JP2003531179A - 悪性細胞表現型に対し一酸化窒素模倣体を使用する処方および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 低用量の一酸化窒素模倣体を細胞に投与することにより、悪性細胞表現型を阻害および防止する方法ならびに処方が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の技術分野） 本発明は、悪性細胞表現型を阻害および防止する方法ならびに処方に関する。
本発明者らは、低酸素症および低窒素症が細胞表現型に影響を及ぼす機構は、必
ずしも低酸素によって媒介されるのではなく、むしろ一酸化窒素模倣活性の欠損
によることを今回発見した。従って本明細書において明らかにされるように、低
用量の一酸化窒素模倣体の投与は、細胞の一酸化窒素模倣活性を増加、回復また
は維持し、その結果悪性細胞表現型が阻害または防止されるのに十分である。従
って本明細書において、悪性細胞表現型を阻害し、および／または悪性細胞表現
型の発生を防止するが、NO模倣体の望ましくない作用の発生は低下または回避す
るような濃度で、低用量一酸化窒素模倣体を細胞に送達するための処方およびこ
れらの処方を使用する方法が提供される。これらの方法および処方は、動物にお
ける癌の治療および防止に特に有用である。

【０００２】 （発明の背景） 低酸素症または細胞における正常な生理値以下の酸素圧は、細胞の生理学的、
更には病理学的変化を生じ、その変化は示差的遺伝子発現に関連する。例えば低
酸素症は、血管作動性物質の転写により調節された発現の変調または血管および
周囲組織の再構築を含む様々な方法で、インビボおよびインビトロにおいて、内
皮細胞の生理に影響を及ぼす(Faller, D.V.、Clin. Exp. Pharmacol. and Physi
ol.、26:74-84(1999))。固形腫瘍における低酸素症は、癌細胞をX線照射により
殺傷されることから守り、かつある種の抗癌剤に対する抵抗性をもたらすことが
示されている。更に低酸素症は、悪性進行を促進しかつ転移を増大すると考えら
れる(Brown, J.M.、Cancer Res.、59:5863-5870(1999))。

【０００３】 一酸化窒素は、様々な生体プロセスに関わっている。例えば一酸化窒素は、内
皮由来血管弛緩および神経伝達に寄与する生物学的メッセンジャー分子である。
これらの研究者らが高レベルとみなすような一酸化窒素は、マクロファージの抗
腫瘍作用および抗菌作用のメディエーターとしても公知である。一酸化窒素は、
マトリックスメタロプロテアーゼ-9およびメタロプロテアーゼの組織インヒビタ
ーのサイトカイン誘導型発現に対し変調性の役割を果たすことも明らかにされて
いる(Eberhardtら、Kidney International、57:59-69(2000))。

【０００４】 大量の臨床および実験データが、一酸化窒素は、固形腫瘍の増殖および進行を
促進することにおいても役割を果たしていることを指摘している。例えば、誘導
型一酸化窒素シンターゼ(iNOS)による一酸化窒素生成は、前立腺癌(Klotzら、Ca
ncer； National Library of Medicine, MDX Health Digest、82(10):1897-903(
1998))に加え、結腸腺癌および乳腺癌(Lala, P.K.およびOrucevic, A.、Cancer
and Metastasis Reviews、17:91-106(1998))の発生に関連している。加えて一酸
化窒素は、肺癌、特に腺癌の代謝および挙動において重要な役割を果たすことが
示唆されている(Fujimotoら、Jpn. J. Cancer Res、88:1190-1198(1997))。実際
、これらの研究者らが低レベル一酸化窒素と称するものを生成するかまたはこれ
に曝露された腫瘍細胞、もしくは一酸化窒素が媒介した損傷に抵抗性を示すこと
が可能な腫瘍細胞は、それらの生存上の利点のためにクローン選択を受けること
が示唆されている(Lala, P.K.およびOrucevic, A.、Cancer and Metastasis Rev
iew、17:91-106(1998))。これらの著者は、これらの腫瘍細胞は、増殖、浸潤お
よび転移の促進のために、ある種の一酸化窒素媒介型機構を利用することを示し
、かつ一酸化窒素阻害薬は、ある種のヒト癌の治療において有用であることを提
唱している。更に腫瘍由来の一酸化窒素は、ヒトを含む動物において腫瘍の血管
新生に加え、ある種の腫瘍の浸潤を促進することを示す証拠もある(Lala, P.K.
、Cancer and Metastasis Reviews、17:1-6(1998))。

【０００５】 しかし一酸化窒素は、低酸素症により誘導された血管収縮物の生成を逆行する
ことが明らかにされている(Faller, D.G.、Clinical and Experimental Pharmac
ology and Physiology、26:74-84(1999))。加えて一酸化窒素供与体であるニト
ロプルシドナトリウム、S-ニトロソ-L-グルタチオンおよび3-モルホリノシドノ
ニミンは、マイクロモル領域で(IC₅₀は、各々、7.8、211および490μM)、低酸素
状態で培養されたHep3B細胞、ヒト肝癌細胞株において転写因子である低酸素症
誘導因子-1により制御された適応性のある細胞反応を抑制することが明らかにさ
れている(Sogawaら、Proc. Natl Acad. Sci. USA、95:7368-7373(1998))。一酸
化窒素供与体であるニトロプルシドナトリウム(SNP；150μM)は更に、血管内皮
細胞増殖因子、正常な血管発生、ならびに癌および虹彩および網膜の血管新生の
ような病原性血管形成性疾患に必要な内皮細胞分裂促進因子の低酸素症誘導性の
発現を低下することが明らかにされている(Ghisoら、Investigative Ophthalmol
ogy & Visual Science、40(6):1033-1039(1999))。これらの実験において、150
μM SNPは、不死化されたヒト網膜上皮細胞において少なくとも24時間、低酸素
症が誘導したVEGF mRNAレベルを完全に抑制することが明らかにされた。

【０００６】 高レベルの一酸化窒素がある種の細胞において誘導された場合、これは細胞分
裂停止およびアポトーシスを生じる。例えばXieらは、利用できる(exploitable)
現象であるはずの高レベルの一酸化窒素への曝露(およそ75μM亜硝酸塩を生成；
Xieらの論文図5A参照)が、マウスK-1735黒色腫細胞の死滅を促進する(Xieらの論
文図6Aおよび6B参照)ことを明らかにしている(J. Exp. Med.、181:1333-1343(19
95))。加えて国際公開公報第93/20806号は、水溶液中に一酸化窒素を放出するこ
とが可能であるスペルミン-ビス(一酸化窒素)付加一水和物500μMなどの化合物
へ細胞を曝露することにより細胞の分裂停止または細胞毒性を誘導する方法を開
示している。これらの化合物は、腫瘍細胞の治療に加え、駆虫、抗真菌および抗
菌治療に有用であると考えられている。大用量の一酸化窒素放出化合物が投与さ
れ、活性化合物を作用させるような時間をかけ、その後一酸化窒素捕捉剤のよう
な適当な試薬がこの活性化合物を失活させかつ非特異的損傷を停止するために個
体に投与されるような、メガ投与計画の採用が示唆されている。国際公開公報第
93/20806号の14頁25〜30行には、3-(n-プロピルアミノ)プロピルアミン-ビス(一
酸化窒素)付加物、ジエチルアミン-ビス(一酸化窒素)付加体のナトリウム塩、イ
ソプロピルアミン-ビス(一酸化窒素)付加体のナトリウム塩、トリオキソ二硝酸
ナトリウム(II)一水和物、およびN-ニトロソヒドロキシルアミン-N-スルホネー
トは、最高濃度500μMまで、細胞生存度には有意には作用しないと記載されてい
る。

【０００７】 米国特許第5,840,759号、米国特許第5,837,736号、および米国特許第5,814,66
7号には、腫瘍の低酸素状態の細胞を放射線に対して増感するために一酸化窒素
放出化合物をmg/kg量使用する方法を開示されている。これらの特許は更に、非
癌性細胞または組織を放射線から保護し、癌性細胞を化学療法剤に対して増感し
、および非癌性細胞または組織を化学療法剤から保護するために、同じ一酸化窒
素放出化合物をmg/kgレベルで使用する方法も開示している。これらの方法にお
いて使用される化合物は、酸素を要求することなく生理条件下で自然発生的に一
酸化窒素を放出する。これらの特許は、治療前約15〜約60分間の一酸化窒素放出
化合物の投与も開示している。投与される一酸化窒素放出化合物の典型的用量は
、体重1kg当り１種以上の一酸化窒素放出化合物を約0.1〜約100mgであることが
示唆されている。MCF7乳癌細胞およびV79繊維芽細胞のインビトロにおけるメル
ファラン、チオテパ、マイトマイシンC、SR4233およびシスプラチンに対する感
受性を増大することが示されている一酸化窒素放出化合物DEA/NOおよびPAPA/NO
の濃度はミリモル領域であるのに対し、DEA/NOの70mg/kgは、インビボ KHT腫瘍
モデルにおいて化学療法剤メルファランを投与されたマウスの生存を延長するこ
とが示された。

【０００８】 米国特許第5,700,830号および国際公開公報第96/15781号は、動物へ一酸化窒
素放出N₂0₂官能基を有する一酸化窒素放出化合物を投与することによる、動物に
おける癌性細胞と非癌性細胞との間の接着を阻害する方法を開示している。しか
し最近の研究は、管外遊出につながる、血管壁への癌細胞接着およびそれに沿っ
た広がりは、転移の必須事象ではないことを指摘している(Morrisら、Exp. Cell
. Res.、219:571-578(1995))。

【０００９】 国際公開公報第98/58633号は、一酸化窒素生成の低下または一酸化窒素作用の
減弱に関連した血管状態を緩和するためのマイクロ用量の一酸化窒素療法を開示
している。

【００１０】 （発明の概要） 本発明の目的は、悪性細胞表現型を阻害および防止するために、低用量の一酸
化窒素模倣体を細胞へ投与する方法および処方を提供することである。

【００１１】 これらの方法および処方は、癌の増殖を低下しかつ治療に対する反応を改善す
ることにより、癌の管理において特に有用である。例えば、本発明の方法および
処方は、悪性表現型を示す細胞の転移、浸潤および進行を阻害することができる
。加えてこれらの方法および処方は、腫瘍の原発部位に加え続発部位において、
悪性表現型を示す細胞の休止状態(dormancy)を誘導または維持することができる
。更にこれらの方法および処方は、悪性細胞表現型を示す細胞の抗悪性治療様式
に対する抵抗性の発生を防止または減少することに加え、抗悪性治療様式の効能
を増強することができる。

【００１２】 本発明の方法および処方は、細胞における一酸化窒素模倣活性の欠損につなが
るような状態および／または治療薬への細胞の曝露時に細胞に発生し得る悪性細
胞表現型の防止においても非常に有用である。

【００１３】 本発明の方法および処方は、癌の発生を誘導するような因子への曝露時に発生
し得るような癌細胞においてより攻撃的な悪性細胞表現型の発生を阻害すること
においても有用である。

【００１４】 加えてこれらの方法および処方は、低用量一酸化窒素模倣体の投与後の悪性細
胞表現型の１種以上のマーカー指標レベルの検出による、動物における悪性細胞
表現型の診断および経過観察において有用である。低用量一酸化窒素模倣体投与
前の動物におけるマーカーレベルと比較した場合の、低用量一酸化窒素模倣体投
与後の動物における、１種以上のこれらのマーカーレベルの無変化、減少または
増加の減速は、その動物における悪性細胞表現型の指標である。 従って、本発明の方法および処方は、動物における癌の治療および防止の新規
治療法ならびに診断法を提供する。

【００１５】 (発明の詳細な説明) 本発明者らは本明細書において、低酸素症および低窒素症が細胞表現型に影響
を及ぼす機構が、酸素の欠乏によってのみではなく、むしろ一酸化窒素模倣活性
の欠損によって媒介されることを明らかにする。更に本発明者らは本明細書にお
いて、低用量一酸化窒素模倣体の投与は、細胞の一酸化窒素模倣活性のレベルを
増加、回復または維持し、その結果悪性細胞表現型が阻害または防止されるのに
十分であることを明らかにする。この阻害および防止は、細胞が低酸素状態環境
にある場合および／または内因性一酸化窒素生成の阻害と組合わせた場合にも生
じる。非常に低用量の一酸化窒素模倣体の投与は、例え顕著に低下した酸素レベ
ル(1％O₂)条件下であっても、悪性細胞表現型の生成を防止し、かつ細胞の悪性
細胞表現型を阻害する。

【００１６】 従って本発明は、細胞の悪性細胞表現型を阻害および防止することにおける低
用量の一酸化窒素模倣体の使用に関する。本発明の方法および処方は、動物にお
ける癌の治療および予防のための新規治療法を提供する。本発明の目的に関して
「治療」または「治療する」は、悪性細胞表現型を示す細胞の増殖を低下し、か
つ抗悪性治療様式に対する反応を改善することによる癌の制御のための全ての手
段を包含していることを意味する。従って「治療」または「治療する」は、悪性
細胞表現型を示す細胞の生存および／または増殖を阻害すること、悪性細胞表現
型を示す細胞の生存および／または増殖を防止すること、悪性細胞表現型を示す
細胞の浸潤度を低下すること、悪性細胞表現型を示す細胞の進展を減速すること
、悪性細胞表現型を示す細胞の転移を減少すること、悪性細胞表現型を示す細胞
の退縮を増大すること、および／または悪性細胞表現型を示す細胞の殺傷を促進
することを意味する。「治療」または「治療する」は、更にその原発部位に加え
続発部位における悪性細胞表現型を示す細胞の休止状態への維持を包含すること
を意味する。更に「治療」または「治療する」は、抗悪性治療様式の効能を増強
することに加え、それに対する抵抗を防止または低下することを意味する。「抗
悪性治療様式」とは、放射線療法、温熱療法、免疫療法、化学療法ならびにその
他の癌および他の悪性疾患の治療において当業者により使用される療法を含むが
、これらに限定されるものではないことを意味する。「効能の増大」は、抗悪性
治療様式の効力および／または活性を増加することおよび／または抗悪性治療様
式に対する抵抗性の発生を減少することを意味する。本発明は更に、低用量NO模
倣体療法を受けている動物における腫瘍選択マーカーの測定による、動物におけ
る悪性細胞表現型の経過観察および／または診断の方法に関する。腫瘍進行およ
び転移を経過観察および診断するために有用な腫瘍マーカーの例は、前立腺癌の
前立腺特異抗原(PSA)、消化器癌の癌胎児性抗原(CEA)、精巣癌のα-フェトプロ
テインおよびβHCG、胃癌のCA19-9およびCA72-4、乳癌のCA15-3ならびに乳癌の
エストロゲンおよびHer-2の細胞表面受容体を含むが、これらに限定されるもの
ではない。診断目的で経過観察することができる別のマーカーは、NDRG-1として
も公知のOXYgen-1により調節されたタンパク質(PROXY-1)、プラスミノーゲンア
クチベーターインヒビター(PAI-1)、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベ
ーター受容体(uPAR)および血管内皮細胞増殖因子(VEGF)を含むが、これらに限定
されるものではない。更に、本内容を判読する際に当業者に理解されるように、
本明細書に例証された追加の腫瘍マーカーも、本発明においてモニタリングする
ことができる。好ましい態様において、腫瘍マーカーは、血清、血漿または尿の
ような生物学的液体中に検出可能である。低用量一酸化窒素模倣体投与前の動物
におけるマーカーレベルと比較した場合の、低用量一酸化窒素模倣体投与後の動
物におけるこれらのマーカーの１種以上のレベルの、無変化、減少または増加の
減速は、その動物における悪性細胞表現型の指標である。

【００１７】 本発明の目的のための用語「低用量」とは、悪性細胞表現型を阻害または防止
しおよび／または低用量NO模倣体と同時投与される抗悪性治療様式の効能を増強
するような細胞に、一酸化窒素模倣活性のレベルを増加、回復または維持させる
ことが可能であるような、一酸化窒素模倣体の量を意味する。この低用量では、
悪性細胞表現型を伴わない動物において、従来から公知のNO模倣体の作用は生じ
ない。本内容を判読する際に当業者に理解されるように、一酸化窒素模倣体は、
細胞内および細胞周辺(すなわち、細胞の微小環境)の両方における活性を増加、
回復または維持する。

【００１８】 細胞培養物、更には血漿および血清中の、亜硝酸塩、硝酸塩およびS-ニトロソ
チオールレベルを基にした細胞の一酸化窒素レベルを決定する方法が説明されて
いる。普通の健常志願者における血清または血漿中の硝酸塩レベルは、平均一酸
化窒素レベル33.4±8.9μMで、14〜60μMの範囲にあることが報告されている(Ma
rzinzigら、Nitric Oxide: Biology and Chemistry、1(2):177-189(1987))。し
かしこれらのレベルは、蓄積するNOシンターゼ最終生成物を基にしており、その
結果おそらく正常な生理的一酸化窒素レベルを過大評価しているであろう。更に
報告された測定レベルは、測定のために選択された方法によって大きく左右され
る。更に血漿または血清中の亜硝酸塩および硝酸塩のレベルは、単なる患者のNO
産生の代表値ではない。本発明者らの実験を基に、細胞の一酸化窒素模倣活性の
正常な生理的レベルは、細胞によっては、当該技術分野において報告された値よ
りも、例えば少なくとも1/5と少なく、好ましくは1/10〜1/10,000であると本発
明者らは考えた。

【００１９】 短期間の一酸化窒素模倣体療法は、一般に細胞の一酸化窒素模倣活性を正常な
生理的レベルを上回るように増加するようなレベルで投与される。しかし概して
より長期の療法が望ましいような本発明の目的については、NO模倣体に対する耐
性の誘導および副作用が懸念される。従って本発明において、投与される一酸化
窒素模倣体の量は、好ましくは投与されたNO模倣体に対する耐性の発生および／
または望ましくない副作用を遅延および／または低下するように非常に低いもの
である。例えば、一酸化窒素または血管拡張剤による心臓血管系の病態治療に通
常使用される用量(すなわち、GTNは0.2mg/h以上)で一酸化窒素をヒトへ送達する
ような化合物の投与は、強力な血管拡張作用を誘起することに加え、反復投与時
にGTNに対する薬物耐性を発生し得る。このような投与は、頭痛、潮紅および低
血圧を含む、多くの望ましくない副作用を伴うことが多い。対照的に、悪性細胞
表現型を阻害および防止するために本発明において投与された一酸化窒素模倣体
の好ましい用量は、血管拡張のような他の治療適応において典型的に使用される
用量よりも低く、好ましくは少なくとも1/3〜1/10,000であり、より好ましくは
少なくとも1/100〜少なくとも1/10,000であり、その結果NO模倣体に対する耐性
を迅速に誘導しないばかりではなく更に望ましくない副作用も誘導しない。例え
ば、一酸化窒素模倣体ニトロプルシドナトリウム(SNP)および三硝酸グリセリン(
GTN)の使用に際し、本発明者らは、細胞環境内の10^-12〜10^-10Mの範囲の量を用
いて、悪性細胞表現型を防止および阻害することができることを明らかにしてい
る。更に本発明者らは、これらの実験結果を基に、SNP用量は、10^-14Mと低くと
も、より低い低酸素または低窒素環境における悪性細胞表現型の防止および阻害
において有効であると考えている。表１は、本発明において有用な一酸化窒素模
倣体に関する様々な好ましい低用量に加え、血管拡張療法において使用される比
較的高い用量の追加例を提供する。

【００２０】

【表１】 表１：有機硝酸塩の典型的血管拡張作用およびマイクロ用量

【００２１】 本内容を読む際に当業者に理解されるように、本明細書に例示した用量よりも
より高いまたはより低い一酸化窒素模倣体量も、細胞の一酸化窒素模倣活性を増
加、回復または維持し、その結果実質的にNO模倣体に対する薬剤耐性を生じずか
つ望ましくない副作用を伴うことなく、悪性表現型が防止または阻害されるとい
う最終の目的を達成することにおける一酸化窒素模倣体の効能を基に投与するこ
とができる。本発明の低用量処方中に混入される一酸化窒素模倣体の量の決定は
、本明細書に記された内容を基に当業者により通常の業務において実行すること
ができる。

【００２２】 本明細書において使用される句「阻害および防止」は、生物学的病態を減少、
逆行または緩和、改善、正常化、制御または管理することを意味する。従って本
発明に従い悪性細胞表現型を阻害および防止することは、悪性細胞表現型の発生
を防止し、発生を逆行または緩和しおよび／または発生を正常化、制御または管
理することを意味する。従って低用量一酸化窒素模倣体の投与は、(1)予防的に
、癌発症のリスクが高い動物、または細胞の一酸化窒素模倣活性を減少すること
が公知の因子に曝露された動物において、悪性細胞表現型の発生を阻害および防
止するために、ならびに(2)転移または抗悪性治療様式に対する抵抗性の発生を
阻害すること、および抗悪性治療様式の効能を増強することにより動物において
癌を治療するための両方で使用することができる。

【００２３】 「ステッドマン医学大辞典(Stedman's Medical Dictionary)」によると、悪性
とは、「1.治療に対して抵抗性があること；重症型でしばしば致命的；悪化する
傾向があり、漸悪性の経過を取る。2.新生物に関しては、局部的浸潤性、破壊的
増殖性、および転移性を有するものをいう。」と定義される。この定義に従い、
本発明の目的に関して「悪性細胞表現型」とは、転移の増加、抗悪性治療様式に
対する抵抗性、および血管新生を包含することを意味する。本発明の目的に関す
る「悪性細胞表現型」は、更に、過形成、肥大および異形成のような、悪性の挙
動および異常な浸潤、更には悪性の経過を促進するそのような細胞および組織に
つながるスペクトル内の状態を含むことも意味する。このスペクトル内の状態の
例は、良性前立腺肥大および奇胎妊娠を含むが、これらに限定されるものではな
い。

【００２４】 本明細書に示されたデータにより証明されるように、細胞における悪性細胞表
現型の阻害および防止は、uPAR、PSA、PAI-1、PROXY-1およびVEGFを含むが、こ
れらに限定されるものではないような遺伝子の発現を試験すること、インビトロ
またはインビボアッセイにおいて細胞浸潤を試験すること、および／または細胞
の抗悪性治療様式に対する抵抗性を試験することにより、型どおりに決定するこ
とができる。上昇したホスホジエステラーゼ発現および／または活性は、悪性細
胞表現型の細胞において認められると考えられている。これらの遺伝子の発現を
測定する方法は、例えば国際公開公報第99/57306号に開示されており、これは本
明細書に参照として組入れられている。しかし本明細書の開示を読む際に当業者
に理解されるように、発現されたタンパク質またはそれらのタンパク質分解性断
片の測定による、遺伝子発現を決定するその他の方法も使用することができる。

【００２５】 本発明の目的について、用語「一酸化窒素模倣体」とは、一酸化窒素、または
それらの機能同等物；一酸化窒素の作用を模倣するか、生体転換を通じて一酸化
窒素を生成または放出するか、自然発生的に一酸化窒素を生成するか、または自
然発生的に一酸化窒素を放出するようないずれかの化合物；いずれか他の方法で
一酸化窒素または一酸化窒素様部分を生成もしくはNO経路の他の段階を活性化す
るいずれかの化合物；もしくは、動物に投与された場合に、細胞によるNO利用を
可能にするまたは促進する化合物を意味する。このような化合物は更に、「NO供
与体」、「NOプロドラッグ」、「NO産生物質」、「NO送達化合物」、「NO産生物
質」および「NOプロバイダー」と称することもできる。このような化合物の例は
、有機硝酸塩、例えばニトログリセリン(GTN)、イソソルビド5-一硝酸塩(ISMN)
、イソソルビド二硝酸(ISDN)、ペンタエリスリトール四硝酸(PETN)、エリスリチ
ル四硝酸(ETN)；アミノ酸誘導体、例えばN-ヒドロキシル-L-アルギニン(NOHA)、
N⁶-(1-イミノエチル)リシン(L-NIL)、L-N⁵-(1-イミノエチル)オルニチン(LN-NIO
)、N^ω-メチル-L-アルギニン(L-NMMA)、およびS-ニトロソグルタチオン(SNOG)；
ならびに、生理的条件下でNOを生成または放出する他の化合物、例えばS,S-ジニ
トロソジチオール(SSDD)、[N-[2-(ニトロキシエチル)]-3-ピリジンカルボキシア
ミド(ニコランジル)、ニトロプルシドナトリウム(SNP)、S-ニトロソ-N-アセチル
ペニシラミン(SNAP)、3-モルホリノ-シドニミン(SIN-1)、モルシドミン、DEA-NO
NOエート(2-(N,N-ジエチルアミノ)-ジアゼノレート-2-オキシド)、およびスペル
ミンNONOエート(N-[4-[1-(3-アミノプロピル)-2-ヒドロキシ-2-ニトロソヒドラ
ジノ]ブチル-1,3-プロパンジアミンを含むが、これらに限定されるものではない
。有機硝酸塩GTN、ISMN、ISDN、ETN、およびPETNに加え、ニコランジル(一般に
カリウムチャネルオペレーターとして公知)は、医薬剤形で市販されている。SIN
-1、SNAP、S-チオグルタチオン、L-NMMA、L-NIL、L-NIO、スペルミンNONOエート
、およびDEA-NONOエートは、Biotium社(リッチモンド、CA)から市販されている
。更に本明細書において使用される用語「一酸化窒素模倣体」は、一酸化窒素経
路の模倣体として作用するか、一酸化窒素様活性を有するか、または一酸化窒素
の作用を模倣するような化合物を意味することが意図されている。このような化
合物は、必ずしも一酸化窒素を放出、生成または提供はしないが、これらは一酸
化窒素により影響を受けるような経路に対し一酸化窒素と同様の作用を有する。
例えば一酸化窒素は、サイクリックGMP依存型およびサイクリックGMP非依存型の
両方の作用を有する。一酸化窒素は、グアニル酸シクラーゼの可溶性型を活性化
し、これによりセカンドメッセンジャーであるサイクリックGMPの細胞内レベル
を増大し、およびサイクリックAMPのような他の細胞内セカンドメッセンジャー
と別の相互作用をすることは公知である。このように、粒子状または可溶性のグ
アニル酸シクラーゼのいずれかを直接活性化する化合物、例えばナトリウム排泄
増加性ペプチド(AMP、BNP、およびCNP)、3-(5'-ヒドロキシメチル-2'-フリル)-1
-ベンジルイミダゾール(indazole)(YC-cGMPまたはYC-1)および8-(4-クロロフェ
ニルチオ)グアノシン3',5'-サイクリック一リン酸(8-PCPT-cGMP)も、NO模倣体の
例である。しかし本発明の一部の態様において、NO模倣体は、粒子状または可溶
型のいずれかのグアニル酸シクラーゼを直接活性化する化合物を包含しないこと
が好ましい。一酸化窒素模倣活性は、例えばグアニル酸シクラーゼおよび他のヘ
ム含有タンパク質などの、少なくとも１種のNO模倣体結合エフェクター分子を含
むそのようなシグナル伝達過程または経路を包含している。細胞によるNO利用を
可能にするまたは促進することによりNO模倣体として作用する物質の例は、ホス
ホジエステラーゼインヒビターのような、ホスホジエステラーゼ活性および／ま
たは発現を阻害するような化合物である。

【００２６】 好ましい本発明の態様において、１種以上のNO模倣体が投与される。この態様
において、NO模倣体は、細胞のNO経路の様々な部分を標的化するかまたは作用す
ることが好ましい。例えば、NO供与体は、ホスホジエステラーゼインヒビターの
ような、環状ヌクレオチド(例えば、cAMPまたはcGMP)分解を阻害する化合物と同
時投与することができる。好ましいNO模倣体として有用なホスホジエステラーゼ
(PDE)インヒビターは、PDE-1からPDE-5を阻害するものである。

【００２７】 本発明の用語「低窒素症」とは、一酸化窒素模倣活性のレベルが、その細胞種
の正常な生理的レベルよりも低いような状態を意味する。 本発明の目的に関して用語「動物」は、全ての哺乳類、特にヒトを含むことを
意味する。好ましいNO模倣体は、悪性細胞表現型のリスクのあるまたはそれに罹
患している動物に投与される。このような動物は更に、本明細書においては治療
の必要な対象または患者と称される。 低酸素レベルは、細胞の浸潤および浸潤性の増大したレベルに相関している。
低酸素ストレスは、様々な細胞の順応を引き起し、ある種の遺伝子のアップレギ
ュレーションを顕在化することも多い。

【００２８】 例えば、uPAR mRNAおよび細胞表面uPARタンパク質レベルは、低酸素状態下で
増大することが示されている。uPARは、プロウロキナーゼ型プラスミノーゲンア
クチベーター(pro-uPA)に高い親和性のある細胞表面受容体である。pro-uPAのuP
ARへの結合時に、不活型の１本鎖pro-uPAは、その活性型2本鎖形に切断される。
この活性化された酵素は、依然その受容体に結合しており、その後プラスミノー
ゲンをプラスミンに転換するように作用し、プラスミンは最終的には細胞外マト
リックス(ECM)のいくつかの成分を分解する。活性型uPAは、潜在的メタロプロテ
アーゼおよび増殖因子の両方の活性化にも役立つ。更にuPARは、ECM分子、ビト
ロネクチンの受容体としても役立つ。これらの機能は組合わせると、細胞浸潤お
よび浸潤性の可能性を増大する。低酸素症が誘導したuPARアップレギュレーショ
ンと癌腫細胞浸潤性の間には、正の相関関係が示唆されている(Grahamら、Int.
J. Cancer、80:617-623(1999))。加えて本発明者らは今回、低酸素条件(1％O₂)
および非低酸素条件(5％および20％O₂)における一酸化窒素シンターゼアンタゴ
ニストL-NMMA(0.5mM)の投与により、低窒素症が誘導され、37℃で24時間インキ
ュベーションしたヒトMDA-MD-231細胞におけるuPAR mRNAレベルが上昇すること
を示した。

【００２９】 PAI-1は、低酸素条件下で刺激されることも示されている。国際公開公報第99/
57306号参照。更にこの刺激には、細胞接着の減少が随伴している。PAI-1は、様
々な正常細胞および悪性細胞により産生される52kDaのECM糖タンパク質である。
この糖タンパク質は、プラスミノーゲンアクチベーター活性のレギュレーターで
ある。これは、不可逆的共有結合複合体の形成を通じて、遊離および結合したuP
Aの両方を阻害するように機能する。PAI-1は、更に、ビトロネクチンの同一ドメ
インへの結合についてuPARと競合することも示されている。このようにして、PA
I-1は、ビトロネクチンで被覆したプレートに結合した細胞を放出することが可
能である。PAI-1は、肺癌細胞の最適なインビトロ浸潤性に必要であるという研
究が発表されている。

【００３０】 低酸素症は、更に細胞傷害に対する細胞の抵抗性を増大することも示されてい
る。PROXY-1遺伝子は、様々な細胞種の低酸素レベルでの培養後のディファレン
シャルディスプレイを基にしたRT-PCRを用いて、同定された。国際公開公報第99
/57306号参照。増強されたPROXY-1発現が、下記の有害な各刺激に対する発現に
おいて認められるので、43kDaのPROXY-1タンパク質は、低酸素症を含む発作、DN
A損傷物質、細胞傷害およびグルコース枯渇からの細胞の保護において役割を果
たすと考えられている。この遺伝子は様々な無関係の細胞種により発現されると
いう事実と合わせると、この種の遺伝子発現は、低酸素症への細胞適応につなが
る最初の事象に関与した普遍的「スイッチ」であるPROXY-1の指標であるといえ
る。

【００３１】 本発明者らは、一酸化窒素は、細胞内および細胞周辺の酸素レベルの変化に対
する細胞適応反応の一次メディエーターであることを今回発見した。本発明者ら
は、低用量一酸化窒素模倣体の投与にもかかわらず、一酸化窒素模倣活性が、悪
性細胞表現型を阻害または防止するレベルへ増加、回復または維持することがで
きることを示した。対照的に、細胞に低酸素レベルを維持する作用は、内在性一
酸化窒素産生の基底レベルを阻害するように制限される。

【００３２】 本発明者らは現在、酸素レベルが制限される低酸素条件下では、癌細胞株が下
記の悪性細胞表現型特性の１種以上を獲得することを明らかにしている：これら
は、同系マウスにおけるi.v.接種後、それらの肺コロニー形成能を増大する(実
験的転移)；これらは、インビトロにおいて細胞外マトリックスを通じてのそれ
らの浸潤性を増大する(同じく転移に関連)；および、これらは、化学療法剤ドキ
ソルビシンに対してより抵抗性となる。これらの実験において、癌細胞は、1％O₂ (10〜15mmHg pO₂)に曝露し、低酸素症を惹起し、かつ非低酸素5〜20％O₂(30〜1
60mmHg)に曝露した癌細胞と比べた。低用量一酸化窒素模倣体の投与により(酸素
レベルが制限された期間および／または内在性一酸化窒素産生が阻害された期間
)、これらの悪性表現型の変化の獲得は妨げられた。この妨害は、細胞が極端な
低酸素環境にある場合であっても生じる。

【００３３】 本発明者らは今回、低用量一酸化窒素模倣体SNPおよび／または三硝酸グリセ
リン(GTN)は、uPARおよびPAI-1、更にはPROXY-1の低酸素性アップレギュレーシ
ョンを阻害することを明らかにしている。同様の低用量一酸化窒素模倣体療法は
、L-NMMA(0.5mM)で処理された細胞において認められるもののように、同じくこ
れらの遺伝子の低窒素性アップレギュレーションを阻害することにおいて有効、
すなわち悪性細胞表現型を阻害および防止するであろうと予想される。

【００３４】 低酸素条件(1％O₂)で培養されたヒト乳癌細胞において実施された実験は、低
酸素状態細胞の10^-12M SNPによる処置が、対照低酸素状態細胞および10^-8M SNP
で処置した低酸素状態細胞と比べ、uPAR mRNAのレベルを有意に低下することを
示した。同様に、低酸素条件で培養された乳癌細胞の低用量10^-11M〜10^-10Mでの
一酸化窒素模倣体GTNによる処理は、未処置の低酸素状態細胞ならびにGTNの10^-9 M、10^-8M、10^-7M、10^-6Mおよび10^-5Mで処置した低酸素状態細胞と比べ、低酸素
状態細胞においてuPAR mRNAレベルを有意に低下した。実際、10^-11M GTNおよび1
0^-10M GTNで処理した低酸素状態乳癌細胞におけるuPAR mRNAレベルは、非低酸素
条件(20％O₂)下で培養した細胞において測定したuPAR mRNAレベルと類似してい
た。GTNの10^-6Mおよび10^-5Mで処置した低酸素状態細胞におけるuPAR mRNAレベル
は、未処理の低酸素状態細胞のレベルと類似しており、これはNO模倣体に対する
耐性を示唆している。同じくuPARタンパク質レベルの低下は、これらの細胞にお
いてこれらの一酸化窒素模倣体と共にインキュベーションの24時間後に観察され
た。

【００３５】 更なるヒト浸潤性栄養芽層細胞(HTR-8/SVneo)による実験は、これらの一酸化
窒素模倣体の低用量での低酸素状態細胞においてuPAR発現を低下する能力を確認
した。 HTR-8/SVneo浸潤性栄養芽層細胞の一酸化窒素模倣体GTNによる処理のPROXY-1
mRNAレベルに対する作用も試験した。PROXY-1 mRNAレベルは、20％O₂において培
養した細胞においては非常に低い。しかし、PROXY-1 mRNAレベルは、未処理およ
び10^-7M GTNで処理した1％O₂中で培養した細胞においては増加した。比較のため
のPROXY-1のレベルは、低用量10^-11M GTNで処理した低酸素状態細胞においては
るかに低かった。

【００３６】 加えて、乳癌細胞における一酸化窒素模倣体SNPおよびGTNのPAI-1 mRNAレベル
に対する作用を試験した。再度、低酸素状態細胞の低用量一酸化窒素模倣体SNP(
10^-12M)およびGTN(10^-11M)による処理は、未処理の低酸素状態細胞と比べ、PAI-
1 mRNAのレベルを有意に低下した。

【００３７】 低用量一酸化窒素模倣体のメタロプロテアーゼレベルに対する作用を確認する
実験も行った。乳癌細胞は、変動する濃度のSNPまたはGTNの存在する低酸素条件
または対照条件下で培養した。低酸素状態細胞の低用量一酸化窒素模倣体、10^{-1 1} M GTNおよび10^-12M SNPによる処理は、未処理の低酸素状態細胞と比べ、細胞か
ら分泌されたメタロプロテアーゼの低下を生じた。

【００３８】 機能的に、その後これらの遺伝子の低酸素状態でのアップレギュレーションの
阻害は、細胞浸潤および薬物耐性の低下を生じることが示された。一酸化窒素模
倣体の存在下または非存在下での低酸素条件における細胞の浸潤性も、MATRIGEL
浸潤チャンバー(Boydenチャンバーの変形)を用いて評価した。これらのインビト
ロ浸潤アッセイにおいて、乳癌細胞(図１参照)またはHTR-8/SVneo浸潤性栄養芽
層のいずれかを、MATRIGEL被覆膜上に配置した。その後細胞を、低酸素条件また
は通常の条件下で、単独でまたは一酸化窒素模倣体の存在下でインキュベーショ
ンした。各処置に関する浸潤インデックスを、膜を浸潤した細胞を染色しかつそ
れらを計数することにより決定した。両細胞株において、低用量一酸化窒素模倣
体による処理は、未処理の低酸素状態細胞と比べ、低酸素状態細胞の浸潤を有意
に低下した。10^-10M SNPおよび10^-11M GTNで処理した低酸素状態乳癌細胞の浸潤
インデックスは、非低酸素条件下で培養した細胞と類似しているかもしくはそれ
よりも低かった。HTR-8/SVneo栄養芽層細胞において、10^-7M GTNは、低酸素状態
細胞の浸潤性を56.2％阻害したのに対し、10^-8M SNPは浸潤性を63.4％阻害した
。

【００３９】 次に低用量一酸化窒素模倣体の動物における腫瘍細胞の転移を阻害する能力を
確認した。第一の実験セットにおいて、低酸素条件の転移数を増加する能力が明
らかにされた。これらの実験においては、マウスに、尾静脈注射により、ボーラ
ス転移性黒色腫細胞を投与した。注射直後に、マウスを2群に分けた。第一群は
、21％O₂(室内大気)を含有する混合気体の連続流れを伴うチャンバーに入れた。
第二群は、わずかに10％O₂の低酸素環境に置いた。24時間後、両群を取出し、室
内大気に維持した通常のケージに入れた。14日後、これらの動物を屠殺し、かつ
動物の肺内の転移結節を計数した。低酸素環境にあった動物は、非低酸素環境の
動物と比べ、統計学的に2倍多い数の肺結節を有していた。

【００４０】 第二の実験セットにおいて、マウスに、低用量一酸化窒素模倣体(GTN；2x10^{-1 1} M)の存在下または非存在下、1％または20％O₂中で12時間プレインキュベーショ
ンしたマウス黒色腫細胞を注射した。14日後、このマウスを屠殺し、かつ肺を転
移性結節について肉眼により観察した。加えて、これらのマウスにおける肺結節
の数を比較した。注射前に一酸化窒素模倣体で処理した低酸素および非低酸素の
黒色腫細胞が投与された動物の肺は、未処置の低酸素状態および非低酸素状態の
黒色腫細胞のいずれかを投与した動物と比べ、統計学的に減少した転移性結節を
示した(図２参照)。特に、2x10^-11M GTNによるインビトロ前処理は、低酸素状態
が刺激した肺結節形成を85％低下し、かつ20％酸素中においてでさえ、GTN前処
理は、60％よりも多く転移の程度を低下した。実際に、GTN前処理による肺結節
形成の抑制は、インビトロ酸素化レベルとは無関係に同等であることがわかった
。更に、これらの細胞のマウスへ接種前のL-NMMAによる処理は、肺結節数の63％
の全般的増加を生じた(p＜0.01；post hocフィッシャー検定)。GTN(10^-10M)およ
びL-NMMAを用いる併用処理は、この転移性反応を60％まで減弱した(p＜0.0005)
。これら3種の実験群を通じての肺結節の頻度分布は、0〜111の範囲であった。
対照マウス2匹およびGTN処理したマウス4匹においては、肺結節は見つからなか
った。三分位値(tertile)による肺結節頻度の特徴決定は、L-NMMA処理群と比べ
、NO模倣体処理群を通じての一貫した抑制パターンを明らかにした。加えて、GT
N処理群の転移は、最高の三分位値であっても対照レベル以下と有意に低かった
。まとめると、これらのデータ(date)は、酸素それ自身ではないNOのレベルが、
転移性表現型の重篤度を決定することを示している。更に低濃度のGTN処理の肺
結節形成に対する作用は、これらは未処理の細胞とインビトロコロニー形成能が
類似しているので、細胞に対する非特異的細胞傷害性または増殖阻害性作用には
起因していない。

【００４１】 本明細書を読む際に当業者に理解されるように、これらのマウスモデルにおけ
る試験結果は、ヒトを含む他の種における薬物素因を推定し、ヒトを含む様々な
種における薬物動態学的当量を定義し、ならびに他の実験動物モデルおよびヒト
臨床試験用の投与計画をデザインするために使用することができる。このような
薬物動態学的増減は、Mordenti J. J. Pharm. Sci.、75(ll):1028-1040(1986)の
ような参考文献で証明されたように、本明細書に提供されるようなデータを基に
日常的に行われている。

【００４２】 更に、NO模倣体のヒトにおける疾患進行を低下する能力が明らかにされた。こ
の試験において、連続的に経皮貼付剤を用い、非常に低用量のGTN(0.033mg/時)
を、再発性前立腺癌の患者に送達した。前立腺癌患者は、この種の癌の進行が前
立腺特異抗原(PSA)血漿レベルと良く相関しているので、本試験のために選択し
た。従って、低用量NO模倣体療法の転帰は、PSAレベルの測定により容易に評価
することができる。この試験における患者2名のデータを分析したところ、GTN処
理の2ヶ月以内に血漿PSAレベルにおける急激な減衰が明らかになり、従ってこれ
は低用量NO模倣体療法が、ヒトにおける癌、特に前立腺癌の管理に有効な手法で
あることを示している(図3Aおよび3B参照)。血漿PSAレベルは、Immuno 1(Bayer
社)などの市販のイムノアッセイキットにより測定した。

【００４３】 低用量一酸化窒素模倣体が乳癌細胞のドキソルビシンに対する抵抗性を低下す
る能力も試験した。これらの実験において、低酸素状態のドキソルビシンに対す
る抵抗性を増加する能力が最初に確認された。濃度25および50μMのドキソルビ
シンにおいて、1％O₂に曝露した細胞は、20％O₂に曝露した細胞と比べ、より高
い生存率を有した。次に低用量一酸化窒素模倣体GTNの低酸素および非低酸素状
態細胞のドキソルビシン抵抗性に対する作用を試験した。10^-6Mおよび10^-10MのG
TNで処理した低酸素状態癌細胞は、未処理の低酸素状態細胞と比べ、より低いド
キソルビシン生存率を有することがわかった。一酸化窒素模倣体処理した低酸素
状態細胞の生存率は、未処理の非低酸素状態細胞および一酸化窒素模倣体で処理
した非低酸素状態細胞において認められたものと同等であった。これらの結果は
、多発性ヒト癌に加えマウス癌において、および他の抗悪性治療様式により、確
認されている。

【００４４】 従ってこれらの試験は、低酸素症により誘導されるような悪性細胞表現型は、
一酸化窒素模倣活性のレベルを増加(回復)することにより阻害および防止するこ
とができることを明らかにする。悪性細胞表現型を誘導するように細胞の一酸化
窒素模倣活性を低下することがわかっている他の因子は、以下を含むが、これら
に限定されるものではない：アルギニンレベルの低下、L-NMMAおよびADMAのよう
な内在性一酸化窒素シンターゼアンタゴニストへの曝露、スーパーオキシドのよ
うな内在性一酸化窒素捕捉剤への曝露、一酸化窒素シンターゼ発現における変化
、GSHおよびNADPHなどの補因子の変化、グルコース枯渇、外科的手技、麻酔薬の
投与、血圧降下剤に限定されない循環を変更する薬学的物質の投与、ならびに失
血、血量低下および出血に関連したものを含むが、これらに限定されるものでは
ないような外的損傷。本発明は、低用量の１種以上の一酸化窒素模倣体を投与す
ることにより、これらおよび他の因子により生じた、悪性細胞表現型を阻害およ
び防止する方法に関する。

【００４５】 本発明の低用量一酸化窒素模倣体療法は更に、血管新生としても公知である、
最終的に腫瘍による血管内皮細胞の漸増(recruitment)および腫瘍への血液供給
の発生を生じるような血管内皮細胞の悪性細胞表現型を防止するであろう。血管
内皮細胞内のVEGFをブロックすることにより腫瘍への血液供給を遮断する試みは
、癌治療としては余り成功していない。腫瘍内のVEGFの存在は、腫瘍浸潤性を抑
制することが示されている。従って、抗VEGF抗体のようなVEGFの作用を取除くか
またはブロックするような物質は、実際により攻撃的な癌細胞表現型を生じると
考えられている。しかし本発明を用い、より攻撃的な悪性細胞表現型が生じるこ
とを防止することができ、これにより、より攻撃的な癌細胞を生じることなく血
管新生を防止する抗VEGF療法が可能になる。

【００４６】 これらの試験は更に、低用量NO模倣体療法の患者の腫瘍マーカーレベルを低下
する能力を明らかにしている。腫瘍マーカーレベルは、癌の進行の指標として、
当業者により日常的に使用されている。従って、低用量NO模倣体療法のこれらの
マーカーレベルを低下する能力は、それの癌治療能の指標である。更に、患者の
腫瘍の進行は、低用量一酸化窒素模倣体の存在下で患者の腫瘍マーカーレベルを
測定することにより、診断および／または経過観察することができる。

【００４７】 最終的に悪性細胞表現型を防止または阻害するのに十分な細胞の一酸化窒素模
倣活性の増加、回復または維持を生じるような一酸化窒素模倣体の低用量処方は
、当該技術分野において公知の処方方法に従い作成することができる。本発明の
方法に従う一酸化窒素模倣体投与のための処方は、軟膏剤、経皮貼付剤、経頬側
貼付剤、注射剤、鼻腔吸入剤、口から肺深部への送達のための噴霧剤、経口投与
で摂取可能な錠剤およびカプセル剤、ならびに経口粘膜組織経由の投与のための
錠剤またはトローチ剤、もしくは「キャンディー(lollipop)」製剤の形状である
ことができる。後者の製剤は、舌の上または下、もしくは頬側口腔に保持しなが
ら溶ける錠剤、トローチ剤などを含む。この薬学的調製は、細胞の一酸化窒素模
倣活性が低下されている期間に、一酸化窒素模倣活性を悪性細胞表現型を阻害ま
たは防止するレベルに増加、回復または維持に十分な低用量、本明細書において
は治療有効量とも称される量の一酸化窒素模倣体を提供することが好ましい。更
に１種以上のNO模倣体を含有する処方も好ましい。この態様において、NO模倣体
は、NO経路の様々な部分を標的とするかまたはこれに作用することが好ましい。
例えば、NO供与体は、ホスホジエステラーゼインヒビターのような、環状ヌクレ
オチド(例えば、cAMPまたはcGMP)分解を阻害する化合物と同時投与することがで
きる。NO模倣体として有用な好ましいホスホジエステラーゼ(PDE)インヒビター
は、PDE-1からPDE-5を阻害するものである。

【００４８】 本発明の処方は、１種以上の薬学的に許容できる担体と共に処方された、治療
有効量の一酸化窒素模倣体を含有する。本明細書において使用される用語「薬学
的に許容できる担体」とは、無毒の不活性の固形、半固形、または液体の充填剤
、希釈剤、カプセル封入剤またはあらゆる種類の処方補助剤を意味する。薬学的
に許容できる担体として利用することができる物質の例の一部は、乳糖、ブドウ
糖およびショ糖のような、糖類；コーンスターチおよびジャガイモデンプンのよ
うな、デンプン類；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース
および酢酸セルロースのような、セルロースおよびその誘導体類；粉末トラガカ
ント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐薬用ワックスのような、
賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および
ダイズ油のような油分；プロピレングリコールのような、グリコール類；オレイ
ン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステル類；寒天；水酸化マグネシ
ウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤；アルギン酸；パイロジェン非含
有水；等張生理食塩水；リンガー液；エチルアルコール；およびリン酸緩衝液に
加え、その他の無毒の相溶性の滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびス
テアリン酸マグネシウムがある。着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、矯
味・矯臭剤および香料、保存剤および酸化防止剤も、処方者の判断に従い処方中
に存在することができる。本発明の処方は、ヒトおよび他の動物へ、経口、経直
腸、非経口、槽内、膣内、腹腔内、局所的(散剤、軟膏剤、またはドロップ剤と
して)、舌上(supralingually)(舌の上側)舌下(sublingually)(舌の下側)、頬側(
頬側口腔に保持)、もしくは経口または経鼻噴霧剤的に投与することができる。
経口噴霧剤は、経口吸入により肺深部に送達されるような粉末または霧の形状で
あることができる。

【００４９】 経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容できる乳剤、マイクロエマルジョ
ン、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤を含む。液体剤形は、有効化
合物に加え、当該技術分野において通常使用される、例えば、水または他の溶媒
のような不活性希釈剤、可溶化剤および乳化剤、例としてエチルアルコール、イ
ソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香
酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ジメチルホルム
アミド、油分(特に、綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、
ヒマシ油およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、
ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの
混合物を含有することができる。更に経口処方は、不活性希釈剤に加え、湿潤剤
、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、矯味・矯臭剤ならびに香料などの添加剤を含
有することもできる。例えば、無菌の注射可能な水性または油性懸濁液のような
注射可能な調製物は、適当な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用い、当該技
術分野において公知の技術に従い処方することができる。この無菌の注射可能な
調製物は、例えば1,3-ブタンジオール中の溶液などの、無毒の非経口的に許容で
きる希釈剤または溶剤中の、無菌の注射用溶液、懸濁液または乳液であることも
できる。使用することができる許容できるビヒクルおよび溶剤の中で、水、米国
薬局方リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、無菌の不揮
発油が、通常溶媒または懸濁媒質として使用されている。この目的のために、合
成モノまたはジグリセリドを含むいずれかの商品名の不揮発油を使用することが
できる。加えてオレイン酸のような脂肪酸を、注射可能な調製物中で使用するこ
とができる。

【００５０】 注射可能な処方は、例えば細菌残留フィルターを通す濾過、もしくは使用前に
滅菌水または他の注射可能な媒質へ溶解または分散することができるような無菌
の固形組成物の形の滅菌剤の混入により、滅菌することができる。

【００５１】 一酸化窒素模倣体の作用を延長することが望ましいような場合において、皮下
または筋肉内注射からの一酸化窒素模倣体の吸収を遅延することができる。これ
は、溶解度が低い結晶または非晶質物質の液体懸濁液の使用により達成すること
ができる。次に一酸化窒素模倣体の吸収速度は、結晶サイズおよび結晶形によっ
て左右され、その解離速度に応じても左右される。あるいは非経口投与された処
方の遅延された吸収は、一酸化窒素模倣体の油性ビヒクル内への溶解または懸濁
により達成される。注射可能なデポ剤は、ポリラクチド-ポリグリコリドのよう
な生分解性ポリマー中の薬物のマイクロカプセルマトリックスの形成により製造
される。薬物対ポリマーの比および使用した粒子状ポリマーの性質に応じて、薬
物放出速度は制御され得る。他の生分解性ポリマーの例は、ポリ(オルトエステ
ル)およびポリ(無水物)を含む。デポ剤注射可能な処方は更に、一酸化窒素模倣
体を生体組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルジョン中に捕獲す
ることにより調製することができる。

【００５２】 経直腸または経膣投与のための処方は、一酸化窒素模倣体の、周囲温度では固
体であるが体温では液体でありその結果直腸または膣洞で溶融しこれにより一酸
化窒素模倣体を放出するような適当な非刺激性賦形剤または担体、例えばココア
バター、ポリエチレングリコールまたは坐薬用ワックスなどとの混合により調製
された坐薬が好ましい。

【００５３】 経口投与のための固形剤形は、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤
を含む。このような固形剤形においては、一酸化窒素模倣体は、少なくとも１種
の不活性の薬学的に許容できる賦形剤または担体、例えばクエン酸ナトリウムま
たはリン酸二カルシウム、および／または；充填剤または増量剤、例えばデンプ
ン、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、マンニトールおよびケイ酸；結合剤、例えばカル
ボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、シ
ョ糖、およびアラビアゴム；保湿剤、例えばグリセロール；崩壊剤、例えば寒天
、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種の
ケイ酸塩、および炭酸ナトリウム；溶解抑制剤、例えばパラフィン；吸収促進剤
、例えば4級アンモニウム化合物；湿潤剤、例えばセチルアルコールおよびグリ
セロール一リン酸；吸着剤、例えばカオリンおよびベントナイトクレイ；ならび
に滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム
、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合
物と混合される。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合は、その剤形は更に緩衝剤
を含有することができる。

【００５４】 類似型の固形組成物も、乳糖またはミルクシュガー、更には高分子量ポリエチ
レングリコールなどのような賦形剤を用い、軟質および硬質充填ゼラチンカプセ
ル剤中に充填剤として使用することができる。錠剤、カプセル剤、丸剤および顆
粒剤のような固形剤形は、薬学処方分野においては周知のように腸溶性コーティ
ングおよび他のコーティングのように、コーティングおよびシェルにより調製す
ることができる。これらは、任意に不透明化剤を含有してもよく、かつ一酸化窒
素模倣体のみを、または優先的に腸管の特定部位において、任意に遅延型で、放
出するような組成物であることもできる。使用することができる埋込み型組成物
の例は、高分子物質およびワックスである。

【００５５】 散剤および噴霧剤は、一酸化窒素模倣体に加え、乳糖、タルク、ケイ酸、水酸
化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質
の混合物などを含有することができる。噴霧剤は、更に習慣的に噴射剤、例えば
、クロロフルオロカーボンまたは1,3,4-Aとも称されるDIMELのような別の非CFC
噴射剤を含有することができる。

【００５６】 一酸化窒素模倣体の局所的または経皮的投与のための剤形は、軟膏剤、パスタ
剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、液剤、噴霧剤、吸入剤、または
貼付剤を含む。一酸化窒素模倣体は、無菌条件下で、薬学的に許容できる担体な
らびに必要とされる保存剤および／または緩衝剤と混合される。眼科用製剤、点
眼液、眼用軟膏、散剤および液剤も、本発明の範囲内で考案されている。経皮的
貼付剤は、一酸化窒素模倣体の生体への制御された送達を提供するという更なる
利点を有する。このような剤形は、一酸化窒素模倣体の溶解または粉末媒質中へ
の分散により作成することができる。吸収増強剤も、皮膚を通しての一酸化窒素
模倣体の流出を増加するために使用することができる。その速度は、速度制御膜
を提供するかもしくは一酸化窒素模倣体をポリマーマトリックスまたはゲル中に
分散するかのいずれかにより制御することができる。

【００５７】 軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤およびゲル剤は、一酸化窒素模倣体に加え、動
物性および植物性脂肪、油分、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント
、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケ
イ酸、タルクおよび酸化亜鉛、もしくはそれらの混合物のような賦形剤を含有す
ることもできる。

【００５８】 好ましい送達の様式は、定常状態の血漿濃度を維持するために、一酸化窒素模
倣体の妥当な定常状態での送達を提供するものである。このような送達は、物質
の血漿濃度におけるあらゆる実質的初期スパイク(initial spike)を避け、これ
は負の副作用をもたらすような血漿濃度を避けるために望ましいであろう。

【００５９】 市販の一酸化窒素模倣体を含有するこれらの処方について、本発明の方法にお
いて使用するための低用量処方は、市販の高用量処方と同じ方法であるが、これ
は悪性細胞表現型を阻害または防止するおよび／または抗悪性治療様式の効能を
増強するレベルで細胞に対する一酸化窒素模倣活性を増加、回復または維持する
のに十分な程低用量で処方されることが好ましい。処方の方法は、医薬処方に関
する技術者の技術の範囲内であり、かつ「レミントン薬科学(Remington's Pharm
aceutical Science)」(第18版、Alfonso R. Gennaro編集、Mack Publishing社、
イーストン、ペンシルバニア州、USA、1990年)などの労作において十分に説明さ
れている。

【００６０】 本発明の方法および処方は、転移、および腫瘍細胞の化学療法剤、放射線療法
、免疫療法および温熱療法を含むが、これにに限定されない抗悪性治療様式に対
する抵抗性の発生を阻害することにおいて特に有用である。低用量NO模倣体と組
合わせて有用な化学療法剤の種類の例は、以下を含むが、これらに限定されるも
のではない：抗VEGF薬、アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード、スル
ホン酸アルキル、ニトロソ尿素、エチレンイミンおよびトリアゼンなどを含むが
、これらに限定されるものではない抗血管形成剤；代謝拮抗物質、例えば葉酸ア
ンタゴニスト、プリンアナログ、およびピリミジンアナログなど；抗生物質、例
えばアントラサイクリン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、マイトマイシン、
ダクチノマイシン、およびプリカマイシン；エンドセリン活性化剤；L-アスパラ
ギナーゼのような酵素；ファルネシル-タンパク質トランスフェラーゼインヒビ
ター；5αレダクターゼインヒビター；17β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナ
ーゼ3型のインヒビター；グルココルチコイド、エストロゲンまたは抗エストロ
ゲン、アンドロゲンまたは抗アンドロゲン、プロゲスチン、および黄体形成ホル
モン放出ホルモンアンタゴニストなどの、ホルモン物質；酢酸オクトレオチド；
エクチナサイジンおよびその誘導体のような、微小管破壊物質；タキサンのよう
な、微小管安定化物質、例えば、TAXOL(パクリタキセル)、TAXOTERE(ドセタキセ
ル)およびそれらのアナログ、ならびにエポシロンまたはそれらのアナログ；ビ
ンカ・アルカロイド；エピポドフィロトキシン(epipodophyllotoxin)；トポイソ
メラーゼインヒビター；プレニル-タンパク質トランスフェラーゼインヒビター
；ならびに、その他の物質、例えばヒドロキシ尿素、プロカルバジン、ミトタン
、ヘキサメチルメラミン、プラチナ配位錯体、例えばシスプラチンおよびカルボ
プラチン、生物学的反応修飾剤、増殖因子、および免疫変調剤またはモノクロー
ナル抗体。本発明において有用な種類の化学療法剤の代表例は、アクチノマイシ
ンD、アフラコン(aflacon)、硫酸ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、
カルムスチン、クルラムブシル、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビ
ン、ダカルバジン、ダウノルビシン、ディスコデルモリド(discodermolide)、塩
酸ドキソルビシン、エストラムスチン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エ
トポシド、リン酸エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、
イダルビシン、イフォスファミド、インターフェロン、インターロイキン、ロイ
プロリド、レバミソール、ロムスチン、塩酸メクロレタミン、メルファラン、メ
ルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシンC、パクリタキセル、ペン
タスタチン、プテリジン、キノカルシン、リツキシマブ、サフラシン(safracin)
、サフラマイシン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシ
ド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、
酒石酸ビノレルビン、およびそれらのアナログまたは誘導体を含むが、これらに
限定されるものではない。

【００６１】 癌を罹患した動物には、腫瘍細胞の転移能を阻害し、加えて癌細胞殺傷を目的
とし同時投与される抗悪性治療様式の効能を増強するために、低用量一酸化窒素
模倣体を投与することができる。この態様において、一酸化窒素模倣体は、腫瘍
の外科的除去後、前または同時に、および／または放射線または化学療法の後、
同時、または前に、他の抗悪性治療様式と組合わせて、動物へ投与することがで
きる。この療法は、更に腫瘍へと血管内皮細胞の血管新生を阻害することを目的
とした抗VEGF薬の効能を増強すると考えられる。この態様において、低用量一酸
化窒素模倣体療法は、抗VEGF抗体のような抗VEGF薬の投与の前に、同時にまたは
後に、動物へ投与することができる。この態様において、一酸化窒素療法は、少
なくともわかっている抗VEGF薬の活性期間を通じて維持されることが好ましい。
低用量一酸化窒素模倣体療法は、更に予防療法として、癌発症のリスクの高い動
物に、悪性細胞表現型を伴う細胞の発生を防止するために投与することができる
。この態様において、低用量一酸化窒素模倣体は、動物へ、その生存期間を通じ
て直接投与することができる。従って、長期間の持続放出型投薬処方の投与が、
これらの動物において好ましい。加えて低用量一酸化窒素療法は、悪性細胞表現
型を伴う細胞を誘導するために、細胞の一酸化窒素模倣活性を低下する因子に曝
露されることが推定されるかまたはわかっているような動物に投与することがで
きる。この低用量一酸化窒素療法の投与は、これらの動物における悪性細胞表現
型の発生を阻害すると予想される。この態様において、少なくともこの因子に動
物が曝露されている限りは、一酸化窒素模倣体療法が投与されることが好ましい
。例えば、手術および麻酔の両方が、細胞の一酸化窒素模倣活性を低下し、その
結果悪性細胞表現型を誘導する因子であると考えられる。従って動物における手
術手技および／または麻酔薬投与の前または途中に、悪性細胞表現型を防止およ
び阻害するために、その動物に低用量一酸化窒素模倣体を投与することもできる
。この態様において、一酸化窒素模倣体が、少なくとも動物が手術手技を施され
ているおよび／または麻酔薬の作用下にある期間は投与されることが好ましい。
同様に、物理的外傷、特に失血、血量の低下または出血を伴う物理的外傷を受け
た動物は、悪性細胞表現型を防止および阻害するために、低用量一酸化窒素模倣
体を投与することができる。更に低用量一酸化窒素模倣体の同時投与は、血圧降
下剤などの、循環を変更する薬学的物質の投与時に発生し得るような悪性細胞表
現型を阻害または防止するために使用することができると考えられている。この
態様において、一酸化窒素模倣体は、これらの他の物質と共に毎日、もしくは他
の物質が投与される期間よりも長いような長期間持続放出型処方で投与されるこ
とが好ましい。 下記の限定的でない実施例は、本発明の更に詳細な説明のために提供される。

【００６２】 （実施例）実施例１：材料 組織培養培地(RPMI 1640)およびウシ胎仔血清(FBS)は、Gibco BRL社(グランド
アイランド、NY)から購入した。低酸素条件は、BellCo Biotechnology社(ビネラ
ンド、NJ)の密閉チャンバーを用いて作り出した。GTNは、DuPont Pharmaceutica
ls社(スカボロー、ON)から、エタノール、プロピレングリコールおよび水(1:1:1
.33)を溶媒とする溶液(TRIDIL、5mg/mlまたは2.22M)として入手した。ニトロプ
ルシドナトリウム(SNP)は、Sigma Chemical社(セントルイス、MO)から購入した
。RNA抽出は、Gentra Systems社(ミネアポリス、MN)のPURESCRIPT RNA単離キッ
トを用いて行った。ノーザンブロット分析のために、RNA転写に使用したナイロ
ン膜は、Micron Separations社(ウェストボロ、MA)から購入し；uPARおよびPAI-
1 cDNAプローブは、Bluescriptプラスミドベクターにクローニングし；[³²P]-dC
TPおよびReflection NEFフィルムは、Dupont/New England Nuclear社(ミシソー
ガ、ON)から購入し；ならびに、オリゴ標識キットは、Pharmacia Biotech社(ピ
スカタウェイ、NJ)から入手した。In vitro浸潤アッセイについて、血清非含有E
X-CELL 300培養培地を、JRH Biosciences社(レネキサ、KS)から購入し、Costar
TRANSWELLインサート(insert)(直径6.5mmのポリカーボネート、膜、孔径8μm)は
、Corning Costar社(ケンブリッジ、MA)から購入し、および再構成された基底膜
(MATRIGEL)は、Collaborative Biomedical Products社(ベッドフォード、MA)か
ら得た。プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター-1(PAI-1)酵素結合免疫
吸着アッセイ(ELISA)キットは、American Diagnostica社(グリーンウィッチ、CT
)から入手した。uPARのウェスタンブロット分析のために、溶解したタンパク質
を、Millipore社(ベッドフォード、MA)のImmobilon-P膜に転写し、抗uPAR抗体(
モノクローナル抗体[MoAb]3937)は、American Diagnostica社(グリーンウィッチ
、CT)から購入し、ブロッティング用の等級のアフィニティ精製したヤギ抗マウ
スIgG(H+L)ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体は、BIO-RAD社(ヘラクレ
ス、CA)から購入し、かつこの抗原は、Amersham Canada社(ミシソーガ、ON)の試
薬を用いる増強型ケミルミネッセンス(ECL)により検出した。ザイモグラフ分析
用のゼラチンをBDH社(トロント、ON)から購入し、カゼインをSigma Chemical社(
セントルイス、MO)から、およびプラスミノーゲンをAmerican Diagnostica社(グ
リーンウィッチ、CT)から購入した。

【００６３】実施例２：細胞 これらの実験においては、HTR-8/SVneo浸潤性栄養芽層細胞株およびMDA-MB-23
1転移性乳癌細胞株を用いた。HTR-8/SVneoおよびMDA-MB-231細胞は両方とも、5
％FBSを補充したRPMI-1640培地において培養した。 HTR-8/SVneo細胞株は、ヒトの最初の第一期胎盤の外植片培養から得、SVneoラ
ージT抗原をコードしているcDNA構築体によるトランスフェクションにより不死
化した。これらの細胞は、予め特徴決定し、かつ5％FBSを補充したRPMI-1640培
地において、130継代以上培地において維持した。これらは、高度の増殖指数を
示し、かつトランスフェクションしていない親HTR-8細胞と、インビトロ浸潤能
およびヌードマウスにおける腫瘍原性の欠如などの様々な表現型の類似性を共有
していた。 MDA-MB-231細胞株は、1973年に51歳の乳癌患者の胸腔滲出液から始めて単離さ
れた(Callieauら、J. Nat. Cancer Inst.、53:661-674(1974))。

【００６４】実施例３：低酸素状態細胞培養条件 細胞を、密閉チャンバーに入れ、5％ CO₂:95％ N₂を含有する混合ガスを、酸
素濃度のMinioxi Oxygen Analyzer(Catalyst Research社、オーイングミル、MD)
による測定値が0％となるまで、フラッシュした。次に細胞を、37℃でインキュ
ベーションした。インキュベーションの最初の2時間以内に、チャンバー内の酸
素レベルはおよそ1％に平衡化し、かつこのレベルにインキュベーションの残り
の期間維持した。 あるいは、細胞を、大気O₂レベルがPRO-Ox O₂レギュレーター(Reming Bioinst
ruments社、レッドフィールド、NY)により維持されたチャンバー内に入れた。

【００６５】実施例４：細胞の三硝酸グリセリン(GTN)およびニトロプルシドナトリウム(SNP) による処理 これらの実験において、細胞は、様々な濃度のGTNおよびSNPにより処理した。
GTN保存液は最初に、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)により、濃度10^-4Mへ希釈した
。濾過後、GTN溶液を、培養培地で、濃度10^-4M〜10^-11Mの範囲に希釈した。SNP(
当初は結晶形)は、蒸留水に溶解し、濃度10^-5Mに希釈した。濾過後、このSNPを
培養培地で濃度10^-6M〜10^-12Mの範囲に希釈した。

【００６６】実施例５：ノーザンブロット分析 細胞を、様々な濃度のGTNおよびSNPと共に、低酸素(1％O₂)または対照(20％O₂ )条件下、37℃で培養した。別の実験セットにおいて、MDA-MB-231細胞を、LMMA(
0.5mM)の存在または非存在下で、様々なレベルの酸素(1％、5％または20％O₂)下
、37℃で24時間インキュベーションした。インキュベーション後、これらの細胞
から全細胞RNAを、Gentra社のPURESCRIPT RNA単離キットを用いて単離した。そ
の後単離したRNAは、電気泳動により分離し、かつ帯電したナイロン膜へと転写
した。これらの膜を、50％ホルムアミド、5X Denhardt液、0.5％ドデシル硫酸ナ
トリウム(SDS)、6X SSC(1xSSC=0.15M NaCl、15mMクエン酸ナトリウム、pH7.0)お
よび100μg/mL変性サケ精子DNAを含有する溶液中、42℃でおよそ2時間プレハイ
ブリダイゼーションした。その後これらを、6X SSC、0.5％SDS、100μg/mL変性
サケ精子DNAおよび50％ホルムアミドで構成され、およびPharmacia Oligolabell
ingキットを用い[³²P]-dCTPで標識されたcDNAプローブ(uPARまたはPAI-1)を含有
する溶液中で、およそ24時間42℃で、[³²P]-dCTP標識したcDNAプローブ(uPARま
たはPAI-1)とハイブリダイゼーションした。連続洗浄した後この膜を用い、Dupo
nt Reflection NEFフィルムを露光した。1〜4日後、フィルムを現像し分析した
。各試料に負荷したRNA量の差異を補正するために、28S rRNAを用いた。

【００６７】実施例６：uPARタンパク質レベルのウェスタンブロット分析 uPARタンパク質のレベルを試験するために、最初に細胞を、様々な濃度のSNP
またはGTNが存在する20％O₂または1％O₂中で培養した。インキュベーション後、
これらの細胞を、40mM HEPES(pH7.2)、100mM NaCl、20％グリセロール、0.1mM E
DTA(pH8.0)、0.2％トリトンX100、1mM DTT、および2mM PMSFを含有する緩衝液を
用いて溶解した。その後これらの溶解液に、ホモジネーション、DNA剪断(25 5/8
ゲージ針を用い10回)、煮沸(5分間)および遠心(15分間, 14000g)を施した。上清
を収集し、かつ使用時まで-80℃で貯蔵した。試料に、SDS-ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動(PAGE)を施し、溶解したタンパク質を、湿式転写装置(Bio-Rad Lab
oratories社、ミシソーガ、ON)を用い、Immobilon-P膜に転写した。これらの膜
を、1％PBS、および0.01％Tween20(PBS-T)に加え、5％カゼインを含有する溶液
中で、4℃で一晩ブロックした。これらのブロットを引き続き、モノクローナル
抗uPAR抗体[MoAb 3937]と共に1.5時間インキュベーションし、引き続きPBS-Tで5
分間6回洗浄した。その後これらの膜を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ
標識したヤギ抗マウスIgG二次抗体と共に1.5時間インキュベーションした。更に
PBS-Tで5分間6回洗浄した後、抗原を、増強型ケミルミネッセンスにより検出し
、かつブロットを、Dupont Reflection NEFフィルム上で露光した。

【００６８】実施例７：ザイモグラフによるメタロプロテアーゼおよびプラスミノーゲンアク チベーター活性の測定 メタロプロテアーゼおよびプラスミノーゲンアクチベーター活性のレベルを測
定するために、これらの細胞を、様々な濃度のSNPまたはGTNの存在下、低酸素ま
たは対照条件下でインキュベーションした。これらの細胞を、血清非含有培地(E
X-CELL300)を用いて培養した。インキュベーション後、この培地を抽出し、かつ
5,000rpmで5分間遠心した。その後上清を収集し、使用時まで-80℃で貯蔵した。
SDS-ポリアクリルアミドゲルを、周知の手法に従い調製した。メタロプロテアー
ゼ分泌の分析のためのゲルは0.1％(w/v)ゼラチンを含有し、プラスミノーゲンア
クチベーター分泌の分析のためのゲルには0.1％(w/v)カゼイン、更にはプラスミ
ノーゲン(50μg/mL)を補充した。その後血清非含有馴化培地を、非還元(nonredu
cing)試料負荷緩衝液(グリセロール2mL中、0.5M Tris、10％SDS、1％ブロモフェ
ノールブルー)と比4:1で一緒にし、煮沸しなかった。電気泳動後、ゲルに2.5％T
ritonX-100による15分洗浄を2回行った。この工程はSDSを除去した。H₂Oで洗浄
した後、ゲルを、Tris-HCl(pH7.0)およびCaCl₂(5mM)含有溶液中で、37℃で一晩
インキュベーションした。これらのゲルを、40％メタノール／10％氷酢酸／50％
蒸留水中の0.4％クマシーブリリアントブルーR-250で、およそ1時間染色し、そ
の後30％メタノール／10％氷酢酸／60％蒸留水中で約2時間脱色した。分子量標
準品は、比較的明るい青色背景に対し、暗色のバンドを示し、かつ溶解が生じた
無色のゾーンが出現した。ゼラチン含有ゲルにおいて、これらの領域は、メタロ
プロテアーゼ(ゼラチナーゼ)活性に対応しており、カゼインゲルにおいてはこれ
らのバンドは、プラスミノーゲンアクチベーター活性に対応していた。これらの
ゲルは、保存液(10％氷酢酸／10％グリセロール／80％蒸留水)を用いて1時間保
存し、60℃で1時間セロファン上で乾燥した。

【００６９】実施例８：In vitro浸潤アッセイ MATRIGEL浸潤チャンバー(Boydenチャンバーの変形)を用い、様々な濃度のGTN
またはSNPの存在または非存在下で、低酸素および標準の条件下での細胞の浸潤
性を評価した。これらのチャンバーは、直径6.5mmおよび孔径8μm膜の細胞培養
インサートからなる。膜は各々、冷血清非含有培養培地(EX-CELL300)中に希釈し
た1mg/mL MATRIGEL溶液100μLで被覆し、層流(laminar flow)キャビネット内で
およそ12時間かけて乾燥させた。その後MATRIGELを、100μL血清非含有培地と共
におよそ1時間インキュベーションすることにより、再水和した。再水和後、血
清および一酸化窒素処置物の両方を含む、培地100μL中に細胞5.0x10⁴または1.0
x10⁵個を含む細胞浮遊液を、各ウェルに添加した。血清および各一酸化窒素処置
物を含む培養培地を、各インサートに添加した。これらの細胞を、低酸素(1％O₂ )または対照(20％O₂)のいずれかの条件下で24時間インキュベーションした。イ
ンキュベーション後、非浸潤細胞を、綿棒で拭うことにより、膜の上面から取除
いた。膜の下面の細胞は、Carnoy固定液(25％酢酸、75％メタノール)により10分
間固定し、その後およそ3時間、1％トルイジンブルー、1％ホウ酸ナトリウムで
染色した。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすいだ後、膜を、小さい外科用メス
を収容しているインサートから取除き、顕微鏡スライドガラス上に載せ、カバー
グラスをかけた。次に浸潤している細胞を、倍率40Xで顕微鏡観察し、計数した
。各処理に対する浸潤インデックスは、浸潤細胞数を、標準条件下で浸潤した細
胞数で除算することにより算出した。その後この値を100倍し、百分率を得た。
標準は100％値とし、処理値は標準についての百分率へと変換した。これらの結
果を、統計学的有意性について、対のある多重比較法のためのターキー検定を、
または対のある多重比較法のためのスチューデント-ニューマン-クールズ法のい
ずれかを用い検定した。図１参照のこと。

【００７０】実施例９：In vivo転移モデル C57BL6マウスに、5x10⁴〜10⁵個のB16F1O転移性黒色腫細胞をボーラス静脈内注
射した(尾静脈)。尾静脈注射直後に、マウスを無作為に15群に分け、各群のマウ
スを、各々、20％O₂：バランス量のN₂および10％O₂：バランス量のN₂の混合ガス
を連続フラッシュしているプレキシガラスチャンバー(およそ3L)に入れた。ガス
流は、チャンバー内にCO₂蓄積が生じないレベルに調節した。20％O₂または10％O₂ のいずれかの大気に24時間曝露後、マウスをチャンバーから取り出し、室内大
気に維持した通常のケージに移した。13日後、マウスを、頸部脱臼により屠殺し
、肺を摘出し、Bouin固定液(Sigma社)で固定した。肺表面上の転移性結節(その
多くはメラニンの存在により黒色に見える)を、解剖学顕微鏡下で肉眼により計
数した。データは、注射した10⁴個細胞当りの肺結節数で表し、ノンパラメトリ
ック値に関する統計学的検定を用いて解析した。 実験の第二セットにおいて、B16F10マウス黒色腫細胞を、2x10^-11M GTNの存在
または非存在下、1％または20％酸素中で12時間インキュベーションした以外は
、同じプロトコールを用いた。その後細胞を、トリプシンでプレートから取除き
、かつC57BL6雌マウスへ5x10⁴個の細胞を静脈内注射した(尾静脈)。図２参照の
こと。In vitroにおいて処理した細胞の一部は、組織培養皿上に配置し、実施例
10に説明したプロトコールを用い、コロニー形成能について決定した。

【００７１】実施例10：ドキソルビシン耐性に関するコロニー形成アッセイ MDA-MB-231乳癌細胞のドキソルビシンに対する耐性を、20％または1％酸素中
で培養後、形成されたコロニー数を計数することにより決定した。MDA-MB-231細
胞は、1％O₂または20％O₂中で24時間インキュベーションした。インキュベーシ
ョン後、細胞を、希釈液(対照)、25μMドキソルビシン、25μMドキソルビシン＋
10^-6M GTNまたは25μMドキソルビシン＋10^-10M GTNに、1時間曝露した。これら
の細胞を洗浄し、その後35mmプレート上に異なる希釈で置いた。これらの細胞を
、細胞コロニーを形成させるために、更に1〜2週間インキュベーションした。イ
ンキュベーション期間の最後に、細胞をCarnoy固定液で固定し、クリスタルバイ
オレットで染色し、すすぎかつ風乾した。コロニーを肉眼により計数した。各条
件下での生存細胞を、コロニー数を計数することにより決定し、ドキソルビシン
曝露なしに生存したコロニー数の分数として表した。

【００７２】 本発明は特に、特定の態様を参照し例示および説明されているが、当業者には
、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、形状および詳細における様々
な変更を行うことができることは理解されるであろう。 本明細書に引用された全ての参考文献および特許は、全体が本明細書に参照と
して組入れられている。

【００７３】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、正常(20％O₂)条件と比較した、低酸素(1％O₂)条件でのMDA
-MB-231浸潤性乳癌細胞によるGTNおよびSNPのインビトロ浸潤に対する作用を示
すヒストグラムである。細胞を、MATRIGEL被覆した膜上に塗布し、かつ低酸素ま
たは正常条件下で、単独でまたは一酸化窒素模倣体の存在下でインキュベーショ
ンした。各処置に関する細胞の浸潤能の尺度とみなされる浸潤インデックス(対
照に対する％)は、膜を通して浸潤した細胞を染色しかつそれを計数することに
より決定した。第一の棒グラフは、正常条件(20％O₂)下で培養した細胞の浸潤イ
ンデックスを示す。第二の棒グラフは、低酸素条件(1％O₂)下で培養した細胞の
浸潤インデックスを示す。第三の棒グラフは、低酸素条件(1％O₂)下で培養しか
つ10^-10M SNPを投与した細胞の浸潤インデックスを示す。第四の棒グラフは、低
酸素条件(1％O₂)下で培養しかつ10^-11M GTNを投与した細胞の浸潤インデックス
を示す。「＊」で示した値は、対のある多重比較法のためのスチューデント化さ
れたニューマン・クールズpost hoc検定を用い、有意差(p＜0.05、n=6)がある。

【図２】 図２は、2x10^-11M GTNの存在または非存在下において、1％または2
0％O₂中で12時間インキュベーションし、かつC57B16雌マウスへi.v.注射(尾静脈
)した、B16F10マウス黒色腫細胞の肺コロニー形成能を示すヒストグラムである
。14日後マウスを屠殺し、肺を摘出し、かつBouin固定液中で固定した。黒色お
よび非黒色の両方の転移性コロニーを、解剖顕微鏡下で計数した。第一の棒グラ
フは、正常条件(20％O₂)下で培養した細胞を注射したマウスの肺において観察さ
れた結節数を示す。第二の棒グラフは、正常条件(20％O₂)下で培養しかつ2x10^{-1 1} M GTNを投与した細胞を注射したマウスの肺において観察された結節数を示す。
第三の棒グラフは、低酸素条件(1％O₂)下で培養した細胞を注射したマウスの肺
において観察された結節数を示す。第四の棒グラフは、低酸素条件(1％O₂)下で
培養しかつ2x10^-11M GTNを投与した細胞を注射したマウスの肺において観察され
た結節数を示す。

【図３】 図３は、根治的前立腺切除術を受けた患者A(図3A)および患者B(図3
B)である患者2名における循環血中前立腺特異抗原(PSA)レベルを示す。血漿PSA
レベルの急激な減少が、低用量NO模倣体療法投与後2ヶ月以内に、両方の患者に
おいて認められた。血漿PSAレベルは、ラジオイムノアッセイを用いて測定し、
これは精度±0.1ng/mlであった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｎ 33/53 33/53 Ｓ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ヒートン ジェレミー ピー．ダブリュ ー． カナダ国 オンタリオ州 ガナノケ アー ル． アール．＃３ マックアルパイン ロード 1818 (72)発明者 ポストビット リン−マリア カナダ国 オンタリオ州 キングストン アパートメント ナンバーワン ジョンソ ン ストリート 241 Ｆターム(参考） 2G045 AA29 BB14 BB20 BB24 BB29 BB41 BB46 BB48 BB50 BB51 CB01 FA16 FB03 FB08 GC22 4C084 AA17 AA20 MA02 NA14 ZB261 ZB262 ZC611 ZC612

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 低用量の一酸化窒素模倣体を細胞に投与する工程を含む、悪
   性細胞表現型を阻害および防止する方法。
2. 【請求項２】 細胞が、悪性細胞表現型のリスクのある対象またはそれに罹
   患している対象のものである、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 一酸化窒素模倣体の投与が、転移および細胞における抗悪性
   治療様式に対する抵抗性の発生を阻害する、請求項１または２記載の方法。
4. 【請求項４】 一酸化窒素模倣体の投与が、抗ＶＥＧＦ薬投与時の細胞にお
   ける、より攻撃的な悪性細胞表現型の発生を阻害する、請求項１または２記載の
   方法。
5. 【請求項５】 一酸化窒素模倣体の投与が、細胞の一酸化窒素模倣活性を低
   下する因子に曝露された細胞における悪性細胞表現型の発生を阻害する、請求項
   １または２記載の方法。
6. 【請求項６】 １種よりも多い一酸化窒素模倣体が投与される、請求項１ま
   たは２記載の方法。
7. 【請求項７】 ＮＯ供与体が、環状ヌクレオチドの分解を阻害する化合物と
   同時投与される、請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】 低用量の一酸化窒素模倣体を細胞に投与する工程を含む、癌
   細胞に対する抗悪性治療様式の効能を増強する方法。
9. 【請求項９】 悪性細胞表現型を防止または阻害するレベルまで細胞の一酸
   化窒素模倣活性を増加、回復または維持する量の一酸化窒素模倣体を含有する、
   悪性細胞表現型を阻害および防止する処方。
10. 【請求項１０】 一酸化窒素模倣体の量が、一酸化窒素模倣体に対する薬物
    耐性または副作用の発生を遅延するかもしくは発生を低下する、請求項９記載の
    処方。
11. 【請求項１１】 １種よりも多い一酸化窒素模倣体を含有する、請求項９記
    載の処方。
12. 【請求項１２】 一酸化窒素模倣体が、ＮＯ供与体および環状ヌクレオチド
    分解を阻害する化合物を含む、請求項１１記載の処方。
13. 【請求項１３】 低用量の一酸化窒素模倣体を、それを必要とする動物に投
    与する工程を含む、動物において悪性細胞表現型を阻害および防止する方法。
14. 【請求項１４】 １種よりも多い一酸化窒素模倣体が投与される、請求項１
    ３記載の方法。
15. 【請求項１５】 ＮＯ供与体が、環状ヌクレオチドの分解を阻害する化合物
    と同時投与される、請求項１４記載の方法。
16. 【請求項１６】 一酸化窒素模倣体の投与が、動物における腫瘍の転移およ
    び細胞における抗悪性治療様式に対する抵抗性の発生を阻害する、請求項１３記
    載の方法。
17. 【請求項１７】 一酸化窒素模倣体の投与が、動物への抗ＶＥＧＦ薬投与時
    の動物の細胞におけるより攻撃的な悪性細胞表現型の発生を阻害する、請求項１
    ３記載の方法。
18. 【請求項１８】 一酸化窒素模倣体の投与が、細胞の一酸化窒素模倣活性を
    低下する因子に曝露された動物における悪性細胞表現型の発生を阻害する、請求
    項１３記載の方法。
19. 【請求項１９】 低用量の一酸化窒素模倣体を、それを必要とする対象に投
    与する工程を含む、対象の癌を治療する方法。
20. 【請求項２０】 １種よりも多い一酸化窒素模倣体が投与される、請求項１
    ９記載の方法。
21. 【請求項２１】 ＮＯ供与体が、環状ヌクレオチドの分解を阻害する化合物
    と同時投与される、請求項２０記載の方法。
22. 【請求項２２】 癌が前立腺癌である、請求項１９記載の方法。
23. 【請求項２３】 低用量の一酸化窒素模倣体を動物へ投与する工程を含む、
    癌発症リスクの高い動物において悪性細胞表現型を予防的に阻害および防止する
    方法。
24. 【請求項２４】 １種よりも多い一酸化窒素模倣体が投与される、請求項２
    ３記載の方法。
25. 【請求項２５】 ＮＯ供与体が、環状ヌクレオチドの分解を阻害する化合物
    と同時投与される、請求項２４記載の方法。
26. 【請求項２６】 低用量の一酸化窒素模倣体の存在下において、患者の腫瘍
    マーカーレベルを測定する工程を含む、患者の腫瘍進行を経過観察または診断す
    る方法。
27. 【請求項２７】 腫瘍マーカーが、前立腺特異抗原である、請求項２６記載
    の方法。
28. 【請求項２８】 低用量の一酸化窒素模倣体を患者に投与する工程を含む、
    患者の腫瘍マーカーレベルを低下する方法。
29. 【請求項２９】 腫瘍マーカーが、前立腺特異抗原である、請求項２８記載
    の方法。
30. 【請求項３０】 癌細胞に対する抗悪性治療様式の効能を増強するレベル
    まで細胞の一酸化窒素模倣活性を増加、回復または維持する医薬品を調製するた
    めの、一酸化窒素模倣体の使用。
31. 【請求項３１】 動物における悪性細胞表現型を阻害または防止するレベ
    ルまで細胞の一酸化窒素模倣活性を増加、回復または維持する医薬品を調製する
    ための、一酸化窒素模倣体の使用。
32. 【請求項３２】 癌発症リスクの高い動物における悪性細胞表現型を予防的
    に阻害または防止するレベルまで細胞の一酸化窒素模倣活性を増加、回復または
    維持する医薬品を調製するための、一酸化窒素模倣体の使用。