JP2003525621A

JP2003525621A - 核酸分子の長さを分析する方法

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Publication number: JP2003525621A
Application number: JP2001565398A
Authority: JP
Inventors: リー，マーテイン・アラン; スクイレル，デイビツド・ジエイムズ
Original assignee: UK Secretary of State for Defence
Current assignee: UK Secretary of State for Defence
Priority date: 2000-03-07
Filing date: 2001-03-06
Publication date: 2003-09-02
Also published as: ES2291294T3; US20030143574A1; EP1266031A1; CN1190500C; AU2001235856B2; DE60130973D1; WO2001066795A8; US7176003B2; CA2400339A1; HK1055607A1; CN1427895A; DE60130973T2; EP1266031B1; ATE376068T1; WO2001066795A1; AU3585601A; GB0005281D0

Abstract

(57)【要約】核酸内の特定の領域の長さを分析する方法であって、ａ）前記核酸の試料を前記領域が増幅される複数の増幅反応に供する段階であって、前記反応のそれぞれにおける延長フェーズの時間が様々である段階と、ｂ）前記増幅反応の進行状況を監視する段階と、ｃ）増幅の延長フェーズが各反応混合物中で完了する最小時間を測定し、それを、延長を受ける配列の長さと関連づける段階とを含む方法。この方法を融解温度分析と組み合わせることにより、配列のＧＣ含有パーセントを測定することが可能である。この種の長さ分析は、診断または分析ならびに鎖状体の存在の確認のための組換えＤＮＡ技術および分類学的分類または法医学に用いることができる。この方法で使用する装置も記載され請求される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、核酸配列の長さを、また場合によってはその融解温度をも測定する
方法、これを例えば、配列のＧＣ含有パーセントの決定に使用すること、ならび
に前記方法において使用する装置に関する。この方法は、様々な診断、分析また
は研究状況において用いることができる。

【０００２】ＤＮＡ配列の長さは、様々な理由で重要な場合がある。例えば、遺伝子診断ま
たは遺伝分析において、挿入、欠失、切断または重複によって引き起こされる遺
伝子欠陥は、特定の生物のゲノム内の特定の遺伝子の全長に影響を及ぼす。

【０００３】研究応用例において、ゲノム内の特定の遺伝子の関係を判定するために、遺伝
的連鎖分析が実施されることが多い。そのような例では、特定の遺伝子間の距離
が、特定の遺伝子の機能と性質を確立するうえで有用であることがある。

【０００４】細胞が２倍になるたびに短くなると思われ、したがって、老化過程に関与する
ゲノムの末端に認められるＤＮＡであるテロマーに関して多くの研究が行われて
きた。特定の試料中のテロマーＤＮＡの長さは、したがって、試料を得た宿主の
年齢に関する指標となる可能性がある。

【０００５】ゲノム内のＤＮＡの特定の領域の全長を変化させる可能性のある他の因子とし
て、それ自体を宿主のゲノムに組み込むウイルスによる感染、ならびにトランス
ポゾンの存在などがある。したがって、これらのものの存在を検出することは、
診断または遺伝分析に有用であると思われる。マイクロサテライト（ｍｉｃｒｏ
ｓａｔｅｌｌｉｔｅ）領域の長さは、法医学で現在適用されているＤＮＡフィン
ガープリント法の基盤になっている。組換えＤＮＡ技術では、クローニング実験
には通常、細菌などの組換え宿主生物または細胞中での発現の前に、核酸配列を
ベクターまたはプラスミドなどの他の配列に組み入れることを必要とする。成功
を収めたクローンは、通常、抗生物質耐性のような選択標識を、成功裡に形質転
換された宿主を同定する手段を提供する構築物に含めることによって判断される
。

【０００６】時折、配列が複数のコピーに含められる場合に、クローニング過程の誤りが存
在し、鎖状化が起こる（鈍端を有する構築物を生じさせる制限酵素を用いてクロ
ーンを形成させるときの特殊な問題）。あるいは、標的配列の一部または全部の
欠失をもたらす相同的組換えが起こることもある。

【０００７】さらに、ＲＴ−ＰＣＲを用いるとき、増幅される全配列の長さを変化させるｍ
ＲＮＡの別の切り継ぎ変異型が発生する。

【０００８】現在、核酸の長さの分析は一般的に、場合によっては増幅後にＤＮＡ断片を試
料から採取して、ゲル上で分析を行う、ゲル電気泳動を用いて行われている。こ
のプロセスはかなり時間がかかり、試料は反応容器から取り出さなければならず
、これによって、複数の試料を同時に試験する場合に、汚染または交差汚染の危
険が生ずる。

【０００９】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような核酸増幅反応は、非常によく知られ
ている。ＰＣＲは、大量の特定のＤＮＡ配列を発生させるプロセスであり、塩基
の対合および相補的ＤＮＡ鎖の正確な複製というＤＮＡの特性に基づいている。
典型的なＰＣＲは、３つの基本的段階を繰り返す過程を必要とする。

【００１０】変性：ＰＣＲ試薬を含む混合物（複製するＤＮＡ、個々のヌクレオチド塩基
（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）、適切なプライマーおよびポリメラーゼ酵素を含む）をあら
かじめ決めた温度に加熱して、標的ＤＮＡの２本の鎖を引き離す。

【００１１】アニーリング：次いで、混合物を別のあらかじめ決めた温度に冷却し、プラ
イマーを、ＤＮＡ鎖上のそれらの相補的配列に定着させ、それらに結合させる。

【００１２】延長：混合物をさらなるあらかじめ決めた温度に再び加熱する。ポリメラー
ゼ酵素（触媒として作用する）は個々のヌクレオチド塩基をプライマーの末端に
結合させて、標的ＤＮＡの配列と相補的である新たなＤＮＡ鎖を形成させる。２
本の鎖は結合する。

【００１３】そのような過程は、研究ならびに診断および法医学において広く用いられてい
る。

【００１４】出願人らは、今回、核酸配列の領域の長さを迅速に測定または確認する、また
、もし必要ならば、配列のＧＣ含有パーセントも測定する、これらのような方法
を用いる手段を発見した。

【００１５】本発明によれば、核酸内の特定の領域の長さを分析する方法であって、ａ）前記核酸の試料を前記領域が増幅される複数の増幅反応に供する段階であ
って、前記反応のそれぞれにおける延長フェーズの時間を変化させる段階と、ｂ）前記増幅反応の進行状況を監視する段階と、ｃ）増幅の延長フェーズが反応混合物中で完全に起こるのに必要な最小時間を
測定し、それを、延長を受ける配列の長さと関連づける段階とを含む方法が提供
される。

【００１６】本明細書で用いた「完全に起こる」という表現は、前記のすべての領域に対応
するアンプリコンが各サイクル中に生成されるように増幅反応が行われることを
意味する。一般的に、領域は、増幅反応において用いられる順方向および逆方向
プライマーによって定義され、かつこれらを含むものであり、全長生成物は「完
全な」増幅反応中に得られる。

【００１７】本発明の方法において、応用例の進行状況を監視するのにいずれの方法も用い
ることができる。

【００１８】増幅反応の進行状況を監視するための技術または検定は、当技術分野で知られ
ている。これらの検定の多くにおいて、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
の蛍光監視法が用いられている。これらの技術として、いくつかの第二世代ＰＣ
Ｒ熱サイクル装置で用いることができるプローブ鎖特異的および一般的ＤＮＡ挿
入法などがある。

【００１９】一般的蛍光ＰＣＲ法では、二本鎖ＤＮＡ種に結合したときに蛍光の増大を示す
ＤＮＡ挿入色素を用いる。増幅中のＤＮＡのバルク濃度の上昇による蛍光の増大
を用いて、反応の進行状況を監視し、初期の標的分子のコピー数を決定すること
ができる。

【００２０】これらの一般的蛍光ＰＣＲ法は、時間的不利益を伴うことなく、核酸のバルク
濃度の上昇を監視するものである。すべての反応において、１回の蛍光の読み取
りを同じ点で行うことができる。終点融解曲線解析を用いて、アーチファクトと
アンプリコンとを区別し、各アンプリコンを区別することができる。アガロース
ゲル電気泳動によって可視化できない濃度で、生成物のピークを見ることができ
る。

【００２１】蛍光ＰＣＲ鎖特異的方法では、追加の核酸反応成分を用いて増幅反応の進行状
況を監視する。これらの方法では、蛍光エネルギー移動（ＦＥＴ）を検出の基本
原理として用いることができる。１つまたは複数の核酸プローブを蛍光分子で標
識する。そのうちの１つはエネルギー供与体として作用することができ、他はエ
ネルギー受容分子である。これらは、時には、それぞれリポーター分子および消
光分子として知られている。供与分子は、その光に対して通常蛍光発光波長を示
す光の特定の波長で励起される。受容体分子は、様々な距離依存性エネルギー移
動機構により供与分子の発光エネルギーを受容することができるような、この発
光波長で励起される。起こる可能性のある蛍光エネルギー移動の特定の例は、蛍
光共鳴エネルギー移動、すなわち「ＦＲＥＴ」である。一般に、受容分子は、受
容体分子と供与体分子とが極めて近接して存在している（例えば、同じ分子上、
または隣接した分子）ときに、供与分子の発光エネルギーを受容する。ＦＥＴま
たはＦＲＥＴ検出の基礎は、供与体発光波長での変化を監視することである。受
容体も蛍光分子である場合、受容体発光波長を監視することもできる。

【００２２】一般的に用いられている２種類のＦＥＴまたはＦＲＥＴプローブが存在する。
すなわち、核酸プローブの加水分解を用いて供与体と受容体とを分離するものと
、ハイブリッド形成を用いて供与分子と受容分子の空間的関係を変化させるもの
である。

【００２３】増幅反応の進行状況を監視するための１つの特定の検定は、米国特許第５，５
３８，８４８号に記載されているＴａｑｍａｎ（商標）検定である。

【００２４】加水分解プローブがＴａｑＭａｎ（商標）プローブとして市販されている。こ
れらは、供与および受容分子で標識されているＤＮＡオリゴヌクレオチドからな
っている。このプローブは、ＰＣＲ生成物の１本の鎖の特定の領域に結合するよ
うに設計されている。この鎖とのＰＣＲプライマーのアニーリングの後に、Ｔａ
ｑ酵素は、５’→３’ポリメラーゼ活性によりＤＮＡを延長させる。Ｔａｑ酵素
はまた、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性も示す。ＴａｑＭａｎ（商標）プロ
ーブは、Ｔａｑ延長を始動させることを防止するために、リン酸化により３’末
端で保護されている。もしＴａｑＭａｎ（商標）プローブが、延長よりも生成物
鎖とのハイブリッド形成を受けるならば、Ｔａｑ分子もプローブを加水分解して
、検出の基本原理として、受容体から供与体を遊離させる。この場合の信号は累
積的であり、遊離の供与および受容分子の濃度は増幅反応の各サイクルとともに
増加する。しかしながら、一般的に、ＴＡＱＭＡＮ（商標）のような加水分解に
依拠している検出方法は、本発明の状況においては、ハイブリッド形成現象を用
いるものよりも好ましくない。その理由は、加水分解過程は比較的遅いからであ
る。したがって、延長フェーズが完了まで進行したか否かを判定するときに、プ
ローブの加水分解の結果として引き起こされた遅れを考慮に入れるようにするこ
とが必要である。

【００２５】ハイブリッド形成プローブは、多くの種類のものが入手可能である。分子ビー
コンは、ヘアピンループを形成するような相補的５’および３’配列を有するオ
リゴヌクレオチドである。ヘアピンループが形成されるときに、ＦＲＥＴが起こ
るように、末端蛍光標識が極めて近接して存在している。分子ビーコンの相補的
配列とのハイブリッド形成の後に、ＦＲＥＴが起こらないように、蛍光標識が分
離され、そして、これが検出の基本原理となっている。

【００２６】標識オリゴヌクレオチドの対も用いることができる。これらは、ＦＲＥＴが起
こることができるように供与分子と受容分子とを近づけさせているＰＣＲ生成物
鎖上で極めて近接してハイブリッド形成する。このタイプの異型として、隣接し
た単一のプローブを含む標識増幅プライマーの使用などがある。

【００２７】単一の標識プローブと挿入色素との組合せを用いる検定は、国際特許出願第Ｐ
ＣＴ／ＧＢ９８／０３５６０号に記載されている。

【００２８】国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ９９／００５０４号には、試料中の標的配列の量
を定量するように適合させることができる、特定の核酸配列の存在を検出するた
めの検定が記載されている。この検定では、増幅反応は、少なくとも１つが蛍光
標識されている１組のヌクレオチドを用いて行われる。したがって、増幅生成物
は、その中に組み込まれた蛍光標識を有している。増幅生成物とハイブリッド形
成することができ、前記蛍光標識ヌクレオチドからの蛍光を吸収することができ
る、あるいは、前記蛍光標識ヌクレオチドに蛍光エネルギーを供与することがで
きる反応性分子を含むプローブの存在下で、反応が行われる。前記試料の蛍光を
測定することによって、反応を監視することができる。その理由は、この蛍光は
、プローブとハイブリッド形成し、それらの間のＦＥＴまたはＦＲＥＴ相互作用
を生じさせる、より多くの生成物が生成するにつれて、反応中に変化するからで
ある。

【００２９】これらの技術を用いて、特定の標的配列が試料中に存在するかどうかを直接検
出すること（増幅が起こっているため）だけでなく、データを適切に操作するこ
とによって定量すること、または増幅が完了するときを決定することも可能であ
る。具体的には、蛍光を時間またはサイクル数に対してプロットしたグラフでは
、一般的に、増幅が進行し、試料中のＤＮＡの量が増加するにつれて急激に上昇
するが、その後、増幅が飽和になったときプラトーに達するＳ字型プロットピー
クが得られる。

【００３０】増幅反応の延長フェーズ中のポリメラーゼ活性は、「プロセシビティ」として
特徴付けられる。これは、生成物中に組み込まれる１秒当たりの塩基の数に関連
している。一般に、増幅反応混合物は、完全な標的配列、すなわち、プライマー
によって定義されている全領域が合成されるのに必要な最小時間よりも長い時間
にわたり延長温度に維持される。

【００３１】本発明に従って多段反応を行うことによって、延長フェーズを進行させる時間
は、短すぎて全配列を生成させることができなくなるまで、最終的に短縮される
。

【００３２】これは、増幅反応をかなり抑制することになる。不完全なアプリコン生成物の
１本の鎖は、もはや増幅プライマーの１つに結合せず、したがって、その後のサ
イクル中に延長を受けない。さらに、このようにして生成したアプリコン生成物
の長さはより短く、したがって、アプリコン生成物は、この過程を監視するのに
用いられる挿入色素のような標識物質をさほど多く組み込まなくなる。監視過程
でプローブを用いる場合、それらは、短いアプリコンに結合せず、したがって、
発生する信号に影響を及ぼす可能性がある。

【００３３】各反応を監視するならば、この過程の延長フェーズの長さが不十分の時に、こ
れがすぐに明らかになるであろう。特に、増幅は適切な速度で進行しないであろ
う。これは、もし標的の初期濃度またはコピー数が知られているならば、完全に
決定することができるが、本発明の方法を用いれば、増幅を、延長フェーズの時
間が全長生成物を生成させるに十分長い場合の増幅と比較することによって、そ
れをより簡単に決定できると思われる。

【００３４】さらに、不完全な延長段階の結果として生成した短い生成物は、それ自体、そ
の後の反応におけるプライマーとして働く可能性がある。この反応の効率は、増
幅が短いプライマーを用いて進行している反応よりも低い。ＰＣＲコピー数の検
出は、一般的に以下の式に従う。

【００３５】Ｎ_Ｃ＝Ｎ（１＋Ｅ）^Ｃ式中、Ｎ＝初期コピー数／濃度Ｃ＝サイクル数Ｅ＝反応効率およびＥ＝１００％＝（ｅ^{０．６９３１}）したがって、短い生成物が二次プライマーとして働いている増幅反応は、複雑
な二フェーズ速度論を示すであろう。反応が進行するにつれて反応の延長フェー
ズ中に出現する通常は規則的な信号の増大（以下の図５を参照）が、反応が進行
するにつれて、また、その後の反応を始動させることができるより短い生成物が
生成されるにつれて、ゆがめられるので、延長フェーズの蛍光を連続的に監視す
ることによって、これがただちに明らかになる。

【００３６】これを反応温度で用いられている特定のポリメラーゼの活性と相関させること
によって、これを検討対象の配列の長さと関連づけることができる。典型的なポ
リメラーゼは、ＰＣＲのような増幅反応で見られる通常の温度で、約５００塩基
対を１０秒未満で組み込む。

【００３７】適切な増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応
（ＬＣＲ）を含むが、特に、ＰＣＲ反応を含むものとする。

【００３８】本発明の方法においては、複数の増幅反応を同時に行わせることが適切である
。

【００３９】現在に至るまで、各容器中で異なるタイミングが必要であった場合、複数の異
なる増幅反応を同時に行うことは可能でなかった。これは、熱サイクルを行うの
に用いられている従来型のブロックヒーターが同じ時間プロファイルを用いて同
時にすべての複数の反応ウエルを加熱することだけができるものであったためで
ある。ブロックヒーターは、一般的にすべてのウエルが同様の温度に加熱される
ことを必要とするものであった。

【００４０】しかしながら、本発明の特に好ましい実施形態においては、複数の増幅反応を
、国際出願第９８／２４５４８号に記載され、請求の範囲とされているような装
置中で行わせる。

【００４１】この種の装置では、反応容器を加熱する手段を提供するために導電性ポリマー
を使用している。導電性ポリマーは、当技術分野において知られており、米国ニ
ューアークのＣａｌｉｅｎｔｅＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．から入手できる。そ
のようなポリマーの他の例は、例えば、米国特許第５１０６５４０号および米国
特許第５１０６５３８号に開示されている。適切な導電性ポリマーは、３００℃
までの温度を提供することができ、したがって、典型的な温度範囲が３０°〜１
００℃であるＰＣＲ過程に十分に使用することができる。

【００４２】これらのポリマーに電流を通すことによって、それらを急速に加熱することが
できる。加熱速度は、ポリマーの正確な性質、使用するポリマーの大きさおよび
流す電流の量に依存する。ポリマーは、例えば、１０００オーム．ｃｍ^−１を超
える高い抵抗率を有することが好ましい。ポリマーの温度はポリマーを通る電流
の量を制御することによって容易に制御することができ、それにより、所望の時
間にわたり所望の温度に維持することが可能である。さらに、温度間の遷移の速
度は、例えば、電子制御装置の制御下で、適切な電流を流すことによって、較正
の後に容易に制御することができる。

【００４３】さらに、ポリマーの熱容量が低いため、急速な冷却も保証できる。

【００４４】さらに、ポリマーを反応容器中の加熱エレメントとして使用することにより、
既存のブロックヒーターよりも装置をより小型にすることが一般的に可能となり
、これは、野外、川、工場の床または小規模な店内のような実地条件で化学反応
を行うときに有用である。

【００４５】反応容器は、伝導性ポリマーを容器に極めて近接して配置したガラス、プラス
チックまたはシリコーン製容器などの試薬容器の形をとることができる。容器の
一実施形態において、そのポリマーは、反応容器の周りに合い、この容器と熱的
に接触したさやとして提供される。さやは、反応容器の周りにぴったりと合うよ
うに設計されている成形カバーとして提供することができるか、あるいは、反応
容器の周りに巻きつけ、固定できる帯状のフィルムとして提供することができる
。

【００４６】ポリマーのさやとしての構成は、さやと反応容器との間に密な熱的接触が達成
できることを意味している。これは、反応容器とヒーターとの間の空気層の断熱
効果により生ずる通常の遅れ時間なしに、容器が所望の温度に急速に到達するこ
とを保証する。さらに、ポリマー製さやは、既存の反応容器を用いて装置を適合
させるのに用いることができる。特に、帯状のたわみ性のあるポリマーフィルム
は、種々の大きさおよび形状の反応容器の周りに巻きつけることができる。

【００４７】さやを用いる場合、それは、穴をあけたり、ある方法で網状にすることが有利
となり得る。これにより、ポリマーのたわみ性を増大させることができ、冷却を
行うのにポリマー自体を用いない場合には、冷媒がより容易に接触できるように
することができる。

【００４８】他の実施形態において、ポリマーは、反応容器の不可欠の部分として提供され
る。反応容器は、押出し成形、射出成形または類似の技術によってポリマーから
製造することができる。あるいは、反応容器は、導電性ポリマーを容器製造材料
の層間に挿入するか、もしくは、反応容器の内面または外面をポリマーで被覆す
るか、もしくは、容器が、ＰＣＲ適合性材料の薄い積層品で被覆したポリマーか
ら基本的に製造される、複合製造法を用いて製造してもよい。そのような容器は
、当該技術分野において陳腐であるラミネーションおよび／または化学的または
電気化学的析出法のような析出を用いて製造することができる。

【００４９】前記ポリマーを不可欠な部分として含む容器は、特に小型の構造を実現するこ
とができる。

【００５０】本発明におけるように、一連の特定の反応用にいくつかの反応容器が必要であ
る場合、反応容器は多数配列したものとして用意する。

【００５１】反応容器の各々または各群に、その容器または容器の群に流す電流を調節する
ことによって設定される、それ自体の加熱／冷却／時間プロファイルをもたせる
ことができる。これは、個々の容器をそれ自体の熱プロファイルで互いに独立し
て制御することができる点で、固体ブロックヒーターや乱流空気ヒーターと比べ
て、ポリマーを含む反応容器のさらなる、また特に重要な長所をもたらす。これ
は、各検定が異なる操作条件を必要とするにもかかわらず、比較的に小型の装置
を用いて複数のＰＣＲ検定を同時に行うことができることを意味している。

【００５２】そのような構成は、各容器を延長温度に保持する時間が各場合で異なるにもか
かわらず、複数の増幅反応を同時に行うことができるので、本発明の方法におい
て使用することが特に好ましい。

【００５３】本発明において使用することが特に適切な装置では、プレートに組み込まれた
ウエル中に、例えば射出成形によってポリマー自体が形成されている。電極を各
ウエルに取り付け、好ましくはウエルの均一な加熱を行うことができるように配
置する。具体的には、電極を各ウエルの底部領域に接続することができる。ポリ
マーの厚さは、構造的剛性および完全性と調和して、できるだけ薄いことが適切
である。これにより、ポリマーが発熱するのにかかる時間が短縮される。

【００５４】各ウエルに関連する電極を個々の電源に接続するか、もしくは、ウエル群に関
連するいくつかの電極を異なる別個に制御されている電源に接続することができ
る。各ウエルまたはウエルの群がそれ自体の加熱エレメントを備えているので、
この構成により、異なる時間設定の温度段階を必要とする異なる反応を同時に行
わせることができる。さらに、サイクル反応を迅速に行わせることができる。

【００５５】プレートにはいかなる数のウエルを含めてもよいが、従来の慣例に従うために
、９６または３８４ウエルが同じプレートに存在していてよい。

【００５６】本発明によるこの種の装置を用いるとき、各増幅反応がマルチウエル容器のウ
エル中で行われ、各ウエルが、前記ウエルを具備した、あるいは、前記ウエルを
加熱するように配置された導電性ポリマーに電流を供給することによって加熱さ
れる。

【００５７】適切な制御手段は、様々な反応が自動的に行われるように、電子計装とする。

【００５８】本発明の方法は、多段増幅反応が用いられる他の検定方法論と共に実施するこ
とができる。

【００５９】例えば、反応中に様々な二重らせんが形成または不安定化する温度は、配列の
グアニジン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）の相対含量に高度に依存する。これらの
塩基間に生ずる結合は、アデニン（Ａ）およびチロシン（Ｔ）塩基間に生ずる結
合よりも比較的に強い。その結果として、特定の二重らせんが不安定化する、ま
たは「融解する」温度は、配列のＧＣ含量に高度に依存する。さらに、生物のゲ
ノムのＧＣ含有パーセントは、細菌のような生物の、特に属レベルでの起源の決
定のための分類学的固有特徴と認識されている。

【００６０】特定の二重らせん核酸の長さと融解温度とを測定することによって、そのＧＣ
含量を計算することが可能である。融解温度測定は、上述のように長さ測定と同
時に行うことができる。

【００６１】これを達成するためには、反応混合物中で二重らせんが形成されたり、不安定
化する温度を検出することができ、標識手段が反応混合物中に適切に設けられて
いる適切な標識システムを用いることが必要である。標識は、前記の二重らせん
の形成または不安定化を信号で伝達することができる上述のような蛍光標識など
の可視標識であることが好ましい。したがって、適切な標識を用いることができ
るならば、この検定を本発明の検定と同時に行うことができる。両方のデータセ
ットを収集するために行う必要のあるのは、増幅反応全体を通しての標識からの
信号、ならびに反応温度を監視し、すべての所望の情報を提供するためにデータ
を処理するだけである。

【００６２】この種の組合せ検定の場合、挿入色素またはハイブリッド形成プローブを用い
た標識は、二重らせんが不安定化する温度を可視化するという選択肢を提供する
ので、加水分解プローブよりも好ましい。

【００６３】特に好ましい標識手段は、ＳＹＢＲＧｏｌｄ（商標）またはＳＹＢＲＧｒｅｅ
ｎ（商標）もしくはエチジウムブロマイドなどの挿入色素である。増幅反応中に
二重らせんが形成されるとき、色素は鎖の間に結合し、その結果として増強した
信号を発する。したがって、信号は、二重らせんが反応混合物中で形成されると
きに増大し、不安定化するときに減少する。反応容器中の温度と色素からの信号
との両方を監視することにより、二重らせんが形成または不安定化する温度を確
かめることができる。これは、反応で増幅された特定の配列のＧＣ含量に関連づ
けられる。

【００６４】あるいは、配列の少なくとも一部が知られている場合、標識手段は、上述のよ
うに検出の基本原理として蛍光エネルギー移動（ＦＥＴ）を用いるものであって
よい。しかし、特にこの場合に、標識は、供与または受容分子の１つが、特定の
温度で標的配列に結合する標識ハイブリッド形成プローブ上に備えられているも
のを含むことが適切である。他は、上述したように挿入色素を含んでいてよい。
プローブが標的鎖に結合するとき、挿入色素はプローブに極めて近づけられて、
ＦＥＴが起こる。その結果、供与および／または受容分子からの蛍光の変化が認
められ、これは、プローブが標的配列から「融解」するときに逆転する。単一の
標識プローブおよび挿入色素を用いるシステムが国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ９
８／０３５６０号に記載され、特許請求の範囲とされている。

【００６５】あるいは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ９９／００５０４号に記載されている
ように、標識手段の供与または受容成分の１つが増殖反応で用いられるヌクレオ
チドに含まれていてよい。

【００６６】二重標識プローブまたは「Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ」またはいくつかの分子ビーコ
ンのようなハイブリッド形成プローブも、長さ／融解温度組合せ分析検定に適し
ている。

【００６７】特定のプローブは、特性温度で特定の標的配列に結合する。したがって、種々
のプローブの存在下で一連の増幅反応を行い、これらのプローブが標的配列に結
合またはそれから融解する温度を測定することによって、標的配列が標的配列の
試料中に存在するか否かに関する情報が得られる。

【００６８】特定の一連の増幅反応に用いることができる特定の種類の標識システムは、試
料の性質、保存または標的配列の長さ等に依存する。しかし、大部分の応用例に
ついて、アンプリコンのハイブリッド形成の測定および融解分析のための単純か
つ費用に対して効果が高い方法を提供するので、挿入色素標識が好ましい。

【００６９】特に、増幅生成物が不安定化するときに発生する信号は、より明瞭な信号を提
供するので、好ましい測定対象である。

【００７０】所望ならば、核酸の試料を複数の異なる増幅反応に供してもよい。

【００７１】本明細書で用いているように、「異なる増幅反応」という表現は、特定の試料
中の異なる配列または配列の部分が増幅されることを意味している。概して、こ
れは、各反応において異なる増幅プライマーが用いられることを意味する。増幅
プライマーは、分類学的分析が行われている場合、細菌、真菌または植物のよう
な多数の種のうち試料が採取される既知の種において保存されていることが知ら
れている配列を増幅するように設計されていることが適切である。

【００７２】その結果、１つの試料中の種々の核酸領域の存在、長さおよびＧＣ含有％を同
時に測定することができる。

【００７３】この能力は、ＤＮＡプロファイリングおよび分類学的分類の分野において特に
有用であると思われる。

【００７４】上述した装置は、延長時間を制御可能とするだけでなく、各ウエルまたはウエ
ルの群において異なる増殖が起こることを保証するために、全般的温度プロファ
イルを調節することもできるので、そのような組合せ検定を行うための理想的ビ
ィークルを提供する。制御手段は、電子計装のような自動制御手段であることが
適切である。ポリマーに接続された電気回路用のプログラマブルコントローラを
用いることによって、定められた加熱方法、例えば、あらかじめ決定した時間間
隔および休止期間にわたり設定すべきあらかじめ決定した温度段階の定められた
サイクル数を、装置を用いてあらかじめプログラムすることができる。その加熱
方法には、同じ装置中で異なるウエルを用いて、異なる温度および時間プロファ
イルを同時に用いることが含まれる。

【００７５】制御手段には、所望の加熱および／または冷却方法が遵守され、確認されるよ
うにするために、反応容器の温度を監視し、この情報を制御システムに供給する
熱電対のような監視デバイスを含めることができる。

【００７６】あるいは、例えば、ポリマー加熱エレメントをホイートストンブリッジ回路に
おける抵抗器として配置することによって、その抵抗を測定して、ポリマーの温
度を直接監視することができる。これは、熱電対のような他の温度測定デバイス
の使用を避けている。

【００７７】場合によっては、装置に、１つまたは複数のファンのような人工冷却手段をさ
らに含める。さらに、二重らせん形成または不安定化を検出するために、ルミノ
メータのような蛍光検出デバイスを設置することができる。ウエル中の試薬から
の信号が検出されるように、これらをウエルに極めて近接して配置することが適
切である。

【００７８】一般に行われているが、供試試料を含むウエルを反応容器の１つの部分で実施
し、比較のための既知試料を含むウエルを反応容器の別の部分に置くことが適切
である。このようにして、比較を直接かつ迅速に行うことができる。

【００７９】反応ウエルの他の成分は、増幅反応が起こるのに必要な試薬を含む。これらは
、当技術分野においてよく知られており、増幅プライマー、ヌクレオチド、緩衝
液ならびに上で論じた標識手段を含んでいてよい。

【００８０】上述した方法は、分類学的分類および生物の同定に特に有用である。生物の核
酸および特にＤＮＡを抽出し、一連の試験ウエルに入れる。特定の生物に特有で
あること、もしくは、いくつかの生物において保存されていることが知られてい
る配列が、もし存在するならば、各ウエル中で増幅されるように、増幅反応条件
および用いるプライマーを設定する。上述したように、この配列の長さとＧＣ含
有％に関する情報を得ることによって、迅速な分類学的分類を得ることができる
。

【００８１】同様に、法医学または遺伝分析において、犯罪現場または被験者からの核酸試
料が容疑者または被験者の認知親族の核酸試料と比較される。十分な異なる核酸
配列の長さおよび／またはＧＣ含有％を測定することによって、試料核酸が同じ
供給源からのものか、または比較核酸と関連づけられるかを判定することが可能
であろう。

【００８２】本発明を添付概略図に基づいて実施例により具体的に記述する。

【００８３】すなわち、図１は、本発明の方法で用いた装置の概略図である。

【００８４】図２は、本発明の方法を用いて達成することができる典型的な結果を示す図で
ある。

【００８５】図３は、所定の配列長さにおける融解温度とＧＣ含有％との間に比例関係があ
ることを示す図である。

【００８６】図４は、一連の生成物の融解温度対長さ測定値のプロットを示す図である。

【００８７】図５は、反応が完全に起こるときの増幅反応の連続監視の結果を示す図である
。

【００８８】図１の装置において、複数のウエル（１）が、所望の数のウエルを含めるため
に、例えば、射出成形により形成された導電性ポリマーを含むプレート（２）に
設けられている。各ウエルには、電流を流すことによって、ウエルの内容物があ
らかじめ定められた熱サイクルを用いて加熱されることを可能にする電極（３）
が具備されている。各ウエルにおけるサイクルは、電子計装（図示せず）によっ
て制御される。

【００８９】電子計装は、各増幅反応が反応における拡張相温度に保持される時間を制御す
る。

【００９０】場合によっては、試料のＧＣ含有％を融解温度分析を用いて同時に分析する場
合にも、異なるプライマー配列を使用する結果として、異なる増幅反応を一部の
ウエル中で行うことができる。これが行われる場合、プレート（２）の一部（４
）を試料部として、別の一部を比較部（５）として指定することが好ましい。同
様の一連の増幅反応条件およびプライマーを用いて試料部（４）および比較部（
５）のウエル中で実施される。

【００９１】試料核酸を試料部（４）の各ウエルに入れ、一方、既知の起源の１つまたは複
数の核酸もしくは配列を個別に比較部（５）のウエルに入れる。増幅プライマー
、ヌクレオチド、緩衝液または増幅反応を行うのに必要な他の試薬を、上述の標
識手段および特に挿入色素と共に各ウエルに加える。

【００９２】次いで、電流を各反応容器に、増幅が熱サイクルを通して進むような制御され
た仕方で流して、異なる延長時間での増幅を行う。各ウエルからのルミネセンス
を監視して、増幅反応の進行状況を検出し、延長時間が、増幅が進行するに十分
に長かったかどうかを判断する。

【００９３】さらに、場合によっては、形成した二重らせんの融解温度に関するデータも収
集する。

【００９４】図２に示すように、結果を時間対ルミネセンスのグラフにプロットするならば
、増幅反応が正常に進行し、指数関数的増幅が起こったので、試料増幅反応は一
連のＳ字型曲線を生じ、その多く（Ａ、Ｂ）はプロファイルがほぼ同様となる。
しかし、延長時間が十分に長くなかった場合（Ｄ）、最初の鋳型からの直線増幅
のみが起こる。境界線にある場合（Ｃ）、増幅反応プロファイルの著しい縮小が
認められる。これは、この時間では一部の生成物は成功裡に生成し、一方、他の
生成物は非常に短いためである。この時間を用いて配列の長さを計算することが
できる。

【００９５】同時に融解温度分析を行う場合、異なる増幅反応が用いられるので、試料核酸
中に存在する種々の配列の融解温度に対応する一連の蛍光対融解温度曲線が得ら
れる。上で論じたように、融解温度は、配列の長さとＧＣ含量の関数である。し
たがって、図２の結果と組み合わせると、配列の絶対ＧＣ含量を求めることがで
きる。これは、所定の配列長さについて、ＧＣ含有％と融解温度との間に正比例
関係があるためである（図３）。

【００９６】これらの結果をプロットして、試料核酸の長さ／融解組合せプロファイルを得
て、これから（分類学的に重要な）ＧＣ含有％を得ることができる。作製するこ
とができる種類の比較グラフの一例を図４に示す。配列長さは最小延長時間に正
比例するので、延長時間結果をＸ軸として用いて、同様のグラフが得られると思
われる。

【００９７】ここで、領域（ｉ）の結果は比較的に高いＧＣ％を有する短い生成物により得
られるのに対して、領域（ｉｉ）の結果は低いＧＣ％を有する短い生成物から得
られることは明らかである。領域（ｉｉｉ）の結果は高いＧＣ％を有する比較的
に長い生成物から得られ、領域（ｉｖ）の結果は低いＧＣ含有％を有する比較的
に長い長さの生成物から得られる。

【００９８】増幅の進行状況を監視するために、挿入色素のような標識手段をそのまま用い
るか、または、それに用いられる信号システムの要素として用いるとき、反応容
器中に存在する二重らせんの量の変化を非常に明確に監視することができる。二
重らせんの量が増加するにつれて、蛍光信号の強度は増加する。ＰＣＲのような
増幅反応をとおして蛍光を連続的に測定するならば、図５ａに示すように非常に
特徴的なパターンが出現する。反応のアニーリング相中に、反応混合物中の大量
の二重らせん物質の結果として蛍光の鋭いピークが発生する（ｉ）。これは、二
重らせんが不安定化し、挿入色素が放出されるときに、有意に低下する（ｉｉ）
が、延長フェーズ中に再び徐々に強まり、二本鎖のアプリコンが成長する。効率
のよい増幅反応では延長フェーズの速度論は比較的に単純であり、したがって、
この時間における監視曲線はほぼ直線である（ｉｉｉ）。

【００９９】しかし、延長フェーズが短すぎて全長アプリコンを調製することができない不
完全な反応の場合には、不完全な生成物がその後のサイクルにおいてプライマー
として働き始めよう。そのような反応の効率は、プライマーを用いる反応よりも
低い。

【０１００】その結果として、蛍光曲線の領域（ｉｉｉ）では、反応が進行するにつれて形
状および／または勾配が変化する。

【０１０１】この信号は、どの反応が完了に至るまで進行しないかを検出する代替または確
認手段として働き、したがって、最適反応時間に満たないことを判断する手がか
りにもなる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法で用いた装置の概略図である。

【図２】本発明の方法を用いて達成することができる典型的な結果を示す図である。

【図３】所定の配列長さにおける融解温度とＧＣ含有％との間に比例関係があることを
示す図である。

【図４】一連の生成物の融解温度対長さ測定値のプロットを示す図である。

【図５】反応が完全に起こるときの増幅反応の連続監視の結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者リー，マーテイン・アランイギリス国、ウイルトシヤー・エス・ピー・４・０・ジエイ・キユー、ソールズベリ、ポートン・ダウン、デイー・エス・テイー・エル (72)発明者スクイレル，デイビツド・ジエイムズイギリス国、ウイルトシヤー・エス・ピー・４・０・ジエイ・キユー、ソールズベリ、ポートン・ダウン、デイー・エス・テイー・エルＦターム(参考） 2G045 AA28 BA11 BB50 BB51 CB21 DA12 DA13 DA14 FB07 FB11 FB12 4B024 AA10 AA20 CA01 CA09 HA12 4B063 QA05 QQ42 QR56 QR66 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸内の特定の領域の長さを分析する方法であって、ａ）前記核酸の試料を、前記領域が増幅される複数の増幅反応に供する段階で
あって、前記反応のそれぞれにおける延長フェーズの時間を変化させる段階と、ｂ）前記増幅反応の進行状況を監視する段階と、ｃ）増幅の延長フェーズが各反応混合物中で完全に起こるのに必要な最小時間
を測定し、それを、延長を受ける配列の長さと関係づける段階とを含む方法。
【請求項２】前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガ
ーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】増幅反応がＰＣＲ反応である請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記の複数の増幅反応が同時に実施される請求項１から３の
いずれか一項に記載の方法。
【請求項５】各増幅反応がマルチウエル容器のウエル中で実施され、前記
ウエルを具備した、あるいは前記ウエルを加熱することができる、導電性ポリマ
ーに電流を供給することによって、各ウエルが加熱される請求項１から４のいず
れか一項に記載の方法。
【請求項６】各ウエル中の増幅反応の延長フェーズの時間が独立に制御可
能である請求項６に記載の方法。
【請求項７】増幅反応の進行状況を、反応中に存在する蛍光標識手段を用
いて監視する前記請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】前記標識手段が挿入色素を含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】前記標識手段が標識プローブを含む請求項７に記載の方法。
【請求項１０】前記標識プローブがハイブリッド形成プローブである請求
項９に記載の方法。
【請求項１１】前記プローブが加水分解プローブである請求項９に記載の
方法。
【請求項１２】段階（ｂ）において、延長フェーズの進行状況を連続的に
監視する請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】組換えＤＮＡ技術によって得られたクローンをコンカテマ
ーの存在について選別する請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】遺伝的欠陥またはウイルス感染の診断、またはＤＮＡフィ
ンガープリント法に用いる請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】連鎖分析に使用される請求項１から１３のいずれか一項に
記載の方法。
【請求項１６】年齢分析のためのテロマーの長さの測定に用いる請求項１
から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】前記試料中で特定の反応生成物が二重らせんを形成する、
あるいは二重らせん体が不安定化する温度が認められ、この情報と、配列の長さ
の測定とを合わせて用いて、配列のＧＣ含有パーセントを計算する請求項１から
１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法において使
用する装置。
【請求項１９】それぞれが導電性ポリマーによって加熱可能である複数の
反応ウエルと、各ウエルまたはウエルの群を個別に加熱するために加えられる電
流を制御するように設定され、異なるウエルを、増幅中に延長が起こる温度に保
持する時間を変化させるように設定されている制御手段とを含む請求項１７に記
載の装置。
【請求項２０】制御手段が、各ウエルまたはウエルの群において起こる増
幅反応の各段階の温度を変化させるように設定されている請求項１９に記載の装
置。