JP2003531811A5 - - Google Patents

Description

【００３４】

【００３５】

【００３６】

【００３７】

【００３８】
ここで同定されるＰＲＯポリペプチド配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ＰＲＯ配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、以下に記載するように、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが表１に与えられている配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を用いて得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、表１に示したソースコードは米国著作権事務所, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテック社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能であり、また表１に与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIX(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
ここでの目的のためには、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。％アミノ酸配列同一性の計算の例として、表２Ａ-２Ｂは、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。
【００３９】
特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は上記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov.からダウンロードでき、また他の手段ではNational Institute of Health, Bethesda, MDから得られる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
アミノ酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
さらに、％アミノ酸配列同一性は、WU-BLAST-2コンピュータプログラム（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて決定してもよい。殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。ここでの目的のために、％アミノ酸配列同一性値は、（ａ）天然ＰＲＯポリペプチドから誘導された配列を有する対象とするＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列と、対象とする比較アミノ酸配列（即ち、対象とするＰＲＯポリペプチドが比較されるＰＲＯポリペプチド変異体であってもよい配列）との間の、WU-BLAST-2によって決定した一致する同一アミノ酸残基の数を、（ｂ）対象とするＰＲＯポリペプチドの残基の総数で除した商によって決定される。例えば、「アミノ酸配列Ｂに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っているアミノ酸配列Ａを含んでなるポリペプチド」という表現では、アミノ酸配列Ａが対象とする比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Ｂが対象とするＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００４０】
「ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＰＲＯ変異体核酸配列」は、以下に定義されるような活性なＰＲＯポリペプチドをコード化する核酸分子を意味し、ここに開示されるような全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチドを欠くここに開示されるような全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチドを有する又は欠くここに開示されるようなＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示されるような全長ＰＲＯポリペプチド配列の他の断片を、コード化する核酸配列に対して少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する。通常は、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドは、ここに開示されるような全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチドを欠くここに開示されるような全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチドを有する又は欠くここに開示されるようなＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する全長ＰＲＯポリペプチド配列の他の断片を、コード化する核酸配列と少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然のヌクレオチド配列を含まない。
通常は、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約６０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約９０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約２１０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約２４０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約２７０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約３００ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約６００ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約９００ヌクレオチド長、又はそれ以上である。
【００４１】
ここに同定されるＰＲＯポリペプチドコード化核酸配列に対して同定されている「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、ＰＲＯポリペプチドコード化核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、以下に記載するように、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが表１に与えられている配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を用いて得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、表１に示したソースコードは米国著作権事務所, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテック社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能であり、また表１に与えられるソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIX(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
ここでの目的のためには、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％核酸配列同一性の計算の例として、表２Ｃ-２Ｄは、「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＰＲＯ-ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示す。
特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は上記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％核酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov.からダウンロードでき、その他Helth, Bethesda, MDのNational Instituteから得ることができる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
【００４２】
配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
さらに、％核酸配列同一性値は、WU-BLAST-2コンピュータプログラム（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて決定してもよい。殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。ここでの目的のために、％核酸配列同一性値は、（ａ）天然配列ＰＲＯポリペプチドコード化核酸から誘導された配列を有する対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列と、対象とする比較核酸分子（即ち、対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の配列が比較される変異体ＰＲＯポリヌクレオチドであってもよい配列）との間の、WU-BLAST-2によって決定した一致する同一ヌクレオチドの数を、（ｂ）対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子のヌクレオチドの総数で除した商によって決定される。例えば、「核酸配列Ｂに対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を持つ又は持っている核酸配列Ａを含んでなる単離された核酸分子」という表現では、核酸配列Ａが対象とする比較核酸分子であり、核酸配列Ｂが対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列である。
他の実施態様では、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドは、活性なＰＲＯポリペプチドをコード化する核酸分子であり、好ましくは緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で、それぞれ図２（配列番号：２）、図４（配列番号：４）、図６（配列番号：６）、図８（配列番号：８）、図１０（配列番号：１０）、図１２（配列番号：１２）、図１４（配列番号：１４）、図１６（配列番号：１６）、図１８（配列番号：１８）、図２０（配列番号：２０）、図２２（配列番号：２２）、図２４（配列番号：２４）、図２６（配列番号：２６）、図２８（配列番号：２８）、図３０（配列番号：３０）、及び図３２（配列番号：３２）に示される全長ＰＲＯポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列にハイブリッド形成できる。ＰＲＯ変異体ポリペプチドは、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドにコードされるものでありうる。
【００４３】
上記のように実施されるアミノ酸配列同一性比較の文脈における「ポジティブ（陽性）」という用語は、比較された配列において同一であるアミノ酸残基ばかりでなく類似した特性を有するものも含む。対象とするアミノ酸残基に対してポジティブ値をスコアされるアミノ酸残基は、対象とするアミノ酸残基と同一であるか、又は対象とするアミノ酸残基の（下記の表３で特定するように）好ましい置換とされるものである。
ここでの目的のために、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％ポジティブ値（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％ポジティブを持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメントによってポジティブ値であるとのスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％ポジティブは、ＢのＡに対する％ポジティブとは異なることは理解されるであろう。
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドは、自然に結合する全ての成分と結合していない。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、ＰＲＯの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
ＰＲＯポリペプチドをコード化する「単離された」核酸分子、又は抗-ＰＲＯ抗体をコード化する「単離された」核酸分子は、同定され、ＰＲＯ-コード化核酸の天然源、又は抗-ＰＲＯ-コード化核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、単離された核酸、自然に結合する全ての構成成分と結合していない。単離されたＰＲＯ-コード化核酸分子又は単離された抗-ＰＲＯ-コード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在するＰＲＯ-コード化核酸分子又は抗-ＰＲＯ-コード化核酸分子とは区別される。しかし、ＰＲＯポリペプチドをコード化する単離された核酸分子、又は抗-ＰＲＯ抗体をコード化する単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるＰＲＯポリペプチド又は抗-ＰＲＯ抗体を通常は発現する細胞に含まれるＰＲＯ-核酸分子、又は抗-ＰＲＯ-核酸分子を含む。
【００４４】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのＰＲＯポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的ストランドがその融点より低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（v/v）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
「中程度の緊縮性条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989)に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリッド形成条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【００４５】
「エピトープタグ」なる修飾詞は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＰＲＯポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは融合するポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８から５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０から約２０のアミノ酸残基)を有する。
ＰＲＯ変異体における「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生ＰＲＯポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＰＲＯタンパク質の形態を称する。
ここで開示されているスクリーニングアッセイにより同定可能なＰＲＯポリペプチドに拮抗する分子(例えば、有機又は無機小分子、ペプチド等)における「生物学的活性」とは、ここで同定されたＰＲＯポリペプチドに結合又は複合体化、又は他の細胞タンパク質とＰＲＯポリペプチドとの相互作用を干渉、又はＰＲＯポリペプチドの転写又は翻訳を阻害する分子の能力を称するときに使用される。特に好ましい生物学的活性には、血管に影響を及ぼす全身疾患、例えば真性糖尿病、並びに動脈、毛細管、静脈及び／又はリンパ管の病気、及び癌に作用する心肥大活性が含まれる。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドの一又は複数の生物学的活性、例えば適切であるならば、その分裂促進又は血管形成活性を阻止、阻害、又は中和する任意の分子を含む。ＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストは、ＰＲＯポリペプチドの細胞レセプターへの結合に干渉する、ＰＲＯポリペプチドにより活性化される細胞を無力化又は死亡させる、又はＰＲＯポリペプチドが細胞レセプターに結合した後に血管内皮細胞の活性化に干渉することにより作用する。ＰＲＯポリペプチドアンタゴニストによる仲介のこのような点の全ては、この発明の目的と等しいと考えられる。アンタゴニストは、分裂促進、血管形成、又はＰＲＯポリペプチドの他の生物学的活性を阻害し、よって、腫瘍、特に固形悪性腫瘍、慢性関節リュウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化、糖尿病、他の網膜症、水晶体後繊維増殖症、年齢関連性斑変性、新血管新生緑内障、血管腫、甲状腺過形成(グレイブス病を含む)、角膜及び他の組織の移植、及び慢性炎症を含む、所望しない過度の新血管新生により特徴付けられる病気又は疾患の治療に有用である。また、アンタゴニストは、所望しない過度の血管浸透性により特徴付けられる病気又は疾患、例えば脳腫瘍に関連した浮腫、悪性腫瘍に関連した腹水症、メーグス症候群、肺炎、ネフローゼ症候群、心外膜液(例えば心膜炎に関連したもの)、胸膜滲出の治療に有用である。同様に「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を含む。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然ＰＲＯポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子等を含む。
「小分子」とは、ここでは約５００ダルトン以下の分子量を有するものと定義する。
ここで使用される場合の「ＰＲＯポリペプチドレセプター」なる用語は、ＰＲＯポリペプチドの細胞性レセプター、通常は血管内皮細胞に見出される細胞表面レセプター、並びにＰＲＯポリペプチドに結合する能力を保持しているそれらの変異体を称する。
【００４６】
「抗体」(Ａｂｓ)と「免疫グロブリン」(Ｉｇｓ)は同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すものであるが、免疫グロブリンは、抗体及び抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含むものである。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系により低レベルで、骨髄腫により増加したレベルで産生される。「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、限定するものではないが、特に無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成された多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片も含む。
「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(Ｖ_Ｈ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(Ｖ_Ｌ)を、他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を称する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域又は相補性決定領域(ＣＤＲ)と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つのＣＤＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲ領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲにより近接して結合せしめられ、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。Kabat等, NIH Publ. No.91-3242, Vol.I, 647-669頁[1991]を参照のこと。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害活性への抗体の関与を示す。
【００４７】
「抗体断片」には、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域が含まれる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')_２及びＦｖ断片；ダイアボディー(diabodies)；直鎖状抗体(Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062[1995])；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
抗体のパパイン消化により、各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、その名称が容易に結晶化する能力を表す、残りの「Ｆｃ」断片が産生される。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、更に抗原を架橋させ得るＦ(ａｂ')_２断片が得られる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つのＣＤＲは相互に作用してＶ_Ｈ-Ｖ_Ｌ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')_２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主たるクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらのいくつかは更にサブクラス(アイソタイプ)、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分割される。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、σ、ε、γ及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び３次元構造はよく知られている。
【００４８】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む通常の(ポリクローナル)抗体と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養から合成される点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature 256, 495 (1975)により開示されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる(例えば、米国特許第4,816,567号参照)。また「モノクローナル抗体」は、例えばClackson等, Nature 352:624-628(1991)、及びMarksほか, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片を特に含む(米国特許第4,816,567号; Morrisonほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855[1984])。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはそれらの断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')_２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。大部分においてヒト化抗体はレシピエントのＣＤＲの残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖＦＲ領域残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。更なる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Reichmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。ヒト化抗体は、抗体の抗原結合領域が、対象とする抗原でマカクザルを免疫化することにより生産された抗体に由来する、PRIMATIZED^TM抗体を含む。
【００４９】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインを含有するもので、これらのドメインはポリペプチド単鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合に対する所望の構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーをＶ_ＨとＶ_Ｌドメインの間に更に含んでいる。ｓＦｖのレビューには、例えば、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg及びMoore編(Springer-Verlag, New York, 1994)pp.269-315を参照されたい。
「ダイアボディー」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を意味するもので、断片は軽鎖可変ドメイン(Ｖ_Ｌ)に結合した重鎖可変ドメイン(Ｖ_Ｈ)を同じポリペプチド鎖(Ｖ_Ｈ-Ｖ_Ｌ)に含有する。同じ鎖上での二つのドメイン間の対合が許されないほど短いリンカーを使用することにより、ドメインが、他の鎖の相補的ドメインとの対合を強いられ、二つの抗原結合部位をつくりだす。ダイアボディーは、例えば、欧州特許第404,097号；国際公開93/11161号；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)に更に詳しく記載されている。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリ法(Lowry method)で測定した場合９５％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、抗体に直接又は間接的に複合して「標識」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を称する。標識は、それ自身検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。検出可能な標識として提供できる放射性核種は、例えば、Ｉ-１３１、Ｉ-１２３、Ｉ-１２５、Ｙ-９０、Ｒｅ-１８８、Ａｔ-２１１、Ｃｕ-６７、Ｂｉ-２１２、及びＰｄ-１０９を含む。また、標識は毒素などの検出できない物質であってもよい。
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに含まれる固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ；その他では精製カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
【００５０】
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（ＰＲＯポリペプチド又はここに開示されているそれらの抗体など）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００５１】
ＩＩ. 本発明の組成物と方法
Ａ． ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５及びＰＲＯ８８７変異体
ここに記載した全長天然配列ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５及びＰＲＯ８８７ポリペプチドに加えて、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５及びＰＲＯ８８７変異体も調製できると考えられる。ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５及びＰＲＯ８８７変異体は、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入することにより、及び／又は所望のＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化など、アミノ酸変化がＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７の翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
天然全長配列ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７又はここに記載したＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７の種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７と比較してＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７のアミノ酸配列が変化するＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化する一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７の一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７の配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を全長又は成熟天然配列により示される活性について試験することにより決定される。
【００５２】
特別の実施態様では、関心のある保存的置換を、好ましい置換を先頭にして表３に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表３に例示的置換を示し又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
表３
元の残基 例示的置換 好ましい置換
Ala(A) val; leu; ile val
Arg(R) lys; gln; asn lys
Asn(N) gln; his; lys; arg gln
Asp(D) glu glu
Cys(C) ser ser
Gln(Q) asn asn
Glu(E) asp asp
Gly(G) pro; ala ala
His(H) asn; gln; lys; arg arg
Ile(I) leu; val; met; ala; phe;
ノルロイシン leu
Leu(L) ノルロイシン; ile; val;
met; ala; phe ile
Lys(K) arg; gln; asn arg
Met(M) leu; phe; ile leu
Phe(F) leu; val; ile; ala; tyr leu
Pro(P) ala ala
Ser(S) thr thr
Thr(T) ser ser
Trp(W) tyr; phe tyr
Tyr(Y) trp; phe; thr; ser phe
Val(V) ile; leu; met; phe;
ala; ノルロイシン leu
ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
【００５３】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等の当該技術において公知の技術を使用して作成することができる。部位指向性突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他の周知の技術が、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７変異体ＤＮＡを製造するために、クローン化されたＤＮＡに実施できる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244：1081-1085(1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【００５４】
Ｂ． ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５及びＰＲＯ８８７の修飾
ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５及びＰＲＯ８８７の共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一つのタイプは、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７の選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７を水不溶性支持体マトリクスあるいは抗-ＰＲＯ１７９、抗-ＰＲＯ２３８、抗-ＰＲＯ３６４、抗-ＰＲＯ８４４、抗-ＰＲＯ８４６、抗-ＰＲＯ１７６０、抗-ＰＲＯ２０５、抗-ＰＲＯ３２１、抗-ＰＲＯ３３３、抗-ＰＲＯ８４０、抗-ＰＲＯ８７７、抗-ＰＲＯ８７８、抗-ＰＲＯ８７９、抗-ＰＲＯ８８２、抗-ＰＲＯ８８５又は抗-ＰＲＯ８８７抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１,１-ビス(ジアゾアセチル)-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸、３,３'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１,８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【００５５】
本発明の範囲内に含まれるＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドの共有結合的修飾の他のタイプには、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更が含まれる。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７に見られる一又は複数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる）、及び／又は天然配列ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７に存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この文節は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び割合の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、一又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７（Ｏ-結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７アミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドをコード化するＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
【００５６】
ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO 87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコード化するコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
本発明のＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７の共有結合的修飾の他の型は、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。
【００５７】
また、本発明のＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７は、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７を含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７との融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７のアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７のエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７の容易な精製を可能にする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（poly-his）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-His-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
それに換わる実施態様では、キメラ分子はＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７と免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えてＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。
【００５８】
Ｃ． ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５及びＰＲＯ８８７の調製
本発明は、本出願においてＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７と称される、新規に同定及び単離されたヌクレオチド配列コード化ポリペプチドを提供するものである。特に、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドをコード化するｃＤＮＡは、以下の実施例にさらなる詳細が開示されているように、同定され単離される。分離発現のラウンドで生産されるタンパク質は、異なるＰＲＯ番号が付与されるが、ＵＮＱ番号は任意の付与されるＤＮＡ及びコード化タンパク質で唯一であり、変わることはないであろう。しかしながら、簡単にする目的で、本出願においては、ＤＮＡ１６４５１-１３８８、ＤＮＡ３５６００-１１６２、ＤＮＡ４７３６５-１２０６、ＤＮＡ５９８３８-１４６２、ＤＮＡ４４１９６-１３５３、ＤＮＡ７６５３２-１７０２、ＤＮＡ３０８６８、ＤＮＡ３４４３３、ＤＮＡ４１３７４、ＤＮＡ５３９８７、ＤＮＡ５８１２０、ＤＮＡ５８１２１、ＤＮＡ５８１２２、ＤＮＡ５８１２５、ＤＮＡ５８１２８又はＤＮＡ５８１３０にコードされるタンパク質、さらなる天然相同体、及びＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７の先の定義に含まれる変異体は、由来又は調製方法に無関係に、それぞれ「ＰＲＯ１７９」、「ＰＲＯ２３８」、「ＰＲＯ３６４」、「ＰＲＯ８４４」、「ＰＲＯ８４６」、「ＰＲＯ１７６０」、「ＰＲＯ２０５」、「ＰＲＯ３２１」、「ＰＲＯ３３３」、「ＰＲＯ８４０」、「ＰＲＯ８７７」、「ＰＲＯ８７８」、「ＰＲＯ８７９」、「ＰＲＯ８８２」、「ＰＲＯ８８５」又は「ＰＲＯ８８７」と称される。
以下の説明は、主として、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドをコード化する核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７を調製することができると考えられる。例えば、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチド配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい。Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis,(W.H. Freeman Co., San Francisco, CA 1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Foster City, CA）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７の種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドを生産してもよい。
【００５９】
ｉ． ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化するＤＮＡの単離
ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドをコード化するＤＮＡは、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化するｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＰＲＯ１７９、ヒトＰＲＯ２３８、ヒトＰＲＯ３６４、ヒトＰＲＯ８４４、ヒトＰＲＯ８４６、ヒトＰＲＯ１７６０、ヒトＰＲＯ２０５、ヒトＰＲＯ３２１、ヒトＰＲＯ３３３、ヒトＰＲＯ８４０、ヒトＰＲＯ８７７、ヒトＰＲＯ８７８、ヒトＰＲＯ８７９、ヒトＰＲＯ８８２、ヒトＰＲＯ８８５又はヒトＰＲＯ８８７をコード化するＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドをコード化する遺伝子は、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成により得ることもできる。
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはそれによりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrook等, 上掲に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化する遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである。Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)。
下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、^３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の緊縮性及び高度の緊縮性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。
このようなライブラリスクリーニング法において同定された配列は、GenBank等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長配列に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、相同性を測定する種々のアルゴリズムを使用する、コンピュータソフトウエアプログラム、例えばALIGN、DNAstar及びINHERITにより決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。
【００６０】
ｉｉ． 宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコード化する遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
形質移入の方法、例えば、ＣａＰＯ_４処理及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションは、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して一般に用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)による感染が、Shaw等, Gene, 23: 315 (1983)及び1989年6月29日公開の国際特許出願公開第ＷＯ89/05859号に記載されるように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130: 946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることができる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336: 348-352 (1988)を参照のこと。
【００６１】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞を含む。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７７６（ATCC31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５７７２（ATCC53,635）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、1989年4月12日発行のDD 266,710に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、宿主に外来のタンパク質をコード化する遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｒｔ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５ (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴｋａｎ^ｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ATCC 55,244）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｒｔ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５ (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｒｂｓ７ｉｌｖＧｋａｎ^ｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び1990年8月7日発行の米国特許第4,946,783号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【００６２】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７コード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセスプロンブ(Schizosaccharomyces prombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985年5月2日発行のEP 139,383）；クリュイベロミセス宿主(Kluyveromyces hosts)（米国特許第4,943,529号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばクリュイベロミセス・ラクティス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol. 737 [1983]）、クリュイベロミセス・フラギリス(K. fragilis)（ATCC 12,424）、クリュイベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)（ATCC 16,045）、クリュイベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)（ATCC 24,178）、クリュイベロミセス・ワルチイ(K. waltii)（ATCC 56,500）、クリュイベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)（ATCC 36,906; Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990)）、クリュイベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)及びクリュイベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（EP 402,226）；ピッチャパストリス(Pichia pastoris)（EP 183,070; Sreekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマレーシア(reesia)（EP 244,234）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(occidentalis)（1990年10月31日発行のEP 394,538）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（1991年1月10日発行のWO 91/00357）；及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌（Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及びクロカビ（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
グリコシル化ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化する核酸の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドプテラ(Spodoptera)Ｓｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATCC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【００６３】
ｉｉｉ． 複製可能なベクターの選択及び使用
ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化する核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、配列が分泌されるならば、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化するＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスファターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のEP362179)、又は1990年11月15日に公開されたWO 90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００６４】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコード化する。
哺乳動物細胞に適切な選択可能マーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化する核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である。Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingsman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。
発現及びクローニングベクターは、通常、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化する核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Chang等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモーターもまたＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化するＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ(Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980))又は他の糖分解酵素(Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1978))、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターはEP 73,657に更に記載されている。
【００６５】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７核酸の転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物による所望のＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化するＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化する配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化するｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７の合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載されている。
【００６６】
ｉｖ． 遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980))、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化するＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコード化する外因性配列に対して調製され得る。
【００６７】
ｖ． ポリペプチドの精製
ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ^ＴＭ１００)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドをコード化する核酸の発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドを、組換え細胞タンパク質又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, (Springer-Verlag, New York 1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７の性質に依存する。
【００６８】
Ｄ． ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドの用途
ｉ． 心血管、内皮及び血管形成活性のアッセイ
種々のアッセイがここで記載されたポリペプチドの心血管、内皮及び血管形成活性をテストするために使用可能である。
米国特許第5,773,414号に開示されているエンドセリンアンタゴニスト活性をテストするアッセイには、レセプターアッセイにおけるポリペプチドのヨード化エンドセリン-Ｉ結合を阻害する能力をテストするラット心室結合アッセイ、ウサギ腎動脈平滑筋細胞を使用し、放射能標識されたエンドセリン-Ｉの無傷細胞結合性をテストするエンドセリンレセプタ結合アッセイ、機能活性が第２のメッセッンジャーの細胞内レベルを測定することにより、Ｒａｔ-Ｉ細胞内で測定されるイノシトールホスファート蓄積アッセイ、雄のニュージーランドウサギの内皮を使用するインビトロ(単離された管)研究において、添加化合物の、培養血管平滑筋内でのエンドセリン刺激アラキドン酸の放出を低減させる能力を測定するアラキドン酸放出アッセイ、及び雄ＳＤラットを使用するインビボ研究が含まれる。
組織生成活性のアッセイには、限定するものではないが、WO95/16035(骨、軟骨、腱)、；WO95/05846(神経、ニューロン)、及びWO91/07491(皮膚、内皮)に記載されているものが含まれる。
傷治癒活性のアッセイには、例えば、Eaglstein及びMertz, J. Invest. Dermatol., 71：382-384(1978)の論文で改変されている、Winter, Epidermal Wound Healing, Maibach, HI及びRovee, DT,編(Year Book Medical Publishers. Inc., Chicago),pp71-112に記載されているものが含まれる。
エンドセリンＢ_１(ＥＴＢ_１)レセプターポリペプチドに結合し、シグナル変換活性を調節するＰＲＯポリペプチドに関連したテスト用分子のスクリーニングアッセイは、米国特許第5,773,223号に記載されたようにして、エンドセリンＢ_１レセプターポリペプチドをコード化するＤＮＡで形質転換した宿主細胞を提供し、テスト用候補薬に細胞を曝露し、エンドセリンＢ_１レセプターシグナル変換活性を測定することを含む。
心肥大アッセイにはいくつかある。インビトロアッセイには、成体ラット心臓ミオサイトの拡散の誘導が含まれる。このアッセイにおいて、心室ミオサイトは、Piperら,「Adult ventricular rat heart muscle cells」, Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research. H.M. Piper. ed(Berlin：Springer-Verlag,1990),pp.36-60により詳細に記載されている手順を改変したものに本質的に従って、単一の(雄のＳＤ)ラットから単離される。この手順により、成長心室ミオサイトの単離、及び桿体フェノタイプ細胞の長期間にわたる培養が可能になる。フェニレフリンとプロスタグランジンＦ_２α(ＰＧＦ_２α)は、これら成長細胞の転移反応を誘発することが示されている。ついで、種々の心肥大の潜在的インヒビターによる、ＰＧＦ_２α又はＰＧＦ_２α類似体(例えばフルプロステノール)及びフェニレフリンにより誘発されるミオサイト伝播性の抑制を試験する。
【００６９】
インビボアッセイの一例は、インビボにおけるフルプロステノールにより誘発される心肥大の阻害をテストすることである。この薬理学的モデルは、フルプロステノール(ＰＧＦ_２αのアゴニスト類似体)の皮下注射によりラット(例えば、雄のWistar又はＳＤ)に誘発された心肥大を阻害するＰＲＯポリペプチドの能力をテストするものである。心筋梗塞に誘発される病的な心肥大のあるラットにおいて、心筋内のＰＧＦ_２αが検出可能なレベルまで慢性的に上昇していることが知られている。Laiら, Am. J. Physiol.(Heart Circ. Physiol.), 271：H2197-H2208(1996)。従って、インビボでの心筋成長におけるフルプロステノールの影響を阻害可能な因子は、心肥大の治療に有用である可能性がある。心肥大におけるＰＲＯポリペプチドの効果は、ＰＲＯポリペプチドを受けていないフルプロステノール処理ラットに比較した、心臓、心室及び左心室の重量(体重によって規準化)を測定することにより決定される。
インビボアッセイの他の例は、圧力負荷心肥大アッセイである。インビボテストにおいて、テスト用動物の腹部大動脈の収縮による圧力負荷心肥大を誘発することは共通している。典型的なプロトコルにおいて、ラット(例えば雄のWistar又はＳＤ)は麻酔処理され、各ラットの腹部大動脈を横隔膜の真下まで狭窄する。Beznak M., Can. J. Biochem. Physiol., 33：985-94(1955)。 大動脈を外科的切開により曝露し、短い太針を管の隣におく。大動脈を針周囲に絹糸で結紮して収縮させ、すぐに除去し、針の直径まで大動脈の管腔を低減させる。このアプローチは、例えばRossiら, Am. Heart J., 124：700-709(1992)及びO'Rourke及びReibel, P.S.E.M.B., 200：95-100(1992)に記載されている。
また他のインビボアッセイにおいて、心肥大、続いて実験的に誘発された心筋梗塞(ＭＩ)における効果を測定する。ラットにおいて、急性ＭＩを左冠動脈結紮にて誘発し、さらにこれを心電図試験で確認する。また動物の擬似操作グループを対照動物として用意する。初期のデータには、心肥大はＭＩを有するグループに存在することが示され、体重に対し心臓重量は１８％増加していることが明らかとなった。上掲のLai等。心肥大の候補ブロッカー、例えばＰＲＯポリペプチドでこれらの動物を治療し、テストした候補薬の治療可能性についての貴重な情報を提供する。ＳＤラットを使用する、心肥大の誘発におけるさらなるアッセイテストは米国特許第5,773,415号に開示されている。
【００７０】
癌において、腫瘍の病原及び進行におけるここで同定された遺伝子の役割をさらに理解し、天然ＰＲＯポリペプチドの抗体及び他のアンタゴニスト、例えば小分子アンタゴニストを含む治療用候補薬の効力をテストするために、種々のよく知られた動物モデルを使用することができる。このようなモデルのインビボでの性質は、ヒト患者での反応を特に予測的にする。腫瘍及び癌(乳癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌等)の動物モデルには、非組換え及び組換え(トランスジェニク)動物が含まれる。非組換え動物モデルには、例えば齧歯動物、例えばネズミモデルが含まれる。このようなモデルは標準的な技術、例えば皮下注射、尾静脈注射、脾臓移植、腹膜移植、腎嚢下移植、又はオルソピン(orthopin)移植、例えば結腸組織に移植された結腸癌細胞を使用し、同系のマウスに腫瘍細胞を移入することにより作成することができる。例えば、1997年9月18日に公開されたPCT公開番号WO97/33551を参照されたい。おそらくは癌遺伝子の研究に最も頻繁に使用される動物種は、免疫欠損マウス、特にヌードマウスである。胸腺刺激／形成不全を有するヌードマウスがヒト腫瘍異種移植片用の宿主として成功裡に作用するという知見はこの目的への広範な使用に導いた。常染色体劣性ｎｕ遺伝子は、例えばＡＳＷ、Ａ／Ｈｅ、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｂ１０.ＬＰ、Ｃ１７、ＣＨ３、Ｃ５７ＢＬ、Ｃ５７、ＣＢＡ、ＤＢＡ、ＤＤＤ、Ｉ／ｓｔ、ＮＣ、ＮＦＲ、ＮＦＳ、ＮＦＳ／Ｎ、ＮＺＢ、ＮＺＣ、ＮＺＷ、Ｐ、ＲＩＩＩ及びＳＪＬを含む、非常に多数の明確に同族のヌードマウスに導入される。さらに、ヌードマウス以外に免疫学的欠損を受け継いだ広範囲の他の動物を育て、腫瘍異種移植片のレシピエントとして使用する。さらなる詳細は、The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven及びB. Winograd. eds.(CRC Press, Inc., 1991)を参照されたい。
このような動物に導入された細胞は、上に列挙した任意の腫瘍細胞系のような周知の腫瘍／癌細胞、例えば、例えばＢ１０４-１細胞系(ｎｅｕ原腫瘍遺伝子で形質移入された安定ＮＩＨ-３Ｔ３細胞系)；Ｃａｃｏ-２(ＡＴＣＣ ＨＴＢ-３７)；又は中程度に分化したグレードＩＩヒト結腸腺癌細胞系、ＨＴ-２９(ＡＴＣＣ ＨＴＢ-３８)から、又は腫瘍及び癌から誘導可能である。腫瘍又は癌細胞のサンプルは、手術を受ける患者から得ることができ、凍結及び液体窒素での保管を含む標準的状態を用いる。Karmaliら, Br. J. Cancer. 48：689-696(1983)。
【００７１】
腫瘍細胞は種々の手順によりヌードマウス等の動物に導入することができる。腫瘍の移植には、マウスの皮下(s.c.)空間が非常に適している。腫瘍は、固体ブロックとして、例えばトロカールの使用による針バイオプシー、又は細胞懸濁液を移植することもできる。固体ブロック又はトロカール移植用に適した大きさの腫瘍組織フラグメントが皮下空間に導入される。細胞懸濁液は一次腫瘍又は安定腫瘍細胞系から新鮮に調製され、皮下注射される。また、腫瘍細胞は皮下移植として注射することもできる。この位置において、移植片は真皮結合組織の下部と皮下組織との間に付与される。
乳癌の動物モデルは、Drebinら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83：9129-9133(1986)に記載されたようにして、例えばラット神経芽細胞(当初単離されたｎｅｕ癌遺伝子からのもの)、又はｎｅｕ-形質転換ＮＩＨ-３Ｔ３細胞を、ヌードマウスに移植することにより作成することができる。
同様に、結腸癌の動物モデルは、動物、例えばヌードマウスに結腸癌細胞を通過させ、これらの動物に腫瘍を出現せしめることにより作成することができる。ヌードマウスにおけるヒト結腸癌の同所移植モデルは、例えばWangら, Cancer Research, 54：4726-4728(1994)及びTooら, Cancer Research, 55：681-684(1995)により記載されている。このモデルはAntiCancer,Inc.,(San Diego, California)から販売されている、いわゆる「METAMOUSE^ＴＭ」に基づく。
動物内で生じた腫瘍は除去され、インビトロで培養することができる。ついで、インビトロ培養からの細胞を動物に継代させる。このような腫瘍はさらなるテスト又は薬剤スクリーニングの目的で役立ちうる。あるいは、継代により得られた腫瘍は単離可能で、継代前細胞及び一又は複数の継代段階の後に単離された細胞のＲＮＡは、関心のある遺伝子の差次的発現用に分析される。このような継代技術は、任意の周知の腫瘍又は癌細胞系で行うことができる。
例えば、Ｍｅｔｈ Ａ、ＣＭＳ４、ＣＭＳ５、ＣＭＳ２１及びＷＥＨＩ-１６４はＢＡＬＢ／ｃ雌マウス(DeLeoら, J. Exp. Med., 146：720(1977))の繊維肉腫を化学的に誘発し、種々の薬剤の抗腫瘍活性を研究する高度に制御されたモデル系を提供する。Palladinoら, J. Immunol., 138：4023-4032(1987)。簡単に言えば、腫瘍細胞は細胞培養におけるインビトロで増殖される。動物に注射をする前に細胞系を洗浄し、１０ｘ１０^６から１０ｘ１０^７細胞／ｍｌの細胞密度でバッファーに懸濁させる。ついで、動物に１０から１００μｌの細胞懸濁液を皮下注射すると、１から３週間で腫瘍が出現する。
さらに、最も詳細に研究されている試験用腫瘍の一つであるマウスのルイス肺(３ＬＬ)癌腫を研究用腫瘍モデルとして使用することができる。この腫瘍モデルの効力は、肺の小細胞癌腫(ＳＣＣＬ)と診断されたヒト患者における好ましい効果と相関している。この腫瘍は、病気になったマウス、又は培養されている細胞からの腫瘍フラグメントを注射することで、正常なマウスに導入することができる。Zupiら, Br. J. Cancer, 41：suppl. 4. 30(1980)。腫瘍が単一細胞の注射から出発して、感染した細胞がかなりの高割合で生存しているという証拠が示された。この腫瘍モデルについてのさらなる情報は、Zacharski, Haemostasis, 16：300-320(1986)を参照されたい。
【００７２】
移植腫瘍を有する動物モデルにおける試験化合物の効力を評価する方法の一つは、治療前又は後の腫瘍の大きさを測定することである。伝統的に、移植腫瘍の大きさは２又は３次元のスライドカリパスで測定される。２次元に限定する測定は腫瘍の大きさを正確に反映せず；よって通常は数学的公式を使用し、対応する量に転換する。しかし、腫瘍サイズの測定は非常に不正確である。候補薬の治療効果は治療誘発性の成長が遅れ、特定の成長が遅れた場合に、より良好であると記載することができる。腫瘍成長の記載における他の重要な変数は腫瘍量が２倍になる時間である。また、腫瘍成長の算出及び記載のためのコンピュータプログラム、例えばRygaard及びSpang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals. Wu及びSheng. eds.(Basel. 1989), p.301により報告されているプログラムを入手することができる。しかし、治療後の壊死及び炎症反応は、実際には少なくとも当初には腫瘍サイズの増加の結果となり得ることに留意されるべきである。よって、これらの変化は形態計測とフローサイトメトリー分析を組み合わせて、注意深く監視する必要がある。
さらに、組換え(トランスジェニック)動物モデルは、ここで同定されたＰＲＯ遺伝子のコード化部位を、関心のある動物のゲノムに導入し、トランスジェニック動物を作成するための標準的な技術を使用して加工することができる。トランスジェニック操作の標的として提供可能な動物には、限定するものではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及びサルが含まれる。このような動物に導入遺伝子を導入するための、当該技術における周知の技術には、前核のミクロ注射(米国特許第4,873,191号)；胚へのレトロウイルス媒介性遺伝子移動(例えば、Van der Puttenら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82：6148-615(1985))；胚幹細胞における遺伝子を標的化(Thompsonら, Cell, 56：312-321(1989))；胚のエレクトロポレーション(Lo, Mol. Cell. Biol., 3：1803-1814(1983))；及び精子媒介性遺伝子移動が含まれる。Lavitranoら, Cell, 57：717-73(1989)。レビューには、例えば米国特許第4,736,866号を参照されたい。
本発明の目的において、トランスジェニック動物にはそれらの細胞の一部のみに導入遺伝子を担持するもの(「モザイク動物」)が含まれる。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、又は鎖状体で組み込むことができ、例えば、ヘッド対ヘッド又はヘッド対テイルのタンデムで組み込むことができる。また特定の細胞系への導入遺伝子の選択的導入は、例えばLaskoら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89：6232-636(1992)の技術に続いて可能である。
トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は通常の技術により監視可能である。例えば、サザンブロット分析又はＰＣＲ増幅を導入遺伝子の統合を証明するために使用することができる。ついで、ｍＲＮＡの発現レベルはインシトゥーハイブリッド形成、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ又は免疫細胞化学等の技術を使用して分析することができる。動物は腫瘍又は癌進行の徴候のためにさらに試験される。
【００７３】
また、動物の胚性細胞に導入されたＰＲＯポリペプチドをコード化する変更ゲノムＤＮＡと、ＰＲＯポリペプチドをコード化する内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ここで同定されるＰＲＯポリペプチドをコード化する欠陥又は変更遺伝子を有する「ノックアウト」動物を構成することができる。例えば、特定のＰＲＯポリペプチドをコード化するｃＤＮＡは、確立された技術に従い、該ポリペプチドをコード化するゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。特定のＰＲＯポリペプチドをコード化するゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコード化する遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５’と３’末端の両方)を数キロベース含む。例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと。ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞が選択される。例えば、Li等, Cell, 69:915(1992)参照。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する。例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ＰＲＯポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
ここで同定されたＰＲＯポリペプチドに特異的に結合する抗体、及び他の候補薬の効果は、自発的動物腫瘍の治療においてさらに試験することができる。この研究のための適切な標的はネコ口部扁平上皮細胞癌腫(ＳＣＣ)である。ネコ口部ＳＣＣは侵入性が高く、この悪性腫瘍はネコにおいて最も一般的な口部悪性腫瘍とされ、口部腫瘍の６０％以上がこの種において繰り返されると計測されている。それは遠くの部位にはめったに転移しないが、転移の発生率が低いのは、この腫瘍を有するネコの生存期間が短いことに反映されている。これらの腫瘍は、主としてネコの口腔の解剖学的構造により、通常外科手術により処理することができない。現在では、この腫瘍に対する効果的な治療はない。この研究に入る前に、各々のネコを完全な臨床実験用のバイオプシーとし、コンピュータＸ線断層撮影(ＣＴ)によりスキャンする。舌下口部扁平上皮細胞腫瘍であると診断されたネコはこの研究から除外する。舌はこのような腫瘍の結果として麻痺し、治療により腫瘍が死亡しても、動物は自分自身で食餌することができない。各々のネコを長期間繰り返し治療する。治療期間中、腫瘍の写真を毎日取り、続いて再チェックする。治療後、各ネコを他のＣＴスキャンにかける。ＣＴスキャンと胸部放射線写真を、その後８週間毎に評価する。データは、対照グループに対し、生存率、反応性及び毒性において異なっていると評価した。ポジティブ反応は、好ましくは生存の質の改善及び／又はライフスパンの増加を伴う腫瘍退行の証拠を必要とする。
さらに、イヌ、ネコ及びヒヒ他の自発的動物腫瘍、例えば繊維肉腫、腺癌、リンパ腫、軟骨腫、又は平滑筋肉腫もテストすることができる。もちろん、イヌ及びネコの乳房腺癌は好ましいモデルであり、その外観及び性質はヒトのものと非常に似ている。しかし、このモデルの使用は動物におけるこの種の腫瘍の発生率により制限される。
また、当該技術で周知の他のインビトロ及びインビボ心血管、内皮及び血管形成試験もここで適切である。
【００７４】
ｉｉ．組織分布
さらなる研究、例えば種々のヒト組織におけるｍＲＮＡ発現を測定することにより、ここで心血管、内皮及び血管形成アッセイの結果を証明することができる。
上述したように、種々の組織における遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980))、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。
あるいは、種々の組織における遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＰＲＯポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＰＲＯＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコード化する外因性配列に対して調製され得る。抗体生産のための一般的な技術、及びインサイツ-ハイブリッド形成のための特定のプロトコルは以下に提供する。
【００７５】
ｉｉｉ．抗体結合性の研究
心血管、内皮及び血管形成アッセイに使用される内皮細胞又は他の細胞におけるＰＲＯポリペプチドの効果を阻害する抗-抗体の能力を試験する、心血管、内皮及び血管形成研究の結果は、抗体結合性を研究することで証明することができる。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれ、その調製は以下に記載する。
抗体結合性の研究は任意の周知のアッセイ方法、例えば競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイ等で行われうる。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, (CRC Press, Inc. 1987)pp. 147-158 。
競合結合アッセイは、有限量の抗体との結合における、試験用サンプルに対して競合する標識された標準体の能力による。試験用サンプル中の標的タンパク質の量は、抗体が結合する標準体の量に対して逆比例する。結合する標準体の量の測定を容易にするため、好ましくは抗体は競合の前後に不溶化され、抗体に結合する分析物及び標準体は、便宜上、結合しないで残存する標準体及び分析物から分離する。
サンドイッチアッセイでは、検出される互いに異なる免疫原部分、又はエピトープ、又はタンパク質に結合可能な２つの抗体が使用される。サンドイッチアッセイにおいて、分析されるテスト用サンプルは、固体支持体に固定化された第１の抗体に結合し、その後、第２の抗体が分析物に結合し、よって不溶性の３部位複合体が形成される。例えば、米国特許第4,376,100号を参照されたい。第２の抗体は検出可能な部分で、それ自身がラベルされてもよく（直接サンドイッチアッセイ）、又は検出可能な部分でラベルされた抗免疫グロブリン抗体を使用して測定してもよい(間接サンドイッチアッセイ)。例えば、一方の種類のサンドイッチアッセイはＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合、検出可能な部分は酵素である。
免疫組織化学において、組織サンプルは新鮮なものであるか凍結されていてもよく、パラフィンに埋設されていてもよく、防腐剤、例えばホルマリンで固定されていてもよい。
【００７６】
ｉｖ．細胞ベースの腫瘍アッセイ
心血管、内皮及び血管形成の疾患、例えば腫瘍のための細胞ベースのアッセイ及び動物モデルは、ここで心血管、内皮及び血管形成アッセイの発見を立証し、さらに、ここで同定された遺伝子と所望しない心血管、内皮及び血管形成細胞成長の進行及び病因との関係を理解するために使用可能である。所望しない心血管、内皮及び血管形成細胞成長、例えば腫瘍の進行及び病因におけるここで同定された遺伝子産物の役割は、ＰＲＯポリペプチドにより刺激又は阻害されると同定された細胞又は細胞系を使用して試験することができる。このような細胞には、例えば以下の実施例に示すものが含まれる。
異なるアプローチにおいて、特定の心血管、内皮及び血管形成の疾患に係る周知の細胞種の細胞を、ｃＤＮＡを用いて形質移入し、これらのｃＤＮＡが過度の成長を誘発するか、又は成長を阻害する能力を分析する。心血管、内皮及び血管形成の疾患が癌である場合、適切な腫瘍細胞には、例えば安定腫瘍細胞系、例えばＢ１０４-１-１細胞系(ｎｅｕ原腫瘍遺伝子で形質移入された安定ＮＩＨ-３Ｔ３細胞系)及びｒａｓ-形質移入ＮＩＨ-３Ｔ３細胞が含まれ、これらは所望する遺伝子を形質移入することができ、腫瘍形成成長を監視することができる。ついで、このような形質移入細胞系を使用し、ポリ-又はモノクローナル抗体又は抗体組成物が、形質移入細胞の成長における細胞増殖抑制又は細胞毒性活性を働かせることによる、又は抗体-依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介することによる腫瘍形成細胞成長を阻害する能力をテストする。さらに、ここで同定された遺伝子のコード化配列で形質移入された細胞を、心血管、内皮及び血管形成の疾患、例えば癌の治療用の候補薬を同定するのに使用することができる。
さらに、トランスジェニック動物の腫瘍から得られた一次培地(上述に記載)を細胞ベースのアッセイに使用することができるが、安定細胞系が好ましい。トランスジェニック動物から一定の細胞系を誘導するための技術は当該技術においてよく知られている。例えばSmall等, Mol. Cell. Biol., 5：642-648(1985)を参照されたい。
【００７７】
ｖ． 遺伝子治療
ここでのＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチド、及びポリペプチジルアゴニスト及びアンタゴニストは、このようなポリペプチドのインビボ発現によって本発明に従って使用することができ、しばしば遺伝子治療と呼ばれる。
核酸（場合によってはベクター内に含まれたもの）を患者の細胞に入れるために：インビボ及びエキソビボという２つの主要な方法がある。インビボ送達では、核酸は、通常はＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドが必要とされている部位、すなわちＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドの合成部位、もし知られているならばＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドの生物学的活性が必要とされる部位(例えば傷)に、患者に直接注入される。エキソビボ処理では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を患者に、直接、又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与する（米国特許第4,892,538号及び第5,283,187号参照）。核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は対象とする宿主にインビボで移入されるかによる。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などを含む。形質導入は、複製欠陥、組換えウイルス（好ましくはレトロウイルス）粒子の細胞レセプターとの結合、次いで粒子に含まれる核酸の細胞への導入を含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスである。
【００７８】
現在インビボ核酸移入技術で好ましいのは、ウイルス又は非ウイルスベクター（アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ））、及び脂質ベースの系（遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである；例えば、Tonkinson等, Cancer Investigation, 14(1): 54-65 (1996) 参照）での形質移入を含む。遺伝子治療で使用するために最も好ましいベクターはウイルス、最も好ましくはアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス、又はレトロウイルスである。レトロウイルスベクター等のウイルスベクターは、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサー又は位置決定因子、あるいは選択的スプライシング、核ＲＮＡ輸出、又はメッセンジャーの翻訳後修飾などの他の手段により遺伝子発現を制御する他の因子を含む。さらに、レトロウイルスベクター等のウイルスベクターは、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドをコード化する遺伝子の存在下で転写されたとき、それに作用可能に結合し、翻訳開始配列として機能する核酸分子を含む。このようなベクター作成物はまた、用いるウイルスに適したパッケージングシグナル、末端反復配列（ＬＴＲ）又はその一部、及びポジティブ及びネガティブストランドプライマー結合部位を含む（これらがウイルスベクターに既に存在しない場合）。さらに、これらのベクターは、典型的には、それらが配置される宿主細胞からＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドを分泌させるシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は哺乳動物シグナル配列、最も好ましくはＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドのための天然シグナル配列である。場合によっては、ベクター作成物は、ポリアデニル化並びに一又は複数の制限部位を指向するシグナル及び翻訳終結配列も含む。例として、このようなベクターは典型的には５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第二鎖ＤＮＡ合成の開始点、及び３’ＬＴＲ又はその一部を含む。非ウイルスの他のベクター、例えばカチオン性脂質、ポリリシン、及びデンドリマーを用いることもできる。
幾つかの状況では、核酸供給源を標的細胞をターゲティングする試薬、例えば細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体又は標的細胞、標的細胞上のレセプターのリガンドなどとともに提供するのが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質が、ターゲティング及び／又は取り込みの促進のために用いられ、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はそのフラグメント、サイクリングにおいて内部移行を受けるタンパク質の抗体、及び細胞内局在化をターゲティングし細胞内半減期を向上させるタンパク質である。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987)及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414 (1990)に記載されている。現在知られている遺伝子標識化及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、WO 93/25673及びそこに引用された参考文献も参照。
好適な遺伝子治療及びレトロウイルス粒子及び構造タンパク質の作成方法は、米国特許第5,681,746号に見出される。
【００７９】
ｖｉ． 診断法としての遺伝子の用途
また本発明は、診断法としてのＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドをコード化する遺伝子の用途に関する。ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドの突然変異は腫瘍の原因でありうるため、変異した形態のＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドの検出は、心血管、内皮及び血管形成の疾患、あるいは心血管、内皮及び血管形成の疾患、例えば腫瘍に対する感受性の診断を可能にする。
ヒトＰＲＯ１７９、ヒトＰＲＯ２３８、ヒトＰＲＯ３６４、ヒトＰＲＯ８４４、ヒトＰＲＯ８４６、ヒトＰＲＯ１７６０、ヒトＰＲＯ２０５、ヒトＰＲＯ３２１、ヒトＰＲＯ３３３、ヒトＰＲＯ８４０、ヒトＰＲＯ８７７、ヒトＰＲＯ８７８、ヒトＰＲＯ８７９、ヒトＰＲＯ８８２、ヒトＰＲＯ８８５又はヒトＰＲＯ８８７ポリペプチドをコード化する遺伝子に変異体を担持する個人は、種々の技術でＤＮＡレベルが検出される。診断用の核酸は患者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織バイオプシー、及び検屍物質から得ることができる。ゲノムＤＮＡは、分析の前にＰＣＲを使用して酵素的に増幅させる(Saikiら, Nature, 324：163-166(1986))か、又は直接検出に使用することができる。ＲＮＡ又はｃＤＮＡは同じ目的のために使用することができる。例として、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドをコード化する核酸に相補的なＰＣＲプライマーを、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチド変異体の同定及び分析に使用することができる。例えば、欠失及び挿入は正常な遺伝子型と比較した増幅産物の大きさの変化により検出することができる。点変異(point mutations)は、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドをコード化する放射能標識されたＲＮＡ、又はＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドをコード化する放射能標識されたアンチセンスＤＮＡ配列に対し、増幅ＤＮＡをハイブリッド形成させることにより同定することができる。好ましい適合配列はＲＮアーゼＡ消化又は溶解温度の相違により非適合二重鎖と区別することができる。
ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝子テストは、変性剤を用いるか用いないで、ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動移動性の変化を検出することにより達成される。小配列の欠失及び挿入は高解像度のゲル電気泳動により可視化することができる。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、変性ホルムアミジン勾配ゲルにおいて区別され、異なるＤＮＡフラグメントの移動は、特定の溶解又は部分的な溶解温度により、ゲルの異なる位置で阻害される。例えば、Myersら, Science, 230：1242(1985)。
また特定の位置における配列変化はヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮアーゼ及びＳＩ保護、又は化学的切断方法、例えばCottonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85：4397-4401(1985)により明らかになる。
よって、特定のＤＮＡ配列の欠失はハイブリッド形成、ＲＮアーゼ保護、化学的切断、直接ＤＮＡ配列化、又は制限酵素、例えば制限フラグメント長のポリモルフィズム(ＲＦＬＰ)の使用、及びゲノムＤＮＡのサザンブロット等の方法により達成することができる。
【００８０】
ｖｉｉ．ＰＲＯポリペプチドレベル検出のための用途
より便宜的なゲル電気泳動及びＤＮＡ配列化に加えて、変異はインサイツ分析で検出することもできる。
ＰＲＯポリペプチドをコード化する核酸の発現は、腫瘍形成に関連した血管の病気、又は新血管新生に連動している。ＰＲＯポリペプチドがシグナル配列を有している場合は、ｍＲＮＡは平滑筋細胞では少ないのに対して内皮細胞では高度に発現しており、このことはＰＲＯポリペプチドが血清中に存在していることを示している。従って、このＰＲＯポリペプチドのレベルの変化が腫瘍形成に関連した血管の病気、又は新血管新生であることを示しているために、抗-ＰＲＯポリペプチド抗体は、このような疾患の診断に使用することができる。
ＰＲＯポリペプチドに特異的な抗体を固体支持体上に取り付け、標識されたＰＲＯポリペプチド及び宿主から誘導されたサンプルを固体支持体に通過させる競合アッセイを使用することもでき、固体支持体に取り付けた検出されるレベルの量はサンプル中のＰＲＯポリペプチドの量と相関関係がある。
【００８１】
ｖｉｉｉ．染色体マッピング
また、本発明の配列は染色体同定において重要である。配列は特異的に標的とされ、個人のヒト染色体の特定の位置にハイブリッド形成させることができる。さらに、染色体の特定の部位を同定するために、現在必要である。実際の配列データ(反復多形性)に基づいたいくつかの染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置のマーキングのために入手可能である。本発明の染色体のＤＮＡマッピングは、病気に関連した遺伝子を有する配列を相関させるために、重要な第１段階である。
簡単に言えば、配列はｃＤＮＡからＰＣＲプライマー(好ましくは１５−２５塩基対)を調製することにより、染色体にマッピングすることができる。３'-非翻訳領域のコンピュータ分析を使用すると、ゲノムＤＮＡの一エクソン以上のスパンではないプライマーが素早く選択され、よって増幅プロセスがより複雑になる。これらのプライマーを、次に、個々のヒト染色体を遺伝子を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが、増幅断片を作成するであろう。
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための急速な手順である。同様のオリゴヌクレオチドプライマーを本発明で使用すると、サブ局部限定を、類似した方法で、大きなゲノムクローンのプール又は特定の染色体からの断片のパネルで達成することができる。同様に、その染色体へのマッピングに使用可能な他のマッピング方法には、インサイツハイブリッド形成、標識されたフローソート染色体を用いたプレスクリーニング、及び染色体特異性ｃＤＮＡライブラリを組み立てるためのハイブリッド形成によるプレ選択が含まれる。
中期染色体展開へのｃＤＮＡクローンの蛍光インサイツハイブリッド形成(ＦＩＳＨ)を、正確な染色体位置を一工程で提供するために使用することができる。この技術は５００又は６００塩基と短いｃＤＮＡで使用することができるが；２０００塩基対を越える長さのクローンは、単純な検出に対して十分なシグナル強さを有する独特の染色体位置に結合する見込みが高い。ＦＩＳＨには、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドをコード化する遺伝子を誘導するクローンの使用が必要であり、長くなればなる程良好になる。例えば、２０００塩基対で良好であり、４０００塩基対でより好ましく、４０００を越えても、時間の合理的なパーセンテージの良好な結果を得るのには、おそらく必要ではない。この技術のレビューについては、Verma等, Human Chromosomes；a Manual of Basic Techniques(Pergamon Press, New York. 1988)を参照されたい。
一度、配列を厳密な染色体位置にマッピングすると、染色体上の配列の物理的位置は遺伝子地図データと相関可能である。このようなデータは、例えば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man（Johns Hopkins University Welch Medical Library)に見出される。次に、同じ染色体領域にマッピングされる遺伝子と病気の関係を連鎖アッセイにより同定する(物理的に隣接する遺伝子の共同相続)。
次に、病気に罹患した又は病気に罹患しなかった個体間のｃＤＮＡ又はゲノム配列における差異を測定する必要がある。変異が病気に罹患し個体の数人又は全員に見出され、正常な個体では見出されない場合、変異は病気の原因であると思われる。
物理的マッピング及び遺伝子マッピング技術の現在の解像度によれば、病気に関連した染色体領域に厳密に位置するｃＤＮＡは、５０と５００潜在的原因遺伝子の間の一つである(このことは、１メガベースのマッピング解像度で、２０ｋｂ当たり１遺伝子であると仮定している)。
【００８２】
ｉｘ． 候補薬のスクリーニングアッセイ
本発明は、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドに類似する（アゴニスト）又はＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドの効果を阻害する（アンタゴニスト）ものを同定するための化合物のスクリーニング方法も包含する。アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここに同定した遺伝子にコードされるＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又は他にコード化ポリペプチドと他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。
このアッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイで、この分野で知られたものを含む種々の方式で実施される。
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドと、これら２つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばミクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化されるＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【００８３】
候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子にコードされる特定のＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドに結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、、Chevray及びNathans, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)に開示されているようにして、(Fields及び共同研究者等［Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991))に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系（一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
ここで同定されたＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドをコード化する遺伝子と細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常は反応混合物は、遺伝子産物と細胞外又は細胞内成分を、それら２つの生成物が相互作用及び結合する条件下及び時間で含むように調製される。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブコントロールを提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）は上記のように監視される。試験化合物を含有する反応混合物ではなく対照反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
【００８４】
ＰＲＯポリペプチドが同時有糸分裂促進物質ＣｏｎＡの存在下で内皮細胞の増殖を刺激する能力を有している場合、スクリーニング方法の一例では、この能力の利点が利用される。特に、増殖アッセイにおいて、ヒト臍帯静脈内皮細胞を得、９６-ウェル平底培養皿(Costar, Cambridge, MA)で培養し、細胞の増殖を容易にするのに適切な反応混合物を補い、該混合物はＣｏｎ-Ａ(Calbiochem, La Jolla, CA)を含有している。Ｃｏｎ-Ａ及びスクリーニングされる化合物を添加し、３７℃でインキュベートした後、培養物を^３−Ｈチミジンで標識し、ガラス繊維フィルター上に収集する(ｐｈＤ；Cambridge Technology, Watertown, MA)。３媒体の平均^３−Ｈチミジン取り込み(cpm)を、液体シンチレーション計測器を使用して測定する(Beckman Instruments. Irvine. CA)。有意な^３−(Ｈ)チミジン混入率が内皮細胞の刺激において示された。
アンタゴニストを検定するために、上述したアッセイを行うが、このアッセイにおいて、ＰＲＯポリペプチドはスクリーニングされる化合物とともに添加してよく、ＰＲＯポリペプチド存在下での^３−(Ｈ)チミジン導入を阻害する化合物の能力が、化合物がＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、ＰＲＯポリペプチド及び膜結合ＰＲＯポリペプチドレセプター又は組換えレセプターを持つ潜在的アンタゴニストを、競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることにより検出してもよい。ＰＲＯポリペプチドは、放射活性等で標識でき、レセプターに結合したＰＲＯポリペプチド分子の数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するのに使用できる。レセプターをコード化する遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及びＦＡＣＳソートにより同定できる。Coligan等, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)。好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化ＲＮＡがＰＲＯポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又はＰＲＯポリペプチド反応性でない他の細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を標識したＰＲＯポリペプチドに暴露する。ＰＲＯポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、結果的に推定レセプターをコード化する単一のクローンを生成する。
【００８５】
これに代わるレセプター同定のアプローチとして、標識したＰＲＯポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料はＰＡＧＥに溶解させ、Ｘ線フィルムに暴露する。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片に分離し、タンパク質マイクロ配列決定を施すことができる。マイクロ配列から得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコード化する遺伝子を同定するｃＤＮＡライブラリをスクリーニングする分解性オリゴヌクレオチドプローブの組の設計に用いられる。
アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識ＰＲＯポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
心血管、内皮及び血管形成の疾患の治療に有用な組成物には、限定するものではないが、標的遺伝子産物の活性及び／又は発現を阻害する抗体、小有機及び無機分子、ペプチド、リンペプチド、アンチセンス及びリボザイム分子、トリプルへリックス分子が含まれる。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとＰＲＯポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、単鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが影響せず、それによりＰＲＯポリペプチドの作用を競合的に阻害するＰＲＯポリペプチドの変異形態であってもよい。
他の潜在的なＰＲＯポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ作成物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡは、標的ｍＲＮＡにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟ＰＲＯポリペプチドをコード化するポリペプチドヌクレオチド配列の５’コード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され（トリプルへリックス−Lee等, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooney等, Science, 241: 456 (1988); Dervan等, Science, 251: 1360 (1991)参照）、それによりＰＲＯポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリッド形成してｍＲＮＡ分子のＰＲＯポリペプチドへの翻訳を阻止する（アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)）。上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に輸送され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させて、ＰＲＯポリペプチドの生産を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【００８６】
アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、一般的に少なくとも約５塩基長、約１０塩基長、約１５塩基長、約２０塩基長、約２５塩基長、約３０塩基長、約３５塩基長、約４０塩基長、約４５塩基長、約５０塩基長、約５５塩基長、約６０塩基長、約６５塩基長、約７０塩基長、約７５塩基長、約８０塩基長、約８５塩基長、約９０塩基長、約９５塩基長、約１００塩基長、又はそれ以上である。
潜在的アンタゴニストは、ＰＲＯポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりＰＲＯリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報、番号WO 97/33551（1997年9月18日発行）を参照されたい。
転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、上掲のＰＣＴ公報、番号WO 97/33551を参照されたい。
これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの一又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
【００８７】
ｘ．治療される心血管、内皮及び血管形成の疾患の型
ここで記載された心血管、内皮及び血管形成アッセイにおいて活性を有し、及び／又はそれらの遺伝子産物が心血管系に位置することが見出されているＰＲＯポリペプチド又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニストは、血管に影響を及ぼす全身疾患、例えば真性糖尿病を含む種々の心血管、内皮及び血管形成の疾患において治療用途を有していると思われる。それらの治療有効性は、動脈、毛細管、静脈、及び／又はリンパ管の病気を含みうる。以下治療例には、筋肉消耗病治療、骨粗鬆症治療、移植周囲の細胞成長を刺激するための移植固定補助、よってその意図する部位への結合を容易にするもの、組織又は血清中のＩＧＦ安定性の増加、適切であるならば、ＩＧＦレセプターへの結合性の増加(ＩＧＦがヒト骨髄赤血球及び顆粒球原種細胞の成長を高めることが、インビトロで示されているため)が含まれる。
また、ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、赤血球生成又は顆粒球生成を刺激し、傷の治癒及び組織の再生を刺激し、組織、例えば結合組織、皮膚、骨、軟骨、筋肉、肺又は腎臓の再成長に関連した治療に関連し、内皮細胞の移動を刺激又は阻害するために使用することができる。ＰＲＯポリペプチド又はアンタゴニストにより媒介される血管形成の増加は、虚血組織、心臓の側枝冠動脈、続いて冠動脈狭窄に有益である。アンタゴニストはこのようなポリペプチドの作用を阻害し、例えば傷の治癒又は胚線維症の間に、過度の結合組織の生成を制限するために使用される。これには急性心筋梗塞及び心不全が含まれる。
さらに、本発明は原因にかかわらず、治療的有効量のＰＲＯポリペプチド、又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニストを投与することによる、心肥大の治療に関する。目的がヒト患者の治療である場合、ＰＲＯポリペプチドは、好ましくは組換えヒトＰＲＯポリペプチド(ｒｈＰＲＯポリペプチド)である。心肥大の治療は、心筋梗塞、高血圧、肥大性心筋症、及び心臓弁逆流を含む、多種多様な病状の結果おける、その種々の段階の任意において行うことができる。治療は、根本にある心疾患にかかわらず、心筋の構造的ダメージを有するか又は有さない、心肥大の進行の全ての段階に広げることができる。
分子のアンタゴニストに対抗する場合、特定の指示に対し、分子それ自身又はそのアゴニストを使用するか否かの決定は、主として、分子が新血管新生、内皮細胞の発生、又は血管形成を促進する、又はこれらの病状を阻害するか否かに依存する。例えば、分子が血管形成を促進する場合は、そのアンタゴニストは血管形成の制限又は防止が所望されている疾患の治療に有用である。このような疾病の例には、血管腫瘍、例えば血管腫、腫瘍血管形成、網膜の新血管新生、糖尿病性網膜症又は時期尚早の幼児性網膜症又は黄斑変性及び増殖性硝子体網膜症に関連した脈絡膜、慢性関節リュウマチ、クローン病、アテローム性動脈硬化、卵巣過剰刺激、乾癬、新血管新生に関連した子宮内膜症、気球血管形成が続く再狭窄、瘢痕組織過剰生成、例えば外科手術の後の形成されるケロイドのようなもの、心筋梗塞の後の線維症、又は胚線維症に関連した線維症障害が含まれる。
しかし、分子が血管形成を阻害するならば、上述した病状の治療に直接使用されることが予期される。
【００８８】
他方、分子が血管形成を刺激する場合、指示に対し、それ自体を所望する血管形成、例えば末梢血管病、高血圧、血管炎、レーノー病及びレーノー現象、動脈瘤、及び動脈再狭窄、血栓静脈炎、リンパ管炎、リンパ浮腫、創傷治癒及び組織の修復、虚血再潅流傷害、アンギナ、心筋梗塞、例えば急性心筋梗塞、慢性心疾患、心不全、例えば鬱血性心不全、及び骨粗鬆症等に使用される。
しかし、分子が血管形成を阻害するならば、そのアンタゴニストは血管形成が所望される病状の治療に使用される。
特定の型の病気は以下に記載され、ここでのＰＲＯポリペプチド又はそのアンタゴニストは疾患の予防、又は治療のための治療標的として、又は標的とする血管放出剤に有用なものとして提供される。アテローム性動脈硬化は、体液の蓄積、平滑筋細胞の増殖、及び動脈壁内の繊維組織の形成により、動脈内の厚みが増した脈管内膜にプラークが蓄積することにより特徴付けられる病気である。病気は、任意の器官において大、中及び小動脈を襲う。内皮及び血管平滑筋細胞機能の変化は、これらのプラークの蓄積及び緩和を調節する、重要な役割を担っていることが知られている。
高血圧は全身性動脈、肺動脈、又は門脈系において血圧が上昇することにより特徴付けられる。上昇した血圧は、欠陥のある内皮機能及び／又は血管病に帰着するか、又はこれらに起因する。
血管炎には、巨大細胞動脈炎、タカヤス動脈炎、多発性動脈nodosa(細小血管障害形態を含む)、カワサキ病、微小多発性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、種々の感染症関連の血管疾患(Henoch-Schonlein prupuraを含む)が含まれる。変更内皮細胞機能はこれらの病気において重要であることが示されている。
レーノー病は及びレーノー現象は、冷気にさらされた手足を通って、循環の間欠性異常欠陥により特徴付けられるものである。変更内皮細胞機能がこれらの病気において重要であることが示されている。
動脈瘤は、変更内皮細胞及び／又は血管平滑筋細胞に関連した動脈又は静脈樹状分の嚢状又は紡錘状拡張症である。
動脈再狭窄(動脈壁再狭窄)は、内皮及び血管平滑筋細胞の増殖及び機能の変更の結果によるもので、続いて血管形成を生じる。
血栓静脈炎は及びリンパ管炎は静脈及びリンパ管の炎症性疾患であり、それぞれ内皮細胞機能の変更に帰着するか、及び／又は起因する。同様に、リンパ浮腫は内皮細胞機能からのリンパ管の欠陥に関連した病状である。
良性及び悪性血管腫瘍のファミリーは、血管系の細胞エレメントの異常な増殖及び成長により特徴付けられる。例えば、リンパ管腫は、先天的で、しばしば膀胱のリンパ系の良性腫瘍、通常新生児に生じるリンパの奇形である。膀胱腫瘍は隣接した組織内で成長する傾向にある。膀胱腫瘍は、通常、子宮頸部及び腋か領域に生じる。また、それらは四肢の軟組織でも生じる。主たる徴候は膨張であり、時折、網状に構造化されたリンパ及びリンパ球(lymphocyst)は結合組織に囲まれている。リンパ管腫は、胎性リンパ管又はそれらの欠失に不適当に結合することに起因すると仮定されている。結果は局所的にリンパドレナージを害している。Griener等, Lymphology, 4: 140-144 (1971)。
【００８９】
ここでのＰＲＯポリペプチド又はそのアンタゴニストの他の用途は、成長及び／又は転移可能な腫瘍の血管新生に関与する腫瘍血管形成にある。このプロセスは新しい血管の成長に依存する。新生物及び腫瘍血管形成に係る関連した病状の例には、乳癌腫、肺癌腫、胃癌腫、食道癌腫、結腸直腸癌腫、肝臓癌腫、卵巣癌腫、テコーマ、男性胚腫、子宮頸部癌腫、子宮内膜癌腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、繊維肉腫、絨毛癌、頭部及び首部の癌、鼻咽腔癌腫、喉頭癌腫、肝臓芽腫、カポジ肉腫、黒色腫、皮膚癌腫、血管腫、海面性血管腫、血管芽腫、膵臓癌腫、網膜癌腫、星状細胞腫、膠芽腫、シュワン細胞腫、乏突起膠細胞腫、髄芽腫、神経芽腫、横紋筋肉腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、尿路肉腫、甲状腺癌腫、ウィルムス腫瘍、腎細胞癌腫、前立腺癌腫、phakomatosesに関連した異常な血管増殖、浮腫(例えば脳腫瘍に関連したもの)、及びMeigs症候群が含まれる。
加齢性黄斑変性(ＡＭＤ)は年輩者の集団における、ひどい視覚損失に至る原因である。ＡＭＤの滲出形態は脈絡膜新血管新生及び網膜色素内皮細胞剥離により特徴付けられる。脈絡膜新血管新生が予後の動的低下に関連しているため、ＰＲＯポリペプチド又はそれらのアンタゴニストは、重度のＡＭＤを低減させるのに有用であることが予期される。
また、外傷の治癒、例えば傷の治癒及び組織の修復は、ここでのＰＲＯポリペプチド又はそれらのアンタゴニストが目的とする用途である。新しい血管の形成及び緩和は、本質的に組織の治癒及び修復である。この範疇には、骨、軟骨、腱、靱帯、及び／又は神経組織の成長又は再生、並びに傷の治癒及び組織の再生及び交換、及び火傷、切断、及び潰瘍の治療が含まれる。骨が正常に形成されない環境で軟骨及び／又は骨の成長を誘発するＰＲＯポリペプチド又はそのアンタゴニストは、骨折及び軟骨のダメージ、又はヒト及び他の動物の欠損の治療に適用される。ＰＲＯポリペプチドまたはそのアンタゴニストを使用するこのような調製物は、骨折の低減及び人工関節の固定の改善において予防的に使用される。骨形成剤により誘発される新たな骨の形成は、先天的、外傷誘発性、又は腫瘍学的、切除誘発性頭蓋欠損の修復に寄与し、また美容形成外科においても有用である。
さらに、ＰＲＯポリペプチド又はそのアンタゴニストは、限定するものではないが、圧迫潰瘍、血管不全に関連した潰瘍、外科的又は外傷的な傷等を含む治癒していない傷を、より良好により早く閉塞させることを促進させるのに有用である。
またさらに、ＰＲＯポリペプチド又はそのアンタゴニストは、他の組織、例えば器官(例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、配列又は内皮を含む)、筋肉(平滑筋、骨格筋又は心筋)、及び血管(血管内皮を含む)組織の生成又は再生、又はこのような組織を含む細胞成長の促進活性を示し得る。所望の効果の一部は、線維性瘢痕化を阻害又は調節して、正常な組織を再生することである。
【００９０】
またここでのＰＲＯポリペプチド又はそのアンタゴニストは、全身的サイトカインダメージからの病状、及び種々の組織における傷の再灌流、肺又は肝臓線維症の治療、及び再生又は保護に有用である。また、ＰＲＯポリペプチド又はそのアンタゴニストは、先駆組織又は細胞からの上述した組織の分化を促進又は阻害、又は上述した組織の成長を阻害するのに有用である。
さらに、ＰＲＯポリペプチド又はそのアンタゴニストは歯周病の治療及び他の歯修復プロセスに使用することができる。このような薬剤は骨形成細胞を誘引し、骨形成細胞の成長を刺激し、又は骨形成細胞の原種の分化を誘発する環境で提供される。ここでのＰＲＯポリペプチド又はそのアンタゴニストは、血管が、骨の回転及び成長の調節において重要な役割を担っているため、骨粗鬆症又は骨関節症の、例えば骨及び／又は軟骨修復を刺激、又は炎症プロセスにより媒介される組織破壊(コラゲナーセ活性、破骨細胞等)のプロセス又は炎症をブロックすることによる治療に有用である。
ここでＰＲＯポリペプチド又はそのアンタゴニストにあるとされる組織再生活性の他の範疇は、腱／靱帯形成である。組織が通常形成されない環境での腱／靱帯様組織又は他の組織形成を誘発するタンパク質は、ヒト及び他の動物の腱又は靱帯の裂け目、奇形、及びの腱又は靱帯の欠損の治癒に適用される。このような調製物は、腱又は靱帯組織へのダメージの予防、並びに腱又は靱帯の骨又は他の組織への固定の改善、及び腱又は靱帯組織の欠損の修復において予防的に使用される。ここでのＰＲＯポリペプチド又はそのアンタゴニストの組成物により誘発される新しい腱／靱帯様組織形成は、先天的、外傷誘発性、又は他の由来による腱又は靱帯のたの欠損の修復に寄与し、また腱又は靱帯の取り付け又は修復のための美容形成外科においても有用である。ここでの組成物は、腱-又は靱帯-形成細胞を誘引、腱-又は靱帯-形成細胞の成長を刺激、腱-又は靱帯-形成細胞原種の分化を誘発、又はイクスビボでの回復インビボでの組織修復効果における腱／靱帯細胞又は原種の成長を誘発する環境で提供される。また、ここでの組成物は、腱炎、手根管症候群、及び他の腱又は靱帯欠損にも有用である。さらに組成物は、当該技術でよく知られている担体と同じ適切なマトリクス及び／又は金属イオン封鎖剤を含む。
【００９１】
ＰＲＯポリペプチド又はそのアンタゴニストは神経細胞の増殖、及び神経及び脳組織の再生、すなわち神経細胞又は神経組織の変性、死亡又は外傷に関与する中枢及び末梢神経系の病気及び神経障害、並びに機械的又は外傷的疾患の治療に有用である。特に、ＰＲＯポリペプチド又はそのアンタゴニストは、末梢神経系の病気、例えば末梢神経損傷、末梢神経障害及び局所的神経障害、及び中枢神経系の病気、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングドン病、筋萎縮性側索硬化症、及びシャイ・ドレーガー症候群の治療に使用される。本発明で治療されるさらなる病状には、機械的又は外傷的疾患、例えば脊髄疾患、頭部外傷及び脳血管疾患、例えば脳卒中が含まれる。また、化学療法又は他の医学的療法の結果による末梢神経障害も、ＰＲＯポリペプチド又はそれに対するアンタゴニストを使用しての治療が可能である。
虚血-再潅流傷害は他の徴候である。内皮細胞機能不全は虚血-再潅流傷害が続いて生じる事象の後遺症の開始及び調節の両方において重要である。
慢性関節リュウマチはさらなる徴候である。血管成長及び脈管構造を通過する炎症細胞の標的は、関節炎のリュウマチ様及び血清ネガティブの形態の病因の重要な要因である。
また、ＰＲＯポリペプチド又はそのアンタゴニストは、病状の進行の防止、無症候性の患者の死を含む急死の回避のために、心肥大を有する患者に予防的に投与される。このような予防的治療は大きな左心室心肥大(成人においては最大壁厚が３５ｍｍ又はそれ以上、又は子供においてはそれに匹敵する値)のケース、又は心臓における血管腫の負荷が特に強くなった場合の例において、特に正当である。
さらにＰＲＯポリペプチド又はそのアンタゴニストは、肥大性心筋症と診断された患者のかなりの部分に発現する、心房細動の治療に有用である。
さらなる徴候には、アンギナ、心筋梗塞、例えば急性心筋梗塞、及び心不全、例えば鬱血性心不全が含まれる。さらなる、非新生物病状には乾癬、糖尿病、及び時期尚早の網膜症、水晶体後方繊維増殖症、新血管緑内障を含む他の増殖性網膜症、甲状腺過形成(グレーブス病を含む)、角膜及び他の組織の移植、慢性的炎症、肺炎、ネフローゼ症候群、子癇前症、心膜滲出(例えば心膜炎に関連するもの)、及び胸膜滲出が含まれる。
上述した観点から、内皮細胞機能、増殖及び／又は形態を変更又はこれに衝撃を与えると示されている、ここで記載されたＰＲＯポリペプチド、又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、上述した多くの又は全ての疾患の原因及び病因において重要な役割を担っており、これらの疾患を標的とする血管関連剤、又はこれらのプロセスを増大又は阻害するための治療標的として提供可能であると思われる。
【００９２】
ｘｉ．投与プロトコル、スケジュール、用量及び製剤
ここに記載された分子及びそれらのアゴニスト及びアンタゴニストは、上述した種々の疾患及び病気の予防及び治療薬として製薬的に有用である。
ＰＲＯポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニストの治療用組成物は、適当な純度を持つ所望の分子を任意の製薬的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.編, (1980)）と、凍結乾燥した製剤又は水溶液の形態で混合することにより調製することができる。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、好ましくは用いられる投与量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸炎、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンザルコニウムクロライド；ベンゼトニウムクロライド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）；及び／又はＴＷＥＥＮ^ＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ^ＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
このような担体の更なる例は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、マグネシウムトリシリケート、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、及びプロピレングリコールである。局所用の担体又はゲルベースの形態は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース又はメチルセルロース等の多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、及びモクロウアルコールを含む。あらゆる投与について、従来のデポー形態が好適に用いられる。このような形態は、例えば、マイクロカプセル、ナノ-カプセル、リポソーム、硬膏剤、吸入形態、鼻スプレー、舌下状錠剤、及び除放性製剤を含む。ＰＲＯポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニストは、典型的にはそのような媒体中に約０．１ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの濃度で処方される。
【００９３】
他の調製物は、形成された製品中に、ＰＲＯポリペプチド又はそれらのアンタゴニストを導入して含有される。このような製品は内皮細胞の成長及び血管形成の調節に使用することができる。加えて、腫瘍侵入及び転移をこれらの製品で調節してよい。
インビボ投与に用いられるＰＲＯポリペプチド又はアンタゴニストは無菌でなければならない。これは、凍結乾燥及び再形成の前又は後の滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。ＰＲＯポリペプチドは通常は凍結乾燥形態又は全身投与される場合には溶液中に貯蔵される。凍結乾燥形態にある場合、ＰＲＯポリペプチド又はアゴニストは典型的には使用時の適当な希釈剤を含む他の成分と組み合わせて処方される。ＰＲＯポリペプチド又はアンタゴニストの液体製剤の例は、無菌の、透明な、無色の生鮮溶液で、皮下注射用の１回投与バイアルに充填されている。繰り返し使用に適切な防腐製薬組成物は、例えばポリペプチドの種類及び指示に主として依存し、
ａ）ＰＲＯポリペプチド又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニスト；
ｂ）溶液中のポリペプチド又は他の分子の安定性を最大にする範囲内のｐＨ、好ましくは約４-８のｐＨを維持可能なバッファー；
ｃ）主として、撹拌誘発性集合体に対しポリペプチド又は分子を安定化させる洗浄剤／界面活性剤；
ｄ）等張剤；
ｅ）フェノール、ベンジルアルコール及びベンゼトニウムハロゲン化物、例えば塩化物の群から選択される防腐剤；及び
ｆ）水；
を含有し得る。
使用される洗浄剤が非イオン性であるならば、それは、例えばポリソルベート(例えば、POLYSORBATE^ＴＭ(TWEEN^ＴＭ)２０、８０等)、ポロキサマー(例えば、POLOXAMER^ＴＭ１８８等)であってよい。非イオン性界面活性剤を使用することにより、タンパク質の変性を引き起こすことなく、表面応力の剪断に調製物をさらすことができる。さらに、このような界面活性剤含有調製物は、エアゾール装置、例えば静脈投与、及びニードレスジェッ注入ガンに使用されるものにおいて、使用され得る(例えば、EP257,956を参照されたい)。
等張剤は、ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの液体組成物を確実に等浸透圧とするために存在し、多価糖アルコール、好ましくは３価又は高級糖アルコール、例えばグリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールが含まれる。これらの糖アルコールは、単独で、又は組合せて使用することもできる。また、塩化ナトリウム又は他の適切な塩を、溶液を等にするために使用してもよい。
バッファーは、所望するｐＨに応じて、アセタート、シタラート、スクシナート又はホスファートバッファーであってよい。本発明の液状調製物の一種類のｐＨは、約４から８、好ましくはほぼ生理学的ｐＨの範囲に緩衝される。
防腐剤、フェノール、ベンジルアルコール及びベンゼトニウムハロゲン化物、例えば塩化物は、使用可能な周知の抗菌薬である。
【００９４】
治療用ＰＲＯポリペプチド組成物は、一般的に無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを具備するバイアルに配される。製剤は、好ましくは静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、又は筋肉内（ｉ．ｍ．）の繰り返し注射として、あるいは鼻内又は肺内送達に適したエアロゾル製剤として投与される（肺内送達については、例えばEP 257,956参照）。
また、ＰＲＯポリペプチドは持続放出製剤の形態で投与することもできる。持続放出製剤の好適な例は、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、当該マトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、Langer等, J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981)及びLanger, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)に記載されたようなポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)）、ポリアクチド（米国特許第3,773,919号、EP 58,481）、Ｌ-グルタミン酸及びガンマエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー（Sidman等, Biopolymers, 22: 547-556 (1983)）、非分解性エチレン−酢酸ビニル（Langer等, 上掲）、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばLupron Depot^ＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマ及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能な微小球）、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸（EP 133,988）を含む。
エチレン−酢酸ビニルや乳酸−グリコール酸等の重合体は１００日以上分子を放出できるが、特定のヒドロゲルはより短い時間タンパク質を放出する。カプセル化タンパク質は、長時間体内に残存すると、３７℃で水分に曝されることで、変性又は凝集し、生理活性の喪失や免疫原生の変化のおそれがある。かかる機構によって安定性を得るための合理的な処置が考えられる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ―Ｓ結合であることが分かったら、スルフヒドリル残基を変更し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分量を調整し、適当な添加物を使用し、特定の重合体マトリクス化合物を開発することで安定性を保証することができる。
ＰＲＯポリペプチドの持続放出組成物は、リポソーム的に包括されたＰＲＯポリペプチドを含む。ＰＲＯポリペプチドを含有するリポソームは、それ自体周知である方法、例えば、DE 3,218,121、Epstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985)、Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 (1980)、EP 52,322、EP 36,676、EP 88,046、EP 143,949、EP 142,641、特願昭58-118008、米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号、及びEP 102,324等による方法によって調製する。通常、リポソームは、脂質含有量が約３０モル％以上コレステロールであり、選択される割合が最適な治療法に対して調整された微小（約２００-８００オングストローム）な単ラメラ状のものである。
【００９５】
ＰＲＯポリペプチド又はそのアンタゴニストの治療的有効量は、当然のことながら、治療（予防を含む）すべき病理学的状態、投与方法、治療に用いられる化合物の型、包含される任意の同時治療、患者の年齢、体重、一般的な医学的状態、医学的履歴などの要因によって変化し、それは担当する医師の技量の範囲内で良好に決定される。従って、治療者は、最大の治療効果が得られるように、投与量を滴定し投与経路を修正する必要がある。ＰＲＯポリペプチドが狭い範囲の宿主を有しているならば、ヒトの患者の治療には、ヒトＰＲＯポリペプチド、より好ましくは天然配列ヒトＰＲＯポリペプチドを含有する調製物であることが好ましい。臨床医は投与量が当該病状の治療において所望する効果が得られるまで、ＰＲＯポリペプチドを投与するであろう。例えば、目的がＣＨＦの治療である場合、この病状に関連した進行性心肥大を阻害する量とされる。この治療及び進行状況は、エコーカルジオグラフィーにより容易に監視される。同様に、肥大性心筋症の患者には、経験に基づいてＰＲＯポリペプチドを投与することができる。
上記の指針では、有効投与量は、一般的に約０．００１から約１．０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．０１−１．０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．０１−０．１ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
成人の高血圧の治療における非経口用途では、注射の形態で、体重１ｋｇ当たり約０．０１から５０ｍｇ、好ましくは約０．０５から２０ｍｇ、最も好ましくは１から２０ｍｇのＰＲＯポリペプチドを、静脈内注射により１日に１から３回投与するのが有利である。経口投与では、ＰＲＯポリペプチドをベースとする分子を、好ましくは体重１ｋｇ当たり約５ｍｇから１ｇ、好ましくは約１０から１００ｍｇ、１日に１から３回投与する。内毒素汚染物質、安全レベルの最小量、例えば０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に保持すべきである。さらにヒト投与では、調製物は好ましくは滅菌され、発熱性であり、一般的に安全で、FDA Office and biologics standardsで要求されるようにして精製される。
組織再生に使用されるＰＲＯポリペプチドを含有する製薬組成物の用量計画は、ポリペプチドの作用を変える種々の要因、例えば、形成が望まれる組織(例えば骨)の重量、患者の年齢、性別、食餌、感染症の重傷度、投与時間、及び他の臨床的要因を考慮して、担当する医師により決定されるであろう。用量は、再構成に使用されるマトリクスの種類、製薬組成物の他のタンパク質含有物により変わり得る。例えば、他の周知の成長因子、例えばＩＧＦ−Ｉを最終組成物に添加すると、さらに用量に影響を与える。進行状況は組織／骨の成長及び／又は修復を、例えばＸ線、組織形態測定(histomorphometric determinations)及びテトラサイクリン標識化により、定期的に評価することにより監視可能である。
【００９６】
ＰＲＯポリペプチド又はアンタゴニスト又はアゴニスト投与の経路は周知の方法に従い、例えば静脈内、筋肉内、脳内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、眼内、関節内、滑膜内、包膜内、経口、局所又は吸入経路による注射又は注入、あるいは以下に記載する持続放出系による。またＰＲＯポリペプチド又はそれらのアンタゴニストは腫瘍内、腫瘍周辺、病巣内、又は病巣周辺経路で好適に投与され、局所的並びに全身に治療効果を発揮する。腹腔内経路は、例えば卵巣腫瘍の治療に特に有用であることが予期されている。
ペプチド又は小分子がアンタゴニスト又はアゴニストとして使用される場合、好ましくは、液体又は固体の形態で経口的又は非経口的に哺乳動物に投与される。
塩を形成し下記において有用な分子の薬理学的に許容される塩類の例には、アルカリ金属塩(例えばナトリウム塩、カリウム塩)、アルカリ土類金属塩(例えばカルシウム塩、マグネシウム塩)、アンモニウム塩、有機塩基塩(例えばピリジン塩、トリエチルアミン塩)、無機酸塩(例えば塩酸、硫酸塩、硝酸塩)及び有機酸塩(例えば酢酸塩、シュウ酸塩、ｐ-トルエンスルホン酸塩)が含まれる。
ここで記載され、骨、軟骨、腱、又は靱帯再生に有用な組成物における治療方法には、移植又は装置としての、局所的(topically)、全身的又は局部的(locally)な組成物の投与が含まれる。投与した場合、有用な治療用組成物は、発熱物質を含有しない生理学的に許容可能形態である。さらに組成物は、骨、軟骨又は組織のダメージ部位に送達される粘性のある形態で注射されるかカプセル化されることが望ましい。局所的投与は傷の治癒及び組織の修復に適している。好ましくは、骨及び／又は軟骨の形成のためには、組成物は、骨及び／又は軟骨のダメージ部位にタンパク質含有組成物を送達せしめ、好ましくは体内に再吸収可能な骨及び軟骨を発育する構造体を提供することのできるマトリクスを含む。このようなマトリクスは他の移植医療用途に使用される材料で作成される。
【００９７】
マトリクス材料の選択は、生物学的融和性、生物分解性能、機械的特性、美容的外観、及び界面活性に基づく。組成物の特定の用途は、適切な処方により定義される。組成物の潜在的マトリクスは生物分解性であり、化学的に定義される硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びポリ無水物であってよい。他の潜在的マトリクスは生物分解性で生物学的に明確に定義された、例えば骨又は真皮コラーゲンである。さらなるマトリクスは純粋タンパク質又は細胞外マトリクス成分からなる。他の潜在的マトリクスは、非生物分解性であり、化学的に定義された、例えば焼結ヒドロキシアパタイト、生体ガラス、アルミナート、又は他のセラミックスである。マトリクスは上述した任意の種類の材料、例えばポリ乳酸とヒドロキシアパタイト又はコラーゲンとリン酸三カルシウムの組合せからなるものであってもよい。生物セラミックは組成において、例えばカルシウム-アルミナート-ホスファートに変えてもよく、孔サイズ、粒子サイズ及び生物分解性能を変更するためのプロセスが施されていてもよい。
特定の一実施態様では、乳酸とグリコール酸が５０：５０(モル重量)のコポリマーであり、１５０から８００ミクロンの範囲の直径を有する多孔質粒子の形態である。いくつかの用途において、金属イオン封鎖剤、例えばカルボキシメチルセルロース、又は自己移植血塊を利用し、マトリクスからの分離から組成物を保護するのに有用である。
一好適なファミリーの金属イオン封鎖剤は、セルロース材料、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースを含むアルキルセルロース(ヒドロキシアルキルセルロースを含む)であり、好ましくはカルボキシメチルセルロース(ＣＭＣ)のカチオン塩である。他の好ましい金属イオン封鎖剤には、ヒアルロン酸、アルギニン酸ナトリウム、ポリ(エチレングリコール)、ポリオキシエチレンオキシド、カルボキシビニルポリマー、及びポリ(ビニルアルコール)が含まれる。ここで有用な金属イオン封鎖剤の量は、調製物の全量に基づき、０．５−２０重量％、好ましくは１−１０重量％であり、ポリマトリクスからのポリペプチド(又はそのアンタゴニスト)の脱着を防止し、組成物に適切な操作性を付与し、さらに原細胞のマトリクスへの浸透を防止し、よって、ポリペプチドに原細胞の骨形成活性を助長する機会を付与するのに必要な量である。
【００９８】
ｘｉｉ． 組合せ治療
当問題となる疾患の防止又は治療におけるＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチド、アミンそのアゴニスト又はアンタゴニストの効力は、同じ組成物又は別個の組成物において、これらの目的のために有効な他の薬剤と組合せるか、又は活性剤を連続して投与することにより改善される。
例えば、心肥大の治療のためには、ＰＲＯポリペプチド治療は、周知の心筋ミオサイト肥大因子のインヒビター、例えばフェニレフリン等のα-アドレナリンアゴニストのインヒビター；エンドセリン-Ｉインヒビター、例えばBOSENTAN^ＴＭ及びMOXONODIN^ＴＭ；ＣＴ-１に対するインヒビター(米国特許第5,679,545号)；ＬＩＦに対するインヒビター；ＡＣＥインヒビター；デス-アスパラタート-アンジオテンシンＩインヒビター(米国特許第5,773,415号)及びアンジオテンシンＩＩインヒビターの投与を組合せることができる。
高血圧に関連した心肥大の治療のためには、ＰＲＯポリペプチドを、β-アドレナリン様レセプターブロック剤、例えばプロプラノロール、チモロール、タータロロール、カルテオロール、ナドロール、ベタキソロール、ペンブトロール、アセトブトロール、アテノロール、メトプロロール、又はカーベジルロール；ＡＣＥインヒビター、例えばクイナピリル、カプトプリル、エナラプリル、ラミプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル又はリシノプリル；ジウレティクス、例えばクロロチアザイド、ヒドロクロロチアザイド、ヒドロフルメタザイド、メチルクロチアザイド、ベンズチアザイド、ジクロロフェナミド、アセタゾラミド、又はインダパミド；及び／又はカルシウムチャンネルブロッカー、例えばジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル又はニカルジピンと組合せて投与することができる。一般名によりここで同定された治療薬を遺伝子製薬用組成物は市販されており、用量、投与方法、副作用、禁忌等の製造者の使用説明書に従い投与される。例えば、Physicians'Desk Reference(Medical Economics Data Production Co.：Montvale, N.J., 1997), 51th版を参照されたい。
【００９９】
心肥大の治療における組合せ治療用の好ましい候補薬は、β-アドレナリン様レセプターブロック剤(プロプラノロール、チモロール、タータロロール、カルテオロール、ナドロール、ベタキソロール、ペンブトロール、アセトブトロール、アテノロール、メトプロロール、又はカーベジルロール）、ベラパミル、ジフェジピン、又はジルチアゼムである。高血圧を伴う肥大の治療には、カルシウムチャンネルブロッカー、例えばジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル及びニカルジピン；β-アドレナリン様レセプターブロック剤；ジウレティクス、例えばクロロチアザイド、ヒドロクロロチアザイド、ヒドロフルメタザイド、メチルクロチアザイド、ベンズチアザイド、ジクロロフェナミド、アセタゾラミド、又はインダパミド；及び／又はＡＣＥインヒビター、例えばクイナピリル、カプトプリル、エナラプリル、ラミプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル又はリシノプリルを使用する、抗高血圧治療薬の使用が必要である。
他の徴候のために、ＰＲＯポリペプチド又はそれらのアンタゴニストは、当該問題における骨及び／又は軟骨欠損、傷又は組織の治療に有用な他の薬剤と組合せてもよい。このような薬剤には、種々の成長因子、例えばＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ-α又はＴＧＦ-β、ＩＧＦ、ＦＧＦ、及びＣＴＧＦが含まれる。
加えて、癌の治療に使用されるＰＲＯポリペプチド又はそれらのアンタゴニストは、上述にて同定したような細胞障害剤、化学療法剤又は成長阻害剤と組合せられる。また癌の治療のために、ＰＲＯポリペプチド又はそのアンタゴニストは適切に連続投与されるか、又は、放射活性物質の照射又は投与を含んでも含まなくても、放射線学的治療と組合せられる。
ＰＲＯポリペプチド又はそのアンタゴニストと組合せて投与される治療薬の有効量は、医師又は獣医の裁量による。投与量とその調節は処理される病状に最大の治療効果が達成されるようになされる。例えば、高血圧の治療においては、これらの量は、理想的にはジウレティクス又はデジタルの使用、及び高血圧又は低血圧、腎損傷等を考慮に入れる。用量は、治療される特定の患者及び使用される治療薬の種類等の因子に依存する。典型的には、使用される量は、治療薬をＰＲＯポリペプチドと共に投与しない場合と同じ用量である。
【０１００】
ｘｉｉｉ． 製造品
上述した疾患の診断又は治療に有用なＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチド又はそのアンタゴニストを含むキットのような製造品は、少なくとも１つの容器及びラベルを具備する。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような種々の物質から形成できる。容器は、状態の診断又は治療に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを具備する静脈内バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の活性剤はＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストである。容器上又は添付されるラベルには、組成物が選択した状態の診断又は治療に使用されることが示されている。この製造品は、製薬的に許容されるバッファー、例えばリン酸緩衝塩水、リンガー液、及びデキストロース溶液を収容した第２の容器をさらに具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明書を備えた包装挿入物を含む、商業的及び使用者の立場から望ましい他の材料を具備してもよい。また、この製造品は、上述の他の活性剤を収容した第２又は第３の容器を具備してもよい。
【０１０１】
Ｅ． 抗体
本発明の多くの有用な候補薬のいくつかは、ここで同定された遺伝子の生成、又は遺伝子生成物を阻害、及び／又は遺伝子生成物の活性を低減する抗体及び抗体フラグメントである。
ｉ． ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【０１０２】
ｉｉ． モノクローナル抗体
あるいは、抗-ＰＲＯ１７９、抗-ＰＲＯ２３８、抗-ＰＲＯ３６４、抗-ＰＲＯ８４４、抗-ＰＲＯ８４６、抗-ＰＲＯ１７６０、抗-ＰＲＯ２０５、抗-ＰＲＯ３２１、抗-ＰＲＯ３３３、抗-ＰＲＯ８４０、抗-ＰＲＯ８７７、抗-ＰＲＯ８７８、抗-ＰＲＯ８７９、抗-ＰＲＯ８８２、抗-ＰＲＯ８８５又は抗-ＰＲＯ８８７抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的には対象とするＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する。Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,(New York；Academic Press, 1986) pp. 59-103。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバージニア州マナサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている。Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) pp. 51-63。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【０１０３】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる。Goding, 上掲。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコード化するＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコード化する遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより（米国特許第4,816,567号；Morrison等, 上掲)、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、そのフラグメント、特にＦａｂフラグメントの生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【０１０４】
ｉｉｉ． ヒト及びヒト化抗体
抗-ＰＲＯ１７９、抗-ＰＲＯ２３８、抗-ＰＲＯ３６４、抗-ＰＲＯ８４４、抗-ＰＲＯ８４６、抗-ＰＲＯ１７６０、抗-ＰＲＯ２０５、抗-ＰＲＯ３２１、抗-ＰＲＯ３３３、抗-ＰＲＯ８４０、抗-ＰＲＯ８７７、抗-ＰＲＯ８７８、抗-ＰＲＯ８７９、抗-ＰＲＯ８８２、抗-ＰＲＯ８８５又は抗-ＰＲＯ８８７抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはそのフラグメント(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')_２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はＣＤＲの残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)。
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒトを源にする一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリを含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。また、Cole等及びBoerner等の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる。Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) 。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg等, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-813 (1994); Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
【０１０５】
ｉｖ． 二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本ケースの場合において、結合特異性の一方はＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく。Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のWO 93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-3659 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコード化するＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【０１０６】
ｖ． ヘテロ抱合抗体
ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため(米国特許第4,676,980号)及びＨＩＶ感染の治療のために（WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089)提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,676,980号に開示されているものが含まれる。
ｖｉ． エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌治療における抗体の有効性を向上させるのが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体-依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有しうる。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体はまた、Wolff等, Cancer research 53: 2560-2565 (1993)に記載されたような異種二官能性架橋を用いても調製しうる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
【０１０７】
ｖｉｉ． 免疫抱合体
本発明はまた、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はそのフラグメント）などの細胞障害剤、あるいは放射性同位体（即ち、放射性抱合）に抱合された抗体を含む免疫抱合体にも関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学療法剤は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性抱合抗体の生成に利用可能である。例として、^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^９０Ｙ及び^１８６Ｒｅを含む。
抗体及び細胞障害剤の抱合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。WO 94/11026参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」（ストレプトアビジン等）に抱合されてもよく、抗体-レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞障害剤（例えば、放射性ヌクレオチド等）に抱合された「リガンド」（アビジン等）を投与する。
ｖｉｉｉ． 免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ-ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズの孔のフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、Martin等, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学療法剤（ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
【０１０８】
ｉｘ． 抗体の製薬組成物
ここで同定されるＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、上記及び下記に記した種々の疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドが細胞内であり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、内在化抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体フラグメントを細胞に導入するのに使用できる。抗体フラグメントが用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞障害剤、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science, 上掲に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
持続放出製剤を調製してもよい。持続放出製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。持続放出性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号）、Ｌ-グルタミン酸及びγ-エチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０１０９】
ｘ． 抗体を使用する治療方法
ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドに対する抗体を上述した種々の心血管、内皮及び血管形成病の治療に使用できることが予期されている。
抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入経路などにより投与される。抗体の静脈内投与が好ましい。
他の治療的養生法を例えば本発明の抗体の投与と組み合わせてもよい。例えば、抗体で癌の治療をする場合は、このような抗体で治療される患者は放射線治療を受けてもよい。あるいは、又はそれに加えて、患者に化学療法剤を投与してもよい。このような化学療法剤の調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務者により経験的に決定される。そのような化学治療に対する調製法及び用量スケジュールはまたChemotherapy Service M.C. Perry編, (Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 1992)にも記載されている。化学療法剤は、抗体の投与に先立って、又は続いて投与してもよく、あるいはそれらと同時に投与してもよい。抗体は、タモキシフェン又はEVIST^ＴＭ等の抗エストロゲン化合物又はオナプリストンなどの抗プロゲステロン（EP 616812参照）の、それらの分子について知られた用量と組み合わせてもよい。
また、抗体を癌の治療に使用する場合、他の腫瘍関連抗原に対する抗体、例えば一又は複数のＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又はＶＥＧＦレセプターに結合する抗体を投与することも好ましい。また、上述した薬剤も含む。抗体は適切に連続投与されるか、又は、放射活性物質の照射又は投与を含んでも含まなくても、放射線学的治療と組合せられる。あるいは、又はそれに加えて、ここで開示されており、同じか、又は二又はそれ以上の異なる抗原に対して結合する二又はそれ以上の抗体を、患者に同時投与してもよい。ときどきは、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有利である。好ましい実施態様では、ここの抗体は、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いて本発明の抗体を投与する。しかしながら、同時投与、又は本発明の抗癌剤を最初に投与することも考えられる。成長阻害剤についての適切な用量は現在用いられている量であるが、成長阻害剤とこの抗体との組み合わせ（相乗）効果により減少させ得る。
【０１１０】
一実施態様において、腫瘍の血管新生は、組合せ治療において攻撃される。抗-ＰＲＯポリペプチド抗体及び他の抗体(例えば抗-ＶＥＧＦ)は、例えば腫瘍又は転移病巣の壊死がみられるように決定された治療的有効量で、腫瘍を有する患者に投与される。この治療は、好ましい効果が観察されるか、又は腫瘍又は任意の転移病巣の痕跡がなくなるまで続けられる。ついで、ＴＮＦを、補助剤、例えばアルファ-、ベータ-又はガンマ-インターフェロン、抗-ＨＥＲ２抗体、ヘレグリン(heregulin)、抗ヘレグリン抗体、Ｄ-因子、インターロイキン-１(ＩＬ-１)、インターロイキン-２(ＩＬ-２)、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ-ＣＳＦ)、又は腫瘍中の微細血管凝固促進剤、例えば抗-プロテインＣ抗体、抗-プロテインＳ抗体、又はＣ４ｂ結合プロテイン(1991年2月21日公開のWO91/01753)。
補助剤はその有効性に応じて変わり、便宜的な方式でスクリーニングされるマトリクスにより、腫瘍における影響力と比較することが望ましい。抗-ＰＲＯポリペプチド抗体及びＴＮＦの投与は、所望する臨床効果が達成されるまで繰り返される。また、抗-ＰＲＯポリペプチド抗体は、ＴＮＦ、場合によっては補助剤と共に投与される。固形腫瘍が、四肢又は一般的な循環器からの単離が可能な他の位置で見出される例では、ここに記載される治療薬は単離された腫瘍又は器官に投与される。他の実施態様において、ＦＧＦ又はＰＤＧＦアンタゴニスト、例えば抗-ＦＧＦ又は抗-ＰＤＧＦ中和剤は、抗-ＰＲＯポリペプチド抗体と共に患者に投与される。抗-ＰＲＯポリペプチド抗体を用いた治療は、好ましくは傷の治癒又は所望する新血管新生の期間中は中止する。
心血管、内皮及び血管形成の疾患の予防又は治療のための、ここでの抗体の適切な用量は、上記で定義したような治療される疾患の型、疾患の重篤さ及び経過、防止又は治療目的で薬剤が投与されるか否か、従前の治療、患者の臨床履歴及び抗体に対する反応、及び主治医の裁量による。抗体は、適切には患者に一回又は一連の治療に渡って適切に投与される。
例えば、疾患の型及び重篤さに応じて、約１μｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば、１又はそれ以上の別々の投与あるいは連続注入のいずれにしても、患者に投与するための最初の候補用量である。典型的な１日の用量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上であろう。数日以上に渡る繰り返し投与のためには、状態に応じて、疾患の徴候に所望の抑制が現れるまで治療が続けられる。しかしながら、他の用量計画が有用であることもある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイ、例えばＸ線腫瘍イメージングによって容易に監視される。
【０１１１】
ｘｉ． 製造品
また、抗体を収容する容器とラベルを含む製造品を提供する。このような製造品は上述しており、ここで活性剤は抗-ＰＲＯ１７９、抗-ＰＲＯ２３８、抗-ＰＲＯ３６４、抗-ＰＲＯ８４４、抗-ＰＲＯ８４６、抗-ＰＲＯ１７６０、抗-ＰＲＯ２０５、抗-ＰＲＯ３２１、抗-ＰＲＯ３３３、抗-ＰＲＯ８４０、抗-ＰＲＯ８７７、抗-ＰＲＯ８７８、抗-ＰＲＯ８７９、抗-ＰＲＯ８８２、抗-ＰＲＯ８８５又は抗-ＰＲＯ８８７抗体である。
ｘｉｉ．抗体を使用する腫瘍の診断及び予知
抗体が使用される徴候が癌である場合、或る種の腫瘍で過剰発現される成長レセプター等の細胞表面タンパク質は候補薬剤又は腫瘍（例えば、癌）治療の優れた標的であるが、ＰＲＯポリペプチドと同じタンパク質は腫瘍の診断及び予知におけるさらなる用途が見出されている。例えば、ＰＲＯポリペプチドに対して向けられる抗体は腫瘍の診断及び予知に使用することができる。
例えば、抗体断片を含む抗体は、ＰＲＯポリペプチドをコード化する遺伝子を含む遺伝子の発現の定性的又は定量的検出に用いることができる。抗体は、好ましくは検出可能な、例えば蛍光標識を備え、結合は光学顕微鏡、フローサイトメトリー、フルオロメトリー、又はこの分野で知られた他の技術によって監視できる。このような結合アッセイは、実質的に上述のように実施される。
マーカー遺伝子産物に結合する抗体のインサイツ検出は、例えば、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡によって実施できる。この目的のために、組織学的試料を患者から取り出し、好ましくは生物学的試料に抗体を被せることにより、標識抗体をそれに適用する。この手法はまた、試験される組織におけるマーカー遺伝子産物の分布も決定できるようにする。当業者には、インサイツ検出のために広範な組織学的方法が容易に利用できることは明らかであろう。
【０１１２】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び文献の開示の全体を、出典明示によりここに取り込む。
（実施例）
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、ＶＡである。特に記さない限り、本発明は上記及び以下の教科書に記載されたもののような組換えＤＮＡ技術の標準的な手法を用いた：上掲のSambrook等; Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology（Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989）; Innis等, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications（Academic Press, Inc.; N.Y.., 1990); Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis（IRL Press, Oxford, 1984）; Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan等, Current Protocols in Immunology, 1991。
【０１１３】
実施例１
新規なポリペプチド及びそれをコード化するｃＤＮＡを同定するための細胞外ドメイン相同性スクリーニング
Swiss-Prot公的データベースからの約９５０の既知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列（もしあれば、分泌シグナル配列を含む）を、ＥＳＴデータベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは、公的データベース（例えば、GenBank）及び企業のデータベース（例えば、LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST-2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて、ＥＣＤタンパク質配列のＥＳＴ配列の６フレーム翻訳との比較として実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, WA）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。
この細胞外ドメイン相同性スクリーニングを用いて、phrapを用いて他の同定されたＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。さらに、得られたコンセンサスＤＮＡ配列を、しばしば（常にではない）BLAST又はBLAST-2及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長し、コンセンサス配列を上で議論したＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。
上記のように得られたコンセンサス配列に基づいて、次いでオリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及びＰＲＯポリペプチドの全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして用いるために使用した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般的に２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与えるように設計される。プローブ配列は、典型的に４０−５５ｂｐ長である。幾つかの場合には、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐより大きいときに付加的なオリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, 上掲のように、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象とする遺伝子をコード化するクローンの単離するのに使用した。
ｃＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動で適当にサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター（ｐＲＫ５Ｂ又はｐＲＫ５Ｄ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位において、所定の方向でクローニングした。
【０１１４】
実施例２
アミラーゼスクリーニングによるｃＤＮＡクローンの単離
１．オリゴｄＴプライムｃＤＮＡライブラリの調製
ｍＲＮＡを、対象とするヒト組織から、Invitrogen, San Diego, CAからの試薬及びプロトコールを用いて単離した（Fast Track 2）。このＲＮＡを、Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script Plasmid System)からの試薬及びプロトコールを用いるベクターｐＲＫ５ＤにおけるオリゴｄＴプライムしたｃＤＮＡの生成に使用した。この方法において、二本鎖ｃＤＮＡは１０００ｂｐを越えるサイズで分類され、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ結合ｃＤＮＡをＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断ベクターにクローニングした。ｐＲＫ５Ｄを、ｓｐ６転写開始部位、それに続くＳｆｉＩ制限酵素部位、さらにＸｈｏＩ／ＮｏｔＩｃＤＮＡクローニング部位を持つベクターにクローニングした。
２．ランダムプライムｃＤＮＡライブラリの調製
一次ｃＤＮＡクローンの５’末端を好ましく表すために二次ｃＤＮＡライブラリを作成した。Ｓｐ６ＲＮＡを（上記の）一次ライブラリから生成し、このＲＮＡを、ベクターｐＳＳＴ-ＡＭＹ．０におけるLife Technologies (上で参照したSuper Script Plasmid System)からの試薬及びプロトコールを用いたランダムプライムしたｃＤＮＡライブラリの生成に使用した。この方法において、二本鎖ｃＤＮＡを５００−１０００ｂｐにサイズ分類し、平滑末端でＮｏｔＩアダプターに結合させ、ＳｆｉＩ部位で切断し、そしてＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ切断ベクターにクローニングした。ｐＳＳＴ-ＡＭＹ．０は、ｃＤＮＡクローニング部位の前に酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモーターを有し、さらにクローニング部位の後に、マウスアミラーゼ配列（分泌シグナルを持たない成熟配列）に続く酵母アルコールデヒドロゲナーゼ転写終結区を有するクローニングベクターである。即ち、アミラーゼ配列でフレームに融合するこのベクターにクローニングされたｃＤＮＡは、適当に形質移入された酵母コロニーからのアミラーゼの分泌を導くであろう。
【０１１５】
３．形質転換及び検出
上記２パラグラフに記載したライブラリからのＤＮＡを氷上で冷却し、それにエレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細菌（Life Technoligies、２０ｍｌ）を添加した。細菌及びベクターの混合物は、次いで製造者に推奨されているように電気穿孔した。次いで、ＳＯＣ培地（Life Technplogies、１ｍｌ）を添加し、この混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。形質転換体は、次いでアンピシリンを含む２０の標準１５０ｍｍＬＢプレートに蒔き、１６時間インキュベートした（３７℃）。ポジティブコロニーをプレートから廃棄し、細菌ペレットから標準的な方法、例えばＣｓＣｌ-勾配を用いてＤＮＡを単離した。精製ＤＮＡは、次いで以下の酵母プロトコールを実施した。
酵母法は３つのカテゴリーに分けられる：（１）酵母のプラスミド／ｃＤＮＡ結合ベクターでの形質転換；（２）アミラーゼを分泌する酵母クローンの検出及び単離；及び（３）酵母コロニーから直接的な挿入物のＰＣＲ増幅及び配列決定及びさらなる分析のためのＤＮＡの精製。
用いた酵母菌株はＨＤ５６-５Ａ（ATCC-90785）であった。この株は以下の遺伝子型：ＭＡＴアルファ、ｕｒａ３-５２、ｌｅｕ２-３、ｌｅｕ２-１１２、ｈｉｓ３-１１、ｈｉｓ３-１５、ＭＡＬ^＋、ＳＵＣ^＋、ＧＡＬ^＋を有する。好ましくは、不完全な翻訳後経路を持つ酵母変異体を用いることができる。このような変異体は、ｓｅｃ７１、ｓｅｃ７２、ｓｅｃ６２に転位不全対立遺伝子を持つが、切断されたｓｅｃ７１が最も好ましい。あるいは、これらの遺伝子の正常な操作を阻害するアンタゴニスト（アンチセンスヌクレオチド及び／又はリガンドを含む）、この翻訳後経路に含まれる他のタンパク質（例えば、ＳＥＣ６１ｐ、ＳＥＣ７２ｐ、ＳＥＣ６２ｐ、ＳＥＣ６３ｐ、ＴＤＪ１ｐ又はＳＳＡ１ｐ-４ｐ）又はこれらのタンパク質の複合体形成も、アミラーゼ発現酵母と組み合わせて好ましく用いられる。
形質転換は、Gietz等, Nucl. Acid. Res., 20: 1425 (1992)に概略が記されたプロトコールに基づいて実施された。形質転換細胞は、次いで寒天からＹＥＰＤ複合培地ブロス（１００ｍｌ）に播種し、３０℃で終夜成長させた。ＹＥＰＤブロスは、Kaiser等, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994)に記載されているように調製した。終夜培地は、次いで新鮮なＹＥＰＤブロス（５００ｍｌ）中におよそ２ｘ１０^６細胞／ｍｌ（約ＯＤ_６００＝０．１）に希釈し、１ｘ１０^７細胞／ｍｌ（約ＯＤ_６００＝０．４−０．５）まで再成長させた。
【０１１６】
次いで細胞を収穫し、5,000rpmで５分間のSorval GS3 ローターのＧＳ３ローターボトルに移し、上清を捨て、次いで無菌水に再懸濁することにより形質転換のために調製し、そして５０ｍｌのファルコン管内で、Beckman GS-6KR遠心機において3,500rpmで再度遠心分離した。上清を捨て、細胞をＬｉＡｃ／ＴＥ（10ml, 10mMのトリス-HCl, 1mMのEDTA pH7.5, 100mMのＬｉ_２ＯＯＣＣＨ_３）で続けて洗浄し、ＬｉＡｃ／ＴＥ（2.5ml）中に再懸濁させた。
マイクロチューブ内で、調製した細胞（100μl）を新鮮な変性一本鎖サケ精子ＤＮＡ（Lofstrand Labs, Gaitherburg, MD）及び形質転換ＤＮＡ（1μg. vol.＜10μl）と混合することにより、形質転換を行った。混合物はボルテックスにより簡単に混合し、次いで40%ＰＥＧ／ＴＥ（600μl, 40%のポリエチレングリコール-４０００, 10mMのトリス-HCl, 1mMのEDTA, 100mMのLi_２OOCCH_３, pH 7.5）を添加した。この混合物を緩やかに撹拌し、３０℃で撹拌しながら３０分間インキュベートした。次いで細胞に４２℃で１５分間熱衝撃を与え、反応容器をミクロチューブ内で12,000rpmで5-10秒間遠心分離し、デカント及びＴＥ（500μl, 10mMのトリス-HCl, 1mMのEDTA pH 7.5）への再懸濁に次いで遠心分離した。次いで、細胞をＴＥ（1ml）中に希釈し、アリコート（200μl）を150mm成長プレート（ＶＷＲ）に予め調製した選択培地に拡げた。
あるいは、複数の小さな反応ではなく、１回の大規模反応で形質転換を実施し、このとき試薬の量は適宜スケールアップさせた。
用いた選択培地は、Kaiser等, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994)に記載されているようにして調製したウラシルを欠く合成完全デキストロース寒天（ＳＣＤ-Ｕｒａ）であった。形質転換体は３０℃で２−３日成長させた。
アミラーゼを分泌するコロニーの検出は、選択成長培地における赤色デンプンの包含により実施した。Biely等, Anal. Biochem., 172: 176-179 (1988)に記載された方法に従って、デンプンを赤色染料（反応性 Red-120, Sigma）に結合させた。結合したデンプンをＳＣＤ-Ｕｒａ寒天プレートに最終濃度0.15%（w/v）で導入し、リン酸カリウムでｐＨ７．０に緩衝した（最終濃度50-100mM）。
ポジティブコロニーを選び、新鮮な選択培地（150mmプレート）に画線し、良好に単離され同定可能な単一コロニーを得た。アミラーゼ分泌についてポジティブな、良好に単離されたコロニーは、緩衝ＳＣＤ-Ｕｒａ寒天への赤色団分の直接導入により検出した。デンプンを分解して、ポジティブコロニーの周囲に直接目視できるはっきりとした暈(halo)を生じる能力により、ポジティブコロニーを決定した。
【０１１７】
４．ＰＣＲ増幅によるＤＮＡの単離
ポジティブコロニーが単離された場合、その一部を楊枝で拾い、９６ウェルプレートにおいて無菌水（30μl）に希釈した。この時点で、ポジティブコロニーは凍結して次の分析のために保存するか、即座に増幅するかのいずれかである。細胞のアリコート（5μl）を、0.5μlのKlentaq（Clontech, Palo Alto, CA）; 4.0μlの10mM dNTP（Perkin Elmer-Cetus）; 2.5μlのKentaqバッファー(Clontech); 0.25μlの正方向オリゴ１；0.25μlの逆方向オリゴ２；12.5μlの蒸留水を含有する25μl容量におけるＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。正方向オリゴヌクレオチド１の配列は：
5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3'
（配列番号：３３）であった。
逆方向オリゴヌクレオチド２の配列は：
5'-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3'
（配列番号：３４）であった。
次いで、ＰＣＲは以下の通り実施した：
ａ． 変性 92℃、 5分間
ｂ．次の３サイクル： 変性 92℃、30秒間
アニール 59℃、30秒間
伸長 72℃、60秒間
ｃ．次の３サイクル： 変性 92℃、30秒間
アニール 57℃、30秒間
伸長 72℃、60秒間
ｄ．次の２５サイクル：変性 92℃、30秒間
アニール 55℃、30秒間
伸長 72℃、60秒間
ｅ． 保持 4℃
下線を施した領域は、各々ＡＤＨプロモーター領域及びアミラーゼ領域にアニーリングされ、挿入物が存在しない場合はベクターｐＳＳＴ-ＡＭＹ．０からの３０７ｂｐ領域を増幅する。典型的には、これらのオリゴヌクレオチドの５’末端の最初の１８ヌクレオチドは、配列プライマーのアニーリング部位を含んでいた。即ち、空のベクターからのＰＣＲ反応の全生成物は３４３ｂｐであった。しかしながら、シグナル配列融合ｃＤＮＡは、かなり長いヌクレオチド配列をもたらした。
ＰＣＲに続いて、一定分量にした反応物（5μl）を、上掲のSambrook等に記載されたように1%アガロースゲル中でトリス-ボレート-ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝系を用いたアガロースゲル電気泳動により試験した。４００ｂｐより大きな単一で強いＰＣＲ産物をもたらすクローンを、96 Qiaquick PCR 清浄化カラム（Qiagen Inc., Chatsworth, CA）での精製の後にＤＮＡ配列によりさらに分析した。
【０１１８】
実施例３
シグナルアルゴリズム分析を用いたｃＤＮＡクローンの単離
種々のポリペプチド-コード化核酸配列は、ジェネンテック社（South San Francisco, CA）によって開発された独自の配列発見アルゴリズムを、公的（例えば、GenBank）及び／又は私的（LIFESEQ(登録商標), Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA）データベースからのＥＳＴｓ並びに集団化及び構築されたＥＳＴ断片に適用することにより同定した。シグナル配列アルゴリズムは、考慮している配列又は配列断片の５'-末端の第１の、場合によっては第２のメチオニンコドン（ＡＴＧ）を取り囲むＤＮＡヌクレオチドの性質に基づく分泌シグナルスコアを計算する。第１のＡＴＧに続くヌクレオチドは、停止コドンを持たない少なくとも３５の不明瞭でないアミノ酸をコードしなければならない。第１のＡＴＧが必要なアミノ酸を有する場合、第２のものは試験しない。何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけなかった。ＥＳＴ配列が真正のシグナル配列を含むか否かを決定するために、ＡＴＧコドンを取り囲むＤＮＡ及び対応するアミノ酸配列を、分泌シグナルに関連することが知られた７つのセンサー（評価パラメータ）の組を用いてスコアをつけた。このアルゴリズムの使用により、多くのポリペプチド-コード化核酸配列の同定がなされた。
【０１１９】
実施例４
ヒトＰＲＯ１７９をコード化するｃＤＮＡクローンの単離
ｃＤＮＡは上記実施例２に記載したようなスクリーニングで単離された。上記スクリーニングにおいて単離されたｃＤＮＡ配列は、BLAST及びFastA配列アラインメントにより、アンジオポエチン(angiopoietin)タンパク質をコード化するヌクレオチド配列と配列相同性を有することがわかった。このｃＤＮＡ配列を、ここでＤＮＡ１００２８及び／又はＤＮＡ２５２５０と命名する。
配列相同性に基づいて、ＤＮＡ１００２８分子の配列からプローブを調製し、上記実施例２のパラグラフ１に記載したように調製したヒト胎児肝臓ライブラリ（LIB6）のスクリーニングに使用した。クローニングベクターはｐＲＫ５Ｂであり（ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）、ｃＤＮＡサイズカットは２８００ｂｐ未満であった。
上記に記載したようにして単離されたクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ１７９の全長ＤＮＡ配列とＰＲＯ１７９の誘導されたタンパク質配列を提供した。ＤＮＡ１６４５１-１３８８の完全長ヌクレオチド配列は図１（配列番号：１）に示される。クローンＤＮＡ１６４５１-１３８８は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３７−３９に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置１４１７−１４１９に停止シグナルを持つ（図１）。予測されるポリペプチド前駆体は４６０アミノ酸長であり(図２、配列番号：２)、図２に示される全長ＰＲＯ１７９タンパク質は、約５３,６３７ダルトンの算定分子量及び約６．６１の見積もりｐＩを持つ。
図２（配列番号：２）に示した全長ＰＲＯ１７９配列の分析により、図２に示すような種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は、およそ上記の通りである。全長ＰＲＯ１７９配列(図２、配列番号２)の分析により、以下の存在が明らかになった：約アミノ酸１から約アミノ酸１６のシグナルペプチド；約アミノ酸１２０から約アミノ酸１４２及び約アミノ酸１２７から約アミノ酸１４９のロイシンジッパーパターン；約アミノ酸２３から約アミノ酸２７、約アミノ酸１１５から約アミノ酸１１９、約アミノ酸２９６から約アミノ酸３００、及び約アミノ酸３５７から約アミノ酸３６１のＮ-グリコシル化部位；及び約アミノ酸２７１から約アミノ酸３１０、約アミノ酸３１２から約アミノ酸３２２、約アミノ酸３３１から約アミノ酸３６９、及び約アミノ酸３９３から約アミノ酸４２４のフィブリノーゲンβ及びγ鎖Ｃ末端ドメインである。
クローンＤＮＡ１６４５１−１３８８は１９９８年４月１４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７７６が付与された。配列に関して、挿入したクローンは正確な配列を含み、ここで提供された配列は既知の配列決定の技術に基づくことが理解される。
全長ＰＲＯ１７９配列のアミノ酸配列の分析は、それがアンジオポエチンファミリーのタンパク質と有意な類似性を有し、よってＰＲＯ１７９が新規なアンジオポエチンファミリーのメンバーであることを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース（バージョン35.45 Swiss Prot 35）の分析により、ＰＲＯ１７９アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との有意な相同性が明らかになった：AF004326_1, P_R94605, HSU83508_1, P_R94603, P_R94317, AF025818_1, HSY16132_1, P_R65760, I37391及びHUMRSC192_1。
【０１２０】
実施例５
ヒトＰＲＯ２３８をコード化するｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように、phrapを用いて他のＥＳＴに対してコンセンサスＤＮＡ配列を組み立てた。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ３０９０８と命名する。ＤＮＡ３０９０８コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ２３８の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブはコンセンサスＤＮＡ３０９０８配列から作成された。
全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上掲のAusubel等, Current Protocols in Molecular Biologyに従って、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いでポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いたＰＲＯ２３８遺伝子をコード化するクローンの単離に使用した。
ＰＣＲプライマー（正及び逆）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー１：
5'-GGTGCTAAACTGGTGCTCTGTGGC-3'(配列番号：３５)
正方向ＰＣＲプライマー２：
5'-CAGGGCAAGA TGAGCATTCC-3'(配列番号：３６)
逆方向ＰＣＲプライマー：
5'-TCATACTGTTCCATCTCGGCACGC-3'(配列番号：３７)
ハイブリッド形成プローブ：
5'-AATGGTGGGGCCCTAGAAGAGCTCATCAGAGAACTCACCGCTTCTCATGC-3'(配列番号：３８)
ｃＤＮＡライブライリの作成のためのＲＮＡはヒト胎児肝臓組織から単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するために用いたｃＤＮＡライブラリは、Invitrogen, San Diego, CA からのもの等の市販試薬を用いて標準的方法によって形成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、ＳａｌＩヘミキナーゼアダプターの平滑末端で結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動で適当にサイズ分割をし、定まった方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を持たないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253:1278-1280 (1991)を参照されたい）に独特のＸｈｏｌ及びＮｏｔＩ部位においてクローン化した。
上述のようにして単離されたクローンのＤＮＡ配列決定により、全長ＰＲＯ２３８に対する全長ＤＮＡ配列[ここでＤＮＡ３５６００-１１６２と命名](図３、配列番号：３)及びそのＰＲＯ２３８に対する誘導タンパク質配列が得られた。
ＤＮＡ３５６００−１１６２の全ヌクレオチド配列を図３（配列番号：３）に示す。クローンＤＮＡ３５６００−１１６２は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１３４−１３６に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置１０６４−１０６６の見かけの停止コドンを持つ(図３)。予測されるポリペプチド前駆体は３１０アミノ酸長であり(図４、配列番号：４)、約３３,５２４ダルトンの算定分子量及び約９．５５の見積もりｐＩを持つ。
図４（配列番号：４）に示した全長ＰＲＯ２３８配列の分析により、図４に示されるような種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は、およそ上記の通りである。全長ＰＲＯ２３８ポリペプチドの分析により(図４、配列番号：４)、以下の存在が明らかになった：約アミノ酸１から約アミノ酸２１のシグナル配列；約アミノ酸１０２から約アミノ酸１１９及び約アミノ酸２７８から約アミノ酸２９２の膜貫通ドメイン；約アミノ酸２２８から約アミノ酸２３２のＮ-グリコシル化部位；約アミノ酸４７から約アミノ酸５１のグリコサミノグリカン付着部位；約アミノ酸１４５から約アミノ酸１５３のチロシンキナーゼリン酸化部位；約アミノ酸４４から約アミノ酸５０、約アミノ酸１０５から約アミノ酸１１１、約アミノ酸２３８から約アミノ酸２４４、約アミノ酸２４２から約アミノ酸２４８、及び約アミノ酸２９１から約アミノ酸２９７のN-ミリストイル化部位；約アミノ酸２６５から約アミノ酸２６９のアミド化部位；及び約アミノ酸６から約アミノ酸１７の原核生物膜離歩タンパク質脂質付着部位である。クローンＤＮＡ３５６００−１１６２は１９９７年１０月１６日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９３７０が付与された。
全長ＰＲＯ２３８ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、その部分が還元酵素、特に酸化還元酵素と有意な相同性を持つことが示唆され、それによってＰＲＯ２３８が新規な還元酵素でありうることが示された。
【０１２１】
実施例６
ヒトＰＲＯ３６４をコード化するｃＤＮＡクローンの単離
発現配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を検索し、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）ファミリーのポリペプチドのメンバーと相同性を示すポリペプチドをコードしたＥＳＴ（Incyte EST no. 3003460）を同定した。
BLAST（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）及び「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）の繰り返しサイクルを用いてIncyte EST no. 3003460及び他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。コンセンサス配列を、ここで「<consen01>」と命名し、またここでＤＮＡ４４８２５とも呼ぶ。
ＤＮＡ４４８２５及び「<consen01>」コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ３６４の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドプローブを合成した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般的に２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与えるように設計される。プローブ配列は典型的には４０−５５ｂｐ長である。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上掲のAusubel等, Current Protocols in Molecular Biologyに従って、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いでポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いた興味ある遺伝子をコード化するクローンの単離に使用した。
用いたオリゴヌクレオチド配列は以下の通り：
正方向ＰＣＲプライマー（４４８２５.ｆ１）：
5'-CACAGCACGGGGCGATGGG-3'（配列番号：３９）
正方向ＰＣＲプライマー（４４８２５.ｆ２）：
5'-GCTCTGCGTTCTGCTCTG-3'（配列番号：４０）
正方向ＰＣＲプライマー（４４８２５.ＧＩＴＲ.ｆ）：
5'-GGCACAGCACGGGGCGATGGGCGCGTTT-3'（配列番号：４１）
逆方向ＰＣＲプライマー（４４８２５.ｒ１）：
5'-CTGGTCACTGCCACCTTCCTGCAC-3'（配列番号：４２）
逆方向ＰＣＲプライマー（４４８２５.ｒ２）：
5'-CGCTGACCCAGGCTGAG-3'（配列番号：４３）
正方向ＰＣＲプライマー（４４８２５.ＧＩＴＲ.ｒ）：
5'-GAAGGTCCCCGAGGCACAGTCGATACA-3'（配列番号：４４）
さらに、ＤＮＡ４４８２５コンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた：
ハイブリッド形成プローブ（４４８２５.ｐ１）：
5'-GAGGAGTGCTGTTCCGAGTGGGACTGCATGTGTGTCCAGC-3'（配列番号：４５）
ハイブリッド形成プローブ（４４８２５.ＧＩＴＲ.ｐ）：
5'-AGCCTGGGTCAGCGCCCCACCGGGGGTCCCGGGTGCGGCC-3'（配列番号：４６）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ３６４遺伝子をコード化するクローンを単離するのに使用した。
ｃＤＮＡライブラリの構築のためのＲＮＡはヒト骨髄組織から単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するために用いたｃＤＮＡライブラリは、Invitrogen, San Diego, CA からのもの等の市販試薬を用いて標準的方法によって形成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、ＳａｌＩヘミキナーゼアダプターの平滑末端で結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動で適当にサイズ分割をし、定まった方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５Ｄは、ＳｆｉＩ部位を持たないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253:1278-1280 (1991)を参照されたい）に独特のＸｈｏｌ及びＮｏｔＩ部位においてクローン化した。
ｃＤＮＡクローンは同定され、完全に配列決定された。ＤＮＡ４７３６５−１２０６の完全長ヌクレオチド配列を図５（配列番号：５）に示す。クローンＤＮＡ４７３６５−１２０６は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１２１−１２３に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置８４４−８４６に停止コドンを持つ（図５；配列番号：５）。予測されるポリペプチド前駆体は２４１アミノ酸長であり、約２６,０００ダルトンの算定分子量及び約６．３４の見積もりｐＩを持つ。全長ＰＲＯ３６４タンパク質を図６（配列番号：６）に示す。
【０１２２】
図６（配列番号：６）に示した全長ＰＲＯ３６４配列の分析により、図６に示すような種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は、およそ上記の通りである。全長ＰＲＯ３６４配列（図６；配列番号：６）の分析により、以下の存在が明らかになった：約アミノ酸１から約アミノ酸２５のシグナルペプチド；約アミノ酸１６２からアミノ酸１８０の膜貫通ドメイン；約アミノ酸１４６から約アミノ酸１５０のＮ-グリコシル化部位；約アミノ酸５から約アミノ酸１１、約アミノ酸８から約アミノ酸１４、約アミノ酸２５から約アミノ酸３１、約アミノ酸３０から約アミノ酸３６、約アミノ酸３３から約アミノ酸３９、約アミノ酸１１８から約アミノ酸１２４、約アミノ酸１２２から約アミノ酸１２８、約アミノ酸１５６から約アミノ酸１６２のＮ-ミリストイル化部位；約アミノ酸１６６から約アミノ酸１７７の原核生物膜タンパク脂質結合部位；及び約アミノ酸１７１から約アミノ酸１９３のロイシンジッパーパターン。
クローンＤＮＡ４７３６５−１２０６は１９９７年１１月７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４３６が付与された。
全長ＰＲＯ３６４ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部が腫瘍壊死因子レセプターファミリーのメンバーと有意な相同性を有することを示唆し、よってＰＲＯ３６４が腫瘍壊死因子レセプターファミリーの新規なメンバーであることを示している。ＰＲＯ３６４の細胞内ドメインはＴＲＡＦ２結合に必要であることが示されたＣＤ３０受容体の最小ドメインと同様のモチーフ(アミノ酸２０７-２１４の領域にある)を含み、またそれはＴＮＦＲ２の中に存在する。ＴＮＦＲファミリーに特徴的な３つの見かけの細胞外システインの豊富なドメインがあり(Naismith and Sprang, Trends Biochem. Sci., 23:74-79(1998)参照)、その第３のＣＲＤはＴＮＦＲファミリーのシステインをより典型的な４つ又は６つよりもむしろ３つを持つ。マウスＣＲＤ１(下に記載する)に比較すると、マウスＧＩＴＲのＣＲＤ１にシステイン５つに対して、ＰＲＯ３６４アミノ酸配列はＣＲＤ１に８つのシステインを持ち、マウスＧＩＴＲに４つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位があるのに対し、ＥＣＤには１つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位が存在する。
全長ＰＲＯ３６４ポリペプチドのアミノ酸配列及び当該アミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列の詳細な検査により、Nocentini等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 6216-6221 (1997)に報告されたマウスＧＩＴＲ(ｍＧＩＴＲ)タンパク質との配列相同性が明らかになった。従って、ＰＲＯ３６４はNocentini等に報告されたマウスＧＩＴＲタンパク質のヒト対応物を代表する。
【０１２３】
実施例７
ヒトＰＲＯ８４４をコード化するｃＤＮＡクローンの単離
発現配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）が検索され、ＥＳＴはＬＰと配列同一性があることが確認された。ここで得られた情報と発見に基づき、このＥＳＴクローン、癌性肺ライブラリ(309-LUNGTUT09)からのインサイトクローン2657496がさらに調べられた。
ｃＤＮＡクローンは同定され、完全に配列決定された。ＤＮＡ５９８３８-１４６２の完全長ヌクレオチド配列を図７（配列番号：７）に示す。クローンＤＮＡ５９８３８-１４６２は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５−７に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置３３８−３４０に停止コドンを持つ（図７；配列番号：７）。予測されるポリペプチド前駆体は１１１アミノ酸長であり、約１２，０５０ダルトンの算定分子量及び約５．４５の見積もりｐＩを持つ。全長ＰＲＯ８４４タンパク質を図８（配列番号：８）に示す。
図８（配列番号：８）に示した全長ＰＲＯ８４４配列の分析により、図８に示すような種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は、およそ上記の通りである。全長ＰＲＯ８４４配列（図８；配列番号：８）の分析により、以下の存在が明らかになった：約アミノ酸１
から約アミノ酸１９のシグナルペプチド；約アミノ酸２３から約アミノ酸２９、約アミノ酸２７から約アミノ酸３３、約アミノ酸３２から約アミノ酸３８、約アミノ酸１０２から約アミノ酸１０８のN-ミリストイル化部位；及び約アミノ酸４９から約アミノ酸６３のＷＡＰ型「４-ジスルフィドコア」ドメインシグネチャーである。
クローンＤＮＡ５９８３８-１４６２は１９９８年６月１６日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９７６が付与された。寄託されたクローンはここで提供された表示よりも事実上正しい配列を有する。
全長ＰＲＯ８４４ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、セリンプロテアーゼ抑制剤と有意な相同性が示され、よって、ＰＲＯ８４４は新規なプロテイナーゼ抑制剤であることを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース（バージョン35.45 Swiss Prot 35）の分析により、ＰＲＯ８４４アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との有意な相同性が明らかになった：ALK1_HUMAN, P_P82403, P_P82402, ELAF_HUMAN及びP_P60950。
【０１２４】
実施例８
ヒトＰＲＯ８４６をコード化するｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように、コンセンサスＤＮＡ配列は、phrapを使用して他のＥＳＴ配列に対して構築した。このコンセンサス配列をここでＤＮＡ３９９４９及び「<consen1322>」と命名する。ＤＮＡ３９９４９コンセンサス配列及び「<consen1322>」に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ８４６の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。ＰＣＲプライマー(正方向及び逆方向)は、ＤＮＡ３９９４９及び「<consen1322>」コンセンサス配列に基づいて合成される。さらに、合成ヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブはコンセンサスＤＮＡ３０９０８配列から構築される。
全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上掲のAusubel等, Current Protocols in Molecular Biologyに従って、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いでポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いたＰＲＯ８４６遺伝子をコード化するクローンの単離に使用した。
上記の方法により、以下のヌクレオチド配列が得られた：
正方向ＰＣＲプライマー(39949.fl)：
5'-CCCTGCAGTGCACCTACAGGGAAG-3'(配列番号：４７)
逆方向ＰＣＲプライマー(39949.rl)：
5'-CTGTCTTCCCCTGCTTGGCTGTGG-3'(配列番号：４８)
さらに、次のヌクレオチド配列を持つ合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブをコンセンサスＤＮＡ３９９４９配列から構築した：
ハイブリッド形成プローブ(39949.pl)：
5'-GGTGCAGGAAGGGTGGGATCCTCTTCTCTCGCTGCTCTGGCCACATC-3'(配列番号：４９)
ｃＤＮＡライブラリの構築のためのＲＮＡはヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するために用いたｃＤＮＡライブラリは、例えば、Invitrogen, San Diego, CAの市販試薬を用いて標準的方法によって作成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位でプライムし、ＳａｌＩヘミキナーゼ化アダプターの平滑末端で結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動で適切にサイズ分割をし、決められた方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を持たないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253:1278-1280 (1991)）に独特のＸｈｏｌ及びＮｏｔＩ部位においてクローン化した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ８４６ポリペプチドの全長ＤＮＡ配列[ここで、ＤＮＡ４４１９６-１３５３と命名される](図９、配列番号：９)及びＰＲＯ８４６ポリペプチドの誘導タンパク質配列が得られた。
ＤＮＡ４４１９６-１３５３の完全長ヌクレオチド配列は図９(配列番号：９)に示される。クローンＤＮＡ４４１９６-１３５３は単一のオープンリーディングフレームを有し、ヌクレオチド位置２５−２７に見掛けの翻訳開始部位、及びヌクレオチド位置１０２１−１０２３に停止シグナルを持つ（図９）。予想されるポリペプチド前駆体は、３３２アミノ酸長であり、約３６，１４３ダルトンの算定分子量及び約５．８９の見積もりｐＩを有する(図１０、配列番号：１０)。
図１０（配列番号：１０）に示された全長ＰＲＯ８４６配列の分析により、図１０に示す様々な重要なポリペプチドドメインの存在が証明されたが、それらの重要なポリペプチドドメインに対して与えられる位置はおよそ上記の通りである。全長ＰＲＯ８４６配列（図１０；配列番号：１０）の分析により以下の存在が証明された：約アミノ酸１から約アミノ酸１７のシグナルペプチド；約アミノ酸２４８から約アミノ酸２６９の膜貫通ドメイン；約アミノ酸９６から約アミノ酸１００のＮ-グリコシル化部位；約アミノ酸１０４から約アミノ酸１１４のフィブロゲンβ及びγ鎖Ｃ-末端ドメイン；約アミノ酸１３から約アミノ酸１２８のＩｇ様Ｖ型ドメインである。クローンＤＮＡ４４１９６-１３５３は１９９８年５月６日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８４７が付与された。
【０１２５】
実施例９
ヒトＰＲＯ１７６０をコード化するｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、IncyteデータベースからＥＳＴクラスター配列を同定した。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び企業のＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。一又は複数のＥＳＴが前立腺癌ライブラリから得られた。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５８７９８と命名する。
ＤＮＡ５８７９８配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン３３５８７４５に含まれる配列との間の配列相同性に鑑みて、このＥＳＴを含むクローンを購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。ここで、挿入物は全長タンパク質をコード化することがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１１(配列番号：１１)に示し、ここでＤＮＡ７６５３２−１７０２と命名する。
クローンＤＮＡ７６５３２−１７０２は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置６０−６２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置６２４−６２６の停止コドンで終端する（図１１）。予測されるポリペプチド前駆体は１８８アミノ酸長である（図１２、配列番号：１２）。図．１２に示される全長ＰＲＯ１７６０タンパク質は約２１，０４２ダルトンの算定分子量及び約５．３６の推定ｐＩを有する。
図１２(配列番号：１２)に示される全長ＰＲＯ１７６０配列の分析により、図１２に示される様々な重要なポリペプチドドメインの存在が証明されたが、それらの重要なポリペプチドドメインに対して与えられる位置はおよそ上記の通りである。全長ＰＲＯ１７６０配列の分析により以下の存在が証明された：約アミノ１から約アミノ酸２０のシグナルペプチド；約アミノ酸１２１から約アミノ酸１２５及び約アミノ酸１７１から約アミノ酸１７５のＮ-グリコシル化部位；約アミノ酸５４から約アミノ酸６０及び約アミノ酸１６０から約アミノ酸１６６のＮ-ミリストイル化部位である。クローンＤＮＡ７６５３２−１７０２は１９９８年１１月１７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３４７３が付与された。
図１２（配列番号：１２）に示した全長配列のＷＵ−ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用しての、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１７６０のアミノ酸配列と以下のDayhoff配列：CELT07F12_2, T22J18_16, ATF1C12_3, APE3_YEAST, P_W22471, SAU56908_1, SCPA_STRPY, ATAC00423817, SAPURCLUS_2 及びAF041468_9との間の配列同一性が明らかにされた。
【０１２６】
実施例１０
心臓新生児肥大の刺激（アッセイ１）
このアッセイは新生児心臓の肥大を刺激するＰＲＯポリペプチドの能力を測定するように設計されている。このアッセイで陽性と試験されるＰＲＯポリペプチドは様々な心不全疾患の治療上の処置に利用できることが期待される。
１日齢のHarlan Sprague Dawleyラットから筋細胞を得た。細胞（7.5x10^４/mlで180μl、血清＜0.1%、新たに単離）をDMEM/F12＋4%FCSで予めコートした９６ウェルプレートに１日目に添加した。試験ＰＲＯポリペプチド又は成長培地のみ(ネガティブコントロール)を含有する試験試料(20μL/ウェル)を１日目にウェルに直接添加した。次いで２日目に最終濃度が１０^−６ＭとなるようにＰＧＦ(20μL/ウェル)が加えられる。次いで４日目に細胞が染色され、５日目に視覚によりスコアをつけ、ここでサイズの増加しない細胞(ネガティブコントロールと比較)は０．０とスコアされ、サイズの小から中規模の増加を示した細胞(ネガティブコントロールと比較)は１．０とスコアされさらにサイズの大きな増大を示した細胞(ネガティブコントロールと比較)は２．０とスコアされる。このアッセイで陽性の結果としたのは、１．０又はそれ以上のスコアである。
以下の表４に示される様に、ＰＲＯ８８２はこのアッセイで陽性と試験された。

【０１２７】
実施例１１
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に刺激された内皮細胞成長増殖の阻害（アッセイ９）
内皮細胞のＶＥＧＦ刺激増殖を阻害する様々なＰＲＯポリペプチドの能力を試験した。このアッセイで陽性と試験されたポリペプチドは哺乳動物の内皮細胞成長の抑制に役立ち、例えば腫瘍成長の抑制に有益な効果を与える。
特に、ウシ副腎皮質毛細管内皮細胞（ＡＣＥ）（初代培養からのもの、最大12-14継代）を９６ウェルのプレートにおいて100マイクロリットル当たり500細胞／ウェルでプレーティングした。アッセイ媒体は、低グルコースDMEM、10%子ウシ血清（牛胎児ではない）、2mMグルタミン、及び1Xペニシリン／ストレプトマイシン／ファンギゾンを含む。対照ウェルは以下を含む：（１)ＡＣＥ細胞無添加；（２）ＡＣＥ細胞のみ；（３）ＡＣＥ細胞＋5ng/mlＦＧＦ；（４）ＡＣＥ細胞＋3ng/mlＶＥＧＦ；（５）ＡＣＥ細胞＋3ng/mlＶＥＧＦ＋1ng/mlＴＧＴ-ベータ；及び（６）ＡＣＥ細胞＋3ng/mlＶＥＧＦ＋5ng/mlＬＩＦ。次いで、試験試料、ポリ-HisタグＰＲＯポリペプチド（100マイクロリットル容量）をウェルに添加した（各々、1%、0.1%及び0.01%希釈）。細胞培地を37℃／5%ＣＯ_２で6-7日間インキュベートした。インキュべーションの後、ウェル中の培地を吸引して細胞をＰＢＳで1X洗浄した。次いで、酸ホスファターゼ反応混合物（100マイクロリットル、0.1M酢酸ナトリウム, pH5.5, 0.1% トリトンX-100, 10mMのリン酸ｐ-ニトロフェニル）を各ウェルに添加した。37℃で2時間のインキュベーション後に、10マイクロリットルの1NのNaOHの添加により反応を停止させた。光学密度（ＯＤ）を405nmでマイクロタイタープレートで測定した。
ＰＲＯポリペプチドの活性は、刺激なしの細胞に対する、（OD405nmでの酸性ホスファターゼ活性を測定したときの）ＶＥＧＦ（3ng/mｌ）刺激増殖の阻害パーセントとして計算した。ＴＧＦ-ベータは、ＶＥＧＦ-刺激ＡＣＥ細胞増殖の70-90%をブロックするため、ＴＧＦ-ベータを1ng/mlにおいて活性対照として用いた。以下の表５に示す結果は、癌治療、特に腫瘍血管形成の阻害におけるＰＲＯポリペプチドの有用性を示す。表５に示される数値（相対的阻害）は、刺激なしの細胞に対するＰＲＯポリペプチドによるＶＥＧＦ刺激増殖の阻害パーセントを算定し、次いでＶＥＧＦ刺激細胞増殖の70-90%を阻害することが知られている１ng/mlのＴＧＦ-βにより得られた阻害パーセントでそのパーセントを割ることにより決定される。結果は、ＰＲＯポリペプチドが内皮細胞成長のＶＥＧＦ刺激の30%又はそれ以上の阻害を示した場合（30%以上の相対的阻害）をポジティブと考えた。

【０１２８】
実施例１２
内皮細胞におけるｃ-ｆｏｓの誘導（アッセイ３４）
このアッセイはＰＲＯポリペプチドが内皮細胞においてｃ-ｆｏｓを誘導する能力を示すか否かを決定するために設計されている。このアッセイで陽性と試験されたＰＲＯポリペプチドは、例えば創傷治癒などを含む、血管新生が有益であるような症状や疾患の治療上の処置に有効であると期待される(同様に、これらのＰＲＯポリペプチドのアゴニストもそうでありうる)。このアッセイで陽性と試験されたＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストは癌性腫瘍の治療上の処置に役立つことが期待される。
成長培地（50%のハムのＦ１２ｗ／ｏＧＨＴ：低グルコース、及びグリシンなしの50%ＤＭＥＭ：ＮａＨＣＯ_３、1%グルタミン、10mMのＨＥＰＥＳ、10%のＦＢＳ、10ng/mlのｂＦＧＦ）中のヒト静脈の臍帯静脈内皮細胞（HUVEC, Cell Systems）を1x10^４細胞／ウェルの細胞密度で９６ウェルマクロタイタープレートに蒔いた。蒔いた次の日、成長培地を除き、細胞を100μl／ウェルの試験試料とコントロール（ポジティブコントロール：成長培地；ネガティブコントロール：10mMのＨＥＰＥＳ、140mMのＮａＣｌ、4%（w/v）マンニトール、pH6.8）で処理することにより、細胞を飢餓させた。細胞を5%ＣＯ_２中で37℃において30分間インキュベートした。試料を取り出し、ｂＤＮＡキットプロトコール（Chiron Diagnostics, cat.#6005-037）の最初の部分に従った。ここで、下記の各大文字の試薬／バッファーはキットから利用可能であった。
簡単には、試験に必要なＴＭ溶菌バッファー(TM Lysis Buffer)及びプローブの量を製造者により提供された情報に基づいて計算した。適当な量の解凍プローブをＴＭ溶菌バッファーに添加した。捕獲ハイブリッド形成バッファー(Capture Hybridization Buffer)を室温まで温めた。ｂＤＮＡ条片を金属条片ホルダーにセットし、100μｌの捕獲ハイブリッド形成バッファーを必要な各ｂ-ＤＮＡウェルに添加し、少なくとも30分インキュベートした。細胞を有する試験プレートをインキュベータから取り出し、真空マニフォールドを使用して培地を穏やかに除いた。マイクロタイタープレートの各ウェルにプローブを含有する100μｌの溶菌ハイブリッド形成バッファーをピペットで素早く添加した。ついで、プレートを15分間55℃でインキュベートした。インキュベーターから取り出した時点で、マイクロタイターアダプターヘッドを備えたボルテックスミキサーにプレートを配し、1分間、#2の設定でボルテックスした。80μlの溶菌液を取り出し、捕獲ハイブリッド形成バッファーを含むｂＤＮＡウェルに添加し、ピペットで上下して混合した。プレートを少なくとも16時間53℃でインキュベートした。
【０１２９】
次の日に、ｂＤＮＡキットプロトコールの第２の部分に従った。すなわち、プレートをインキュベーターから取り出し、ベンチに置いて10分間冷却した。必要な添加の容積は製造者により提供される情報に基づいて計算した。ＡＬハイブリッド形成バッファー中に1:100の希釈のアンプリファイアー濃縮物（Amplifier Concentrate）（20fm/μl）を作成することによりアンプリファイアー作用液を調製した。ハイブリダイゼーション混合物をプレートから採取し、洗浄剤Ａで２回洗浄した。50μlのアンプリファイアー作用液をそれぞれのウェルに加え、該ウェルを５３℃で３０分でインキュベートした。ついで、プレートをインキュベーターから取り出して10分間冷却した。ＡＬハイブリッド形成バッファー中に1:100希釈の標識濃縮物（40pmoles/μl）とすることにより標識プローブ作用液を調製した。10分の冷却時間の後、アンプリファイアーハイブリッド形成混合物を取り出し、プレートを洗浄剤Ａで2回洗浄した。50μlの標識プローブ作用液を各ウェルに添加し、ウェルを53℃で15分間インキュベートした。10分間の冷却後、基質を室温まで温めた。アッセイに必要なｍｌの基質それぞれに3μlの基質エンハンサーを添加して、プレートを10分間冷却し、標識ハイブリッド形成混合物を取り出し、プレートを洗浄剤Ａで2回、洗浄剤Ｄで3回洗浄した。エンハンサーを含有する50μlの基質溶液を各ウェルに添加した。プレートを37℃で30分間インキュベートし、ＲＬＵを適切な照度計で読みとった。
複製を平均化し変動係数を決定した。ネガティブコントロール（上述のＨＥＰＥＳバッファー）値に対する活性の増加倍率の測定は化学発光単位（ＲＬＵ）によって示した。結果を下記の表６に示し、ＰＲＯポリペプチドがネガティブコントロールに対して少なくとも２倍の値を示す場合に陽性と考えた。ネガティブコントロール＝1.00%希釈で1.00RLU。ポジティブコントロール＝1.00%希釈で8.39RLU。
【０１３０】

【０１３１】
実施例１３
Ｆ２ａにより誘発される心臓新生児肥大の促進（アッセイ３７）
このアッセイは新生児心臓の肥大を刺激するＰＲＯポリペプチドの能力を測定するように設計されている。このアッセイで陽性と試験されたＰＲＯポリペプチドは様々な心不全疾患と治療上の処置に役立つことが期待される。
１日齢のHarlan Sprague Dawleyラットから筋細胞を得た。細胞（7.5x10^４/mlで180μl、血清＜0.1%、新たに単離）をDMEM/F12＋4%FCSで予めコートした９６ウェルプレートに１日目に添加した。試験ＰＲＯポリペプチド（20μl/ウェル）を含有する試験試料を１日目にウェルに直接添加した。次いで２日後にＰＧＦ（20μl/ウェル）を最終濃度10^−６Mで添加した。次いで細胞を４日目に染色し、５日目にスコアをつけた。視覚的スコアは細胞サイズに基づき、ネガティブコントロールに比較してサイズの増加を示さない細胞を0.0とスコア付けし、ネガティブコントロールに比較してサイズの小から中程度の増加を示す細胞を1.0とスコア付けし、ネガティブコントロールに比較してサイズの大きな増加を示す細胞を2.0とスコア付けした。1.0又はそれ以上のスコアを陽性と考えた。
アッセイ反応にＣａ濃度が重要であるためＰＢＳは含有しない。プレートはDMEM/F12＋4%FCS（200μl/ウェル）でコートした。アッセイ媒体は以下を含む：DMEM/F12（2.44gmの重炭酸塩を含む）、10μg/mlのトランスフェリン、1μg/mlのインシュリン、1μg/mlのアプロチニン、2mmol/Lのグルタミン、100U/mlのペニシリンＧ、100μg/mlのストレプトマイシン。マンニトール（4%）を含むタンパク質バッファーは1/10（0.4%）及び1/100（0.04%）ではポジティブシグナル（スコア3.5）を与えたが、1/1000(0.004%)では与えなかった。従って、マンニトールを含む試験試料バッファーは実行しなかった。
ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ８８２及びＰＲＯ８８７ポリペプチドは、このアッセイで陽性と試験された。
【０１３２】
実施例１４
心臓成人肥大の阻害（アッセイ４２）
このアッセイは心臓成人肥大の阻害を測定するように設計されている。このアッセイで陽性と試験されたＰＲＯポリペプチドは、心肥大に関与する心疾患の治療上の処置での用途が見出される。
心室筋細胞を成体（250g）Harlan Sprague Dawleyラットから新たに単離し、細胞を2000細胞/180μlウェル容積でプレーティングした。２日目にＰＲＯポリペプチドを含む試験試料（20μl）を添加した。５日目に細胞を固定した後に染色した。数時間後に細胞からのＰＣＲによりＡＮＰメッセージの増加も測定できる。結果は細胞サイズの視覚的スコアに基づく：0＝阻害無し、-1＝小さな阻害、-2＝大きな阻害。0未満のスコアをポジティブと考えた。活性参照は、ポジティブコントロールとしての0.1mMのフェニルエフィン（ＰＥ）に相当する。アッセイ媒体は以下を含む：100mMのインシュリン、0.2%のＢＳＡ、5mMのクレチン、2mMのL-カルニチン、5mMのタウリン、100U/mlのペニシリンＧ、100μg/mlのストレプトマイシン(ＣＣＴ媒体)中に懸濁したＭ１９９(修飾)-グルタミンフリー、ＮａＨＣＯ_３、フェノールレッド。９６ウェルプレートの内側６０ウェルのみを使用した。これらの中で、６ウェルをネガティブ及びポジティブ（ＰＥ）コントロール用にとっておいた。
ＰＲＯ８７８ポリペプチドは、上記のアッセイで０よりも小さいスコアを示した。
【０１３３】
実施例１５
内皮細胞アポトーシスの誘発（アッセイ７３）
内皮細胞においてアポトーシスを誘導するＰＲＯポリペプチドの能力をヒト静脈の臍静脈内皮細胞（HUVEC, Cell Systems）中で試験した。アッセイでの陽性の試験は、血管疾患のような腫瘍の治療上の処置でのポリペプチドの有用性が示唆され、内皮細胞のアポトーシスの誘発に有益である。
内皮細胞においてアポトーシスを誘導するＰＲＯポリペプチドの能力を、９６ウェル型を用い、100ng/mlVEGFを補った０％血清媒地中で、ヒト静脈の臍静脈内皮細胞（HUVEC, Cell Systems）で試験した。（HUVEC細胞はプレート表面から容易に取り除かれ、全てのウェルでのピペット作業はできるだけ穏やかに行われるべきである。）
培地は吸引され、細胞は一度PBSで洗浄された。5mlの1xトリプシンがT-175フラスコで細胞に添加され、細胞はプレートから遊離されるまでそのまま置かれた(約5-10分)。トリプシン処理は5mlの成長培地の添加によって停止された。細胞は4℃で5分間、1000rpmで回転させた。培地を吸引し、細胞を10mlの10％血清添加培地(Cell Systems)、1xペニシリン/ストレプトマイシン中に再懸濁した。
細胞を９６ウェルマイクロタイタープレート（Amersham Life Science, cytostar-Tシンチレーティングマイクロプレート、ＲＰＮＱ１６０、無菌、組織培地処理、個々にラッピング）で10%の血清（CSG-媒体、Cell Systems）中、ウェル当たり2x10^４細胞の密度で全容量100μｌでプレーティングした。試験するＰＲＯポリペプチド試料を1%、0.33%及び0.11%希釈の３段階で添加した。細胞無しのウェルをブランクとして用い、細胞のみのウェルをネガティブコントロールとして用いた。ポジティブコントロールとしてスタウロスポリンの３ｘストックの1:3連続希釈50μlを用いた。試験ＰＲＯポリペプチドのアポトーシスを誘導する能力は、カルシウム及びリン脂質結合タンパク質のメンバーであるアネキシンＶを用いて測定され、アポトーシスを検出した。
0.2mlのアネキシンＶ-ビオチンのストック溶液（100μg/ml）を、4.6mlの2 x Ｃａ^２＋結合バッファー及び2.5%BSA中に希釈した(1:25希釈)。50μlの希釈アネキシンＶ-ビオチン液を、1.0μg/mlの最終濃度になるまで各ウェル（コントロールを除く）に添加した。試料を^３５Ｓ-ストレプトアビジンの直接添加の前にアネキシン-ビオチンと共に10-15分間インキュベートした。^３５Ｓ-ストレプトアビジンは2 x Ｃａ^２＋ 結合バッファー、2.5%BSA中に希釈し、最終濃度が3 x 10^４cpm／ウェルになるまで全てのウェルに添加した。次いでプレートを密封し、1000rpmで15分間遠心分離し、2時間の間、軌道シェイカー上に配した。分析は1450 Microbeta Trilux (Wallac)で実施した。結果は以下の表７に示され、バックグラウンドを越えるパーセントがネガティブコントロールを越える毎分当たりのカウントのパーセント量を表す。バックグラウンドを越えるパーセントが30%以上のものがポジティブであると考えられる。
ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３６４及びＰＲＯ８７９は、上記のアッセイにおいてポジティブな結果をスコアした。

【０１３４】
実施例１６
ＬＩＦとエンドセリン-１(ＥＴ-１)に誘発される心臓新生児肥大の抑制（アッセイ７４）
このアッセイは、本発明のＰＲＯポリペプチドがＬＩＦ及びエンドセリン-１(ＥＴ-１)に誘発される新生児心臓の肥大を抑制する能力を示すかどうかを決定するように設計されている。本アッセイで陽性反応を示した試験化合物は心筋の好ましくない肥大に特徴付けられる又は関与する心疾患又は障害の治療上の処置に役立つであろう。
１日齢のHarlan Sprague Dawleyラットからの筋細胞（7.5x10^４/mlで180μl、血清＜0.1%、新たに単離）をDMEM/F12＋4%FCSで予めコートした９６ウェルプレートに１日目に添加する。ついで２日目に試験ＰＲＯポリペプチドサンプル又は成長培地のみのもの(ネガティブコントロール)を20μlの容量でウェルに直接添加する。ついで３日目にＬＩＦ+ＥＴ-１がウェルに添加される。さらに２日後、細胞は培地で染色され、次の日に視覚によりスコアをつける。ＰＲＯポリペプチドで処理したミオサイトが未処理のミオサイトに比べて視覚的に平均して小さいか、又は少ない数であれば、アッセイで陽性となる。
ＰＲＯ２３８及びＰＲＯ１７６０ポリペプチドはこのアッセイで陽性と試験された。
【０１３５】
実施例１７
内皮管形成-芽の形成の刺激（アッセイ８６）
このアッセイは、ＰＲＯポリペプチドが外因性成長因子のない状態で内皮空胞及び管腔形成を促進する能力を示すかどうかを決定するために設計される。このアッセイで陽性と試験されたＰＲＯポリペプチドは、例えば飲作用、イオン・ポンプ、血管透過性及び／又は接合形成の刺激が有益であることを含む内皮空胞及び／又は管腔形成が有益である、障害の治療的な処置に有用であることが期待される。
ＨＵＶＥＣ細胞（初生から８未満の継代数）をＩ型ラット尾のコラーゲンと混合して(最終濃度２．６ｍｇ／ｍｌ)、密度６ｘ１０^５細胞／ｍｌとし、１％のＦＢＳと形成される間にＰＲＯポリペプチドの存在で空胞を染色する為の１μＭの６-ＦＡＭ-ＦＩＴＣ染料を補填したＭ１９９培地をウェル当たり５０μｌで蒔いた。細胞を３７℃／５％ＣＯ_２で４８時間インキュベートし、室温で１０分間３．７％のホルマリンで固定し、Ｍ１９９培地で５回洗浄し、ついで４℃で終夜、Ph-Phalloidinで染色し、４μＭのＤＡＰＩで核染色を行った。アッセイでの陽性の結果は２に等しいか２より小さい[１＝細胞は全て丸い、２＝細胞は長い、３＝細胞は幾つかの結合で管を形成している、４＝細胞は複雑な管状網目を形成している]。
このアッセイにおいて、ＰＲＯ１７９ポリペプチドは陽性と試験された。
【０１３６】
実施例１８
内皮細胞アポトーシス(ＥＬＩＳＡ)の誘発（アッセイ１０９）
内皮細胞においてアポトーシスを誘導するＰＲＯポリペプチドの能力を、100ng/mlのＶＥＧＦ、0.1%のＢＳＡ、1Xpenn/strepを補充した0%血清培地中で９６ウェルフォーマットを使用して、ヒト静脈の臍静脈内皮細胞（HUVEC, Cell Systems）中で試験した。このアッセイでの陽性の結果は、例えば腫瘍成長の抑制を含む望ましくない内皮細胞成長に関連する任意の様々な症状を治療的に処置するためのＰＲＯポリペプチドの有用性を示す。使用した９６ウェルプレートはFalconにより製造された（番号3072）。９６ウェルプレートのコーティングは、ＰＢＳ溶液中の0.2%ゼラチン100μlで＞30分間ゼラチン化を起こすことにより調製した。ゼラチン混合物を完全に吸引した後、10%血清含有培地中で2x10^４細胞/mlの最終濃度−ウェル当たり100μl容量でＨＵＶＥＣ細胞をプレーティングした。対象とするＰＲＯポリペプチドを含有する試験試料を添加する前に細胞を24時間成長させた。
全てのウェルに、100ng/mlのＶＥＧＦ、0.1%のＢＳＡ、1Xpenn/strepを補充した0%血清培地100μlを添加した。ＰＲＯポリペプチドを含有する試験試料を1%、0.33%及び0.11%の希釈で三つ組で添加した。細胞の無いウェルをブランクとして使用し、細胞だけのウェルをネガティブコントロールとして使用した。ポジティブコントロールとして、3x原液のスタウロスポリンの50μlの1:3の連続希釈物を使用した。ＥＬＩＳＡに先立って、細胞を24から35時間インキュベートした。
ＥＬＩＳＡを、Boehringer マニュアル［Boehringer, 細胞死検出ELISA plus, カタログ番号1920685］に従ってアポトーシス調製溶液のレベルを決定するのに使用した。試料調製：９６ウェルプレートを1krpmで10分間スピン沈降させ（200g）；高速反転により上清を除去し、プレートをペーパータオル上に上下逆に置いて残りの液体を除去した。各ウェルに、200μlの1X溶菌バッファーを添加して振盪させずに30分間室温でインキュベートした。プレートを1krpmで10分間スピン沈降させ、20μlの溶菌液（細胞質画分）をストレプトアビジン被覆ＭＴＰに移した。80μlの免疫試薬混合物を各ウェルで20μl溶菌液に加えた。ＭＴＰを粘着性ホイルでカバーし、それを軌道振盪機（200rpm）に配することにより2時間室温でインキュベートした。2時間後、上清を吸引により除去し、ウェル当たり250μlの1Xインキュべーションバッファーで3回ウェルをリンスした（吸引で除去した）。各ウェルに基質溶液を添加し（100μl）、軌道振盪機で室温において250rpmで、光度測定分析に十分な発色がされるまでインキュベートした（約10-20分後）。参照波長492nmとして405nmでプレートを読むのに９６ウェルリーダーを用いた。ＰＩＮ３２（コントロールバッファー）について得られたレベルを100%に設定した。レベル＞130%の試料をアポトーシス誘導についてのポジティブと考えた。
ＰＲＯ８４６及びＰＲＯ８４４ポリペプチドは、このアッセイにおいて陽性と試験された。
【０１３７】
実施例１９
インサイツハイブリッド形成
インサイツハイブリッド形成は、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及び局在化のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定と局在化、特定のｍＲＮＡ合成における変化の追跡及び染色体マッピングにおける補助に有用である。
インサイツハイブリッド形成は、Lu及びGillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994)のプロトコールの最適化バージョンに従って、ＰＣＲ生成^３３Ｐ-標識リボプローブを用いて実施される。簡単には、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼＫ（20g/ml）で１５分間３７℃で脱タンパクし、さらに上掲のLu及びGillettに記載されたようにインサイツハイブリッド形成する。(^３３-Ｐ)ＵＴＰ-標識アンチセンスリボプローブをＰＣＲ産物から生成し、５５℃で終夜ハイブリッド形成する。スライドをKodak NTB2^ＴＭ核トラックエマルションに浸漬して４週間露出する。
^３３Ｐ-リボプローブ合成
6.0μl（125mCi）の^３３Ｐ-ＵＴＰ（Amersham BF 1002, SA＜2000 Ci/mmol）をスピード真空乾燥させた。乾燥^３３Ｐ-ＵＴＰを含む各管に以下の成分を添加した：
2.0μlの5ｘ転写バッファー
1.0μlのＤＴＴ（100mM）
2.0μlのＮＴＰ混合物（2.5mM: 各10μlの10mM GTP, CTP及びATP+10μlのH₂O）
1.0μlのＵＴＰ（50μM）
1.0μlのＲＮＡｓｉｎ
1.0μlのＤＮＡテンプレート（1μg）
1.0μlのＨ_２Ｏ
1.0μlのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＣＲ産物についてT3＝AS, T7=S,通常）
管を３７℃で１時間インキュベートし、1.0μlのRQ1 ＤＮａｓｅを添加し、次いで３７℃で１５分間インキュベートした。総計90μlのＴＥ（10mMトリスpH7.6／1mMのＥＤＴＡpH8.0）を添加し、混合物をDE81紙にピペットした。残りの溶液をMicrocon-50^ＴＭ限外濾過ユニットに負荷し、プログラム１０を用いてスピンさせた（6分間）。濾過ユニットを第２の管に変換し、プログラム２を用いてスピンさせた（3分間）。最終回収スピンの後、総計100μlのＴＥを添加し、次いで1μlの最終生成物をDE81紙にピペットし6mlのBIOFLUOR II(商品名)で数えた。
プローブをＴＢＥ／尿素ゲル上で走らせた。1-3μlのプローブ又は5μlのＲＮＡ ＭｒｋIIIを3μlの負荷バッファーに添加した。加熱ブロック上で９５℃に３分間加熱した後、ゲルを即座に氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシングし、試料を負荷し、180-250ボルトで45分間走らせた。ゲルをプラスティックラップ（ＳＡＲＡＮ(商品名)ブランド）でラップし、−７０℃冷凍機内で補強スクリーンを持つＸＡＲフィルムに１時間から終夜露出した。
【０１３８】
^３３Ｐ-ハイブリッド形成
Ａ．凍結切片の前処理
スライドを冷凍機から取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で５分間解凍した。トレイを５５℃のインキュベータに５分間配置して凝結を減らした。スライドを蒸気フード内において氷上4%パラホルムアルデヒド中で１０分間固定し、0.5ｘＳＳＣで５分間室温で洗浄した（25ml 20xSSC + 975ml SQ H₂O）。0.5μg/mlのプロテイナーゼＫ中、３７℃で１０分間の脱タンパクの後（250mlの予備加熱ＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中の10mg/mlストック12.5μl）、切片を0.5ｘＳＳＣで１０分間室温で洗浄した。切片を、70%、95%、及び100%エタノール中、各2分間脱水した。
Ｂ．パラフィン包埋切片の前処理：
スライドを脱パラフィンし、ＳＱ Ｈ_２Ｏ中に配置し、2ｘＳＳＣで室温において各々５分間２回リンスした。切片を20μg/mlのプロテイナーゼＫ（250ｍｌのＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中10mg/mlを500μｌ；３７℃、１５分間）−ヒト胚又は８ｘプロテイナーゼＫ（250mlのＲＮａｓｅバッファー中100μl、３７℃、３０分間）−ホルマリン組織で脱タンパクした。続く0.5ｘＳＳＣでのリンス及び脱水は上記のように実施した。
Ｃ．プレハイブリッド化：
スライドをＢｏｘバッファー（4ｘＳＳＣ、50%ホルムアミド）−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。組織を50μlのハイブリッド形成バッファー（3.75gデキストラン硫酸＋6mlＳＱ Ｈ_２Ｏ）で被覆し、ボルテックスし、キャップを外して２分間マイクロ波で加熱した。氷上で冷却した後、18.75mlのホルムアミド、3.75ｍｌの20ｘＳＳＣ及び9mlのＳＱ Ｈ_２Ｏを添加し、組織を良くボルテックスし、４２℃で1-4時間インキュベートした。
Ｄ．ハイブリッド形成：
スライド当たり1.0ｘ10^６cpmのプローブ及び1.0μlのｔＲＮＡ（50mg/mlストック）を９５℃で３分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり48μlのハイブリッド形成バッファーを添加した。ボルテックスの後、50μlの^３３Ｐ混合物をスライド上のプレハイブリッド50μlに添加した。スライドを５５℃で終夜インキュベートした。
Ｅ．洗浄：
洗浄は、2ｘ10分間、2ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡで室温で実施し（400mlの20ｘSSC＋16mlの0.25M EDTA、Ｖ_ｆ＝４Ｌ）、次いでＲＮａｓｅＡ処理を３７℃で３０分間行った（250mlＲＮａｓｅバッファー中10mg/mlを500μｌ＝20μg/ml）。スライドを2ｘ10分間、2ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡで室温において洗浄した。緊縮性洗浄条件は次の通り：５５℃で２時間、0.1ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡ（20mlの20ｘSSC＋16mlのEDTA、Ｖ_ｆ＝４Ｌ）。
【０１３９】
Ｆ．オリゴヌクレオチド
ここに開示したＤＮＡ配列の３つについてインサイツ分析を実施した。これらの分析に対して用いたオリゴヌクレオチドは次の通りである：
（１）ＤＮＡ４７３６５-１２０６（ＰＲＯ３６４）(ＴＮＦ受容体相同体)
p1：
5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAACCCGAGCATGGCACAGCAC-3'(配列番号：５０)
p2：
5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGATCTCCCAGCCGCCCCTTCTC-3'(配列番号：５１)
（２）ＤＮＡ３０８６８（ＰＲＯ２０５）(ホリスタチン相同体)
p1：
5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAGAGACAGGGCAAGCAGAATG-3'(配列番号：５２)
p2：
5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAGAAGGGGATGACTGGAGGAAC-3'(配列番号：５３)
（３）ＤＮＡ４１３７４（ＰＲＯ３３３）(ＣＤ３３相同体)
p1：
5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCTCCACAGAACCTCGCCATCA-3'(配列番号：５４)
p2：
5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGATGGGGCAAGACTCACAAGCAG -3'(配列番号：５５)
【０１４０】
Ｇ．結果
ここに開示した上記の３つのＤＮＡ配列についてインサイツ分析を実施した。これらの分析からの結果は次の通りである：
（１）ＤＮＡ４７３６５−１２０６（ＰＲＯ３６４）（ＴＮＦ受容体相同体）
発現は、胎児において、椎骨体の前側表面を内張りする筋膜で観察された。発現は、胎児網膜全体でも見られた。しかしながら胎児ニューロン全体では低レベルの発現が起こった。他の組織は全てネガティブであった。
（２）ＤＮＡ３０８６８（ＰＲＯ２０５）(ホリスタチン相同体)
胎児組織において、脊髄、自律神経節、腸管神経、仙骨神経叢、末梢及び脳神経で発現があった。他の胎児及び成人組織は全てネガティブであった。
試験した胎児の組織（12-16週）は以下を含む：胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤及び下肢。
成人組織は以下を含む：肝臓、腎臓、副腎、心筋、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺及び皮膚。
【０１４１】
（３）ＤＮＡ４１３７４（ＰＲＯ３３３）(ＣＤ３３相同体)
この分子は（Ｔリンパ球共刺激アッセイにおいて一方向混合リンパ球反応におけるＴリンパ球増殖を亢進する）免疫賦活性があることが示された。この分子の分布パターンは、この研究の開始時に利用できる組織を含む限られた組織スクリーニングによって評価した。
多くの検定された組織において、弱い核酸発現は胸腺Ｔリンパ球で検出された(脾臓とリンパ節は検定されなかった)。この結果はこれに続くin situハイブリダイゼーション研究で確認された。その研究の結果はＴリンパ球特定領域の非ヒト霊長類胸腺及びヒト扁桃腺で、同様に低いレベルで発現を示した。制限された分散パターンはＴリンパ球や抗体提示細胞のようなＴリンパ球に深く関与する細胞(樹状細胞集団など)により発現が示唆される。重大なリンパ球炎症及び反応性濾胞形成の存在での炎症したヒト組織(炎症性腸疾患及び慢性リンパ球性の間質性肺炎／気管支炎)には、多数のＴリンパ球を含む領域の発現が検出されない。
分散の違い(例えば、Ｔリンパ球性炎症のある領域以外の胸腺と扁桃のリンパ領域での発現)は以下の可能性を示唆する：
１．炎症した細胞以外の胸腺及び扁桃腺リンパ節に存在するＴリンパ球部分集合で選択的／制限的発現があるということ。未成熟で、機能していないＴリンパ球は、胸腺及び扁桃の両方に存在するが、恐らく慢性炎症組織での主要な集団ではない。
２．Ｔリンパ球での発現は弱く、Ｔリンパ球を持つ組織での検出の違いは、Ｔリンパ球集団の型の違いの反映であるよりもむしろ、それらの組織部分のＲＮＡの質の反映であるということ。
３．胸腺及び扁桃での発現はリンパ球内ではなく、むしろＴリンパ球に深く関与する特異的細胞集団内であり、炎症した肺及び腸では検出されないということ。その様な可能性があるのは樹状細胞集団である。
非ヒト霊長類では、胸腺リンパ球の弱い発散発現がある。
その後の研究で、次のような結果が報告された：
炎症肺：(慢性リンパ球性及び肉芽腫性肺)：弱い負のシグナルはコントロールのセンスプローブに比較して間質で観察された。；通常のチンパンジー胸腺(ヒト胸腺は入手不可能)及びヒト扁桃で弱い発現があった。後に発現は毛包周辺帯域を含むこの構造のＴリンパ球領域及び副皮質で顕著であった。
次のヒト組織では発現が検出されなかった：炎症性腸疾患(８患者検体)、慢性炎症性及び通常の肺(６患者検体)、慢性硬化性腎炎(１患者検体)、急性炎症性及び硬化肝臓(１０患者検体)、通常及び乾癬の皮膚、及び末梢リンパ節(非反応性)。
【０１４２】
実施例２０
ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７のハイブリッド形成プローブとしての使用
以下の方法は、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化するヌクレオチド配列のハイブリッド形成プローブとしての使用を記述する。
（それぞれ図１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，及び３１、それぞれ配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，及び３１に示されるような）全長又は成熟ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７又はその断片のコード化配列を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリの同種ＤＮＡ（ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７の天然発生変異体をコード化するもの等）のスクリーニングのためのプローブとして用いられる。
ハイブリッド形成及びいずれかのライブラリＤＮＡを含むフィルターの洗浄は、以下の高緊縮性条件下で実施される。ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドをコードしている遺伝子から誘導された放射標識プローブのフィルターへのハイブリッド形成は、50%ホルムアミド、5x ＳＳＣ、0.1%ＳＤＳ、0.1%ピロリン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、2xデンハード液、及び10%デキストラン硫酸の溶液中で４２℃で２０時間実施した。フィルターの洗浄は、0.1xＳＳＣ及び0.1%ＳＤＳ水溶液中で、４２℃で実施される。
全長天然配列をコード化するＤＮＡと所望の配列同一性を持つＤＮＡは、次いで当分野で既知の標準的技術を用いて同定できる。
【０１４３】
実施例２１
大腸菌におけるＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化する核酸の発現
この実施例は、大腸菌での組換え発現による非グリコシル化形態のＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７の調製を示す。
初めに、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７（それぞれ配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，又は３１）をコード化するＤＮＡ配列を、選択したＰＣＲプライマーを用いて増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターが用いられる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌から誘導されたもの；Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)参照）であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され脱リン酸される。ＰＣＲ増幅した配列を、次いでベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリＨｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ポリＨｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７コード化領域、ラムダ転写終結区、及びａｒｇＵ遺伝子をコード化する配列を含む。
ライゲーション混合物は、次いで、上掲のSambrook等に記載された方法を用いた選択大腸菌株の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列決定で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で一晩増殖させうる。オーバーナイト培地は、続いて大規模培地の播種に用いてもよい。次に細胞を所望の光学密度まで増殖させ、その間に発現プロモーターが作動する。
更に数時間の細胞培養の後、細胞を遠心分離によって回収することができる。遠心分離で得られた細胞ペレットは当分野で周知の種々の試薬を用いて可溶化され、ついで金属キレート化カラムを用いてポリペプチドを緊密に結合させる条件下において可溶化ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドを精製することができる。
ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４及びＰＲＯ１７６０は上記した方法でポリ-Ｈｉｓタグ形態で大腸菌で成功裏に発現された。
【０１４４】
実施例２２
哺乳動物細胞におけるＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化する核酸の発現
この実施例は、哺乳動物細胞での組換え発現による、潜在的にグリコシル化形態のＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７の調製を例示する。
発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５（1989年3月15日発行のEP 307,247参照）を用いた。場合によっては、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ＤＮＡを、選択制限酵素でｐＲＫ５に結合させ、上掲のSambrook等に記載されたような結合方法を用いてＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化するＤＮＡを挿入させる。得られたベクターは、ｐＲＫ５-(ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７コード化ＤＮＡ)と呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞である。ヒト２９３細胞（ATCC CCL 1573）は、組織培養プレートにおいて子ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの培地でコンフルエンスまで増殖させた。約１０μｇのｐＲＫ５-(ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７コード化ＤＮＡ)をＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコード化する約1μgのＤＮＡ［Thimmappaya等, Cell, 31:543 (1982))］と混合し、５００μｌの1mMトリス-ＨＣｌ、0.1mMのＥＤＴＡ、0.227MのＣａＣｌ_２に溶解させた。この混合物に、滴状の、500μlの50mMのＨＥＰＥＳ（pH7.35）、280mMのＮａＣｌ、1.5mMのＮａＰＯ_４を添加し、２５℃で10分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約4時間定着させた。培養培地を吸引し、2mlのＰＢＳ中20%グリセロールを３０秒間添加した。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートした。
形質移入の約２４時間後、培養培地を除去し、培養培地（のみ）又は200μCi/mlの^３５Ｓ-システイン及び200μCi/mlの^３５Ｓ-メチオニンを含む培養培地で置換した。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、15%ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムに暴露した。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
【０１４５】
これに代わる技術では、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化する遺伝子を、Somparyrac等, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入してもよい。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、700μgのｐＲＫ５-(ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７コード化ＤＮＡ)を添加する。細胞を、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートした。細胞を20%グリセロールで90秒間処理し、組織培地で洗浄し、組織培地、5μｇ/mlウシインシュリン及び0.1μg/mlウシトランスフェリンを含有するスピナーフラスコに再度導入した。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いでＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドをコード化する発現遺伝子を含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の任意の選択方法によって精製した。
他の実施態様では、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化する遺伝子をＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５-(ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７コード化ＤＮＡ)核酸は、ＣａＰＯ_４又はＤＥＡＥ-デキストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートすることができ、培地を培養培地（単独）又は^３５Ｓ-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換した。ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドの存在を同定した後、培養培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、次いで条件培地を回収する。次いで、発現されたＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７を含む培地を濃縮して、選択した方法によって精製することができる。
【０１４６】
また、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７ポリペプチドをコードしているエピトープタグ遺伝子を、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコードしている遺伝子はｐＲＫ５ベクターからサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物はＰＣＲ増幅を受けてバキュロウイルス発現ベクター中にポリ-Ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグとインフレームで融合できる。ポリ-ＨｉｓタグＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化する遺伝子挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入することができる。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。次いでポリ-Ｈｉｓタグ-[ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７]をコード化する発現遺伝子を含む培地を濃縮し、Ｎｉ^２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィー等の任意の選択方法により精製できる。
ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６及びＰＲＯ２０５は上述した方法によりＣＨＯ細胞中で安定に発現された。さらに、ＰＲＯ３６４とＰＲＯ８４６は一時的方法によりＣＨＯ細胞中で発現された。
【０１４７】
実施例２３
酵母菌でのＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化する核酸の発現
以下の方法は、酵母菌中でのＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化する遺伝子の組換え発現を記載する。
まず、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７の細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを構築する。ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化するＤＮＡ及びプロモーターを、選択したプラスミドの適切な制限酵素部位に挿入してＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化する遺伝子の細胞内発現させる。分泌のために、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化するＤＮＡを、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、天然ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７シグナルポリペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチドをコード化するＤＮＡ、又は、例えば酵母菌アルファ因子又はインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７コード化遺伝子の発現のためのリンカー配列とともに、選択プラスミド中にクローニングすることができる。
次いで、酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌を上記の発現プラスミドで形質転換し、選択発酵培地中で培養されうる。形質転換した酵母菌上清を、１０％トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７は、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択カートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７を含む濃縮物は、選択カラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
【０１４８】
実施例２４
バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化する核酸の発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中における組換え発現を記載する。
ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化する配列は、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させる。このようなエピトープタグは、ポリ-Ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Novagen）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単に説明すると、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５のコード化配列又はＰＲＯ８８７又はＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７のコード化配列の所望する部分［膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコード化する配列又はタンパク質が細胞外である場合には成熟タンパク質をコードする配列など］が、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５’プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生成物は、次いで、それらの選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGoldＴＭウイルスＤＮＡ（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。２８℃で４−５日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilley等, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, (Oxford: Oxford University Press (1994))に記載されているように実施した。
次いで、発現されたポリ-Ｈｉｓタグ-[ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７]は、例えば、Ｎｉ^２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィーにより以下のように精製される。抽出物は、Rupert等, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製した。簡単に説明すると、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（25mlのＨｅｐｅｓ、pH7.9；12.5mMのＭｇＣｌ_２；0.1mMのＥＤＴＡ；10%のグリセロール；0.1%のＮＰ-４０；0.4MのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で2回20秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー（50mMリン酸塩、300mMＮａＣｌ、10%のグリセロール、pH7.8）で50倍希釈し、0.45μｍフィルターで濾過した。Ｎｉ^２＋-ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販）を5mlの総容積で調製し、25mlの水で洗浄し、25mlの負荷バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分0.5mlでカラムに負荷した。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ _２８０ のベースラインまで負荷バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（50mMのリン酸塩；300mMのＮａＣｌ、10%のグリセロール、pH6.0）で洗浄した。Ａ _２８０ のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で0から500mMのイミダゾール勾配で展開した。1mlの分画を回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）に複合したＮｉ^２＋-ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析した。溶離したＨｉｓ _１０ −タグ[ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７]を含む分画をそれぞれプールし、負荷バッファーで透析した。
【０１４９】
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）-[ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７]の精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
発現は実際には0.5-2Lのスケールであったが、容易により大きな（例えば8L）調製にスケールアップできる。タンパク質はＩｇＧ作成物（イムノアドヘシン）として発現され、そこではタンパク質細胞外領域がヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン及び／又はポリ-Ｈｉｓタグ形態を含むＩｇＧ１定常領域配列に融合している。
ＰＣＲ増幅に続いて、対応するコード化配列をバキュロウイルス発現ベクター（ＩｇＧ融合物に対するpb.PH.IgG及びポリ-Ｈｉｓタグタンパク質に対するpb.PH.His.c）にサブクローニングし、そのベクター及びBaculogold(登録商標)バキュロウイルスＤＮＡ（Pharmingen）を１０５スポドプテラフルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）にリポフェクチン（Gibco BRL）を用いて同時形質移入した。pb.PH.IgG及びpb.PH.Hisは、市販のバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（Pharmingen）の修飾物であり、Ｈｉｓ又はＦｃタグ配列を含むように修飾されたポリリンカー領域を持つ。細胞を、10%のＦＢＳ（Hyclone）を追加したHinkのＴＮＭ-ＦＭ培地で成長させた。細胞は、２８℃で５日間インキュベートした。上清を回収し、続いて10%ＦＢＳを追加したHinkのＴＮＭ-ＦＨ培地におけるＳｆ９細胞感染による約10の感染効率（ＭＯＩ）での最初のウイルス増幅に用いた。細胞を２８℃で３日間インキュベートした。上清を回収し、バキュロウイルス発現ベクターにおける作成物の発現を、1mlの上清の25mLのヒスチジンタグタンパク質用のＮｉ^２＋-ＮＴＡビーズ（QIAGEN）又はＩｇＧタグタンパク質用のプロテインＡセファロースCL-4Bビーズ（Pharmacia）へのバッチ結合、次いでクマシーブルー染色により周知の濃度のタンパク質標準と比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定した。
第１の増幅ウイルス上清をＥＳＦ-９２１培地（Expression System LLC）で成長させたＳｆ９細胞のスピナー培地（500ml）の約０．１のＭＯＩでの感染に使用した。細胞は２８℃で３日間インキュベートした。上清を回収して濾過した。バッチ結合及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、スピナー培地の発現が確認されるまで、必要に応じて繰り返した。
形質移入細胞からの条件培地（0.5〜3L）を、遠心分離により細胞を除去し0.22ミクロンフィルターを通して濾過することにより回収した。ポリ-Ｈｉｓタグ構築物については、Ｎｉ^２＋-ＮＴＡカラム（Qiagen）を用いてタンパク質構築物を精製した。精製前に、イミダゾールを条件培地に5mMの濃度まで添加した。条件培地を、0.3MのＮａＣｌ及び5mMイミダゾールを含む20mMのＨｅｐｅｓ, pH7.4バッファーで平衡化した6mlのNi^２＋-NTAカラムに4-5ml/分の流速で４℃においてポンプ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて10mMのＨｅｐｅｓ、0.14MのＮａＣｌ及び4%のマンニトールを含む貯蔵バッファー、pH6.8に25mlのG25 Superfine（Pharmacia）カラムを用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵した。
【０１５０】
タンパク質のイムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH6.8で平衡化した5mlのプロテインＡカラム（Pharmacia）に汲み出した。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離した。溶離したタンパク質は、1mlの画分を275mLの1Mトリスバッファー, pH9を含む管に回収することにより即座に中性化した。続いて、高度に精製されたタンパク質を、ポリ-Ｈｉｓタグタンパク質について上記したような貯蔵バッファー中に脱塩した。タンパク質の均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＰＥＧ）電気泳動及びエドマン(Edman)分解によるＮ-末端アミノ酸配列決定により評価できる。
ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ８８５及びＰＲＯ８８７は、上記の方法でバキュロウイルス感染したＳｆ９昆虫細胞で成功裏に発現された。
あるいは、改変したバキュロウイルス法をｈｉｇｈ５細胞取り込みに使用してもよい。この方法では、所望の配列をコード化するＤＮＡは、Ｐｆｕ（Stratagene）等の適切な系で増幅されても、又はバキュロウイルス発現ベクターの含まれるエピトープタグの上流（5'-）に融合させてもよい。このようなエピトープタグには、ポリ-Ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域等）を含む。種々のプラスミドを用いることができ、ｐＩＥ1-１（Novagen）等の市販のプラスミドから誘導されたプラスミドも含まれる。安定に形質転換された昆虫細胞におけるバキュロウイルスｉｅ１プロモーターからの組換えタンパク質の構成的発現のために、ｐＩＥ1-１及びｐＩＥ1-２ベクターを設計する。このプラスミドは複数のクローニング部位の方向においてのみ相違し、未感染昆虫細胞におけるｉｅ１媒介遺伝子発現に重要であることが知られた全てのプロモーター配列並びにｈｒ５エンハンサーエレメントを含む。ｐＩＥ1-１及びｐＩＥ1-２は翻訳開始部位を含み、融合タンパク質の製造に使用できる。簡単には、所望の配列又は配列の所望の部分（膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコード化する配列など）を、５'及び３'領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅する。５'プライマーは隣接する（選択された）制限酵素部位を導入してもよい。生成物は、次いで、選択された制限酵素で消化して発現ベクターにサブクローニングされる。例えば、ｐＩＥｌ-１の誘導体はヒトＩｇＧ（pb.PH.IgG）のＦｃ領域又は所望する配列の８ヒスチジン（pb.PH.His）タグ下流（3'-）を含むことができる。好ましくは、ベクター作成物は確認のために配列決定される。
【０１５１】
Ｈｉｇｈ-５細胞を、２７℃、ＣＯ_２無し、pen/strep無しの条件下で50%の集密度まで成長させた。150mmプレート各々について、配列を有するｐＩＥベースベクター30μgを、1mlのＥｘ-細胞培地（媒質：Ex-細胞401＋1/100 L-Ｇｌｕ JRH Biosciences #14401-78P（注：この媒質は光感受性））と混合し、別の管において、100μlのセルフェクチン（CellFECTIN(Gibco BRL #10362-010)(ボルテックスで混合)）を1mlのＥｘ-細胞培地と混合した。２つの溶液を混合し、室温で１５分間インキュベーションした。8mlのＥｘ-細胞培地を2mlのＤＮＡ／セルフェクチン混合物に添加し、Ｅｘ-細胞培地で１回洗浄したhigh-５細胞上に層形成させた。次いでプレートを暗中室温で１時間インキュベートした。次いでＤＮＡ／セルフェクチン混合物を吸引し、細胞をＥｘ-細胞で１回洗浄して過剰のセルフェクチンを除去した。30mlの新鮮なＥｘ-細胞培地を添加し、細胞を２８℃で３日間インキュベートした。上清を回収して、バキュロウイルス発現ベクターでの配列の発現を、1mlの上清の25mLのヒスチジンタグタンパク質用のＮｉ^２＋-ＮＴＡビーズ（QIAGEN）又はＩｇＧタグタンパク質用のプロテインＡセファロースCL-4Bビーズ（Pharmacia）へのバッチ結合、次いでクマシーブルー染色により周知の濃度のタンパク質標準と比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定した。
形質移入細胞からの条件培地（0.5〜3L）を、遠心分離により細胞を除去し、0.22ミクロンフィルターを通して濾過することにより回収した。ポリ-Ｈｉｓタグ作成物については、配列を含むタンパク質をＮｉ^２＋-ＮＴＡカラム（Qiagen）を用いて精製した。精製前に、イミダゾールを条件培地に5mMの濃度まで添加した。条件培地を、0.3MのＮａＣｌ及び5mMイミダゾールを含む20mMのＨｅｐｅｓ, pH7.4バッファーで平衡化した6mlのNi^２＋-NTAカラムに4-5ml/分の流速で４８℃においてポンプ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて10mMのＨｅｐｅｓ、0.14MのＮａＣｌ及び4%のマンニトールを含む貯蔵バッファー, pH6.8中で25mlのG25 Superfine（Pharmacia）カラムを用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵した。
タンパク質のイムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH6.8で平衡化した5mlのプロテインＡカラム（Pharmacia）に汲み出した。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離した。溶離したタンパク質は、1mlの画分を275mLの1Mトリスバッファー, pH9を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ-Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。配列の均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲル及びエドマン(Edman)分解によるＮ-末端アミノ酸配列決定及び所望又は必要に応じて他の分析手法により評価できる。
ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ１７６０は、ｈｉｇｈ５細胞で上記の方法により発現された。
【０１５２】
実施例２５
ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７に結合する抗体の調製
この実施例は、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７に特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、当分野で周知であり、例えば、上掲のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原は、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７を含む精製ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７融合タンパク質、及び細胞表面に組換えＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７をコード化する遺伝子を発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に１−１００マイクログラムの量で注入したＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入する。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗-ＰＲＯ１７９、抗-ＰＲＯ２３８、抗-ＰＲＯ３６４、抗-ＰＲＯ８４４、抗-ＰＲＯ８４６、抗-ＰＲＯ１７６０、抗-ＰＲＯ２０５、抗-ＰＲＯ３２１、抗-ＰＲＯ３３３、抗-ＰＲＯ８４０、抗-ＰＲＯ８７７、抗-ＰＲＯ８７８、抗-ＰＲＯ８７９、抗-ＰＲＯ８８２、抗-ＰＲＯ８８５又は抗-ＰＲＯ８８７抗体の検出のためにＥＬＩＳＡアッセイで試験するため、レトロオービタル出血によって血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
【０１５３】
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ」な動物に、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７の静脈内注射の最後の注入がされうる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出した。次いで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＣＴＴから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫細胞系に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
ハイブリドーマ細胞は、ＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７に対する反応性についてのＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。所望のＰＲＯ１７９、ＰＲＯ２３８、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ８４６、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ３２１、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ８７７、ＰＲＯ８７８、ＰＲＯ８７９、ＰＲＯ８８２、ＰＲＯ８８５又はＰＲＯ８８７に対するモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
ポジティブハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗-ＰＲＯ１７９、抗-ＰＲＯ２３８、抗-ＰＲＯ３６４、抗-ＰＲＯ８４４、抗-ＰＲＯ８４６、抗-ＰＲＯ１７６０、抗-ＰＲＯ２０５、抗-ＰＲＯ３２１、抗-ＰＲＯ３３３、抗-ＰＲＯ８４０、抗-ＰＲＯ８７７、抗-ＰＲＯ８７８、抗-ＰＲＯ８７９、抗-ＰＲＯ８８２、抗-ＰＲＯ８８５又は抗-ＰＲＯ８８７モノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの結合に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０１５４】
材料の寄託
次の細胞系をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,10801 ユニバーシティブールバール、マナッサス、ＶＡ20110-2209、米国(ATCC)に寄託した：
材料 ATCC寄託番号 寄託日
DNA16451-1388 209776 1998年4月14日
DNA35600-1162 209370 1997年10月16日
DNA47365-1206 209436 1997年11月7日
DNA59838-1462 209976 1998年6月16日
DNA44196-1353 209847 1998年5月6日
DNA76532-1702 203473 1998年11月17日
DNA34433 209719 1998年3月31日
DNA53987 209858 1998年5月12日
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 天然配列ＰＲＯ１７９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）を示す図であり、配列番号：１は、ここで「ＤＮＡ１６４５１-１３８８」と称されるクローンである。
【図２】 図１に示した配列番号：１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２）を示す図である。
【図３】 天然配列ＰＲＯ２３８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３）を示す図であり、配列番号：３は、ここで「ＤＮＡ３５６００-１１６２」と称されるクローンである。
【図４】 図３に示した配列番号：３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４）を示す図である。
【図５】 天然配列ＰＲＯ３６４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５）を示す図であり、配列番号：５は、ここで「ＤＮＡ４７３６５-１２０６」と称されるクローンである。
【図６】 図５に示した配列番号：５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６）を示す図である。
【図７】 天然配列ＰＲＯ８４４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７）を示す図であり、配列番号：７は、ここで「ＤＮＡ５９８３８-１４６２」と称されるクローンである。
【図８】 図７に示した配列番号：７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：８）を示す図である。
【図９】 天然配列ＰＲＯ８４６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９）を示す図であり、配列番号：９は、ここで「ＤＮＡ４４１９６-１３５３」と称されるクローンである。
【図１０】 図９に示した配列番号：９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１０）を示す図である。
【図１１】 天然配列ＰＲＯ１７６０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示す図であり、配列番号：１１は、ここで「ＤＮＡ７６５３２-１７０２」と称されるクローンである。
【図１２】 図１１に示した配列番号：１１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１２）を示す図である。
【図１３】 天然配列ＰＲＯ２０５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３）を示す図であり、配列番号：１３は、ここで「ＤＮＡ３０８６８」と称されるクローンである。
【図１４】 図１３に示した配列番号：１３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１４）を示す図である。
【図１５】 天然配列ＰＲＯ３２１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５）を示す図であり、配列番号：１５は、ここで「ＤＮＡ３４４３３」と称されるクローンである。
【図１６】 図１５に示した配列番号：１５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６）を示す図である。
【図１７】 天然配列ＰＲＯ３３３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７）を示す図であり、配列番号：１７は、ここで「ＤＮＡ４１３７４」と称されるクローンである。
【図１８】 図１７に示した配列番号：１７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８）を示す図である。
【図１９】 天然配列ＰＲＯ８４０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９）を示す図であり、配列番号：１９は、ここで「ＤＮＡ５３９８７」と称されるクローンである。
【図２０】 図１９に示した配列番号：１９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２０）を示す図である。
【図２１】 天然配列ＰＲＯ８７７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１）を示す図であり、配列番号：２１は、ここで「ＤＮＡ５８１２０」と称されるクローンである。
【図２２】 図２１に示した配列番号：２１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２）を示す図である。
【図２３】 天然配列ＰＲＯ８７８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２３）を示す図であり、配列番号：２３は、ここで「ＤＮＡ５８１２１」と称されるクローンである。
【図２４】 図２３に示した配列番号：２３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２４）を示す図である。
【図２５】 天然配列ＰＲＯ８７９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２５）を示す図であり、配列番号：２５は、ここで「ＤＮＡ５８１２２」と称されるクローンである。
【図２６】 図２５に示した配列番号：２５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６）を示す図である。
【図２７】 天然配列ＰＲＯ８８２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７）を示す図であり、配列番号：２７は、ここで「ＤＮＡ５８１２５」と称されるクローンである。
【図２８】 図２７に示した配列番号：２７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８）を示す図である。
【図２９】 天然配列ＰＲＯ８８５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９）を示す図であり、配列番号：２９は、ここで「ＤＮＡ５８１２８」と称されるクローンである。
【図３０】 図２９に示した配列番号：２９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３０）を示す図である。
【図３１】 天然配列ＰＲＯ８８７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３１）を示す図であり、配列番号：３１は、ここで「ＤＮＡ５８１３０」と称されるクローンである。
【図３２】 図３１に示した配列番号：３１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す図である。 [Document Name] Statement
Title of the Invention Angiogenesis andheartPromotion or inhibition of angiogenesis
[Claims]
    1. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide, or an agonist or antagonist thereof, is pharmaceutically acceptable. Mixed with carrierMComposition.
    (2) A therapeutically effective amount ofThe composition of claim 1, comprising the polypeptide, or the agonist or antagonist thereof.
    3. The method according to claim 1, wherein the agonist is anti-PRO179, anti-PRO238, anti-PRO364, anti-PRO844, anti-PRO846, anti-PRO1760, anti-PRO205, anti-PRO321, anti-PRO333, anti-PRO877, anti-PRO877. The composition of claim 1, which is a PRO878, anti-PRO879, anti-PRO882, anti-PRO885 or anti-PRO887 antibody.
    4. The antagonist may comprise anti-PRO179, anti-PRO238, anti-PRO364, anti-PRO844, anti-PRO846, anti-PRO1760, anti-PRO205, anti-PRO321, anti-PRO333, anti-PRO877, anti-PRO877. The composition of claim 1, which is a PRO878, anti-PRO879, anti-PRO882, anti-PRO885 or anti-PRO887 antibody.
    5. The composition of claim 1, further comprising a cardiovascular, endothelial, angiogenic agent or an angiostatic agent.
    6. The PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide, or an agonist or antagonist thereof, is pharmaceutically acceptable. Including mixing with a carrierM2. The composition of claim 1PreparationMethod.
    7. (1) (a) PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide, (b) PRO189, PRO287. PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, agonists of PRO885 or PRO887 polypeptide, or (c) PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PR 879, PRO882, PRO885 or PRO887 antagonist polypeptide in admixture with a pharmaceutically acceptable carrier includingMComposition;
  (2) a container containing the composition; and
  (3) An article of manufacture comprising a label affixed to the container or a packaging insert contained in the container indicating use of the composition in treating cardiovascular, endothelial, and angiogenic diseases.
    8. The agonist may be an anti-PRO179, anti-PRO238, anti-PRO364, anti-PRO844, anti-PRO846, anti-PRO1760, anti-PRO205, anti-PRO321, anti-PRO333, anti-PRO877, The product according to claim 7, which is -PRO878, anti-PRO879, anti-PRO882, anti-PRO885 or anti-PRO887 antibody.
    9. The method according to claim 9, wherein the antagonist is anti-PRO179, anti-PRO238, anti-PRO364, anti-PRO844, anti-PRO846, anti-PRO1760, anti-PRO205, anti-PRO321, anti-PRO333, anti-PRO877, anti-PRO877. The product according to claim 7, which is -PRO878, anti-PRO879, anti-PRO882, anti-PRO885 or anti-PRO887 antibody.
    10. The composition according to claim 1,,A therapeutically effective amount of said polypeptide or agonist or antagonist thereof.,Mixed with the above pharmaceutically acceptable carriersIncludeAn article of manufacture according to claim 7.
    11. A method for identifying an agonist of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide:
  (A) cellsWhenThe test compound to be screened is suitable for eliciting a cellular response normally induced by PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide. ConditionsoContactThat;as well as
  (B) measuring the induction of the cellular response to determine whether the test compound is an effective agonist, wherein the induction of the cellular response is,Indicates that the test compound is an effective agonistDoing things,
A method that includes
    12. The method of claim 11, wherein the cellular response normally elicited by said polypeptide is a stimulation of cell proliferation.
    13. A method for identifying a compound that inhibits the activity of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide, Contacting the test compound with the polypeptide under conditions and for a time sufficient for the test compound to interact with the polypeptide, and determining whether the activity of the polypeptide is inhibited Method.
    14. A method for identifying a compound that inhibits the activity of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide.
  (A) contacting a cell with a test compound to be screened in the presence of the polypeptide under conditions suitable for inducing a cellular response normally elicited by the polypeptide; and
  (B) measuring the induction of said cellular response to determine whether the test compound is an effective antagonist.
    15. The method of claim 14, wherein the cellular response normally elicited by said polypeptide is a stimulation of cell proliferation.
    16. In a cell that normally expresses the polypeptide, the expression of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 polypeptide is inhibited. In a method of identifying a compound, contacting the cell with a test compound under conditions suitable for expressing the polypeptide, and determining whether expression of the polypeptide is inhibited. Including methods.
    17. An agonist of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide.
    18. An antagonist of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide.
    19. The expression of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide in a mammalian cell expressing said polypeptide. Compounds that inhibit.
    20. The compound according to claim 19, wherein said compound is an antisense oligonucleotide.
    21. An isolated antibody that binds to PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 polypeptide.
    22. The antibody according to claim 21, which is a monoclonal antibody.
    23. The antibody according to claim 21, which is an antibody fragment.
    24. The antibody according to claim 21, which is a single-chain antibody.
    25. A disease or disorder associated with a mutation in PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide-encoding nucleic acid sequence. Diagnosing a susceptibility to said disease, comprising determining the presence or absence of said mutation in said polypeptide-encoding nucleic acid sequence, wherein the presence or absence of said mutation is indicative of the presence of said disease or susceptibility to said disease.
    26. In a mammalheartIn a method for diagnosing a disease of blood vessels, endothelium or angiogenesis, PRO179, PRO238 in (a) a test sample of tissue cells obtained from the mammal and (b) a control sample of known normal tissue cells of the same cell type. , PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or a test when comparing to a control sample, including analyzing the expression level of a gene encoding the polypeptide. A method wherein the level of expression in the sample is indicative of the presence of a cardiovascular, endothelial or angiogenic disease in said mammal.
    27. In a mammalheartIn the method for diagnosing a disease of blood vessel, endothelium or angiogenesis, the test sample of tissue cells obtained from the mammal may have PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, A method comprising detecting the presence or absence of a PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide, wherein the presence or absence of the polypeptide in the test sample indicates the presence of a cardiovascular, endothelial or angiogenic disease in the mammal.
    28. In a mammalheartA method for diagnosing a disease of blood vessels, endothelium, or angiogenesis, wherein (a) a test sample of tissue cells obtained from the mammal is used as an anti-PRO179, anti-PRO238, anti-PRO364, anti-PRO844, anti-PRO846. Contacting with anti-PRO1760, anti-PRO205, anti-PRO321, anti-PRO333, anti-PRO877, anti-PRO878, anti-PRO879, anti-PRO882, anti-PRO885 or anti-PRO887 antibody; and (b) Detecting the formation of a complex between said antibody and PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide in a test sample. , In the formation of the serial complex said mammalheartA method of indicating the presence of a vascular, endothelial or angiogenic disease.
    29. A method for determining the presence of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 polypeptide in a sample. Samples presumed to contain the polypeptide were tested for anti-PRO179, anti-PRO238, anti-PRO364, anti-PRO844, anti-PRO846, anti-PRO1760, anti-PRO205, anti-PRO321, anti-PRO333, anti-PRO877, A method comprising contacting with an anti-PRO878, anti-PRO879, anti-PRO882, anti-PRO885 or anti-PRO887 antibody and measuring the binding of said antibody to a component of said sample.
    30. Anti-PRO179, anti-PRO238, anti-PRO364, anti-PRO844, anti-PRO846, anti-PRO1760, anti-PRO205, anti-PRO321, anti-PRO333, anti-PRO877, anti-PRO878, anti -PRO879, anti-PRO882, anti-PRO885 or anti-PRO887 antibody and carrier in suitable packagingheartA diagnostic kit for diseases of blood vessels, endothelium or angiogenesis.
    31. In a mammalheartTreat vascular, endothelial or angiogenic diseasesDrug for, A therapeutically effective amount of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide, or an agonist or antagonist thereofDrugs containing.
    32. The method according to claim 31, wherein the mammal is a human.Drug.
    33. The method according to claim 32, wherein the human has myocardial infarction.Drug.
    34. The humanheart33. The method of claim 32, having hypertrophy, trauma, cancer, or age-related macular degeneration.Drug.
    35. heartHypertrophy is PGF_2α35. The method of claim 34, characterized by the presence of elevated levels ofDrug.
    36. A polypeptide comprising PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide,heart32. The method of claim 31, wherein the agent is administered with a blood vessel, endothelial or angiogenic agent.Drug.
    37.
  35. The method of claim 34, comprising PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide, and administered following primary angioplasty.Drug.
    38. heartThe method according to claim 31, wherein the disease of blood vessel, endothelium or angiogenesis is cancer.Drug.
    39. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide.Including39. The method of claim 38, wherein the agent is administered in combination with a chemotherapeutic agent, a growth inhibitor or a cytotoxic agent.Drug.
    40. The agonist may be an anti-PRO179, anti-PRO238, anti-PRO364, anti-PRO844, anti-PRO846, anti-PRO1760, anti-PRO205, anti-PRO321, anti-PRO333, anti-PRO877, anti-PRO877. 32. The antibody of claim 31, which is a PRO878, anti-PRO879, anti-PRO882, anti-PRO885 or anti-PRO887 antibody.Drug.
    41. The antagonist, wherein the antagonist is anti-PRO179, anti-PRO238, anti-PRO364, anti-PRO844, anti-PRO846, anti-PRO1760, anti-PRO205, anti-PRO321, anti-PRO333, anti-PRO877, anti-PRO877. 32. The antibody of claim 31, which is a PRO878, anti-PRO879, anti-PRO882, anti-PRO885 or anti-PRO887 antibody.Drug.
    42. In a mammalheartAn agent for treating a disease of blood vessels, endothelium or angiogenesis, comprising PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide, Or a nucleic acid molecule encoding the agonist or antagonist thereofDrugs containing.
    43. The agonist may be anti-PRO179, anti-PRO238, anti-PRO364, anti-PRO844, anti-PRO846, anti-PRO1760, anti-PRO205, anti-PRO321, anti-PRO333, anti-PRO877, anti-PRO877. 43. The antibody of claim 42 which is a PRO878, anti-PRO879, anti-PRO882, anti-PRO885 or anti-PRO887 antibody.Drug.
    44. The antagonist according to claim 44, wherein the antagonist is anti-PRO179, anti-PRO238, anti-PRO364, anti-PRO844, anti-PRO846, anti-PRO1760, anti-PRO205, anti-PRO321, anti-PRO333, anti-PRO877, anti-PRO877. 43. The antibody of claim 42 which is a PRO878, anti-PRO879, anti-PRO882, anti-PRO885 or anti-PRO887 antibody.Drug.
    45. The method according to claim 42, wherein the mammal is a human.Drug.
    46. The method of claim 42, wherein said agent is administered via ex vivo gene therapy.Drug.
    47. Essentially (1) a promoter, (2) a PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide or agonist thereof. Or a nucleic acid encoding an antagonist, and (3) a retrovirus vector comprising a signal sequence for cellular secretion of the polypeptide, wherein the retrovirus vector is accompanied by a retrovirus structural protein.
    48. A retrovirus structural protein is expressed and expressed essentially as (1) a promoter, (2) PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, An ex vivo producing cell comprising a nucleic acid encoding a PRO885 or PRO887 polypeptide or an agonist or antagonist thereof, and (3) a nucleic acid structure comprising a retroviral vector comprising a signal sequence for cell secretion of the polypeptide, A producer cell wherein the producer cell comprises a retroviral vector with a structural protein and produces recombinant retroviral particles.
    49. PRO333, PRO364, PRO877, PRO879, PRO882 or PRO885 polypeptides or agonists thereof.MmEndothelial cell growth in mammalsInhibitors.
    50. PIncluding the RO179, PRO321, PRO840, PRO844, PRO846, PRO878 or PRO879 polypeptides or agonists thereof.M,NursingEndothelial cell growth in mammalsStimulant.
    51. PIncluding antagonists of the RO179, PRO321, PRO840, PRO844, PRO846, PRO878 or PRO879 polypeptides.MmEndothelial cell growth in mammalsInhibitors.
    52. PIncluding antagonists of the RO333, PRO364, PRO877, PRO879, PRO882 or PRO885 polypeptides.MmEndothelial cell growth in mammalsStimulant.
    Claim 53 PIncluding RO205, PRO882 or PRO887 polypeptide or agonist thereofMmIn mammalsheartHypertrophyInducer.
    54. PIncluding RO238, PRO878 or PRO1760 polypeptides or agonists thereofMmIn mammalsheartHypertrophyInhibitors.
    55. PIncluding RO238, PRO878 or PRO1760 polypeptides or agonists thereofMmIn mammalsheartHypertrophyInducer.
    56. PIncluding antagonists of RO205, PRO882 or PRO887 polypeptidesMmIn mammalsheartHypertrophyInhibitors.
    57. PRO179 in a mammal,PRO321,PRO844, PRO846,PRO878, PRO879PoAngiogenesis induced by repeptideAn inhibitor of,A therapeutically effective amount ofAnti-PRO179,Anti-PRO321,Anti-PRO844, Anti-PRO846,Anti-PRO878, Anti-PRO879AntibodyInhibitors containing.
    58. PRO179 in a mammal,PRO321,PRO844, PRO846,PRO878, PRO879PoAngiogenesis induced by repeptideStimulantA therapeutically effective amount of said polypeptideStimulants containing.
    59 (SEQ ID NO: 2), FIG. 4 (SEQ ID NO: 4), FIG. 6 (SEQ ID NO: 6), FIG. 8 (SEQ ID NO: 8), FIG. 10 (SEQ ID NO: 10), FIG. 12 (SEQ ID NO: 12), FIG. 14 (SEQ ID NO: 14), FIG. 16 (SEQ ID NO: 16), FIG. 18 (SEQ ID NO: 18), FIG. 22 (SEQ ID NO: 22), FIG. : 24), nucleotide sequences encoding the amino acid sequences shown in FIG. 26 (SEQ ID NO: 26), FIG. 28 (SEQ ID NO: 28), FIG. 30 (SEQ ID NO: 30), and FIG. An isolated nucleic acid having at least 80% nucleic acid sequence identity.
    60 (SEQ ID NO: 1), FIG. 3 (SEQ ID NO: 3), FIG. 5 (SEQ ID NO: 5), FIG. 7 (SEQ ID NO: 7), FIG. 9 (SEQ ID NO: 9), FIG. 11 (SEQ ID NO: 11), FIG. 13 (SEQ ID NO: 13), FIG. 15 (SEQ ID NO: 15), FIG. 17 (SEQ ID NO: 17), FIG. 21 (SEQ ID NO: 21), FIG. : 23), the nucleotide sequence shown in FIG. 25 (SEQ ID NO: 25), FIG. 27 (SEQ ID NO: 27), FIG. 29 (SEQ ID NO: 29), and FIG. 31 (SEQ ID NO: 31) and at least 80% nucleic acid An isolated nucleic acid having sequence identity.
    61 (SEQ ID NO: 1), FIG. 3 (SEQ ID NO: 3), FIG. 5 (SEQ ID NO: 5), FIG. 7 (SEQ ID NO: 7), FIG. 9 (SEQ ID NO: 9), FIG. 11 (SEQ ID NO: 11), FIG. 13 (SEQ ID NO: 13), FIG. 15 (SEQ ID NO: 15), FIG. 17 (SEQ ID NO: 17), FIG. 21 (SEQ ID NO: 21), FIG. : 23), the full length code of the nucleotide sequence shown in FIG. 25 (SEQ ID NO: 25), FIG. 27 (SEQ ID NO: 27), FIG. 29 (SEQ ID NO: 29), and FIG. 31 (SEQ ID NO: 31)ArrangementAn isolated nucleic acid having at least 80% nucleic acid sequence identity with the sequence.
    62. The full length code of the DNA deposited under ATCC accession numbers 209776, 209370, 209436, 20976, 209847, 203473, or 209719.ArrangementAn isolated nucleic acid having at least 80% nucleic acid sequence identity with the sequence.
    63. A vector comprising the nucleic acid according to any one of claims 59 to 62.
    64. The vector of claim 63, operably linked to a control sequence recognized by a host cell transformed with said vector.
    65. A host cell comprising the vector of claim 63.
    66. The host cell according to claim 65, wherein said cell is a CHO cell.
    67. The host cell according to claim 65, wherein said cell is Escherichia coli.
    68. The host cell of claim 65, wherein said cell is a yeast cell.
    69. The host cell of claim 65, wherein said cell is a baculovirus-infected insect cell.
    70. A method for producing PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide, wherein the host according to claim 65. A method comprising culturing cells under conditions suitable for expression of said polypeptide, and recovering said polypeptide from a culture medium.
    71 (SEQ ID NO: 2), FIG. 4 (SEQ ID NO: 4), FIG. 6 (SEQ ID NO: 6), FIG. 8 (SEQ ID NO: 8), FIG. 10 (SEQ ID NO: 10), FIG. 12 (SEQ ID NO: 12), FIG. 14 (SEQ ID NO: 14), FIG. 16 (SEQ ID NO: 16), FIG. 18 (SEQ ID NO: 18), FIG. 22 (SEQ ID NO: 22), FIG. : 24), FIG. 26 (SEQ ID NO: 26), FIG. 28 (SEQ ID NO: 28), FIG. 30 (SEQ ID NO: 30), and FIG. 32 (SEQ ID NO: 32) and at least 80% of the amino acids An isolated polypeptide having sequence identity.
    72 (SEQ ID NO: 2), FIG. 4 (SEQ ID NO: 4), FIG. 6 (SEQ ID NO: 6), FIG. 8 (SEQ ID NO: 8), FIG. 10 (SEQ ID NO: 10), FIG. 12 (SEQ ID NO: 12), FIG. 14 (SEQ ID NO: 14), FIG. 16 (SEQ ID NO: 16), FIG. 18 (SEQ ID NO: 18), FIG. 22 (SEQ ID NO: 22), FIG. : 24), at least 80 when compared to the amino acid sequences shown in FIG. 26 (SEQ ID NO: 26), FIG. 28 (SEQ ID NO: 28), FIG. 30 (SEQ ID NO: 30), and FIG. 32 (SEQ ID NO: 32). Isolated polypeptide scored as% positive.
    73. A single amino acid sequence having at least 80% amino acid sequence identity to the amino acid sequence encoded by the full length coding sequence of the DNA deposited under ATCC accession numbers 209776, 209370, 209436, 20976, 209847, 203473, or 209719. Isolated polypeptide.
    74. A chimeric molecule comprising the polypeptide of any one of claims 71 to 73 fused to a heterologous amino acid sequence.
    75. The chimeric molecule according to claim 74, wherein said heterologous amino acid sequence is an epitope tag sequence.
    76. The chimeric molecule according to claim 74, wherein said heterologous amino acid sequence is an Fc region of an immunoglobulin.
    77. An antibody that specifically binds to the polypeptide of any one of claims 71 to 73.
    78. The antibody of claim 77, wherein said antibody is a monoclonal, humanized or single chain antibody.
    (A) FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), FIG. 4 (SEQ ID NO: 4), FIG. 6 (SEQ ID NO: 6), FIG. 8 (SEQ ID NO: 8), FIG. 10 (SEQ ID NO: 10), FIG. 12 (SEQ ID NO: 12), FIG. 14 (SEQ ID NO: 14), FIG. 16 (SEQ ID NO: 16), FIG. 18 (SEQ ID NO: 18), FIG. 22 (SEQ ID NO: 22), FIG. (SEQ ID NO: 24), FIG. 26 (SEQ ID NO: 26), FIG. 28 (SEQ ID NO: 28), FIG. 30 (SEQ ID NO: 30), and FIG. 32 (SEQ ID NO: 32) , Its related signalspeptideA nucleotide sequence encoding a lacking;
  (B) FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), FIG. 4 (SEQ ID NO: 4), FIG. 6 (SEQ ID NO: 6), FIG. 8 (SEQ ID NO: 8), FIG. 10 (SEQ ID NO: 10), FIG. (SEQ ID NO: 12), FIG. 14 (SEQ ID NO: 14), FIG. 16 (SEQ ID NO: 16), FIG. 18 (SEQ ID NO: 18), FIG. 22 (SEQ ID NO: 22), FIG. ), The extracellular domains of the polypeptides shown in FIG. 26 (SEQ ID NO: 26), FIG. 28 (SEQ ID NO: 28), FIG. 30 (SEQ ID NO: 30), and FIG. A nucleotide sequence encoding one having its associated signal peptide; or
  (C) FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), FIG. 4 (SEQ ID NO: 4), FIG. 6 (SEQ ID NO: 6), FIG. 8 (SEQ ID NO: 8), FIG. 10 (SEQ ID NO: 10), FIG. (SEQ ID NO: 12), FIG. 14 (SEQ ID NO: 14), FIG. 16 (SEQ ID NO: 16), FIG. 18 (SEQ ID NO: 18), FIG. 22 (SEQ ID NO: 22), FIG. ), The extracellular domains of the polypeptides shown in FIG. 26 (SEQ ID NO: 26), FIG. 28 (SEQ ID NO: 28), FIG. 30 (SEQ ID NO: 30), and FIG. An isolated nucleic acid having at least 80% nucleic acid sequence identity with a nucleotide sequence encoding that lacks the relevant signal peptide.
    (A) FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), FIG. 4 (SEQ ID NO: 4), FIG. 6 (SEQ ID NO: 6), FIG. 8 (SEQ ID NO: 8), FIG. 10 (SEQ ID NO: 10), FIG. 12 (SEQ ID NO: 12), FIG. 14 (SEQ ID NO: 14), FIG. 16 (SEQ ID NO: 16), FIG. 18 (SEQ ID NO: 18), FIG. 22 (SEQ ID NO: 22), FIG. (SEQ ID NO: 24), FIG. 26 (SEQ ID NO: 26), FIG. 28 (SEQ ID NO: 28), FIG. 30 (SEQ ID NO: 30), and FIG. 32 (SEQ ID NO: 32) , Its related signalspeptideLacking;
  (B) FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), FIG. 4 (SEQ ID NO: 4), FIG. 6 (SEQ ID NO: 6), FIG. 8 (SEQ ID NO: 8), FIG. 10 (SEQ ID NO: 10), FIG. (SEQ ID NO: 12), FIG. 14 (SEQ ID NO: 14), FIG. 16 (SEQ ID NO: 16), FIG. 18 (SEQ ID NO: 18), FIG. 22 (SEQ ID NO: 22), FIG. ), The extracellular domains of the polypeptides shown in FIG. 26 (SEQ ID NO: 26), FIG. 28 (SEQ ID NO: 28), FIG. 30 (SEQ ID NO: 30), and FIG. Having its associated signal peptide; or
  (C) FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), FIG. 4 (SEQ ID NO: 4), FIG. 6 (SEQ ID NO: 6), FIG. 8 (SEQ ID NO: 8), FIG. 10 (SEQ ID NO: 10), FIG. (SEQ ID NO: 12), FIG. 14 (SEQ ID NO: 14), FIG. 16 (SEQ ID NO: 16), FIG. 18 (SEQ ID NO: 18), FIG. 22 (SEQ ID NO: 22), FIG. ), The extracellular domains of the polypeptides shown in FIG. 26 (SEQ ID NO: 26), FIG. 28 (SEQ ID NO: 28), FIG. 30 (SEQ ID NO: 30), and FIG. An isolated polypeptide having at least 80% amino acid sequence identity with one lacking its associated signal peptide.
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
      [0001]
(Background of the Invention)
(Field of the Invention)
  The present invention relates to compositions and methods useful for promoting or inhibiting angiogenesis and / or cardiovascularization in a mammal in need of such a biological effect. This includes the diagnosis and treatment of cardiovascular disorders and carcinogenic diseases.
      [0002]
(Background description)
A. Heart disease and factors
  Approximately 5 million Americans have heart failure, and about 400,000 new heart failure cases each year. It is the single largest cause of hospitalization for people over the age of 65 in the United States. Acute heart including acute myocardial infarctiondiseaseChronic as a result of recent advances in the management ofheartFailureToOnsetsellThe number of patients is expanding. From 1979 to 1995, patients with congestive heart failure (CHF)HospitalizationRose from 377,000 to 872,000 (up 130 percent), and CHF deaths increased 116 percent.
  CHF is a syndrome characterized by left ventricular dysfunction, reduced exercise tolerance, poor living standards, and markedly reduced life span. A prerequisite for heart failure is that the heart cannot pump blood fast enough to meet the metabolic needs of body tissues (in other words, lack of cardiac output).
  At least four major types, including peripheral vasoconstriction, increased heart rate, increased cardiac contractility, and increased plasma volumeCompensatoryThe mechanism is activated in case of heart failureIncrease cardiac outputYou. These effects are mainly mediated by the sympathetic nervous system and the renin-angiotensin system. See Eichhorn, American Journal of Medicine, 104: 163-169 (1998). Pulse and heart rate as output from the sympathetic nervous system increases,And the shrinkage increases. Angiotensin II 1) directly stimulates vascular smooth muscle contraction, 2) stimulates plasma volume expansion by stimulating aldosterone and antidiuretic hormone secretion, 3) stimulates sympathetic mediated vascular tone, 4) It raises blood pressure by catalyzing the degeneration of bradykinin, which has vasodilation and natriuretic activity. See discussion by Brown and Vaughan, Circulation, 97: 1411-1420 (1998). As described below, angiotensin II also promotes myocyte necrosis (deterioration of systolic function) and cardiac fibrosis (diastolic and possibly contractile function).In the heartHas direct adverse effects. See Weber, Circulation, 96: 4065-4082 (1998).
      [0003]
  A common feature of congestive heart failure (CHF) is cardiac hypertrophy, where cardiac enlargement is activated by both mechanical and hormonal stimulation, allowing the heart to meet the demands of increased cardiac output. Morganas well asBaker, Circulation, 83: 13-25 (1991). This hypertrophic response is often associated with various characteristic conditions, such as hypertension, aortic stenosis, myocardial infarction, cardiomyopathy, valvular regurgitation, and intracardiac shunts, all of which are associated with chronic hemodynamic hyperactivity. It becomes a load.
  Hypertrophy is usually defined as an increase in the size of an organ or structure that is not involved in natural growth without tumor formation. Hypertrophy of the heart results from either or both an increase in the mass of individual cells (myocytes) or an increase in the number of cells forming tissue (hyperplasia). The expansion of the fetal heart depends mainly on an increase in myocyte count (lasting shortly after birth), but postnatal cardiac myocytes lose their proliferative capacity. Further development occurs through the enlargement of individual cells.
  The expansion of myocytes in adults is initially beneficial as a short-term response to impaired cardiac function by allowing the strain on individual muscle fibers to be reduced initially. However, under severe and prolonged overload, hypertrophic cells begin to degrade and die. Katz, "Heart Failure", in: Katz A.M.ed., Physiology of the Heart (New York: Raven Press, 1992) pp. 638-668. Cardiac hypertrophy is a significant risk factor for mortality and morbidity in the clinical course of heart failure. Katz, Trends Cardiovasc. Med., 5: 37-44 (1995). For further details on the causes and symptoms of cardiac hypertrophy, see, for example, Heart Disease, A Textbook of Cardiovascular Medicine, Braunwald, E. ed. (W.B. Saunders Co., 1988), Chapter 14, "Pathophysiology of Heart Failure".
  At the cellular level, the heart is composed of myocytes and surrounding supporting cells, collectively called non-myocytes. Non-myocytes are initially fibroblasts / mesenchymal cells and they include endothelial and smooth muscle cells. In fact, myocytes form the majority of adult myocardial mass, but represent only about 30% of the total number of cells present in the heart. In response to hormonal, physiological, hemodynamic, and pathological stimuli, adult ventricular myocytes can adapt to an increasing burden through activation of the hypertrophic process. This response increases the content of contractile proteins and cell size of myocytes in individual cardiomyocytes, without concomitant cell division and activation of fetal genes, including the gene for atrial natriuretic peptide (ANP) It is characterized by Chien et al., FASEB J., 5: 3037-3046 (1991); Chien et al., Annu. Rev. Physiol., 55: 77-95 (1993). Increased myocardial mass as a result of increased myocyte size associated with the accumulation of interstitial collagen in the extracellular matrix and around the intramyocardial coronary arteries is associated with left ventricular hypertrophy following pressure overload in humans It has been described. Caspari et al., Cardiovasc. Res. , 11: 554-558 (1977); Schwarz et al., Am. J.Cardiol., 42: 895-903 (1978); Hess et al., Circulation, 63: 360-371 (1981); Pearlman et al., Lab. Invest., 46 158-164 (1982).
      [0004]
  In addition, paracrine factors produced by non-myocyte supporting cells further develop cardiac hypertrophyToIt has been suggested that they may be involved, and various non-myocyte derived hypertrophic factors have been identified, such as leukocyte inhibitory factor (LIF) and endothelin. Metcalf, Growth Factors, 7: 169-173 (1992); Kurzrock et al., Endocrine Reviews, 12: 208-217 (1991); Inoue et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2863-2867 (1989); Yanagisawa and Masaki, Tre.nds Pharm. Sci., 10: 374-378 (1989); U.S. Patent No. 5,573,762 (published November 12, 1996). Additional exemplary factors that are potential mediators of cardiac hypertrophy include cardiotrophin-1 (CT-1) (Pennica et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 92: 1142-1146 ( 1995)), catecholamines, corticosteroids, angiotensin, and prostaglandins.
  Currently, the treatment of cardiac hypertrophy depends on the underlying heart disease.Catecholamines, corticosteroids, angiotensin, prostaglandins, LIF, endothelin (including endothelin-1, -2, and -3 and big endothelin) and CT-1 have potential for hypertrophy. Enter factors that are considered as intervening substances. For example, β-adrenergic receptor blockers (β-blockers such as propranolol, timolol,TaroRoll (tertalolol), carteolol, nadolol, betaxolol, penbutolol, acetobutolol, atenolol, metoprolol, carvedilol, etc.) and verapamil are widely used in the treatment of hypertrophic cardiomyopathy. The beneficial effects of β-blockers on symptoms (eg, chest pain) and exercise stress mainly depend on reducing heart rate, thus prolonging diastole and passively increasing ventricular filling. Thompson et al., Br. Heart J., 44: 488-98 (1980); Harrison et al., Circulation, 29: 84-98 (1964). Verapamil has been described to improve ventricular filling and possibly reduce myocardial ischemia. Bonow et al., Circulation, 72: 853-64 (1985).
  MaNifedipine and diltiazem are sometimes used to treat hypertrophic cardiomyopathy. Lorell et al., Circulation, 65: 499-507 (1982); Betocchi et al., Am. J. Cardiol., 78: 451-457 (1996). However, nifedipine can be harmful, especially for patients with outflow obstruction, due to the strong vasodilator properties. Disopyramide isNegative inotropicUsed to relieve symptoms by characteristics. Pollick, N. Engl. J. Med., 307: 997-999 (1982). However, in many patients, the initial effect gradually decreases. Wigle et al., Circulation, 92: 1680-1692 (1995). Antihypertensive treatment is associated with elevated blood pressureheartIt has been reported to have a beneficial effect on hypertrophy. Examples of drugs used alone or in combination for antihypertensive treatment include calcium antagonists, such as nitrendipine; adrenergic receptor inhibitors, such as those listed above; such as quinapril, captopril, enalapril, ramipril, Angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors such as benazepril, fosinopril, lisinopril; diuretics such as chlorothiazide, hydrochlorothiazide, hydroflumethiazide, methylchlothiazide, benzthiazide, dichlorophenamide, acetazolamide, and indabamide; and There are calcium channel inhibitors such as diltiazene, nifedipine, verapamil, and nicardipine.
  For example, treatment of hypertension with diltiazene and captoril showed a decrease in left ventricular muscle mass, but did not normalize the Doppler index of diastolic function. Szlachcic et al., Am. J. Cardiol., 63: 198-201 (1989); Shahi et al., Lancet, 336: 458-461 (1990). These findings are interpreted to indicate that excess amounts of interstitial collagen may remain after regression of left ventricular hypertrophy. Rossi et al., Am. Heart J., 124: 700-709 (1992). Rossi et al., Cited above, test in ratsHeartThe effects of captopril on the suppression and degeneration of interstitial fibrosis and cardiomyocyte hypertrophy in hypertrophy were studied.
      [0005]
  Drugs that directly increase myocardial contractility (inotropic agents)ShortperiodsoImprove cardiac outputSo heartPatients with insufficiencyToWas thought to be useful. However, all positive inotropic agents except digoxigenin improve mortality in the long term, even if it improves cardiac performance in the short term. Massie, Curr. Op. In Cardiology, 12: 209-217 (1997); Reddy et al., Curr. Opin. Cardiol., 12: 233-241 (1997). Recently, β-adrenergic receptor inhibitors have been proposed for use in heart failure. Evidence from clinical trials suggests that improvements in cardiac function can be achieved without increasing mortality, but has not yet been demonstrated to improve patient survival. Also, cardiotropin-1 or an antagonist thereof for the treatment of CHF, or growth hormone and / or insulin-like growth factor-IUse ofSee U.S. Patent Nos. 5,959,924, 5,624,806; 5,661,122; and 5,610,134 and International Patent Application No. 95/28173. Another treatment modality is heart transplantation, which is limited by the availability of donor hearts.
  Endothelin is a vasoconstrictor peptide comprising 21 amino acids, isolated from porcine artery endothelial culture supernatant and determined structurally. Yanagisawa et al., Nature, 332: 411-415 (1998). Endothelin was later found to have various effects, and endothelin antibodies, such as endothelin antagonists, have proven to be effective in treating myocardial infarction, renal failure, and other diseases. Such endothelin is present in the body,Show actionIt is expected to be an endogenous factor in the regulation of the circulatory system and may be further involved in hypertension, heart diseases such as myocardial infarction, and kidney diseases such as acute renal failure. Endothelin antagonists are described, for example, in US Pat. No. 5,773,414; Japanese Patent Publication No. 3130299/1991, European Patent 457195, European Patent 460679, and European Patent 552489. Novel endothelin B receptors for identifying endothelin receptor antagonists are described in US Pat. No. 5,773,223.
  heartFailureThe current treatments are mainly directed to the use of captopril and angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors such as diuretics. These drugs improve hemodynamic aspects, and exercise load, and reduce mortality and morbidity in patients with CHF. Kramer et al., Circulation, 67 (4): 807-816 (1983); Captopril Multicenter Research Group, JACC, 2 (4): 755-763 (1983); The CONSENSUS Trial Study Group, N. Engl. J. Med. , 316 (23): 1429-1435 (1987); The SOLVD Investigators, N. Engl. J. Med., 325 (5): 293-302 (1991). In addition, they are used for hypertension, left ventricular dysfunction, atherosclerotic vascular disease, and diabetic nephropathy. Brown and Vaughan above. However, despite proven efficacy, the response of ACE inhibitors is limited. For example, when prolonging life in the context of heart failure, ACE inhibitors appear to slow the progression of end-stage heart failure, and the majority of patients with ACE inhibitors have functional class III heart failure.
  In addition, functionalWhatAbility and exercise timeImprovementJust a littleYesMortality rate is low but highEver. The CONSENSUS Trial Study Group, N. Engl. J. Med., 316 (23): 1429-1453 (1987); The SOLVD Investigators, N. Engl. J. Med., 325 (5): 293-302 (1991). Cohn et al., N. Engl. J. Med., 325 (5): 303-310 (1991); The Captopril-Digoxin Multicenter Research Group, JAMA, 259 (4): 539-544 (1988). Thus, it is clear that ACE inhibitors can consistently alleviate symptoms in over 60% of heart failure patients and reduce heart failure mortality by only about 15-20%. See Broun and Vaughan, supra, for further side effects.
      [0006]
  Alternatives to ACE inhibitors are indicated by certain AT1 receptor antagonists. Clinical studies have shown these two approaches in the treatment of cardiovascular and renal diseases.phaseofInfluenceA comparison is planned. However, animal model data suggests that the ACE / AngII pathway, while clearly implicated in cardiac hypertrophy, is not the only one or the active primary pathway in this role.SutraTo test individual components of the roadMaMouse gene "knockout" modelButHave been created. In one such model, the key to AngIIHeart receptor, ATsub1AToGenetically deletedLet meIn these mice, when AngII is given experimentally,HypertrophyProgressShinaI(Confirming the basic success of the model in removing secondary hypertrophy of AngII). However, when the aorta is contracted in these animals (a hypertensive cardiac stress model), the heart still becomes hypertrophic. This suggests that another signaling pathway unrelated to this receptor (ATsub1A) is activated in hypertension. ACE inhibitors will probably not be able to suppress these pathways. See Harada et al., Circulation, 97: 1952-1959 (1998). See Homcy, Circulation, 97: 1890-1892 (1998) for the mystery related to the process and mechanism of cardiac hypertrophy.
  Approximately 750,000 patients develop acute myocardial infarction (AMI) each yearSufferingAbout one quarter of all deaths in the United States are due to AMI. In recent years, thrombolytic agents such as streptokinase, urokinase, and especially tissue plasminogen activator (t-PA) have greatly improved the survival of patients suffering from myocardial infarction. 1.5 to 4 hoursAcrossWhen administered as a continuous intravenous injection of t-PA, 69% to 90% of treated patients cause coronary vessel release in 90 minutes. Topol et al., Am. J. Cardiol., 61: 723-728 (1998); Neuhaus et al., J. Am. Coll. Cardiol., 12: 581-587 (1988); Neuhaus et al., J. Am. Coll. Cardiol. ., 14: 1566-1569 (1989). highestPatencyRates have been reported for high dose or rapid dosing regimens. Topol, J. Am. Coll. Cardiol., 15: 922-924 (1990). Also, t-PA can be administered as a single bolus and is dependent on the short half-life associated therewith, but is suitable for infusion therapy. Tebbe et al., Am. J. Cardiol., 64: 448-453 (1989). Although t-PA variants have been created to have particularly long half-lives and high fibrin specificity, TNKt-PA (aT103N, N117Q, KHRR (296-299) AAAAt-PA variants, Keyt et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3670-3674 (1994)) is particularly suitable for bolus administration. However, despite all these developments, the long-term prognosis of a patient's survival is highly dependent on the patient's post-infusion monitoring and treatment, including cardiac hypertrophy monitoring and treatment.
      [0007]
B. Growth factor
  Various naturally occurring polypeptides are reported to induce endothelial cell proliferation. These polypeptides include basic and acidic fibroblast growth factor (FGF) (Burgess and Maciag, Annual Rev. Biochem., 58: 575 (1989)), platelet-derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF). (Ishikawa et al., Nature, 338: 557 (1989)), and vascular endothelial growth factor (VEGF). Leung et al., Science, 246: 1306 (1989); Ferrara and Henzel, Biochem. Biophys. Res.Commun., 161: 851 (1989); Tischer et al., Biochem. Biophys. European Patent No. 471754B, issued July 31, 1996.
  Conditioned medium with cells transfected with human VEGF (hVEGF) cDNA promotes proliferation of capillary endothelial cells, whereas controlcellThen it was not. Leung et al., Science 246: 1306 (1989). Some additional cDNAs have been identified in human cDNA libraries encoding the 121-, 189-, and 206-amino acid isoforms of hVEGF (also collectively referred to as hVEGF-related proteins). The 121-amino acid protein differs from hVEGF by the feature that 44 amino acids between residues 116 and 159 of hVEGF are deleted. The 189-amino acid protein differs from hVEGF in that it has 24 amino acids inserted at residue 116 of hVEGF, and is clearly identical to human vascular permeability factor (hVPF). The 206-amino acid protein differs from hVEGF by the feature that 41 amino acids are inserted at residue 116 of hVEGF. Houck et al., Mol.Endocrin., 5: 1806 (1991); Ferrara et al.,J. cell.Biochem, 47: 211 (1991); Ferrara et al., Endocrine Reviews, 13:18 (1992); Keck et al., Science, 246: 1309 (1989); Connolly et al., J. Biol. Chem., 264: 20017 (1989); Europe published May 30, 1990. Patent No. 370989.
  ExistingFormation of new blood vessels from endotheliumAboutAngiogenesis is associated with the pathogenesis of various diseases,CurrentlyQuite proven. These include solid tumors and metastases, atherosclerosis, post lens fibroplasia, hemangiomas, chronic inflammation, intraocular neovascular syndromes such as proliferative retinopathy (e.g., diabetic retinopathy), age-related macula Including degeneration (AMD), neovascular glaucoma, immune response of transplanted corneal cells and other cells, rheumatoid arthritis, and psoriasis. Folkman et al., J. Biol. Chem., 267: 10931-10934 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol., 53: 217-239 (1991); and Garner A., "Vascular diseases", In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710.
  In the case of tumor growth, angiogenesis changes from hyperplasia to tumor formation,as well asIt appears to be very important in providing nutrients for the growth of solid tumors. Folkman et al., Nature, 339: 58 (1989). Neovascularization favors the growth of tumor cells relative to normal cells and confers proliferative autonomy. Thus, there is a correlation between the microvascular density of the tumor part and patient survival in breast cancer as well as some other tumors. Weidner et al., N. Engl. J. Med, 324: 1-6 (1991); Horak et al., Lancet, 340: 1120-1124 (1992); Macchiarini et al., Lancet, 340: 145-146 (1992).
  By exploring the positive regulators of angiogenesis, aFGF, bFGF, TGF-α, TGF-β, HGF, TNF-α, angioGeniNumerous candidates were given, including IL-8, IL-8, etc. Folkman et al., J. B. C., supra, and Klagsbrun et al., Supra. So farIdentificationThrombospondin (Good et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87: 6624-6628 (1990)), a 16-kilodalton N-terminal fragment of prolactin (Clapp et al., Endocrinology , 133: 1292-1299 (1993)), angiostatin (O'Reilly et al., Cell, 79: 315-328 (1994)), and endostatin. O'Reilly et al., Cell, 88: 277-285 (1996).
      [0008]
  In recent years, studies have not only stimulated the proliferation of vascular endothelial cells, but also induced vascular penetration and angiogenesisThatThe important role of VEGF has been elucidated. Ferrara et al., Endocr. Rev., 18: 4-25 (1997).onlyOne VEGF alleleEvenThe finding that loss can result in fetal death is implicated in the development and differentiation of the vascular system.StayAlternatives played by this factorCanShows no role. In addition, VEGF has been shown to be an important mediator of neovascularization associated with tumors and intraocular diseases. Ferrara et al., Endocr. Rev., supra. VEGF mRNA is overexpressed in many human tumors examined. Berkman et al., J. Clin. Invest., 91: 153-159 (1993); Brown et al., Human Pathol., 26: 89-91 (1995); Brown et al., Cancer Res., 53: 4727-4735 (1993). Mattern et al., Brit. J. Cancer, 73: 931-934 (1996); Dvorak et al., Am. J. Pathol., 146: 1029-1039 (1995).
  Also, VEGF concentration levels in ocular fluid are highly correlated with the presence of active vascular proliferation in patients with diabetes and other ischemia-related retinopathies. Aiello et al., N. Engl. J. Med., 331: 1480-1487 (1994). In addition, recent studies have shown that VEGF is localized in choroidal neovascular membranes in patients affected by AMD. Lopez et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 37: 855-868 (1996).
  Anti-VEGF neutralizing antibodies inhibit the growth of various human tumor cell lines in nude mice (Kim et al., Nature, 362: 841-844 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest., 95 : 1789-1797 (1995); Borgstrom et al., Cancer Res., 56: 4032-4039 (1996); Melnyk et al., Cancer Res., 56: 921-924 (1996)), and intraocular blood vessels in ischemic retinal diseases. Inhibits formation. Adamis et al., Arch. Ophthalmol., 114: 66-71 (1996). Thus, anti-VEGF monoclonal antibodies or other inhibitors of VEGF action have been identified as candidate drugs for the treatment of solid tumors and various intraocular neovascular diseases. Such antibodies are described, for example, in EP 817,648 published January 14, 1998 and PCT / US98 / 06724 filed April 3, 1998.
      [0009]
  Expressed by certain types of cellsIsThere are several other growth and mitogens, including transforming oncogenes, that can rapidly induce complexes of such genes. Lau and Nathans, Molecular Aspects of Cellular Regulation, 6: 165-202 (1991). These genes, termed immediate-early genes or early-response genes,NewproteinofIrrespective of synthesis, it is transcriptionally activated within minutes after contact with growth or mitogens. These groups of immediate early genes include differentiation and proliferation, regeneration, andWound healingEncodes secreted extracellular proteins necessary to regulate complex biological processes such as Ryseck et al., Cell Growth Differ., 2: 235-233 (1991).
  Highly related proteins belonging to this group include cef10 (Simmons et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1178-1182 (1989)), which is rapidly activated by serum- or platelet-derived growth factor (PDGF). Cyr61 (O'Brien et al., Mol. Cell. Biol., 10: 3569-3577 (1990)), secreted by human vascular endothelial cells at high levels after activation by transforming growth factor β (TGF-β) Human connective tissue growth factor (CTGF), which exhibits PDGF-like biological and immunological activities and competes with PDGF for specific cell surface receptors (Bradham et al., J. Cell. Biol., 114: 1285). -1294 (1991)), fisp-12 (Ryseck et al., Cell Growth Differ., 2: 235-233 (1991)), human vascular IBP-like growth factor (VIGF) (WO96 / 17931), and usually adult kidney Cell quiescent and found to be overexpressed in myeloblast-associated-virus type I-induced nephroblastoma Are included are nov. Joloit et al., Mol. Cell. Biol., 12: 10-21 (1992).
  The expression of these immediate early genes acts as a "third messenger" in a cascade of events triggered by growth factors. They are also involved in complex biological processes such as differentiation and cell proliferation.Commonly used wound healingIs considered necessary to integrate and coordinate
  As additional mitogens, insulin-like growth factor binding proteins (IGFBPs) increase the binding of IGF to fibroblasts and smooth muscle cell surface receptors as a complex with insulin-like growth factor (IGF) It has been shown to stimulate. Clemmons et al., J. Clin. Invest., 77: 1548 (1986). Various inhibitory effects of IGFBP on IGF action in vitro include stimulation of glucose transport by adipocytes, sulfate uptake by chondrocytes, and thymidine uptake in fibroblasts. Zapf et al., J. Clin. Invest., 63: 1077 (1979). Furthermore, the inhibitory effect of IGFBP on growth factor-mediated mitogen activity in normal cells has been demonstrated.
      [0010]
C. Need for further treatment
  In view of the role of vascular endothelial cell growth and angiogenesis in many diseases and disorders, it is preferable to have means to reduce or suppress one or more of the biological effects resulting from these processes. It would also be desirable to have a means to test for the presence of a pathogenic polypeptide in normal and disease states, especially cancer. Furthermore, in certain aspects, there are no treatments that are generally applicable to the treatment of cardiac hypertrophy, so identifying factors that can prevent or reduce cardiac myocyte hypertrophy can inhibit pathophysiological heart growth. Is of great importance in the development of new therapeutic strategies. Although there are several treatment modalities for various cardiovascular and oncogene diseases, additional therapeutic approaches are still needed.
      [0011]
(Summary of the Invention)
  A. Embodiment
  Accordingly, the present invention relates to compositions and methods for promoting or inhibiting angiogenesis and / or cardiovascularization in a mammal. The present invention is based on the identification of proteins that test positive in various cardiovascular assays that test for the promotion or inhibition of certain biological activities. Therefore,Protein isPromotion or inhibition of angiogenesis, inhibition or stimulation of vascular endothelial cell growth, stimulation of vascular endothelial cell growth or proliferation, inhibition of tumor growth, inhibition of angiogenesis-dependent tissue growth, stimulation of angiogenesis-dependent tissue growth, heart Inhibition of hypertrophy and stimulation of cardiac hypertrophylikeEffect is desiredToDiagnosis and / or treatment of disease (including prevention),For example, cure congestive heart failureTreatmentIt is considered to be a useful drug.
  In one embodiment, the invention provides a composition comprising a PRO polypeptide mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. In one aspect, the composition contains a therapeutically effective amount of the polypeptide. In another embodiment, the composition comprises a further active ingredient, ie, a cardiovascular, endothelial or angiogenic agent or angiostatic agent, preferably an angiogenic or angiostatic agent. Preferably, the composition is sterile. PRO polypeptides are liquidPharmaceutical preparationsAdministration in the form ofMay be,this is,Long termStorage stabilityAchievedCan be stored as Stored liquid pharmaceutical formulation multiple timesdoseOf the PRO polypeptide, and thus repeatsofSuitable for useUYou.
      [0012]
  In a further embodiment, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier and a therapeutically effective amount of a PRO polypeptide.Tomixturedo itMethods of preparing such compositions useful for treating cardiovascular, endothelial or angiogenic diseases are provided.
  In another embodiment, the present invention provides a composition comprising a PRO polypeptide agonist or antagonist mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. In one aspect, the composition contains a therapeutically effective amount of the agonist or antagonist. In another aspect, the composition comprises a further active ingredient, ie, a cardiovascular, endothelial or angiogenic agent or angiostatic agent, preferably an angiogenic or angiostatic agent. Preferably, the composition is sterile. Agonists or antagonists of the PRO polypeptide may be administered in the form of a liquid pharmaceutical formulation and may be preserved to achieve long-term storage stability. The stored liquid pharmaceutical formulation may contain multiple doses of the PRO polypeptide agonist or antagonist and is therefore suitable for repeated useUYou.
  In a further embodiment, the invention provides a pharmaceutically acceptable carrier,Therapeutically effective amountWith PRO polypeptide agonists or antagonistsTomixturedo itMethods of preparing such compositions useful for treating cardiovascular, endothelial or angiogenic diseases are provided.
  In yet another embodiment, the invention is directed to a composition comprising the anti-PRO antibody, mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. In one embodiment, the composition contains a therapeutically effective amount of the antibody. In another embodiment, the composition contains an additional active ingredient, ie, a cardiovascular, endothelial or angiogenic agent or angiostatic agent, preferably an angiogenic or angiostatic agent. Preferably, the composition is sterile. The compositions may be administered in the form of a liquid pharmaceutical formulation and are preserved to achieve long-term storage stability.sell. The stored liquid pharmaceutical formulation may contain multiple doses of the anti-PRO antibody and may therefore be suitable for repeated use. In a preferred embodiment, the antibodies are monoclonal antibodies, antibody fragments, humanized antibodies or single chain antibodies.
  In a further embodiment, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier and a therapeutically effective amount of an anti-PRO antibody.Tomixturedo itMethods of preparing such compositions useful for treating cardiovascular, endothelial or angiogenic diseases are provided.
      [0013]
  In yet a further aspect, the invention provides:
(a)PRO polypeptideOr an agonist or antagonist thereofA composition of matter comprising:
(b) a container containing the composition; and
(c) said PRO polypeptide in the treatment of cardiovascular, endothelial or angiogenic diseasesOr an agonist or antagonist thereofThe use ofTheLabel attached to the container or stored in the containerAttachmentProviding a manufactured product comprisingTheAn agonist or antagonist can be an antibody that binds to the PRO polypeptide. The composition may comprise a therapeutically effective amount of the PRO polypeptide or an agonist or antagonist thereof.
  In another embodiment, the invention provides a method of identifying an agonist of a PRO polypeptide, comprising:
  (A) contacting the cells with the test compound to be screened under conditions suitable for inducing a cellular response normally elicited by the PRO polypeptide; and
  (B) measuring the induction of the cellular response to determine whether the test compound is an effective agonist, wherein the induction of the cellular response results in the test compound being an effective agonist Indicates that
  In another embodiment, the invention provides a method of identifying an agonist of a PRO polypeptide, comprising:
  (A) contacting the cells with the test compound to be screened under conditions suitable for stimulating cell proliferation by the PRO polypeptide; and
  (B) measuring the proliferation of said cells to determine whether the test compound is an effective agonist, wherein stimulation of cell proliferation indicates that said test compound is an effective agonist.
      [0014]
  In another embodiment, the present invention provides a method of identifying a compound that inhibits the activity of a PRO polypeptide, the method comprising the steps of: providing a test compound with conditions sufficient for the PRO polypeptide to interact with the test compound and the polypeptide. And measuring whether the activity of the PRO polypeptide is inhibited. In a particularly preferred embodiment, either the test compound or the PRO polypeptide is immobilized on a solid support. In another preferred embodiment, the non-immobilized component carries a detectable label. In a preferred embodiment, the method comprises:
  (A) contacting the cells with the test compound to be screened in the presence of the PRO polypeptide under conditions suitable for inducing a cellular response normally elicited by the PRO polypeptide;
  (B) measuring the induction of the cellular response and determining whether the test compound is effective;ChildDetermining whether or not it is a gonist.
  In another preferred embodiment, the method comprises:
  (A) contacting the cells with the test compound to be screened in the presence of the PRO polypeptide under conditions suitable for stimulating cell proliferation by the PRO polypeptide;
  (B) measuring the proliferation of the cells and determining whether the test compound is effective;ChildDetermining whether or not it is a gonist.
  In another embodiment, the invention relates to a method for expressing a PRO polypeptide in a cell.The PRO polypeptideProvides a method of identifying a compound that inhibits the expression of, comprising contacting a cell with a test compound and determining whether expression of the PRO polypeptide is inhibited. In a preferred embodiment, the method comprises:
  (a) contacting the cells with the test compound to be screened under conditions suitable for expressing the PRO polypeptide; and
  (b) measuring the inhibition of the expression of the polypeptide.
  In yet a further embodiment, the invention provides a compound that inhibits expression of a PRO polypeptide, such as a compound identified by the methods described above.
      [0015]
  Another aspect of the invention is directed to PRO polypeptide agonists or antagonists., Optionally aboveMay be identified by the method ofI.
  One type of antagonist of a PRO polypeptide that inhibits one or more functions or activities of the PRO polypeptide is an antibody. Thus, in another aspect, the invention provides an isolated antibody that binds a PRO polypeptide. In a preferred embodiment, the antibody is a monoclonal antibody, preferably having non-human complementarity determining region (CDR) residues and human framework region (FR) residues. The antibody may be labeled or immobilized on a solid support. In a further aspect, the antibody is an antibody fragment, a single chain antibody, or a humanized antibody. Preferably, the antibodies specifically bind to the polypeptide.
  In yet a further embodiment, the invention is a method of diagnosing a disease or susceptibility to a disease associated with a mutation in a PRO polypeptide encoding nucleic acid sequence, the method comprising determining the presence or absence of the mutation in the PRO polypeptide nucleic acid sequence. Providing a method wherein the presence or absence of said mutation indicates the presence of said disease or susceptibility to said disease.
  In yet a further aspect, the present invention provides a method of diagnosing a cardiovascular, endothelial or angiogenic disease in a mammal, comprising: (a) a test sample of tissue cells obtained from said mammal; Analyzing the expression level of the gene encoding the PRO polypeptide in a control sample of known normal tissue cells of the same cell type, wherein the level of expression in the test sample as compared to the control sample is increased or decreased. 2 illustrates the presence of a cardiovascular, endothelial or angiogenic disease in a mammal. Expression of the gene encoding the PRO polypeptide may optionally be made by measuring the level of mRNA or polypeptide in the test sample as compared to a control sample.
  In yet a further aspect, the present invention provides a method of diagnosing a cardiovascular, endothelial or angiogenic disease in a mammal, the method comprising the steps of:PRODetecting the presence or absence of the polypeptide, wherein the test sample comprisesPROThe presence or absence of the polypeptide indicates the presence of a cardiovascular, endothelial or angiogenic disease in the mammal.
      [0016]
  In yet a further aspect, the invention provides a method of diagnosing a cardiovascular, endothelial or angiogenic disease in a mammal, comprising: (a)NursingContacting a test sample of tissue cells from a milk animal with an anti-PRO antibody, and (b) detecting the formation of a complex between said antibody and a PRO polypeptide in the test sample, The formation of the body indicates the presence of a cardiovascular, endothelial or angiogenic disease in the mammal. Detection may be qualitative or quantitative, and may be performed relative to monitoring complex formation in a control sample of known normal tissue cells of the same cell type. The amount of complex formation in the test sample indicates the presence of cardiovascular, endothelial, or dysvascularization in the mammal from which the test tissue cells were obtained. The antibody preferably carries a detectable label. Complex formation can be monitored, for example, by light microscopy, flow cytometry, fluorimetry, or other techniques known in the art. Test samples are usually obtained from individuals suspected of having a cardiovascular, endothelial or angiogenic disease.IsYou.
  In another embodiment, the invention provides a method for determining the presence of a PRO polypeptide in a sample, comprising contacting a sample suspected of containing the PRO polypeptide with an anti-PRO antibody, Measuring the binding of the sample to the components. In particular aspects, the sample comprises cells suspected of containing the PRO polypeptide, and the antibody binds to the cells. The antibodies are preferably detectably labeled and / or immobilized on a solid support.
  In a further aspect, the present invention provides a diagnostic kit for a cardiovascular, endothelial or angiogenic disease comprising an anti-PRO antibody and a carrier in suitable packaging. Preferably, such a kit further comprises instructions for using the antibody to detect the presence of a PRO polypeptide. Preferably, the carrier is, for example, a buffer. Preferably, the cardiovascular, endothelial or angiogenic disease is cancer.
  In yet another embodiment, the invention provides a method of treating a cardiovascular, endothelial or angiogenic disease in a mammal, comprising administering to the mammal an effective amount of a PRO polypeptide. Become. Preferably, the disease is cardiac hypertrophy, trauma, such as a wound or burn, or some type of cancer. In a further aspect, if the disease of cardiovascular, endothelial or angiogenesis is a type of cancer, the mammal is an angioplasty or an agent for treating a disease of cardiovascular, endothelial or angiogenesis, such as ACE. Further exposure to inhibitors or chemotherapeutic agents. Preferably, the mammal is a human, preferably a human at risk for cardiac hypertrophy, more preferably a human suffering from myocardial infarction.
  In another preferred embodiment, cardiac hypertrophy is caused by PGF_{2α '}Characterized by an elevated level. Alternatively, cardiac hypertrophy is induced by myocardial infarction, wherein preferably administration of the PRO polypeptide is initiated within 48 hours, preferably within 24 hours, after myocardial infarction.
      [0017]
  In another preferred embodiment, the cardiovascular, endothelial or angiogenic disease is cardiac hypertrophy and the PRO polypeptide is administered with a cardiovascular, endothelial or angiogenic agent. Preferred cardiovascular, endothelial or angiogenic agents for this purpose are selected from the group consisting of antihypertensives, ACE inhibitors, endothelin receptor antagonists and thrombolytics. If a thrombolytic agent is administered, preferably the PRO polypeptide is administered after administration of such an agent. More preferably, the thrombolytic agent is a recombinant human tissue plasminogen activator.
  In another preferred embodiment, the disease of cardiovascular, endothelial or angiogenesis is cardiac hypertrophy, and the PRO polypeptide is administered following primary angioplasty for the treatment of acute myocardial infarction, wherein the mammal is preferably The animals are further exposed to angioplasty or cardiovascular, endothelial or angiogenic agents.
  In another preferred embodiment, the cardiovascular, endothelial or angiogenic disease is cancer and the PRO polypeptide is administered in combination with a chemotherapeutic, growth inhibitor or cytotoxic agent.
  In a further embodiment, the present invention relates to a method for treating a cardiovascular, endothelial or angiogenic disease in a mammal, comprising administering to the mammal an effective amount of an agonist of a PRO polypeptide. Preferably, the cardiovascular, endothelial or angiogenic disease is cardiac hypertrophy, trauma, cancer, or age-related macular degeneration. Also preferably, the mammal is a human and an effective amount of an angiogenic or angiostatic agent is administered with the agonist.
  In a further embodiment, the present invention relates to a method of treating a cardiovascular, endothelial or angiogenic disease in a mammal, comprising administering to the mammal an effective amount of an antagonist of a PRO polypeptide. Preferably, the cardiovascular, endothelial or angiogenic disease is cardiac hypertrophy, trauma, cancer, or age-related macular degeneration. Also preferably, the mammal is a human, and an effective amount of an angiogenic or angiostatic agent is administered with the antagonist.
  In a further embodiment, the present invention relates to a method of treating a cardiovascular, endothelial or angiogenic disease in a mammal, comprising administering to the mammal an effective amount of an anti-PRO antibody. Preferably, the cardiovascular, endothelial or angiogenic disease is cardiac hypertrophy, trauma, cancer, or age-related macular degeneration. Also preferably, the mammal is a human and an effective amount of an angiogenic or angiostatic agent is administered with the antibody.
      [0018]
  In a further embodiment, the present invention provides a method of treating a cardiovascular, endothelial or angiogenic disease in a mammal suffering from a cardiovascular, endothelial or angiogenic disease, comprising: (a) a PRO polypeptide; b) administering to the mammal a nucleic acid molecule encoding either an agonist of the PRO polypeptide or (c) an antagonist of the PRO polypeptide, wherein said agonist or antagonist is an anti-PRO antibody. May be. In a preferred embodiment, the mammal is a human. In another preferred embodiment, the gene is administered via ex vivo gene therapy. In a further preferred embodiment, the gene is contained in a vector, more preferably an adenovirus, adeno-associated virus, lentivirus or retroviral vector.
  In another aspect, the present invention provides:BookQualitatively,Nucleic acid encoding a promoter, (a) a PRO polypeptide, (b) an agonist polypeptide of the PRO polypeptide, or (c) an antagonist polypeptide of the PRO polypeptide,And a retroviral vector comprising a retroviral vector comprising a signal sequence for cellular secretion of the polypeptide, wherein the retroviral vector comprises a retroviral structural protein.Accompanying. Preferably, the signal sequence is from a mammal, eg, a native PRO polypeptide.
  In yet a further embodiment, the invention provides expression of a retroviral structural protein.I,In addition, the bookQualitativelyIsNucleic acid encoding a promoter, (a) a PRO polypeptide, (b) an agonist polypeptide of the PRO polypeptide, or (c) an antagonist polypeptide of the PRO polypeptide,And having a retroviral vector comprising a signal sequence for cell secretion of a polypeptide, providing an ex vivo producer cell comprising a nucleic acid construct, wherein the producer cell is,Retroviral vectors with structural proteinsIncludingRecombinant retroviral particlesProduce.
  In yet another embodiment, the invention provides a method of inhibiting endothelial cell growth in a mammal, comprising: (a) a PRO polypeptide, (b) an agonist of a PRO polypeptide, or (c) an antagonist of a PRO polypeptide. Administering to a mammal, wherein endothelial cell growth in the mammal is inhibited, wherein the agonist or antagonist can be an anti-PRO antibody. Preferably, the mammal is a human and the endothelial cell growth is associated with a tumor or retinal disease.
  In yet another embodiment, the invention provides a method of stimulating endothelial cell growth in a mammal, comprising: (a) a PRO polypeptide, (b) an agonist of a PRO polypeptide, or (c) an antagonist of a PRO polypeptide. Providing a method of stimulating endothelial cell growth in a mammal, wherein the agonist or antagonist can be an anti-PRO antibody. Preferably, the mammal is a human.
  In yet another embodiment, the invention provides a method of inhibiting cardiac hypertrophy in a mammal, comprising: (a) a PRO polypeptide, (b) an agonist of a PRO polypeptide, or (c) an antagonist of a PRO polypeptide. Providing a method of inhibiting cardiac hypertrophy in said mammal, comprising administering to said mammal, wherein said agonist or antagonist may be an anti-PRO antibody. Preferably, the mammal is a human, and the cardiac hypertrophy has been induced by a myocardial infarction.
      [0019]
  In yet another embodiment, the invention provides a method of stimulating cardiac hypertrophy in a mammal, comprising: (a) a PRO polypeptide, (b) an agonist of a PRO polypeptide, or (c) an antagonist of a PRO polypeptide. Providing a method of stimulating cardiac hypertrophy in said mammal, comprising administering to a mammal, wherein said agonist or antagonist may be an anti-PRO antibody. Preferably, the mammal is a human suffering from congestive heart failure.
  In yet another embodiment, the invention provides a method of inhibiting angiogenesis induced by a PRO polypeptide in a mammal, comprising administering to the mammal a therapeutically effective amount of an anti-PRO antibody. Comprising. Preferably, the mammal isThe human, more preferably the mammal is a tumor or retinal diseaseA human suffering from
  In yet another embodiment, the invention provides a method of stimulating angiogenesis induced by a PRO polypeptide in a mammal, comprising administering to the mammal a therapeutically effective amount of the PRO polypeptide. Comprising. Preferably, the mammal is a human, more preferably the angiogenesis promotes tissue regeneration or wound healing.
  In yet another embodiment, the invention relates to,Methods for inhibiting endothelial cell growth in mammalsAnd, PRO333, PRO364, PRO877 to mammals,Including the administration of PRO879, PRO882 or PRO885 polypeptides or agonists thereof.AboveProvided is a method for suppressing endothelial cell growth in mammalsYouYou.
  In yet another embodiment, the invention relates to,Methods for stimulating endothelial cell growth in mammalsAndAdministration of PRO179, PRO321, PRO840, PRO844, PRO846, PRO878 or PRO879 polypeptide or an agonist thereof to a mammal.AboveProvided is a method for stimulating endothelial cell growth in a mammalYouYou.
  In yet another embodiment, the invention relates to,Methods for inhibiting endothelial cell growth in mammalsAndThe administration of a PRO179, PRO321, PRO840, PRO844, PRO846, PRO878 or PRO879 polypeptide antagonist to a mammal.AboveProvided is a method for suppressing endothelial cell growth in mammalsYouYou.
  In yet another embodiment, the invention relates to,Methods for stimulating endothelial cell growth in mammalsAndDo not include administering an antagonist of PRO333, PRO364, PRO877, PRO879, PRO882 or PRO885 polypeptide to the mammal.AboveProvided is a method for stimulating endothelial cell growth in a mammalYouYou.
  In yet another embodiment, the invention relates to,Methods of inducing cardiac hypertrophy in mammalsAndComprising administering PRO205, PRO882 or PRO887 polypeptide or an agonist thereof to a mammal.AboveProvided is a method for inducing cardiac hypertrophy in mammalsYouYou.
  In yet another embodiment, the invention relates to,Methods for reducing cardiac hypertrophy in mammalsAndComprising administering a PRO238, PRO878 or PRO1760 polypeptide or an agonist thereof to a mammal.AboveProvide a method for reducing cardiac hypertrophy in mammalsYouYou.
  In yet another embodiment, the invention relates to,Methods of inducing cardiac hypertrophy in mammalsAndThe administration of a PRO238, PRO878 or PRO1760 polypeptide antagonist to a mammal.AboveProvided is a method for inducing cardiac hypertrophy in mammalsYouYou.
  In yet another embodiment, the invention relates to,Methods for reducing cardiac hypertrophy in mammalsAndDo not include administering an antagonist of PRO205, PRO882 or PRO887 polypeptide to a mammal.AboveProvide a method for reducing cardiac hypertrophy in mammalsYouYou.
  In yet another embodiment, the invention provides:PMethods for inhibiting angiogenesis induced by RO179, PRO321, PRO840, PRO844, PRO846, PRO878 or PRO879 polypeptideAndNot comprising administering to the mammal a therapeutically effective amount of an anti-PRO179, anti-PRO321, anti-PRO840, anti-PRO844, anti-PRO846, anti-PRO878 or anti-PRO879 antibody.AboveAngiogenesisSuppressionProvide a way to beYouYou.
  In yet another embodiment, the invention provides:PInduced by a RO179, PRO321, PRO840, PRO844, PRO846, PRO878 or PRO879 polypeptideBloodHow to stimulate tube formationAndAdministering to a mammal a therapeutically effective amount of said polypeptide.AboveA method is provided for stimulating angiogenesis.
      [0020]
  B. Further embodiments
  In another aspect of the invention, the invention provides an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding a PRO polypeptide.
  In one aspect, the isolated nucleic acid molecule comprises (a) a full-length amino acid sequence as disclosed herein, an amino acid sequence lacking a signal peptide as disclosed herein, a signal peptide as disclosed herein. A DNA molecule encoding a PRO polypeptide having the extracellular domain of a transmembrane protein having or lacking, or other identified fragments of the full-length amino acid sequence as disclosed herein; or (b) (a) DNA moleculeComplementary strandAt least about 80%Nucleic acidSequence identity, preferably at least about 81%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 82%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 83%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 84%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 85%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 86%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 87%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 88%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 89%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 90%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 91%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 92%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 93%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 94%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 95%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 96%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 97%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 98%Nucleic acidSequence identity, and even more preferably at least about 99%Nucleic acidIncludes nucleotide sequences having sequence identity.
  In other aspects, the isolated nucleic acid molecule comprises (a) a full length PRO polypeptide cDNA coding sequence as disclosed herein, a PRO polypeptide coding sequence lacking a signal peptide as disclosed herein. Encoding the extracellular domain of a transmembrane PRO polypeptide having or lacking a signal peptide as disclosed herein, or other identified fragments of the full length amino acid sequence as disclosed herein A DNA molecule having a sequence, or a DNA molecule of (b) or (a)Complementary strandAt least about 80%Nucleic acidSequence identity, preferably at least about 81%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 82%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 83%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 84%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 85%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 86%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 87%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 88%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 89%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 90%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 91%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 92%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 93%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 94%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 95%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 96%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 97%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 98%Nucleic acidSequence identity, and even more preferably at least about 99%Nucleic acidIncludes nucleotide sequences having sequence identity.
      [0021]
  In a further aspect, the present invention relates to (a) a DNA molecule encoding the same mature polypeptide as encoded by any of the human protein cDNAs deposited with the ATCC as disclosed herein; or (b) ) Of the DNA molecule of (a)Complementary strandAt least about 80%Nucleic acidSequence identity, preferably at least about 81%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 82%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 83%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 84%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 85%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 86%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 87%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 88%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 89%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 90%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 91%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 92%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 93%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 94%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 95%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 96%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 97%Nucleic acidSequence identity, more preferably at least about 98%Nucleic acidSequence identity, and even more preferably at least about 99%Nucleic acidAn isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence having sequence identity.
  Another aspect of the invention is directed to a nucleotide sequence encoding a PRO polypeptide in which the transmembrane domain has been deleted or the transmembrane domain has been inactivated, or a nucleotide complementary to such an encoded nucleotide sequence. Provided is an isolated nucleic acid molecule comprising the sequence, wherein the transmembrane domain of such a polypeptide is disclosed herein. Accordingly, the soluble extracellular domains of the PRO polypeptides described herein are contemplated.
  Other embodiments include fragments of the PRO polypeptide encoding sequence, or fragments thereof.Complementary strandThey find use, for example, as hybridization probes for coding fragments of a PRO polypeptide, optionally encoding a polypeptide comprising a binding site for an anti-PRO antibody, or as antisense oligonucleotide probes. Such nucleic acid fragments are usually at least about 20 nucleotides in length, preferably at least about 30 nucleotides in length, more preferably at least about 40 nucleotides in length, more preferably at least about 50 nucleotides in length, more preferably at least about 60 nucleotides in length, More preferably at least about 70 nucleotides in length, more preferably at least about 80 nucleotides in length, more preferably at least about 90 nucleotides in length, more preferably at least about 100 nucleotides in length, more preferably at least about 110 nucleotides in length, more preferably at least about 120 nucleotides in length, more preferably at least about 130 nucleotides in length, more preferably at least about 140 nucleotides in length, more preferably at least about 150 nucleotides in length, More preferably, it is at least about 160 nucleotides in length, more preferably at least about 170 nucleotides in length, more preferably at least about 180 nucleotides in length, more preferably at least about 190 nucleotides in length, more preferably at least about 200 nucleotides in length, more preferably at least about 250 nucleotides in length, more preferably at least about 300 nucleotides in length, more preferably at least about 350 nucleotides in length, more preferably at least about 400 nucleotides in length, more preferably at least about 450 nucleotides in length, more preferably at least about 500 nucleotides in length, Preferably at least about 600 nucleotides in length, more preferably at least about 700 nucleotides in length, more preferably at least about 800 nucleotides in length. Long, more preferably at least about 900 nucleotides in length, more preferably at least about 1000 nucleotides in length, wherein the reference nucleotide sequence length content length that the reference plus or minus 10% of the word "about"Tomeans. Novel fragments of the PRO polypeptide encoding nucleotide sequence can be prepared by aligning the PRO polypeptide encoding nucleotide sequence with other known nucleotide sequences using any of a number of well-known sequence alignment programs. By determining whether a PRO polypeptide encoding nucleotide sequence fragment is novel,DecisionMay be. All such PRO polypeptide encoding nucleotide sequences are contemplated herein. Also contemplated are the PRO polypeptide fragments encoded by these nucleotide molecule fragments, preferably the PRO polypeptide fragments that include a binding site for an anti-PRO antibody.
      [0022]
  In another embodiment, the present invention provides a method as described above.IdentificationAn isolated PRO polypeptide encoded by any of the isolated nucleic acid sequences provided.
  In certain aspects, the present invention relates to a full-length amino acid sequence as disclosed herein, an amino acid sequence lacking a signal peptide as disclosed herein, a transmembrane protein having or lacking a signal peptide as disclosed herein. Extracellular domain, or full length as disclosed hereinamino acidAt least about 80% of the PRO polypeptide having other fragments of the sequence specifically identifiedamino acidSequence identity, preferably at least about 81%amino acidSequence identity, more preferably at least about 82%amino acidSequence identity, more preferably at least about 83%amino acidSequence identity, more preferably at least about 84%amino acidSequence identity, more preferably at least about 85%amino acidSequence identity, more preferably at least about 86%amino acidSequence identity, more preferably at least about 87%amino acidSequence identity, more preferably at least about 88%amino acidSequence identity, more preferably at least about 89%amino acidSequence identity, more preferably at least about 90%amino acidSequence identity, more preferably at least about 91%amino acidSequence identity, more preferably at least about 92%amino acidSequence identity, more preferably at least about 93%amino acidSequence identity, more preferably at least about 94%amino acidSequence identity, more preferably at least about 95%amino acidSequence identity, more preferably at least about 96%amino acidSequence identity, more preferably at least about 97%amino acidSequence identity, more preferably at least about 98%amino acidSequence identity, and even more preferably at least about 99%amino acidHave sequence identityamino acidThe present invention relates to an isolated PRO polypeptide comprising a sequence.
  In a further aspect, the present invention provides that the at least about 80% relative to the amino acid sequence encoded by any of the human protein cDNAs deposited with the ATCC disclosed herein.amino acidSequence identity, preferably at least about 81%amino acidSequence identity, more preferably at least about 82%amino acidSequence identity, more preferably at least about 83%amino acidSequence identity, more preferably at least about 84%amino acidSequence identity, more preferably at least about 85%amino acidSequence identity, more preferably at least about 86%amino acidSequence identity, more preferably at least about 87%amino acidSequence identity, more preferably at least about 88%amino acidSequence identity, more preferably at least about 89%amino acidSequence identity, more preferably at least about 90%amino acidSequence identity, more preferably at least about 91%amino acidSequence identity, more preferably at least about 92%amino acidSequence identity, more preferably at least about 93%amino acidSequence identity, more preferably at least about 94%amino acidSequence identity, more preferably at least about 95%amino acidSequence identity, more preferably at least about 96%amino acidSequence identity, more preferably at least about 97%amino acidSequence identity, more preferably at least about 98%amino acidSequence identity, and even more preferably at least about 99%amino acidHave sequence identityamino acidThe present invention relates to an isolated PRO polypeptide comprising a sequence.
      [0023]
  In a further aspect, the invention relates to a full-length amino acid sequence as disclosed herein, an amino acid sequence lacking a signal peptide as disclosed herein, a transmembrane protein having or lacking a signal peptide as disclosed herein. PRO polypeptide having an extracellular domain or other specifically identified fragment of the full length amino acid sequence as disclosed hereinAmino acid sequence ofAt least about 80% positive when compared toOrAt least about 81% positive,OrAt least about 82% positive, or at least about 83% positive, or at least about 84% positive, or at least about 85% positive, or at least about 86% positive, or at least about 87% positive, or at least about 88% positive, or at least About 89% positive, or at least about 90% positive, or at least about 91% positive, or at least about 92% positive, or at least about 93% positive, or at least about 94% positive, or at least about 95% positive, or at least about 96% positive, or at least about 97% positive, or at least about 98% positive, or even, at least about Comprising an amino acid sequence with 9% positives score to an isolated PRO polypeptide.
  In a particular embodiment, the present invention relates to isolated PRO polypeptides, having no N-terminal signal sequence and / or an initiating methionine, and encoded by a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence as described above. provide. Methods for making them are also described herein, which include culturing host cells having a vector containing the appropriate encoding nucleic acid molecule under conditions suitable for expression of the PRO polypeptide, and removing the PRO polypeptide from the culture medium. Recovering the peptide.
  Another aspect of the invention provides an isolated PRO polypeptide wherein the transmembrane domain has been deleted or the transmembrane domain has been inactivated. Methods for making them are also described herein, which include culturing host cells containing a vector containing the appropriate encoding nucleic acid molecule under conditions suitable for expression of the PRO polypeptide, and removing PRO polypeptide from the cell culture medium. Recovering the peptide.
  In yet another embodiment, the invention relates to agonists and antagonists of the native PRO polypeptides identified herein. In a specific embodiment, the agonist or antagonist is an anti-PRO antibody or small molecule.
  In a further embodiment, the present invention relates to a method of identifying an agonist or antagonist of a PRO polypeptide, comprising contacting the PRO polypeptide with a candidate molecule and monitoring a biological activity mediated by said PRO polypeptide. including. Preferably, the PRO polypeptide is a native PRO polypeptide.
      [0024]
  In yet a further embodiment, the invention relates to a composition of matter comprising a PRO polypeptide, or an agonist or antagonist of a PRO polypeptide as described herein, or an anti-PRO antibody in combination with a carrier. In some cases, the carrier is a pharmaceutically acceptable carrier.
  Another embodiment of the present invention is directed to a PRO polypeptide, an agonist or antagonist thereof or a PRO polypeptide, an agonist or antagonist thereof as described above, for the preparation of a medicament useful in the treatment of a condition resulting from an anti-PRO antibody. Alternatively, it relates to the use of anti-PRO antibodies.
  In a further embodiment of the invention, the invention provides a vector comprising DNA encoding any of the polypeptides described herein. Host cells containing any of such vectors are also provided. By way of example, the host cells may be CHO cells, E. coli,yeast,Alternatively, it may be a baculovirus-infected insect cell. Further provided is a method of producing any of the polypeptides described herein, comprising culturing host cells under conditions suitable for expression of the desired polypeptide and recovering the desired polypeptide from the cell culture medium.
  In another embodiment, the invention provides a chimeric molecule comprising any of the polypeptides described herein fused to a heterologous polypeptide or amino acid sequence. Examples of such chimeric molecules include any of the polypeptides described herein fused to an epitope tag sequence or the Fc region of an immunoglobulin.
  In another embodiment, the invention provides an antibody that specifically binds to any of the above or below polypeptides. In some cases, the antibody is a monoclonal antibody, a humanized antibody, an antibody fragment, or a single chain antibody.
  In yet another embodiment, the invention provides oligonucleotide probes useful for isolating genomic and cDNA nucleotide sequences or antisense probes, wherein the probes are derived from any of the above or below nucleotide sequences. sell.
      [0025]
(Detailed description of the invention)
I. Definition
  The terms "disorders of cardiovascular, endothelial and angiogenesis", "dysfunction of cardiovascular, endothelial and angiogenic", "diseases of cardiovascular, endothelial or angiogenic" and "dysfunction of cardiovascular, endothelial or angiogenic" Used interchangeably,For one, systemic diseases affecting the blood vessels, such as diabetes,As well as diseases of blood vessels, such as arteries, capillaries, veins, and / or lymph vessels themselves. This includes signs that stimulate angiogenesis and / or cardiovascularization, and signs that inhibit angiogenesis and / or cardiovascularization. Such diseases include, for example, diseases of the arteries, such as atherosclerosis, hypertension, inflammatory vasculitis, Raynaud's disease and Raynaud's phenomenon, aneurysms, and restenosis of the arteries; diseases of the veins and lymphatic vessels, such as thromboveins Inflammation, lymphangitis, and lymphedema; and other vascular diseases, such as peripheral vascular disease, cancer, such as vascular tumors, such as hemangiomas (capillary and spongy), glomus tumors, telangiectasia, bacterial hemangiomatosis, Hemangioendothelioma, hemangiosarcoma, hemangiopericytoma, Kaposi's sarcoma, lymphangioma, and lymphangiogenic sarcoma, tumor angiogenesis, trauma, e.g., wounds, burns, and other tissue damage, transplant fixation, scarring, Includes perfusion injury, rheumatoid arthritis, cerebrovascular disease, kidney disease such as acute renal failure, and osteoporosis. Also included are angina, myocardial infarction such as acute myocardial infarction, cardiac hypertrophy, and heart failure such as CHF.
  "Hypertrophy" as used herein is defined as an increase in the size of a tissue or structure independent of normal growth that is not involved in tumorigenesis. Hypertrophy of an organ or tissue is due to either an increase in the size of individual cells (true hypertrophy) or an increase in the number of cells forming the tissue (hyperplasia), or both. Certain organs, such as the heart, lose their ability to divide shortly after birth. Thus, "heartHypertrophy is defined as an increase in the size of the heart, and in adults, cell divisionAccompanyNo, characterized by increased contractile protein content and increased myocyte cell size. The characteristics of the stresses that stimulate hypertrophy (e.g., increased preload, increased afterload, loss of myocytes as in myocardial infarction, primary loss of contractility) are important in determining the nature of the response. It is clear that they have a role. The early stages of cardiac hypertrophy are usually morphologically characterized by increasing myofibril and mitochondrial size, as well as mitochondrial and nuclear enlargement. At this stage, the muscle cells are larger than normal and most of the cell organization is maintained.heartAs the phase of hypertrophy progresses further, the number and size of certain organelles, such as mitochondria, increase preferentially, and new contractile elements are added in an irregular manner to localized areas of the cell. Cells that have undergone hypertrophy for many years have a more pronounced lobulated membrane that displaces adjacent myofibrils, causing disruption of normal Z-membrane registration, and is more clearly defined in cell organization, including significantly expanded nuclei. Indicates division. The term "cardiac hypertrophy" is used to include all stages in the progression of a pathology characterized by varying degrees of structural damage to the heart muscle, regardless of the underlying heart disease. Thus, the term also includes physiological conditions in the development of cardiac hypertrophy, such as elevated blood pressure, aortic stenosis, or myocardial infarction.
      [0026]
  "Heart failure" refers to an abnormality in cardiac function in which the heart does not pump blood at the rate required by the demands of metabolizing tissues. Heart failure can be due to a variety of factors, including ischemic, congenital, rheumatic or idiopathic forms.
  `` Congestive heart failure '' (CHF) is a progression of the heart that cannot supply sufficient cardiac output (the amount of blood pushed out by the heart over time) to deliver oxygenated blood to peripheral tissues It is a sexual condition. As CHF progresses, structural and hemodynamic damage occurs. These damagesWith various signs,One characteristicSymptomsIs ventricular hypertrophy. CHF is a common end result of many different heart disorders.
  "Myocardial infarction" is atherosclerosis of the coronary arteries, often with multiple coronary thrombosisofIt is generally the result. It is an intramural infarction where there is myocardial necrosis throughout the thickness of the ventricular wall, and the necrosis is in the subendothelial layer, in the myocardial wall, or both, without extending all the way through the ventricular wall to the epicardium Accessory endocardial (non-mural) infarctionofIt can be divided into two types. Myocardial infarction is known to be due to both altered hemodynamic effects and structural changes in damaged and healthy areas of the heart. Thus, for example, due to myocardial infarction, the maximum outflow of the heart and the heartbeat capacity are reduced. Also, related to myocardial infarction, DNA synthesis occurring in the gap is stimulated,ReceivingIncreased collagen formation in the unhearted heart region.
  In prolonged hypertension, increased cardiac stress and pressure results in, for example, an increase in total peripheral tolerance and cardiac hypertrophy becomes associated with prolonged "hypertension". A characteristic of the ventricle that has become enlarged as a result of chronic pressure is disturbed diastolic capacity. Fouad et al., J. Am. Coll. Cardiol., 4: 1500-1506 (1984); Smith et al., J. Am. Coll. Cardiol., 5: 869-874 (1985). For long-term relaxation of the left ventricle, the systolic function is normal orNonRegardless of normal, earlyPeriodBookstateHypertension was detected. Hartford et al., Hypertension, 6: 329-338 (1984). But between blood pressure levels and cardiac hypertrophyThe close parallel relationship toAbsent. In humans, improvement in left ventricular function is repeated in response to antihypertensive treatment, but diuretics (hydrochlorothiazide), β-blockers (proLopraNorol) or calcium channel blockers (Diltiazem) have a return to left ventricular hypertrophy without improved diastolic function. Inouye et al., Am. J. Cardiol., 53: 1583-7 (1984).
      [0027]
  Another complex heart disease associated with cardiac hypertrophy is "hypertrophic cardiomyopathy." This condition has very diverse morphological, functional and clinical characteristics (Maron et al., N. Engl. J. Med., 316: 780-789 (1987); Spirito et al., N. Engl. J. Med., 320: 749-755 (1989); Louie and Edwards, Prog. Cardiovasc. Dis., 36: 275-308 (1994); Wigle et al., Circulation, 92: 1680-1692 (1995)), all ages. It is characterized by heterogeneity, highlighted by the facts that plague patients. Spirito et al., N. Engl. J. Med., 336: 775-785 (1997). Also, the factors that cause hypertrophic cardiomyopathy are diverse and are poorly understood. Generally, mutations in the gene encoding the sarcomere protein have been implicated in hypertrophic cardiomyopathy. Recent data suggest that β-myosin heavy chain mutations are measured to be approximately 30 to 40 percent of the causes of familial hypertrophic cardiomyopathy. Watkins et al., N. Engl. J. Med., 326: 1108-1114 (1992); Schwartz et al., Circulation, 91: 532-540 (1995); Marian and Roberts, Circulation, 92: 1336-1347 (1995); Thierfelder et al., Cell, 77: 701-712 (1994); Watkins et al., Nat. Gen., 11: 434-437 (1995). In addition to β-myosin heavy chain, gene mutations at other positions include cardiac troponin T, alpha-topomyosin, cardiac myosin binding protein C, essential myosin light chain, and regulatory myosin light chain. See Malik and Watkins, Curr. Opin. Cardiol., 12: 295-302 (1997).
  The superior valve "aortic stenosis" is a hereditary vascular disease characterized by narrowing of the ascending aorta, but other arteries, including the pulmonary artery, may be further affected. Untreated aortic stenosis increases intracardiac pressure, resulting in cardiac hypertrophy, which in fact leads to heart failure and death. Although the pathogenesis of this disease is not well understood, hyperplasia and hypertrophy of intermediate smooth muscle are hallmarks of the disease. Molecular variants of the elastin gene have been reported to be involved in the pathogenesis of the development of aortic stenosis in US Pat. No. 5,650,282 published Jul. 22, 1997.
  "Heart valve regurgitation" results from heart disease due to heart valve disease. Various diseases, such as rheumatic fever, cause contraction or pulling of the valve orifice, while other diseases include endocarditis, inflammation of the endocardium or the inner membrane of the atrial orifice, and cardiac surgery. become. Defects, such as valve stenosis or the proximity of a valve defect, can result in the accumulation of blood in the heart cavity or the regurgitation of blood through the valve. Failure to heal valvular stenosis or failure for an extended period of time results in cardiac hypertrophy and damage associated with the myocardium, ultimately requiring valve replacement.
  All of these and the treatment of other cardiovascular, endothelial and angiogenic diseases, with or without cardiac hypertrophy, are included in the present invention.
      [0028]
  The terms "cancer", "cancerous" and "malignant" refer to or describe the physiological condition in mammals that is typically characterized by unregulated cell growth. Examples of cancer include, but are not limited to, adenocarcinoma, lymphoma, blastoma, melanoma, sarcoma, and leukemia. More specific examples of such cancers include squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, gastric cancer, Hodgkin and non-Hodgkin lymphoma, pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, Liver cancer such as hepatic carcinoma and hepatoma, bladder cancer, breast cancer, colorectal cancer, colorectal cancer, endometrial cancer, salivary gland cancer, kidney cancer such as renal cell carcinoma and Wilms tumor, basal cell carcinoma , Melanoma, prostate cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, testicular cancer, esophageal cancer, and various types of head and neck cancers. Suitable cancers for treatment here are breast, colon, lung, melanoma, ovarian cancer and others mentioned above.IVascular tumors.
  As used herein, the term "cytotoxic agent" refers to a substance that inhibits or suppresses the function of cells and / or causes cell destruction. The term refers to radioisotopes (eg,¹³¹I,¹²⁵I,⁹⁰Y and¹⁸⁶Re), chemotherapeutic agents, and toxins, such as enzymatically active toxins of bacterial, fungal, plant or animal origin, or fragments thereof.
  “Chemotherapeutic agents” are chemical compounds useful for treating cancer. Examples of chemotherapeutic agents include alkylating agents, folate antagonists, metabolites of nucleic acid metabolism, antibiotics, pyrimidine analogs, 5-fluorouracil, cisplatin, purine nucleosides, amines, amino acids, triazole nucleosides, or corticosteroids Is included. Specific examples include adriamycin, doxorubicin, 5-fluorouracil, cytosine arabinoside ("Ara-C"), cyclophosphamide, thiotepa, busulfan, cytoxin, taxol, toxotea, methotrexate, cisplatin, melphalan, vinblastine , Bleomycin, etoposide, ifosfamide, mitomycin C, mitoxantBAnd vincristine, vinorelbine, carboplatin, teniposide, daunomycin, carminomycin, aminopterin, dactinomycin, mitomycin, esperamicin (see US Pat. No. 4,675,187), melphalan and related nitrogen mustards. Also included in this definition are hormonal drugs that function to modulate or inhibit hormonal effects on tumors, such as tamoxifen and onapristone.
      [0029]
  “Growth inhibitor,” as used herein, refers to a compound or composition that inhibits the growth of cells, eg, Wnt-overexpressing cancer cells, in vitro or in vivo. That is, growth inhibitors significantly reduce the percentage of malignant cells in the S phase. Examples of growth inhibitors include agents that block cell cycle progression (at a location other than the S phase), eg, agents that induce G1 arrest and M phase arrest. Classical M-phase blockers include vincas (vincristine and vinblastine), taxol, and topo II inhibitors such as doxorubicin, daunorubicin, etoposide, and bleomycin. These agents that cause G1 arrest also spread to S-phase arrest, for example, DNA alkylating agents such as tamoxifen, prednisone, dacarbazine, mechlorethamine, cisplatin, methotrexate, 5-fluorouracil, and Ara-C. Further information can be found in The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, Murakami et al., Entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especially page 13. Further examples include antibodies capable of inhibiting or neutralizing angiogenic activity of tumor necrosis factor (TNF), acidic or basic FGF or hepatocyte growth factor (HGF), capable of inhibiting or neutralizing coagulation activity of tissue factor Antibodies, protein C or protein S (see WO91 / 01753 published February 21, 1991), or antibodies capable of binding to the HER2 receptor (WO89 / 06692), such as the 4D5 antibody (and their functions) (E.g., WO92 / 22653).
  “Treatment” is intended to prevent the progression or change of the pathological condition of cardiovascular, endothelial and angiogenic diseases.Is a treatment. The concept of treatment is used in the broadest sense and specifically includes the suppression (prevention), mitigation, reduction and cure of any stage of cardiovascular, endothelial and angiogenic diseases. Thus, "treatment" refers to both curative treatment and prophylactic or preventative measures, andBloatedPrevent or delay cardiovascular, endothelial and angiogenic diseases(Decrease)Let me do. Those in need of treatment include those already with the disorder as well as those prone to have the disorder or those in which the disorder is prevented. The disease may be due to any cause, including idiopathic, cardiotrophic, or myotrophic causes, or ischemia or ischemic attacks, such as myocardial infarction.
  What is "chronic" administration?,Early treatment effectTo, E.g., maintain anti-hypertrophic effects over timelike,Refers to drug administration in a continuous manner as opposed to an acute manner.
  A "mammal" for therapeutic purposes is any human, domestic and agricultural animal, zoo, sports, or pet animal, such as any mammal classified as a dog, horse, cat, cow, sheep, pig, and the like. Refers to animals. Preferably, the mammal is a human.
  Administration "in combination with" one or more further therapeutic agents includes simultaneous (concurrent) and consecutive administration in any order.
      [0030]
  The term "cardiovascular, endothelial and angiogenic agents" generally refers to any agent that acts in the treatment of cardiovascular, endothelial and angiogenic diseases. Examples of cardiovascular agents promote blood pressure, heart rate, cardiac contractility, and vascular homeostasis that regulate endothelial and smooth muscle biology, and all factors have a role in cardiovascular disease. Specific examples of these include angiotensin-II receptor antagonists: endothelin receptor antagonists such as BOSENTAN^TMAnd MOXONODIN^TMInterferon-gamma (IFN-γ); des-asparatate-angiotensin I: thrombolytic agents such as streptokinase, urokinase, t-PA, and longer half-lives, designed to have very high fibrin specificity T-PA mutant, TNK t-PA (T103N, N117Q, KHRR (296-299) AAAAt-PA mutant, Keyt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3670-3674 (1994)): cardiotonic or vasopressor, for example Digoxigenin and β-adrenergic receptor blocking agents such as propranolol, timolol, tertalolol, carteolol, nadolol, betaxolol, penbutolol, acetobutolol, atenolol, metoprolol, and potassiumLeVegirole: angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor, for exampleKiNapril, captopril, enalapril, ramipril, benazepril, fosinopril and lisinopril; diuretics, eg chlorothiaTheDo, hydrochlorothiaTheDe, hydroflumetiaTheDe, methyl crothiaTheDe, benzthiazide, dicloLeAnd phenamide, acetazolamide, and indapamide; and calcium channel blockers such as diltiazem, nifedipine, verapamil, and nicardipine. One of the preferred categories of this type is cardiac hypertrophy or progression of cardiac hypertrophy.TriggerIt is a therapeutic agent used in the treatment of physiological conditions such as elevated blood pressure, aortic stenosis or myocardial infarction.
  "Angiogenic agents" and "endothelial agents" are active agents that promote angiogenesis and / or endothelial cell growth or, where appropriate, angiogenesis. These include factors that promote wound healing, such as growth hormone, insulin-like growth factor-I (IGF-I), VEGF, VIGF, PDGF, epidermal growth factor (EGF), CTGF and its members, FGF, And TGF-α and TGF-β.
  "Angiostatic agents" are active agents that inhibit angiogenesis or tube formation, or inhibit or prevent cancer cell growth. Examples include antibodies to the aforementioned angiogenic agents or other antagonists, such as antibodies to VEGF. In addition, cell therapeutics such as cytotoxics, chemotherapeutics, growth inhibitors, apoptotic drugs, and other agents that treat cancer, such as anti-HER-2, anti-CD20, and bioactive and organic chemicals included.
  In the pharmacological sense of the present invention, a "therapeutically effective amount" of an active agent, such as a PRO polypeptide, or an agonist or antagonist thereof, or an anti-PRO antibody, refers to a cardiovascular, endothelial and angiogenic disease of a mammal. Refers to an effective amount for the treatment of and can be empirically determined.
  As used herein, an “effective amount” of an active agent, eg, a PRO polypeptide, or agonist or antagonist thereof, or an anti-PRO antibody is intended to mean an amount effective to perform the stated purpose, Such an amount can be empirically determined depending on the desired effect.
  As used herein, the terms “PRO polypeptide” and “PRO” refer to various polypeptides when preceded by a numerical symbol, and the complete symbol (eg, PRO / number) refers to the particular polypeptide described herein. Means peptide sequence. As used herein, “PRO / numerical polypeptide” and “PRO / numerical”, where “numerical” is given as the actual numerical code used herein, refers to native sequence polypeptides and variants (herein In more detail). The PRO polypeptides described herein may be isolated from a variety of sources, such as human tissue types or other sources, and may be prepared by recombinant or synthetic methods.
      [0031]
  A “native sequence PRO polypeptide” includes a polypeptide having the same amino acid sequence as the corresponding PRO polypeptide from nature. Such native sequence PRO polypeptides can be isolated from nature or can be produced by recombinant or synthetic means. The term “native sequence PRO polypeptide” specifically includes naturally occurring truncated or secreted forms (eg, extracellular domain sequences), naturally occurring mutant forms (eg, alternatively spliced forms) of a particular PRO polypeptide. Forms) and naturally occurring allelic variants of the polypeptide. In various embodiments of the invention, the native sequence PRO polypeptide disclosed herein is a mature or full-length native sequence polypeptide comprising the full-length amino acid sequence shown in the accompanying drawings. Start and stop codons are shown in bold and underlined in the figure. However, the PRO polypeptide disclosed in the accompanying drawings is shown to begin with a methionine residue, designated herein as amino acid position 1, but may be located upstream or downstream of amino acid position 1 in the drawings. It is conceivable and possible to use the methionine residue of SEQ ID NO: 1 as the starting amino acid residue of the PRO polypeptide.
  A PRO polypeptide “extracellular domain” or “ECD” refers to a form of a PRO polypeptide that has substantially no transmembrane and cytoplasmic domains. Usually, PRO polypeptide ECDs have less than 1% of their transmembrane and / or cytoplasmic domains, preferably less than 0.5% of such domains. It will be understood that any transmembrane domain identified for the PRO polypeptides of the present invention will be identified according to criteria routinely used in the art to identify its type of hydrophobic domain. . The exact boundaries of the transmembrane domain can vary, but will likely not exceed about 5 amino acids from the end of either of the originally identified domains. Thus, the PRO polypeptideofThe extracellular domain may optionally include no more than about 5 amino acids from either side of the transmembrane domain and / or extracellular domain boundaries as identified in the Examples or the specification, and the signal peptide Polypeptides and nucleic acids encoding them, with or without, are contemplated by the present invention.
  The appropriate position of the "signal peptide" of the various PRO polypeptides disclosed herein isThe present specification and / orIt is shown in the attached drawings. However, as noted, the C-terminal boundary of the signal peptide can vary, but most likely is less than about 5 amino acids on either side of the signal peptide C-terminal boundary as defined herein. Highly, the C-terminal boundary of the signal peptide can be identified according to criteria routinely used to identify such types of amino acid sequence components (eg, Nielsen et al., Prot. Eng. 10: 1-6). (1997) and von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986)). In addition, in some cases, signals from secreted polypeptidesArrayIt has also been observed that cleavage of the DNA is not completely uniform and results in one or more secreted species. These mature polypeptides, in which the signal peptide is cleaved within less than about 5 amino acids on either side of the C-terminal boundary of the signal peptide as defined herein, and the polynucleotides that encode them, are contemplated by the present invention. You.
      [0032]
  A “PRO polypeptide variant” is a full-length native sequence PRO polypeptide as disclosed herein, as defined above or below.Array,PRO polypeptide sequences as disclosed herein lacking a signal peptide, PRO as disclosed herein having or lacking a signal peptidePolypeptideExtracellular domain, or a full-length PRO polypeptide as disclosed hereinArrayRefers to an active PRO polypeptide having at least about 80% amino acid sequence identity to another fragment of PRO. Such PRO polypeptide variants include, for example, PRO polypeptides in which one or more amino acid residues have been added or deleted at the N- or C-terminus of the full length native amino acid sequence. Typically, the PRO polypeptide variant is a full-length native as disclosed herein.Sequence PRO polypeptideSequence, as disclosed herein, lacking a signal peptidePPRO as disclosed herein having or lacking a RO polypeptide sequence, a signal peptidePolypeptideExtracellular domain, or a full-length PRO polypeptide as disclosed hereinArrayOtherEspecially identifiedAt least about 80% amino acid sequence identity to the fragment;OrAt least about 81% amino acid sequence identity;OrAt least about 82% amino acid sequence identity,OrAt least about 83% amino acid sequence identity, or at least about 84% amino acid sequence identity;OrAt least about 85% amino acid sequence identity,OrAt least about 86% amino acid sequence identity;OrAt least about 87% amino acid sequence identity;OrAt least about 88% amino acid sequence identity, or at least about 89% amino acid sequence identity;OrAt least about 90% amino acid sequence identity;OrAt least about 91% amino acid sequence identity,OrAt least about 92% amino acid sequence identity;OrAt least about 93% amino acid sequence identity, or at least about 94% amino acid sequence identity;OrAt least about 95% amino acid sequence identity;OrAt least about 96% amino acid sequence identity, or at least about 97% amino acid sequence identity;OrAt least about 98% amino acid sequence identity; andOrIt has at least about 99% amino acid sequence identity. Typically, the PRO variant polypeptide is at least about 10 amino acids in length, more often at least about 20 amino acids in length, more often at least about 30 amino acids in length, more often at least about 40 amino acids in length, more often at least about 50 amino acids in length. Long, more often at least about 60 amino acids long, more often at least about 70 amino acids long, more often at least about 80 amino acids long, more often at least about 90 amino acids long, more often at least about 100 amino acids long, and more It is at least about 150 amino acids in length, more often at least about 200 amino acids in length, more often at least about 300 amino acids in length, or longer.
  As shown below, Table 1 shows the ALIGN-2 sequence comparison computer program.CompleteGive full source code. This source code is routinely compiled for use with the UNIX® operating system, providing an ALIGN-2 sequence comparison computer program.
  In addition, Tables 2A-2D provide the following methods for determining% amino acid sequence identity (Tables 2A-2B) and% nucleic acid sequence identity (Tables 2C-2D) using the ALIGN-2 sequence comparison computer program. Shows hypothetical examples to use, "PRO" indicates the amino acid sequence of the hypothetical PRO polypeptide of interest, and "Comparative protein" indicates the amino acid sequence of the polypeptide to which the "PRO" polypeptide of interest is compared. Wherein "PRO-DNA" indicates the hypothetical PRO-encoding nucleic acid sequence of interest, "Comparative DNA" indicates the nucleotide sequence of the nucleic acid molecule to which the "PRO-DNA" nucleic acid molecule of interest is compared, "X", "Y" and "Z" indicate different hypothetical amino acid residues, and "N", "L" and "V" indicate different hypothetical nucleotides.
      [0033]

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      [0038]
  hereIdentificationThe "percent (%) amino acid sequence identity" for a given PRO polypeptide sequence aligns the sequences, introduces gaps if necessary to obtain maximum percent sequence identity, and eliminates any conservative substitutions in sequence identity. Is defined as the percentage of amino acid residues in the candidate sequence that are identical to the amino acid residues in the PRO sequence, not considered as part of the PRO sequence. Alignments for the purpose of determining percent amino acid sequence identity can be obtained by various methods within the skill of the art, such as BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 or Megalign (DNASTAR) software. This can be achieved by using computer software available at One of skill in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms necessary to achieve maximum alignment over the entire length of the sequences being compared. However, for purposes herein, the% amino acid sequence identity values are, as described below, the sequence comparisons given in Table 1 for the complete source code for the ALIGN-2 program.ComputerObtained using the program ALIGN-2. The ALIGN-2 sequence comparison computer program was created by Genentech, Inc. and the source code set forth in Table 1 was submitted to the United States Copyright Office, Washington DC, 20559 with user documentation, and was issued under United States copyright registration number TXU510087. It is registered. ALIGN-2programIs publicly available through Genentech, South San Francisco, California and may be compiled from the source code provided in Table 1. The ALIGN-2 program is compiled for use with a UNIX operating system, preferably digital UNIX V4.0D. All sequence comparison parameters are set by the ALIGN-2 program and do not vary.
  For purposes herein,% amino acid sequence identity of a given amino acid sequence A to or to a given amino acid sequence B (or to a given amino acid sequence B or to A given amino acid sequence A having or including some degree of amino acid sequence identity) can be calculated as follows:
  100 times the fraction X / Y
Here, X is the number of amino acid residues having a score consistent with the same by the alignment of A and B of the sequence alignment program ALIGN-2, and Y is the total number of amino acid residues of B. It will be appreciated that if the length of amino acid sequence A is different from the length of amino acid sequence B, the percent amino acid sequence identity of A to B will be different from the percent amino acid sequence identity of B to A.%Table 2 shows an example of calculating amino acid sequence identity.A-2BShows a method for calculating the percent amino acid sequence identity of an amino acid sequence referred to as “PRO” to an amino acid sequence referred to as “PRO”.
      [0039]
  Unless otherwise specified, all% amino acid sequence identity values herein are obtained using the ALIGN-2 sequence comparison computer program as described above. However,% amino acid sequence identity may be determined using the sequence comparison program NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). The NCBI-BLAST2 sequence comparison program can be downloaded from http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Or otherwise obtained from the National Institute of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 uses several search parameters, all of which are set to initial values, for example, unmask = OK, chain = all, predicted occurrence = 10, minimum low complex length = 15/5 , Multipath e-value = 0.01, multipath constant = 25, final gap alignment drop-off = 25, and scoring matrix = BLOSUM62.
  NCBI-BLAST2 used for amino acid sequence comparisonLaIn certain situations, the given amino acid sequence A, the given amino acid sequence B, or the% amino acid sequence identity thereto (or the given amino acid sequence B, or some% amino acid identity thereto) A given amino acid sequence A with or including sequence identity) can be calculated as follows:
  100 times the fraction X / Y
Here, X is the number of amino acid residues having a score consistent with being identical by the alignment of A and B of the sequence alignment program NCBI-BLAST2, and Y is the total number of amino acid residues of B. It will be appreciated that if the length of amino acid sequence A is different from the length of amino acid sequence B, the percent amino acid sequence identity of A to B will be different from the percent amino acid sequence identity of B to A.
  In addition,% amino acid sequence identityIs, WU-BLAST-2 computer program (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)). Most WU-BLAST-2 search parameters are set to default values. The parameters that are not set to the initial values, i.e. the adjustable parameters are set to the following values: overlap span = 1, overlap fraction = 0.125, word threshold (T) = 11, and scoring matrix = BLOSUM62. For the purposes herein, the% amino acid sequence identity value is defined as (a) the amino acid sequence of the PRO polypeptide of interest having a sequence derived from a native PRO polypeptide, and the comparative amino acid sequence of interest (ie, The number of identical amino acid residues determined by WU-BLAST-2 between the PRO polypeptide of interest (which may be a PRO polypeptide variant to be compared) and (b) Determined by the quotient divided by the total number of residues in the PRO polypeptide. For example, in the expression "polypeptide comprising amino acid sequence A having or having at least 80% amino acid sequence identity to amino acid sequence B", amino acid sequence A is a comparative amino acid sequence of interest, Amino acid sequence B is the amino acid sequence of the PRO polypeptide of interest.
      [0040]
  "PRO variant polynucleotide" or "PRO variant nucleic acid sequence" refers to a nucleic acid molecule encoding an active PRO polypeptide as defined below, including the full length native sequence PRO as disclosed herein. A polypeptide sequence, a full length native sequence PRO polypeptide sequence as disclosed herein lacking a signal peptide, an extracellular domain of a PRO polypeptide as disclosed herein having or lacking a signal peptide, or disclosed herein. Other fragments of such full-length PRO polypeptide sequences will have at least about 80% nucleic acid sequence identity to the encoding nucleic acid sequence. Typically, the PRO variant polynucleotide has or lacks a full-length native sequence PRO polypeptide sequence as disclosed herein, a full length native sequence PRO polypeptide sequence as disclosed herein, a signal peptide. At least about 80% nucleic acid sequence identity to the encoding nucleic acid sequence of an extracellular domain of a PRO polypeptide as disclosed herein, or another fragment of a full-length PRO polypeptide sequence disclosed herein;OrAt least about 81% nucleic acid sequence identity;OrAt least about 82% nucleic acid sequence identity;OrAt least about 83% nucleic acid sequence identity;OrAt least about 84% nucleic acid sequence identity;OrAt least about 85% nucleic acid sequence identity;OrAt least about 86% nucleic acid sequence identity;OrAt least about 87% nucleic acid sequence identity;OrAt least about 88% nucleic acid sequence identity;OrAt least about 89% nucleic acid sequence identity;OrAt least about 90% nucleic acid sequence identity;OrAt least about 91% nucleic acid sequence identity;OrAt least about 92% nucleic acid sequence identity;OrAt least about 93% nucleic acid sequence identity;OrAt least about 94% nucleic acid sequence identity;OrAt least about 95% nucleic acid sequence identity;OrAt least about 96% nucleic acid sequence identity;is thereOr at least about 97% nucleic acid sequence identity,OrAt least about 98% nucleic acid sequence identity; andOrIt has at least about 99% nucleic acid sequence identity. A variant does not include the native nucleotide sequence.
  Typically, a PRO variant polynucleotide is at least about 30 nucleotides in length, more often at least about 60 nucleotides in length, more often at least about 90 nucleotides in length, more often at least about 120 nucleotides in length, more often at least about 150 nucleotides in length. Long, more often at least about 180 nucleotides, more often at least about 210 nucleotides, more often at least about 240 nucleotides, more often at least about 270 nucleotides, more often at least about 300 nucleotides, more often It is at least about 450 nucleotides in length, more often at least about 600 nucleotides in length, more often at least about 900 nucleotides in length, or longer.
      [0041]
  hereIdentificationThe "percent (%) nucleic acid sequence identity" identified for a given PRO polypeptide encoding nucleic acid sequence aligns the sequences and introduces gaps if necessary to obtain maximum percent sequence identity. ,PRO polypeptide encodingNucleic acidDefined as the percentage of nucleotides in the candidate sequence that are identical to the nucleotides in the sequence. Alignments for the purpose of determining percent nucleic acid sequence identity can be obtained by various methods within the skill of the art, such as BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 or Megalign (DNASTAR) software. This can be achieved by using computer software available at One of skill in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms necessary to achieve maximum alignment over the entire length of the sequences being compared. However, for the purposes herein, the% nucleic acid sequence identity values are based on the sequence comparisons given in Table 1 for the complete source code for the ALIGN-2 program, as described below.ComputerObtained using the program ALIGN-2. The ALIGN-2 sequence comparison computer program was created by Genentech, Inc. and the source code set forth in Table 1 was submitted to the United States Copyright Office, Washington DC, 20559 with user documentation, and was issued under United States copyright registration number TXU510087. It is registered. ALIGN-2programIs publicly available through Genentech, South San Francisco, California, andTable 1May be compiled from the source code given to. The ALIGN-2 program is compiled for use with a UNIX operating system, preferably digital UNIX V4.0D. All sequence comparison parameters are set by the ALIGN-2 program and do not vary.
  For purposes herein, a given nucleic acid sequence C, a given nucleic acid sequence D, or a% nucleic acid sequence identity thereto (or a given nucleic acid sequence D, or Given or containing some% nucleic acid sequence identityNuclearAcid sequence C) is calculated as follows:
  100 times the fraction W / Z
Here, W is the number of nucleotides having a score consistent with being identical by the alignment of C and D of the sequence alignment program ALIGN-2, and Z is the total number of nucleotides of D. It will be appreciated that if the length of the nucleic acid sequence C is different from the length of the nucleic acid sequence D, the% nucleic acid sequence identity of C to D will be different from the% nucleic acid sequence identity of D to C. As an example of calculating% nucleic acid sequence identity using this method,2C-2DShows a method for calculating the% nucleic acid sequence identity of a nucleic acid sequence referred to as “PRO-DNA” of a nucleic acid sequence referred to as “comparison DNA”.
  Unless otherwise specified, all% nucleic acid sequence identity values herein are obtained using the ALIGN-2 sequence comparison computer program as described above. However,% nucleic acid sequence identity may be determined using the sequence comparison program NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). The NCBI-BLAST2 sequence comparison program is available at http: // www.ncbi.nlm.nih.gov.Can be downloaded fromAnd other sources from the National Institute of Helth, Bethesda, MDYou. NCBI-BLAST2 uses several search parameters, all of which are set to initial values, for example, unmask = OK, chain = all, predicted occurrence = 10, minimum low complex length = 15/5 , Multipath e-value = 0.01, multipath constant = 25, final gap alignment drop-off = 25, and scoring matrix = BLOSUM62.
      [0042]
  NCBI-BLAST2 used for sequence comparisonLaIn certain circumstances, the given nucleic acid sequence C, the given nucleic acid sequence D or to it has a% nucleic acid sequence identity (alternatively the given nucleic acid sequence D or some% nucleic acid sequence thereto). A given nucleic acid sequence C with or including sequence identity) can be calculated as follows:
  100 times the fraction W / Z
Here, W is the number of nucleotides having a score consistent with being identical by the alignment of C and D of the sequence alignment program NCBI-BLAST2, and Z is the total number of nucleotides of D. It will be appreciated that if the length of the nucleic acid sequence C is different from the length of the nucleic acid sequence D, the% nucleic acid sequence identity of C to D will be different from the% nucleic acid sequence identity of D to C.
  In addition,% nucleic acid sequence identity values may be determined using the WU-BLAST-2 computer program (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)). Most WU-BLAST-2 search parameters are set to default values. The parameters that are not set to the initial values, i.e. the adjustable parameters are set to the following values: overlap span = 1, overlap fraction = 0.125, word threshold (T) = 11, and scoring matrix = BLOSUM62. For purposes herein, the% nucleic acid sequence identity value refers to (a) the PRO polypeptide encoding of interest having a sequence derived from a native sequence PRO polypeptide encoding nucleic acid.Nucleic acid moleculeA variant wherein the sequence of the nucleic acid molecule of interest is compared with the reference nucleic acid molecule of interest (ie, the sequence of the nucleic acid molecule encoding the PRO polypeptide of interest)PRO(B) the PRO polypeptide encoding nucleic acid of interest, as determined by WU-BLAST-2moleculeIs determined by the quotient divided by the total number of nucleotides. For example, "at least 80% of the nucleic acid sequence BNuclearThe phrase "isolated nucleic acid molecule comprising nucleic acid sequence A having or having acid sequence identity" refers to a comparative nucleic acid to which nucleic acid sequence A is directed.moleculeAnd nucleic acid sequence B is the nucleic acid sequence of the PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule of interest.
  In another embodiment, the PRO variant polynucleotide is a nucleic acid molecule encoding an active PRO polypeptide, preferably under stringent hybridization and wash conditions, respectively, in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), FIG. 4 (SEQ ID NO: 4), FIG. 6 (SEQ ID NO: 6), FIG. 8 (SEQ ID NO: 8), FIG. 10 (SEQ ID NO: 10), FIG. 12 (SEQ ID NO: 12), FIG. 14), FIG. 16 (SEQ ID NO: 16), FIG. 18 (SEQ ID NO: 18), FIG. 20 (SEQ ID NO: 20), FIG. 22 (SEQ ID NO: 22), FIG. 24 (SEQ ID NO: 24), FIG. (SEQ ID NO: 26), hybridizes to the nucleotide sequence encoding the full-length PRO polypeptide shown in FIG. 28 (SEQ ID NO: 28), FIG. 30 (SEQ ID NO: 30), and FIG. 32 (SEQ ID NO: 32). it can. A PRO variant polypeptide can be one that is encoded by a PRO variant polynucleotide.
      [0043]
  The term "positive" in the context of amino acid sequence identity comparisons performed as described above refers not only to amino acid residues that are identical in the compared sequences, but also toIt was similarIncluding those having properties. The amino acid residue that is scored as a positive value for the target amino acid residue is the same as the target amino acid residue or the target amino acid residue (see the table below).3(As specified in).
  For purposes herein, a given amino acid sequence A, a given amino acid sequence B, or a% positive value thereto (or a given amino acid sequence B, or some degree thereof). The given amino acid sequence A with or including% positive) can be calculated as follows:
  100 times the fraction X / Y
Here, X is positive by the alignment of A and B of the sequence alignment program ALIGN-2.value, And Y is the total number of amino acid residues in B. It will be understood that if the length of amino acid sequence A differs from the length of amino acid sequence B, the% positive of A against B will be different from the% positive of B against A.
  “Isolated,” as used to describe the various polypeptides disclosed herein, means a polypeptide that has been identified and separated and / or recovered from a component of its natural environment. Preferably, the isolated polypeptide is not associated with any components that naturally associate. Contaminant components of its natural environment are substances that typically interfere with the diagnostic or therapeutic use of the polypeptide, and include enzymes, hormones, and other proteinaceous or nonproteinaceous solutes. In a preferred embodiment, the polypeptide is (1) sufficient to obtain an N-terminal or internal amino acid sequence of at least 15 residues by using a spinning cup sequenator, or (2) Coomassie blue or Preferably, it is purified to homogeneity by SDS-PAGE under non-reducing or reducing conditions using silver staining. The isolated polypeptide includes PROofDue to the absence of at least one component of the natural environment, the in situPolypeptideIs included. However, usually, an isolated polypeptide is prepared by at least one purification step.
  An “isolated” nucleic acid molecule that encodes a PRO polypeptide, or an “isolated” nucleic acid molecule that encodes an anti-PRO antibody, has been identified and identified as a natural source of PRO-encoding nucleic acid, or an anti-PRO nucleic acid. A nucleic acid molecule that has been separated from at least one contaminating nucleic acid molecule normally associated with the natural source of the PRO-encoding nucleic acid. Preferably, the isolated nucleic acid,All that combine naturallyStructural componentNot combined with An isolated PRO-encoding nucleic acid molecule or isolated anti-PRO-encoding nucleic acid molecule is other than in the form or setting in which it is found in nature. Thus, an isolated nucleic acid molecule is distinguished from a PRO-encoding or anti-PRO-encoding nucleic acid molecule that is present in natural cells. However, an isolated nucleic acid molecule encoding a PRO polypeptide, or an isolated nucleic acid molecule encoding an anti-PRO antibody, for example, has a nucleic acid molecule at a different chromosomal location than that of a native cell. Includes PRO-nucleic acid molecules or anti-PRO-nucleic acid molecules contained in cells that normally express a PRO polypeptide or anti-PRO antibody.
      [0044]
  The term "control sequence" refers to a DNA sequence necessary to express an operably linked coding sequence in a particular host organism. For example, control sequences suitable for prokaryotes include a promoter, optionally an operator sequence, and a ribosome binding site. Eukaryotic cells are known to utilize promoters, polyadenylation signals and enhancers.
  A nucleic acid is “operably linked” when it is placed into a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, the DNA of a presequence or secretory leader is operably linked to the DNA of the PRO polypeptide if it is expressed as a preprotein that participates in the secretion of the polypeptide; the promoter or enhancer is responsible for transcription of the sequence. Is operably linked to the coding sequence if it affects the coding sequence; or the ribosome binding site is operably linked to the coding sequence if it is in a position such that it facilitates translation. Generally, "operably linked" means that the DNA sequences being linked are contiguous, and, in the case of a secretory leader, contiguous and in reading phase. However, enhancers need not be in close proximity. Binding is achieved by ligation at convenient restriction sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used according to conventional techniques.
  "Stringency" of hybridization reactions is readily determinable by one of ordinary skill in the art, and generally is an empirical calculation dependent upon probe length, washing temperature, and salt concentration. In general, longer probes have higher temperatures for proper annealing, while shorter probes have lower temperatures. Hybridization generally depends on the ability of denatured DNA to reanneal when the complementary strand is present in an environment below its melting point. The higher the degree of desired homology between the probe and the hybridizable sequence, the higher the relative temperature that can be used. As a result, higher relative temperatures make the reaction conditions more stringent, while lower temperatures reduce stringency. For further details and explanation of the stringency of the hybridization reaction see Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
  As defined herein, "stringent conditions" or "high stringent conditions" means (1) low ionic strength and high temperature for washing, for example, 0.015 M sodium chloride / 0.0015 M at 50 ° C. Using sodium citrate / 0.1% sodium dodecyl sulfate; (2) denaturing agents such as formamide during hybridization, eg, 50% (v / v) formamide and 0.1% bovine serum albumin at 42 ° C. /0.1% ficoll / 0.1% polyvinylpyrrolidone / 50mM sodium phosphate buffer pH 6.5 and 750mM sodium chloride, 75mM sodium citrate; (3) 50% formamide at 42 ° C; 5 × SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M sodium citrate), 50 mM sodium phosphate (PH 6.8), 0.1% sodium pyrophosphate, 5 × Denhardt's solution, sonicated salmon sperm DNA (50 μg / ml), 0.1% SDS, and 10% dextran sulfate with 0% at 42 ° C. Identified by washing in 2 × SSC (sodium chloride / sodium citrate) and 50% formamide at 55 ° C. followed by a high stringency wash consisting of 0.1 × SSC with EDTA at 55 ° C.
  "Medium stringency conditions" are described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989) and involves the use of less stringent wash solutions and hybridization conditions (eg, temperature, ionic strength and% SDS) as described above. Moderate stringency conditions included 20% formamide, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5 × denhard solution, 10% dextran sulfate, and 20 mg / ml. Conditions include overnight incubation at 37 ° C. in a solution containing denatured sheared salmon sperm DNA, followed by filter washing at 37-50 ° C. in 1 × SSC. One skilled in the art will recognize how to adjust temperature, ionic strength, etc. as necessary to accommodate factors such as probe length.
      [0045]
  The modifier "epitope tag", as used herein, refers to a chimeric polypeptide comprising a PRO polypeptide fused to a "tag polypeptide". A tag polypeptide has a sufficient number of residues to provide an epitope upon which the antibody can be produced, but is short enough so as not to inhibit the activity of the polypeptide to which it is fused. Also, the tag polypeptide is preferably quite unique so that the antibody does not substantially cross-react with other epitopes. Suitable tag polypeptides generally have at least 6 amino acid residues, usually about 8 to 50 amino acid residues (preferably about 10 to about 20 amino acid residues).
  “Active” and “activity” in a PRO variant refer to the form of the PRO protein that retains the biological and / or immunological activity of the native or naturally occurring PRO polypeptide.
  A “biological activity” in a molecule (eg, small organic or inorganic molecule, peptide, etc.) that antagonizes a PRO polypeptide identifiable by the screening assays disclosed herein is defined by the PRO polypeptide identified herein. Used when referring to the ability of a molecule to bind or complex, or interfere with the interaction of other polypeptides with the PRO polypeptide, or inhibit the transcription or translation of the PRO polypeptide. Particularly preferred biological activities include systemic diseases affecting the blood vessels, such as diabetes mellitus, and diseases of the arteries, capillaries, veins and / or lymphatic vessels, and cardiac hypertrophy activity acting on cancer.
  The term “antagonist” is used in the broadest sense and refers to one or more of the biological activities of the native PRO polypeptides disclosed herein, such as to block, inhibit, inhibit, if appropriate, its mitogenic or angiogenic activity. Or any molecule that neutralizes. An antagonist of the PRO polypeptide may interfere with the binding of the PRO polypeptide to the cell receptor, neutralize or kill cells activated by the PRO polypeptide, or inhibit vascular endothelial cells after the PRO polypeptide binds to the cell receptor. It acts by interfering with the activation of. All such points of mediation by the PRO polypeptide antagonists are considered equivalent to the objects of the present invention. Antagonists inhibit mitogenesis, angiogenesis, or other biological activities of the PRO polypeptides, and therefore tumors, especially solid malignancies, rheumatoid arthritis, psoriasis, atherosclerosis, diabetes, other retinopathies , Post lens fibroplasia, age-related macular degeneration, neovascular glaucoma,Useful for treating diseases or disorders characterized by unwanted excessive neovascularization, including hemangiomas, thyroid hyperplasia (including Graves' disease), transplantation of cornea and other tissues, and chronic inflammation. Also, antagonists may be used in diseases or disorders characterized by unwanted excessive vascular permeability, such as edema associated with brain tumors, ascites associated with malignancies, Meigs syndrome, pneumonia, nephrotic syndrome, epicardial fluid (e.g., It is useful for treating pleural effusion. Similarly, the term "agonist" is used in the broadest sense and includes any molecule that mimics the biological activity of a native PRO polypeptide disclosed herein. Suitable agonist or antagonist molecules include, in particular, agonist or antagonist antibodies or antibody fragments, fragments or amino acid sequence variants of native PRO polypeptides, peptides, small organic molecules and the like.
  "Small molecule" is defined herein as having a molecular weight of about 500 daltons or less.
  As used herein, the term "PRO polypeptide receptor" retains the ability to bind to the cellular receptor for the PRO polypeptide, usually a cell surface receptor found on vascular endothelial cells, as well as the PRO polypeptide. These variants are referred to.
      [0046]
  "Antibodies" (Abs) and "immunoglobulins" (Igs) are glycoproteins having the same structural characteristics. Antibodies exhibit binding specificity for a particular antigen, whereas immunoglobulins include both antibodies and other antibody-like molecules that lack antigen specificity. Polypeptides of the latter type are produced, for example, at lower levels by the lymphatic system and at increased levels by myeloma. The term "antibody" is used in its broadest sense and includes, but is not limited to, intact monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies formed from at least two intact antibodies (e.g., bispecific antibodies). ), And antibody fragments so long as they exhibit the desired biological activity.
  “Native antibodies” and “native immunoglobulins” are usually heterotetrameric glycoproteins of about 150,000 daltons, composed of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) chains. Each light chain is linked to a heavy chain by one covalent disulfide bond, and the number of disulfide bonds varies among the heavy chains of different immunoglobulin isotypes. Each heavy and light chain has regularly spaced interchain disulfide bonds. Each heavy chain has a variable domain (V_H) At one end. Each light chain has at one end a variable domain (V_L) Has a constant domain at the other end; the constant domain of the light chain is aligned with the first constant domain of the heavy chain, and the variable domain of the light chain is aligned with the variable domain of the heavy chain. Particular amino acid residues are believed to form an interface between the light and heavy chain variable domains.
  The term "variable" refers to the fact that certain portions of the variable domains vary widely in sequence within an antibody and are used for the binding and specificity of each particular antibody to its particular antigen. . However, the variability is not evenly distributed over the variable domains of the antibody. It is concentrated into three segments called hypervariable regions or complementarity determining regions (CDRs) of both the light and heavy chain variable domains. The more highly retained portion of the variable domain is called the framework region (FR). The variable domains of the natural heavy and light chains predominantly adopt a β-sheet configuration linked by three CDRs that bind the β-sheet structure and, in some cases, form loop bonds that form part of it. Each contains two FR regions. The CDRs of each chain are more closely bound by the FRs, and together with the CDRs of the other chains, contribute to the formation of the antigen-binding site of the antibody. See Kabat et al., NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pp. 647-669 [1991]. The constant domains are not involved directly in binding an antibody to an antigen, but exhibit various effector functions, such as participation of the antibody in antibody-dependent cellular cytotoxicity.
      [0047]
  "Antibody fragments" include a portion of an intact antibody, preferably the antigen binding or variable region of the intact antibody. Examples of antibody fragments include Fab, Fab ', F (ab')₂Diabodies; linear antibodies (Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 [1995]); single-chain antibody molecules; and multispecific antibodies formed from antibody fragments. Is included.
  Upon papain digestion of an antibody, two identical antigen-binding fragments, each called a "Fab" fragment, each having a single antigen-binding site, and the remaining "Fc" fragment, the name of which represents the ability to crystallize readily, Produced. F (ab ') which has two antigen-binding sites by pepsin treatment and can further crosslink an antigen₂A fragment is obtained.
  "Fv" is the minimum antibody fragment which contains a complete antigen-recognition and -binding site. This region consists of a dimer of one heavy and one light chain variable domain in tight, non-covalent association. In this configuration, the three CDRs of each variable domain interact to_H-V_LForm an antigen-binding site on the dimer surface. Collectively, the six CDRs confer antigen-binding specificity to the antibody. However, even a single variable domain (or half of an Fv containing only three CDRs specific for an antigen) has a lower affinity than the entire binding site, but has the ability to recognize and bind the antigen. Have.
  The Fab fragment has a light chain constant domain and a heavy chain first constant region (CH1). Fab ′ fragments differ from Fab fragments by the addition of a few residues at the carboxy terminus of the heavy chain CH1 region including one or more cysteines from the antibody hinge region. Fab'-SH is the designation herein for Fab 'where the cysteine residue (s) of the constant domains carry a free thiol group. F (ab ')₂Antibody fragments were produced as pairs of Fab 'fragments which have hinge cysteines between them. Other chemical bonds of antibody fragments are known.
  The “light chain” of an antibody (immunoglobulin) from any vertebrate species has two distinct types of kappa (κ) and lambda (λ), based on the amino acid sequence of its constant domain. One is assigned.
  Depending on the amino acid sequence of the constant domain of the heavy chain, immunoglobulins can be assigned to different classes. There are five main classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, some of which are further divided into subclasses (isotypes), for example, IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4, IgA and IgA2. The heavy chain constant domains that correspond to the different classes of immunoglobulins are called α, σ, ε, γ, and μ, respectively. The subunit structures and three-dimensional structures of different classes of immunoglobulins are well known.
      [0048]
  As used herein, the term "monoclonal antibody" refers to an antibody obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, i.e., the individual antibodies that make up the population may be present in small amounts and may occur naturally. Identical except for mutations. Monoclonal antibodies are highly specific, being directed against a single antigenic site. In addition, each monoclonal antibody has a single determinant on the antigen, as compared to a regular (polyclonal) antibody, which typically contains different antibodies to different determinants (epitope).ToAgainst. In addition to its specificity, monoclonal antibodies are advantageous in that they are synthesized from a hybridoma culture that is not contaminated with other immunoglobulins. The modifier "monoclonal" indicates the character of the antibody as being obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, and does not imply that the antibody must be produced in any particular manner. For example, the monoclonal antibodies used in the present invention can be made by the hybridoma method first disclosed by Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), or can be made by recombinant DNA methods (e.g., U.S.A.). Patent No. 4,816,567). Further, "monoclonal antibody" is, for example, a phage antibody library using the technology described in Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991), and Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991). Can also be isolated.
  Here, a monoclonal antibody is one in which a part of the heavy chain and / or the light chain is identical or homologous to the corresponding sequence of an antibody derived from a specific species or an antibody belonging to a specific antibody class or subclass, and A "chimeric" antibody (immunoglobulin) in which a portion of the antibody is identical or homologous to the corresponding sequence of an antibody from another species or an antibody belonging to another antibody class or subclass, as well as having the desired biological activity In particular, fragments of these antibodies are specifically included (US Pat. No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 [1984]).
  A “humanized” form of a non-human (eg, mouse) antibody refers to a chimeric immunoglobulin, immunoglobulin chain, or a fragment thereof (eg, Fv, Fab, Fab ′, F (ab ′)₂Or another antigen-binding subsequence of an antibody), which comprises a minimal sequence derived from a non-human immunoglobulin. In most cases, humanized antibodies will have the CDR residues of the recipient replaced by CDR residues of a non-human species (donor antibody) having the desired specificity, affinity and potency, such as mouse, rat or rabbit. Human immunoglobulin (recipient antibody). In some cases, FvFR region residues of the human immunoglobulin are replaced by corresponding non-human residues. Furthermore, humanized antibodies may contain residues that are not found in the recipient antibody, nor in the imported CDR or framework sequences. These modifications are made to further refine and optimize antibody performance. In general, a humanized antibody will have at least one, typically at least one, typically at least all CDR regions corresponding to those of a non-human immunoglobulin and all or almost all FR regions of a human immunoglobulin sequence. Includes substantially all of the two variable domains. The humanized antibody optimally will comprise at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), typically that of a human immunoglobulin. For further details, see Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596 (1992). checking ... In a humanized antibody, the antigen-binding region of the antibodyTargetProduced by immunizing macaque monkeys with different antigensToComes from,PRIMATIZED^TMIncluding antibodies.
      [0049]
  "Single-chain Fv" or "sFv" antibody fragments are derived from the V_HAnd V_LContaining domains, these domains are present in a single polypeptide chain. Preferably, the Fv polypeptide has a polypeptide linker that allows the sFv to form the desired structure for antigen binding._HAnd V_LIncludes further between domains. For a review of sFv, see, for example, Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, edited by Rosenburg and Moore (Springer-Verlag, New York, 1994) pp. 269-315.
  The term "diabody" refers to a small antibody fragment having two antigen-binding sites, wherein the fragment is a light chain variable domain (V_LHeavy chain variable domain (V_H) With the same polypeptide chain (V_H-V_L). By using a linker that is too short to allow pairing between the two domains on the same chain, the domains are forced to pair with the complementary domains of the other chain, creating two antigen binding sites. Diabodies are described in further detail, for example, in EP 404,097; WO 93/11161; and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).
  An "isolated" antibody is one that has been identified and separated and / or recovered from a component of its natural environment. Contaminants of the natural environment are substances that would interfere with the diagnostic or therapeutic use of the antibody, and include enzymes, hormones, and other proteinaceous or nonproteinaceous solutes. In a preferred embodiment, the antibody is prepared by (1) using more than 95% of the antibody as determined by the Lowry method, most preferably to more than 99% by weight, and (2) using a spinning cup sequenator. Enough to obtain an N-terminal or internal amino acid sequence of at least 15 residues, or (3) homogeneity by SDS-PAGE under non-reducing or reducing conditions using Coomassie blue or preferably silver staining. Purified. Isolated antibody includes the antibody in situ within recombinant cells since at least one component of the antibody's natural environment will not be present. However, usually, an isolated antibody is prepared by at least one purification step.
  The term "label" as used herein refers to a detectable compound or composition that is conjugated directly or indirectly to the antibody to produce a "labeled" antibody. The label may itself be detectable (eg, a radioactive or fluorescent label) or, in the case of an enzymatic label, may catalyze a chemical transformation of a detectable substrate compound or composition. Radionuclides that can be provided as detectable labels include, for example, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, At-211, Cu-67, Bi-212, and Pd-109. Including. Further, the label may be an undetectable substance such as a toxin.
  "Solid phase" means a non-aqueous matrix to which the antibodies of the present invention can be attached. Examples of solid phases included herein include those formed, in part or in whole, from glass (eg, controlled pore glass), polysaccharides (eg, agarose), polyacrylamide, polystyrene, polyvinyl alcohol, and silicone. In certain embodiments, depending on the context, the solid phase may constitute a well of an assay plate; in others, it may be a purification column (eg, an affinity chromatography column). The term also encompasses a discrete solid phase of discrete particles, as described in US Pat. No. 4,275,149.
      [0050]
  "Liposomes" are small vesicles composed of various types of lipids, phospholipids and / or surfactants, which are used to transfer drugs (such as PRO polypeptides or their antibodies disclosed herein) to mammals. Useful for transportation. The components of the liposome are usually arranged in a bilayer format, similar to the lipid arrangement of biological membranes.
  The term "immunoadhesin" as used herein refers to an antibody-like molecule that combines the binding specificity of a heterologous protein ("adhesin") with the effector functions of immunoglobulin constant domains. Structurally, immunoadhesins comprise a fusion of an amino acid sequence with the desired binding specificity, other than the antigen recognition and binding site of an antibody (ie, "heterologous"), and an immunoglobulin constant domain sequence. . The adhesin portion of an immunoadhesin molecule is a contiguous amino acid sequence that typically includes at least the receptor or ligand binding site. The immunoglobulin constant domain sequence of the immunoadhesin can be any of the following: IgG-1, IgG-2, IgG-3 or IgG-4 subtype, IgA (including IgA-1 and IgA-2), IgE, IgD or IgM. From immunoglobulins.
      [0051]
II. Compositions and Methods of the Invention
A. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 and PRO887 mutants
  In addition to the full-length native sequences PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 and PRO887 polypeptides described herein, PRO379, PRO87, PRO287 It is contemplated that PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, and PRO887 variants can also be prepared. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, and PRO887 mutants PRO179, PRO238, PRO1608, PRO1844, PRO344, 8344 PRO8, PRO344, 8344 PRO8, PRO344, 8344 PRO8, PRO344, 8344 PRO8, PRO344, 8344 PRO8, PRO344, 8360 PRO8, PRO8, PRO3, PRO8, PRO8, PRO8, PRO8, PRO3, PRO8, PRO3, PRO8, PRO3, PRO3, PRO3, PRO3, PRO3 PRO8 , PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 DNA by introducing appropriate nucleotide changes and / or the desired PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO332, PRO321, PRO321. PRO8 0, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, can be prepared by combining the PRO885 or PRO887 polypeptide. Those skilled in the art will recognize that amino acid changes, such as changes in the number or position of glycosylation sites or changes in membrane anchoring properties, are PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, That the post-translational process of PRO882, PRO885 or PRO887 can be alteredUnderstandWill be.
  The natural full-length sequence PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887, or PRO179, PRO4, PRO4, PRO838, or PRO4 PRO8, PRO4 PRO8, PRO4 PRO8, PRO4 PRO8, PRO4 PRO836 Mutations in the various domains of PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 can be any of the conservative and non-conservative mutations described, for example, in US Pat. No. 5,364,934. Using the techniques and guidelines of The mutation results in a native sequence PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, PRO487, PRO487, PRO487, PRO487, PRO487, PRO487 Wherein the amino acid sequence of PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 is changed. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO1760, PRO1760, PRO1760, PRO1760 PRO878, PRO879, PRO882, substitution of one or more codons encoding the PRO885 or PRO887, may be deletion or insertion. In some cases, the mutation is at least one amino acid of any one or more domains of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887. With other amino acids. Guidance on which amino acid residues are inserted, substituted or deleted without adversely affecting the desired activity can be found in PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, It is found by comparing the sequence of PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 to the sequence of a protein molecule of known homology and minimizing amino acid sequence changes made in regions of high homology. Amino acid substitutions can be the result of substitution of one amino acid for another amino acid having similar structural and / or chemical properties, for example, substitution of leucine for serine, ie, a conservative amino acid substitution. Insertions and deletions can optionally be in the range of 1 to 5 amino acids. Tolerable mutations are determined by systematically making amino acid insertions, deletions or substitutions in the sequence and testing the resulting variants for the activities exhibited by the full-length or mature native sequence.
      [0052]
  In particular embodiments, conservative substitutions of interest are set forth in Table 3, beginning with the preferred substitution. If such substitutions result in altered biological activity, more substitutional changes are introduced and the product screened as shown in Table 3 for exemplary substitutions or as further described in the amino acid classes below.
                  Table 3
Original residue Exemplary substitution Preferred substitution
Ala (A) val; leu; ile val
Arg (R) lys; gln; asn lys
Asn (N) gln; his; lys; arg gln
Asp (D) glu glu
Cys (C) ser ser
Gln (Q) asn asn
Glu (E) asp asp
Gly (G) pro; ala ala
His (H) asn; gln; lys; arg arg
Ile (I) leu; val; met; ala; phe;
              Norleucine leu
Leu (L) norleucine; ile; val;
              met; ala; phe ile
Lys (K) arg; gln; asn arg
Met (M) leu; phe; ile leu
Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr leu
Pro (P) ala ala
Ser (S) thr thr
Thr (T) ser ser
Trp (W) tyr; phe tyr
Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe
Val (V) ile; leu; met; phe;
              ala; norleucine leu
  Substitutional modifications of the function and immunological identity of the PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide are: (a) Substitutions that differ substantially in their structure while maintaining the structure of the polypeptide backbone of the substitution region, such as a sheet or helical configuration, (b) the charge or hydrophobicity of the molecule at the target site, or (c) the bulk of the side chain. This is achieved by choosing a group. Naturally occurring residues can be divided into groups based on common side chain characteristics:
(1) Hydrophobic: norleucine, met, ala, val, leu, ile;
(2) Neutral hydrophilicity: cys, ser, thr;
(3) acidic: asp, glu;
(4) Basicity: asn, gln, his, lys, arg;
(5) Residues affecting chain orientation: gly, pro; and
(6) Aromatic: trp, tyr, phe.
  Non-conservative substitutions will entail exchanging a member of one of these classes for another. Also, such substituted residues may be introduced at conservative substitution sites, preferably at the remaining (non-conserved) sites.
      [0053]
  Mutations can be made using techniques known in the art, such as oligonucleotide-mediated (site-directed) mutagenesis, alanine scanning, and PCR mutagenesis. Site-directed mutagenesis [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)], cassette mutagenesis [Wells et al., Gene, 34: 315 (1985)], restriction selective mutagenesis [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)], or other well-known techniques, are available from PRO179, PRO238, PRO364, PRO844. , PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 mutant DNA can be carried out on the cloned DNA.
  Also, scanning amino acid analysis can be used to identify one or more amino acids along a flanking sequence. Preferred scanning amino acids are relatively small, neutral amino acids. Such amino acids include alanine, glycine, serine, and cysteine. Alanine is a typically preferred scanning amino acid within this group because it eliminates side chains beyond the beta carbon and is less likely to alter the backbone structure of the mutant [Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085. (1989)]. Alanine is also typically preferred because it is the most common amino acid. In addition, it is often found in both buried and exposed locations [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)]. If alanine substitution does not yield a sufficient amount of variant, isoteric amino acids can be used.
      [0054]
B. Modification of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, and PRO887
  Covalent modifications of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, and PRO887 are included within the scope of the present invention. One type of covalent modification is the amino acid residue targeted by PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide. Can be reacted with a selected side chain or an N or C-terminal residue of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. Reacting with a derivatizing reagent. Derivatization with a bifunctional reagent can, for example, convert PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 into a water-insoluble support matrix. -PRO179, anti-PRO238, anti-PRO364, anti-PRO844, anti-PRO846, anti-PRO1760, anti-PRO205, anti-PRO321, anti-PRO333, anti-PRO840, anti-PRO877, anti-PRO878, anti-PRO879 , Anti-PRO882, anti-PRO885 or anti-PRO887 antibodies are useful for cross-linking a surface for use in a purification method or vice versa. Commonly used crosslinking agents include, for example, 1,1-bis (diazoacetyl) -2-phenylethane, glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide ester, for example, 4-azidosalicylic acid, 3,3′-dithiobis (succinimidyl) Homobifunctional imide esters including disuccinimidyl esters such as propionate), bifunctional maleimides such as bis-N-maleimido-1,8-octane, and methyl-3-[(p-azidophenyl)- [Dithio] propioimidate.
  Other modifications include deamination of glutaminyl and asparaginyl residues to the corresponding glutamyl and aspartyl, proline and lysine, respectively.TheHydroxylation of a seryl or threonyl residue,The, Arginine, and histidine α-amino group methylation [TE Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, WH Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)] Includes acetylation and amidation of any C-terminal carboxyl groups.
      [0055]
  Other types of covalent modifications of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides included within the scope of the present invention. Includes altering the native glycosylation pattern of a polypeptide. By "altered native glycosylation pattern" is intended herein the native sequence PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885. Or deletion of one or more carbohydrate moieties found in PRO887 (either by removing existing glycosylation sites or by removing glycosylation by chemical and / or enzymatic means) and / or native sequence PRO179, PRO238 , PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO8. 5 or PRO887 adding one or more glycosylation sites that are not present. In addition, this clause includes qualitative changes in glycosylation of the native protein, including changes in the nature and proportion of the various carbohydrate moieties present.
  The addition of a glycosylation site to the PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 polypeptide may be accompanied by an amino acid sequence change. . This alteration may be, for example, a native sequence of one or more serine or threonine residues, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO885. O-linked glycosylation sites) or by substitution. The PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 amino acid sequence may optionally be altered at the DNA level, particularly PRO2, at PR17. , PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides are mutated at a preselected base and translated to the desired amino acid. May be altered through the generation of codons to be made.
      [0056]
  Other means of increasing the number of carbohydrate moieties on the PRO184, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide glycosides are also available. By chemical or enzymatic coupling to the peptide. Such methods are described in the art, for example, in WO 87/05330 published September 11, 1987, and in Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., Pp. 259-306 (1981). Has been described.
  Removal of the carbohydrate moiety present on the PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide is accomplished chemically or chemically. Alternatively, it can be accomplished by mutational substitution of a codon encoding an amino acid residue presented as a target for glucosylation. Chemical deglycosylation techniques are known in the art and are described, for example, by Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987), and by Edge et al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981). ). Enzymatic cleavage of the carbohydrate moiety on the polypeptide is achieved by using various endo and exoglycosidases, as described in Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138: 350 (1987).
  Other types of covalent modifications of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 of the present invention are PRO2, PR4, PRO436 , PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides, such as polyethylene glycol.(PEG), Polypropylene glycol or one of the polyoxyalkylenes in the manner described in U.S. Patent Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 or 4,179,337.
      [0057]
  In addition, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 of the present invention are fused to another heterologous polypeptide or amino acid sequence 9 by PRO. , PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887.
  In one embodiment, such a chimeric molecule comprises a PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877 tag molecule that provides an epitope to which an anti-tag antibody can selectively bind. , PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. The epitope tag is generally located at the amino or carboxyl terminus of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. The presence of such epitope-tagged forms of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 using antibodies against the tag polypeptides. Can be detected. Also, the provision of the epitope tag can be performed by affinity purification using an anti-tag antibody or another type of affinity matrix that binds to the epitope tag, by using PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, Allows easy purification of PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887ToI do. Various tag polypeptides and their respective antibodies are well known in the art. Examples are poly-histidine (poly-his) or poly-histidine-glycine (poly-histidine).His-gly) tag; flu HA tag polypeptide and its antibody 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)]; c-myc tag and its corresponding 8F9, 3C7, 6E10, G4. , B7 and 9E10 antibodies [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)]; and herpes simplex virus glycoprotein D (gD) tag and its antibodies [Paborsky et al., Protein Engineering, 3 (6): 547-553 (1990)]. Other tag polypeptides include flag peptides [Hopp et al., BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)]; KT3 epitope peptides [Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)]; α-tubulin epitope peptides [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)]; and T7 gene 10 protein peptide tag [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6393-6397 ( 1990)].
  In an alternative embodiment, the chimeric molecule is PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 and a region of immunoglobulin or immunoglobulin and May be included. For a bivalent form of the chimeric molecule (also called an "immunoadhesin"), such a fusion could be the Fc region of an IgG molecule. The Ig fusion preferably replaces PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or at least one variable region within the Ig molecule. Includes solubilized (transmembrane domain deleted or inactivated) forms of the polypeptide. In a particularly preferred embodiment, the immunoglobulin fusion comprises the hinge, CH2 and CH3, or the hinge, CH1, CH2 and CH3 regions of an IgG1 molecule. See US Pat. No. 5,428,130, issued Jun. 27, 1995, for the production of immunoglobulin fusions.
      [0058]
C. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, and PRO888.ofPreparation
  The present invention has been newly identified and isolated, referred to in the present application as PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. Provided herein are nucleotide sequence-encoding polypeptides. In particular, cDNAs encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides are described in more detail in the Examples below. Identified and isolated as disclosed. Separate expressionIn the roundThe protein produced will be given a different PRO number, but the UNQ number will be unique for any given DNA and encoded protein and will not change. However, for the purpose of simplicity, in the present application, DNA16451-1388, DNA35600-1162, DNA47365-1206, DNA59838-1462, DNA44196-1353, DNA76532-1702, DNA30868, DNA34433, DNA41374, DNA53987, DNA58120, DNA58121, DNA58122. , DNA58125, DNA58128, or DNA58130, additional natural homologs, and PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, or PRO885. Variants included in the above definitions are "PRO179", "PRO238", "PRO364", "PRO844", "PRO846", "PRO1760", "PRO205", "PRO321", regardless of origin or preparation method. , "PRO333", "PRO840", "PRO877", "PRO878", "PRO879", "PRO882", "PRO885" or "PRO887".
  The following description is based primarily on nucleic acids encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 polypeptide. By culturing the transformed or transfected cells, a polypeptide for PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide is produced. . Of course, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO888 are prepared using other methods well known in the art. It is thought that it is possible. For example, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide sequence, or a portion thereof using direct solid phase technology. It may be produced by peptide synthesis. See Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, (W.H. Freeman Co., San Francisco, CA 1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963). In vitro protein synthesis may be performed by manual techniques or by automation. Automated synthesis may be performed, for example, using an Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) according to the manufacturer's instructions. The various portions of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 are chemically synthesized separately and chemically or enzymatically. The method may be used to produce a full-length PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 polypeptide.
      [0059]
i. Isolation of DNA encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887.
  DNAs encoding the PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides, PRO179, PRO4, 836, PRO438, PRO438, PRO438, PRO438, PRO438, PRO438, PRO48 From a cDNA library prepared from a tissue that possesses mRNA encoding PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 and that will express it at a detectable level. Obtainable. Therefore, human PRO179, human PRO238, human PRO364, human PRO844, human PRO846, human PRO1760, human PRO205, human PRO321, human PRO333, human PRO840, human PRO877, human PRO878, human PRO879, human PRO882, human PRO885, or human PRO887. The encoding DNA can be conveniently obtained from a cDNA library prepared from human tissue, as described in the Examples. Also, the gene encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide can be obtained from a genomic library or by oligonucleotide synthesis. You can also.
  The library includes probes (PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO877, PRO878, PRO879, which are designed to identify the gene of interest or the protein encoded thereby. Antibodies against PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides, or oligonucleotides of at least about 20-80 bases). Screening of a cDNA or genomic library with the selected probe can be performed using standard procedures described, for example, in Sambrook et al., Supra.POther methods for isolating the genes encoding RO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 are PCR methods. It is. Sambrook et al., Supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995).
  The following example describes a technique for screening a cDNA library. The oligonucleotide sequence selected as a probe must be of sufficient length and sufficiently distinct to minimize false positives. The oligonucleotide is preferably labeled so that it is detectable upon hybridization with DNA in the library being screened. Labeling methods are well known in the art,³²Includes the use of radiolabels such as P-labeled ATP, biotinylation or enzymatic labels. MediumAusteritySexual and advancedAusterityHybridization conditions, including gender, are given in Sambrook et al., Supra.
  The sequence identified in such a library screening method is GenGenBThe sequences can be compared and aligned with known sequences that have been deposited in public databases such as ank or personal sequence databases and made available to the public. Sequence identity (either at the amino acid or nucleic acid level) within a determined region of the molecule or across the full-length sequence can be determined by computer software programs, such as ALIGN, using various algorithms to determine homology. It can be determined by DNAstar and INHERIT.
  Nucleic acids having protein-encoding sequences may use, for the first time, the deduced amino acid sequences disclosed herein, and if necessary, detect intermediates and precursors of mRNA that were not reverse transcribed into cDNA, see Sambrook et al., Supra. And by screening selected cDNA or genomic libraries using conventional primer extension methods as described in US Pat.
      [0060]
ii. Selection and transformation of host cells
  The host cell is transfected with an expression or cloning vector for production of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 described herein. Alternatively, one may transform, induce a promoter, select transformants, or culture in a conventional nutrient medium suitably modified to amplify the gene encoding the desired sequence. Culture conditions, such as medium, temperature, pH, etc., can be selected by those skilled in the art without undue experimentation. In general, principles, protocols, and practical techniques for maximizing cell culture productivity can be found in Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, Ed. M. Butler (IRL Press, 1991) and Sambrook et al., Supra. it can.
  Transfection methods, such as CaPO₄Processing and electroporation are known to those skilled in the art. Depending on the host cell used, transformation is effected using standard techniques appropriate for that cell. Calcium treatment with calcium chloride or electroporation described in Sambrook et al., Supra, is commonly used for prokaryotes or other cells that contain a substantial cell wall barrier. Infection by Agrobacterium tumefaciens has been reported by Shaw et al., Gene, 23: 315 (1983) and international patent application published on June 29, 1989.ReleaseIt is used for the transformation of certain plant cells, as described in WO 89/05859. For such mammalian cells without cell walls, the calcium phosphate precipitation method of Graham and van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978) is used. General aspects of mammalian cell host system transformations are described in US Pat. No. 4,399,216. Transformation into yeast is typically performed using VanSolingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) and Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979). However, other methods of introducing DNA into cells, such as nuclear microinjection, electroporation, intact cells, or bacterial protoplast fusion using polycations, such as polybrene, polyornithine, etc., can also be used. For various techniques for transforming mammalian cells, see Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) and Mansour et al., Nature, 336: 348-352 (1988).
      [0061]
  Suitable host cells for cloning or expressing the DNA in the vectors described herein include prokaryotes, yeast, or higher eukaryotic cells. Suitable prokaryotes include, but are not limited to, eubacteria, for example, Gram-negative or Gram-positive organisms, for example, Enterobacteriaceae such as E. coli. Various E. coli strains are available to the public, for example, E. coli K12 strain MM294 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); E. coli strains W3110 (ATCC 27,325) and K5772 (ATCC 53,635). Other preferred prokaryotic host cells are E. coli, such as E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, such as Salmonella typhimurium, Serratia, such as Serratia marcesans ( Serratia marcescans), and Shigella, and bacilli such as B. subtilis and B. licheniformis (for example, Basililiceniformol described in DD 266,710 published April 12, 1989). Miss 41P), including Pseudomonas, for example, Enterobacteriaceae such as Pseudomonas muscle and Streptomyces. These examples are illustrative rather than limiting. Strain W3110 originates from recombinant DNA production.YeastIs one particularly preferred host or parent host because it is a common host strain for E. coli. Preferably, the host cells secrete minimal amounts of proteolytic enzymes. For example, strain W3110 may be modified to make a genetic mutation in the gene encoding the foreign protein in the host; examples of such hosts include E. coli W3110 strain 1A2 having the complete genotype tonA; E. coli W3110 strain 9E4 with complete genotype tonA ptr3; complete genotype tonA prt3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompTkan^rE. coli W3110 strain 27C7 (ATCC 55,244) having the complete genotype tonA prt3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7ilvGkan^rEscherichia coli W3110 strain 37D6 having a non-kanamycin resistance degP deletion mutation; Escherichia coli W3110 strain 40B4 which is a 37D6 strain having a non-kanamycin resistance degP deletion mutation; and Escherichia coli having a mutant periplasmic protease disclosed in U.S. Pat. No. 4,946,783 issued on Aug. 7, 1990 Including strains. Alternatively, in vitro methods of cloning, such as PCR or other nucleic acid polymerase reactions, are preferred.
      [0062]
  In addition to prokaryotes, eukaryotic microbes such as filamentous fungi or yeast can be PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO885. A suitable cloning or expression host for the encoding vector. Saccharomyces cerevisiae is a commonly used lower eukaryotic host microorganism. Others include Schizosaccharomyces prombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139,383 published May 2, 1985);RuiBelomissesHost(Kluyveromyces hosts) (U.S. Pat.No. 4,943,529; Fleer et al., Bio / Technology, 9: 968-975 (1991)), for exampleKluyveromycesEasyTea(K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737 [1983]),KluyveromycesFragilis (ATCC 12,424),KluyveromycesBulgaricus (K. bulgaricus) (ATCC 16,045),KluyveromycesWikeramii (K. wickeramii) (ATCC 24,178),KluyveromycesWaltii (K. waltii) (ATCC 56,500),KluyveromycesK. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio / Technology, 8: 135 (1990)),KluyveromycesTemotolerance (K. thermotolerans) andKluyveromycesC. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]); Candida; reesia) (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]); schwanniomyces, for example, occidentalis. ) (EP 394,538 published Oct. 31, 1990); and filamentous fungi, such as neurospora, penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 published Jan. 10, 1991); For example, pseudonested koji fungi (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) and black mold (Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]). Preferred methylotropic yeasts here include, but are not limited to, Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, and Rhodotorula. Includes yeast capable of growing in methanol selected from the genus. A list of specific species that exemplify this class of yeast is given in C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
  A host cell suitable for the expression of a nucleic acid encoding glycosylated PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. Derived from Examples of invertebrate cells include Drosophila S2 and Spod.PuteInsect cells such as Spodoptera Sf9 and plant cells are included. Examples of useful mammalian host cell lines include Chinese Hamster Ovary (CHO) and COS cells. More detailed examples are monkey kidney CV1 strain transformed by SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); human embryonic kidney strain (293 or 293 cells subcloned for growth in suspension culture, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); Chinese hamster ovary cells / -DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)); mouse Sertoli cells (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); human lung cells (W138, ATCC CCL 75); human hepatocytes (Hep G2, HB 8065); and mouse breast tumor cells (MMT 060562, ATCC CCL51). The selection of an appropriate host cell is within the skill of the art.
      [0063]
iii. Selection and use of replicable vectors
  The nucleic acid (eg, cDNA or genomic DNA) encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 is cloned (DNA or genomic DNA). Inserted into a replicable vector for amplification) or expression. Various vectors are publicly available. The vector can be, for example, in the form of a plasmid, cosmid, virus particle, or phage. The appropriate nucleic acid sequence is inserted into the vector by various techniques. Generally, DNA is inserted into an appropriate restriction endonuclease site using techniques well known in the art. Vector components generally include, but are not limited to, one or more signal sequences, an origin of replication, one or more marker genes, enhancer elements, promoters, and Including termination sequence. Construction of suitable vectors containing one or more of these components employs standard ligation techniques known to those of skill in the art.
  PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 are not only produced directly by recombinant techniques, but also signal sequences or matures. Fusion with a heterologous polypeptide, which is another polypeptide having a specific cleavage site at the N-terminus of the protein or polypeptidePolyIt is also produced as a peptide. In general, the signal sequence is a component of the vector, or the code for PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO888 inserted into the vector. Part of the DNA to be converted. The signal sequence may be, for example, a prokaryotic signal sequence selected from the group of alkaline phosphatase, penicillinase, lpp or a thermostable enterotoxin II leader. For yeast secretion, the signal sequence includes a yeast invertase leader, an alpha factor leader (including Saccharomyces and Kluyveromyces alpha factor leaders, the latter described in U.S. Patent No. 5,010,182). Or acid phosphAIt can be a Tase leader, a C. albicans glucoamylase leader (EP362179 issued April 4, 1990), or a signal described in WO 90/13646 published November 15, 1990. For expression in mammalian cells, mammalian signal sequences may be used for signal secretion from the same or related secreted polypeptides as well as for direct secretion of proteins such as viral secretory leaders.
      [0064]
  Both expression and cloning vectors contain a nucleic acid sequence that enables the vector to replicate in one or more selected host cells. Such sequences are well known for many bacteria, yeasts and viruses. The origin of replication from plasmid pBR322 is suitable for most Gram-negative bacteria, the 2μ plasmid origin is suitable for yeast, and various viral origins (SV40, polyoma, adenovirus, VSV or BPV) are mammalian. Useful for cloning vectors in animal cells.
  Expression and cloning vectors typically contain a selection gene, also termed a selectable marker. Typical selection genes are (a) conferring resistance to antibiotics or other toxins such as ampicillin, neomycin, methotrexate or tetracycline, (b) compensating for auxotrophic deficiencies, or (c) encoding the gene for e.g. It encodes proteins that supply important nutrients not available from complex media, such as D-alanine racemase.
  Examples of selectable markers suitable for mammalian cells are PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, such as DHFR or thymidine kinase. Alternatively, a cell component capable of taking up the nucleic acid encoding PRO887 can be identified. A suitable host cell when using wild-type DHFR is DHFR activity prepared and grown as described by Urlaub et al. In Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980). Defective CHO cell line. A suitable selection gene for use in yeast is the trp1 gene present in the yeast plasmid YRp7. Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10: 157 (1980). The trp1 gene provides a selectable marker for a mutant strain of yeast lacking the ability to grow in tryptophan, for example, ATCC No. 44076 or PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977).
  Expression and cloning vectors are generally capable of acting on a nucleic acid sequence encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. And a promoter that controls mRNA synthesis. Suitable promoters that are recognized by a variety of possible host cells are known. Suitable promoters for use in prokaryotic hosts include the β-lactamase and lactose promoter systems [Chang et al., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)], alkaline phosphatase, tryptophan (trp) promoter system [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980); EP] 36,776], and hybrid promoters such as the tac promoter [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)]. Promoters used in bacterial systems also may be operable to bind to a DNA encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887. It has a Shine-Dalgarno (SD) sequence.
  Examples of suitable promoter sequences for use with yeast hosts include 3-phosphoglycerate kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)) or other glycolytic enzymes (Hess et al., J. Am. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry, 17: 4900 (1978)), For example, enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphate isomerase, 3-phosphoglycerate mutase, pyruvate kinase, trioseric acid Includes isomerase, phosphoglucose isomerase, and glucokinase.
  Other yeast promoters include inducible promoters that have the additional effect of regulating transcription by growth conditions, such as alcohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, acid phosphatase, degradative enzymes associated with nitrogen metabolism, metallothionein, and glycerol. There are promoter regions for aldehyde-3-phosphate dehydrogenase and enzymes that govern maltose and galactose utilization. Vectors and promoters suitably used for expression in yeast are further described in EP 73,657.
      [0065]
  Transcription of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 nucleic acid from a vector in a mammalian host cell is, for example, a polyoma virus. Infectious epithelioma virus (UK 2,211,504 published July 5, 1989), adenovirus (eg, adenovirus 2), bovine papilloma virus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, retrovirus, hepatitis B virus and simian virus 40 ( Promoters derived from the genome of a virus such as SV40), heterologous mammalian promoters such as actin or immunoglobulin promoters, and heat shock promoters Is controlled as long as such a promoter is compatible with the host cell system.
  Transcription of the DNA encoding the desired PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 by higher eukaryotes is: It can be enhanced by inserting an enhancer sequence therein. Enhancers, usually about 10 to 300 base pairs, are cis-acting elements of DNA that act on a promoter to enhance its transcription. Many enhancer sequences from mammalian genes are currently known (globin, elastase, albumin, α-fetoprotein and insulin). Typically, however, one will use an enhancer from a eukaryotic cell virus. Examples include the SV40 enhancer on the late side of the replication origin (100-270 base pairs), the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer on the late side of the replication origin, and adenovirus enhancers. The enhancer may be at position 5 ′ or 3 ′ in the vector encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887. It can be spliced, but is preferably located 5 'to the promoter.
  Expression vectors used in eukaryotic host cells (nucleated cells derived from yeast, fungi, insects, plants, animals, humans, or other multicellular organisms) contain sequences necessary for terminating transcription and stabilizing mRNA. Including. Such sequences can be obtained from the usually 5 'and sometimes 3' untranslated regions of eukaryotic or viral DNA or cDNA. These regions are the polyadenylation of the non-translated fragment of the mRNA encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. Includes transcribed nucleotide segments.
  Other suitable for adapting the synthesis of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 in recombinant vertebrate cell culture. Methods, vectors and host cells are described in Gething et al., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281: 40-46 (1979); EP 117,060; and EP 117,058.
      [0066]
iv. Gene amplification / expression detection
  Amplification and / or expression of the gene was performed using a probe appropriately labeled based on the sequence provided herein, for example, by a conventional Southern blot method, a Northern blot method for quantifying mRNA transcription (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)), dot blotting (DNA analysis), or in situ hybridization. Alternatively, an antibody capable of recognizing a specific duplex, including a DNA duplex, an RNA duplex, a DNA-RNA hybrid duplex, or a DNA-protein duplex, can also be used. The antibody can then be labeled and the assay performed, wherein the duplex is bound to the surface, such that the antibody bound to the duplex at the time of formation at the surface of the duplex Presence can be detected.
  Alternatively, gene expression can be measured by immunological methods that directly quantify gene product expression, such as immunohistochemical staining of cells or tissue sections and cell culture or body fluid assays. Antibodies useful for immunohistochemical staining and / or assay of a sample solution may be monoclonal or polyclonal, and may be prepared in any mammal. Conveniently, the antibody is against or provided for the native sequence PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide. Or encodes PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887. It can be prepared against exogenous sequences that fuse to DNA and encode specific antibody epitopes.
      [0067]
v. Purification of polypeptides
  The forms of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide can be recovered from the culture medium or from a lysate of the host cells. . If membrane-bound, a suitable wash solution (eg, Triton-X^TM100) or detached from the membrane using enzymatic cleavage. The cells used for expression of a nucleic acid encoding a PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide are freeze-thawed. The disruption can be by various chemical or physical means such as sonication, mechanical disruption, or cell lysing agent. It is desirable to purify PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide from a recombinant cell protein or polypeptide. Purified by the following procedure, which is an example of a suitable purification procedure: fractionation on an ion exchange column; ethanol precipitation; reverse phase HPLC; chromatography on silica or a cation exchange resin, such as DEAE; chromatofocusing; PAGE; ammonium sulfate precipitation; gel filtration using, for example, Sephadex G-75; Protein A Sepharose column to remove contaminants such as IgG; and PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, Metal chelation columns for binding epitope-tagged forms of PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 polypeptides. Many protein purification methods known in the art and described in, for example, Deutcher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, (Springer-Verlag, New York 1982) can be used. it can. The purification process chosen can be, for example, the production method used and the particular PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO885 specifically produced. Depends on the nature of
      [0068]
D. Use of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide.
i. Assay for cardiovascular, endothelial and angiogenic activities
  A variety of assays can be used to test the cardiovascular, endothelial and angiogenic activities of the polypeptides described herein.
  Assays for testing endothelin antagonist activity disclosed in U.S. Patent No. 5,773,414 include rat ventricular binding assays that test the ability of polypeptides to inhibit iodinated endothelin-I binding in receptor assays, rabbit renal artery smooth muscle cells An endothelin receptor binding assay that tests the intact cell binding of radiolabeled endothelin-I, wherein the functional activity is measured in Rat-I cells by measuring the intracellular levels of a second messenger. Inositol phosphate accumulation assay measured, in vivo using endothelium of male New Zealand rabbitsToro(Isolated tube) studyToIn addition, the added compound in the cultured vascular smooth muscleAtEndothelin-stimulated arachidonic acidReleaseArachidonic acid release assay measures ability to reduceAnd maleIn vivo using SD ratsBoResearch included.
  Assays for tissue forming activity include, but are not limited to, WO95 / 16035 (bones, cartilage, tendons); WO95 / 05846 (nerves, neurons), and WO91 / 07491 (skin, endothelium) Things included.
  Assays for wound healing activity include, for example, Winter, Epidermal Wound Healing, Maibach, HI and Rovee, DT, modified in the article of Eaglstein and Mertz, J. Invest. Dermatol., 71: 382-384 (1978). , Eds. (Year Book Medical Publishers. Inc., Chicago), pp71-112.
  Endothelin B₁(ETB₁) A screening assay for test molecules related to a PRO polypeptide that binds to a receptor polypeptide and modulates signal transduction activity may be performed using endothelin B as described in US Pat. No. 5,773,223.₁Providing host cells transformed with DNA encoding a receptor polypeptide, exposing the cells to a test drug candidate, and administering endothelin B₁Measure receptor signal conversion activityIncluding.
  There are several cardiac hypertrophy assays. In vitro assays include induction of adult rat cardiac myocyte proliferation. In this assay, ventricular myocytes were analyzed according to Piper et al., "Adult ventricular rat heart muscle cells", Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research. HM Piper. Ed (Berlin: Springer-Verlag, 1990), pp. 36-60. Isolated from single (male SD) rats essentially according to a modification of the procedure described in detail. This procedure allows the isolation of growing ventricular myocytes and long-term culture of rod phenotype cells. Phenylephrine and Prostaglandin F_2α(PGF_2α) Have been shown to induce a metastatic response in these growing cells. Subsequently, PGF by various potential inhibitors of cardiac hypertrophy_2αOr PGF_2αMyocytes induced by analogs (e.g., fluprostenol) and phenylephrineTransmissibleTest suppression.
      [0069]
  One example of an in vivo assay is to test for inhibition of fluprostenol-induced cardiac hypertrophy in vivo. This pharmacological model is based on fluprostenol (PGF_2αTo test the ability of the PRO polypeptide to inhibit cardiac hypertrophy induced in rats (eg, male Wistar or SD) by subcutaneous injection of an agonist analog. In rats with pathological cardiac hypertrophy induced by myocardial infarction, PGF_2αIs known to rise chronically to detectable levels. Lai et al., Am. J. Physiol. (Heart Circ. Physiol.), 271: H2197-H2208 (1996). Thus, factors that can inhibit the effects of fluprostenol on myocardial growth in vivo may be useful in treating cardiac hypertrophy. The effect of PRO polypeptide on cardiac hypertrophy isKeiteHeart, ventricle and left ventricle compared to fluprostenol-treated rats withoutWeight ofIt is determined by measuring (normalized by body weight).
  Another example of an in vivo assay is the pressure overload cardiac hypertrophy assay. It is common in in vivo tests to induce pressure-loaded cardiac hypertrophy due to contraction of the abdominal aorta in test animals. In a typical protocol, rats (eg, male Wistar or SD) are anesthetized and the abdominal aorta of each rat is constricted to just below the diaphragm. Beznak M., Can. J. Biochem. Physiol., 33: 985-94 (1955). The aorta is exposed by surgical incision and a short thick needle is placed next to the tube. The aorta is ligated with a silk thread around the needle to shrink and is immediately removed, reducing the lumen of the aorta to the diameter of the needle. This approach is described, for example, in Rossi et al., Am. Heart J., 124: 700-709 (1992) and O'Rourke and Reibel, P.S.E.M.B., 200: 95-100 (1992).
  In yet another in vivo assay, the effects on cardiac hypertrophy followed by experimentally induced myocardial infarction (MI) are measured. In rats, acute MI is induced by ligation of the left coronary artery, which is further confirmed by an electrocardiographic test. A sham-operated group of animals is prepared as a control animal. Early data showed that cardiac hypertrophy was present in the group with MI, revealing an 18% increase in heart weight over body weight. Lai et al., Supra. Treating these animals with a candidate blocker of cardiac hypertrophy, such as a PRO polypeptide, provides valuable information about the therapeutic potential of the tested candidate drug. A further assay test for induction of cardiac hypertrophy using SD rats is disclosed in US Pat. No. 5,773,415.
      [0070]
  To further understand the role of the genes identified herein in tumor pathogenesis and progression in cancer, and to test the efficacy of therapeutic candidates including native PRO polypeptide antibodies and other antagonists, such as small molecule antagonists A variety of well-known animal models can be used. The in vivo nature of such a model isAtEspecially the reactionMake predictive. Animal models for tumors and cancers (breast, colon, prostate, lung, etc.) include non-recombinant and recombinant (transgenic) animals. Non-recombinant animal models include, for example, rodents, eg, murine models. Such models use standard techniques, such as subcutaneous injection, tail vein injection, spleen transplant, peritoneal transplant, subrenal transplant, or orthopin transplant, for example, colon cancer cells transplanted into colon tissue, It can be made by transferring tumor cells to syngeneic mice. See, for example, PCT Publication No. WO 97/33551 published September 18, 1997. Probably the most frequently used animal species for studying oncogenes is immunodeficient mice, especially nude mice. The finding that nude mice with thymic stimulation / dysplasia successfully act as hosts for human tumor xenografts has led to widespread use for this purpose. Autosomal recessive nu genes include, for example, ASW, A / He, BALB / c, B10.LP, C17, CH3, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I / st, NC, NFR, NFS, NFS / N, It is introduced into a very large number of distinctly related nude mice, including NZB, NZC, NZW, P, RIII and SJL. In addition, a wide range of other animals that have inherited the immunological deficiency besides nude mice are bred and used as recipients for tumor xenografts. For further details, see The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven and B. Winograd. Eds. (CRC Press, Inc., 1991).
  Cells introduced into such animals may be transformed into well-known tumor / cancer cells, such as any of the tumor cell lines listed above, eg, the B104-1 cell line (stable NIH transfected with the neu proto-oncogene). Caco-2 (ATCC HTB-37); or from a moderately differentiated grade II human colon adenocarcinoma cell line, HT-29 (ATCC HTB-38), or from tumors and cancersInvitationIt can be conducted. A sample of tumor or cancer cells,Can be obtained from patients undergoing surgery,Standard conditions including freezing and storage in liquid nitrogenUse. Karmali et al., Br. J. Cancer. 48: 689-696 (1983).
      [0071]
  Tumor cells can be introduced into animals such as nude mice by various procedures. The subcutaneous (s.c.) space of mice is very suitable for tumor implantation. Tumors can also be implanted as a solid block, eg, a needle biopsy, eg, using a trocar, or a cell suspension. A tumor block fragment of a size suitable for solid block or trocar implantation is introduced into the subcutaneous space. Cell suspensions are prepared fresh from primary tumor or stable tumor cell lines and injected subcutaneously. Also, tumor cells can be injected as a subcutaneous implant. In this position, the implant is applied between the lower part of the dermal connective tissue and the subcutaneous tissue.
  Animal models of breast cancer have been described, for example, in rat neuroblasts (from the originally isolated neu oncogene) as described in Drebin et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83: 9129-9133 (1986). Neu-transformed NIH-3T3 cells) or by transplanting the cells into nude mice.
  Similarly, animal models of colon cancer can be made by passing colon cancer cells through animals, such as nude mice, and allowing these animals to develop tumors. Orthotopic transplantation models of human colon cancer in nude mice are described, for example, by Wang et al., Cancer Research, 54: 4726-4728 (1994) and Too et al., Cancer Research, 55: 681-684 (1995). This model is sold by AntiCancer, Inc., (San Diego, California), a so-called "METAMOUSE^TM"based on.
  Tumors arising in the animal are removed and can be cultured in vitro. The cells from the in vitro culture are then passaged into animals. Such tumors may be useful for further testing or drug screening purposes. Alternatively, tumors obtained by passage can be isolated, and RNA from cells before passage and cells isolated after one or more passage stages can be analyzed for differential expression of the gene of interest. Is done. Such passaging techniques can be performed on any well-known tumor or cancer cell line.
  For example, Meth A, CMS4, CMS5, CMS21 and WEHI-164 chemically induce fibrosarcoma in BALB / c female mice (DeLeo et al., J. Exp. Med., 146: 720 (1977)) and produce various A highly controlled model system for studying the antitumor activity of drugs is provided. Palladino et al., J. Immunol., 138: 4023-4032 (1987). Briefly, tumor cells are grown in vitro in cell culture. Before injecting animals, the cell lines are washed and 10x10⁶From 10x10⁷Suspend in buffer at a cell density of cells / ml. The animals are then injected subcutaneously with 10 to 100 μl of the cell suspension and tumors appear in 1 to 3 weeks.
  In addition, one of the most studied study tumors, Lewis Lung (3LL) carcinoma of mice, can be used as a study tumor model. The efficacy of this tumor model has been correlated with favorable effects in human patients diagnosed with small cell carcinoma of the lung (SCCL). The tumor can be introduced into diseased mice or normal mice by injecting tumor fragments from cells being cultured. Zupi et al., Br. J. Cancer, 41: suppl. 4.30 (1980). Evidence was shown that the tumors started with a single cell injection and that the infected cells were living at a much higher rate. For further information on this tumor model, see Zacharski, Haemostasis, 16: 300-320 (1986).
      [0072]
  One way to assess the efficacy of a test compound in an animal model having a transplanted tumor is to measure the size of the tumor before or after treatment. Traditionally, the size of a transplanted tumor is measured with a two or three dimensional slide caliper. Measurements limited to two dimensions do not accurately reflect the size of the tumor; thus, usually use mathematical formulas and convert to corresponding quantities. However, the measurement of tumor size is very inaccurate. The therapeutic effect of the candidate drug can be described as better if treatment-induced growth is delayed and certain growth is delayed. Another important variable in describing tumor growth is the time at which tumor volume doubles. Also reported by computer programs for calculating and describing tumor growth, such as Rygaard and Spang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals. Wu and Sheng. Eds. (Basel. 1989), p. 301. You can get the program that is. However, it should be noted that post-treatment necrosis and inflammatory responses can actually result, at least initially, in an increase in tumor size. Therefore, these changes need to be carefully monitored using a combination of morphometry and flow cytometry analysis.
  In addition, recombinant (transgenic) animal models use standard techniques to create transgenic animals by introducing the coding site of the PRO gene identified herein into the genome of the animal of interest. Can be processed. Animals that can serve as targets for transgenic manipulation include, but are not limited to, mice, rats, rabbits, guinea pigs, sheep, goats, pigs, and non-human primates, such as baboons, chimpanzees and monkeys. Techniques well known in the art for introducing transgenes into such animals include microinjection of the pronucleus (US Pat. No. 4,873,191); retrovirus-mediated gene transfer into the embryo (eg, Van der Putten). Nat. Acad. Sci. USA, 82: 6148-615 (1985)); Targeting genes in embryonic stem cells (Thompson et al., Cell, 56: 312-321 (1989)); Electroporation of embryos (Lo, Mol. Cell. Biol., 3: 1803-1814 (1983)); and sperm-mediated gene transfer. Lavitrano et al., Cell, 57: 717-73 (1989). See, for example, US Pat. No. 4,736,866 for a review.
  For the purposes of the present invention, transgenic animals include those that carry the transgene in only some of their cells ("mosaic animals"). The transgene can be integrated as a single transgene or in a concatemer, for example, tandem head-to-head or head-to-tail. Alternatively, the selective introduction of a transgene into a particular cell line is possible, for example, following the technique of Lasko et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89: 6232-636 (1992).
  Transgene expression in the transgenic animal can be monitored by conventional techniques. For example, Southern blot analysis or PCR amplification can be used to demonstrate transgene integration. The mRNA expression levels can then be analyzed using techniques such as in situ hybridization, Northern blot analysis, PCR or immunocytochemistry. Animals are further tested for signs of tumor or cancer progression.
      [0073]
  Also, the homologous recombination between the altered genomic DNA encoding the PRO polypeptide introduced into the embryonic cells of the animal and the endogenous gene encoding the PRO polypeptide results in the PRO polypeptide identified herein. "Knockout" animals can be constructed that have a defective or altered gene that encodes the peptide. For example, cDNA encoding a particular PRO polypeptide can be used for cloning genomic DNA encoding the polypeptide according to established techniques. A portion of the genomic DNA encoding a particular PRO polypeptide can be deleted or replaced with another gene, such as a gene encoding a selectable marker used to monitor integration. Typically, the vector contains several kilobases of unchanged flanking DNA (both 5 'and 3' ends). See, for example, Thomas and Capecchi, Cell, 51: 503 (1987) for homologous recombination vectors. The vector is introduced (eg, by electroporation) into embryonic stem cells, and cells in which the introduced DNA has been homologously recombined with endogenous DNA are selected. See, for example, Li et al., Cell, 69: 915 (1992). The selected cells are then injected into the blastocyst of an animal (eg, a mouse or rat) to form an assembled chimera. See, for example, Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152. The chimeric embryo is then implanted into a suitable pseudopregnant female nanny to create "knock-out" animals at intervals. Progeny that have homologously recombined DNA in embryonic cells are identified by standard techniques and can be used to propagate animals in which all of the animal's cells contain homologously recombined DNA. . Knockout animals are characterized by certain pathological conditions due to the absence of the PRO polypeptide and the ability to protect against the development of that pathological condition.
  Antibodies that specifically bind to the PRO polypeptides identified herein, and the effects of other candidate drugs, can be further tested in the treatment of spontaneous animal tumors. A suitable target for this study is feline oral squamous cell carcinoma (SCC). Feline oral SCC is highly invasive, and this malignancy is considered to be the most common oral malignancy in cats, with more than 60% of oral tumors being measured to be repeated in this species. It rarely metastasizes to distant sites, but the low incidence of metastasis is reflected in the short survival of cats with this tumor. These tumors cannot be usually treated by surgery, mainly due to the anatomy of the feline oral cavity. At present, there is no effective treatment for this tumor. Prior to entering this study, each cat is a complete biopsy for clinical testing and is scanned by computed tomography (CT). Cats diagnosed with sublingual oral squamous cell tumors are excluded from this study. The tongue becomes paralyzed as a result of such a tumor, and even if the tumor dies from the treatment, the animal cannot feed on its own. Each cat is treated repeatedly for an extended period of time. During the treatment period, photographs of tumors are taken daily and subsequently rechecked. After treatment, each cat undergoes another CT scan. CT scans and chest radiographs will be evaluated every 8 weeks thereafter. The data were evaluated as different in viability, reactivity and toxicity relative to the control group. A positive response requires evidence of tumor regression, preferably with improved quality of survival and / or increased lifespan.
  In addition, dogs, cats and baboons and other spontaneous animal tumors such as fibrosarcoma, adenocarcinoma, lymphoma, chondroma, or leiomyosarcoma can also be tested. Of course, dog and cat breast adenocarcinoma are the preferred models, and their appearance and properties are very similar to those of humans. However, the use of this model is limited by the incidence of such tumors in animals.
  Other in vitro and in vivo cardiovascular, endothelial and angiogenesis tests well known in the art are also suitable herein.
      [0074]
    ii. Tissue distribution
  Further studies, such as measuring mRNA expression in various human tissues, can now prove the results of cardiovascular, endothelial and angiogenic assays.
  As described above, gene amplification and / or expression in various tissues can be performed using appropriately labeled probes based on the sequences provided herein, eg, conventional Southern blotting, quantifying mRNA transcripts. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)), dot blotting (DNA analysis), or in situ hybridization. Alternatively, an antibody capable of recognizing a specific duplex, including a DNA duplex, an RNA duplex, and a DNA-RNA hybrid duplex or a DNA-protein duplex, can also be used.
  Alternatively, gene expression in various tissues can be measured by immunological methods that directly quantify the expression of the gene product, such as immunohistochemical staining of tissue sections and cell culture or body fluid assays. Antibodies useful for immunohistochemical staining and / or assay of a sample solution may be monoclonal or polyclonal, and may be prepared in any mammal. Conveniently, the antibody is directed against the native sequence PRO polypeptide or to a synthetic peptide based on the DNA sequences provided herein, or to an exogenous sequence fused to the PRODNA and encoding a specific antibody epitope. Can be prepared for General techniques for antibody production, and specific protocols for in situ-hybridization are provided below.
      [0075]
    iii. Antibody binding studies
  The results of cardiovascular, endothelial and angiogenesis studies testing the ability of anti-antibodies to inhibit the effects of the PRO polypeptide on endothelial cells or other cells used in cardiovascular, endothelial and angiogenesis assays show that It can be proved by studying gender. Examples of antibodies include polyclonal, monoclonal, humanized, bispecific and heteroconjugate antibodies, the preparation of which is described below.
  Antibody binding studies can be performed with any of the well-known assay methods, such as competitive binding assays, direct and indirect sandwich assays, and immunoprecipitation assays. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, (CRC Press, Inc. 1987) pp. 147-158.
  Competitive binding assays rely on the ability of a labeled standard to compete with a test sample for binding to a finite amount of antibody. The amount of target protein in the test sample is inversely proportional to the amount of standard to which the antibody binds. To facilitate determination of the amount of bound standard, the antibody is preferably insolubilized before and after competition, and analytes and standards that bind to the antibody are conveniently separated from remaining unbound standards and analytes. I do.
  Sandwich assays use two antibodies capable of binding to different immunogen moieties, or epitopes, or proteins to be detected. In a sandwich assay, the test sample to be analyzed binds to a first antibody immobilized on a solid support, after which a second antibody binds to the analyte, thus forming an insoluble three-site complex. Is done. See, for example, U.S. Patent No. 4,376,100. The second antibody is a detectable moiety, which may itself be labeled (direct sandwich assay) or measured using an anti-immunoglobulin antibody labeled with a detectable moiety (indirect sandwich). Assay). For example, one type of sandwich assay is an ELISA assay, where the detectable moiety is an enzyme.
  In immunohistochemistry, a tissue sample may be fresh or frozen, embedded in paraffin, or fixed with a preservative, for example, formalin.
      [0076]
    iv. Cell-based tumor assays
  Cell-based assays and animal models for cardiovascular, endothelial and angiogenic diseases, such as tumors, have now demonstrated the discovery of cardiovascular, endothelial and angiogenic assays, and have further identified the genes identified herein as Can be used to understand the relationship between cardiovascular, endothelial and angiogenic cell growth progression and pathogenesis. The role of the gene products identified herein in undesired cardiovascular, endothelial and angiogenic cell growth, such as tumor progression and pathogenesis, uses cells or cell lines identified as stimulated or inhibited by the PRO polypeptide. Can be tested. Such cells include, for example, those described in the Examples below.
  In a different approach, cells of known cell types associated with certain cardiovascular, endothelial and angiogenic diseases are transfected with cDNAs, and these cDNAs induce excessive growth or inhibit growth Analyze ability. If the cardiovascular, endothelial and angiogenic disease is cancer, suitable tumor cells include, for example, a stable tumor cell line, such as the B104-1-1 cell line (stable NIH-3T3 transfected with the neu proto-oncogene). Cell lines) and ras-transfected NIH-3T3 cells, which can be transfected with the desired gene and monitored for tumorigenic growth. Then, using such transfected cell lines, the poly- or monoclonal antibody or antibody composition exerts a cytostatic or cytotoxic activity in the growth of the transfected cells, or an antibody-dependent cellular cell. The ability to inhibit tumorigenic cell growth by mediating toxicity (ADCC) is tested. In addition, cells transfected with the coding sequences of the genes identified herein can be used to identify candidate drugs for the treatment of cardiovascular, endothelial and angiogenic diseases such as cancer.
  In addition, primary media obtained from tumors of transgenic animals (described above) can be used for cell-based assays, but stable cell lines are preferred. Techniques for deriving certain cell lines from transgenic animals are well known in the art. See, for example, Small et al., Mol. Cell. Biol., 5: 642-648 (1985).
      [0077]
v. Gene therapy
  hereofPRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide, and a polypeptidyl agonist and antagonist areSuch polypeptideofAccording to the invention by in vivo expressionCan be used,Often called gene therapy.
  There are two main methods for introducing nucleic acids (optionally contained in a vector) into a patient's cells: in vivo and ex vivo. For in vivo delivery, the nucleic acid typically requires a PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 polypeptide. That is, the synthesis site for PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides, if known, are PRO179, PRO179, and PRO287 , PRO844, PRO846, PRO1760, PRO 05, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, the PRO882, PRO885 or PRO887 site biological activity of the polypeptide is required (e.g. wound), it is injected directly into the patient. In ex vivo treatment, the patient's cells are removed, the nucleic acid is introduced into these isolated cells, and the modified cells are administered to the patient, either directly or encapsulated, for example, in a porous membrane embedded in the patient (US Patents 4,892,538 and 5,283,187). There are various techniques available for introducing nucleic acids into living cells. These techniques depend on whether the nucleic acid is transferred into cultured cells in vitro or into a host of interest in vivo. Techniques suitable for transferring nucleic acids into mammalian cells in vitro include liposomes, electroporation, microinjection, transduction, cell fusion, DEAE-dextran, calcium phosphate precipitation, and the like. Transduction involves a replication defect, binding of the recombinant virus (preferably retrovirus) particle to a cell receptor, and then introducing the nucleic acid contained in the particle into a cell. Vectors commonly used for ex vivo delivery of genes are retroviruses.
      [0078]
  Currently preferred in vivo nucleic acid transfer techniques are viral or non-viral vectors (adenovirus, lentivirus, herpes simplex I virus, or adeno-associated virus (AAV)), and lipid-based systems (useful for lipid-mediated transfer of genes). Lipids include, for example, DOTMA, DOPE, and DC-Chol; see, for example, transfection with Tonkinson et al., Cancer Investigation, 14 (1): 54-65 (1996). The most preferred vector for use in gene therapy is a virus, most preferably an adenovirus, AAV, lentivirus, or retrovirus. Viral vectors, such as retroviral vectors, contain at least one transcription promoter / enhancer or locator, or other factor that controls gene expression by other means, such as alternative splicing, nuclear RNA export, or messenger post-translational modification. including. In addition, viral vectors such as retroviral vectors include those encoding the genes encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 polypeptide. It includes a nucleic acid molecule that is operably linked thereto when transcribed in the presence and functions as a translation initiation sequence. Such vector constructs also include a suitable packaging signal for the virus used, the terminal repeat (LTR) or a portion thereof, and positive and negative strand primer binding sites (if they are not already present in the viral vector). . In addition, these vectors are typically prepared from the host cell in which they are placed, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or It contains a signal sequence that secretes the PRO887 polypeptide. Preferably, the signal sequence for this purpose is a mammalian signal sequence, most preferably PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. Natural signal sequence for a polypeptide. In some cases, the vector construct also includes a signal that directs polyadenylation and one or more restriction sites and a translation termination sequence. By way of example, such vectors typically include a 5 'LTR, a tRNA binding site, a packaging signal, a start point for second strand DNA synthesis, and a 3' LTR or a portion thereof. Other non-viral vectors can also be used, such as cationic lipids, polylysine, and dendrimers.
  In some situations, it may be desirable to provide the nucleic acid source with a reagent that targets the target cell, such as an antibody specific for a cell surface membrane protein or a target cell, a ligand for a receptor on the target cell, and the like. When liposomes are used, proteins that bind to cell surface membrane proteins with endocytosis are used for targeting and / or promotion of uptake, such as capsid proteins for specific cell types or fragments thereof, Antibodies to proteins that undergo internalization during cycling, and proteins that target intracellular localization and improve intracellular half-life. Techniques for receptor-mediated endocytosis are described, for example, in Wu et al., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987) and Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414 (1990). )It is described in. For a review of currently known gene labeling and gene therapy protocols see Anderson et al., Science, 256: 808-813 (1992). See also WO 93/25673 and the references cited therein.
  Suitable gene therapy and methods for making retroviral particles and structural proteins are found in US Patent No. 5,681,746.
      [0079]
vi. Uses of genes as diagnostics
  The present invention also relates to the use of a gene encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide as a diagnostic method. . PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptideSuddenlyMutations cause tumorsRiuTherefore, the detection of the mutated forms of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides is based on FormationofDiseases or diseases of cardiovascular, endothelial and angiogenic, eg tumorsAgainstFeelingReceivingEnables gender diagnosis.
  Human PRO179, human PRO238, human PRO364, human PRO844, human PRO846, human PRO1760, human PRO205, human PRO321, human PRO333, human PRO840, human PRO877, human PRO878, human PRO879, human PRO882, human PRO885 or human PRO887 polypeptide. Individuals carrying variants in the encoding gene can have their DNA levels detected by various techniques. Diagnostic nucleic acids can be obtained from cells of a patient, such as blood, urine, saliva, tissue biopsies, and necropsy material. Genomic DNA can be amplified enzymatically using PCR before analysis (Saiki et al., Nature, 324: 163-166 (1986)) or used directly for detection. RNA or cDNA can be used for the same purpose. By way of example, a PCR primer complementary to a nucleic acid encoding a PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 polypeptide is a PR9 with a PR9 primer that is a PR9 primer. , PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide variants. For example, deletions and insertions can be detected by a change in size of the amplified product relative to the normal genotype. Point mutations are radioactively labeled PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide. RNA or a radiolabeled antisense DNA sequence encoding a PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide. On the other hand, it can be identified by hybridizing the amplified DNA. Preferred matching sequences can be distinguished from non-matching duplexes by differences in RNase A digestion or melting temperature.
  Genetic testing based on DNA sequence differences is accomplished by detecting changes in electrophoretic mobility of DNA fragments in gels, with or without denaturing agents. Small sequence deletions and insertions can be visualized by high resolution gel electrophoresis. DNA fragments of different sequences are distinguished in denaturing formamidine gradient gels, and migration of different DNA fragments is inhibited at different locations in the gel due to specific lysis or partial lysis temperatures. For example, Myers et al., Science, 230: 1242 (1985).
  Sequence changes at specific positions may also be revealed by nuclease protection assays, such as RNase and SI protection, or chemical cleavage methods, such as Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4397-4401 (1985). Become.
  Thus, deletion of a particular DNA sequence can result from hybridization, RNase protection, chemical cleavage, direct DNA sequencing, or the use of restriction enzymes, such as restriction fragment length polymorphism (RFLP), and Southern blots of genomic DNA. This can be achieved by a method.
      [0080]
    vii. Uses for PRO polypeptide level detection
  In addition to more convenient gel electrophoresis and DNA sequencing, mutations can also be detected by in situ analysis.
  Expression of a nucleic acid encoding a PRO polypeptide has been linked to vascular disease associated with tumorigenesis, or neovascularization. When the PRO polypeptide has a signal sequence, mRNA is less expressed in smooth muscle cells but highly expressed in endothelial cells, indicating that the PRO polypeptide is present in serum. Is shown. Accordingly, anti-PRO polypeptide antibodies may be used in the diagnosis of such diseases, as this altered level of PRO polypeptide is indicative of a vascular disease or neovascularization associated with tumorigenesis. can do.
  A competitive assay in which an antibody specific for the PRO polypeptide is mounted on a solid support and the sample derived from the labeled PRO polypeptide and host is passed through the solid support can also be used. The amount of the detected level correlates with the amount of the PRO polypeptide in the sample.
      [0081]
    viii. Chromosome mapping
  Also, the sequences of the present invention are important in chromosome identification. The sequence can be specifically targeted and hybridized to a particular location on the individual's human chromosome. In addition, there is a current need to identify specific sites on the chromosome. Several chromosome marking reagents based on actual sequence data (repetitive polymorphisms) are currently available for marking chromosomal locations. The chromosomal DNA mapping of the present invention is an important first step in correlating sequences with disease-related genes.
  Briefly, sequences can be mapped to chromosomes by preparing PCR primers (preferably 15-25 base pairs) from the cDNA. Using computer analysis of the 3'-untranslated region, primers that are not spanned by more than one exon of genomic DNA are quickly selected, thus complicating the amplification process. These primers are then used for PCR screening of somatic cell hybrids containing the individual human chromosomes. Only those hybrids containing the human gene corresponding to the primer will generate an amplified fragment.
  PCR mapping of somatic cell hybrids is a rapid procedure for assigning specific DNA to specific chromosomes. Using similar oligonucleotide primers in the present invention, sublocalization can be achieved in a similar manner on pools of large genomic clones or panels of fragments from a particular chromosome. Similarly, other mapping methods that can be used to map to the chromosome include in situ hybridization, prescreening using labeled flowsorted chromosomes, and preselection by hybridization to assemble a chromosome-specific cDNA library. Is included.
  Fluorescence in situ hybridization (FISH) of a cDNA clone to a metaphase chromosomal spread can be used to provide the exact chromosomal location in one step. This technique can be used with cDNAs as short as 500 or 600 bases; clones longer than 2000 base pairs are likely to bind to unique chromosomal locations with sufficient signal strength for simple detection. Is high. FISH includes clones that induce a gene encoding a PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide. And the longer the better, the better. For example, 2000 base pairs is good, 4000 base pairs is more preferable, and exceeding 4000 is probably not necessary to get a good result with a reasonable percentage of time. For a review of this technique, see Verma et al., Human Chromosomes; a Manual of Basic Techniques (Pergamon Press, New York. 1988).
  Once a sequence is mapped to a precise chromosomal location, the physical location of the sequence on the chromosome can be correlated with genetic map data. Such data is found, for example, in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (Johns Hopkins University Welch Medical Library). Next, the relationship between the disease and the gene mapped to the same chromosomal region is identified by a linkage assay (joint inheritance of physically adjacent genes).
  Next, it is necessary to determine the differences in the cDNA or genomic sequence between affected and unaffected individuals. If the mutation is found in some or all of the individuals affected by the disease and not in normal individuals, the mutation is likely to be the cause of the disease.
  According to the current resolution of physical mapping and gene mapping techniques, a cDNA located strictly in a chromosomal region associated with a disease is one between 50 and 500 potential causative genes (this is a 1 megabase At a mapping resolution of 1 gene per 20 kb).
      [0082]
ix. Candidate drug screening assays
  The present invention relates to a PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO885, or PRO387, PRO387, PRO887, PRO887 polypeptide. Also included are methods for screening compounds to identify those that inhibit (antagonist) the effects of PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide. Screening assays for antagonist candidate drugs include the PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 polypeptide encoded by the gene identified herein. It is designed to identify compounds that bind or complex with, or otherwise inhibit, the interaction of the encoded polypeptide with other cellular proteins. Such screening assays include those applicable to high-throughput screening of chemical libraries, making them particularly suitable for identifying small molecule drug candidates.
  This assay is performed in a variety of formats, including protein-protein binding assays, biochemical screening assays, immunoassays, and cell-based assays known in the art.
  All assays for antagonists include those where the candidate drug is encoded by the nucleic acid identified herein, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882. , PRO885 or PRO887 polypeptides in that they require contacting the two components under conditions and for sufficient time to interact.
  In a binding assay, the interaction is binding, and the complex formed is isolated or detected in the reaction mixture. In a specific embodiment, the PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 polypeptide encoded by the gene identified herein. The drug candidate is immobilized on a solid phase, eg, a microtiter plate, by covalent or non-covalent attachments. Non-covalent attachment generally involves coating the solid surface with a solution of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 polypeptide. This is achieved by Alternatively, an immobilized antibody specific to PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide to be immobilized, such as a monoclonal antibody. Can be used to adhere it to a solid surface. The assay is performed by adding a non-immobilized component, which may be labeled with a detectable label, to the immobilized component, eg, the coated surface containing the anchored component. When the reaction is completed, unreacted components are removed, for example, by washing, and the complex fixed on the solid surface is detected. If the first non-immobilized component has a detectable label, detection of the label immobilized on the surface indicates that complex formation has occurred. If the first non-immobilized component has no label, complex formation can be detected, for example, by a labeled antibody that specifically binds to the immobilized complex.
      [0083]
  The specific PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 that the candidate compound interacts with but is encoded by the gene identified herein. If not bound to a peptide, its interaction with the polypeptide can be assayed by well-known methods to detect protein-protein interactions. Such assays include traditional techniques such as cross-linking, co-immunoprecipitation, and co-purification through a gradient or chromatography column. In addition, protein-protein interactions were determined as described in Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991). Song, Nature (London) 340, 245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)). Can be monitored. Many transcriptional activators, such as yeast GAL4, consist of two physically distinct modular domains, one acting as a DNA binding domain and the other as a transcriptional activation domain. The yeast expression system described in earlier literature (commonly referred to as the "two-hybrid system") takes advantage of this property and uses two hybrid proteins, while the target protein is the DNA-binding domain of GAL4. And, on the other hand, the candidate activation protein is fused to the activation domain. Expression of the GAL1-lacZ reporter gene under the control of the GAL4 activating promoter depends on the reconstitution of GAL4 activity through protein-protein interactions. Colonies containing interacting polypeptides are detected with a chromogenic substance for β-galactosidase. A complete kit for identifying protein-protein interactions between two specific proteins using the two-hybrid technique (MATCHMAKER®) is commercially available from Clontech. This system can be extended to map the protein domains involved in a particular protein interaction, as well as to identify amino acid residues that are important for this interaction.
  The genes encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide identified herein and intracellular or extracellular components. Compounds that inhibit the interaction with can be tested as follows: Usually, the reaction mixture separates the gene product from the extracellular or intracellular components under the conditions and for the time at which the two products interact and bind. It is prepared to contain. To test the ability of a candidate compound to inhibit binding, reactions are performed in the absence and presence of the test compound. In addition, a placebo may be added to the third reaction mixture to provide a positive control. Binding (complex formation) between the test compound and the intracellular or extracellular components present in the mixture is monitored as described above. Complex formation in the control reaction but not in the reaction mixture containing the test compound indicates that the test compound inhibits the interaction of the test compound with its binding partner.
      [0084]
  If the PRO polypeptide has the ability to stimulate endothelial cell proliferation in the presence of the concomitant mitogen ConA, one example of a screening method takes advantage of this ability. In particular, in a proliferation assay, human umbilical vein endothelial cells were obtained and cultured in 96-well flat bottom culture dishes (Costar, Cambridge, Mass.) Supplemented with a suitable reaction mixture to facilitate cell growth. Con-A (Calbiochem, La Jolla, CA). After adding Con-A and the compound to be screened and incubating at 37 ° C., the culture is^3-Label with H-thymidine and collect on glass fiber filters (phD; Cambridge Technology, Watertown, MA). Average of 3 media^3-H-thymidine incorporation (cpm) is measured using a liquid scintillation counter (Beckman Instruments. Irvine. CA). Significant^3-(H) Thymidine incorporation was shown in endothelial cell stimulation.
  To assay for antagonists, the assay described above is performed, in which the PRO polypeptide may be added with the compound to be screened, and in the presence of the PRO polypeptide.^3-(H) The ability of the compound to inhibit thymidine incorporation indicates that the compound is an antagonist of the PRO polypeptide. Alternatively, antagonists may be detected by binding the PRO polypeptide and a potential antagonist with a membrane-bound PRO polypeptide receptor or recombinant receptor under conditions suitable for a competitive inhibition assay. The PRO polypeptide can be labeled, such as by radioactivity, and the number of PRO polypeptide molecules bound to the receptor can be used to determine the effectiveness of the potential antagonist. The gene encoding the receptor can be identified by a number of methods known to those skilled in the art, such as ligand panning and FACS sorting. Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1 (2): Chapter 5 (1991). Preferably, expression cloning is used, polyadenylation RNA is prepared from cells responsive to the PRO polypeptide, and a cDNA library generated from this RNA is partitioned into pools, and COS cells or other non-PRO polypeptide reactive Used for transfection of cells. Transfected cells grown on glass slides are exposed to labeled PRO polypeptide. PRO polypeptides can be labeled by a variety of means, including iodination or inclusion of a recognition site for a site-specific protein kinase. After fixation and incubation, slides are subjected to autoradiographic analysis. A positive pool is identified and the subpool is prepared and re-transfected using an interactive subpooling and rescreening step, resulting in a single clone encoding the putative receptor.
      [0085]
  As an alternative receptor identification approach, labeled PRO polypeptides can be photoaffinity bound to cell membranes or extract preparations expressing the receptor molecule. The crosslinked material is dissolved in PAGE and exposed to X-ray film. The labeled complex containing the receptor can be excited, separated into peptide fragments, and subjected to protein microsequencing. The amino acid sequence obtained from the microsequence is used to design a set of degradable oligonucleotide probes to screen a cDNA library that identifies the gene encoding the putative receptor.
  In another assay for antagonists, mammalian cells or membrane preparations expressing the receptor are incubated with the labeled PRO polypeptide in the presence of the candidate compound. The ability of the compound to promote or block this interaction is then measured.
  Compositions useful for the treatment of cardiovascular, endothelial and angiogenic diseases include, but are not limited to, antibodies, small organic and inorganic molecules, peptides, phosphopeptides that inhibit the activity and / or expression of a target gene product , Antisense and ribozyme molecules, triple helix molecules.
  More specific examples of potential antagonists are oligonucleotides that bind to a fusion of an immunoglobulin and a PRO polypeptide, particularly, but not limited to, poly- and monoclonal antibodies and antibody fragments, single-chain antibodies, anti-idio Includes type antibodies, and chimeric or humanized forms of these antibodies or fragments, as well as antibodies, including human antibodies and antibody fragments. Alternatively, a potential antagonist may be a closely related protein, for example, a mutant form of the PRO polypeptide that recognizes but does not affect the receptor, thereby competitively inhibiting the action of the PRO polypeptide.
  Other potential PRO polypeptide antagonists are antisense RNA or DNA constructs prepared using antisense technology, for example, antisense RNA or DNA hybridizes to target mRNA and interferes with protein translation. By doing so, it acts to directly block the translation of mRNA. Antisense technology can be used to control gene expression through triple helix formation or antisense DNA or RNA, both of which methods are based on the binding of a polynucleotide to DNA or RNA. For example, the 5 'encoding portion of the polypeptide nucleotide sequence encoding the mature PRO polypeptide herein is used to design an antisense RNA oligonucleotide of about 10 to 40 base pairs in length. DNA oligonucleotides are designed to be complementary to the region of the gene involved in transcription (triple helix-Lee et al., Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456). (1988); Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)), thereby preventing transcription and production of the PRO polypeptide. Antisense RNA oligonucleotides hybridize to mRNA in vivo and block translation of the mRNA molecule into PRO polypeptide (antisense-Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression ( CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)). The oligonucleotides described above can also be delivered to cells and express antisense RNA or DNA in vivo to inhibit production of the PRO polypeptide. When antisense DNA is used, oligodeoxyribonucleotides derived from the translation initiation site, eg, between about −10 and +10 positions of the target gene nucleotide sequence, are preferred.
      [0086]
  Antisense RNA or DNA molecules are generally at least about 5 bases, about 10 bases, about 15 bases, about 20 bases, about 25 bases, about 30 bases, about 35 bases, about 40 bases. Long, about 45 bases, about 50 bases, about 55 bases, about 60 bases, about 65 bases, about 70 bases, about 75 bases, about 80 bases, about 85 bases, about 90 bases Long, about 95 bases long, about 100 bases long or longer.
  Potential antagonists include small molecules that bind to the PRO polypeptide active site, receptor binding site, or growth factor or other relevant binding site, thereby blocking the normal biological activity of the PRO repeptide. Examples of small molecules include, but are not limited to, small peptides or peptide-like molecules, preferably soluble peptides, and synthetic non-peptide organic or inorganic compounds.
  Ribozymes are enzymatic RNA molecules that can catalyze the specific cleavage of RNA. Ribozymes act by sequence-specific hybridization to complementary target RNA, followed by nucleotide-strand cleavage. Specific ribozyme cleavage sites within potential RNA targets can be identified by known techniques. For further details, see, for example, Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994) and PCT Publication No. WO 97/33551, issued September 18, 1997.
  The nucleic acid molecule in triple helix formation used for transcription inhibition is single-stranded and consists of deoxynucleotides. The basic composition of these oligonucleotides is designed to promote triple helix formation via Hoogsteen base pairing rules, which generally requires a resizable extension of a purine or pyrimidine on one strand of the duplex . For further details see, for example, the above-cited PCT publication, number WO 97/33551.
  These small molecules can be identified by any one or more of the screening assays discussed above and / or by any other screening techniques well known to those skilled in the art.
      [0087]
    x. Cardiovascular, endothelial and angiogenic disease types to be treated
  PRO polypeptides or agonists or antagonists thereof that have activity in the cardiovascular, endothelial and angiogenesis assays described herein and / or whose gene products have been found to be located in the cardiovascular system, It appears to have therapeutic use in a variety of cardiovascular, endothelial and angiogenic diseases, including systemic diseases affecting blood vessels, eg, diabetes mellitus. Their therapeutic efficacy may include arterial, capillary, venous, and / or lymphatic disease. The following treatment examples include muscle wasting disease treatment, osteoporosis treatment, transplant fixation assistance to stimulate cell growth around the transplant, thereby facilitating binding to its intended site, IGF stability in tissue or serum And, if appropriate, increased binding to the IGF receptor (since IGF has been shown in vitro to enhance the growth of human bone marrow red blood cells and granulocyte progenitor cells).
  Also, the PRO polypeptide or agonist or antagonist thereof stimulates erythropoiesis or granulocyte production, stimulates wound healing and tissue regeneration, and stimulates tissues such as connective tissue, skin, bone, cartilage, muscle, lung or kidney. Can be used to stimulate or inhibit endothelial cell migration in connection with regrowth-related therapies. Increased angiogenesis mediated by PRO polypeptides or antagonists is beneficial for ischemic tissue, side branch coronary arteries of the heart, followed by coronary artery stenosis. Antagonists inhibit the action of such polypeptides and are used, for example, to limit excessive connective tissue production during wound healing or embryonic fibrosis. This includes acute myocardial infarction and heart failure.
  Furthermore, the present invention relates to the treatment of cardiac hypertrophy by administering a therapeutically effective amount of the PRO polypeptide, or an agonist or antagonist thereof, regardless of cause. If the purpose is to treat a human patient, the PRO polypeptide is preferably a recombinant human PRO polypeptide (rhPRO polypeptide). Treatment of cardiac hypertrophy can be performed at any of its various stages, as a result of a wide variety of medical conditions, including myocardial infarction, hypertension, hypertrophic cardiomyopathy, and heart valve regurgitation. Treatment can be extended to all stages of progression of cardiac hypertrophy, with or without structural damage to the heart muscle, regardless of the underlying heart disease.
  When opposing antagonists of a molecule, deciding whether to use the molecule itself or its agonists for a particular indication is largely due to the fact that the molecule promotes neovascularization, endothelial cell development, or angiogenesis. Or whether these conditions are inhibited. For example, if the molecule promotes angiogenesis, the antagonist is useful for treating a disease in which restriction or prevention of angiogenesis is desired. Examples of such diseases include hemangiomas, such as hemangiomas, tumor angiogenesis, neovascularization of the retina, diabetic retinopathy or premature infantile retinopathy or macular degeneration and proliferative vitreoretinopathy. Choroid, rheumatoid arthritis, Crohn's disease, atherosclerosis, ovarian hyperstimulation, psoriasis, endometriosis associated with neovascularization, restenosis followed by balloon angiogenesis, scar tissue overproduction, e.g. after surgery Such as keloids formed, fibrosis after myocardial infarction, or fibrosis disorders associated with embryonic fibrosis.
  However, if the molecule inhibits angiogenesis, it is expected to be used directly in the treatment of the above-mentioned conditions.
      [0088]
  On the other hand, if the molecule stimulates angiogenesis, an indication of desired angiogenesis, such as peripheral vascular disease, hypertension, vasculitis, Raynaud's disease and Raynaud's phenomenon, aneurysm, and arterial restenosis, thrombophlebitis, when indicated It is used for lymphangitis, lymphedema, wound healing and tissue repair, ischemia reperfusion injury, angina, myocardial infarction such as acute myocardial infarction, chronic heart disease, heart failure such as congestive heart failure, and osteoporosis.
  However, if the molecule inhibits angiogenesis, the antagonist is used in the treatment of a condition where angiogenesis is desired.
  Specific types of diseases are described below, wherein the PRO polypeptides or antagonists thereof are provided as therapeutic targets for the prevention or treatment of the disease, or as useful as targeted vascular release agents. Atherosclerosis is a disease characterized by the accumulation of plaque in the thickened intima in arteries due to the accumulation of fluid, the proliferation of smooth muscle cells, and the formation of fibrous tissue in the walls of the arteries. is there. The disease affects the large, medium and small arteries in any organ. Changes in endothelial and vascular smooth muscle cell function are known to play an important role in regulating the accumulation and relaxation of these plaques.
  Hypertension is characterized by elevated blood pressure in the systemic arteries, pulmonary arteries, or portal system. Elevated blood pressure results in or results from defective endothelial function and / or vascular disease.
  Vasculitis includes giant cell arteritis, Takayas arteritis, polyarterial nodosa (including forms of microangiopathy), Kawasaki disease, micropolyplasia vasculitis, Wegener's granulomatosis, various infectious disease-related vascular diseases ( Henoch-Schonlein prupura). Altered endothelial cell function has been shown to be important in these diseases.
  Raynaud's disease and the Raynaud's phenomenon are characterized by intermittent abnormal defects in circulation through limbs exposed to the cold. Altered endothelial cell function has been shown to be important in these diseases.
  An aneurysm is a saccular or fusiform ectasia of the arterial or venous dendrites associated with altered endothelial cells and / or vascular smooth muscle cells.
  Arterial restenosis (arterial wall restenosis) is the result of altered proliferation and function of endothelial and vascular smooth muscle cells, followed by angiogenesis.
  Thrombophlebitis and lymphangitis are inflammatory diseases of the veins and lymphatic vessels, each resulting in and / or due to altered endothelial cell function. Similarly, lymphedema is a condition associated with defective lymphatic vessels from endothelial cell function.
  The family of benign and malignant vascular tumors is characterized by abnormal proliferation and growth of cellular elements of the vasculature. For example, lymphangioma is a congenital, often a benign tumor of the lymphatic system of the bladder, a lymph malformation that usually occurs in newborns. Bladder tumors tend to grow in adjacent tissues. Bladder tumors usually occur in the cervix and axillary areas. They also occur in soft tissues of the extremities. The main sign is swelling, and occasionally the reticulated structured lymph and lymphocysts are surrounded by connective tissue. Lymphangioma has been postulated to be due to improper binding to the fetal lymphatic vessels or their deletion. The result is locally impaired lymph drainage. Griener et al., Lymphology, 4: 140-144 (1971).
      [0089]
  Another use of the PRO polypeptides or antagonists herein is in tumor angiogenesis, which involves the angiogenesis of tumors that can grow and / or metastasize. This process relies on the growth of new blood vessels. Examples of neoplasms and related pathologies relating to tumor angiogenesis include breast carcinoma, lung carcinoma, gastric carcinoma, esophageal carcinoma, colorectal carcinoma, liver carcinoma, ovarian carcinoma, tecoma, male embryo, cervical carcinoma, uterus Endometrial carcinoma, endometrial hyperplasia, endometriosis, fibrosarcoma, choriocarcinoma, head and neck cancer, nasopharyngeal carcinoma, laryngeal carcinoma, hepatoblastoma, Kaposi's sarcoma, melanoma, skin carcinoma, blood vessels Tumors, marine hemangiomas, hemangioblastomas, pancreatic carcinomas, retinal carcinomas, astrocytomas, glioblastomas, schwannomas, oligodendrogliomas, medulloblastomas, neuroblastomas, rhabdomyomas, bone Includes primary sarcoma, leiomyosarcoma, urinary sarcoma, thyroid carcinoma, Wilms tumor, renal cell carcinoma, prostate carcinoma, abnormal vascular growth associated with phakomatoses, edema (e.g., associated with brain tumors), and Meigs syndrome .
  Age-related macular degeneration (AMD) is responsible for severe visual loss in the elderly population. The exudative form of AMD is characterized by choroidal neovascularization and retinal pigment endothelial cell detachment. Because choroidal neovascularization is associated with a dynamic reduction in prognosis, PRO polypeptides or their antagonists are expected to be useful in reducing severe AMD.
  Also, wound healing, such as wound healing and tissue repair, is a contemplated use of the PRO polypeptides or antagonists herein. The formation and relaxation of new blood vessels is essentially the healing and repair of tissue. This category includes the growth or regeneration of bone, cartilage, tendons, ligaments, and / or neural tissue, as well as wound healing and tissue regeneration and replacement, and treatment of burns, amputations, and ulcers. PRO polypeptides or antagonists thereof that induce cartilage and / or bone growth in an environment where bone is not formed normally have application in the treatment of fractures and cartilage damage, or defects in humans and other animals. Such preparations using the PRO polypeptides or antagonists thereof are used prophylactically in reducing fractures and improving fixation of artificial joints. New bone formation induced by osteogenic agents contributes to the repair of congenital, traumatic, or oncological, resection-induced cranial defects and is also useful in cosmetic plastic surgery.
  In addition, the PRO polypeptides or antagonists thereof better and faster occlude non-healing wounds, including but not limited to pressure ulcers, ulcers associated with vascular insufficiency, surgical or traumatic wounds, etc. Useful to promote things.
  Still further, the PRO polypeptides or antagonists thereof may be used in other tissues such as organs (including, for example, pancreas, liver, intestine, kidney, arrays or endothelium), muscle (smooth muscle, skeletal muscle or myocardium), and blood vessels (vascular It may exhibit the activity of generating or regenerating tissue (including endothelium) or promoting the growth of cells containing such tissue. Part of the desired effect is to inhibit or regulate fibrotic scarring and regenerate normal tissue.
      [0090]
  The PRO polypeptides or antagonists herein are also useful in medical conditions from systemic cytokine damage, and in reperfusion of wounds in various tissues, treatment of lung or liver fibrosis, and regeneration or protection. PRO polypeptides or antagonists thereof are also useful for promoting or inhibiting the differentiation of the above-mentioned tissues from precursor tissues or cells, or inhibiting the growth of the above-mentioned tissues.
  In addition, PRO polypeptides or antagonists thereof can be used in the treatment of periodontal disease and other dental restoration processes. Such agents are provided in an environment that attracts osteogenic cells, stimulates the growth of osteogenic cells, or induces progenitor differentiation of osteogenic cells. The PRO polypeptides or antagonists herein may stimulate osteoporosis or osteoarthritis, such as bone and / or cartilage repair, or inflammation, because blood vessels play an important role in regulating bone rotation and growth. It is useful for treatment by blocking the process of process-mediated tissue destruction (collagenase activity, osteoclasts, etc.) or inflammation.
  Another category of tissue regeneration activity that is attributed to the PRO polypeptide or antagonist herein is tendon / ligament formation. Proteins that induce tendon / ligament-like tissue or other tissue formation in an environment where tissue is not normally formed are applicable to the healing of tendons or ligaments in humans and other animals, ruptures, malformations, and tendon or ligament defects. You. Such preparations are used prophylactically in preventing damage to tendon or ligament tissue, and improving fixation of tendon or ligament to bone or other tissue, and repairing tendon or ligament tissue defects. The new tendon / ligament-like tissue formation induced by the compositions of the PRO polypeptides or antagonists herein contributes to the repair of congenital, traumatic, or other sources of tendon or ligament defects. It is also useful in cosmetic plastic surgery for attaching or repairing tendons or ligaments. The compositions herein attract tendon- or ligament-forming cells, stimulate the growth of tendon- or ligament-forming cells, induce differentiation of tendon- or ligament-forming cell progenitors, or recover ex vivo. Provided in an environment that induces the growth of tendon / ligament cells or progenitors in a tissue repair effect. The compositions herein are also useful for tendonitis, carpal tunnel syndrome, and other tendon or ligament defects. In addition, the composition may comprise the same suitable matrix and / or sequestrant as a carrier well known in the art.ToIncluding.
      [0091]
  PRO polypeptides or antagonists thereof are involved in neuronal proliferation and regeneration of nerve and brain tissue, ie, diseases and neuropathies of the central and peripheral nervous system involved in degeneration, death or trauma of nerve cells or nerve tissue, and mechanical or Useful for treating traumatic disease. In particular, PRO polypeptides or antagonists thereof are useful for diseases of the peripheral nervous system, such as peripheral nerve injury, peripheral and regional neuropathy, and diseases of the central nervous system, such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntingdon's disease, muscle atrophy. It is used for the treatment of lateral sclerosis and Shy-Drager syndrome. Additional medical conditions that may be treated with the present invention include mechanical or traumatic disorders such as spinal cord disorders, head trauma and cerebrovascular disorders such as stroke. Peripheral neuropathy resulting from chemotherapy or other medical therapy can also be treated using the PRO polypeptides or antagonists thereto.
  Ischemia-reperfusion injury is another sign. Endothelial cell dysfunction is important both in initiating and regulating the sequelae of events that follow ischemia-reperfusion injury.
  Rheumatoid arthritis is an additional sign. Targeting of inflammatory cells through blood vessel growth and vasculature is an important factor in the pathogenesis of rheumatoid and serum negative forms of arthritis.
  PRO polypeptides or antagonists thereof are also administered prophylactically to patients with cardiac hypertrophy to prevent the progression of the condition and to avoid sudden death, including death of asymptomatic patients. Such prophylactic treatment is in cases of large left ventricular hypertrophy (maximum wall thickness of 35 mm or more in adults or comparable in children), or when the hemangioma burden in the heart is particularly high In the example, is particularly valid.
  In addition, PRO polypeptides or antagonists thereof are useful for treating atrial fibrillation, which is expressed in a significant portion of patients diagnosed with hypertrophic cardiomyopathy.
  Additional signs include angina, myocardial infarction, eg, acute myocardial infarction, and heart failure, eg, congestive heart failure. Additional non-neoplastic conditions include psoriasis, diabetes, and premature retinopathy, retrobulbar fibroplasia, other proliferative retinopathies including neovascular glaucoma, thyroid hyperplasia (including Graves' disease), cornea and others Tissue transplantation, chronic inflammation, pneumonia, nephrotic syndrome, preeclampsia, pericardial effusion (eg, associated with pericarditis), and pleural effusion.
  In view of the foregoing, the PRO polypeptides described herein, or agonists or antagonists thereof, which have been shown to alter or impact endothelial cell function, proliferation and / or morphology, include many or all of the above. It plays an important role in the etiology and pathogenesis of these diseases, and could be provided as a vascular-related agent targeting these diseases, or as a therapeutic target to augment or inhibit these processes.
      [0092]
    xi. Dosing protocol, schedule, dose and formulation
  The molecules described herein and their agonists and antagonists are pharmaceutically useful as prophylactic and therapeutic agents for the various diseases and conditions described above.
  The therapeutic composition of a PRO polypeptide or agonist or antagonist can be prepared by combining the desired molecule of appropriate purity with any pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or stabilizer (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol). , A. Ed., (1980)) and in the form of a lyophilized preparation or an aqueous solution. An acceptable carrier, excipient, or stabilizer is preferably non-toxic to recipients at the dosages and concentrations employed, and buffers such as phosphate, citrate, and other organic acids; ascorbin Antioxidants containing acids and methionine; preservatives (octadecyldimethylbenzylammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride; benzethonium chloride; phenol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben; catechol; resorcinol Cyclopentanol; 3-pentanol; and m-cresol); low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides; proteins such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; Amino acids such as glutamine, asparagine, histidine, arginine or lysine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates, including glucose, mannose or dextran; chelating agents such as EDTA; sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; Salt-forming counterions such as sodium; metal complexes (eg, Zn-protein complexes); and / or TWEEN.^TM, PLURONICS^TMOr a nonionic surfactant such as polyethylene glycol (PEG).
  Further examples of such carriers are ion exchangers, alumina, aluminum stearate, lecithin, serum albumins such as human serum albumin, buffer substances such as phosphate, glycine, sorbic acid, potassium sorbate, saturated vegetable fatty acids Partial glyceride mixtures, water, salts, or electrolytes, such as protamine sulfate, disodium hydrogen phosphate, potassium hydrogen phosphate, sodium chloride, zinc salts, colloidal silica, magnesium trisilicate, polyvinylpyrrolidone, cellulose-based materials, and Propylene glycol. Topical carrier or gel-based forms include polysaccharides such as sodium carboxymethylcellulose or methylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polyacrylates, polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymers, polyethylene glycol, and mocro alcohol. For all administrations, conventional depot forms are suitably used. Such forms include, for example, microcapsules, nano-capsules, liposomes, plasters, inhalation forms, nasal sprays, sublingual tablets, and sustained release formulations. A PRO polypeptide or agonist or antagonist is typically formulated in such vehicles at a concentration of about 0.1 mg / ml to 100 mg / ml.
      [0093]
  Other preparations contain PRO polypeptides or their antagonists incorporated into the formed product. Such products can be used to regulate endothelial cell growth and angiogenesis. In addition, tumor invasion and metastasis may be modulated with these products.
  PRO polypeptides or antagonists used for in vivo administration must be sterile. This is readily accomplished by lyophilization and filtration through a sterile filtration membrane before or after reconstitution. PRO polypeptides are usually stored in lyophilized form or in solution when administered systemically. When in lyophilized form, the PRO polypeptide or agonist is typically formulated in combination with other ingredients, including suitable diluents for use. An example of a liquid formulation of a PRO polypeptide or antagonist is a sterile, clear, colorless, fresh solution filled into single-dose vials for subcutaneous injection. Preservative pharmaceutical compositions suitable for repeated use depend, for example, primarily on the type and direction of the polypeptide,
a) PRO polypeptides or agonists or antagonists thereof;
b) a buffer capable of maintaining a pH within a range that maximizes the stability of the polypeptide or other molecule in solution, preferably a pH of about 4-8;
c) detergents / surfactants that mainly stabilize the polypeptide or molecule against the agitation-induced assembly;
d) isotonic agents;
e) preservatives selected from the group of phenol, benzyl alcohol and benzethonium halides, for example chloride;
f) water;
May be contained.
  If the detergent used is non-ionic, it may be, for example, polysorbate (e.g., POLYSORBATE^TM(TWEEN^TM) 20, 80 etc.), poloxamers (e.g., POLOXAMER^TM188). By using a non-ionic surfactant, the preparation can be exposed to surface stress shear without causing protein denaturation. In addition, such surfactant-containing preparations can be used in aerosol devices, such as those used for intravenous administration and needless jet injection guns (see, for example, EP 257,956).
  Isotonic agents are present to ensure that the liquid composition of the PRO polypeptide or agonist or antagonist thereof is isotonic and is a polyhydric sugar alcohol, preferably a trihydric or higher sugar alcohol, such as glycerin, erythritol, arabitol , Xylitol, sorbitol and mannitol. These sugar alcohols can be used alone or in combination. Also, sodium chloride or other suitable salt may be used to equalize the solution.
  The buffer can be an acetate, citrate, succinate or phosphate buffer, depending on the desired pH. The pH of one of the liquid preparations of the present invention is buffered in the range of about 4 to 8, preferably about physiological pH.
  Preservatives, phenol, benzyl alcohol and benzethonium halides, such as chloride, are well known antibacterial agents that can be used.
      [0094]
  Therapeutic PRO polypeptide compositions are typically placed in a container having a sterile access port, for example, an intravenous solution bag or vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle. The formulations are preferably administered as repeated intravenous (iv), subcutaneous (sc), or intramuscular (im) injections, or as aerosol formulations suitable for nasal or pulmonary delivery. (See, for example, EP 257,956 for pulmonary delivery).
  The PRO polypeptide can also be administered in the form of a sustained release formulation. Suitable examples of sustained release formulations include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing proteins, which matrices are in the form of moldings, such as films or microcapsules. Examples of sustained release matrices include polyesters, hydrogels (eg, Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981) and Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)). Poly (2-hydroxyethyl-methacrylate) or poly (vinyl alcohol) as described, polyactide (US Pat. No. 3,773,919, EP 58,481), copolymers of L-glutamic acid and gamma ethyl-L-glutamate (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 (1983)), non-degradable ethylene-vinyl acetate (Langer et al., Supra), degradable lactic acid-glycolic acid copolymers such as Lupron Depot^TM(Injectable microspheres consisting of lactic acid-glycolic acid copolymer and leuprolide acetate), and poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid (EP 133,988).
  While polymers such as ethylene-vinyl acetate and lactic acid-glycolic acid can release molecules for over 100 days, certain hydrogels release proteins for shorter time periods. If the encapsulated protein remains in the body for a long period of time, it may be denatured or aggregated by exposure to water at 37 ° C., which may cause a loss of biological activity or a change in immunogenicity. Reasonable measures to obtain stability by such a mechanism are conceivable. For example, if it turns out that the aggregation mechanism is an intermolecular SS bond by thio-disulfide exchange, the sulfhydryl residue is changed, lyophilized from an acidic solution, adjusted for the amount of water, and used an appropriate additive. By developing a specific polymer matrix compound, stability can be guaranteed.
  A sustained release composition of a PRO polypeptide comprises a liposome-encapsulated PRO polypeptide. Liposomes containing the PRO polypeptide can be prepared by methods known per se, for example, DE 3,218,121, Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985), Hwang et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980), EP 52,322, EP 36,676, EP 88,046, EP 143,949, EP 142,641, Japanese Patent Application No. 58-118008, U.S. Patent Nos. 4,485,045 and 4,544,545, and EP 102,324. And the like. Typically, liposomes are microlamellar (about 200-800 angstroms) monolamellar with a lipid content of about 30 mol% or more cholesterol and the proportion selected is adjusted for optimal therapy.
      [0095]
  The therapeutically effective amount of the PRO polypeptide or antagonist thereof will, of course, be the amount of pathological condition to be treated (including prophylaxis), the mode of administration, the type of compound used for treatment, any concomitant treatment included, It depends on factors such as the patient's age, weight, general medical condition, medical history, etc., which are well determined within the skill of the attending physician. Therefore, the practitioner will need to titrate the dosage and modify the route of administration to obtain the maximum therapeutic effect. If the PRO polypeptide has a narrow range of hosts, it is preferred for treatment of human patients to be a preparation containing human PRO polypeptide, more preferably a native sequence human PRO polypeptide. The clinician will administer the PRO polypeptide until the dosage has the desired effect in treating the condition. For example, if the purpose is to treat CHF, the amount is that which inhibits progressive cardiac hypertrophy associated with this condition. This treatment and progress is easily monitored by echocardiography. Similarly, patients with hypertrophic cardiomyopathy can be administered a PRO polypeptide based on experience.
  According to the above guidelines, effective doses generally will be from about 0.001 to about 1.0 mg / kg, preferably about 0.01-1.0 mg / kg, and most preferably about 0.01-0.1 mg / kg. kg.
  In the treatment of hypertension in adultsToFor parenteral use, about 0.01 to 50 mg, preferably about 0.05 to 20 mg, most preferably 1 to 20 mg of PRO polypeptide per kg body weight, in the form of injections, may be administered by intravenous injection, from 1 to 5 times daily. Advantageously, three doses are administered. For oral administration, a molecule based on a PRO polypeptide is preferably administered from about 5 mg to 1 g, preferably from about 10 to 100 mg, per kg body weight once to three times daily. Endotoxin contaminants should be kept at a minimum level of safety level, eg, less than 0.5 ng / mg protein. Further, for human administration, preparations are preferably sterile, pyrogenic, generally safe, and purified as required by FDA Office and biologics standards.
  The dosage schedule of the pharmaceutical composition containing the PRO polypeptide used for tissue regeneration will depend on various factors that alter the effect of the polypeptide, such as the weight of the tissue (e.g., bone) desired to be formed, the age of the patient, the sex, It will be determined by the attending physician in view of diet, severity of infection, time of administration, and other clinical factors. Dosages may vary depending on the type of matrix used for reconstitution, other protein content of the pharmaceutical composition. For example, the addition of other well-known growth factors, such as IGF-I, to the final composition will further affect dose. Progress can be monitored by regularly assessing tissue / bone growth and / or repair, for example, by x-ray, histomorphometric determinations and tetracycline labeling.
      [0096]
  The route of administration of the PRO polypeptide or antagonist or agonist is in accordance with well-known methods, for example, intravenous, intramuscular, intracerebral, intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutaneous, intraocular, intraarticular, synovial, intrathecal, oral Injection or infusion by local or inhalation route, or by the sustained release system described below. The PRO polypeptides or antagonists thereof are also suitably administered by intratumoral, peritumoral, intralesional, or peristaltic routes, and exert local and systemic therapeutic effects. The intraperitoneal route is expected to be particularly useful, for example, in the treatment of ovarian tumors.
  When the peptide or small molecule is used as an antagonist or agonist, it is preferably administered orally or parenterally to the mammal in liquid or solid form.
  Examples of pharmacologically acceptable salts of molecules that form salts and are useful below include alkali metal salts (e.g., sodium, potassium salts), alkaline earth metal salts (e.g., calcium salts, magnesium salts), ammonium Salts, organic base salts (eg, pyridine salts, triethylamine salts), inorganic acid salts (eg, hydrochloric acid, sulfate, nitrate) and organic acid salts (eg, acetate, oxalate, p-toluenesulfonate) are included.
  Methods of treatment in compositions described herein useful for bone, cartilage, tendon, or ligament regeneration include administration of the topically, systemically, or locally composition as an implant or device. Is included. When administered, useful therapeutic compositions are in a pyrogen-free, physiologically acceptable form. In addition, the composition is desirably injected or encapsulated in a viscous form that is delivered to the site of bone, cartilage or tissue damage. Topical administration is suitable for wound healing and tissue repair. Preferably, for bone and / or cartilage formation, the composition delivers the protein-containing composition to the site of bone and / or cartilage damage, and preferably develops resorbable bone and cartilage in the body. Includes a matrix capable of providing a structure. Such matrices are made of materials used for other transplant medical applications.
      [0097]
  The choice of matrix material is based on biological compatibility, biodegradability, mechanical properties, cosmetic appearance, and surface activity. The particular use of the composition is defined by the appropriate formulation. The potential matrix of the composition is biodegradable and may be chemically defined calcium sulfate, tricalcium phosphate, hydroxyapatite, polylactic acid, polyglycolic acid, and polyanhydride. Other potential matrices are biodegradable and biologically well-defined, such as bone or dermal collagen. Further matrices consist of pure proteins or extracellular matrix components. Other potential matrices are non-biodegradable and chemically defined, such as sintered hydroxyapatite, bioglass, aluminate, or other ceramics. The matrix may be composed of any of the materials described above, for example, a combination of polylactic acid and hydroxyapatite or a combination of collagen and tricalcium phosphate. The bioceramic may be changed in composition, for example, to calcium-aluminate-phosphate, and may have undergone a process to alter pore size, particle size and biodegradability.
  In one particular embodiment, lactic acid and glycolic acid are 50:50 (molar weight) copolymers, in the form of porous particles having a diameter in the range of 150 to 800 microns. In some applications, sequestering agents, such as carboxymethylcellulose, or autologous clots are utilized to help protect the composition from separation from the matrix.
  One preferred family of sequestrants is cellulosic materials, such as methylcellulose, ethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, alkylcellulose, including hydroxypropylmethylcellulose and carboxymethylcellulose, including hydroxyalkylcellulose, preferably carboxymethylcellulose. (CMC) is a cationic salt. Other preferred sequestering agents include hyaluronic acid, sodium alginate, poly (ethylene glycol), polyoxyethylene oxide, carboxyvinyl polymers, and poly (vinyl alcohol). The amount of sequestering agent useful herein is 0.5-20% by weight, preferably 1-10% by weight, based on the total amount of the preparation, and desorption of the polypeptide (or its antagonist) from the polymatrix. The amount necessary to provide the composition with appropriate operability and further prevent penetration of the progenitor cells into the matrix, thus providing the polypeptide with the opportunity to promote the osteogenic activity of the progenitor cells. It is.
      [0098]
xii. Combination therapy
  PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide, amine or agonist thereof in the prevention or treatment of the diseases in question. Efficacy is improved by combining with other agents effective for these purposes, or administering the active agent sequentially, in the same composition or in separate compositions.
  For example, for the treatment of cardiac hypertrophy, PRO polypeptide treatments include well-known inhibitors of cardiac myocyte hypertrophy, such as inhibitors of α-adrenergic agonists such as phenylephrine; endothelin-I inhibitors, such as BOSENTAN^TMAnd MOXONODIN^TMAn inhibitor to CT-1 (US Pat. No. 5,679,545); an inhibitor to LIF; an ACE inhibitor; a des-aspartate-angiotensin I inhibitor (US Pat. No. 5,773,415) and an angiotensin II inhibitor.
  For the treatment of cardiac hypertrophy associated with hypertension, PRO polypeptides are converted to beta-adrenergic receptor blocking agents such as propranolol, timolol, tartarolol, carteolol, nadolol, betaxolol, penbutolol, acetobutolol, atenolol, metoprolol, Or an ACE inhibitor such as quinapyryl, captopril, enalapril, ramipril, benazepril, fosinopril or lisinopril; diuretics such as chlorothiazide, hydrochlorothiazide, hydroflumethazide, methylclothiazide, benzthiazamide, dichlorophenamide, Or calcium channel blockers such as diltiazem, nifedipine, It may be administered in combination with Pamiru or nicardipine. Genetic pharmaceutical compositions of the therapeutic agent identified here by the generic name are commercially available and administered according to the manufacturer's instructions on dosage, administration methods, side effects, contraindications, and the like. For example, see the Physicians' Desk Reference (Medical Economics Data Production Co .: Montvale, N.J., 1997), 51st edition.
      [0099]
  Preferred candidates for combination therapy in the treatment of cardiac hypertrophy are β-adrenergic receptor blocking agents (propranolol, timolol, tartarolol, carteolol, nadolol, betaxolol, penbutolol, acetobutolol, atenolol, metoprolol, or carvedilol) , Verapamil, diphedipine, or diltiazem. For the treatment of hypertension with hypertension, calcium channel blockers such as diltiazem, nifedipine, verapamil and nicardipine; β-adrenergic receptor blocking agents; diuretics such as chlorothiazide, hydrochlorothiazide, hydroflumethazide, methylclothiazide, benzthiazide And / or dichlorophenamide, acetazolamide, or indapamide; and / or the use of an anti-hypertensive agent using an ACE inhibitor such as quinapyryl, captopril, enalapril, ramipril, benazepril, fosinopril or lisinopril.
  For other indications, the PRO polypeptides or antagonists thereof may be combined with other agents useful for treating bone and / or cartilage defects, wounds or tissues in the subject. Such agents include various growth factors such as EGF, PDGF, TGF-α or TGF-β, IGF, FGF, and CTGF.
  In addition, the PRO polypeptides or their antagonists used for treating cancer are combined with a cytotoxic, chemotherapeutic or growth inhibitor as identified above. Also, for the treatment of cancer, the PRO polypeptide or antagonist thereof will be suitably administered continuously, or in combination with radiological treatment, with or without the irradiation or administration of radioactive substances.
  An effective amount of a therapeutic agent to be administered in combination with a PRO polypeptide or an antagonist thereof is at the discretion of the physician or veterinarian. Dosages and adjustments are made to achieve the maximum therapeutic effect for the condition being treated. For example, in treating hypertension, these amounts ideally take into account the use of giuretics or digital, and high or low blood pressure, renal damage, and the like. The dose will depend on factors such as the particular patient being treated and the type of therapeutic used. Typically, the amount used will be the same as if the therapeutic were not administered with the PRO polypeptide.
      [0100]
xiii. Products
  Kits comprising PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide or antagonists thereof useful for the diagnosis or treatment of the aforementioned diseases. Such an article of manufacture comprises at least one container and a label. Suitable containers include, for example, bottles, vials, syringes, and test tubes. The container can be formed from various materials such as glass or plastic. The container may contain a composition that is effective for diagnosing or treating the condition and may have a sterile access port (for example, the container may be an intravenous bag or vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle. ). The active agent in the composition is a PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide or agonist or antagonist thereof. The label on, or associated with, the container indicates that the composition is used for diagnosing or treating the condition of choice. The article of manufacture may further comprise a second container containing a pharmaceutically acceptable buffer, such as phosphate buffered saline, Ringer's solution, and dextrose solution. In addition, other materials desirable from a commercial and user standpoint may be included, including other buffers, diluents, filters, needles, syringes, and packaging inserts with instructions for use. The article of manufacture may also include a second or third container containing the other active agent described above.
      [0101]
E. antibody
  Some of the many useful drug candidates of the present invention are antibodies and antibody fragments that produce the gene identified herein, or inhibit the gene product, and / or reduce the activity of the gene product.
i. Polyclonal antibody
  Methods for preparing polyclonal antibodies are known to those skilled in the art. In mammals, polyclonal antibodies can be raised, for example, by one or more injections of an immunizing agent and, if desired, an adjuvant. Typically, the immunizing agent and / or adjuvant will be injected into the mammal by multiple subcutaneous or intraperitoneal injections. The immunizing agent can include PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide or a fusion protein thereof. It is useful to conjugate the immunizing agent to a protein of known immunogenicity in the immunized mammal. Examples of such immunogenic proteins include, but are not limited to, keyhole limpet hemocyanin, serum albumin, bovine thyroglobulin, and soybean trypsin inhibitor. Examples of adjuvants that can be used include Freund's complete adjuvant and MPL-TDM adjuvant (monophosphoryl lipid A, synthetic trehalose dicorynomycolate). The immunization protocol will be selected by one of skill in the art without undue experimentation.
      [0102]
ii. Monoclonal antibody
  Alternatively, anti-PRO179, anti-PRO238, anti-PRO364, anti-PRO844, anti-PRO846, anti-PRO1760, anti-PRO205, anti-PRO321, anti-PRO333, anti-PRO840, anti-PRO877, anti-PRO877, The anti-PRO879, anti-PRO882, anti-PRO885 or anti-PRO887 antibody may be a monoclonal antibody. Monoclonal antibodies can be prepared using the hybridoma method as described in Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 (1975). In the hybridoma method, a mouse, hamster, or other suitable host animal is typically immunized with an immunizing agent to produce antibodies that specifically bind to the immunizing agent or to generate lymphocytes capable of producing the antibody. Trigger. Lymphocytes can also be immunized in vitro.
  The immunizing agent typically comprises a PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide or fusion protein thereof of interest. Including. Generally, peripheral blood lymphocytes ("PBL") are used if cells of human origin are desired, or spleen cells or lymph node cells if a non-human mammalian source is desired. Next, the lymphocytes are fused with the immortalized cell line using a suitable fusion agent such as polyethylene glycol to form hybridoma cells. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, (New York; Academic Press, 1986) pp. 59-103. Immortalized cell lines are usually transformed mammalian cells, particularly myeloma cells of rodent, bovine, and human origin. Usually, rat or mouse myeloma cell lines are used. The hybridoma cells are preferably cultured in a suitable medium containing one or more substances that inhibit the survival or growth of the unfused, immortalized cells. For example, if the parental cell lacks the enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT or HPRT), the hybridoma medium typically contains hypoxatin, aminoptilin and thymidine (`` HAT medium ''). This substance blocks the growth of HGPRT deficient cells.
  Preferred immortalized cell lines are those that fuse efficiently, support stable high level expression of antibody by the selected antibody-producing cells, and are sensitive to a medium such as HAT medium. A more preferred immortalized cell line is a mouse myeloma line, which is available, for example, from the Salk Institute Cell Distribution Center in San Diego, California or the American Type Culture Collection in Manassas, VA. Also disclosed are human myeloma and mouse-human xenomyeloma cell lines for producing human monoclonal antibodies. Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984), Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) pp. 51-63.
  The culture medium in which the hybridoma cells are then cultured is determined by the presence of a monoclonal antibody to PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide. Test. Preferably, the binding specificity of the monoclonal antibody produced by the hybridoma cells is determined by immunoprecipitation or an in vitro binding assay such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Such techniques and assays are known in the art. The binding affinity of the monoclonal antibody can be measured, for example, by the Scatchard analysis according to Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).
      [0103]
  After the desired hybridoma cells have been identified, the clones can be subcloned by a limiting dilution step and grown by standard methods. Goding, supra. Suitable media for this purpose include, for example, Dulbecco's Modified Eagle's Medium and RPMI-1640 medium. Alternatively, the hybridoma cells can be grown as ascites in vivo in a mammal.
  Monoclonal antibodies secreted by the subclones can be isolated from the culture medium or ascites fluid by conventional immunoglobulin purification methods such as, for example, protein A-sepharose, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis or affinity chromatography. Separated or purified.
  Monoclonal antibodies can be prepared by recombinant DNA methods, for example, the method described in US Pat. No. 4,816,567. The DNA encoding the monoclonal antibody of the present invention can be prepared using conventional methods (e.g., using an oligonucleotide probe that can specifically bind to the genes encoding the heavy and light chains of the mouse antibody). Can be easily isolated and sequenced. The hybridoma cells of the present invention are a preferred source of such DNA. Once isolated, the DNA can be placed in an expression vector, which is transfected into host cells such as monkey COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, or myeloma cells that do not produce immunoglobulin proteins. Thus, monoclonal antibodies can be synthesized in recombinant host cells. Alternatively, the DNA may be non-immunized to the immunoglobulin coding sequence, for example, by substituting the coding sequence for the human heavy and light chain constant domains in place of the homologous mouse sequence (US Pat. No. 4,816,567; Morrison et al., Supra). It can be modified by covalently attaching a part or all of the coding sequence of a globulin polypeptide. Such non-immunoglobulin polypeptides can be substituted for the constant domains of the antibodies of the invention, or for the variable domains of one of the antigen binding sites of the antibodies of the invention, to produce chimeric bivalent antibodies.
  The antibody may be a monovalent antibody. Methods for preparing monovalent antibodies are well known in the art. For example, one method involves the recombinant expression of an immunoglobulin light chain and a modified heavy chain. The heavy chain is truncated generally at any point in the Fc region to prevent heavy chain crosslinking. Alternatively, the relevant cysteine residues are replaced or deleted with other amino acid residues to prevent crosslinking.
  In vitro methods are also suitable for preparing monovalent antibodies. Production of the fragments, especially Fab fragments, by digestion of the antibody can be accomplished using conventional techniques known in the art.
      [0104]
iii. Human and humanized antibodies
  Anti-PRO179, anti-PRO238, anti-PRO364, anti-PRO844, anti-PRO846, anti-PRO1760, anti-PRO205, anti-PRO321, anti-PRO333, anti-PRO840, anti-PRO877, anti-PRO878, anti-PRO PRO879, anti-PRO882, anti-PRO885 or anti-PRO887 antibody further includes a humanized or human antibody. A humanized form of a non-human (eg, mouse) antibody refers to a chimeric immunoglobulin, an immunoglobulin chain or a fragment thereof (eg, Fv, Fab, Fab ′, F (ab ′)).₂Or another antigen-binding subsequence of an antibody), which comprises a minimal sequence derived from a non-human immunoglobulin. A humanized antibody is a humanized immunoglobulin (recipe) in which CDR residues have been replaced by CDR residues of a non-human species (donor antibody) having the desired specificity, affinity and capacity, such as mouse, rat or rabbit. Ent antibody). In some cases, Fv framework residues of the human immunoglobulin have been replaced by corresponding non-human residues. Also, a humanized antibody may contain residues that are not found in the recipient antibody, nor in the imported CDR or framework sequences. In general, a humanized antibody will have at least one, typically at least one, typically all of the CDR regions correspond to those of a non-human immunoglobulin and all or almost all of the FR regions will be of a human immunoglobulin consensus sequence. Contains substantially all of the two variable domains. The humanized antibody optimally will comprise at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), typically that of a human immunoglobulin. Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).
  Methods for humanizing non-human antibodies are well known in the art. Generally, one or more amino acid residues from a non-human source are introduced into a humanized antibody. These non-human amino acid residues are often referred to as "import" residues, which are typically taken from an "import" variable domain. Humanization essentially involves the replacement of the relevant sequence of a human antibody with a rodent CDR or CDR sequence, winter and co-workers [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann. Et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)], by replacing the rodent CDR or CDR sequence with the corresponding sequence of a human antibody. Will be implemented. Thus, such “humanized” antibodies are chimeric antibodies (US Pat. No. 4,816,567) in which substantially less than an intact human variable domain has been substituted by the corresponding sequence from a non-human species. In practice, humanized antibodies are typically human antibodies in which some CDR residues and possibly some FR residues have been replaced by residues from similar sites in rodent antibodies.
  Human antibodies can also be produced using various methods known in the art, including phage display libraries. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991). Also, methods such as Cole et al. And Boerner et al. Can be used to prepare human monoclonal antibodies. Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. P.77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol., 147 (1): 86-95 (1991). Similarly, human antibodies can be produced by introducing a human immunoglobulin locus into a transgenic animal, such as a mouse in which the endogenous immunoglobulin gene has been partially or completely inactivated. Upon administration, the production of human antibodies is observed that is very similar in all respects to that found in humans, including gene rearrangement, assembly, and antibody repertoire. This approach is described, for example, in U.S. Patent Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, and the following scientific references: Marks et al., Bio / Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14 , 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 1365-93 (1995).
      [0105]
iv. Bispecific antibodies
  Bispecific antibodies are monoclonal, preferably human or humanized, antibodies that have binding specificities for at least two different antigens. In the present case, one of the binding specificities is for PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide. The other is against any other antigen, preferably a cell surface protein or receptor or receptor subunit.
  Methods for making bispecific antibodies are well known in the art. Traditionally, recombinant production of bispecific antibodies is based on the co-expression of two immunoglobulin heavy / light chain pairs, where the two heavy chains have different specificities. Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983). Because of the random assortment of immunoglobulin heavy and light chains, these hybridomas (quadromas) produce a potential mixture of ten different antibody molecules, only one of which has the correct bispecific structure. Purification of the correct molecule is usually achieved by an affinity chromatography step. A similar procedure is described in WO 93/08829 published May 13, 1993, and in Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-365.9 (1991).
  Antibody variable domains with the desired binding specificities (antibody-antigen combining sites) can be fused to immunoglobulin constant domain sequences. The fusion is preferably with an immunoglobulin heavy chain constant domain, comprising at least part of the hinge, CH2, and CH3 regions. Desirably, at least one of the fusions has a first heavy chain constant region (CH1) containing sites necessary for light chain binding. The DNA encoding the immunoglobulin heavy chain fusion and, if desired, the immunoglobulin light chain, are inserted into separate expression vectors and co-transfected into a suitable host organism. For further details on generating bispecific antibodies see, for example, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
      [0106]
v. Heteroconjugate antibody
  Heteroconjugate antibodies consist of two covalently linked antibodies. Such antibodies can be used, for example, to target immune system cells to unwanted cells (US Pat. No. 4,676,980) and to treat HIV infection (WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089). Proposed. It is contemplated that the antibodies can be prepared in vitro using known methods in synthetic protein chemistry, including those involving crosslinking agents. For example, immunotoxins can be made using a disulfide exchange reaction or by forming a thioether bond. Examples of suitable reagents for this purpose include iminothiolate and methyl-4-mercaptobutyrimidate and, for example, US Pat. No. 4,676.,No. 980 is included.
vi. Processing effector functions
  It is desirable to modify the antibodies of the invention for effector function, for example to improve the effectiveness of the antibodies in treating cancer. For example, a cysteine residue may be introduced into the Fc region, thereby forming an interchain disulfide bond in this region. The homodimeric antibody so generated may have improved internalization capacity and / or increased complement-mediated cell killing and antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). See Caron et al., J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Homodimeric antibodies with enhanced anti-tumor activity can also be prepared using heterobifunctional crosslinks as described in Wolff et al., Cancer research 53: 2560-2565 (1993). Alternatively, the antibody can be engineered to have two Fc regions, thereby improving complement lysis and ADCC capabilities. See Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989).
      [0107]
vii. Immunoconjugate
  The present invention is also conjugated to chemotherapeutic agents, cytotoxic agents such as toxins (eg, enzymatically active toxins from bacteria, fungi, plants or animals, or fragments thereof), or radioisotopes (ie, radioconjugates). It also relates to an immunoconjugate comprising the antibody.
  Chemotherapeutic agents useful for generating such immune complexes have been described above. Enzymatically active toxins and fragments thereof that can be used include diphtheria A chain, non-binding active fragment of diphtheria toxin, exotoxin A chain (from Pseudomonas aeruginosa), ricin A chain, abrin A chain, modeccin A chain , Alpha-sarcin, Aleurites fordii protein, dianthin protein, Phytolaca americana protein (PAPI, PAPII and PAP-S), momordica charantia inhibitor, crusin (curcin), crotin, sapaonaria oficinalis inhibitor, gelonin, mitogellin, restrictoccin, restrictocin, phenomycin, enomycin and trichothecene. )including. A variety of radionucleotides are available for producing radioconjugated antibodies. As an example,²¹²Bi,¹³¹I,¹³¹In,⁹⁰Y and¹⁸⁶Including Re.
  Conjugates of antibodies and cytotoxic agents can be prepared using various bifunctional protein coupling agents such as N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithiol) propionate (SPDP), iminothiolane (IT), imidoester Derivatives (such as dimethyl adipimidate HCl), active esters (such as disuccinimidyl suberate), aldehydes (such as glutaraldehyde), bis-azide compounds (such as bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine), bis-diazonium Using derivatives (such as bis- (p-diazoniumbenzoyl) -ethylenediamine), diisocyanates (such as triene 2,6-diisocyanate), and bis-active fluorine compounds (such as 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene) Can be created. For example, a ricin immunotoxin can be prepared as described in Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). Carbon-14-labeled 1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylenetriaminepentaacetic acid (MX-DTPA) is an example of a chelating agent for conjugation of radionucleotides to antibodies. See WO 94/11026.
  In another embodiment, the antibody may be conjugated to a “receptor” (such as streptavidin) for use in pre-targeting the tumor, and the antibody-receptor complex is administered to the patient, and then the clarifying agent is added. Unbound complex is used to remove unbound complex from the circulation and then administered a "ligand" (such as avidin) conjugated to a cytotoxic agent (such as a radionucleotide).
viii. Immunoliposome
  Also, the antibodies disclosed herein may be prepared as immunoliposomes. Liposomes containing antibodies are described in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); and U.S. Pat. It is prepared by methods known in the art, such as described in 4,485,045 and 4,544,545. Liposomes with improved circulation times are disclosed in US Pat. No. 5,013,556.
  Particularly useful liposomes are produced by the reverse phase evaporation method with a lipid composition comprising phosphatidylcholine, cholesterol and PEG-derived phosphatidylethanolamine (PEG-PE). The liposomes are extruded through a pore size filter to produce liposomes having the desired diameter. Fab 'fragments of the antibodies of the present invention can be conjugated to liposomes via a disulfide exchange reaction, as described in Martin et al., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982). A chemotherapeutic agent (such as doxorubicin) is optionally contained within the liposome. See Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989).
      [0108]
ix. Antibody pharmaceutical composition
  Antibodies that specifically bind to PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 polypeptides identified herein, as well as those disclosed above. Other molecules identified in the screening assays described above can be administered in the form of pharmaceutical compositions for the treatment of the various diseases described above and below.
  PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides are intracellular and all antibodies are used as inhibitors. Antibodies are preferred. However, lipofections or liposomes can also be used to introduce antibodies, or antibody fragments, into cells. If an antibody fragment is used, a minimal inhibitory fragment that specifically binds to the binding domain of the target protein is preferred. For example, a peptide molecule that retains the ability to bind to a target protein sequence can be designed based on the variable region sequence of the antibody. Such peptides can be chemically synthesized and / or produced by recombinant DNA technology. See, for example, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993).
  The formulations herein may also contain more than one active compound as necessary for the particular indication being treated, preferably those with complementary activities that do not adversely affect each other. Alternatively, or in addition, the composition may include a cytotoxic agent, a cytokine or a growth inhibitor. These molecules are suitably present in combination in amounts that are effective for the purpose intended.
  The active ingredient may also be incorporated in a microcapsule prepared, for example, by coacervation techniques or by interfacial polymerization, such as hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsules and poly (methyl methacrylate) microcapsules, respectively, in a colloidal drug delivery system (eg, , Liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules), or microemulsions. These techniques are disclosed in Remington's Pharmaceutical Science, supra.
  The formulations used for in vivo administration must be sterile. This is easily achieved by filtration through a sterile filtration membrane.
  Sustained-release preparations may be prepared. Suitable examples of sustained release formulations include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing the antibody, which matrices are in the form of shaped articles, eg, films, or microcapsules. Examples of sustained release matrices include polyester hydrogels (eg, poly (2-hydroxyethyl-methacrylate) or poly (vinyl alcohol)), polylactide (US Pat. No. 3,773,919), L-glutamic acid and γ-ethyl-L-glutamate. Lactic acid-glycolic acid copolymer, such as non-degradable ethylene-vinyl acetate, LUPRON DEPOT (trade name) (injectable small spheres of lactic acid-glycolic acid copolymer and leuprolide acetate), poly- (D) -3 -Contains hydroxybutyric acid. While polymers such as ethylene-vinyl acetate and lactic acid-glycolic acid enable release of molecules for over 100 days, certain hydrogels release proteins for shorter time periods. If the encapsulated antibodies remain in the body for an extended period of time, they will denature or aggregate due to exposure to water at 37 ° C., resulting in reduced biological activity and possible changes in immunogenicity . Rational methods can be devised for stabilization depending on the mechanism involved. For example, if the aggregation mechanism is found to be intermolecular SS bond formation through thio-disulfide exchange, stabilization may include modification of sulfhydryl residues, lyophilization from acidic solutions, control of water content, appropriate And the development of specific polymer matrix compositions.
      [0109]
x. Therapeutic methods using antibodies
  Antibodies to PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides are described above for the treatment of various cardiovascular, endothelial and angiogenic diseases. It is expected that it can be used for
  Antibodies can be administered to mammals, preferably humans, in well-known fashion, for example, intravenously as a bolus or by continuous infusion over a period of time, intramuscularly, intraperitoneally, intracerebrospinally, subcutaneously, between joints, intrasynovically, It is administered by intrathecal, oral, topical or inhalation routes. Intravenous administration of the antibody is preferred.
  Other therapeutic regimens may be combined, for example, with the administration of the antibodies of the invention. For example, when treating cancer with antibodies, patients treated with such antibodies may receive radiation therapy. Alternatively, or in addition, a chemotherapeutic agent may be administered to the patient. The preparation and dosage schedule of such chemotherapeutic agents is used according to the manufacturer's instructions or is determined empirically by the skilled practitioner. Preparation methods and dosage schedules for such chemotherapy are also described in Chemotherapy Service, edited by M.C. Perry, (Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 1992). The chemotherapeutic agent may be administered prior to or subsequent to administration of the antibody, or may be administered simultaneously therewith. Antibodies are tamoxifen or EVIST^TMAnd antiprogesterone compounds such as onapristone (see EP 616812) may be combined with doses known for those molecules.
  When the antibody is used for treating cancer, it is also preferable to administer an antibody against another tumor-associated antigen, for example, an antibody that binds to one or more ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, or VEGF receptor. It also includes the drugs mentioned above. The antibodies are suitably administered sequentially or in combination with radiological treatment, with or without irradiation or administration of the radioactive substance. Alternatively or additionally, two or more antibodies disclosed herein and binding to the same or two or more different antigens may be co-administered to the patient. Sometimes it is also advantageous to administer one or more cytokines to the patient. In a preferred embodiment, the antibodies herein are co-administered with a growth inhibitor. For example, a growth inhibitor is administered first, followed by administration of an antibody of the invention. However, it is also conceivable to co-administer or to administer the anticancer agent of the invention first. Suitable doses for growth inhibitors are those currently used, but may be reduced by the combined (synergistic) effect of the growth inhibitor and the antibody.
      [0110]
  In one embodiment, tumor angiogenesis is attacked in combination therapy. Anti-PRO polypeptide antibodies and other antibodies (eg, anti-VEGF) are administered to a tumor-bearing patient in a therapeutically effective amount, eg, determined to result in necrosis of a tumor or metastatic lesion. This treatment is continued until favorable effects are observed or there is no evidence of a tumor or any metastatic lesion. TNF is then supplemented with adjuvants such as alpha-, beta- or gamma-interferon, anti-HER2 antibody, heregulin, anti-heregulin antibody, D-factor, interleukin-1 (IL-1), interleukin- 2 (IL-2), granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), or a microvascular procoagulant in tumors, such as anti-protein C antibody, anti-protein S antibody, or C4b binding protein (1991 WO91 / 01753 published on February 21).
  The adjuvant depends on its effectiveness and it is desirable to compare the impact on the tumor by a matrix that is screened in a convenient manner. Administration of the anti-PRO polypeptide antibody and TNF is repeated until the desired clinical effect is achieved. Also, the anti-PRO polypeptide antibody is administered with TNF, optionally with adjuvants. In instances where a solid tumor is found in the limb or other location that allows isolation from the general circulation, the therapeutic agents described herein are administered to the isolated tumor or organ. In another embodiment, an FGF or PDGF antagonist, such as an anti-FGF or anti-PDGF neutralizing agent, is administered to the patient along with the anti-PRO polypeptide antibody. Treatment with the anti-PRO polypeptide antibody is preferably discontinued during the period of wound healing or desired neovascularization.
  For the prevention or treatment of cardiovascular, endothelial and angiogenic diseases, the appropriate doses of the antibodies herein may be the type of disease to be treated, the severity and course of the disease, the prevention or prevention as defined above. Whether the drug is administered for therapeutic purposes, previous treatment, the patient's clinical history and response to antibodies, and the discretion of the attending physician. The antibody is suitably administered to the patient at one time or over a series of treatments.
  For example, depending on the type and severity of the disease, about 1 μg / kg to 50 mg / kg (eg, 0.1-20 mg / kg) of the antibody may be administered, for example, in one or more separate doses or by continuous infusion. In any case, it is the first candidate dose to administer to the patient. A typical daily dosage might range from about 1 μg / kg to 100 mg / kg or more, depending on the factors mentioned above. For repeated administrations over several days or longer, depending on the condition, treatment is continued until the desired suppression of disease symptoms occurs. However, other dosage regimens may be useful. The progress of this therapy is easily monitored by conventional techniques and assays, such as X-ray tumor imaging.
      [0111]
xi. Products
  Also provided is an article of manufacture comprising a container containing the antibody and a label. Such articles of manufacture are described above, where the active agent is anti-PRO179, anti-PRO238, anti-PRO364, anti-PRO844, anti-PRO846, anti-PRO1760, anti-PRO205, anti-PRO321, anti-PRO321. PRO333, anti-PRO840, anti-PRO877, anti-PRO878, anti-PRO879, anti-PRO882, anti-PRO885 or anti-PRO887 antibody.
xii. Diagnosis and prediction of tumors using antibodies
  If the indication for which the antibody is to be used is cancer, cell surface proteins such as growth receptors that are overexpressed in certain tumors are excellent candidates for candidate drugs or tumor (eg, cancer) treatment, but PRO poly The same proteins as peptides find additional use in the diagnosis and prognosis of tumors. For example, antibodies directed against the PRO polypeptides can be used in the diagnosis and prognosis of tumors.
  For example, an antibody comprising an antibody fragment can be used for qualitative or quantitative detection of expression of a gene, including a gene encoding a PRO polypeptide. The antibody is preferably provided with a detectable, eg, fluorescent, label, and binding can be monitored by light microscopy, flow cytometry, fluorometry, or other techniques known in the art. Such a binding assay is performed substantially as described above.
  In situ detection of antibodies that bind to the marker gene product can be performed, for example, by immunofluorescence or immunoelectron microscopy. For this purpose, a histological sample is removed from the patient and a labeled antibody is applied to it, preferably by overlaying the antibody on a biological sample. This approach also allows the distribution of the marker gene product in the tissue being tested to be determined. It will be apparent to those skilled in the art that a wide variety of histological methods are readily available for in situ detection.
      [0112]
  The following examples are provided for illustrative purposes only, and are not intended to limit the scope of the invention in any way.
  The entire disclosures of all patents and literature cited herein are hereby incorporated by reference.
(Example)
  Commercial reagents referred to in the examples were used according to manufacturer's instructions unless otherwise indicated. The source of cells identified by the ATCC accession number in the examples below and throughout the specification is the American Type Culture Collection, Manassas, VA. Unless otherwise noted, the present invention used standard techniques of recombinant DNA technology, such as those described in the textbooks above and below: Sambrook et al., Supra; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing). Associates and Wiley Interscience, NY, 1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc .; NY., 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold). Spring Harbor 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press, Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991.
      [0113]
Example 1
Extracellular domain homology screening to identify novel polypeptides and cDNAs encoding them
  Extracellular domain (ECD) sequences (including secretory signal sequences, if any) from about 950 known secreted proteins from the Swiss-Prot public database were used to search the EST database. EST databases include public databases (eg, GenBank) and corporate databases (eg, LIFESEQ (trade name), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). The search was performed using the computer program BLAST or BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)) as a comparison of the ECD protein sequence with the six frame translation of the EST sequence. Comparatives that do not encode a known protein and have a BLAST score of 70 (sometimes 90) or higher are pooled with the program "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA) and consensus DNA sequences Was built.
  Using this extracellular domain homology screen, phrap was used to construct a consensus DNA sequence against other identified EST sequences. In addition, the resulting consensus DNA sequence is often (but not always) extended using BLAST or BLAST-2 and phrap repeat cycles, and the consensus sequence is made as far as possible using the EST sequence sources discussed above. Extended.
  Based on the consensus sequence obtained above, oligonucleotides are then synthesized, PCR is used to identify a cDNA library containing the sequence of interest, and a clone of the full length coding sequence of the PRO polypeptide is isolated. Used for use as a probe. Forward and reverse PCR primers generally range from 20 to 30 nucleotides and often give a PCR product about 100-1000 bp in lengthLikeDesigned to. Probe sequences are typically 40-55 bp in length. In some cases, additional oligonucleotides are synthesized when the consensus sequence is greater than about 1-1.5 kbp. To screen several libraries for full-length clones, DNA from the libraries was analyzed by Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology,AbovePCR with a PCR primer pairamplificationScreened. The positive library was then used to isolate clones encoding the gene of interest using the probe oligonucleotide and one of the primer pairs.
  The cDNA library used to isolate the cDNA clones was made by standard methods using commercially available reagents such as those from Invitrogen, San Diego, CA. The cDNA is primed with oligo dT containing a NotI site, ligated to the SalI hemikinase adapter with blunt ends, cut with NotI, appropriately sized by gel electrophoresis, and a suitable cloning vector (such as pRK5B or pRK5D; pRK5B is a precursor of pRK5D that does not contain an SfiI site; see Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991)) and was cloned in a unique orientation at the unique XhoI and NotI sites.
      [0114]
Example 2
Isolation of cDNA clones by amylase screening
  1. Preparation of oligo dT primed cDNA library
  mRNA was isolated from human tissues of interest using reagents and protocols from Invitrogen, San Diego, CA (Fast Track 2). This RNA was used to generate oligo dT primed cDNA in vector pRK5D using reagents and protocols from Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script Plasmid System). In this method, double-stranded cDNAs were sized at over 1000 bp and SalI / NotI-linked cDNAs were cloned into XhoI / NotI-cut vectors. pRK5D was cloned into a vector having a sp6 transcription initiation site, followed by a SfiI restriction enzyme site, and a further XhoI / NotI cDNA cloning site.
  2. Preparation of random primed cDNA library
  The 5 'end of the primary cDNA clone is preferablyYouFor this purpose, a secondary cDNA library was prepared. Sp6 RNA was generated from the primary library (described above) and this RNA was converted to the vector pSST-AMY. 0 was used to generate a random primed cDNA library using reagents and protocols from Life Technologies (Super Script Plasmid System referenced above). In this method, double-stranded cDNA was sized to 500-1000 bp, ligated to the NotI adapter with blunt ends, cut at the SfiI site, and cloned into the SfiI / NotI cut vector. pSST-AMY. 0 is the yeast alcohol dehydrogenase promoter before the cDNA cloning siteHasAnd, after the cloning site, a mouse amylase sequence (a mature sequence without a secretion signal)ContinueThis is a cloning vector having a yeast alcohol dehydrogenase transcription termination domain. Thus, a cDNA cloned into this vector that fuses in frame with an amylase sequence will direct secretion of amylase from a suitably transfected yeast colony.
      [0115]
  3. Transformation and detection
  DNA from the library described in the two paragraphs above was chilled on ice and electrocompetent DH10B bacteria (Life Technologies, 20 ml) were added. The mixture of bacteria and vector was then electroporated as recommended by the manufacturer. Then, SOC medium (Life Technologies, 1 ml) was added and the mixture was incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Transformants were then plated on 20 standard 150 mm LB plates containing ampicillin and incubated for 16 hours (37 ° C.). Positive colonies were discarded from the plates and DNA was isolated from the bacterial pellet using standard methods, for example using a CsCl- gradient. The purified DNA was then subjected to the following yeast protocol:ConductWas.
  yeastLawIs threeCategories(2) detection and isolation of amylase-secreting yeast clones; and (3) PCR amplification of inserts directly from yeast colonies. Purification of DNA for sequencing and further analysis.
  The yeast strain used was HD56-5A (ATCC-90785). This strain has the following genotypes: MATalpha, ura3-52, leu2-3, leu2-112, his3-11, his3-15, MAL.⁺, SUC⁺, GAL⁺Having. Preferably, yeast mutants with incomplete post-translational pathways can be used. Such variants have translocation deficient alleles at sec71, sec72 and sec62, with truncated sec71 being most preferred. Alternatively, antagonists (including antisense nucleotides and / or ligands) that inhibit the normal operation of these genes, and other proteins involved in this post-translational pathway (eg, SEC61p, SEC72p, SEC62p, SEC63p, TDJ1p or SSA1p-) 4p) or complex formation of these proteins is also preferably used in combination with an amylase-expressing yeast.
  Transformation was performed based on the protocol outlined in Gietz et al., Nucl. Acid. Res., 20: 1425 (1992). The transformed cells were then inoculated from agar into YEPD complex medium broth (100 ml) and grown at 30 ° C. overnight. YEPD broth was prepared as described in Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994). Overnight medium was then approximately 2 × 10 5 in fresh YEPD broth (500 ml).⁶Cells / ml (about OD₆₀₀= 0.1) and 1 × 10⁷Cells / ml (about OD₆₀₀= 0.4-0.5).
      [0116]
  The cells are then harvested, transferred to a GS3 rotor bottle on a Sorval GS3 rotor for 5 minutes at 5,000 rpm, the supernatant is discarded, then prepared for transformation by resuspension in sterile water, and placed in a 50 ml Falcon tube. And centrifuged again at 3,500 rpm in a Beckman GS-6KR centrifuge. The supernatant is discarded and the cells are washed with LiAc / TE (10 ml, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7.5, 100 mM Li₂OOCCH₃) And resuspended in LiAc / TE (2.5 ml).
  MaBy mixing the prepared cells (100 μl) with fresh, denatured single-stranded salmon sperm DNA (Lofstrand Labs, Gaitherburg, MD) and transforming DNA (1 μg. Vol. <10 μl) in a microtube.Perform the transformationWas. The mixture was mixed briefly by vortexing, then 40% PEG / TE (600 μl, 40% polyethylene glycol-4000, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM Li₂OOCCH₃, pH 7.5) was added. The mixture was stirred gently and incubated at 30 ° C. with stirring for 30 minutes. The cells are then heat shocked at 42 ° C. for 15 minutes, the reaction vessel is centrifuged in a microtube at 12,000 rpm for 5-10 seconds, decanted and into TE (500 μl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7.5). Followed by centrifugation. The cells were then diluted in TE (1 ml) and an aliquot (200 μl) was spread on selective medium previously prepared in a 150 mm growth plate (VWR).
  Or multiplesmallNot a small reaction,1In a large-scale reactionformQuality changeToAnd the amount of reagentAs appropriateScale-upLetWas.
  The selection medium used was synthetic complete dextrose agar lacking uracil prepared as described in Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994). (SCD-Ura). Transformants were grown at 30 ° C. for 2-3 days.
  Detection of amylase secreting colonies was performed by inclusion of red starch in the selective growth medium. Starch was coupled to a red dye (reactive Red-120, Sigma) according to the method described by Biely et al., Anal. Biochem., 172: 176-179 (1988). The bound starch was introduced to SCD-Ura agar plates at a final concentration of 0.15% (w / v) and buffered to pH 7.0 with potassium phosphate (50-100 mM final concentration).
  Positive colonySelect,Streaking on fresh selection medium (150 mm plate) yielded a single colony that was well isolated and identifiable. Well isolated colonies positive for amylase secretion were detected by direct introduction of the red cluster on buffered SCD-Ura agar. Degradation of starch allows direct visualization around positive coloniesClearPositive colonies were determined by their ability to produce halo.
      [0117]
  4. DNA isolation by PCR amplification
  If a positive colony was isolated, a portion was picked with a toothpick and diluted in sterile water (30 μl) in a 96-well plate. At this point, positive colonies are either frozen and stored for further analysis, or are amplified immediately. Aliquots (5 μl) of cells were collected with 0.5 μl Klentaq (Clontech, Palo Alto, CA); 4.0 μl 10 mM dNTP (Perkin Elmer-Cetus); 2.5 μl Kentaq buffer (Clontech); 0.25 μl forward oligo 1; 0.25 μl inverted oligo 2; used as template for PCR reaction in 25 μl volume containing 12.5 μl distilled water. The sequence of forward oligonucleotide 1 is:
  5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3 '
(SEQ ID NO: 33).
The sequence of reverse oligonucleotide 2 is:
  5'-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3 '
(SEQ ID NO: 34).
  The PCR was then performed as follows:
  a. Denaturation 92 ° C, 5 minutes
  b. Next 3 cycles: Denaturation 92 ° C, 30 seconds
                        Annealing 59 ° C, 30 seconds
                        Extension 72 ° C, 60 seconds
  c. Next 3 cycles: Denaturation 92 ° C, 30 seconds
                        Annealing 57 ° C, 30 seconds
                        Extension 72 ° C, 60 seconds
  d. Next 25 cycles: Denaturation 92 ° C, 30 seconds
                        Annealing 55 ° C, 30 seconds
                        Extension 72 ° C, 60 seconds
  e. Hold 4 ℃
  The underlined regions are annealed to the ADH promoter region and the amylase region, respectively. Amplify the 307 bp region from 0. Typically, the first 18 nucleotides at the 5 'end of these oligonucleotides contained the annealing site of the sequence primer. That is, the total product of the PCR reaction from the empty vector was 343 bp. However, the signal sequence fusion cDNA resulted in a considerably longer nucleotide sequence.
  Following PCR, aliquots of the reaction (5 μl) were agarose gel electrophoresed in a 1% agarose gel using a Tris-borate-EDTA (TBE) buffer system as described in Sambrook et al., Supra. Tested. Clones yielding a single strong PCR product of greater than 400 bp were further analyzed by DNA sequence after purification on a 96 Qiaquick PCR purification column (Qiagen Inc., Chatsworth, CA).
      [0118]
Example 3
Isolation of cDNA clones using signal algorithm analysis
  The various polypeptide-encoding nucleic acid sequences areTsuKCompanyUnique sequence discovery algorithms developed by (South San Francisco, CA) from public (eg, GenBank) and / or private (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA) databases. ESTs as well as populations and assembled EST fragments. The signal sequence algorithm calculates a secretion signal score based on the nature of the DNA nucleotides surrounding the first and possibly second methionine codon (ATG) at the 5'-end of the sequence or sequence fragment under consideration. The nucleotide following the first ATG must encode for at least 35 non-obvious amino acids without a stop codon. If the first ATG has the required amino acids, the second is not tested. If none of the requirements were met, no candidate sequences were scored. To determine whether the EST sequence contains a genuine signal sequence, the DNA surrounding the ATG codon and the corresponding amino acid sequence were analyzed using a set of seven sensors (evaluation parameters) known to be associated with secretion signals. And scored. The use of this algorithm has led to the identification of many polypeptide-encoding nucleic acid sequences.
      [0119]
Example 4
Isolation of cDNA clones Encoding Human PRO179
  cDNA was isolated by screening as described in Example 2 above. The cDNA sequence isolated in the above screen was found by BLAST and FastA sequence alignment to have sequence homology to the nucleotide sequence encoding the angiopoietin protein. This cDNA sequence is herein designated as DNA10028 and / or DNA25250.
  Based on sequence homology, probes were prepared from the sequence of the DNA10028 molecule and used to screen a human fetal liver library (LIB6) prepared as described in paragraph 1 of Example 2 above. The cloning vector was pRK5B (pRK5B is a precursor of pRK5D that does not contain an SfiI site; see Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991)), and the cDNA size cut was less than 2800 bp.
  The DNA sequence of the clone isolated as described above provided the full length DNA sequence of PRO179 and the derived protein sequence of PRO179. The full length nucleotide sequence of DNA16451-1388 is shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1). Clone DNA16451-1388 contains a single open reading frame with an apparent translational initiation site at nucleotide positions 37-39 and a stop signal at nucleotide positions 1417-1419 (FIG. 1). The predicted polypeptide precursor is 460 amino acids long (Figure 2, SEQ ID NO: 2), and the full length PRO179 protein shown in Figure 2 has a calculated molecular weight of approximately 53,637 daltons and an estimated pI of approximately 6.61. Have.
  Analysis of the full-length PRO179 sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2) revealed the presence of various important polypeptide domains as shown in FIG. 2, and the positions assigned to those important polypeptide domains. Is approximately as described above. Analysis of the full-length PRO179 sequence (FIG. 2, SEQ ID NO: 2) revealed the following: a signal peptide of about amino acid 1 to about amino acid 16; about amino acid 120 to about amino acid 142 and about amino acid 127 to about amino acid 149. A N-glycosylation site of about amino acid 23 to about amino acid 27, about amino acid 115 to about amino acid 119, about amino acid 296 to about amino acid 300, and about amino acid 357 to about amino acid 361; and about amino acid 271 to about amino acid 271. The fibrinogen β and γ chain C-terminal domains of amino acid 310, about amino acid 312 to about amino acid 322, about amino acid 331 to about amino acid 369, and about amino acid 393 to about amino acid 424.
  Clone DNA16451-1388 was deposited with the ATCC on April 14, 1998, and is assigned ATCC deposit no. 209776. With respect to sequence, it is understood that the inserted clone contains the correct sequence, and that the sequences provided herein are based on known sequencing techniques.
  Analysis of the amino acid sequence of the full-length PRO179 sequence suggests that it has significant similarity to proteins of the angiopoietin family, and thus PRO179 is a novel member of the angiopoietin family. More specifically, analysis of the Dayhoff database (version 35.45 Swiss Prot 35) revealed significant homology between the PRO179 amino acid sequence and the following Dayhoff sequences: AF004326_1, P_R94605, HSU83508_1, P_R94603, P_R94317, AF025818_1, HSY16132_1, P_R65760, I37391 and HUMRSC192_1.
      [0120]
Example 5
Isolation of cDNA clones Encoding Human PRO238
  As described in Example 1 above, consensus DNA sequences were assembled for other ESTs using phrap. This consensus sequence is herein designated DNA30908. Based on the DNA30908 consensus sequence, oligonucleotides were synthesized to 1) identify a cDNA library containing the sequence of interest by PCR, and 2) use it as a probe to isolate a clone of the full-length coding sequence for PRO238. did. In addition, a synthetic oligonucleotide hybridization probe was generated from the consensus DNA30908 sequence.
  To screen several libraries for full-length clones, DNA from the libraries was screened by PCR amplification with a PCR primer pair according to Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra. The positive library was then used to isolate clones encoding the PRO238 gene using the probe oligonucleotide and one of the primer pairs.
  PCR primers (forward and reverse) were synthesized:
Forward PCR primer 1:
  5′-GGTGCTAAACTGGTGCTCTGTGGC-3 ′ (SEQ ID NO: 35)
Forward PCR primer 2:
  5'-CAGGGCAAGA TGAGCATTCC-3 '(SEQ ID NO: 36)
Reverse PCR primer:
  5'-TCATACTGTTCCATCTCGGCACGC-3 '(SEQ ID NO: 37)
Hybridization probe:
  5'-AATGGTGGGGCCCTAGAAGAGCTCATCAGAGAACTCACCGCTTCTCATGC-3 '(SEQ ID NO: 38)
  RNA for construction of the cDNA library was isolated from human fetal liver tissue. The cDNA library used to isolate the cDNA clones was formed by standard methods using commercially available reagents such as those from Invitrogen, San Diego, CA. The cDNA is primed with an oligo dT containing a NotI site, ligated at the blunt end of a SalI hemikinase adapter, cut with NotI, appropriately size-digested by gel electrophoresis, and in a predetermined direction with an appropriate cloning vector (pRKB PRK5B is a precursor of pRK5D without an SfiI site; see Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991)) and cloned at unique Xhol and NotI sites.
  DNA sequencing of the clones isolated as described above yielded the full length DNA sequence for full length PRO238 [herein designated as DNA35600-1162] (FIG. 3, SEQ ID NO: 3) and its derived protein sequence for PRO238. Was.
  The entire nucleotide sequence of DNA35600-1162 is shown in FIG. 3 (SEQ ID NO: 3). Clone DNA35600-1162 contains a single open reading frame with an apparent translational initiation site at nucleotide positions 134-136 and an apparent stop codon at nucleotide positions 1064-1066 (FIG. 3). The predicted polypeptide precursor is 310 amino acids long (Figure 4, SEQ ID NO: 4), has a calculated molecular weight of approximately 33,524 daltons and an estimated pI of approximately 9.55.
  Analysis of the full-length PRO238 sequence shown in FIG. 4 (SEQ ID NO: 4) revealed the presence of various key polypeptide domains as shown in FIG. 4 and was assigned to those key polypeptide domains. The location is approximately as described above. Analysis of the full-length PRO238 polypeptide (FIG. 4, SEQ ID NO: 4) revealed the following: a signal sequence from about amino acid 1 to about amino acid 21; about amino acid 102 to about amino acid 119 and about amino acid 278 to about amino acid 278. A transmembrane domain of amino acid 292; an N-glycosylation site from about amino acid 228 to about amino acid 232; a glycosaminoglycan attachment site from about amino acid 47 to about amino acid 51; a tyrosine kinase phosphorylation site from about amino acid 145 to about amino acid 153; An N-myristoylation site of about amino acid 44 to about amino acid 50, about amino acid 105 to about amino acid 111, about amino acid 238 to about amino acid 244, about amino acid 242 to about amino acid 248, and about amino acid 291 to about amino acid 297; About 26 amino acids Amidation sites; and from about amino acid 6 is a prokaryotic membrane Hanarefu protein lipid attachment site from about amino acid 17. Clone DNA35600-1162 was deposited with the ATCC on October 16, 1997 and has been assigned ATCC deposit number 209370.
  Analysis of the amino acid sequence of the full-length PRO238 polypeptide suggested that the portion had significant homology to reductases, particularly oxidoreductases, thereby indicating that PRO238 could be a novel reductase.
      [0121]
Example 6
Isolation of cDNA clones Encoding Human PRO364
  A search of the expressed sequence tag (EST) DNA database (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, Calif.) Encoded polypeptides showing homology to members of the tumor necrosis factor receptor (TNFR) family of polypeptides. EST (Incyte EST no. 3003460) was identified.
  Using the BLAST (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)) and "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) repetitive cycles to Incyte EST no. 3003460 and other EST sequences. A consensus DNA sequence was constructed. The consensus sequence is herein designated "<consen01>" and is also referred to herein as DNA44825.
  Based on DNA44825 and the "<consen01>" consensus sequence, 1) to identify a cDNA library containing the sequence of interest by PCR, and 2) to use as a probe to isolate a clone of the full length coding sequence of PRO364. Next, an oligonucleotide probe was synthesized. Forward and reverse PCR primers generally range from 20 to 30 nucleotides and are often designed to give a PCR product of about 100-1000 bp in length. Probe sequences are typically 40-55 bp in length. To screen several libraries for full-length clones, DNA from the libraries was screened by PCR amplification with a PCR primer pair according to Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra. The positive library was then used to isolate clones encoding the gene of interest using the probe oligonucleotide and one of the primer pairs.
  The oligonucleotide sequences used are as follows:
Forward PCR primer (44825.f1):
5'-CACAGCACGGGGCGATGGG-3 '(SEQ ID NO: 39)
Forward PCR primer (44825.f2):
5'-GCTCTGCGTTCTGCTCTG-3 '(SEQ ID NO: 40)
Forward PCR primer (44825.GITR.f):
5'-GGCACAGCACGGGGCGATGGGCGCGTTT-3 '(SEQ ID NO: 41)
Reverse PCR primer (44825.r1):
5'-CTGGTCACTGCCACCTTCCTGCAC-3 '(SEQ ID NO: 42)
Reverse PCR primer (44825.r2):
5'-CGCTGACCCAGGCTGAG-3 '(SEQ ID NO: 43)
Forward PCR primer (44825.GITR.r):
5'-GAAGGTCCCCGAGGCACAGTCGATACA-3 '(SEQ ID NO: 44)
In addition, a synthetic oligonucleotide hybridization probe was made from the DNA44825 consensus sequence, which had the following nucleotide sequence:
Hybridization probe (44825.p1):
5'-GAGGAGTGCTGTTCCGAGTGGGACTGCATGTGTGTCCAGC-3 '(SEQ ID NO: 45)
Hybridization probe (44825.GITR.p):
5'-AGCCTGGGTCAGCGCCCCACCGGGGGTCCCGGGTGCGGCC-3 '(SEQ ID NO: 46)
  To screen several libraries for sources of full-length clones, DNA from the libraries was PCR amplified with the PCR primer pairs identified above. The positive library was then used to isolate clones encoding the PRO364 gene using the probe oligonucleotide and one of the PCR primer pairs.
  RNA for construction of the cDNA library was isolated from human bone marrow tissue. The cDNA library used to isolate the cDNA clones was formed by standard methods using commercially available reagents such as those from Invitrogen, San Diego, CA. The cDNA is primed with an oligo dT containing a NotI site, ligated at the blunt end of a SalI hemikinase adapter, cut with NotI, appropriately size-digested by gel electrophoresis, and in a predetermined direction with an appropriate cloning vector (pRKB PRK5D is a precursor of pRK5D without an SfiI site; see Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991)) and cloned at unique Xhol and NotI sites.
  The cDNA clone was identified and completely sequenced. The full length nucleotide sequence of DNA47365-1206 is shown in FIG. 5 (SEQ ID NO: 5). Clone DNA47365-1206 contains a single open reading frame with an apparent translational initiation site at nucleotide positions 121-123 and a stop codon at nucleotide positions 844-846 (FIG. 5; SEQ ID NO: 5). The predicted polypeptide precursor is 241 amino acids long, has a calculated molecular weight of about 26,000 daltons and an estimated pI of about 6.34. The full length PRO364 protein is shown in FIG. 6 (SEQ ID NO: 6).
      [0122]
  Analysis of the full-length PRO364 sequence shown in FIG. 6 (SEQ ID NO: 6) revealed the presence of various important polypeptide domains as shown in FIG. 6, and the positions assigned to those important polypeptide domains. Is approximately as described above. Analysis of the full length PRO364 sequence (FIG. 6; SEQ ID NO: 6) revealed the following: a signal peptide from about amino acid 1 to about amino acid 25; a transmembrane domain from about amino acid 162 to amino acid 180; N-glycosylation site from about amino acid 5 to about amino acid 11, from about amino acid 8 to about amino acid 14, from about amino acid 25 to about amino acid 31, from about amino acid 30 to about amino acid 36, from about amino acid 33 to about amino acid 39 An N-myristoylation site of about amino acid 118 to about amino acid 124, about amino acid 122 to about amino acid 128, about amino acid 156 to about amino acid 162; a prokaryotic membrane protein lipid binding site of about amino acid 166 to about amino acid 177; 171 to about amino acid 193 leucine Zipper pattern.
  Clone DNA47365-1206 was deposited with the ATCC on November 7, 1997 and was assigned ATCC deposit no. 209436.
  Analysis of the amino acid sequence of the full-length PRO364 polypeptide suggests that some have significant homology to members of the tumor necrosis factor receptor family, thus indicating that PRO364 is a novel member of the tumor necrosis factor receptor family. Is shown. The intracellular domain of PRO364 contains a motif (in the region of amino acids 207-214) similar to the minimal domain of the CD30 receptor that has been shown to be required for TRAF2 binding, and is present in TNFR2. There are three apparent extracellular cysteine-rich domains characteristic of the TNFR family (see Naismith and Sprang, Trends Biochem. Sci., 23: 74-79 (1998)), and the third CRD is of the TNFR family. It has three rather than the more typical four or six cysteines. Compared to mouse CRD1 (described below), the PRO364 amino acid sequence has eight cysteines in CRD1 and five potential N-linked glycosylation sites in mouse GITR, versus five cysteines in CRD1 of mouse GITR. In contrast, the ECD has one potential N-linked glycosylation site.
  A detailed examination of the amino acid sequence of the full-length PRO364 polypeptide and the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence provides a mouse GITR reported in Nocentini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 6216-6221 (1997). The sequence homology with the (mGITR) protein was revealed. Thus, PRO364 represents the human counterpart of the mouse GITR protein reported by Nocentini et al.
      [0123]
Example 7
Isolation of a cDNA clone encoding human PRO844
  An expression sequence tag (EST) DNA database (LIFESEQ (trade name), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) was searched, and it was confirmed that EST had sequence identity with LP. Based on the information and findings obtained here, this EST clone, the insight clone 2657496 from the cancerous lung library (309-LUNGTUT09), was further investigated.
  The cDNA clone was identified and completely sequenced. The full length nucleotide sequence of DNA59838-1462 is shown in FIG. 7 (SEQ ID NO: 7). Clone DNA59838-1462 contains a single open reading frame with an apparent translational initiation site at nucleotide positions 5-7 and a stop codon at nucleotide positions 338-340 (FIG. 7; SEQ ID NO: 7). The predicted polypeptide precursor is 111 amino acids long, has a calculated molecular weight of approximately 12,050 daltons and an estimated pI of approximately 5.45. The full length PRO844 protein is shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 8).
  Analysis of the full-length PRO844 sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 8) revealed the presence of various important polypeptide domains as shown in FIG. 8, and the positions assigned to those important polypeptide domains. Is approximately as described above. Analysis of the full length PRO844 sequence (FIG. 8; SEQ ID NO: 8) revealed the following: about amino acid 1
From about amino acid 23 to about amino acid 29, from about amino acid 27 to about amino acid 33, from about amino acid 32 to about amino acid 38, from about amino acid 102 to about amino acid 108, the N-myristoylation site; A WAP-type "4-disulfide core" domain signature from about amino acid 63 to about 63 amino acids.
  Clone DNA59838-1462 was deposited with the ATCC on June 16, 1998 and has been assigned ATCC deposit no. The deposited clone has a sequence that is substantially more correct than the representation provided herein.
  Analysis of the amino acid sequence of full-length PRO844 polypeptide shows significant homology to serine protease inhibitors, thus suggesting that PRO844 is a novel proteinase inhibitor. More specifically, analysis of the Dayhoff database (version 35.45 Swiss Prot 35) revealed significant homology between the PRO844 amino acid sequence and the following Dayhoff sequences: ALK1_HUMAN, P_P82403, P_P82402, ELAF_HUMAN and P_P60950.
      [0124]
Example 8
Isolation of a cDNA clone encoding human PRO846
    As described in Example 1 above, a consensus DNA sequence was constructed for other EST sequences using phrap. This consensus sequence is herein designated DNA39949 and "<consen1322>". Based on the DNA39949 consensus sequence and "<consen1322>", 1) to identify a cDNA library containing the sequence of interest by PCR, and 2) to use as a probe to isolate a clone of the full length coding sequence of PRO846. Next, an oligonucleotide was synthesized. PCR primers (forward and reverse) are synthesized based on DNA39949 and the "<consen1322>" consensus sequence. In addition, synthetic nucleotide hybridization probes are constructed from the consensus DNA 30908 sequence.
  To screen several libraries for full-length clones, DNA from the libraries was screened by PCR amplification with a PCR primer pair according to Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra. The positive library was then used to isolate clones encoding the PRO846 gene using the probe oligonucleotide and one of the PCR primer pairs.
  The following nucleotide sequence was obtained by the above method:
Forward PCR primer (39949.fl):
  5'-CCCTGCAGTGCACCTACAGGGAAG-3 '(SEQ ID NO: 47)
Reverse PCR primer (39949.rl):
  5'-CTGTCTTCCCCTGCTTGGCTGTGG-3 '(SEQ ID NO: 48)
In addition, a synthetic oligonucleotide hybridization probe with the following nucleotide sequence was constructed from the consensus DNA39949 sequence:
Hybridization probe (39949.pl):
  5'-GGTGCAGGAAGGGTGGGATCCTCTTCTCTCGCTGCTCTGGCCACATC-3 '(SEQ ID NO: 49)
  RNA for construction of the cDNA library was isolated from human fetal kidney tissue (LIB227). The cDNA library used to isolate the cDNA clones was created by standard methods using, for example, commercially available reagents from Invitrogen, San Diego, CA. The cDNA is primed at the NotI site, ligated at the blunt end of the SalI hemikinase adapter, cut with NotI, appropriately size-separated by gel electrophoresis, and in a determined direction with an appropriate cloning vector (such as pRKB or pRKD). PRK5B is a precursor of pRK5D without an SfiI site; cloned at the unique Xhol and NotI sites in Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991)).
  By DNA sequencing of the clones isolated as described above, the full-length DNA sequence of PRO846 polypeptide [herein designated as DNA44196-1353] (FIG. 9, SEQ ID NO: 9) and the derived protein sequence of PRO846 polypeptide was gotten.
  The full length nucleotide sequence of DNA44196-1353 is shown in FIG. 9 (SEQ ID NO: 9). Clone DNA44196-1353 has a single open reading frame, an apparent translational initiation site at nucleotide positions 25-27, and a stop signal at nucleotide positions 1021-1102 (FIG. 9). The predicted polypeptide precursor is 332 amino acids long, has a calculated molecular weight of approximately 36,143 daltons and an estimated pI of approximately 5.89 (FIG. 10, SEQ ID NO: 10).
  Analysis of the full-length PRO846 sequence shown in FIG. 10 (SEQ ID NO: 10) demonstrated the presence of various key polypeptide domains shown in FIG. 10, but was given to those key polypeptide domains. The location is approximately as described above. Analysis of the full length PRO846 sequence (FIG. 10; SEQ ID NO: 10) demonstrated the presence of the following: a signal peptide from about amino acid 1 to about amino acid 17; a transmembrane domain from about amino acid 248 to about amino acid 269; N-glycosylation site at about amino acid 100; fibrogen β and γ chain C-terminal domains from about amino acid 104 to about amino acid 114; Ig-like V-type domain from about amino acid 13 to about amino acid 128. Clone DNA44196-1353 was deposited with the ATCC on May 6, 1998 and was assigned ATCC deposit no. 209847.
      [0125]
Example 9
Isolation of a cDNA clone encoding human PRO1760
  EST cluster sequences were identified from the Incyte database by using the signal sequence algorithm described in Example 3 above. This EST cluster sequence is then compared to various expression sequence tag (EST) databases, including public databases (eg, GenBank) and corporate EST DNA databases (LIFESEQ ™, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). Identified existing homologies. One or more ESTs were obtained from a prostate cancer library. Homolog searches were performed using the computer program BLAST or BLAST2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)). Comparisons that do not encode a known protein and have a BLAST score of 70 (sometimes 90) or higher can be grouped with the program "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) to consensus DNA sequences. Was built. The consensus sequence obtained therefrom is herein designated DNA58798.
  In view of the sequence homology between the DNA58798 sequence and the sequence contained in Incyte's EST clone 3358745, a clone containing this EST was purchased, a cDNA insert was obtained and sequenced. Here, the insert was found to encode a full-length protein. The sequence of this cDNA insert is shown in FIG. 11 (SEQ ID NO: 11) and is herein designated as DNA76532-1702.
  Clone DNA76532-1702 contains a single open reading frame, has an apparent translational initiation site at nucleotide positions 60-62, and terminates at the stop codon at nucleotide positions 624-626 (FIG. 11). The predicted polypeptide precursor is 188 amino acids long (Figure 12, SEQ ID NO: 12). Fig. The full length PRO1760 protein shown in Figure 12 has a calculated molecular weight of about 21,042 daltons and an estimated pI of about 5.36.
  Analysis of the full-length PRO1760 sequence shown in FIG. 12 (SEQ ID NO: 12) demonstrated the presence of various key polypeptide domains shown in FIG. 12, but was given to those key polypeptide domains. The location is approximately as described above. Analysis of the full length PRO1760 sequence demonstrated the following: a signal peptide of about amino acid 1 to about amino acid 20; an N-glycosylation site of about amino acid 121 to about amino acid 125 and about amino acid 171 to about amino acid 175; about amino acid 54 From about amino acid 60 to about amino acid 160 and from about amino acid 160 to about amino acid 166. Clone DNA76532-1702 was deposited with the ATCC on November 17, 1998, and assigned ATCC deposit no. 203473.
  Analysis of the Dayhoff database (version 35.45 SwissProt 35) using the WU-BLAST2 sequence alignment analysis of the full-length sequence shown in FIG. 12 (SEQ ID NO: 12) revealed that the amino acid sequence of PRO1760 and the following Dayhoff sequence: CELT07F12_2 , T22J18_16, ATF1C12_3, APE3_YEAST, P_W22471, SAU56908_1, SCPA_STRPY, ATAC00423817, SAPURCLUS_2 and AF041468_9.
      [0126]
Example 10
Stimulation of cardiac neonatal hypertrophy (Assay 1)
  This assay is designed to measure the ability of the PRO polypeptide to stimulate neonatal heart hypertrophy. PRO polypeptides that test positive in this assay are expected to be available for therapeutic treatment of various heart failure diseases.
  Myocytes were obtained from 1 day old Harlan Sprague Dawley rats. Cells (7.5x10⁴180 μl / ml, serum <0.1%, freshly isolated) was added on day 1 to a 96-well plate previously coated with DMEM / F12 + 4% FCS. Test samples (20 μL / well) containing test PRO polypeptide or growth medium alone (negative control) were added directly to the wells on day 1. Then on day 2 the final concentration is 10^-6M is added to PGF (20 μL / well). Cells were then stained on day 4 and scored visually on day 5, where cells that did not increase in size (compared to the negative control) scored 0.0, indicating a small to medium increase in size. Cells that showed (compared to the negative control) scored 1.0 and cells that showed a larger increase in size (compared to the negative control) scored 2.0. A positive result in this assay was a score of 1.0 or higher.
  The following table4PRO882 tested positive in this assay, as shown in FIG.

      [0127]
Example 11
Inhibition of endothelial cell growth and proliferation stimulated by vascular endothelial growth factor (VEGF) (Assay 9)
  The ability of various PRO polypeptides to inhibit VEGF-stimulated proliferation of endothelial cells was tested. Polypeptides that test positive in this assay serve to suppress endothelial cell growth in mammals and have a beneficial effect, for example, in suppressing tumor growth.
  In particular, bovine adrenocortical capillary endothelial cells (ACE) (from primary culture, up to 12-14 passages) were plated at 500 cells / well per 100 microliter in 96 well plates. The assay medium contains low glucose DMEM, 10% calf serum (not fetal calf), 2 mM glutamine, and 1 × penicillin / streptomycin / fungizone. Control wells include: (1) no ACE cells added; (2) ACE cells only; (3) ACE cells + 5 ng / ml VEGF; (4) ACE cells + 3 ng / ml VEGF; (5) ACE cells + 3 ng / ml VEGF + 1 ng / ml TGT. -Beta; and (6) ACE cells + 3 ng / ml VEGF + 5 ng / ml LIF. The test sample, poly-His-tagged PRO polypeptide (100 microliter volume) was then added to the wells (1%, 0.1% and 0.01% dilution, respectively). Cell culture medium at 37 ° C / 5% CO₂For 6-7 days. After the incubation, the medium in the wells was aspirated, and the cells were washed 1 × with PBS. The acid phosphatase reaction mixture (100 microliters, 0.1 M sodium acetate, pH 5.5, 0.1% Triton X-100, 10 mM p-nitrophenyl phosphate) was then added to each well. After incubation at 37 ° C. for 2 hours, the reaction was stopped by the addition of 10 microliters of 1N NaOH. Optical density (OD) was measured at 405 nm in a microtiter plate.
  The activity of the PRO polypeptide was calculated as the percent inhibition of VEGF (3 ng / ml) stimulated growth (as measured by acid phosphatase activity at OD 405 nm) on unstimulated cells. TGF-beta was used as an activity control at 1 ng / ml to block 70-90% of VEGF-stimulated ACE cell proliferation. The results, shown in Table 5 below, demonstrate the utility of the PRO polypeptides in treating cancer, particularly inhibiting tumor angiogenesis. The values shown in Table 5 (relative inhibition) calculate the percent inhibition of VEGF-stimulated growth by the PRO polypeptide relative to unstimulated cells and are then known to inhibit 70-90% of VEGF-stimulated cell growth. It is determined by dividing the percent by the percent inhibition obtained with 1 ng / ml TGF-β. The results were considered positive if the PRO polypeptide showed 30% or more inhibition of VEGF stimulation of endothelial cell growth (30% or more relative inhibition).

      [0128]
Example 12
Induction of c-fos in endothelial cells (assay 34)
  This assay is designed to determine whether a PRO polypeptide exhibits the ability to induce c-fos in endothelial cells. PRO polypeptides that tested positive in this assay were,For example, wound healingIncluding,Angiogenesis may be beneficialFor therapeutic treatment of symptoms and diseasesExpected to be effective(Similarly,Agonists of these PRO polypeptidesCan also be). PRO polypeptides tested positive in this assayAntagonistsIs expected to be useful for therapeutic treatment of cancerous tumors.
  Growth medium (50% ham F12w / oGHT: low glucose and 50% DMEM without glycine: NaHCO₃Umbilical cord of a human vein in 1% glutamine, 10 mM HEPES, 10% FBS, 10 ng / ml bFGF)band1x10 venous endothelial cells (HUVEC, Cell Systems)⁴Cells / well at a cell density of 96 well macrotiter platesSowingWas. The next day after plating, the growth medium was removed and cells were removed from 100 μl / well of test sample and control (positive control: growth medium; negative control: 10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 4% (w / v) mannitol, pH 6. Cells were starved by treatment in 8). 5% CO₂For 30 minutes at 37 ° C. A sample was removed and the first part of the bDNA kit protocol (Chiron Diagnostics, cat. # 6005-037) was followed. Here, each upper case reagent / buffer below was available from the kit.
  Briefly, the amount of TM Lysis Buffer and probe required for the test was calculated based on the information provided by the manufacturer. Appropriate amount of thawed probe was added to TM lysis buffer. The Capture Hybridization Buffer was warmed to room temperature. The bDNA strips were set on a metal strip holder and 100 μl of capture hybridization buffer was added to each required b-DNA well and incubated for at least 30 minutes. cellHavingRemove the test plate from the incubatorbrothThe medium was gently removed using a vacuum manifold. Add 100 μl of lysis hybridization buffer containing probe to each well of the microtiter plate.PiAdded quickly with pets. The plate was then incubated for 15 minutes at 55 ° C. Remove from incubatorAt the timeThe plate was placed in a vortex mixer equipped with a microtiter adapter head and vortexed for 1 minute at setting # 2. Remove 80 μl of lysatebrothWas added to the bDNA wells containing the capture hybridization buffer and mixed by pipetting up and down. Plates were incubated for at least 16 hours at 53 ° C.
      [0129]
  The next day, the second part of the bDNA kit protocol was followed. That is, remove the plate from the incubatorbroth, Placed on bench and cooled for 10 minutes. The required addition volume depends on the manufacturer.OfferCalculated based on the information provided. Amplifier working solution was prepared by making a 1: 100 dilution of Amplifier Concentrate (20 fm / μl) in AL hybridization buffer. Hybridization mixtureFrom the plate,Wash twice with detergent AIWas. 50 μl of amplifier working solution was added to each well and the wells were incubated at 53 ° C. for 30 minutes. Then remove the plate from the incubatorbrothAnd cooled for 10 minutes. 1: 100 in AL hybridization bufferRarePardonofLabeled concentrate (40 pmoles/μl)WhenThus, a labeled probe working solution was prepared. After a 10 minute cooling time, the amplifier hybridization mixture istake outThe plate was washed twice with detergent A. 50 μl of labeled probe working solution was added to each well and the wells were incubated at 53 ° C. for 15 minutes. After cooling for 10 minutes, the substrate was warmed to room temperature. Necessary for the assaymlSubstrateRespectively, 3 μl of substrate enhancer was added, the plate was cooled for 10 minutes, the labeled hybridization mixture was removed, and the plate was washed twice with detergent A and three times with detergent D.D50μ containing enhancerlWas added to each well. Plates were incubated at 37 ° C for 30 minutes and RLU was read on a suitable luminometer.
  Duplicates were averaged to determine the coefficient of variation. The measurement of the fold increase of the activity relative to the value of the negative control (HEPES buffer described above) was expressed in chemiluminescence units (RLU). The results are shown in the table below.6Shown inPRO polypeptideA sample was considered positive if it showed a value at least twice that of the negative control. Negative control = 1.00 RLU at 1.00% dilution. Positive control = 8.39 RLU at 1.00% dilution.
      [0130]

      [0131]
Example 13
Stimulation of F2a-induced neonatal cardiac hypertrophy (Assay 37)
  This assay is designed to measure the ability of the PRO polypeptide to stimulate neonatal heart hypertrophy. PRO polypeptides that test positive in this assay are expected to be useful in treating various heart failure diseases and therapeutics.
  Myocytes were obtained from 1 day old Harlan Sprague Dawley rats. Cells (7.5x10⁴180 μl / ml, serum <0.1%, freshly isolated) was added on day 1 to a 96-well plate previously coated with DMEM / F12 + 4% FCS. Test samples containing test PRO polypeptide (20 μl / well) were added directly to the wells on day 1. Two days later, PGF (20 μl / well) was added to a final concentration of 10^-6M added. Cells were then stained on day 4 and scored on day 5. Visual scores were based on cell size, with cells showing no increase in size compared to the negative control scored as 0.0, and cells showing small to moderate increase in size compared to the negative control were scored as 1.0. Cells that showed a large increase in size compared to the negative control were scored as 2.0. A score of 1.0 or higher was considered positive.
  PBS is not included because Ca concentration is important in the assay reaction. Plates were coated with DMEM / F12 + 4% FCS (200 μl / well). Assay media included: DMEM / F12 (containing 2.44 gm bicarbonate), 10 μg / ml transferrin, 1 μg / ml insulin, 1 μg / ml aprotinin, 2 mmol / L glutamine, 100 U / ml penicillin G, 100 μg / ml streptomycin. Protein buffer containing mannitol (4%) gave a positive signal (score 3.5) at 1/10 (0.4%) and 1/100 (0.04%) but not at 1/1000 (0.004%). Therefore, no test sample buffer containing mannitol was run.
  PRO205, PRO882 and PRO887 polypeptides tested positive in this assay.
      [0132]
Example 14
Inhibition of adult cardiac hypertrophy (assay 42)
  This assay is designed to measure inhibition of adult cardiac hypertrophy. PRO polypeptides that test positive in this assay find use in the therapeutic treatment of heart diseases involving cardiac hypertrophy.
  Ventricular myocytes were freshly isolated from adult (250 g) Harlan Sprague Dawley rats and cells were plated at 2000 cells / 180 μl well volume. On day 2, a test sample (20 μl) containing the PRO polypeptide was added. On day 5, the cells were fixed and stained. Several hours later, the increase in ANP message can also be measured by PCR from the cells. Results are based on visual score of cell size: 0 = no inhibition, -1 = small inhibition, -2 = large inhibition. Scores less than 0 were considered positive. Activity reference corresponds to 0.1 mM phenylefine (PE) as a positive control.The assay medium includes: 100 mM insulin, 0.2% BSA, 5 mM cretin, 2 mM L-carnitine, 5 mM taurine, 100 U / ml penicillin G, 100 μg / ml streptomycin (CCT medium). M199 (modified) -glutamine free, NaHCO₃, Phenol red. Only the inner 60 wells of a 96 well plate were used. Of these, 6 wells were reserved for negative and positive (PE) controls.
  PRO878 polypeptide showed a score less than 0 in the above assay.
      [0133]
Example 15
Induction of endothelial cell apoptosis (assay 73)
  The ability of the PRO polypeptide to induce apoptosis in endothelial cells was tested in human venous umbilical vein endothelial cells (HUVEC, Cell Systems). Positive in assaytestIs a therapeutic treatment for tumors such as vascular disease.PoThe usefulness of the repeptide is suggested, and it is useful for inducing apoptosis of endothelial cells.
  The ability of the PRO polypeptide to induce apoptosis in endothelial cells was tested in human venous umbilical vein endothelial cells (HUVEC, Cell Systems) in a 96-well format in 0% serum medium supplemented with 100 ng / ml VEGF. . (HUVEC cells are easily removed from the plate surface and pipetting in all wells should be done as gently as possible.)
  The medium was aspirated and the cells were washed once with PBS. 5 ml of 1 × trypsin was added to the cells in a T-175 flask and the cells were left undisturbed from the plate (about 5-10 minutes). Trypsinization was stopped by the addition of 5 ml of growth medium. Cells were spun at 1000 rpm for 5 minutes at 4 ° C. The medium was aspirated and the cells were resuspended in 10 ml of 10% serum-supplemented medium (Cell Systems), 1x penicillin / streptomycin.
  Cells were transferred to 96-well microtiter plates (Amersham Life Science, cytostar-T scintillating microplates,RPNQ160,2x10 / well in 10% serum (CSG-vehicle, Cell Systems) with sterile, tissue media treatment, individually wrapping⁴Plated in a total volume of 100 μl at the density of the cells.testPRO polypeptideTrialThe ingredients were added in three stages of 1%, 0.33% and 0.11% dilution. Wells without cells were used as blanks, and wells with cells only were used as negative controls. 50 μl of a 1: 3 serial dilution of a 3 × stock of staurosporine was used as a positive control.testThe ability of PRO polypeptides to induce apoptosis is due to the annexin V, a member of the calcium and phospholipid binding proteins.Is measured usingDetect apoptosisIWas.
  0.2 ml of annexin V-biotin stock solution (100 μg / ml) is added to 4.6 ml of 2 × Ca²⁺Diluted in binding buffer and 2.5% BSA (1:25 dilution). 50 μl of the diluted annexin V-biotin solution was added to each well (except controls) to a final concentration of 1.0 μg / ml. Sample³⁵Incubated with annexin-biotin for 10-15 minutes before direct addition of S-streptavidin.³⁵S-streptavidin is 2 x Ca²⁺ ConclusionBuffer in 2.5% BSA to a final concentration of 3 x 10⁴Added to all wells until cpm / well. The plate was then sealed, centrifuged at 1000 rpm for 15 minutes, and placed on an orbital shaker for 2 hours. Analysis was performed on a 1450 Microbeta Trilux (Wallac). The results are shown in Table 7 below, where percent above background represents the percent amount of counts per minute above negative control. Those with a percent above background of 30% or more are considered positive.
  PRO333, PRO364 and PRO879 scored positive results in the above assay.

      [0134]
Example 16
Suppression of LIF and endothelin-1 (ET-1) -induced neonatal cardiac hypertrophy (assay 74)
  This assay shows that PRO polypeptides of the invention inhibit LIF and endothelin-1 (ET-1) -induced neonatal heart hypertrophyNohDesigned to determine whether to show force. Test compounds that test positive in this assay are useful for the therapeutic treatment of heart diseases or disorders characterized or associated with undesired hypertrophy of the myocardiumWill.
  Myocytes (7.5 × 10 5) from one-day-old Harlan Sprague Dawley rats⁴180 μl / ml, serum <0.1%, freshly isolated) is added on day 1 to a 96-well plate pre-coated with DMEM / F12 + 4% FCS. Then, on day 2, a test PRO polypeptide sample or growth medium alone (negative control) is added directly to the wells in a volume of 20 μl. Then, on day 3, LIF + ET-1 is added to the wells. After another two days, the cells are stained with medium and scored visually the next day. A positive or negative assay is if the number of myocytes treated with the PRO polypeptide is visually smaller or less on average than untreated myocytes.
  PRO238 and PRO1760 polypeptides tested positive in this assay.
      [0135]
Example 17
Endothelial tube formation-stimulation of bud formation (assay 86)
  In this assay, the PRO polypeptide isIn the absence of exogenous growth factorsDesigned to determine whether it exhibits the ability to promote endothelial vacuoles and tube formation. PRO polypeptides that tested positive in this assay include, for example, phagocytosis, ion pump, vascular permeability and / or conjugation.StimulationIs beneficialMEndothelial vacuoles and / or lumen formation are beneficial,It is expected to be useful for therapeutic treatment of disorders.
  HUVEC cells (less than 8 passages from the beginning) were mixed with type I rat tail collagen (final concentration 2.6 mg / ml) to give a density of 6 × 10 6⁵Cells / ml were seeded at 50 μl per well of M199 medium supplemented with 1 μM 6-FAM-FITC dye to stain vacuoles in the presence of PRO polypeptide while forming with 1% FBS. Cells at 37 ° C./5% CO₂For 48 hours, fixed in 3.7% formalin at room temperature for 10 minutes, washed 5 times with M199 medium, then stained with Ph-Phalloidin at 4 ° C. overnight and nuclear stained with 4 μM DAPI. . Positive results in the assay are equal to or less than 2 [1 = cells are all round, 2 = cells are long, 3 = cells form tubes with some binding, 4 = cells are complex Forming a tubular network].
  In this assay, the PRO179 polypeptide tested positive.
      [0136]
Example 18
Induction of endothelial cell apoptosis (ELISA) (assay 109)
  The ability of the PRO polypeptide to induce apoptosis in endothelial cells was determined using a 96-well format in 0% serum medium supplemented with 100 ng / ml VEGF, 0.1% BSA, 1X penn / strep using the human umbilical vein. Tested in endothelial cells (HUVEC, Cell Systems).A positive result in this assay indicates the utility of the PRO polypeptide for therapeutically treating any of a variety of conditions associated with undesirable endothelial cell growth, including, for example, inhibition of tumor growth.96 wells usedplateWas manufactured by Falcon (# 3072). Coatings for 96-well plates were prepared by inducing gelatinization with 100 μl of 0.2% gelatin in PBS solution for> 30 minutes. After complete aspiration of the gelatin mixture, the medium wasTwox10⁴Cells / ml final concentration-in 100 μl volume per wellHUVEC cellsPlated. Cells were grown for 24 hours before adding a test sample containing the PRO polypeptide of interest.
  To all wells, 100 μl of 0% serum medium supplemented with 100 ng / ml VEGF, 0.1% BSA, 1 × penn / strep was added. Test samples containing the PRO polypeptide were added in triplicate at 1%, 0.33% and 0.11% dilutions. Wells without cells were used as blanks, and wells with cells only were used as negative controls. As a positive control, a 1: 3 serial dilution of 50 μl of a 3 × stock solution of staurosporine was used. Cells were incubated for 24-35 hours prior to ELISA.
  An ELISA was used to determine the level of apoptosis preparation solution according to the Boehringer manual [Boehringer, ELISA for cell death detection plus, cat. No. 1920685]. Sample preparation: Spin down a 96-well plate at 1 krpm for 10 minutes (200 g);The supernatant was removed by rapid inversion and the plate was placed upside down on a paper towel to remove any remaining liquid. To each well, 200 μl of 1 × lysis buffer was added and incubated for 30 minutes at room temperature without shaking. The plate was spun down at 1 krpm for 10 minutes and 20 μl of the lysate (cytoplasmic fraction) was transferred to streptavidin-coated MTP. 80 μl of the immunoreagent mixture was added to 20 μl lysate in each well. The MTP was covered with sticky foil and incubated for 2 hours at room temperature by placing it on an orbital shaker (200 rpm). After 2 hours, the supernatant was removed by aspiration and the wells were rinsed (removed by aspiration) three times with 250 μl of 1 × incubation buffer per well. Substrate solution was added to each well (100 μl) and incubated on an orbital shaker at room temperature at 250 rpm until sufficient color was developed for photometric analysis (after about 10-20 minutes). A 96-well reader was used to read the plate at 405 nm with a reference wavelength of 492 nm. The level obtained for PIN32 (control buffer) was set to 100%. Samples with levels> 130% were considered positive for apoptosis induction.
  PRO846 and PRO844PolypeptideTested positive in this assay.
      [0137]
Example 19
In-situ hybrid formation
  In situ hybridization is a powerful and versatile technique for the detection and localization of nucleic acid sequences in cell or tissue preparations. It is useful, for example, for identifying sites of gene expression, analyzing tissue distribution of transcripts, identifying and localizing viral infections, tracking changes in specific mRNA synthesis, and assisting in chromosome mapping.
  In situ hybridization was performed by PCR generation according to an optimized version of the protocol of Lu and Gillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994).³³Performed using P-labeled riboprobes. Briefly, formalin-fixed, paraffin-embedded human tissue was sectioned, deparaffinized, deproteinized with proteinase K (20 g / ml) for 15 minutes at 37 ° C., and further described as described in Lu and Gillett, supra. Hybridize in situ. (³³-P) UTP-labeled antisense riboprobe is generated from the PCR product and hybridized at 55 ° C overnight. Slide Kodak NTB2^TMImmerse in Nuclear Track Emulsion and expose for 4 weeks.
  ³³P-riboprobe synthesis
  6.0 μl (125 mCi)³³P-UTP (Amersham BF 1002, SA <2000 Ci / mmol) was vacuum dried in speed. Dry³³The following components were added to each tube containing P-UTP:
  2.0 μl 5x transfer buffer
  1.0 μl DTT (100 mM)
  2.0 μl NTP mixture (2.5 mM: 10 μl each of 10 mM GTP, CTP and ATP + 10 μl H_TwoO)
  1.0 μl UTP (50 μM)
  1.0 μl RNAsin
  1.0 μl DNA template (1 μg)
  1.0 μl of H₂O
  1.0 μl RNA polymerase (T3 = AS, T7 = S, usually for PCR products)
  The tubes were incubated at 37 ° C. for 1 hour, 1.0 μl of RQ1 DNase was added, and then incubated at 37 ° C. for 15 minutes.Grand total90 μl of TE (10 mM Tris pH 7.6 / 1 mM EDTA pH 8.0) was added and the mixture was pipetted on DE81 paper. Transfer remaining solution to Microcon-50^TMThe ultrafiltration unit was loaded and spun using program 10 (6 minutes). The filtration unit was converted to a second tube and spun using program 2 (3 minutes). After the final recovery spin,Grand totalAdd 100 μl of TE,Then 1 μl of the final product was pipetted on DE81 paper and counted with 6 ml of BIOFLUOR II (trade name).
  The probe was run on a TBE / urea gel. 1-3 μl of probe or 5 μl of RNA MrkIII was added to 3 μl of loading buffer. After heating on a heating block to 95 ° C. for 3 minutes, the gel was immediately placed on ice. The gel wells were flushed, the sample was loaded and run at 180-250 volts for 45 minutes. GelPlastic wrap (SARAN (brand name) brand)And exposed to XAR film with a reinforcing screen in a -70 ° C refrigerator for 1 hour to overnight.
      [0138]
  ³³P-hybrid formation
  A. Pretreatment of frozen sections
  The slide was removed from the refrigerator, placed on an aluminum tray and thawed at room temperature for 5 minutes. The tray was placed in a 55 ° C. incubator for 5 minutes to reduce setting. Slides in 4% paraformaldehyde on ice in a steam hood10For 5 minutes and washed with 0.5 × SSC for 5 minutes at room temperature (25 ml 20 × SSC + 975 ml SQ H_TwoO). After deproteinization in 0.5 μg / ml proteinase K at 37 ° C. for 10 minutes (12.5 μl of a 10 mg / ml stock in 250 ml of preheated RNase-free RNase buffer), sections were washed with 0.5 × SSC for 10 minutes at room temperature. Sections were dehydrated in 70%, 95%, and 100% ethanol for 2 minutes each.
  B. Pretreatment of paraffin embedded sections:
  Deparaffinize slides, SQ H₂Placed in O and rinsed twice with 2 × SSC at room temperature for 5 minutes each. Sections were prepared with 20 μg / ml proteinase K (500 μl of 10 mg / ml in 250 ml RNase buffer without RNase; 37 ° C., 15 minutes) —Human embryo or 8 × proteinase K (100 μl in 250 ml RNase buffer, 37 ° C., 30 minutes) — Deproteinized in formalin tissue. Subsequent rinsing with 0.5 × SSC and dehydration were performed as described above.
  C. Pre-hybridization:
  Slides were placed in a plastic box lined with Box buffer (4x SSC, 50% formamide) -saturated filter paper. Tissue is mixed with 50 μl of hybridization buffer (3.75 g dextran sulfate + 6 ml SQ H₂O), vortexed, uncapped and heated in the microwave for 2 minutes. After cooling on ice, 18.75 ml of formamide, 3.75 ml of 20 × SSC and 9 ml of SQ H₂O was added, the tissue was vortexed well and incubated at 42 ° C for 1-4 hours.
  D. Hybridization:
  1.0x10 per slide⁶The cpm probe and 1.0 μl of tRNA (50 mg / ml stock) were heated at 95 ° C. for 3 minutes. The slides were cooled on ice and 48 μl of hybridization buffer was added per slide. After vortexing, 50 μl³³The P mixture was added to 50 μl of prehybrid on the slide. Slides were incubated overnight at 55 ° C.
  E. FIG. Washing:
  Washing was performed for 2 × 10 minutes in 2 × SSC, EDTA at room temperature (400 ml of 20 × SSC + 16 ml of 0.25 M EDTA, V_f= 4 L), followed by RNase A treatment at 37 ° C for 30 minutes (500 μl of 10 mg / ml in 250 ml RNase buffer = 20 μg / ml). Slides were washed 2x10 minutes with 2xSSC, EDTA at room temperature. The stringent washing conditions were as follows: 55 ° C. for 2 hours, 0.1 × SSC, EDTA (20 ml of 20 × SSC + 16 ml of EDTA, V_f= 4L).
      [0139]
  F. Oligonucleotide
  Of the DNA sequences disclosed herein3An in-situ analysis was performed on one of these. The oligonucleotides used for these analyzes are as follows:
(1) DNA47365-1206 (PRO364) (TNF receptor homolog)
p1:
5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAACCCGAGCATGGCACAGCAC-3 '(SEQ ID NO: 50)
p2:
5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGATCTCCCAGCCGCCCCTTCTC-3 '(SEQ ID NO: 51)
(2) DNA30868 (PRO205) (follistatin homolog)
p1:
5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAGAGACAGGGCAAGCAGAATG-3 '(SEQ ID NO: 52)
p2:
5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAGAAGGGGATGACTGGAGGAAC-3 '(SEQ ID NO: 53)
(3) DNA41374 (PRO333) (CD33 homolog)
p1:
5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCTCCACAGAACCTCGCCATCA-3 '(SEQ ID NO: 54)
p2:
5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGATGGGGCAAGACTCACAAGCAG -3 '(SEQ ID NO: 55)
      [0140]
  G. FIG. result
  The above disclosed above3An in situ analysis was performed on the two DNA sequences. The results from these analyzes are as follows:
(1) DNA47365-1206 (PRO364) (TNF receptor homolog)
  Expression was observed in the fetus in the fascia lining the anterior surface of the vertebral body. Expression was also found throughout the fetal retina. However, low levels of expression occurred throughout fetal neurons. All other tissues were negative.
(2) DNA30868 (PRO205) (follistatin homolog)
  In fetal tissue, there was expression in the spinal cord, autonomic ganglia, enteric nerves, sacral plexus, peripheral and cranial nerves. All other fetal and adult tissues were negative.
  Fetal tissues tested (12-16 weeks) include: placenta, umbilical cord, liver, kidney, adrenal gland, thyroid, lung, heart, largeBlood vesselsEsophagus, stomach, small intestine, spleen, thymus, pancreas, brain, eyes, spinal cord, body wall, pelvis and lower limbs.
  Adult tissues include: liver, kidney, adrenal gland, myocardium, aorta, spleen, lymph nodes, pancreas, lung and skin.
      [0141]
(3) DNA41374 (PRO333) (CD33 homolog)
  This molecule has been shown to be immunostimulatory (enhancing T lymphocyte proliferation in a one-way mixed lymphocyte reaction in a T lymphocyte costimulation assay). The distribution pattern of this molecule was assessed by limited tissue screening, including those available at the beginning of the study.
  In many tested tissues, weak nucleic acid expression was detected on thymic T lymphocytes (spleen and lymph nodes were not tested). This result was confirmed in subsequent in situ hybridization studies. The results of that study showed similarly low levels of expression in non-human primate thymus and human tonsils in specific areas of T lymphocytes. The restricted distribution pattern is suggested to be expressed by cells deeply involved in T lymphocytes (such as dendritic cell populations) such as T lymphocytes and antibody presenting cells. Inflamed human tissues (inflammatory bowel disease and chronic lymphocytic interstitial pneumonia / bronchitis) in the presence of significant lymphocyte inflammation and reactive follicle formation, expression of a region containing numerous T lymphocytes Is not detected.
  Differences in variance (eg, expression in thymic and tonsil lymph areas other than in areas with T lymphocytic inflammation) suggest the following possibilities:
1. That there is selective / restricted expression in a subset of T lymphocytes present in thymus and tonsil lymph nodes other than inflamed cells. Immature, non-functional T lymphocytes are present in both the thymus and tonsils, but are probably not the major population in chronic inflammatory tissues.
2. Expression in T lymphocytes is weak, and differences in detection in tissues with T lymphocytes are a reflection of the quality of the RNA in those tissue parts, rather than of differences in the type of T lymphocyte population. That means.
3. That expression in the thymus and tonsils is not in lymphocytes, but rather in a specific cell population deeply involved in T lymphocytes and is not detected in inflamed lungs and intestines. Such a possibility is a population of dendritic cells.
  In non-human primates, there is weak divergent expression of thymic lymphocytes.
  Subsequent studies have reported the following results:
Inflamed lung: (chronic lymphocytic and granulomatous lung): Weak negative signal was observed in stroma compared to control sense probe. Weak expression in normal chimpanzee thymus (human thymus not available) and human tonsils. Later expression was prominent in the T lymphocyte area of this structure, including the peri-follicular zone, and in the cortex.
  No expression was detected in the following human tissues: inflammatory bowel disease (8 patient samples), chronic inflammatory and normal lung (6 patient samples), chronic sclerosing nephritis (1 patient sample), acute inflammatory and sclerotic Liver (10 patient samples), normal and psoriatic skin, and peripheral lymph nodes (non-reactive).
      [0142]
Example 20
Use of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 as a hybridization probe
  The following method uses the nucleotide sequence encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 as a hybridization probe. Describe.
  (FIGS. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, and 31, respectively, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, Full length or mature PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840 (as shown in 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, and 31). DNA containing the coding sequence of PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 or a fragment thereof may be a homologous DNA of a human tissue cDNA library or a human tissue genomic library (PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO 05, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, used as a probe for screening a PRO885 or such as those encoding naturally-occurring variants of PRO887).
  Hybridization and washing of filters containing any library DNA is performed under the following high stringency conditions. Filtering of a radiolabeled probe derived from a gene encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 polypeptide. Hybridization was performed at 42 ° C. for 20 hours in a solution of 50% formamide, 5 × SSC, 0.1% SDS, 0.1% sodium pyrophosphate, 50 mM sodium phosphate, pH 6.8, 2 × Denhardt's solution, and 10% dextran sulfate. . Washing of filters was performed in 0.1x SSC and 0.1% SDS aqueous solution at 42 ° C.Be done.
  DNA encoding the full-length native sequence and the desiredArrayDNA with identity can then be identified using standard techniques known in the art.
      [0143]
Example 21
PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO885 in E. coli.Nucleic acid encodingExpression of
  This example demonstrates the preparation of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 in a non-glycosylated form by recombinant expression in E. coli. Is shown.
  First, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 (SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 9, 11 respectively) , 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, or 31) were amplified using selected PCR primers. Primers must have a restriction enzyme site corresponding to the restriction enzyme site of the selected expression vector. Various expression vectors are used. An example of a suitable vector is pBR322 (derived from E. coli; see Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)), which contains genes for ampicillin and tetracycline resistance. The vector is digested with restriction enzymes and dephosphorylated. The PCR amplified sequence is then ligated into a vector. The vector preferably comprises an antibiotic resistance gene, a trp promoter, a polyHis leader (the first six STII codons, polyHis sequence, and the enterokinase cleavage site), PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 coding region, daram coding end region. Section and argU geneThe array to encodeIncluding.
  The ligation mixture was then selected for E. coli using the method described in Sambrook et al., Supra.stockUsed for transformation. Transformants are identified by their ability to grow on LB plates, and antibiotic resistant clones are then selected. Plasmid DNA is isolated and confirmed by restriction analysis and DNA sequencing.
  Selected clones can be grown overnight in a liquid medium such as LB broth supplemented with antibiotics. Overnight medium is subsequently used for seeding large-scale media.May. Then the cellsDesired opticsdensityMasoProliferationDuring which the expression promoter is turned on.
  After a few more hours of cell culture, the cells are centrifuged.Collectioncan do. The cell pellet obtained by centrifugation is solubilized using various reagents well known in the art, and then solubilized PRO179, PRO238, PRO364, under conditions that allow the polypeptide to be tightly bound using a metal chelation column. PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887PolypeptideCan be purified.
  PRO238, PRO364 and PRO1760 were successfully expressed in E. coli in poly-His tag form in the manner described above.
      [0144]
Example 22
Nucleic acids encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO885 in mammalian cellsofExpression
  This example demonstrates that the potentially glycosylated forms of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, by recombinant expression in mammalian cells. Preparation of PRO885 or PRO887An exampleShowTo.
  The vector pRK5 (see EP 307,247 issued March 15, 1989) was used as an expression vector. In some cases, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 DNA are linked to pRK5 on pRK5 with a selective restriction enzyme. DNA encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 using a binding method such as those described in US Pat. Let it. The resulting vector is pRK5- (PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 code.ConversionDNA).
  In one embodiment, the selected host cells are 293 cells. Human 293 cells (ATCC CCL 1573) were obtained from fetal calf serum and possibly nutrient components in tissue culture plates.And / orSuch as DMEM with antibioticsCulture mediumsoProliferate to confluenceWas. About 10 μg of pRK5- (PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 encoded DNA)ToEncodes VA RNA geneConversionDoabout1μgofDNA [Thimmappaya et al., Cell, 31: 543 (1982)] and mixed with 500 μl of 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 0.227 M CaCl.₂Was dissolved. To this mixture is added dropwise 500 μl of 50 mM HEPES (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO₄Was added and a precipitate was formed at 25 ° C. for 10 minutes. The precipitate was suspended, added to 293 cells, and fixed at 37 ° C. for about 4 hours. The culture medium was aspirated and 2 ml of 20% glycerol in PBS was added for 30 seconds. The 293 cells were then washed with serum-free medium, fresh medium was added, and the cells were incubated for about 5 days.
  About 24 hours after transfection, the culture medium was removed and either culture medium (only) or 200 μCi / ml³⁵S-cysteine and 200 μCi / ml³⁵The medium was replaced with a culture medium containing S-methionine. After a 12 hour incubation, the conditioned medium was collected, concentrated on a spin filter, and loaded on a 15% SDS gel. The treated gel is dried and selected over the selected time to reveal the presence of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 polypeptide. Exposure. The medium containing the transformed cells was subjected to further incubation (in serum-free medium) and the medium was tested in a selected bioassay.
      [0145]
  In an alternative technique, the gene encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 is a sompary.rNatl. Acad. Sci., 12: 7575 (1981), may be used to transiently introduce 293 cells using the dextran sulfate method. 293 cells are grown to maximal density in spinner flasks and 700 μg of pRK5- (PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882 or PRO8888. (Encoding DNA) is added. Cells were first concentrated by centrifugation from spinner flasks and washed with PBS. The DNA-dextran precipitate was incubated on the cell pellet for 4 hours. Cells were treated with 20% glycerol for 90 seconds, washed with tissue media and re-introduced into spinner flasks containing tissue media, 5 μg / ml bovine insulin and 0.1 μg / ml bovine transferrin. After about 4 days, the conditioned medium was centrifuged and filtered to remove cells and cell debris. Next, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO885.PolypeptideConcentrate the sample containing the expressed gene encodingas well as/Alternatively, it was purified by any selection method such as column chromatography.
  In another embodiment, the gene encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 can be expressed in CHO cells. it can. pRK5- (PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 encoded DNA) nucleic acid is CaPO₄Alternatively, CHO cells can be transfected using known reagents such as DEAE-dextran. As described above, the cell medium can be incubated and the medium can be culture medium (alone) or³⁵Replace with medium containing radiolabel such as S-methioninedid. After identifying the presence of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide, the culture medium was replaced with a serum-free medium. Is also good. Preferably, the medium is incubated for about 6 days, and then the conditioned medium is collected. Next, the medium containing the expressed PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 is purified by the selected method. be able to.
      [0146]
  In addition, an epitope tag gene encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 polypeptide is expressed in host CHO cells. May be. The gene encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 may be subcloned from the pRK5 vector. The subclone insert was subjected to PCR amplification and the poly-HIt can be fused in frame with a selected epitope tag, such as an is tag. Poly-HA gene insert encoding the istag PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 is then selected for a stable clone. Can be subcloned into an SV40-derived vector containing a selection marker such as DHFR. Finally, the CHO cells are transfected (as described above) with the SV40 derived vector.can do. Labeling may be performed as described above to confirm expression.ThenPoly-His tag-[PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO888.]The codeConversionMedia containing expressed genesToConcentrate, Ni²⁺-Chelate affinity chromatographyanyIt can be purified by a selection method.
  PRO179, PRO364, PRO840, PRO844, PRO846 and PRO205 were stably expressed in CHO cells by the method described above. In addition, PRO364 and PRO846 are transformed in CHO cells by a transient method.DepartureAppeared.
      [0147]
Example 23
Expression of nucleic acids encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 in yeast.
  The following method describes the recombinant expression of a gene encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 in yeast. Is described.
  First, intracellular production or secretion of yeast from the ADH2 / GAPDH promoter for PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. Construct an expression vector. The DNA and promoter encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 are selected as appropriate restriction enzyme sites in the selected plasmid. Intracellular expression of a gene that inserts and encodes PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887.SaLet For secretion, the DNA encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 promoter is encoded by the ADH2 / GAPROH promoter. DNA encoding a PRO287, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 signal polypeptide or other mammalian signal peptide, or, for example, a yeast. Fungal alpha factorOr invertaseSecretion signal / leader sequence, and (if necessary) PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO888.Coding geneCan be cloned into a selection plasmid along with a linker sequence for expression of
  ThenYeasts such as yeast strain AB110ToIt can be transformed with the above expression plasmids and cultured in a selective fermentation medium. The transformed yeast supernatant can be analyzed by precipitation with 10% trichloroacetic acid and separation by SDS-PAGE, and then staining the gel with Coomassie blue staining.
  Subsequently, the recombinant PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 yeast cells were removed from the fermentation medium by centrifugation. The medium can then be isolated and purified by concentrating the medium using a selective cartridge filter. Concentrates containing PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 may be further purified using selective column chromatography resins. Good.
      [0148]
Example 24
Expression of nucleic acid encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 in baculovirus-infected insect cells.
  The following method describes recombinant expression in baculovirus-infected insect cells.
  The sequence encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 is the epitope contained in the baculovirus expression vector upstream of the baculovirus expression vector. FusedTo. Such epitope tags include poly-His tags and immunoglobulin tags (such as the Fc region of an IgG). pVL1393 (Novagen) can be used, including plasmids derived from commercially available plasmids. simplyTo explain, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885.Coded array ofOr PRO887 or PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887.Coded arrayPlaceWantPart [sequence encoding extracellular domain of transmembrane proteinOr the sequence encoding the mature protein if the protein is extracellularEtc.] are amplified by PCR with primers complementary to the 5 'and 3' regions. The 5 'primer may include an adjacent (selected) restriction enzyme site. The product is thenThemIt is digested with the selected restriction enzymes and subcloned into an expression vector.
  Recombinant baculovirus is obtained by co-transfection of the above plasmid and BaculoGold ™ virus DNA (Pharmingen) into Spodoptera frugiperda (“Sf9”) cells (ATCC CRL 1711) using lipofectin (commercially available from GIBCO-BRL). Created. After incubation for 4-5 days at 28 ° C, the released virus was recovered and used for further amplification. Viral infection and protein expression are described by O'Reilley et al., Baculovirus.ExpressionVectors: ALaboratory Manual,(Oxford: Oxford University Press (1994))Performed as described in.
  Then, the expressed poly-His tag [PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887] is, for example, Ni.²⁺-Purified by chelate affinity chromatography as follows. Extracts were prepared from recombinant virus-infected Sf9 cells as described in Rupert et al., Nature, 362: 175-179 (1993). simplyTo explain, Sf9 cells were washed and sonication buffer (25 ml Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl 2₂0.1% EDTA; 10% glycerol; 0.1% NP-40; 0.4M KCl) and sonicated twice on ice for 20 seconds. The sonicate was clarified by centrifugation and the supernatant was diluted 50-fold with loading buffer (50 mM phosphate, 300 mM NaCl, 10% glycerol, pH 7.8) and filtered through a 0.45 μm filter. Ni²⁺A -NTA agarose column (commercially available from Qiagen) was prepared in a total volume of 5 ml, washed with 25 ml of water and equilibrated with 25 ml of loading buffer. The filtered cell extract was loaded on the column at 0.5 ml per minute. The column is changed to A, the point where fraction collection starts ₂₈₀ Washed with loading buffer to baseline. Next, the column was washed with a secondary wash buffer (50 mM phosphate; 300 mM NaCl, 10% glycerol, pH 6.0), which elutes the bound protein non-specifically. A ₂₈₀ After reaching the baseline again, the column was developed with a 0-500 mM imidazole gradient in the secondary wash buffer. 1 ml fractions were collected and analyzed by SDS-PAGE and silver staining or Ni complexed with alkaline phosphatase (Qiagen).²⁺-Analyzed by Western blot on NTA. His eluted ₁₀ −tag[PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO888.]Fraction containingRespectivelyPooled and dialyzed against loading buffer.
      [0149]
  Alternatively, an IgG tag (or Fc tag)-[PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO888.]Can be purified using known chromatography techniques including, for example, protein A or protein G column chromatography.
  Expression was actually on a 0.5-2 L scale, but can easily be scaled up to larger (eg, 8 L) preparations. The protein is expressed as an IgG construct (immunoadhesin), where the extracellular region of the protein is fused to an IgG1 constant region sequence that includes hinge, CH2 and CH3 domains and / or a poly-His tagged form.
  Following PCR amplification, the corresponding coding sequence was transferred to a baculovirus expression vector (pb.PH.IgG and poly-His tag for IgG fusion).proteinPB.PH.His.c), and the vector and Baculogold® baculovirus DNA (Pharmingen) were cloned into 105 Spodoptera.FulgiSpodoptera frugiperda ("Sf9") cells (ATCC CRL 1711) were co-transfected with lipofectin (Gibco BRL). pb.PH.IgG andpb.PH.HisIsModified version of the commercially available baculovirus expression vector pVL1393 (Pharmingen), which has a polylinker region modified to include a His or Fc tag sequence. Cells with 10% FBS (Hyclone)AdditionalGrow in Hink's TNM-FM medium supplemented. Cells were incubated at 28 ° C. for 5 days. Collect the supernatant, then add 10% FBSAdditionalHink supplemented was used for initial virus amplification at a multiplicity of infection (MOI) of about 10 by Sf9 cell infection in TNM-FH medium. Cells were incubated at 28 ° C. for 3 days. The supernatant was collected and expression of the construct in the baculovirus expression vector was determined using 25 ml of Ni for histidine tag protein in 1 ml of supernatant.²⁺-Determined by batch binding to NTA beads (QIAGEN) or Protein A Sepharose CL-4B beads (Pharmacia) for IgG-tagged proteins, followed by SDS-PAGE analysis by Coomassie blue staining comparing to known concentrations of protein standards.
  The first amplified virus supernatant was used to infect spinner medium (500 ml) of Sf9 cells grown in ESF-921 medium (Expression System LLC) at an MOI of about 0.1. Cells were incubated at 28 ° C for 3 days. The supernatant was collected and filtered. Batch binding and SDS-PAGEanalysisWas repeated as necessary until expression of the spinner medium was confirmed.
  Conditioned media (0.5-3 L) from transfected cells was recovered by removing cells by centrifugation and filtering through a 0.22 micron filter. Poly-His tagConstructionAbout thingsNi²⁺-NTA column (Qiagen)TaProteinBuildingWas purified. Prior to purification, imidazole was added to the conditioned medium to a concentration of 5 mM. The conditioned medium was treated with 6 ml of Ni equilibrated with 20 mM Hepes, pH 7.4 buffer containing 0.3 M NaCl and 5 mM imidazole.²⁺-NTA column was pumped at 4 ° C at a flow rate of 4-5 ml / min. After loading, the column was further washed with equilibration buffer and the protein was eluted with equilibration buffer containing 0.25M imidazole. The highly purified protein was subsequently treated with a storage buffer containing 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl and 4% mannitol, pH 6.8.To25ml of G25 Superfine (Pharmacia)columnDesalted using and stored at -80 <0> C.
      [0150]
  An immunoadhesin (containing Fc) construct of the protein was purified from the conditioned medium as follows. The conditioned medium was applied to a 5 ml Protein A column (Pharmacia) equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer, pH 6.8.Pumping outdid. After loading, the column was washed extensively with the equilibration buffer and then eluted with 100 mM citric acid, pH 3.5. The eluted protein was immediately neutralized by collecting 1 ml fractions into a tube containing 275 mL of 1 M Tris buffer, pH9.continue,Highly purified proteinToDescribed above for the poly-His tag proteinlikeStorage bufferinsideDesalted. Protein homogeneity can be assessed by SDS polyacrylamide gel (PEG) electrophoresis and N-terminal amino acid sequencing by Edman degradation.
  PRO205, PRO321, PRO840, PRO846, PRO885 and PRO887 are baculovirus-infected Sf9 insect cells in the manner described above.SuccessfullyWas expressed.
  Alternatively, a modified baculovirus method may be used for uptake of high5 cells. In this method, the DNA encoding the desired sequence is amplified by an appropriate system such as Pfu (Stratagene) or fused to the upstream (5'-) of an epitope tag contained in a baculovirus expression vector. Is also good. Such epitope tags include poly-His tags and immunoglobulin tags (such as the IgG Fc region). A variety of plasmids can be used, including plasmids derived from commercially available plasmids such as pIE1-1 (Novagen). The pIE1-1 and pIE1-2 vectors are designed for constitutive expression of the recombinant protein from the baculovirus ie1 promoter in stably transformed insect cells. This plasmid differs only in the direction of multiple cloning sites and contains all promoter sequences known to be important for ie1-mediated gene expression in uninfected insect cells, as well as the hr5 enhancer element. pIE1-1 and pIE1-2 areTransliterationIt contains a translation initiation site and can be used to produce fusion proteins. Briefly, a desired sequence or a desired portion of a sequence (such as a sequence encoding the extracellular domain of a transmembrane protein) is amplified by PCR with primers complementary to the 5 'and 3' regions. The 5 'primer may introduce an adjacent (selected) restriction enzyme site. The product is then digested with the selected restriction enzymes and subcloned into an expression vector. For example, a derivative of pIEl-1 is a human IgG (pb.PH.IgG) Fc region orOf the desired sequence8 Histidine (pb.PH.His) tag downstream (3'-). Preferably, the vector construct is sequenced for confirmation.
      [0151]
  High-5 cellsTo, 27 ° C, CO₂No growth without pen / strep to 50% confluency. For each 150mm plate,Have an array30 μg of pIE base vector,Mix with 1 ml of Ex-cell culture medium (medium: Ex-cell 401 + 1/100 L-Glu JRH Biosciences # 14401-78P (Note: this medium is photosensitive)), and in another tube, add 100 μl CellFectin (CellFECTIN (Gibco BRL # 10362-010) (mixed by vortex)) was mixed with 1 ml of Ex-cell medium. The two solutions were mixed and incubated at room temperature for 15 minutes. 8 ml of Ex-cell medium was added to 2 ml of the DNA / Cellfectin mixture and layered on high-5 cells that had been washed once with Ex-cell medium. Then plate in the dark at room temperature1 hourIncubated. The DNA / cellfectin mixture was then aspirated and the cells were washed once with Ex-cells to remove excess cellfectin. 30 ml of fresh Ex-cell medium was added and the cells were incubated at 28 ° C for 3 days. Collect supernatant and baculovirusExpressionIn vectorArrayExpression of 25 ml of Ni for histidine-tagged protein in 1 ml of supernatant²⁺-Determined by batch binding to NTA beads (QIAGEN) or Protein A Sepharose CL-4B beads (Pharmacia) for IgG-tagged proteins, followed by SDS-PAGE analysis by Coomassie blue staining comparing to known concentrations of protein standards.
  Remove conditioned medium (0.5-3 L) from transfected cells by centrifugation.,Collected by filtration through a 0.22 micron filter. For the poly-His tag construct, the protein containing the sequence was²⁺Purification was performed using a -NTA column (Qiagen). Prior to purification, imidazole was added to the conditioned medium to a concentration of 5 mM. The conditioned medium was treated with 6 ml of Ni equilibrated with 20 mM Hepes, pH 7.4 buffer containing 0.3 M NaCl and 5 mM imidazole.²⁺-NTA column was pumped at 48 ° C at a flow rate of 4-5 ml / min. After loading, the column was further washed with equilibration buffer and the protein was eluted with equilibration buffer containing 0.25M imidazole. The highly purified protein is subsequently purified by 25 ml of G25 Superfine (Pharmacia) in storage buffer, pH 6.8, containing 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl and 4% mannitol.columnDesalted using and stored at -80 <0> C.
  An immunoadhesin (containing Fc) construct of the protein was purified from the conditioned medium as follows. The conditioned medium was applied to a 5 ml Protein A column (Pharmacia) equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer, pH 6.8.Pumping outdid. After loading, the column was washed extensively with the equilibration buffer and then eluted with 100 mM citric acid, pH 3.5. The eluted protein was immediately neutralized by collecting 1 ml fractions into a tube containing 275 mL of 1 M Tris buffer, pH9. The highly purified protein was subsequently desalted in the storage buffer described above for the poly-His tag protein.ArrayCan be assessed by SDS polyacrylamide gel and N-terminal amino acid sequencing by Edman degradation and other analytical techniques as desired or necessary.
  PRO179, PRO205, PRO321, PRO333, PRO364, PRO844, PRO846, PRO877, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO1760 were expressed in high5 cells by the method described above.
      [0152]
Example 25
Preparation of Antibodies that Bind to PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887
  This example illustrates the preparation of a monoclonal antibody that can specifically bind to PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887.
  Techniques for the production of monoclonal antibodies are well known in the art and are described, for example, in Goding, supra. Immunogens that can be used include purified PRO179, PRO4, 836, PRO88, PRO8, PRO8, PRO8, PRO8, PRO8, PRO8, PRO8, PRO8, PRO8, PRO8, PRO8, PRO8, PRO2, PRO8, PRO8, PRO8, PRO2, PRO8, PRO2, PRO8, PRO8, PRO4, 836. , PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 fusion protein;as well asCells that express a gene encoding recombinant PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 on the cell surface. The selection of an immunogen can be made by one skilled in the art without undue experimentation.
  Mice such as Balb / c were emulsified in complete Freund's adjuvant and injected subcutaneously or intraperitoneally in an amount of 1-100 micrograms into PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, Immunize with the PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 immunogen. Alternatively, the immunogen is emulsified in MPL-TDM adjuvant (Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT) and injected into the animal's hind footpadDo. The immunized mice are then boosted 10 to 12 days later with an additional immunogen emulsified in the selected adjuvant. The mice are then boosted with additional immunization injections for several weeks. Anti-PRO179, anti-PRO238, anti-PRO364, anti-PRO844, anti-PRO846, anti-PRO1760, anti-PRO205, anti-PRO321, anti-PRO333, anti-PRO840, anti-PRO877, anti-PRO878, anti-PRO Serum samples may be periodically collected from mice by retro-orbital bleeding to test in an ELISA assay for detection of PRO879, anti-PRO882, anti-PRO885 or anti-PRO887 antibodies.
      [0153]
  After an appropriate antibody titer has been detected, animals that are "positive" for the antibody are treated with PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO885. The last infusion of an intravenous injection of PRO887 may be given. Three to four days later, the mice were sacrificed and spleen cells were removed. The spleen cells were then used (with 35% polyethylene glycol) to P3X63AgU.P available from ACTT under the number CRL1597. It was fused to one such selected mouse myeloma cell line. The fusion produces hybridoma cells, followed by HATCultureSeeds were plated in 96 well tissue culture plates containing ground to inhibit the growth of unfused cells, myeloma hybrids, and spleen cell hybrids.
  Hybridoma cells are screened in an ELISA for reactivity against PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. A "positive" hybridoma cell line secreting a monoclonal antibody against the desired PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 hybridoma cells. Within the range.
  Positive hybridoma cells were injected intraperitoneally into syngeneic Balb / c mice and injected with anti-PRO179, anti-PRO238, anti-PRO364, anti-PRO844, anti-PRO846, anti-PRO1760, anti-PRO205, anti-PRO321, anti-PRO321. Ascites is generated containing the PRO333, anti-PRO840, anti-PRO877, anti-PRO878, anti-PRO879, anti-PRO882, anti-PRO885 or anti-PRO887 monoclonal antibody. Alternatively, the hybridoma cells can be grown in tissue culture flasks or roller bottles. Purification of the monoclonal antibodies produced in ascites can be performed using ammonium sulfate precipitation followed by gel exclusion chromatography. Alternatively, antibodies to protein A or protein GJoinCan be used.
      [0154]
Material Deposit
  The following cell lines have been deposited with the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):
Material ATCC deposit number Deposit date
DNA16451-1388 209776 April 14, 1998
DNA35600-1162 209370 October 16, 1997
DNA47365-1206 209436 November 7, 1997
DNA59838-1462 209976 June 16, 1998
DNA44196-1353 209847 May 6, 1998
DNA76532-1702 203473 November 17, 1998
DNA34433 209719 March 31, 1998
DNA53987 209858 May 12, 1998
  The deposit was made in accordance with the provisions of the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for Patent Procedure and its Regulations (Budapest Treaty). This ensures that a viable culture of the deposit is maintained for 30 years from the date of the deposit. Deposits may be obtained from the ATCC pursuant to the provisions of the Budapest Treaty and pursuant to an agreement between Genentech and the ATCC, whether at first or at the time of issuance of the relevant U.S. patent or at any time Ensures that progeny of the deposited culture are made permanently and unrestrictedly available at the time of publication of the U.S. or foreign patent application and is governed by 35 U.S.C. (Including Article 1.14) to ensure that descendants are available to those who are determined to be entitled in accordance with the United States Patent Office.
  The assignee of the present application agrees that if the deposited culture dies or is lost or destroyed when cultured under appropriate conditions, the material will be immediately replaced with the same other at the time of notification. I do. The availability of the deposited material is not to be construed as a license to practice the present invention in violation of the rights granted under any government authority under patent law.
  It is believed that the written description above is sufficient to enable one skilled in the art to practice the invention. The deposited embodiment is intended as an illustration of one aspect of the invention, and since any functionally equivalent construction is within the scope of the invention, the deposited construction will limit the scope of the invention. It is not limited. The deposit of material herein is not an admission that the written description contained herein is insufficient to enable the practice of any aspect of the invention, including its best mode, and that It is not to be construed as limiting the claim to the particular illustrations represented. Indeed, various modifications of the invention in addition to those shown and described herein will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description and fall within the scope of the appended claims.
[Brief description of the drawings]
  FIG. 1 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO179 cDNA (SEQ ID NO: 1), which is a clone designated herein as “DNA16451-1388”.
  FIG. 2 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 1 shown in FIG.
  FIG. 3 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO238 cDNA (SEQ ID NO: 3), which is a clone designated herein as “DNA35600-1162”.
  FIG. 4 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 3 shown in FIG.
  FIG. 5 shows the nucleotide sequence of native sequence PRO364 cDNA (SEQ ID NO: 5), which is a clone designated herein as “DNA47365-1206”.
  FIG. 6 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 5 shown in FIG.
  FIG. 7 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO844 cDNA (SEQ ID NO: 7), which is a clone designated herein as “DNA59838-1462”.
  FIG. 8 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 7 shown in FIG.
  FIG. 9 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO846 cDNA (SEQ ID NO: 9), which is a clone designated herein as “DNA44196-1353”.
  FIG. 10 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 9 shown in FIG.
  FIG. 11 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1760 cDNA (SEQ ID NO: 11), which is a clone designated herein as “DNA76532-1702”.
  FIG. 12 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 12) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 11 shown in FIG.
  FIG. 13 shows the nucleotide sequence of native sequence PRO205 cDNA (SEQ ID NO: 13), which is a clone designated herein as “DNA30868”.
  FIG. 14 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 14) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 13 shown in FIG.
  FIG. 15 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO321 cDNA (SEQ ID NO: 15), which is a clone designated herein as “DNA34433”.
  FIG. 16 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 16) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 15 shown in FIG.
  FIG. 17 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO333 cDNA (SEQ ID NO: 17), which is a clone designated herein as “DNA41374”.
  FIG. 18 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 18) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 17 shown in FIG.
  FIG. 19 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO840 cDNA (SEQ ID NO: 19), which is a clone designated herein as “DNA53897”.
  FIG. 20 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 20) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 19 shown in FIG.
  FIG. 21 shows the nucleotide sequence of native sequence PRO877 cDNA (SEQ ID NO: 21), which is a clone designated herein as “DNA58120”.
  FIG. 22 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 22) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 21 shown in FIG. 21.
  FIG. 23 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO878 cDNA (SEQ ID NO: 23), which is a clone designated herein as “DNA58121”.
  FIG. 24 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 24) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 23 shown in FIG. 23.
  FIG. 25 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO879 cDNA (SEQ ID NO: 25), which is a clone designated herein as “DNA58122”.
  FIG. 26 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 26) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 25 shown in FIG. 25.
  FIG. 27 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO882 cDNA (SEQ ID NO: 27), which is a clone designated herein as “DNA58125”.
  FIG. 28 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 28) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 27 shown in FIG. 27.
  FIG. 29 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO885 cDNA (SEQ ID NO: 29), which is a clone designated herein as “DNA58128”.
  FIG. 30 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 30) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 29 shown in FIG. 29.
  FIG. 31 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO887 cDNA (SEQ ID NO: 31), which is a clone designated herein as “DNA58130”.
  FIG. 32 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 32) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 31 shown in FIG. 31.

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