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JP2003530115A - アルツハイマー病に対する診断試験 - Google Patents

アルツハイマー病に対する診断試験

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Publication number
JP2003530115A
JP2003530115A JP2001575224A JP2001575224A JP2003530115A JP 2003530115 A JP2003530115 A JP 2003530115A JP 2001575224 A JP2001575224 A JP 2001575224A JP 2001575224 A JP2001575224 A JP 2001575224A JP 2003530115 A JP2003530115 A JP 2003530115A
Authority
JP
Japan
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butyrylcholinesterase
ache
ratio
unbound
concanavalin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2001575224A
Other languages
English (en)
Inventor
ヘンリー スモール，デイビッド
サエス−バレロ，ハビエル
Original Assignee
アクソニックス，インコーポレイティド
ユニバーシティ オブ メルボルン
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アクソニックス，インコーポレイティド, ユニバーシティ オブ メルボルン filed Critical アクソニックス，インコーポレイティド
Publication of JP2003530115A publication Critical patent/JP2003530115A/ja
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/46—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase involving cholinesterase
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Abstract

(57)【要約】 （１）前記患者由来の適切な生体流体の試料を供給すること及び（２）前記試料中で変化した糖化パターンを有するＢｕＣｈＥの存在を検出することの段階を含んで成る患者に於いてアルツハイマー病（ＡＤ）の診断の為の方法である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】技術分野 本発明はアルツハイマー病に対する診断試験に関連する。
【０００２】技術背景 アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶及び高次認識機能の欠失を伴う通常進行性
の痴呆症である。当該疾患は、患者の脳に於けるアミロイドの沈着の存在により
特性決定される。これらの沈着は細胞外（アミロイド斑）及び細胞内（神経原繊
維の変化）両方で発見される。アミロイド斑の主要な成分はアミロイドタンパク
質（Ａβ）であり、それは、アミロイドタンパク質前駆体（ＡＰＰ）の為のタン
パク質分解開裂により生産される（Evin et al. 1994）。神経原繊維変化の主要
な成分は、細胞骨格タンパク質τ（Kosik, 1992 ）である。
【０００３】 ＡＤに於いて観察される特徴的な神経化学的変化の１つは、アセチルコリンエ
ステラーゼ（ＡＣｈＥ）及びコリンアセチルトランスフェラーゼ活性の、例えば
皮質、海馬、扁桃基底核に於ける欠失である（Whitehouseら、1981, 1982 ; Str
ubleら、1982 ; Mesulam and Geula, 1988）。コリン作用構造及びマーカーの欠
失は、斑の数及び病巣の変化、並びに疾患の臨床的な症度に相関する（Perry ら
、1978 ; Wilcockら、1982 ; Nearyら、1986 ; Perry, 1986）。ＡＣｈＥの欠失
はブチリルコリンエステラーゼ（ＢｕＣｈＥ）の増加に付随する（Atack ら、19
86）。
【０００４】 存命期中のＡＤの正確な診断は必須である。しかしながら、臨床的評価法はせ
いぜい精度約８０％である。故に、ＡＤの特異的な生化学的マーカーの同定が要
請される。これ迄、検出可能な差が所定のタンパク質のレベルに於いて報じられ
て来た（Motterら、1995）が、血液又は脳脊髄液（ＣＳＦ）の解析は、十分な診
断値のマーカーを生まなかった（Blass ら、1998）。
【０００５】 血液及び脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＡＣｈＥ及びＢｕＣｈＥ活性のレベルのアッ
セイはＡＤに対する生前の診断試験として提案されて来た。しかしながら、ＡＣ
ｈＥ及びＢｕＣｈＥのレベルがこれらの組織中で一貫して作用を受けるかどうか
についての総意はない。ＡＤ患者に於いて血清又は血しょうＡＣｈＥのレベルは
、増加する（Perry ら、1982 ; Atackら、1985）、減少する（Nakanoら、1986 ;
Yamamoto ら、1990）もしくは不変である（St. Clair ら、1986 ; Sirvio ら、
1989）と報じられている。赤血球ＡＣｈＥのレベルは作用を受けない（Atack ら
、1985 ; Perryら、1982）又は減少する（Chipperfieldら、1981）として報じら
れて来た。ＡＤ患者のＣＳＦ中のＡＣｈＥ活性のレベルは（最も最近にAppleyar
d 及びMcDonald, 1992 ; Shen ら、1993によって）減少する又は（最も最近Appl
eyard ら、1987 ; Ruberg ら、1987によって）不変であると報じられている。
【０００６】 ＡＣｈＥ及びＢｕＣｈＥは６つ迄の様々なイソ型分子内で存在することが示さ
れて来ており、そのうち３つは単量体（Ｇ１）、二量体（Ｇ２）及び三量体（Ｇ
４）のイソ型である（Massoulie ら、1993）。ＡＣｈＥ及びＢｕＣｈＥの様々な
イソ型の相対的な割合は、頭頂骨皮質に於けるＡＣｈＥのＧ４イソ型の減少（At
ack ら、1983）、並びにＡＣｈＥのＧ１イソ型の増加（Arerdtら、1992）により
、ＡＤに於いて顕著に作用を受ける。他のＡＤ脳領域、例えばブロッドマンエリ
ア（Ｂｒｏｄｍａｎ ａｒｅａｓ）９，１０，１１，２１及び４０並びに扁桃に
於いて同様の変化が同定されている（Fishman ら、1986）。ヒトの脳に於いて僅
少の総ＡＣｈＥ量を示すのだが不斉のコラーゲンを添付されたイソ型（Ａ１２）
はブロッドマンエリアに於いて４００％迄増加する。
【０００７】 しかしながら、今日までＡＣｈＥ及びＢｕＣｈＥの発現及びイソ型分布に於け
る変化は有用なＡＤの診断マーカーとなる程十分な感度又は特異性を有するとは
見出されていなかった。
【０００８】本発明の開示 生体流体、例えば血液又はＣＳＦの生化学的解析に基づくＡＤについての診断
試験に対する要請がある。本発明は、非ＡＤ群のブチリルコリンエステラーゼ（
ＢｕＣｈＥ）に対して異なる糖化パターンを示すＡＤ患者のＢｕＣｈＥに基づく
試験を供する。
【０００９】 本発明の第一の局面に従い、患者に於けるアルツハイマー病（ＡＤ）の診断の
為の方法が供され、この方法は、 （１）前記患者由来の適切な試料を用意し、そして （２）前記試料中で糖化パターンが変化するＢｕＣｈＥの存在を検出する段階
を含んで成る。
【００１０】 本発明のある実施態様に於いて、総ＢｕＣｈＥに対する、特異的な糖化パター
ンを有するＢｕＣｈＥの相対的な割合が測定される。
【００１１】 総ＢｕＣｈＥに対する、特異的な糖化パターンを有するＢｕＣｈＥのイソ型の
相対的な割合の測定は、例えばＨＰＬＣ及びマススペクトロメトリーのような生
化学的な解析又はＥＬＩＳＡのような免疫学的技術もしくはアッセイを用いるこ
とによりいずれの汎用の方法で実行されて良い。しかしながら特に、ＢｕＣｈＥ
のイソ型の相対的な割合を測定する好適な手段はレクチン結合解析を伴う。
【００１２】 ＡＤ患者のＣＳＦ中で平均約９３．６％のＢｕＣｈＥがコンカナバリン（Ｃｏ
Ａ）に対し結合する。従って、本発明の好適な実施態様に於いて特に、試料中で
特異的な糖化パターンを有するＢｕＣｈＥの存在を検出する為に、ＣｏｎＡに対
するＢｕＣｈＥの結合率が決定される。ＣｏｎＡに対して結合するＢｕＣｈＥの
百分率は、特異的な糖化パターンを伴うＢｕＣｈＥの割合の特性である。
【００１３】 各実験に於いて未結合ＢｕＣｈＥの活性を、試料中の総ＢｕＣｈＥに対する、
ＣｏｎＡに対し未結合のＢｕＣｈＥの量を決定することにより、測定することは
特に有用である。
【００１４】 本発明の他の実施態様に於いて、ＣｏｎＡに結合するＡＣｈＥとコムギ胚芽凝
集素（ＷＧＡ）に結合するＡＣｈＥとの比率を本明細書中で以後Ｃ／Ｗ比率とし
て言及する。ＣｏｎＡに対して未結合のＢｕＣｈＥの百分率に対して比較するこ
とは有利である。当該比率はＡＣｈＥの様々な糖化パターンの特性である。Ｃｏ
ｎＡに対する未結合のＢｕＣｈＥの百分率に対して当該Ｃ／Ｗ比率をプロットす
ることにより、非ＡＤと比較してＡＤと診断された患者の分類が、そのようなプ
ロットを見た時明白になる。
【００１５】 ＡＤ患者のＣＳＦ中の７５〜９５％のＡＣｈＥがコンカナバリン（ＣｏｎＡ）
又はコムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）に結合するが、各々に対して異なる特異性を有
する。ＡＤを伴う患者について、Ｃ／Ｗ比率は典型的に０．９５超であり、全Ｂ
ｕＣｈＥに対するＣｏｎＡに対して未結合のＢｕＣｈＥの百分率は約８％以上で
ある。
【００１６】 本発明の別の実施態様に於いて、変化した糖化パターンを伴うＢｕＣｈＥに対
して特異的なモノクローナル抗体が与えられ（変化した糖化パターンを伴うＢｕ
ＣｈＥの）存在を検出する為に用いられる。
【００１７】 解析される生体流体は脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液又は血しょうでありうる。有
利に、前記生体流体が血液の時は、血しょうは解析の為の血液から調製される。
【００１８】 本発明の更なる局面に従うと変化した糖化パターンを有し、且つ未変化の糖化
パターンを持つＢｕＣｈＥよりもＣｏｎＡに対する親和性が比較的より低いこと
に特性があるＢｕＣｈＥの異常なイソ型が供される。
【００１９】 本発明の更なる局面に従うと、変化した糖化パターンを有し、且つ変化した糖
化のパターンを持つＢｕＣｈＥよりもＣｏｎＡに対する親和性が比較的低いこと
に特性があるＢｕＣｈＥの異常なイソ型が供される。
【００２０】本発明を実施する最適な方法 ＡＣｈＥ，アセチルコリンエステラーゼ；ブチリルコリンエステラーゼ（Ｂｕ
ＣｈＥ）ＣｈＥ，コリンエステラーゼ；Ａβ，アミロイドβタンパク質；ＡＤ，
アルツハイマー病；ＤＰ，広汎性斑；ＮＤ，他の神経学的疾患；ＰＭＩ、死後の
間隔；ＰＢＳ，リン酸−塩類緩衝液；ＴＢ，トリス緩衝液；ＴＳＢ，トリス塩類
緩衝液；ＳＳ，塩類可溶性上清；ＴＳ，トリトンＸ−１００−可溶性上清；ＡＦ
，両親媒性の画分；ＨＦ、親水性の画分；Ｇa 、球状の両親媒性のイソ型；Ｇna ，球状の非−両親媒性のイソ型；及びカナバリア・エンシホルミス（Ｃａｎａｖ
ａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）凝集剤由来の（コンカナバリンＡ），Ｃｏｎ
Ａ；トリチカム・ブルガリス（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｉｓ）（コムギ
胚芽），ＷＧＡ；リシヌス・コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ），
ＲＣＡ120 ；レンス・クリナリス（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ），ＬＣＡ；
ドリチュス・ビフロルス（Ｄｏｌｉｃｈｕｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓ），ＤＢＡ；ウ
レックス・ユーロピーウス（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ），ＵＥＡ1 ；グリ
シン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ），ＳＢＡ；及びアルカリス・ヒポガ
エア（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ），ＰＮＡ。
【００２１】 固定化レクチン（ＣｏｎＡ−及びＬＣＡ−セファロース，ＷＧＡ−，ＲＣＡ12 0 −，ＤＢＡ−，ＵＥＡ1 −；ＳＢＡ及びＰＮＡ−アガロース），フェニルアガ
ロース，ウシの肝臓カタラーゼ，大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アルカリ性ホスファタ
ーゼ，ポリオキシエチレン−１０−オレイルエーテル（Ｂｒｉｊ ９７），トリ
トンＸ−１００，テトライソプロピルピロホスホラジミン（ｉｓｏ−ＯＭＰＡ）
，１，５−ビス（４−アリジメチル−アンモニウムフェニル）−ペンタン−３−
１ヂブロミド（ＢＷ２８４ｃ５１），アセチルチオコリンイオヂド及び５，５′
−ヂチオ−ビス−２−ニトロベンゼン酸（ＤＴＮＢ）らは全てSigma-Aldrich Pt
y. Ltd. (Seven Hills, NSW, Australia）から得た。セファロースＣＬ−４Ｂ（
Pharmacia Biotech AB (Uppsala, Sweden ）から購入した。
【表１】
【００２２】 以下の実施例はアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）により行われる実験
に関連する。ある当業者は以下の実施例から、変化した糖化パターンを有すブチ
リルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）の検出を含んで成るアルツハイマー病に対
する診断テストを作成する為に、容易に推断可能であろう。
【００２３】実施例１ ＡＤ患者に於けるレクチン結合ＡＣｈＥ実験 １８の臨床学的又は病理学的痴呆を有さないコントロール、臨床的及び病理学
的痴呆のない並びに脳病理学の痕跡のないＡＤの２７ケース非ＡＤ型の痴呆（Ｄ
ＮＡＴ）７ケース（前頭葉痴呆５人レーヴィー体痴呆／パーキンソン病１人、及
び複合梗塞痴呆／コンゴレッドで染まるアミロイド血管造影１人）、及び他の神
経学的疾患（ＮＤ）６ケース、（ハントン病４人、精神分裂病１人及び大脳皮質
基底核変性１人）の腰又は脳室ＣＳＦを死後得た。コントロール群の平均年齢は
６８±４歳、女性１０及び男性１０並びにＰＭＩは４０±６であった。ＡＤ群に
於いて、年齢は８１±２歳、女性１３及び男性１４並びにＰＭＩは３５±６であ
った。ＮＤ群に於いて、年齢は６５±６、女性３及び男性３でありＰＭＩは４５
±１２であった。ＤＮＡＴ群に於いて、年齢は７６±３、女性４及び男性３であ
りＰＭＩは３４±１１であった。試料ＣＳＦを−７０℃で保存し、×１０００ｇ
で１５分間に渡り実験前遠心した。ＡＣｈＥ活性をエルマン法（Ellman et al 1
961 ）の改良ミクロアッセイにより２２℃でアッセイした。アリコート（０．３
ml）を０．１mlセファロース４ＢとＰＢＳ（コントロール）、コンカナバリンＡ
（ＣｏｎＡ）又はセファロース上に固定化したコムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ、トリ
チカム・ブルガリス（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｉｓ）と混合した。酵素
−レクチン混合物を４℃で一晩インキュベートし、次いで遠心（×１，０００ｇ
、１５分）した。ＡＣｈＥ活性を上清画分中でアッセイした。データを学生のｔ
検定を用いて解析した。
【００２４】 ６０歳≧患者の脳室ＣＳＦ試料に於いて総ＡＣｈＥ値は、コントロール（１７
．２４±４．２８nmol／分／ml；Ｐ＜０．００１）に於いてよりもＡＤ群（６．
９８±０．２８nmol／min ／ml）に於いて有意に低かった。しかし、従来報じら
れた（Appleyard ら、1983）ように、データ間の多大なオーバラップ（４０％）
が、有意な診断マーカーとしての総ＡＣｈＥの使用を阻む。
【００２５】 しかし、レクチン結合解析がＡＤ群とコントロールとの間の有意な違いを明ら
かにした。ＣＳＦｓ中の約７５〜９５％のＡＣｈＥが、ＣｏｎＡ又はＷＧＡに対
して結合する。比率（Ｃ／Ｗ比率）をＷＧＡに対する未結合のＡＣｈＥとは別け
てＣｏｎＡに対する未結合のＡＣｈＥとして定義する。ＡＤ群に対する平均Ｃ／
Ｗ比率はコントロールの（図１）と有意に異なる。確定ＡＤ（患者）由来の２７
ＣＳＦの２１試料はＣ／Ｗ比率＞０．９５を有した。全１８コントロール試料は
、より若い（ｎ＝５ Ｃ／Ｗ±０．３７±０．１０）とより年配（ｎ＝６、０．
３８±０．０８）の患者試料との間で有意な違いがなくＣ／Ｗ＜０．９５であっ
た。死後間隔（ＰＭＩ）とのＣ／Ｗ率に於ける相互関係は示されなかった。本デ
ータを図１に図表を用いて示した。
【００２６】 ＣＳＦ ＡＣｈＥのレクチン−結合解析は感度８０％且つ特異性９７％である
、ＡＤに対する診断試験を供しうるものとデータが示す。従って、ＣＳＦ中のＡ
ＣｈＥの糖化パターンに於いて観察される違いを、ＡＤに対する生前診断マーカ
ーとして、特に他の生化学的マーカーの測定との組み合わせに於いて用いた時に
有用であって良いものとして提案される。
【００２７】実施例２ ＡＣｈＥ実験の為のヒトの脳及びＣＳＦ試料 脳室及び腰のＣＳＦ、前頭皮質及び小脳の試料を死体から得、−８０℃で保存
した。３つの非ＡＤグループ試料 １）痴呆の臨床学又は組織学的特徴を有さな
いコントロール（ｎ＝１８）、２）痴呆の臨床学的特徴を示さないが、平均的な
数の非神経炎性Ａｂ−免疫反応性分散斑（ＤＰ）が見つかった各個体（ｎ＝６）
並びに３）７ケースの非ＡＤ型痴呆（５つの前頭葉痴呆、１つのレーヴィ小体痴
呆及び１つの脈管の痴呆）及び７ケースの他の神経学的疾患（４つのハンティン
グトン病、１つのパーキンソン病、１つの精神分裂病及び１つの大脳基質基底核
変性症）を決めた。ＡＤのケースをそれらの痴呆の病歴及び神経病理学的ＣＥＲ
ＡＤ診断法（Mirra ら、1994）を基礎として選択した。ＡＤ及びＮＤ群に含まれ
る全ＣＳＦ試料は脳室の（サンプル）であり（それぞれ総１８及び６の患者由来
の）５つのみの試料及び１つのＤＰ ＣＳＦ試料を腰の穿刺により用いた。小脳
試料の免疫組織化学的実験は、前頭皮質とは違い、従来の研究（Mannら、1996）
と矛盾なく小さな神経炎のアミロイド斑沈着（データを示さない）をどのＡＤ組
織も獲得していないことを示した。
【００２８】 ７２時間超の死後間欠期（ＰＭＩ）について、２０℃での保存又は凍結−解凍
の繰り返しは、糖化解析の混乱を増すＡＣｈＥの変性を引き起こす。故に、７２
時間内のＰＭＩを伴う試料（ＰＭＩ＝３６±４時間）が用いられる。（Grass ら
、1982 ; Fishmanら、1986 ; Saez-Valeroら、1993）。各試料群の間で有為な差
はなかった。
【００２９】試料の調製及びＡＣｈＥの抽出 試料ＣＳＦを４℃で徐々に解凍し次いで×１０００ｇで１５分に渡り使用する
前遠心した。前頭皮質及び小脳の小片（０．５ｇ）を４℃で徐々に解凍し、重量
を測りプロテアーゼ阻害物のカクテルを含有する氷冷トリス塩類緩衝液（ＴＳＢ
；５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、及び５０mM ＭｇＣｌ2 pH７．
４）（Silmanら、1978）中でホモジナイズ（１０％ｗ／ｖ）した。組織をガラス
／テフロン（登録商標）ホモジナイザーでホモジナイズし、次いでブランソン（
Ｂｒａｎｓｏｎ）音波器を用いて設定４で、５０％間欠で１０〜１５回超音波破
砕した。懸濁を塩類可溶性ＣｈＥ画分（ＳＳ）を回収する為に７０．１Ｔｉ回転
装置を用いるベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）Ｌ８−８０Ｍ超遠心機中で４℃で×
１００，０００ｇで遠心した。ペレットを等量のＴｒｉｔｏｎＸ−１００ １％
（ｗ／ｖ）を含むＴＳＢで再抽出し、懸濁を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００−塩類Ｃ
ｈＥ画分（ＴＳ）を得る為に４℃で１時間に渡り遠心した。この溶解−抽出法は
８０〜９０％の総ＣｈＥ活性を回収する。（Saezvaleroら、1993 ; Moral Naran
joら、1996）。
【００３０】ＡＣｈＥアッセイ及びタンパク質決定 ＡＣｈＥ活性をエルマンの改良ミクロアッセイ法（Saez-valeroら、1993 ）に
よい決定した。ＡＣｈＥ活性の一単位を２２℃でのｎモルアセチルコリンの加水
分解数／分として定義した。タンパク質濃度を標準としてウシ血清アルブミンに
よるビシンコニン酸法（Smith ら、1995）を用いて決定した。
【００３１】フェニルアガロースに対する疎水性相互作用クロマトグラフィー 両親媒性ＡＣｈＥ形態を疎水性形態から、先に記載した（Saez-valeroら、199
3 ）フェニルアガロースに対する疎水性相互作用クロマトグラフィーにより分離
した。ＣＳＦ（４つの異なる患者から得た４つの試料から留めた１０ml）をフェ
ニルアガロースのカラム（１０×１cm）に適用した。ＡＣｈＥの疎水性形態を含
む親水性画分（ＨＦ）を３０mlのＴＳＢで分離し、次いで結合した両親媒性イソ
型を含む両親媒性画分（ＡＦ）を２％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む
５０mMトリス−ＨＣｌ（ＴＢ、pH７．４）により分離した。高いＡＣｈＥ活性を
有す最大の画分を留め、Ultrafree-4 Centrifugal Filter Device Biomex 10kDa
濃縮器（Millipore Corporation, Bedford, MA, USA ）を用いて濃縮した。
【００３２】沈降解析 ＡＣｈＥの分子イソ型をベックマンＳＷ４０回転装置に於いて４℃で１８時間
に渡る連続ショ糖勾配（５〜２０％ ｗ／ｖ）中で×１５０００ｇでの超遠心に
より解析した。勾配液は０．５Ｍ ＮａＣｌ，５０mM ＭｇＣｌ2 及び０．５％
（ｗ／ｖ）Ｂｒｉｊ９７を含む１０mlの５０mMトリス−ＨＣｌ（pH７．４）を含
んだ。既知の沈降係数の酵素、ウシ肝臓カタラーゼ（１１．４Ｓ、Ｓ20,WＳｖｅ
ｄｂｅｒｇユニット）及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アルカリ性ホスファターゼ（
６．１Ｓ）を当該勾配中で、ＡＣｈＥイソ型の凡その沈降係数を決定する為に用
いた。軽い球状ＡＣｈＥイソ型Ｇ2 a及びＧ1 aの両方に対する、Ｇ4分子（Ｇ4 na＋
Ｇ4 a）の割合を反映したＡＣｈＥ種Ｇ4／（Ｇ2＋Ｇ1）の比率を決定した。ＡＣ
ｈＥの各分子形態の相対的な割合の見積りを、各ピーク下活性（Ｇ4 又はＧ2 ＋
Ｇ1 ）を加えて、相対的な百分率（回収率＞９５％）を計算することにより実行
した。
【００３３】ＡＣｈＥのレクチン結合解析 試料（０．３ml）をアガロース又はセファロース上に固定化されているセファ
ロース４Ｂ（コントロール）、ＣｏｎＡ、ＷＧＡ、ＲＣＡ120 、ＬＣＡ、ＤＢＡ
、ＵＥＡ1 、ＳＢＡ又はＰＮＡ ０．１ｍ（水和物体積）に添加した。酵素−レ
クチン混合物を穏当な混合をしながら４℃で一晩インキュベートした。結合及び
遊離ＡＣｈＥをＪＡ−２０回転装置を用いるベックマンＪ２−２１Ｍ／Ｅ遠心器
中で×１０００ｇで４℃１５分に渡り遠心し、未結合のＡＣｈＥを上清画分中で
アッセイした。レクチンインキュベーション中の未結合のＡＣｈＥの百分率を（
レクチンに対して未結合のＡＣｈＥ／セファロースに対して未結合のＡＣｈＥ）
×１００として計算した。Ｃ／Ｗ比率を公式に従い計算し、ＣｏｎＡインキュベ
ーションに於ける未結合のＡＣｈＥ活性をＷＧＡインキュベーションに於ける未
結合ＡＣｈＥ活性で除した。ＡＤＣＳＦ中で起こるＡＣｈＥ糖化に於ける特異的
な変化をこの比率が検出することが観察された。
【００３４】ＣＳＦ、ＡＣｈＥのレクチン結合性 ＡＣｈＥの糖化を検査する為に、１８人のコントロール及びＡＤの３０ケース
由来のＣＳＦ試料を、異なる糖を認識する様々な固定化レクチンと共にインキュ
ベートした。ＡＣｈＥはＣｏｎＡ、ＷＧＡ及びＬＣＡに対して強いが、ＲＣＡ12 0 、ＰＮＡ、ＤＢＡ、ＵＥＡ及びＳＢＡに対しては弱く結合し（表１）、大部分
の酵素は、末端のガラクトース、末端のＮ−アセチル−ガラクトサミン又はフコ
ースを欠くことが示唆されている。
【００３５】 ＡＤ群とコントロールとの間で、ＣｏｎＡ及びＷＧＡに対するＡＣｈＥの結合
に於いて小さいが有為な違いがある（表１）。ＡＤ ＣＳＦ中の未結合のＡＣｈ
Ｅの百分率がＣｏｎＡに対して増加し、そしてＷＧＡに対して減少したので、比
率（Ｃ／Ｗ＝〔ＣｏｎＡに対して結合しない％ＡＣｈＥ〕／〔ＷＧＡに対して結
合しない％ＡＣｈＥ〕）が決定され、２つの群に於ける重要な弁別が供された。
この方法を用いて、ＡＤ群に対する平均Ｃ／Ｗ比率は他のコントロール群、例え
ば分散斑のケース（非決定、ＤＰ）、及び他の神経学的及び神経精神医学的疾患
（ＮＤ）よりも有為に高いことが分かり（図２）実施例１の結果と矛盾がない。
ＡＤを確認したケースから３０個のＣＳＦ試料の２４試料はＣ／Ｗ＝０．９５の
切り捨て値を超える（図２）。１８個のコントロール由来の１試料、分散斑を伴
うケース由来の試料１／６及び他の神経学的疾患由来の試料の１／１４のみがこ
の値を超える。０．９５より低いＣ／Ｗ比率を有する６つのＡＤ試料はＣ／Ｗ比
率＞０．６０を持ち、値は非ＡＤ群のＣ／Ｗ平均より高い（コントロール＝０．
５３±０．１；ＤＰ＝０．４６±０．２；ＮＤ＝０．５３±０．１）。
【００３６】 Ｃ／Ｗ比率とＰＭＩの間で相関関係がないことを発見でき、ＡＤ群に於ける様
々なＣ／Ｗ比率はＰＭＩに於ける差によることが示唆される。更に、ＰＭＩとＡ
Ｄ（３３±６時間）及び非ＡＤ試料（４０±６時間）に於いて有為な差は無かっ
た。
【００３７】 ＣＳＦ試料を更に総ＡＣｈＥ活性に対して解析した（図２）。先に報じられた
（Appleyard ら、1983 ; Atackら、1988）、ＡＤを有する患者由来のＣＳＦはコ
ントロール（１５．８±２．９Ｕ／ml）又は他の疾患（１２．４±２．４Ｕ／ml
）より有為に低いＡＣｈＥ活性（６．５±０．８Ｕ／ml）を有した。しかし、Ｃ
／Ｗ比率はＣＳＦ中に於いて、ＡＣｈＥ活性の総レベル（図２）よりも更に信頼
できる臨床上の指標である。
【００３８】ＣＳＦ中のＡＣｈＥ情報 糖化に於ける変化がＡＣｈＥの特異的なイソ型に於ける変化によるものである
かどうかを決定する為に、両親媒性（Ｇa ）及び疎水性種（Ｇna）（図３）を分
離する疎水性相互作用クロマトグラフィー及び個々の分子量のイソ型（Ｇ4 ，Ｇ2 及びＧ1 ）（図３）を分離する０．５％（ｗ／ｖ）Ｂｒｊｉ９７中でのショ糖
密度勾配遠心によりＣＳＦ試料を解析した。コントロール（図４）に比較してＡ
ＤＣＳＦ中のＧ4 、ＡＣｈＥの割合の減少が確認された。（Ｇ4 ／（Ｇ2 ＋Ｇ1
））の比率（Ｐ＜０．０１）は、ＡＤケース（１．１６±０．１２；ｎ＝４）に
於いてより有為にコントロール（１．８０±０．１２；ｎ＝４）に於いて高かっ
た。両親媒性イソ型から親水性のイソ型を分離する為に、ＣＳＦをフェニルアガ
ロース上での疎水性相互作用クロマトグラフィーにより分画した（図３）。より
低い百分率のＡＣｈＥが、正常のＣＳＦ中で（１２±３％ ｎ＝４）フェニルア
ガロースに対し、ＡＤ ＣＳＦ中（３８±４％、ｎ＝４；Ｐ＜０．００１）より
も結合した。未結合の親水性画分（ＨＦ）の沈降解析が親水性４量体（Ｇ4 na ）
イソ型（Atack ら、1987）並びに少量のより軽いＡＣｈＥイソ型、５．１Ｓ二量
体及び４．３Ｓ単量体と一致して１０．８Ｓのメインピークを示した（図４）。
フェニルアガロースカラムからの結合した両親媒性画分は９．０〜９．５Ｓの小
さいピーク（多分両親媒性三量体、Ｇ4 a）及び両親媒性球状二量体（Ｇ2 a，４．
２Ｓ）並びに単量体（Ｇ1 a，３．１Ｓ）の大きなピークを含んだ。両親媒性の軽
いイソ型のレベルは、コントロールに於いてよりもＡＤ ＣＳＦに於いてより高
い（図４）。
【００３９】ＣＳＦ中での個々のＡＣｈＥイソ型の糖化 ＣｏｎＡ及びＷＧＡに固定化したＨＦ及びＡＦのインキュベーションは、ＡＤ
ＣＳＦに於いてＣ／Ｗ比率の増加があったこと、並びに高Ｃ／Ｗ比率は二量体及
び単量体を含む両親媒性断片に関連することを示した（図４）。ＡＤ ＣＳＦ中
のＧ2 及びＧ1 ＡＣｈＥの寄与はＡＤ ＣＳＦ中の総ＡＣｈＥのＣ／Ｗ比率の増
加に主に原因があったことをデータが示す。
【００４０】前頭皮質及び小脳に於けるＡＣｈＥのレベル ＡＣｈＥ糖化に於ける変化が、脳のＡＣｈＥイソ型の発現又は糖化に於ける変
化を反映しているかを決定する為に、前頭葉及び小脳の試料に於けるＡＣｈＥ活
性のレベルを検査した。可溶性及び膜結合型ＡＣｈＥイソ型を抽出する為に塩及
びＴｒｉｔｏｎＸ−１００によりサンプルをホモジナイズし、次いで、両画分中
でのＡＣｈＥ活性を決定した（表２）。ＡＤ患者由来の前頭皮質試料はコントロ
ールと比較して塩類可溶性画分（ＳＳ）に於けるレベルに差がなく、Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ−１００可溶性（ＴＳ）画分に於いて（４０％未満）有為にＡＣｈＥ活性の
減少を有した（表３）。主要なＧ4 イソ型はＴＳ画分に於いてのみ減少したこと
を示す従来の研究（Younkin ら、1986 ; Seik ら、1990）と矛盾しない。ＡＤ及
びＮＤ群の両方のＴＳ画分のタンパク質含有率に於いて、小さいがしかし有為な
減少（１５％未満）が又確認された。ＮＤ群の前頭皮質試料に於いてＡＣｈＥの
レベルはＳＳ及びＴＳ画分中でコントロールと有為に異なった。しかし、ＮＤ群
は不均質（前頭葉痴呆２、ハンティングトン病１及びパーキンソン病１）である
ので、ＡＣｈＥレベルに於ける変化の意義は不明確である。小脳に於けるＡＣｈ
Ｅのレベルは又、ＡＤ群由来のＴＳ画分に於いて有為に減少した（表２）。
【００４１】前頭皮質及び小脳に於けるＡＣｈＥの糖化 ＡＤＣＳＦ中のＡＣｈＥの様々な糖化パターンが又ＡＤ脳に於いて存在するか
を決定する為に、脳ＡＣｈＥの糖化をレクチンを結合させることにより検査した
。前頭皮質及び小脳由来のホモジネートをＣｏｎＡ又はＷＧＡに固定化してイン
キュベートし未結合の活性の量を計算した。ＡＤ前頭皮質中に於いて、ＣｏｎＡ
又はＷＧＡに対し結合しなかった％ＡＣｈＥ活性はコントロールを有為に異なっ
た（表３）。ＣＳＦ ＡＣｈＥと同様、前頭皮質ＡＣｈＥのＣ／Ｗ比率は非ＡＤ
試料に於いてよりもＡＤに於いてより高かった。この増加は、ＷＧＡに対して結
合しなかったＡＣｈＥの量の増加に関わらずＣｏｎＡに対し結合しなかったＡＣ
ｈＥの量の多大な増加による（表３）。ＤＰ及びＮＤ群に於けるＣ／Ｗ比率に於
ける増加はなかった（表３）。レクチンを結合することに於いて、小脳画分に於
けるＡＤ及び非ＡＤ群の間で差が見られなかった（表３）。
【００４２】前頭皮質及び小脳中のＡＣｈＥイソ型 ＡＤ脳に於いて変化した糖化の原因を決定する為に、前頭皮質及び小脳中のＡ
ＣｈＥイソ型のパターンを検査した。等量のＳＳ及びＳＴ上清（総ＡＣｈＥ活性
）のをプールし、次いで主要なＡＣｈＥイソ型を分離する為に０．５％（ｗ／ｖ
）Ｂｒｉｊ９７を伴うショ糖密度勾配沈降分離法により解析した（図５）。それ
らの沈降係数（Atack ら、1986 ; Massoulieら、1982）に基づいて、ＡＣｈＥの
親水性（Ｇna、１０．７±０．１Ｓ）及び両親媒性三量体（Ｇ4 a、８．６±０．
１Ｓ）及び両親媒性二量体（Ｇ2 a、４．７±０．１Ｓ）並びに単量体（Ｇ1 a、３
．０±０．１Ｓ）を同定可能であった（図６）。各群由来の個々のイソ型の沈降
係数（Ｓ）に於いて差はなかった。ＡＣｈＥＧ4 na 及びＧ4 aの間の沈降係数に於
けるオーバーラップにより、これら３つのイソ型を完全に分離することは不可能
である（図５）。しかし、Ｇ4 aの寄与はＧ4 na より大きかった。不斉（Ａ12）Ａ
ＣｈＥイソ型をいくつかの画分中僅少量（２〜５％）に於いて同定した。
【００４３】 ＡＤ前頭皮質由来の画分に於いて、Ｇ4 （平均コントロール値の４０％、Ｐ＜
０．００１）及びＧ2 ＋Ｇ、ＡＣｈＥ（平均コントロール値の６０％、Ｐ＝０．
００２）に於ける有為な減少が検出された。ＡＣｈＥの相対的な割合に於ける変
化は、ＡＤ試料中で有為により低いＧ4 ／（Ｇ2＋Ｇ1）比率に於いて反映された
。注目すべきは、ＤＰ患者に対するＧ4 ／（Ｇ2＋Ｇ1）比率に於いて有為な減少
が確認されたことであった。この比率の変化はＧ2＋Ｇ1のレベルの２５％の増加
及びＧ4 ＡＣｈＥに於ける僅かな減少（１０％）によるものだが、それ自体の変
化は統計的に有為である。ＴＳ画分（表２）中のＡＣｈＥに於ける（表２）及び
Ｇ4 ＡＣｈＥの総量（コントロール中の Ｇ4＝３８０±４０Ｕ／ml、ＡＤ中の
Ｇ4＝１９５±７０Ｕ／ml；Ｐ＝０．００８）に於ける統計的に有為な減少（４
０％）にも関わらずＡＤ小脳中でＡＣｈＥ Ｇ4／（Ｇ2＋Ｇ1）に於ける値の変化
は発見されなかった。
【００４４】前頭皮質及び小脳中の個々のＡＣｈＥイソ型の糖化 ＡＣｈＥの比率はＡＤ患者の前頭皮質中で変化することが分かったので脳ＡＣ
ｈＥのＣ／Ｗ比率に於ける増加は、ＡＣｈＥの糖化に於ける変化又は特異的形態
の発見によるものかどうかを確める為段階を行った。個々のＡＣｈＥイソ型をシ
ョ糖勾配遠心法により分離し、次いで、Ｇ4 又はＧ2＋Ｇ1ピーク由来の画分をプ
ールし限外ろ過により濃縮したＴＳＢ−ＴｒｉｔｏｎＸ−１００緩衝液に対して
透析した。次いで各イソ型をレクチン結合アッセイによりアッセイしＣ／Ｗ比率
を各イソ型に対して計算した（図５）。
【００４５】 ＡＤと非ＡＤ群の間のＧ4 ＡＣｈＥのＣ／Ｗ比率に於いて差は見られなかった
（図５）。しかし、全ての前頭葉皮質試料に於いて、Ｇ2＋Ｇ1画分はＣ／Ｗ比率
＞１．００を持ち、Ｇ2 又はＧ1 ＡＣｈＥはＧ4 イソ型と異なって糖化されてい
ることを示している。更に一層、Ｇ2＋Ｇ1に対するＣ／Ｗ比率はコントロール又
はＤＰに於いてよりもＡＤ群に於いてより高い。同様に、（主にＧ2＋Ｇ1 ＡＣ
ｈＥを含む）ＣＳＦ由来の両親媒性画分のＣ／Ｗ比率はコントロールに於いてよ
りもＡＤ群に於いてより高かった（図３）。前頭皮質に於いて、ＤＰ群に於ける
Ｇ4 ／（Ｇ2＋Ｇ1）及びＣ／Ｗ比率の間での相関関係はなかった。小脳に於いて
、ＡＤ及び非ＡＤ群の間のＧ4 ＡＣｈＥ又はＧ2＋Ｇ1ＡＣｈＥのＣ／Ｗ比率の差
は確認されなかった（図４）。ＡＤ及び非ＡＤ小脳群由来のＧ2＋Ｇ1画分は、両
方の脳領域の間の Ｇ2＋Ｇ1 ＡＣｈＥの糖化のパターンに於ける違いを示してい
る前頭皮質（Ｃ／Ｗ＞１．００）由来の同じ画分とは対照的に、Ｃ／Ｗ＜０．５
０を持つ。
【００４６】 ＡＣｈＥは、ＡＤ患者の前頭皮質及びＣＳＦ中で、非ＡＤ型の痴呆を伴う患者
等の非ＡＤ群由来のＡＣｈＥと比較して、様々に糖化されることをこの実施例が
示す。糖化に於ける差は、ＡＤ試料中の様々に糖化される両親媒性の二量体及び
単量体ＡＣｈＥの割合の増加によるものである。この結果は、ＡＤＣＳＦ中で異
常な糖化を受けたＡＣｈＥが脳に由来しうることを示唆し、なぜなら糖化に於け
る類似の差が、ＡＤ患者の前頭皮質に於いても又発見されたからである。
【表２】
【表３】
【表４】
【００４７】 以下の参照は参考として本明細書中に組み込まれた：
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【図面の簡単な説明】
【図１】 脳脊髄液中のＡＣｈＥ及びＢＣｈＥの間のレベルの相関関係を示す。（黒い四
角形＝コントロール、白抜き円＝ＡＤ） 類似の生化学的機構が、ＡＤＣＳＦ中の双方の酵素の活性に於ける減少に基づ
きうることを示唆するＡＣｈＥ及びＢＣｈＥのレベルの明らかな相関関係がある
ことをこの図で示す。
【図２】 ＣｏｎＡに対するＢＣｈＥ未結合百分率（％）に対するＡＣｈＥ Ｃ／Ｗ比率
のプロットである。この図はこれら解析対象の間で明らかな相関関係がないこと
を示す。この図は又両方の測定を組み合わせることにより、ＡＤとコントロール
群間の完全ほぼ完全な分離が示される。
【図３】 ＡＤ及びコントロール両方に対する、ＣｏｎＡに対するＢＣｈＥ未結合の百分
率のプロットである。この図はＢＣｈＥの糖化及び年齢の間の関連はないことを
示す。従って疾患の状態は相関関係のみある。
【図４】 ＡＤ及びコントロール群の完全な分離を示す総ＢＣｈＥ、Ｃ／Ｗ比率及びＣｏ
ｎＡに対する非結合ＢＣｈＥ未結合百分率（％）の３次元プロットである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 サエス−バレロ，ハビエル スペイン国，エー−03203 エチェ，セグ ンド ペセタ エー，カリェ アヨーラ， ３ Ｆターム(参考） 4B050 CC10 LL03 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ32 QR12 QR48 QR51 QR82 QS13 QS33

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 患者に於いてアルツハイマー病を診断する為の方法であり、 （１）前記患者由来の適切な生体流体の試料を用意し、 （２）前記試料に於いて変化した糖化のパターンを有するブチリルコリンエス
    テラーゼの存在を検出する段階を含んで成る方法。
  2. 【請求項２】 特異的な糖化のパターンを持つブチリルコリンエステラーゼ
    の総ブチリルコリンエステラーゼに対する相対的な割合が測定される請求項１記
    載の方法。
  3. 【請求項３】 ブチリルコリンエステラーゼの相対的な割合がレクチン結合
    解析を用いて測定される請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記レクチン結合解析がコンカナバリンＡに対するブチリル
    コリンエステラーゼ結合の測定を含む請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 未結合のブチリルコリンエステラーゼの活性が決定される請
    求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 （１）コンカナバリンＡに対して結合するアセチルコリンエ
    ステラーゼの割合を測定し、 （２）コムギ胚芽凝集素に対して結合するアセチルコリンエステラーゼの割合
    を測定し （３）コムギ胚芽凝集素に対して未結合のアセチルコリンエステラーゼに対し
    てコンカナバリンＡに対して未結合のアセチルコリンエステラーゼの比率を決定
    し （４）コンカナバリンＡに対して未結合のブチリルコリンエステラーゼの相対
    的な割合と前記比率とを比較する段階を更に含んで成る請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記比率がアルツハイマー病患者に於いて約０．９５超であ
    る請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】 総ブチリルコリンエステラーゼ活性が決定される請求項６記
    載の方法。
  9. 【請求項９】 コンカナバリンＡに対する未結合のブチリルコリンエステラ
    ーゼの割合が、総ブチリルコリンエステラーゼ活性及び、コムギ胚芽凝集素に対
    して未結合のアセチルコリンエステラーゼに対するコンカナバリンＡに対して未
    結合のアセチルコリンエステラーゼの比率に対してプロットされた請求項８記載
    の方法。
  10. 【請求項１０】 モノクローナル抗体が変化した糖化パターンを有するブチ
    リルコリンエステラーゼの存在を検出する為に用いられる請求項１記載の方法。
  11. 【請求項１１】 変化した糖化パターンを有するブチリルコリンエステラー
    ゼの異常なイソ型が検出される請求項１記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記試料が脳脊髄液流体、血液又は血しょうである請求項
    １記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記血液又は血しょうが解析の為の血液から調製される請
    求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記生体流体が血しょうであり、変化した糖化パターンを
    有するアセチルコリンエステラーゼの存在の解析の前にブチリルコリンエステラ
    ーゼが除去される請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 変化した糖化パターン及びコンカナバリンＡに対するより
    低い親和性並びに未変化の糖化パターンを持つブチリルコリンエステラーゼより
    コムギ胚芽凝集素に対してより高い親和性を有する、ブチリルコリンエステラー
    ゼの異常なイソ型。
  16. 【請求項１６】 変化した糖化パターン及びコンカナバリンＡに対する低い
    親和性並びに、変化した糖化パターンを持つブチリルコリンエステラーゼよりコ
    ムギ胚芽凝集素に対してより高い親和性を有する、ブチリルコリンエステラーゼ
    の異常なイソ型。
  17. 【請求項１７】 総ブチリルコリンエステラーゼに対するコンカナバリンＡ
    に対して未結合のブチリルコリンエステラーゼの比率が約８％以上である請求項
    ８記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記生体流体が血しょうであり、変化した糖化パターンを
    有するアセチルコリンエステラーゼの存在について解析の前にブチリルコリンエ
    ステラーゼが不活性化される請求項１５記載の方法。
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