JP2003531577A - 新規ヒトキナーゼおよびそれをコードするポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 療法、診断および薬理遺伝学的用途に使用できる新規ヒトポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、米国仮出願６０／１８３，５８２および６０／１８４，０１４（そ
れぞれ２０００年２月１８日出願および２０００年２月２２日出願）の優先権を
主張する。それらの全体を本明細書に援用する。

【０００２】 １．発明の分野 本発明は、哺乳動物輸送タンパク質との配列類似性をもつタンパク質をコード
する新規ヒトポリヌクレオチドの知見、同定および解明に関する。本発明は、本
明細書に記載するポリヌクレオチド、宿主細胞発現系、コードされるタンパク質
、融合タンパク質、ポリペプチドおよびペプチド、コードされるタンパク質およ
びペプチドに対する抗体、ならびに遺伝子工学的に処理された、開示遺伝子を欠
如または過剰発現する動物、それらのタンパク質のアンタゴニストおよびアゴニ
スト、ならびに開示配列によりコードされるタンパク質の発現または活性を調節
する他の化合物であって、診断、薬物スクリーニング、臨床試験モニタリング、
疾患および障害の処置に使用できる化合物を包含する。

【０００３】 ２．発明の背景 キナーゼは、細胞内の広範囲のタンパク質および化合物のリン酸化を仲介する
。ホスファターゼに加えて、キナーゼは調節経路の一部として含まれる。キナー
ゼの生理的重要性から、キナーゼは長年精査の対象であり、有望な薬剤開発の標
的である。

【０００４】 ３．発明の概要 本発明は、新規ヒトタンパク質をコードするヌクレオチド、および対応するこ
れらのタンパク質のアミノ酸配列の知見、同定および解明に関する。本明細書に
初めて記載したこれらの新規ヒトタンパク質（ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ；ＮＨＰ）は、特に制限されないがたとえば細胞分裂コントロールプロ
テインキナーゼ、セリン／トレオニンプロテインキナーゼおよび膜結合グアニル
酸キナーゼ（ＭＡＧＵＫｓ）を含む動物キナーゼと構造類似性をもつ。このよう
に新規ポリヌクレオチドは、門および広範な種にわたる相同体およびオーソログ
（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）をもつ新規キナーゼファミリーをコードする。

【０００５】 本明細書に記載する新規ヒトポリヌクレオチド配列は、長さ１０３５、１２１
４、１００７、２９６、７２、３１８、９４、１０８、３７５、１３７、４７３
、２４９、１５５、１８４、５２０、２９６、１９５、２２４、５６０、３３６
、２１１、２４０、５７６、および３５２アミノ酸長のタンパク質／オープンリ
ーディングフレーム（ＯＲＦ）（それぞれ配列番号：２、４、６、８、１０、１
２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３
６、３８、４０、４２、４４、４６および４８を参照）をコードする。

【０００６】 本発明は下記のものをも包含する：前記ＮＨＰのアゴニストおよびアンタゴニ
スト（天然ＮＨＰと競合する、小型分子、大型分子、変異ＮＨＰ、またはその一
部が含まれる）、ペプチド、および抗体、ならびに前記ＮＨＰの発現を阻害する
ために使用できるヌクレオチド配列（たとえばアンチセンス分子およびリボザイ
ム分子、ならびに遺伝子または調節配列の置換構築体）、または前記ＮＨＰ配列
の発現を高めるために使用できるヌクレオチド配列（たとえば、前記遺伝子を強
力なプロモーター系の制御下におく発現構築体）、ならびにＮＨＰトランスジー
ンを発現するトランスジェニック動物、または機能性ＮＨＰを発現しない”ノッ
クアウト体”（条件付きであってもよい）。記載する配列のネズミ相同体（ある
いはヒト相同体のオーソログ）中に、ジーントラップ突然変異を含む、幾つかの
ノックアウトＥＳ細胞株を産生した。

【０００７】 さらに本発明は、ＮＨＰ発現および／またはＮＨＰ活性を調節する化合物、す
なわちそのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物の同定方法で
あって、前記ＮＨＰおよび／またはＮＨＰ生成物の精製物、あるいはそれを発現
する細胞を使用する方法にも関する。それらの化合物は、生物学的障害または平
衡異常を伴う多様な症状の処置のための療法薬として使用できる。

【０００８】 ４．配列表および図面の説明 配列表に、前記ＮＨＰアミノ酸配列をコードする記載するＮＨＰ ＯＲＦの配
列を示す。配列番号４９および５０は、完全長ＮＨＰ ＯＲＦ並びにフランキン
グ５’および３’配列を記載する。

【０００９】 ５．発明の詳細な記述 配列番号１−６および配列番号５０に記載したＮＨＰ配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ
で利用可能な配列と関連して遺伝子トラップ配列からコンパイルされた。本明細
書に初めて記載する新規タンパク質は、特にヒト細胞系、およびヒト胎児の脳、
脳、脳下垂体、小脳、胸腺、脾臓、リンパ節、骨髄、気管、腎臓、肝臓、胎児の
肝臓、前立腺、精巣、甲状腺、副腎、膵臓、唾液腺、胃、小腸、結腸、子宮、胎
盤、乳腺、脂肪、食道、膀胱、頚部、直腸、心膜、視床下部、卵巣、胎児の腎臓
および胎児の肺細胞において発現した。

【００１０】 配列番号７−４９に記載したＮＨＰ配列は、ＧＥＮＢＡＮＫで利用可能な配列
と関連して遺伝子トラップ配列、および肺並びに精巣ライブラリー由来のｃＤＮ
Ａからコンパイルされた（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、メリーランド州ガ
イザースバーグ）。本明細書に初めて記載する新規タンパク質は、特にヒト細胞
系、およびヒトの脳、脳下垂体、小脳、胸腺、脾臓、リンパ節、骨髄、気管、腎
臓、肝臓、胎児の肝臓、前立腺、精巣、副腎、膵臓、唾液腺、胃、小腸、結腸、
骨格筋、子宮、胎盤、乳腺、脂肪、皮膚、食道、膀胱、直腸、甲状腺、臍静脈の
内皮細胞、および胎児肺細胞において発現した。

【００１１】 本発明は下記のものを包含する：配列表に示すヌクレオチド配列、それらのヌ
クレオチドを発現する宿主細胞、それらのヌクレオチドの発現生成物、ならびに
（ａ）前記配列の哺乳動物相同体をコードするヌクレオチド（具体的に記載した
ＮＨＰおよびＮＨＰ生成物を含む）；（ｂ）機能性ドメイン（活性ドメインの新
規領域が含まれるが、これらに限定されない）に対応する１以上のＮＨＰ部分を
コードするヌクレオチド、およびそれらのヌクレオチド配列により特定されるポ
リペプチド生成物；（ｃ）前記ＮＨＰの少なくとも１つのドメインの全部または
一部が欠失または変化した遺伝子工学的に形成した変異体または天然変異体をコ
ードする単離ヌクレオチド、およびそれらのヌクレオチド配列により特定される
ポリペプチド生成物；シグナル配列の全部または一部が欠失した可溶性タンパク
質およびペプチドが含まれるが、これらに限定されない；（ｄ）ＮＨＰまたはそ
のドメインの１つ（たとえば受容体またはリガンドの結合ドメイン、アクセサリ
ータンパク質／自己会合ドメインなど）が他のペプチドまたはポリペプチドに融
合したキメラ融合タンパク質をコードする、ＮＨＰコード領域の全部または一部
を含有するヌクレオチド；あるいは（ｅ）前記ポリヌクレオチドの療法用または
診断用誘導体、たとえば本明細書の配列表に初めて開示した配列を含むオリゴヌ
クレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ｄｓＲＮＡまたは遺
伝子療法構築体。

【００１２】 前記のように、本発明には下記のものが含まれる：（ａ）配列表に示したヒト
ＤＮＡ配列（およびそれらを含むベクター）；さらに、配列表に示したＤＮＡ配
列の相補配列に高緊縮条件下で［たとえば０．５Ｍ ＮａＨＰＯ₄、７％ドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、６５℃でフィルター結合Ｄ
ＮＡにハイブリダイゼーション、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中、
６８℃で洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．編，１９８９，Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社，お
よびＪｏｈｎ Ｗｉｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ社，ニューヨーク，ｐ．２．１０．３）
］ハイブリダイズする連続ＮＨＰオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をも
ち、機能的に均等な遺伝子生成物をコードする、いかなるヌクレオチド配列も考
慮される。さらに、配列表に示したアミノ酸配列をコードおよび発現するＤＮＡ
配列の相補配列に中等度緊縮条件下で［たとえば０．２×ＳＳＣ／０．１％ Ｓ
ＤＳ中、４２℃で洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，前掲）］ハ
イブリダイズし、なおかつ機能的に均等なＮＨＰ生成物をコードする、いかなる
ヌクレオチド配列も考慮される。ＮＨＰの機能均等物には、他の種に存在する天
然ＮＨＰ、および天然の、または工学的に作成した（部位特異的変異誘発、遺伝
子シャッフリング、指向性進化：たとえばＵＳＰ５，８３７，４５８に記載）変
異ＮＨＰが含まれる。本発明には、開示したＮＨＰポリヌクレオチド配列の縮重
核酸バリアントも含まれる。

【００１３】 さらに、ＮＨＰ ＯＲＦを含むポリヌクレオチド、または配列表のヌクレオチ
ド配列の対応する領域に約９９％、９５％、９０％もしくは約８５％類似するか
または同一である（たとえば標準デフォルト設定を採用したＧＣＧ配列分析パッ
ケージを用いるＢＬＡＳＴ配列比較分析により測定して）ポリヌクレオチド配列
を含む、それらの機能均等物が考慮される。

【００１４】 本発明には、前記ＮＨＰヌクレオチド配列にハイブリダイズする、したがって
その相補配列である核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子も含まれる。そのようなハ
イブリダイゼーション条件は、前記のように高緊縮であってもよく、または緊縮
度がより低くてもよい。核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド（”ＤＮＡオリ
ゴ体”）である場合、それらの分子は本明細書の配列表に初めて開示した配列の
連続領域を含む、一般に約１６〜約１００塩基、約２０〜約８０塩基、または約
３４〜約４５塩基の長さのもの、またはそこに示すサイズの任意の変更または組
合わせである。それらのオリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
と組み合わせて用いて、ライブラリーのスクリーニング、クローンの単離、なら
びにクローニング鋳型および配列決定用鋳型の調製などを行うことができる。

【００１５】 あるいは、そのようなＮＨＰオリゴヌクレオチドを、ライブラリーのスクリー
ニングおよび遺伝子発現パターンの評価のためのハイブリダイゼーションプロー
ブとして用いることができる（特にマイクロアレイまたはハイスループット”チ
ップ”方式を用いて）。さらに、一連の前記ＮＨＰオリゴヌクレオチド配列また
はその相補配列を用いて、前記ＮＨＰ配列の全部または一部を提示することがで
きる。配列番号：１〜５０の配列のうち１以上の少なくとも一部に初めて開示し
たオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を、固体支持体マトリックス
／基体（樹脂、ビーズ、膜、プラスチック、ポリマー、金属または金属化基体、
結晶質または多結晶質の基体など）と組み合わせて、ハイブリダイゼーションプ
ローブとして使用できる。特に注目すべきものは、空間的にアドレス指定可能な
、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドのアレイ、または対応するオリゴ
ペプチドおよびポリペプチドのアレイ（すなわち遺伝子チップ、マイクロタイタ
ープレートなど）である。その際、空間的にアドレス指定可能なアレイ上に存在
する少なくとも１つの生体ポリマーには、配列番号：１〜５０の配列のうち少な
くとも１つに初めて開示したオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド配列
、またはそれらがコードするアミノ酸配列が含まれる。生体ポリマーを固体支持
体マトリックスに付着させる方法またはその上で合成する方法、およびその上で
結合試験を実施する方法は、特にＵＳＰ５，７００，６３７、５，５５６，７５
２、５，７４４，３０５、４，６３１，２１１、５，４４５，９３４、５，２５
２，７４３、４，７１３，３２６、５，４２４，１８６および４，６８９，４０
５に開示されており、それらの開示内容全体を本明細書に援用する。

【００１６】 配列番号：１〜５０に初めて開示した配列を含むアドレス指定可能なアレイは
、一時的および組織特異的な遺伝子発現を同定および解明するのに使用できる。
これらのアドレス指定可能なアレイは、必要な特異性をもつのに十分であってな
おかつ生産技術の限度内にある長さのオリゴヌクレオチド配列を含む。これらの
プローブの長さは、約８〜約２０００ヌクレオチドの範囲内である。プローブは
、好ましくは配列番号：１〜５０に初めて開示した配列に由来する６０ヌクレオ
チド、より好ましくは２５ヌクレオチドを含む。

【００１７】 たとえば一連の前記オリゴヌクレオチド配列またはその相補配列を、前記配列
の全部または一部を提示するためにチップ方式で使用できる。一般に約１６〜約
４０（またはこの範囲のうちの任意の整数）ヌクレオチド長さのオリゴヌクレオ
チドが互いに部分的にオーバーラップしてもよく、および／またはオーバーラッ
プしないオリゴヌクレオチドを用いて配列を提示することもできる。したがって
、前記ポリヌクレオチド配列は一般に、それぞれ前記配列表に初めて開示した少
なくとも約８ヌクレオチドの長さの別個のオリゴヌクレオチド配列を少なくとも
約２つまたは３つ含むはずである。そのようなオリゴヌクレオチド配列は、配列
表中の配列内に存在するいずれかのヌクレオチドから始まり、前記配列に対して
センス（５’−から−３’へ）配向またはアンチセンス配向のいずれで進行して
もよい。

【００１８】 マイクロアレイに基づく分析によって広範な遺伝子活性パターンを見出すこと
ができ、遺伝子機能について新たな理解が得られ、転写プロセスおよび生物学的
機序について新規な予想外の洞察が得られる。配列番号：１〜５０に初めて開示
した配列を含むアドレス指定可能なアレイの使用により、特定の経路に関与する
転写の変化について詳細な情報が得られ、これによって新規な表現型として現わ
れる新規な成分または遺伝子機能を同定できる。

【００１９】 配列番号：１〜５０に初めて開示した配列を含むプローブは、薬物を見出すた
めの新規分子ターゲットの同定、選択および立証にも使用できる。これらのユニ
ーク配列を用いて薬物ターゲットを直接に確認し、その薬物の目的ターゲットと
は異なる経路により調節される、薬物による遺伝子発現の変化を識別することが
できる。したがってこれらのユニーク配列は、薬物の作用および毒性の両方を判
定およびモニターするのにも有用である。

【００２０】 有用性の例として、配列番号：１〜５０に初めて開示した配列をマイクロアレ
イまたは他のアッセイ方式に利用して、特定の医学的状態にある患者から採集し
た遺伝子材料をスクリーニングできる。これらの検査は、配列番号：１〜５０に
初めて開示した配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで用い、当業者に既知のコンピュータ
ーソフトウェアを利用して、以前に収集した遺伝子データベースおよび開示配列
を比較することによっても実施できる。

【００２１】 たとえば、配列番号：１〜５０に初めて開示した配列を、特定の疾患に関連す
る変異の同定のために、また診断アッセイまたは予後アッセイとしても利用でき
る。

【００２２】 現在記載されている配列はヌクレオチド配列を用いて具体的に記載されている
が、各配列は多様な他の構造特性またはその組合わせのいずれかを用いて独自に
記載できることを理解すべきである。たとえば、ある配列は、その配列の特定の
領域内に存在するヌクレオチドの正味組成を、配列番号：１〜５０に初めて開示
した１以上の特異的オリゴヌクレオチド配列の存在と組み合わせることにより記
載できる。あるいは、制限エンドヌクレアーゼ消化部位の相対位置または種々の
パリンドロームその他の特異的オリゴヌクレオチド配列を特定する制限地図を用
いて、ある配列の構造を記載することができる。このような制限地図は、広く利
用できるコンピュータープログラム（たとえばウィスコンシン大学ＧＣＧ配列分
析パッケージ、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ ３．０、Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ社、ミシ
ガン州アン・アーバーなど）により一般に作製される。これらの制限地図は所望
により、配列中にある１以上の別個のヌクレオチド配列を、１以上の追加配列ま
たは開示配列中にある１以上の制限部位に対するその配列の相対位置により表し
たものと組み合わせて使用できる。

【００２３】 オリゴヌクレオチドプローブに関して、高緊縮条件とは、たとえば６×ＳＳＣ
／０．０５％ピロリン酸ナトリウム中、３７℃（１４塩基オリゴ体について）、
４８℃（１７塩基オリゴ体について）、５５℃（２０塩基オリゴ体について）、
および６０℃（２３塩基オリゴ体について）での洗浄を表す。これらの核酸分子
は、たとえばＮＨＰ遺伝子調節に有用なＮＨＰ遺伝子アンチセンス分子を含み、
またはそれらの分子として作用することができる（ＮＨＰ遺伝子核酸配列の増幅
反応におけるアンチセンスプライマーを得るために、および／またはアンチセン
スプライマーとして）。ＮＨＰ遺伝子調節に関しては、それらの方法を用いて生
物学的機能を調節することができる。さらに、そのような配列を、同様にＮＨＰ
遺伝子調節に有用なリボザイムおよび／または三重らせん配列の一部として使用
できる。

【００２４】 さらに、阻害性のアンチセンスまたは二本鎖オリゴヌクレオチドは、下記を含
めた群（これらに限定されない）から選択される少なくとも１個の修飾塩基部分
を含むことができる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロ
ウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシ
トシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチル
アミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル
、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６
−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２
−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシ
トシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチ
ルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベー
タ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、
５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラ
シル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオ
シン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、
４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエス
テル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−
（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、
および２，６−ジアミノプリン。

【００２５】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラビノー
ス、キシルロースおよびヘキソースを含めた（これらに限定されない）群から選
択される少なくとも１個の修飾糖部分を含むこともできる。

【００２６】 さらに他の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオ
エート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデー
ト、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル
およびホルムアセタール、またはその類似体よりなる群から選択される少なくと
も１個の修飾リン酸主鎖を含む。

【００２７】 さらに他の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはα−アノマーオ
リゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のβ−単位
と異なり、鎖が互いに平行に走行する特異的な二本鎖ハイブリッドを相補的ＲＮ
Ａと形成する（Ｇａｕｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．，１５：６６２５−６６４１）。このオリゴヌクレオチドは２’−
Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌ
．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５：６１３１−６１４８）、またはキメラＲＮＡ−
ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２
１５：３２７−３３０）である。あるいは二本鎖ＲＮＡを用いてターゲットＮＨ
Ｐの発現および機能を撹乱することができる。

【００２８】 本発明のオリゴヌクレオチドは、当技術分野で既知の標準法により、たとえば
自動ＤＮＡ合成装置（たとえばＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓなどから市販されているもの）を用いて合成できる。一例として、
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはＳｔｅｉｎらの方法（１９８８，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：３２０９）により合成でき、メチルホスホ
ネートオリゴヌクレオチドは制御ポアガラスポリマー支持体を用いて製造できる
（Ｓａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：７４４８−７４５１）など。

【００２９】 低緊縮条件は当業者に周知であり、ライブラリーおよび標識配列が由来する個
々の生物に応じて異なるが、推定可能であろう。そのような条件に関する手引き
については、たとえば下記を参照されたい：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，
１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（およびその定期的改訂版），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９
８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓおよび
Ｗｉｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ニューヨーク。

【００３０】 あるいは、適切な緊縮条件を採用し、またはＰＣＲにより、適切に標識したＮ
ＨＰヌクレオチドプローブを用いてヒトゲノムライブラリーをスクリーニングす
ることができる。ヒトゲノムクローンの同定および解明は、多型性（ヌクレオチ
ド反復配列、マイクロサテライト対立遺伝子、一ヌクレオチド多型、またはコー
ディング一ヌクレオチド多型が含まれるが、これらに限定されない）の確認、特
定の遺伝子座／対立遺伝子のゲノム構造の決定、および診断試験の設計に有用で
ある。たとえばヒト遺伝子のイントロン／エキソン境界に隣接する領域に由来す
る配列を用いて、エキソン、イントロン、スプライス部位（たとえばスプライス
アクセプターおよび／またはドナー部位）内などの変異を検出するための増幅ア
ッセイに用いるプライマーを設計し、これらを診断および薬理遺伝学に使用でき
る。

【００３１】 さらに、本明細書に開示するＮＨＰ生成物内のアミノ酸配列に基づいて設計し
た２つの縮重または”ゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）”オリゴヌクレオチドプライマー
プールを用いてＰＣＲを行うことにより、目的生物の核酸からＮＨＰ遺伝子相同
配列を単離できる。反応の鋳型は、ＮＨＰ遺伝子の対立遺伝子を発現することが
分かっているかまたは推測されるヒトまたは非ヒト細胞系または組織（たとえば
前立腺、直腸、結腸または副腎）から調製したｍＲＮＡの逆転写により得られる
全ＲＮＡ、ｍＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡであってよい。

【００３２】 増幅配列が目的ＮＨＰ遺伝子の配列であることを確認するために、ＰＣＲ生成
物をサブクローニングして配列決定することができる。次いでそのＰＣＲフラグ
メントを用いて多様な方法で全長ｃＤＮＡクローンを単離できる。たとえば増幅
フラグメントを標識し、ｃＤＮＡライブラリー、たとえばバクテリオファージｃ
ＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用できる。あるいは、標識フラグメン
トを用いて、ゲノムライブラリーのスクリーニングによりゲノムクローンを単離
することができる。

【００３３】 ＰＣＲ法を利用して、全長ｃＤＮＡ配列を単離することもできる。たとえば標
準法により、適切な細胞源または組織源（すなわち、ＮＨＰ遺伝子を発現するこ
とが分かっているかまたは推測されるもの）からＲＮＡを単離できる。最も５’
末端の増幅フラグメントに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを第１鎖合成
のプライミングに用いて、ＲＮＡについて逆転写（ＲＴ）反応を行うことができ
る。次いで得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを標準的なターミナルトランス
フェラーゼ反応により”テイル形成”し、このハイブリッドをＲＮａｓｅ Ｈで
消化し、次いで相補プライマーにより第２鎖合成をプライミングすることができ
る。こうして、増幅フラグメントの上流のｃＤＮＡ配列を単離できる。使用でき
るクローニング方式の概説については、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ
．，１９８９（前掲）を参照されたい。

【００３４】 変異ＮＨＰ遺伝子をコードするｃＤＮＡは、たとえばＰＣＲを用いて単離でき
る。この場合、第１ｃＤＮＡ鎖は、変異ＮＨＰ対立遺伝子を保有すると推定され
る個体において発現することが分かっているかまたは推測される組織から単離し
たｍＲＮＡに、オリゴ−ｄＴオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、この新
たな鎖を逆転写酵素で延長することにより合成できる。次いで正常遺伝子の５’
末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いて、このｃＤＮＡ
の第２鎖を合成する。次いでこれら２プライマーを用いて、生成物をＰＣＲによ
り増幅させ、所望により適切なベクター中へクローニングし、当業者に周知の方
法でＤＮＡ配列分析を行う。変異ＮＨＰ対立遺伝子のＤＮＡ配列を対応する正常
なＮＨＰ対立遺伝子のものと比較することにより、変異ＮＨＰ配列生成物の機能
の喪失または変化に関与する変異（１以上）を確認できる。

【００３５】 あるいは、変異ＮＨＰ対立遺伝子を保有することが推測されるかもしくは分か
っている個体（すなわちＮＨＰ関連表現型、たとえば肥満症、高血圧症、結合組
織障害、不妊症などを発現している者）から得たＤＮＡを用いてゲノムライブラ
リーを構築することができ、または変異ＮＨＰ対立遺伝子を発現することが分か
っているかもしくは推測される組織からのＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリー
を構築することができる。次いで、正常なＮＨＰ遺伝子、またはそのいずれか適
切なフラグメントを標識してプローブとして用い、そのようなライブラリー中の
対応する変異ＮＨＰ対立遺伝子を同定することができる。次いで、当業者に周知
の方法で変異ＮＨＰ遺伝子配列を含むクローンを精製し、配列分析することがで
きる。

【００３６】 さらに、たとえば変異ＮＨＰ対立遺伝子を保有することが推測されるかまたは
分かっている個体の、そのような変異対立遺伝子を発現することが分かっている
かまたは推測される組織より単離したＲＮＡから合成したｃＤＮＡを利用して、
発現ライブラリーを構築できる。この方法で、後記のように、推定変異組織が形
成した遺伝子生成物を発現させ、正常ＮＨＰ生成物に対して産生された抗体と組
み合わせた標準抗体スクリーニング法を用いてスクリーニングすることができる
（スクリーニング法については、たとえばＨａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ
編，１９８８，”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，コールド・スプ
リング・ハーバー，ＮＹ、参照）。

【００３７】 さらに、標識ＮＨＰ融合タンパク質、たとえばアルカリ性ホスファターゼ−Ｎ
ＨＰまたはＮＨＰ−アルカリ性ホスファターゼ融合タンパク質を用いてスクリー
ニングすることによりスクリーニングを行うことができる。ＮＨＰ変異により機
能の変化した遺伝子生成物が発現する場合（たとえばミスセンス変異またはフレ
ームシフト変異の結果）、ＮＨＰに対するポリクローナル抗体が対応する変異Ｎ
ＨＰ遺伝子生成物と交差反応する可能性がある。それらとそのような標識抗体と
の反応により検出されるライブラリークローンを当技術分野で周知の方法で精製
し、配列分析することができる。

【００３８】 本発明は下記のものをも包含する：（ａ）前記ＮＨＰコード配列および／また
はそれらの相補配列（すなわちアンチセンス）のいずれかを含むＤＮＡベクター
；（ｂ）コード配列の発現を指令する調節要素と機能可能な状態で結合した前記
ＮＨＰコード配列のいずれかを含むＤＮＡ発現ベクター（たとえばＵＳＰ５，８
６９，３３６に記載のバキュロウイルス；本明細書に援用する）；（ｃ）宿主細
胞におけるコード配列の発現を指令する調節要素と機能可能な状態で結合した前
記ＮＨＰコード配列のいずれかを含む、遺伝子工学的に処理した宿主細胞；なら
びに（ｄ）外から導入された調節要素の制御下に内因性ＮＨＰ遺伝子を発現する
（すなわち遺伝子の活性化）、遺伝子工学的に処理した宿主細胞。本明細書中で
用いる調節要素には、誘導性および非誘導性のプロモーター、エンハンサー、オ
ペレーター、ならびに発現を誘発および調節することが当業者に知られている他
の要素が含まれるが、これらに限定されない。それらの調節要素には、下記のも
のが含まれるが、これらに限定されない：サイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）極
初期遺伝子、調節可能なウイルス要素（特にレトロウイルスＬＴＲプロモーター
）、ＳＶ４０アデノウイルスの初期または後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ
系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージラムダの主オペレーターおよびプロモーター
領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｐ
ＧＫ）のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、ならびに酵母α−
接合因子のプロモーター。

【００３９】 本発明は下記のものをも包含する：抗体および抗イディオタイプ抗体（Ｆａｂ
フラグメントが含まれる）、ＮＨＰのアンタゴニストおよびアゴラスト、ならび
にＮＨＰ遺伝子の発現を阻害する化合物もしくはヌクレオチド構築体（転写因子
阻害薬、アンチセンス分子およびリボザイム分子、または遺伝子もしくは調節配
列置換構築体）、またはＮＨＰの発現を促進する化合物もしくはヌクレオチド構
築体（たとえばＮＨＰコード配列が機能可能な状態でプロモーター、プロモータ
ー／エンハンサーなどの発現制御要素と結合した発現構築体）。

【００４０】 前記ＮＨＰまたはＮＨＰペプチド、ＮＨＰ融合タンパク質、ＮＨＰヌクレオチ
ド配列、抗体、アンタゴニストおよびアゴニストは、疾病の診断のために変異Ｎ
ＨＰまたは不適正発現したＮＨＰを検出するのに使用できる。ＮＨＰタンパク質
またはペプチド、ＮＨＰ融合タンパク質、ＮＨＰヌクレオチド配列、宿主細胞発
現系、抗体、アンタゴニスト、アゴニスト、ならびに遺伝子工学的に処理した細
胞および動物は、身体における正常なＮＨＰ機能の撹乱の症候性発現または表現
型発現を処置するのに有効な薬物のスクリーニング（またはコンビナトリアルラ
イブラリーのハイスループットスクリーニング）にも使用できる。遺伝子工学的
に処理した宿主細胞および／または動物の使用は、それらの系によりＮＨＰの内
因性受容体に結合する化合物を同定できるだけでなく、ＮＨＰ仲介による活性ま
たは経路を誘発する化合物をも同定できるという点で、有利である。

【００４１】 最終的に、ＮＨＰ生成物を療法薬として使用できる。たとえばＮＨＰの可溶性
誘導体、ＮＨＰに対応するペプチド／ドメイン、ＮＨＰ融合タンパク質生成物（
特にＮＨＰ−Ｉｇ融合タンパク質、すなわちＩｇＦｃへのＮＨＰまたはＮＨＰド
メインの融合体）、ＮＨＰ抗体および抗イディオタイプ抗体（Ｆａｂフラグメン
トが含まれる）、アンタゴニストまたはアゴニスト（ＮＨＰ仲介経路における下
流ターゲットを調節し、またはそれに作用する化合物が含まれる）を用いて、そ
のような疾病または障害を直接に処置することができる。たとえば、有効量の可
溶性ＮＨＰ、またはＮＨＰを模倣するＮＨＰ−ＩｇＦｃ融合タンパク質もしくは
抗イディオタイプ抗体（またはそのＦａｂ）の投与により、内因性ＮＨＰ受容体
を活性化するか、またはそれと効果的に拮抗させることができる。そのようなＮ
ＨＰ生成物をコードするヌクレオチド構築体を用いて、そのような生成物をイン
ビボで発現するように宿主細胞を遺伝子工学的に処理することができる；遺伝子
工学的に処理したこれらの細胞は体内で”バイオリアクター”として作用し、Ｎ
ＨＰ、ＮＨＰペプチドまたはＮＨＰ融合タンパク質を身体に連続的に供給する。
機能性ＮＨＰ、変異ＮＨＰ、ならびにアンチセンス分子およびリボザイム分子を
コードするヌクレオチド構築体は、ＮＨＰ発現を調節する”遺伝子療法”方式に
も使用できる。したがって本発明は、生物学的障害を処置するための医薬配合物
および方法をも包含する。

【００４２】 本発明の多様な態様について、以下の各サブセクションにさらに詳細に記載す
る。 ５．１ ＮＨＰ配列 前記ＮＨＰのｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を配列表に示す。
配列番号１−６のＮＨＰヌクレオチド配列は、ヒト遺伝子トラップ配列タグに存
在する配列情報を用いて得られた。

【００４３】 発現分析により、前記ＮＨＰはヒト組織、および遺伝子トラップしたヒト細胞
において発現しうることが証明された。セリン／トレオニンキナーゼに加えて、
配列番号１−６に記載するＮＨＰは、ＮＥＫ２およびＮＹ−ＲＥＮ−５５のよう
な更なる広範なキナーゼファミリー並びに広範な門および種にわたるプロテイン
キナーゼと顕著な類似性を有する。

【００４４】 同様に、配列番号７−４９に記載するＮＨＰは、前述のＭＡＧＵＫｓに加えて
、様々な門および種からなる広範な更なるキナーゼファミリーと顕著な類似性を
有する。二つの多形が配列解析プロジェクト中で同定された。一つ目は、例えば
配列番号７のヌクレオチド７３９に相当する配列位置でのＡ−Ｇ変化を同定した
（結果として、たとえば配列番号８のアミノ酸位置番号２４７でのイソロイシン
−バリン変化）。もう一つのＡ−Ｇ変化は、例えば配列番号９のヌクレオチド６
７に相当する配列位置で同定された（結果として、たとえば配列番号１０のアミ
ノ酸位置番号２３でのイソロイシン−バリン変化）。

【００４５】 プロテインキナーゼの生理的重要性から、プロテインキナーゼは例えば本明細
書に参照として援用する米国特許第５，８１７，４７９および５，８１７，４７
９において議論されているように精査の対象であり、それらには記載するＮＨＰ
配列にに適用することができる様々な使用や応用が記載されている。それらの全
体を参照としてここに援用する。

【００４６】 ５．２ ＮＨＰおよびＮＨＰポリペプチド ＮＨＰ、ポリペプチド、ペプチドフラグメント、変異形、トランケート形もし
くは欠失形のＮＨＰ、および／またはＮＨＰ融合タンパク質を、多様な用途のた
めに調製することができる。これらの用途には、抗体産生、診断アッセイにおけ
る試薬としての用途、ＮＨＰに関連した他の細胞遺伝子生成物の同定のための用
途、精神的、生物学的または医学的な障害および疾病の療法処置に有用な医薬と
して使用できる化合物のスクリーニングのためのアッセイにおける試薬としての
用途が含まれるが、これらに限定されない。類似性情報および発現データから、
記載するＮＨＰは、疾病を治療すること、あるいは例えば、胸もしくは前立腺癌
の治療に使用される化学療法治療剤の効能を治療上増大することを(薬剤、オリ
ゴ、抗体などによって)目標とすることができる。

【００４７】 配列表に、前記ＮＨＰ配列によりコードされるアミノ酸配列を開示する。前記
ＮＨＰは典型的に、翻訳開始部位に一致するＤＮＡ配列コンテクストにイニシエ
ーターメチオニンを示す。

【００４８】 本発明のＮＨＰアミノ酸配列には、配列表に示したアミノ酸配列、ならびにそ
れらの類似体および誘導体が含まれる。さらに、他の種に由来する対応するＮＨ
Ｐ相同配列も本発明に包含される。事実、配列表に示したアミノ酸配列の全部ま
たはいずれかの新規部分をコードする新規ポリヌクレオチド配列のほか、前記Ｎ
ＨＰヌクレオチド配列がコードするいかなるＮＨＰタンパクも本発明の範囲に含
まれる。遺伝子コードの縮重性は周知であり、したがって配列表に示した各アミ
ノ酸はそのアミノ酸をコードしうる周知の核酸”トリプレット”コドン（または
多くの場合、コドン類）の一般的代表例である。したがって、本明細書で意図す
るように、配列表に示したアミノ酸配列は、遺伝子コード（たとえば”Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１９８６，Ｊ．Ｄａｒｎｅｌｌら編
，ｐ．１０９，表４−１参照，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏ
ｏｋｓ，ニューヨーク州ニューヨーク；本明細書に参考として援用）を合わせて
考慮すると、そのようなアミノ酸配列をコードしうる核酸配列の種々の変形およ
び組合わせによるすべてのうちの一般的代表例である。

【００４９】 本発明は、多数の基準のいずれかにより判定して本明細書に記載したヌクレオ
チド配列がコードするＮＨＰに機能的に均等なタンパク質をも包含する。これら
の基準には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ＮＨＰの基質を結
合および開裂する能力；同一または補足的な下流経路に影響を及ぼす能力；細胞
代謝（たとえばタンパク質分解活性、イオンフラックス、チロシンリン酸化など
）を変化させる能力。そのような機能的に均等なＮＨＰタンパク質には、前記Ｎ
ＨＰヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列内のアミノ酸残基の付加体また
は置換体であって、ただしサイレント変化を生じ、したがって機能的に均等な遺
伝子生成物を産生するものが含まれるが、これらに限定されない。アミノ酸置換
は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水度、親水度および／または両親媒
性の類似性に基づいて行うことができる。たとえば非極性（疎水性）アミノ酸残
基にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニ
ン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸にはグリシン
、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミン
が含まれ；正に荷電した（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リシンおよびヒス
チジンが含まれ；負に荷電した（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグル
タミン酸が含まれる。

【００５０】 多様な宿主発現ベクター系を利用して、本発明のＮＨＰヌクレオチド配列を発
現させることができる。本発明の場合のようにＮＨＰペプチドまたはポリペプチ
ドが膜タンパクであると考えられるならば、タンパク質の疎水性領域を切除する
ことができ、結果として可溶性ペプチドまたはポリペプチドを培地から回収でき
る。そのような発現系には、ＮＨＰまたはその機能均等物をｉｎ ｓｉｔｕで発
現する工学的に処理した宿主細胞も包含される。そのような発現系からのＮＨＰ
の精製または富化は、適切な界面活性剤および脂質ミセル、ならびに当業者に周
知の方法を用いて行うことができる。しかし、ＮＨＰの構造特性および機能特性
を維持するだけでなく、たとえば薬物スクリーニングアッセイにおいて生物学的
活性を評価することが重要である場合、そのような工学的に処理した宿主細胞自
体を使用できる。

【００５１】 本発明の目的に使用できる発現系には下記のものが含まれるが、それらに限定
されない：ＮＨＰヌクレオチド配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プ
ラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した微生物、た
とえば細菌（たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
））；ＮＨＰヌクレオチド配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵
母（たとえばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃ
ｈｉａ））；ＮＨＰ配列を含む組換えウイルス発現ベクター（たとえばバキュロ
ウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ＮＨＰヌクレオチド配列を含む組換えウイ
ルス発現ベクター（たとえばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコ
モザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた、もしくは組換えプラスミド発現ベク
ター（たとえばＴｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；または哺乳動物細
胞のゲノムに由来するプロモーター（たとえばメタロチオネインプロモーター）
もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（たとえばアデノウイルス後
期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターなど）を含む組換え
発現構築体を宿した哺乳動物細胞系（たとえばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２３９
、３Ｔ３など）。

【００５２】 細菌系では、発現するＮＨＰ生成物について意図する用途に応じて、多数の発
現ベクターを有利に選択できる。たとえばＮＨＰの医薬組成物またはＮＨＰ含有
医薬組成物を調製するために、あるいはＮＨＰに対する抗体を産生させるために
、そのようなタンパク質を大量に製造したい場合、容易に精製される融合タンパ
ク質生成物の高レベル発現を指令するベクターが望ましいことがある。そのよう
なベクターには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：大腸菌発現ベ
クターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，ＥＭＢＯ Ｊ．
，２：１７９１）、この場合、ＮＨＰコード配列を個々に、融合タンパク質が産
生されるようにｌａｃＺコード領域と読み枠を一致させて、ベクター中にライゲ
ートさせる；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ，１９８５，Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ Ｈ
ｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６
４：５５０３−５５０９）など。ｐＧＥＸベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａまたは
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を用い
て、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融
合タンパク質として発現させることもできる。一般にそのような融合タンパク質
は可溶性であり、溶解細胞からグルタチオン−アガロースビーズへの吸着、次い
で遊離グルタチオンの存在下での溶離によって、容易に精製できる。ｐＧＥＸベ
クターがトロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むように設計し、
これにより、クローン化したターゲット遺伝子の生成物をＧＳＴ部分から放出さ
せることができる。

【００５３】 昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核ポリヒドロー
シスウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｉｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（Ａ
ｃＮＰＶ）を外来遺伝子発現のためのベクターとして用いる。このウイルスをＳ
ｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞内で増殖させる。ＮＨＰ遺伝子
コード配列を個々にウイルスの非必須領域（たとえばポリヘドリン遺伝子）内へ
クローン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター（たとえばポリヘドリンプロモーター）
の制御下におく。ＮＨＰ遺伝子コード配列の挿入に成功すると、ポリヘドリン遺
伝子が不活性化され、ノンオクルーデッド（ｎｏｎ−ｏｃｃｌｕｄｅｄ）組換え
ウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子がコードするタンパク質性コートをも
たないウイルス）が産生されるであろう。次いでこれらの組換えウイルスをＳｐ
ｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞の感染に用い、ここで挿入遺伝子
を発現させる（たとえばＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
．４６：５８４；Ｓｍｉｔｈ，ＵＳＰ４，２１５，０５１参照）。

【００５４】 哺乳動物宿主細胞の場合、多数のウイルス性発現系を利用できる。アデノウイ
ルスを発現ベクターとして用いる場合、目的とするＮＨＰヌクレオチド配列をア
デノウイルス転写／翻訳制御複合体、たとえば後期プロモーターおよび三部分（
ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列にライゲートさせることができる。次いで
このキメラ遺伝子をインビトロまたはインビボ組換えによりアデノウイルスゲノ
ムに挿入する。ウイルスゲノムの非必須領域（たとえば領域Ｅ１またはＥ３）に
挿入すると、感染宿主においてＮＨＰ遺伝子生成物を発現しうる生存可能な組換
えウイルスが得られる（たとえばＬｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ，１９８４，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３６５５−３６５９参照）
。挿入したＮＨＰヌクレオチド配列の効率的翻訳には、特異的開始シグナルが必
要なこともある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含
まれる。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む全ＮＨＰ遺伝子またはｃＤ
ＮＡを適切な発現ベクターに挿入する場合、追加の翻訳制御シグナルは必要ない
かもしれない。しかしＮＨＰコード配列の一部のみを挿入する場合、外因性翻訳
制御シグナル（おそらく、ＡＴＧ開始コドンを含む）を供給しなければならない
。さらに、挿入配列全体を確実に翻訳するためには、開始コドンが目的コード配
列の読み枠と一致しなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび
開始コドンは、天然および合成のいずれでも、多様な由来のものであってよい。
適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを取り込ませることによ
り、発現効率を高めることができる（Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１６−５４４参照）。

【００５５】 さらに、挿入配列の発現を調節し、または遺伝子生成物を目的とする特定の様
式で修飾およびプロセシングする、宿主細胞系統を選ぶことができる。タンパク
質生成物のそのような修飾（たとえばグリコシル化）およびプロセシング（たと
えば開裂）は、タンパク質の機能にとって重要である。異なる宿主細胞は、タン
パク質および遺伝子生成物の翻訳後プロセシングおよび修飾について特徴的かつ
特異的な機序をもつ。発現した外来タンパク質の適正な修飾およびプロセシング
を確実にするために、適切な細胞系または宿主系を選ぶことができる。このため
に、一次転写体の適正なプロセシング、遺伝子生成物のグリコシル化およびリン
酸化のための細胞機構をもつ真核宿主細胞を使用できる。そのような哺乳動物宿
主細胞にはＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、
３Ｔ３、ＷＩ３８、特にヒト細胞系が含まれるが、これらに限定されない。

【００５６】 組換えタンパク質の長期高収率産生のためには、安定な発現が好ましい。たと
えば前記ＮＨＰ配列を安定に発現する細胞系を工学的に作成することができる。
ウイルス複製起点を含む発現ベクターを用いるのではなく、適切な発現制御要素
（たとえばプロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニ
ル化部位など）により制御されるＤＮＡ、および選択性マーカーで、宿主細胞を
形質転換することができる。この外来ＤＮＡの導入後、工学的に処理した細胞を
富化培地で１〜２日間増殖させ、次いで選択培地に切り替える。組換えプラスミ
ド内の選択性マーカーが選択に対する耐性を与え、細胞はそのプラスミドを細胞
の染色体に安定に組み込むことができ、増殖してフォーカスを形成する。次いで
これをクローン化し、細胞系に拡張することができる。この方法は、ＮＨＰ生成
物を発現する細胞系を工学的に作成するのに有利に使用できる。このような工学
的に作成した細胞系は、ＮＨＰ生成物の内因活性に影響を与える化合物のスクリ
ーニングおよび評価に特に有用である。

【００５７】 多数の選択系を使用でき、これには下記のものが含まれるが、これらに限定さ
れない：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．
，１９７７，Ｃｅｌｌ，１１：２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボ
シルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，１９
６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８：２０２６）、お
よびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，ｅｔ ａｌ．，１
９８０，Ｃｅｌｌ，２２：８１７）遺伝子を、それぞれｔｋ^-、ｈｇｐｒｔ^-また
はａｐｒｔ^-細胞に使用できる。代謝拮抗物質耐性を下記の遺伝子の選択の基礎
として用いることもできる：ｄｈｆｒ、これはメトトレキセートに対する耐性を
与える（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ，７７：３５６７；Ｏ’Ｈａｒｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１５２７）；ｇｐｔ、これはミ
コフェノール酸に対する耐性を与える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，１９
８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２）；ｎ
ｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与える（Ｃｏｌｂｅｒ
ｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１
５０：１）；およびｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンに対する耐性を与える
（Ｓａｎｔｅｒｒｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｇｅｎｅ，３０：１４７）。

【００５８】 あるいは、発現する融合タンパク質に特異的な抗体を利用することにより、い
かなる融合タンパク質も容易に精製できる。たとえばＪａｎｋｎｅｃｈｔらが記
載した系は、ヒト細胞系において発現した非変性融合タンパク質を容易に精製で
きる（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８９７２−８９７６）。この系では、目的遺伝
子をその遺伝子のオープンリーディングフレームが６ヒスチジン残基からなるア
ミノ末端タグに翻訳時融合するように、ワクシニア組換えプラスミド内へサブク
ローニングする。組換えワクシニアウイルスを感染させた細胞からの抽出物をＮ
ｉ²⁺・ニトリロ酢酸−アガロースカラムに装填し、ヒスチジンタグ付きタンパク
質をイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶離する。

【００５９】 本発明には、ＮＨＰをターゲット臓器へ向かわせ、および／または膜を透過し
て細胞質ゾル内への輸送を促進する融合タンパク質が含まれる。抗体分子または
そのＦａｂフラグメントへのＮＨＰの結合は、特定のエピトープを保有する細胞
をターゲティングするのに利用できる。適切なシグナル配列をＮＨＰに結合させ
ると、ＮＨＰを細胞内の目的位置へ輸送することもできる。あるいは、ＮＨＰま
たはその核酸配列のターゲティングは、リポソームまたは脂質複合体をベースと
する送達系を用いて達成することもできる。そのような技術は、Ｌｉｐｏｓｏｍ ｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ，Ｎｅｗ、ＲＲＣ編、オック
スフォード大学出版社、ニューヨーク、およびＵＳＰ４，５９４，５９５、５，
４５９，１２７、５，９４８，７６７および６，１１０，４９０に記載されてお
り、それらの各開示内容全体を本明細書に援用する。更に本発明には、新規なタ
ンパク質構築体であって、細胞膜を透過し、ターゲット部位あるいは目的臓器へ
のＮＨＰの輸送を容易にするように、および／またはＮＨＰの機能を及ぼすこと
ができる場所である核へのＮＨＰの輸送を促進しうるように作成したものも包含
される。この目標は、ＮＨＰのターゲティング特異性を与えるサイトカインある
いは他のリガンドとのカップリングによって、および／または細胞膜透過容易に
するためにタンパク形質導入ドメイン（そのような形質導入配列の例として米国
特許出願６０／１１１，７０１および６０／０５６，７１３を参照。これらを参
照として本明細書に援用する。）とＮＨＰをカップリングすることにより達成さ
れ、そして選択的に核局所化配列を含むように作成することができる。

【００６０】 ５．３ ＮＨＰ生成物に対する抗体 ＮＨＰの１以上のエピトープ、またはＮＨＰの保存バリアントのエピトープ、
またはＮＨＰのペプチドフラグメントを特異的に認識する抗体も、本発明に包含
される。そのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡ
ｂ）、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’
）₂フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されるフラグメント、抗
イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、および前記のいずれかのエピトープ結合性フ
ラグメントが含まれるが、それらに限定されない。

【００６１】 本発明の抗体は、たとえば生物試料中のＮＨＰの検出に使用でき、したがって
患者を異常な量のＮＨＰについて調べる診断法または予後判定法の一部として使
用できる。そのような抗体を、たとえば化合物スクリーニング法と組み合わせて
、後記のようにＮＨＰ遺伝子生成物の発現および／または活性に対する被験化合
物の作用を評価するのにも利用できる。さらに、そのような抗体を遺伝子療法と
組み合わせて用い、たとえば正常および／または工学的に処理したＮＨＰ発現細
胞を患者に導入する前に評価することができる。そのような抗体をさらに、異常
なＮＨＰ活性の阻害手段として使用できる。したがって、そのような抗体を処置
方法の一部として利用できる。

【００６２】 抗体産生のためには、ＮＨＰ、ＮＨＰペプチド（たとえばＮＨＰの機能性ドメ
インに対応するもの）、トランケート形ＮＨＰポリペプチド（１以上のドメイン
を欠失したＮＨＰ）、ＮＨＰの機能均等物、またはＮＨＰの変異バリアントを注
射することにより、種々の宿主動物を免疫化することができる。数例を挙げると
、そのような宿主動物にはブタ、ウサギ、マウス、ヤギおよびラットが含まれる
が、これらに限定されない。宿主の種に応じて、免疫応答を高めるために種々の
アジュバントを使用でき、これにはフロイントアジュバント（完全および不完全
）、無機塩、たとえば水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム、界面活性
物質、たとえばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチ
ド、油エマルション、ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント、たとえばＢＣ
Ｇ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが含まれるが、これらに限定されない。あるい
は、キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、破
傷風毒素、ジフテリア毒素、卵アルブミン、コレラ毒素、またはそのフラグメン
トなどの分子との組合わせおよび／または結合により、免疫応答を高めることが
できる。ポリクローナル抗体は免疫化動物の血清から得られる不均一な抗体分子
集団である。

【００６３】 特定の抗原に対する均一な抗体集団であるモノクローナル抗体は、連続した培
養細胞系により抗体分子を産生するいかなる方法によっても得ることができる。
これらには下記の方法が含まれるが、これらに限定されない：Ｋｏｈｌｅｒおよ
びＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ法（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４
９５−４９７；およびＵＳＰ４，３７６，１１０）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ
法（Ｋｏｓｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａ
ｙ，４：７２；Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２０２６−２０３０）、およびＥＢＶ−ハイブリ
ドーマ法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉ
ｓｓ社，ｐｐ．７７−９６）。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、Ｉ
ｇＡ、ＩｇＤおよびそのいずれかのサブクラスを含めた、いかなる免疫グロブリ
ンクラスであってもよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマをインビト
ロまたはインビボで培養することができる。インビボで高力価のｍＡｂを産生で
きるので、これは現在好ましい産生方法である。

【００６４】 さらに、”キメラ抗体”（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅ
ｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４−６０８；
Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４５２−４５
４）の産生のために開発された、適切な抗原特異性をもつマウス抗体分子からの
遺伝子を適切な生物学的活性をもつヒト抗体分子からの遺伝子とスプライシング
することによる方法を使用できる。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に
由来する分子、たとえばネズミｍＡｂ由来の可変部とヒト免疫グロブリン定常部
をもつものである。そのような方法はＵＳＰ６，０７５，１８１および５，８７
７，３９７に記載されており、それらの各開示内容全体を本明細書に援用する。
同様に本発明に含まれるのは、米国特許６，１５０，５８４に記載されている完
全人化モノクローナル抗体の使用であり、相当する開示の全体を参照として本明
細書に援用する。

【００６５】 あるいは、一本鎖抗体の産生のために記載された方法（ＵＳＰ４，９４６，７
７８；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓ
ｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，８５：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，
Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４−５４６）を、ＮＨＰ遺伝子生成物に対する一本
鎖抗体の産生に適合させることができる。一本鎖抗体は、Ｆｖ部のＨ鎖およびＬ
鎖フラグメントをアミノ酸橋により結合させて一本鎖ポリペプチドにすることに
より形成される。

【００６６】 特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、既知の方法で形成できる。
たとえばそのようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化により調製でき
るＦ（ａｂ’）₂フラグメント、およびＦ（ａｂ’）₂フラグメントのジスルフィ
ド橋を還元することにより調製できるＦａｂフラグメントが含まれるが、これら
に限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して（Ｈｕｓｅ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１）、目的
とする特異性をもつモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速かつ容易に同定す
ることができる。

【００６７】 次いでＮＨＰに対する抗体を使用し、当業者に周知の方法を用いて、そのＮＨ
Ｐを”模倣”する抗イディオタイプ抗体を産生させることができる（たとえばＧ
ｒｅｅｎｓｐａｎ ＆ Ｂｏｎａ，１９９３，ＦＡＳＥＢ Ｊ．７（５）：４３
７−４４４；およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１
４７（８）：２４２９−２４３８参照）。たとえば、ＮＨＰドメインに結合して
ＮＨＰがそのコグネイト受容体に結合するのを競合阻害する抗体を用いて、ＮＨ
Ｐを”模倣”する、したがって受容体に結合および活性化または中和する、抗イ
ディオタイプ抗体を産生させることができる。そのような抗イディオタイプ抗体
またはそのような抗イディオタイプ抗体のＦａｂフラグメントは、ＮＨＰ仲介経
路を伴う療法に使用できる。

【００６８】 本発明の範囲は本明細書に記載した具体的態様により限定されない。これらの
態様は本発明の個々の態様を説明するために示したにすぎず、機能的に均等な方
法および成分は本発明の範囲に含まれる。実際に、本明細書に例示および記載し
たもののほか本発明の種々の変更が、以上の記載および添付の図面からから当業
者に明らかになるであろう。そのような変更も本発明の範囲に含まれる。引用し
た刊行物、特許および特許出願の全体を本明細書に援用する。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ネポンニチー，ボリス アメリカ合衆国テキサス州77909，ヒュー ストン，サイプレス・ステーション・ドラ イブ 905，ナンバー 1515 (72)発明者 ターナー，シー・アレキサンダー，ジュニ ア アメリカ合衆国テキサス州77381，ザ・ウ ッドランズ，ウインター・ウィート・プレ イス 67 (72)発明者 ザンブロウィックズ，ブライアン アメリカ合衆国テキサス州77382，ザ・ウ ッドランズ，ファイアーソーン・プレイス 18 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA10 CA01 CA04 CA07 DA02 DA05 DA11 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 HA11

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１に記載の新規配列中の少なくとも２４連続塩基の
   ヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
2. 【請求項２】 （ａ）配列番号：２に示すアミノ酸配列をコードし；かつ （ｂ）緊縮条件下で配列番号：１のヌクレオチド配列またはその相補配列にハ
   イブリダイズする ヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
3. 【請求項３】 配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
   配列を含む、単離核酸分子。
4. 【請求項４】 配列番号：４に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
   配列を含む、単離核酸分子。
5. 【請求項５】 配列番号：６に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
   配列を含む、単離核酸分子。
6. 【請求項６】 配列番号：４５に記載の新規配列中の少なくとも２４連続塩基
   のヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
7. 【請求項７】 （ａ）配列番号：４６に示すアミノ酸配列をコードし；かつ （ｂ）緊縮条件下で配列番号：４５のヌクレオチド配列またはその相補配列に
   ハイブリダイズする ヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
8. 【請求項８】 配列番号：４６に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチ
   ド配列を含む、単離核酸分子。
9. 【請求項９】 配列番号：３８に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチ
   ド配列を含む、単離核酸分子。
10. 【請求項１０】 配列番号：３０に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオ
    チド配列を含む、単離核酸分子。