JP2003529746A - 骨疾患の治療に有用な化合物を同定する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 骨質量減少に関連する骨疾患治療用物質を同定するためのスクリーニング法であって、該物質を、骨芽細胞における、Ｆｒａ−１発現の上方制御能力又はＦｒａ−１標的遺伝子発現の調節能力について試験し、該上方制御及び調節がインビボにおける骨形成の増加を引き起こすことを特徴とする方法。同定された骨誘導性化合物及び生物学的に活性なＦｒａ−１分子をコードするＤＮＡ分子は、骨質量の限局性又は全身性減少により特徴付けられる骨疾患の治療に使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、骨質量減少に関連する骨疾患の治療に関する。 骨形成、細胞外マトリックスの合成及び沈着は、骨の発達、構築（modeling）
、再構築及び修復に必須である。骨芽細胞、すなわち骨格の骨形成細胞型は、多
能性間充織幹細胞に由来する。骨芽細胞の分化及び増殖は、多数の細胞外因子、
例えばホルモン、増殖因子及びサイトカインなどにより調節することができる。
最近、転写因子Ｃｂｆａ−１が骨芽細胞分化に必須であることが明らかになった
（Banerjee等, 1997; Ducy等, 1997; Otto等, 1997; Komori等, 1997）。しかし
ながら、インビボにおいて骨形成を制御する分子メカニズムは、ほとんど理解さ
れていない。 活性化タンパク質（ＡＰ−１）は、Ｊｕｎ、Ｆｏｓ又はＡＴＦ（活性化転写因
子）ファミリーメンバーから構成される二量体転写因子である。ＡＰ−１は共通
ＤＮＡ部位であるＡＰ−１結合部位に結合し、細胞外シグナルを多数の細胞性及
びウイルス性遺伝子の転写における変化へと転換する（Angel 及び Karin, 1991
にて検討されている）。ＡＰ−１活性は、増殖因子、サイトカイン、腫瘍プロモ
ーター、発ガン物質及び特定の発癌遺伝子を含む種々のシグナルにより調節され
る。ＡＰ−１は、多数の生物学的プロセス、例えば細胞増殖、細胞分化及びアポ
トーシスなどにおいて関係している。しかしながら、インビボ及び組織培養細胞
におけるＡＰ−１機能の分析は、異なるＡＰ−１メンバーは、異なる標的遺伝子
を制御し、細胞型特異的態様において異なる生物学的機能を遂行することを示し
ている。 幾つかの証拠は、ＡＰ−１が骨芽細胞機能の制御に関与していることを示唆し
ている。コンセンサスＡＰ−１ ＤＮＡ結合部位は、骨芽細胞の増殖、分化並び
に細胞外マトリックスの形成及び分解の制御に関連する遺伝子、例えばアルカリ
ホスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、オステオカルシン、オステオポンチン並びに
マトリックスメタロプロテイナーゼ−１及び−１３遺伝子のプロモーター領域に
存在している（Owen等, 1990; Schule等, 1990; Guo等, 1995; Angel等, 1987;
Pendas等, 1997）。骨芽細胞の増殖及び分化についての多数の制御因子（トラン
スフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、副甲状腺ホルモン、成長ホルモン
及び１，２５−ジヒドロキシビタミンＤを含む）は、インビトロ及びインビボに
おいて骨芽細胞のＡＰ−１成分の発現を誘導する（Candeliere等, 1991; Slootw
eg等, 1991; Clohisy等, 1992; Machwate等, 1995; Koe等, 1997）。更に、ＡＰ
−１複合体の種々の成分は、インビトロにおける骨該細胞分化の間に差動的に発
現し、インビボにおける活性な骨形成部位において検出することができる（Dony
及び Gruss, 1987; Sandberg等, 1988; Smeyne等, 1992; McCabe等, 1995; McC
abe等, 1996）。

【０００２】 Ｆｒａ−１は、ｃ−Ｆｏｓに対して広範なアミノ酸ホモロジーを示す転写因子
のＡＰ−１ファミリーの１つのメンバーをコードする即時型遺伝子である（Cohe
n 及び Curran, 1988）。Ｆｒａ−１は、全てのＪｕｎタンパク質（ｃ−Ｊｕｎ
、ｊｕｎＢ、ｊｕｎＤ）とヘテロ二量体複合体を形成し、ＡＰ−１結合部位と相
互作用して遺伝子転写を制御する（Cohen等, 1989; Ryseck 及び Bravo, 1991;
Suzuki等, 1991）。ｃ−Ｆｏｓとは異なり、Ｆｒａ−１はＣ末端トランス活性化
ドメインを欠いている（Wisdom 及び Verma, 1993）。血清及びマイトジェンに
よる誘導に加えて、Ｆｒａ−１発現は、リンパ球活性化時並びにケラチノサイト
、精母細胞及び骨芽細胞の分化の間に制御される（McCabe等, 1995; McCabe等,
1996; Cohen 及び Curran, 1988; Cohen等, 1993; Welter 及び Eckert, 1995;
Gandarillas 及び Watt, 1995; Huo 及び Rothstein, 1996; Rutberg等, 1996)
。更に、骨芽細胞前駆細胞系におけるＦｒａ−１の異所的発現は、骨芽細胞の発
達を増強する（Owens等, 1999）。 限局性又は全身性の骨質量減少は、骨の強度を損ない、病的骨折に対する素因
となる。 局在型溶骨性病変の共通の原因は、転移性骨疾患、多発性骨髄腫及びリンパ腫
である。更に、限局性骨欠損は、多数の良性骨障害（特に、骨嚢胞、線維性骨異
形成、感染症、良性骨腫瘍及び損なわれた骨折治癒を含む）により引き起こされ
ることができる。これらの病変の現在の治療は、病理組織の外科的除去又は放射
線療法的破壊、骨折部の固定、移植片の安定化及び骨格欠損の再構築を含んでい
る。しかしながら、自家移植片又は骨欠損に近い同種移植骨を利用する現在の外
科的方法には制限がある。自家移植手順は、ドナーの部位の骨折及びドナー部位
の痛みを引き起こすことができ、利用可能な自家性の骨の量により制限される。
同種移植は、宿主において生物学的に不活性であり、かつ、免疫性及び感染性疾
患のリスクを有している。 対照的に、骨粗鬆症は、全体の骨格における低骨質量及び微小構造的劣化、結
果としての骨、特に主要な機械的力に付された骨の脆弱性及び骨折に対する感受
性の増加により特徴付けられる。

【０００３】 骨は、骨吸収及び骨形成の協調的発生を伴って生涯にわたって再構築される。
骨粗鬆症は、骨吸収速度が骨形成速度を上回り骨質量の進行的減少が起こる場合
に発達する。加齢及び生殖腺機能の喪失を含む、骨粗鬆症に対する多数の危険因
子が同定されている。更に、骨粗鬆症は、種々の内分泌疾患、血液疾患、胃腸疾
患及びリウマチ疾患と関連し、糖質コルチコイド、ヘパリン及び抗てんかん薬を
用いた治療の結果であることがある。骨粗鬆症の主要な臨床症状は椎体骨折であ
り、これは、背中の痛み及び脊椎の変形を導く。骨粗鬆症の診断は、骨質量の減
少に基づき、通常は骨塩量（bone mineral density）を測定することによって評
価される。エストロゲン、ビスホスホネート（bisphosphonate）及びカルシトニ
ンを含む、骨粗鬆症治療に使用する薬のほとんどは、骨吸収を減少させることに
より作用する。骨形成を効果的に刺激する治療法は利用可能ではない。フッ化ナ
トリウム療法は、骨塩量の大幅な増加を起こすが、骨折率に対する効果は小さい
。なぜなら、フッ化ナトリウムは、機械的強度が低い骨マトリックスの形成を刺
激するものだからである。 本発明の目的は、骨組織の限局性又は全身性減少に関連する骨疾患を患う個体
において、局所的又は全体的骨格における骨形成を増強することにより、患部の
骨の機械的特性を回復する、改良された治療法を提供することである。 骨形成を刺激することができる薬の投与に基づく治療学的アプローチを提供す
るために、骨形成の基礎をなす細胞メカニズム又は分子メカニズムを研究した。 インビボにおけるＦｒａ−１の異所的発現の結果について研究するために、骨
を含む広範囲の組織において高レベルのＦｒａ−１を発現するトランスジェニッ
クマウスを作成した。異所的Ｆｒａ−１発現は、骨芽細胞による骨形成を刺激し
、全骨格における骨質量の増加の発生を導くことが示された。更に、トランスジ
ェニック骨が増加した数の成熟骨芽細胞を含んでいたので、本発明の実験で得ら
れたデータは、構成的Ｆｒａ−１発現が骨芽細胞の増殖及び分化を促進すること
を示している。更に、トランスジェニックマウス由来の骨芽細胞は、インビトロ
で促進された分化過程を受けることが示された。このことは、Ｆｒａ−１がイン
ビボ及びインビトロで骨形成を正に制御することができることを示している。

【０００４】 骨質量の維持は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収とのバランス
に依存している。現在までに報告された骨質量が増加したマウスモデルの大部分
では、破骨細胞の分化又は機能のいずれかが欠損していることによる、骨吸収障
害が原因であり、これは大理石骨病を引き起こすものである（Johnson等, 1992;
Wang等, 1992; Grigoriadis等, 1994; Iotsova等, 1997; Simonet等, 1997; To
ndravi等, 1997; Saftig等, 1998; Kong等, 1999）。対照的に、本発明のマウス
モデル、すなわちｆｒａ−１トランスジェニックマウスは、破骨細胞による骨吸
収の減少ではなく、促進された骨芽細胞分化による骨形成の増加の結果として骨
質量増加を発生することが示された。幾つかの証拠がこの結論を支持している。
骨形成を測定する組織形態計測的パラメータは、ｆｒａ−１トランスジェニック
マウスにおいて増加した。移植実験は、骨の表現型の原因はトランスジェニック
骨芽細胞に存在し、それゆえ二次的効果、すなわちホルモン分泌の増加によるも
のではないことを示した。すなわち、トランスジェニック骨芽細胞及び野生型破
骨細胞により形成したキメラ骨は骨形成の増加を発生させたが、野生型骨芽細胞
及びトランスジェニック破骨細胞から構成される骨は、骨質量増加の組織学的特
徴を示さなかった。間接的証拠は、破骨細胞はトランスジェニックマウスに存在
していること及び破骨細胞はトランスジェニック及び野生型マウスにおいて骨表
面をかなりの程度覆っているとの観察結果により提供される。最終的に、トラン
スジェニック破骨細胞はインビトロで骨マトリックスを再吸収した。このことは
、吸収機能の低下は、トランスジェニック骨格における骨質量増加の原因ではな
いことを示している。 現在まで、転写因子による骨形成の制御は、分子レベルではほとんど理解され
ていなかった。Ｃｂｆａ−１は、胚発達の間における基本的機能を超えて、成体
マウスにおける骨細胞外マトリックスの沈着を制御する（Ducy等, 1999）。単一
の骨芽細胞のレベルで細胞外マトリックスの合成を制御するＣｂｆａ−１とは対
照的に、Ｆｒａ−１は、骨芽細胞表面及びミネラル化（mineralizing）表面に対
する組織形態計測的値の増加により示されるように、活性な骨芽細胞の数を増加
させると考えられる。対照的に、トランスジェニック及び野生型の大腿骨におい
て、ミネラル付加（apposition）速度及び類骨厚さ（osteoid thickness）は同
等であった。このことは、トランスジェニック骨芽細胞の骨形成活性はほとんど
変化しないことを示唆している。

【０００５】 インビトロにおける分化条件下、骨芽細胞は、骨芽細胞特異的遺伝子の一時的
発現により特徴付けられる定義された分化パターンを受ける。発明者等により、
トランスジェニック骨芽細胞培養が、ＡＬＰ活性及びミネラル化の促進された時
間経過を示すことが示されるだろう。このことは、Ｆｒａ−１発現が前駆細胞か
ら骨形成骨芽細胞への分化を促進することを示している。Ｆｒａ−１が骨芽細胞
分化を増強する分子メカニズムは知られていない。理論に束縛されることを望む
ものではないが、Ｆｒａ−１は、骨芽細胞の増殖因子受容体又は増殖因子の発現
を誘導することができるものと考える。候補となる因子は、ＴＧＦ−β１及びイ
ンシュリン様増殖因子−２である。両因子ともにインビトロ及びインビボでの骨
形成の正の制御因子であり、強力なＡＰ−１標的遺伝子であると考えられている
。なぜなら、両方の遺伝子の発現は、ＡＰ−１により誘導可能だからである（No
da 及び Camilliere, 1989; Joyce等, 1990; Kim等, 1990; Caricasole 及び Wa
rd, 1993）。標的破壊されたオステオカルシン遺伝子を保有するマウスは類似（
但し、程度は穏やか）の骨表現型を示し、このことは、Ｆｒａ−１がトランスジ
ェニック骨芽細胞においてオステオカルシンの発現を減少させることにより作用
するという可能性を高めている（Ducy等, 1996）。しかしながら、オステオカル
シン発現は、トランスジェニック及び野生型マウスの頭蓋冠においてわずかに増
加しただけであった。このことは、Ｆｒａ−１がオステオカルシンとは独立して
作用することを示唆している。代わりに、Ｆｒａ−１は、細胞周期の正の制御因
子を直接誘導し、骨芽細胞系内での増加した増殖を誘導することができるだろう
。興味深いことに、Ｆｒａ−１はｃ−Ｊｕｎと共に、線維芽細胞内のサイクリン
Ｄ１発現を上方制御することができる（Mechta等, 1997）。 骨芽細胞は、Ｆｒａ−１発現の上昇したレベルに対して高い感受性を示すこと
が示された。骨形成に対する刺激効果は、転写因子のＡＰ−１ファミリーのその
他のメンバーと比較してＦｒａ−１に対して特異的であると考えられる。骨組織
中で高レベルのＦｏｓＢ、Ｆｒａ−２、ｃ−Ｊｕｎ又はＪｕｎＢを発現するマウ
スは、骨格表現型を示さない（Grigoriadis等, 1993; McHenry等, 1998）。しか
しながら、ＡＰ−１因子のＦｏｓサブファミリーの別メンバーであるｃ−Ｆｏｓ
は、骨芽細胞系に対して同様の向性（tropism）を示す。トランスジェニックマ
ウスにおけるｃ−Ｆｏｓの過剰発現は、骨芽細胞の形質転換及び骨格骨肉腫の発
達を引き起こす（Grigoriadis等, 1993; Ruther等, 1989）。

【０００６】 したがって、Ｆｒａ−１は骨形成の正の制御因子であるという本発明の知見は
、骨質量が減少する又は骨形成が障害を受ける病理状態、例えば骨粗鬆症又は損
なわれた骨折治癒における、医薬的処置に対する標的としてＦｒａ−１を使用す
る基礎を提供する。 本発明の知見は、Ｆｒａ−１発現を上方制御する化合物、したがって、骨疾患
治療の骨誘導性（osteoinductive）薬剤候補である化合物を同定するためのアッ
セイの設計に利用することができる。 本発明は、骨質量の減少に関連する骨疾患を治療するための物質を同定する方
法であって、該物質を骨芽細胞中のＦｒａ−１又はＦｒａ−１標的遺伝子の発現
を調節する能力について試験し、該物質による上方制御又は調節がインビボにお
ける骨質量の増加を引き起こすことを特徴とする方法に向けられる。 第一の側面において、前記物質は、Ｆｒａ−１発現を上方制御する能力につい
て試験される。 本発明の一つの態様において、スクリーニング方法が提供される。前記方法は
、哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞に基づくものであり、該細胞中では、試験物
質とインキュベーションしたときにＦｒａ−１発現の誘導をモニターすることが
できる。 本発明のスクリーニング方法は、興味の対象となる遺伝子の発現を転写的に調
節する化合物を同定するための、当該技術分野において既知のアッセイ方法のタ
イプに基づいている。本発明の方法は、既知の方法、例えばWO 91/01379に記載
の方法にしたがい設計されかつ実行される。本発明の方法は、多数の化合物を試
験するための高処理フォーマットでの使用に十分に適している。 好ましい側面において、試験化合物とインキュベーションしたときのＦｒａ−
１発現の誘導は、ｆｒａ−１遺伝子の制御配列の制御下でのリポーター遺伝子の
発現を測定することによりモニターされる。ラット及びマウスのｆｒａ−１遺伝
子の制御領域は既知であり、当業者は容易に入手可能である（Bergers等, 1995;
Schreiber等, 1997）。これらの制御領域は、５’領域の遺伝子内配列を含み、
ｆｒａ−１遺伝子の第一エクソン及び第一イントロンの配列を含んでいる。リポ
ーター遺伝子構築物に対して適切な制御領域の例は、５’フランキング配列、エ
クソン１及びイントロン１の５’半分を保有しているラットｆｒａ−１遺伝子の
５．５ｋｂ断片である。代わりに、ｆｒａ−１遺伝子の５’フランキング配列、
エクソン１及びイントロン１の一部を含む１．６ｋｂ ＳａｃＩ断片を使用して
もよい（Bergers等, 1995）。

【０００７】 好ましくは、ヒトｆｒａ−１遺伝子の制御領域を用いる。ｆｒａ−１遺伝子の
マウス及びラット配列に基づき、ヒトｆｒａ−１ゲノムＤＮＡを、慣用技術、例
えばラット又はマウスｆｒａ−１プローブを用いたヒトゲノムライブラリーのス
クリーニングによりクローニングすることができ、クローニングされた遺伝子か
ら制御配列を得ることができる。 ｆｒａ−１制御配列を使用する代わりに、ｆｒａ−１標的遺伝子の制御配列を
使用してもよい。Ｆｒａ−１標的遺伝子、すなわち、Ｆｒａ−１の発現により発
現が調節される遺伝子は、下記の通りにして同定することができる。その制御配
列がスクリーニングアッセイにおける使用に有用である標的遺伝子は、ｆｒａ−
１様であり、骨形成に対して刺激効果を示す遺伝子である。骨形成に対するＦｒ
ａ−１の効果が、興味の対象となるＦｒａ−１標的遺伝子の下方制御によるもの
である場合、当該標的遺伝子の制御配列の制御下でのリポーター遺伝子の減少し
た発現を決定することにより、前記のアッセイを、各Ｆｒａ−１標的遺伝子を下
方制御する物質を同定するために使用することができる。 好ましい態様において、本発明の方法は、以下の通りに行われる。 第一工程において、適切な試験細胞、すなわち、組織培養中で容易に増殖する
ことができ、かつ、当該細胞中のリポーター遺伝子の活性化を測定することがで
きる細胞を選択する。好ましい態様において、一次（primary）骨芽細胞を試験
細胞として使用する。一次骨芽細胞は、当該技術分野で利用可能な方法、例えば
実施例４に記載の方法により得ることができる。代わりに、骨肉腫細胞系及び骨
芽細胞様細胞系、例えばＭＣ ３Ｔ３−Ｅ１細胞を使用してもよい。細胞系につ
いての更なる例は、Ｓａｏｓ−２（ヒト、ATCC HTB-85）、Ｕ−２ＯＳ（ヒト、A
TTC HTB-96）、ＵＭＲ−１０６又は１０８（ラット、ATTC CRL-1661 又は ATTC
CRL-1663）である。原則として、Ｆｒａ−１の発現を誘導することができるその
他全ての細胞型、例えば線維芽細胞又はＰＣ１２（ラット、フェオクロモサイト
ーマ（pheochromoytoma））細胞を使用してもよい。しかしながら、前記の細胞
中で同定された化合物の誘導作用は、骨芽細胞中で確認する必要がある。したが
って、骨芽細胞に密接に関連する細胞を使用したスクリーニングが好ましい。

【０００８】 試験細胞は、既知の方法によりリポーター遺伝子に融合したｆｒａ−１遺伝子
の制御領域、好ましくは最小のプロモーター、例えばＳＶ４０、β−グロビン又
はＴＫ最小プロモーター配列と組み合わせた制御領域を含む組替えＤＮＡ分子を
用いた慣用技術により適切にトランスフェクトされる。リポーター遺伝子として
は、その発現産物が当該産物濃度に比例したシグナルを測定することにより検出
可能であり、かつ、検出及び定量することができる全ての遺伝子が使用されるだ
ろう。好ましくは、自動化アッセイにおいては、高感度のリポーター遺伝子が用
いられる。好ましいリポーター遺伝子の例は、ルシフェラーゼ遺伝子（De Wet等
, 1987）、緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Kallunki等, 1994）及びｌａｃＺ遺伝子
である。細胞を、マイクロタイターアッセイプレートの適切な培地中で増殖させ
、試験する物質と共にインキュベートする。所望の効果、すなわちＦｒａ−１発
現の誘導を示す物質は、当該試験物質が存在しない同一条件下でインキュベート
した同一の対照細胞と比較して、リポーター活性を上方制御させることが予想さ
れる。 特異性対照については、対照細胞を、試験細胞と同一条件下で試験物質と共に
インキュベートする。対照細胞は、そのリポーター遺伝子構築物中にｆｒａ−１
制御要素を欠いているが、その他は試験細胞と同一である。薬候補として選択さ
れる物質は、ｆｒａ−１構築物を有する細胞でのみリポーター遺伝子発現の増加
を引き起こす物質である（試験細胞中で最小プロモーター配列を使用する場合、
対照細胞中のリポーター遺伝子は、当該最小プロモーター配列によってのみ駆動
する）。 代わりの特異性対照では、細胞型は試験細胞と同一又は異なっており、ｆｒａ
−１制御要素とは異なる転写制御単位の制御下にあるリポーター遺伝子を含んで
いる細胞を使用する。ｆｒａ−１試験細胞中のリポーター遺伝子発現の増加を示
す試験物質は、前記の対照細胞におけるリポーター遺伝子発現の増加を誘導する
ものであってはならない。 アッセイを、所望の治療効果を達成するために化合物によって下方制御される
必要があるＦｒａ−１標的遺伝子へ適用する場合、当該治療効果は、当該物質と
とインキュベートしたときのリポーター遺伝子発現の減少により反映される。

【０００９】 アッセイを最適化するために、一連の実験において、試験細胞を、培養細胞中
のＦｒａ−１発現を誘導することが知られている物質、例えばフェノール系酸化
防止剤ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（Yoshioka等, 1995）と共に、変化させた
アッセイ条件下でインキュベートし、リポーター遺伝子発現を測定する。 一次スクリーニングにおいて同定された物質を更に評価するために、Ｆｒａ−
１過剰発現と関連する生物学的効果の決定に基づく二次スクリーニングを行って
もよい。既知の生物学的効果の例は、インビトロにおける足場依存性増殖、イン
ビトロにおける浸潤性増殖及び細胞の運動性である。これらの効果を測定するア
ッセイは、Bergers等, 1995 及び Kustikova等, 1998に記載されている。 次の工程において、化合物を、その骨誘導活性、すなわちインビトロにおける
骨芽細胞の分化及び増殖を促進させる能力及び／又は動物モデル、例えばマウス
を使用することによりインビボで骨形成を増加させる能力について試験するだろ
う。 本発明の方法により薬候補として同定された化合物の毒性及び治療効果は、標
準的な薬学的手順（ＩＣ₅₀、ＬＤ₅₀、ＥＤ₅₀を決定するための細胞培養及び動物
実験の実施を含む）により決定することができる。得られたデータは、ヒトの投
与量範囲を決定するために使用する。ヒトの投与量範囲は剤型（錠剤、カプセル
剤、エアロゾル噴霧剤、アンプル剤など）及び投与経路（経口投与、頬側内投与
、経鼻投与、非経口投与又は直腸投与）にも依存するだろう。活性成分として前
記化合物を含む医薬組成物は、慣習的な方法において、少なくとも生理学的に活
性な担体及び賦形剤を使用して製剤化することができる。前記の製剤を製造する
方法は、マニュアル、例えば「Remington Pharmaceutical Sciences」に見出す
ことができる。本発明により同定された化合物の製剤化に有用な成分の例は、WO
99/18193に見出される。 骨誘導性低分子量化合物又はｆｒａ−１ ＤＮＡ分子は、前述の骨質量減少に
関連する限局性又は全身性骨疾患の治療に使用することができる。 骨粗鬆症について、治療戦略は、適切な対照群と比較して正常な骨質量が回復
するまで、骨誘導性薬を用いた治療を含んでいる。骨質量は、骨塩量を決定する
ことにより評価することができる。次いで、前記の治療は、行き過ぎた骨形成に
より可能性のある副作用を回避するために骨損失を予防する確立された治療法へ
切り替えることができる。

【００１０】 限局性骨疾患について、有望な治療学的アプローチは、骨移植片を病変部へ置
き、骨形成を増強するためにｆｒａ−１ ＤＮＡを局所的に投与することであろ
う。 本発明の方法により薬候補として同定された物質の毒性及び治療効果は、標準
的な薬学的手順（ＩＣ₅₀、ＬＤ₅₀、ＥＤ₅₀を決定するための細胞培養及び動物実
験の実施を含む）により決定することができる。得られたデータは、ヒトの投与
量範囲を決定するために使用する。ヒトの投与量範囲は剤型（錠剤、カプセル剤
、エアロゾル噴霧剤、アンプル剤など）及び投与経路（経口投与、頬側内投与、
経鼻投与、非経口投与又は直腸投与）にも依存するだろう。活性成分として前記
化合物を含む医薬組成物は、慣習的な方法において、少なくとも生理学的に活性
な担体及び賦形剤を使用して製剤化することができる。前記の製剤を製造する方
法は、マニュアル、例えば「Remington Pharmaceutical Sciences」に見出すこ
とができる。本発明により同定された化合物の製剤化に有用な成分の例は、WO 9
9/18193に見出される。 更なる態様において、本発明は、治療、特に骨疾患治療のためのｆｒａ−１
ＤＮＡに関する。この態様において、ＤＮＡは、体細胞遺伝子治療について知ら
れている方法により使用される。 「Ｆｒａ−１ ＤＮＡ」は、骨芽細胞中で発現したときに骨形成の増加を誘導
する能力を有するＦｒａ−１又はその断片をコードするＤＮＡ分子を表わす。Ｄ
ＮＡは、全体のｆｒａ−１ ｃＤＮＡ又はゲノムｆｒａ−１ ＤＮＡであり、そ
の断片又は変異体であり、好ましくはヒト起源であろう。遺伝子治療アプローチ
に使用するＤＮＡ分子の有効性を決定するために、候補（例えば全ｆｒａ−１
ｃＤＮＡ及びそれの種々の断片又は変異体）を、標的細胞（すなわち骨芽細胞）
へ、当該技術分野において既知のウイルス性又は非ウイルス性遺伝子導入法によ
り導入する。ウイルス性遺伝子導入ベクターの例は、レトロウイルス又はアデノ
ウイルスベクターである。試験する配列を、構成的又は誘導可能なプロモーター
の制御下、前記のベクターへ挿入する。このようにして遺伝子的に修飾された細
胞を、分化条件下で培養し（実施例４参照）、所望の生物学的効果を、分化の時
間経過及びインビトロで形成したミネラル化細胞外マトリックスの量をモニター
することにより決定する。

【００１１】 ヒトの治療のためには、生物学的に活性なＦｒａ−１をコードするＤＮＡを、
ウイルス性又は非ウイルス性遺伝子治療適用経路により送達し、骨芽細胞中での
Ｆｒａ−１の構成的又は誘導可能な発現を、十分なＦｒａ−１発現、したがって
所望の治療効果を達成するレベルで達成する。遺伝子治療の例は、レトロウイル
ス又はアデノウイルスベクターの使用である。ｆｒａ−１ ＤＮＡ分子を、強力
なプロモーターの制御下、前記のベクターへ挿入する。骨芽細胞をＦｒａ−１発
現の標的とするために、オステオカルシン遺伝子のプロモーターを使用すること
ができる（Hou等, 1999）。ｆｒａ−１ ＤＮＡは、例えば、骨粗鬆症治療の場
合は全身的に投与され、限局的骨欠損の場合は当該欠損部への適用により局所的
に投与されるだろう。 本発明の更なる態様では、骨芽細胞中でＦｒａ−１を構成的に発現するトラン
スジェニック動物、好ましくはマウスが提供される（ｆｒａ−１トランスジェニ
ック動物）。 これらのマウスは、トランスジェニック動物作成のための標準技術、例えばマ
ウスゲノムｆｒａ−１配列を含むｆｒａ−１導入遺伝子を１つの細胞胚の前核へ
マイクロインジェクションすることにより得ることができる（Hogan, 1994）。 本発明のｆｒａ−１トランスジェニックマウスを使用して、骨形成又はその他
の生物学的過程の間にＦｒａ−１により制御される標的遺伝子を同定することが
できる。ｆｒａ−１トランスジェニックマウス及び野生型対照マウスから一次細
胞、例えば骨芽細胞を単離し、インビトロで分化させる。タンパク質レベルにお
けるＲＮＡの差異は、差動的な遺伝子転写及び／又はタンパク質発現について当
該技術分野で既知の標準的方法、例えば差動的ディスプレイＲＴ−ＰＣＲ分析（
Liang 及び Pardee, 1992; Bauer等,1993）、ＤＮＡマイクロアレイ技術（DeRis
i等, 1997; Schena等, 1995; Wodicka等, 1997; Ramsay, 1998）、サブトラクテ
ィブ（subtractive）ハイブリダイゼーション（Diatchenko等, 1996; Hubank 及
び Schatz, 1994）又はプロテオーム解析（Pennington等, 1997; Pasquali等, 1
997）により決定される。 本発明は、Ｆｒａ−１がインビボでの骨形成における正の制御因子であること
の最初の遺伝子的証拠を提供する。Ｆｒａ−１過剰発現は生命維持に必要な生理
学的機能に干渉しないと考えられるので、Ｆｒａ−１発現又はＦｒａ−１自体を
誘導する薬は、骨質量減少又は損なわれた骨形成により特徴付けられる疾患、例
えば骨粗鬆症及び損なわれた骨折治癒の治療に使用されるだろう。

【００１２】実施例１ Ｆｒａ−１過剰発現トランスジェニックマウスの作成 インビボにおけるＦｒａ−１の役割を研究するために、広範囲の器官でＦｒａ
−１を過剰発現するマウスを作成した。トランスジェニックベクター（Ｈ２−ｆ
ｒａ−１ＬＴＲ）は、マウスＭＨＣクラスＩ Ｈ２−Ｋ^bプロモーター（H2; Mor
ello等, 1986）に融合したマウスｆｒａ−１遺伝子及び当該ｆｒａ−１遺伝子の
３’末端に連結されたＦＢＪ−ＭＳＶウイルスの３’ＬＴＲから構成された。こ
のベクターは、既述（Grigoriadis等, 1993）のＨ２−ｃ−ｆｏｓＬＴＲ（ｐ１
２８／１）に基づいて構築した。Ｈ２−ｃ−ｆｏｓＬＴＲベクターのＳａｌＩ断
片を、オープンリーディングフレーム全体をコードする全４つのエキソンを含む
マウスゲノムｆｒａ−１配列により置換した（Schreiber等, 1997）。１２ｋｂ
の導入遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩによる消化により遊離させ、標準的技術（Hogan,
1994）を使用して１つの細胞胚の前核（C57BL/6 x CBA F1）へマイクロインジ
ェクションした。トランスジェニック子孫は、サザンブロッティングにより同定
した。全４頭の創始（founder）雄を入手した。創始雄をC57/Bl6 x CBA F1雌と
交尾させて系統を確立した。トランスジェニック子孫は、以下のプライマー（１
．２ｋｂのＰＣＲ産物を生成）を使用したテール（tail）ＤＮＡのＰＣＲ分析に
より同定した。 5'-CGA TCA CCA AGA ACC AAT CAG-3' （配列番号１） 5'-GGG ATT AAA TGC ATG CCT AGC T-3' （配列番号２） ４頭の創始雄うち１頭が、ｆｒａ−１導入遺伝子を子孫へ伝達した（図１ｃ）
。 トランスジェニックマウスにおけるｆｒａ−１の発現を分析するために、３週
齢マウスの種々の器官から抽出したＲＮＡを、内在性及び外来性ｆｒａ−１転写
物を検出するプローブを使用したＲＮａｓｅ保護アッセイにより研究した。全Ｒ
ＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（GIBCO-BRL）を製造者の指示にしたがい使用して単
離した。ＲＮＡを、³²Ｐ標識アンチセンス転写物と、６０℃で一晩ハイブリダイ
ズさせ、続いてＲＮａｓｅＡ及びＲＮａｓｅＴ１で消化した。保護された断片を
、８％ポリアクリルアミドゲル／尿素ゲル中で分離し、一晩暴露した。２２３ｂ
ｐ断片を保護する、エクソン３及び４に対応するｆｒａ−１プローブを使用した
。対照のＳ１６プローブは、９０ｂｐの保護されたバンドを生成した。トランス
ジェニックｆｒａ−１は、トランスジェニックマウスの脾臓、心臓、肺、腎臓及
び精巣において高レベルで検出された（図１ｄ）。低レベルの発現は、肝臓、胸
腺、脳及び長骨において見出された。内在性ｆｒａ−１転写物は、野生型の精巣
において検出された。出生時、Ｆｒａ−１トランスジェニックマウスと野生型同
腹仔とは区別することができなかった。しかし、４週齢から、トランスジェニッ
クマウスは野生型同腹仔と同様に迅速に成長しなくなった。 図１は、ｆｒａ−１トランスジェニックマウスの作成を示している。（ａ）ｆ
ｒａ−１導入遺伝子の図式的表示である。Ｐは、下記（ｄ）に示されるＲＮａｓ
ｅ保護アッセイに使用したプローブである。（ｂ）４月齢のトランスジェニック
マウス（Ｔｇ）及び野生型同腹仔（ｗｔ）を示す。矢印は、脊髄後弯症を示して
いる。（ｃ）ｆｒａ−１トランスジェニック創始者のサザンブロット分析を示し
ている。三角印は、導入遺伝子をその子孫へ伝達した創始者を示している。（ｄ
）ＲＮａｓｅ保護アッセイにより分析した、３週齢の野生型及びトランスジェニ
ック^*マウスの種々の器官におけるＦｒａ−１の発現を示している。ｓｐ：膵臓
、ｌｉ：肝臓、ｔｈｙ：胸腺、ｈｅ：心臓、ｌｕ：肺、ｔｅ：精巣、ｋｉ：腎臓
、ｂｒ：脳。

【００１３】実施例２ Ｆｒａ−１トランスジェニックマウスは増加した骨形成を示す 加齢の進行に伴い、トランスジェニックマウスは、骨格異常を示す脊柱後弯症
を発達させた（図１ｂ）。全身Ｘ線撮影により、長骨の遠心端及び近位端、椎体
、肋骨及び頭蓋骨の放射線濃度の増加が明らかになった。トランスジェニック長
骨のマイクロラジオグラフィー分析及び組織学的分析により、皮層厚さの増加、
骨柵状織（trabecular）の数及び大きさの増大、細胞外マトリックスの顕著な沈
着の表示が明らかになった（図２）。厚さの増加を示した頭蓋冠において、骨髄
腔（space）は、骨沈着物により痕跡が消された。トランスジェニック骨柵状織
の表面は、立方形骨芽細胞により大部分が覆われていた。このことは、機能的な
活性を示している。骨芽細胞はしばしばクラスターを形成した。このことは、骨
芽細胞コンパートメントの拡大を示唆している。酒石酸塩耐性酸性ホスファター
ゼ（ＴＲＡＰ）についての組織化学的染色により、野生型及びトランスジェニッ
ク型の骨の両方において骨芽細胞の存在が明らかになった。野生型及びトランス
ジェニック骨の骨マトリックスは均一にミネラル化されており、軟骨残遺物は観
察されなかった。トランスジェニックマウスにおいて、放射線学的及び組織学的
異常は、加齢に伴う急速な進行と共に４週齢において最初に明らかになった。骨
格のパターン化又は歯のエラプション（erruption）における異常は観察されな
かった。骨端部プレートの構造、長軸方向の骨成長の部位は正常であった。骨マ
トリックスの進行的沈着にもかかわらず、トランスジェニック及び野生型同腹仔
マウスは、１０週齢において、カルシウム、リン及びアルカリホスファターゼに
ついて同等の血清レベルを示した。しかしながら、トランスジェニックマウスは
、脾腫及び正色素性貧血を患った。このことは、延髄外造血が骨髄腔の損失を部
分的にのみ補償することを示唆している。対照的に、末梢血におけるリンパ球、
血小板、顆粒球又は単球の数に有意な変化はなかった。

【００１４】 トランスジェニックマウスの骨質量増加進展の原因となる細胞メカニズムを理
解するために、静的及び動的な組織形態計測的分析を、８週齢マウスの大腿骨幹
端（metaphyses）について行った。柵状織の骨容量は、トランスジェニックマウ
スにおいて、野生型同腹仔と比較して４倍を超えていた（図３ａ）。新たに形成
した骨マトリックスの量、すなわち類骨容量及び類骨表面を測定する組織形態計
測的パラメータは、トランスジェニックマウスにおいて増加した（図３ｂ）。骨
芽細胞表面は、トランスジェニック骨において２倍増加した。一方、破骨細胞の
数は、野生型及びトランスジェニックマウスにおいて同等であった（図３ｃ、３
ｄ）。骨表面のミネラル化及び骨形成を含む骨形成を定量化する動的組織形態計
測的パラメータは、トランスジェニックマウスにおいて有意に高かった（図３ｅ
、３ｇ）。対照的に、ミネラル付加速度は、わずかに増加しただけであり、類骨
厚さにおいて差異はなかった（図３ｆ）。これらの結果は、トランスジェニック
マウスにおいて観察された骨質量増加は、骨吸収の減少ではなく骨形成の増加に
よるものであることを示している。 図２は、８週齢の野生型及びトランスジェニックマウスの長骨の縦断面及び横
断面のマイクロラジオグラフィーを示している。トランスジェニック大腿骨にお
いて、骨幹端におけるミネラル化骨柵状織（白色）の数及び大きさ並びに中骨幹
皮層（mid-diaphyseal cortex）の厚さは増加した。 図３は、組織形態計測分析の結果を示している。組織形態計測分析は、それぞ
れ犠牲にする１０日及び７日前にテトラサイクリン（２５ｍｇ／ｋｇ体重）及び
カルセイン（２５ｍｇ／ｋｇ体重）を用いて蛍光色素標識した後の８週齢のトラ
ンスジェニックマウス（ｎ＝８）及び野生型マウス（ｎ＝６）の大腿骨について
行った。大腿骨を、７．５％ホルムアルデヒド／７５％エタノール中で一晩固定
し、メチルメタクリレート中に脱灰せずに包埋した。組織形態計測測定は、３６
の試験ポイントを有するメルツグリッド（計数線）を拡大率×２００用いて、パ
ラゴン染色基底切片（５０μｍ）又はＴＲＡＰ染色パラフィン切片（５μｍ）に
ついて行った（Merz 及び Schenk, 1970）。柵状織骨についてのパラメータは、
大腿骨の遠位骨幹端において、成長プレート近くの長さ０．５〜１．１ｍｍの領
域において測定した。組織形態計測パラメータは、推奨される命名法に従う（Pa
rfitt等, 1987）。学生実験を用いて、差異の統計学的有意性を試験した。デー
タは、平均及び標準偏差で示した。ＢＶ：骨容量、ＴＶ：組織容量、ＢＳ：骨面
積。（＊）野生型群及びトランスジェニック群の間の統計学的に有意な差異；学
生実験によるｐ＜０．０１。

【００１５】実施例３ 骨形成の増加は、ｆｒａ−１トランスジェニック骨芽細胞の細胞自律性表現型に よるものである 骨形成の増加は、骨芽細胞系に固有の表現型によるものであるか否かを試験す
るために、組織組替え実験を行った。１３．０〜１３．５日の胎仔に由来する大
腿骨を、周囲組織から切除し、同系成体マウスの腎小体下へ移植した（Kratochw
il等, 1989）。この移植段階において、胎仔の大腿骨は、間充織細胞により形成
された骨テンプレート（bone template）から構成されている。宿主において、
移植された骨芽細胞はキメラ骨へと発達し、骨芽細胞及び軟骨細胞を含む全ての
間充織由来細胞型はドナーに由来し、一方、破骨細胞を含む全ての造血性細胞は
宿主由来であった。移植片を移植６週後に集め、脱灰し、組織学により分析した
。野生型及びトランスジェニック型の肢原基痕跡（limb rudiments）は、成体大
腿骨に類似する長骨へと発達した。多数のワイドボーン（wide bone）柵状織が
、レシピエントの遺伝子型に関係のなくトランスジェニック移植片の骨幹端域に
おいて観察された。このことは、骨質量の増加を示している（図４ｂ、４ｄ）。
対照的に、トランスジェニック又は野生型レシピエントへ移された野生型胎仔性
肢は、骨質量増加の組織学的徴候を示さなかった（図４ａ、４ｃ）。 図４は、移植された野生型及びｆｒａ−１トランスジェニック大腿骨における
骨の発達を示している。胚性の１３．０〜１３．５日の胎仔の大腿骨原基痕跡を
、示された表現型の成体レシピエントの腎小体下へ移植した。移植片を６週後に
集め、組織学により分析した。ｂｍ：骨髄、ｇｐ：成長プレート、白色矢印：骨
柵状織（トリクロム染色）。 骨形成の増加がｆｒａ−１の過剰発現に特異的なものであるか否かを更に調査
するために、実施例４に記載されるようにして調製した野生型一次骨芽細胞を、
Ｆｒａ−１の構成的発現を駆動するレトロウイルスベクターで感染させた（Owen
s等, 1999）。分化条件（実施例４参照）下で培養したときに、ｆｒａ−１感染
骨芽細胞は、空ベクター感染細胞と比較してより多くのミネラル化細胞外マトリ
ックスを発達させた。このことは、骨形成増加は、Ｆｒａ−１の過剰発現に特異
的であることを示している。

【００１６】実施例４ ｆｒａ−１トランスジェニック骨芽細胞の促進された分化 骨形成の増加を導く分子メカニズムを研究するために、骨芽細胞マーカーの発
現を、４週齢のトランスジェニックマウスの頭蓋冠についてのノーザンブロット
分析により研究した。全ＲＮＡは、トリゾール（Trizol）試薬（GIBCO-BRL）を
製造者の指示に従って用いて単離し、ノーザンブロット分析は、既報（Grigoria
dis等, 1993）に記載されているようにして行った。トランスジェニックｆｒａ
−１は、トランスジェニックでは強く発現したが、野生型頭蓋冠では存在しなか
った（図５ａ）。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、オステオポンチン及びオ
ステオカルシンの発現レベルは、野生型対照と比較してトランスジェニック頭蓋
冠において穏やかな増加を示した。 骨芽細胞におけるＦｒａ−１発現結果を更に研究するために、一次骨芽細胞を
、新生仔（６〜８日齢）マウスの頭蓋冠から調製し、インビトロで分化させた。
頭蓋冠を、０．１％コラゲナーゼ及び０．２％ディスパーゼ（dispase）を含む
α−ＭＥＭ中で１０分間連続的に消化した。画分２〜５により単離した細胞を、
造骨細胞集団として組み合わせ、１０％ＦＣＳを有するα−ＭＥＭ中で２日間発
達させ、１０⁴／ｃｍ²の密度で再培養（replate）した。集密に達した後、培地
に５ｍＭ β−グリセロホスフェート及び１００μｇ／ｍｌアスコルビン酸を補
充した。野生型及びトランスジェニック骨芽細胞の増殖に差異はなかった。分化
の時間経過は、ＡＬＰ活性に続き、更に、ミネラル化細胞外マトリックスの沈着
へ続いた。ＡＬＰ活性測定のために、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中で超音波処理した。溶解液中のＡＬＰ活性を
、比色アッセイ（Sigma）を使用して測定した。ミネラル化細胞外マトリックス
の塊（nodule）を、アリザリンレッド染色（Sigma）により形態学的に同定した
。ＡＬＰ活性は、野生型培養と比較してトランスジェニックにおいて迅速に増加
し、高レベルに達した（図５ｂ）。トランスジェニック培養において、アリザリ
ンレッドＳ染色によりモニターしたミネラル化細胞外マトリックス領域は、１２
日目に最初に観察された。このとき、野生型培養に染色領域は存在しなかった（
図５ｄ）。トランスジェニック培養は、１４日目、１６日目及び１８日目におい
て多量のミネラル化マトリックスを一貫して示した。２０日目及び２４日目の間
の後では、野生型及びトランスジェニック培養の両方における染色領域は同様の
大きさであった。

【００１７】 トランスジェニック骨芽細胞におけるｆｒａ−１及び骨芽細胞マーカーの発現
を更に研究するために、内在性及び外来性のｆｒａ−１に特異的なプライマー対
並びにｃｂｆａ−１、Ｉ型コラーゲン及びオステオポンチンに特異的なプライマ
ー対を使用して、プレーティング７日後の非刺激骨芽細胞培養についてＲＴ−Ｐ
ＣＲ分析を行った。全ＲＮＡは、トリゾール試薬（GIBCO-BRL）を製造者の指示
に従って用いて単離した。ＲＴ−ＰＣＲ分析のために、全ＲＮＡを、SuperScrip
t逆転写酵素をオリゴ（ｄＴ）プライマー（GIBCO-BRL）と共に用いて逆転写した
。ｃＤＮＡの増幅は、以下の特異的プライマーを使用して行った。 内在性ｆｒａ−１について 5'- GTA CCG AGA CTA CGG GGA ACC GG -3' （配列番号３）及び、 5'- TGG CTT GGA GTA GCA CCA GCA AGG -3' （配列番号４） 外来性ｆｒａ−１について 5'- GTA CCG AGA CTA CGG GGA ACC GG -3' （配列番号５）及び、 5'- CCG CTA CAG ATC CTC TTC TGA GAT G -3' （配列番号６） Ｃｂｆａ−１について 5'- TGG AAG GGA TGA AAG GCT GC -3' （配列番号７）及び、 5'- TGG ACG ACA CCA TTT GTG GC -3' （配列番号８） オステオポンチンについて 5'- GAC CAT GAG ATT GGC AGT GAT TTG -3' （配列番号９）及び、 5'- TGA TGT TCC AGG CTG GCT TTG -3' （配列番号１０） Ｉ型コラーゲンについて 5'- AAT GGT GAG ACG TGG AAA CCC GAG -3' （配列番号１１）及び、 5'- CGA CTC CTA CAT CTT CTG AGT TTG G -3' （配列番号１２）

【００１８】 外来性及び内在性ｆｒａ−１は、ホルボールミリステートアセテート（phorbo
l myristate acetate）（ＰＭＡ）による誘導に関係なく、トランスジェニック
骨芽細胞中で検出された。対照的に、内在性ｆｒａ−１は野生型骨芽細胞中では
発現しなかったが、ＰＭＡ刺激下では誘導された。この結果は、外来性Ｆｒａ−
１は内在性遺伝子座由来のｆｒａ−１の発現を刺激することを示している。この
ことは、Ｆｒａ−１は骨芽細胞中におけるＦｒａ−１自体の発現を正に制御する
ことを示唆している。トランスジェニック及び野生型培養の骨芽細胞表現型は、
ｃｂｆａ−１、Ｉ型コラーゲン及びオステオポンチンを含む骨芽細胞マーカーの
発現により確認された（図５ｃ）。 図５は、ｆｒａ−１トランスジェニック骨芽細胞の分析を示している。（ａ）
は、４週齢のトランスジェニック及び野生型マウスにおける、ｆｒａ−１、アル
カリホスファターゼ（ＡＬＰ）、オステオポンチン（ＯＰ）及びオステオカルシ
ン（ＯＣ）発現についてのノーザンブロット分析を示している。（ｂ）は、野生
型及びトランスジェニック骨芽細胞培養溶解液中のＡＬＰ活性の時間経過を示し
ている。（ｃ）は、トランスジェニック及び野生型骨芽細胞培養中の内在性及び
外来性ｆｒａ−１転写物のＲＴ−ＰＣＲによる発現分析を示している。ＰＭＡ：
ホルボールミリステートアセテート、ＲＴ：逆転写酵素。

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【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ｆｒａ−１トランスジェニックマウスの作成を示している。

【図２】 図２は、ｆｒａ−１トランスジェニック骨及び野生型骨の放射線分析を示して
いる。

【図３】 図３は、組織形態計測分析を示している。

【図４】 図４は、移植された野生型及びｆｒａ−１トランスジェニック大腿骨の骨発達
を示している。

【図５】 図５は、ｆｒａ−１トランスジェニック骨芽細胞の機能分析を示している。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 19/08 Ａ６１Ｐ 19/08 19/10 19/10 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 松尾 光一 オーストリア アー1190 ヴィエンナ レ オポルドシュタイネルガッセ 52／11 (72)発明者 ヴァーグナ エルヴィン エフ オーストリア アー1140 ヴィエンナ ブ ルーテンガッセ ９／25 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 4B024 AA01 BA21 CA04 DA02 EA04 GA11 4B063 QA18 QQ13 QR32 QR55 QS34 4C084 AA02 AA03 AA07 AA13 AA17 BA35 BA44 CA53 MA13 MA17 MA22 MA23 MA31 MA35 MA37 MA52 MA55 MA57 MA59 MA60 NA14 ZA962 ZA972 ZC412 4C087 AA01 AA02 BC83 CA09 CA12 CA20 MA13 MA17 MA22 MA23 MA31 MA35 MA37 MA43 MA52 MA55 MA57 MA59 MA60 NA14 ZA96 ZA97 ZC41

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 骨質量減少に関連する骨疾患治療用物質の同定方法であって
   、 該物質の、骨芽細胞における、Ｆｒａ−１発現の上方制御能力又はＦｒａ−１
   標的遺伝子発現の調節能力について試験し、 該上方制御及び調節がインビボにおける骨形成の増加を引き起こすことを特徴
   とする方法。
2. 【請求項２】 前記物質を、Ｆｒａ−１発現の上方制御能力について試験す
   る、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 ｆｒａ−１遺伝子に由来する制御要素の制御下にリポーター
   遺伝子を有するプラスミドで感染した哺乳類細胞を、多数の試験物質と共にイン
   キュベートし、及び、 該リポーター遺伝子の発現を上方制御する物質を選択する、 工程を含む、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記細胞が骨芽細胞である、請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記細胞が骨肉腫細胞である、請求項３に記載の方法。
6. 【請求項６】 骨芽細胞において、Ｆｒａ−１発現を上方制御する又はＦｒ
   ａ−１標的遺伝子発現を調節することができる化合物であって、 該上方制御及び調節はインビボにおける骨形成の増加を引き起こすものであり
   、 該物質は骨質量減少に関連する骨疾患を治療するためのものである、 ことを特徴とする化合物。
7. 【請求項７】 骨粗鬆症治療用である、請求項６に記載の化合物。
8. 【請求項８】 骨欠損症治療用である、請求項６に記載の化合物。
9. 【請求項９】 ヒト又は動物の治療用である、ｆｒａ−１又はその生物学的
   に活性な断片をコードするＤＮＡ分子。
10. 【請求項１０】 骨質量減少に関連する骨疾患治療用である、請求項９に記
    載のＤＮＡ分子。
11. 【請求項１１】 ｆｒａ−１導入遺伝子を有する動物。
12. 【請求項１２】 前記動物がマウスである、請求項１１に記載の動物。