JP2003525630A - エンドトキシン除去方法 - Google Patents
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、核酸からエンドトキシンを除去する方法に関する。エンドトキシンは、塩フリー界面活性剤溶液での核酸のプレインキュベーションおよび続く触手陰イオン交換体での陰イオン交換クロマトグラフィーによって除去される。
Description
【０００１】
本発明は、エンドトキシンレベルを低減するため、または生物学的材料からエ
ンドトキシンを除去するための方法に関する。本発明による方法は、例えば、高
純度のプラスミドDNAを天然のソースから得ることを可能にする。
ンドトキシンを除去するための方法に関する。本発明による方法は、例えば、高
純度のプラスミドDNAを天然のソースから得ることを可能にする。
【０００２】
高純度のプラスミドDNAを生物学的ソースから得るための迅速で効率的な方法
に対する要求が、外因性発現または治療的用途のための組換DNAの高まる重要性
のために絶えず増大している。特に、大規模で行なうこともできる精製方法に対
する要求もまた増大している。
に対する要求が、外因性発現または治療的用途のための組換DNAの高まる重要性
のために絶えず増大している。特に、大規模で行なうこともできる精製方法に対
する要求もまた増大している。
【０００３】
実質的に全ての既知のプラスミドDNAの、特に比較的大量の精製のための方法
は、クロマトグラフィーによる精製工程を含む。この工程の効率によって、一般
的に精製の効率と効果が決定されもする。
は、クロマトグラフィーによる精製工程を含む。この工程の効率によって、一般
的に精製の効率と効果が決定されもする。
【０００４】
プラスミドは、分子量2.6×106〜13.2×106ダルトンに相当する4〜20kBの長さ
を有するエピゲノミックな（epigenomic）環状のDNA分子である。それらのコン
パクトな形状（スーパーコイル）にもかかわらず、プラスミドDNA分子は、通常
、数百nmの大きさを有する。その寸法により、それらは大抵のクロマトグラフィ
ー材料の孔よりも大きい。このことは、次に、なかんずく、プラスミドDNAのた
めに一般的に用いる分離材料の乏しい結合能力を引き起こす。
を有するエピゲノミックな（epigenomic）環状のDNA分子である。それらのコン
パクトな形状（スーパーコイル）にもかかわらず、プラスミドDNA分子は、通常
、数百nmの大きさを有する。その寸法により、それらは大抵のクロマトグラフィ
ー材料の孔よりも大きい。このことは、次に、なかんずく、プラスミドDNAのた
めに一般的に用いる分離材料の乏しい結合能力を引き起こす。
【０００５】
プラスミドDNAの精製におけるさらなる問題は、それからプラスミドDNAを分離
すべき不純物によって引き起こされる。それらは、まず、ゲノムDNAおよびRNAで
ある。プラスミドDNAと寸分違わず、これらの分子は、強い陰イオン性の特徴を
有し、したがって分離材料と極めて類似の結合挙動を有する。
すべき不純物によって引き起こされる。それらは、まず、ゲノムDNAおよびRNAで
ある。プラスミドDNAと寸分違わず、これらの分子は、強い陰イオン性の特徴を
有し、したがって分離材料と極めて類似の結合挙動を有する。
【０００６】
エンドトキシンの除去は、少なくとも複合体としてである。エンドトキシンは
、例えば、大腸菌（Escherichia coli）などのグラム陰性宿主細胞の外膜に局在
するリポ多糖（LPS）である。細胞溶解の間、プラスミドDNAに加えて、LPSおよ
び他の膜構成物質が、溶け出す。エンドトキシンは、１細胞あたりおよそ3.5×1
06コピーの多数で細胞中に存在し(Escherichia Coli and Salmonella Typhimuri
um Cell. and Mol. Biology, J.L. Ingraham et al. Eds., 1987, ASM)、そして
104を超える係数だけプラスミドDNA分子の数を上回る。この理由から、グラム陰
性宿主細胞から得られたプラスミドDNAは、しばしば多量のエンドトキシンを含
む。しかしながら、これらの物質は、多くの望まない副反応をもたらす(Morriso
n and Ryan, 1987, Ann. Rev. Med. 38, 417-432; Boyle et al. 1998, DNA and
Cell Biology, 17, 343-348)。例えば、遺伝子治療に本プラスミドDNAを用いよ
うとした場合、例えば、不純物による炎症性または壊死性の副反応が起こらない
ということは、極めて重要である。したがって、エンドトキシンの濃度を可能な
限り低いレベルに低減するための効果的な方法に対する極めて大きな需要が存在
する。
、例えば、大腸菌（Escherichia coli）などのグラム陰性宿主細胞の外膜に局在
するリポ多糖（LPS）である。細胞溶解の間、プラスミドDNAに加えて、LPSおよ
び他の膜構成物質が、溶け出す。エンドトキシンは、１細胞あたりおよそ3.5×1
06コピーの多数で細胞中に存在し(Escherichia Coli and Salmonella Typhimuri
um Cell. and Mol. Biology, J.L. Ingraham et al. Eds., 1987, ASM)、そして
104を超える係数だけプラスミドDNA分子の数を上回る。この理由から、グラム陰
性宿主細胞から得られたプラスミドDNAは、しばしば多量のエンドトキシンを含
む。しかしながら、これらの物質は、多くの望まない副反応をもたらす(Morriso
n and Ryan, 1987, Ann. Rev. Med. 38, 417-432; Boyle et al. 1998, DNA and
Cell Biology, 17, 343-348)。例えば、遺伝子治療に本プラスミドDNAを用いよ
うとした場合、例えば、不純物による炎症性または壊死性の副反応が起こらない
ということは、極めて重要である。したがって、エンドトキシンの濃度を可能な
限り低いレベルに低減するための効果的な方法に対する極めて大きな需要が存在
する。
【０００７】
エンドトキシンレベルを低減する既知の方法は、しばしばシリカ支持体、ガラ
ス粉末またはヒドロキシアパタイトを用いる複数の精製工程に、また逆相、アフ
ィニティ、サイズ排除および／または陰イオン交換クロマトグラフィーに基づい
ている。
ス粉末またはヒドロキシアパタイトを用いる複数の精製工程に、また逆相、アフ
ィニティ、サイズ排除および／または陰イオン交換クロマトグラフィーに基づい
ている。
【０００８】
まず、宿主細胞を、例えばアルカリ溶解などの既知の方法で消化する。しかし
ながら、例えば、高圧煮沸溶解の使用、界面活性剤の使用またはリゾチームによ
る消化などの他の溶解方法も知られている。
ながら、例えば、高圧煮沸溶解の使用、界面活性剤の使用またはリゾチームによ
る消化などの他の溶解方法も知られている。
【０００９】
媒質中のプラスミドDNAはこのようにして得られ、「清澄化溶解液（cleared l
ysate）」は基本的に比較的小さな細胞構成物、前の処理工程の化学品、RNA、タ
ンパク質およびエンドトキシンが混入している。これら不純物の除去には、通常
、複数の引き続く精製工程が必要である。陰イオン交換クロマトグラフィーによ
る精製がとりわけ有利であることが証明されている。
ysate）」は基本的に比較的小さな細胞構成物、前の処理工程の化学品、RNA、タ
ンパク質およびエンドトキシンが混入している。これら不純物の除去には、通常
、複数の引き続く精製工程が必要である。陰イオン交換クロマトグラフィーによ
る精製がとりわけ有利であることが証明されている。
【００１０】
しかしながら、プラスミドDNAに対するたいていの陰イオン交換体の動的結合
容量（dynamic binding capacity）は、分離材料１mlあたり約0.4mg(about 0.4
mg/ml of separating material)だけである。この低い値の理由は、官能基が支
持体と直接または短いスペーサーを介して結合し、そしてその結果、大きなプラ
スミドDNA分子との相互反応について限定した範囲でだけ利用可能だからである
。
容量（dynamic binding capacity）は、分離材料１mlあたり約0.4mg(about 0.4
mg/ml of separating material)だけである。この低い値の理由は、官能基が支
持体と直接または短いスペーサーを介して結合し、そしてその結果、大きなプラ
スミドDNA分子との相互反応について限定した範囲でだけ利用可能だからである
。
【００１１】
従来の陰イオン交換クロマトグラフィーのさらなる欠点は、相当な量のエンド
トキシンがプラスミドDNAとともに結合し、この方法では分離できないというこ
とである。プラスミドDNA 1mgあたり500EU(500EU/mg of plasmid DNA)より多い
割合のエンドトキシンを伴なうプラスミドDNAが得られる。したがって、エンド
トキシンレベルを低減するために、例えば、クロマトグラフ工程（ゲル濾過）ま
たはイソプロパノール、酢酸アンモニウム若しくはポリエチレングリコールでの
沈降などの、さらなる精製工程が必要である。例えば、陰イオン交換クロマトグ
ラフィーなどのクロマトグラフ方法を組み合わせた精製方法および付加的なエン
ドトキシン除去工程は、プラスミドDNA 1mgあたり50EU(50EU/mg of plasmid DNA
)より少ないエンドトキシン含量を有するプラスミドDNAを得ることを可能にする
。しかしながら、このタイプの方法は、通常、複雑で、時間がかかり、比較的大
量のDNAの精製についての限られた好適性しかない。
トキシンがプラスミドDNAとともに結合し、この方法では分離できないというこ
とである。プラスミドDNA 1mgあたり500EU(500EU/mg of plasmid DNA)より多い
割合のエンドトキシンを伴なうプラスミドDNAが得られる。したがって、エンド
トキシンレベルを低減するために、例えば、クロマトグラフ工程（ゲル濾過）ま
たはイソプロパノール、酢酸アンモニウム若しくはポリエチレングリコールでの
沈降などの、さらなる精製工程が必要である。例えば、陰イオン交換クロマトグ
ラフィーなどのクロマトグラフ方法を組み合わせた精製方法および付加的なエン
ドトキシン除去工程は、プラスミドDNA 1mgあたり50EU(50EU/mg of plasmid DNA
)より少ないエンドトキシン含量を有するプラスミドDNAを得ることを可能にする
。しかしながら、このタイプの方法は、通常、複雑で、時間がかかり、比較的大
量のDNAの精製についての限られた好適性しかない。
【００１２】
WO95/21179には、清澄化溶解液を塩水溶液および界面活性剤で最初にプレイン
キュベートするエンドトキシンレベルの低減方法が記載されている。この後に、
イオン交換材料をさらなる塩水溶液で洗浄したイオン交換クロマトグラフィーに
よる精製を行ない、プラスミドDNAを溶出し、続いて、例えば、イソプロパノー
ル沈降によってさらに精製する。この方法は、同様に、前記の欠点を有する。
キュベートするエンドトキシンレベルの低減方法が記載されている。この後に、
イオン交換材料をさらなる塩水溶液で洗浄したイオン交換クロマトグラフィーに
よる精製を行ない、プラスミドDNAを溶出し、続いて、例えば、イソプロパノー
ル沈降によってさらに精製する。この方法は、同様に、前記の欠点を有する。
【００１３】
純粋な陰イオン交換クロマトグラフィー工程のかわりに、WO99/63076では、２
５〜９０％のアルコールを洗浄緩衝液に加えた混合型方式（mixed-mode princip
le）を用いる。この方法は同様に、効果的な精製を達成するための複数の工程を
要求するのが典型的である。
５〜９０％のアルコールを洗浄緩衝液に加えた混合型方式（mixed-mode princip
le）を用いる。この方法は同様に、効果的な精製を達成するための複数の工程を
要求するのが典型的である。
【００１４】
したがって、本発明の目的は、第一に、さらなる精製工程なしにプラスミドDN
A 1mgあたり50EU(50EU/mg of plasmid DNA)より少ないエンドトキシン含量を有
するプラスミドDNAを提供し、第二に、大量のDNAの精製に適してもいるプラスミ
ドDNAのクロマトグラフ精製方法を提供することであった。
A 1mgあたり50EU(50EU/mg of plasmid DNA)より少ないエンドトキシン含量を有
するプラスミドDNAを提供し、第二に、大量のDNAの精製に適してもいるプラスミ
ドDNAのクロマトグラフ精製方法を提供することであった。
【００１５】
清澄化溶解液を塩フリーの界面活性剤溶液でプレインキュベートし、続いて触
手支持体（tentacle support）上で陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて精
製した場合、さらなる沈降工程なしに極めて良好な純度でプラスミドDNAが得ら
れることが見出された。本発明の方法は、少量のプラスミドDNAの精製に適して
いるが、特には、大量のプラスミドDNAの精製にも適している。
手支持体（tentacle support）上で陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて精
製した場合、さらなる沈降工程なしに極めて良好な純度でプラスミドDNAが得ら
れることが見出された。本発明の方法は、少量のプラスミドDNAの精製に適して
いるが、特には、大量のプラスミドDNAの精製にも適している。
【００１６】
プレインキュベーションを塩含有界面活性剤溶液で行なうWO 95/21179に開示
のものに比べて、塩フリーの界面活性剤溶液の使用、特に、続く触手支持体上で
の陰イオン交換クロマトグラフィーとの組合せでの使用は、エンドトキシンレベ
ルの極めて効率的な低減をもたらすことが見出された。
のものに比べて、塩フリーの界面活性剤溶液の使用、特に、続く触手支持体上で
の陰イオン交換クロマトグラフィーとの組合せでの使用は、エンドトキシンレベ
ルの極めて効率的な低減をもたらすことが見出された。
【００１７】
したがって、本発明は、天然の、遺伝子工学的または生物工学的なソース由来
の核酸中のエンドトキシンレベルを低減する方法であって、以下の工程： a) 精製すべき核酸を含む媒質の調製; b) 工程a)からの媒質の、塩フリーの界面活性剤溶液とのプレインキュベーショ
ン; c) 工程b)からのインキュベーション溶液の、官能基が支持体表面の触手と結合
する陰イオン交換材料への適用; d) 不純物がイオン強度の増加および／またはpHの変化によって洗い出される、
即ち、陰イオン交換クロマトグラフィー条件下での、陰イオン交換体の洗浄; e) さらなるイオン強度の増加および／またはpHの変化による試料の溶出、 によって特徴づけられる、前記方法に関する。
の核酸中のエンドトキシンレベルを低減する方法であって、以下の工程： a) 精製すべき核酸を含む媒質の調製; b) 工程a)からの媒質の、塩フリーの界面活性剤溶液とのプレインキュベーショ
ン; c) 工程b)からのインキュベーション溶液の、官能基が支持体表面の触手と結合
する陰イオン交換材料への適用; d) 不純物がイオン強度の増加および／またはpHの変化によって洗い出される、
即ち、陰イオン交換クロマトグラフィー条件下での、陰イオン交換体の洗浄; e) さらなるイオン強度の増加および／またはpHの変化による試料の溶出、 によって特徴づけられる、前記方法に関する。
【００１８】
好ましい態様において、精製すべき生物学的ソースはプラスミドDNAを含む。
本方法の好ましい態様において、DEAEまたはTMAE陰イオン交換体が用いられる
。 好ましい態様において、工程d)に用いられる洗浄緩衝液は、０〜２０％（v/v
）の有機の溶媒または溶媒混合物、特に１または２以上のアルコール、好ましく
はC1〜C5のアルコール、特に好ましくはエタノールおよび／またはイソプロパノ
ールを含む。
。 好ましい態様において、工程d)に用いられる洗浄緩衝液は、０〜２０％（v/v
）の有機の溶媒または溶媒混合物、特に１または２以上のアルコール、好ましく
はC1〜C5のアルコール、特に好ましくはエタノールおよび／またはイソプロパノ
ールを含む。
【００１９】
さらに好ましい態様において、工程a)で調製された媒質は、アルカリ溶解など
の消化方法、遠心分離、濾過または沈降によって、天然のソースから得られる。
媒質は典型的には清澄化溶解液である。
の消化方法、遠心分離、濾過または沈降によって、天然のソースから得られる。
媒質は典型的には清澄化溶解液である。
【００２０】
図１は、フラクトゲル（Fractogel（登録商標））EMD TMAE HiCap触手支持体(
TS)と、WO 95/21179に用いられた材料に対応する従来のシリカ-DEAE支持体(SS)
との動的結合容量の比較を示す。
TS)と、WO 95/21179に用いられた材料に対応する従来のシリカ-DEAE支持体(SS)
との動的結合容量の比較を示す。
【００２１】
クロマトグラフィー用分離材料は、当業者に知られているとおり、有機または
無機の高分子成形品からなる。本発明に関して、成形品なる用語は、例えば、ビ
ーズ状成形品、メンブレン、チューブ、中空糸メンブレンまたはスポンジなどの
多孔性および無孔性の高分子材料を意味する。
無機の高分子成形品からなる。本発明に関して、成形品なる用語は、例えば、ビ
ーズ状成形品、メンブレン、チューブ、中空糸メンブレンまたはスポンジなどの
多孔性および無孔性の高分子材料を意味する。
【００２２】
本発明に関して、触手支持体は、官能基が個々に支持体とスペーサーを介して
結合していない分離材料である。代わりに、本発明に用いる分離材料の官能基は
、ベース支持体に重合化されるポリマー鎖のモノマー単位に結合する。これらフ
レキシブルポリマー構造は、時々「触手様（tentacle-like）」と呼ばれる。触
手支持体の例は、WO 96/22316、WO 97/49754、EP 0 337 144、DE 43 34 359およ
びWO 95/09695に開示されている。支持体のベース材料および官能基は、特定の
クロマトグラフの目的に依存して選択することができる。好ましいものとして、
メタクリレートベースのコポリマーから作成された触手支持体が挙げられ、特に
好ましくは、例えば、メルク社（Merck KGaA、ドイツ連邦共和国）からのフラク
トゲル（登録商標）EMDが挙げられる。
結合していない分離材料である。代わりに、本発明に用いる分離材料の官能基は
、ベース支持体に重合化されるポリマー鎖のモノマー単位に結合する。これらフ
レキシブルポリマー構造は、時々「触手様（tentacle-like）」と呼ばれる。触
手支持体の例は、WO 96/22316、WO 97/49754、EP 0 337 144、DE 43 34 359およ
びWO 95/09695に開示されている。支持体のベース材料および官能基は、特定の
クロマトグラフの目的に依存して選択することができる。好ましいものとして、
メタクリレートベースのコポリマーから作成された触手支持体が挙げられ、特に
好ましくは、例えば、メルク社（Merck KGaA、ドイツ連邦共和国）からのフラク
トゲル（登録商標）EMDが挙げられる。
【００２３】
触手支持体は、従来の分離材料よりも、プラスミドDNAに対するより大きな結
合容量を示す。例１および図１は、フラクトゲル（登録商標）EMD触手支持体と
シリカ支持体（WO 95/21179において用いられる）との動的結合容量の比較を示
す。フラクトゲル（登録商標）EMD触手支持体の結合容量は、支持体１mlあたり
プラスミド１mg(1mg of plasmid/ml of support)より大きく、一方で、シリカ支
持体は、支持体１mlあたりプラスミド0.4mg(0.4mg of plasmid/ml of support)
だけしか結合するに過ぎない。
合容量を示す。例１および図１は、フラクトゲル（登録商標）EMD触手支持体と
シリカ支持体（WO 95/21179において用いられる）との動的結合容量の比較を示
す。フラクトゲル（登録商標）EMD触手支持体の結合容量は、支持体１mlあたり
プラスミド１mg(1mg of plasmid/ml of support)より大きく、一方で、シリカ支
持体は、支持体１mlあたりプラスミド0.4mg(0.4mg of plasmid/ml of support)
だけしか結合するに過ぎない。
【００２４】
生体高分子の分離または精製に用いられるクロマトグラフ用分離材料または吸
着剤は、良好な分離特性に加えて、高いアルカリ安定性を有していなければなら
ない。このことは、特に、吸着剤が受ける特別な精製および滅菌方法のためであ
る。
着剤は、良好な分離特性に加えて、高いアルカリ安定性を有していなければなら
ない。このことは、特に、吸着剤が受ける特別な精製および滅菌方法のためであ
る。
【００２５】
いわゆる定置洗浄（clean in place）方法において、例えば分離材料を1M水酸
化ナトリウム溶液で、カラムの寸法に応じて１０分〜３時間処理する。微生物混
入を避けるため、分離材料の長期貯蔵を0.1M水酸化ナトリウム溶液中で行なう。
生体高分子の分離のために用いる分離材料の全てが、このような条件下で安定な
わけではない。
化ナトリウム溶液で、カラムの寸法に応じて１０分〜３時間処理する。微生物混
入を避けるため、分離材料の長期貯蔵を0.1M水酸化ナトリウム溶液中で行なう。
生体高分子の分離のために用いる分離材料の全てが、このような条件下で安定な
わけではない。
【００２６】
例えば、EP 0 337 144またはWO 95/09695において、本発明による使用に対し
て開示もされているバイオクロマトグラフィー用ベース支持体は、例えば、デキ
ストラン、アガロースまたはセルロースなどの天然の高分子、シリカゲル、また
はポリスチレンおよびメタクリレートなどの合成高分子である。特に、シリカゲ
ルに基づく分離材料は、既知の通り、乏しいアルカリ安定性を示す。しかしなが
ら、メタクリレートに基づく支持体は、限定された範囲でだけアルカリ処理を受
けることもできる。したがって、本発明の使用のために、高いアルカリ安定性を
有する分離材料が特に好ましい。この方法において、バイオクロマトグラフィー
における使用のための分離材料は、十分に滅菌することができ、そして、反復使
用にさえも適している。
て開示もされているバイオクロマトグラフィー用ベース支持体は、例えば、デキ
ストラン、アガロースまたはセルロースなどの天然の高分子、シリカゲル、また
はポリスチレンおよびメタクリレートなどの合成高分子である。特に、シリカゲ
ルに基づく分離材料は、既知の通り、乏しいアルカリ安定性を示す。しかしなが
ら、メタクリレートに基づく支持体は、限定された範囲でだけアルカリ処理を受
けることもできる。したがって、本発明の使用のために、高いアルカリ安定性を
有する分離材料が特に好ましい。この方法において、バイオクロマトグラフィー
における使用のための分離材料は、十分に滅菌することができ、そして、反復使
用にさえも適している。
【００２７】
本発明の方法のためには、したがって、式IIの化合物と式Iの反応基を含む触
手支持体の反応によって調製されるアルカリ安定吸着剤が特に好ましい。
手支持体の反応によって調製されるアルカリ安定吸着剤が特に好ましい。
【化１】
【００２８】
式Iにおいて：
R1、R2およびR3は、それぞれ互いに独立してHまたはCH3であり、
R4は、H、１〜５個の炭素原子を有するアルキルまたは６〜１２個の炭素原子を
有するアリールであり、 Uは、-O-または-NH-であり、そして nは、１〜５の整数である。
有するアリールであり、 Uは、-O-または-NH-であり、そして nは、１〜５の整数である。
【化２】
【００２９】
式IIにおいて、
Aは、NHR5であり、
Bは、H、OH、SHまたはNHR5であり、ここで
R5は、H、１〜５個の炭素原子を有するアルキル、好ましくはH、メチルまたはエ
チルであり、そして mは、１〜６の整数で、好ましくは２および３である。
チルであり、そして mは、１〜６の整数で、好ましくは２および３である。
【００３０】
支持体は、特に好ましくは、式I（式中、
R1およびR2は、Hであり、
R3は、CH3であり、
R4は、Hであり、
Uは、-O-であり、そして
nは、１である）
の反応基を含む。
これらの基は、好ましくは、ベースポリマーへのメタクリル酸グリシジルのブ
ロック重合化またはグラフト重合化によって形成される。
ロック重合化またはグラフト重合化によって形成される。
【００３１】
用いた式IIの化合物は、特に好ましくはエタノールアミンである。
支持体は、極めて特に好ましくは、ポリアミド、ポリビニルアルコールまたは
（メタ）アクリレート誘導体のコポリマーおよび脂肪族水酸基を含むコモノマー
を含むベースポリマーからなる。
（メタ）アクリレート誘導体のコポリマーおよび脂肪族水酸基を含むコモノマー
を含むベースポリマーからなる。
【００３２】
支持体は、付加的に、分離エフェクターをもつ式IIIの基を含んでもよい。
【化３】
【００３３】
式IIIにおいて：
R1、R2およびR3は、互いに独立して、HまたはCH3であり、
R4は、H、１〜５個の炭素原子を有するアルキルまたは６〜１２個の炭素原子を
有するアリールであり、 Uは、-O-または-NH-であり、 nは、１〜５の整数であり、そして １つの基Xは、分離エフェクターで、他の基XはOHである。
有するアリールであり、 Uは、-O-または-NH-であり、 nは、１〜５の整数であり、そして １つの基Xは、分離エフェクターで、他の基XはOHである。
【００３４】
分離エフェクタ−は、特に、
−NR7R8および−N+R7R8R9、
（式中
R7およびR8は、互いに独立して、Hまたは１〜５個の炭素原子を有するアルキル
であり、そして R9は、１〜５個の炭素原子を有するアルキルであるが、 但し、X＝−N+R7R8R9の場合、R7およびR8はHとはなり得ない） から選択されるイオン性基である。
であり、そして R9は、１〜５個の炭素原子を有するアルキルであるが、 但し、X＝−N+R7R8R9の場合、R7およびR8はHとはなり得ない） から選択されるイオン性基である。
【００３５】
式Iに従う反応基を含む支持体は、式IIに従う化合物との反応によって、安定
化される。この目的のため、支持体は、典型的には、対応する化合物の0.5〜5M
水溶液で処理され、20〜60℃で1〜6時間往復運動することによって混合される。
式II（式中、mは、１または２）の化合物との反応が特に好ましい。より長い鎖
の化合物は、成形品の疎水特性を高める。
化される。この目的のため、支持体は、典型的には、対応する化合物の0.5〜5M
水溶液で処理され、20〜60℃で1〜6時間往復運動することによって混合される。
式II（式中、mは、１または２）の化合物との反応が特に好ましい。より長い鎖
の化合物は、成形品の疎水特性を高める。
【００３６】
この続く安定化工程は、通常ベース変動（generally base-labile）ポリマー
またはアクリレート誘導体の重合化層を、アルカリ処理に対し有意により安定に
する。したがって、極めて良好な結合容量によって特徴づけられるのだが、アク
リレートでのブロック重合またはグラフト重合により製造される吸着剤の主要な
欠点は克服される。本発明に用いられるための好ましい官能基は、トリメチルア
ンモニウムエチル(TMAE)、ジエチルアミノエチル(DEAE)またはジメチルアミノエ
チル(DMAE)である。
またはアクリレート誘導体の重合化層を、アルカリ処理に対し有意により安定に
する。したがって、極めて良好な結合容量によって特徴づけられるのだが、アク
リレートでのブロック重合またはグラフト重合により製造される吸着剤の主要な
欠点は克服される。本発明に用いられるための好ましい官能基は、トリメチルア
ンモニウムエチル(TMAE)、ジエチルアミノエチル(DEAE)またはジメチルアミノエ
チル(DMAE)である。
【００３７】
今や、触手支持体の高い結合容量および安定性に加えて、それらが陰イオン交
換クロマトグラフィーによるプラスミドDNAの精製において特に利点を有するこ
とが見出された。触手支持体を用いる本発明による方法は、エンドトキシンの含
有量を標準的な方法に比べて１０〜２０倍低減することができる。したがって、
従来技術ではクロマトグラフ精製の後に行なわれなければならないさらなる精製
工程は、本発明による方法においては、通常、不必要である。
換クロマトグラフィーによるプラスミドDNAの精製において特に利点を有するこ
とが見出された。触手支持体を用いる本発明による方法は、エンドトキシンの含
有量を標準的な方法に比べて１０〜２０倍低減することができる。したがって、
従来技術ではクロマトグラフ精製の後に行なわれなければならないさらなる精製
工程は、本発明による方法においては、通常、不必要である。
【００３８】
本発明の方法は、特に核酸の精製に適している。これらは、一本鎖または二本
鎖のRNAまたはDNA、RNA/DNAハイブリッド、DNA断片、オリゴヌクレオチド、増幅
DNAまたはRNA、BAC、または特にプラスミドDNAである。核酸のサイズは、6 b/bp
〜1000 kb/kbpの間であり得る。
鎖のRNAまたはDNA、RNA/DNAハイブリッド、DNA断片、オリゴヌクレオチド、増幅
DNAまたはRNA、BAC、または特にプラスミドDNAである。核酸のサイズは、6 b/bp
〜1000 kb/kbpの間であり得る。
【００３９】
精製すべき核酸は、任意の天然の、遺伝子工学的または原核細胞培養物などの
生物工学的なソースからの由来であってもよい。細胞調製物からの核酸を精製す
べき場合、細胞は最初に、例えば、溶解などの既知の方法によって消化される。
精製すべき材料が既に他の方法で前処理されている場合、溶解的消化は不必要で
ある。例えば、媒質は、生物学的材料から細胞残屑およびRNAの沈殿の除去によ
り得られ、また、すでに前精製され、そして例えば、緩衝液または代替的に増幅
後形成され、エンドトキシン不純物をまだ含む核酸溶液中に存在する核酸試料か
ら得られる。濾過、沈降または遠心分離工程が必要となり得る。当業者は生物学
的材料のソースに応じて適切な消化方法を選択することができる。いずれにして
も、精製すべき試料は、本発明による方法のために、界面活性剤溶液の添加にお
いて、沈殿を形成しない、または他の望まない副反応を生じない媒質に存在すべ
きである。媒質は、好ましくは、例えば、清澄化溶解液などの細胞から得た溶解
液である。
生物工学的なソースからの由来であってもよい。細胞調製物からの核酸を精製す
べき場合、細胞は最初に、例えば、溶解などの既知の方法によって消化される。
精製すべき材料が既に他の方法で前処理されている場合、溶解的消化は不必要で
ある。例えば、媒質は、生物学的材料から細胞残屑およびRNAの沈殿の除去によ
り得られ、また、すでに前精製され、そして例えば、緩衝液または代替的に増幅
後形成され、エンドトキシン不純物をまだ含む核酸溶液中に存在する核酸試料か
ら得られる。濾過、沈降または遠心分離工程が必要となり得る。当業者は生物学
的材料のソースに応じて適切な消化方法を選択することができる。いずれにして
も、精製すべき試料は、本発明による方法のために、界面活性剤溶液の添加にお
いて、沈殿を形成しない、または他の望まない副反応を生じない媒質に存在すべ
きである。媒質は、好ましくは、例えば、清澄化溶解液などの細胞から得た溶解
液である。
【００４０】
大腸菌（E. coli）からのプラスミドDNAの精製のために、細胞は、例えば、最
初にNaOH/SDS溶液でのアルカリ溶解によって溶解される。次いで、酸性のカリウ
ム含有中和緩衝液の添加によって、遠心分離または濾過により除去し得る沈殿が
生じる。残存の上清、清澄化溶解液を本発明による方法のための出発物質、即ち
媒質として用いることができる。透析または沈降などの既知の方法によって、清
澄化溶解液を最初に濃縮または予備精製することもできる。
初にNaOH/SDS溶液でのアルカリ溶解によって溶解される。次いで、酸性のカリウ
ム含有中和緩衝液の添加によって、遠心分離または濾過により除去し得る沈殿が
生じる。残存の上清、清澄化溶解液を本発明による方法のための出発物質、即ち
媒質として用いることができる。透析または沈降などの既知の方法によって、清
澄化溶解液を最初に濃縮または予備精製することもできる。
【００４１】
本発明による方法の最初の工程において、塩フリーの非イオン性界面活性剤溶
液を清澄化溶解液に添加する。界面活性剤中の不純物を介して塩が溶液に入る場
合、その濃度は0.005％より小さく、即ち、1mMより小さくなくてはならない。用
いられる界面活性剤は、例えば、トライトン（Triton）（登録商標）X-100、ト
ライトン（登録商標）X-114、トゥイーン（Tween）（登録商標）20もしくはイゲ
パル（Igepal）（登録商標）CA 630、またはそれらの混合物などの非イオン性界
面活性剤である。試料への添加後、界面活性剤は、好ましくは、終濃度0.01〜30
％(v/v)、特に好ましくは0.5〜15％(v/v)で存在する。
液を清澄化溶解液に添加する。界面活性剤中の不純物を介して塩が溶液に入る場
合、その濃度は0.005％より小さく、即ち、1mMより小さくなくてはならない。用
いられる界面活性剤は、例えば、トライトン（Triton）（登録商標）X-100、ト
ライトン（登録商標）X-114、トゥイーン（Tween）（登録商標）20もしくはイゲ
パル（Igepal）（登録商標）CA 630、またはそれらの混合物などの非イオン性界
面活性剤である。試料への添加後、界面活性剤は、好ましくは、終濃度0.01〜30
％(v/v)、特に好ましくは0.5〜15％(v/v)で存在する。
【００４２】
プレインキュベーションの後に、溶解液を本発明に関して適切な陰イオン交換
体に添加する。負荷、洗浄および溶出は既知の方法で行なわれる。イオン交換体
に対する標的分子の結合の程度および強度は、とりわけ、緩衝液のpHおよびイオ
ン強度、標的分子の等電点およびマトリックスの電荷密度に依存する。一般的に
、試料を、非結合分子を洗い出した後に、低イオン強度の緩衝液で平衡化したカ
ラムへ負荷する。イオン強度の増大および／またはpHの変化によって、さらなる
イオン強度の増大および／またはさらなるpHの変化を介して標的分子が溶出する
前に、不純物が選択的に洗い出される。
体に添加する。負荷、洗浄および溶出は既知の方法で行なわれる。イオン交換体
に対する標的分子の結合の程度および強度は、とりわけ、緩衝液のpHおよびイオ
ン強度、標的分子の等電点およびマトリックスの電荷密度に依存する。一般的に
、試料を、非結合分子を洗い出した後に、低イオン強度の緩衝液で平衡化したカ
ラムへ負荷する。イオン強度の増大および／またはpHの変化によって、さらなる
イオン強度の増大および／またはさらなるpHの変化を介して標的分子が溶出する
前に、不純物が選択的に洗い出される。
【００４３】
当業者は、特定の触手支持体または精製すべき生物学的材料に対して適切な試
薬を選択することができる。ここで、プラスミドDNAと、例えばフラクトゲル（
登録商標）EMD TMAE支持体などのイオン交換基との間の相互作用が、例えば、シ
リカ-DEAE支持体などの従来の支持体を使用した場合よりも、イオン強度におけ
る相違によって、より強く影響することに注意すべきである。TMAEのpK（１３を
超える）が、DEAEのそれ（１１）よりも大きいのであるが、したがって特別な負
荷条件を、フラクトゲル（登録商標）EMD触手支持体の使用において、順守しな
くてはならない。特に、支持体に負荷されるべき試料のイオン強度が、プラスミ
ドDNAの溶出点のそれよりも十分に下であることが確保されなければならない。
薬を選択することができる。ここで、プラスミドDNAと、例えばフラクトゲル（
登録商標）EMD TMAE支持体などのイオン交換基との間の相互作用が、例えば、シ
リカ-DEAE支持体などの従来の支持体を使用した場合よりも、イオン強度におけ
る相違によって、より強く影響することに注意すべきである。TMAEのpK（１３を
超える）が、DEAEのそれ（１１）よりも大きいのであるが、したがって特別な負
荷条件を、フラクトゲル（登録商標）EMD触手支持体の使用において、順守しな
くてはならない。特に、支持体に負荷されるべき試料のイオン強度が、プラスミ
ドDNAの溶出点のそれよりも十分に下であることが確保されなければならない。
【００４４】
例えば、エタノール含有緩衝液のかわりにイソプロパノール含有緩衝液の使用
が有利であることが見出された。DE 44 03 693に提案されたように、調製した核
酸の特に良好なトランスフェクションの割合（またはより低いエンドトキシンの
不純物レベル）が、イソプロパノール含有緩衝液の使用を介して達成できる。本
発明により用いられる洗浄および溶出緩衝液は、２０％(v/v)以上の１種または
２種以上の有機溶媒を含まないべきである。これは不純物の洗い出しおよび核酸
の溶出を陰イオン交換クロマトグラフィー、即ち、特にイオン強度および／また
はpH変化に依存しているものによって行い、さらなる洗浄工程を不要とするため
である。特に、用いられる有機溶媒は、C1-からC5-アルコール、好ましくはエタ
ノールおよび／またはイソプロパノールである。緩衝液は特に好ましくは、１０
〜１５％のエタノールおよび／またはイソプロパノールを含む。
が有利であることが見出された。DE 44 03 693に提案されたように、調製した核
酸の特に良好なトランスフェクションの割合（またはより低いエンドトキシンの
不純物レベル）が、イソプロパノール含有緩衝液の使用を介して達成できる。本
発明により用いられる洗浄および溶出緩衝液は、２０％(v/v)以上の１種または
２種以上の有機溶媒を含まないべきである。これは不純物の洗い出しおよび核酸
の溶出を陰イオン交換クロマトグラフィー、即ち、特にイオン強度および／また
はpH変化に依存しているものによって行い、さらなる洗浄工程を不要とするため
である。特に、用いられる有機溶媒は、C1-からC5-アルコール、好ましくはエタ
ノールおよび／またはイソプロパノールである。緩衝液は特に好ましくは、１０
〜１５％のエタノールおよび／またはイソプロパノールを含む。
【００４５】
したがって本発明による方法は、典型的には次の工程を含む：
−塩フリー界面活性剤溶液での、核酸（典型的には清澄化溶解液）を含む媒質の
インキュベーション（約１５〜３０分間） −プレキャリブレーションした陰イオン交換体カラムへのインキュベーション溶
液の適用 −洗浄緩衝液でのカラムの洗浄 −溶出緩衝液でのプラスミドDNAの溶出。
インキュベーション（約１５〜３０分間） −プレキャリブレーションした陰イオン交換体カラムへのインキュベーション溶
液の適用 −洗浄緩衝液でのカラムの洗浄 −溶出緩衝液でのプラスミドDNAの溶出。
【００４６】
陰イオン交換体からの溶出後、本発明の方法によって精製されたプラスミドDN
Aは、プラスミド１mgあたり50EU(50EU/mg of plasmid)より少ないエンドトキシ
ン含量を有し、たいていの場合はプラスミド１mgあたり25EU(25EU/mg of plasmi
d)より少ないエンドトキシン含量だけしか有さない。従来の方法では、これらの
値は、沈降やゲル濾過などの付加的な精製工程を介してのみ達成できる。
Aは、プラスミド１mgあたり50EU(50EU/mg of plasmid)より少ないエンドトキシ
ン含量を有し、たいていの場合はプラスミド１mgあたり25EU(25EU/mg of plasmi
d)より少ないエンドトキシン含量だけしか有さない。従来の方法では、これらの
値は、沈降やゲル濾過などの付加的な精製工程を介してのみ達成できる。
【００４７】
塩フリーのプレインキュベーションと特別な陰イオン交換体でのクロマトグラ
フィー工程とを組合わせた本発明による方法は、したがって、例えばプレインキ
ュベーションのための塩含有界面活性剤溶液などを用いた他の方法よりも、５〜
１０倍以上効果的である。本発明の方法のプレインキュベーションが塩含有界面
活性剤溶液で行なわれた場合、精製の効率は落ちる。したがって、例えば、フラ
クトゲル（登録商標） EMD陰イオン交換体などの触手支持体の使用におけるプレ
インキュベーションの間のイオン強度の増大は、溶出試料のエンドトキシン含量
の増大をもたらす。
フィー工程とを組合わせた本発明による方法は、したがって、例えばプレインキ
ュベーションのための塩含有界面活性剤溶液などを用いた他の方法よりも、５〜
１０倍以上効果的である。本発明の方法のプレインキュベーションが塩含有界面
活性剤溶液で行なわれた場合、精製の効率は落ちる。したがって、例えば、フラ
クトゲル（登録商標） EMD陰イオン交換体などの触手支持体の使用におけるプレ
インキュベーションの間のイオン強度の増大は、溶出試料のエンドトキシン含量
の増大をもたらす。
【００４８】
溶出した核酸は、２以上の画分として(in fractions)組合わせるかまたは回収
することができ、そしてそれらのさらなる使用に供される。陰イオン交換体から
溶出後の精製した試料は、常に溶出緩衝液の塩の混入があるので、塩を除くため
に、例えば、透析またはアルコール沈降などの付加的な試料の精製を行なう必要
があり得る。しかしながら、本発明による方法におけるこれら工程は、単に塩を
除くために用いられ、従来技術のように、さらにエンドトキシンレベルを低減す
るために用いられない。
することができ、そしてそれらのさらなる使用に供される。陰イオン交換体から
溶出後の精製した試料は、常に溶出緩衝液の塩の混入があるので、塩を除くため
に、例えば、透析またはアルコール沈降などの付加的な試料の精製を行なう必要
があり得る。しかしながら、本発明による方法におけるこれら工程は、単に塩を
除くために用いられ、従来技術のように、さらにエンドトキシンレベルを低減す
るために用いられない。
【００４９】
精製した核酸の質に加えて、核酸が精製できる規模もまた非常に重要である。
本発明による方法は、少量（１mgより少ない）の精製および大量（１mgから数百
gまたはそれ以上）の精製の両方に好適である。
本発明による方法は、少量（１mgより少ない）の精製および大量（１mgから数百
gまたはそれ以上）の精製の両方に好適である。
【００５０】
さらなる詳細がなくとも、当業者は前記記載をその最も広範な範囲で活用する
ことができるだろう。したがって好ましい態様および例は、絶対的にいかなる限
定もされない単に記述的な開示としてとみなされるべきである。
ことができるだろう。したがって好ましい態様および例は、絶対的にいかなる限
定もされない単に記述的な開示としてとみなされるべきである。
【００５１】
本明細書を通して記載の全ての出願、特許および公報の完全な開示は、参照と
してこの出願に組み込まれる。
してこの出願に組み込まれる。
【００５２】
例
以下の溶液は精製のために用いた：
１．CL再懸濁緩衝液
50mM TRIS.HCl、pH 8.0
10mM EDTA
100 μg/ml DNアーゼフリーのリボヌクレアーゼA
２．CL溶解緩衝液
200mM NaOH
1％(w/v) SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)
３．CL中和緩衝液
3.0M KOAc(酢酸カリウム)、pH 5.5
４．IE平衡緩衝液
50mM TRIS、pH 6.5
500mM NaCl
15％(v/v) エタノール
５．IE洗浄緩衝液
50mM TRIS、pH 6.5
625mM NaCl
15％(v/v) エタノール
６．IE溶出緩衝液
50mM TRIS、pH 8.5
1500mM NaCl
15％(v/v) エタノール
【００５３】
細菌培養液を既知の方法で培養し、清澄化溶解液を得るように処理した。した
がって、これは以下のように簡単に説明される： １．50ml〜3lの細菌培養液からの細胞を、6000gで１５分間遠心分離し、培養液
５０mlあたりCL再懸濁緩衝液４mlに再懸濁した。濁った懸濁液を比較的大きな細
胞凝集なしに得た。 ２．等量のCL溶解緩衝液を添加し、内容物を溶液が清澄化するまで撹拌する（反
転／渦巻き）。この溶液は、室温で１０分間以上保存してはならない。 ３．次いで、等量のCL中和緩衝液（培養液５０mlあたり４ml）を添加し、溶液を
溶解液が濁り、凝集するまで撹拌した。続いて溶解液を氷上で１５〜２０分間イ
ンキュベートした。 ４．次いで、溶液を20,000g、３０分間、４℃で遠心分離し、清澄化溶解液を得
た。 ５．清澄化溶解液の上清を新しい容器に移した。
がって、これは以下のように簡単に説明される： １．50ml〜3lの細菌培養液からの細胞を、6000gで１５分間遠心分離し、培養液
５０mlあたりCL再懸濁緩衝液４mlに再懸濁した。濁った懸濁液を比較的大きな細
胞凝集なしに得た。 ２．等量のCL溶解緩衝液を添加し、内容物を溶液が清澄化するまで撹拌する（反
転／渦巻き）。この溶液は、室温で１０分間以上保存してはならない。 ３．次いで、等量のCL中和緩衝液（培養液５０mlあたり４ml）を添加し、溶液を
溶解液が濁り、凝集するまで撹拌した。続いて溶解液を氷上で１５〜２０分間イ
ンキュベートした。 ４．次いで、溶液を20,000g、３０分間、４℃で遠心分離し、清澄化溶解液を得
た。 ５．清澄化溶解液の上清を新しい容器に移した。
【００５４】
例1:結合容量の比較
フラクトゲル（登録商標）EMD TMAE触手支持体(TS)の動的結合容量を、官能基
にグラフトしたキアゲン（Qiagen）からの従来のシリカ支持体(SS)と比較した。
にグラフトしたキアゲン（Qiagen）からの従来のシリカ支持体(SS)と比較した。
【００５５】
細菌（pTriExプラスミドで形質転換したDH5α、pBluesciptプラスミドで形質
転換したJM109およびpTriExプラスミドで形質転換したNovaBlueの一夜培養）を
ペレット化し、CL再懸濁緩衝液、CL溶解緩衝液およびCL中和緩衝液を用いて、連
続的に再懸濁、溶解および中和を行なった。種々の溶解液の細胞残屑は遠心分離
除去した。 この時点で、種々の清澄化溶解液を、同一の出発材料が精製に用いられること
を確保するために、２つの画分にそれぞれ分割した。
転換したJM109およびpTriExプラスミドで形質転換したNovaBlueの一夜培養）を
ペレット化し、CL再懸濁緩衝液、CL溶解緩衝液およびCL中和緩衝液を用いて、連
続的に再懸濁、溶解および中和を行なった。種々の溶解液の細胞残屑は遠心分離
除去した。 この時点で、種々の清澄化溶解液を、同一の出発材料が精製に用いられること
を確保するために、２つの画分にそれぞれ分割した。
【００５６】
各清澄化溶解液の２つの画分の１つ（全てが支持体の量に対するプラスミドの
量が飽和である）をフラクトゲル（登録商標）支持体に負荷し、他方をシリカ支
持体に負荷した。
量が飽和である）をフラクトゲル（登録商標）支持体に負荷し、他方をシリカ支
持体に負荷した。
【００５７】
試料の負荷の前に、フラクトゲル（登録商標）EMD TMAE HiCapカラムを、５カ
ラム容量のIE平衡緩衝液で平衡化した。シリカ支持体キアゲンプラスミドマキシ
キット（QIAGEN（登録商標）Plasmid Maxi Kit、カタログ番号12163）での陰イ
オン交換クロマトグラフィーのために、WO 95/21179、例１に記載の緩衝液を用
いた。カラムの負荷の間、全ての溶出液を２以上の画分として回収し、プラスミ
ド含有量を分析した。
ラム容量のIE平衡緩衝液で平衡化した。シリカ支持体キアゲンプラスミドマキシ
キット（QIAGEN（登録商標）Plasmid Maxi Kit、カタログ番号12163）での陰イ
オン交換クロマトグラフィーのために、WO 95/21179、例１に記載の緩衝液を用
いた。カラムの負荷の間、全ての溶出液を２以上の画分として回収し、プラスミ
ド含有量を分析した。
【００５８】
図１は、分析の結果を示す。４回の独立実験の結果を計算した。動的結合容量
は、支持体１mlあたりのプラスミドDNAのmg(mg of plasmid DNA/ml of support)
で縦軸に示す。フラクトゲル（登録商標）EMD TMAE支持体が、プラスミドDNAに
対する有意に高い結合容量を有することが見出された。
は、支持体１mlあたりのプラスミドDNAのmg(mg of plasmid DNA/ml of support)
で縦軸に示す。フラクトゲル（登録商標）EMD TMAE支持体が、プラスミドDNAに
対する有意に高い結合容量を有することが見出された。
【００５９】
例２：pBacMam DNAの精製
細菌（pBacMamプラスミドで形質転換したDH5a 細胞の一夜培養）をペレット化
し、CL再懸濁緩衝液、CL溶解緩衝液およびCL中和緩衝液を用いて、連続的に再懸
濁、溶解および中和を行なった。細胞残屑は遠心分離除去した。
し、CL再懸濁緩衝液、CL溶解緩衝液およびCL中和緩衝液を用いて、連続的に再懸
濁、溶解および中和を行なった。細胞残屑は遠心分離除去した。
【００６０】
この時点で、清澄化溶解液を、同一の出発材料が全ての精製に用いられること
を確保するために、種々の画分に分割した。 次の画分を形成した： （ａ）清澄化溶解液をプレインキュベーションしないが、代わりにフラクトゲル
（登録商標）支持体に直接負荷する。 （ｂ）清澄化溶解液をその体積の1/10の塩フリー２０％トライトン（登録商標）
X-114溶液で３０分間プレインキュベートし、次いで、フラクトゲル（登録商標
）支持体に負荷する。 （ｃ）清澄化溶解液を既知の方法 (Manthorpe et al. (1993), Hum. Gene Ther. 4, 419-431)により、濃縮しない（uncondensed）トライトン（登録商標）X-114
界面活性剤溶液で２回または３回の連続相分離に付し、次いでフラクトゲル（登
録商標）支持体に負荷する。
を確保するために、種々の画分に分割した。 次の画分を形成した： （ａ）清澄化溶解液をプレインキュベーションしないが、代わりにフラクトゲル
（登録商標）支持体に直接負荷する。 （ｂ）清澄化溶解液をその体積の1/10の塩フリー２０％トライトン（登録商標）
X-114溶液で３０分間プレインキュベートし、次いで、フラクトゲル（登録商標
）支持体に負荷する。 （ｃ）清澄化溶解液を既知の方法 (Manthorpe et al. (1993), Hum. Gene Ther. 4, 419-431)により、濃縮しない（uncondensed）トライトン（登録商標）X-114
界面活性剤溶液で２回または３回の連続相分離に付し、次いでフラクトゲル（登
録商標）支持体に負荷する。
【００６１】
試料の負荷の前に、フラクトゲル（登録商標）EMD TMAE HiCapカラムを５カラ
ム容量のIE平衡緩衝液で平衡化した。負荷の後に、カラムを１０カラム容量のIE
洗浄緩衝液で洗浄し、４カラム容量のIE溶出緩衝液で溶出した。溶出を、さらな
る精製工程なしに、LAL(リムルス変形細胞溶解液)テスト(Bayston and Cohen (1
990), J. Med. Microbiol. 31, 73-83)により分析した。このテストは、欧州薬
局方（European Pharmacopoeia）第３版(1997)第2.6.14章に記載の通り、そして
１９８７年１２月のFDA「ヒトおよび動物の非経口薬、生物学的産物及び医療デ
バイスに対する最終産物エンドトキシンテストとしてのLALテストの検証につい
てのガイドライン（Guideline on validation of the LAL Test as an endprodu
ct endotoxin test for human and animal parenteral drugs, biological prod
ucts and medical devices)」にしたがって行なわれた。溶解液の感度は0.12 EU
/mlより低かった。
ム容量のIE平衡緩衝液で平衡化した。負荷の後に、カラムを１０カラム容量のIE
洗浄緩衝液で洗浄し、４カラム容量のIE溶出緩衝液で溶出した。溶出を、さらな
る精製工程なしに、LAL(リムルス変形細胞溶解液)テスト(Bayston and Cohen (1
990), J. Med. Microbiol. 31, 73-83)により分析した。このテストは、欧州薬
局方（European Pharmacopoeia）第３版(1997)第2.6.14章に記載の通り、そして
１９８７年１２月のFDA「ヒトおよび動物の非経口薬、生物学的産物及び医療デ
バイスに対する最終産物エンドトキシンテストとしてのLALテストの検証につい
てのガイドライン（Guideline on validation of the LAL Test as an endprodu
ct endotoxin test for human and animal parenteral drugs, biological prod
ucts and medical devices)」にしたがって行なわれた。溶解液の感度は0.12 EU
/mlより低かった。
【００６２】
表１は、３回の独立実験から得たエンドトキシンの値を示す。
【表１】
【００６３】
２回の連続したトライトン（登録商標）X-114界面活性剤相分離を実験２で行
ない、実験１および３のそれぞれにおいては３回行なった。 フラクトゲル（登録商標）EMD陰イオン交換体での陰イオン交換クロマトグラ
フィーと塩フリー界面活性剤溶液でのプレインキュベーションとを組合わせるこ
とによって、プラスミドDNA１mgあたり＜25EU(25EU/mg of plasmid DNA)のエン
ドトキシンの値が得られた。沈殿またはゲル濾過などのさらなる精製工程なしに
、DNAは、より大変極めて複雑な界面活性剤相分離の後と丁度同等の少量のエン
ドトキシンを含む。
ない、実験１および３のそれぞれにおいては３回行なった。 フラクトゲル（登録商標）EMD陰イオン交換体での陰イオン交換クロマトグラ
フィーと塩フリー界面活性剤溶液でのプレインキュベーションとを組合わせるこ
とによって、プラスミドDNA１mgあたり＜25EU(25EU/mg of plasmid DNA)のエン
ドトキシンの値が得られた。沈殿またはゲル濾過などのさらなる精製工程なしに
、DNAは、より大変極めて複雑な界面活性剤相分離の後と丁度同等の少量のエン
ドトキシンを含む。
【００６４】
例３：種々の非イオン性界面活性剤を用いたpTriEx DNAの精製
細菌（pTriExプラスミドで形質転換したDH5a 細胞の一夜培養）をペレット化
し、CL再懸濁緩衝液、CL溶解緩衝液およびCL中和緩衝液を用いて、連続的に再懸
濁、溶解および中和を行なった。細胞残屑は遠心分離除去した。 この時点で、清澄化溶解液を、同一の出発材料が全ての精製に用いられること
を確保するために、種々の画分に分割した。 次の画分を形成した： （ａ）清澄化溶解液をプレインキュベーションしないが、代わりにフラクトゲル
（登録商標）支持体に直接負荷する。 （ｂ）清澄化溶解液をその体積の1/10の種々の塩フリー２０％界面活性剤溶液と
ともに氷上で６０分間プレインキュベートし、次いで、フラクトゲル（登録商標
）支持体に負荷する。 試料を負荷する前に、フラクトゲル（登録商標）EMD TMAE HiCapカラムを５カ
ラム容量のIE平衡緩衝液で平衡化した。負荷の後に、カラムを１０カラム容量の
IE洗浄緩衝液で洗浄し、４カラム容量のIE溶出緩衝液で溶出した。さらなる精製
工程なしに、溶出物を濁度LALテストにより分析した。結果を表２に示す：
し、CL再懸濁緩衝液、CL溶解緩衝液およびCL中和緩衝液を用いて、連続的に再懸
濁、溶解および中和を行なった。細胞残屑は遠心分離除去した。 この時点で、清澄化溶解液を、同一の出発材料が全ての精製に用いられること
を確保するために、種々の画分に分割した。 次の画分を形成した： （ａ）清澄化溶解液をプレインキュベーションしないが、代わりにフラクトゲル
（登録商標）支持体に直接負荷する。 （ｂ）清澄化溶解液をその体積の1/10の種々の塩フリー２０％界面活性剤溶液と
ともに氷上で６０分間プレインキュベートし、次いで、フラクトゲル（登録商標
）支持体に負荷する。 試料を負荷する前に、フラクトゲル（登録商標）EMD TMAE HiCapカラムを５カ
ラム容量のIE平衡緩衝液で平衡化した。負荷の後に、カラムを１０カラム容量の
IE洗浄緩衝液で洗浄し、４カラム容量のIE溶出緩衝液で溶出した。さらなる精製
工程なしに、溶出物を濁度LALテストにより分析した。結果を表２に示す：
【表２】
塩フリー界面活性剤溶液とのプレインキュベーションが、エンドトキシン含量
の有意な低減をもたらすことが見出された。
の有意な低減をもたらすことが見出された。
【００６５】
例４：フラクトゲル（登録商標）EMD TMAE HiCapおよびキアゲン（登録商標）支
持体での塩フリーおよび塩含有イゲパル（登録商標）界面活性剤溶液によるpTri
Ex DNAの精製 清澄化溶解液を、pTriExプラスミドで形質転換したNovaBlue細胞の一夜培養か
ら始めた以外は、例３に記載の通りに調製した。
持体での塩フリーおよび塩含有イゲパル（登録商標）界面活性剤溶液によるpTri
Ex DNAの精製 清澄化溶解液を、pTriExプラスミドで形質転換したNovaBlue細胞の一夜培養か
ら始めた以外は、例３に記載の通りに調製した。
【００６６】
清澄化溶解液を、同一の出発材料が全ての精製に用いられることを確保するた
めに、種々の画分に分割した。 （ａ）２画分を、プレインキュベーションしないが、代わりに２つの支持体（フ
ラクトゲル（登録商標）EMD TMAE HiCapおよびキアゲン（登録商標）-DEAE）に
直接適用する。 （ｂ）２画分を、塩含有界面活性剤溶液でプレインキュベーションし、次いで支
持体に適用する。プレインキュベーションはWO 95/21179、例１に記載の通り行
なった。 （ｃ）２画分を、例３に記載の通り、塩フリー界面活性剤溶液でプレインキュベ
ーションし、次いで支持体に適用する。
めに、種々の画分に分割した。 （ａ）２画分を、プレインキュベーションしないが、代わりに２つの支持体（フ
ラクトゲル（登録商標）EMD TMAE HiCapおよびキアゲン（登録商標）-DEAE）に
直接適用する。 （ｂ）２画分を、塩含有界面活性剤溶液でプレインキュベーションし、次いで支
持体に適用する。プレインキュベーションはWO 95/21179、例１に記載の通り行
なった。 （ｃ）２画分を、例３に記載の通り、塩フリー界面活性剤溶液でプレインキュベ
ーションし、次いで支持体に適用する。
【００６７】
キアゲン支持体での陰イオン交換クロマトグラフィーのために、WO 95/21179
、例１に記載の緩衝液を用いた。しかしながら、プラスミドDNAの溶出点は２つ
の分離材料で異なるので、緩衝液は完全に同一の組成を有することはできない。
フラクトゲル（登録商標）EMD TMAE HiCap支持体については、例のはじめに記載
した緩衝液を用いた。
、例１に記載の緩衝液を用いた。しかしながら、プラスミドDNAの溶出点は２つ
の分離材料で異なるので、緩衝液は完全に同一の組成を有することはできない。
フラクトゲル（登録商標）EMD TMAE HiCap支持体については、例のはじめに記載
した緩衝液を用いた。
【００６８】
イオン交換カラムからの溶出物を回収し、さらなる精製工程なしに集め、その
エンドトキシン含量をLALテストによって直接分析した。 結果を表３および表４に示す。
エンドトキシン含量をLALテストによって直接分析した。 結果を表３および表４に示す。
【表３】
【００６９】
したがって、プレインキュベーションなしのイオン交換クロマトグラフィー(
標準IEC)と比較した以下の改善は、２つの支持体およびプレインキュベーション
（塩有りおよび塩無し）により生じた。
標準IEC)と比較した以下の改善は、２つの支持体およびプレインキュベーション
（塩有りおよび塩無し）により生じた。
【表４】
【００７０】
表は２回の独立した実験の平均を示している。塩フリーの界面活性剤溶液での
プレインキュベーション/フラクトゲル（登録商標） 支持体の組合わせが、群を
抜いて、最良の精製をもたらすことが見出された。
プレインキュベーション/フラクトゲル（登録商標） 支持体の組合わせが、群を
抜いて、最良の精製をもたらすことが見出された。
【図１】 図１は、フラクトゲル（登録商標）EMD TMAE HiCap触手支持体(T
S)と、WO 95/21179に用いられた材料に対応する従来のシリカ-DEAE支持体(SS)と
の動的結合容量の比較を示すグラフである。
S)と、WO 95/21179に用いられた材料に対応する従来のシリカ-DEAE支持体(SS)と
の動的結合容量の比較を示すグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 30/14 Ｇ０１Ｎ 30/34 Ｅ
30/34 30/88 Ｅ
30/88 30/26 Ａ
// Ｇ０１Ｎ 30/26 30/48 Ｓ
30/48 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ
Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ
，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，
ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ
Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ
，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，
ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ
Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ
，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(71)出願人 Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． 250，
Ｄ−64293 Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄ
ｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅ
ｒｍａｎｙ
(72)発明者 ヘンドリクス，ロベルテュス
ドイツ連邦共和国 69121 ハイデルベル
ク、ツム シュタインベルク 46
(72)発明者 ヴェスリンク，マリア
ドイツ連邦共和国 64291 ダルムシュタ
ット、レーマーシュトラーセ 61
(72)発明者 ラントス，アンドレア
ドイツ連邦共和国 65929 フランクフル
ト、バッハシュテルツェンヴェーク ６
Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 EA04 HA20
4D017 AA11 BA07 CA17 CB01 DA01
DB10
4G066 AC12C AC17C AC26C AD02C
AD06C AD10B AD20C AE10B
CA20 DA11 EA01
Claims (4)
- 【請求項１】 天然の、遺伝子工学的または生物工学的なソース由来の核酸
中のエンドトキシンレベルを低減する方法であって、以下の工程： a) 精製すべき核酸を含む媒質の調製; b) 工程a)からの媒質の、塩フリーの界面活性剤溶液とのプレインキュベーショ
ン; c) 工程b)からのインキュベーション溶液の、官能基が支持体表面の触手と結合
する陰イオン交換材料への適用; d) 不純物がイオン強度の増加および／またはpHの変化によって洗い出される陰
イオン交換体の洗浄; e) さらなるイオン強度の増加および／またはpHの変化による試料の溶出、 によって特徴づけられる、前記方法。 - 【請求項２】 精製すべき生物学的ソースが、プラスミドDNAを含むことを
特徴とする、請求項１に記載のエンドトキシンレベルを低減する方法。 - 【請求項３】 陰イオン交換体が、官能基としてDEAEまたはTMAEを含むこと
を特徴とする、請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 工程a)において調製される媒質が、アルカリ溶解などの消化
方法、遠心分離、濾過または沈降によって、天然のソースから得られることを特
徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
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|---|---|---|---|
| DE10010342A DE10010342A1 (de) | 2000-03-06 | 2000-03-06 | Verfahren zur Abreicherung von Endotoxinen |
| DE10010342.1 | 2000-03-06 | ||
| PCT/EP2001/001610 WO2001066718A1 (de) | 2000-03-06 | 2001-02-14 | Verfahren zur abreicherung von endotoxinen |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=7633346
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|
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| EP (1) | EP1261702B1 (ja) |
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| AU (1) | AU2001244140A1 (ja) |
| DE (2) | DE10010342A1 (ja) |
| WO (1) | WO2001066718A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015050191A1 (ja) * | 2013-10-03 | 2015-04-09 | 協和発酵バイオ株式会社 | 二重鎖リボ核酸の精製方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| US20040083493A1 (en) * | 1997-02-19 | 2004-04-29 | Next Level Communications, Inc. | Transmitting caller ID within a digital stream |
| WO2003080834A2 (en) * | 2002-03-21 | 2003-10-02 | Avecia Biotechnology Inc. | Purification methods for oligonucleotides and their analogs |
| RU2344425C2 (ru) | 2002-06-24 | 2009-01-20 | Профос АГ | Способ идентификации и экстракции эндотоксина |
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| FR2848223B1 (fr) * | 2002-12-09 | 2005-02-25 | Centre Nat Rech Scient | Nouveau procede d'isolement des endotoxines. |
| DE602004020473D1 (de) * | 2003-06-24 | 2009-05-20 | Organon Nv | Abtrennung von lipopolysacchariden aus lipopolysaccharidkomplexen mit hilfe von nicht-entzündbaren lösungsmitteln |
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| DE102005002969A1 (de) | 2005-01-21 | 2006-08-03 | Profos Ag | Verfahren zum Nachweis und zur Entfernung von Endotoxin |
| EP2409995A3 (en) | 2007-02-28 | 2012-08-15 | Lipoxen Technologies Limited | Reduction of endotoxin in polysialic acids |
| CN103255130B (zh) * | 2008-04-30 | 2015-12-23 | 斯特莱科生物有限公司 | 高纯度质粒dna制备物及其制备方法 |
| CN108148831A (zh) * | 2018-01-15 | 2018-06-12 | 南京驯鹿医疗技术有限公司 | 一种无内毒素质粒大量制备工艺 |
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| WO2023012206A1 (en) | 2021-08-05 | 2023-02-09 | Merck Patent Gmbh | Method for reducing endotoxin levels in nucleic acid purification |
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| PT751988E (pt) * | 1994-03-22 | 2000-05-31 | Immune Response Corp Inc | Producao e isolamento altamente eficientes de particulas virais |
| US6825012B2 (en) * | 1995-02-23 | 2004-11-30 | Gencell S.A. | DNA molecules, preparation and use in gene therapy |
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- 2001-02-14 JP JP2001565875A patent/JP2003525630A/ja active Pending
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