JP2003529337A - ヒトアルファ１ｇ−ｃｔ型カルシウムチャンネルをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒトＴ型低閾値カルシウムチャンネル（アルファ１Ｇ−ｃ）の新規なアイソフォームをコードするＤＮＡ分子をクローン化し、特性化した。このタンパク質の生物学的及び構造的特性をアミノ酸及びヌクレオチド配列と同様に開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景 電位依存性カルシウムチャンネルは、神経興奮、神経伝達物質及びホルモン分
泌、並びにＣａ依存性転写因子による遺伝子転写の調節を含む重要な役割を果た
す。それらの機能は、一つにはそれらの細胞配置及びそれらのゲート開閉特性（
それらの開口、不活性化、非活性化、及び不活性化からの回復の特徴）により決
まる。５つの一般的なクラスの電位依存性カルシウムチャンネルが、様々なニュ
ーロン及び非ニューロン組織において認められている。チャンネルサブユニット
の補足及び発現される電位依存性カルシウムチャンネルの細胞以下配置は、機能
性細胞特性を決定する。 電位依存性Ｃａチャンネルの相違は２つの主要なカテゴリーに入る：低閾値（Ｌ
ＶＡ）及び高閾値（ＨＶＡ）。

【０００２】 全てのクローン化された電位依存性カルシウムチャンネルアルファサブユニッ
ト（孔形成サブユニット）の保存される一般構造が同定されている。それは、電
位依存性Ｋ及びＮａチャンネルに存在するドメインに相同性を有する４個のドメ
インからなる。各ドメインは、６個の膜貫通領域（Ｓ１−Ｓ６）及びＳ５〜Ｓ６
間に位置する孔領域（Ｐ）を含有する。細胞外ループは一般に非常に短く；細胞
内ループは、リン酸化によりモジュレーションされるそして他のエフェクターと
相互作用することができる部位を含有する。しかしながら、アルファサブユニッ
ト間でドメインＩのＳ５−Ｓ６ループ及びドメインＩ〜ＩＩ間の細胞内ループの
長さの顕著な違いがある。

【０００３】 異なるカルシウムチャンネルの電気生理学的特性は、おそらく細胞タンパク質
、例えばキナーゼ、並びに副（ａｕｘｉｌｉａｒｙ）カルシウムチャンネルサブ
ユニットによるモジュレーションのために、発現される細胞タイプもしくは組織
により異なるので、異なるカルシウムチャンネルはそれらの薬理学的プロフィー
ルにより最適に分類される。

【０００４】 ＨＶＡチャンネルクラスは、少なくとも３もしくは４個の異なるサブユニット
：α１（これは孔を含有する）、ベータ（β）及びα２δからなると考えられる
。骨格筋では、γサブユニットもまた骨格チャンネル複合体と共沈する。最近、
２つのガンマ様サブユニットが脳からクローン化されており、それらの一つは、
ｓｔａｒｇａｚｅｒ突然変異体マウスにおいて突然変異している遺伝子である（
Ｂｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｌｅｔｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）
。サブユニット組成は、骨格Ｌ型（α１ α２δ β γ）及び脳Ｎ型（α１ α２
δ β）チャンネルのみに対して立証されている（Ｐｅｒｅｚ−Ｒｅｙｅｓ ａ
ｎｄ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，１９９５）。これらのチャンネルは、一般に、活性
化のために大きい膜脱分極を必要とする（静止電位（ＲＰ）から〜３０ｍＶ）。
４クラスのＨＶＡカルシウムチャンネルが、電気生理学的、薬理学的及び分子的
データに基づいて同定されている。これらのクラスには、Ｌ型（少なくとも４個
の遺伝子（α１サブユニットα１Ｓ（骨格筋）、α１Ｃ、α１Ｄ（神経内分泌）
及びα１Ｆ（網膜）を包含する）によりコードされる）、Ｎ型（α１Ｂ；（Ｗｉ
ｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２））、Ｐ／Ｑ型（α１Ａ）及びＲ型（少
なくともα１Ｅ遺伝子によりコードされる）が包含される。

【０００５】 ＨＶＡ α１ファミリーは、細胞質的に位置するβサブユニットの共発現、特
に機能性細胞表面チャンネルの発現レベル及びチャンネルの電気生理学的応答（
すなわち、反応速度論）により強く影響を受ける。βサブユニットは、機能性チ
ャンネルの数を増しそしてチャンネル複合体の活性化及び不活性化特性を改変す
るためにＩ−ＩＩ細胞内ループ中の特定の配列と相互作用する（Ｆｕｒｕｋａｗ
ａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。選択的にスプライシングされる少なくとも４個
のβ遺伝子があり（β１ａ−ｃ；β２ａ−ｃ；β３；β４；（Ｐｅｒｅｚ−Ｒｅ
ｙｅｓ ａｎｄ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，１９９５））；α１機能に対するこれら
のβの各々の作用はα１クラスにより決まるようである。興味深いことに、βの
突然変異体（Ｃｃｈβ４）は、嗜眠（ｌｈ）マウスにおいて運動失調及び発作を
引き起こす（Ｂｅｒｇｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。α２δサブユニット
もまたα１機能をモジュレーションし、そして既知の遺伝子は、ある家系におい
て悪性高熱表現型と共分離する（Ｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。

【０００６】 ＨＶＡチャンネルの生理学的役割は、チャンネルの細胞以下配置及び組織タイ
プにより決まる。細胞以下配置は組織間で異なるが、神経伝達物質及びホルモン
放出、活動電位期間、筋肉細胞における興奮収縮連関、並びに遺伝子発現におい
て重要であることが示されている（Ｍｉｌｌｅｒ，１９８７）。ＬＶＡカルシウ
ムチャンネルのＴ型ファミリーには少なくとも３個の遺伝子がある（α１Ｇ、α
１Ｈ及びα１Ｉ）（Ｐｅｒｅｚ−Ｒｅｙｅｓ，１９９８）。それらの構造は、多
数の重要な点でＨＶＡチャンネルのものと異なる。Ｉ−ＩＩ細胞内リンカーは、
既知のＨＶＡチャンネルのものよりはるかに長い（〜４００アミノ酸）。ドメイ
ンＩ Ｓ５−Ｐ細胞外リンカーは、ＨＶＡチャンネルのものより長く、そしてこ
のチャンネルとの薬剤相互作用の優れた標的であることができる。βは、このク
ラスではα１と会合していないようであり、そしてそれらはベータサブユニット
結合のために重要であることが既知である基準配列を欠く（Ｌａｍｂｅｒｔ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９７；Ｌｅｕｒａｎｇｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。全
ての既知のベータのものに対して向けられるアンチセンス実験は、下神経節ニュ
ーロンにおいてＨＶＡカルシウムチャンネルの発現の減少を示すが、ＬＶＡカル
シウムチャンネルはそうではない（Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７）
。

【０００７】 卵母細胞もしくはＨＥＫ２９３細胞において発現されるα１Ｇは、これら２つ
の細胞タイプにおいて劇的に異なる電流量を生じさせるので、強いＴチャンネル
発現には他のタンパク質もしくは細胞環境が必要とされる可能性がある（Ｐｅｒ
ｅｚ−Ｒｅｙｅｓ，１９９８）。

【０００８】 Ｔ型カルシウム電流は、視床、オリーブ、小脳プルキンエ細胞、側手綱細胞（
ｌａｔｅｒａｌ ｈａｂｅｎｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ）、背角（ｄｏｒｓａｌ ｈ
ｏｒｎ）ニューロン、感覚ニューロン（ＤＲＧ、結節性）、コリン作動性前脳ニ
ューロン、海馬介在ニューロン、ＣＡ１、ＣＡ３歯状回錐体細胞、基底前脳ニュ
ーロン、扁桃様ニューロンを包含する末梢及び中枢神経系の多数の細胞タイプに
おいてインビボで認められている（Ｔａｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。
Ｔ型チャンネルは、視床中継（ｒｅｌａｙ）ニューロン及び小脳プルキンエ細胞
のような強いＣａ依存性放出発射（ｂｕｒｓｔ ｆｉｒｉｎｇ）行動を示すニュ
ーロンの細胞体及び樹状突起において顕著である（Ｈｕｇｕｅｎａｒｄ，１９９
６）。 生理学的役割及び治療分野 Ｔ型カルシウムチャンネルは、放出発射を引き起こすための低閾値スパイクの
生成に関与する（Ｈｕｇｕｅｎａｒｄ，１９９６）。これらのチャンネルは、そ
れらが静止膜電位で開口のいくらかの可能性を有する点でＨＶＡチャンネルと異
なる。それらの定常状態不活性化曲線は、ＨＶＡチャンネルと比較して負の電位
の方にシフトしているので（すなわち、チャンネルの半分は不活性化されておら
ず、そして静止膜電位（ＲＰ）より負の電位で脱分極電位工程により開くことが
できる）、ＲＰに近いウインドウ電流（ｗｉｎｄｏｗ ｃｕｒｒｅｎｔ）がある
（すなわち、Ｔチャンネルの一部はＲＰで開いている）。低閾値スパイク及び反
跳（ｒｅｂｏｕｎｄ）放出発射は、オリーブ、視床、海馬及び新皮質からのニュ
ーロンにおいて顕著である（Ｈｕｇｕｅｎａｒｄ，１９９６）。

【０００９】 Ｔ型チャンネルは、癲癇に対して重要な結果を有する振動行動を促進する。低
閾値スパイクを発射する細胞の能力は、振動行動及び増加した放出発射（約５０
−１００ｍｓ離れた活動電位の群）の発生において重要である。Ｔ型カルシウム
チャンネルは、全身性非癲癇発作の一つのタイプ、欠神癲癇において重要な役割
を果たすと考えられる。電位依存性カルシウムチャンネルが、発作の維持及び伝
播を包含する癲癇誘発発射に寄与する証拠には、１）欠神癲癇のラット遺伝モデ
ル（ＧＡＥＲＳ）における癲癇性発作の発生に関与すると仮定されている細網視
床（ｎＲＴ）ニューロンにおけるＴ型電流の特異的増大（Ｔｓａｋｉｒｉｄｏｕ
ｅｔ ａｌ．，１９９５）；２）欠神小発作に対する抗痙攣薬（エトスクシミ
ド及びジメタジオン）は、生理学的に適切な用量で視床（腹部基底複合体（ｖｅ
ｎｔｒｏｂａｓａｌ ｃｏｍｐｌｅｘ））ニューロンにおけるＴ型電流を部分的
に抑制することが示されている（Ｃｏｕｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｋ
ｏｓｔｙｕｋ ｅｔ ａｌ．，１９９２）；そして３）Ｔ型カルシウムチャンネ
ルは、癲癇に関与すると仮定されている特定のニューロン（ｎＲＴ、視床中継及
び海馬錐体細胞）の固有の放出特性を生じる（Ｈｕｇｕｅｎａｒｄ，１９９６）
が包含される。ラットα１Ｇは、顕著なＣａ²⁺依存性低閾値スパイクを生成する
ことができる視床皮質中継細胞（ＴＣ）において非常に発現される（Ｔａｌｌｅ
ｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。

【００１０】 Ｔ型チャンネルは、視床振動及び皮質同調性において重要な役割を果たし、そ
してそれらの関与は、欠神癲癇及び睡眠の開始を引き起こすと考えられる皮質ス
パイク波の生成に直接結び付けられている（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ａｎｄ Ｂａ
ｌ，１９９７）。神経ネットワークの振動は、睡眠波周期中のような通常の脳機
能において重要である。視床は、皮質リズム発生に密接に関与することが一般に
認められている。視床ニューロンは、覚醒動物では持続性発射（定期的に間隔を
置いた自然発射）を最も頻繁に示し、一方、相（ｐｈａｓｉｃ）放出発射は徐波
睡眠に特有であり、そして皮質ＥＥＧにおける付随する紡錘形化を説明すること
ができる。放出発射へのシフトは、シナプス的にもたらされる抑制により刺激さ
れる低閾値Ｃａ²⁺スパイクの活性化の結果として起こる（すなわち、ＲＰの過分
極の際に活性化される）。新皮質のさらに深層の錐体ニューロン、視床の皮質中
継ニューロン、及びそれらのそれぞれの抑制性介在ニューロン間の相互連結は、
基本ペースメーカー回路を形成すると考えられる。

【００１１】 膜電位（Ｖｍ）の小さな変化（脱分極（ｅｐｓｐｓ；興奮性シナプス後電位）
もしくは過分極（ｉｐｓｐｓ；抑制性シナプス後電位）；陽極開放放出（ａｎｏ
ｄｅ ｂｒｅａｋ ｅｘｈａｌｔａｔｉｏｎ）もしくは反跳放出発射のいずれか
）はＴ型カルシウムチャンネルを開くことができるので、Ｔ型チャンネルはシナ
プス後レベルでシナプス相乗作用に寄与する。ｉｐｓｐ中の過分極したＶｍで、
さらに多くのＴ型チャンネルが開くことに応じられるようになり（それらは不活
性化から回復している）、その結果、ＲＰへの再分極の際に、さらに大きい割合
のＴチャンネルが開かれ、そして低閾値ＣａスパイクがＮａチャンネル活性化及
び活動電位生成の閾値に達するとこれは陽極開放放出、強い反跳放出発射を引き
起こす。活動電位の放出は、Ｃａ依存性脱分極のすぐ後に進行する。この現象は
、網様視床ニューロンにおいて特に顕著である（Ｈｕｇｕｅｎａｒｄ，１９９６
）。

【００１２】 Ｔ型チャンネルは、伝達物質放出に関与することができる。Ｔチャンネルがシ
ナプス前終末に位置する細胞において、それらは神経伝達物質放出を促進する（
Ａｈｎｅｒｔ−Ｈｉｌｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ａｒｎｏｕｌｔ ｅｔ
ａｌ．，１９９７）。

【００１３】 Ｔ型チャンネルは、細胞内Ｃａ濃度［Ｃａ］_iの自然変動に寄与する。それら
は、心臓におけるペースメーカー活性、従って心拍数、及び非興奮性細胞からの
小胞放出において重要である（Ｅｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。

【００１４】 Ｔ型カルシウム電流は、成体ラット脊髄神経節（ＤＲＧ）ニューロンの異なる
亜集団において異なって発現される。Ｔ型電流は、小さい直径の１及び３型細胞
において適度な密度で存在し、前者はＴＴＸ抵抗性Ｎａ電流、長期間の活動電位
及びカプサイシン感受性を有し（Ｃ型侵害受容ニューロンと一致する）、そして
後者は短い活動電位期間を有し、カプサイシン感受性を有さない（Ａδ侵害受容
もしくはＡα／βニューロンと一致する）（Ｃａｒｄｅｎａｓ ｅｔ ａｌ．，
１９９５）。ｎＭ濃度のニモジピンに対する異なる感受性に基づく成体ラット感
覚ニューロンにおいて発現されるＬＶＡ電流の異なるタイプがあるようである（
Ｆｏｒｍｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。ほぼ閾値の膜興奮性に寄与する
ことにおけるＴ型カルシウムチャンネルの役割のために、Ｔチャンネルの選択的
抑制は、ニューロンの過剰興奮性（ｈｙｐｅｒｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ）を減
らし（疼痛性ニューロパシー）、そして疼痛の知覚の閾値を上げる（中枢性疼痛
症候群）。

【００１５】 Ｔチャンネルは、通常、ヒトの心室筋細胞に存在しないので、心臓のペースメ
ーカー細胞及び伝導繊維におけるＴ型カルシウムチャンネルの特異的遮断薬は、
「純粋な」徐脈（心拍数を遅らせる）特性を示すかもしれない。特定の構造状態
のＴ型チャンネルを遮断する薬剤は、正常な心臓の変力特性にほとんど影響を与
えずに（心拍数を下げることにより）頻脈の処置を可能にするかもしれない（Ｒ
ｏｕｓｓｅａｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。心筋症（遺伝ゴールデンハムスタ
ーモデル）は、心室筋細胞におけるＴ型カルシウムチャンネルの増加した発現に
よるＣａ過負荷の結果である（Ｓｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，１９９４）。成長
ホルモンを分泌する腫瘍を有する成体ラットからの心房筋細胞には増加したＴ型
電流がある（Ｘｕ ａｎｄ Ｂｅｓｔ，１９９０）。特異的Ｔ型カルシウムチャ
ンネル遮断薬は、これらの場合において心臓防御剤として働くと思われる。

【００１６】 副腎皮質の副腎束状帯細胞におけるＴ型チャンネルは、コルチゾール分泌をモ
ジュレーションすることが示されている（Ｅｎｙｅａｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９
９３）。コルチゾールはグルココルチコイドの前駆体であり、そしてグルココル
チコイドに長くさらされることは、末梢組織タンパク質の分解、肝臓による増加
したグルコース生産及び脂肪貯蔵物からの脂質の代謝を引き起こす。さらに、不
安及びストレスを患っている個体は、高すぎるレベルのグルココルチコイドを生
産し、そしてこれらのレベルを調節する薬剤が求められている（例えばＣＲＦに
対するアンタゴニスト）。

【００１７】 Ｔ型カルシウムチャンネルは、精巣セルトリ細胞からの栄養分の放出に関与す
る可能性がある。Ｔ型カルシウムチャンネルは、未成熟ラットセルトリ細胞上に
発現される（Ｌａｌｅｖｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。セルトリ細胞は、精
子生産において主要な役割を果たすと考えられる精巣細胞である。発生中の生殖
細胞とセルトリ細胞との密接な並置は、配偶子を維持して成長を促すことにおい
て後者が役割を果たすことを示唆する。セルトリ細胞は、輸送タンパク質、ホル
モン及び増殖因子、胚芽細胞発生及び生殖と関連する他の生物学的プロセスを調
節する酵素を包含する多数のタンパク質を分泌する（Ｇｒｉｗｏｌｄ，１９８８
）。それらは、下垂体前葉への重要な負のフィードバックシグナル、ペプチドホ
ルモンインヒビンＢを分泌する。それらは、タンパク質分解酵素を生成するプラ
スミノーゲンアクチベーターを放出することにより精子分離（ｓｐｅｒｍｉａｔ
ｉｏｎ）（セルトリ細胞から管腔への成熟精子の最終的分離）を助ける。Ｔチャ
ンネルの役割は知られていないが、それらは栄養素、インヒビンＢ及び／もしく
はプラスミノーゲンアクチベーターの放出において重要である可能性がある。

【００１８】 配偶子相互作用中の精子におけるＴ型カルシウムチャンネルの抑制は、透明帯
依存性Ｃａ²⁺上昇を抑制し、そしてアクロソーム反応を抑制し、従って、精子Ｔ
型カルシウムチャンネルを受精に直接関連させる（Ａｒｎｏｕｌｔ ｅｔ ａｌ
．，１９９６）。

【００１９】 Ｔ型カルシウムチャンネルはまた、特に心臓血管系において、細胞の成長及び
増殖にも関与している（Ｋａｔｚ，１９９９；Ｌｉｊｎｅｎ ａｎｄ Ｐｅｔｒ
ｏｖ，１９９９；Ｒｉｃｈａｒｄ ａｎｄ Ｎａｒｇｅｏｔ，１９９８；Ｗａｎ
ｇ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。

【００２０】 振せんは、Ｔ型カルシウムチャンネルが強く発現される領域、脳幹神経節及び
視床を通して制御することができる（Ｔａｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９）
。抗痙攣薬エトスクシミドは、振せん、特にパーキンソン病、本態性振せんもし
くは小脳疾患と関連する振せんを処置するために用いられるので、Ｔ型カルシウ
ムチャンネルは振せんの病態生理学に関与している（特許ＵＳ４９８１８６７；
Ｄ．Ａ．Ｐｒｉｎｃｅ）。 薬理学 カルシウムチャンネルのＴ型クラスの既知の特異的遮断薬はない。ＨＶＡチャ
ンネルに対してＴ型カルシウムチャンネルを遮断することにいっそう有効である
イオン（例えばＮｉ⁺²）があり、そしてＨＶＡチャンネルより高い親和性でＴチ
ャンネルを遮断するいくつかの薬剤がある。多数の薬理学的遮断薬は、異なる細
胞タイプにおいて発現されるＴ型カルシウム電流に対して異なる作用を有するが
（（Ｔｏｄｏｒｏｖｉｃ ａｎｄ Ｌｉｎｇｌｅ，１９９８）からの表１を参照
）、しかしながら、Ｔ型電流の薬理学的プロフィールの多様性がある。アンタ
ゴニストに対する電流の異なる感受性は、異なるサブユニット構造（Ｐｅｒｅｚ
−Ｒｅｙｅｓ，１９９８）並びに細胞環境のためである可能性がある。Ｔ型カル
シウムチャンネルアルファサブユニット遺伝子は、ＨＶＡチャンネルの遺伝子の
ように、選択的スプライシングを示す（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ Ｊ ７６：Ａ４０８）。個々のＴ型カルシウムチャンネルクローン
の細胞外及び細胞内ループは、それら自体の間で著しい多様性を示し、そしてＨ
ＶＡチャンネルに対するいっそう低い相同性を示す。

【００２１】 ミベフラジル（（１Ｓ，２Ｓ）−２−［２−［［３−（１Ｈ−ベンズイミダゾ
ール−２−イル）プロピル］メチル−アミノ］エチル］−６−フルオロ−１−イ
ソプロピル−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレンー２−イルメトキシアセ
テート）は、不活性化状態と優先的に相互作用することによりＴ型カルシウムチ
ャンネルを遮断する。従って、平滑筋細胞のような比較的低いＲＰ（〜５０ｍＶ
）を有する細胞タイプでは、ほぼ全てのＴチャンネルがミベフラジルにより遮断
され、一方、心筋細胞のような非常に負のＲＰを有する細胞では、Ｔチャンネル
の大部分が不活性化されず、従って、ミベフラジルにより遮断されない（Ｂｅｚ
ｐｒｏｚｖａｎｎｙ ａｎｄ Ｔｓｉｅｎ，１９９５）。ミベフラジルは、−６
０の保有電位（ｈｏｌｄｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ）から加えるとマウスア
ルファ１Ｇに対する複合遮断作用を有し、そして２集団の部位に合わせることに
より最もよく適合できた（Ｋｌｕｇｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。高
親和性成分は−１００ｍＶで減少した。最も顕著な（低親和性）部位は、〜４０
０ｎＭのミベフラジルのＩＣ₅₀値を有した。

【００２２】 エトスクシミドは、欠神癲癇を処置するために用いられ、そして治療的に適切
な濃度（０．２５−０．７５ｍＭ）（Ｓｈｅｒｗｉｎ，１９８９）でいくつかの
調製物においてＴ型電流を部分的に遮断する（Ｃｏｕｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，
１９８９）。エトスクシミドは、異なる組織のＴ型カルシウムチャンネルに異な
る親和性を有する。モルモットもしくはラット腹部基底視床ニューロンからのＴ
型電流の大部分は、〜５００μＭのミベフラジル（ｍｉｂｅｆｒａｄｉｌ）のＩ
Ｃ₅₀値及び１ｍＭで〜４０％遮断の最大遮断を示した（Ｃｏｕｌｔｅｒ ｅｔ
ａｌ．，１９８９）。興味深いことに、試験したＴＣの２５％ではＴ電流に対す
るエトスクシミドの効果がなかった（Ｃｏｕｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９
）。海馬ＣＡ３ニューロンでは、ＬＶＣＣの全ての成分は、２５０μＭもしくは
１ｍＭのエトスクシミドに非感受性であった。Ｔ型カルシウムチャンネルがこれ
らの細胞においてＬＶＣＣを引き起こす場合、この薬剤はこれらのＴ型カルシウ
ムチャンネルに効果がなかった（Ａｖｅｒｙ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，１９
９６）。１日齢のラットからの脊髄神経節ニューロンからのＴ型カルシウムチャ
ンネルは、１００％の最大遮断で、視床ニューロンよりエトスクシミドに高い親
和性を有する（Ｔ電流のＫｄは、Ｌ型電流の１５μＭに対して７μＭである）（
Ｋｏｓｔｙｕｋ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。ヒトアルファ１Ｈは、エトスクシ
ミドに非感受性である（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９９２８３４２
；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。

【００２３】 Ｎｉ²⁺は、孔領域だけでなくチャンネルタンパク質上の別の未知の場所でも作
用すると考えられる（Ｚａｍｐｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。マウスアル
ファ１Ｇは、他のＴ型チャンネルとは対照的にＮｉ²⁺に非常に低い感受性を有す
る（Ｋｌｕｇｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。卵母細胞において発現さ
れるヒトアルファ１Ｈは、約６μＭのＮｉ²⁺のＩＣ₅₀を有する（Ｗｉｌｌｉａｍ
ｓ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９９２８３４２）。

【００２４】 多数の受容体、チャンネル及び交換輸送体でのアンタゴニスト、アミロライド
は、Ｔ型カルシウムチャンネルでは低親和性アンタゴニストである。アミロライ
ドに対するＴ電流の感受性の顕著な違いがある（Ｔｏｄｏｒｏｖｉｃ ａｎｄ
Ｌｉｎｇｌｅ，１９９８）。アミロライドの作用は、５０〜＞１０００μＭの範
囲のＥＣ₅₀で、細胞タイプにより非常に多様であり、異なる細胞における異なる
レベルのＴ型チャンネル発現もしくは異なる細胞内の異なるチャンネル複合体を
示唆する（Ｈｕｇｕｅｎａｒｄ，１９９６）。例えば、卵母細胞において発現さ
れるヒトアルファ１Ｈは、約２０μＭのアミロライドのＩＣ₅₀を有する（Ｗｉｌ
ｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９９２８３４２）。

【００２５】 ＮＰＰＢ（５−ニトロ−２−（３−フェニルプロピルアミノ）安息香酸）は、
Ｎ型カルシウムチャンネルを単離するために用いられており（Ｓｔｅａ ｅｔ
ａｌ．，１９９９）、そしてＴ型カルシウムチャンネルを単離するために本発明
での研究において使用した。しかしながら、我々は、ＮＰＰＢがヒトアルファ１
Ｇ−ｃ（ｈａｌｐｈａ １Ｇ−ｃ）電流を遮断することを見出した。ＮＰＰＢは
、電位感受性カルシウム電流（Ｋｉｒｋｕｐ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、より
詳細にはＬ型カルシウム電流（Ｄｏｕｇｈｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８）を遮
断することが示されている。興味深いことに、ＮＰＰＢは、Ｃａ²⁺静止電流を下
げ、そして単離したゴキブリ背側無対性正中ニューロンのスパイク頻度を改変し
た（Ｈｅｉｎｅ ａｎｄ Ｗｉｃｈｅｒ，１９９８）。静止カルシウム電流は、
Ｔ型カルシウムチャンネルによりもたらされる可能性があるが、これはこれから
確認されなければならない。

【００２６】 発明の要約 ヒトＴ型低閾値カルシウムチャンネル（アルファ１Ｇ−ｃ）の新規なアイソフ
ォームをコードするＤＮＡ分子をクローン化し、特性化した。このタンパク質の
生物学的及び構造的特性を、アミノ酸及びヌクレオチド配列と同様に開示する。
組換えタンパク質は、アルファ１Ｇ−ｃカルシウムチャンネルのモジュレーター
を同定するために有用である。本明細書に開示するアッセイにおいて同定される
モジュレーターは、治療薬として有用であり、そしてヒトアルファ１Ｇ−ｃ活性
によりもたらされる疾患の処置の候補である。ヒトアルファ１Ｇ−ｃによりもた
らされる可能性があるそのような活性には、癲癇、精神分裂病、鬱病、睡眠障害
、ストレス、内分泌疾患、呼吸器疾患、末梢筋肉疾患、筋肉興奮性、クッシング
病、受精、避妊、ニューロン発射調節を冒す疾患、呼吸器疾患、高血圧、心臓リ
ズム、シナプスシグナルの相乗作用、収縮期高血圧における増大する動脈コンプ
ライアンス、血管膨張を減らすことによるような筋肉緊張、細胞増殖（タンパク
質合成、細胞分化、及び増殖）、心臓肥大、心臓線維症、アテローム性動脈硬化
症、並びに心筋梗塞、不整脈、心不全及び狭心症が含まれるがこれらに限定され
るものではない心臓血管障害が包含される。組換えＤＮＡ分子及びその一部は、
ＤＮＡ分子の相同物を単離するため、ＤＮＡ分子のゲノム同等物を同定及び単離
するため、そしてＤＮＡ分子の突然変異体形態を同定、検出もしくは単離するた
めに有用である。

【００２７】 詳細な記述 本発明は、ヒト視床ｃＤＮＡライブラリーから単離されたヒトカルシウムチャ
ンネルアルファ１Ｇ−ｃをコードするＤＮＡに関する。ヒトカルシウムチャンネ
ルアルファ１Ｇ−ｃは、本明細書において用いる場合、低閾値カルシウムチャン
ネルとして特に機能を果たすことができるタンパク質をさす。

【００２８】 本発明において提示する配列は、ラットアルファ１Ｇ受託番号ＡＦ０２７９８
４（Ｐｅｒｅｚ−Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）の相同物であり、そし
てヒトアルファ１Ｇ「ａ」アイソフォーム（受託番号ＡＦ１２６９６６）と同様
であるが、本明細書において提示する配列は、両方の配列には欠けているドメイ
ンＩ〜ＩＩ間の第二細胞内ループ中の２３アミノ酸の挿入物を含有する。２３ア
ミノ酸の挿入物は、Ｓ９７１で推定のＣＫＩＩリン酸化部位を含有する。この２
３アミノ酸の挿入物は、ラット（ＡＦ１２５１６１）及びマウス（ＡＪ０１２５
６９）における相同配列とそれぞれ９１及び８７％同一であり、２つのタンパク
質は、アルファ１Ｇアミノ酸１５７５で挿入物を含有するのでそうでなければヒ
トアルファＧ−ｃと異なる。ヒトアルファＧ−ｃ挿入物中の推定のカゼインキナ
ーゼＩＩリン酸化部位は、同等のラットもしくはマウス配列において保存されて
いない。以前に記述されたヒト全長ｃＤＮＡ（ＡＦ１２６９６６）は機能性チャ
ンネルを生成するが（Ｍｏｎｔｅｉｌ，ａ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏ
ｆ ａ１Ｇ ａｎｄ ａ１Ｉ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ−ｔｙ
ｐｅ Ｃａ２＋ ｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｂｓｔ：Ａ４０８）、
その機能的及び構造的特徴の完全な記述は報告されていない。従って、本発明は
、知る限りでは、ヒトアルファ１Ｇ−ｃ Ｔ型カルシウムチャンネルの詳細な特
性化の最初の報告である。Ｅ．Ｐｅｒｅｚ−Ｒｅｙｅｓにより提示された本発明
の領域と同一である２つの部分ヒト配列がある（ＡＦ０２９２２９；ＡＦ０２９
２２８）。ＡＦ０２９２２８はアルファ１Ｇ−ｃではアミノ酸１１８６で始まり
、そしてアミノ酸１５０４で終わり；ＡＦ０２９２２９はアミノ酸１８２７で始
まり、そしてＴＧＡ終止コドンで終わる。

【００２９】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇの完全なアミノ酸配列は以前に記述さ
れているが、しかしながら、本発明は以前に知られていなかった新規なアイソフ
ォームである。これは、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇの「ｃ」アイソ
フォームをコードする全長ＤＮＡ分子の最初に報告されるクローニングである。
多種多様な細胞及び細胞タイプが、記述するチャンネルを含有すると予測される
。

【００３０】 他の細胞及び細胞系もまた、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃを単
離するための使用に適当であることができる。適当な細胞の選択は、全細胞もし
くは細胞抽出物におけるヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ活性につい
てスクリーニングすることにより行うことができる。ヒトカルシウムチャンネル
アルファ１Ｇ−ｃ活性は、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃを通した
低脱分極電位誘発Ｃａ²⁺流入もしくはＣａ電流の直接測定によりモニターするこ
とができる。このアッセイにおいてヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ
活性を有する細胞は、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ＤＮＡもし
くはｍＲＮＡの単離のために適当であることができる。

【００３１】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃを分子的にクローン化するために
当該技術分野において既知である様々な方法のいずれかを用いることができる。
これらの方法には、適切な発現ベクター系におけるヒトカルシウムチャンネルア
ルファ１Ｇ−ｃを含有するｃＤＮＡライブラリーの構築後のヒトカルシウムチャ
ンネルアルファ１Ｇ−ｃ遺伝子の直接機能性発現が包含されるが、これに限定さ
れるものではない。別の方法は、バクテリオファージもしくはプラスミドシャト
ルベクターにおいて構築したヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃを含有
するｃＤＮＡライブラリーをヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ挿入物
のアミノ酸配列から設計した標識オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニング
することである。さらなる方法は、バクテリオファージもしくはプラスミドシャ
トルベクターにおいて構築したヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃを含
有するｃＤＮＡライブラリーを、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃタ
ンパク質をコードする部分ｃＤＮＡでスクリーニングすることからなる。この部
分ｃＤＮＡは、精製したヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質
のアミノ酸配列からの縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計によるヒトカル
シウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ＤＮＡフラグメントの特異的ＰＣＡ増幅に
より得られる。

【００３２】 別の方法は、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ産生細胞からＲＮＡ
を単離しそしてそのＲＮＡをインビトロもしくはインビボ翻訳系によりタンパク
質に翻訳することである。ペプチド、タンパク質へのＲＮＡの翻訳は、例えば、
抗−ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ抗体との免疫学的反応性により
もしくはヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質の生物学的活性
により同定することができるヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃタンパ
ク質の少なくとも一部の生成をもたらす。この方法において、ヒトカルシウムチ
ャンネルアルファ１Ｇ−ｃ産生細胞から単離されるＲＮＡのプールは、ヒトカル
シウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質の少なくとも一部をコードするＲ
ＮＡの存在について分析することができる。ヒトカルシウムチャンネルアルファ
１Ｇ−ｃ ＲＮＡを非ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ＲＮＡから精
製するためにＲＮＡプールのさらなる分別を行うことができる。この方法により
製造されるペプチドもしくはタンパク質は、アミノ酸配列を提供するために分析
することができ、次にそれを用いてヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ
ｃＤＮＡの製造のためのプライマーを提供するか、または翻訳に使用するＲＮ
Ａは、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃをコードするヌクレオチド配
列を提供するために分析することができ、そしてヒトカルシウムチャンネルアル
ファ１Ｇ−ｃ ｃＤＮＡのこの製造のためのプローブを提供することができる。
この方法は当該技術分野において既知であり、そして例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ
，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ
Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．１９８９に
見出すことができる。

【００３３】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃをコードするＤＮＡを単離するた
めに他のタイプのライブラリー並びに他の細胞もしくは細胞タイプから構築した
ライブラリーが有用であり得ることは当業者に容易に明らかである。他のタイプ
のライブラリーには、他の細胞から得られるｃＤＮＡライブラリー並びにＹＡＣ
（酵母人工染色体）及びコスミドライブラリーを含むゲノムＤＮＡライブラリー
が包含されるが、これらに限定されるものではない。

【００３４】 適当なｃＤＮＡライブラリーは、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ
活性を有する細胞もしくは細胞系から製造できることは当業者に容易に明らかで
ある。ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ｃＤＮＡを単離するために
ｃＤＮＡライブラリーを製造することに使用する細胞もしくは細胞系の選択は、
カルシウムにより調節される生物学的活性の測定を用いて細胞関連ヒトカルシウ
ムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ活性を最初に測定することにより行うことができ
る。

【００３５】 ｃＤＮＡライブラリーの製造は、当該技術分野において周知である標準的な技
術により行うことができる。周知であるｃＤＮＡライブラリー構築技術は、例え
ば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ．１９８９）に見出すことができる。

【００３６】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃをコードするＤＮＡはまた適当な
ゲノムＤＮＡライブラリーからも単離できることもまた当業者に容易に明らかで
ある。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は、当該技術分野において周知である標
準的な技術により行うことができる。周知であるゲノムＤＮＡライブラリー構築
技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ．１９８９）に見出すことができる。

【００３７】 上記の方法によりヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ遺伝子をクロー
ン化するためには、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃのアミノ酸配列
が必要であり得る。これを成し遂げるために、ヒトカルシウムチャンネルアルフ
ァ１Ｇ−ｃタンパク質を精製し、そして部分アミノ酸配列を自動シーケンサーに
より決定することができる。全アミノ酸配列を決定する必要はないが、部分ヒト
カルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅用プ
ライマーの製造のためにタンパク質から６〜８アミノ酸の２領域の線状配列を決
定する。

【００３８】 適当なアミノ酸配列がいったん同定されると、それらをコードすることができ
るＤＮＡ配列を合成する。遺伝暗号は縮重しているので、特定のアミノ酸をコー
ドするために１個より多くのコドンを使用することができ、従って、アミノ酸配
列を一組の同様のＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかによりコードすることが
できる。この組の一つのメンバーのみがヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ
−ｃ配列と同一であるが、ミスマッチを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在
下でさえヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ＤＮＡにハイブリダイズ
することができる。ミスマッチＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ヒトカルシウムチ
ャンネルアルファ１Ｇ−ｃをコードするＤＮＡの同定及び単離を可能にするため
にそれでもなお十分にヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ＤＮＡにハ
イブリダイズすることができる。これらの方法により単離されるＤＮＡは、無脊
椎動物及び脊椎動物起源から、様々な細胞タイプのＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングするため、そして相同遺伝子を単離するために用いることができる。

【００３９】 精製される生物学的に活性のヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃは、
いくつかの異なる物理的形態を有することができる。ヒトカルシウムチャンネル
アルファ１Ｇ−ｃは、全長の新生もしくはプロセシングされていないポリペプチ
ドとして、または部分的にプロセシングされたポリペプチドもしくはプロセシン
グされたポリペプチドの組み合わせとして存在することができる。全長の新生ヒ
トカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃポリペプチドは、特定のタンパク質分
解切断事象により翻訳後的に修飾することができ、これは全長の新生ポリペプチ
ドのフラグメントの形成をもたらす。フラグメントもしくはフラグメントの物理
的会合は、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃと関連する完全な生物学
的活性を有する可能性があるが、しかしながら、ヒトカルシウムチャンネルアル
ファ１Ｇ−ｃ活性の程度は、個々のヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ
フラグメント及び物理的に会合したヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ
ポリペプチドフラグメント間で異なり得る。

【００４０】 本明細書において記述する方法により得られるクローン化したヒトカルシウム
チャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ＤＮＡは、適当なプロモーター及び他の適切な転
写調節要素を含有する発現ベクターへの分子クローニングにより組換え的に発現
させることができ、そして組換えヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃタ
ンパク質を製造するために原核もしくは真核宿主細胞に導入することができる。
そのような操作のための技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ，ｅｔ ａｌ．，上記に
完全に記述されており、そして当該技術分野において周知である。

【００４１】 発現ベクターは、適切な宿主における遺伝子のクローン化コピーの転写及びそ
れらのｍＲＮＡの翻訳のために必要とされるＤＮＡ配列として本明細書において
定義される。そのようなベクターは、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を包
含する細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞を包含する真菌細胞、及び動
物細胞のような様々な宿主において真核生物遺伝子を発現させるために用いるこ
とができる。

【００４２】 特別に設計されたベクターは、細菌−酵母もしくは細菌−動物細胞もしくは細
菌−真菌細胞もしくは細菌−無脊椎動物細胞のような宿主間のＤＮＡの往復を可
能にする。適切に構築された発現ベクターは：宿主細胞における自律複製のため
の複製起点、選択可能なマーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー
数の潜在能力及び活性のプロモーターを含有すべきである。プロモーターは、Ｄ
ＮＡに結合してＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼを導くＤＮＡ配
列として定義される。強いプロモーターは、高頻度でｍＲＮＡを開始させるもの
である。発現ベクターには、クローニングベクター、改変したクローニングベク
ター、特別に設計したプラスミドもしくはウイルスを包含することができるが、
これらに限定されるものではない。

【００４３】 哺乳動物細胞において組換えヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃを発
現させるために様々な哺乳動物発現ベクターを用いることができる。組換えヒト
カルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ発現のために適当であることができる市
販されている哺乳動物発現ベクターには、ｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）
、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２
）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴ
ＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（
ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴ
ａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）及びｌＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）が包含され
るが、これらに限定されるものではない。

【００４４】 細菌細胞において組換えヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃを発現さ
せるために様々な細菌発現ベクターを用いることができる。組換えヒトカルシウ
ムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ発現のために適当であることができる市販されて
いる細菌発現ベクターには、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）及びｐＱＥベク
ター（Ｑｉａｇｅｎ）が包含されるが、これらに限定されるものではない。

【００４５】 酵母のような真菌細胞において組換えヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ
−ｃを発現させるために様々な真菌細胞発現ベクターを用いることができる。組
換えヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ発現のために適当であることが
できる市販されている真菌細胞発現ベクターには、ｐＹＥＳ２（ＩｎＶｉｔｒｏ
ｇｅｎ）及びＰｉｃｈｉａ発現ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）が包含される
が、これらに限定されるものではない。

【００４６】 昆虫細胞において組換えヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃを発現さ
せるために様々な昆虫細胞発現ベクターを用いることができる。ヒトカルシウム
チャンネルアルファ１Ｇ−ｃの組換え発現のために適当であることができる市販
されている昆虫細胞発現ベクターには、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（ＩｎＶｉｔｒｏ
ｇｅｎ）が包含されるが、これに限定されるものではない。

【００４７】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃをコードするＤＮＡは、組換え宿
主細胞における発現のために発現ベクターにクローン化することができる。組換
え宿主細胞は、エシェリキア・コリのような細菌、酵母のような真菌細胞、ヒト
、ウシ、ブタ、サル及びげっ歯類起源の細胞系を含むがこれらに限定されるもの
ではない哺乳動物細胞、並びにショウジョウバエ及びカイコ由来の細胞系を含む
がこれらに限定されるものではない昆虫細胞を包含するがこれらに限定されるも
のではない原核生物もしくは真核生物のであることができる。適当であることが
できそして市販されている哺乳動物種から得られる細胞系には、ＣＶ−１（ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（
ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、Ｈ
ｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、Ｂ
Ｓ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）
、Ｌ細胞及びＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）が包含されるがこれ
らに限定されるものではない。

【００４８】 発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、リ
ポフェクション及び電気穿孔を包含するがこれらに限定されるものではない多数
の技術のいずれか一つにより宿主細胞に導入することができる。発現ベクターを
含有する細胞をクローン的に増殖させ、そしてそれらがヒトカルシウムチャンネ
ルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質を生産するかどうかを決定するために個々に分析
する。ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃを発現する宿主細胞クローン
の同定は、抗−ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ抗体との免疫学的反
応性及び宿主細胞に関連するヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ活性の
存在を包含するがこれらに限定されるものではないいくつかの手段により行うこ
とができる。

【００４９】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ｃＤＮＡの発現はまた、インビ
トロで製造した合成ｍＲＮＡを用いて行うこともできる。合成ｍＲＮＡもしくは
ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ産生細胞から単離したｍＲＮＡは、
コムギ胚芽抽出物及び網状赤血球抽出物を包含するがこれらに限定されるもので
はない様々な無細胞系において効率よく翻訳することができ、同様にカエル卵母
細胞への微量注入を包含するがこれに限定されるものではない細胞に基づく系に
おいて効率よく翻訳することができ、カエル卵母細胞への微量注入が一般に好ま
しい。

【００５０】 最適レベルのヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ活性及び／もしくは
ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質をもたらすヒトカルシウ
ムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ｃＤＮＡ配列（１つもしくは複数）を決定する
ために、下記のもの：約塩基１から約塩基６８２２までの（これらの番号は、最
初のメチオニンの１番目のヌクレオチド及び最初の終止コドンの前の最後のヌク
レオチドに相当する）約２５２ｋＤａタンパク質をコードするヒトカルシウムチ
ャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ｃＤＮＡの全長オープンリーディングフレーム及び
ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質をコードするｃＤＮＡの
一部を含有するいくつかの構築物を包含するがこれらに限定されるものではない
ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ＤＮＡ分子を構築することができ
る。全ての構築物は、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ｃＤＮＡの
５’もしくは３’非翻訳領域のいずれも含有しないか、全部もしくは一部を含有
するように設計することができる。ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ
活性及びタンパク質発現のレベルは、適切な宿主細胞へのこれらの構築物の単独
及び組み合わせの両方での導入後に決定することができる。一過性アッセイにお
いて最適発現をもたらすヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ＤＮＡカ
セットを決定した後、このヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ＤＮＡ
構築物を、哺乳動物細胞、バキュロウイルスに感染させる昆虫細胞、エシェリキ
ア・コリ及び酵母サッカロミセス・セレビシエを包含するがこれらに限定される
ものではない宿主細胞における発現のために様々な発現ベクターに導入する。

【００５１】 宿主細胞トランスフェクション体（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ）及び微量注
入した卵母細胞は、以下の方法によりヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−
ｃチャンネル活性のレベル及びヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃタン
パク質のレベルの両方をアッセイするために用いることができる。組換え宿主細
胞の場合、これは１つもしくはそれ以上のフラグメントもしくはサブユニットを
コードするヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ＤＮＡを含有する１つ
またはおそらく２つもしくはそれ以上のプラスミドの共トランスフェクションを
含む。卵母細胞の場合、これはヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃタン
パク質の合成ＲＮＡの共注入を含む。発現を考慮した適切な期間の後、細胞タン
パク質を例えば³⁵Ｓ−メチオニンで２４時間代謝的に標識し、その後で細胞ライ
セート及び細胞培養上清を採取し、そしてヒトカルシウムチャンネルアルファ１
Ｇ−ｃタンパク質に対して向けられるポリクローナル抗体での免疫沈降に供する
。

【００５２】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ活性を検出する他の方法は、ヒト
カルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ｃＤＮＡをトランスフェクションした
全細胞もしくはヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ｍＲＮＡを注入し
た卵母細胞におけるヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ活性の直接測定
を含む。ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ活性は、ヒトカルシウムチ
ャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ＤＮＡを発現する宿主細胞の生物学的特性により測
定する。ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃを発現する組換え宿主細胞
の場合、受容体活性を測定しそしてヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ
タンパク質を定量するためにパッチ電位固定技術を用いることができる。卵母細
胞の場合、シングルチャンネル及び全細胞コンダクタンスを決定することにより
カルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ活性を測定しそしてヒトカルシウムチャ
ンネルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質を定量するためにパッチクランプ並びに２電
極電位固定技術を用いることができる。

【００５３】 宿主細胞におけるヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質のレ
ベルは、免疫アフィニティー及び／もしくはリガンドアフィニティー技術により
定量する。ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃを発現する細胞は、細胞
膜に結合する放射性リガンドの量を測定することにより発現されるヒトカルシウ
ムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ分子の数についてアッセイすることができる。例
えば³⁵Ｓ−メチオニンで標識されたもしくは標識されていないヒトカルシウムチ
ャンネルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質を単離するために、ヒトカルシウムチャン
ネルアルファ１Ｇ−ｃ特異的アフィニティービーズもしくはヒトカルシウムチャ
ンネルアルファ１Ｇ−ｃ特異的抗体を用いる。標識されたヒトカルシウムチャン
ネルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。標識され
ていないヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質は、ヒトカルシ
ウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ特異的抗体を用いてウェスタンブロッティング
、ＥＬＩＳＡもしくはＲＩＡアッセイにより検出する。

【００５４】 遺伝暗号は縮重しているので、特定のアミノ酸をコードするために１個より多
くのコドンを用いることができ、従って、アミノ酸配列は、一組の同様のＤＮＡ
オリゴヌクレオチドのいずれかによりコードすることができる。この組の一つの
メンバーのみがヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ配列と同一であるが
、適切な条件下でミスマッチを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でさえ
ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ＤＮＡにハイブリダイズすること
ができる。別の条件下で、ミスマッチＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ヒトカルシ
ウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃをコードするＤＮＡの同定及び単離を可能にす
るためにヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ＤＮＡにそれでもなおハ
イブリダイズすることができる。

【００５５】 特定の生物からのヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃをコードするＤ
ＮＡは、他の生物からのヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃの相同物を
単離し精製するために用いることができる。これを成し遂げるために、第一のヒ
トカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ＤＮＡを、適切なハイブリダイゼー
ション条件下でヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃの相同物をコードす
るＤＮＡを含有するサンプルと混合することができる。ハイブリダイズしたＤＮ
Ａ複合体を単離し、そして相同なＤＮＡをコードするＤＮＡをそれから精製する
ことができる。

【００５６】 特定のアミノ酸をコードする様々なコドンにはかなりの量の重複があることが
知られている。従って、本発明はまた、同一アミノ酸の最終的翻訳をコードする
別のコドンを含有するＤＮＡ配列にも関する。本明細書の目的のために、一つも
しくはそれ以上の置換されたコドンを保有する配列は縮重変異体として定義され
る。同様に本発明の範囲内に含まれるのは、発現タンパク質の最終的な物理的性
質を実質的に改変しないＤＮＡ配列もしくは翻訳タンパク質のいずれかにおける
突然変異である。例えば、ロイシンの代わりのバリン、リシンの代わりのアルギ
ニンもしくはグルタミンの代わりのアスパラギンの置換は、ポリペプチドの機能
性における変化をもたらさない可能性がある。そのような置換は周知であり、そ
して例えばＷａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．によるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，４^th Ｅｄ．Ｂｅｎｇａｍｉｎ Ｃｕｍｍｉｎ
ｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．に記述されている。

【００５７】 ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然に存在するペプチドのものと異なる
特性を有するペプチドをコードするように改変できることが知られている。ＤＮ
Ａ配列を改変する方法には、部位特異的突然変異誘発が包含されるがこれに限定
されるものではない。改変する特性の例には、基質に対する酵素もしくはリガン
ドに対する受容体の親和性の変化が包含されるがこれらに限定されるものではな
い。

【００５８】 本明細書において用いる場合、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃの
「機能性誘導体」は、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃの生物学的活
性と実質的に同様である生物学的活性（機能もしくは構造のいずれか）を有する
化合物である。「機能性誘導体」という用語には、ヒトカルシウムチャンネルア
ルファ１Ｇ−ｃの「フラグメント」、「変異体」、「縮重変異体」、「類似体」
及び「相同物」もしくは「化学的誘導体」が包含されるものとする。「フラグメ
ント」という用語は、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃの任意のポリ
ペプチドサブセットをさすものとする。「変異体」という用語は、全ヒトカルシ
ウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ分子もしくはそのフラグメントのいずかと構造
及び機能において実質的に同様である分子をさすものとする。ある分子はヒトカ
ルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃと、両方の分子が実質的に同様の構造を有
する場合もしくは両方の分子が同様の生物学的活性を有する場合に「実質的に同
様である」。従って、２つの分子が実質的に同様の活性を有する場合、たとえそ
れらの分子の一方の構造がもう一方に存在しないとしても、もしくはたとえ２つ
のアミノ酸配列が同一ではないとしても、それらは変異体であるとみなされる。
「類似体」という用語は、全ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ分子も
しくはそのフラグメントのいずれかに機能において実質的に同様である分子をさ
す。カルシウムチャンネル活性に関する「機能性の」という用語は、チャンネル
が、刺激及び／もしくはチャンネルに親和性を有する結合リガンドに応答して、
Ｃａ＋２もしくはＢａ＋２またはＣａ＋２もしくはＢａ＋２の流れを遮断するイ
オンを包含するがこれらに限定されるものではないカルシウムチャンネル選択的
イオンの侵入を与えそして調節できることを意味する。好ましくは、そのような
チャンネル活性は、宿主細胞中にあるあらゆる内因性カルシウムチャンネル活性
から、例えば当業者に既知である電気生理学的、薬理学的及び他の手段により区
別することができる。

【００５９】 組換え宿主細胞におけるヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃの発現後
に、活性形態のヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃを提供するためにヒ
トカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質を回収することができる。
いくつかのヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ精製方法が利用でき、そ
して使用に適している。天然起源からのヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ
−ｃの精製について前に記述したように、組換えヒトカルシウムチャンネルアル
ファ１Ｇ−ｃは、細胞ライセート及び抽出物から、もしくはならし培養培地から
、塩分別、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒ
ドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラ
フィーの様々な組み合わせもしくは個々の適用により精製することができる。

【００６０】 さらに、組換えヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃは、全長の新生ヒ
トカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ、ヒトカルシウムチャンネルアルファ
１Ｇ−ｃのポリペプチドフラグメントもしくはヒトカルシウムチャンネルアルフ
ァ１Ｇ−ｃサブユニットに特異的なモノクローナルもしくはポリクローナル抗体
で作製した免疫アフィニティーカラムの使用により他の細胞タンパク質から分離
することができる。

【００６１】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃに対する単一特異性抗体は、ヒト
カルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃに対して反応する抗体を含有する哺乳動
物抗血清から精製するか、もしくはＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，
Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）の技術を用いてヒトカルシ
ウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃと反応するモノクローナル抗体として製造する
。単一特異性抗体は、本明細書において使用する場合、ヒトカルシウムチャンネ
ルアルファ１Ｇ−ｃに対する均質な結合特性を有する単一の抗体種もしくは複数
の抗体種として定義される。均質な結合は、本明細において用いる場合、上記の
ような、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃと関連するもののような、
特定の抗原もしくはエピトープに結合する抗体種の能力をさす。ヒトカルシウム
チャンネルアルファ１Ｇ−ｃ特異的抗体は、免疫アジュバントと共にもしくはそ
れなしに適切な濃度のヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃで、マウス、
ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマ等のような動物を免疫することにより
作製し、ウサギが好ましい。

【００６２】 最初の免疫の前に免疫前血清を集める。許容しうる免疫アジュバントと会合し
た約０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇの間のヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ
−ｃを各動物に与える。そのような許容しうるアジュバントには、フロイント完
全、フロイント不完全、明礬沈殿物、瘡菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｐａｒｖｕｍ）を含有する油中水滴型エマルジョン及びｔＲＮＡが包含される
がこれらに限定されるものではない。最初の免疫は、皮下（ＳＣ）、腹腔内（Ｉ
Ｐ）もしくは両方のいずれかで複数部位で好ましくはフロイント完全アジュバン
ト中のヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃからなる。抗体力価を決定す
るために、各動物から一定間隔で、好ましくは毎週瀉血する。動物には、最初の
免疫後にブースター注射を与えることができもしくは与えなくてもよい。ブース
ター注射を与える動物には、一般に、同じ経路によりフロイント不完全アジュバ
ント中の等量の抗原を与える。ブースター注射は、最大力価が得られるまで約３
週間隔で与える。各ブースター免疫後約７日でもしくは一回の免疫後ほぼ毎週、
動物から瀉血し、血清を集め、そしてアリコートを約−２０℃で保存する。

【００６３】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃと反応するモノクローナル抗体（
ｍＡｂ）は、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃで近交系マウス、好ま
しくはＢａｌｂ／ｃを免疫することにより製造する。マウスは、上記説明のよう
に、等容量の許容しうるアジュバントに含まれる約０．５ｍｌのバッファーもし
くは食塩水中約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、好ましくは約１ｍｇのヒトカルシウム
チャンネルアルファ１Ｇ−ｃでＩＰもしくはＳＣ経路により免疫する。フロイン
ト完全アジュバントが好ましい。マウスに０日に最初の免疫を与え、そして約３
〜約３０週間休ませる。免疫したマウスに静脈内（ＩＶ）経路によりリン酸緩衝
食塩水のようなバッファー溶液中約０．１〜約１０ｍｇのヒトカルシウムチャン
ネルアルファ１Ｇ−ｃの１回もしくはそれ以上のブースター免疫を与える。免疫
したマウスから当該技術分野において既知である標準的な方法により脾臓を取り
除くことにより、抗体陽性マウスからのリンパ球、好ましくは脾臓リンパ球を得
る。安定なハイブリドーマの形成を与える条件下で、脾臓リンパ球を適切な融合
相手、好ましくは骨髄腫細胞と混合することによりハイブリドーマ細胞を製造す
る。融合相手には：マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ
−１９４及びＳｐ２／０を包含することができるが、これらに限定されるもので
はなく、Ｓｐ２／０が一般に好ましい。抗体産生細胞及び骨髄腫細胞は、約３０
％〜約５０％の濃度で、ポリエチレングリコール、約１０００ｍｏｌ．ｗｔ中で
融合させる。融合したハイブリドーマ細胞は、当該技術分野において既知である
方法によりヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを補足したダルベッコ
の修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）における増殖によって選択する。増殖陽性ウェ
ルから約１４、１８及び２１日に上清液を集め、そして抗原としてヒトカルシウ
ムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃを用いて固相免疫放射線検定法（ＳＰＩＲＡ）の
ような免疫アッセイにより抗体生産についてスクリーニングする。培養液はまた
、ｍＡｂのアイソタイプを決定するためにオークターロニー沈降アッセイにおい
ても試験する。抗体陽性ウェルからのハイブリドーマ細胞は、Ｔｉｓｓｕｅ Ｃ
ｌｕｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｋｒｕｓ
ｅ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１
９７３中のＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｓｏｆｔ Ａｇａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
の軟寒天技術のような技術によりクローン化する。

【００６４】 モノクローナル抗体は、プリスタンプライミングＢａｌｂ／ｃマウスにプライ
ミングの約４日後に約２ｘ１０⁶〜約６ｘ１０⁶のハイブリドーマ細胞をマウス当
たり約０．５ｍｌ注入することによりインビボで製造する。細胞導入後約８−１
２日で腹水液を集め、そして当該技術分野において既知である技術によりモノク
ローナル抗体を精製する。

【００６５】 抗−ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ｍＡｂのインビトロ製造は
、十分な量の特異的ｍＡｂを得るために約２％のウシ胎仔血清を含有するＤＭＥ
Ｍにおいてハイブリドーマを増やすことにより実施する。ｍＡｂは、当該技術分
野において既知である技術により精製する。

【００６６】 腹水もしくはハイブリドーマ培養液の抗体力価は、沈降、受身凝集反応、酵素
結合イムノソルベント抗体（ＥＬＩＳＡ）技術及び放射線免疫検定法（ＲＩＡ）
技術が包含されるがこれらに限定されるものではない様々な血清学的もしくは免
疫学的アッセイにより決定する。体液もしくは組織及び細胞抽出物におけるヒト
カルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃの存在を検出するために同様のアッセイ
を用いる。

【００６７】 単一特異性抗体を製造するための上記の方法は、ヒトカルシウムチャンネルア
ルファ１Ｇ−ｃポリペプチドフラグメント、もしくは全長の新生ヒトカルシウム
チャンネルアルファ１Ｇ−ｃポリペプチド、もしくは個々のヒトカルシウムチャ
ンネルアルファ１Ｇ−ｃドメインに特異的な抗体を製造するために利用できるこ
とは当業者に容易に明らかである。詳細には、ヒトカルシウムチャンネルアルフ
ァ１Ｇ−ｃに特異的な単一特異性抗体は、２３アミノ酸の挿入物から得られる抗
原性ペプチドもしくはそのフラグメントで動物を免疫することにより作製できる
ことは当業者に容易に明らかである。

【００６８】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ抗体アフィニティーカラムは、抗
体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシス
クシンイミドエステルで活性化されるゲル支持体、Ａｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ）に抗体を加えることにより作製する。次に抗体をスペーサーアーム
とのアミド結合によりゲルに連結する。残っている活性化エステルを次に１Ｍエ
タノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）でクエンチする。あらゆる結合していない抗体
もしくは外来タンパク質を除くためにカラムを水、続いて０．２３ＭグリシンＨ
Ｃｌ（ｐＨ２．６）で洗浄する。次にカラムをリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．３）
において平衡化し、そしてヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃもしくは
ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃサブユニットを含有する細胞培養上
清もしくは細胞抽出物をカラムにゆっくりと通す。次にカラムをリン酸緩衝食塩
水で光学密度（Ａ₂₈₀）がバックグラウンドに下がるまで洗浄し、次にタンパク
質を０，２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶出する。精製したヒトカル
シウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質を次にリン酸緩衝食塩水に対して
透析する。

【００６９】 組換え宿主細胞において発現させると、カルシウムの流入を調節しそしてＮＰ
ＰＢ（５−ニトロ−２−（３−フェニルプロピルアミノ）安息香酸）に感受性で
あるチャンネルを形成するタンパク質をコードするヒトカルシウムチャンネルア
ルファ１Ｇ−ｃと称するＤＮＡクローンが同定される。ヒトカルシウムチャンネ
ルアルファ１Ｇ−ｃ ＤＮＡの発現は、適切な刺激での直接活性化を包含する、
ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃをコードするポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを
注入した卵母細胞において認められる特性の再構成をもたらす。

【００７０】 本発明はまた、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃをコードするＤＮ
ＡもしくはＲＮＡの発現並びに発現されるヒトカルシウムチャンネルアルファ１
Ｇ−ｃタンパク質の量をモジュレ−ションする化合物についてスクリーニングす
る方法にも関する。「化合物」という用語は、小さな有機もしくは無機分子（二
価イオンを包含する）、合成もしくは天然のアミノ酸ポリペプチド、タンパク質
、または合成もしくは天然の核酸配列をさす。化合物は、ヒトカルシウムチャン
ネルアルファ１Ｇ−ｃをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現、または細胞表
面ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質の量を増やすかまたは
減らすことによりモジュレーションすることができる。ヒトカルシウムチャンネ
ルアルファ１Ｇ−ｃをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現またはヒトカルシ
ウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質の量をモジュレーションする化合物
は、様々なアッセイにより検出することができる。アルファ１Ｇ−ｃの発現のレ
ベルの変化を測定するアッセイは、当該技術分野において周知である様々な手段
、例えばｍＲＮＡ、細胞内タンパク質（小胞体もしくはゴルジ装置内でプロセシ
ングされるタンパク質を新たに合成する）、もしくは細胞表面タンパク質の量の
変化により成し遂げることができる。ｍＲＮＡのレベルは、逆転写ポリメラーゼ
連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、またはディファレンシャル遺伝子発現（定量
的遺伝子チップ）により検出する。免疫アフィニティーは、宿主細胞内及びその
表面上の両方のタンパク質のレベルを定量する。タンパク質特異的アフィニティ
ービーズもしくは特異的抗体は、例えば³⁵Ｓ−メチオニンで標識されたもしくは
標識されていないタンパク質を単離するために用いる。標識されたタンパク質は
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。標識されていないタンパク質は、特異的抗体
を用いてウェスタンブロッティング、蛍光細胞ソーティングによる細胞表面検出
、ＥＬＩＳＡもしくはＲＩＡにより検出する。

【００７１】 ヒトアルファ１Ｇ−ｃカルシウムチャンネル活性をモジュレーションする化合
物を同定するための真核細胞を用いるアッセイもまた提供される。これらのアッ
セイを実施する際に、本明細書に記述するＤＮＡ配列によりコードされる異種起
源のヒトアルファ１Ｇ−ｃカルシウムチャンネルを発現する真核細胞は、試験化
合物及びカルシウムチャンネル選択的イオンを含有する溶液中にあり、細胞膜を
脱分極させ、そして細胞に流れ込む電流を検出する。試験化合物がカルシウムチ
ャンネル活性をモジュレーションするものである場合、検出される電流は、同じ
カルシウムチャンネル選択的イオンの存在下であるが化合物の非存在下で同じも
しくは実質的に同じ細胞を脱分極させることにより生じるものと異なる。好まし
い態様として、細胞は哺乳動物細胞、最も好ましくはＨＥＫ２９３細胞、もしく
は両生類卵母細胞である。アッセイ方法は、（ａ）ヒトアルファ１Ｇ−ｃカルシ
ウムチャンネルを発現する細胞におけるヒトアルファ１Ｇ−ｃの活性を測定する
こと；（ｂ）化合物を細胞と接触させること；及び（ｃ）細胞における変化をモ
ニターすることの工程を含んでなる。これらのアッセイにおいて、アゴニストは
、チャンネルを活性化するかもしくは不活性化の電位依存性を変えるために通常
は十分ではないＫの濃度の存在下で、高いＫ脱分極刺激なしにＣａ流入を増す。
これらのアッセイにおいて、アンタゴニストは、高いカリウムにより誘発される
Ｃａ流入を遮断する。電気生理学的なカルシウムチャンネル機能を測定するアッ
セイは、例えば、フルオ−３のようなＣａ感受性色素もしくは⁴⁵Ｃａのような放
射性イオンまたは電位固定技術を用いることにより、Ｃａ流入の量もしくは期間
を測定する。電位感受性色素及び電流固定電気生理学的技術は、Ｃａ流入の結果
生じる脱分極を測定するために用いることができる。試験方法のさらに別の態様
は、１９９１年８月７日に出願されたＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９１／
５６２５号に記述されているように、Ｃａ感受性プロモーターの誘導制御下の転
写に基づくアッセイを用いることによりＣａ流入の「下流の」結果を測定する。

【００７２】 これらのアッセイは、発現もしくは機能の変化があるかどうかを決定するため
の簡単な「イエス／ノー」アッセイであることができ、またはそれらは、基準サ
ンプルにおける発現もしくは機能のレベルと試験サンプルの発現もしくは機能と
を比較することにより定量的にすることができる。これらの方法のいずれかによ
り同定されるモジュレーターは、治療薬として有用である。

【００７３】 本明細書に開示するアッセイにおいて同定されるモジュレーターは、ヒトアル
ファ１Ｇ−ｃ活性によりもたらされる処置疾患の治療薬として有用な候補である
。ヒトアルファ１Ｇ−ｃによりもたらされる可能性があるそのような活性には、
癲癇、精神分裂病、鬱病、睡眠障害、ストレス、内分泌疾患、呼吸器疾患、末梢
筋肉疾患、筋肉興奮性、クッシング病、受精、避妊、ニューロン発射調節を冒す
疾患、呼吸器疾患、高血圧、心臓リズム、シナプスシグナルの相乗作用、収縮期
高血圧における増大する動脈コンプライアンス、血管膨張を減らすことによるよ
うな筋肉緊張、心臓肥大、心臓線維症、アテローム性動脈硬化症、並びに心筋梗
塞、不整脈、心不全及び狭心症が含まれるがこれらに限定されるものではない心
臓血管障害、並びに細胞増殖（タンパク質合成、細胞分化、及び増殖）が包含さ
れる。ヒトアルファ１Ｇ−ｃカルシウムチャンネル活性をモジュレーションする
化合物は：（ａ）例えば、外傷性損傷、手術もしくは心肺バイパス後の血圧制御
を回復させる処置、及び麻酔薬の心臓血管作用を最小限に抑えるように設計され
る予防処置；（ｂ）自律神経系による血管反射及び血圧制御を改善する処置にお
いて血管を拡張するかもしくは血管を収縮するいずれかの血管平滑筋緊張を調節
することにおいて有用であることができる。ヒトアルファ１Ｇ−ｃカルシウムチ
ャンネル活性をモジュレーションする化合物はまた、泌尿器学疾患及び生殖障害
の処置：（ａ）手術、外傷性損傷、尿毒症及び不都合な薬剤反応後の腎機能を処
置し回復させること；（ｂ）膀胱機能不全を処置すること；並びに（ｃ）血液透
析での患者における尿毒症性ニューロン毒性及び低血圧：生殖障害；（ｄ）不能
症を包含する性的機能の障害；（ｅ）アルコール性不能症（Ｔ型カルシウムチャ
ンネル制御を受けている可能性がある自律神経制御下）；並びに（ｆ）受精能（
（オスにおける）セルトリ細胞もしくは（哺乳動物卵では）透明帯に対する直接
作用によるかまたはホルモンフィードバックのモジュレーションによる）におい
ても有用であることができる。ヒトアルファ１Ｇ−ｃカルシウムチャンネル活性
をモジュレーションする化合物は、アルコールの急性過剰消費の結果生じるニュ
ーロン毒性及び自律神経系損傷を処置し減らすことにおいて肝疾患の処置に有用
であることができる。ヒトアルファ１Ｇ−ｃカルシウムチャンネル活性をモジュ
レーションする化合物は、神経学的疾患；（ａ）癲癇及び間脳性癲癇；（ｂ）パ
ーキンソン病：並びに（ｃ）震え及び汗腺分泌及び末梢血管血液供給の異常のよ
うな異常な温度制御の有用な処置であることができる。ヒトアルファ１Ｇ−ｃカ
ルシウムチャンネル活性をモジュレーションする化合物は、異常な呼吸、例えば
麻酔薬の術後合併症及び内分泌疾患；（ａ）ノルアドレナリン、ドーパミン及び
他のホルモンの異常な分泌を包含する異常な下垂体及び視床下部機能を処置する
こと；並びに（ｂ）インシュリン、チロキシンアドレナリンの過剰生産及び他の
ホルモン失調の処置に有用であることができる。

【００７４】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ヒトカ
ルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃに対する抗体、またはヒトカルシウムチャ
ンネルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質を含有するキットを製造することができる。
そのようなキットは、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ＤＮＡにハ
イブリダイズするＤＮＡを検出するため、またはサンプル中のヒトカルシウムチ
ャンネルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質もしくはペプチドフラグメントの存在を検
出するために用いる。そのような特性化は、法医学分析、診断用途及び疫学研究
が包含されるがこれらに限定されるものではない様々な目的のために有用である
。

【００７５】 本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質及び抗体は、ヒトカルシ
ウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ＤＮＡ、ヒトカルシウムチャンネルアルファ
１Ｇ−ｃ ＲＮＡもしくはヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃタンパク
質のレベルをスクリーニングし、測定するために用いることができる。組換えタ
ンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子及び抗体は、ヒトカルシウムチャンネルアル
ファ１Ｇ−ｃの検出及びタイピングのために適当なキットの形成に役立つ。その
ようなキットは、少なくとも一つの容器を密封して保持するために適当な区分さ
れたキャリヤー（ｃａｒｒｉｅｒ）を含んでなる。キャリヤーは、組換えヒトカ
ルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質もしくはヒトカルシウムチャン
ネルアルファ１Ｇ−ｃを検出するために適当な抗−ヒトカルシウムチャンネルア
ルファ１Ｇ−ｃ抗体のような試薬をさらに含んでなる。キャリヤーはまた、標識
した抗原もしくは酵素基質等のような検出の手段を含有することもできる。

【００７６】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃをコードするＤＮＡ配列に相補的
なヌクレオチド配列をアンチセンス治療のために合成することができる。これら
のアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホネー
トのようなＤＮＡの安定な誘導体、ＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡのような
ＲＮＡの安定な誘導体、もしくは他のヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−
ｃアンチセンスオリゴヌクレオチド模倣物であることができる。ヒトカルシウム
チャンネルアルファ１Ｇ−ｃアンチセンス分子は、微量注入、リポソーム包膜化
によりもしくはアンチセンス配列を保有するベクターからの発現により細胞に導
入することができる。ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃアンチセンス
治療は、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ活性を減らすことが有益で
ある疾患の処置のために特に有用であることができる。

【００７７】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ遺伝子治療は、標的生物の細胞に
ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃを導入するために用いることができ
る。ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ遺伝子は、レシピエント宿主細
胞の感染によりヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ＤＮＡの導入をも
たらすウイルスベクターに連結することができる。適当なウイルスベクターには
、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、
ワクシニアウイルス、ポリオウイルス等が包含される。あるいはまた、ヒトカル
シウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ＤＮＡは、リガンド−ＤＮＡコンジュゲー
トもしくはアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡコンジュゲートを用いる受容体に
よりもたらされる選択的ＤＮＡ導入、リポフェクション膜融合または直接微量注
入を包含する非ウイルス技術により遺伝子治療のための細胞に導入することがで
きる。これらの方法及びそのバリエーションは、エクスビボ並びにインビボヒト
カルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ遺伝子治療のために適している。ヒトカ
ルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ遺伝子治療は、ヒトカルシウムチャンネル
アルファ１Ｇ−ｃ活性を高めることが有益である疾患の処置のために特に有用で
あることができる。

【００７８】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ＤＮＡ、ヒトカルシウムチャン
ネルアルファ１Ｇ−ｃ ＲＮＡ、もしくはヒトカルシウムチャンネルアルファ１
Ｇ−ｃタンパク質、もしくはヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ活性の
モジュレーターを含んでなる製薬学的に有用な組成物は、製薬学的に許容しうる
担体の混合によるような既知の方法に従って調合することができる。そのような
担体及び調合方法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出すことができる。有効な投与のために適当な製薬
学的に許容しうる組成物を生成せしめるために、そのような組成物は、有効量の
タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはモジュレーターを含有する。

【００７９】 本発明の治療もしくは診断組成物は、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ
−ｃ関連活性のモジュレーションの適応がある疾患を処置もしくは診断するため
に十分な量で個体に投与する。有効量は、個体の症状、体重、性別及び年齢のよ
うな様々な因子により異なることができる。他の因子には、投与の形態が包含さ
れる。製薬学的組成物は、皮下、局所、経口及び筋肉内のような様々な経路によ
り個体に与えることができる。

【００８０】 「化学的誘導体」という用語は、通常は基本分子の一部ではない追加の化学成
分を含有する分子を表す。そのような成分は、基本分子の可溶性、半減期、吸収
等を向上することができる。あるいはまた、成分は、基本分子の有害な副作用を
弱めるかもしくは基本分子の毒性を減らすことができる。そのような成分の例は
、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
のような様々な指定図書に記述されている。

【００８１】 本明細書に開示する方法に従って同定される化合物は、あらゆる可能性がある
毒性を最小限に抑えながらヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃもしくは
その活性の最適抑制を得るために慣例的な試験により特定される適切な投薬量で
単独に用いることができる。さらに、他の薬剤の共投与もしくは順次投与が望ま
しい可能性がある。

【００８２】 本発明はまた、本発明の新規な処置方法における使用のために適当な局所、経
口、全身及び非経口製薬学的製剤を提供するという目的も有する。ヒトカルシウ
ムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ受容体のモジュレーションに使用する有効成分と
して本発明に従って同定される化合物もしくはモジュレーターを含有する組成物
は、投与のための通常の賦形剤中多種多様な治療剤形で投与することができる。
例えば、化合物もしくはモジュレーターは、錠剤、カプセル剤（各々、徐放性及
び持続性製剤を包含する）、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、液
剤、懸濁剤、シロップ剤及び乳剤のような経口剤形で、もしくは注入により投与
することができる。同様に、それらはまた、全て薬学分野の当業者に周知である
形態を用いて、静脈内（ボーラス及び注入の両方）、腹腔内、皮下、閉ざしたも
しくは閉ざさない局所、または筋肉内形態で投与することもできる。ヒトカルシ
ウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃモジュレーション剤として、所望の化合物の有
効であるが無毒である量を用いることができる。

【００８３】 生成物の日量は、１日につき患者当たり０．０１〜１，０００ｍｇの広範囲に
わたって変えることができる。経口投与では、組成物は、好ましくは、処置する
患者に対する投薬量の症状による調整のために０．０１、０．０５、０．１、０
．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０及び５０．０ミ
リグラムの有効成分を含有する刻み目をつけたもしくは刻み目をつけていない錠
剤の形態で与える。有効量の薬剤は、通常、１日につき約０．０００１ｍｇ／ｋ
ｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量レベルで与える。この範囲は、より特に１
日につき約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。ヒトカルシウム
チャンネルアルファ１Ｇ−ｃモジュレーターの投薬量は、所望の効果を得るため
に組み合わせる場合調整される。一方、これらの様々な薬剤の投薬量は、独立し
て最適化し、そしていずれかの薬剤を単独に用いる場合より病状が減少する相乗
作用の結果を得るために組み合わせることができる。

【００８４】 都合よく、本発明の化合物もしくはモジュレーターは、単一の日量で投与する
ことができ、または総日量を毎日２、３もしくは4回の分割した用量で投与する
ことができる。さらに、本発明の化合物もしくはモジュレーターは、適当な鼻内
賦形剤の局所使用により鼻内形態で、または当業者に周知である経皮皮膚パッチ
の形態を用いて経皮経路により投与することができる。経皮送達系の形態で投与
するために、投薬量投与は、もちろん、投薬量処方計画の間中断続的よりむしろ
継続的である。

【００８５】 有効薬剤が別個の投薬製剤である、一つより多くの有効薬剤での併用処置では
、有効製剤を同時に投与することができ、またはそれらを各々別個のずらした時
間で投与することができる。

【００８６】 本発明の化合物もしくはモジュレーターを利用する投薬処方計画は、患者のタ
イプ、人種、年齢、体重、性別及び医療状態；処置する症状の重さ；投与の経路
；患者の腎及び肝機能；並びに用いるその特定の化合物を包含する様々な因子に
従って選択する。通常の技量の医師もしくは獣医は、症状の進行を防ぐか、阻止
するかもしくは止めるために必要とされる薬剤の有効量を用意に決定し処方する
ことができる。毒性なしに効能をもたらす範囲内の薬剤の濃度を達成することに
おける最高精度は、標的部位への薬剤の利用能の反応速度論に基づく処方計画を
必要とする。これは、薬剤の分布、平衡及び除去の考察を含む。

【００８７】 本発明の方法において、本明細書に詳細に記述する化合物もしくはモジュレー
ターは有効成分であることができ、そして典型的には意図される投与形態、すな
わち、経口錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤等に関して適当に選択
されそして通常の製薬学的実践と一致する適当な製薬学的希釈剤、賦形剤もしく
は担体（集合的に本明細書では「担体」材料と称する）と混合して投与する。

【００８８】 例えば、錠剤もしくはカプセル剤の形態の経口投与では、有効薬剤成分は、エ
タノール、グリセロール、水等のような経口の無毒の製薬学的に許容しうる不活
性担体と合わせることができる。さらに、所望もしくは必要に応じて、適当な結
合剤、潤滑剤、崩壊剤及び着色剤を混合物に導入することもできる。適当な結合
剤には、限定なしに、澱粉、ゼラチン、グルコースもしくはβ−ラクトースのよ
うな天然の糖、コーン甘味料、アカシア、トラガカントもしくはアルギン酸ナト
リウムのような天然及び合成のゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレ
ングリコール、ワックス等が包含される。これらの剤形に用いる潤滑剤には、限
定なしに、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグ
ネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が包含され
る。崩壊剤には、限定なしに、澱粉、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、
キサンタンゴム等が包含される。

【００８９】 液体形態では、有効薬剤成分は、合成及び天然のゴム、例えば、トラガカント
、アカシア、メチルセルロース等のような適当に風味をつけた沈殿防止剤もしく
は分散助剤に合わせることができる。用いることができる他の分散助剤には、グ
リセリン等が包含される。非経口投与では、滅菌した懸濁剤及び液剤が所望され
る。静脈剤投与が所望される場合には、一般に適当な防腐剤を含有する等張製剤
を用いる。

【００９０】 有効薬剤成分を含有する局所製剤は、例えばアルコール、アロエ・ベラゲル、
アラントイン、グリセリン、ビタミンＡ及びＥ油、鉱油、ＰＰＧ２プロピオン酸
ミリスチル等のような当該技術分野において周知である様々な担体材料と混合す
ることができ、例えばアルコール性溶液、局所洗剤、クレンジングクリーム、ス
キンゲル、スキンローション、及びクリームもしくはゲル配合物のシャンプーを
生成せしめる。

【００９１】 本発明の化合物もしくはモジュレーターはまた、小さい一重層小胞、大きい一
重層小胞及び多重層小胞のようなリポソーム送達系の形態で投与することもでき
る。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンもしくはホスファチジル
コリンのような様々なリン脂質から形成することができる。

【００９２】 本発明の化合物はまた、化合物分子を連結させる個々の担体としてモノクロー
ナル抗体の使用により送達することもできる。本発明の化合物もしくはモジュレ
ーターはまた、攻撃目標設定可能な薬物担体として可溶性ポリマーと連結するこ
ともできる。そのようなポリマーには、ポリビニル−ピロリドン、ピランコポリ
マー、ポリヒドロキシプロピルメタクリル−アミドフェノール、ポリヒドロキシ
−エチルアスパルトアミドフェノール、もしくはパルミトイル残基で置換したポ
リエチル−エンオキシドポリリシンを包含することができる。さらに、本発明の
化合物もしくはモジュレーターは、薬剤の制御放出を達成することにおいて有用
な生物分解性ポリマーの種類、例えば、ポリ乳酸、ポリエプシロン、カプロラク
トン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒド
ロ−ピラン、ポリシアノアクリレート及びヒドロゲルの架橋したもしくは両親媒
性ブロックコポリマーに連結することができる。

【００９３】 経口投与では、化合物もしくはモジュレーターは、カプセル剤、錠剤もしくは
ボーラス形態で投与することができ、あるいはまた、それらは動物飼料に混合す
ることができる。カプセル剤、錠剤及びボーラスは、澱粉、タルク、ステアリン
酸マグネシウムもしくはリン酸ジカルシウムのような適切な担体賦形剤と組み合
わせた有効成分を含んでなる。これらの単位剤形は、均一な混合物が得られるよ
うに希釈剤、増量剤、崩壊剤及び／もしくは結合剤を包含する適当な細かく粉末
にした不活性成分と有効成分とをよく混合することにより製造する。不活性成分
は、化合物もしくはモジュレーターと反応しないそして処置する動物に無毒であ
るものである。適当な不活性成分には、澱粉、ラクトース、タルク、ステアリン
酸マグネシウム、植物ゴム及び油等が包含される。これらの製剤は、処置する動
物種の大きさ及びタイプ並びに感染のタイプ及び重さのような多数の因子により
大きく変えられる量の有効及び不活性成分を含有することができる。有効成分は
また、化合物を食品と単に混合することによりもしくは化合物を飼料の表面に加
えることにより飼料への添加物として投与することもできる。あるいはまた、有
効成分は不活性担体と混合することができ、そして得られる組成物を次に飼料と
混合するかもしくは動物に直接与えることができる。適当な不活性担体には、ひ
き割りトウモロコシ粉、柑橘類粗びき粉、発酵残留物、ダイズ粗粒、乾燥穀粒等
が包含される。有効成分は、最終組成物が０．００１〜５重量％の有効成分を含
有するように粉砕、攪拌、微粉砕もしくはタンブリングによりこれらの不活性担
体とよく混合する。

【００９４】 あるいはまた、化合物もしくはモジュレーターは、不活性液体担体に溶解した
有効成分からなる製剤の注入により非経口的に投与することができる。注入は、
筋肉内、管内、気管内もしくは皮下のいずれかであることができる。注入可能な
製剤は、適切な不活性液体担体と混合した有効成分からなる。許容しうる液体担
体には、落花生油、綿実油、ゴマ油等のような植物油並びにソルケタール、グリ
セロール、ホルマール等のような有機溶媒が包含される。代案として、水性の非
経口製剤もまた用いることができる。植物油は好ましい液体担体である。製剤は
、最終製剤が０．００５〜１０重量％の有効成分を含有するように有効成分を液
体担体に溶解もしくは懸濁することにより製造する。

【００９５】 化合物もしくはモジュレーターの局所施用は、水性の溶液もしくは懸濁液とし
て本発明の化合物もしくはモジュレーターを含有する液体ドレンチ（ｄｒｅｎｃ
ｈ）もしくはシャンプーの使用により可能である。これらの製剤は、一般に、ベ
ントナイトのような沈殿防止剤を含有し、そして通常は泡消剤も含有する。０．
００５〜１０重量％の有効成分を含有する製剤が許容しうる。好ましい製剤は、
０．０１〜５重量％の本発明の化合物もしくはモジュレーターを含有するもので
ある。

【００９６】 以下の実施例は本発明を例示するが、しかしながら、本発明をそれらに限定し
ない。

【００９７】 実施例１ ヒト視床ライブラリーの作製 ｃＤＮＡ合成： 第一鎖合成： ｃＤＮＡ合成キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用
いてｃＤＮＡを合成するために約５μｇのヒト視床ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
）を用いた。５μｌのｍＲＮＡに２μｌのＮｏｔ１プライマーアダプターを加え
、そして混合物を７０℃に１０分間加熱し、氷上に置いた。以下の試薬を氷上で
加えた：４μｌの５ｘ第一鎖バッファー（２５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．３）、３７５ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂）、２μｌの０．１Ｍ ＤＴ
Ｔ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ（ヌクレオチド３リン酸）混合物及び１μｌのＤＥＰＣ
処理した水。反応物を４２℃で５分間インキュベーションした。最後に、５μｌ
のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＲＴ ＩＩを加え、そして４２℃でさらに２時間イン
キュベーションした。反応を氷上で止めた。第二鎖合成： 第一鎖生成物を水で９３μｌに調整し、そして以下の試薬を氷上で
加えた：３０μｌの５ｘ第二鎖バッファー（５ｘ濃度（ｍＭ単位）：１００ｍＭ
ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ６．９）、４５０ｍＭ ＫＣｌ、２３ｍＭ ＭｇＣｌ₂、
０．７５ｍＭ β−ＮＡＤ＋、５０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄）、３μｌの１０ｍＭ
ｄＮＴＰ（ヌクレオチド３リン酸）、１μｌ エシェリキア・コリＤＮＡリガー
ゼ（１０ユニット）、１μｌ ＲＮアーゼＨ（２ユニット）、４μｌ ＤＮＡ ｐ
ｏｌＩ（１０ユニット）。反応物を１６℃で２時間インキュベーションした。Ｄ
ＮＡ末端を平滑化するために第二鎖合成からのＤＮＡをＴ４ ＤＮＡポリメラー
ゼで処理しそして１６℃で置いた。二本鎖ｃＤＮＡをフェノール及びクロロホル
ム（１：１、ｖ：ｖ）の１５０μｌの混合物で抽出し、そして０．５容量の７．
５Ｍ ＮＨ₄ＯＡｃ及び２容量の無水エタノールで沈殿させた。ペレットを７０％
エタノールで洗浄し、そして残留エタノールを除くために３７℃ですっかり乾燥
させた。二本鎖ＤＮＡペレットを２５μｌの水に再懸濁し、そして以下の試薬を
加えた；１０μｌの５ｘ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファー、１０μｌのＳａｌ１
アダプター及び５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ。成分を穏やかに混合し、そして
１６℃で一晩連結させた。ライゲーション混合物をフェノール：クロロホルム：
イソアミルアルコールで抽出し、完全にボルテックスし、そして相を分離するた
めに１４，０００ｘｇで室温で５分間遠心分離した。水相を新しいチューブに移
し、そして容量を水で１００ｍｌに調整した。より小さいｃＤＮＡ分子を除くた
めに、精製したＤＮＡをクロマスピン（ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ）１０００カラム
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）上でサイズ選択した。二本鎖ＤＮＡをＮｏｔ１制限酵素で
３７℃で３−４時間消化した。制限消化物を０．８％低融解アガロースゲル上で
電気泳動した。１−５ｋｂの範囲のｃＤＮＡを切り出し、そしてＧｅｌｚｙｍｅ
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて精製した。生成物をフェノール：クロロホル
ムで抽出し、そしてＮＨ₄ＯＡｃ及び無水エタノールで沈殿させた。ペレットを
７０％エタノールで洗浄し、そして１０ｍｌの水に再懸濁した。ベクターへのｃＤＮＡの連結： ｃＤＮＡを５本のチューブ（各２μｌ）に分割し
、そして４．５μｌの水、２μｌの５ｘライゲーションバッファー、１μｌのｐ
−ＳｐｏｒｔベクターＤＮＡ（Ｓａｌ−１／Ｎｏｔ１で切断し、そしてホスファ
ターゼ処理した）及び０．５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼを加えることによりラ
イゲーション反応を引き起こした。ライゲーションを４０℃で一晩インキュベー
ションした。電気穿孔によるエシェリキア・コリへの連結したｃＤＮＡの導入： ライゲーション反応容量を水で２０μｌの総容量に調整した。５ｍｌの酵母ｔ
ＲＮＡ、１２．５ｍｌの７．５Ｍ ＮＨ₄ＯＡｃ及び７０ｍｌの無水エタノール（
−２０℃）を加えた。混合物を完全にボルテックスし、そしてすぐに１４，００
０ｘｇで室温で２０分間遠心分離した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、
そして各ペレットを５ｍｌの水に再懸濁した。全ての５ライゲーション（２５ｍ
ｌ）をプールし、そして１００μｌのＤＨ１０Ｂエレクトロ−コンピテント細胞
（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１ｍｌのＤＮＡで電気穿孔し（合計
２０電気穿孔）、次に１μｌ当たりの組換え体の数（ｃｆｕ）を決定するために
アンピシリンプレート上に平板培養して広げた。全ライブラリーを２リットルの
Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈに接種し、そしてＰｒｏｍｅｇａ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐ
キットを用いてマキシプレップ（ｍａｘｉｐｒｅｐ）を行い、そして塩化セシウ
ム勾配上で精製した。

【００９８】 実施例２：ライブラリースクリーニング／ヒトカルシウムチャンネルアルファ １Ｇ−ｃ作製 ヒト視床ライブラリースクリーニング： ヒト視床ライブラリーの１μｌアリコートをＥｌｅｃｔｒｏｍａｘ ＤＨ１０
Ｂ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に電気穿孔した。容量をＳＯＣ
培地で１ｍｌに調整し、そして振盪しながら３７℃で６０分間インキュベーショ
ンした。次にライブラリーを、ＬＢを含有する１５０ｃｍ²プレート上にプレー
ト当たり２００００コロニーの密度に平板培養して広げた。培養物を３７℃で一
晩増やした。

【００９９】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃプローブは、以下のプライマー対
： 配列番号：１ ５’オリゴ（１８３４１Ｆ）５’ＧＣＡＣＴＧＣＣＡＧＴＧＧＣ
ＣＧＡＧＧＧ 胚列番号：２ ３’オリゴ（１８７４７Ｒ）：５’＿ＣＣＡＴＧＧＣＧＡＴＧＧ
ＴＧＡＴＧＣＡＧ を用いてポリメラーゼ連鎖反応により作製した。

【０１００】 プローブは、５’及び３’プローブオリゴ（各１００ｎｇ）並びに１０ｎｇの
希釈したミニプレップＤＮＡを用いて通常のＰＣＲ条件を使用してＰＣＲにより
作製した。得られる２７４ｂｐフラグメントを１％アガロースゲル上で泳動し、
そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮキット（Ｂｉｏ １０１，Ｉｎｃ．）を用いて精製し
た。約１００ｎｇの精製したプローブをＰｈａｒｍａｃｉａからのオリゴラベリ
ングキットを用いてアルファ３２Ｐで標識し、そして標識されたＤＮＡをＳ−２
００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製した。

【０１０１】 ライブラリーコロニーをＰｒｏｔｒａｎニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈ
ｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌ）上に取り上げ、そしてＤＮＡを１．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．５Ｍ ＮａＯＨ中で変性させた。フィルターディスクを１．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で中和し、そして次にＵＶ−
Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて膜にＵＶ架橋した
。フィルターを洗浄溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ；０．１％ ＳＤＳ）中室温で数回洗浄した。次にディス
クを、５０％ホルムアミド及び１００μｇ／ｍｌの剪断サケ精子ＤＮＡ（５’−
３’Ｉｎｃ）を含有する１ｘサザンプレハイブリダイゼーションバッファー（５
’−３’Ｉｎｃ）中４２℃で６時間インキュベーションした。最後に、ハイブリ
ダイゼーションを、標識したプローブ（５ｘ１０⁵〜１ｘ１０⁶ｃｐｍ／ｍｌハイ
ブリダイゼーションバッファー）の存在下で５０％ホルムアミド、１００ｎｇの
剪断サケ精子ＤＮＡを含有する１ｘハイブリダイゼーションバッファー（５’−
３’）中４２℃で一晩行った。

【０１０２】 ディスクを室温で３０分間２ｘＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ中で一回、５０℃で
３０分間０．２ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で一回、５５℃で３０分間０．２
ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で一回、そして６０℃で１５分間０．２ｘＳＳＣ
、０．１％ ＳＤＳ中で一回洗浄した。次に膜を一面の濾紙上に置き、サランラ
ップに包み、そして−２０℃で一晩フィルムに感光させた。

【０１０３】 陽性クローンを同定し、そして最初のプレートからコロニーを円筒形に抜き取
ることにより集めた。コロニーを２ｍｌのＬＢ中３７℃で２時間インキュベーシ
ョンした。培養物の希釈をＬＢ寒天プレート上に平板培養し、そしてフィルター
での取り上げ、ハイブリダイゼーション、洗浄、コロニー採集方法を繰り返した
。二次スクリーニングからの個々のクローンを採集し、そしてインサートの大き
さを決定するためにＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩで消化し、そしてインサートをシーク
エンスした。

【０１０４】 オープンリーディングフレームを有する３−５ｋｂの間の長さの３個の異なる
クローンが同定された。これらをＥｃｏＲ１／Ｘｈｏ１及びＸｈｏ１／Ｎｏｔ１
で消化した。４．２ｋｂ及び３．２ｋｂであるこれら２つの断片は、ＥｃｏＲ１
及びＮｏｔ１で切断して低融点アガロースゲル上で精製したｐＳｐｏｒｔ−１ベ
クターのアリコートを用いて３種のライゲーションに供した。連結した環状プラ
スミドＤＮＡをＧｉｂｃｏ ＢＲＬからのＤＨ５アルファ細菌細胞に形質転換し
た。数個のコロニーを採集し、そして全７．４ｋｂの配列を再確認した。Ｐｒｏ
ｍｅｇａキットを用いてプラスミドＤＮＡのマキシプレップを得た。このＤＮＡ
をＥｃｏＲ１及びＮｏｔ１でさらに消化し、そして７．４ｋｂを発現ベクターｐ
ＧＥＭ ＨＥに挿入した。ＭＥＧＡプレップキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて
ＤＮＡの大規模調製を行った。

【０１０５】 実施例３−哺乳動物発現ベクターへのヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ −ｃ ｃＤＮＡのクローニング ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ｃＤＮＡ（集合体にｈＣａＣｈ
ａｌｐｈａ１Ｇ−ｃと称する）を哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅ
ｏ（＋）にクローン化した。粘着末端を作り出すためにｐ−Ｓｐｏｒｔベクター
中のプラスミドＤＮＡをＮｏｔＩ及びＥｃｏＲ１（ＮＥＢ）で消化した。生成物
を低融解アガロースゲル電気泳動により精製した。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（
＋）ベクターをＥｃｏＲ１及びＮｏｔ１酵素で消化し、続いて低融解アガロース
ゲル上で精製した。ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ｃＤＮＡイン
サートに連結するためにこの線状ベクターを用いた。

【０１０６】 実施例４−ヒトアルファ１Ｇ−ｃを発現する安定な細胞系の構築 組換え体を単離し、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃと称し、そし
てＥｆｆｅｃｔｅｎｅ非リポソーム脂質に基づくトランスフェクションキット（
Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ−７もしくはＣ
ＨＯ−Ｋ１細胞）をトランスフェクションするために用いる。ゼオシンの存在下
での増殖により安定な細胞クローンを選択する。単一のゼオシン耐性クローンを
単離し、そして本発明のヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ遺伝子を含
有することを示す。ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ｃＤＮＡを含
有するクローンをヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質発現に
ついて分析する。ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃをコードするＤＮ
Ａを含有する組換えプラスミドを用いて哺乳動物ＣＯＳもしくはＣＨＯ細胞また
はＨＥＫ２９３細胞を形質転換する。

【０１０７】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃを安定にもしくは一過性に発現す
る細胞は、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ活性の発現について試験
するために用いる。これらの細胞は、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−
ｃをモジュレーション、抑制もしくは活性化する能力について他の化合物を同定
し調べるために用いる。

【０１０８】 プロモーターに関して正の向きにヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ
ｃＤＮＡを含有するカセットは、プロモーターの３’の適切な制限部位に連結
しそして制限部位マッピング及び／もしくはシークエンシングにより同定する。
これらのｃＤＮＡ発現ベクターは、電気穿孔もしくは化学的方法（陽イオン性リ
ポソーム、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム）を包含するがこれらに限
定されるものではない標準的な方法により繊維芽細胞宿主細胞、例えばＣＯＳ−
７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６５１）及びＣＶ−１ ｔａｔ［Ｓａｃｋｅｖｉｔｚ
ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１５７５（１９８７）］、２９３、Ｌ
（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ６３６２）に導入する。トランスフェクションした細胞及び
細胞培養上清を採集し、そして本明細書に記述するようにヒトカルシウムチャン
ネルアルファ１Ｇ−ｃ発現について分析する。

【０１０９】 哺乳動物一過性発現に用いるベクターは全て、ヒトカルシウムチャンネルアル
ファ１Ｇ−ｃを発現する安定な細胞系を樹立するために用いることができる。発
現ベクターにクローン化した改変していないヒトカルシウムチャンネルアルファ
１Ｇ−ｃ受容体ｃＤＮＡ構築物は、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ
タンパク質を作るように宿主細胞をプログラムすると予想される。トランスフェ
クション宿主細胞には、ＣＶ−１−Ｐ［Ｓａｃｋｅｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３８：１５７５（１９８７）］、ｔｋ−Ｌ［Ｗｉｇｌｅｒ，ｅ
ｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７）］、ＮＳ／０及びｄＨＦｒ-
ＣＨＯ［Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９ ：６０１，（１９８２）］が包含されるが、これらに限定されるものではない。

【０１１０】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ｃＤＮＡ構築物はまた、ヒトカ
ルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃの最も高い可能なレベルを合成する哺乳動
物細胞クローンの製造のために増幅可能な薬剤耐性マーカーを含有するベクター
にも連結される。細胞へのこれらの構築物の導入後に、プラスミドを含有するク
ローンを適切な薬剤で選択し、そして増加する用量の薬剤における選択により高
コピー数のプラスミドを有する過剰発現クローンの単離を成し遂げる。

【０１１１】 Ｇ４１８、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ；ハイグロマイシン、
ハイグロマイシン−Ｂホスホトランスフェラーゼ；ＡＰＲＴ、キサンチン−グア
ニンホスホリボシル−トランスフェラーゼもしくはゼオシンを包含するがこれら
に限定されるものではない薬剤選択プラスミドとヒトカルシウムチャンネルアル
ファ１Ｇ−ｃ ｃＤＮＡを含有する任意のベクターとの共トランスフェクション
は、安定にトランスフェクションされたクローンの選択を可能にする。ヒトカル
シウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃのレベルは、本明細書に記述するアッセイに
より定量する（実施例６）。

【０１１２】 組換えヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃの発現は、哺乳動物宿主細
胞への全長ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ｃＤＮＡのトランスフ
ェクションにより実施する。

【０１１３】 実施例５ ゼノプス卵母細胞におけるｐＣａＣｈａｌｐｈａ１Ｇ−ｃによりコードされる機 能性タンパク質の特性化 以前に記述されておりそして当該技術分野において既知である標準的な方法（
Ｆｒａｓｅｒ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９３））を用いてゼノプス・ラエビ
ス（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞を調製し、注入した。成体メスゼ
ノプス・ラエビス（Ｎｏｓｃｏ，Ｆｏｒｔ Ａｔｋｉｎｓｏｎ，ＷＩ）からの卵
巣葉を細かく裂いてばらばらにし、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調製した、８２．５
ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ ＨＥＰＥＳを
含有する名目上Ｃａを含まない食塩水（ＯＲ−２）中で数回すすぎ、そして０．
２％コラーゲナーゼ１型（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ａｕｒｏｒａ，Ｏ
ｈｉｏ）を含有するＯＲ−２中で２−５時間穏やかに振盪した。約５０％の濾胞
層が除かれると、Ｖ及びＶＩ期卵母細胞を選択し、そして７５％ ＯＲ−２及び
２５％ ＮＤ−９６からなる培地中ですすいだ。ＮＤ−９６は：１００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１．８ｍＭ ＣａＣｌ₂、５ｍＭ ＨＥ
ＰＥＳ、２．５ｍＭピルビン酸Ｎａ、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有
し、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した。細胞外Ｃａ⁺²を徐々に増やし、そして細
胞を注入の前に２−２４時間ＮＤ−９６中で維持した。インビトロ転写では、ヒ
トカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃを含有するｐＳＰＯＲＴ（Ｌｉｍａｎ
，Ｅ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９２））からの複数のクローニング部位を含有す
るように改変されているｐＧＥＭ ＨＥをＮｏｔＩで線状にし、そしてキャップ
類似体ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇの存在下でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（
Ｐｒｏｍｅｇａ）で転写した。ヒトアルファ１Ｇ−ｃはその生来のコザック配列
を含有した。合成されたｃＲＮＡを酢酸アンモニウム及びイソプロパノールで沈
殿させ、そして５０μｌのヌクレアーゼを含まない水に再懸濁した。ｃＲＮＡは
、ＲＮＡマーカー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，０．２４−９．５Ｋｂ）に対してホル
ムアルデヒドゲル（１％アガロース、１ｘＭＯＰＳ、３％ホルムアルデヒド）を
用いて定量した。

【０１１４】 卵母細胞に５０ｎｌのヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ｃＲＮＡ
（約６００ｎｇ）を注入した。コントロール卵母細胞には５０ｎｌの水を注入し
た。ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃの発現についての分析の前に卵
母細胞をＮＤ−９６中でインキュベーションした。インキュベーション及びコラ
ーゲナーゼ消化は室温で実施した。注入した卵母細胞を４８ウェル細胞培養クラ
スター（Ｃｏｓｔａｒ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）において１８℃で維持した
。全細胞アゴニスト誘発電流は、以前に記述されておりそして当該技術分野にお
いて既知である標準的な方法（Ｄａｓｃａｌ，Ｎ．（１９８７））を用いて通常
の２電極電位固定（ＧｅｎｅＣｌａｍｐ５００，Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎ
ｔｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で注入の３−６日後に測定した。微小電
極に３Ｍ ＫＣｌを満たし、それらは１及び２ＭΩの抵抗を有した。ことわらな
い限り室温で細胞にＮＤ９６を２−５ｍｌ／分で連続して灌流させた。いくつか
の実験では、細胞を（ｍＭ単位で）：４０ＢａＣｌ₂、２ＫＣｌ、３６ＴＥＡ−
Ｃｌ、５ ４−ＡＰ及び５ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６を含有する４０ｍＭ Ｂａ食塩
水に浸した。膜電位は、ことわらない限り−１００ｍＶで固定した。

【０１１５】 図４ａ、ｂに示すように、脱分極電位工程は、クローン化したヒトカルシウム
チャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ｃＤＮＡから転写されるＲＮＡを注入した卵母細
胞において内向き電流を引き出した。卵母細胞が負の電位で大きい外向き電流及
びゆっくりと活性化する内向き電流（内因性Ｃａ活性化Ｃｌ電流の活性化）を発
現したいくつかの実験では、卵母細胞を４０ｍＭ Ｂａ食塩水に浸した。表面電
荷スクリーニングに対するＢａ２＋の影響のために（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ
．，１９８３）、通常はより生理学的な条件（２ｍＭの細胞外Ｃａ²⁺；ＮＤ９６
）を用いた。

【０１１６】 図４ａは、卵母細胞に加えた脱分極パルスにより引き出される電流痕跡の代表
的集団を示す。内向きのＢａ²⁺電流はほぼ閾値の電位でゆっくりと活性化し、そ
してさらに大きい脱分極電位パルスで、電流はいっそう迅速に活性化しそして不
活性化し、古典的なＴ型電流の特徴「十字形」パターンを生じた（Ｒａｎｄａｌ
ｌ ａｎｄ Ｔｓｉｅｎ，１９９７）。水を注入した卵母細胞は、検出可能な内
向き電流を有さなかった。２ｍＭの細胞外Ｃａ²⁺において記録されるピーク電流
は、Ｂａ²⁺を電荷キャリヤーとして認められるもの（−２４０＋／−２０ｎＡ；
ｎ＝８）と同様で、−３８０＋／−１７０ｎＡ（ｎ＝９）であった。ＮＤ９６に
おいて記録される閾値電位は約−５９ｍＶ（ｎ＝９）であった。最大電流を引き
出す電位は、−２９＋／−５ｍＶ（ｎ＝９）であった。電流が符号を逆にする電
位は、＋２９＋／−５ｍＶ（ｎ＝４）であった。電位パルスの開始からピークま
での時間は、５．２＋／−２ｍｓｅｃ（ｎ＝９）であった。４０ｍＭ Ｂａ²⁺溶
液において、活性化の電位依存性は電位軸に沿ってわずかにシフトした（Ｈｕｇ
ｕｅｎａｒｄ，１９９６；Ｐｅｒｅｚ−Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）
。ピーク電流を引き出す電位は−３３＋／−２ｍＶ（ｎ＝８）であった。ピーク
応答までの時間は、２ｍＭ Ｃａ²⁺において記録されるもの（４．８＋／−０．
３ｍｓｅｃ）と同様であった。

【０１１７】 定常状態不活性化（図４ｃ、ｄ）は、チャンネル利用能を測定するために４秒
の長さのプレパルス、続いて−３０ｍＶまでの試験パルスを加えることにより調
べた。いくつかの実験では、４秒のパルスの終りにまだ開いているあらゆるチャ
ンネルを閉じるために−１００ｍＶまでの５ｍｓｅｃの再分極パルスを行った。
結果は同様であり、合わせた。ＨＥＫ２９３細胞において発現させたクローン化
したマウスアルファ１Ｇ（ＡＪ０１２５６９は、細胞内ループＩＩ−ＩＩＩ中の
本発明において認められる挿入物並びにドメインＩＩＩ−ＩＶ間の細胞内ループ
中の余分の１８アミノ酸の挿入物を含有する）の不活性化の同様のＶ_0.5が、Ｃ
ａ²⁺及びＢａ²⁺食塩水において認められた（Ｋｌｕｇｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．
，１９９９）。図４ｃは、試験パルス中に記録される代表的な電流痕跡を示す。
最大応答のパーセントを計算し、プレパルス電位の関数としてプロットし、そし
てボルツマン式で調整した（図４ｄ）。ヒトアルファ１Ｇ−ｃの不活性化は閾値
以下の電位で起こり、そして急勾配の電位依存性を示した（傾き−４．９［−６
．０〜−３．８］，ｎ＝７）。不活性化の電位依存性は、−６８．３〜−６５．
８ｍＶの９５％信頼区間で−６７ｍＶで起こった（ｎ＝７実験；ＣａＳＯＳ）。
不活性化の電位依存性は、４０ｍＭ Ｂａ²⁺において記録した場合に同様であっ
た（−７１＋／−５ｍＶ，ｎ＝５）。

【０１１８】 Ｔ型カルシウム電流の特定特徴は、それらがＨＶＡカルシウム電流と比較して
比較的ゆっくりと非活性化し、脱分極パルス後にゆっくりと減衰する尾部電流を
生じることである。−３０ｍＶまでの５ｍｓｅｃ電位工程に−１００ｍＶまでの
工程を続けた。電流非活性化のタウは、Ｔ型電流について報告された値と同様で
、２．２＋／−０．４ｍｓｅｃ（ｎ＝３）であった。

【０１１９】 ゼノプス卵母細胞において発現させたヒトアルファ１Ｇ−ｃの薬理学的特性化
をミベフラジル、Ｎｉ²⁺、Ｃｄ²⁺、アミロライド及びエトスクシミドについて決
定した。ピークＴ電流に対するミベフラジルの示す濃度の影響を決定した。ミベ
フラジルは、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ｃＲＮＡを発現する
卵母細胞に浴添加した（ｂａｔｈ ａｐｐｌｉｅｄ）（図５）。示すのは、７個
の個々の卵母細胞に対して試験した１−３濃度である。ＩＣ₅₀は、１．３〜４．
９μＭの９５％信頼区間で２．５μＭであった。卵母細胞はＮＤ９６に浸した。

【０１２０】 本発明は、ラットアルファ１Ｇ（ＡＪ０２７９８４）に対して認められるもの
と同様に（Ｐｅｒｅｚ−Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、Ｎｉ²⁺遮断に
比較的非感受性であった。２００μＭ ＮｉＣｌ₂は、ピーク電流を２５＋／−
６％（ｎ＝３）遮断し；同じ細胞において、１ｍＭ ＮｉＣｌ₂は、２００μＭ
Ｎｉ²⁺により遮断される電流の約２倍遮断した。卵母細胞は、試験パルス間に−
１００ｍＶで電位固定した。Ｃｄ²⁺（１００μＭ）は、Ｔ電流を４４＋／−９％
（ｎ＝３）遮断した。

【０１２１】 本発明は、アミロライド遮断に感受性であった。５００μＭのアミロライドは
、ラット脊髄運動ニューロンで認められる遮断と同様に（Ｈｕｇｕｅｎａｒｄ，
１９９６）、ピーク電流を２３＋／−４％（ｎ＝４）のみ遮断した。この濃度は
、いくつかのＴ型カルシウム電流（例えばヒトアルファ１Ｈ；背景を参照）を完
全に遮断する。卵母細胞は、電位パルス間に−１００ｍＶで保ち、そして同様の
結果がＮＤ９６及びＢａ²⁺食塩水に浸した卵母細胞に対して得られた。

【０１２２】 本発明は、抗癲癇薬エトスクシミドによる遮断に感受性であった。６００μＭ
のエトスクシミド（Ｓｉｇｍａ）は、欠神癲癇の処置のための治療的に適切な濃
度の範囲内で（背景を参照）、ピーク電流を２６＋／−３％（ｎ＝３）可逆的に
遮断した。卵母細胞は、電位パルス間に−１００ｍＶで保ち、そして同様の結果
がＮＤ９６及びＢａ²⁺食塩水に浸した卵母細胞に対して得られた。ヒトアルファ
１Ｈ電流は、３００μＭのエトスクシミドにより〜７％のみ遮断される（ＷＯ９
９／２８３４２）。

【０１２３】 興味深いことに、クロリドチャンネル遮断薬ＮＰＰＢ（Ｎ−ニトロ−２−（３
−フェニルプロピルアミノ）安息香酸）は、卵母細胞において発現させたヒトア
ルファ１Ｇ−ｃ電流を遮断した。２０、１００及び２００μＭのＮＰＰＢは、そ
れぞれ、２２＋／−６％（ｎ＝３）、５５＋／−７％（ｎ＝３）及び８９＋／−
７％（ｎ＝３）遮断した。別のクロリドチャンネル遮断薬９−ＡＣ（アントラセ
ン−９−カルボン酸、Ｓｉｇｍａ）は、Ｔ電流を遮断することにおいて効果が低
く；１００μＭの９−ＡＣはピーク電流を３０＋／−３％（ｎ＝４）遮断した。
ＤＩＤＳ（４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸
（Ｓｉｇｍａ）；１００μＭ）及びニフルム酸（ｎｉｆｌｕｍｉｃ ａｃｉｄ）
（１００μＭ）は、ピークヒトアルファ１Ｇ−ｃ電流に対する影響がなかった。
ＤＩＤＳ及びニフルム酸は、それぞれ、電流を１６＋／−１３％（ｎ＝３）及び
０＋／−２％（ｎ＝３）遮断した。

【０１２４】 実施例６−ヒトＨＥＫ２９３細胞系におけるヒトカルシウムチャンネルアルフ
ァ１Ｇ−ｃの特性化 ヒトＨＥＫ２９３細胞にヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ｐＣａ
Ｃｈａｌｐｈａ１Ｇｃ（実施例４）をトランスフェクションする。１００ｍｍ皿
につき１０⁶細胞当たり１μｇのｐＣａＣｈａｌｐｈａ１Ｇの一過性トランスフ
ェクションをＥｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクションキット（Ｑｕｉａｇｅｎ
；３０１４２５）を用いて行う。トランスフェクションの３日後に細胞を９６ウ
ェルプレート（Ｂｉｏｃｏａｔ，ポリーＤ−リシンを被覆した黒／透明プレート
；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製品＃３５４６４０）上に平板培養する。
１日後に、ウェルをＦ１２／ＤＭＥＭですすぎ、次にプルロン酸（Ｐｌｕｒｏｎ
ｉｃ ａｃｉｄ）（２０％、４０μを２０ｍｌの総容量に用いる）を含むフルオ
ー４（２μＭ）中室温で１時間インキュベーションする。ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＦＬ１０１）を用いてプレートをアッセイする。
細胞を１０、２５及び４３ｍＭ Ｋ⁺の最終濃度を得るために高いＫ＋で攻撃する
（５０μｌ／ｓｅｃの速度で８０μｌに加える４０μｌ中で加える）。ベクター
単独でのトランスフェクションをコントロールとして試験する。基礎バッファー
は（ｍＭ単位）：１２３ＮａＣｌ、２ＫＣｌ、１ＭｇＣｌ₂、２ ＣａＣｌ₂、１
５グルコース及び２０ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を含有する。

【０１２５】 ヒトアルファ１Ｇ−ｃを安定に発現する細胞を９６ウェルプレート（Ｂｉｏｃ
ｏａｔ，ポリーＤ−リシンを被覆した黒／透明プレート；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃ
ｋｉｎｓｏｎ製品＃３５４６４０）上に平板培養し、そして融合するまで増やす
。ウェルをＦ１２／ＤＭＥＭですすぎ、次にプルロン酸（２０％、４０μを２０
ｍｌの総容量に用いる）を含むフルオー４（２μＭ）中室温で１時間インキュベ
ーションする。ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＦＬ１０１
）を用いてプレートをアッセイする。細胞を高いＫ＋で攻撃する（５０μｌ／ｓ
ｅｃの速度で８０μｌに加える４０μｌ中）。

【０１２６】 １２ｍｍカバーガラス上で＞１日間維持したヒトカルシウムチャンネルアルフ
ァ１Ｇ−ｃを安定に発現するＨＥＫ２９３からのリガンド誘発電流を記録するた
めに全細胞パッチクランプ技術（Ｈａｍｉｌｌ，Ｏ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９８
１））を用いる。細胞は、ＤＩＣ Ｎｏｍａｒｓｋｉレンズを有するＮｉｋｏｎ
Ｄｉａｐｈｏｔ ３００を用いて視覚化する。細胞は、他にことわらない限り生
理食塩水において連続して灌流させる（〜０．５ｍｌ／分）。基準生理食塩水（
「ＣａＣｈ生理食塩水（ＣａＣｈＰＳ）」）は：１５ｍＭ ＢａＣｌ₂、１５０ｍ
ＭコリンＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３、Ｗｅ
ｓｃｏｒ ５５００蒸気圧（Ｗｅｓｃｏｒ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を用
いて測定した場合に３２５ｍＯｓｍ）を含有する。記録電極は、ホウケイ酸塩毛
管（Ｒ６；Ｇａｒｎｅｒ Ｇｌａｓｓ，Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から組立て
、先端は歯科用表面ワックス（ｄｅｎｔａｌ ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ ｗａｘ）（
Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ，ＩＮ）で被覆
し、そして細胞内食塩水：１３５ｍＭ ＣｓＣｌ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ
ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４、ＴＥＡ−ＯＨを含む、２９０ｍ
Ｏｓｍ）を含有する場合に１−２ＭΩの抵抗を有する。電流及び電位シグナルは
、Ａｘｏｐａｔｃｈ １Ｄパッチクランプ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で検出しそして２ｋＨｚでフィルター
を通し、ＤｉｇｉＤａｔａ １２００Ｂ実験（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）インター
フェース（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）及びＰＣ互換性コンピューター
システムでデジタル式に記録し、そしてオフライン分析のために磁気ディスク上
に保存する。データの入手及び分析は、ＰＣｌａｍｐソフトウェアで行う。

【０１２７】 実施例７−ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質の一次構造 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃのヌクレオチド配列は、２２７３
アミノ酸をコードする約６８１９塩基対の単一の大きいオープンリーディングフ
レームを示した。ｃＤＮＡは、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃの約
５１１及び約３９７ヌクレオチドの５’及び３’非翻訳伸長をそれぞれ有する。
最初のインフレームのメチオニンは、約２５１．８ｋＤａの概算分子量（Ｍ_r）
を有するヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質が予測されるオ
ープンリーディングフレームの開始コドンとして示された。

【０１２８】 予測されるヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質をヌクレオ
チド及びタンパク質データベースと整列させ、そして本明細書において提示する
配列はドメインＩ〜ＩＩ間の第二細胞内ループ中に２３アミノ酸の挿入物を含有
することを除いてヒトアルファ１Ｇ「ａ」アイソフォーム（受託番号ＡＦ１２６
９６６）と同様であることが見出された。挿入物は、Ｓ９７１で推定のＣＫＩＩ
リン酸化部位を含有する。この２３アミノ酸の挿入物は、ラット（ＡＦ１２５１
６１）及びマウス（ＡＪ０１２５６９）における相同配列とそれぞれ９１及び８
７％同一である。しかしながら、この挿入物は、配列の残りに関して本発明にオ
ーソロガスである別のラットアルファ１Ｇアイソフォーム（ＡＦ０２７９８４）
には存在しない。本発明におけるこの挿入物中の推定のカゼインキナーゼＩＩリ
ン酸化部位は、ラットもしくはマウスにおいて保存されていない。

【０１２９】 それぞれ、８、２３、１５及び１２個の推定のＰＫＡ（すなわｔ、Ｒ／Ｋ Ｒ
／Ｋ ｘ Ｔ／Ｓ）、ＰＫＣ（すなわち、Ｓ／Ｔ ｘ Ｋ／Ｒ）、カゼインキナー
ゼＩＩ（ＣＫＩＩ；すなわち、Ｓ／Ｔ ｘｘ Ｄ／Ｅ）及びＭＧＣＫ（乳腺カゼイ
ンキナーゼ；すなわち、Ｓ ｘ Ｅ）リン酸化部位がある。８個の可能なＮ結合グ
リコシル化部位がある。予測される細胞内ドメインには推定のチロシンリン酸化
モチーフ（すなわち、Ｒ／Ｋ ｘｘｘ Ｄ ｘｘ Ｙ）がない。

【０１３０】 実施例８−エシェリキア・コリ発現ベクターへのヒトカルシウムチャンネルア ルファ１Ｇ−ｃ ｃＤＮＡのクローニング 組換えヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃは、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏ
ｖａｇｅｎ）が包含されるがこれらに限定されるものではないエシェリキア・コ
リ発現ベクターにヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ発現カセットを導
入した後にエシェリキア・コリにおいて生産される。ｐＥＴベクターは、厳重に
調節されるバクテリオファージＴ７プロモーターの制御下にヒトカルシウムチャ
ンネルアルファ１Ｇ−ｃ発現を置く。誘導性ｌａｃプロモーターにより導かれる
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含有するエシェリキア・コリ
宿主にこの構築物を導入した後、適切なｌａｃ基質（ＩＰＴＧ）を培養物に加え
るとヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃの発現が誘導される。発現され
るヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃのレベルは、本明細書に記述する
アッセイにより決定する。

【０１３１】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃの全オープンリーディングフレー
ムをコードするｃＤＮＡをｐＥＴ［１６］１１ａのＮｄｅＩ部位に挿入する。正
の向きの構築物を配列分析により同定し、そして発現宿主株ＢＬ２１を形質転換
するために用いる。次に形質転換体を用いてヒトカルシウムチャンネルアルファ
１Ｇ―ｃタンパク質の生産のために培養物に接種する。培養物は、Ｍ９もしくは
ＺＢ培地において増やすことができ、その発酵は当業者に既知である。ＯＤ₆₀₀
＝１．５まで増やした後、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃの発現を
１ｍＭ ＩＰＴＧで３７℃で３時間誘導する。

【０１３２】 実施例９−昆虫細胞における発現のためのバキュロウイルス発現ベクターへの ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ｃＤＮＡのクローニング ＡｃＮＰＶウイルスのゲノムから得られるバキュロウイルスベクターを、昆虫
細胞のＳｆ９系統（ＡＴＣＣ ＣＲＬ＃１７１１）におけるｃＤＮＡの高レベル
発現を与えるように設計する。ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ｃ
ＤＮＡを発現する組換えバキュロウイルスは、以下の標準的な方法（ＩｎＶｉｔ
ｒｏｇｅｎ Ｍａｘｂａｃ Ｍａｎｕａｌ）により製造する：ヒトカルシウムチ
ャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ｃＤＮＡ構築物を、ｐＡＣ３６０及びＢｌｕｅＢａ
ｃベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を包含する様々なバキュロウイルス導入ベ
クターにおいてポリヘドリン遺伝子に連結する。組換えバキュロウイルスは、Ｓ
ｆ９細胞にバキュロウイルス導入ベクター及び線状にしたＡｃＮＰＶゲノムＤＮ
Ａを共トランスフェクションした後に相同的組換えにより作製される［Ｋｉｔｔ
ｓ，Ｐ．Ａ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１８：５６６７（１９９０）］。組
換えｐＡＣ３６０ウイルスは、感染細胞における封入体の欠如により同定され、
そして組換えｐＢｌｕｅＢａｃウイルスは、β−ガラクトシダーゼ発現に基づい
て同定される（Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．，Ｔｅ
ｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｅｘｐ．Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
Ｎｏ．１５５５）。プラーク精製後に、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１
Ｇ−ｃ発現を本明細書に記述するアッセイにより測定する。

【０１３３】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃの全オープンリーディングフレー
ムをコードするｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃＩＩのＢａｍＨＩ部位に挿入する。
正の向きの構築物を配列分析により同定し、そして線状ＡｃＮＰＶマイルドタイ
プＤＮＡの存在下でＳｆ９細胞をトランスフェクションするために用いる。

【０１３４】 真正の、活性のあるヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃが感染細胞の
細胞質に存在する。活性のあるヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃを低
張もしくは溶剤溶解により感染細胞から抽出する。

【０１３５】 実施例１０−酵母発現ベクターへのヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ− ｃ ｃＤＮＡのクローニング 組換えヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃは、異種起源のタンパク質
の細胞内もしくは細胞外発現を導くように設計された発現ベクターへの最適ヒト
カルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ ｃＤＮＡシストロンの挿入後に酵母サ
ッカロミセス・セレビシエにおいて生産される。細胞内発現の場合、ＥｍＢＬｙ
ｅｘ４等のようなベクターをヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃシスト
ロンに連結する［Ｒｉｎａｓ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
８：５４３−５４５（１９９０）；Ｈｏｒｏｗｉｔｚ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：４１８９−４１９２（１９８９）］。細胞外発
現では、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質のＮＨ₂末端に
分泌シグナル（酵母もしくは哺乳動物ペプチド）を融合する酵母発現ベクターに
ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃシストロンを連結する［Ｊａｃｏｂ
ｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，Ｇｅｎｅ ８５：５１１−５１６（１９８９）；Ｒｉｅｔｔ
Ｌ．ａｎｄ Ｂｅｌｌｏｎ Ｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２９４１−２９４９
（１９８９）］。

【０１３６】 これらのベクターには、発現されるｃＤＮＡにヒト血清アルブミンシグナルを
融合するｐＡＶＥ１＞６［Ｓｔｅｅｐ Ｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：
４２−４６（１９９０）］及び発現されるｃＤＮＡにヒトリゾチームシグナルを
融合するベクターｐＬ８ＰＬ［Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８
：２７２８−２７３２］が包含されるがこれらに限定されるものではない。さら
に、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃは、ベクターｐＶＥＰ［Ｅｃｋ
ｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：７７１５−７７１９（１９
８９），Ｓａｂｉｎ，Ｅ．Ａ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：７０５−７
０９（１９８９），ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ Ｄ．Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．９：５５１７−５５２３（１９８９）］を利用してユビキチンに結合させた
融合タンパク質として酵母において発現される。発現されるヒトカルシウムチャ
ンネルアルファ１Ｇ−ｃのレベルは、本明細書に記述するアッセイにより決定す
る。

【０１３７】 実施例１１−組換えヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃの精製 組換え的に製造したヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃは、抗体アフ
ィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。

【０１３８】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ抗体アフィニティーカラムは、抗
体がアガロースゲルビース支持体と共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシス
クシンイミドエステルで前もって活性化するゲル支持体Ａｆｆｉｇｅｌ−１０（
Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に抗−ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ抗体を加え
ることにより作製する。次に抗体をスペーサーアームとのアミド結合によりゲル
に連結する。残っている活性化エステルを次に１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐ
Ｈ８）でクエンチする。あらゆる結合していない抗体もしくは外来タンパク質を
除くためにカラムを水、続いて０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄
する。次にカラムを溶剤のような適切な膜可溶化剤と一緒にリン酸緩衝食塩水（
ｐＨ７．３）において平衡化し、そして可溶化したヒトカルシウムチャンネルア
ルファ１Ｇ−ｃを含有する細胞培養上清もしくは細胞抽出物をカラムにゆっくり
と通す。次にカラムを溶剤と一緒にリン酸緩衝食塩水で光学密度（Ａ₂₈₀）がバ
ックグラウンドに下がるまで洗浄し、次にタンパク質を溶剤と一緒に０，２３Ｍ
グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶出する。精製したヒトカルシウムチャンネ
ルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質を次にリン酸緩衝食塩水に対して透析する。

【０１３９】

【表１】

【０１４０】

【表２】

【０１４１】

【表３】

【０１４２】

【表４】

【０１４３】

【表５】

【０１４４】

【表６】

【０１４５】

【表７】

【０１４６】

【表８】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃのコーディング領域のヌクレオチ
ド配列を示す（終止コドンを含む６８２２ｂｐ）。

【図２】 ５１１ｂｐの5’ＵＴ及び３９７ｂｐの３’ＵＴを含むヒトカルシウムチャン
ネルアルファ１Ｇ−ｃのヌクレオチド配列を示す。

【図３】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃのアミノ酸配列を示す（２２７３
アミノ酸）。

【図４】 ゼノプス卵母細胞におけるヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃの機能
性発現を示す：脱分極電位工程による活性化（ａ，ｂ）及び定常状態不活性化（
ｃ，ｄ）。ａ）４０ｍＭ ＢａＣｌ₂食塩水に浸した卵母細胞を−１００ｍＶの保
有電位から脱分極電位プロトコルで攻撃した。４０ｍｓｅｃの試験パルスを−７
０から−２０ｍＶまで１０ｍＶの増加で加えた。ｂ）ＮＤ９６に浸した9個の卵
母細胞から得られる電流−電位の関係。電流はほぼ−６０ｍＶで活性化し、そし
てほぼ＋３０ｍＶで符号を逆にした。ピーク電流は、約−３０ｍＶへの工程によ
り引き出された。ｃ）４０ｍＭ ＢａＣｌ₂に浸した卵母細胞の不活性化の電位依
存性を標準的な電位プロトコルを用いて決定した。−１００〜−４５ｍＶ（５ｍ
Ｖの増加で）への4ｓｅｃ電位工程に、−１００ｍＶへの５ｍｓｅｃ工程、−３
０ｍＶへの工程を続けた。−３０ｍＶで引き出される電流は、正に動く静電容量
過渡応答後に示される。チャンネルの半分を不活性化するプレパルス電位（Ｖ_{0. 5} ）は約−７０ｍＶであった。ｄ）ＮＤ９６に浸した卵母細胞に対する不活性化
の電位依存性を示す（ｎ＝９実験）。

【図５】 ゼノプス卵母細胞において発現させたヒトアルファ１Ｇ−ｃの薬理学的特性化
：ミベフラジルによる用量依存的遮断。ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ
−ｃ ｃＲＮＡを発現する卵母細胞に浴添加した示す濃度のミベフラジルに対す
る応答。示すのは7個の個々の卵母細胞に対して試験した１−３濃度である。Ｉ
Ｃ５０は、１．３〜４．９μＭの９５％信頼区間で２．５μＭであった。卵母細
胞はＮＤ９６に浸した。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/06 Ａ６１Ｐ 9/10 ４Ｃ０８４ 9/10 9/12 ４Ｈ０４５ 9/12 11/00 11/00 13/02 13/02 13/10 13/10 13/12 13/12 15/00 15/00 15/10 15/10 17/02 17/02 21/00 21/00 23/00 23/00 25/08 25/08 25/18 25/18 25/20 25/20 25/24 25/24 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ガリンド，ジヨゼ・イー アメリカ合衆国カリフオルニア州92173サ ンデイエゴ・モントリーパインドライブ 1550−ビー (72)発明者 ピアテイ，ジヤヤシユリー アメリカ合衆国カリフオルニア州92129サ ンデイエゴ・ピクラスストリート12285 (72)発明者 ズー，ジエシカ・ワイ アメリカ合衆国カリフオルニア州92129サ ンデイエゴ・ピクラスストリート12460 (72)発明者 アーランダー，マーク・ジー アメリカ合衆国カリフオルニア州92122サ ンデイエゴ・ヒルクレスト442 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB14 BB46 BB50 BB51 CB01 DA13 DA36 FB02 4B024 AA01 CA04 HA01 4B063 QA05 QA18 QQ08 QR77 QS36 QX04 4B064 AG01 CA19 CC24 DA01 4B065 AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA01 AA27 BA44 CA62 ZA05 ZA06 ZA12 ZA18 ZA36 ZA38 ZA40 ZA42 ZA45 ZA59 ZA81 ZA86 ZA89 ZA94 ZC03 ZC08 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 CA40 DA50 DA75 EA21 EA23 FA74

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃチャンネルタン
   パク質をコードする単離され、精製されたＤＮＡ分子。
2. 【請求項２】 （配列番号：３）；（配列番号：４）；及びその機能性誘導
   体よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する請求項１の単離され、精
   製されたＤＮＡ分子。
3. 【請求項３】 該ＤＮＡ分子がゲノムＤＮＡである請求項１の単離され、精
   製されたＤＮＡ分子。
4. 【請求項４】 組換え宿主におけるヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ
   −ｃチャンネルタンパク質の発現のための発現ベクターであって、ヒトカルシウ
   ムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃタンパク質及びその機能性誘導体をコードする組
   換え遺伝子を含有する該ベクター。
5. 【請求項５】 （配列番号：３）；（配列番号：４）；及びその機能性誘導
   体よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するヒトカルシウムチャンネ
   ルアルファ１Ｇ−ｃチャンネルタンパク質をコードするクローン化した遺伝子を
   含有する請求項４の発現ベクター。
6. 【請求項６】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃチャンネルタン
   パク質をコードするゲノムＤＮＡを含有する請求項４の発現ベクター。
7. 【請求項７】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃチャンネルタン
   パク質もしくはその機能性誘導体をコードする組換え的にクローン化した遺伝子
   を含有する組換え宿主細胞。
8. 【請求項８】 該遺伝子が、（配列番号：３）；（配列番号：４）；及びそ
   の機能性誘導体よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する請求項７の
   組換え宿主細胞。
9. 【請求項９】 該クローン化した遺伝子がゲノムＤＮＡである請求項７の組
   換え宿主細胞。
10. 【請求項１０】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃチャンネルタ
    ンパク質の機能を果たす実質的に純粋な形態のタンパク質。
11. 【請求項１１】 配列番号：５及びその機能性誘導体からなるアミノ酸配列
    を有する請求項１０に記載のタンパク質。
12. 【請求項１２】 ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃチャンネルタ
    ンパク質と免疫学的に反応する単一特異性抗体。
13. 【請求項１３】 抗体がチャンネルの活性を遮断する請求項１２の抗体。
14. 【請求項１４】 （ａ）請求項４の発現ベクターを適当な宿主細胞に導入す
    ること；及び （ｂ）発現ベクターからのヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃチャンネ
    ルタンパク質の発現を与える条件下で工程（ａ）の宿主細胞を培養すること、 を含んでなる組換え宿主細胞におけるヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−
    ｃチャンネルタンパク質の発現方法。
15. 【請求項１５】 （ａ）ヒトアルファ１Ｇ−ｃカルシウムチャンネルを発現
    する細胞におけるヒトアルファ１Ｇ−ｃの活性を測定すること； （ｂ）化合物を細胞と接触させること；及び （ｃ）細胞における変化をモニターすること、 を含んでなるヒトカルシウムアルファ１Ｇ−ｃチャンネル活性をモジュレートす
    る化合物を同定する方法。
16. 【請求項１６】 カルシウムにより調節される電気生理学的特性のモジュレ
    ーションについて細胞をモニターする請求項１５の方法。
17. 【請求項１７】 モニターするカルシウムにより調節される電気生理学的特
    性が、カルシウム流入の刺激もしくは抑制である請求項１６の方法。
18. 【請求項１８】 請求項１５の方法において活性のある化合物。
19. 【請求項１９】 該化合物が、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ
    のアゴニストもしくはアンタゴニストである請求項１５の方法において活性のあ
    る化合物。
20. 【請求項２０】 該化合物が、ヒトカルシウムチャンネルアルファ１Ｇ−ｃ
    の発現のモジュレーターである請求項１５の方法において活性のある化合物。
21. 【請求項２１】 請求項１５の方法において活性のある化合物を含んでなる
    製薬学的組成物。
22. 【請求項２２】 請求項１５の方法において活性のあるヒトアルファ１Ｇ−
    ｃをモジュレートする化合物の投与を含んでなる、ヒトアルファ１Ｇ−ｃにより
    もたらされる症状についてそのような処置を必要とする患者を処置する方法。