JP2003533975A - 分泌性蛋白 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト分泌性蛋白（SECP）、及びSECPを識別しコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、発現ベクター及び宿主細胞、抗体、アゴニスト、アンタゴニストを提供する。更に、本発明は、SECPの異常発現に関連する疾患の診断・治療・予防方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の所属分野） 本発明は、分泌性蛋白の核酸配列及びアミノ酸配列に関する。本発明はまた、
これらの配列を利用した細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、心血管疾患、
神経の疾患、および発生障害の診断・治療・予防に関する。本発明はさらに、分
泌性蛋白の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来性化合物の効果につい
ての評価に関する。

【０００２】 （発明の背景） タンパク質の輸送及び分泌は、細胞機能のために必須である。タンパク質の輸
送は、タンパク質のアミノ末端のシグナルペプチドによって媒介されて、輸送若
しくは分泌される。シグナルペプチドは、約１０から２０の疎水性アミノ酸から
なり、それらはリボソームより小胞体（ER）のような特定の膜結合要素までの新
生タンパク質を標的とする。ERを標的とするタンパク質は分泌経路を通って進む
か、ER、ゴルジ体、若しくはリソソームのような分泌細胞器官に残るかのいずれ
かあり得る。分泌経路を通り移動するタンパク質は、細胞外空間へ分泌されるか
、原形質膜内に残るかのいずれかである。原形質膜内に保持されるタンパク質は
、一つ若しくは複数の膜貫通ドメインを有し、各々が約２０の疎水性アミノ酸残
基よりなる。分泌性蛋白は、通常は分泌経路を介して移動する際に翻訳後のプロ
セシングイベントによって活性化される不活性の前駆体として合成される。その
ようなイベントは、糖鎖形成、タンパク質分解、及びシグナルペプチダーゼによ
るシグナルペプチドの除去を含む。タンパク質の運搬の間に起こりうるその他の
イベントは、新生タンパク質のシャペロン依存アンフォールディング及びフォー
ルディング、及びレセプター若しくは細孔複合体を有するタンパク質の相互作用
を含む。アミノ末端シグナルペプチドを有する分泌性蛋白の例は以下に述べられ
、細胞−細胞情報伝達の役割を有するタンパク質を含む。そのようなタンパク質
は、原形質膜レセプタ及び細胞表面のマーカー、細胞外基質分子、サイトカイン
、ホルモン、成長及び分化ファクター、酵素、ニューロペプチド、及びvasomedi
atorを有する（Alberts, B.ら (1994) Molecular Biology of The Cell, Garlan
d Publishing, New York, NY, pp. 557-560, 582-592を参照）。

【０００３】 細胞表面のマーカーは、免疫系の白血球細胞上で識別される細胞表面抗原を有
する。これら抗原は、系統的なモノクローン抗体(mAb)-ベースの“ショットガン
（shot gun）”技術を用いて同定されてきた。これらの技術は、未知の細胞表面
白血球抗原に向けられた数百のmAbの生成という結果に終わった。それら抗原は
、様々な分化白血球細胞型及び画一的白血球細胞型の従来の免疫細胞化学位置決
めパターンを基にした“分化クラスター”へとグループ分けされた。所与のクラ
スター内の抗原は単細胞表面タンパク質を識別するために仮定され、また“分化
クラスター”若しくは“CD”命名（designation）を割り当てられる。CD抗原に
よって識別されたタンパク質をコードする複数の遺伝子は、通常の分子生物学技
術によって複製され検証される。CD抗原は、膜貫通タンパク質、およびグリコシ
ルホスファチジルイノシトール（GPI）のような脂肪酸含有糖脂質に対する共有
結合アタッチメントを介して原形質膜に取り付けられた細胞表面タンパク質の双
方として特徴づけられてきた。(Barclay, A. N.ら(1995) The Leucocyte Antige
n Facts Book, Academic Press, San Diego, CA, pp. 17-20.参照。) 基質タンパク質(MP)は、形成、成長、再形成、及び持続において機能し、炎症
反応の重要な介在物質及び制御因子として働く、膜貫通及び細胞外タンパク質で
ある。MPの発現及びバランスが、先天的、連続的発現、若しくは感染性疾患より
結果として生じる生化学的変化によって乱されても良い。加えてMPは、免疫学的
応答において白血球転移、増殖、分化、及び活性化に影響を与える。MPは、コラ
ーゲン様ドメイン、EGF様ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、及びフィブロ
ネクチン様ドメインを含んでも良い一つ若しくは複数のドメインの存在によって
しばしば特徴づけられる。加えて、MPは重度にクリコシル化されてもよく、接着
相互作用の役割をしても良いアルギニン−グリシン−アスパラギン酸塩（RGD）
トリペプチドモチーフを含んでも良い。MPは、細胞外タンパク質として、フィブ
ロネクチン、コラーゲン、ガレクチン（galectin）、ビトロネクチン、及びその
タンパク分解誘導体ソマトメジンB、また細胞接着レセプターとして、細胞接着
分子（CAM）、カドヘリン、及びインテグリンを有する（Ayad, S. ら、 (1994) The Extracellular Matrix Facts Book , Academic Press, San Diego, CA, pp.
2-16 ;Ruoslahti, E. (1997) Kidney Int. 51 : 1413-1417 ; Sjaastad, M. D.
及び Nelson, W. J. (1997) BioEssays 19 : 47-55.）。

【０００４】 ホルモンは、循環を通って伝わり、標的とする細胞の表面若しくは細胞内の表
面上に特定のレセプタを結合させる分泌された分子である。しかし、それらが異
なった生化学的な組成及び動作のメカニズムを有するので、ホルモンは二つのカ
テゴリーに分類される。一つのカテゴリーは、標的とする細胞の原形質膜を介し
て拡散し、サイトソル若しくは核内受容体に結合し、遺伝子の発現を変更する複
合体を形成する小さな親油性ホルモンを含む。それら分子の例としては、レチン
酸、チロキシン、及びプロゲステロン、エストロゲン、テストステロン、コルチ
ゾール、又はアルドステロンのようなコレステロール由来のステロイドホルモン
が含まれる。第二のカテゴリーには、原形質膜を通って信号を伝達する細胞表面
のレセプターに対して結合することで機能する親水性ホルモンが含まれる。その
ようなホルモンの例としては、アミノ酸の誘導体としてカテコールアミン（エピ
ネフリン、ノルエピネフリン）、及びヒスタミンが、ペプチドホルモンとしてグ
ルカゴン、インスリン、ガストリン、セクリチン、コレシストキニン、副腎皮質
刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、及
びバソプレシンが含まれる（Lodish ら. (1995) Molecular Cell Biology, Scie
ntific American Books Inc., New York, NY, pp. 856-864参照）。

【０００５】 成長及び分化因子は、細胞間伝達で機能する分泌性蛋白である。複数の因子が
オリゴマー形成を要求し、または活性のために膜タンパク質との関連を要求する
。それら因子及びレセプター間の複合体相互作用は、細胞分裂、細胞分化、細胞
シグナル伝達、及び細胞運動性を刺激又は抑制する細胞内信号伝達経路のきっか
けとなる。ほとんどの成長及び分化因子は、その局所環境にある細胞上で作用す
る（パラ分泌シグナル伝達）。成長及び分化因子の３つのブロードクラスが存在
する。第一のクラスには、大きなポリペプチド成長因子として、上皮成長因子、
線維芽細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子、インシュリン様成長因子
、及び血小板由来の成長因子が含まれる。第二のクラスには、造血性成長因子と
して、コロニー形成活性化因子（CSF）が含まれる。造血性成長因子は、Bリンパ
球、Tリンパ球、赤血球、血小板、好酸球、好塩基球、好中球、マクロファージ
、及びそれらの幹細胞前駆体のような血液細胞の増殖及び分化を刺激する。第三
のクラスは、小さなペプチド因子として、ボンベシン、バソプレッシン、オキシ
トシン、エンドセリン、トランスフェリン、アンギオテンシンII、血管作用性小
腸ペプチド、及び増殖以外の細胞機能を制御するためにホルモンとして働くブラ
ジキニンが含まれる。

【０００６】 成長及び分化因子は、in vitroでの細胞の腫瘍性転化、及びin vivoでの腫瘍
進行において重大な役割を果たす。腫瘍細胞による成長因子の不適性な発現は、
腫瘍の血管新生及び転移に貢献しうる。血球新生の間に、成長因子のミス制御が
、貧血、白血病、及びリンパ腫中で結果として起こる。インターフェロンのよう
なある成長因子は、in vitro及びin vivoの双方での腫瘍細胞に対する細胞毒性
である。さらには、複数の成長因子及び成長因子レセプタが、構造的及び機能的
の双方で腫瘍性タンパク質と関連している。加えて、成長因子はプロトオンコジ
ーン及び腫瘍抑制因子遺伝子の双方の転写調節に影響を与える(Pimentel, E. (1
994) Handbook of Growth Factors, CRC Press, Ann Arbor, MI, pp. 1-9参照)
。

【０００７】 神経ペプチド及び血管介在物質(NP/VM)は、内在性シグナル伝達分子の大きな
ファミリーを有する。このファミリーに含まれるのは、神経ペプチド及び神経ペ
プチドホルモンとして、ボンベシン、神経ペプチドY、ニューロテンシン、ニュ
ーロメディンN、メラノコルチン、オピオイド、ガラニン、ソマトスタチン、タ
キキニン、ウロテンシンII、及び平滑筋刺激ペプチド、バソプレッシンペプチド
、血管作用性小腸ペプチドに含まれる関連ペプチド、また循環系−borneシグナ
ル伝達分子として、アンジオテンシン、補体、カルシトニン、エンドセリン、ホ
ルミルメチオニルペプチド、グルカゴン、コレシストキニン、及びガストリンで
ある。NP/VMは直接信号を伝達し得り、別の神経伝達物質及びホルモンの活性若
しくは遊離を調節し、またカスケードにおいて触媒酵素として働く。NP/VMの効
果は、極端に短い時間から持続性を有するまでの幅を有する(Martin, C. R. ら
(1985) Endocrine Physiology. Oxford University Press, New York, NY, pp. 57-62参照)。

【０００８】 NP/VMは、多くの神経学的及び心血管疾患に関与する。例えば、神経ペプチドY
は、高血圧症、うっ血心不全、情動障害、食欲調節に関与する。ソマトスタチン
は、腸、膵臓腺房細胞、及び膵臓ベータ細胞内の分泌を阻害するのは勿論のこと
、成長ホルモン及び下垂体前葉の分泌を阻害する。ソマトスタチンレベルでの減
少は、アルツハイマー病及びパーキンソン病で報告された。バソプレッシンは、
水分吸収及びナトリウム吸収のために腎臓内で作用し、また高濃度では、血管平
滑筋の収縮、血小板活性、及び肝臓内グリコーゲン分解を刺激する。バソプレッ
シン及びその類似体は、尿崩症の治療のため臨床的に用いられる。エンドセリン
及びアンジオテンシンは高血圧症に関与し、アンジオテンシンの血漿レベルを減
少させるカプトプリルのような薬剤は、血圧を下げるのに用いられる(Watson, S
.及びS. Arkinstall、(1994) The G-protein Linked Receptor Facts Book, Aca
demic Press, San Diego CA, pp. 194 ; 252 ; 284 ; 55 ; 111)。

【０００９】 神経ペプチドはまた痛覚（痛み）の役割を有していることが示された。血管作
用性小腸ペプチドは、慢性的な神経障害痛において重要な役割を果たすことが明
らかである。オピオイドレセプター様１レセプターのための内在性リガンドであ
るノシセプチンは、主に非侵害受容性を有すると考えられており、持続性若しく
は慢性的な痛みの異なった動物モデルにおいて鎮痛特性を有している事が示され
た(Dickinson, T. 及び Fleetwood-Walker, S. M. (1998) Trends Pharmacol. S
ci. 19 : 346-348)。

【００１０】 そのような活性は、例えば、オキシドレダクターゼ／デヒドロゲナーゼ活性、
トランスフェラーゼ活性、加水分解酵素活性、リアーゼ活性、異性化酵素活性、
若しくはリガーゼ活性を有する。例えば、基質メタロプロテイナーゼは、細胞外
基質を分解する分泌加水分解酵素であり、そのようなわけで、腫瘍転移、組織形
態形成、及び関節炎において重要な役割を果たす(Reponen, P. ら、 (1995)Dev.
Dyn. 202 : 388-396 ; Firestein, G. S. (1992) Curr. Opin. Rheumatol. 4 :
348-354 ; Ray, J. M. 及びStetler-Stevenson, W. G. (1994) Eur. Respir. J
. 7 : 2062-2072 ; Mignatti, P.及び Rifkin, D. B. (1993)Physiol. Rev. 73
: 161-195)。

【００１１】 新規の分泌性蛋白およびそれらをコードするポリヌクレオチドの発見により、
新規の組成物を提供することで当分野の要望に応えることができる。この新規の
組成物は、細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、心血管疾患、神経の疾患、
および発生障害の診断・治療・予防において有用である。

【００１２】 新規の分泌性蛋白およびそれらをコードするポリヌクレオチドの発見により、
新規の組成物を提供することで当分野の要望に応えることができる。この新規の
組成物は、細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、心血管疾患、神経の疾患、
および発生障害の診断・治療・予防において有用であり、また、分泌性蛋白の核
酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来性化合物の効果についての評価にも
有用である。

【００１３】 （発明の要約） 本発明は、総称して「SECP」、個別にはそれぞれ「SECP-1」、「SECP-2」、「
SECP-3」、「SECP-4」、「SECP-5」、「SECP-6」、「SECP-7」、「SECP-8」、「
SECP-9」、及び「SECP-10」と呼ぶ分泌性蛋白である精製されたポリペプチドを
提供する。本発明の一実施態様では、（ａ）SEQ ID NO:1乃至10（SEQ ID NO:1−
10）からなる一群から選択されたアミノ酸配列と、（ｂ）SEQ ID NO:1−10から
なる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する天然の
アミノ酸配列と、（ｃ）SEQ ID NO:1−10からなる一群から選択されたアミノ酸
配列の生物学的に活性な断片と、（ｄ）SEQ ID NO:1−10とからなる一群から選
択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される一群から選択されたアミノ
酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。別法では、SEQ ID NO:1−10
のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。

【００１４】 更に本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1−10からなる一群から選択されたアミノ酸
配列と、（ｂ）SEQ ID NO:1−10からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９
０％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（ｃ）SEQ ID NO:1−10
からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（ｄ）SE
Q ID NO:1−10からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構
成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離
されたポリヌクレオチドを提供する。別法では、このポリヌクレオチドは、SEQ
ID NO:1−10からなる一群から選択されたポリペプチドをコードする。別法では
、このポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:11−20からなる一群から選択される。

【００１５】 更に、本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1−10からなる一群から選択されたアミノ
酸配列と、（ｂ）SEQ ID NO:1−10からなる一群から選択されたアミノ酸配列と
９０％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（ｃ）SEQ ID NO:1−1
0からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（ｄ）S
EQ ID NO:1−10からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構
成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドと機能的に結合されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオ
チドを提供する。別法では、本発明は、この組換えポリヌクレオチドで形質転換
された細胞を提供する。更なる別法では、本発明は、この組換えポリヌクレオチ
ドを含む遺伝子組換え生物を提供する。

【００１６】 また、本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1−10からなる一群から選択されたアミノ
酸配列と、（ｂ）SEQ ID NO:1−10からなる一群から選択されたアミノ酸配列と
９０％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（ｃ）SEQ ID NO:1−1
0からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（ｄ）S
EQ ID NO:1−10とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで
構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドの生産方法を提
供する。この方法は、（ａ）このポリペプチドの発現に好適な条件下で、このポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に結合されたプロモーター配
列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養するステップと、
（ｂ）このように発現したポリペプチドを回収するステップとを含む。

【００１７】 更に、本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1−10からなる一群から選択されたアミノ
酸配列と、（ｂ）SEQ ID NO:1−10からなる一群から選択されたアミノ酸配列と
９０％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（ｃ）SEQ ID NO:1−1
0からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（ｄ）S
EQ ID NO:1−10とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで
構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合
する単離された抗体を提供する。

【００１８】 更に、本発明は、（ａ）SEQ ID NO:11−20からなる一群から選択されたポリヌ
クレオチド配列と、（ｂ）SEQ ID NO:11−20からなる一群から選択されたポリヌ
クレオチド配列と９０％以上の配列同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列
と、（ｃ）前記（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列と、（ｄ）前記（ｂ）に
相補的なポリヌクレオチド配列と、（ｅ）前記（ａ）乃至（ｄ）のRNA等化物と
で構成される一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌ
クレオチドを提供する。別法では、このポリヌクレオチドは、少なくとも６０個
の連続するヌクレオチドを含む。

【００１９】 更に本発明は、（ａ）SEQ ID NO:11−20からなる一群から選択されたポリヌク
レオチド配列と、（ｂ）SEQ ID NO:11−20からなる一群から選択されたポリヌク
レオチド配列と９０％以上の配列同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列と
、（ｃ）前記（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列と、（ｄ）前記（ｂ）に相
補的なポリヌクレオチド配列と、（ｅ）前記（ａ）乃至（ｄ）のRNA等化物とで
構成される一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配
列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプルにおいて検出する方法を提供する。
この方法は、（ａ）前記サンプル内の標的ポリヌクレオチドと相補的な配列を構
成する少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含むプローブと前記サンプル
をハイブリダイズさせるステップであって、前記プローブと前記標的ポリヌクレ
オチドまたはその断片とでハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で
、前記プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする、該
ステップと、（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在するか否かを検出
し、存在する場合には随意選択でその収量を測定するステップとを含む。別法で
は、前記プローブは、少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含む。

【００２０】 更に本発明は、（ａ）SEQ ID NO:11−20からなる一群から選択されたポリヌク
レオチド配列と、（ｂ）SEQ ID NO:11−20からなる一群から選択されたポリヌク
レオチド配列と９０％以上の配列同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列と
、（ｃ）前記（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列と、（ｄ）前記（ｂ）に相
補的なポリヌクレオチド配列と、（ｅ）前記（ａ）乃至（ｄ）のRNA等化物とで
構成される一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配
列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプルにおいて検出する方法を提供する。
この方法は、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて、前記標的ポリヌクレオ
チドまたはその断片を増幅するステップと、（ｂ）増幅された前記標的ポリヌク
レオチドまたはその断片が存在するか否かを検出し、存在する場合には随意選択
でその収量を測定するステップとを含む。

【００２１】 更に本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1−10からなる一群から選択されたアミノ酸
配列と、（ｂ）SEQ ID NO:1−10からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９
０％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（ｃ）SEQ ID NO:1−10
からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（ｄ）SE
Q ID NO:1−10とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで
構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含む効果的な量のポリペプチド及
び好適な医薬用賦形剤を含む組成物を提供する。一実施例では、SEQ ID NO:1−1
0からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含む組成物を提供する。更に、本
発明は、患者にこの組成物を投与することを含む、機能的SECPの発現の低下に関
連した疾患やその症状の治療方法を提供する。

【００２２】 更に本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1−10からなる一群から選択されたアミノ酸
配列と、（ｂ）SEQ ID NO:1−10からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９
０％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（ｃ）SEQ ID NO:1−10
からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（ｄ）SE
Q ID NO:1−10とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで
構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドのアゴニストと
して効果的な化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、（ａ）
このポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、（ｂ）このサ
ンプルのアゴニスト活性を検出するステップとを含む。別法では、本発明は、こ
の方法によって同定されたアゴニスト化合物と好適な医薬用賦形剤とを含む組成
物を提供する。更なる別法では、本発明は、この組成物の患者への投与を含む、
機能的SECPの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。

【００２３】 更に、本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1−10からなる一群から選択されたアミノ
酸配列と、（ｂ）SEQ ID NO:1−10からなる一群から選択されたアミノ酸配列と
９０％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（ｃ）SEQ ID NO:1−1
0からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（ｄ）S
EQ ID NO:1−10とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで
構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドのアンタゴニス
トとして効果的な化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、（
ａ）このポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、（ｂ）こ
のサンプルのアンタゴニスト活性を検出するステップとを含む。別法では、本発
明は、この方法によって同定されたアンタゴニスト化合物と好適な医薬用賦形剤
とを含む組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この組成物の患者への
投与を含む、機能的SECPの過剰な発現に関連した疾患やその症状の治療方法を提
供する。

【００２４】 更に本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1−10からなる一群から選択されたアミノ酸
配列と、（ｂ）SEQ ID NO:1−10からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９
０％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（ｃ）SEQ ID NO:1−10
からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（ｄ）SE
Q ID NO:1−10とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで
構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合
する化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、（ａ）このポリ
ペプチドを好適な条件下で少なくとも１つの化合物と結合させるステップと、（
ｂ）このポリペプチドとこの試験化合物との結合を検出して、このポリペプチド
と特異的に結合する化合物を同定するステップとを含む。

【００２５】 更に本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1−10からなる一群から選択されたアミノ酸
配列と、（ｂ）SEQ ID NO:1−10からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９
０％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（ｃ）SEQ ID NO:1−10
からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（ｄ）SE
Q ID NO:1−10とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで
構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドの活性を調節す
る化合物をスクリーニングする方法を提供する。このスクリーニング方法は、（
ａ）このポリペプチドを、その活性が許容される条件下で少なくとも１つの化合
物と結合させるステップと、（ｂ）この試験化合物の存在下でのこのポリペプチ
ドの活性を評価するステップと、（ｃ）この試験化合物の存在下でのこのポリペ
プチドの活性と、この試験化合物の不在下でのこのポリペプチドの活性とを比較
するステップとを含み、この試験化合物の存在下でのこのポリペプチドの活性の
変化が、このポリペプチドの活性を調節する化合物の存在を示唆するという特徴
を有する。

【００２６】 更に本発明は、SEQ ID NO:11−20からなる一群から選択された配列を含む標的
ポリヌクレオチドの発現を変化させるのに効果的な化合物をスクリーニングする
方法であって、（ａ）この標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露
するステップと、（ｂ）この標的ポリヌクレオチドの発現の変化を検出するステ
ップとを含む、該スクリーニング方法を提供する。

【００２７】 本発明はさらに、試験化合物の毒性を評価する方法を提供する。この方法は、
（ａ）核酸を含む生体サンプルを前記試験化合物で処理するステップと、（ｂ）
処理した前記生体サンプルの核酸をプローブとハイブリダイズするステップと、
（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を測定するステップと、（ｄ）前記
処理した生体サンプルにおけるハイブリダイゼーション複合体の収量を、未処理
の生体サンプルにおけるハイブリダイゼーション複合体の収量とを比較するステ
ップとを含み、前記処理した生体サンプルにおけるハイブリダイゼーション複合
体の収量の差異が試験化合物の毒性を示唆する。この方法における前記プローブ
は、（１）SEQ ID NO:11−20からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列
と、（２）SEQ ID NO:11−20からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列
と少なくとも９０％の配列同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列と、（３
）前記（１）に相補的なポリヌクレオチド配列と、（４）前記（２）に相補的な
ポリヌクレオチド配列と、（５）前記（１）乃至（４）のRNA等価物とで構成さ
れる一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの連続す
る少なくとも２０個のヌクレオチドを含む。また、前記ハイブリダイゼーション
は、前記プローブと前記生体サンプルの標的ポリヌクレオチドとの間で特異的な
ハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で行わる。また、前記標的ポ
リヌクレオチドが、（１）SEQ ID NO:11−20からなる一群から選択されたポリヌ
クレオチド配列と、（２）SEQ ID NO:11−20からなる一群から選択されたポリヌ
クレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する天然のポリヌクレオチ
ド配列と、（３）前記（１）に相補的なポリヌクレオチド配列と、（４）前記（
２）に相補的なポリヌクレオチド配列と、（５）前記（１）乃至（５）のRNA等
価物とを含む。代替的に前記標的ポリヌクレオチドは前記ポリヌクレオチド配列
の断片である。

【００２８】 （本発明の記載について） 本発明のタンパク質及び核酸配列、方法について説明する前に、本発明は、こ
こに開示した特定の装置及び材料、方法に限定されず、その実施形態を変更でき
ることを理解されたい。また、ここで用いられる用語は、特定の実施例のみを説
明する目的で用いられたものであり、後述の請求の範囲によってのみ限定され、
本発明の範囲を限定することを意図したものではないということも理解されたい
。

【００２９】 本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」
は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って
、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体
は含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。

【００３０】 本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、
本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。
本明細書で記述したものと類似、或いは同等の全ての装置及び材料、方法は本発
明の実施及びテストに使用できるが、好適な装置及び材料、方法をここに記す。
本明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に
記載された細胞系、プロトコル、試薬、ベクターを記述し開示するために引用し
た。従来の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈さ
れるものではない。

【００３１】 （定義） 用語「SECP」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特にウシ
、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に
精製されたSECPのアミノ酸配列を指す。

【００３２】 用語「アゴニスト」は、SECPの生物学的活性を強めたり、模倣する分子を指す
。このアゴニストは、SECPに直接相互作用するか、或いはSECPが関与する生物学
的経路の成分と作用して、SECPの活性を調節するタンパク質、核酸、糖質、小分
子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。

【００３３】 用語「アレル変異配列」は、SECPをコードする遺伝子の別の形を指す。アレル
変異配列は、核酸配列における少なくとも１つの変異によって生じ、変異mRNA若
しくは変異ポリペプチドになり、これらの構造や機能は変わる場合もあれば変わ
らない場合もある。ある遺伝子は、天然型のアレル変異配列が存在しないもの、
１つ或いは多数存在するものがある。一般にアレル変異配列を生じる変異は、ヌ
クレオチドの自然な欠失、付加、或いは置換による。これらの各変異は、単独或
いは他の変異と同時に起こり、所定の配列内で一回或いはそれ以上生じる。

【００３４】 SECPをコードする「変異」核酸配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或
いは置換が起こっても、SECPと同じポリペプチド或いはSECPの機能特性の少なく
とも１つを備えるポリペプチドを指す。この定義には、SECPをコードするポリヌ
クレオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置でのアレル変異配列との
不適当或いは予期しないハイブリダイゼーション、並びにSECPをコードするポリ
ヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或
いは検出困難な多形性を含む。コードされたタンパク質も変異され得り、サイレ
ント変化を生じSECPと機能的に等価となるアミノ酸残基の欠失、挿入、或いは置
換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にSECPの活性
が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／また
は両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に荷電したアミ
ノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸には
リシン及びアルギニンが含まれ得る。類似の親水性の値をもち極性非荷電側鎖を
有するアミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニンが含まれ
得る。類似の親水性の値をもち非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシン、イ
ソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、フェニルアラニン及びチロシンが含
まれ得る。

【００３５】 用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリ
ペプチド、タンパク質配列、或いはそれらの任意の断片を指し、天然の分子及び
合成分子を含む。「アミノ酸配列」が天然のタンパク質分子の配列を指す場合、
「アミノ酸配列」及び類似の用語は、アミノ酸配列を記載したタンパク質分子に
関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。

【００３６】 用語「増幅」は、核酸配列の複製物を作製することに関連する。一般に増幅は
、この技術分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術によって行われる。

【００３７】 用語「アンタゴニスト」は、SECPの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子で
ある。アンタゴニストは、SECPに直接相互作用するか、或いはSECPが関与する生
物学的経路の成分と作用して、SECPの活性を調節する抗体、核酸、糖質、小分子
、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。

【００３８】 用語「抗体」は、抗原決定基と結合可能なFab及びF(ab')₂、及びそれらの断片
、Fv断片などの無傷の分子を指す。SECPポリペプチドと結合する抗体は、抗体を
免疫する小ペプチドを含む無傷の分子またはその断片を用いて作製可能である。
動物（例えば、マウス、ラット、若しくはウサギ）を免疫化するのに使用される
ポリペプチド或いはオリゴペプチドは、RNAの翻訳から、或いは化学的に合成可
能であり、必要に応じて担体タンパク質と結合させることも可能である。ペプチ
ドと化学的に結合した一般に用いられる担体は、ウシ血清アルブミン、チログロ
ブリン、及びキーホールリンペットヘモニアン（KLH）を含む。次ぎに、この結
合したペプチドを用いて動物を免疫化する。

【００３９】 用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の領域（即ちエピトープ）
を指す。タンパク質或いはタンパク質の断片が、宿主動物を免疫化するのに用い
られるとき、このタンパク質の種々の領域は、抗原決定基（タンパク質上の特定
の領域或いは三次元構造体）に特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原
決定基は、抗体と結合するために無傷の抗原（即ち、免疫応答を引き出すために
用いられる免疫原）と競合し得る。

【００４０】 本明細書において「アンチセンス」は、特定の核酸配列のセンス（コーディン
グ）鎖と塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス成分には、DNA
と、RNAと、ペプチド核酸（PNA）と、ホスホロチオネートやメチルホスホネート
、ベンジルホスホネート（benzylphosphonate）などの修飾された骨格（backbon
e linkage）を有するオリゴヌクレオチドと、2'-メトキシエチル糖または2'-メ
トキシエトキシ糖などの修飾された糖を有するオリゴヌクレオチドと、5-メチル
シトシンまたは2'-deoxyuracil、7-deaza-2'-deoxyguanosineなどの修飾された
塩基を有するオリゴヌクレオチドを含み得る。アンチセンス分子は、化学合成や
転写を含む任意の方法で作り出すことができる。相補的アンチセンス分子は、一
度細胞に導入されると、細胞によって作られた天然の核酸配列と塩基対となって
二重鎖を形成し、転写や翻訳を阻害する。「負」または「マイナス」という表現
はアンチセンス鎖であり、「正」または「プラス」という表現はセンス鎖である
。

【００４１】 用語「生物学的に活性」は、天然分子の構造的、調節的、或いは生化学的な機
能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原
性」は、天然或いは組換え体のSECP、合成のSECPまたはそれらの任意のオリゴペ
プチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合
する能力を指す。

【００４２】 用語「相補的」は、塩基対合によってアニールする２つの一本鎖核酸配列間の
関係を指す。例えば、配列「５'ＡＧＴ３'」が相補的な配列「３'ＴＣＡ５'」と
対をなす。

【００４３】 「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のアミノ酸配列を
含む組成物」は広い意味で、所定のヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を含
む任意の組成物を指す。この組成物は、乾燥した製剤或いは水溶液を含み得る。
SECP若しくはSECPの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハ
イブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥
状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である。ハ
イブリダイゼーションにおいて、プローブは、塩（例えば、NaCl）及び界面活性
剤（例えば、SDS：ドデシル硫酸ナトリウム）、その他の物質（例えば、デンハ
ート液、乾燥ミルク、サケ精子DNAなど）を含む水溶液に展開され得る。

【００４４】 「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにDNA配列の解析を繰り
返し行い、XL-PCRキット（PE Biosystems,Foster City CA）を用いて５'及び／
または３'の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGEL
VIEW 断片構築システム（GCG, Madison, WI）またはPhrap (University of Wash
ington, Seattle WA)等の断片構築用のコンピュータプログラムを用いて１つ或
いはそれ以上の重複するcDNAやEST、またはゲノムDNA断片から構築された核酸配
列を指す。伸長及び重複の両方によって構築されるコンセンサス配列もある。

【００４５】 用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えない置換
を指す。即ち、置換によってそのタンパク質の構造や機能が大きくは変わらず、
そのタンパク質の構造、特にその機能が保存される。以下に、あるタンパク質の
元のアミノ酸が別のアミノ酸に置換される保存的なアミノ酸置換を示す。 元の残基 保存的な置換 Ala Gly, Set Arg His, Lys Asn Asp, Gln, His Asp Asn, Glu Cys Ala, Ser Gln Asn, Glu, His Glu Asp, Gln, His Gly Ala His Asn, Arg, Gln, Glu Ile Leu, Val Leu Ile, Val Lys Arg, Gln, Glu Met Leu, Ile Phe His, Met, Leu, Trp, Tyr Ser Cys, Thr Thr Ser, Val Trp Phe, Tyr Tyr His, Phe, Trp Val Ile. Leu, Thr 一般に、保存されたアミノ酸置換の場合は、a）置換された領域のポリペプチ
ドの骨格構造、例えば、βシートやαヘリックス高次構造、b）置換された部位
の分子の電荷または疎水性、及び／または、c）側鎖の大半が維持される。

【００４６】 用語「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列の変化、或
いは１個以上のヌクレオチドが欠如する核酸配列の変化を指す。

【００４７】 用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指
す。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、アルキル基、アシル基、ヒ
ドロキシル基、或いはアミノ基による水素の置換がある。誘導体ポリヌクレオチ
ドは、自然分子（未修飾の分子）の生物学的或いは免疫学的機能の少なくとも１
つを維持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドとは、もとのポリ
ペプチドの生物学的機能、或いは免疫学的機能の少なくとも１つを維持する、グ
リコシル化、ポリエチレングリコール化、或いは任意の同様のプロセスによって
修飾されたポリペプチドのことである。

【００４８】 「検出可能な標識」は、測定可能な信号を生成し得る、ポリヌクレオチドやポ
リペプチドに共有結合或いは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。

【００４９】 用語「断片」は、SECPまたはSECPをコードするポリヌクレオチドの固有の部分
であって、その親配列（parent sequence）と同一であるがその配列より長さが
短いものを指す。「断片」の最大の長さは、親配列から１つのヌクレオチド／ア
ミノ酸残基を差し引いた長さである。例えば、ある断片は、５〜１０００個の連
続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基を含む。プローブ、プライマー、抗原、
治療用分子、またはその他の目的に用いる断片は、少なくとも５、１０、１５、
１６、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若
しくは５００個の連続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さである。断片
は、優先的に分子の特定の領域から選択される場合もある。例えば、ポリペプチ
ド断片は、所定の配列に示された最初の２５０若しくは５００のアミノ酸（或い
は、ポリペプチドの最初の２５％または５０％）から選択された連続するアミノ
酸の所定の長さを含み得る。これらの長さは一例であり、配列表及び表、図面を
含む明細書に記載の任意の長さが、本発明の実施例に含まれ得る。

【００５０】 SEQ ID NO:11−20の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは
異なる、SEQ ID NO:11−20を明確に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域
を含む。SEQ ID NO:11−20のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増
幅技術、またはSEQ ID NO:11−20を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似
の方法に有用である。ある断片と一致するSEQ ID NO:11−20の正確な断片の長さ
や領域は、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測
定できる。

【００５１】 SEQ ID NO:1−10のある断片は、SEQ ID NO:11−20のある断片によってコード
される。SEQ ID NO:1−10のある断片は、SEQ ID NO:1−10を特異的に同定する固
有のアミノ酸配列の領域を含む。例えば、SEQ ID NO:1−10のある断片は、SEQ I
D NO:1−10を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして有用
である。ある断片と一致するSEQ ID NO:1−10の正確な断片の長さや領域は、そ
の断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に決定できる。

【００５２】 「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例
えばメチオニン）、それに続くオープンリーディングフレーム及び翻訳終止コド
ンを有する配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペ
プチド配列をコードする。

【００５３】 「相同性」は、２つ以上のポリヌクレオチド配列間または２つ以上のポリペプ
チド配列間の配列類似性である。この配列類似性は配列同一性と言い換えること
ができる。

【００５４】 ポリヌクレオチド配列についての用語「パーセントの同一性」または「％の同
一性」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる、２つ以
上のポリヌクレオチド配列間の一致する残基の百分率のことである。このような
アルゴリズムは、標準化され再現できる方法で、２つの配列間のアラインメント
を最適化するべく、配列にギャップを挿入して、より意味をもつ２つの配列間の
比較を行うことができる。

【００５５】 ポリヌクレオチド配列間の同一性のパーセントは、MEGALIGN version 3.12e配
列アラインメントプログラムに組込まれるCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルト
パラメータを用いて決定可能である。このプログラムはLASERGENEソフトウェア
パッケージの一部であり、分子生物学分析プログラム一式（DNASTAR, Madison W
I）である。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G. 及び P.M. Sharp (1989) CABIOS
5:151-153、Higgins, D.G. 他 (1992) CABIOS 8:189-191に記載されている。ポ
リヌクレオチド配列の対のアライメントの場合、デフォルトパラメータは、Ktup
le=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。「重み付
けされた」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。同一性のパーセン
トは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「類似性のパーセント」
としてCLUSTAL Vによって報告される。

【００５６】 別法では、National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic L
ocal Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul, S.F. 他 (1990) J. Mol. Bio
l. 215:403-410)が提供する、広く用いられている無料の配列比較アルゴリズム
一式が、NCBI（Bethesda、MD）を含む幾つかのソース及びインターネット（http
://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）で入手可能である。このBLASTソフトウェア
一式には、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレ
オチド配列とのアラインメントに用いられる「blastn」を含む、様々な配列分析
プログラムが含まれる。「BLAST 2 Sequences」と呼ばれるツールが入手可能で
あり、２つのヌクレオチド配列の対を直接比較するために用いられる。「BLAST
2 Sequences」は、http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.htmlにアクセスして
、対話形式で利用ができる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn 及び bla
stp（以下に記載）の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的に
は、デフォルトを設定するギャップ及び他のパラメーターと共に用いられる。例
えば、２つのヌクレオチド配列を比較する場合、ある者は、デフォルトパラメー
タに設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (April-21-2000)
でblastnを使用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以
下のようにする。

【００５７】 Matrix: BLOSUM62 Reward for match: 1 Penalty for mismatch: -2 Open Gap: 5 及び Extension Gap: 2 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 11 Filter: on 同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定の配列の
全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例えば、ある大き
な所定の配列から得られた断片、例えば、連続する少なくとも、２０または３０
、４０、５０、７０、１００、２００のヌクレオチドの断片の長さに対して測定
してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図面を含む明細
書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定される
長さを示すことができる。

【００５８】 高い同一性を示さない核酸配列でも、遺伝子コードの縮重によって類似のアミ
ノ酸配列をコードし得る。縮重を利用して核酸配列を変え、それぞれが実質的に
同じタンパク質をコードする様々な核酸配列を作製できることを理解されたい。

【００５９】 ポリペプチド配列に用いられる用語「パーセントの同一性」または「％の同一
性」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上の
ポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列ア
ラインメントの方法は周知である。アラインメント方法の中には、保存的なアミ
ノ酸置換を考慮したものもある。詳細に上述したこのような保存的な置換は、一
般に、置換部位の電荷や疎水性が保存され、ポリペプチドの構造（従って機能も
）が保存される。

【００６０】 ポリペプチド配列間の同一性のパーセントは、MEGALIGN バージョン3.12e配列
アラインメントプログラム（上記）に組込まれるCLUSTAL Vアルゴリズムのデフ
ォルトパラメータを用いて決定可能である。CLUSTAL Vを用いる対方式のポリぺ
プチド配列のアライメントの場合、デフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap pe
nalty=3、window=5、及び「diagonals saved」=5と設定する。PAM250マトリクス
が、デフォルトの残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドアライン
メントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の同一性のパーセ
ントは、「類似性のパーセント」としてCLUSTAL Vによって報告される。

【００６１】 別法では、NCBI BLASTソフトウェア一式が用いられる。例えば、２つのポリペ
プチド配列を対で比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定され
た「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (Apr-21-2000)でblastpを使用
するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のようにする
。

【００６２】 Matrix: BLOSUM62 Open Gap: 11 及び Extension Gap: 1 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 3 Filter: on 同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定のポリペ
プチド配列の全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例え
ば、ある大きな所定のポリペプチド配列から得られた断片、例えば、連続する少
なくとも１５、２０または３０、４０、５０、７０、１５０の残基の断片の長さ
に対して測定してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図
面を含む明細書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセント
が測定される長さを示すことができる。

【００６３】 「ヒト人工染色体（HAC）」は、約６kb（キロベース）〜１０MbのサイズのDNA
配列を含み得る、安定した有糸分裂染色体の分離及び維持に必要な全てのエレメ
ントを含む直鎖状の小染色体である。

【００６４】 用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せる
ために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。

【００６５】 「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、
ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリ
ングのプロセスである。特異的なハイブリダイゼーションとは、２つの核酸配列
が高い相同性を有することを意味する。アニーリングが許容される条件下で、特
異的なハイブリダイゼーション複合体が形成され、洗浄過程の後もハイブリダイ
ズしたままである。洗浄過程は、ハイブリダイゼーションプロセスの厳密性即ち
ストリンジェンシー（stringency）の決定において特に重要であり、よりストリ
ンジェントな条件では、非特異的な結合、即ち完全には一致しない核酸鎖間の対
の結合が減少する。核酸配列間のアニーリングが許容される条件は、当業者によ
って日常的に決定され、ハイブリダイゼーションの間は一定であるが、洗浄過程
は、目的のストリンジェンシーにするためにその最中に条件の変更が可能であり
、ハイブリダイゼーション特異性が得られる。アニーリングが許容される条件は
、例えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％（w/v）のSDS、並びに約１００
μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子DNAが含まれる。

【００６６】 一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、洗浄過程を行う際
の温度によっても左右される。この洗浄温度は通常、所定のイオン強度とｐＨに
おける特定の配列の熱融点（Tm）より約５〜２０℃低く選択される。このTmは、
（所定のイオン強度とｐＨの下）標的の配列の５０％が完全に一致するプローブ
とハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸のハイブリダイゼー
ションの条件は、周知であり、Sambrook, J. 他による, 1989, Molecular Cloni ng: A Laboratory Manual , 第2版の1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainvi
ew NY; 特に2巻の9章に記載されている。

【００６７】 本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーシ
ョンでは、約０．２x SSC及び約１％のSDSの存在の下、約６８℃で１時間の洗浄
過程を含む。別法では、６５℃、６０℃、５５℃、４２℃の温度で行う。SSCの
濃度は、約０．１％のSDSが存在の下、約０．１〜２x SSCの範囲である。通常は
、ブロッキング試薬を用いて非特異的なハイブリダイゼーションを阻止する。こ
のようなブロッキング試薬には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌの切断さ
れ変性したサケ精子DNAが含まれる。約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドな
どの有機溶剤が、例えば、RNAとDNAのハイブリダイゼーションなどの特定の場合
に用いることができる。これらの洗浄条件の有用な改変は、当業者には周知であ
る。特に高いストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションは、ヌクレオ
チド間の進化における類似性を示唆し得る。このような類似性は、それらのヌク
レオチド及びコードされたポリペプチドが類似の役割を果たしていることを強く
示唆する。

【００６８】 用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によっ
て、形成された２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体
は溶液中（例えば、Ｃ_０ｔまたはＲ_０ｔ分析）で形成されるか、或いは溶液中の
１つの核酸配列と固体の支持物（例えば、紙、膜、フィルター、チップ、ピン、
或いはスライドガラス、または細胞及びその核酸を固定する任意の適当な基板）
に固定されたもう一つの核酸配列とで形成され得る。

【００６９】 用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチド
がそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。

【００７０】 「免疫応答」は、炎症性疾患及び外傷、免疫異常、感染症、遺伝病などに関連
する症状を指す。これらの症状は、細胞系及び全身防衛系に影響を及ぼすサイト
カイン及びケモカイン、別の情報伝達分子などの様々な因子の発現という特徴を
もつ。

【００７１】 用語「免疫原性断片」は、例えば哺乳動物などの生きている動物に導入すると
、免疫反応を引き起こすGVREDのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を
指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知の
あらゆる抗体生産方法に有用なSECPのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断
片を含む。

【００７２】 用語「マイクロアレイ」は、基質上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチド
またはその他の化合物の構成を指す。

【００７３】 用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有
の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化
合物を指す。

【００７４】 用語「調節」は、SECPの活性の変化を指す。例えば、調節によって、SECPのタ
ンパク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或い
は免疫学的特性の変化が起こる。

【００７５】 用語「核酸」及び「核酸配列」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリ
ヌクレオチド、或いはそれらの断片を指し、一本鎖若しくは二本鎖であって、セ
ンス鎖或いはアンチセンス鎖であるゲノム起源若しくは合成起源のDNA或いはRNA
、ペプチド核酸（PNA）、任意のDNA様物質、及びRNA様物質である。

【００７６】 「機能的に結合した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係に
ある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を
与える場合、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に結合している。一般
に、機能的に結合したDNA配列は、同じ読み枠内で２つのタンパク質をコードす
る領域が結合する必要がある場合は、非常に近接或いは連続する。

【００７７】 「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチド
骨格に結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含
む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。この末端のリシンにより、この
組成物が溶解性となる。PNAは、相補的な一本鎖DNAやRNAに優先的に結合して転
写物の伸長を止め、ポリエチレングリコール化して細胞における寿命を延ばし得
る。

【００７８】 SECPの「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、
ラセミ化、蛋白分解性切断及びその他の当分野で既知の修飾を含まれ得る。これ
らのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、SECPの酵素
環境に依存し、細胞の種類によって異なり得る。

【００７９】 「プローブ」とは、同一配列或いはアレル核酸配列、関連する核酸配列の検出
に用いる、SECPやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列
のことである。プローブは、検出可能な標識またはレポーター分子が結合され単
離されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドである。典型的な標識には、放
射性アイソトープ及びリガンド、化学発光試薬、酵素がある。「プライマー」と
は、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能な、
通常はDNAオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーがポリヌクレ
オチドにアニーリングした後、あるDNAポリメラーゼ酵素によって、標的のDNA一
本鎖に沿って伸長される。プライマーの組は、例えば、PCR法における核酸配列
の増幅（及び同定）に用いることができる。

【００８０】 本発明に用いられるプローブ及びプライマーは、既知の配列の少なくとも１５
の連続するヌクレオチドを含む。特異性を高めるために、より長いプローブ及び
プライマーが用いることも可能である。例えば、開示した核酸配列の連続する少
なくとも２０または２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００
、１５０のヌクレオチドを含む。プローブ及びプライマーは、上記した例より相
当長いものも用いることができ、本明細書の表及び図面、配列表に示された任意
の長さのヌクレオチドも用いることができることを理解されたい。

【００８１】 プローブ及びプライマーの準備及び使用方法については、例えば、Sambrook,
J.他による、1989年、名称「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第2
版の1-3巻(Cold Spring Harbor Press, Plainview NY)、またはAusubel, F.M.
他による、1987年、名称「Current Protocols in Molecular Biology」(Greene
Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY)、並びに Innis他による、
1990年、名称「PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications」(Acade
mic Press, San Diego CA.)を参照されたい。PCR用のプライマーの組は、例えば
、Primer (Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research
, Cambridge MA)などのそのような目的のためのコンピュータプログラムを用い
て、ある既知の配列から引き出すことができる。

【００８２】 プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、当分野で周知のプライマー選
択用のコンピュータプログラムで選択される。例えば、OLIGO 4.06ソフトウェア
は、それぞれが最大１００ヌクレオチドまでのPCR用のプライマーの対の選択、
及び３２，０００塩基までの入力ポリヌクレオチド配列から最大５，０００ヌク
レオチドまでの大きなポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの分析に有用で
ある。類似のプライマー選択用プログラムには、能力を拡大する追加の機能が含
まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（Genome Center at Uni
versity of Texas South West Medical Center, Dallas TXより入手可能）は、
メガベース配列から特定のプライマーを選択できるため、ゲノムワイドスコープ
（genome-wide scope）におけるプライマーの設計に有用である。Primer3プライ
マー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research,
Cambridge MA1より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位とし
て避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming libaray
）」を入力できる。また、Primer3は、特にマイクロアレイのオリゴヌクレオチ
ドの選択に有用である（後の方の２つのプライマー選択プログラムのソースコー
ドは、それぞれのソースから得ることができ、ユーザーのニーズを満たすように
変更することもできる）。PrimerGenプログラム（UK Human Genome Mapping Pro
ject Resource Centre, Cambridge UK より入手可能）は、多数の配列アライン
メントに基づいてプライマーを設計するため、アラインメントされた核酸配列の
最も保存された領域或いは最も保存されていない領域のどちらかとハイブリダイ
ズするプライマーを選択することができる。従って、このプログラムは、固有及
び保存されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドの断片の同定に有用である
。上記した任意の選択方法で同定されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチド
の断片は、例えば、PCR法やシークエンシングプライマー、マイクロアレイエレ
メント、或いはサンプルの核酸の完全或いは部分的に相補的なポリヌクレオチド
を同定する特定のプローブなどの、ハイブリダイゼーション技術に有用である。
オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記した方法に制限されるものではない。

【００８３】 本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の離
れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人工の組み合せは、化
学合成によって作られる場合も多いが、前出のSambrook に記載されたような遺
伝子工学の技術を用いて核酸の離れたセグメントを人工的に操作する方がより一
般的である。この「組換え核酸」には、単に核酸の一部の追加または置換、欠失
によって変更された核酸も含む。組換え核酸は、あるプロモーター配列に機能的
に結合した核酸配列を含む場合もある。このような組換え核酸は、例えば、ある
細胞を形質転換するのに用いられるベクターの一部であり得る。

【００８４】 別法では、このような組換え核酸は、この組換え核酸を発現する哺乳動物のワ
クチン接種に用いると、その哺乳動物の防衛的な免疫応答を誘発する、ワクシニ
アウイルスに基づいたウイルスベクターの一部であり得る。

【００８５】 「調節エレメント」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり
、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５'及び３'の非翻訳領域（UTR
）を含む。調節エレメントは、転写や翻訳、またはRNAの安定性を調節する宿主
またはウイルスタンパク質と相互作用する。

【００８６】 「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的
または生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤
、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子及びその他の
当分野で既知の成分が含まれる。

【００８７】 本明細書において、DNA配列に対する「RNA等価物」とは、基準となるDNA配列
と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、窒素性塩基のチミンがウラシルに置換
され、糖鎖の背骨がデオキシリボースではなくリボースからなる。

【００８８】 用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。SECP、SECPをコー
ドする核酸、またはその断片を含むと推定されるサンプルは、体液と、細胞から
の抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶液中に
存在するまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織と、組織プリン
ト等を含み得る。

【００８９】 用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチ
ドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しく
は合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、結合する分子に
よって認識される、例えば、抗原決定基つまりエピトープなどのタンパク質の特
定の構造の存在によって左右される。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して
特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」及び抗体を含む反応液に、エ
ピトープＡを含むポリペプチド或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在する
と、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。

【００９０】 用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或い
は分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物
が少なくとも約６０％除去されたものであり、好ましくは約７５％以上の除去、
最も好ましいくは９０％以上除去されたものを指す。

【００９１】 「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ
酸またはヌクレオチドに置き換えることである。

【００９２】 用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィ
ルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲ
ル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。この基板に
は、壁または塹壕、ピン、チャンネル、細孔などの様々な表面形態があり、そこ
にポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。

【００９３】 「転写イメージ」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類また
は組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。

【００９４】 「形質転換」とは、外来DNAが受容細胞に導入されるプロセスのことである。
形質転換は、当分野で周知の種々の方法により、自然或いは人工の条件下で起こ
り、原核宿主細胞若しくは真核宿主細胞の中に外来核酸配列を挿入する任意の周
知の方法によって行うことができる。この形質転換の方法は、形質転換される宿
主細胞のタイプによって選択される。この方法には、バクテリオファージまたは
ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポフェクション、及
び微粒子照射が含まれるが、これらに限定されるものではない。「形質転換され
た」細胞には、導入されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主
染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さ
らに、限られた時間に一時的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれ
る。

【００９５】 本明細書における「遺伝子組換え生物」とは、当分野で周知の遺伝子組換え技
術などを用いて、人間が生物の１つ以上の細胞に異種の核酸を導入した任意の生
物であり、動物及び植物を含むが、それらに限定されるものではない。微量注入
や組換えウイルスに感染させるなどの慎重な遺伝子操作によって、細胞の前駆体
に直接或いは間接的に異種核酸を細胞に導入する。「遺伝子操作」とは、典型的
な交雑育種やin vitroでの受精ではなく、組換えDNA分子を導入することである
。本発明に従った遺伝子組換え生物には、細菌及びラン藻類、菌類、植物、動物
が含まれる。本発明の単離されたDNAは、当分野で周知の、例えば、感染、形質
移入、形質転換、トランス接合（transconjugation）などの方法によって、宿主
に導入することができる。本発明のDNAをそのような生物に導入する技術は周知
であり、前出のSambrook他（1989）に記載されている。

【００９６】 特定の核酸配列の「変異配列」とは、デフォルトパラメータ設定の「BLAST 2
Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May-07-1999)を用いるblastnによって、ある
核酸配列のある長さに対する該特定の核酸配列の同一性が、少なくとも４０％と
決定された核酸配列のことである。このような核酸の対は、ある長さにおいて、
例えば、少なくとも５０％または６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９
５％、９８％、或いはそれ以上の同一性を示し得る。ある変異配列は、例えば、
「アレル」変異配列（上述）または「スプライス」変異配列、「種」変異配列、
「多型」変異配列と表すことができる。スプライス変異配列は基準分子と同一性
が極めて高い可能性があるが、mRNAプロセッシング中のエキソンの択一的スプラ
イシングによってポリヌクレオチドの数が多くなったり、少なくなったりする。
対応するポリペプチドは、基準分子に存在する追加の機能ドメインを有したり、
基準分子に存在するドメインが欠落したりし得る。種変異配列は、種によって異
なるポリヌクレオチド配列である。得られるポリペプチドは、互いに高いアミノ
酸同一性を有する。多型変異配列は、所定の種と種における特定の遺伝子のポリ
ヌクレオチド配列が異なる。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つ
のヌクレオチドが異なる「１ヌクレオチド多型」（SNP）も含み得る。SNPの存在
は、例えば、或る集団、病態、病態の性向を示唆し得る。

【００９７】 特定のポリペプチド配列の「変異体」とは、デフォルトパラメータ設定の「BL
AST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May-07-1999)を用いるblastpによって
、ある核酸配列のある長さに対する該特定のポリペプチド配列の同一性が、少な
くとも４０％と決定されたポリペプチド配列のことである。このようなポリペプ
チドの対は、ある長さにおいて、例えば、少なくとも５０％または６０％、７０
％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、或いはそれ以上の同一性を示し
得る。

【００９８】 （発明） 本発明は、新規のヒト分泌性蛋白（SECP）及びSECPをコードするポリヌクレオ
チドの発見に基づき、これらの組成物を利用した細胞増殖異常、自己免疫／炎症
性の疾患、心血管疾患、神経の疾患、および発生障害の診断、治療、及び予防に
関する。

【００９９】 表１は、本発明のポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の識別番号を示
す。各ポリヌクレオチドおよびそれに対応するポリペプチドは、１つのインサイ
トプロジェクト識別番号（Incyte Project ID）に相関する。各ポリペプチド配
列は、記載されているようにポリペプチド配列識別番号（Polypeptide SEQ ID N
O :）およびインサイトポリペプチド配列番号（Incyte Polypeptide ID）の両方
によって示されている。各ポリヌクレオチド配列は、記載されているようにポリ
ヌクレオチド配列識別番号（Polypeptide SEQ ID NO :）およびインサイトポリ
ヌクレオチドコンセンサス配列番号（Incyte Polypeptide ID）の両方によって
示されている。

【０１００】 表２は、GenBankタンパク質（genept）データベースにおいてBLAST解析により
同定された本発明のポリペプチドに相同性を有する配列を示す。列１および列２
はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（Poly
peptide SEQ ID NO :）およびそれに対応するインサイトポリペプチド配列番号
（Incyte Polypeptide ID）を示す。列３は、GenBankの最も近い相同体のGenBan
kの識別番号（Genbank ID NO :）を示す。列４は、各ポリペプチドとそのGenBan
k相同体との間の一致を表す確率スコアを示す。列５は、GwnBank相同体のアノテ
ーションを示し、更に該当箇所には適当な引用文も示す。これらを引用すること
を以って本明細書の一部とする。

【０１０１】 表３は、本発明の各ポリペプチドの様々な構造的特徴を示す。列１および列２
はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号（SEQ ID NO
:）およびそれに対応するインサイトポリペプチド配列番号（Incyte Polypeptid
e ID）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列
５はそれぞれ、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム（Genet
ics Computer Group, Madison WI）によって決定された、潜在的なリン酸化部位
および潜在的なグリコシル化部位を示す。列６は、シグネチャ（signature）配
列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質
の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所にはさらに分析方法に利
用した検索可能なデータベースを示す。

【０１０２】 表２及び３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それ
ら特性が請求の範囲に記載されたポリペプチドが分泌性蛋白であることを確立し
ている。例えば、配列識別番号１は、Basic Local Alignment Search Tool (BLA
ST)で決定されるようにハツカネズミリゾホスファチジン酸ホスファターゼ(GenB
ank ID g6635858)と７６％同一である（図２参照）。BLAST確率スコアは1e-176
であり、それは、偶然に観測されたポリペプチド配列を得る確率を示す。配列識
別番号１はまた、保存ドメインの隠されたMarkovモデル（HMM）ベースPFAMデー
タベース中の統計学的に有意な整合（match）を捜索する事で決定されるヒスチ
ジン酸ホスファターゼドメインを含む（図３参照）。BLIMPS及びPROFILESCAN解
析よりのデータは、配列識別番号１が酸性ホスファターゼである、さらに実証的
な証拠を提供する。配列識別番号２−１０は、同様の規則で解析され注釈された
。配列識別番号１−１０の解析のためのアルゴリズム及びパラメータが表７で記
述されている。

【０１０３】 表４に示されているように、本発明のポリヌクレオチド配列は、cDNA配列、ま
たはゲノムDNA由来のコード（エキソン）配列、或いはこれらの２種類の配列の
あらゆる組み合わせを用いて組み立てた。列１および列２はそれぞれ、本発明の
各ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列識別番号（Polynucleotide SEQ ID
NO :）およびそれに対応するインサイトポリヌクレオチドコンセンサス配列番号
（Incyte Polynucleotide ID）を示す。列３は、塩基対における各ポリヌクレオ
チド配列の長さを示す。列４は、例えば、SEQ ID NO:11−20を同定するため、或
いはSEQ ID NO:11−20と関連するポリヌクレオチド配列とを区別するためのハイ
ブリダイゼーションまたは増幅技術に有用なポリヌクレオチド配列の断片を示す
。列５は、cDNA配列、ゲノムDNAから推定されるコード配列（エキソン）、およ
び／またはcDNAおよびゲノムDNAの両方からなる群に対応する識別番号を示す。
これらの配列を用いて本発明のポリヌクレオチド配列を組み立てた。表４の列６
および列７はそれぞれ、列５の配列に対応するcDNA配列およびゲノム配列の開始
ヌクレオチド（５'）位置および終了ヌクレオチド（３'）位置を示す。

【０１０４】 表４の列５に示されている識別番号は、具体的には、例えばインサイトcDNAお
よびそれらに対応するcDNAライブラリの識別番号を示す。例えば、1803159H1は
インサイトcDNA配列の識別番号であり、SINTNOT13はそれが由来するcDNAライブ
ラリの識別番号である。cDNAライブラリが示されていないインサイトcDNAは、プ
ールされているcDNAライブラリ（例えば、60137216V1）に由来した。列５の識別
番号は、完全長ポリヌクレオチド配列の組み立てに用いたGenBankのcDNAすなわ
ちEST（例えば、g5523837）の識別番号の場合もある。または、列５の識別番号
が、ゲノムDNAのGenscan分析によって推定されるコード領域の場合もある（例え
ば、g5523837がGenscan分析によって得られたGenBankの配列の識別番号であるg5
523837.v113.gs_3.nt.edit）。このGenscan推定コード配列は、配列を組み立て
る前に編集する場合がある（実施例４を参照）。または、列５の識別番号は、"e
xon-stitching"アルゴリズムによってcDNAおよびGenscan推定エキソンの両方か
らなる群の場合もある（実施例５を参照）。または、列５の識別番号は、"exon-
stretching"アルゴリズムによってcDNAおよびGenscan推定エキソンの両方からな
る群の場合もある（実施例５を参照）。場合によっては、列５に示されている配
列の範囲と重複するインサイトcDNAの範囲が得られ、最終的なコンセンサス配列
が決定されるが、それに相当するインサイトcDNAの識別番号は示されていない。

【０１０５】 表５は、インサイトcDNA配列を用いて組み立てられたこれらのポリヌクレオチ
ド配列が由来する代表的なcDNAライブラリを示す。代表的なcDNAライブラリとは
、上記ポリヌクレオチド配列の組み立ておよび決定に用いられたインサイトcDNA
配列を最も多く含むインサイトcDNAライブラリのことである。表５に示されてい
るcDNAライブラリを作製するために用いた組織およびベクターが表６に示されて
いる。

【０１０６】 本発明はまた、SECPの変異体も含む。好適なSECPの変異体は、SECPの機能的或
いは構造的特徴の少なくともどちらか一方を有し、かつSECPアミノ酸配列に対し
て少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％のアミ
ノ酸配列同一性、更には少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。

【０１０７】 本発明はまた、SECPをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実施例
において、本発明は、SECPをコードするSEQ ID NO:11−20からなる一群から選択
された配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。配列表に示したSEQ ID NO:
11−20のポリヌクレオチド配列は、窒素系塩基のチミンがウラシルに置換され、
糖鎖の背骨がデオキシリボースではなくリボースからなる等価RNA配列を含む。

【０１０８】 本発明はまた、SECPをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳
細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、SECPをコードするポリ
ヌクレオチド配列と少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少
なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも９５％ものポ
リヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施形態は、SEQ ID NO:11
−20からなる一群から選択された核酸配列と少なくとも７０％のポリヌクレオチ
ド配列同一性、或いは少なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には
少なくとも９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有するSEQ ID NO:11−20か
らなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を提供す
る。上記したポリヌクレオチド変異配列は何れも、SECPの機能的或いは構造的特
徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードする。

【０１０９】 遺伝暗号の縮重により作り出され得るSECPをコードする種々のポリヌクレオチ
ド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の
類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したが
って本発明には、可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作り出
され得る可能なポリヌクレオチド配列の変異の全てが含まれ得る。これらの組み
合わせは、天然のSECPのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレッ
ト遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。

【０１１０】 SECPをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は一般に、好適に選択さ
れたストリンジェントな条件下で、天然のSECPのヌクレオチド配列とハイブリダ
イズ可能であるが、非天然のコドンを含めるなどの実質的に異なった使い方のコ
ドンを有するSECP或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作ることは
有利となり得る。特定のコドンが宿主によって利用される頻度に基づいてコドン
を選択して、ペプチドの発現が特定の真核細胞または原核宿主に発生する割合を
高めることが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、SECP及びそ
の誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、天然の
配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるRNA転
写物を作ることにある。

【０１１１】 本発明はまた、SECP及びその誘導体をコードするDNA配列またはそれらの断片
を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当分
野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何
れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、SECPまたはその任意の断
片をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。

【０１１２】 更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載されたポ
リヌクレオチド配列、特に、SEQ ID NO:11−20及びそれらの断片とハイブリダイ
ズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger
(1987) Methods Enzymol. 152:399-407; and Kimmel. A.R. (1987) Methods En
zymol. 152:507-511.を参照)。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼ
ーションの条件は、「定義」に記載されている。

【０１１３】 当分野で周知のDNAのシークエンシング方法を用いて、本発明の何れの実施例
も実行可能である。この方法には、例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SE
QUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Applied Biosys
tems）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech Piscataway N
J）、或いはELONGASE増幅システム(Life Technologies, Gaithersburg MD)にみ
られるような校正エキソヌクレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせなどの酵素
が用いられる。好ましくは、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilton, Reno,
NV）、PTC200 Thermal Cycler200（MJ Research, Watertown MA）及びABI CATAL
YST 800 (PE Biosystems) などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、
ABI 373或いは377 DNAシークエンシングシステム(PE Biosystems)、MEGABACE 10
00 DNAシークエンシングシステム(Molecular Dynamics. Sunnyvale CA)または当
分野で周知の他の方法を用いてシークエンシングを行う。得られた配列を当分野
で周知の様々なアルゴリズムを用いて分析する(例えば、Ausubel, F.M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, New York NY, un
it 7.7; Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley V
CH, New York NY, pp. 856-853.を参照)。

【０１１４】 当分野で周知のPCR法をベースにした種々の方法で、部分的なヌクレオチド配
列を利用して、SECPをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメ
ントなどの上流にある配列を検出する。例えば制限部位PCR法を利用する１つの
方法では、一般的なプライマー及び入れ子プライマー（nested primer）を用い
てクローニングベクター内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する（例えば、Sar
kar, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318-322を参照）。逆PCR法を用いる別法
では、広範な方向に伸長して環状化した鋳型から未知の配列を増幅するプライマ
ーを用いる。この鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限
断片に由来する（例えば、Triglia, T.ら（1988）Nucleic Acids Res 16:8186を
参照）。キャプチャPCR法を用いる第３の方法は、ヒト及び酵母菌人工染色体DNA
の既知の配列に隣接するDNA断片のPCR増幅を含む（例えば、Lagerstrom, M.他（
1991）PCR Methods Applic 1:111-119を参照）。この方法では、多数の制限酵素
による消化及びライゲ−ションを用いて、PCRを行う前に未知の配列の領域の中
に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、当分野で周知の別の方
法を用いて未知の配列を得ることも可能である。(例えば、Parker, J.D. 他 (19
91)Nucleic Acids Res. 19:3055-3060を参照)。更に、PCR、ネスト化プライマー
、PROMOTERFINDERライブラリ（Clontech, Palo Alto CA）を用いれば、ゲノムDN
A内の歩行が可能である。この方法ではライブラリをスクリーニングする必要が
なく、イントロン／エキソン接合部を探すのに有用である。全てのPCR法をベー
スにした方法では、プライマーは、市販のOLIGO 4.06 Primer Analysis softwar
e（National Biosciences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムなどを用
いて、長さが２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含量が５０％以上、約６８℃〜７２
℃の温度で鋳型に対してアニーリングするよう設計される。

【０１１５】 完全長のcDNAをスクリーニングする場合は、大きなcDNAを含むようにサイズが
選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、オリゴd(T)ライブラリが完
全な長さのcDNAを産生できない場合は、遺伝子の５'領域を有する配列を含むも
のが多いランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリが有用である。ゲノムライ
ブラリは、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。

【０１１６】 市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはPCR
産物のヌクレオチド配列のサイズの分析、または確認が可能である。詳しくは、
キャピラリーシークエンシングには、電気泳動による分離のための流動性ポリマ
ー、及び４つの異なったヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光色
素、放出された波長の検出に利用するCCDカメラを使用することが可能である。
出力／光強度は、適切なソフトウェア（例えば、GENOTYPER及びSEQUENCE NAVIGA
TOR、PE Biosystems）を用いて電気信号に変換され、サンプルのローディングか
らコンピュータ分析までのプロセス及び電子データ表示がコンピュータ制御可能
である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しない場合
もあるDNAの小片のシークエンシングに特に適している。

【０１１７】 本発明の別の実施例では、SECPをコードするポリヌクレオチド配列またはその
断片を組換えDNA分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にSECP、その断片
または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の縮重により
、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のDNA配列が
作られ得り、これらの配列をSECPのクローン化及び発現に利用可能である。

【０１１８】 種々の目的でSECPをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られ
ている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この
目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の調節が
含まれるが、これらに限定されるものではない。ランダムな断片によるDNAの混
合や遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドのPCR再組み立てを用いて、ヌクレオ
チド配列の組換えが可能である。例えば、オリゴヌクレオチド媒介性定方向突然
変異誘発を利用して、新しい制限部位を生成する突然変異の導入、グリコシル化
パターンの変更、コドン選択の変更、スプライスバリアントの作製等が可能であ
る。

【０１１９】 本発明のヌクレオチドを、MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara C
A; 米国特許第5,837,458号; Chang, C.-C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:793
-797; Christians, F.C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264; Crameri, A
. 他 (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319)などのDNAシャフリング技術を用い
てシャフリングして、SECPの生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化
合物と結合する能力などのSECPの生物学的特性を変更或いは改良することができ
る。DNAシャフリングは、PCR法による遺伝子断片の組換えで遺伝子変異体のライ
ブラリを作製するプロセスである。次に、このライブラリを、目的の特性を有す
る遺伝子変異体を同定するために選択或いはスクリーニングする。これらの好ま
しい変異体をプールし、DNAシャフリング及び選択／スクリーニングを繰り返す
。従って、人工的な育種及び急速な分子の進化によって多様な遺伝子が作られる
。例えば、ランダムな位置に変異がある１つの遺伝子の断片を、目的の特性が最
適化するまで、組換え及びスクリーニング、シャフリングを実施することもでき
る。別法では、所定の遺伝子の断片を、同じ或いは異なった種の同じ遺伝子ファ
ミリーの相同な遺伝子の断片で組換え、それによってプロトコルに従った調節可
能な方法で、多数の天然遺伝子の遺伝子多様性を最大にすることができる。

【０１２０】 別の実施例によれば、SECPをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を
用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Caruthers. M.H.ら（1980
）Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. Acid
s Res. Symp. Ser.225-232を参照）。別法として、化学的方法を用いてSECP自体
またはその断片を合成することが可能である。例えば、ペプチド合成は種々の固
相技術を用いて実行可能である（例えば、Creighton, T. (1984) Proteins. Str uctures and Molecular Properties , WH Freeman, New York NY, pp. 55-60; Ro
berge, J.Y.ら(1995) Science 269:202-204を参照）。また、合成の自動化は例
えばABI 431Aペプチドシンセサイザー（PE Biosystems）を用いて達成し得る。
更にSECPのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及
び／または化学的方法を用いた他のタンパク質または任意のその一部からの配列
との組み合わせにより、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドまたは変
異体ポリペプチドを作製することが可能である。

【０１２１】 このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー(例えば、Chiez, R.M.
及び F.Z. Regnier (1990)Methods Enzymol. 182:392-421を参照)を用いて実質
的に精製可能である。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸分析或いはシーク
エンシングにより確認することができる(例えば、Creighton、前出、pp28-53を
参照)。

【０１２２】 生物学的に活性なSECPを発現させるために、SECPをコードするヌクレオチド配
列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、好
適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要なエレメン
トを含む。これらのエレメントには、ベクター及びSECPをコードするポリヌクレ
オチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５'
及び３'の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このようなエレメントは、そ
の長さ及び特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、SECPをコードす
る配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルに
は、ＡＴＧ開始コドン及びコザック配列などの近傍の配列が含まれる。SECPをコ
ードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入
された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであ
ろう。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は
、インフレームのＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベク
ターに含まれなければならない。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、自然及び
合成の様々なものから得ることが可能である。用いられる特定の宿主細胞系に好
適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である。(例え
ば、Scharf, D. 他 (1994) Results Probl. Cell Differ. 201−18-162.を参照)
。

【０１２３】 当業者に周知の方法を用いて、SECPをコードする配列、好適な転写及び翻訳調
節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法に
は、in vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれ
る。(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Ma nual , Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4章及び8章, 及び１6-17章;
及び Ausubel, F.M. 他. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Jo
hn Wiley & Sons, New York NY, ch. 9章及び13章1−4章を参照)。

【０１２４】 種々の発現ベクター／宿主系を利用して、SECPをコードする配列の保持及び発
現が可能である。これらには、限定するものではないが、組換えバクテリオファ
ージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌など
の微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌や、ウイルス発現ベク
ター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベク
ター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス
、TMV）または細菌発現ベクター（例えば、TiまたはpBR322プラスミド）で形質
転換された植物細胞系や、動物細胞系などが含まれる（例えば、前出のSambrook
、前出のAusubel、Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem
. 264:5503-5509、Engelhard、E.K. 他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91
:3224-3227、Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945、Takamatsu,
N. (1987) EMBOJ. 6:307-311; The McGraw Hill Yearbook of Science and Tec hnology (1992) McGraw Hill, New York NY, pp. 191-196、Logan, J. and T. S
henk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659、Harrington, J.J. 他
(1997) Nat. Genet. 15:345-355を参照）。レトロウイルス、アデノウイルス、
ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の
細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、
組織または細胞集団へ輸送することができる（Di Nicola, M. 他 (1998) Cancer
Gen. Ther. 5(6):350-356、Yu, M. 他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(
13):6340-6344、Buller, R.M. 他(1985) Nature 317(6040):813-815; McGregor,
D.P. 他(1994) Mol. Immunol. 31(3):219-226、Verma, I.M. and N. Somia (19
97) Nature 389:239-242等を参照）。本発明は使用される宿主細胞によって限定
されるものではない。

【０１２５】 細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、SECPをコード
するポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、SECPを
コードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、
増殖には、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはpSPORT１プラスミド(G
IBCO BRL)などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多
数のクローニング部位にSECPをコードする配列をライゲーションするとlacＺ遺
伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スク
リーニング法が可能となる。更に、これらのベクターを用いて、クローニングさ
れた配列のin vitroでの転写、ジデオキシンスクリーニング、ヘルパーファージ
による一本鎖の救出、入れ子状態の欠失を作り出すことが可能である(例えば、V
an Heeke, G.及びS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509.を参照
)。例えば、抗体の産生のためなどに多量のSECPが必要な場合は、SECPの発現を
ハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力に発現を誘発するT5
またはT7バクテリオファージプロモーターを含むベクターを使用できる。

【０１２６】 SECPの発現に酵母の発現系の使用が可能である。α因子やアルコールオキシダ
ーゼやPGHプロモーターなどの構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多種の
ベクターが、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはPichia pastorisに使用
可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内
への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列
を組み込む。(例えば、Ausubel, 1995,前出、Bitter, G.A. ら (1987) Methods
Enzymol.153:516-544、及びScorer. C. A. ら (1994) Bio/Technology 121−181
-184.を参照)。

【０１２７】 植物系もSECPの発現に使用可能である。SECPをコードする配列の転写は、例え
ば、CaMV由来の35S及び19Sプロモーターなどのウイルスプロモーターが単独で、
或いはTMV（例えば、Coruzzi, G. ら. (1984) EMBO J. 3 : 1671-1680 ; Brogli
e, R. ら (1984) Science 224 : 838-843 ; および Winter, J. ら (1991) Resu
lts Probl. Cell Differ. 17 : 85-105を参照）由来のオメガリーダー配列と組
み合わせて促進される。これらの作製物は、直接のDNA形質転換或いは病原体を
介したトランスフェクションによって、植物細胞の中に導入可能である。（例え
ば、The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology（1992）McGraw Hil
l NY, pp.191-196を参照）。

【０１２８】 哺乳動物細胞では、多種のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウ
イルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダ
ー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にSECPをコードする配列を結
合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入により、感
染した宿主細胞にSECPを発現する生ウイルスを得ることが可能である（Logan, J
.及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659を参照）。さら
に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて
、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることが可能である。タンパク質を
高レベルで発現させるために、SV40またはEBVを基にしたベクターを用いること
が可能である。

【０１２９】 ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドで発現しそれに含まれているも
のより大きなDNAの断片を供給可能である。治療のために約６kb〜１０MbのHACs
を作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、または
ベシクル）で供給する。(例えば、Harrington. J.J. 他 (1997) Nat Genet.15:3
45-355.を参照)。

【０１３０】 哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞にお
けるSECPの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、SECPをコ
ードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベク
ターは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現要素や、同じ或いは別の
ベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入の後、細胞を選択培
地に移す前に、強化培地で約１〜２日の間増殖させる。選択マーカーの目的は選
択的な媒介物に対する抵抗性を与えるとともに、その存在により導入された配列
を確実に発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細
胞の耐性クローンは、その細胞型に好適な組織培養技術を用いて増殖可能である
。

【０１３１】 任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することが可能であ
る。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼ遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ
、それぞれtk⁻またはapr⁻細胞において使用される。(例えば、Wigler, M. 他
(1977) Cell 11:223-232; 及びLowy, I. 他(1980) Cell 22:817-823を参照)。ま
た代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択のベースとして用いるこ
とができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノ
グリコシッドネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え、als或いはpatはクロ
ルスルフロン（cSECPsulfuron）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラ
ーゼ（phosphinotricin acetyltransferase）に対する耐性を与える(例えば、Wi
gler, M. 他. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570; Colbere-Garapin
, F. 他(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14を参照)。さらに選択に利用できる遺伝
子、例えば、代謝のために細胞が必要なものを変えるtrpB及びhisDが文献に記載
されている（例えば、Hartman, S.C.及びR.C. Mulligan（1988）Proc. Natl. Ac
ad. Sci. 85:8047-51を参照）。アニトシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP；Cl
ontech）、βグルクロニダーゼ及びその基質GUS，ルシフェラーゼ及びその基質
ルシフェリンなどの可視マーカーが用いられる。緑色蛍光タンパク質（GFP）(Cl
ontech, Palo Alto, CA)も使用できる。これらのマーカーを用いて、トランスフ
ォーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安
定したタンパク質発現を定量することが可能である（例えば、Rhodes, C.A.他（
1995）Methods Mol. Biol. 55:121-131を参照）。

【０１３２】 マーカー遺伝子の発現の存在／不在によって目的の遺伝子の存在が示されても
、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、SECPをコード
する配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、SECPをコードする配列を
含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能である。
または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がSECPをコードする配列
と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子
の発現は、通常タンデム遺伝子の発現も示す。

【０１３３】 一般に、SECPをコードする核酸配列を含み、SECPを発現する宿主細胞は、当業
者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。これらの方法には、
DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーションや、PCR法、核酸或いはタンパ
ク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベース
の技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、
これらに限定されるものではない。

【０１３４】 特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるSE
CPの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。この
ような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラジオ
イムノアッセイ（RIA）、蛍光標示式細胞分取器（FACS）などがある。SECP上の
２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノ
クローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）
が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及
びその他のアッセイは、当分野では十分に知られている。(例えば、 Hampton. R
. 他.(1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul
. MN, Sect. IV; Coligan, J. E. 他Current Protocols in Immunology, Greene
Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York. NY; 及びPound, J.D. (
1990) Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ)。

【０１３５】 種々の標識技術及び結合技術が当業者には周知であり、様々な核酸アッセイお
よびアミノ酸アッセイに用いられ得る。SECPをコードするポリヌクレオチドに関
連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或い
はPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション
、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。別
法として、SECPをコードする配列、またはその任意の断片をmRNAプローブを生成
するためのベクターにクローニングすることも可能である。当分野では周知であ
り市販されているこのようなベクターを、T7，T3，またはSP6などの好適なRNAポ
リメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの追加によって、in vitroでのRNAプロ
ーブの合成に用いることができる。これらの方法は、例えば、Amersham Pharmac
ia Biotech及びPromega（Madison WI）、U.S. Biochemical Corp（Cleveland OH
）が市販する種々のキットを用いて行うことができる。容易な検出のために用い
得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、コファクター、インヒビター
、磁気粒子、及び放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色素産生剤などが含
まれる。

【０１３６】 SECPをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地で
のこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。形質転換された
細胞から産生されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される
その配列及び／またはそのベクターによる。SECPをコードするポリヌクレオチド
を含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するSECPの分泌を誘導
するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。

【０１３７】 更に、挿入した配列の発現調節能力または発現したタンパク質を所望の形にプ
ロセシングする能力によって宿主細胞株が選択される。このようなポリペプチド
の修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（
lipidation）、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。
タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを
利用して、標的タンパク質、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能
である。翻訳後の活性のための特定の細胞装置及び特徴のある機構をもつ種種の
宿主細胞（例えば、CHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38）がAmerican Type Culture
Collection（ATCC; Bethesda, MD）より入手可能であり、外来のタンパク質の
正しい修飾及びプロセシングを確実にするために選択される。

【０１３８】 本発明の別の実施例では、SECPをコードする自然或いは変更された、または組
換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列
に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラSE
CPタンパク質が、SECPの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスク
リーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分が、
市販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。このような部分
には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質
（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6−Hi
s、FLAG、c−mc、赤血球凝集素（HA）が含まれるが、これらに限定されるもので
はない。GST及びMBP、Trx、CBP、6−Hisによって、固定されたグルタチオン、マ
ルトース、フェニルアルシン酸化物（phenylarsine oxide）、カルモジュリン、
金属キレート樹脂のそれぞれで同族の融合タンパク質の精製が可能となる。FLAG
、c−mc、及び赤血球凝集素（HA）によって、これらのエピトープ標識を特異的
に認識する市販のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いた融合タン
パク質の免疫親和性の精製ができる。また、SECPをコードする配列と異種タンパ
ク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺
伝子操作すると、SECPが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質
の発現と精製の方法は、Ausubel. (1995、前出 ch 10).に記載されている。市販
されている様々なキットを用いて、融合タンパク質の発現及び精製を促進できる
。

【０１３９】 本発明の別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽
出系(Promega)を用いてin vitroで放射能標識したSECPの合成が可能である。こ
れらの系は、T7またはT3、SP6プロモーターと機能的に結合したタンパク質をコ
ードする配列の転写と翻訳をつなげる。翻訳は、例えば、³⁵Ｓメチオニンである
放射能標識されたアミノ酸前駆体の存在の下で起こる。

【０１４０】 本発明のSECPまたはその断片を用いて、SECPに特異結合する化合物をスクリー
ニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、SE
CPへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物の例に
は、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子が挙
げられる。

【０１４１】 一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片な
どのSECPの天然のリガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態性ま
たは自然結合パートナーに密接に関連している（Coligan, J.E. 他 (1991) Curr ent Protocols in Immunology 1(2)の5章等を参照）。同様に、化合物は、SECP
が結合する天然受容体、或いは例えばリガンド結合部位などの少なくとも受容体
のある断片に密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物
を合理的に設計することができる。一実施例では、このような化合物に対するス
クリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方と
してSECPを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、
酵母、大腸菌からの細胞が含まれる。SECPを発現する細胞またはSECPを含有する
細胞膜断片を試験化合物と接触させて、SECPまたは化合物の何れかの結合、刺激
または阻害を分析する。

【０１４２】 あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、結合を
、フルオロフォア、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識に
より検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化
合物を、溶液中の或いは固体支持物に固定されたSECPと結合させるステップと、
SECPとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識され
た競合物の存在下での試験化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更
にこのアッセイでは、細胞遊離剤、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を用
いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固
定させる。

【０１４３】 本発明のSECPまたはその断片を用いて、SECPの活性を調整する化合物をスクリ
ーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴ
ニスト、或るいは部分的または逆アゴニスト等が含まれる。一実施例では、SECP
が少なくとも１つの試験化合物と結合する、SECPの活性が許容される条件下でア
ッセイを実施し、試験化合物の存在下でのSECPの活性が試験化合物不在下でのSE
CPの活性と比較する。試験化合物の存在下でのSECPの活性の変化は、SECPの活性
を調整する化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物をSECPの活性に適し
た条件下でSECPを含むin vitroまたは細胞遊離系と結合させてアッセイを実施す
る。これらアッセイの何れかにおいて、SECPの活性を調整する試験化合物は間接
的に結合することが可能であり、試験化合物と直接接触する必要がない。少なく
とも１つから複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。

【０１４４】 別の実施例では、胚性幹細胞（ES細胞）における相同組換えを用いて動物モデ
ル系内で、SECPまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノ
ックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患
動物モデルの作製に有用である（米国特許第5,175,383号及び第5,767,337号等を
参照）。例えば129/SvJ細胞株等のマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培
地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子（neo: Capecchi, M.R. (1989) Science 244:1288-1292）等のマー
カー遺伝子で破壊した目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクタ
ーは、相同組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、
Cre-loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的
遺伝子をノックアウトする（Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999-2002;
Wagner, K.U. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25:4323-43 30）。形質転換した
ES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス系等から採取したマウス細胞胚盤胞に微
量注入する。胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝
形質を決め、これを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。
このようにして作製した遺伝子組換え動物は、潜在的な治療薬や毒性薬剤で検査
することができる。

【０１４５】 SECPをコードするポリヌクレオチドをin vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞にお
いて操作することが可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細
胞の種類を含む少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。こ
れらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する（Thomso
n, J.A. 他 (1998) Science 282:1145-1 147）。

【０１４６】 SECPをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノッ
クイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を
作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、SECPをコードするポリヌ
クレオチドの或る領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに
組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺
伝子組換え子孫または近交系について研究し、潜在的な医薬品を用いて処理し、
ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばSECPを乳汁内に分泌す
るなどSECPを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る
（Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74）。

【０１４７】 （治療） SECPのある領域と分泌性蛋白のある領域との間に、例えば配列及びモチーフの
文脈における化学的及び構造的類似性が存在する。更に、SECPの発現は、肝臓組
織に密接に関連する。従って、SECPは、細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患
、心血管疾患、神経の疾患、および発生障害においてある役割を果たすと考えら
れる。SECPの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、SECPの
発現または活性を低下させることが望ましい。また、SECPの発現または活性の低
下に関連する疾患の治療においては、SECPの発現または活性を増大させることが
望ましい。

【０１４８】 従って、一実施例において、SECPの発現または活性の低下に関連した疾患の治
療または予防のために、患者にSECPまたはその断片や誘導体を投与することが可
能である。限定するものではないが、このような疾患には細胞増殖異常、自己免
疫／炎症性の疾患、心血管疾患、神経の疾患、および発生障害が含まれ、細胞増
殖異常の中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎
、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性
多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、
骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚
部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状
腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含まれ
、自己免疫／炎症性の疾患の中には、炎症及び日光性角化症、後天性免疫不全症
候群（AIDS）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎
炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧
血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフ
ィー（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚
炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球
症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グ
レーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症
、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性
筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群
、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、原発性血
小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透
析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫
感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、心血管疾患の中には、うっ血性心不全、虚
血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大
動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪状石灰化（mitral annular calci
fication）、僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非
細菌性血栓性心内膜炎、全身性エリテマトーデスの心内膜炎、カルチノイド心疾
患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、先天性肺異常（
congenital lung anomalies）、肺移植の合併症、動静脈瘻、アテローム硬化、
高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎及び静
脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成術（balloon angiop
lasty）、血管置換術（vascular replacement）、大動脈冠動脈バイパス術移植
手術（coronary artry bypass graft suegery）が含まれ、神経の疾患の中には
、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病
、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側
策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎
、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜
炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及
び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤ
コブ病、ゲルストマン症候群、Gerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含むプ
リオン病と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、
結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、
脳３叉神経血管症候群、ダウン症を含む中枢神経系性精神薄弱及び他の発生障害
、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多
発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力
症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性の障害、分裂病性疾患を含む精神病と
、季節性障害（SAD）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー
、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経
痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、皮質基部変性（corticobasal deg
eneration）及び家族性の前頭側頭性健忘症とが含まれ、また発生障害も含まれ
、その中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性
小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WA
GR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マ
ジェニス症候群(Smith- Magenis syndrome)、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜
上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症な
どの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、Syndenham舞踏病(Syndenham's
chorea)及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂
、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれる。

【０１４９】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むSECPの発現
または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、SECPまたはその断
片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。

【０１５０】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むSECPの
発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製
されたSECPを含む組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与することも可能で
ある。

【０１５１】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むSECPの
発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、SECPの活性を
調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。

【０１５２】 更なる実施例では、SECPの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または
予防のために、患者にSECPのアンタゴニストを投与することが可能である。限定
するものではないが、このような疾患の例には、上記した細胞増殖異常、自己免
疫／炎症性の疾患、心血管疾患、神経の疾患、および発生障害が含まれる。一実
施態様では、SECPと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いは
SECPを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング或いは運搬機構と
して間接的に用いられ得る。

【０１５３】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むSECPの発現
または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、SECPをコードする
ポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与することも可能で
ある。

【０１５４】 別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補的な配列、ベクターを別の好適な治療薬と組み合わせて投与すること
もできる。当業者は、従来の医薬原理にしたがって併用療法で用いる好適な治療
薬を選択可能である。治療薬との組み合わせにより、上に列記した種々の疾患の
治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いて少ない量の各薬剤
で医薬効果をあげることが可能であり、広範囲な副作用の可能性を低減し得る。

【０１５５】 SECPのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能
である。詳しくは、精製されたSECPを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラ
リをスクリーニングしてSECPと特異的に結合するものを同定が可能である。SECP
の抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。このよう
な抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、
Fabフラグメント、及びFab発現ライブラリによって作られたフラグメントが含ま
れる。但し、これらに限定されるものではない。治療用には、中和抗体（即ち、
二量体の形成を阻害するもの）が特に好ましい。

【０１５６】 抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のも
のを含む種々の宿主が、SECPまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備える
そのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々の
アジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。このようなアジュバント
にはフロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバ
ント、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳
剤、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノールなどの界面活
性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられるアジュ
バントの中では、BCG（bacilli Calmette-Guerin）及びCorynebacterium parvum が特に好ましい。

【０１５７】 SECPに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、ま
たは断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなり、一般的には約１０個以上の
アミノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド或いはペプチド、ま
たはそれらの断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であること
が望ましい。SECPアミノ酸の短いストレッチは、KLHなどの別のタンパク質の配
列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。

【０１５８】 SECPに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体
分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらの技術に
は、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びEBV−ハイブリ
ドーマ技術が含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、Kohler,
G. ら. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D. ら. (1985) .J. Immunol. Met
hods 81−8-42; Cote, R.J. ら. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030
; Cole, S.P. ら. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120を参照）。

【０１５９】 更に、「キメラ抗体」作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝
子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備
える分子を得るために用いられる（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc. N
atl. Acad. Sci. 81−4851−4855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604
-608; Takeda, S.ら. (1985) Nature 314:452,454を参照）。別法では、当分野
で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、
SECP特異性一本鎖抗体を生成する。関連する特異性を備えるが別のイディオタイ
プの組成の抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリから鎖混
合によって生成することもできる（例えば、Burton D.R. (1991) Proc. Natl. A
cad. Sci. 88:11120-3を参照）。

【０１６０】 抗体は、リンパ球集団の中のin vivo産生を誘発することによって、または免
疫グロブリンライブラリのスクリーニングまたは文献に示されているような、高
度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって、得ることも
できる（例えば、Orlandi, R. 他. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833-3
837; Winter, G. 他. (1991) Nature 349:293-299を参照）。

【０１６１】 SECPに対する特異的な結合部位を含む抗体も得ることができる。例えば、この
ような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成されるF（ab'）に断片と
、F（ab'）に断片のジスルフィド架橋を減じることによって生成されるFab断片
が含まれるが、これらに限定されるものではない。別法では、Fab発現ライブラ
リを作製することによって、所望の特異性とモノクローナルFab断片の迅速且つ
容易な同定が可能となる（例えば、Huse, W.D. ら. (1989) Science 254:1275-1
281を参照）。

【０１６２】 種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体
を同定する。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプ
ロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、SECP
とその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。二つの非干渉性SECPエ
ピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナル
ベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用する
ことができる(Pound、前出)。

【０１６３】 ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、S
ECPに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは
、平衡状態の下でSECP抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で
除して得られる値である。多数のSECPエピトープに対して親和性が不均一なポリ
クローナル抗体医薬のＫａは、SECPに対する抗体の平均親和性または結合活性を
表す。特定のSECPエピトープに単一特異的なモノクローナル抗体医薬のＫａは、
親和性の真の測定値を表す。Ka値が１０^９〜１０^１２Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体
医薬は、SECP抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに
用いるのが好ましい。Ka値が１０^６〜１０^７Ｌ／ｍｏｌの低親和性抗体医薬は、
SECPが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（immunopuri
fication）及び類似の処理に用いるのが好ましい。(Catty, D. (1988) Antibodi es, Volume I: A Practical Approach . IRL Press, Washington, DC; Liddell,
J. E. and Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, J
ohn Wiley & Sons, New York NY)。

【０１６４】 ある下流での適用におけるこのような医薬品の品質及び適性を調べるために、
ポリクローナル抗体医薬の抗体価及び結合活性を更に評価する。例えば、少なく
とも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的
な抗体を含むポリクローナル抗体医薬は一般に、SECP抗体複合体を沈殿させなけ
ればならない処理に用いられる。様々な適用例における抗体の特異性及び抗体価
、結合活性、抗体の品質や使用法の指針は一般に入手可能である。(例えば、Cat
ty, 前出, 及びColigan 他、前出を参照)。

【０１６５】 本発明の別の実施例では、SECPをコードするポリヌクレオチド、またはその任
意の断片や相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、
SECPをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチ
センス分子（DNA及びRNA、修飾ヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更する
ことができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、SECPをコードする配列の制御領域
から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である。

【０１６６】 治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な
任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的
タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を発現する発
現プラスミドの形で細胞内に送達することができる（例えば、Slater, J.E. 他
(1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469-475; and Scanlon, K.J. 他 (1
995)9(13):1288-1296.を参照 ）。また、アンチセンス配列は、例えばレトロウ
イルスやアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて細胞内に導
入することもできる（例えば、Miller, A.D. (1990) Blood 76:271; Ausubel,
前出; Uckert, W. and W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63(3):323-347を
参照）。その他の遺伝送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロ
ープ、及び当分野で周知のその他の系が含まれる（Rossi, J.J. (1995) Br. Med
. Bull. 51(1):217-225; Boado, R.J.他 (1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1
315; and Morris, M.C. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730-2736.を参
照）。

【０１６７】 本発明の別の実施例では、SECPをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若し
くは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療は、（i）遺
伝子欠損症（例えば、Ｘ染色体連鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M. 他 (2000) Scie
nce 288:669-672）によって特徴づけられる重度の複合型免疫欠損（SCID）-X1）
、遺伝性アデノシン−デアミナーゼ（ADA）欠損症(Blaese, R.M. 他 (1995) Sci
ence 270:475-480; Bordignon, C. 他 (1995) Science 270:470-475)に関連する
重度の複合型免疫欠損、嚢胞性繊維症（Zabner, J. 他 (1993) Cell 75:207-216
: Crystal, R.G. 他 (1995) Hum. Gene Therapy 6:643-666; Crystal, R.G. 他
. (1995) Hum. Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalassamia）、家族
性高コレステロール血症、第VIII因子若しくは第IX因子欠損による血友病（Crys
tal, 35 R.G. (1995) Science 270:404-410; Verma, I.M. and Somia. N. (199
7) Nature 389:239-242）を治療したり、（ii）条件的致死性遺伝子産物（例え
ば、細胞増殖の制御不能による癌の場合）を発現させたり、及び（iii）細胞内
の寄生虫（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）（Baltimore, D. (1988) Natu
re 335:395-396; Poescbla, E. 他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11
395-11399）や、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicans
及びParacoccidioides brasiliensis等の真菌寄生虫、Plasmodium falciparum及
びTrypanosoma cruzi等の原虫寄生体）に対する防御機能を有するタンパク質を
発現させて行うことができる。SECPの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が
疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からSECPを発現させて、遺伝
子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。

【０１６８】 本発明の更なる実施例では、SECPの欠損による疾患や異常症は、SECPをコード
する哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によって
SECP欠損細胞に導入することによって治療する。in vivo或いはex vitroの細胞
に用いる機械的な導入技術には、（i）個々の細胞内へのDNAのマイクロインジェ
クション、（ii）金粒子の打ち込み、（iii）リポソーム仲介性トランスフェク
ション、（iv）受容体仲介性遺伝子導入、及び（v）DNAトランスポソン（Morgan
, R.A. and W.F. Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem. 62:191-217; Ivics, Z
. (1997) Cell 91:501-510; Boulay, J-L. and H. Rｅcipon (1998) Curr. Opin
. Biotechnol. 9:445-450）の使用が含まれる。

【０１６９】 SECPの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、限定するものではないが、
PCDNA 3.1、EPITAG、PRCCMV2、PREP、PVAXベクター(Invitrogen, Carlsbad CA)
、PCMV-SCRIPT、PCMV-TAG、PEGSH／PERV (Stratagene, La Jolla CA)、PTET-OFF
、PTET-ON、PTRE2、PTRE2-LUC、PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA)が含まれる
。SECPを発現させるために、（i）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイ
トメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジ
ンキナーゼ（TK）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、(ii)誘導性プロモーター
（例えば、市販されているT-REXプラスミド（Invitrogen）に含まれている、テ
トラサイクリン調節性プロモーター（Gossen, M. and H. Bujard (1992) Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551; Gossen, M. 他 (1995) Science 268:1
766-1769; Rossi, F.M.V. and H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:4
51-456））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミドPVGRXR
及びPINDに含まれている：Invitrogen）、FK506／ラパマイシン誘導性プロモー
ター、またはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Rossi, F.M.V. a
nd H.M. Blau, 前出）、または（iii）正常な個体に由来するSECPをコードする
内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いるこ
とが可能である。

【０１７０】 市販のリポソーム形質転換キット（例えば、Invitrogenが販売しているPERFEC
T LIPID及びTRANSFECTION KIT）を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らない
でもポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能である。別法で
は、リン酸カルシウム法（Graham. F.L. and A.J. Eb (1973) Virology 52:456-
467）若しくは電気穿孔法 (Neumann, B. 他 (1982) EMBO J. 1:841-845)を用い
て形質転換を行う。初代細胞にDNAを導入するためには、これらの標準的な哺乳
動物トランスフェクションプロトコルを変更する必要がある。

【０１７１】 本発明の別の実施例では、SECPの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾
患や異常症は、（i）レトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーター若しくは
独立したプロモーターのコントロール下でSECPをコードするポリヌクレオチドと
、（ii）好適なRNAパッケージングシグナルと、（iii）追加のレトロウイルス・
シス作用性RNA配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコーディング配列を伴
うRev応答性エレメント（RRE）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治
療することができる。レトロウイルスベクター（例えば、PFB及びPFBNEO）はStr
atagene社から入手可能であり、公表データ（Riviere, I. 他. (1995) Proc. Na
tl. Acad. Sci. U.S.A. 92:6733-6737）に基づいている。上記データを引用する
ことをもって本明細書の一部とする。このベクターは、VSVg（Armentano, D. 他
(1987) J. Virol. 61:1647-1650; Bender, M.A. 他 (1987) J. Virol. 61:1639
-1646; Adam, M.A. and A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806; Dull, T
. 他 (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zufferey, R. 他 (1998) J. Virol. 72:
9873-9880）等の乱交雑エンベロープタンパク質若しくは標的細胞上の受容体に
対する親和性を有するエンベロープ遺伝子を発現する好適なベクター産生細胞系
（VPCL）において増殖される。RIGGに付与された米国特許第5,910,434号（「Met
hod for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transdu
cing efficiency retroviral supernatant」）において、レトロウイルスパッケ
ージング細胞系を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明
細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、ある細胞集団（例えば、CD
4⁺Ｔ細胞）の形質導入、並びに形質導入した細胞を患者に戻す方法は、遺伝子治
療の分野では周知であり、多数の文献に記載されている（Ranga, U. 他. (1997)
J. Virol. 71:7020-7029; Bauer, G. 他 (1997) Blood 89:2259-2267; Bonyhad
i, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707-4716; Ranga, U. 他 (1998) Proc. Natl. A
cad. Sci. U.S.A. 95:1201-1206: Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290）。

【０１７２】 別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、SECPの発現に関連
する１或いは複数の遺伝子異常を有する細胞にSECPをコードするポリヌクレオチ
ドを送達する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングは当分野で
は周知である。複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調節タンパク質をコ
ードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島の中に導入するために可変性であることが
証明された（Csete, M.E. 他. (1995) Transplantation 27:263-268）。使用で
きる可能性のあるアデノウイルスベクターが、米国特許第5,707,618号（「Adeno
virus vectors for gene therapy」）に記載されており、引用することをもって
本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについてはまた、Antinozzi, P
.A. 他 (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511-544; and Verma, I.M. and N. Somia
(1997) Nature 18:389:239-242を参照し、引用することをもって本明細書の一部
とする。

【０１７３】 別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、SECPの発現に関連する１
或いは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にSECPをコードするポリヌクレオチド
を送達する。単純疱疹ウイルス（HSV）系のベクターは、HSV親和性の中枢神経細
胞にSECPを導入する際に特に重要である。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケ
ージングは当分野では周知である。複製適格性の単純疱疹ウイルス（HSV）I型系
のベクターは、霊長類の眼にレポーター遺伝子を送達するために用いられてきた
（Liu, X. 他 (1999) Exp. Eye Res.169:385-395）。HSV-1ウイルスベクターの
作製は、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号(Herpes simplex virus swa
ins for gene transfer)に記載されており、引用することをもって本明細書の一
部とする。米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために、
好適なプロモーターのコントロールの下で、細胞に導入される少なくとも１つの
内在性遺伝子を含むゲノムからなる組換えHSV d92についての記載がある。また
上記特許には、ICP4、ICP27及びICP22のために除去される組換えHSV株の作製及
び使用方法が開示されている。HSVベクターについては、Goins, W.F. 他 (1999)
J. Virol. 73:519-532 and Xu, H. 他 (1994) Dev. Biol. 163:152-161を参照
し、引用することをもって本明細書の一部とする。クローニングされたヘルペス
ウイルス配列の操作や、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なった部分を含む多
数のプラスミドをトランスフェクトした後の組換えウイルスの継代、ヘルペスウ
イルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は当分野で周知
の技術である。

【０１７４】 別法では、αウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いてSECPをコ
ードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスで
あるセムリキ森林熱ウイルス（Semliki Forest Virus, SFV）の生物学的な研究
が広範に行われ、遺伝子伝達ベクター（gene transfer vector）がSFVゲノムに
基づいていることが分かった（Garoff, H. and K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Bi
otech. 9:464-469）。αウイルスRNAの複製中に、通常はウイルスカプシドタン
パク質をコードするサブゲノムRNAが作り出される。このサブゲノムRNAが完全長
のゲノムRNAより高いレベルで複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ
及びポリメラーゼ）を有するウイルスタンパク質に対してカプシドタンパク質が
過剰に産生される。同様に、SECPをコードする配列をαウイルスゲノムのカプシ
ドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数の
SECPをコードするRNAが産生され、高いレベルでSECPが合成される。通常はαウ
イルス感染は２〜３日以内の細胞溶解に関係するが、シンドビスウイルス（SIN
）の変異体を有するハムスターの正常な腎細胞（BHK-21）の持続的な感染を確立
する能力は、αウイルスの溶解性の複製が遺伝子治療に適用できるように好適に
変更することが可能であることを示唆している（Dryga, S.A. 他. (1997) Virol
ogy 228 :74-83）。様々な宿主にαウイルスを導入できることから、様々なタイ
プの細胞にSECPを導入することできる。ある集団における細胞のサブセットの特
定の形質導入には、形質導入する前に細胞のソーティングを必要とする場合があ
る。αウイルスの感染性cDNAクローンの操作、αウイルスcDNA及びRNAのトラン
スフェクション、並びにαウイルスの感染方法は当分野で周知である。

【０１７５】 転写物がリボソームに結合するのを阻止すること。

【０１７６】 酵素性RNA分子であるリボザイムは、RNAの特異的切断を触媒するために用いる
ことができる。リボザイム作用の機構には、相補的な標的RNAへのリボザイム分
子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれ、ヌクレオチド鎖切断が続く。
例えば、SECPをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効果的に触
媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。

【０１７７】 任意の潜在的RNA標的内の特異的なリボザイム切断部位が、後続の配列ＧＵＡ
、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位に対して、標的分子をスキャニ
ングすることによって初めに同定される。一度同定されると、切断部位を含む標
的遺伝子の領域に対応する１５個から２０個のリボヌクレオチドの短いRNA配列
を、オリゴヌクレオチドの機能を不全にする二次的な構造の特徴について評価す
ることが可能である。候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用
いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易性をテス
トすることによって評価することが可能である。

【０１７８】 本発明の相補的なリボ核酸分子及びリボザイムは、当分野で周知の方法を用い
て、核酸分子の合成のために作製することができる。これらの方法には、固相ホ
スホラミダイト化合物などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法が含ま
れる。別法では、RNA分子がin vitro及びin vivoでSECPをコードするDNA配列の
転写によって生成され得る、このようなDNA配列はT7またはSP6等の好適なRNAポ
リメラーゼプロモータを用いて、種々のベクターの中に組み入れることが可能で
ある。別法では、相補的なRNAを構成的または誘導的に合成するこれらのcDNA作
製物は、細胞株、細胞、または組織の中に導入することができる。

【０１７９】 RNA分子を修飾することによって、細胞内の安定性を高め、半減期を長くする
ことができる。可能な修飾には、分子の５’及び／または３’端部でのフランキ
ング配列の追加、または分子のバックボーン内のホスホジエステル結合の代わり
にホスホロチオネートまたは２’Ｏメチルを用いる修飾が含まれるが、これらに
限定されるものではない。PNAの生成に固有のこの概念は、内在性のエンドヌク
レアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン
、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び同様の修飾形態だけでな
く、イノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブトシン（wybutosine）な
どの従来のものでない塩基を含めることによって、これらの分子の全体に拡大す
ることができる。

【０１８０】 本発明の更なる実施例は、SECPをコードするポリヌクレオチドの発現の変化に
有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。特定のポリヌクレオチドの発現
の変化に有効な化合物には、限定するものではないが、特定のポリヌクレオチド
配列と相互作用可能な非高分子化学物質、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオ
リゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子やその他のポ
リペプチド転写調節因子が含まれる。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現の
インヒビター或いはエンハンサーとして作用し、ポリヌクレオチドの発現を変化
させ得る。従って、SECPの発現または活性の増加に関連する疾患の治療において
は、SECPをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療
上有用であり、SECPの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、
SECPをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有
用であり得る。

【０１８１】 特定のポリヌクレオチドの発現の変化の有効性を調べるために、少なくとも１
個から複数個の試験化合物をスクリーニングすることができる。試験化合物は、
有効な化合物の化学修飾を含む当分野で周知の任意の方法で得ることができる。
このような方法は、ポリヌクレオチドの発現を変化させる場合、一般に市販され
ている或いは専売の天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合、標
的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づいて化合物を合理的
にデザインする場合、更に組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラ
リから選択する場合に有効である。SECPをコードするポリヌクレオチドを含むサ
ンプルは、少なくとも１つの試験化合物に曝露して得る。サンプルには、例えば
無傷細胞、透過化処理した細胞、in vitro細胞遊離系または再構成生化学系が含
まれ得る。SECPをコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当分野で
周知の任意の方法でアッセイする。通常、SECPをコードするポリヌクレオチドの
配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーシ
ョンにより、特定のヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーションの
収量を定量し、その値が１或いは複数の試験化合物に曝露される及び曝露されな
いポリヌクレオチドの発現の比較における基準となり得る。試験化合物に曝露さ
れるポリヌクレオチドの発現の変化が検出される場合は、ポリヌクレオチドの発
現の変化に試験化合物が有効であることを示している。特定のポリヌクレオチド
の発現の変化に有効な化合物を調べるために、例えばSchizosaccharomyces pomb e 遺伝子発現系（Atkins, D. 他 (1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M.
他 (2000) Nucleic Acids Res. 28:E15）またはHeLa細胞等のヒト細胞株（Clark
e, M.L. 他 (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-13）を用いてスク
リーニングする。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド配列に対す
るアンチセンス活性を調べるための、各オリゴヌクレオチド（デオキシリボヌク
レオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、及び修飾オリゴヌクレオチド）の
組み合わせライブラリのスクリーニングを含む（Bruice, T.W. 他 (1997) 米国
特許第5,686,242号、Bruice, T.W. 他 (2000) 米国特許第6,022,691号）。

【０１８２】 ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用でき、in vivo、in vi tro 、及びex vivoでの使用に等しく適している。ex vivoでの治療の場合、患者
から採取された肝細胞の中にベクターを導入して、自家移植で同じ患者に戻すた
めにクローニング増殖される。トランスフェクション、リボソーム注入またはポ
リカチオンアミノポリマーによる運搬は、当分野で周知の方法を用いて実行する
ことができる（例えば、Goldman, C.K. 他. (1997) Nature Biotechnology 15:4
62-66:を参照）。

【０１８３】 上記したいかなる治療方法も、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサ
ギ及びサルなどの哺乳動物を含む、治療が必要な全ての被験者に適用できる。

【０１８４】 本発明の別の実施例は、上記した全ての治療効果のために、医学上認められる
担体と共に医薬品或いは無菌組成物の投与に関連する。このような組成物は、SE
CP、SECPの抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、またはSECPのインヒビタ
ーなどからなる。この組成物は、単体で、或いは安定剤などの１種類以上の別の
薬剤と共に、無菌の生体適合性医薬品担体に投与することができる。このような
医薬品担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、及び水などが含まれるが
これらに限定されるものではない。この組成物は、単独或いは薬物またはホルモ
ンなどの別の薬剤と共に投与することができる。

【０１８５】 本発明に用いられる組成物は、様々な経路を用いて投与するが可能である。こ
の経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下、心室内、経皮
、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、または直腸が含まれるがこれらに
限定されるものではない。

【０１８６】 肺投与用の組成物は、液状または乾燥粉末状に調製することができる。このよ
うな組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば、
従来の低分子量有機薬剤）の場合には、速効製剤のエアロゾル輸送が当分野で周
知である。高分子（例えばより大きなペプチドやタンパク質）の場合には、肺の
肺胞領域を介する肺輸送の技術が近年向上したため、インスリン等の薬剤を実際
に血中に輸送することが可能となった（Patton, J.S. 他, 米国特許第5,997,848
号等を参照）。肺輸送は、針注射を用いないで投与できるという点で優れており
、潜在的に有毒な浸透エンハンサーが必要でなくなる。

【０１８７】 本発明に用いる好適な組成物には、目的を達成するため、効果的な量の活性処
方成分を含む組成物が含まれる。当業者は、十分に自身の能力で効果的な服用量
を決めることができる。

【０１８８】 SECPまたはその断片を含む高分子を直接細胞内に輸送するべく、特殊な形態に
組成物が調製されるのが好ましい。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソー
ム製剤は、細胞融合及び高分子の細胞内輸送を促進し得る。別法では、SECPまた
はその断片をHIV Tat-1タンパク質の陽イオンN末端部に結合することもできる。
このようにして作製された融合タンパク質は、マウスモデル系の脳を含む全ての
組織の細胞に形質導入されることが確認されている（Schwarze, S.R. 他 (1999)
Science 285:1569-1572）。

【０１８９】 どのような組成物であっても、治療に効果的な薬用量は、初めは、例えば腫瘍
細胞の腫瘍細胞アッセイで、或いは動物モデルのどちらかで推定することができ
る。通常、動物モデルには、マウス、ウサギ、イヌ、サル、またはブタなどが用
いられる。動物モデルはまた、好適な濃縮範囲及び投与の経路を決めるのに用い
ることができる。このような治療をもとに、ヒトへの有益な薬用量及び投与経路
を決定することができる。

【０１９０】 医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばSECPまたはそ
の断片、SECPの抗体、SECPのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターな
どの活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、たとえば、ED_５０（
服用に対して集団の５０％に医薬的効果がある用量）またはLD_５０（服用に対し
て集団の５０％に致命的である用量）統計を計算するなど、細胞培養または動物
実験における標準的な薬剤手法によって決定することができる。毒性効果と治療
効果との薬用量比は治療指数であり、LD_５０／ED_５０と示すことができる。高い
治療指数を示す組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られた
データが、ヒトへの適用のために、薬用量の範囲を調剤するのに用いられる。こ
のような組成物が含まれる薬用量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ED_５０を含
む血中濃度の範囲であることが望ましい。薬用量は、用いられる投与形態及び患
者の感受性、投与の経路によって、この範囲内で様々である。

【０１９１】 正確な薬用量は、治療が必要な患者に関する要素を考慮して、実務者によって
決められるであろう。薬用量及び投与は、効果的なレベルの活性成分を与えるた
め或いは所望の効果を維持するために調節される。薬用量の要素として考慮され
るものには、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、年齢、体重、及び患者の
性別、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、及び治療に対する応答
が含まれる。作用期間が長い組成物は、三日か四日に一度、一週間に一度、二週
間に一度、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって左右され、投与され
得る。

【０１９２】 通常の薬用量は投与の経路によって異なるが、約0.1〜100,000μgまでの最大
約１グラムまでである。特定の薬用量及び運搬の方法に関するガイダンスは文献
に記載されており、一般に当分野の実務者はそれを利用することができる。当業
者は、タンパク質またはインヒビターとは異なったヌクレオチドの製剤を利用す
るであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの運搬は、特定の細
胞、状態、位置などに対して特異的であろう。

【０１９３】 （診断） 別の実施例では、SECPに特異的に結合する抗体が、SECPの発現によって特徴付
けられる疾患の診断、またはSECPやSECPのアゴニストまたはアンタゴニスト、イ
ンヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる
。診断に有用な抗体は、治療のところで記載した方法と同じ方法で製剤される。
SECPの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織か
ら採取されたものからSECPを検出する方法が含まれる。これらの抗体は、修飾を
して或いはしないで使用され、レポーター分子の共有結合性或いは非共有結合性
の接着によって標識化され得る。当分野で周知の種々のレポーター分子が用いら
れるが、その内の幾つかは上記した。

【０１９４】 SECPを測定するためのELISA，RIA，及びFACSを含む種々のプロトコルは、当分
野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのSECPの発現を診断する元とな
るものを提供する。正常或いは標準的なSECPの発現の値は、複合体の形成に適し
た条件の下、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または
細胞とSECPに対する抗体とを結合させることによって決定する。標準的な複合体
形成の量は、測光法（photometric）などの種々の方法で定量され得る。被験者
のSECPの発現の量、制御及び疾患、生検組織からのサンプルが基準値と比較され
る。基準値と被験者との間の偏差が、診断の指標となる。

【０１９５】 本発明の別の実施例によれば、SECPをコードするポリヌクレオチドを診断のた
めに用いることもできる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチ
ド配列、相補的なRNA及びDNA分子、及びPNAが含まれる。このポリヌクレオチド
を用いて、疾患と相関し得るSECPを発現する生検組織における遺伝子の発現を検
出し定量する。この診断アッセイを用いて、SECPの存在の有無、更に過剰な発現
を調べ、治療中のSECP値の調節を監視する。

【０１９６】 一実施形態では、SECPまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリヌ
クレオチド配列を検出可能なPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションによ
って、SECPをコードする核酸配列を同定することが可能である。例えば５'調節
領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであるやや特異性
の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション
或いは増幅のストリンジェントは、プローブがSECPをコードする自然界の配列の
みを同定するかどうか、或いはアレルや関連配列コードする自然界の配列のみを
同定するかどうかによって決まるであろう。

【０１９７】 プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、SECPをコードする任意の配
列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼ
ーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:11−20の配列
、或いはSECP遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配
列に由来し得る。

【０１９８】 SECPをコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作
製方法には、SECP及びSECP誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をmRNAプロ
ーブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。このようなベクタ
ーは市販されており、当業者には周知であり、好適なRNAポリメラーゼ及び好適
な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでRNAプローブを合
成するために用いられる。ハイブリダイゼーションプローブは、例えば^３２Ｐ或
いは^３５Ｓなどの放射性核種、或いはアビジン／ビオチン（biotin）結合系によ
ってプローブに結合されたアルカリホスファターゼなどの酵素標識等の種々のレ
ポーターの集団によって標識され得る。

【０１９９】 SECPをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、SECPの発現に関連する疾患
を診断することが可能である。限定するものではないが、このような疾患には細
胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、心血管疾患、神経の疾患、および発生障
害が含まれ、細胞増殖異常の中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑
液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモ
グロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、
リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、
骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、
卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、精巣、胸腺、甲状腺、及
び子宮の癌が含まれ、自己免疫／炎症性の疾患の中には、炎症及び日光性角化症
、後天性免疫不全症候群（AIDS）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレ
ルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、
自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ
性外胚葉ジストロフィー（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン
病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リン
パ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャ
ー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症
候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょ
う症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、
シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身
性硬化症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群
、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、
寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、心血管疾患の中には、
うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜
性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪状石灰化（mi
tral annular calcification）、僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、
感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性エリテマトーデスの心内膜炎
、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾
患、先天性肺異常（congenital lung anomalies）、肺移植の合併症、動静脈瘻
、アテローム硬化、高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、静脈瘤
、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成
術（balloon angioplasty）、血管置換術（vascular replacement）、大動脈冠
動脈バイパス術移植手術（coronary artry bypass graft suegery）が含まれ、
神経の疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハ
イマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外
路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎
縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性
及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓
性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びク
ロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、Gerstmann-Straussler-Schei
nker症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝
病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangi
oblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症を含む中枢神経系性精神薄
弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、末梢神経疾
患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパ
シーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性の障害、分裂病性
疾患を含む精神病と、季節性障害（SAD）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿
病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障
害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、皮質基部変性
（corticobasal degeneration）及び家族性の前頭側頭性健忘症とが含まれ、ま
た発生障害も含まれ、その中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候
群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇
、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神
薄弱）、スミス‐マジェニス症候群(Smith- Magenis syndrome)、脊髄形成異常
症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病
及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、Syndenham
舞踏病(Syndenham's chorea)及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無
脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれる。
SECPをコードするポリヌクレオチド配列は、サザーン法やノーザン法、ドットブ
ロット法、或いはその他の膜系の技術、PCR法、ディップスティック（dipstick
）、ピン（pin）、ELISA式アッセイ、及び変異SECPの発現を検出するために患者
から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用することが可能で
ある。このような質的或いは量的方法は、当分野では周知である。

【０２００】 ある実施態様では、SECPをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、特
に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。SECPをコードするヌ
クレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体
の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加える
ことができるであろう。好適な培養期間の後、サンプルを洗浄し、シグナルを定
量して基準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、制御サンプルと較
べて著しく変わっている場合は、サンプル内のSECPをコードするヌクレオチド配
列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセ
イを用いて、動物実験、臨床試験、或いは個人の患者の治療を監視における、特
定の治療効果を推定することが可能である。

【０２０１】 SECPの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、発現の
正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーシ
ョン或いは増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から
抽出された体液或いは細胞と、SECPをコードする配列或いはその断片とを結合さ
せることにより達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被験
者から得た値と周知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実
験からの値とを比較することによって定量可能である。正常なサンプルから得た
標準的な値を、疾患の症状を示す被験者から得た値と比較可能である。基準値と
被験者の値との偏差を用いて罹患しているかどうを決定する。

【０２０２】 疾患の存在が確定され、治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイを通常ベースで繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な
患者に示される値に近づき始めたかどうかを推定することが可能である。繰り返
し行ったアッセイの結果を、数日から数ヶ月の期間の治療の効果を見るのに用い
ることができる。

【０２０３】 癌では、個体からの生体組織における異常な量の転写物が、疾患の発生の素因
を示し、また実際に臨床的症状が出る前に疾患を検出する方法を提供することが
可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法或いは積
極的な治療法を早くから利用して、癌の発生または進行を防ぐことが可能となる
。

【０２０４】 SECPをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への
利用には、PCRの利用が含まれ得る。このようなオリゴマーは、化学的な合成、
酵素を用いた生成、或いはin vitroで生成され得る。オリゴマーは、好ましくは
SECPをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはSECPをコードするポリヌクレ
オチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件の下、特定の遺伝
子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリン
ジェントな条件の下、近縁のDNA或いはRNA配列の検出及び／または定量のため用
いることが可能である。

【０２０５】 或る実施態様において、SECPをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いて、一塩基多型（SNP）を検出し得る。SNPは、ヒ
トの先天性または後天性遺伝病の原因となる場合が多いヌクレオチドの置換、挿
入及び欠失である。限定するものではないが、SNPの検出方法には、一本鎖立体
構造多型（SSCP）及び蛍光SSCP（fSSCP）法が含まれる。SSCPでは、SECPをコー
ドするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリ
メラーゼ連鎖反応（PCR）でDNAを増幅する。このDNAは、例えば病変或いは正常
な組織、生検サンプル、体液等に由来し得る。このDNA内のSNPは、一本鎖形状の
PCR産物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。この差異は非変性ゲル中での
ゲル電気泳動法を用いて検出可能である。fSCCPでは、オリゴヌクレオチドプラ
イマーを蛍光標識することによって、DNAシークエンシング装置などのハイスル
ープット機器でアンプリマー（amplimer）の検出をすることが可能になる。更に
、インシリコSNP（in silico SNP：isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法
は、共通のコンセンサス配列の構築に用いられる個々の重複するDNA断片の配列
を比較することによって、多型を同定することができる。これらのコンピュータ
ベースの方法は、DNA配列クロマトグラムの自動分析及び統計モデルを用いたシ
ークエンシングエラーや研究室でのDNAの調整に起因する配列のばらつきを排除
する。別法では、例えばハイスループットのMASSARRAYシステム（Sequenom, Inc
., San Diego CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。

【０２０６】 SECPの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標識
或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）、及び標準的な
曲線に結果が加えられたものが含まれる（例えば、Melby, P.C.ら(1993) J. Imm
unol. Methods, 159:235-44；Duplaa, C.ら(1993) Anal. Biochem. 229-236を参
照）。多数のサンプルの定量速度は、ハイスループット型のアッセイを用いるこ
とで速くなるであろう。このアッセイでは、目的のオリゴマーやポリヌクレオチ
ドが様々な希釈液中に含まれ、分光光度法或いは非色応答によって定量が迅速で
ある。

【０２０７】 更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列に由来
するオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおける標的と
して用いることができる。マイクロアレイを、上記したように多数の遺伝子の相
対的な発現レベルを同時にモニタリングする転写イメージング技術に用いてるこ
とができる。マイクロアレイはまた、遺伝子変異、突然変異及び多型の同定に用
いることができる。この情報を用いて、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠
を解明し、疾患を診断し、遺伝子発現に関連する疾病の進行／後退をモニタリン
グし、疾患の治療における治療薬の開発や活性のモニタリングを行うことができ
る。特に、患者にとって最適かつ有効な治療法を選択するために、この情報を用
いて患者の薬理ゲノムプロフィールを作成することができる。例えば、患者の薬
理ゲノムプロフィールに基づいて、患者に対して極めて効果的でありながら副作
用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。

【０２０８】 別の実施例では、SECP、SECPの断片、SECPに特異的な抗体をマイクロアレイ上
のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のよう
にタンパク質間相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロファイルをモ
ニタリング及び測定することが可能である。

【０２０９】 特定の実施例は、或る組織または細胞型の転写イメージを生成する本発明のポ
リヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞型に
より遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所定の
条件下で所定の時間に発現した遺伝子の数及び相対存在量を定量することにより
分析される（Seilliamer 他、米国特許第5,840,484号の"Comparative Gene Tran
script Analysis" を参照。この特許に言及することを以って本明細書の一部と
する）。従って、特定の組織または細胞型の転写物または逆転写物の全てに本発
明のポリヌクレオチドまたはその相補配列をハイブリダイズすることにより、転
写イメージが生成され得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたは
その相補配列がマイクロアレイ上に複数のエレメントのサブセットを構成するハ
イスループット型でハイブリダイゼーションさせる。結果として得られる転写イ
メージは、遺伝子活性のプロファイルとなり得る。

【０２１０】 転写イメージは、組織、細胞株、生検サンプル、またはその他の生体サンプル
から単離した転写物を用いて生成し得る。従って、転写イメージは、組織または
生検サンプルの場合にはin vivo、または細胞株の場合にはin vitroにおける遺
伝子発現を反映する。

【０２１１】 本発明のポリヌクレオチドの発現プロファイルを示す転写イメージはまた、合
成化合物または天然化合物の毒性試験のみならず、in vitroモデル系及び薬剤の
前臨床評価に関連して使用され得る。全ての化合物は、作用及び毒性の機構を示
唆する、頻繁に分子フィンガープリント若しくは毒性シグネチャ（signature）
と称されるような特徴的な遺伝子発現パターンを引き起こす（Nuwaysir, E.F.
他 (1999) Mol. Carcinog. 24:15 3-159、Steiner, S. and N.L. Anderson (200
0) Toxicol. Lett. 112-113:467-471、また言及することを以って本明細書の一
部とする）。試験化合物が、毒性を有する既知の化合物のシグネチャと同一のシ
グネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性が高い。フィンガー
プリンまたはシグネチャが、より多くの遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発現
情報を含んでいれば、より有用かつ正確になる。理想としては、発現のゲノム全
域にわたって測定し、最高品質のシグネチャを提供することである。任意の試験
化合物によっても発現が変化しない遺伝子も同様に重要である。それは、これら
の遺伝子の発現レベルを用いて残りの発現データを標準化することができるため
である。標準化処理は、異なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用で
ある。毒性シグネチャのエレメントへの遺伝子機能を割り当てることは毒性機構
の解明に役立つが、毒性の予測につながるシグネチャの統計的な一致には遺伝子
機能の知識は必要ではない（例えば２０００年２月２９日にNational Institute
of Environmental Health Sciencesより発行されたPress Release 00-02を参照
されたい。これについてはhttp://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htmで入
手可能である）。従って、毒性シグネチャを用いる毒性スクリーニングにおいて
、全ての発現した遺伝子配列を含めることは重要でありまた望ましいことである
。

【０２１２】 一実施例では、試験化合物の毒性は、核酸を含有する生体サンプルをその試験
化合物で処理して評価する。処理した生体サンプル中で発現した核酸は、本発明
のポリヌクレオチドに特異的な１若しくは複数のプローブでハイブリダイズさせ
、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量すること
ができる。処理した生体サンプル中の転写レベルを、非処理生体サンプル中のレ
ベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差が、処理されたサンプル中で試験
化合物が引き起こす毒性反応を示唆する。

【０２１３】 別の実施例は、本発明のポリペプチド配列を用いて組織または細胞型のプロテ
オームを分析することに関連する。「プロテオーム」という用語は、或る特定の
組織または細胞型におけるタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオー
ムを構成する各タンパク質は、個々に更なる分析をすることができる。プロテオ
ーム発現パターン即ちプロファイルは、所定の条件下で所定の時間に発現したタ
ンパク質の数及びそれらの相対的な存在量を定量することにより分析する。従っ
て、ある細胞のプロテオームのプロファイルは、特定の組織または細胞型のポリ
ペプチドを分離及び分析することにより作成し得る。或る実施例では、このよう
な分離は２次元ゲル電気泳動によって行う。この２次元ゲル電気泳動法では、ま
ず、１次元の等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、次に、２
次元のドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に従って分離す
る（前出のSteiner and Anderson）。これらのタンパク質は、通常クーマシーブ
ルーまたはシルバーまたは蛍光染色などの染色剤を用いてゲルを染色して、分散
した個別の位置にあるスポットとしてゲル中で可視化される。各タンパク質スポ
ットの光学密度は、通常サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサン
プル、例えば試験化合物または治療薬で処理済みまたは未処理のいずれかの生体
サンプルから得られる等位置にあるタンパク質スポットの光学密度を比較し、処
理に関連するタンパク質スポット密度の変化を調べる。スポット内のタンパク質
は、例えば化学的または酵素的に切断した後、質量分析する標準的な方法を用い
て部分的にシークエンシングする。スポット内のタンパク質の同一性は、好適に
は少なくとも５個の連続するアミノ酸残基であるその部分的な配列を、本発明の
ポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的な
タンパク質同定のための更なる配列が得られる。

【０２１４】 プロテオームのプロファイルは、SECPに特異的な抗体を用いてSECP発現レベル
を定量することによっても作成可能である。或る実施例では、マイクロアレイ上
のエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝露して各アレイ
エレメントへのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベ
ルを定量する（Lueking, A. ら. (1999) Anal. Biochern. 270:103-111、Mendoz
e, L.G. ら. (1999) Biotechniques 27:778-788）。検出は当分野で既知の様々
な方法で行うことができ、例えば、チオール反応性またはアミノ反応性蛍光化合
物を用いてサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイエレメントにおける蛍
光結合の量を検出し得る。

【０２１５】 プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であ
り、転写レベルでの毒性シグネチャと並行して分析するべきである。或る組織に
おける或るタンパク質では、転写物の存在量とタンパク質の存在量との相関性が
低いことがあるため（Anderson, N.L. and J. Seilhamer (1997) Electrophores
is 18:533-537）、プロテオーム毒性シグネチャは、転写イメージにはそれ程影
響しないがプロテオームのプロファイルを変化させる化合物の分析において有用
たり得る。更に、体液中での転写の分析は、mRNAが急速に分解するため困難であ
る。しがたがって、このような場合にはプロテオームのプロファイル作成はより
信頼でき、情報価値がある。

【０２１６】 別の実施例では、試験化合物の毒性は、タンパク質を含む生体サンプルをその
試験化合物で処理して評価する。処理された生体サンプル中で発現したタンパク
質を分離して、各タンパク質の量が定量できるようにする。各タンパク質の量を
、未処理生体サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプル中の
タンパク質の量の差は、処理されたサンプル中の試験化合物に対する毒性反応を
示唆する。個々のタンパク質は、それらのアミノ酸残基をシークエンシングし、
これらの部分配列を本発明のポリペプチドと比較することで同定する。

【０２１７】 別の実施例では、試験化合物の毒性は、タンパク質を含む生体サンプルをその
試験化合物で処理することにより評価する。生体サンプルから得たタンパク質を
、本発明のポリペプチドに特異的な抗体と共にインキュベートする。その抗体に
より認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生体サンプル中のタンパ
ク質の量を、未処理生体サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルの
タンパク質量の差が、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示唆する
。

【０２１８】 当分野で周知の方法でマイクロアレイを準備して使用し、分析する。(例えば
、Brennan, T.M. 他 (1995) 米国特許第5,474,796号;Schena, M. 他 (1996) Pro
c. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619; Baldeschweiler 他(1995) PCT出願番号W
O95/251116; Shalon, D.他 (1995) PCT出願番号WO95/35505; Heller, R.A. 他(1
997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155; 及び Heller, M.J. 他 (1997) 米
国特許第5,605,662号を参照)。様々なタイプのマイクロアレイが周知であり、詳
細については、DNA Microarrays: A Practical Approach, M. Schena, ed. (199
9) Oxford University Press, Londonに記載されている。また、この文献を引用
することを以って本明細書の一部とする。

【０２１９】 本発明の別の実施例ではまた、SECPをコードする核酸配列を用いて、天然のゲ
ノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製す
ることが可能である。コーディング配列または非コーディング配列の何れかを用
いることができるが、或る例では、コーディング配列より非コード配列が好まし
い。例えば、多重遺伝子ファミリーのメンバー間にコーディング配列が保存され
ていることにより、染色体マッピング時に望ましくない交差ハイブリダイゼーシ
ョンが生じる可能性がある。この配列は、特定の染色体、染色体の特定領域また
は人工の染色体、例えば、ヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細
菌人工染色体（BAC）、細菌P1産物、或いは単一染色体cDNAライブラリに対して
マッピングされる（Harrington, J.J. ら (1997) Nat Genet. 15:345-355、Pric
e, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127-134、Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:
149-154等を参照）。一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて、例え
ば病状の遺伝と特定の染色体領域やまたは制限断片長多型（RFLP）の遺伝とが相
関するような遺伝子連鎖地図を作成可能である（Lander, E.S. and D. Botstein
(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353-7357を参照）。

【０２２０】 in sit蛍光ハイブリダイゼーション（FISH）は、他の物理的及び遺伝子地図デ
ータと相関し得る（例えば、Heinz-Ulrich, 他による(1995) in Meyers, 前出,
pp. 965-968を参照）。遺伝子地図データの例は、種々の科学誌あるいはOnline
Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のワールドワイドウェブのサイトで見付
けることができる。物理的な染色体地図上のSECPをコードする遺伝子の位置と特
定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に対する素因が、このような疾患と関連
するDNA領域の決定に役立つため、更なる位置を決定するクローニングが行われ
る。

【０２２１】 染色体標本のin sitハイブリダイゼーション、及び確定した染色体マーカーを
用いた結合分析などの物理的マッピング技術を用いて、遺伝子地図を拡張するこ
ともできる。マウスなどの別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置させることに
より、たとえ正確なヒト染色体の位置が分かっていなくても、関連するマーカー
が明らかになる場合が多い。この情報は、位置クローニング或いは別の遺伝子発
見技術を用いて遺伝的疾患の研究をしている研究者にとって価値がある。疾患や
症候群に関与する１つ或いは複数の遺伝子の位置が、例えば血管拡張性失調症の
11q22-23などの特定の遺伝子領域に遺伝子結合によって大まかに決定されると、
その領域に対するどの配列マッピングも、さらなる調査のための関連する遺伝子
或いは調節遺伝子を表す（例えば、Gatti, R.A.他による（1988）Nature 336:57
7-580を参照）。また、目的の本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、保
有者、即ち感染者の間の、転位置、反転などによる染色体位置の違いを検出する
こともある。

【０２２２】 本発明の別の実施例では、SECP、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそ
のオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のラ
イブラリのスクリーニングに用いることができる。このようなスクリーニングに
用いる断片は、溶液に遊離、固体支持物に固定、細胞の表面上に保持、或いは細
胞内に存在する。SECPと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定しても
よい。

【０２２３】 薬剤スクリーニングに用いる別の方法は、目的のタンパク質に対して、好適な
結合親和性を有する化合物のスクリーニング処理能力を高めるために用いられる
（例えば、Geysen,他による(1984) PCT出願番号 WO84/03564を参照）。この方法
では、相当な数の異なる小さな試験用化合物が、プラスチックピン或いは他の基
板の上に合成される。試験用化合物は、SECP、或いはその断片と反応してから洗
浄される。次ぎに、結合されたSECPが、当分野で周知の方法で検出される。精製
されたSECPはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられるプレー
ト上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いて、ペプチドを
捕らえ、固体支持物に固定することもできる。

【０２２４】 別の実施例では、SECPと結合可能な中和抗体がSECPと結合するため試験用化合
物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。
この方法では、抗体が、SECPと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチド
の存在も検出する。

【０２２５】 別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にSECPをコードするヌクレオチド
配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特異
的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提供
することができる。

【０２２６】 当分野の技術者であれば、更なる説明がなくても前述の説明だけで最大限に本
発明を利用できるであろう。したがって、以下に記載する特定の好適な実施例は
、例示目的であって本発明を限定するものではない。

【０２２７】 前述した及び以下に記載する全ての特許出願、特許、刊行物、特に米国特許出
願第60/176,113号、同第60/177,333号、同第60/178,832号、同第60/179,774号、
および同第60/186,792号に言及することをもって本明細書の一部とする。

【０２２８】 （実施例） １ cDNAライブラリの作製 インサイトcDNAはLIFESEQ GOLD データベース (Incyte Genomics, Palo Alto
CA)に含まれているcDNAライブラリに由来し、表４の列５に示されている。まず
、組織の一部をホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解
する一方、この組織の別の一部をホモジナイズしてフェノールに溶解するか、或
いはTRIZOL (Life Technologies)、グアニジニウムイソチオシアネート及びフェ
ノールの単相溶液などの好適な変性剤の混合液に溶解した。この溶解物を塩化セ
シウムにおいて遠心分離によって、或いはクロロホルムで抽出した。イソプロパ
ノール或いは酢酸ナトリウムのどちらかとエタノール、或いは別の方法でこの溶
解物からRNAを沈殿させた。

【０２２９】 RNAの純度を高めるためにRNAのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰
り返した。場合によっては、DNA分解酵素でRNAを処理する。殆どのライブラリで
は、オリゴd(T)連結常磁性粒子(Promega)またはOLIGOTEXラテックス粒子(QIAGEN
. Valencia CA)、OLIGOTEX mRNA精製キット(QIAGEN)を用いてポリ（A＋）RNAを
単離した。別法では、POLY(A)PURE mRNA精製キット(Ambion, Austin TX)などの
別のRNA単離キットを用いて組織溶解物から直接単離した。

【０２３０】 ある場合には、Stratagene社にRNAを提供し、Stratagene社が対応するcDNAラ
イブラリを作製した。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム(Stratagene)
またはSUPERSCRIPT プラスミドシステム(Life Technologies)を用いて当分野で
周知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成してcDNAライブラリを作製した。
(例えば、Ausubel, 1997,前出,ユニット5.1-6.6を参照)。逆転写は、オリゴd(T)
またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプタ
ーを二本鎖cDNAに結合させてから、好適な１つの制限酵素或いは複数の制限酵素
でcDNAを消化した。殆どのライブラリでは、SEPHACRYL S 1000または SEPHAROSE
CL2B、SEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィー(Amersham Pharmacia Biotech
)、アガロースゲル電気泳動法によってcDNAの大きさ（300〜1000bp）を選択した
。PBLUESCRIPTプラスミド(Stratagene)またはpSPORT1プラスミド(Life Technolo
gies)、pcDNA2.1プラスミド(Invitrogen Carlsbad CA)、PBK-CMVプラスミド（St
ratagene）、plNCYプラスミド(Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto CA)若しく
はその誘導体などの好適なプラスミドのポリリンカーの適合性制限酵素部位にcD
NAを結合させた。この組換えプラスミドを、Stratagene社のXL1-Blue, XL1-BIue
MRF、SOLRを含むE.coli細胞、またはLife Technologies社のDH5αまたはDH 10B
、ELECTROMAX DH 10Bを含むコンピテント大腸菌細胞に導入し組み込んだ。

【０２３１】 ２ cDNAクローンの単離 上記実施例１に記載したように得たプラスミドを、UNIZAPベクターシステム(S
tratagene)或いは細胞溶解を利用したin vivo切除によって宿主細胞から回収し
た。MagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム(Promega)、及びAGTC Minip
rep精製キット(Edge Biosystems, Gaithersburg MD)、QIAGEN社のQIAWELL 8 Pla
smid、QIAWELL 8 Plus Plasmid、QIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、REAL
Prep 96プラスミドキットの内の少なくとも１つを用いてプラスミドを精製した
。沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾
燥しないで４℃で保管した。

【０２３２】 別法では、ハイスループットの直接結合PCR法によって宿主細胞溶解物からプ
ラスミドDNAを増幅した。(Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1-14)。宿主
細胞の溶解及び熱サイクリング過程を単一反応混合液で行った。サンプルを処理
してから３８４−ウェルプレートに移して保管し、増幅したプラスミドDNAの濃
度をPICOGREEN色素(Molecular Probes, Eugene OR)及びFluoroskan II蛍光スキ
ャナ(Labsystems Oy, Helsinki, Finland)を用いて蛍光定量的に測定した。

【０２３３】 ３ シークエンシング及び分析 実施例２に記載したようにプラスミドから回収したインサイトcDNAを、以下に
示すようにシークエンシングした。cDNAのシークエンシング反応は標準的な方法
で行うか、またはHYDRAマイクロディスペンサー(Robbins Scientific)或いはMIC
ROLAB 2200 (Hamilton) 液体移送装置と共にABI CATALYST 800 (PE Biosystems)
サーマルサイクラー或いはPTC-200 thermal cycler (MJ Research)などのハイ
スループット装置を用いて行った。cDNAのシークエンシング反応は、Amersham P
harmacia Biotech社の試薬、またはABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequen
cing ready reactionキット(PE Biosystems)などのABIシークエンシングキット
に含まれる試薬を用いて行った。cDNAシークエンシングの反応物の電気泳動的に
よる分離及び標識したポリヌクレオチドの検出は、MEGABACE 1000 DNAシークエ
ンシングシステム(Molecular Dynamics)、標準ABIプロトコル及び塩基対呼び出
しソフトウェアを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム(PE
Biosystems)、または当分野で周知のその他の配列解析システムを用いて行った
。cDNA配列内の読み枠は、標準的な方法(Ausubel, 1997, 前出, unit 7.7)を用
いて決定した。cDNA配列の幾つかを選択して、実施例８に記載した方法で配列を
伸長した。

【０２３４】 インサイトcDNAに由来する本ポリヌクレオチド配列の確認は、BLAST、動的プ
ログラミング、およびジヌクレオチドの分布による解析（dinucleotide nearest
neighbor analysis）に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクタ
ー、リンカー、およびポリＡ配列を取り除き、更にあいまいな塩基対をマスクす
ることで行った。次に、インサイトcDNA配列およびそれらの翻訳を、公共のデー
タベースであるGenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物、および真核生
物のデータベース、およびBLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM、およびPFAMなどの隠
れマルコフモデル（HMM）を基にしたタンパク質ファミリーのデータベースから
選択した配列に対して問合せた（HMMは、遺伝子ファミリーのコンセンサス主構
造を分析する確率的手法である。例えば、Eddy, S. R. (1996) Curr. Opin. Str
uct. Biol. 6 : 361-365を参照）。このような問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS
、およびHMMRに基づいたプログラムを用いて行った。インサイトcDNA配列を組み
立てて、完全長ポリヌクレオチド配列を作製した。或いは、GenBank cDNAs、Gen
Bank EST、ステッチ配列（stitched sequence）、ストレッチ配列（stretched s
equences）、またはGenscan-推定コード配列（実施例４および５を参照）を用い
て、インサイトcDNA群を完全長の配列に伸長した。配列の組み立ては、Phred、P
hrap、およびConsedに基づいたプログラムを用いて行い、GeneMark、BLAST、お
よびFASTAに基づいたプログラムを用いてcDAN群をスクリーニングし、オープン
リーディングフレームを決定した。これらの完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳
して対応する完全長ポリペプチド配列を得た。次に、これらのポリペプチド配列
をGenBankタンパク質データベース（genpept）、SwissProt、BLOCKS、PRINTS、D
OMO、PRODOM、Prosite、およびPFAMなどの隠れマルコフモデル（HMM）に基づい
たタンパク質ファミリーデータベースに対して問合せて分析した。こられの完全
長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PRO ソフトウェア（Hitachi Softwa
re Engineering, South San Francisco CA）およびLASERGENEソフトウェア（DNA
STAR）を用いて分析した。ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列のアラ
インメントを、アライメントした配列間のパーセント同一性も計算するMEGALIGN
マルチシークエンスアラインメントプログラム（DNASTAR）に組み込まれたCLUST
ALアルゴリズムによって指定されたデフォルトパラメータを用いて作成した。

【０２３５】 表７は、インサイトcDNAの組み立ておよび完全長配列の分析に利用したツール
、プログラム、およびアルゴリズム、並びにそれらの説明、引用文献、閾値パラ
メーターを簡単に示す。表７の列１は用いたツール、プログラム、およびアルゴ
リズム、列２はそれらの簡単な説明、列３は引用することで本明細書の一部とし
た引用文献、列４の記載されている部分は２つの配列の一致の程度を評価するた
めに用いたスコア、確率値、およびその他のパラメータを示す（スコアが高くな
れば高くなるほど即ち確率値が低ければ低いほど、配列間の相同性が高くなる）
。

【０２３６】 完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の組み立て及び分析に用
いる上記のプログラムは、SEQ ID NO:11−20のポリヌクレオチド配列断片の同定
にも利用できる。ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約２０〜約
４０００ヌクレオチドの断片を表４の列４に示した。

【０２３７】 ４ ゲノムDNA由来のコード配列の同定および編集 推定分泌性蛋白は、公共のゲノム配列データベース（例えば、gbpriやgbhtg）
においてGenscan遺伝子同定プログラムを実行して初めに同定された。Genscanは
、様々な生物に由来するゲノムDNA配列を分析するための汎用遺伝子同定プログ
ラムである（Burge, C. および S. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268 : 78-94
、Burge, C. および S. Karlin (1998) Curr. Opin. Struct. Biol. 8 : 346-35
4を参照）。このプログラムは推定エキソンを連結して、メチオニンから停止コ
ドンまで伸長した組み立てcDNA配列を構築する。Genscanにより得られる配列は
、FASTAデータベースのポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列になる。G
enscanによって一回で解析できる配列の最大長さは３０kbに設定されている。こ
れらのGenscan推定cDNA配列の内、どの配列が分泌性蛋白をコードするかを決定
するために、コードされたポリペプチドをPFAMモデルにおいて分泌性蛋白につい
て問合せて分析した。潜在的な分泌性蛋白が、分泌性蛋白としてアノテーション
が付けられたインサイトcDNA配列に対する相同性を基に同定された。次に、これ
らの選択されたGenscan推定配列を、BLAST解析を用いてgeneptおよびgbpri公共
データベースの配列と比較した。必要に応じて、Genscan推定cDNA配列を、genep
tにおいてBLASTで最もヒットした配列と比較して、Genscan推定配列における余
分なエキソンや省いてしまったエキソンなどのエラーを修正し、編集した。BLAS
T解析を用いてGenscan推定cDNA配列を含むインサイトcDNAまたは公共のcDNAを見
つけ出すことにより、転写の証拠が得られる。インサイトcDNAがGenscan推定cDN
A配列を含む場合、この情報を用いてGenscan推定配列を修正或いは確認できる。
完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に説明した組み立て方法でGenscan推
定コード配列とインサイトcDNAおよび／または公共のcDNA配列を組み立てて作製
した。また、完全長ポリヌクレオチド配列は、最終的には、編集および編集され
ていないGenscan推定配列に由来した。

【０２３８】 ５ ゲノム配列データとcDNA配列データとの組み立て ステッチ配列（Stiched Sequence） 部分的なcDNA配列を、実施例４に記載したGenscan遺伝子同定プログラムによ
って推定されたエキソンで伸長した。実施例３に記載されたように組み立てられ
た部分的なcDNAをゲノムDNAにマッピングし、関連するcDNAおよび１或いは複数
のゲノム配列に由来する関連する推定Genscanエキソンを含む複数のクラスター
に入れた。各クラスターを、グラフ理論および動的計画法に基づいたアルゴリズ
ムを用いて、cDNAおよびゲノム情報を統合して分析し、後に確認される潜在的な
スプライスバリアントを生成し、編集或いは伸長して完全長の配列を作製した。
或るクラスターの２つ以上の配列に或る区間の全長が存在する配列区間を同定し
、推移（transitivity）により同定した区間を同等と考える。例えば、或る区間
がcDNAおよび２つのゲノム配列のそれぞれに存在する場合、これら３つ全ての区
間を同等と考える。この方法によって、関連しないが連続するゲノム配列をcDNA
配列によって繋ぎ１つにする。このようにして同定された区間を、親配列（pare
nt sequence）に沿って現われるようにステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可
能な最も長い配列および変異配列を作製する。或るタイプ（cDNAとcDNA、または
ゲノム配列とゲノム配列）の親配列に沿って連結される区間と区間との繋ぎ合わ
せは、親配列のタイプが異なる（cDNAとゲノム配列）連結より好ましい。得られ
たステッチ配列を翻訳し、BLAST解析でgenpeptおよびgbpri公共データベースに
おける配列と比較した。Genscanによって推定された不適当なエキソンを、genep
tにおいてBLASTで最もヒットした配列と比較して修正する。このような配列を更
なるcNDA配列で伸長し、必要に応じてゲノムDNAで検査した。

【０２３９】 ストレッチ配列（Stretched Sequence） 部分的なDNA配列をBLAST解析に基づいたアルゴリズムで完全長に伸長した。ま
ず、実施例３に記載したように組み立てた部分的なcDNAを、BLASTプログラムを
用いてGenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物、および真核生物のデー
タベースなどの公共のデータベースに対して問い合わせた。次に、GenBankの相
同性の最も高いタンパク質を、実施例４に記載したインサイトcDNA或いはGenSca
nエキソン推定配列の何れかと比較した。得られた複数の高スコアのセグメント
対（HSP）を用いてキメラタンパク質を作製し、GenBnakの相同タンパク質上に翻
訳した配列をマッピングした。元のGenBnakの相同タンパク質に対して、キメラ
タンパク質に挿入や欠失が起こり得る。公共のヒトゲノムデータベースから相同
ゲノム配列を探し出すために、GenBnakの相同タンパク質およびキメラタンパク
質の両方をプローブとして用いた。このようにして、部分的なDNA配列を相同ゲ
ノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。完全な遺伝子を含んでいる
か得られたストレッチ配列を検査した。

【０２４０】 ６ SECPをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング SEQ ID NO:11−20を組み立てるために用いた配列を、BLAST及びSmith-Waterma
nアルゴリズムを用いて、インサイトLIFESEQデータベース及び公共のドメインデ
ータベースの配列と比較した。SEQ ID NO:11−20と一致するこれらのデータベー
スの配列を、Phrap（表７）などの構築アルゴリズムを使用して、連続及び重複
した配列のクラスターに組み入れた。Stanford Human Genonse Center (SHGC)、
Whitehead Institute for Genome Research (WIGR)及びGenethonなどの公共の情
報源から入手できる放射線ハイブリッド（radiation hybrid）及び遺伝子マッピ
ングのデータを用いて、クラスター化した配列がすでにマッピングされているか
を調べる。クラスターにマッピングされた配列が含まれている場合は、そのクラ
スターの全ての配列（特定のSEQ ID NOを含む）をそのマッピング位置に割り当
てた。

【０２４１】 遺伝子地図の位置は、範囲、区間、またはヒト染色体によって表される。セン
チモルガンで示したマッピング位置の範囲は、染色体の短腕（p）の末端から測
定した（センチモルガン（cM）は、同一染色体上の遺伝子間の乗換え率に基づい
た距離を表す単位である。平均すると、１cMはヒトの染色体の１メガベースに概
ね等しいいが、組換え率の高い部分と低い部分があるため、大きく変化し得る）
。距離cMは、配列がそれぞれのクラスターに含まれている放射線ハイブリッドマ
ーカーの境界を検出できるGenethonによってマッピングされた遺伝子マーカーに
基づいている。NCBI「GeneMap99」（http://www.ncbi.nlm.nih.gpv/genemap）な
どの公衆が入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、上記し
た区間が既に同定されている疾患遺伝子マップ内若しくは近傍に位置するかを決
定できる。

【０２４２】 ７ ポリヌクレオチド発現の分析 ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技
術であり、特定の細胞種或いは組織からのRNAが結合されている膜への標識され
たヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う(例えば、Sambrook,前出,
7章; 及び Ausubel. F.M. 他、前出, 4章及び16章を参照)。

【０２４３】 BLASTに用いる類似のコンピュータ技術を用いて、GenBank或いはLIFESEQ（Inc
yte Pharmaceuticals）のようなcDNAデータベース内の同一或いは関連する分子
を検索する。この分析は多くの膜系ハイブリダイゼーションより非常に速度が速
い。さらにコンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の一致が、厳密な一
致或いは相同的一致の何れかとして分類されるかを確定することができる。検索
の基準は、

【数１】 として定義される積スコアである。積スコアは、０〜１００の標準化された値で
あり、以下のように求める。BLASTスコアにヌクレオチド配列の一致率を乗じ、
その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除する。高スコアのセグメントの対
（HSP）において一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不適性塩基対に
−４を割り当てることにより、BLASTスコアを計算する。２つの配列は、２以上
のHSPを共有し得る（ギャップにより離隔される）。２以上のHSPがある場合には
、最高BLASTスコアの塩基対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、BLASTア
ラインメントの断片的重複と質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、
比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合にのみ
得られる。積スコア７０は、１００％の一致で一端が７０％重畳しているか、或
いは８８％一致で他端が１００％重畳しているかの何れかの場合である。積スコ
ア５０は、１００％の一致で一端が５０％重畳しているか、或いは７９％の一致
で他端が１００％重畳しているかの何れかの場合である。

【０２４４】 或いは、SECPをコードするポリヌクレオチド配列は、由来する組織に対して分
析する。例えば、ある完全長の配列は、少なくとも部分的にインサイトcDNA配列
をオーバーラップさせて組み立てられる（実施例３を参照）。各cDNA配列は、ヒ
ト組織から作製されたcDNAライブラリに由来する。各ヒト組織は、心血管系、結
合組織、消化系、胚構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖
細胞、血液および免疫系、肺、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器官、
皮膚、顎口腔系、分類不能／混合、または尿管などの１つの生物／組織のカテゴ
リーに分類される。各カテゴリーにおけるライブラリの数をカウントし、その合
計数を全カテゴリーのライブラリ数で除す。同様に、各ヒト組織は、癌、細胞系
、発生、炎症、神経、外傷、心血管、プール（pooled）などの１つの疾患／症状
のカテゴリーに分類され、各カテゴリーにおけるライブラリの数をカウントし、
その合計数を全カテゴリーのライブラリ数で除す。得られるパーセンテージは、
SECPをコードするcDNAの疾患特異的な発現を反映する。cDNA配列およびcDNAライ
ブラリ／組織の情報は、LIFESEQ GOLD データベース（Incyte Genomics, Palo A
lto CA）から得ることができる。

【０２４５】 ８ SECPをコードするポリヌクレオチドの伸長 完全長のポリヌクレオチド配列は、完全長分子の好適な断片から設計したオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いてその完全長分子の好適な断片を伸長して作製
した。一方のプライマーは既知の断片の５'の伸長を開始するために合成し、他
方のプライマーは既知の断片の３'の伸長を開始するために合成した。開始プラ
イマーは、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）或いは他の適切な
プログラムを用いて、約２２個から約３０個のヌクレオチドの長さで約５０％以
上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするよう
に設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体が生じないように
ヌクレオチドを伸長した。

【０２４６】 選択されたヒトcDNAライブラリを用いてこの配列を伸長した。２段階以上の伸
長が必要な場合、若しくは望ましい場合は、追加或いはネスト化プライマーの組
を設計する。

【０２４７】 当分野で既知の方法を利用したPCR法で高い忠実度で増幅した。PCRはPTC-200
thermal cycler (MJ Research, Inc.)用いて96ウェルブロックプレートで行った
。反応混合液は、鋳型DNA及び200 nmolの各プライマー、Mg^２+と(NH₄)₂SO₄とβ
−メルカプトエタノールを含むバッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pha
rmacia Biotech)、ELONGASE酵素(Life Technologies)、Pfu DNAポリメラーゼ(St
ratagene)を含む。プライマーの組、PCI AとPCI Bに対して以下のパラメーター
で増幅を行った。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ６０℃で１分間 ステップ４ ６８℃で２分間 ステップ５ ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す ステップ６ ６８℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管 別法では、プライマーの組、T7とSK+に対して以下のパラメーターで増幅を行っ
た。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ５７℃で１分間 ステップ４ ６８℃で２分間 ステップ５ ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す ステップ６ ６８℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管。

【０２４８】 各ウェルのDNA濃度は、１X TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した
100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25% (v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugen
e OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Coming Costar, Acton MA)の各ウェルに分
配してDNAが試薬と結合できるようにして測定する。このプレートをFluoroskan
II (Labsystems Oy, Helsinki, Finland)でスキャンして、サンプルの蛍光を計
測してDNAの濃度を定量化する。反応混合物の5〜10μlのアリコットを１％のア
ガロースミニゲル上での電気泳動によって解析し、何れの反応物が配列を伸長す
ることに成功したかを決定する。

【０２４９】 伸長したヌクレオチドを脱塩及び濃縮してから384ウェルプレートに移し、Cvi
JIコレラウィルスエンドヌクレアーゼ(Molecular Biology Research, Madison W
I)で消化し、pUC 18ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)に再連結する前に音
波処理またはせん断を行った。ショットガンシークエンシングのために、消化し
たヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上に分離して断
片を切断し、寒天をAgar ACE (Promega)で消化した。T4リガーゼ(New England B
iolabs, Beverly MA)を用いて伸長したクローンをpUC 18ベクター(Amersham Pha
rmacia Biotech)に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)で制限部位の延
び出しを処理してコンピテント大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を
選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2Xカ
ルベニシリン培養液の384ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。

【０２５０】 細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu
DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ６０℃で１分間 ステップ４ ７２℃で２分間 ステップ５ ステップ２、３、及び４を２９回繰り返す ステップ６ ７２℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管。 上記したようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量化した。DNA回収
率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを20％のジメチル
サルホサイド（dimethysulphoxide）(1:2, v/v)で希釈し、DYENAMIC DIRECTキッ
ト(Amersham Pharmacia Biotech)またはABI PRISM BIGDYE Terminator cycle se
quencing ready reactionキット(Applied Biosystems)を用いてシークエンシン
グした。

【０２５１】 同様に上述の手順で、完全長のポリヌクレオチド配列を検査したり、或いは完
全長のポリヌクレオチド配列を利用して、この伸長のために設計したオリゴヌク
レオチドと好適なゲノムライブラリを用いて５′調節配列を得た。

【０２５２】 ９ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用法 SEQ ID NO:11−20から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて
、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約２０塩基対からなる
オリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大きなcDNAフラグメントの
場合でも基本的に同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO4.06ソフト
ウェア（National Bioscience）のような最新式のソフトウェアを用いてデザイ
ンし、50pmolの各オリゴマーと、250μCiの[γ‐^３２Ｐ]アデノシン三リン酸（A
mersham, Chicago, IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN、Bost
on MA）とを組み合わせて用いることにより標識する。標識されたオリゴヌクレ
オチドを、SEPHADEX G-25超精細排除デキストランビードカラム（Amersham Phar
macia Biotech）を用いて実質的に精製する。毎分１０^７カウントの標識された
プローブを含むアリコットを、次のエンドヌクレアーゼ、Ase I、Bgl II、Eco R
I、Pst I、Xba1或いはPvu II（DuPont NEN）の１つを用いて切断したヒトゲノム
DNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において用いる。

【０２５３】 各切断物からのDNAを、0.7％アガロースゲル上で分画して、ナイロン製メンブ
ラン（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に転写する。ハイブリ
ダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くた
め、例えば、最大０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸
ナトリウムの条件の下、ブロットを順次室温にて洗浄する。ハイブリダイゼーシ
ョンパターンをオートラジオグラフィー或いは別のイメージ化手段で視覚化して
比較する。

【０２５４】 １０ マイクロアレイ マイクロアレイ上のアレイエレメントの連結または合成は、フォトリソグラフ
ィ、ピエゾプリント（インクジェットプリンター、前出のBaldeschweiler等を参
照）、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて
達成することが可能である。上記各技術において基板は、均一な非多孔性の固体
とするべきである（Schena (1999).前出）。推奨する基板には、シリコン、シリ
カ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。別法では、ドッ
トブロット法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱や紫外線
、または化学的或いは機械的な結合手段で基板の表面にエレメントを配置して結
合させることができる。通常のアレイは利用可能な方法や機械を用いて作製でき
、任意の適正な数のエレメントを含めることができる（Schena, M. 他 (1995) S
cience 270:467-470、Shalon. D. 他 (1996) Genome Res. 6:639-645、Marshall
, A. and J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31.を参照）。

【０２５５】 完全長cDNA、発現遺伝子配列断片（EST）、或いはそれらの断片やオリゴマー
が、マイクロアレイのエレメントとなり得る。ハイブリダイゼーションに好適な
断片やオリゴマーを、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）などの当分野で周知の
ソフトウェアを用いて選択することが可能である。このアレイエレメントを、生
体サンプル中のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせる。生体サンプル中のポ
リヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識またはその他の分子タグに
結合する。ハイブリダイゼーションの後、生体サンプルからハイブリダイズしな
かったヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントにおけ
るハイブリダイゼーションを検出する。別法では、レーザー脱離及び質量スペク
トロメトリーを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ
上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの相補性の程度及び相
対的存在量は、算定することができる。一実施例におけるマイクロアレイの調整
及び使用について、以下に詳述する。

【０２５６】 組織または細胞サンプルの調製 グアニジウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全RNAを単離し、オ
リゴ(dT)セルロース法を用いてポリ(A)⁺RNAを精製する。各ポリ(A)⁺RNAサンプル
は、MMLV逆転写酵素、０.０５ pg/μlのオリゴ(dT)プライマー（21mer）、１×
第１鎖緩衝液、０.０３単位/μlのRNアーゼインヒビター、５００μM dATP、５
００μM dGTP、５００μM dTTP、４０μM dCTP、４０μM dCTP-Cy3（BDS）また
はdCTP-Cy5（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて逆転写する。この逆転写反
応は、GEMBRIGHTキット（Incyte）を用いて、200 ngのポリ(A)⁺RNAを含む25 ml
容量で行う。特異的なコントロールポリ(A)⁺RNAは、in vitro転写により非コー
ディング酵母ゲノムDNAから合成する。３７０℃で２時間インキュベートした後
、各反応サンプル（一方はCy3標識、他方はCy5標識）は、２.５mlの０.５M 水酸
化ナトリウムで処理し、８５０℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させ
てRNAを変性する。サンプルは、２つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピン
カラム（CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA）を用いて精
製する。結合後、２つの反応サンプルを、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）、６
０mlの酢酸ナトリウム及び３００mlの１００％エタノールを用いてエタノール沈
殿させる。サンプルは次に、SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbrook NY
）を用いて乾燥して仕上げ、１４μl ５×SSC／０.２％ SDS中で再懸濁する。

【０２５７】 マイクロアレイの準備 本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは
、クローン化cDNA挿入断片を含むベクターを含有する細菌性細胞から増幅する。
PCR増幅は、cDNA挿入断片に隣接するベクター配列に相補的なプライマーを用い
る。３０サイクルのPCRによって、１〜２ngの初期量から５μgを超える最終量ま
でアレイエレメントを増幅する。増幅されたアレイエレメントは、SEPHACRYL-40
0（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて精製する。

【０２５８】 精製したアレイエレメントを、ポリマーコートされたスライドガラス上に固定
する。顕微鏡スライドガラス（Corning）は、処理中及び処理後に大量の蒸留水
での洗浄と、０.１％のSDS及びアセトン中で超音波による洗浄を行う。スライド
ガラスは、４％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation (VWR), W
est Chester PA）中でエッチングし、蒸留水中で広範囲にわたって洗浄し、９５
％エタノール中の０.０５％アミノプロピルシラン（Sigma）でコーティングする
。コーティングしたスライドガラスは、１１０℃の天火で硬化させる。

【０２５９】 米国特許第5,807,522号に記載されている方法を用いて、コーティングしたガ
ラス基板にアレイエレメントを付加する。この特許に引用することを以って本明
細書の一部とする。平均濃度が１００ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを高速
機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント（open capillary
printing element）に充填する。次にこの装置が、スライド毎に約５nlのアレ
イエレメントサンプルを分注する。

【０２６０】 マイクロアレイには、STRATALINKER UVクロスリンカー（Stratagene）を用い
てUV架橋する。マイクロアレイは、室温において０.２％SDSで１回洗浄し、蒸留
水で３回洗浄する。非特異的な結合部位は、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)（Trop
ix, Inc., Bedford MA）における０.２％カゼイン中で６０℃で３０分間マイク
ロアレイをインキュベートし、その後上述したように０.２％SDS及び蒸留水で洗
浄することによってブロックする。

【０２６１】 ハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーション反応液は、５×SSC、０.２％SDSハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液にCy3及びCy5標識したcDNA合成産物を各０.２μg含む９μlのサンプ
ル混合体を含めたものである。サンプル混合液を、６５℃で５分間加熱し、マイ
クロアレイ表面上に一定量分注してから１.８cm² のカバーガラスで覆う。この
アレイを、顕微鏡スライドより僅かに大きいキャビティを有する防水チェンバー
に移す。チャンバーの角に１４０μlの５×SSCを加えて、チャンバー内を湿度10
0%に保持する。このアレイを含むチャンバーを、６０℃で約６．５時間インキュ
ベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×SSC,０.１％SDS）において４５
℃で１０分間、第２洗浄緩衝液中（０.１×SSC）において４５℃で１０分間それ
ぞれ３回洗浄し、その後乾燥させる。

【０２６２】 検出 レポーター標識されたハイブリダイゼーション複合体は、Cy3を励起するため
の４８８nm、及びCy3を励起するための６３２nmのスペクトル線を生成し得るInn
ova 70混合ガス10 Wレーザー（Coherent, Inc., Santa Clara CA）を備えた顕微
鏡で検出する。２０倍の顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用い
て、アレイ上に励起レーザー光を集中させる。このアレイを含むスライドを顕微
鏡のコンピュータ制御X-Yステージに置き、対物レンズを通してラスタスキャン
する。本実施例で用いた１.８cm×１.８cmのアレイは、２０μmの解像度でスキ
ャンする。

【０２６３】 ２つの異なるスキャンにおいて、混合ガスマルチラインレーザーは２つの蛍光
体を連続的に励起する。放射された光は、波長に基づいて２つの蛍光体に対応す
る２つの光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Brid
gewater NJ）に分割される。アレイと光電子増倍管との間に配設された好適なフ
ィルターを用いて信号をフィルタリングする。用いる蛍光体の最大発光は、Cy3
では５６５nm、Cy5では６５０nmである。装置は両方の蛍光体からのスペクトル
を同時に記録できるが、レーザー源に好適なフィルターを用いて、蛍光体１つに
つき１回スキャンし、各アレイを通常２回スキャンする。

【０２６４】 スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるcDNAコントロ
ール種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置
には相補的DNA配列を含め、その位置におけるシグナルの強度がハイブリダイズ
する種の重量比1：100,000に相関するようにする。異なる試料（例えば検査細胞
及びコントロール細胞を代表する）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光体
で標識し、他と異なって発現する遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブ
リダイズさせる場合には、較正は２つの蛍光体を有する較正するcDNAのサンプル
を標識して、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えて行う。

【０２６５】 光電子増倍管の出力は、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールされ
た１２ビットRTI-835Hアナログ−ディジタル（AID）変換ボード（Analog Device
s, Inc., Norwood MA）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデー
タは、リニア２０色変換を用いてシグナル強度が青色（低シグナル）から赤色（
高シグナル）までの擬似カラー範囲にマッピングされるイメージとして表示され
る。データはまた、定量的に分析される。２つの異なる蛍光体を同時に励起して
測定する場合には、各蛍光体の発光スペクトルを用いて、先ずデータは蛍光体間
の光学的漏話（重複発光スペクトルに起因する）に対して補正される。

【０２６６】 グリッドを蛍光シグナルイメージ上に重畳して、各スポットからのシグナルが
グリッドの各エレメントに中央に位置するようにする。各エレメント内の蛍光シ
グナルを統合し、シグナルの平均強度に対応する数値を得る。シグナル分析に用
いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte）である。

【０２６７】 １１ 相補的ポリヌクレオチド SECPをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然の
SECPの発現を低下させるため即ち阻害するために用いられる。約１５〜約３０個
の塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、より小さな或いはよ
り大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Oligo4
.06ソフトウェア（National Biosciences）及びSECPのコーディング配列を用い
て、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特
な５′配列から相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモータ
ーがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補
的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがSECPをコードする転写物に結
合するのを阻害する。

【０２６８】 １２ SECPの発現 SECPの発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行う
ことができる。細菌でSECPが発現するために、抗生物質耐性及びcDNAの転写レベ
ルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニン
グする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節エレメントに関連
するT5またはT7バクテリオファージプロモーター及びtrp-lac(tac)ハイブリッド
プロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。組換えベクター
を、BL21(DE3)などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌
が、イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発されるとSECPを発
現する。真核細胞でのSECPの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般に
バキュロウイスルスとして知られているAutographica californica核多面性ウイ
ルス(AcMNPV)を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子
を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移
のどちらかによって、SECPをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維
持され、強いポリヘドリンプロモータによって高いレベルのcDNAの転写が行われ
る。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda (Sf9)昆
虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後
者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。(例え
ば、Engelhard. E. K.他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227; S
andig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945.を参照)。

【０２６９】 殆どの発現系では、SECPが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)
、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク
質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベース
の精製が素早く１回で行うことができる。Schistosoma japonicumからの２６キ
ロダルトンの酵素GSTによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で
固定されたグルタチオンで融合タンパク質の精製が可能となる(Amersham Pharma
cia Biotech)。精製の後、GST部分を特定の操作部位でSECPからタンパク分解的
に切断できる。アミノ酸８個のペプチドであるFLAGで、市販のモノクローナル及
びポリクローナル抗FLAG抗体(Eastman Kodak)を用いた免疫親和性の精製が可能
となる。６個の連続するヒスチジン残基のストレッチである6-Hisによって、金
属キレート樹脂(QIAGEN)で精製が可能となる。タンパク質の発現及び精製の方法
は、Ausubel (1995,前出, ch 10, 16)に記載されている。これらの方法で精製し
たSECPを直接用いて以下の実施例１６、及び１７のアッセイを行うことができる
。

【０２７０】 １３ 機能のアッセイ SECPの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでの
SECPをコードする配列の発現によって評価する。cDNAを、cDNAを高いレベルで発
現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。
このようなベクターには、pCMV SPORT^TM (Life Technologies.)及びpCR 3.1 (In
vitrogen, Carlsbad, CA)が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモータ
ーを含んでいる。５〜１０μgの組換えベクターを、例えば内皮由来か造血由来
のヒト細胞株にリポソーム製剤或いは電気穿孔法によって一時的に形質移入する
。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時
に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入された細胞と形質移入
されていない細胞とを区別できる。また、標識タンパク質の発現によって、cDNA
の組換えベクターからの発現を正確に予想できる。このような標識タンパク質に
は、緑色蛍光タンパク質(GFP；Clontech)、及びCD64またはCD64-GFP融合タンパ
ク質が含まれる。レーザー光学に基づいた技術を利用した自動流動細胞計測法(F
CM)を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、その
細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。また、FCMで、先行した或
いは同時の細胞死の現象を診断する蛍光分子の取り込みを検出して計量する。こ
れらの現象には、プロピジウムヨウ化物でのDNAの染色によって計測される核DNA
内容物の変化と、ブロモデオキシウリジンの取り込み量の低下によって計測され
るDNA合成の下方調節と、特異的な抗体との反応性によって計測される細胞表面
及び細胞内のタンパンク質の発現の変化と、蛍光複合アネキシンＶタンパク質の
細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とが含まれる。流動細
胞計測法は、Ormerod, M. G.による (1994) Flow Cytometry Oxford, New York,
NY.に記載されている。

【０２７１】 遺伝子発現におけるSECPの影響は、SECPをコードする配列とCD64またはCD64-G
FPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価すること
ができる。CD64またはCD64-GFPは形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グ
ロブリンG(IgG)の保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換さ
れない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビー
ドを用いて分離することができる(DYNAL. Lake Success. NY)。mRNAは、当分野
で周知の方法で細胞から精製することができる。SECP及び目的の他の遺伝子をコ
ードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することがで
きる。

【０２７２】 １４ SECPに特異的な抗体の作製 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE；例えば、Harrington, M.G. (1990)
Methods Enzymol. 1816−3088-495を参照)または他の精製技術で実質的に精製
されたSECPを用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す
。

【０２７３】 別法では、SECPアミノ酸配列をLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて解
析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを
用いて当業者に周知の方法で抗体を生産する。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親
水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で周
知である(例えば、前出のAusubel, 1995,11章を参照)。

【０２７４】 通常、約１５残基の長さのオリゴペプチドを、Applied BiosystemsのABI 431A
ペプチドシンセサイザー（PE Biosystems）を用いてfmoc法のケミストリにより
合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（
MBS）を用いた反応によりKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、
免疫原性を高める(例えば、前出のAusubel, 1995を参照)。フロイントの完全ア
ジュバントにおいてオリゴペプチド−KLH複合体を用いてウサギを免疫化する。
得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗SECP活性を検査するには、ペプチドまた
はSECPを基板に結合し、１％BSAを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と
反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgGと反応させ
る。

【０２７５】 １５ 特異的抗体を用いる天然SECPの精製 天然SECP或いは組換えSECPを、SECPに特異的な抗体を用いるイムノアフィニテ
ィークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは
、CNBr-活性化SEPHAROSE（Amersham Pharmacia Biotech）のような活性化クロマ
トグラフィー用レジンと抗SECP抗体とを共有結合させることにより形成する。結
合の後、そのレジンを製造者の使用説明書に従ってブロッキング処理し洗浄する
。

【０２７６】 SECPを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、SECPを優先的に吸着
できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファー
で）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とSECPとの結合を切るような条
件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン
酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、SECPを回収する。

【０２７７】 １６ SECPと相互作用する分子の同定 SECPまたは生物学的に活性なその断片を、^１２５Ｉボルトンハンター試薬（例
えば、Bolton A.E.及びW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529を参照）で標
識する。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したSE
CPと共にインキュベートし、洗浄して、標識したSECP複合体を有する全てのウェ
ルをアッセイする。様々なSECP濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合
したSECPの数量及び親和性、会合についての値を計算する。

【０２７８】 別法では、SECPと相互作用する分子を、Fields, S.及びO. Song(1989, Nature
340:245-246)に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（yeast two-hybrid syst
em）やMATCHMAKERシステム(Clontech)などの２−ハイブリッドシステムに基づい
た市販のキットを用いて分析する。

【０２７９】 SECPはまた、ハイスループット型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するPA
THCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の２つの
大きなライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定す
ることができる（Nandabalan, K. 他 (2000) 米国特許第6,057,101号）。

【０２８０】 １７ SECPの活性の実証 SECPの成長刺激活性若しくは阻害活性の為のアッセイは、スイスマウスの3T3
細胞におけるDNA合成の量を測定する(McKay, Ｉ. 及び Leigh, I., eds. (1993)
Growth Factors : A Practical Approach, Oxford University Press, New Yor
k, NY)。このアッセイにおいては、SECPの量の変更が、放射性DNA前駆物質であ
る［³H］チミジンの存在中で静止状態3T3培養細胞へと加えられる。このアッセ
イのためのSECPは、組み替え型の手段を用いて得られても良く、また生化学的な
標本より得られても良い。酸−沈殿可能DNAへの［³H］チミジンの混合は、適切
な時間間隔で測定され、混合量は新規に合成されたDNAの量に直接比例する。少
なくとも１００倍のSECP濃度レンジにわたる一次の用量‐応答曲線は、成長調節
活性を示している。ミリリットルあたりの活性の一つのユニットは、５０％の応
答レベルを提供するSECPの濃度として定義される。ここで、１００％の応答レベ
ルは、酸−沈殿可能DNAへの［³H］チミジンの最大の混合を示している。

【０２８１】 代替例として、SECP活性のためのアッセイは、培養細胞中の神経伝達物質の刺
激作用若しくは抑制を測定する。培養CHO繊維芽細胞はSECPに晒されている。エ
ンドサイトーシスのSECP取込に続いて、細胞は新鮮な（fresh）培養液で洗浄さ
れ、アフリカツメガエル筋細胞を固定した全体細胞が、SECPを含まない媒質中の
線維芽細胞の一つと接触して処置される。膜電流は筋細胞より測定される。制御
値に対し増加若しくは減少した電流は、SECPの神経調節性効果を示している(Mor
imoto, T.ら (1995)Neuron 15 : 689-696)。

【０２８２】 代替例として、SECPのADP-リボシル化活性は、タンパク質への放射標識ADP-リ
ボースの混合を用いて測定される。例えば、Barth, Hら(1998 ; J. Biol. Chem.
273 : 29506-11)は、２５マイクログラムの反応バッファ（35 mM HEPES pH 7.
5、 0. 2 mM MgCl₂、 0. 1 mM ジチオスレイトール、 及び0. 5 uM [アデニル酸
-32P] NAD）中、３７℃で１０分間にわたって、約５０マイクログラムのタンパ
ク質を含むヒトの血小板サイトゾルと共に、SECPをインキュベートした。放射標
識タンパク質は11 %のSDS-PAGEで分離され、phorphorimagingによって定量化さ
れた。

【０２８３】 代替例として、SECP活性のアッセイは、分泌性の膜結合細胞小器官におけるSE
CPの量を測定する。上述したように形質移入された細胞が採取され、溶解された
。ライセートは、例えば当業者にショ糖密度勾配超遠心法として知られるような
方法を用いて分別される。そのような方法は、ゴルジ体、ER、小膜結合小胞、及
びその他の分泌細胞小器官のような、細胞内要素の隔離を可能とする。分割され
た細胞ライセート及び全体の細胞ライセートよりの免疫沈降は、SECP特定抗体を
用いて実行され、また免疫沈降サンプルはSDS-PAGE及び免疫ブロット技術を用い
て解析される。全体の細胞ライセートにおけるSECPに対する分泌オルガネラ中の
SECP濃度は、分泌経路を通る通過するSECPの量に比例する。

【０２８４】 当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法
及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。特定の好適な実施例に
基づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当
に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連
する分野の専門家には明らかな、本明細書に記載の本発明の実施例の様々な改変
は、特許請求の範囲に含まれる。

【０２８５】 （表の簡単な説明） 表１は、本発明のポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列に対する系統的
な名称を示す。

【０２８６】 表２は、本発明の各ポリペプチドに最も近いGenBankの相同体のGenBankの識別
番号およびアノテーションを示す。各ポリペプチドとそのGenBankの相同体との
間の一致を表す確率値スコアも示す。

【０２８７】 表３は、推定上のモチーフおよびドメインを含む各ポリペプチド配列の構造的
な特徴、並びに各ポリペプチドの分析に用いた方法、アルゴリズム、および検索
可能なデータベースを示す。

【０２８８】 表４は、各ポリヌクレオチド配列の組み立てに用いたcDNA断片およびゲノムDN
A断片のリスト、並びにポリヌクレオチド配列の選択された断片のリストを示す
。

【０２８９】 表５は、本発明の各ポリヌクレオチドの代表的なcDNAライブラリを示す。

【０２９０】 表６は、表５に示すcDNAライブラリの作製に用いた組織およびベクターを示す
付録である。

【０２９１】 表７は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの分析に用いたツール、
プログラム、及びアルゴリズム、並びにその説明、引用文献、閾値パラメータを
示す。

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【表１０】

【表１１】

【表１２】

【表１３】

【表１４】

【表１５】

【表１６】

【表１７】

【表１８】

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 35/00 ４Ｃ０８４ 29/00 37/00 ４Ｈ０４５ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 37/00 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/53 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ６０／１７８，８３２ (32)優先日 平成12年１月28日(2000．1．28) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１７９，７７４ (32)優先日 平成12年２月２日(2000．2．2) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１８６，７９２ (32)優先日 平成12年３月３日(2000．3．3) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 パターソン、チャンドラ アメリカ合衆国カリフォルニア州94025・ メンロパーク・＃１・シャーウッドウェイ 490 (72)発明者 ワライア、ナリンダー・ケイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94577・ サンレアンドロ・＃205・デービスストリ ート 890 (72)発明者 ニュエン、ダニエル・ビー アメリカ合衆国カリフォルニア州95118・ サンノゼ・リッジウッドドライブ 1403 (72)発明者 ユエ、ヘンリー アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ サニーベイル・ルイスアベニュー 826 (72)発明者 カーン、ファラ・エイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃221・エスケラアベ ニュー 333 (72)発明者 タング、ワイ・トム アメリカ合衆国カリフォルニア州95118・ サンノゼ・ランウィックコート 4230 (72)発明者 ボーグン、マライア・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94577・ サンレアンドロ・サンティアゴロード 14244 (72)発明者 リュ、デュング・アイナ・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州95123・ サンノゼ・コイドライブ 233 (72)発明者 ヤング、ジュンミング アメリカ合衆国カリフォルニア州95129・ サンノゼ・バークレーン 7125 (72)発明者 バーフォード、ニール アメリカ合衆国コネチカット州06422・ダ ラム・ワイルドウッドサークル 105 (72)発明者 オウ−ヤング、ジャニス アメリカ合衆国カリフォルニア州94005・ ブリスベーン・ゴールデンイーグルレーン 233 (72)発明者 レディ、ルーパ アメリカ合衆国カリフォルニア州94086・ サニーベイル・＃３・ウェストマッキンレ ーアベニュー 1233 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 BA13 BA14 BB03 BB20 BB24 CB01 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FA16 FB02 FB03 FB04 FB06 FB07 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA09 DA02 DA06 EA04 FA02 GA11 GA18 GA19 HA03 HA12 4B063 QA01 QA18 QQ42 QR08 QR32 QR38 QR55 QR82 QS25 QS34 QS39 QX07 4B064 AG01 CA02 CA19 CC24 DA05 DA08 DA13 4B065 AA26X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA19 BA22 CA53 CA56 MA52 MA55 MA66 NA14 ZA011 ZA361 ZB071 ZB111 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA86 EA22 EA23 EA28 EA50 FA74

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 単離されたポリペプチドであって、 （ａ）SEQ ID NO:1乃至SEQ ID NO:10（SEQ ID NO:1−10）からなる群から選択
   されたアミノ酸配列と、 （ｂ）SEQ ID NO:1−10からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも
   ９０％の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、 （ｃ）SEQ ID NO:1−10からなる群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に
   活性な断片と、 （ｄ）SEQ ID NO:1−10からなる群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断
   片とで構成される群から選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする単離さ
   れたポリペプチド。
2. 【請求項２】 SEQ ID NO:1−10からなる群から選択された請求項１の単
   離されたポリペプチド。
3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドをコードする単離されたポリヌク
   レオチド。
4. 【請求項４】 請求項２のポリペプチドをコードする単離されたポリヌク
   レオチド。
5. 【請求項５】 SEQ ID NO:11−20からなる群から選択された請求項４の単
   離されたポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項３のポリヌクレオチドに機能的に結合されたプロモ
   ーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 請求項６の組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞
   。
8. 【請求項８】 請求項６の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え生
   物。
9. 【請求項９】 請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１のポリペプチドを
   コードするポリヌクレオチドに機能的に結合されたプロモーター配列を含む組換
   えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養するステップと、 （ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収するステップとを含むことを特
   徴とする請求項１のポリペプチドの生産方法。
10. 【請求項１０】 請求項１のポリペプチドに特異的に結合する単離された
    抗体。
11. 【請求項１１】 単離されたポリヌクレオチドであって、 （ａ）SEQ ID NO:11−20からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列と、 （ｂ）SEQ ID NO:11−20からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列と少
    なくとも９０％の配列同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列と、 （ｃ）前記（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列と、 （ｄ）前記（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列と、 （ｅ）前記（ａ）乃至（ｄ）のRNA等価物とで構成される群から選択されたポ
    リヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
12. 【請求項１２】 請求項１１のポリヌクレオチドの少なくとも６０個の連
    続するヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
13. 【請求項１３】 サンプルにおいて、請求項１１に記載のポリヌクレオチ
    ド配列を有する標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、 （ａ）前記サンプルをプローブでハイブリダイズするステップであって、前記
    プローブが、前記サンプル内の前記標的ポリヌクレオチドと相補的な配列を含む
    少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含み、前記プローブと前記標的ポリ
    ヌクレオチドまたはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成され
    る条件下で、前記プローブが前記標的ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイ
    ズする、該ステップと、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体が存在するか否かを検出し、存在す
    る場合には随意選択でその収量を測定するステップとを含むことを特徴とする標
    的ポリヌクレオチドの検出方法。
14. 【請求項１４】 前記プローブが少なくとも６０個の連続するヌクレオチ
    ドを含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 サンプルにおいて、請求項１１のポリヌクレオチド配列
    を有する標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、 （ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて、前記標的ポリヌクレオチドまたは
    その断片を増幅するステップと、 （ｂ）増幅された前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在するか否か
    を検出し、存在する場合には随意選択でその収量を測定するステップとを含むこ
    とを特徴とする標的ポリヌクレオチドの検出方法。
16. 【請求項１６】 有効量の請求項１のポリペプチド及び医薬的に容認でき
    る賦形剤を含む組成物。
17. 【請求項１７】 前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1−10からなる群から
    選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１６の組成物。
18. 【請求項１８】 機能的なSECPの発現の低下に関連する疾患や病態の治療
    方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項１６の組成物を投与するこ
    とを含むことを特徴とする治療方法。
19. 【請求項１９】 請求項１のポリペプチドのアゴニストとして効果的な化
    合物をスクリーニングする方法であって、 （ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと
    、 （ｂ）前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出するステップとを含むこと
    を特徴とするスクリーニング方法。
20. 【請求項２０】 請求項１９のスクリーニング方法によって同定されたア
    ゴニスト化合物及び医薬的に容認できる賦形剤を含む組成物。
21. 【請求項２１】 機能的なSECPの発現の低下に関連する疾患や病態の治療
    方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項２０の組成物を投与するこ
    とを含むことを特徴とする治療方法。
22. 【請求項２２】 請求項１のポリペプチドのアンタゴニストとして効果的
    な化合物をスクリーニングする方法であって、 （ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと
    、 （ｂ）前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出するステップとを含む
    ことを特徴とするスクリーニング方法。
23. 【請求項２３】 請求項２２のスクリーニング方法によって同定されたア
    ンタゴニスト化合物及び医薬的に容認できる賦形剤を含む組成物。
24. 【請求項２４】 機能的なSECPの過剰な発現に関連する疾患や病態の治療
    方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項２３の組成物を投与するこ
    とを含むことを特徴とする治療方法。
25. 【請求項２５】 請求項１のポリペプチドに特異的に結合する化合物をス
    クリーニングする方法であって、 （ａ）請求項１のポリペプチドを好適な条件下で少なくとも１つの試験化合物
    と結合させるステップと、 （ｂ）請求項１のポリペプチドと前記試験化合物との結合を検出して、請求項
    １のポリペプチドと特異的に結合する化合物を同定するステップとを含むことを
    特徴とするスクリーニング方法。
26. 【請求項２６】 請求項１のポリペプチドの活性を変化させる化合物をス
    クリーニングする方法であって、 （ａ）請求項１のポリペプチドを、その活性が許容される条件下で少なくとも
    １つの試験化合物と結合させるステップと、 （ｂ）前記試験化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性を評価する
    ステップと、 （ｃ）前記試験化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性と、前記試
    験化合物の不在下での請求項１のポリペプチドの活性とを比較するステップとを
    含み、 前記試験化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性の変化が、請求項
    １のポリペプチドの活性を変化させる化合物の存在を示唆すること特徴とするス
    クリーニング方法。
27. 【請求項２７】 請求項５の配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を変
    化させるのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、 （ａ）前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、前記標的ポリヌク
    レオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、 （ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの発現の変化を検出するステップと、 （ｃ）様々な量の前記化合物の存在下での前記標的ポリヌクレオチドの発現と
    、前記化合物の不在下での前記標的ポリヌクレオチドの発現とを比較するステッ
    プとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
28. 【請求項２８】 試験化合物の毒性を評価する方法であって、 （ａ）核酸を含む生体サンプルを前記試験化合物で処理するステップと、 （ｂ）処理した前記生体サンプルの核酸と、請求項１１のポリヌクレオチドの
    少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含むプローブをハイブリダイズさせる
    ステップであって、このハイブリダイゼーションゼーションが、前記プローブと
    前記生体サンプルの標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーシ
    ョン複合体が形成される条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項
    １１のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列またはその断片を含むポリヌク
    レオチドである、前記ステップと、 （ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量するステップと、 （ｄ）前記処理した生体サンプルにおけるハイブリダイゼーション複合体の収
    量を、未処理の生体サンプルにおけるハイブリダイゼーション複合体の収量と比
    較するステップとを含み、 前記処理した生体サンプルにおけるハイブリダイゼーション複合体の収量の差
    が試験化合物の毒性を示唆することを特徴とする試験化合物の毒性評価方法。