決定ゲルで分離し、乾燥
ゲルを、コダックフィルムに２４〜４８時間露出した。
【０１７６】 現像後、下垂体腫瘍と正常下垂体から増幅したＤＮＡ断片を比較した。下垂体
腫瘍に固有のバンドをゲルから切り出し、１００μlの水の中で沸騰させ、グリ
コーゲン（ゲンハンターコーポレーション（GenHunter Corportion））の存在下
でエタノール沈殿させて、ＤＮＡを抽出した。元々のプライマーセットと同じサ
イクル条件（ただし、ｄＮＴＰ濃度は２０μMに上げた）を使用してＤＮＡを再
増幅した。反応生成物を、１％アガロースゲルにかけ、臭化エチジウムで染色し
た。ゲルからバンドを切り出し、溶出（キアゲン（Qiagen））し、ＴＡベクター
（インビトロゲン（Invitrogen））にクローン化し、シーケナーゼ（ユーエスビ
ー（USB））を使用して配列決定した。上記ＰＣＲ測定法の１２０プライマー対
を使用して、下垂体腫瘍細胞中で差別的に発現されたと思われる１１個のＤＮＡ
バンドを同定した。ＰＣＲ産物をプローブとして使用してノーザンブロット解析
により、これらのバンドを評価した。
【０１７７】 ノーザンブロット解析のために、２０μgの総ＲＮＡを１％アガロースゲルで
分画し、ナイロン膜にブロットし、クイックハイブ（Quickhyb）溶液（ストラタ
ジーン（Stratagene））を使用して、ランダムプライムドプローブとハイブリダ
イズさせた。洗浄後、膜をコダックフィルムに６〜７２時間露光させた。ノーザ
ンブロット解析の結果として、２つのバンドについて下垂体腫瘍特異的シグナル
が検出された。ＤＮＡ配列解析により、１つの配列はインスリン誘導性増殖応答
タンパク質であり、もう１つの３９６塩基対断片（固定プライマーとして５’−
ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ−３’［配列番号１１］、そして任意のプラ
イマー５’−ＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣ−３’［配列番号１２］を使用して増
幅した）は、ジーンバンク（GenBank）中の既知の配列と、全く相同性を示さな
かった。この３９６断片は、下垂体腫瘍細胞中で約１．３kbの高度に発現された
ｍＲＮＡを検出したが、正常下垂体や骨原性肉腫細胞中では検出されなかった。
【０１７８】 例２：ＰＴＴＧをコードするｃＤＮＡ配列の性状解析 この下垂体腫瘍特異的ｍＲＮＡをさらに性状解析するために、ラット下垂体腫
瘍から単離されたｍＲＮＡを使用してｃＤＮＡライブラリーを構築した。ポリＡ
＋ＲＮＡを下垂体腫瘍ＧＨ4 細胞から、メッセンジャーＲＮＡ単離キット（スト
ラタジーン（Stratagene））を使用して製造業者の説明書に従って単離し、これ
を使用して、ザップエクスプレス（ZAP Express）ベクター（ストラタジーン（S
tratagene））中でＤＮＡライブラリーを構築した。このｃＤＮＡライブラリー
は、ザップエクスプレス（ZAP Express）（登録商標）ｃＤＮＡ合成およびギガ
パック（Gigapack）IIIゴールドクローニングキット（ストラタジーン（Stratag
ene））を使用して、製造業者の説明書に従って構築した。３９６bpの差別ディ
スプレイされたＰＣＲ産物（ＴＡベクター中にクローン化した）をプローブとし
て使用して、このライブラリーをスクリーニングした。３次スクリーニング後、
ヘルパーファージを使用してインビボ切り出しにより、陽性クローンを切り出し
た。挿入体を含有する得られたｐＢＫ−ＣＭＶファジミドを、サザンブロット解
析により同定した。エキソIII／ムング（EXOIII/Mung）マメヌクレアーゼ欠失キ
ット（ストラタジーン（Stratagene））を使用して製造業者の説明書に従って、
単方向ネスティッド欠失をＤＮＡ挿入体中に作成した。挿入体ＤＮＡの両方の鎖
を、シーケナーゼ（ユーエスビー（USB））を使用して配列決定した。
【０１７９】 例１に記載の３９６bpのＰＣＲ断片をプローブとして使用して、９７４bpのｃ
ＤＮＡクローン（配列番号１）を単離し性状解析した。このｃＤＮＡを、下垂体
腫瘍特異的遺伝子（ＰＴＴＧ）と名付けた。ＰＴＴＧの配列は、１９９アミノ酸
（配列番号２）の読みとり枠を含有する。予測される開始コドンの上流のフレー
ム内停止コドンの存在は、ＰＴＴＧが完全なＯＲＦを含有することを示す。これ
は、例３に記載の遺伝子産物のインビトロ転写とインビトロ翻訳の両方を証明す
ることにより確認した。
【０１８０】 例３：ＰＴＴＧのインビトロ転写と翻訳 センスおよびアンチセンスＰＴＴＧ ｍＲＮＡを、それぞれＴ３およびＴ７
ＲＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Stratagene））を使用してインビトロで
転写した。ＤＮａｓｅＩ消化により、過剰の鋳型を除去した。反応は、３μlの
インビトロ転写ＲＮＡ、２μlの35Ｓ−メチオニン（デュポン（Dupond））と２
０μlの溶解物を含有する総量２５μl中で、３０℃で６０分行った。翻訳産物を
、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％分離ゲルと５％スタッキングゲル）により分析し、
コダックフィルムに１６時間露光した。
【０１８１】 結果は、インビトロ転写したＰＴＴＧセンスｍＲＮＡの翻訳により、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ上で約２５KDのタンパク質が得られ、ｍＲＮＡの添加が無い時またはＰ
ＴＴＧアンチセンスｍＲＮＡを使用した時は、タンパク質は生成されないことを
示した。
【０１８２】 例４：ＰＴＴＧ ｍＲＮＡ発現のノーザンブロット解析 ジーンバンク（GenBank）の検索とタンパク質プロフィール分析（ブラスト（B
LAST）プログラム検索（ナショナルセンター・フォー・バイオテクノロジーイン
フォメーション（National Center for Biotechnology Information）を使用）
は、ＰＴＴＧが既知の配列と相同性が無く、コードされるタンパク質は疎水性が
高く、充分に認識された機能性モチーフを有さないことを示した。ＰＴＴＧ ｍ
ＲＮＡの組織発現パターンを、ノーザンブロット解析により調べた。ラットの複
数組織ノーザンブロットをクロンテク（Clontech）から購入した。８つの異なる
ラットの組織（心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および睾丸）から１レ
ーン当たり約２μgのポリＡ＋ＲＮＡを、変性ホルムアルデヒド１．ｌ２％アガ
ロースゲルにかけ、ナイロン膜に移し、ＵＶで架橋した。膜をまず、完全長ＰＴ
ＴＧ ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、切り離し、ヒトβ−アクチンｃ
ＤＮＡ対照プローブに再ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、エ
クスプレスハイブ（ExpressHyb）ハイブリダイゼーション溶液（クロンテク（Cl
ontech））中で６０℃で１時間行った。２×ＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳ中で室温
で１５分、２回洗浄し、０．１％ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で５０℃で１５分、
２回洗浄した。ＰＴＴＧプローブについて露光時間は、２４時間であり、アクチ
ンプローブは２時間であった。
【０１８３】 ノーザン測定法の結果は、睾丸が、下垂体腫瘍細胞以外の、ＰＴＴＧ ｍＲＮ
Ａを発現する唯一の組織であり、睾丸発現レベルは、下垂体腫瘍細胞（２０μg
総ＲＮＡ、６時間露光）よりはるかに低い（２μgポリＡ＋ｍＲＮＡ、２４時間
露光）ことを示す。興味深いことに睾丸転写体（約１Kb）は、下垂体腫瘍中の転
写体（１．３Kb）より短く、ｍＲＮＡは睾丸中で差別的にスプライスされ、１．
３Kb転写体が、下垂体腫瘍細胞に特異的であることを示している。
【０１８４】 例５：ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞中のＰＴＴＧの過剰発現 ＰＴＴＧ ｍＲＮＡは下垂体腫瘍細胞中で過剰発現されるため、このタンパク
質が細胞増殖と形質転換に影響を与えるかどうかを調べた。ＰＴＴＧの全コード
領域を含有する真核生物発現ベクターを、ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞中に安定にト
ランスフェクションした。
【０１８５】 ＰＴＴＧの全コード領域を、ｐＢＫ−ＣＭＶ真核生物発現ベクター（ストラタ
ジーン（Stratagene））中のフレーム内にクローン化し、カルシウム沈殿法によ
りＮＩＨ３Ｔ３細胞中にトランスフェクションした。トランスフェクションの４
８時間後、細胞を１：１０希釈し、１mg/ml Ｇ４１８を含有する選択培地中で
２週間増殖させ、個体コロニーを単離した。各コロニーから細胞抽出物を調製し
、１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ナイロン膜上にブロット
した。ＰＴＴＧの最初の１７アミノ酸をエピトープ（リサーチジェネティクス（
Research Genetics））として使用して、ポリクローナル抗体を作成した。抗体
を１：５０００希釈し、上記の膜と室温で１時間インキュベートした。洗浄後、
膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識２次抗体で、室温で１時間インキュベー
トした。ハイブリダイゼーションシグナルは、増強化学発光により検出した（イ
ーシーエル（ECL）検出装置、アマシャム（Amersham））。
【０１８６】 ＰＴＴＧの発現レベルを、このタンパク質の最初の１７アミノ酸に対して作成
した上記特異的ポリクローナル抗体を使用して、免疫ブロット分析により追跡し
た。各コロニーの発現レベルは変動し、より高いタンパク質レベルを発現したク
ローンを、さらなる分析に使用した。
【０１８７】 例６：細胞増殖へのＰＴＴＧ発現の作用 非放射性細胞増殖測定法を使用して、細胞増殖に及ぼすＰＴＴＧタンパク質過
剰発現の作用を調べた（例えば、モスマン（Mossmann, T.）、1983, J. Immunol
. Meth., 65:55-63；およびカルミカエル（Carmichael）ら、1987, Cencer Res.
, 47:943-946）。細胞増殖は、セルタイター（CellTiter）９６ＴＭ非放射性細
胞増殖測定キット（プロメガ（Promega））を使用して、製造業者の説明書に従
って測定した。５０００個の細胞を９６ウェルプレートに接種（各測定法で各ク
ローンにつき６ウェル）し、３７℃で２４〜７２時間インキュベートした。各時
点で、１５μlの色素溶液を各ウェルに加え、３７℃で４時間インキュベートし
た。次に、１００μlの可溶化／停止溶液を各ウェルに加えた。１時間インキュ
ベーション後、ウェルを混合し、５９５nmの吸光度をＥＬＩＳＡリーダーを使用
して記録した。５９５nmの吸光度は、各ウェル中の細胞数と正比例する。
【０１８８】 ３つの独立した実験を行った。ＰＴＴＧタンパク質を発現する３Ｔ３細胞の細
胞増殖速度（テトラゾリウムのホルマザンへの細胞変換により測定した）は、ｐ
ＣＭＶベクター単独を発現する３Ｔ３細胞と比較して２５〜５０％抑制され、Ｐ
ＴＴＧタンパク質は細胞増殖を阻害することを示した（データは示していない）
。
【０１８９】 例７：形態形質転換とＮＩＨ３Ｔ３細胞の軟寒天増殖のＰＴＴＧ誘導 ＰＴＴＧタンパク質の形質転換性は、マンスレーヤー（manslayer）培養で細
胞増殖巣を形成する能力と、軟寒天で非足場依存性増殖を示す能力により証明さ
れる（表１）。初代下垂体細胞は、複数の型の細胞の混合物であり、インビトロ
では複製しないため、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用した。軟寒天測定法（シュワブ（
Schwab）ら、1985, Nature 316:160-162）では、６０mMの組織培養プレートを５
mlの軟寒天（２０％、２×ＤＥＥＭ、５０％ＤＥＥＭ、１０％胎児牛血清、２０
％２．５％寒天、融解し、４５℃で合わせた）で被覆した。培地に懸濁した２ml
の細胞を、４mlの寒天混合物と一緒にし、この混合物の１．５mlを各プレートに
加えた。細胞を、１０4 細胞／プレートの密度で蒔き、１４日間インキュベート
した後、コロニー数を数え、写真を取った。少なくとも４０細胞からなるコロニ
ーのみを計測した。表１に示す値は、三重測定の平均±ＳＥＭである。
【０１９０】 表１３．ＰＴＴＧ ｃＤＮＡ構築体でトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細 胞によるコロニー形成 ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― 細胞株 軟寒天中の増殖 軟寒天中のコロニー形成 の効率（％）* ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― ＤＮＡ無し ０ ０ ベクターのみ １．３±０．７ ０．０１３ ＰＴＴＧ３ ２６±４．６ ０．２６ ＰＴＴＧ４ １３２±２６ １．３２ ＰＴＴＧ８ ３３±６．０ ０．３３ ＰＴＴＧ９ ７２±１３ ０．７２ ＰＴＴＧ１０ ９２±１８ ０．９２ ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― * コロニー形成の効率は、総細胞数で割ったコロニー数のパーセントとして計算
した。 ――――――――――――――――――――――――――――――――――――
【０１９１】 結果は、ＮＩＨ３Ｔ３親細胞とｐＣＭＶベクターでトランスフェクションした
３Ｔ３細胞が軟寒天上でコロニーを形成しないが、ＰＴＴＧでトランスフェクシ
ョンした３Ｔ３細胞は大きいコロニーを形成することを示す。さらに、ＰＴＴＧ
タンパク質を過剰発現している細胞では、細胞増殖巣の形質転換が観察されるが
、ＰＴＴＧ挿入体の無いｐＣＭＶベクターを発現する細胞は、親３Ｔ３細胞と同
様の形態を示した。
【０１９２】 例８：ＰＴＴＧがインビボで腫瘍発生であるかどうかを調べるための測定法 ＰＴＴＧがインビボで腫瘍発生であるかどうかを調べるために、ＰＴＴＧでト
ランスフェクションした３Ｔ３細胞を無胸腺ヌードマウスに皮下注射した。ＰＴ
ＴＧまたはｐＣＭＶベクターのみでトランスフェクションした細胞の３×１０5
個の細胞を、ＰＢＳに再懸濁し、ヌードマウスの皮下に注射した（各群５匹）。
３週間目の最後に屠殺した動物から腫瘍を切り出し、重量を測定した。注射した
すべての動物は、３週間以内に大きい腫瘍（１〜３グラム）を示した。結果を下
の表１４に示す。ベクターのみでトランスフェクションした細胞を注射したマウ
スは、腫瘍を発生しなかった。これらの結果は、ＰＴＴＧがインビボで強力な形
質転換遺伝子であることを明確に示す。
【０１９３】 表１４：ＰＴＴＧ ｃＤＮＡ発現ベクターでトランスフェクションしたＮＩＨ３ Ｔ３細胞によるインビボ腫瘍発生 ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― 細胞株 注射した動物の数 腫瘍形成 ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― ベクターのみ ５ ０／５ ＰＴＴＧ４ ５ ５／５ ――――――――――――――――――――――――――――――――――――
【０１９４】 例９：ヒト癌細胞株はＰＴＴＧを発現する 種々のヒト細胞株中のＰＴＴＧの発現パターンを、複数のヒト癌細胞株ノーザ
ンブロット（クロンテク（Clontech））を使用して調べた。試験した具体的な細
胞株を下の表１５に示す。
【０１９５】 表１５．試験したヒト癌細胞株 ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― 細胞株 ＰＴＴＧ発現 ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― １ 前骨髄性白血病ＨＬ−６０ ＋ ２ ヒーラ細胞Ｓ３ ＋ ３ 慢性骨髄性白血病Ｋ−５６２ ＋ ４ リンパ芽球性白血病ＭＯＬＴ−４ ＋ ５ バーキットリンパ腫Ｒａｊｉ ＋ ６ 結腸直腸腺腫ＳＷ４８０ ＋ ７ 肺癌Ａ５４９ ＋ ８ 黒色腫Ｇ３６１ ＋ ――――――――――――――――――――――――――――――――――――
【０１９６】 上記表３に示した８つの細胞株のそれぞれから約２μgのポリＡ ＲＮＡを、
変性ホルムアルデヒド１．２％アガロースゲルの各レーンにのせ、変性ゲル電気
泳動により分離して無傷であることを確認し、ノーザンブロッティングにより電
荷修飾したナイロン膜に移し、ＵＶ照射により固定した。レーン１〜８は、それ
ぞれ前骨髄性白血病ＨＬ−６０、ヒーラ細胞株Ｓ３、ヒト絨毛性骨髄性白血病Ｋ
−５６２、リンパ芽球性白血病ＭＯＬＴ−４、バーキットリンパ腫Ｒａｊｉ、結
腸直腸腺腫ＳＷ４８０、肺癌Ａ５４９、および黒色腫Ｇ３６１からのＲＮＡを含
有した。９．５、７．５、４．４、２．４および１．３５kbのＲＮＡサイズマー
カーの線は、ブロットの左端にインクで示し、サイズ標準物質として使用し、方
向を示すために膜の左下に切り目を入れた。放射能標識したヒトβ−アクチンｃ
ＤＮＡを、異なるバッチのポリＡ ＲＮＡの一致のための対照プローブとして使
用した。すべてのレーン中の２．０kbの単一の対照バンドは確認のためである。
【０１９７】 サムブルーク（Sambrook）らが記載（その関連部分は、参照することにより本
明細書に組み込まれる）したようにエクスプレスハイブ（ExpressHyb）ハイブリ
ダイゼーション溶液（クロンテク（Clontech））中で、ブロットに、完全長ラッ
トＰＴＴＧ ｃＤＮＡプローブ（配列番号１；９７４bp）を６０℃で１時間プロ
ーブ結合させた。サムブルーク（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験室マ
ニュアル（第２版）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリープレス
（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、コールドスプリングハーバー、ニ
ューヨーク州(1989)を参照されたい。次にブロットを、２×ＳＳＣ、０．０５％
ＳＤＳ中で室温で１５分で２回洗浄し、０．１％ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で５
０℃で１５分で２回洗浄した。残りの実験法のさらなる詳細は、ペイ（Pei, L.
）とメルメド（Melmed S.）中に見いだされる（その関連部分は、参照すること
により本明細書に組み込まれる）（ペイ（Pei, L.）とメルメド（Melmed S.）、
Endocrinology 4:433-441 [1997]を参照されたい）。
【０１９８】 上記のようにノーザンブロット解析で試験した、特にリンパ腫、白血病、黒色
腫および肺癌を含むすべての細胞は、ヒトＰＴＴＧ（すなわち、ＰＴＴＧ１）の
発現を示した。
【０１９９】 例１０：ヒトＰＴＴＧ ｃＤＮＡの分子クローニング 全ラットＰＴＴＧコード領域の放射能標識ｃＤＮＡ断片をプローブとして使用
して、ヒト胎児肝ｃＤＮＡライブラリー（クロンテク（Clontech）、パロアルト
（Palo Alto）、カリホルニア州）を、マニアティス（Maniatis）らが記載した
ようにスクリーニングした（マニアティス（Maniatis）ら、「分子クローニング
」、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Laborator
y Press）、1989）。陽性のクローンからのｃＤＮＡ挿入体を、プラスミドｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（ストラタジーン（Stratagene）、ラホヤ（La Jolla
）、カリホルニア州）中にサブクローニングし、シーケナーゼ（Sequenase）キ
ット（ユーエスバイオケミカル社（U.S. Biochemical Corp.）、クリーブランド
、オハイオ州）を使用して、配列解析に付した。
【０２００】 陽性クローン中に、６０６bpを含有する完全な読みとり枠が見つかった。読み
とり枠のヌクレオチド配列とラットＰＴＴＧのコード領域のヌクレオチド配列と
の相同性は、８５％である。この読みとり枠の翻訳産物とラットＰＴＴＧタンパ
ク質とのアミノ酸配列比較は、７７％の同一性と８９％の相同性を示す。これら
のクローンから得られるｃＤＮＡは、ラットＰＴＴＧのヒト同族体である。この
ライブラリーからは、より高い相同性を示す他のｃＤＮＡ断片は検出されなかっ
た。
【０２０１】 例１１：ヒトＰＴＴＧ ｍＲＮＡの組織分布 手術時に採取し液体窒素で凍結した、正常ヒト下垂体（ゾイオンリサーチ社（
Zoion Research Inc.）、ウォーチェスター（Worchester）、マサチューセッツ
州）と新鮮なヒト下垂体腫瘍から、トリゾール試薬（Trizol Reagent）（ギブコ
ビーアールエル（Gibco-BRL）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーラ
ンド州）を使用して、総ＲＮＡを調製した。１％アガロースゲル電気泳動に、２
０mgの総ＲＮＡを使用した。正常な成人および胎児組織から、ならびに悪性腫瘍
細胞株からのＲＮＡブロット（クロンテク（Clontech）、パロアルト（Palo Alt
o）、カリホルニア州）を、完全なコード領域を含有する放射能標識したヒトｃ
ＤＮＡ断片とハイブリダイズさせた。各細胞株から単離したＲＮＡを、ナイロン
膜（アマシャム（Amersham）、アーリントンハイツ（Arlington Heights）、イ
リノイ州）に移し、放射能標識プローブと、６×ＳＳＣ、２×デンハルツ溶液、
０．２５％ＳＤＳ中で、５５℃で一晩ハイブリダイズさせた。膜を、それぞれ室
温で１５分、２回洗浄し、次に０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６０℃で２０
分洗浄し、オートラジオグラフィーを行った。オートラジオグラフィーは、コダ
ックバイオメックス−エムアール（BIOMEX-MR）フィルム（イーストマンコダッ
ク（Eastman Kodak）、ローチェスター（Rochester）、ニューヨーク州）を使用
して、強化スクリーンを用いて行った。ブロットを、蒸留水中で９５℃で２０分
洗浄して切り離して、以後のプローブ結合用とした。
【０２０２】 ノーザンブロット解析の結果は、ＰＴＴＧが、ヒト胎児組織の肝臓で発現され
、脳、肺および腎臓では発現されないことを示した。さらにＰＴＴＧは、正常な
ヒト成体組織の睾丸で強く発現され、胸腺で中程度に発現され、結腸と小腸で弱
く発現される。脳、心臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、胎盤、腎臓、および膵臓では
、ノーザン解析により全く発現が検出されなかった。
【０２０３】 いくつかのヒト癌細胞株中のＰＴＴＧの発現をまた、ノーザンブロットで分析
した。調べたすべての癌細胞で、ＰＴＴＧは強く発現されていた。試験したヒト
腫瘍細胞株を、下記の表１６に列挙する。
【０２０４】 表１６．試験したヒト腫瘍細胞株 ―――――――――――――――――――――――――― 前骨髄性白血病ＨＬ−６０ 上皮様細胞癌ヒーラ細胞Ｓ３ 慢性骨髄性白血病Ｋ−５６２ リンパ芽球性白血病ＭＯＬＴ−４ バーキットリンパ腫Ｒａｊｉ 結腸直腸腺腫ＳＷ４８０ 肺癌Ａ５４９ 黒色腫Ｇ３６１ 肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂ 甲状腺癌ＴＣ−１ 乳房腺腫ＭＣＦ−７ 骨原性肉腫Ｕ２ＯＳ 胎盤絨毛癌ＪＡＲ 絨毛癌ＪＥＧ−３ ――――――――――――――――――――――――――
【０２０５】 例１２：正常下垂体および下垂体腫瘍におけるヒトＰＴＴＧ発現 ＲＴ−ＰＣＲを以下のように行った。５mgの総ＲＮＡを１００ＵのＲＮａｓｅ
フリーＤＮａｓｅＩで室温で１５分処理した。ＤＮａｓｅＩを、６５℃で１５分
インキュベートして不活性化した。次に試料を、オリゴ−ｄＴプライマーとスー
パースクリプトII（SuperScript II）逆転写酵素（ギブコビーアールエル（Gibc
o-BRL）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）を使用する逆
転写のために使用した。逆転写後、試料を、ｈＰＴＴＧ特異的プライマーとヒト
シクロフィリン−Ａ特異的プライマーを内部対照として使用して、ＰＣＲスーマ
ーミックス（PCR SuperMix）（ギブコビーアールエル（Gibco-BRL）、ゲーサー
ズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）を用いるＰＣＲ増幅に付した。
【０２０６】 ノーザンブロット解析は、ＰＴＴＧの発現レベルは、正常下垂体でも下垂体腫
瘍でも非常に低いことを示した。従って比較ＲＴ−ＰＣＲを使用して、正常下垂
体と下垂体腫瘍でのＰＴＴＧの発現を定量的に調べた。この試験の結果は、試験
したほとんどの下垂体腫瘍（機能していない腫瘍、ＧＨ分泌性腫瘍、およびプロ
ラクチノーマを含む）で、ＰＴＴＧの発現レベルは、正常下垂体より高いことを
示した。
【０２０７】 例１３：ヒトＰＴＴＧのＮＩＨ３Ｔ３細胞への安定なトランスフェクション ｈＰＴＴＧ ｃＤＮＡの完全なコード領域を、哺乳動物発現ベクターｐＢＫ−
ＣＭＶ（ストラタジーン（Stratagene）、ラホヤ（La Jolla）、カリホルニア州
）中に読みとり枠でサブクローニングし、リポフェクタミン（ギブコビーアール
エル（Gibco-BRL）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）に
より製造業者のプロトコールに従って、ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞中にトランスフ
ェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を連続希釈し、１mg
/mlＧ４１８を含有する選択培地中で２週間増殖させた。個々のクローンを単離
し、選択培地中で維持した。ｈＰＴＴＧトランスフェクション細胞株とブランク
ベクターｐＢＫ−ＣＭＶをトランスフェクションした対照細胞から、総ＲＮＡを
単離した。ノーザンブロットを行って、トランスフェクション細胞株中のｈＰＴ
ＴＧの過剰発現を確認した。これらの細胞株を、以後の細胞増殖測定法ならびに
インビトロとインビボの形質転換測定法で使用した。
【０２０８】 例１４：細胞増殖測定法 細胞増殖測定法は、セルタイター（CellTiter）９６非放射性細胞増殖測定法
キット（プロメガメディシン（Promega Medicine）、ウィスコンシン州）を使用
して、製造業者のプロトコールに従って行った。５，０００個の細胞を９６ウェ
ルプレートに接種し、３７℃で２４〜７２時間インキュベートした。各測定法で
各クローンにつき８つのウェルを使用した。各時点で、１５mlの色素溶液を各ウ
ェルに加え、細胞を３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後
、１００μlの可溶化／停止溶液を各ウェルに加え、プレートを室温で一晩イン
キュベートした。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して５９５nmで吸光度を測定した。
【０２０９】 対照とｈＰＴＴＧ過剰発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用して、この測定法を行った
。結果は、ＰＴＴＧ発現ベクターでトランスフェクションした細胞の増殖が、ブ
ランクベクターでトランスフェクションした細胞と比較して３０〜４５％低下し
たことを示した。これらの結果は、ＰＴＴＧタンパク質が細胞増殖を阻害するこ
とを明確に示している。
【０２１０】 例１５：インビトロとインビボの形質転換測定法 （ａ）インビトロ形質転換測定法 対照とｈＰＴＴＧトランスフェクション細胞を、軟寒天中で非足場依存性増殖
について試験した。３mlの軟寒天（２０％の２×ＤＭＥＭ、５０％ＤＭＥＭ、１
０％胎児牛血清、および２０％の２．５％寒天、４５℃で融解し混合した）を、
３５mmの組織プレートに加えた。１０，０００個の細胞を１mlの軟寒天と混合し
、各プレートに加え、コロニーが計測できるまで２週間インキュベートし、写真
を取った。
【０２１１】 （ｂ）インビボ形質転換測定法 ブランクベクターを含有する５×１０5 個の細胞またはｈＰＴＴＧ発現細胞を
、ヌードマウスに注入した。注入の２週間後マウスを屠殺し、注入部位の近くに
形成された腫瘍を調べた。
【０２１２】 ＰＴＴＧ発現ベクターで安定にトランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞
を、非足場依存性増殖測定法で試験すると、これらの細胞は、軟寒天上で大きな
コロニー形成を示し、ＰＴＴＧタンパク質の形質転換能力を示していた。
【０２１３】 ＮＩＨ３Ｔ３細胞をヌードマウスに注入すると、これらは、注入後２週間以内
にインビボの腫瘍形成を引き起こした。これらのデータは、ヒトＰＴＴＧはラッ
トＰＴＴＧのように、強力形質転換遺伝子であることを示す。
【０２１４】 例１６：ＰＴＴＧ−Ｃ末端ポリペプチドによる細胞形質転換／腫瘍形成の阻害 細胞株：ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１０％胎児牛血清を補足した高グルコース（４
．５g/l）ＤＭＥＭ（ギブコビーアールエル（Gibco BRL））中で維持した。ヒー
ラ細胞を、１０％胎児牛血清（ＦＢＳ）を補足した低グルコース（１g/l）ＤＭ
ＥＭ（ギブコビーアールエル（Gibco BRL））中で維持した。Ｔ−４７ＤとＭＣ
Ｆ−７細胞を、１０％胎児牛血清（ＦＢＳ）と０．０１mg/mlウシインスリン（
シグマ（Sigma））を補足した高グルコース（１g/l）ＤＭＥＭ（ギブコビーアー
ルエル（Gibco BRL））中で維持した。すべての細胞株は、アメリカンタイプカ
ルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から得られた。
【０２１５】ヒトおよび変異体ＰＴＴＧのＮＩＨ３Ｔ３への部位特異的突然変異誘発と安定な トランスフェクション 。野生型ヒトＰＴＴＧポリペプチド（ｗｔＰＴＴＧ）のプ
ロリンリッチなドメイン上の点突然変異を、ＰＣＲベースの部位特異的突然変異
誘発により作成した。点突然変異を引き起こして、ｗｔＰＴＴＧタンパク質中で
アミノ酸配列の変化Ｐ１６３Ａ、Ｓ１６５Ｑ、Ｐ１６６Ｌ、Ｐ１７０Ｌ、Ｐ１７
２ＡおよびＰ１７３Ｌを引き起こす２つの合成オリゴヌクレオチド、５’−ＧＡ
ＴＧＣＴＣＴＣＣＧＣＡＣＴＣＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＴＣＴＧ−３’（配列番
号５）および５’ＴＴＣＡＣＡＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＧＣＣＣＡＧＣＴＧＡＡ
ＡＣＡＧ−３’（配列番号６）を使用して、ｐＢｌｕｅ−Ｓｃｒｉｐｔ−ＳＫベ
クター（ストラタジーン（Stratagene））中にクローン化されたＰＴＴＧ ｃＤ
ＮＡを増幅した。次に、増幅した突然変異ｃＤＮＡ（ｍｕｔＰＴＴＧ）を哺乳動
物発現ベクターｐＣＩ−ｎｅｏ（プロメガ（Promega））中にクローン化した。
トランスフェクション細胞中のｍｕｔＰＴＴＧの過剰発現は、ノーザン解析とＲ
Ｔ−ＰＣＲ、次に直接配列解析により確認した。ｗｔＰＴＴＧとｍｕｔＰＴＴＧ
をｐＣＩ−ｎｅｏ中にサブクローニングし、ベクターを使用して、ザング（Zhan
g, X.）ら、[1999a]が記載したようにＮＩＨ３Ｔ３細胞をトランスフェクション
した。
【０２１６】 トランス活性化測定法。ｗｔＰＴＴＧ ｃＤＮＡを、ｐＧＡＬ４（ストラタジ
ーン（Stratagene））とフレーム内に融合し、ｐＧＡＬ４−ｗｔＰＴＴＧと呼び
、欠失と突然変異分析の鋳型として使用した；ｍｕｔＰＴＴＧ ｃＤＮＡはまた
、ｐＧＡＬ４とフレーム内に融合し、ｐＧＡＬ４−ｍｕｔＰＴＴＧと呼んだ。ｐ
ＧＡＬ４−ＶＰ１６を陽性対照として使用した。実験プラスミドを、ｐＬＵＣと
ｐＣＭＶ−β−Ｇａｌ（内部対照として）とともに、同時トランスフェクション
した。細胞溶解物を、トランスフェクションの４８時間前に調製し、既に記載さ
れているように（ワング（Wang, Z.）とメルメド（Melmed, S.）、[2000]；サム
ブルーク（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル（第２版）」
、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリープレス（Cold Spring Harbor
Laboratory Press）、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、10.2.1-
10.2.6 [1989]）ルシフェラーゼ活性について測定した。
【０２１７】野生型および変異体ヒトＰＴＴＧ Ｃ末端ポリペプチドのための発現ベクターの 構築 ｗｔＰＴＴＧおよびｍｕｔＰＴＴＧ Ｃ末端ポリペプチド発現ベクターを作成
するために、ｗｔＰＴＴＧとｍｕｔＰＴＴＧ ｃＤＮＡの内部ＸｂａＩ部位およ
びこれらのｃＤＮＡの３’部分を、ＸｂａＩとＮｏｔＩ部位を介してｐＣＩ−ｎ
ｅｏ（プロメガ（Promega）、マジソン、ウィスコンシン州）中にクローン化し
た。これらのクローンでは、完全長ＰＴＴＧのＭ１４７のＡＴＧが開始ｃＤＮＡ
使用されて、完全長ｗｔＰＴＴＧのヌクレオチド１４７〜２０２位に対応する５
６アミノ酸残基のポリペプチドが作成される。
【０２１８】ヒトＰＴＴＧ Ｃ末端ペプチドの腫瘍細胞への安定なトランスフェクション 。 野生型および変異体ヒトＰＴＴＧ Ｃ末端発現構築体を、リポフェクチン（ギ
ブコビーアールエル（Gibco BRL））を用いて製造業者のプロトコールに従って
、ヒーラ、ＭＣＦ−７およびＴ４７−Ｄ細胞中にトランスフェクションした。ト
ランスフェクションの２４時間後、細胞を連続希釈し、Ｇ４１８（１mg/ml）で
２週間選択した。個々のクローンを単離し、選択培地（１０％ＦＢＳと前述のよ
うにＧ１４８［１mg/ml］を含有する各高または低グルコース）で維持し、トラ
ンスフェクションされた細胞から総ＲＮＡを抽出した。野生型と突然変異ＰＴＴ
Ｇ−Ｃ末端を、ＲＴ−ＰＣＲにより２つの合成オリゴヌクレオチド（１つはベク
ターｐＣＩ−ｎｅｏからの５’−非翻訳領域に特異的な、５’−ＧＧＣＴＡＧＡ
ＧＴＡＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣ−３’（配列番号７）で
、他はＰＴＴＧ１ ｃＤＮＡの３’−翻訳領域に特異的な、５’−ＣＴＡＴＧＴ
ＣＡＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＴＧＧＣＡＡＴＴＣＡＡＣ−３’（配列番号８））
を使用して確認し、次に、直接配列決定を行った。
【０２１９】インビトロコロニー形成とインビボ腫瘍発生 。ＮＩＨ３Ｔ３安定トランスフェク
ション体を、ザング（Zhang, X.）ら、[1999a]に記載のようにインビボで試験し
た。トランスフェクションした細胞を、軟寒天中でザング（Zhang, X.）ら、[19
99a]に記載のように非足場依存性増殖について試験した。ヒーラ細胞を３週間イ
ンキュベートし、ＭＣＦ−７（乳癌）とＴ−４７Ｄ（乳癌）細胞を２週間インキ
ュベートした。腫瘍発生のインビボ測定のために、１×１０7 個のＭＣＦ−７安
定トランスフェクション体を、５００μlのマトリゲル（MATRIGEL）基底膜マト
リックス（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、ベッドフォード（Be
dford）、マサチューセッツ州）中に再懸濁し、ヌードマウスに皮下注射した（
各群について３匹のマウス）。４週間後、動物の写真を取り、腫瘍を切り出し重
量を測定した。
【０２２０】調整培地中の塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）のＥＬＩＳＡ 。ヒーラ細胞
培地中の塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）濃度を、クアンチキンＨＳヒト
ＦＧＦ基礎免疫測定法キット（Quantikine HS Human FGF Basic Immuoassay Kit
）（アールアンドディーシステムズ（R & D Systems）、ミネアポリス、ミネソ
タ州）を使用して製造業者のプロトコールに従って測定した。細胞（１×１０5
）を１００mmの細胞培養プレートに蒔いた。７２時間後、培地を採取し、２００
mlをＥＬＩＳＡ測定法のために使用した。
【０２２１】腫瘍誘導に及ぼす野生型ヒトＰＴＴＧと変異体ＰＴＴＧ過剰発現の作用 。野生型
ＰＴＴＧを過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞は、非足場依存性増殖測定法で大きい
コロニーを形成し、無胸腺ヌードマウスに注入すると腫瘍を形成し、一方プロリ
ンリッチな領域中の点突然変異（Ｐ１６３Ａ、Ｐ１７０Ｌ、Ｐ１７２ＡおよびＰ
１７３Ｌ）はコロニーと腫瘍の形成を阻害することが、すでに証明された（ザン
グ（Zhang, X.）ら、[1999a]）。各トランスフェクション体細胞株中のｗｔＰＴ
ＴＧとｍｕｔＰＴＴＧ（Ｐ１６３Ａ、Ｓ１６５Ｑ、Ｐ１６６Ｌ、Ｐ１７０Ｌ、Ｐ
１７２ＡおよびＰ１７３Ｌ）の過剰発現は、ノーザン解析とＲＴ−ＰＣＲ次に直
接配列解析により確認した（データは示していない）。
【０２２２】 さらに、無胸腺ヌードマウス中に注入した過剰発現ＰＴＴＧトランスフェクシ
ョン体は、すべての注入動物で２週間以内に腫瘍形成を引き起こした。３群のそ
れぞれの５匹のマウスに、（１）対照細胞株（ｐＧＡＬ４ベクター単独でトラン
スフェクションした）；（２）野生型ＰＴＴＧ過剰発現（ｗｔＰＴＴＧ）；また
は（３）変異体ＰＴＴＧ過剰発現（ｍｕｔＰＴＴＧ［Ｐ１６３Ａ、Ｓ１６５Ｑ、
Ｐ１６６Ｌ、Ｐ１７０Ｌ、Ｐ１７２ＡおよびＰ１７３Ｌ］）でトランスフェクシ
ョンした、３×１０5 のＮＩＨ３Ｔ３細胞を、皮下注射した。２週間後、マウス
を屠殺し、腫瘍を切り出し重量を測定した。対照トランスフェクション体または
ｍｕｔＰＴＴＧトランスフェクション体を注入したマウスでは、腫瘍は出現しな
かった。しかしｗｔＰＴＴＧを有するトランスフェクション細胞を注入したマウ
スは、例外無しに腫瘍を生成した。腫瘍の重量は、４７０〜１５００mgの範囲で
あった（表１７）。
【０２２３】 表１７．無胸腺ヌードマウスにおけるＰＴＴＧ発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞による腫瘍 形成 腫瘍重量（mg） ベクター ｗｔＰＴＴＧ ｍｕｔＰＴＴＧ 無し＊ １５００ 無し 無し ７７０ 無し 無し １２５０ 無し 無し ５５０ 無し 無し ４７０ 無し ＊ 無し＝検出可能な腫瘍無し
【０２２４】ＰＴＴＧは転写活性化を示す 。ベクターｐＧＡＬ４単独（陰性対照）は、ルシフ
ェラーゼ（ｌｕｃ）レポーターを活性化せず、既知の活性化ドメインＶＰ１６は
、レポーター活性を約２８倍有意に上昇させた。ｐＧＡＬ４−ｗｔＰＴＴＧは、
トランス活性化性を示し、レポーター活性を約２２倍誘導した（図１）。
【０２２５】 ｐＧＡＬ４−ｍｕｔＰＴＴＧ（突然変異したプロリン領域［Ｐ１６３Ａ、Ｓ１
６５Ｑ、Ｐ１６６Ｌ、Ｐ１７０Ｌ、Ｐ１７２ＡおよびＰ１７３Ｌ］の転写活性、
ｗｔＰＴＴＧの他の点突然変異、ならびに別の欠失（ｄ）はまた、表１８に示す
ように試験した。表１８では、記載のプラスミドを、ｐＬｕｃおよびｐＣＭＶ−
β−ＧａｌＴとともにＮＩＨ３Ｔ３細胞中に同時トランスフェクションし、β−
ｇａｌを内部対照としてルシフェラーゼ測定を行った。各値は、２つの独立した
実験からの３つずつのウェル（±ＳＥＭ）を示す；ｗｔＰＴＴＧによるトランス
活性化を１００％とした。ｐＧＡＬ４−ｍｕｔＰＴＴＧは、ｐＧＡＬ４−ｗｔＰ
ＴＴＧと比較して約９５％のトランス活性化を示し、こうしてトランス活性化の
ためのｗｔＰＴＴＧプロリンリッチなモチーフの重要性を確認した。
【０２２６】 表１８．ｈＰＴＴＧ変異体のトランス活性化 突然変異体 活性化活性（％）（±ＳＥＭ） ｐＧＡＬ４−ｗｔＰＴＴＧ １００ −１６３Ｐｒｏ→Ａｌａ １００±１０ −１６６Ｐｒｏ→Ａｌａ ４５±５＊ −１７０Ｐｒｏ→Ａｌａ １００±１０ −１８２Ｐｒｏ→Ａｌａ １００±１０ −１５２Ｇｌｕ→Ｇｌｎ １００±１０ −１９２Ｇｌｕ→Ｇｌｎ ５０±３＊ −１６５Ｓｅｒ→Ａｌａ ３０±３＊ −１６５Ｓｅｒ→Ｌｅｕ ２０±２＊ −１７６Ｓｅｒ→Ａｌａ １００±１０ −１８３Ｓｅｒ→Ａｌａ １００±１０ −１８４Ｓｅｒ→Ａｌａ １００±１０ −ｄ（１−１００） １００±１０ −ｄ（１８０−２０２） １００±１０ −ｍｕｔＰＴＴＧ ６±１＊ ＊ｐ＜０．０１
【０２２７】ヒトＰＴＴＧ Ｃ末端ペプチド発現は細胞形質転換を阻止する 。上記したように
トランス活性化、形質転換および腫瘍形成におけるプロリンリッチな領域の決定
的に重要な役割は、ＰＴＴＧがＳＨ３介在シグナル伝達を介して機能することを
意味する。ヒトＰＴＴＧ１タンパク質がＳＨ３関連シグナルカスケードを仲介す
るなら、これはおそらく、それぞれ上流および下流シグナル分子と相互作用する
少なくとも２つの機能性ドメインを含有する。１つのみのそのような機能性ドメ
インを含有する変異体タンパク質は、優性陰性的に作用して、野生型タンパク質
機能を阻害し、シグナル伝達を破壊する可能性がある。
【０２２８】 この仮説に基づき、Ｎ末端アミノ酸残基１〜１４６が欠如した末端切断型ＰＴ
ＴＧ１突然変異ペプチドを、ヒト癌細胞中に導入した。完全長タンパク質の残基
１４７〜２０２に対応するＰＴＴＧ−ＣペプチドをＣＭＶプロモーターの制御下
で発現する発現構築体を使用した。このポリペプチドはプロリンリッチなドメイ
ン（残基１６３〜１７３；ザング（Zhang, X.）ら、[1999a]）を含有し、コード
配列がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合した時、これは
、適当な分子量を有する無傷のタンパク質として大腸菌（E. coli）中で発現さ
れた（データは示していない）。変異体発現ベクターｐＣＩｎｅｏ−ｍｕｔＰＴ
ＴＧ（突然変異プロリン領域［Ｐ１６３Ａ、Ｓ１６５Ｑ、Ｐ１６６Ｌ、Ｐ１７０
Ｌ、Ｐ１７２ＡおよびＰ１７３Ｌ］ならびに対照としての空のベクターｐＣＩ−
ｎｅｏ単独は、ヒーラ、ＭＣＦ−７、およびＴ−４７Ｄヒト癌細胞株中に安定に
トランスフェクションされた。
【０２２９】 野生型ＰＴＴＧカルボキシ末端ペプチド（ＰＴＴＧ−Ｃ）、いくつかのプロリ
ン残基で突然変異したＰＴＴＧＣ末端（ＰＴＴＧ−Ｃｐｍ；突然変異したプロリ
ン残基［Ｐ１６３Ａ、Ｓ１６５Ｑ、Ｐ１６６Ｌ、Ｐ１７０Ｌ、Ｐ１７２Ａおよび
Ｐ１７３Ｌ］）を発現するトランスフェクション体、およびベクター（Ｖ）を単
離した。各トランスフェクション株の発現は、発現ベクターの５’−非翻訳領域
に対するプライマーとＰＴＴＧ ｍＲＮＡの３’−翻訳領域に対するプライマー
とを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを行い、次に直接配列解析して確認した（図２Ａ、
２Ｂおよび２Ｃ）。これらの３つの安定にトランスフェクションされた細胞株の
形質転換能力を非足場依存性増殖測定法で試験し、ＰＴＴＧ−Ｃｐｍ細胞が大き
いコロニーを形成することが観察され、同じ発現ベクターを含有するが野生型も
しくは変異体Ｃ末端ポリペプチドを欠如した対照Ｖ細胞と同じであった。各トラ
ンスフェクション細胞株を、３つの異なるプレートに入れた。ヒーラを２１日目
に、そしてＴ−４７ＤとＭＣＦ−７を１４日目にスコアを付けた。６０またはそ
れ以上の細胞からなるコロニーのスコアを付けた。しかしＰＴＴＧ−Ｃを発現す
る細胞により形成されるコロニーの数とサイズは、著しく低下していた（ｐ＜０
．０１）（図３）。表１９（下記）は、各型の癌細胞について軟寒天コロニー形
成を要約する。
【０２３０】 表１９．軟寒天中のＰＴＴＧ１ Ｃ末端（ＰＴＴＧ−Ｃ）および変異体ＰＴＴＧ Ｃ末端（ＰＴＴＧ−Ｃｐｍ）発現細胞によるコロニー形成 ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― 細胞株 ベクター コロニー／１０4 細胞 （平均±ＳＥＭ） ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― ヒーラ ベクター単独 １４６５±５４ ベクター単独 ２３９２±５５ ＰＴＴＧ−Ｃ １１±２＊ ＰＴＴＧ−Ｃ ６±１＊ ＰＴＴＧ−Ｃ ４８±３＊ ＰＴＴＧ−Ｃ ３±１＊ ＰＴＴＧ−Ｃｐｍ １１６９±７７ ＰＴＴＧ−Ｃｐｍ １０９７±７９ ＰＴＴＧ−Ｃｐｍ ２６１５±７６ Ｔ−４７Ｄ ベクター単独 １３５±４ ＰＴＴＧ−Ｃ ４６±５＊ ＰＴＴＧ−Ｃ ５２±２＊ ＰＴＴＧ−Ｃｐｍ １９３±５ ＰＴＴＧ−Ｃｐｍ １０６±５ ＭＣＦ−７ ベクター単独 ２８７±３ ＰＴＴＧ−Ｃ ９±３＊ ＰＴＴＧ−Ｃ ３４±４＊ ＰＴＴＧ−Ｃｐｍ ２３６±１１ ＰＴＴＧ−Ｃｐｍ ２０６±４ ＊Ｐ＜０．０１
【０２３１】ヒトＰＴＴＧ Ｃ末端ポリペプチドを発現するＭＣＦ−７乳癌細胞はインビボで 腫瘍を発生しない 。安定にトランスフェクションされたＭＣＦ−７乳癌細胞株を
、無胸腺ヌードマウスの皮下に注射した（５００μlのマトリゲル基底膜マトリ
ックス中１×１０7 細胞／マウス）。４週間後、マウスの写真を取り、死亡させ
、腫瘍を切り出し、重量を測定した。対照ベクターのみでトランスフェクション
した細胞を注射した３匹のマウスは、４週間で目に見える腫瘍が発生したが、Ｐ
ＴＴＧ−Ｃでトランスフェクションした細胞を注射したマウスは腫瘍を発生しな
かった。剖検では、ＰＴＴＧ−Ｃでトランスフェクションした細胞を投与された
マウスでは、皮下または他の末梢腫瘍形成は存在しないことが確認された。ＰＴ
ＴＧ−Ｃｐｍでトランスフェクションした細胞を注射された３匹のマウスも、４
週間後に腫瘍が発生し、これは、対照ベクターでトランスフェクションされた細
胞を注射されたマウス中に出現したものと同じ大きさであり、突然変異ＰＴＴＧ
−Ｃ−末端ポリペプチドは、内因性ＰＴＴＧ機能を阻害する能力を失ったことを
示している（表２０）。
【０２３２】 表２０．無胸腺ヌードマウスにおけるＰＴＴＧ−Ｃを発現するＭＣＦ−７乳癌細 胞による腫瘍形成 腫瘍重量（mg） ベクター ＰＴＴＧ−Ｃ ＰＴＴＧ−Ｃｐｍ ２１２ 無し＊ １８５ ２３５ 無し １９６ ２０９ 無し ２０３ ＊無し＝検出可能な腫瘍無し
【０２３３】 これらの結果は、ＰＴＴＧ Ｃ末端ペプチドの過剰発現が、癌細胞のインビト
ロ細胞形質転換とエクスビボ腫瘍増殖能力を失わせたことを示す。また、これら
のプロリン残基の点突然変異を含有するＰＴＴＧ Ｃ末端ペプチドは、インビボ
の形質転換活性または腫瘍形成活性を妨害できなかったため、ここでプロリンリ
ッチな領域の重要性がさらに確認された。
【０２３４】ＰＴＴＧ−ＣペプチドによるｂＦＧＦ分泌とＰＲＬ発現の抑制 。野生型ヒトＰＴ
ＴＧ−Ｃ末端ペプチドを発現する細胞は、軟寒天上のコロニー形成能力が顕著に
低下し、インビボで固形腫瘍増殖を誘導性することもできなかったため、ヒーラ
トランスフェクション体でｂＦＧＦの発現を試験した。酵素結合免疫吸着測定法
（ＥＬＩＳＡ）を行って、ヒーラトランスフェクション体の７２時間培養物から
得られた調整培地中のｂＦＧＦレベルを調べた。図４に示すように、ＰＴＴＧ−
Ｃ ＤＮＡでトランスフェクションした細胞から得られた調整培地中では、ベク
ターのみおよびＰＴＴＧ−Ｃｐｍでトランスフェクションした細胞から得られた
調整培地と比較して、ｂＦＧＦレベルが顕著に低下しており、ＰＴＴＧカルボキ
シ末端ペプチドの存在に起因するｂＦＧＦ分泌の抑制を示した。
【０２３５】 固形腫瘍の増殖速度は、血管形成の活性化と新しい血管の動員に正比例するた
め、これは、本発明において、新しい血管増殖の能力が、本発明のＰＴＴＧ−Ｃ
ペプチドにより障害され、こうしてインビボの新生物細胞増殖と腫瘍増殖をでき
なくする追加の機構を提供することを示す。実験的腫瘍は、血管形成が無いと１
または２mm以上には増殖できない（フォークマン（Folkman, J.）、New Engl. J
. Med. 285:1182-1186 [1971]；フォークマン（Folkman, J.）とクラーグスバー
ン（Klagsburn, M.）(1987) Science 235:442-447 [1987]）。この試験で使用し
たヒト癌細胞株は、顕著な固形腫瘍（直径＞２mm）を形成し、活発な血管形成を
示した。
【０２３６】 さらに、これらの結果は、ｂＦＧＦ分泌の低下により、例えばプロラクチン（
ＰＲＬ）発現のようなｂＦＧＦ介在経路の発現が変化したため、追加のホルモン
制御カスケードが、本発明のＰＴＴＧ−Ｃペプチドに影響を受けることがあるこ
とを意味する。例えば、ラットプロラクチン（ＰＲＬ）−および成長ホルモン（
ＧＨ）分泌ＧＨ３細胞中の同じヒト野生型ＰＴＴＧ−Ｃ末端ペプチド（配列番号
４のアミノ酸残基１４７〜２０２）の発現は、対照ベクター単独でトランスフェ
クションしたラットＧＨ３細胞、または突然変異ＰＴＴＧ１ Ｃ末端断片（Ｐ１
６３Ａ、Ｓ１６５Ｑ、Ｐ１６６Ｌ、Ｐ１７０Ａ、Ｐ１７２ＡおよびＰ１７３Ｌ、
データは示していない）を発現するＧＨ３細胞と比較して、顕著に低下したＰＲ
Ｌプロモーター活性（約１６倍の低下）、ＰＲＬ ｍＲＮＡ発現（約１０倍の低
下）、およびプロラクチンタンパク質発現（約７２倍の低下）を示した。さらに
、ＰＴＴＧ−Ｃ末端を発現するＧＨ３細胞では、ＧＨ ｍＲＮＡ（約１３倍の増
加）とタンパク質（約３７倍の増加）で補償的増加が観察された。これらの観察
結果は、ＧＨ３細胞中で発現されたＰＴＴＧカルボキシ末端ペプチドが、ＰＲＬ
遺伝子発現を抑制しＧＨ発現を増強することにより、ホルモン分泌パターンを変
化させることを証明している。
【０２３７】 例１７：正常細胞と白血病Ｔリンパ球中のＰＴＴＧの発現 細胞培養。健常ヒト成人の新鮮な末梢静脈血からの単核細胞の陽性選択により
、Ｔリンパ球を調製した。ある実験では、アメリカ赤十字の匿名のドナーのロイ
コパック（leukopack）調製物を使用した。単核血液細胞を、リンホプレップ（L
ymphopreo）（登録商標）キット（ニコメッドファーマ社（Nycomed Pharma AS）
、オスロ、ノルウェー）を使用して、勾配遠心分離により単離した。ロイコパッ
ク（leukopack）調製物を使用した時、単離した単核細胞をまず１０％ＤＭＳＯ
を補足した９０％胎児牛血清（ＦＢＳ）中で凍結させた。これらの細胞を融解し
、洗浄し、１０％ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させた。ヒト
ジューカット（Jurkat）白血病Ｔ細胞とヒトＨＬ−６０前骨髄球白血病細胞を、
同じ培地中で増殖させた。
【０２３８】 免疫磁性ビーズ（ダイナル（Dynal）ＣＤ２（登録商標）セレクション（CELLe
ction）（登録商標）キット、ダイナル社（Dynal AS）、オスロ、ノルウェー）
を使用して、２重Ｔ細胞選択を行い、細胞を、固定化抗ヒトモノクローナルＣＤ
３抗体（ファーミンゲンインターナショナル（PharMingen International）、ベ
クトンディッキンソン社（Becton Dickinson Co.））を含有するシャーレ中で培
養することにより、さらに活性化した。抗体固定化は、リン酸緩衝化生理食塩水
（ＰＢＳ）中１mlの抗ＣＤ３溶液（１０μg/ml）を満たした新鮮な６０mmのプラ
スチックシャーレの９０分のインキュベーション（３７℃）により行った。Ｔ細
胞の単離と活性化の間、製造業者が提供するキットのプロトコールを使用した。
ある実験では、植物性血球凝集素（ＰＨＡ、５μg/ml、ギブコビーアールエル（
Gibco BRL））を使用して、休止Ｔ細胞を活性化した。各実験において、細胞を
三重測定の蛍光色素標識抗ＣＤ３／ＣＤ１９／ＣＤ４５抗体（カルタグラボラト
リーズ社（Caltag Laboratories, Inc.）、バーリンゲーム（Burlingame）、カ
リホルニア州）を用いて標識して、次にフローサイトメトリー（ベクトンディッ
キンソン（Becton Dickinson）ファクスキャン（FACScan））を使用する試験に
より、細胞集団中の抗ＣＤ３標識Ｔ細胞の相対量をチェックした。実験では、９
５〜９７％のＴ細胞と０〜０．０５％のＢ細胞を含有する試料を使用した。細胞
はまた、細胞活性化開始後０時間から始めて、ヒドロコーチゾン２１−ヘミスク
シネートのナトリウム塩（０．１〜１μM、シグマ（Sigma）、セントルイス、ミ
ズーリ州）、シクロスポリンＡ（１μg/ml、カルビオケム（Calbiochem）、サン
ジエゴ、カリホルニア州）、ＴＧＦベータ１（１０ng/ml、アールアンドディー
システムズ社（R & D Systems Inc.）、ミネアポリス、ミネソタ州）、アフィジ
コリン（１μg/ml、カルビオケム（Calbiochem））、ノコダゾール（５００ng/m
l、カルビオケム（Calbiochem））で処理した。ディソルバンツ（dissolvants）
（０．１％Ｃ2Ｈ5ＯＨ（アフィジコリン）と０．２％ＤＭＳＯ（ノコダゾール）
）についての対照実験は、ＰＴＴＧ ｍＲＮＡ発現への影響の証拠を示さなかっ
た。
【０２３９】 ノーザンブロット解析。トリゾール試薬（TRIzol Reagent）（ギブコビーアー
ルエル（Gibco-BRL）、グランドアイランド（Grand Island）、ニューヨーク州
）を使用して、総ＲＮＡを単離した；ＲＮＡ（Ｔ細胞について約５μg、ジュー
カット（Jurkat）細胞について約２０μg）を、１％アガロース−ホルムアルデ
ヒドゲルで電気泳動し、ハイボンド−Ｎ膜（アマシャムインターナショナル（Am
ersham International）、英国）にブロットした。膜をＵＶ架橋させ、６８℃で
クイックハイブ（Quickhyb）溶液（ストラタジーン（Stratagene）、ラホヤ（La
Jolla）、カリホルニア州）で１時間プレハイブリダイズさせ、次にランダムプ
ライムした32Ｐ標識ヒトＰＴＴＧ ｃＤＮＡ（２×１０6 cpm/ml）および超音波
処理し変性させたサケ精子ＤＮＡ（ストラタジーン（Stratagene））を補足した
同じ溶液中で６８℃で３時間ハイブリダイズさせた。ＩＬ−２ ｍＲＮＡ発現を
調べると、ＩＬ−２ ｃＤＮＡプローブ（４５７塩基対のサイズ）のＰＣＲ調製
物についてオリゴヌクレオチドセンスとアンチセンスプライマーの配列は、すで
に報告された通りであった（ブッチ（Butch, AW）ら、「胚中心芽細胞によるサ
イトカイン発現」、J. Immunol. 150:39-47 [1993]）。シクロフィリンｃＤＮＡ
プローブは、アンビオン社（Ambion, Inc.）（オースチン、テキサス州）から得
た。膜を、１×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳ中で室温で２回洗浄し（各回２０分）、
次に０．２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳ中で６０℃で１回洗浄（３０分）した。洗
浄後、膜をＸ線フィルム（コダック（Eastman Kodak）、ローチェスター（Roche
ster）、ニューヨーク州）に一晩露光した。
【０２４０】 ウェスタンブロット解析。細胞をエッペンドルフチューブに採取し、使用前に
１％トリトンＸ−１００、１mMフェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）
、１μg/mlアプロチニン、２mMロイペプチンを補足した溶解緩衝液（５０mMヘペ
ス、１５０mM ＮａＣｌ、１０mM ＥＤＴＡ、１０mM Ｎａ4Ｐ2Ｏ7、１００mM
ＮａＦ、２mM オルトバナジウム酸ナトリウム、ｐＨ７．４）中で、氷上で１
５分溶解した。溶解した細胞上清中のタンパク質濃度を測定し、５０μgのタン
パク質を含有するアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で希釈し、５分沸
騰させ、冷却し、遠心分離し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。タンパク質
を、ＰＶＤＦイモビロン−Ｐ膜（ミリポア（Millipore）、ベッドフォード（Bed
ford）、マサチューセッツ州）上に移した。膜を、ヒトＰＴＴＧポリペプチド断
片に対するポリクローナルウサギ抗血清（１：３，０００希釈）で４℃で一晩イ
ンキュベートし、次にペルオキシダーゼ結合２次抗体（サンタクルツバイオテク
ノロジー（Santa Cruz Biotechnology）、サンタクルツ（Santa Cruz）、カリホ
ルニア州）とインキュベートした。ＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（
アマシャム（Amersham））を使用して、ブロットを視覚化した。
【０２４１】 ＦＡＣＳ解析。細胞サイクルパターンを調べるために、細胞を遠心分離してペ
レットにし、冷（４℃）リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１mlのＰ
ＢＳに再懸濁し、次に細胞固定のために２mlの冷メタノールをゆっくり加えた。
【０２４２】 ５００μlのヨウ化プロピジウム（５００μg/ml ＰＢＳ）を１μlのリボヌク
レアーゼＡ（１０単位/μl）とともに加え、細胞懸濁物をボルテックス混合した
。４℃で１時間インキュベーション後、細胞試料を、ベクトンディッキンソン（
Becton Dickinson）ファクスキャン（FACScan）でフローサイトメトリーにより
解析した。解析領域は、少なくとも１０，０００イベントである。次に、これら
のデータについてモドフィット（Modfit）ソフトウェアでマキントッシュコンピ
ューターを使用して、細胞サイクル解析を行った。
【０２４３】 三重測定のマウス抗ＣＤ３／ＣＤ１９／ＣＤ４５蛍光色素標識抗体による細胞
標識は、製造業者のプロトコール（カルタグラボラトリーズ社（Caltag Laborat
ories, Inc.）、バーリンゲーム（Burlingame）、カリホルニア州）を使用して
行った。１５μlのカルタグ（Caltag）３重抗体を１００μlの細胞懸濁物に加え
、次に１８０μlのＰＢＳを加えて静かに混合した。チューブを暗所で室温で１
５分インキュベートし、カルライズ（Cal-Lyse）溶解液（カルタグラボラトリー
ズ社（Caltag Laboratories, Inc.））を使用して細胞を固定し、３分の脱イオ
ン水で洗浄し、遠心分離してペレットとし、１mlの冷ＰＢＳに再懸濁した。ベク
トンディッキンソン（Becton Dickinson）ファクスキャン（FACScan）を使用し
てフローサイトメトリーを行った。 すべての実験は少なくとも３回繰り返し、代表的な実験の結果を以下に示す。
【０２４４】 ＰＴＴＧ発現は、Ｔ細胞活性化によりアップレギュレートされた。Ｔ細胞活性
化は、Ｔリンパ球と抗原提示細胞との複雑な相互作用が必要であることは公知で
ある（クラブツリー（Crabtree GR）、クリプストーン（Clipstone NA）、「Ｔ
リンパ球の原形質膜と核の間のシグナル伝達」、Annu Rev Biochem. 63:1045-10
83 [1994]）。主要組織適合遺伝子複合体とのＴ細胞受容体の相互作用は、Ｔ細
胞活性化のための最も重要なシグナルを生成させるが、ここではある接着性相互
作用ならびに同時刺激性分子が特に重要である。Ｔ細胞表面分子は、２つの方法
で同時刺激シグナルを与えるようである：ＴＣＲ／ＣＤ３複合体により生成され
る第２メッセンジャー（例えば、ＣＤ２）により定量的に、またはＴＣＲ／ＣＤ
３複合体が生成するものとは異なる細胞内生化学的シグナルを生成することによ
り定性的（例えば、ＣＤ２８）に。陽性Ｔ細胞のために我々が使用した方法は、
抗ＣＤ２被覆免疫磁性ビーズへのＴ細胞結合と次に抗ＣＤ３被覆プレート中の細
胞培養である。免疫磁性ビーズ自体は、Ｔ細胞を活性化することができなかった
（ＰＴＴＧ ｍＲＮＡ発現と細胞サイクルの増加は観察されなかった）が、Ｔ細
胞の同時刺激物質として機能することができた。この示唆するところの間接的説
明は、細胞ソーターを使用して単離したＴ細胞は、固定化抗ＣＤ３抗体でもＰＨ
Ａでも活性化できなかったという我々の観察結果（この試験にはデータは示して
いない）かも知れない。
【０２４５】 休止ヒトＴ細胞をＴ細胞分裂促進因子ＣＤ３抗体で処理した後、Ｔ細胞は、順
にＳ期とＧ２／Ｍ期に入ることにより証明されるように、増殖を始めた（図５）
。ＰＴＴＧ ｍＲＮＡ発現は、休止Ｔ細胞中ではほとんど存在しなかったが、Ｓ
期とＧ２／Ｍ期の細胞の割合が多くなると、劇的に増加した。休止Ｔリンパ球細
胞を別々の分裂促進因子（植物性血球凝集素［ＰＨＡ］）で刺激すると、Ｔ細胞
増殖とＴ細胞発現について同様の経時変化が見られた（データは示していない）
。３日間のＰＨＡ刺激後のＴ細胞増殖とＰＴＴＧ発現は同様に、５μg/mlまでの
ＰＨＡ濃度に依存した（図６）。より高濃度のＰＨＡは、Ｓ期をさらに増加させ
たが、Ｇ２／Ｍ期は減少させ、ＰＴＴＧ発現にはまったく影響がなかった。
【０２４６】 ＩＬ−２は最も重要な早期Ｔ細胞活性化遺伝子である（クラブツリー（Crabtr
ee GR）、クリプストーン（Clipstone NA）、「Ｔリンパ球の原形質膜と核の間
のシグナル伝達」、Annu Rev Biochem. 63:1045-1083 [1994]；ワイス（Weiss A
.）、「Ｔリンパ球活性化」、ポール（Paul WE）編、「基礎免疫学（Fundamenta
l Immunology）」、第３版中、ニューヨーク州：ラーベンプレス社（Raven Pres
s, Ltd.）、[1993] pp. 467-497；クロンケ（Kronke, M.）ら、「シクロスポリ
ンＡはｍＲＮＡ転写のレベルでＴ細胞増殖因子遺伝子発現を阻害する」、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81:5214-5218 [1984]）。
【０２４７】 遅い時期にアップレギュレートされたＰＴＴＧ発現に対して、インターロイキ
ン２（ＩＬ−２）発現は、早期に、細胞増殖の前に上昇した（図７）。ＩＬ−２
発現はまず、細胞がＳまたはＧ２／Ｍ期に入るかなり前に、固定化した抗ＣＤ３
抗体適用により誘導した６時間後に上昇し、この期のＩＬ−２発現は細胞増殖に
依存しないことを示している。この時、ＰＴＴＧ ｍＲＮＡ発現もＳ期の有意な
量も見られなかった。別の期のＩＬ−２上昇発現は、Ｔ細胞活性化の開始後、Ｔ
細胞が増殖し初めてから、４８時間後に起きた。この時、相当量のＰＴＴＧ ｍ
ＲＮＡとＳ期およびＧ２／Ｍ期の細胞が観察され、これはＩＬ−２ ｍＲＮＡが
増殖するＴ細胞によりすでに産生されたことを意味する。
【０２４８】 細胞内シクロスポリンＡ結合タンパク質でもあるハウスキーピング遺伝子であ
るシクロフィリンはまた、Ｔ細胞をＰＨＡで活性化すると、増加した（図８）。
シクロフィリンは、細胞内シクロスポリンＡ結合タンパク質として機能すること
は公知である（クラブツリー（Crabtree GR）、クリプストーン（Clipstone NA
）、「Ｔリンパ球の原形質膜と核の間のシグナル伝達」、Annu Rev Biochem. 63
:1045-1083 [1994]）。シクロフィリンは、ポリペプチド基質中のプロリン残基
のシス−トランス異性体化の触媒に関与する、ペプチジルプロリル−シス−トラ
ンスイソメラーゼ活性を有する。この酵素活性は、おそらく活性型への不活性な
シグナル伝達中間体の正しい折り畳みを触媒することにより、Ｔ細胞シグナル伝
達カスケードにおいて重要な役割を果たす。しかし、この単純化モデルは、シク
ロスポリンＡ作用の主要な機構ではないという強硬な主張がある。シクロスポリ
ンＡ−シクロフィリン複合体は、転写因子ＮＦ−ＡＴ（核因子−活性化Ｔ細胞）
の核エントリーを制御することにより、カルシネウリン（calcineurin）（カル
シウム／カルシウム−制御セリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼ）の作
用を阻止することができ、これによりＴ細胞特異的ＩＬ−２遺伝子発現が制御さ
れる。（クラブツリー（Crabtree GR）、クリプストーン（Clipstone NA）、「
Ｔリンパ球の原形質膜と核の間のシグナル伝達」、Annu Rev Biochem. 63:1045-
1083 [1994]）。我々は、ＰＨＡ誘導性Ｔ細胞活性化の後に、シクロフィリンｍ
ＲＮＡ発現のレベルが大きく上昇していることを見いだし、これは、休止Ｔ細胞
がより高いシクロフィリンレベルを有しているため、活性化Ｔ細胞が、休止Ｔ細
胞よりシクロスポリンＡの作用に対してより感受性であることを示している。
【０２４９】 両方のＩＬ−２（クラブツリー（Crabtree）、クリプストーン（Clipstone）[
1994]）とＰＴＴＧ（カカー（Kakar SS）、「分子クローニング、ゲノム構成、
およびヒト下垂体腫瘍形質転換遺伝子のプロモーターの同定」、Gene 240:317-3
24 [1999]）遺伝子プロモーターは、ＡＰ−１結合領域を含有することが知られ
ており、これは、これらの２つの遺伝子の発現の共通のレギュレーターの存在を
示唆する。また、公知の免疫抑制剤シクロスポリンＡは、ＩＬ−２遺伝子抑制を
介してＴリンパ球に対するその阻害作用を示し、これがＴ細胞中のＤＮＡ合成の
阻害に至ることが認められている（クラブツリー（Crabtree GR）とクリプスト
ーン（Clipstone NA） [1994]；クロンケ（Kronke, M.）ら、「シクロスポリン
ＡはｍＲＮＡ転写のレベルでＴ細胞増殖因子遺伝子発現を阻害する」、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 1984, 81:5214-5218 [1984]）。
【０２５０】 糖質コルチコイドは（シクロスポリンＡとは）異なる細胞内受容体を有するが
、これらは、Ｔ細胞でのＩＬ−２とインターフェロン−ガンマ産生を抑制し、Ｉ
Ｌ−４の産生を促進することも証明されている（クレリシ（Clerici M）、トラ
バトニ（Trabattoni D）、ピコニ（Piconi S）ら、「ヒト免疫不全症ウイルスの
進行におけるコルチゾール／抗コルチゾールの不均衡の可能な役割」、Pssychon
euroendocrinology 22、増刊、1:S27-S31 [1997]）。糖質コルチコイドの作用に
ついて既に記載されている別の機構は、Ｔ細胞アポトーシスの誘導に基づく。（
シドロウスキー（Cidlowski JA）ら、「免疫系における糖質コルチコイド誘導ア
ポトーシスの生化学と分子生物学」、Recent Prog Horm Res. 51:457-490 [1996
]）。我々は、ヒドロコーチゾンによる、ＰＴＴＧ ｍＲＮＡ発現とＳ期とＧ２
／Ｍ期のＴ細胞の量の両方の、用量依存性阻害を見いだしたが、低用量（最終濃
度２０nM）では、このステロイドホルモンは、これらの指標をわずかに上昇させ
た。免疫抑制剤ヒドロコーチゾン（図９）とシクロスポリンＡ（図１０）は、Ｐ
ＨＡ刺激Ｔ細胞増殖とＰＴＴＧ発現を阻害した。シクロスポリンＡの阻害作用は
はるかに強く、ヒドロコーチゾン作用は、低用量ではわずかに刺激性であり、１
００nMより高い濃度では阻害性であった。これらの結果は、ＰＴＴＧ発現がＴ細
胞増殖に関連することをさらに示した。一般に、非常に高濃度の存在下でも、一
部のＰＴＴＧ発現とＴ細胞サイクリングが観察され、一方シクロスポリンＡは、
はるかに強くＴ細胞機能を抑制する。ヒドロコーチゾンは、ジューカット（Jurk
at）白血病Ｔ細胞株中で、ＰＴＴＧ発現を阻害しなかったことも注意されたい（
後述）。
【０２５１】 白血病細胞中のＰＴＴＧ発現。ヒト白血病細胞株ＨＬ−６０とジューカット（
Jurkat）は、Ｓ期の細胞の存在により示されるように、ＣＤ３またはＰＨＡの無
い１０％ＦＢＳ補足ＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖する（図１１）。ＨＬ−６０
とジューカット（Jurkat）細胞中のＰＴＴＧ ｍＲＮＡの豊富さは、ＰＨＡまた
はＣＤ３抗体による活性化Ｔ細胞中のものに匹敵した。使用した３つの免疫抑制
剤（シクロスポリンＡ、ヒドロコーチゾン、およびＴＧＦ−β１）の中で、シク
ロスポリンＡのみが、正常Ｔ細胞とジューカット（Jurkat）Ｔ細胞中でＰＴＴＧ
ｍＲＮＡ発現と細胞サイクリングに対して同様に作用し、ヒドロコーチゾンと
ＴＧＦ−β１の作用は、これらの２つの実験モデルのそれぞれに特異的であった
。
【０２５２】 細胞サイクル依存性ＰＴＴＧ発現。我々は、ＰＴＴＧ ｍＲＮＡ発現が、細胞
サイクル依存性であり、腫瘍細胞株のＧ２／Ｍでピーク発現があることを証明し
た。我々は、Ｔ細胞中の細胞サイクルへのＰＴＴＧ発現の同様の依存性を見いだ
した。この依存性は、正常Ｔ細胞（図１２）ではジューカット（Jurkat）Ｔ細胞
白血病株（図１３）より、はるかに強かった。正常Ｔ細胞とジューカット（Jurk
at）Ｔ細胞中のＳ期の細胞の量とＰＴＴＧ ｍＲＮＡ発現のレベル中の明らかに
された変化の方向は、大体同じであったが、これらの変化は、おそらくジューカ
ット（Jurkat）細胞の不死性とＰＴＴＧの高基礎レベルのために、悪性ジューカ
ット（Jurkat）Ｔ細胞中で、より低いことがわかった。
【０２５３】 我々は、Ｔ細胞のＣＤ３抗体誘導活性化が、シクロスポリンＡ、ヒドロコーチ
ゾン、アフィジコリン（Ｓ期インヒビター）またはノコダゾール（Ｇ２／Ｍ期ブ
ロッカー）により異なる程度に阻害され、一方ＴＧＦ−β１（１０ng/ml最終濃
度）が、ＰＴＴＧ ｍＲＮＡにもＳ期またはＧ２／Ｍ期の細胞の量にも大きな作
用を示さない（図１２）ことを見いだした。同時に、新鮮な１％または１０％Ｆ
ＢＳも植物性血球凝集素（ＰＨＡ）とホルボール−１２−メリステート−１３−
アセテート（ＰＭＡ）の混合物［すなわち、ＰＨＡ＋ＰＭＡ混合物］も、ジュー
カット（Jurkat）Ｔ細胞中のＰＴＴＧレベルを大きく上昇させず、この混合物は
これをさらに低下させた。比較のためにジューカット（Jurkat）Ｔ細胞を使用し
て、これらをＰＨＡ＋ＰＭＡで処理し、これは、１％ＦＢＳ補足培地中で４８時
間培養後、ジューカット（Jurkat）Ｔ細胞について分裂促進作用のために使用し
た。Ｓ期細胞の量の変化はまた、ＰＴＴＧ ｍＲＮＡ発現のレベルの変化に平行
していた。シクロスポリンＡとＴＧＦ−β１は、ＰＴＴＧ ｍＲＮＡレベルとＳ
期ジューカット（Jurkat）細胞の量の両方を低下させ、ヒドロコーチゾンは１０
μMの最終濃度で使用してもこれらの指数を変化させなかった（データは示して
いない）。
【０２５４】 ＴＧＦ−β１は、細胞機能へのその双方向性作用（細胞標的の性質とその処理
条件に強く依存する細胞増殖を含む）について公知である。同時に、ジューカッ
ト（Jurkat）Ｔ細胞を使用した時、我々は、ＰＴＴＧ ｍＲＮＡ発現と細胞サイ
クリングのＴＧＦ−β１惹起阻害を検出した。この作用は、培地に加えた新鮮な
ＦＢＳの存在下では観察されなかった（データは示していない）が、ＰＨＡ＋Ｐ
ＭＡ混合物によるジューカット（Jurkat）細胞の処理後にのみ見られた。
【０２５５】 これらの結果は、ＰＴＴＧの発現が正常Ｔ細胞中で容易に制御可能であること
を示す。これは、非特異的（ＰＨＡ）および特異的（抗ＣＤ３抗体）Ｔ細胞アク
チベーターの両方によって、高レベルまで誘導され、この誘導は、公知の免疫抑
制剤であるシクロスポリンＡとヒドロコーチゾンにより阻害することができる。
予備データは、ＰＴＴＧ Ｃ末端領域をコードするＤＮＡによるＰＨＡ活性化Ｔ
細胞のトランスフェクションは、Ｓ期細胞の量と細胞サイクルのＧ２／Ｍ期の蓄
積の低下を引き起こすことを示したことは、重要である。
【０２５６】 興味深いことに、ヒドロコーチゾンは、Ｔ細胞機能の研究に広く使用されてい
るジューカット（Jurkat）Ｔ細胞株中でのＰＴＴＧ発現を阻害せず、他の免疫モ
ジュレーターであるＴＧＦ−β１は、正常Ｔ細胞中のＰＴＴＧ発現に影響を与え
なかったが、ジューカット（Jurkat）細胞中ではこれを低下させた。すなわち、
ジューカット（Jurkat）Ｔ細胞株中で機能するＰＴＴＧの研究の結果は、おそら
く悪性腫瘍細胞中のＰＴＴＧ癌遺伝子の高い基礎レベルの発現のために、正常Ｔ
細胞について直接適用できない。
【０２５７】 正常Ｔ細胞とジューカット（Jurkat）Ｔ細胞株はまた、細胞サイクルインヒビ
ター（アフィジコリンとノコダゾール）の作用に対して異なる感受性を有した。
アフィジコリンは、ジューカット（Jurkat）細胞をＳ期で停止させてＧ２／Ｍ期
期の量を減少させたが、ＰＴＴＧ ｍＲＮＡレベルの有意な変化は観察されなか
った（データは示していない）。ノコダゾールは、これらの細胞をＧ２／Ｍ期で
停止させ、Ｓ期の細胞は、その存在下であまり検出されず、ジューカット（Jurk
at）細胞のノコダゾール処理後に、ＰＴＴＧ ｍＲＮＡ発現の一部の増加が観察
された。おそらく、正常Ｔ細胞は、細胞サイクルインヒビターの毒性作用に対し
てより感受性であり、その存在下でＰＴＴＧｍＲＮＡレベルとサイクリング細胞
の量の両方が低下した。
【０２５８】 本明細書に記載の結果は、ＰＴＴＧの標的化とＰＴＴＧ発現が、抗新生物治療
法と免疫抑制治療法の両方に有用であることを示す。
【０２５９】 本発明は、特定の作用機構に限定も依存もしないが、正常なＴ細胞活性化中の
ＰＴＴＧ ｍＲＮＡ誘導と平行したＳ期の上昇は、ＰＴＴＧ細胞形質転換作用の
機構がその過剰発現にあり、その結果、姉妹染色分体分離と異数性に対する制御
ミスではなく細胞サイクリングを上昇させることを意味する。
【０２６０】 例１８：乳房腫瘍と卵巣腫瘍組織中のＰＴＴＧ１発現 患者と組織。乳房腫瘍（ｎ＝１３）と卵巣腫瘍（ｎ＝１５）の別々の試料を、
切除術後の連続的非選択患者から得て、液体窒素中に浸漬して−７０℃に保存し
たか、または分析のために１０％ホルマリン中に固定した。正常乳房（ｎ＝１４
）と卵巣（ｎ＝９）剖検組織は、メリーランド大学（ボルチモア（Baltimore）
）の発生疾患のための脳と組織バンク（Brain & Tissue Banks for Development
al Disorders）から得た（平均±ＳＥＭ年齢：４４±７．２才）。２８の腫瘍組
織のうちの２５と２３の正常組織のうちの２０から、非分解ＲＮＡを得て、さら
なる分析のために使用した。乳癌の１２症例（平均±ＳＥＭ年齢：６０±３．５
才）と卵巣癌の１３症例（平均±ＳＥＭ年齢：５６±４．９才）（表２１）を調
べた。組織学的評価は、病理学者が独立に記録した。
【０２６１】 細胞培養。ＡＴＣＣから得られたＭＣＦ−７（乳癌）、ＭＤＡ−ＭＢ２３１（
エストロゲン受容体［ＥＲ］陰性乳癌細胞）とＳＫＯＶ−３（卵巣癌）細胞を、
１０％ＦＣＳを有するフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ中で維持し、デキス
トラン被覆活性炭（ＣＳＳ）で３日間前処理した後、既に記載されている（ヒー
ネイ（Heaney A.P.）ら、[1999]）ようにジエチルスチルベストロール（１０-8
Ｍと１０-10Ｍ）、およびＩＣＩ−１８２７８０（トクリス（Tocris））（１０- 7 Ｍと１０-8Ｍ）で４８時間処理した。
【０２６２】 ノーザンブロット解析。細胞培養物（〜３×１０7 細胞）と切り出した組織か
ら、トリゾル（TRIzol）で総ＲＮＡを抽出した。ＪＥＧ−３絨毛癌細胞から得ら
れたＲＮＡを、ＰＴＴＧ１発現の陽性対照とした。電気泳動したＲＮＡをハイボ
ンド（Hybond）−Ｎナイロン膜（アマシャムインターナショナル（Amersham Int
ernational）、バッキンガムシャー（Buckinghamshire）、英国）に移し、既に
記載されている（ヒーネイ（Heaney A.P.）ら、[1999]）ようにヒトＰＴＴＧ
ｃＤＮＡと６８℃でハイブリダイズさせた。ＰＴＴＧ ｍＲＮＡ発現を、β−ア
クチン発現に対して標準化し、同じ個体（８つの乳房症例）からの一致した正常
粘膜に対する増加倍数として、または正常乳房（ｎ＝１３）と卵巣組織（ｎ＝７
）中で測定した平均ＰＴＴＧ／アクチン比として表した。
【０２６３】 ウェスタンブロット解析。ＲＩＰＡ緩衝液（ヒーネイ（Heaney A.P.）ら、[19
99]）を使用して、乳房および卵巣組織からタンパク質を調製し、ローディング
緩衝液中で変性させ、可溶性タンパク質（ブラッドフォード測定法により５０μ
g）を電気泳動（１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、ＰＶＤＦ膜（アマシ
ャム（Amersham））に移し、ＰＢＳ−０．０５％ツイーン溶液中の５％脱脂乳中
でインキュベートし、次にＰＴＴＧに対する抗体（１：５０００）とβ−アクチ
ンに対する抗体（１：２５００；シグマ（Sigma））とインキュベートした。ブ
ロットを洗浄し、適当な西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ＩｇＧとインキュベ
ートさせ、洗浄し、次に複合体をＥＣＬ化学発光検出により視覚化した。 差は、適宜ＡＮＯＶＡまたは対応のないｔ検定により評価した。
【０２６４】結果 ＰＴＴＧ１は乳房腫瘍と卵巣腫瘍で過剰発現される。ＰＴＴＧ ｍＲＮＡ発現
の増加は、正常乳房または卵巣組織と比較して、それぞれ乳癌１２症例のうちの
１２と卵巣癌１３症例のうちの１２（乳癌は２．５±０．３倍の増加；卵巣癌は
３．５±０．６倍の増加）で観察された。最も高いＰＴＴＧ ｍＲＮＡ発現は、
乳癌または卵巣に限局された腫瘍（乳房腫瘍は１．９±０．３５倍の増加卵巣腫
瘍は３．２±１．０倍の増加を示した）と比較して、周りのリンパまたは血管構
造中に浸潤した乳房腫瘍および卵巣腫瘍で、検出された（乳房腫瘍は３．５±０
．４５倍の増加；卵巣腫瘍は３．８±０．７倍の増加を示した）が、この差は乳
房腫瘍では統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．０３）。
【０２６５】 表２１．乳癌と卵巣癌におけるＰＴＴＧ１発現 番号 患者年齢 診断 リンパ節侵襲 ＰＴＴＧ発現 （上昇倍率） 乳房腫瘍 １ ４９ ＣＡＩa ＮＡ ２．７ ２ ５８ ＣＡＩ 陰性 １．３ ３ ８３ 浸潤性導管Ｃａb 陰性 ２．３ ４ ４２ 侵襲性導管Ｃａ 陰性 １．０ ５ ８０ 浸潤性導管Ｃａ 陰性 １．３ ６ ５６ 侵襲性導管Ｃａ（ムチン性） 陰性 ２．０ ７ ５３ 侵襲性導管Ｃａ（管状） 陰性 １．２ ８ ６７ 浸潤性導管Ｃａ 陰性 ３．９ ９ ５６ 侵襲性導管Ｃａ 陰性c ３．８ １０ ６５ 侵襲性導管Ｃａ 陽性 ４．１ １１ ５２ 浸潤性導管Ｃａ 陽性 ２．２ １２ ６２ 浸潤性導管Ｃａ 陽性 ４．０ ２．５±０．３ （平均±ＳＥＭ） 卵巣腫瘍 １３ １８ セルトリ‐ライテ゛ィッヒ細胞腫 陰性 １．９ １４ ４５ 子宮内膜Ｃａ 陰性 ０．９ １５ ６２ 子宮内膜Ｃａd 陰性 ２．２ １６ ５７ 漿液性嚢腺腫 陰性 ４．９ １７ ６２ ミュラー乳頭腺Ｃａ（ＨＧ）e 陰性 ６．３ １８ ５０ ムチン性嚢腺腫 陽性 １．１ １９ ４７ 嚢腺腫（ＨＧ）e 陽性 １．８ ２０ ６７ 漿液性乳頭腺Ｃａ（ＨＧ） 陽性 ３．３ ２１ ６７ 漿液性乳頭腺Ｃａ（ＨＧ） 陽性 ３．３ ２２ ８２ 腺Ｃａ（ＨＧ） 陽性 ３．８ ２３ ４８ ミュラー漿液性乳頭腺Ｃａ 陽性 ４．２ ２４ ５１ ミュラー腺Ｃａ（ＨＧ） 陽性 ５．１ ２５ ７８ ミュラー漿液性乳頭腺Ｃａ（ＨＧ） 陽性 ７．６ ３．５±０．６ （平均±ＳＥＭ） b Ｃａ＝癌 c リンパ血管侵襲存在 d 両側性関与 e ＨＧ＝高グレード
【０２６６】 この研究のほとんどの閉経後の女性からの乳房腫瘍と卵巣腫瘍中の、ＰＴＴＧ
のエストロゲン制御とその過剰発現は、パラドックスに思えるかも知れない。し
かしエストロゲンは、閉経前および閉経後の女性の重要な増殖因子であり、ホル
モン依存性乳癌の罹患率は、乳癌の頻度と同様に、年齢とともに上昇する。閉経
後は、末梢組織が、腫瘍増殖を刺激するのに充分な濃度のエストラジールを産生
して、ＥＲ陽性の乳房腫瘍の閉経後女性の約８０％が、抗エストロゲン治療に応
答し、アジュバントタモキシフェンは、閉経後女性の標準的治療法である（ウェ
イドナー（Weidner, N.）ら、「腫瘍血管形成：早期乳癌の新しい重要な独立し
た予測因子」、J. Natl. Cancer Inst. 1992; 84:1875-87 [1992]）。
【０２６７】 エストロゲンは乳癌と卵巣癌細胞のＰＴＴＧ１発現をインビトロで制御し、腫 瘍エストロゲン受容体発現と相関する 。エストロゲン（ジエチルスチルベストロ
ール １０-8〜１０-10Ｍ）は、ＭＣＦ−７乳癌細胞（図１５ａ；ｐ＜０．０１
）および卵巣癌細胞（図１５ｂ、挿入図）中のＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡ発現の約２
〜９倍の増加を誘導した。ＰＴＴＧ１のエストロゲン介在誘導は、抗エストロゲ
ンＩＣＩ−１８２７８０（１０-7Ｍ〜１０-8Ｍ）と同時インキュベートすること
により、部分的に阻害または阻止された（図１５、ｐ＜０．０１）。ＰＴＴＧ１
ｍＲＮＡ発現は、エストロゲンによるエストロゲン受容体（ＥＲ）陰性ＭＤＡ
−ＭＢ２３１乳癌細胞の治療後に、変化せず（データは示していない）、エスト
ロゲン介在ＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡ誘導のためのＥＲの動員を確認している。
【０２６８】 ＰＴＴＧはｂＦＧＦ分泌を制御（ペイ（Pei, L.）とメルメド（Melmed S.）、
「下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）の単離と性状解析」、Mol. Endocrino
l. 11:433-441 [1997]）し、ｂＦＧＦはＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞中のＰＴＴＧを
制御する。従って、ここで観察されたＩＣＩ−１８２７８０によるエストロゲン
誘導性ＰＴＴＧの不完全な抑制は、その作用が抗エストロゲンにより変わらない
培地由来増殖因子のせいかも知れない。乳癌と卵巣癌は、その起源が上皮であり
、正常と腫瘍組織の間質／上皮成分が異なる可能性があるため、その解釈には注
意する必要がある。間質は細胞性が乏しいため、そして試料の総ＤＮＡまたはＲ
ＮＡ含量にほとんど寄与しない（オー−ウィーバー（Orr-Weaver, T.L.）、「姉
妹を分離する困難さ」、Science 285:344-345 [1999]）ため、正常乳房組織での
発現と比較して、ノーザンブロット解析およびウェスタンブロット解析を使用す
る乳房腫瘍および卵巣腫瘍における豊富なＰＴＴＧ発現の検出は、適切と思われ
、他の研究（オー−ウィーバー（Orr-Weaver, T.L.）、[1999]）により証明され
る。
【０２６９】 例１９：ＰＴＴＧ−Ｃは細胞障害性抗癌剤による治療に対して癌細胞を過剰感作 する 癌細胞中のＰＴＴＧ−Ｃ（ｗｔＰＴＴＧ Ｃ末端）の同時発現は、ＰＴＴＧ介
在シグナル伝達を破壊し、軟寒天中のコロニー形成とヌードマウス中のインビボ
の腫瘍形成を妨害する（前述の例１６を参照）。さらに、癌細胞（例えば、特に
限定されないが、乳癌および卵巣癌細胞）中のＰＴＴＧ−Ｃの発現は、パクリタ
キセル（タキソール（Taxol））のような細胞障害性抗癌剤による治療に対して
細胞を過剰感作する。例えば図１６と１７は、パクリタキセルによるｗｔＰＴＴ
Ｇ Ｃ末端トランスフェクションＭＣＦ−７の治療（安定なトランスフェクショ
ン）は、対照ベクターでトランスフェクションした細胞中でコロニー形成を阻害
するのに必要な用量（１０-9Ｍ）より低い用量（１０-11〜１０-10Ｍ）で、コロ
ニー形成を阻害した。（図１６と１７）。
【０２７０】 例２０：ＰＴＴＧによる血管形成の調節 材料：ラットテイルコラーゲンＩ型は、シグマケミカル（Sigma Chemical）（
セントルイス、ミズーリ州）から得られ、改変ボイデンチャンバーとトランスウ
ェルズ（Transwells）（登録商標）は、コーニングコスター（Corning Coster）
（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）から得られた。ヒトの組換え抗ｂＦＧＦ
抗体と免疫前ヤギＩｇＧは、アールアンドディーシステムズ（R & D Systems）
（ミネアポリス、ミネソタ州）から購入し、増殖因子低下マトリゲル基底膜マト
リックス（ジーエフアールマトリゲル（GFR Matrigel））はベクトンディッキン
ソン（Becton Dickinson）（ベッドフォード、マサチューセッツ州）から得て、
受精ホワイトレッグホーンニワトリ卵は、チノバレイランチャーズ（Chino Vall
ey Ranchers）（アルカジア（Arcadia）、カリホルニア州）から得られた。すべ
ての化学品は、入手できる最も高い市販のグレードである。 細胞培養。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１０％子ウシ血清（ＢＣＳ）と抗生物質を補
足した低グルコースＤＭＥＭ（ギブコビーアールエル（Gibco BRL））で培養し
た。ＨＵＶＥＣ（クロネティクス（Clonetics）、サンジエゴ、カリホルニア州
）を、ＥＧＭ中で販売業者の説明書に従って増殖させ、すべての実験について１
０継代未満まで増殖させた。
【０２７１】 既に記載されている（ザング（Zhang, X.）ら、「ヒト下垂体腫瘍形質転換遺
伝子（ＰＴＴＧ）の構造、発現および機能」、Mol. Endocrinol. 13:156-166 [1
999]）ように、野生型、変異体ｈＰＴＴＧ、またはベクター単独を発現する安定
にトランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞（２×１０6 ）を、１００mmの
ゼラチン化プレートに蒔いた。ウェスタンブロット解析は、野生型ＰＴＴＧと変
異体ＰＴＴＧトランスフェクション細胞の両方で、等量のＰＴＴＧタンパク質が
発現されることを確認した。２４時間後、維持培地を、１０mlの無血清ＤＭＥＭ
で置換し、細胞をさらに４８時間インキュベートした。この調整培地（ＣＭ）を
次に、野生型ｈＰＴＴＧ（ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ）、変異体ｈＰＴＴＧ（Ｍ−
ｈＰＴＴＧ−ＣＭ）、およびベクター単独（Ｃ−ＣＭ）でトランスフェクション
したＮＩＨ３Ｔ３細胞、および非トランスフェクションＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ｎ−
ＣＭ）から採取し、各ＣＭ型は、無菌の０．２μm孔径フィルターで別々にろ過
して、細胞破片を除去し、次にさらに試験するまで保存した。
【０２７２】 ｂＦＧＦ ＥＬＩＳＡ。調整培地（１ml）をスピードバック（Speed Vac）（
サバント（Savant）、ファーミングデール（Farmingdale）、ニューヨーク州）
で凍結乾燥し、１００mlのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、ｂＦ
ＧＦ濃度を測定した（クアンチキンＨＳヒトＦＧＦ基礎免疫測定法キット（Quan
tikine HS Human FGF Basic Immuoassay Kit）、アールアンドディーシステムズ
（R & D Systems））。
【０２７３】 内皮細胞増殖測定法。ＨＵＶＥＣを４８ウェルのゼラチン化培養プレート上に
約５０００細胞／ウェルで２４時間蒔いた。次に、培地を、前述のトランスフェ
クションまたは非トランスフェクションＮＩＨ３Ｔ３細胞の培養物から得られた
等量のＣＭで置換した。陽性対照として、ＤＭＥＭを１ng/mlの組換えヒトｂＦ
ＧＦで強化し、陰性対照として、無血清ＤＭＥＭを使用した。各ＣＭ中のｂＦＧ
Ｆの活性を調べるために、まず１００ng/mlの抗ｂＦＧＦ抗体と免疫前ヤギＩｇ
Ｇを各ＣＭに加えた。４８時間後、ＨＵＶＥＣ細胞をトリプシン処理し、コール
ターカウンター（コールターエレクトロニクス（Coulter Electronics）、ハイ
アレア（Hialeah）、フロリダ州）で計測した。すべての実験は、三重測定で行
った。
【０２７４】 傷害移動測定法。傷害測定法は、すでに記載された（サトウ（Sato, Y）とリ
フキン（Rifkin, DB）、「塩基性繊維芽細胞増殖因子のオートクリン活性：内皮
細胞移動、プラスミノーゲンアクチベータ合成、およびＤＮＡ合成の制御」、J.
Cell Biol. 107:1199-1205 [1988]）ものを若干修飾して行った。３５mmのゼラ
チン化培養プレートのＨＵＶＥＣのコンフルエンス単層を、カミソリの刃で押し
て細胞シートを切ってプレートにマークして傷をつけた。刃を静かに一方に動か
して、シートの一部を除去する。次に、細胞をＰＢＳで２回洗浄する。上記のト
ランスフェクションした３Ｔ３細胞由来ＣＭを適用し、ＨＵＶＥＣをＣＭ中でさ
らに１６時間インキュベートした。次に細胞を、無水メタノールで固定し、ギム
ザ染色し、写真を取った。接眼グリッドを有する顕微鏡下で、切断端から１００
μM×２５００μM切片で細胞を計測して、移動を定量した。値は、３つのランダ
ムな視野からの平均を示す。すべての実験は、三重測定で繰り返した。
【０２７５】 改変ボイデンチャンバー測定法。移動はまた、すでに記載された（リーブズレ
イ（Leavesley DI）ら、「インテグリンベータ１−およびベータ３−介在内皮細
胞移動は、明確なシグナル伝達機構を介して開始される」、J. Cell Biol. 121:
163-170 [1993]）ものを若干修飾して、６．５mm、８．０μmのトランスウェル
ズ（Transwells）（登録商標）を用いて測定した。ポリカーボネート膜を０．１
％ゼラチン（３７℃で１時間）被覆した。６００μlの各ＣＭ試料を、下のチャ
ンバーに入れ、３７℃で３０分インキュベートした。増殖因子を含まない培地中
で１６時間培養したサブコンフルエントなＨＵＶＥＣを採取し、洗浄し、無血清
ＤＭＥＭ（１００μl）中に再懸濁し、上のチャンバーに入れた。２４時間後、
膜の上の面から綿棒ですべての非移動細胞を取り出し、下の面の移動細胞を無水
メタノールで固定し、ギムザ染色し、写真を撮った。定量分析のために、次に染
色細胞を１０％酢酸で抽出し、吸光度を５９５nmで測定した。
【０２７６】 管形成測定法。ＨＵＶＥＣの毛細管様構造形成の測定は、市販のジーエフアー
ルマトリゲル（GFR Matrigel）を用いて行った。２４ウェルプレートを、３００
μlのジーエフアールマトリゲル（GFR Matrigel）（１１mg/ml）で被覆し、３７
℃で３０分インキュベートしてゲル化を促進した。５００μlアリコートの試料
ＣＭに懸濁したＨＵＶＥＣを各ウェルに加え、最終培養物を約５×１０4 細胞／
ウェルとした。２４時間インキュベーション後、位相差顕微鏡により管形成測定
を評価し、スポットカラーデジタルカメラ（ダブリューヌスバウム社（W. Nuhsb
aum, Inc.）、マクヘンリー（McHenry）、イリノイ州）で写真を取った。デジタ
ル画像を、ＮＩＨ画像ソフトウェアで縮小して、既に記載されている（ウォジタ
（Wojta, J.）ら、「肝細胞増殖因子は、ヒトケラチン細胞中の血管内皮細胞増
殖因子とプラスミノーゲンアクチベータインヒビター−１と、ヒト内皮細胞中の
血管内皮増殖因子様ｆｌｋ−１の発現を上昇させる」、Lab Invest. 79:427-438
[1999]）ように、画素数を計測した。すべての実験は、三重測定で繰り返した
。
【０２７７】 漿尿膜（ＣＡＭ）測定法。各ＣＭのインビボの血管形成活性を調べるために、
受精受精ホワイトレッグホーンニワトリ卵を、加湿孵卵器中でＣＯ2 無しで３７
℃でインキュベートした（ブルークス（Brooks, PC）ら、「血管形成の研究のた
めの１０日令のニワトリ胚モデルの使用」、Methods Mol Biol. 129:257-269 [1
999]）。３日間インキュベーション後、殻に丸い窓を開け、３mlのアルブミンを
取り出して、ＣＡＭを殻から離した。ＷＴ−ｈＰＴＴＧ、Ｍ−ｈＰＴＴＧ、ベク
ターでトランスフェクションした３Ｔ３細胞とトランスフェクションしていない
３Ｔ３細胞からの１０mlのＣＭを、（スピードバック（SpeedVac））で別々に凍
結乾燥し、再度１００μlのＰＢＳに再懸濁した。５μl ＰＢＳ中１μgのｂＦ
ＧＦを陽性対照として使用し、同様に濃縮した無血清ＤＭＥＭを陰性対照として
使用した。９日目に、濃縮ＣＭ、または陽性もしくは値後対照の５μlを、０．
５mgのラットテイルコラーゲン１型スポンジに適用した。次に、試料をしみこま
せたスポンジをＣＭＡの上に置いた。１３日目に、殻の窓を注意深く拡大し、ス
ポンジと周りのＣＭＡ領域の写真を取った。定量分析のために、コラーゲンスポ
ンジに入る血管の数を、立体顕微鏡で２５×の倍率で計測した。各試料について
３つの卵を使用し、実験は三重測定で繰り返した。
【０２７８】 統計解析。統計解析はスチューデントｔ検定を使用して行った。すべてのＰ値
は両側であり、０．０５未満を有意であるとした。
【０２７９】結果 調整培地中のｂＦＧＦ濃度。 ｈＰＴＴＧはｂＦＧＦ分泌を制御する（ザング（Zhang, X.）ら、「ヒト下垂
体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）の構造、発現および機能」、Mol. Endocrino
l. 13:156-166 [1999]）ため、我々は、無血清培地中で４８時間培養後、安定に
トランスフェクションされた細胞（約２×１０6 ）から得られた調整培地中のｂ
ＦＧＦ濃度を測定した（図１８）。ＷＴ−ｈＰＴＴＧトランスフェクション体か
ら採取したＣＭ中のｂＦＧＦ濃度は１０．５±０．５６pg/mlであり、他のトラ
ンスフェクション細胞株から得られたＣＭ中のｂＦＧＦレベル（［pg/ml] Ｍｕ
ｔ−ｈＰＴＴＧ、３．３±０．２７；Ｃｔｒ−ベクター、２．３±０．７２；正
常３Ｔ３細胞 ３．３±０．５６；ｐ＜０．０１）より顕著に高い。ｍｕｔ−ｈ
ＰＴＴＧ、Ｃｔｒ−ベクターでトランスフェクションした３Ｔ３細胞および正常
３Ｔ３細胞からのＣＭ中のｂＦＧＦ濃度は異ならなかった。ＣＭ採取時の総細胞
数とタンパク質濃度は、各独立の細胞株またはトランスフェクション体について
同様であった。
【０２８０】 内皮細胞増殖測定法。ＨＵＶＥＣを各ＣＭ中で４８時間培養し、次に細胞数を
測定した（図１９）。予測されるように、すべての細胞株から得られたＣＭは、
無血清ＤＭＥＭと比較して増殖活性を示した。ＷＴ−ｈＰＴＴＧでトランスフェ
クションした細胞からのＣＭは、Ｍｕｔ−ｈＰＴＴＧ、ベクターで形質転換した
および正常３Ｔ３細胞からのＣＭより有意（ｐ＜０．０１）に高い細胞増殖を誘
導した。各ＣＭへの抗ｂＦＧＦ抗体の添加は、増殖活性を抑制した：６２％、Ｗ
Ｔ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；４３％、Ｍ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；４４％、Ｃ−ＣＭ；お
よび４９％、Ｎ−ＣＭ。しかし、ヤギ抗ｂＦＧＦ抗体を加えた後の細胞増殖は、
無血清ＤＭＥＭ単独中よりさらに高かった。ＨＵＶＥＣの増殖は、免疫前ヤギＩ
ｇＧを各ＣＭに加えても変化せず、誘導された増殖はｂＦＧＦにより仲介された
ことを確認した。
【０２８１】 傷害測定法とボイデンチャンバー測定法における内皮細胞移動。傷害治癒測定
法と改変ボイデンチャンバー測定法を使用して、内皮細胞増殖と移動を試験した
。傷害測定法では（図２０）、１００μm分の増加でマークしたグリッドで、非
傷害領域に移動したＨＵＶＥＣの数を計測して、移動を定量した。ＷＴ−ｈＰＴ
ＴＧ−ＣＭ中でインキュベートした（４８時間）ＨＵＶＥＣは、Ｍｕｔ−ＰＴＴ
Ｇ、ベクター単独または非トランスフェクション３Ｔ３細胞を含む、他の細胞株
からのＣＭでインキュベートしたＨＵＶＥＣより、遠くにかつたくさん移動した
。ヤギ抗ｂＦＧＦ抗体は、すべての細胞株中の活性を抑制したが、免疫前ヤギＩ
ｇＧは影響がなかった。改変ボイデンチャンバー測定法を使用して、ＷＴ−ｈＰ
ＴＴＧトランスフェクション体からの調整培地は、膜孔を介するＨＵＶＥＣ細胞
移動を誘導した（図２１；ｐ＜０．０１）。トランスフェクションまたは非トラ
ンスフェクションＮＩＨ３Ｔ３細胞を下のチャンバーに蒔き、ＨＵＶＥＣを上の
チャンバーに膜と、同時培養で同様の結果が得られた（データは示していない）
。抗ｂＦＧＦ抗体は、傷害測定法で観察されたものと同様に、すべての細胞株で
移動活性を抑制した。ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ、Ｍ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ、Ｃ−Ｃ
ＭおよびＮ−ＣＭの抗ｂＦＧＦ抗体による抑制作用は、同じオーダーであり、５
５％、４０％、４３％および３９％であった。ＣＭ介在血管形成に及ぼす抗ｂＦ
ＧＦ抗体の阻害作用は、他の細胞株から得られたＣＭより、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−
ＣＭでより明白であった。すなわち、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭの血管形成活性は
、中和ｂＦＧＦ抗体により阻害される。中和ｂＦＧＦ抗体の添加は、ｗｔＰＴＴ
Ｇトランスフェクション細胞からのＣＭの血管形成作用を完全に逆転することは
なく、一部のＰＴＴＧ指令血管形成はおそらく、他のＣＭ由来因子に起因するこ
とを意味する。
【０２８２】 Ｍ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ〜Ｃ−ＣＭおよびＮ−ＣＭを使用して、同様の血管形成
活性が観察され、これらはすべて、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭにより仲介される血
管形成活性より有意に低く、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭが強い血管形成活性を誘導
することを示している。これらの結果はまた、ＰＴＴＧペプチドのＰＴＴＧカル
ボキシ末端のプロリンリッチなドメインは、形質転換活性のみならず、ＰＴＴＧ
介在血管形成性についても重要である。
【０２８３】 管形成測定法。マトリゲル（Matrigel）は、ＨＵＶＥＣ接着と分化を調べるの
に有用である。マトリゲル（Matrigel）自体は、ＨＵＶＥＣの差別的活性を誘導
するため、我々はジーエフアール材料を使用して、マトリゲル自体からの増殖因
子の作用を低下させた。図２２Ａに示すように、ＨＵＶＥＣはジーエフアール材
料に接着すると、これらは、互いに整列して、ＣＭ中の差別的活性の影響下で、
毛管網に似た管を形成した。ＨＵＶＥＣ管形成測定の定量分析（デネカンプ（De
nekamp J.）、「総説論文：癌治療の標的としての血管形成、新血管増殖および
血管病態生理学」、Br J Radiol. 66:181-196 [1993]）は、他の細胞株から得ら
れたＣＭでＨＵＶＥＣをインキュベートした時に観察されたものと比較して、Ｗ
Ｔ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭが、ＨＵＶＥＣ管形成測定を増強することを明らかにした
（図２２Ｂ；ｐ＜０．０１）。毛細管形成に似た形態変化は、抗ｂＦＧＦ抗体を
各ＣＭに添加することにより抑制された。ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ、Ｍ−ｈＰＴ
ＴＧ−ＣＭ、Ｃ−ＣＭおよびＮ−ＣＭの抗ｂＦＧＦ抗体の抑制作用は、７４％、
５８％、５７％、および６２％であった。
【０２８４】 ＨＵＶＥＣ細胞の管形成の測定結果は、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭが強い血管形
成活性を誘導することを、さらに証明した。Ｍ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ〜Ｃ−ＣＭお
よびＮ−ＣＭを使用して、同様の血管形成活性が観察され、これらはすべて、Ｗ
Ｔ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭにより仲介される血管形成活性より有意に低いため、ＰＴ
ＴＧのプロリンリッチなドメインは、形質転換活性のみならず、ＰＴＴＧ介在血
管形成性についても重要であるようである。
【０２８５】 ＣＡＭ測定法。ＰＴＴＧ介在血管形成活性はまた、インビボでＣＡＭ測定法に
より調べた。ヒヨコのＣＡＭは、すでに存在する血管からの新しい血管の発生を
誘導するための理想的な微小環境を与える。我々は、ＷＴ−ｈＰＴＴＧでトラン
スフェクションした細胞からのＣＭが、ＣＡＭ上にスポーク車輪様の外観を誘導
することを観察し、この作用は、他の細胞株から得られたＣＭで観察されたもの
より顕著であった。９日令のヒヨコ卵の胚を使用して、インビボでＣＡＭの血管
増殖を試験した。試料をしみこませたコラーゲンスポンジをＣＡＭ上にのせ、４
日間のインキュベーション後、周りのコラーゲンスポンジの血管新生を評価した
。図２３に示すように、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭをあらかじめしみこませたスポ
ンジの適用は、スポーク車輪様の外観を誘導し、これは、他のＣＭにしみこませ
たスポンジの適用とのＣＡＭ血管形成より明瞭であった。コラーゲンスポンジに
入る検出可能な血管の数を立体顕微鏡下で数えると、予測されたように、トラン
スフェクションおよび非トランスフェクションＮＩＨ３Ｔ３細胞から得られたす
べてのＣＭ試料は、無血清ＤＭＥＭ単独より強い血管形成応答を誘導した（ｐ＜
０．０１）。
【０２８６】 ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭを含むスポンジのＣＡＭへの適用は、最も高い血管形
成活性を誘導した（ｐ＜０．０１）が、組換えｂＦＧＦ（１μg／卵）をＣＡＭ
に加えるとさらに高い血管形成活性が観察された。インビトロ測定法に比較して
、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ由来ＣＭ中にしみこませたスポンジの定量的血管形成活性は
、添加したｂＦＧＦ（１μg／卵）中にしみこませたしたスポンジの適用後に観
察されたものより弱かった。しかし、組換えペプチドをしみこませたスポンジと
ＣＭをしみこませたスポンジのｂＦＧＦバイオベイラビリティは、異なり、この
差を説明しているかも知れない。
【０２８７】 例２１：ＰＴＴＧ２過剰発現はＰＴＴＧ１生物活性を阻害する ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）。表２２に示す拡張高忠実度ＰＣＲシステム
（Expanded High Fidelity PCR system）（ロシュモレキュラーバイオケミカル
ズ（Roche Molecular Biochemicals）、インディアポリス、インディアナ州）ま
たはアドバンテージゲノミックポリメラーゼミックス（Advantage Genomic Poly
merase mix）（クロンテク（Clontech）、パロアルト（Palo Alto）、カリホル
ニア州）、およびプライマー（ギブコ（Gibco）、グランドアイランド（Grand I
sland）、ニューヨーク州）を用いて、ＰＣＲを行った。
【０２８８】 表２２．ＰＣＲプライマー。センス（Ｆ）とアンチセンス（Ｒ）配向からのＰＣ Ｒプライマー配列を列記する。導入した制限酵素部位に下線を引いてある 。
【０２８９】 ＰＴＴＧ遺伝子ファミリーメンバーの放射線ハイブリッド（ＲＨ）マッピング 。Ｇ３ ＲＨマッピングパネル（リサーチジェネティクス（Research Genetics
）、フンツビル（Huntsville）、アラバマ州）を、ＰＴＴＧプライマーを用いて
、（プレザント（Prezant, T.R.）ら、「ヒトプロト癌遺伝子ｈＰＴＴＧのイン
トロンの無い同族体は下垂体腫瘍で発現される：ｈＰＴＴＧファミリーの証拠」
、J. Clin. Endocrinol. Metab. 84:1149-1152 [1999]）に記載のように、９４
℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で３０秒（ＰＴＴＧ３、ＰＴＴＧ４）また
は２．５分（ＰＴＴＧ２−４）を４０サイクル行って増幅した。結果を、連鎖決
定のために、スタンフォードヒトゲノムセンター（Stanford Human Genome Cent
er）ウェブサイトに、電子的に提出した。配列決定によりＰＴＴＧの関連性を確
認した。
【０２９０】 ＰＴＴＧ３。個々のＵＭＢ６１からの胸腺ＤＮＡから増幅した３４ａ／６０１
ｂ ＰＣＲ産物を配列決定した。次に、遺伝子特異的プライマー（３−８８Ｆ／
３−４３４Ｒ）を設計して、Ｇ３ＲＨパネルから推定ＰＴＴＧ３配列を増幅した
。
【０２９１】 ＰＴＴＧ４。共通のプライマーＣ１０６Ｆ／Ｃ５２５Ｒは、以前ＰＴＴＧ２と
ＰＴＴＧ３について陰性であったＧ３ＲＨパネルでｃＤＮＡサイズの生成物を増
幅した。これらのＰＣＲ産物をゲル単離（キアエックスII（QIAEXII）、キアゲ
ン（Qiagen）、バレンシア（Valencia）、カリホルニア州）し、配列決定した。
次に、Ｇ３ＲＨパネルをＰＴＴＧ４特異的プライマー（４−７Ｆ／４−２８２Ｒ
）を用いて増幅した。
【０２９２】 染色体局在化の確認。染色体４（ＮＡ１０１１５）、５（ＮＡ１０１１４）、
８（ＮＡ１０１５６Ｂ）、または１１（ＮＡ１０９２７Ａ）とチャイニーズハム
スターＤＮＡ（ＮＡ１０６５８）を含有するハムスター−ヒトモノクロモソーム
ＤＮＡを、コリエル医学研究所（Coriell Institute for Medical Research）（
カムデン（Camden）、ニュージャージー州）から得た。１０ngのＤＮＡを、３−
８８Ｆ／３−４３４Ｒ（ＰＴＴＧ３）または４−７Ｆ／４−２８２Ｒ（ＰＴＴＧ
４）で増幅した。１０μgのＤＮＡを、サザンブロット解析のためにＢａｍＨＩ
で消化した。
【０２９３】 組織と細胞株。凍結組織は、正常ヒト下垂体（ゾイオンダイアグノスティクス
（Zoion Diagnostics）、ニューヨーク、ニューヨーク州；ナショナル神経研究
試料バンク（National Neurological Research Specimen Bank）、ロサンゼルス
、カリホルニア州）と胸腺（ＵＭＢ６１）、正常乳房組織と卵巣組織（メリーラ
ンド大学（ボルチモア（Baltimore）、メリーランド州）の発生疾患のための脳
と組織バンク（Brain & Tissue Banks for Developmental Disorders））を含ん
だ。細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（マナサス（Manassas
）、バージニア州）またはフィリップ・ケーフラー（Phillip Koeffler）博士か
ら得た。下垂体腫瘍は、シーダーズサイナイメディカルセンター（Cedars-Sinai
Medical Center）（ロサンゼルス、カリホルニア州）のＧＣＲＣから得て、結
腸癌、乳房腫瘍および卵巣腫瘍試料は、病理学教室から得て、すべて施設のガイ
ドラインに従った。
【０２９４】 ＲＮＡとＤＮＡ単離。組織または細胞ペレットを、（プレザント（Prezant, T
.R.）ら、「ヒトプロト癌遺伝子ｈＰＴＴＧのイントロンの無い同族体は下垂体
腫瘍で発現される：ｈＰＴＴＧファミリーの証拠」、J. Clin. Endocrinol. Met
ab. 84:1149-1152 [1999]）に記載のように、ＲＮＡ単離用のトリゾール（TRIZO
L）試薬（ギブコ（Gibco））中でホモジナイズした。トリゾール（TRIZOL）界面
からＤＮＡを単離し、プロテイナーゼＫで再抽出し、フェノール／クロロホルム
とエタノールで沈殿させたか、またはキアアンプ（QIAamp）組織キット（キアゲ
ン（Qiagen）、バレンシア（Valencia）、カリホルニア州）でさらに精製した。
【０２９５】 プライマー伸長分析。ＰＴＴＧ−１−４ ｃＤＮＡを、ＤＮａｓｅ処理ＲＮＡ
（増幅グレードＤＮＡａｓｅＩ、ギブコ（Gibco）またはロシュ（Roche）から；
スーパースクリプトII（SuperScript II）、ギブコ（Gibco）から）から逆転写
し、プライマーＣ１０６Ｆ／Ｃ５２５ＲまたはＣ１２４Ｆ／Ｃ４８１Ｒで増幅し
た。クロンテク（Clontech）複数組織パネルｃＤＮＡ（成人パネルＩとII、胎児
パネルＩ）とマラソンレースレディ（Marathon RACE-ready）下垂体ｃＤＮＡの
ために、ネステッド（nested）ＰＣＲ反応（Ｃ１０６Ｆ／Ｃ５２５Ｒプライマー
、次にＣ１２４Ｆ／Ｃ４８１Ｒプライマー）を使用した。融解したシープラーク
（SeaPlaque）アガロース（エフエムシープロダクツ（FMC Products）、ロック
ランド（Rockland）、メイン州）中の〜１ngのＰＣＲ産物を、６μlのプライマ
ー伸長混合物｛サーモシーケナーゼ（ThermoSequenase）酵素、１×緩衝液およ
び０．５μlの［アルファ−33Ｐ］ｄｄＡＴＰ（アマシャム（Amersham）、ピス
カタウェイ（Piscataway）、ニュージャージー州）、５pmolプライマーＣ２３３
Ｒ、および２．５μMのｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびＴＴＰ（ギブコ（Gibco））を
含む｝に加えた。９５℃で１５秒、６２℃で３０秒、７２℃で１分を４０サイク
ル後、反応物をホルムアミド色素で変性させ、８％配列決定ゲル（ナショナルダ
イアグノスティクス（National Diagnostics）、アトランタ、ジョージア州）で
電気泳動し、コダックバイオマックス（Kodak BioMax）ＭＲフィルムでオートラ
ジオグラフィーを行った。ＰＴＴＧ３のＣ２３３Ｒプライムした配列決定ラダー
はサイズマーカーである。陰性対照は、−ＲＴ反応物（腫瘍と組織）またはＰＣ
Ｒ水ブランク（クロンテク（Clontech）ｃＤＮＡ）である。デンシトメトリー分
析は、パブリックドメインＮＩＨイメージ１．６１プログラム（ＮＩＨにより開
発され、rsb.info.nih.gov/nih-imageで入手できる）を使用して、マキントッシ
ュコンピューター上で行った。
【０２９６】 配列決定分析。 ５’染色体歩行（クロンテク（Clontech））は、一次ＰＣＲ
のためにＣ５２５／ＡＰ１プライマーを使用し、２次ＰＣＲのためにプライマー
ＡＰ２を２−３０６Ｒ（ＰＴＴＧ２）、３−４３Ｒ（ＰＴＴＧ）またはＣ２３３
Ｒ（ＰＴＴＧ４）とともに使用した。３’染色体歩行は、一次ＰＣＲのためにＡ
Ｐ１＋２−１４Ｆ（ＰＴＴＧ２）、３−８８Ｆ（ＰＴＴＧ３）、または４−７Ｆ
（ＰＴＴＧ４）を、２次増幅のためにＡＰ２＋プライマーＣ１０６Ｆ（ＰＴＴＧ
２）またはＣ１２４Ｆ（ＰＴＴＧ３，４）を使用した。ＰＣＲ産物を、ゲル単離
（キアエックスII（QIAEXII）、キアゲン（Qiagen））し、ｐＣＲ２．１−ＴＯ
ＰＯ（インビトロゲン（Invitrogen）、カールスバッド、カリホルニア州）中に
クローン化した。［アルファ−33Ｐ］ｄｄＡＴＰ（アマシャム（Amersham））と
のサーモシーケナーゼ（ThermoSequenase）反応物を、６％アクリルアミド／８
．３Ｍ尿素ゲル（ナショナルダイアグノスティクス（National Diagnostics））
で電気泳動し、コダックバイオマックス（Kodak BioMax）ＭＲフィルムに露光し
た。ＧＣＧプログラム（マジソン、ウィスコンシン州）を使用して配列を組み立
て、リピートマスカー（RepeatMasker）（ワシントン大学、ベイラーカレッジオ
ブメディシン配列ユーティリティーズ（Baylor College of Medicine Sequence
Utilities）ウェブサイト）を用いて、繰り返し成分について分析した。
【０２９７】 マッピング近似転写開始部位。ＰＴＴＧ１−３ＭＲの５’末端をＲＴ−ＰＣＲ
実験によりしぼりこんだ。反応物は、ゲノムＤＮＡ（陽性対照）と、ＲＴ有り（
試験試料）またはＲＴ無し（陰性対照）でＲＮＡ処理した、ＤＮａｓｅ処理した
正常下垂体を含んだ。ＰＴＴＧ１のために、下流プライマーはＣ２３３Ｒであり
、上流プライマーは、Ｇ１−２５３Ｆ、−２４５Ｆ、−２１３Ｆ、−１４５Ｆ、
−１１５Ｆおよび−８３Ｆである。Ｇ１−２１３Ｆ／Ｃ２３３ＲとＧ１−１４５
Ｆ／Ｃ２３３Ｒについて予測されたサイズのＰＣＲ産物を配列決定した。ＰＴＴ
Ｇ２のために、下流プライマーは２−３０６Ｒであり、上流プライマーはＧ２−
６２Ｆ、−５３Ｆ、−４９Ｆおよび２−１４Ｆである。ＰＴＴＧ３のために、下
流プライマーは３−４３４Ｒ、および上流プライマーはＧ３−３３Ｆと３−８８
Ｆである。
【０２９８】 サザンブロット。〜５μgのＢａｍＨＩ消化ゲノムＤＮＡを、ＴＢＥ中０．８
％アガロースで電気泳動し、ハイボンド（Hybond）Ｎ＋（アマシャム（Amersham
））膜（サムブルーク（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル
（第２版）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリープレス（Cold S
pring Harbor Laboratory Press）、コールドスプリングハーバー、ニューヨー
ク州 [1989]）に移し、６８℃で２時間ハイブリダイズさせた（クイックハイブ
（Quick-Hyb）、ストラタジーン（Stratagene））。プローブは、ランダムプラ
イム標識（ラドプライム（RadPrime）、ギブコ（Gibco）；［アルファ−32Ｐ］
ｄＣＴＰ、ニューイングランドヌクレア（New England Nuclear）、ボストン、
マサチューセッツ州）したＰＴＴＧ１−３ ＰＣＲ産物（−５Ｆ／６５３Ｒ）の
混合物である。厳密性の高い洗浄は、６０℃の０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
を含有した。ブロットを、コダックバイオマックス（Kodak BioMax）ＭＲフィル
ムに露光した。染色体１７（ブラッグ（M. Bragg）からの供与）のＳＴＳマーカ
ーＤ１７Ｓ３３からのプローブＨＨＨ２０２を、標準化のために使用した。
【０２９９】 ノーザンブロット。１０μgの総ＲＮＡを、モルホリノプロパンスルホン酸緩
衝液と６％ホルムアルデヒドを含有する１％アガロースで電気泳動（サムブルー
ク（Sambrook）ら、[1989]）し、ハイボンド（Hybond）Ｎ＋（アマシャム（Amer
sham））に移し、クイックハイブ（Quick-Hyb）溶液（ストラタジーン（Stratag
ene））中でＰＴＴＧ１−３プローブ混合物とハイブリダイズさせ、上記のサザ
ンブロットのように洗浄した。ランダムプライム標識１８Ｓ ｃＤＮＡ（アンビ
オン（Ambion）、ヒューストン、テキサス州）を、ローディング標準化のために
使用した。
【０３００】 ｐＴａｒｇｅＴプラスミド。ＰＴＴＧコード配列をＰＣＲ増幅し、ＰＴＴＧ１
−２について−５Ｆ／６５３Ｒと、ＰＴＴＧ３について−５Ｆ／Ｇ３−６７９Ｒ
を使用して、ｐＴａｒｇｅＴ（プロメガ（Promega）、マジソン、ウィスコンシ
ン州）中にＴＡクローン化した。鋳型は、ＰＴＴＧ１−ｃＤＮＡクローン９Ｃ（
ザング（Zhang, X.）ら、「ヒト下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）の構造
、発現および機能」、Mol. Endocrinol. 13:156-166 [1999]）、ＰＴＴＧ２−Ｎ
Ａ１０１１５（コリエル研究所（Coriell Institute））、ＰＴＴＧ３−Ｇ３
ＲＨパネルメンバー＃６（リサーチジェネティクス（Research Genetics））で
ある。ＰＴＴＧ２ΔＣは、プライマー対Ｇｅｎｅ２−Ｃｔａｉｌ．Ｆ／−Ｃｔａ
ｉｌ．ＲによりｐＴａｒｇｅＴ−ＰＴＴＧ２をＰＣＲ突然変異誘発し、次にキナ
ーゼと細胞内連結（ラピッドリガーゼ（RapidLigase）、ロシュ（Roche）；ＳＵ
ＲＥ２細胞へ形質転換、ストラタジーン（Stratagene））により、ＰＴＴＧ２Δ
Ｃを作成した。
【０３０１】 ｐＢＩＮＤプラスミド。ＰＴＴＧコード配列をＰＴＴＧ−Ｓ／ＰＴＴＧ−ＡＳ
プライマーで増幅し、ｐＣＲ２．１（インビトロゲン（Invitrogen））中にサブ
クローニングし、ＢａｍＨＩとＫｐｎＩで消化し、ｐＢＩＮＤ−ＧＡＬ４（スト
ラタジーン（Stratagene））中に指向性にクローン化した。フレーム内ＤＢＤ−
ＰＴＴＧ融合体は、配列決定により確認した。後に再増幅、酵素消化、および連
結により、同一のジャンクション配列を作成した。ＰＴＴＧ１は、ＰＴＴＧ１−
Ｆ／ｐＢＩＮＤ−５’ＲとＢａｍＨＩを使用し；ＰＴＴＧ２はＰＴＴＧ２−Ｒ／
ｐＢＩＮＤ３’ＦとＫｐｎＩを使用し；ＰＴＴＧ３はＰＴＴＧ３−５’Ｆ／ＰＴ
ＴＧ３−Ｒ（ｐＴａｒｇｅＴ−ＰＴＴＧ３鋳型）、ＢａｍＨＩ＋ＫｐｎＩを使用
し、ｐＢＩＮＤにサブクローニングした；ｐＢＩＮＤ−ＰＴＴＧ２ΔＬは、Ｇｅ
ｎｅ２−Ｃｔａｉｌ．Ｒ／ｐＢＩＮＤ−３’ＦとＫｐｎＩを使用した。ＰＴＴＧ
２ΔＳは、ＰＣＲアーチファクトとして生成した。ＡＴＧの後のヌクレオチド４
６６の１塩基欠失は、ＰＴＴＧ２の１５６アミノ酸と、その後の１０のフレーム
外のアミノ酸を生じさせ、ＰＸＸＰモチーフは含まない。
【０３０２】 転写活性化測定法。マキシ（Maxi）またはミニプレップ（miniprep）ＤＮＡ（
キアゲン（Qiagen））を、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（リポフェクタミンプラス、ギブコ
（Gibco））中に３つずつのウェルに、少なくとも３つの実験で同時トランスフ
ェクションした。ウェル１つにつき、ＤＮＡ濃度は、１μg ｐＢＩＮＤプラス
ミド、０．１２５μgレポーターｐＧ５／Ｌｕｃ、および０．１μg ｐＣＭＶ／
βｇａｌである。トランスフェクションの２〜３日後、ルシフェラーゼ測定のた
めに細胞質抽出物を調製し（レイ（Ray, D.W.）ら、「白血病阻害因子（ＬＩＦ
）は副腎皮質刺激ホルモン産生細胞株中のプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ
）発現を刺激する。ＳＴＡＴ経路の役割」、J. Clin. Invest. 97:1852-1859 [1
996]）、これをβ−ガラクトシダーゼ（インビトロゲン（Invitrogen））に対し
て標準化した。実験の平均±ＳＥＭを、一元配置ＡＮＯＶＡ、ベンフェローニの
（Benferroni's）多重比較検定、およびプリズム（Prism）３．０解析ソフトウ
ェアにより解析した。
【０３０３】 転写阻害測定法。２．５μgの競合プラスミド［ｐＴａｒｇｅＴプラスミド（
挿入体対照無し、またはＰＴＴＧ１−３挿入体）、またはｐＣＩ−ｎｅｏプラス
ミド（ＰＴＴＧ１−Ｃ’ＷＴ、−Ｃ’Ｍｕｔ）］を、０．５μgのｐＢＩＮＤプ
ラスミド、０．１２５μgのｐＧ５／Ｌｕｃ、および０．１μgのｐＣＭＶ／βｇ
ａｌとともに、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の３つのウェルのそれぞれに、同時トランスフ
ェクションした。１：５希釈のｐＴａｒｇｅＴ−ＰＴＴＧ２は、０．５μgのプ
ラスミドと２．０μgのｐＴａｒｇｅＴを、総濃度２．５μgの競合ＤＮＡ混合物
で使用した。溶解物を採取し、上記のように、ルシフェラーゼとβ−ガラクトシ
ダーゼ活性について測定した。ある実験では、リン酸緩衝化生理食塩水（ギブコ
（Gibco））中に採取した後、半分の細胞からＤＮＡを調製し、遠心分離し、ト
リゾール（TRIZOL）（ギブコ（Gibco））中に再懸濁した。界面からＤＮＡを単
離し、「ドットブロット」分析のために変性させ、ＬａｃＺとプローブ結合させ
た。
【０３０４】 結果：ＰＴＴＧ遺伝子ファミリーの同定 ＰＴＴＧ１とＰＴＴＧ２：５ｑ３３上のＰＴＴＧ１の染色体位置（ザング（Zh
ang, X.）ら、「ヒト下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）の構造、発現およ
び機能」、Mol. Endocrinol. 13:156-166 [1999a]）と４ｐ１２のイントロンの
無いＰＴＴＧ２の発見と局在化（プレザント（Prezant, T.R.）ら、「ヒトプロ
ト癌遺伝子ｈＰＴＴＧのイントロンの無い同族体は下垂体腫瘍で発現される：ｈ
ＰＴＴＧファミリーの証拠」、J. Clin. Endocrinol. Metab. 84:1149-1152 [19
99]）が記載されている。遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＧＳＯ）を用いて
ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡを使用して、ＰＴＴＧ２が、脾臓、肝臓および白血球で低レ
ベルで転写されることが証明された（プレザント（Prezant, T.R.）ら、[1999]
）。ＰＴＴＧ２ ｍＲＮＡは、異なる下垂体腫瘍サブタイプで、総ＰＴＴＧのか
なりの比率を含有した。ＰＴＴＧ２のゲノムＤＮＡを配列決定する過程で、２つ
の追加のＰＴＴＧファミリーメンバーが発見された。
【０３０５】 ＰＴＴＧ３：症例対照を調べる時、我々は、３７のホモ接合性配列変化を含有
する異常な「ＰＴＴＧ２」配列を見いだした（プレザント（Prezant, T.R.）ら
、[1999]）。これが第３の（イントロンの無い）ＰＴＴＧ遺伝子であるかどうか
を、推定ＰＴＴＧ３配列に特異的なＰＣＲプライマーを用いてＧ３ ＲＨマッピ
ングパネルを増幅することにより試験した。ヒトＰＴＴＧ３ゲノム配列（配列番
号６５；ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ＡＹ０２８４７１）を、以下の
表２３に記載する。下線の配列（配列番号６６）（ヌクレオチド３３９〜３４１
位の転写開始部位で始まり、ヌクレオチド９４５〜９４７位の停止コドンまで伸
長する）は、ｈＰＴＴＧ３タンパク質のコード配列である（配列番号６７）。
【０３０６】 表２３．ｈＰＴＴＧ３遺伝子配列
【０３０７】 （配列番号６６）によりコードされる対応するＰＴＴＧ３アミノ酸配列を以下
の表２４に示す。
【０３０８】 表２４．ｈＰＴＴＧ３アミノ酸配列
【０３０９】 ＰＴＴＧ３は、染色体８ｑ２２上のマーカーＳＨＧＣ−１２８３３から１５cR
adsに位置し、ＬＯＤスコアは１０．４７である。この染色体位置は、ヒト第８
染色体のみを含有するハムスター／ヒトハイブリッド株からのＤＮＡを使用して
、サザンブロット解析（後述）およびＰＣＲ解析（示していない）により確認し
た。
【０３１０】 ＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３の読みとり枠を、染色体歩行と配列解析により決定し
た。我々の以前の研究（プレザント（Prezant, T.R.）ら、[1999]）からのＰＣ
ＲとＧＳＯプライマーは、ＰＴＴＧ３ ｃＤＮＡよりＰＴＴＧ１およびＰＴＴＧ
２に対して相同性が大きい。コードされるタンパク質は、ＰＴＴＧ１タンパク質
と９０％同一であり、両方のＰＸＸＰモチーフが保存されている。これらのファ
ミリーメンバーは、げっ歯類ＰＴＴＧタンパク質よりＰＴＴＧ１タンパク質に対
して、全体的相同性が大きい（図２４）。しかしＰＴＴＧ２は、配列番号６３の
ヌクレオチド５３４位に＋Ｔ挿入を有し、これは読みとり枠を変化させて、１９
１アミノ酸の推定の末端切断型タンパク質（配列番号６４）を与え、アミノ酸１
７９で終わるＰＴＴＧ１タンパク質に対して相同性を有する。（チェン（Chen,
L.）ら、「ヒト下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ｈＰＴＴＧ）ファミリーの同定：分
子構造、発現および染色体位置」、Gene 248:41-50 [2000]）中のＰＴＴＧ２の
配列は、＋Ｔ挿入を含まないため、我々の配列とは異なる。我々のＰＴＴＧ２部
分コード配列は、ジーンバンク（GenBank）から受け入れ番号ＡＦ１１６５３８
．１で入手でき、配列は確認されている。
【０３１１】 ｈＰＴＴＧ２、ｈＰＴＴＧ３およびｈＰＴＴＧ４ゲノム配列のセグメントは、
ｈＰＴＴＧ１読みとり枠配列と高い相同性を有する（配列番号３のヌクレオチド
９５〜７００位）。特に配列番号３のヌクレオチド９９位で始まるように整列す
ると、配列番号６２のヌクレオチド３８７〜１０６５位でｈＰＴＴＧ２と；配列
番号６５のヌクレオチド３４３〜１０１９位とｈＰＴＴＧ３と；および配列番号
６８のヌクレオチド４１８〜１０９１位でｈＰＴＴＧ４と、高い相同性がある。
【０３１２】 ＲＴ−ＰＣＲ実験を行って、ＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３の読みとり枠が完全に転
写されるかどうかを決定した。オリゴ（ｄＴ）プライムＰＴＴＧ２ ｃＤＮＡは
、正常な下垂体から、ＡＴＧ転写開始部位から−３２、−４９、および−５３（
しかし、−６２からではない）で始まる上流プライマーを用いて増幅され、ＰＴ
ＴＧ３ ｃＤＮＡは、ＡＴＧ転写開始部位から−３３で始まる上流プライマーを
用いて増幅される。すなわち、両方の遺伝子が転写され、おそらく翻訳される。
【０３１３】 ＰＴＴＧ１の転写開始部位の位置を、同様に決定した。ＲＴ−ＰＣＲ産物を正
常下垂体から、ＡＴＧ転写開始部位から−８３、−１１５、−１４５、−２１３
、および−２４５（しかし、−２５３からではない）で始まる上流プライマーを
用いて、得た。−２１３／Ｃ２３３Ｒと−１４５／Ｃ２３３Ｒ ＲＴ−ＰＣＲ産
物について配列を確認した。興味深いことに、ヒトＰＴＴＧのこの転写領域は、
ラットＰＴＴＧプロモーターと重複する。（ペイ（Pei, L.）、「ラット下垂体
腫瘍形質転換遺伝子中の複数のタンパク質の結合部位を含有するエンハンサー成
分のゲノム構築と同定」、J. Biol. Chem. 273:5219-5225 [1998]）。
【０３１４】 ６つのエキソンと５つのイントロンの我々のＰＴＴＧ１遺伝子構造（ザング（
Zhang, X.）ら、[1999a]）は、（チェン（Chen, L.）ら [2000]）のものとは異
なる。チェン（Chen）ら（2000）は、イントロン１／エキソン２ジャンクション
にまたがるプローブを使用して、伸長産物を配列決定することなく、プライマー
伸長分析と、ＲＮＡｓｅ保護を使用した；彼らは、ＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡが、Ａ
ＴＧ転写開始部位の−３７ヌクレオチド上流で始まると結論した。従ってチェン
（Chen）ら（2000）のプロモーターは、イントロン１を含有する。我々の実験室
では、イントロンを含まないＲＴ−ＰＣＲ産物を一貫して増幅した。
【０３１５】 ＰＴＴＧ４：すべての３つのＰＴＴＧ ｃＤＮＡの発現を同時に区別するため
に、我々は、プライマー伸長分析をできる領域を同定し、我々がＰＴＴＧ３を発
見した個体から得られたゲノムＤＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｃ１０６Ｆ／Ｃ
５２５Ｒ）とプライマー伸長反応（Ｃ２３３Ｒ）のための新しいＰＣＲ「共通の
」プライマーを試験した。表２５は、ヒトＰＴＴＧ４偽遺伝子とフランキングゲ
ノム配列を示す（配列番号６８；ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ＡＹ０
２８４７３）。
【０３１６】 表２５．ｈＰＴＴＧ４配列
【０３１７】 複合配列（配列番号６８）は、ＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３の配列の両方と異なる
１６８ヌクレオチドの１２を有した。これらの驚くべき結果は、２つの可能性を
示唆した：ＰＴＴＧ２および／またはＰＴＴＧ３の対立遺伝子のいずれかまたは
両方が、複数の配列変化を有する；または追加のイントロンの無いＰＴＴＧ同族
体が存在する。
【０３１８】 これらの仮説を検証するために、我々は、新しいプライマーＣ１０６Ｆ／Ｃ５
２５Ｒを用いて放射線ハイブリッド（ＲＨ）パネルマッピングを再増幅し、以前
はＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３について陰性であった７つのパネルメンバーで、１２
ヌクレオチドの変化の１１と同一の配列を見いだした。すなわち、イントロンの
無いＰＴＴＧ４遺伝子の存在が確認され、この遺伝子は、ＰＴＴＧファミリーの
他の遺伝子とは異なる遺伝子座にマッピングされる。ＰＴＴＧ４特異的プライマ
ーを用いるＲＨマッピングは、これを染色体１１ｑ１２−１３に局在化させた（
ＬＯＤスコア１４．００、マーカーＤ１１Ｓ４２０５から１４cRs）。これは、
ＡＴＧ転写開始部位を含む、ＰＴＴＧ１のエキソン２との相同性が欠如している
ため、追加の配列データは、ＰＴＴＧ４が偽遺伝子であることを示す。さらに、
６７３bpの重複でＰＴＴＧ１と全体で８９％の相同性があるにもかかわらず、長
い読みとり枠は見つからなかった。
【０３１９】 図２５は、ＰＴＴＧファミリーのゲノム構造を示す。ＰＴＴＧ３とＰＴＴＧ４
は、その横に直接繰り返し構造が位置し、ＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テ
イルに対応する位置でポリ（Ａ）の短いストレッチを含有する点で、古典的なイ
ントロンの無い遺伝子のようである（ブロシウス（Brosius, J.）「すべての範
疇のＲＮＡは、新規遺伝子または制御成分として適合し得る逆配列（retroseque
nces）を生じさせる」、Gene 238:115-134 [1999]）。ＰＴＴＧ３の横にライン
１（Line1）ファミリー繰り返し構造が位置し、ＰＴＴＧ４はＬＴＲに囲まれて
いる。ＰＴＴＧ２は、１kb以上離れたＬ２ｂ繰り返し構造を有し、ポリ（Ａ）の
痕跡が無いレトロポゾン（retroposon）的特徴と多様なカルボキシ末端をコード
する配列の欠如は、ＰＴＴＧ２のレトロトランスポジション(retrotranspositio
n)イベントについて高齢であることを反映しているかも知れない。
【０３２０】 ＰＴＴＧファミリーメンバーは、４つの異なる染色体に局在化し、異なる組織
特異的発現パターンを有する。ＰＴＴＧ３は、プレザント（Prezant, T.R.）ら
（プレザント（Prezant, T.R.）ら、「ヒトプロト癌遺伝子ｈＰＴＴＧのイント
ロンの無い同族体は下垂体腫瘍で発現される：ｈＰＴＴＧファミリーの証拠」、
J. Clin. Endocrinol. Metab. 84:1149-1152 [1999]）で言及されており、次に
チェン（Chen, L.）ら（チェン（Chen, L.）ら、「ヒト下垂体腫瘍形質転換遺伝
子（ｈＰＴＴＧ）ファミリーの同定：分子構造、発現および染色体位置」、Gene
248:41-50 [2000]）により記載された。ＰＴＴＧ１−３の報告された染色体局
在化の小さな差（５ｑ３３対５ｑ３５．１、４ｐ１２対４ｐ１５．１、８ｑ２２
対８ｑ１３．１）は、おそらく方法の差が原因であろう（本明細書で使用された
ＲＨマッピングに対して、チェン（Chen, L.）らが使用したＦＩＳＨ）。さらに
許容される（permissive）ＰＣＲ条件下で、第１１染色体上のｍｅｎ１を動原体
とする、ＰＴＴＧ４偽遺伝子が本明細書で記載される。本明細書に記載の染色体
割り当ては、サザンブロット解析により確認された。
【０３２１】正常組織でのＰＴＴＧファミリーの発現パターン 。 標準化ＲＴ−ＰＣＲ産物の
プライマー伸長分析は、ＰＴＴＧ１と、３つのイントロンの無いＰＴＴＧ２、Ｐ
ＴＴＧ３およびＰＴＴＧ４遺伝子の発現とを区別する。図２６は、ほとんどの胎
児および成体組織中でＰＴＴＧ１が主要な型であるが、成体の睾丸、胸腺、保存
、結腸、胎盤および脳と胎児肝臓のみが、ノーザンブロットで検出可能なＰＴＴ
Ｇ ｍＲＮＡを有することを示す（ザング（Zhang, X.）ら、[1999a]）。我々は
、ＰＴＴＧ２ ｍＲＮＡの比率は、結腸、白血球、肝臓および心臓で最も高く、
ＰＴＴＧ３は、結腸、前立腺、膵臓および腎臓で最も高いことを見いだした。Ｐ
ＴＴＧ４はあまり転写されない。デンシトメトリー分析から得られるように、４
つのＰＴＴＧ ｃＤＮＡの相対的比率は、グラフで示される（図２６）。
【０３２２】 我々は使用したプライマー伸長法は、ＰＣＲに基づくものであり、クロンテク
（Clontech）ｃＤＮＡは非常に希薄（０．２ng/μl）であるため、ＰＴＴＧ発現
が低いほとんどの組織（ザング（Zhang, X.）ら、[1999a]）では、ネステッド（
nested）反応が必要であった。従ってこれらの結果は、試料内の遺伝子ファミリ
ーメンバーの相対的発現を示している。
【０３２３】 ＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡは、９つの胎児組織とほとんどの成体組織中で最も高い
比率の総ＰＴＴＧ ｍＲＮＡを含有する。ＰＴＴＧがノーザンブロットにより検
出可能なある組織については、新しいファミリーメンバーもまた発現される：脾
臓と結腸中のＰＴＴＧ２，および結腸中のＰＴＴＧ３。ＰＴＴＧ２および／また
はＰＴＴＧ３ ｃＤＮＡもまた、いくつかの組織中で検出可能であり、ＰＴＴＧ
発現は低い（ｗｂｃ、乳房、卵巣中の両方の遺伝子；肝臓と心臓中のＰＴＴＧ２
、腎臓、前立腺および膵臓中のＰＴＴＧ３）。ＰＴＴＧ４は、あまり転写されず
、またフレーム内ＡＴＧコドンが欠如しているため、偽遺伝子と思われる。
【０３２４】 ＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３ ｍＲＮＡの組織分布パターンは、（チェン（Chen,
L.）ら [2000]）に記載のものとは異なる。これらの結果は、ＰＴＴＧ２：（＋
）脾臓と結腸、および（−）胸腺、およびＰＴＴＧ３：（−）脾臓、胸腺、睾丸
、卵巣、小腸についての我々の結果と一致するが、ＰＴＴＧ２：（＋）前立腺、
睾丸、卵巣、小腸、および（−）ｗｂｃ、およびＰＴＴＧ３：（＋）卵巣腫瘍の
み、および（−）前立腺、結腸、ｗｂｃについては一致しない。この差は、両グ
ループともクロンテク（Clontech）ノーザンブロットまたは対応する複数の組織
パネルを使用したため、単に異なるＲＮＡの起源によるものではなく、形態の差
による可能性がある。例えば、ノーザンブロット解析で使用されたＰＴＴＧ２オ
リゴヌクレオチドプローブは、ｍＲＮＡサイズの情報が提供されていないため、
無関係の遺伝子を検出するかも知れない。また、彼らの研究のＰＴＴＧ２とＰＴ
ＴＧ３ ＲＴ−ＰＣＲについて使用された各プライマー対の１つの配列は、我々
の測定とは異なる。ＰＴＴＧ３ノーザンブロットを用いた彼らの陰性結果は、そ
のアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブの３つの配列の差による可能性があ
る。
【０３２５】 癌におけるＰＴＴＧファミリーの発現パターン。 我々は、結腸癌、乳癌およ
び卵巣癌で観察されたＰＴＴＧ ｍＲＮＡの５〜１０倍の増加へのＰＴＴＧファ
ミリーメンバーの相対的寄与を評価した。プライマー伸長測定法は、標準化ＲＴ
−ＰＣＲ産物を使用した（プライマー伸長中で同様の量のｃＤＮＡ産物を使用し
て）。図２７Ａは、正常な結腸中ではＰＴＴＧ１が主要な型であるが、ＰＴＴＧ
２とＰＴＴＧ３も転写されることを示す。しかしＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡの比率は
、一致した正常組織試料と比較して、５つの結腸腫瘍で選択的に増加した（図２
８）。すなわち、原発性結腸新生物では、癌細胞株と同様に、ＰＴＴＧ ｍＲＮ
Ａの増加は、ほとんどＰＴＴＧ１による。
【０３２６】 ＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡはまた、白血病細胞株（ｎ＝３、示していない）、乳癌
（ｎ＝４、図２７Ｂ）、および卵巣癌（ｎ＝５、図２７Ｃ）で、主要な分子種で
あった。ＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡは、卵巣癌中の高レベルのＰＴＴＧ発現に最も寄
与するものであり、図２７Ｃに示すように５つの腫瘍のうちの４つで総ＰＴＴＧ
ｍＲＮＡの＞９５％を占めた。ＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡは、比率的に卵巣癌と乳
癌の両方で最も多く発現されるファミリーメンバーである。ＰＴＴＧ３転写体は
、正常乳房では検出されなかったが、４つの乳房腫瘍のうち２つで中程度に発現
された。低レベルのＰＴＴＧ２ ｃＤＮＡは、正常乳房と４つの乳房腫瘍で同様
であった。ＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３ ｃＤＮＡは、５つの卵巣癌すべてで検出さ
れたが、その比率は、正常卵巣対照より高くはなかった。チェン（Chen, L.）ら
[2000]とは異なり、ＰＴＴＧ３は正常卵巣中で高い比率で発現されているため
、我々は、ＰＴＴＧ３の卵巣腫瘍特異的発現パターンを観察できず、５つの卵巣
腫瘍のうちの４つと卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３（示していない）は、ほとんどＰＴ
ＴＧ１転写体を発現した。
【０３２７】 下垂体腺腫のプライマー伸長結果を、図２９に要約する。２４の腺腫のうちの
１５でＰＴＴＧ２ ｃＤＮＡが容易に検出できたが、２４の腫瘍のうちの５つで
のみＰＴＴＧ３が弱く発現された。プロラクチノーマの優先的ＰＴＴＧ１発現は
、エストロゲンによる制御のせいかも知れない。（ヒーネイ（Heaney A.P.）ら
、「プロラクチノーマ病因におけるエストロゲン誘導下垂体腫瘍形質転換遺伝子
（ＰＴＴＧ）の早期関与と繊維芽細胞増殖因子発現」、Nature Med. 5:1317-132
1 [1999]）。他の下垂体腫瘍サブタイプ中のＰＴＴＧ２ ｍＲＮＡの高い比率は
、これらの腺腫の全体に良性の結果に関連しているかも知れない。 表２６は、ＰＴＴＧファミリーメンバーの染色体局在、相同性および発現パタ
ーンを要約する。
【０３２８】 表２６ ヒトＰＴＴＧ遺伝子ファミリー。相同性：同一のヌクレオチド（ｎｔ） 配列またはアミノ酸（ａａ）配列；ｈＰＴＴＧ１との類似性：保存的アミノ酸変 化。染色体遺伝子座は放射線ハイブリッド（ＲＨ）マッピングにより決定した。 発現パターンは図２６〜２９中のプライマー伸長分析からの結果を要約する。
遺伝子 ％相同性 ＤＮＡ タンパク質 遺伝子座 発現パターン PTTG1 (100) (100) 5q33 睾丸で最も高い発現、ノーザン ブロットにより、胸腺、脾臓、 結腸、脳、胎盤、胎児肝臓で検 出される、他の正常組織での主 要な型、癌細胞株、結腸腫瘍、 乳房腫瘍、および卵巣腫瘍で増 加している PTTG2 93(620nt) 90(179/191aa) 4p12 正常結腸、卵巣、ｗｂｃ、 93%類似 脾臓、肝臓、心臓；正常乳房と 下垂体で低い；一部の下垂体腫 瘍で高い PTTG3 94(632nt) 90(202aa) 8q22 正常結腸、乳房、卵巣、腎臓、 94%類似 前立腺、膵臓、ｗｂｃ；一部の 乳房腫瘍で高い PTTG4 89(673nt) - 11q12-13 -
【０３２９】 癌でのＰＴＴＧ遺伝子増幅の欠如。ＰＴＴＧ遺伝子ファミリーメンバーが、結
腸新生物および癌細胞株中で再配列されるか、および／または増幅されるかどう
かを、サザンブロット解析を使用して調べた。まず、ハムスター／ヒトモノクロ
モソームハイブリッドからのＤＮＡを用いて、ＢａｍＨＩはコード領域の外を消
化し、４つのＰＴＴＧ遺伝子の区別可能なバンドを与えることを確認した（図３
０Ａ）。ＰＴＴＧ ｍＲＮＡ発現の少なくとも５〜１０倍の増加にもかかわらず
、隣接正常組織試料と比較して、一致する結腸腫瘍の３つの対で、染色体増幅も
再配列も観察されなかった（図３０Ｂ）。
【０３３０】 骨髄性細胞株ＨＬ−６０(クロンテク（Clontech）癌ＲＮＡパネル中でＰＴＴ
Ｇを豊富に発現する）は、ＰＴＴＧ１遺伝子座のすぐ近傍にある染色体領域５ｑ
１１−ｑ３１（３１）の間質欠失がある（ザング（Zhang, X.）ら、[1999a]）。
この欠失は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）と急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）で観察
される（ミテルマン（Mitelman, F.）ら、「ヒト新生物中の周期性染色体再配列
の区切り点地図」、Nature Genet., 15:特別号、［1997年４月号］；ホリガン（
Horrigan, S.K.）ら、「５ｑ３１上の悪性骨髄疾患中の腫瘍抑制遺伝子の９つの
候補の最小区間の確定と同定」、Blood 95:2372-2377 [2000]）。我々は、ＰＴ
ＴＧ１サイズのＢａｍＨＩ制限断片の用量が、下垂体上皮細胞株ＬＬ２４と比較
して、２つのリンパ細胞株（ＨＬ−６０とＫＧ−１）で低下していることを見い
だした（図３０Ｃ）。第１７染色体からの単一の遺伝子プローブを用いてハイブ
リダイズした同じブロットを、下に示す。これらの細胞株の対応するノーザンブ
ロットを、図３０Ｄに示す。
【０３３１】 ＰＴＴＧファミリーの機能解析 転写活性化。ＰＴＴＧ１タンパク質は、酵母と哺乳動物２ハイブリッド系で転
写アクチベーターである（ドミングエ（Dominguez, A.）ら、「ラットＰＴＴＧ
のヒト同族体であるＰＴＴＧは造血系新生物で過剰発現される。ＰＴＴＧの転写
活性化機能の証拠」、Oncogene 17:2187-2193 [1998]；ワング（Wang, Z.）とメ
ルメド（Melmed, S.）、「下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）トランス活性
化および形質転換活性」、J. Biol. Chem. 275:7459-7461 [2000]）。ＰＴＴＧ
１、ＰＴＴＧ２およびＰＴＴＧ３のトランス活性化機能を、哺乳動物の２ハイブ
リッド系で比較した。ＰＴＴＧ１と融合したキメラＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイ
ン（ＤＢＤ）は、ＤＢＤ対照プラスミドによるトランスフェクションと比較して
、ルシフェラーゼレポータープラスミドの発現の５４倍の増加を引き起こした。
ＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３挿入体は、ルシフェラーゼ発現のそれぞれ１．８倍と５
．５倍の増加を誘導した。従って、ＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３は、ＰＴＴＧ１と相
同性が高いが、そのコード配列は、もし発現されると、インビボで異なる生物学
的機能を有するかも知れない。ＰＴＴＧ２は、その異なるカルボキシ末端で、少
なくとも転写活性を有する。全カルボキシ末端をコードするセグメント（ＰＴＴ
ＧΔＬ）の欠失は、ＰＴＴＧのトランス活性化を２６倍上昇させ、この領域が転
写に阻害性であり、一方ＰＸＸＰモチーフの欠如したより短い末端切断型（ＰＴ
ＴＧ２ΔＳ）は転写活性が無いことを意味する。３つの実験の結果を図３１に示
す。
【０３３２】 ＰＴＴＧ２はＰＴＴＧ１トランス活性化を阻害する。 ＰＴＴＧ２および／ま
たはＰＴＴＧ３がＰＴＴＧ１の優性陰性インヒビターかどうかを試験した。５倍
モル過剰のＰＴＴＧ含有プラスミド（ＤＢＤドメイン無し）を、トランス活性化
測定法のために、ＣＭＶプロモーターに転写制御される両方のプラスミドを用い
て同時トランスフェクションした。図３２Ａは、ＰＴＴＧ２の過剰発現が、ＰＴ
ＴＧ１によるトランス活性化を強力に阻害することを示す（４８％の低下、ｐ＜
０．００１）。ＰＴＴＧ２はまた、ＶＰ１６、ＰＴＴＧ３およびＰＴＴＧ２を含
有するＤＢＤプラスミドについてトランス活性化を阻害するため、この阻害は用
量依存性であり、遺伝子特異的ではない（図３２Ｂ）。これに対して、ＰＴＴＧ
１の過剰発現は、ＰＴＴＧ２のトランス活性化機能の低下を逆転させない。
【０３３３】 トランス活性化活性に必要なカルボキシ末端中の２つのＳＨ３結合ドメインに
より阻害が仲介されるかどうかを調べるために、ＰＴＴＧ１の野生型と変異体Ｃ
末端断片を、競合測定法で試験した。ＰＴＴＧ１の野生型Ｃ末端のみが、トラン
ス活性化を弱く低下させた。これは、ＰＴＴＧ２のユニークなＣ末端が、トラン
ス活性化阻害に関与し、末端切断型ＰＴＴＧ２タンパク質（ａａ１〜１７９；免
疫細胞蛍光により確認された［示していない］）をコードする変異体ＰＴＴＧ２
は、ＰＴＴＧ１トランス活性化をもう阻害しなかったことを意味する（図３２Ｂ
）。
【０３３４】 ＰＴＴＧタンパク質は、核に局在化（チエン（Chien, W.）とペイ（Pei, L.）
、「新規結合因子は、下垂体腫瘍形質転換遺伝子産物の核移動とトランス活性化
機能を促進する」、J. Biol. Chem. 275:19422-19427 [2000]；ユー（Yu, R.）
ら、「下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）は胎盤ＪＥＧ−３細胞の分裂と生
存を制御する：生きた細胞イメージングからの証拠」、Mol. Endocrinol. 14:11
37-1146 [2000]）し、そこで染色体分離に参加する（ゾウ（Zou, J.）ら、「形
質転換と腫瘍発生に関与する脊椎動物姉妹染色分体分離インヒビターの同定」、
Science 285:418-422 [1999]）。ＰＴＴＧタンパク質はまた、転写アクチベータ
ーとして機能する。（ドミングエ（Dominguez, A.）ら、「ラットＰＴＴＧのヒ
ト同族体であるＰＴＴＧは造血系新生物で過剰発現される。ＰＴＴＧの転写活性
化機能の証拠」、Oncogene 17:2187-2193 [1998]；ワング（Wang, Z.）とメルメ
ド（Melmed, S.）、「下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）トランス活性化お
よび形質転換活性」、J. Biol. Chem. 275:7459-7461 [2000]）。ＰＴＴＧ遺伝
子ファミリーの機能的性状解析を始めるために、ＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３により
コードされる読みとり枠を、哺乳動物細胞中のトランス活性化機能について試験
した。９０％のアミノ酸同一性にもかかわらず、ＰＴＴＧ３タンパク質は、ＰＴ
ＴＧ１より１０倍低いトランス活性化能を有し、これはおそらく、本明細書で前
記した、マウスＰＴＴＧ１の構造／機能分析により、トランス活性化に決定的に
重要であることが証明された残基中のアミノ酸の差（Ｅ１７５Ｋ、Ｄ１２４Ｇ）
によるものであろう。
【０３３５】 コードされるＰＴＴＧ２タンパク質は、１７９アミノ酸についてＰＴＴＧ１タ
ンパク質と９０％同一であるが、そのカルボキシ末端は、追加の１２アミノ酸に
ついて相同性ではない。ＰＴＴＧ２タンパク質は、Ｐ１４５、Ｓ１６５、Ｅ１７
５に対応するマウスＰＴＴＧ中で同定される決定的に重要な残基とヒトＰＴＴＧ
１中のアミノ酸１２３〜１３０を保持するため、この異なるカルボキシ末端が、
トランス活性化活性の３０倍上昇の原因である可能性がある。異なるカルボキシ
末端をコードする変種ＰＴＴＧ転写体は、トランス活性化機能と形質転換能力を
失なったため、カルボキシ末端領域はマウスＰＴＴＧ機能にとって決定的に重要
である。ＰＴＴＧ２のカルボキシ末端セグメントの除去は、トランス活性化機能
の２６倍の上昇を引き起こし、これはＰＴＴＧ２のこの領域がトランス活性化に
対して阻害作用を有することを意味する。
【０３３６】 我々は、ＰＴＴＧ２および／またはＰＴＴＧ３タンパク質が、ＰＴＴＧ１タン
パク質のトランス活性化機能を阻害するかどうかを試験した。これらの遺伝子を
過剰発現するプラスミドを、ＤＢＤプラスミドと比較して５倍モル過剰の「遊離
の」ＰＴＴＧ遺伝子を使用して、トランス活性化測定法で同時トランスフェクシ
ョンした。ＰＴＴＧ２の過剰発現は、ＰＴＴＧ１トランス活性化活性をほとんど
半分に低下させ、ＰＴＴＧ３は、この系でまったく効果はなかった。ＰＴＴＧ２
による阻害は用量依存性であり、複数の実験で異なるＤＮＡ調製物で再現された
。我々は、ＰＴＴＧ２過剰発現はまた、ＰＴＴＧ３とＰＴＴＧ２および無関係の
遺伝子ＶＰ１６のトランス活性化活性も阻害することを見いだした。予想外にも
、遊離のＰＴＴＧ１の過剰発現は、ＤＢＤ−ＰＴＴＧ１のトランス活性化活性を
増強した。ＶＰ１６、ＰＴＴＧ２およびＰＴＴＧ３のトランス活性化活性は変化
しなかったため、この増強は、遺伝子特異的であった。１つの解釈は、ＰＴＴＧ
１が、トランス活性化中にオリゴマーを形成することである。
【０３３７】 野生型ＰＴＴＧ１−Ｃ末端過剰発現は、ＰＴＴＧ１トランス活性化に対してほ
んのわずかの作用を有するのみであるため、ＰＴＴＧ２により引き起こされたト
ランス活性化の大きな低下は、明らかに２つを超えるＳＨ３結合ドメインを必要
とする。我々は、末端切断型ＰＴＴＧ２をコードするプラスミドを作成して、Ｐ
ＴＴＧ２タンパク質の顕著なカルボキシ末端テイルが、優性陰性阻害作用に関与
するかどうかを試験した。変異体ＰＴＴＧ２タンパク質の過剰発現（免疫細胞蛍
光により確認された；示していない）は、ＰＴＴＧ１によるトランス活性化を阻
害しない。従ってＰＴＴＧ２の阻害機能は、その異なるカルボキシ末端に依存す
る。
【０３３８】 ＰＴＴＧファミリーは、２つの意味で他の癌遺伝子ファミリーとは異なる。第
１に、ほとんどの癌（結腸、乳房、卵巣および骨髄系統）でＰＴＴＧ１のみが過
剰発現される。これは、複数の同族体がプロト癌遺伝子であるｒａｓやｍｙｃと
は対照的であるが、その活性化は組織特異的癌に対応するかも知れない。ＰＴＴ
Ｇファミリーの第２の特徴は、その異なる同族体が、反対の細胞内機能を有する
ことである。ＰＴＴＧ１は転写を活性化するが、ＰＴＴＧ２は、特異的ではない
が用量依存性にトランス活性化を阻害する。この阻害ドメインは、異なるＰＴＴ
Ｇ２カルボキシ末端にマッピングされる。本発明は、特定の分子機構に依存しな
いが、いくつかのモデル（例えば、転写機構への非生産的結合、転写因子の隔離
、または不活性なヘテロダイマーの形成）がこの転写阻害を説明できるかも知れ
ない。試験したすべて腫瘍の中で、あまり転移しない下垂体腫瘍が、比例的に高
いレベルの発現を有することに注意されたい。
【図面の簡単な説明】
【図１】 トランスフェクションの４８時間後のｐＧＡＬ４、ｐＧＡＬ４−ＶＰ１６，ｐ
ＧＡＬ−４−ｗＰＴＴＧ、またはｐＧＡＬ４−ｍｕｔＰＴＴＧにより仲介される
、トランスフェクションしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞中のトランス活性化を例示する
。細胞溶解物タンパク質を、ルシフェラーゼとβ−ｇａｌ発現について測定した
。ｐＧＡＬ４は陰性対照として使用し、ｐＧＡＬ４−ＶＰ１６は陽性対照として
使用した。
【図２】 トランスフェクションした腫瘍細胞中のＰＴＴＧ−ＣとＰＴＴＧ−Ｃｐｍ発現
を示す。図２Ａは、ＣＭＶプロモーター（黒い棒）の制御下での、配列番号４の
アミノ酸残基１４７−２０２（すなわち、配列番号９）に対応するヒトＰＴＴＧ
１タンパク質のＣ末端ペプチド（ＰＴＴＧＣ）の発現構築体を例示する。ＰＸＸ
Ｐは、ＰＴＴＧ−Ｃのプロリンリッチな領域である。突然変異発現ベクター（Ｐ
ＴＴＧ−Ｃｐｍ）は、点突然変異Ｐ１６３Ａ、Ｓ１６５Ｑ、Ｐ１６６Ｌ、Ｐ１７
０Ｌ、Ｐ１７２ＡおよびＰ１７３Ｌを含有した。図２Ｂは、ヒーラ細胞（上のパ
ネル）、Ｔ−４７Ｄ細胞（真ん中のパネル）、およびＭＣＦ−７細胞（下のパネ
ル）のＲＴ−ＰＣＲ産物の１％アガロースゲルであり、ＰＴＴＧ−ＣとＰＴＴＧ
−Ｃｐｍ発現を示す。ＲＴの存在下（＋）または非存在下（−）で行った逆転写
の生成物を、ＰＣＲ反応の鋳型として使用した。図２Ｃは、ＲＴ−ＰＣＲ後の直
接配列解析の代表的配列決定ゲルであり、各トランスフェクション体中のＰＴＴ
Ｇ−ＣとＰＴＴＧ−Ｃｐｍの発現を示す。矢印は、ヌクレオチド変化を示す。
【図３】 軟寒天上でＰＴＴＧ−ＣまたはＰＴＴＧ−Ｃｐｍ発現ベクターでトランスフェ
クションしたヒーラ細胞（上の段）、Ｔ−４７Ｄ細胞（真ん中の段）、およびＭ
ＣＦ−７細胞（下の段）のコロニー形成を示す。「ベクター（左の列）」は、ベ
クターｐＣＩ−ｎｅｏ単独でトランスフェクションした細胞を示し、「ＰＴＴＧ
−Ｃ」（真ん中の列）は、ＰＴＴＧ−Ｃ末端をコードするｃＤＮＡを含有するベ
クターｐＣｉ−ｎｅｏでトランスフェクションした細胞を示し、「ＰＴＴＧ−Ｃ
ｐｍ」（右の列）は、変異体ＰＴＴＧ Ｃ末端ｃＤＮＡ（Ｐ１６３Ａ、Ｓ１６５
Ｑ、Ｐ１６６Ｌ、Ｐ１７０Ｌ、Ｐ１７２ＡおよびＰ１７３Ｌ）を含有するベクタ
ーｐＣＩ−ｎｅｏでトランスフェクションした細胞を示す。
【図４】 ＰＴＴＧ−Ｃペプチドを発現するヒーラ細胞によるｂＦＧＦ分泌の抑制を示す
。７２時間培養したトランスフェクション体から得られる調整培地中のｂＦＧＦ
の、ＥＬＩＳＡで測定した濃度。「ベクター」（２つの最も左の棒）は、ベクタ
ーｐＣＩ−ｎｅｏ単独でトランスフェクションした細胞により調整した培地を示
し、「ＰＴＴＧ−Ｃ」（３つの真ん中の棒）は、ｗｔＰＴＴＧ−Ｃ末端をコード
するｃＤＮＡを含有するベクターｐＣＩ−ｎｅｏでトランスフェクションした細
胞により調整した培地を示し、「ＰＴＴＧ−Ｃｐｍ」（３つの最も右の棒）は、
変異体ＰＴＴＧ Ｃ末端ｃＤＮＡ（Ｐ１６３Ａ、Ｓ１６５Ｑ、Ｐ１６６Ｌ、Ｐ１
７０Ｌ、Ｐ１７２ＡおよびＰ１７３Ｌ）を含有するベクターｐＣＩ−ｎｅｏでト
ランスフェクションした細胞により調整した培地を示す。
【図５】 分裂促進因子である抗ＣＤ３抗体で処理した正常ヒト成人Ｔ細胞中のＰＴＴＧ
ｍＲＮＡ発現を示す。Ｔ細胞を単離し、抗ＣＤ３抗体で７２時間刺激した。Ｐ
ＴＴＧ ｍＲＮＡ ＰＴＴＧをノーザンブロッティングで測定し、Ｓ期またはＧ
２／Ｍ期の細胞のパーセントをＦＡＣＳにより測定した。
【図６】 分裂促進因子である植物性血球凝集素（ＰＨＡ）で処理した正常ヒト成人Ｔ細
胞中のＰＴＴＧ ｍＲＮＡ発現を示す。Ｔ細胞を単離し、上昇する濃度のＰＨＡ
で７２時間刺激した。ＰＴＴＧ ｍＲＮＡをノーザンブロッティングで測定し、
Ｓ期またはＧ２／Ｍ期の細胞のパーセントをＦＡＣＳにより測定した。
【図７】 分裂促進因子であるＣＤ３抗体で処理した正常ヒト成人Ｔ細胞中のＩＬ−２
ｍＲＮＡ発現を示す。Ｔ細胞を単離し、抗ＣＤ３抗体で７２時間刺激した。ＩＬ
−２ ｍＲＮＡ ＰＴＴＧをノーザンブロッティングで測定し、Ｓ期またはＧ２
／Ｍ期の細胞のパーセントをＦＡＣＳにより測定した。
【図８】 分裂促進因子である抗ＣＤ３抗体で処理した正常ヒト成人Ｔ細胞中のシクロフ
ィリン ｍＲＮＡ発現を示す。Ｔ細胞を単離し、抗ＣＤ３抗体で４８時間刺激し
た。シクロフィリン ｍＲＮＡ ＰＴＴＧをノーザンブロッティングで測定した
。
【図９】 ＰＴＴＧ ｍＲＮＡ発現とヒドロコーチゾンを示す。ＰＨＡ（５μg/ml）刺激
正常ヒト成人Ｔ細胞をヒドロコーチゾンで７２時間処理した。ＰＴＴＧ ｍＲＮ
Ａをノーザンブロッティングで測定し、Ｓ期またはＧ２／Ｍ期の細胞のパーセン
トをＦＡＣＳにより測定した。
【図１０】 ＰＴＴＧ ｍＲＮＡ発現とシクロスポリンを示す。ＰＨＡ（５μg/ml）刺激正
常ヒト成人Ｔ細胞をシクロスポリンで７２時間処理した。ＰＴＴＧ ｍＲＮＡを
ノーザンブロッティングで測定し、Ｓ期またはＧ２／Ｍ期の細胞のパーセントを
ＦＡＣＳにより測定した。
【図１１】 白血病細胞中のＰＴＴＧ ｍＲＮＡ発現を例示する。循環するヒト白血病ＨＬ
−６０細胞（１）、ジューカット（Jurkat）Ｔ細胞（２）、休止細胞（３）、Ｐ
ＨＡ（５μg/ml）刺激細胞、（４）抗ＣＤ３刺激細胞、および（５）正常ヒト成
人Ｔ細胞のＰＴＴＧ ｍＲＮＡ値と細胞サイクルを測定した。
【図１２】 Ｔ細胞中のＰＴＴＧ ｍＲＮＡ発現と細胞サイクルを示す。Ｔ細胞を以下の条
件で処理し、ＰＴＴＧ ｍＲＮＡとＳ期のパーセントを比較した。（１）休止細
胞；（２）ＰＨＡ（５μg/ml）刺激；（３）抗ＣＤ３刺激；（４）抗ＣＤ３＋ヒ
ドロコーチゾン（１００nM）；（５）抗ＣＤ３＋シクロスポリンＡ（１μg/ml）
；（６）抗ＣＤ３＋アフィジコリン（１μg/ml）；（７）抗ＣＤ３＋ノコダゾー
ル（５００ng/ml）；（８）抗ＣＤ３＋ＴＧＦ−β１（１０ng/ml）。
【図１３】 ヒトジューカットＴ細胞白血病株中のＰＴＴＧ ｍＲＮＡ発現。ジューカット
Ｔ細胞を、後述のように処理した。（１）１％ＦＢＳ補足培地中で４８時間維持
した細胞；（２）新鮮な１％ＦＢＳ補足培地に培地交換した後の細胞；（３）１
０％ＦＢＳ補足培地に培地交換した後の細胞；（４）１％ＦＢＳ中の植物性血球
凝集素（ＰＨＡ；１μg/ml）＋ホルボール−１２−メリステート−１３−アセテ
ート（ＰＭＡ；５０ng/ml）；（５）（ＰＨＡ＋ＰＭＡ）＋シクロスポリンＡ（
１μg/ml）；（６）（ＰＨＡ＋ＰＭＡ）＋ＴＧＦ−β１（１０ng/ml）。
【図１４】 代表的ノーザンブロッット（上のパネル）とウェスタンブロット（下のパネル
）解析を示し：（図１４ａ）正常組織（Ｎ）および乳癌（Ｔ；ｎ＝１２）組織；
および（図１４ｂ）正常組織（Ｎ）および卵巣癌（Ｔ；ｎ＝１３）組織を比較し
、ＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡとＰＴＴＧ１タンパク質の発現を示す。ＰＴＴＧ１また
はβ−アクチンについて［α−32Ｐ］ｄＣＴＰプローブを用いるハイブリダイゼ
ーション、または抗ＰＴＴＧ１抗体（１：５０００）を用いるブロッティングは
、隣接の正常組織と比較して、乳癌および卵巣癌のＰＴＴＧ過剰発現を示した。
ＪＥＧ−３絨毛癌細胞は、陽性対照とした。左端、分子サイズ；右端、ｍＲＮＡ
産物の位置。
【図１５】 エストロゲンによるインビトロのＰＴＴＧ１の制御を示す。完全長ＰＴＴＧ−
プロモーターで一過性にトランスフェクションした（図１５ａ）ＭＣＦ−７細胞
と（図１５ｂ）ＳＫＯＶ−３細胞を、活性炭で精製した血清（ＣＳＳ）で前処理
した血清を含有する培地（白い棒）、１０％ＦＢＳ（ＷＳ）を含有する培地を添
加する前（黒い棒）、またはＣＳＳと添加エストロゲン（ジエチルシチルベスト
ロール １０08〜１０-10Ｍ）（Ｅ）を含有する培地（影の棒）中で、抗エスト
ロゲン有りまたは無し（影の棒）でインキュベートした（ＩＣＩ−１８２７８０
１０-7〜１０-8Ｍ）（ＡＥ）。ＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡをβ−アクチンについて
標準化した。各棒は、３つの別々の実験からの６つのプレートの平均±ＳＥＭで
ある。統計解析はＡＮＯＶＡにより行った。
【図１６】 ｗｔ−ｈＰＴＴＧ Ｃ末端ペプチドが、寒天中のコロニー形成を阻害し、乳癌
細胞をタキソールに対して感作することを示す。ベクター単独（ａ，ｂ，ｃ，ｄ
）またはｗｔ−ｈＰＴＴＧ Ｃ末端をコードするＤＮＡを含有するベクター（ｅ
，ｆ，ｇ，ｈ）でトランスフェクションしたＭＣＦ−７細胞（約５，０００）を
、ビヒクルのみ（ａ，ｅ）またはタキソール１０-11Ｍ（ｂ，ｆ）、１０-10Ｍ（
ｄ，ｇ）または１０-9Ｍ（ｄ，ｈ）を含有する寒天中に入れた（倍率×２００）
。
【図１７】 ビヒクルのみまたはタキソール（１０-11Ｍ〜１０-10Ｍ）で処理（１０日）後
の、寒天中のベクターでトランスフェクションしたおよびベクター＋ｗｔ−ｈＰ
ＴＴＧ Ｃ末端ＤＮＡでトランスフェクションしたＭＣＦ−７細胞により形成さ
れたコロニーの数を示す。
【図１８】 トランスフェクションおよび非トランスフェクションＮＩＨ−３Ｔ３細胞から
得られた調整培地中のｂＦＧＦ濃度を示す。野生型ＰＴＴＧ、変異体ｈＰＴＴＧ
またはベクター単独でトランスフェクションしたかまたは非トランスフェクショ
ンＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、無血清ＤＭＥＭ中で４８時間インキュベートし、調整
培地のアリコートを集めた。ｂＦＧＦ濃度を、ＥＬＩＳＡにより測定した。ＷＴ
、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；Ｍ、Ｍｕｔ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；Ｃ、Ｃ−ＣＭ；Ｎ
，Ｎ−ＣＭ。示したデータは、３つの別々の実験からの平均±ＳＤである。*、
ｐ＜０．０１対ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ。
【図１９】 内皮細胞増殖を示す。トランスフェクションしたかまたは非トランスフェクシ
ョンＮＩＨ−３Ｔ３細胞から得られた５００mlの調整培地中で、４８ウェル培養
プレート上でＨＵＶＥＣを培養した。４８時間のインキュベーション後細胞数を
測定した。記載した結果は、３つの別々の実験からの平均±ＳＤである。左から
右へ：Ｄ、無血清ＤＭＥＭ；Ｆ、ＤＭＥＭ中１ng/ml ｂＦＧＦ；ＷＴ、ＷＴ−
ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；Ｍ、Ｍ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；Ｃ、Ｃ−ＣＭ；Ｎ、Ｎ−ＣＭ。
ｐ＜０．０１対 *無血清ＤＭＥＭ、**ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ、***各調整培地
単独。
【図２０】 傷害測定法におけるＨＵＶＥＣの移動を示す。ＨＵＶＥＣの傷害単層を、調整
培地の各アリコートに１６時間暴露した。次に、移動した細胞を固定し、染色し
、写真を撮った。（Ａ）ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ中の移動ＨＵＶＥＣの代表的写
真を示す。ａ、調整培地単独；ｂ、調整培地＋１００ng/ml抗ｂＦＧＦ抗体。（
Ｂ）移動ＨＵＶＥＣの定量。３つの視野の０．１×２．５mm領域内の細胞数を、
カミソリの刃で付けた元々のマークを起点として使用して計測した。示した結果
は、３つの別々の実験からの視野当たりの細胞の平均数±ＳＤである。ａ、対照
；ｂ、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；ｃ、Ｍ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；ｄ、Ｃ−ＣＭ；ｅ
、Ｎ−ＣＭ；白丸、ＤＭＥＭ中１ng/ml ｂＦＧＦ；白三角、無血清ＤＭＥＭ；
黒丸、調整培地単独；黒三角、調整培地＋１００ng/ml抗ｂＦＧＦ抗体；黒四角
、調整培地＋１００ng/ml免疫前ヤギＩｇＧ。
【図２１】 Ａは、改変ボイデンチャンバー測定法中のＨＵＶＥＣの移動を示す。試料調整
培地を、改変ボイデンチャンバーの下のチャンバーに入れ、ＨＵＶＥＣを上のチ
ャンバーに加えた。２４時間のインキュベーション後、非移動細胞を取り出し、
膜の孔（８μm）を通過した細胞をギムザ染色し、写真を撮った。（Ａ）各実験
条件下で代表的膜からの移動したＨＵＶＥＣの顕微鏡写真。ａ、無血清ＤＭＥＭ
；ｂ、ＤＭＥＭ中１ng/ml ｂＦＧＦ；対照；ｃ、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；ｄ
，ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ＋１００ng/ml抗ｂＦＧＦ抗体；ｅ、ＷＴ−ｈＰＴＴ
Ｇ−ＣＭ＋１００ng/ml免疫前ヤギＩｇＧ；ｆ、Ｍ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；ｇ、Ｃ
−ＣＭ；ｈ、Ｎ−ＣＭ。 Ｂは、移動した細胞の定量を示す。染色した細胞を１０％酢酸で抽出し、抽出
溶液の吸光度を測定した。示したデータは、３つの別々の実験の平均±ＳＤであ
る。Ｄ、無血清ＤＭＥＭ；Ｆ、ＤＭＥＭ中１ng/ml ｂＦＧＦ；ＷＴ、ＷＴ−ｈ
ＰＴＴＧ−ＣＭ；Ｍ，Ｍ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；Ｃ、Ｃ−ＣＭ；Ｎ、Ｎ−ＣＭ。ｐ
＜０．０１対 *ＤＭＥＭ、**ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ、***各調整培地（ＣＭ）
単独。
【図２２】 マトリゲル上のＨＵＶＥＣの管形成を示す。試料調整培地中に懸濁しＧＦＲマ
トリゲルに蒔いた５×１０4 のＨＵＶＥＣは、２４ウェル培養プレートを厚く被
覆した。２４時間インキュベーション後、位相差顕微鏡で写真を取った。図２２
Ａは、管形成ＨＵＶＥＣの顕微鏡写真を示す。各実験条件の代表的な写真を示す
。ａ、無血清ＤＭＥＭ；ｂ、ＤＭＥＭ中１ng/ml ｂＦＧＦ；ｃ、ＷＴ−ｈＰＴ
ＴＧ−ＣＭ；ｄ，ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ＋１００ng/ml抗ｂＦＧＦ抗体；ｅ、
ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ＋１００ng/ml免疫前ヤギＩｇＧ；ｆ、Ｍ−ｈＰＴＴＧ
−ＣＭ；ｇ、Ｃ−ＣＭ；ｈ、Ｎ−ＣＭ。図２２Ｂは、管形成の定量を示す。管の
長さは、「材料と方法」に記載のように定量した。３つの別々の実験の平均ピク
セル数±ＳＤを表す。左から右へ：Ｄ、無血清ＤＭＥＭ；Ｆ、ＤＭＥＭ中１ng/m
l ｂＦＧＦ；ＷＴ、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；Ｍ、Ｍ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；Ｃ
、Ｃ−ＣＭ；Ｎ、Ｎ−ＣＭ。ｐ＜０．０１対 *ＤＭＥＭ、**ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−
ＣＭ、***各調整培地（ＣＭ）単独。
【図２３】 調整培地に対するＣＡＭの血管反応を示す。コラーゲンスポンジ中の試験試料
、陽性対照または陰性対照を、９日令のヒヨコ胚のＣＡＭにのせた。４日後、Ｃ
ＡＭの写真を取った。（Ａ）１３日令のヒヨコ胚の代表的ＣＡＭの写真。ａ、無
血清ＤＭＥＭ；ｂ、ＤＭＥＭ中１ng/ml ｂＦＧＦ；ｃ、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−Ｃ
Ｍ；ｄ，ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；ｅ、Ｃ−ＣＭ；ｆ、Ｎ−ＣＭ。（Ｂ）誘導さ
れた血管の定量。コラーゲンスポンジ中に入っている血管の数を、立体顕微鏡で
計測した。示したデータは、３つの別々の実験の平均±ＳＤである。：Ｄ、無血
清ＤＭＥＭ；Ｆ、ＢＰＳ中１ng/ml ｂＦＧＦ；ＷＴ、ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ
；Ｍ、Ｍ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ；Ｃ、Ｃ−ＣＭ；Ｎ、Ｎ−ＣＭ。ｐ＜０．０１対 *
ＰＢＳ、**ＷＴ−ｈＰＴＴＧ−ＣＭ。
【図２４】 ＰＴＴＧ遺伝子ファミリーの保存を示す。コードされたＰＴＴＧタンパク質を
、相同性を示すために整列させる。ＰＸＸＰモチーフと高度に保存された領域に
下線を引く。星印は、同じアミノ酸を示し、ダッシュは、整列を維持するために
入れる。略号：ｈ−ヒト、ｍ−マウス、ｒ−ラット。
【図２５】 ヒトＰＴＴＧ遺伝子ファミリーのゲノム構造を示す。イントロンの無いＰＴＴ
Ｇ同族体であるＰＴＴＧ２−４は、ＰＴＴＧ１のｃＤＮＡの下に示して、相対的
サイズと共通の特徴を示す。ＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３はそれぞれ、ＰＴＴＧ４が
欠如したフレーム内ＡＴＧを含有する。逆転位(retrotransposition)イベントに
関連するフランキング繰り返し成分を示す。
【図２６】 正常ヒト胎児と成体組織中のＰＴＴＧのプライマー伸長解析を例示する。ＰＴ
ＴＧ ｃＤＮＡは、ネステッドＰＣＲによりクロンテク（Clontech）の胎児複数
組織パネル（ａ）、および成体複数組織パネルＩとII（ｂ）から増幅し、プライ
マー伸長解析に付して、ＰＴＴＧ遺伝子ファミリーメンバーの相対的比率を決定
した。上：オートラジオグラム；下：密度計測の結果。
【図２７】 正常および新生物結腸（図２７Ａ）、乳房（図２７Ｂ）、および卵巣（図２７
Ｃ）中のヒトＰＴＴＧのプライマー伸長解析を示す。ＰＴＴＧ ＲＴ−ＰＣＲ産
物を標準化し、プライマー伸長解析に付してＰＴＴＧ１−４の相対的発現レベル
を決定した。パネル：（Ａ）対の正常組織と５人の患者から得られた腫瘍性結腸
組織からのＰＴＴＧ ｃＤＮＡ、（Ｂ）正常および腫瘍性乳房、（Ｃ）正常およ
び腫瘍性卵巣組織。Ｔ＝腫瘍、Ｎ＝正常組織。
【図２８】 隣接する正常結腸細胞と比較した図２７Ａ中の５つの結腸腫瘍の細胞中の相対
的ＰＴＴＧ ｍＲＮＡ発現を示す。
【図２９】 下垂体腫瘍中のヒトＰＴＴＧのプライマー伸長解析を示す。ヒトの下垂体腺腫
または正常下垂体からの標準化ＰＴＴＧ ｃＤＮＡを使用するプライマー伸長反
応を、密度測定により解析し、グラフで示す。正常下垂体試料は、２つの死体解
剖後の生検と、１８の正常下垂体のプールからのｃＤＮＡ（クロンテク（Clonte
ch））を含んだ。腫瘍サブタイプ：ＮＦ−非機能性；ホルモン分泌性：ＰＲＬ−
プロラクチン、ＧＨ−成長ホルモン、ＡＣＴＨ−副腎皮質刺激ホルモン、ＬＨ／
ＦＳＨ−黄体形成ホルモンと卵胞刺激ホルモン、ａｓｕ−アルファサブユニット
について免疫陽性。３つの混合腫瘍は、以下のホルモンについて免疫陽性であっ
た：Ｔ−４９：ＦＳＨ／ＬＨ／ＡＣＴＨ、Ｔ−５２：ＧＨ／ＰＲＬ／ａｓｕ、Ｔ
−５６：ＰＲＬ／ＡＣＴＨ。
【図３０】 ＰＴＴＧ遺伝子の染色体局在化を示す。Ａは、ハムスター／ヒトのモノクロモ
ソームハイブリッド細胞株からのＢａｍＨＩ消化ＤＮＡのサザンブロット解析を
示し、これは電気泳動し、ＰＴＴＧ ｃＤＮＡプローブを用いてサザンブロット
解析に付し、ヒトゲノムＤＮＡ中の各ハイブリダイズするバンドの起点を同定し
た。Ｂは、３つの結腸腫瘍と一致する正常組織とからのＰＴＴＧ１−３ ＰＣＲ
産物とプローブ結合させた、ＢａｍＨＩ消化ヒトゲノムＤＮＡのサザンブロット
解析を示す。各レーンの対は、異なる患者から得られた。Ｔ＝腫瘍、Ｎ＝正常組
織。Ｃは、癌細胞株中のＰＴＴＧ遺伝子ファミリーメンバーのサザンブロット解
析を示す。ＢａｍＨＩ消化ゲノムＤＮＡを電気泳動し、ＰＴＴＧ１ ｃＤＮＡと
ＰＴＴＧ２とＰＴＴＧ３ゲノムＰＣＲ産物のプローブ混合物を用いて、サザンブ
ロット解析に付した。細胞株は：ＨＬ−６０、ＪＥＧ３、ＫＧ１、ＩＬ２４およ
びＭＢ２３１である。染色体１７プローブであるＨＨＨ２０２へのハイブリダイ
ゼーションを以下に示す。Ｄは、癌細胞株中のＰＴＴＧのノーザンブロッッティ
ング解析を示す。Ｄ中の細胞株のノーザンブロット解析：ＨＬ−６０、ＪＥＧ３
、ＫＧ１、ＬＬ２４およびＭＢ２３１は、ＰＴＴＧ（上）または１８Ｓ ｃＤＮ
Ａ（下）とプローブ結合した。
【図３１】 ヒトＰＴＴＧ１、ＰＴＴＧ２およびＰＴＴＧ３により仲介される転写活性化を
示す。ＧＡＬ４−ＤＢＤプラスミド：ｐＢＩＮＤ（挿入体対照無し）、ｐＢＩＮ
Ｄ−ＰＴＴＧ１、−ＰＴＴＧ２、−ＰＴＴＧ２ΔＳ、−ＰＴＴＧ２ΔＬ、または
−ＰＴＴＧ３を、本明細書に記載のように、トランス活性化測定法のためにＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞中にトランスフェクションした。ＰＴＴＧ２ΔＬは、末端切断型Ｐ
ＴＴＧ２をコードし、アミノ酸１７９の後の分岐性カルボキシ末端テイルが欠如
している。ＰＴＴＧΔＳは、コドン１５６の後にフレームシフト変異を有し、こ
れは、フレーム外の１０アミノ酸を有しＰＸＸＰドメインの無い末端切断型タン
パク質を与える。ルシフェラーゼレベルは、β−ガラクトシダーゼ活性に対して
標準化した。結果は、３つの別々の実験からの平均±ＳＥＭを示す。
【図３２】 ＰＴＴＧの過剰発現によるトランス活性化の阻害を示す。Ａは、ＰＴＴＧ１ト
ランス活性化機能がＰＴＴＧ２の過剰発現により阻害されることを示す。ＰＴＴ
Ｇ１−３およびＰＴＴＧ１カルボキシ末端（ＳＨ３ドメインの野生型または変異
型）、または末端切断型（ＰＴＴＧ２ΔＣ）、対照ｐＴａｒｇｅＴプラスミド（
挿入体無し）を過剰発現する５倍過剰のプラスミドを、本明細書に記載のように
、ｐＢＩＮＤ−Ｇ１、ｐＧ５／ＬｕｃおよびｐＣＭＶ／Ｂｇａｌを有するＮＩＨ
３Ｔ３細胞中に同時トランスフェクションした。ルシフェラーゼレベルを、ベー
タ−ガラクトシダーゼ活性に対して標準化し、ｐＴａｒｇｅＴプラスミドとの同
時トランスフェクションに対するパーセント対照として表した。結果は、少なく
とも３つの実験からの平均±ＳＥＭである。Ｃ’＝カルボキシ末端。Ｂは、ＶＰ
１６、ＰＴＴＧ３およびＰＴＴＧ２のトランス活性化機能は、ＰＴＴＧ２の過剰
発現により阻害されることを示す。ＰＴＴＧ１−３または対照ｐＴａｒｇｅＴプ
ラスミド（挿入体無し）を過剰発現する５倍過剰のプラスミドを、トランス活性
化プラスミドでＮＩＨ３Ｔ３細胞中に同時トランスフェクションし、上記のよう
に測定した。結果は、三重測定からの平均±ＳＥＭである。ＰＴＴＧ１に対して
、トランス活性化活性は：ＶＰ１６（３３１％）、ＰＴＴＧ３（１５．４％）、
ＰＴＴＧ２（９．８７％）、ｐＢＩＮＤ対照プラスミド（４．６５％）。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 ４Ｃ０８７ 37/06 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ０９／７３０，４６９ (32)優先日 平成12年12月４日(2000．12．4) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／７７７，４２２ (32)優先日 平成13年２月５日(2001．2．5) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／８５４，３２６ (32)優先日 平成13年５月11日(2001．5．11) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ザーン、シュン アメリカ合衆国 マサチューセッツ、モー ルデン、 サマー ストリート 105、ナ ンバー 204 (72)発明者 メルメッド、シュロモ アメリカ合衆国 カリフォルニア、ロス アンジェルス、 クレスタ ドライブ 9437 Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA35 BB10 BB29 BB50 BB51 DA13 FA16 FA29 FB02 FB03 FB05 FB08 GC10 JA01 4B024 AA01 AA12 BA21 CA04 EA02 GA11 HA11 HA17 4B063 QA01 QA18 QQ08 QR32 QR55 QS34 4C084 AA01 AA02 AA13 BA02 BA35 CA18 NA14 ZB08 ZB26 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 NA14 ZB08 ZB26 4C087 AA01 AA02 CA12 NA14 ZB08 ZB26

Claims (53)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 哺乳動物Ｔリンパ球細胞の活性化を阻害する方法であって、 Ｔリンパ球細胞においてＰＴＴＧ１および／または内因性ＰＴＴＧ１を阻害し
    、それによってＴリンパ球細胞の活性化が阻害される上記方法。
  2. 【請求項２】 ＰＴＴＧ１特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドをＴリン
    パ球細胞に送達することをさらに含む請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 内因性ＰＴＴＧ１タンパク質分子上のＳＨ３結合部位への特
    異的結合を阻止することにより、ＳＨ３介在シグナル伝達を妨害することをさら
    に含む請求項１の方法。
  4. 【請求項４】 ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドからなる組成
    物を哺乳動物Ｔリンパ球細胞に送達し、該ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレ
    オチドが細胞に入るのに充分な量と条件下で、細胞性取り込み増強物質と複合体
    を形成しており、こうしてリンパ球細胞の活性化が阻害される、 ことをさらに含む請求項１の方法。
  5. 【請求項５】 Ｔリンパ球細胞はヒト起源である請求項１の方法。
  6. 【請求項６】 Ｔリンパ球細胞はインビトロで培養される請求項１の方法。
  7. 【請求項７】 組成物がインビボで細胞に送達されるように、組成物を哺乳
    動物被験体に投与することをさらに含む請求項４の方法。
  8. 【請求項８】 ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡである請求項４の方
    法。
  9. 【請求項９】 ポリヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである
    請求項４の方法。
  10. 【請求項１０】 ポリヌクレオチドはタンパク質核酸である請求項４の方法
    。
  11. 【請求項１１】 組成物は、プロモーターを含む発現ベクターをさらに含み
    、ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドは、転写単位中でプロモーター
    に機能的に連結している請求項８の方法。
  12. 【請求項１２】 ポリヌクレオチドはＰＴＴＧカルボキシ末端ペプチドをコ
    ードする請求項１１の方法。
  13. 【請求項１３】 ポリヌクレオチドは、 （Ａ）（配列番号９）、（配列番号１６）または（配列番号１７）のアミノ酸
    配列を有するペプチド、 （Ｂ）（Ａ）のいずれかと少なくとも約６０％の配列相同性を有する哺乳動物
    ＰＴＴＧ−Ｃペプチド、および （Ｃ）少なくとも１５の連続的アミノ酸残基を有し、内因性ＰＴＴＧ発現およ
    び／またはＰＴＴＧ機能をダウンレギュレートするように機能する（Ａ）または
    （Ｂ）のペプチド断片、 よりなる群から選択される哺乳動物ＰＴＴＧ−Ｃペプチドをコードするヌクレオ
    チド塩基配列を規定する請求項１２の方法。
  14. 【請求項１４】 （Ｃ）のペプチド断片はプロリンリッチな領域を含む請求
    項１３の方法。
  15. 【請求項１５】 ポリヌクレオチドは、 （Ａ）（配列番号１０）、（配列番号１８）または（配列番号１９）、 （Ｂ）（Ａ）のいずれかの縮重コード配列、 （Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）のいずれかに相補的な配列、または （Ｄ）（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のいずれかの少なくとも４５の連続的ヌク
    レオチドを含むポリヌクレオチド断片、 からなるヌクレオチド配列を有する請求項１３の方法。
  16. 【請求項１６】 プロモーターを含む発現ベクターとポリヌクレオチドとを
    含む組成物を送達することを含み、該ポリヌクレオチドは、哺乳動物ＰＴＴＧ−
    Ｃペプチドをコードする第１のＤＮＡセグメントを含み、該ポリヌクレオチドは
    転写単位内でプロモーターに機能的に連結しており、該ＰＴＴＧ−Ｃペプチドは （Ａ）（配列番号９）、（配列番号１６）または（配列番号１７）のアミノ酸
    配列を有するペプチド、 （Ｂ）（Ａ）のいずれかと少なくとも約６０％の配列相同性を有する哺乳動物
    ＰＴＴＧ−Ｃペプチド、および （Ｃ）少なくとも１５の連続的アミノ酸残基を有し、内因性ＰＴＴＧ発現およ
    び／またはＰＴＴＧ機能をダウンレギュレートするように機能する（Ａ）または
    （Ｂ）のペプチド断片、よりなる群から選択され、 該発現ベクターは、ＰＴＴＧ−ＣペプチドがＴリンパ球細胞内で発現されるよ
    うに、細胞に入るのに充分な量と条件下で、細胞性取り込み増強物質と複合体を
    形成しており、こうしてリンパ球細胞の活性化が阻害される、 ことからなる請求項１の方法。
  17. 【請求項１７】 （Ｃ）のペプチド断片はプロリンリッチな領域を含む請求
    項１６の方法。
  18. 【請求項１８】 ポリヌクレオチドは、取り込み増強物質および／または移
    入能力のあるペプチドセグメントをコードする第２のＤＮＡセグメントをさらに
    含む請求項１６の方法。
  19. 【請求項１９】 取り込み増強物質および／または移入能力のあるペプチド
    セグメントは、ヒト免疫不全症ウイルスＴＡＴ由来ペプチドセグメント、または
    カポジ繊維芽細胞増殖因子からのシグナルペプチドである請求項１８の方法。
  20. 【請求項２０】 発現ベクターがインビボで細胞に送達されるように、組成
    物を哺乳動物被験体に投与することをさらに含む請求項１６の方法。
  21. 【請求項２１】 Ｔリンパ球細胞に入り込ませ、それによってＴリンパ球細
    胞の活性化が阻害されるのに充分な量と条件下で、細胞性取り込み増強物質と複
    合体を形成したＰＴＴＧカルボキシ末端ペプチドまたはその生物学的に機能的な
    断片からなる組成物を、哺乳動物Ｔリンパ球細胞に送達することをさらに含む請
    求項１の方法。
  22. 【請求項２２】 リンパ球細胞はヒト起源である請求項２１の方法。
  23. 【請求項２３】 組成物は、インビトロでリンパ球細胞に送達される請求項
    ２１の方法。
  24. 【請求項２４】 ポリヌクレオチドがインビボでリンパ球細胞に送達される
    ように、哺乳動物被験体に組成物を投与することを含む請求項２１の方法。
  25. 【請求項２５】 取り込み増強物質はポリ陽イオン性脂質物質である請求項
    ２１の方法。
  26. 【請求項２６】 取り込み増強物質は、細胞性取り込み増強物質および／ま
    たは移入能力のあるペプチドセグメントを含む請求項２１の方法。
  27. 【請求項２７】 細胞性取り込み増強物質および／または移入能力のあるペ
    プチドセグメントは、ヒト免疫不全症ウイルスＴＡＴ由来ペプチドセグメント、
    またはカポジ繊維芽細胞増殖因子からのシグナルペプチドである請求項２６の方
    法。
  28. 【請求項２８】 ヒトリンパ球細胞に、 （Ａ）（配列番号９）、（配列番号１６）または（配列番号１７）のアミノ酸
    配列を有するペプチド、 （Ｂ）（Ａ）のいずれかと少なくとも約６０％の配列相同性を有する哺乳動物
    ＰＴＴＧ−Ｃペプチド、および （Ｃ）少なくとも１５の連続的アミノ酸残基を有し、内因性ＰＴＴＧ発現およ
    び／またはＰＴＴＧ機能をダウンレギュレートするように機能する（Ａ）または
    （Ｂ）のペプチド断片、よりなる群から選択されるＰＴＴＧ−Ｃペプチドを含む
    組成物を送達することをさらに含み、 該発現ベクターは、ＰＴＴＧ−Ｃペプチドがリンパ球細胞内で発現されるよう
    に、細胞に入るのに充分な量と条件下で、細胞性取り込み増強物質と複合体を形
    成しており、こうしてリンパ球細胞の活性化が阻害される請求項１の方法。
  29. 【請求項２９】 （Ｃ）のペプチド断片はプロリンリッチな領域を含む請求
    項２８の方法。
  30. 【請求項３０】 組成物は、インビトロで細胞に送達される請求項２８の方
    法。
  31. 【請求項３１】 ＰＴＴＧ−Ｃペプチドがインビボでリンパ球細胞に送達さ
    れるように、治療の必要なヒト被験体に組成物を投与することを含む請求項２８
    の方法。
  32. 【請求項３２】 取り込み増強物質はポリ陽イオン性脂質物質を含む請求項
    ２８の方法。
  33. 【請求項３３】 取り込み増強物質は、細胞性取り込み増強物質および／ま
    たは移入能力のあるペプチドセグメントを含む請求項２８の方法。
  34. 【請求項３４】 細胞性取り込み増強物質および／または移入能力のあるペ
    プチドセグメントは、ヒト免疫不全症ウイルスＴＡＴ由来ペプチドセグメント、
    またはカポジ繊維芽細胞増殖因子からのシグナルペプチドである請求項３３の方
    法。
  35. 【請求項３５】 新規の免疫抑制剤のための物質をスクリーニングするイン
    ビトロの方法であって、 哺乳動物Ｔリンパ球を培養する、 培養リンパ球を潜在的な免疫抑制剤に既知のリンパ球アクチベーターの存在下
    で曝露し、および 潜在的な免疫抑制剤に曝露していない対照リンパ球に比較してリンパ球中のＰ
    ＴＴＧ１の発現レベルにおける変化を検出し、ＰＴＴＧ１発現のダウンレギュレ
    ーションは、潜在的な免疫抑制剤が保持する免疫抑制能力を示す、 ことを含む上記方法。
  36. 【請求項３６】 ＰＴＴＧカルボキシ末端関連ポリヌクレオチドに機能的に
    連結された馴化ＨＩＶベクターを含む、哺乳動物Ｔリンパ球の活性化を阻害する
    ための組成物。
  37. 【請求項３７】 ポリヌクレオチドは、 （Ａ）（配列番号９）、（配列番号１６）または（配列番号１７）のアミノ酸
    配列を有するペプチド、 （Ｂ）（Ａ）のいずれかと少なくとも約６０％の配列相同性を有する哺乳動物
    ＰＴＴＧ−Ｃペプチド、および （Ｃ）少なくとも１５の連続的アミノ酸残基を有し、内因性ＰＴＴＧ発現およ
    び／またはＰＴＴＧ機能をダウンレギュレートするように機能する（Ａ）または
    （Ｂ）のペプチド断片、よりなる群から選択される哺乳動物ＰＴＴＧ−Ｃペプチ
    ドをコードする、請求項３６の組成物。
  38. 【請求項３８】 薬剤学的に許容される担体をさらに含む請求項３６の組成
    物。
  39. 【請求項３９】 該ＰＴＴＧカルボキシ末端ペプチドは、 （Ａ）（配列番号９）、（配列番号１６）または（配列番号１７）のアミノ酸
    配列を有するペプチド、 （Ｂ）（Ａ）のいずれかと少なくとも約６０％の配列相同性を有する哺乳動物
    ＰＴＴＧ−Ｃペプチド、および （Ｃ）少なくとも１５の連続的アミノ酸残基を有し、内因性ＰＴＴＧ発現およ
    び／またはＰＴＴＧ機能をダウンレギュレートするように機能する（Ａ）または
    （Ｂ）のペプチド断片、よりなる群から選択される、請求項３７の組成物。 ＰＴＴＧカルボキシ末端ペプチドと複合体を形成している細胞性取り込み増強
    物質をさらに含む、請求項３７の組成物。
  40. 【請求項４０】 ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡである請求項３６
    の組成物。
  41. 【請求項４１】 ポリヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドであ
    る請求項３６の組成物。
  42. 【請求項４２】 ポリヌクレオチドはタンパク質核酸である請求項３６の組
    成物。
  43. 【請求項４３】 ポリヌクレオチドは哺乳動物ＰＴＴＧ−Ｃペプチドまたは
    相補配列をコードする請求項３６の組成物。
  44. 【請求項４４】 ポリヌクレオチドは、 （Ａ）（配列番号９）、（配列番号１６）または（配列番号１７）のアミノ酸
    配列を有するペプチド、 （Ｂ）（Ａ）のいずれかと少なくとも約６０％の配列相同性を有する哺乳動物
    ＰＴＴＧ−Ｃペプチド、および （Ｃ）少なくとも１５の連続的アミノ酸残基を有し、内因性ＰＴＴＧ発現およ
    び／またはＰＴＴＧ機能をダウンレギュレートするように機能する（Ａ）または
    （Ｂ）のペプチド断片、よりなる群から選択される哺乳動物ＰＴＴＧ−Ｃペプチ
    ドをコードするヌクレオチド塩基配列を規定する請求項４３の組成物。
  45. 【請求項４５】 （Ｃ）のペプチド断片はプロリンリッチな領域を含む請求
    項４４の組成物。
  46. 【請求項４６】 ポリヌクレオチドは、 （Ａ）（配列番号１０）、（配列番号１８）または（配列番号１９）、 （Ｂ）（Ａ）のいずれかの縮重コード配列、 （Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）のいずれかに相補的な配列、または （Ｄ）（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のいずれかの少なくとも４５の連続的ヌク
    レオチドを含むポリヌクレオチド断片、 からなるヌクレオチド配列を有する請求項４４の組成物。
  47. 【請求項４７】 転写単位内にポリヌクレオチドを含む発現ベクターをさら
    に含む請求項３６の組成物。
  48. 【請求項４８】 Ｔリンパ球の新生物細胞増殖の治療のためのキットであっ
    て、 請求項３６の組成物、および Ｔリンパ球の新生物細胞増殖および／または形質転換を阻害するための該組成
    物の使用説明書、 とを含む上記キット。
  49. 【請求項４９】 免疫抑制療法のためのキットであって、 請求項３６の組成物、および Ｔリンパ球の活性化を阻害するための該組成物の使用説明書、 とを含む上記キット。
  50. 【請求項５０】 Ｔリンパ球の新生物細胞増殖の治療のためのキットであっ
    て、 請求項３７の組成物、および Ｔリンパ球の新生物細胞増殖および／または形質転換を阻害するための該組成
    物の使用説明書、 とを含む上記キット。
  51. 【請求項５１】 免疫抑制療法のためのキットであって、 請求項３７の組成物、および Ｔリンパ球の活性化を阻害するための該組成物の使用説明書、 とを含む上記キット。
  52. 【請求項５２】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＳＣＡ、８１８２
    、サイクリックＡＭＰ反応性成分、エストロゲン反応性成分、インシュリン反応
    性成分、ＳＰ１およびＧＣボックスからなる群から選択されるＰＴＴＧプロモー
    ター中の制御領域に特異的に結合する請求項２の方法。
  53. 【請求項５３】 哺乳動物Ｔリンパ球の活性化を増大する新規の免疫増強剤
    のための物質をスクリーニングするインビトロの方法であって、 哺乳動物Ｔリンパ球を培養する、 培養Ｔリンパ球を潜在的な免疫増強剤に曝露し、および 潜在的な免疫増強剤に曝露していない対照Ｔリンパ球に比較してリンパ球中の
    ＰＴＴＧ１の発現レベルにおける変化を検出し、ＰＴＴＧ１発現のアップレギュ
    レーションは、潜在的な免疫増強剤が保持する免疫増強能力を示す、 ことを含む上記方法。
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