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JP2003524370A - ヒト受容体ｇｐｒ１４、並びにヒトおよびラットｇｐｒ１４に対するアゴニストおよびアンタゴニストの探索方法 - Google Patents

ヒト受容体ｇｐｒ１４、並びにヒトおよびラットｇｐｒ１４に対するアゴニストおよびアンタゴニストの探索方法

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JP2003524370A
JP2003524370A JP2000530606A JP2000530606A JP2003524370A JP 2003524370 A JP2003524370 A JP 2003524370A JP 2000530606 A JP2000530606 A JP 2000530606A JP 2000530606 A JP2000530606 A JP 2000530606A JP 2003524370 A JP2003524370 A JP 2003524370A
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JP
Japan
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polypeptide
human
gpr14
receptor
disorders
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Application number
JP2000530606A
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English (en)
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ダグラス，ステファン，エー．
ウィレッテ，ロバート，エヌ．
アイヤー，ナムビ，ヴィー．
アーノルド，アン，ロマニック
カンドゥ−ディ，ナシラ
グート，ベルナルド
アル−バラザンジ，カマル
アムス，ロバート，エス．
フォーレー，ジェームズ，ジェイ．
サラウ，ヘンリー，エム．
チャンバーズ，ジョン
シェイボン，ウズマン
バーグズマ，ダーク，ジェイ．
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SmithKline Beecham Ltd
Original Assignee
SmithKline Beecham Ltd
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 ヒトGPR14ポリペプチドおよびポリヌクレオチドならびに組換え技術によりこのようなポリペプチドを生産する方法が開示される。また、ヒトGPR14ポリペプチドおよびポリヌクレオチドをとりわけ、虚血性冠状動脈疾患（狭心症および心筋梗塞）、アテローム硬化症、代謝病（例えば、糖尿病）、CHF/心筋機能不全、不整脈、再狭窄、高血圧、低血圧、肺疾患（高血圧、COPD：慢性閉塞性肺疾患、喘息）、繊維性血管症（糖尿病、SLE： 全身性エリテマトーデス、AS、レーノー症候群）、脳血管障害（例えば、出血性発作および虚血性発作）、神経性の炎症/片頭痛、造血疾患、ARDS：成人呼吸促進症候群、癌、自己免疫疾患（例えば、HIV-1および-2感染およびAIDS）、胃腸障害および尿生殖器障害（例えば、潰瘍）、内分泌障害、繊維増殖性疾患（例えば、乾癬）、炎症疾患（例えば、RA、クローン病、IBS)、良性前立腺肥大、腎不全および糸球体症、過度の血管収縮、心筋機能不全および/または異常繊維増殖/炎症反応により特徴づけられる心臓血管系および非心臓血管系の両方の病状、精神病および神経系疾患（不安症、精神分裂症、躁鬱病、せん妄、痴呆、重度の精神遅滞、パーキンソン病および運動障害を含む）、細菌感染、真菌感染、原生生物感染およびウイルス感染、痛み、摂食障害（肥満症、食欲不振、過食症など）、喘息、尿閉、骨粗鬆症、アレルギー、ハンチントン病またはジル・ド・ラ・トゥーレット症候群の治療のためのプロトコルの設計およびそのような症状のための診断アッセイに利用する方法も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は1998年2月9日に出願された米国仮出願第60/074,075号および1999年1
月15日に出願された一部継続出願（出願番号はまだ与えられていない）の優先権
の利益を主張するものであり、1998年4月10日に出願された一部継続出願第09/05
8,725号の優先権を主張するものである。これら３つの出願はすべて、全文が引
用により本明細書中に含まれるものとする。
【０００２】 発明の属する技術分野 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドによりコ
ードされるポリペプチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドの使用、ならびにそれらの生産に関する。より特定すると、本発明のポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドは、Ｇタンパク質共役受容体（本明細書中では以
後ヒトGPR14と称する）に関連する。本発明はまた、このようなポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの作用の阻害または活性化に関する。
【０００３】 発明の背景 多くの医学的に重要な生物学的プロセスが、Ｇタンパク質を含めたシグナル伝
達経路に関与しているタンパク質および／または第二メッセンジャー(例えばcAM
P)により媒介されるということはよく知られている(Lefkowitz,Nature, 1991,35
1：353−354)。本明細書中では、これらのタンパク質はＧタンパク質を含む経路
に関与しているタンパク質つまりＰＰＧタンパク質と称される。これらのタンパ
ク質のいくつかの例としては、アドレナリンアゴニストおよびドーパミンの受容
体( Kobilka, B.K.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1987,84：46−50；Kobilka
, B.K.ら、Science,1987，238：650−656；Bunzow,J.R.ら、Nature,1988,336：
783−787)、Ｇタンパク質それ自体、エフェクタータンパク質(例えばホスホリパ
ーゼＣ、アデニルシクラーゼ、およびホスホジエステラーゼ)、アクチュエータ
ータンパク質(例えばプロテインキナーゼAおよびプロテインキナーゼC)( Simon,
M.I.ら、Science,1991,252：802−8)の受容体のようなGPC受容体が挙げられる
。
【０００４】 例えば、シグナル伝達の一つの形態においては、ホルモンが結合することによ
り細胞内で酵素アデニル酸シクラーゼが活性化される。ホルモンによるこの酵素
の活性化はヌクレオチドGTPの存在に依存する。GTPもまたホルモンの結合に影響
を及ぼす。Ｇタンパク質はホルモン受容体をアデニル酸シクラーゼと結びつけて
いる。Ｇタンパク質はホルモン受容体により活性化されると、結合していたGDP
をGTPと交換することが示された。このGTP担持形態は次に活性化されたアデニル
酸シクラーゼに結合する。GTPからGDPへの加水分解はＧタンパク質自身によって
触媒され、Ｇタンパク質はその不活性な基底状態に戻る。したがって、Ｇタンパ
ク質はシグナルを受容体からエフェクターへ引き継ぐ中間物質として、およびシ
グナルの持続時間を制御する時計として機能し、2つの役割を果たしている。
【０００５】 Ｇタンパク質共役受容体の膜タンパク質遺伝子スーパーファミリーは７つの推
定上の膜貫通ドメインを有すると特徴付けられた。これらのドメインは細胞外、
または細胞質ループにより接続された膜貫通α−ヘリックスに相当すると考えら
れる。Ｇタンパク質共役受容体には、ホルモンやウイルス、増殖因子および神経
の受容体といった多くの生物学的に活性な受容体が含まれる。
【０００６】 Ｇタンパク質共役受容体は、少なくとも８つの異なる親水性ループをつなぐ、
約20〜30アミノ酸からなる７つの保存された疎水性の領域を含むと特徴付けられ
てきた。Ｇタンパク質共役受容体のファミリーには、精神病および神経障害の治
療に用いる神経弛緩薬と結合するドーパミン受容体を含む。このファミリーのメ
ンバーの他の例としてはカルシトニン、アドレナリン、エンドセリン、cAMP、ア
デノシン、ムスカリン、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン
、キニン、濾胞刺激ホルモン、オプシン、内皮細胞分化遺伝子−1、ロドプシン
、におい物質、およびサイトメガロウイルス受容体が含まれるが、これらに限ら
ない。
【０００７】 大部分のＧタンパク質共役受容体(他には７TM受容体としても知られている)は
、機能性タンパク質の構造を安定化させていると考えられるジスルフィド結合を
形成する保存されたシステイン残基を、最初の２つの細胞外ループの各々におい
て1個有する。７つの膜貫通領域はTM1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM6、およびTM7と
称される。TM3はシグナル伝達に関与している。
【０００８】 システイン残基のリン酸化およびリピド化(パルミトイル化またはファルネシ
ル化)はいくつかのＧタンパク質共役受容体のシグナル伝達に影響を及ぼすこと
ができる。大部分のＧタンパク質共役受容体はその3番目の細胞質ループおよび
／またはカルボキシ末端内にリン酸化部位を含むことが多い。β−アドレナリン
受容体のような数種のＧタンパク質共役受容体では、プロテインキナーゼＡおよ
び／または特異的な受容体キナーゼによるリン酸化が受容体の脱感作を媒介する
。
【０００９】 いくつかの受容体では、Ｇタンパク質共役受容体のリガンド結合部位は数個の
Ｇタンパク質共役受容体膜貫通ドメインにより形成される親水性のソケット(soc
ket)を含み、このソケットはＧタンパク質共役受容体の疎水性残基に囲まれてい
ると考えられている。各々のＧタンパク質共役受容体膜貫通ヘリックスの親水性
の側は内部に面し、極性を持つリガンド結合部位を形成していると仮定されてい
る。TM３はTM３アスパラギン酸残基のようなリガンド結合部位を有するため、一
部のＧタンパク質共役受容体におけるリガンドの結合に関与してきた。TM５のセ
リン、TM６のアスパラギンおよびTM６またはTM７のフェニルアラニンまたはチロ
シンもまたリガンド結合に関与している。
【００１０】 Ｇタンパク質共役受容体は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質により種々の細胞内酵
素、イオンチャンネルおよびトランスポーターに細胞内で結合し得る（ Johnson
ら、Endoc.Rev.,1989,10:317−331参照）。個々のＧタンパク質のαサブユニッ
トは特定のエフェクターを優先的に刺激して、細胞内の種々の生物学的機能をモ
ジュレートする。Ｇタンパク質共役受容体の細胞質側の残基のリン酸化は、一部
のＧタンパク質共役受容体のＧタンパク質の共役を調節するために重要な機構で
あるとして同定された。Ｇタンパク質共役受容体は、哺乳動物宿主の非常に多く
の部位で見つかっている。
【００１１】 過去15年に渡り、７回膜貫通（7TM）受容体を標的とする350種類近くの治療薬
が市場に出回り成功してきた。
【００１２】 この事実は、これらの受容体が治療上の標的として、確立され、立証されてき
た歴史を有することを示す。明らかに、機能障害や疾患を予防、改善または矯正
する上で何らかの役割を果たし得る別の受容体の同定および特性評価が必要とさ
れている。該機能障害や疾患には、これらに限定するものではないが、虚血性冠
状動脈疾患（狭心症および心筋梗塞）、アテローム硬化症、代謝病（例えば、糖
尿病）、CHF/心筋機能不全、不整脈、再狭窄、高血圧、低血圧、肺疾患（高血圧
、COPD：慢性閉塞性肺疾患、喘息）、繊維性血管症（fibrotic vasculopathies)
（糖尿病、SLE： 全身性エリテマトーデス、AS、レーノー症候群）、脳血管障害
（例えば、出血性発作および虚血性発作）、神経性の炎症/片頭痛、造血疾患、A
RDS：成人呼吸促進症候群、癌、自己免疫疾患（例えば、HIV-1および-2感染およ
びAIDS）、胃腸障害および尿生殖器障害（例えば、潰瘍）、内分泌障害、繊維増
殖性疾患（例えば、乾癬）、炎症疾患（例えば、RA、クローン病、IBS)、良性前
立腺肥大、腎不全および糸球体症、過度の血管収縮、心筋機能不全および/また
は異常繊維増殖/炎症反応により特徴づけられる心臓血管系および非心臓血管系
の両方の病状、精神病および神経系疾患（不安症、精神分裂症、躁鬱病、せん妄
、痴呆、重度の精神遅滞、パーキンソン病および運動障害を含む）、細菌感染、
真菌感染、原生生物感染およびウイルス感染、痛み、摂食障害（肥満症、食欲不
振、過食症など）、喘息、尿閉、骨粗鬆症、アレルギー、ハンチントン病または
ジル・ド・ラ・トゥーレット症候群などが挙げられる。
【００１３】 発明の概要 ある態様においては、本発明はヒトGPR14ポリペプチドおよび組換え物質、な
らびにそれらの生産方法に関する。本発明の別の態様は、このようなヒトGPR14
ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法に関する。この使用には、以下
の疾患の治療を含む。該疾患とは、虚血性冠状動脈疾患（狭心症および心筋梗塞
）、アテローム硬化症、代謝病（例えば、糖尿病）、CHF/心筋機能不全、不整脈
、再狭窄、高血圧、低血圧、肺疾患（高血圧、COPD：慢性閉塞性肺疾患、喘息）
、繊維性血管症（糖尿病、SLE： 全身性エリテマトーデス、AS、レーノー症候群
）、脳血管障害（例えば、出血性発作および虚血性発作）、神経性の炎症/片頭
痛、造血疾患、ARDS：成人呼吸促進症候群、癌、自己免疫疾患（例えば、HIV-1
および-2感染およびAIDS）、胃腸障害および尿生殖器障害（例えば、潰瘍）、内
分泌障害、繊維増殖性疾患（例えば、乾癬）、炎症疾患（例えば、RA、クローン
病、IBS)、良性前立腺肥大、腎不全および糸球体症、過度の血管収縮、心筋機能
不全および/または異常繊維増殖/炎症反応により特徴づけられる心臓血管系およ
び非心臓血管系の両方の病状、精神病および神経系疾患（不安症、精神分裂症、
躁鬱病、せん妄、痴呆、重度の精神遅滞、パーキンソン病および運動障害を含む
）、細菌感染、真菌感染、原生生物感染およびウイルス感染、痛み、摂食障害（
肥満症、食欲不振、過食症など）、喘息、尿閉、骨粗鬆症、アレルギー、ハンチ
ントン病またはジル・ド・ラ・トゥーレット症候群などである。
【００１４】 本発明の別の態様により、ラットもしくはヒトGPR14ポリペプチド（受容体）
に結合し、それを活性化（アゴニスト）または活性化を阻害（アンタゴニスト）
する化合物、およびその受容体のリガンドをスクリーニングする方法を提供する
。
【００１５】 特に、ヒトもしくはラットGPR14ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニ
ストの好ましい同定方法は、 化合物の該ポリペプチドへの結合に応答して検出可能なシグナルを提供し得る
第2の構成成分と結合されている該ポリペプチドをその表面に発現している細胞
に、スクリーニングしようとする化合物を該ポリペプチドへの結合を可能とする
条件下で接触させること、および 該化合物と該ポリペプチドとの相互作用により生成するシグナルのレベルを測
定することによって、該化合物が該ポリペプチドに結合してそれを活性化するの
かまたは阻害するのかを、決定すること、 を含んでなる。
【００１６】 さらに好ましい実施形態においては、該方法は、標識されたもしくは標識され
ていない、魚類またはヒトウロテンシンIIの存在下で、アゴニストまたはアンタ
ゴニストの同定を実施することをさらに含む。
【００１７】 ヒトまたはラットGPR14ポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストの
同定方法の別の実施形態は、 候補化合物の存在下に、該ポリペプチドへの結合を可能とする条件下で、その
表面に該ポリペプチドを有する細胞または該ポリペプチドを含む細胞膜へのリガ
ンドの結合の阻害を測定すること、および該ポリペプチドに結合したリガンドの
量を測定すること（それでリガンドの結合を減少させ得る化合物はアゴニストま
たはアンタゴニストである）を含んでなる。好ましくは、該リガンドはヒトまた
はラットウロテンシンIIである。さらに好ましくは、ヒトまたは魚類ウロテンシ
ンIIは標識されている。
【００１８】 さらに本発明は、同定された化合物を用いたヒトGPR14の平衡異常に関連する
症状の治療に関する。本発明のさらに別の態様は、不適切なヒトGPR14活性また
はレベルに関連する疾患を検出するための診断アッセイに関する。
【００１９】 発明の説明 定義 以下の定義は本明細書中以下でしばしば用いられる用語を理解しやすくするた
めのものである。
【００２０】 「ヒトGPR14」は、通常、配列番号２に示したアミノ酸配列を有するポリペプ
チド、またはその対立遺伝子変異体をいう。
【００２１】 「魚類ウロテンシンII」は、Ala-Gly-Thr-Ala-Asp-Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys-
Val（配列番号３）のアミノ酸配列からなるポリペプチドをいう。Pearsonら、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 1980 8月；77（8）:5021-5024に記載されている。
【００２２】 「ラットGPR14受容体」または「ラットGPR14受容体ポリペプチド」はGenBank
受託番号U32673のタンパク質であり、Marcheseらにより、Genomics 1995 9月 2
0；29(2):335-344に記載されている。ラットGPR14受容体は図２（配列番号４）
に示すアミノ酸配列を有する。
【００２３】 「ヒトウロテンシンII」は、アミノ酸配列ETPDCFWKYCV（配列番号５）からな
るタンパク質である。本発明者らの研究において、配列番号５のヒトウロテンシ
ンIIが、現在までに同定された哺乳動物血管収縮剤のなかで、最も効力の高いも
のであり、健全な霊長類において全身の血管収縮、心筋収縮性機能不全、そして
最終的には致命的な不整脈を誘発することを見出した（この系の過度の活性によ
り、さらなる代謝/内分泌機能不全もまた生じ得る）。「受容体活性」または「
受容体の生物学的活性」は、上記ヒトGPR14の代謝機能または生理的機能をいい
、類似の活性または改善された活性またはこれらの活性で望ましくない副作用を
減じたものを含む。上記ヒトGPR14の抗原活性および免疫原性活性をも含む。
【００２４】 「ヒトGPR14ポリペプチド」は、ヒトGPR14配列に十分類似するアミノ酸配列を
有し、好ましくは受容体の生物学的活性を少なくとも1つ示すポリペプチドをい
う。
【００２５】 「ヒトGPR14遺伝子」は、配列番号１に示したヌクレオチド配列を有するポリ
ヌクレオチドまたはその対立遺伝子変異体および/またはその相補体をいう。
【００２６】 「ヒトGPR14ポリヌクレオチド」は、ヒトGPR14ポリペプチドもしくはその断片
をコードするヌクレオチド配列、または配列番号２のポリペプチドもしくはそれ
に対応する断片をコードするヌクレオチド配列と少なくとも75.9％の同一性を有
するヌクレオチド配列、または配列番号１に含まれるヌクレオチド配列と十分な
同一性を有し、増幅での使用またはプローブもしくはマーカーとしての使用が可
能な条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含むポリヌクレオチドを
いう。
【００２７】 本明細書中で用いる「抗体」には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体
、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、さらにＦａｂまたは他の免疫グロブリ
ン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメントが含まれる。
【００２８】 「単離された」とは、天然の状態から「人間の手によって」改変されたことを
意味する。「単離された」組成物または物質が天然に存在するのであれば、それ
はそのもとの環境から変化しているか分離されており、またはその両方である。
例えば、生存している動物の体内に自然界で存在するポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態の共存物質から分離
されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書中で用いられるように
、「単離された」ものである。
【００２９】 「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデ
オキシリボヌクレオチドをさし、これは修飾されていないRNAもしくはDNA、また
は修飾されたRNAもしくはDNAであり得る。「ポリヌクレオチド」には、制限する
ものではないが、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合
ったDNA、一本鎖および二本鎖RNA、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったRNA
、DNAとRNAを含むハイブリッド分子（一本鎖でも、またはより典型的には二本鎖
でもよく、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったものでもよい）が含まれる。
加えて、「ポリヌクレオチド」はRNAまたはDNAまたはRNAとDNAの両方からなる三
重鎖領域を意味する。「ポリヌクレオチド」という用語はまた、１個以上の修飾
塩基を含有するDNAまたはRNA、および安定性または他の理由のために修飾された
骨格を有するDNAまたはRNAも含む。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化
された塩基およびイノシンのような特殊な塩基がある。DNAおよびRNAに対してさ
まざまな修飾が施された。こうして、「ポリヌクレオチド」は、自然界に一般的
に存在するポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、
並びにウイルスおよび細胞に特徴的なDNAおよびRNAの化学的形態を包含する。ま
た、「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと称される比較的短
いポリヌクレオチドも包含する。
【００３０】 「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合（すなわ
ち、ペプチドアイソスター）により連結された２個以上のアミノ酸を含むペプチ
ドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプチド」は短鎖（通常はペプチド、オ
リゴペプチドまたはオリゴマーという）と長鎖（一般的にはタンパク質という）
の両方をさす。ポリペプチドは２０種類の遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ
酸を含んでもよい。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセシングのような天然のプ
ロセスで、または当業界で公知の化学的修飾法のいずれかで修飾されたアミノ酸
配列を含む。このような修飾は基本的な教科書、より詳細な学術論文および研究
文献に詳述されている。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノまたはカル
ボキシル末端を含めてポリペプチドのどこでも行うことができる。同じタイプの
修飾が所定のポリペプチドのいくつかの部位に同程度でまたはさまざまに異なる
程度で存在してもよい。また、所定のポリペプチドが多くのタイプの修飾を含ん
でいてもよい。ポリペプチドはユビキチン化のために分枝していても、分枝のあ
る又はない環状であってもよい。環状の、分枝した、または分枝した環状のポリ
ペプチドは翻訳後の天然プロセスから生じることがあり、また、合成法によって
製造することもできる。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシ
ル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまた
はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファ
チジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチ
ル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミ
ル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル
化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング
、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のよ
うなタンパク質へのアミノ酸の転移RNA媒介付加、ユビキチン化などがある（例
えば、Proteins - Structure and Molecular Properties 2nd Ed., T.E. Creig
hton, W.H. Freeman and Company, New York, 1993; Posttranslational Covale
nt Modification of Proteins, B.C. Johnson編, Academic Press, New York, 1
983中のWold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspectives
and Prospects, pgs. 1-12; Seifterら, “Analysis for protein modification
s and nonprotein cofactors", Meth Enzymol (1990) 182:626-646; および Rat
tanら, “Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging",
Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62 を参照のこと）。
【００３１】 本明細書中で用いる用語としての「変異体」とは、基準のポリヌクレオチドま
たはポリペプチドとそれぞれ異なるが、不可欠な性質を保持しているポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドのことである。典型的なポリヌクレオチドの変異体は
基準ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列の点で相違する。この変異体のヌクレ
オチド配列の変化は、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
のアミノ酸配列を変更しても、しなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、以下で
述べるように、基準配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸の置換、欠
失、付加、融合および末端切断（トランケーション）をもたらしうる。典型的な
ポリペプチドの変異体は基準ポリペプチドとアミノ酸配列の点で相違する。一般
的には、基準ポリペプチドの配列と変異体の配列が全般的によく類似しており、
多くの領域で同一となるような相違に限られる。変異体と基準ポリペプチドは任
意に組み合わせた１以上の置換、欠失、付加によりアミノ酸配列が相違していて
よい。置換または付加されるアミノ酸残基は遺伝子コードによりコードされるも
のであっても、なくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は
アレル変異体のように天然に存在するものでも、天然に存在することが知られて
いない変異体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然に存
在しない変異体は、突然変異誘発法または直接合成により作製することができる
。
【００３２】 当技術分野で知られた「同一性」とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオ
チド配列の比較により決定された、２以上のかかる配列間の関連性のことである
。当技術分野ではまた、「同一性」はポリペプチド配列またはポリヌクレオチド
配列の鎖間のマッチ(match)により決定された、このような配列間の配列関連性
の程度を意味する。「同一性」および「類似性」は公知の方法により難なく算出
することができ、こうした方法として、例えば Computational Molecular Biolo
gy, Lesk, A.M.編, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing:
Informatics and Genome Projects, Smith, D.W. 編, Academic Press, New Yo
rk, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. and
Griffin, H.G. 編, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in M
olecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysi
s Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. 編, M Stockton Press, New York,
1991; および Carillo, H. and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073
(1988) に記載された方法があるが、これらに限らない。同一性を決定するため
の好ましい方法は、検討する配列間で最大級のマッチが得られるように設計され
る。さらに、同一性および類似性を決定する方法は一般に入手可能なコンピュー
タプログラムに編集されている。２配列間の同一性および類似性を決定する好ま
しいコンピュータプログラム法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ (Devere
ux, J.ら, Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984))、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡ
ＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ (Atschul, S.F.ら, J. Molec. Biol. 215:403-410 (19
90)) があるが、これらに限らない。ＢＬＡＳＴ ＸプログラムはＮＣＢＩおよび
他のソースから一般に入手可能である (BLAST Manual, Altschul, S.ら, NCBI N
LM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S.ら, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1
990))。公知のSmith Watermanアルゴリズムも同一性の決定に使用することがで
きる。
【００３３】 ポリペプチド配列を比較するための好ましいパラメーターは次のものを含む：
アルゴリズム：Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970) 比較
マトリックス：BLOSSUM62 、Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci
. USA, 89: 10915-10919 (1992) ギャップペナルティー：12 ギャップ長ペナルティー：４ これらのパラメーターと共に役に立つプログラムは Genetics Computer Group（
Madison WI）から「ｇａｐ」プログラムとして一般に入手可能である。前記のパ
ラメーターはペプチド比較のためのデフォルトパラメーター(default parameter
) である（末端ギャップのペナルティーは無し）。
【００３４】 ポリヌクレオチド配列を比較するための好ましいパラメーターは次のものを含
む： アルゴリズム：Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)； 比
較マトリックス：マッチ＝＋10、ミスマッチ＝０ ギャップペナルティー：50 ギャップ長ペナルティー：３ これらのパラメーターと共に役に立つプログラムは Genetics Computer Group(M
adison WI)から「ｇａｐ」プログラムとして入手可能である。これらは核酸比較
のためのデフォルトパラメーターである。
【００３５】 好ましいポリヌクレオチドの具体例は、配列番号１の基準配列に対して少なく
とも50、60、70、80、85、90、95、97または100％の同一性を有するポリヌクレ
オチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドをさらに含む。前記ポリヌ
クレオチド配列は配列番号１の基準配列と同一であっても、該基準配列に対して
、ある整数個までのヌクレオチド変異を含んでいてもよい。前記変異は少なくと
も１個のヌクレオチドの欠失、置換（トランジションおよびトランスバージョン
を含む）または挿入よりなる群から選択され、こうした変異は基準ヌクレオチド
配列の 5'もしくは 3'末端位置、またはこれらの末端位置の間のどこに存在して
もよく、基準配列中のヌクレオチドの間に個々に、または基準配列内に１以上の
連続するグループとして介在することができる。ヌクレオチド変異の数は、配列
番号１のヌクレオチドの総数に、それぞれの（100で割った）同一性％値を掛け
、その積を配列番号１のヌクレオチドの総数から差し引くことにより、すなわち
、次式：ｎn ≦ｘn −（ｘn・ｙ）により求めることができる。式中、ｎnはヌ
クレオチド変異の数であり、ｘnは配列番号１のヌクレオチドの総数であり、ｙ
は50％については0.50、60％については0.60、70％については0.70、80％につい
ては0.80、85％については0.85、90％については0.90、95％については0.95、97
％については0.97または100％については1.00であり、・は乗法演算子を表す記
号であり、ｘnとｙの非整数の積は、その積をｘnから引く前に、最も近似する整
数に切り下げる。配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
の改変は、そのコード配列にナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト突然
変異を生じさせ、それにより、こうした変異後に該ポリヌクレオチドによりコー
ドされたポリペプチドを改変させることができる。
【００３６】 例として、本発明のポリヌクレオチド配列は、配列番号２の基準配列と同一で
ある、すなわち基準配列に対して100％の同一性を有するか、または同一性％が1
00％未満となるように基準配列に対してある整数個までのアミノ酸変異を含むこ
とができる。前記変異は少なくとも１個の核酸の欠失、置換（トランジションお
よびトランスバージョンを含む）または挿入よりなる群から選択され、こうした
変異は基準ポリヌクレオチド配列の 5'もしくは 3'末端位置、またはこれらの末
端位置の間のどこに存在してもよく、基準配列中の核酸の間に個々に、または基
準配列内に１以上の連続するグループとして介在することができる。核酸変異の
数は、配列番号２のアミノ酸の総数に、それぞれの（100で割った）同一性％値
を掛け、その積を配列番号２のアミノ酸の総数から差し引くことにより、すなわ
ち、次式：ｎn＝ｘn−（ｘn・ｙ）により求めることができる。式中、ｎnはアミ
ノ酸変異の数であり、ｘnは配列番号２中のアミノ酸の総数であり、ｙは例えば7
0％については0.70、80％については0.80、85％については0.85などであり、・
は乗法演算子を表す記号であり、ｘnとｙの非整数の積は、その積をｘnから引く
前に、最も近似する整数に切り下げる。
【００３７】 好ましいポリペプチドの具体例は、配列番号２の基準配列に対して少なくとも
50、60、70、80、85、90、95、97または100％の同一性を有するポリペプチドを
含んでなる単離されたポリペプチドをさらに含む。前記ポリペプチド配列は配列
番号２の基準配列と同一であっても、該基準配列に対して、ある整数個までのア
ミノ酸変異を含んでいてもよい。このような変異は少なくとも１個のアミノ酸の
欠失、置換（保存的および非保存的アミノ酸置換を含む）または挿入よりなる群
から選択され、これらの変異は基準ポリペプチド配列のアミノもしくはカルボキ
シ末端位置、またはこれらの末端位置の間のどこに存在してもよく、基準配列中
のアミノ酸の間に個々に、または基準配列内に１以上の連続したグループとして
点在することができる。アミノ酸変異の数は、配列番号２中のアミノ酸の総数に
それぞれの（100で割った）同一性％の数値を掛け、その積を配列番号２中のア
ミノ酸の総数から引くことにより、すなわち次式により求められる。ｎa≦ｘa−
（ｘa・ｙ）式中、ｎaはアミノ酸変異の数であり、ｘaは配列番号２中のアミノ
酸の総数であり、ｙは50％については0.50、60％については0.60、70％について
は0.70、80％については0.80、85％については0.85、90％については0.90、95％
については0.95、97％については0.97または100％については1.00であり、・は
乗法演算子を表す記号であり、ｘaとｙの非整数の積は、その積をｘaから引く前
に、最も近似する整数に切り下げる。
【００３８】 例として、本発明のポリペプチド配列は、配列番号２の基準配列と同一である
、すなわち基準配列に対して100％の同一性を有するか、または同一性％が100％
未満となるように基準配列に対してある整数個までのアミノ酸変異を含むことが
できる。このような変異は少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換（保存的およ
び非保存的アミノ酸置換を含む）または挿入よりなる群から選択され、これらの
変異は基準ポリペプチド配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、またはこれ
らの末端位置の間のどこに存在してもよく、基準配列中のアミノ酸の間に個々に
、または基準配列内に１以上の連続したグループとして点在することができる。
アミノ酸変異の数は、配列番号２中のアミノ酸の総数にそれぞれの（100で割っ
た）同一性％の数値を掛け、その積を配列番号２中のアミノ酸の総数から引くこ
とにより、すなわち次式により求められる。 ｎa＝ｘa−（ｘa・ｙ） 式中、ｎaはアミノ酸変異の数であり、ｘaは配列番号２中のアミノ酸の総数であ
り、ｙは例えば70％については0.70、80％については0.80、85％については0.85
等であり、・は乗法演算子を表す記号であり、ｘaとｙの非整数の積は、その積
をｘaから引く前に、最も近似する整数に切り下げる。
【００３９】 本発明のポリペプチド 本発明のヒトGPR14ポリペプチドは、配列番号２のポリペプチド（特に成熟ポ
リペプチド）だけでなく、配列番号２のポリペプチドまたはこれと同等な部分と
少なくとも84.25％の同一性を有し、配列番号２と、より好ましくは少なくとも8
5％の同一性、さらに好ましくは少なくとも90％の同一性、さらに好ましくは少
なくとも95％の同一性を有するヒトGPR14ポリペプチドを含む。
【００４０】 ヒトGPR14ポリペプチドは「成熟」タンパク質の形であっても、融合タンパク
質のような、より大きいタンパク質の一部であってもよい。しばしば、追加のア
ミノ酸配列を含めることが有利であり、このようなアミノ酸配列としては、分泌
すなわちリーダー配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配
列、または組換え生産の間の安定性を確保する付加的配列などがある。
【００４１】 ヒトGPR14ポリペプチドの生物学的に活性な断片もまた本発明に含まれる。断
片は、全体が前記ヒトGPR14ポリペプチドのアミノ酸配列の一部と等しいが、全
部と等しいわけではないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ヒトGPR14
ポリペプチドと同様に、断片は「それ自体で独立」していてもよいし、該断片が
その一部または領域、最も好ましくは単一の連続領域を形成しているより大きな
ポリペプチド内に含まれていてもよい。本発明のポリペプチド断片の代表的な具
体例として、例えば、ヒトGPR14ポリペプチドのアミノ酸番号約1〜20、21〜40、
41〜60、61〜80、81〜100および101〜最後までの断片が挙げられる。上記文脈に
おいて「約」は、特に示した範囲に対して、片側または両端のいくつか、5、4、
3、2、または1アミノ酸だけ大きくまたは小さくなっているものを含む。
【００４２】 好ましい断片としては、例えば、アミノ末端を含む一連の連続残基もしくはカ
ルボキシル末端を含む一連の連続残基の欠失、または一方がアミノ末端を含み他
方がカルボキシル末端を含む二つの一連の連続残基の欠失以外の、ヒトGPR14ポ
リペプチドのアミノ酸配列を含む末端切断ポリペプチドが挙げられる。また、構
造的または機能的性状により特徴づけられる断片も好ましい。該断片としては、
例えば、α-ヘリックスおよびα-ヘリックス形成領域、β-シートおよびβ-シー
ト形成領域、ターン（turn）およびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領
域、親水性領域、疎水性領域、α-両親媒性領域、β-両親媒性領域、フレキシブ
ル領域、表面形成領域、基質結合領域、高抗原性インデックス領域を含む断片な
どが挙げられる。生物学的に活性な断片は、受容体活性を媒介する断片であり、
類似の活性もしくは改良された活性を持つ断片、または望ましくない活性の低減
した断片が挙げられる。また、動物、特にヒト内で抗原性または免疫原性の断片
も含まれる。
【００４３】 従って、本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも84
.25％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその断片であって配列
番号２の対応する断片と84.25％同一であるものを含む。好ましくは、これらの
ポリペプチドはすべて、抗原活性などの受容体の生物学的活性を保持している。
このようなグループには、特定の配列および断片の変異体が含まれる。好ましい
変異体は、保存的なアミノ酸置換によって指示物と異なるものである。すなわち
、ある残基が似通った特性を有する別の残基と置換された変異体である。典型的
なこうした置換は、Ala, Val, Leu および Ileの間；Ser とThr の間；酸性残基
AspとGlu の間；Asn とGln の間；塩基性残基 LysとArg の間；または芳香族残
基 PheとTyr の間で起こる。特に、数個、５〜１０個、１〜５個、１〜３個、１
〜２個または１個のアミノ酸が任意の組合せで置換、欠失または付加されている
変異体が好適である。
【００４４】 本発明のヒトGPR14ポリペプチドは任意の適当な方法で製造することができる
。このようなポリペプチドには、単離された天然のポリペプチド、組換え的に生
産されたポリペプチド、合成的に製造されたポリペプチド、またはこれらの方法
の組合せにより製造されたポリペプチドが含まれる。こうしたポリペプチドを製
造するための手段は当業界でよく理解されている。
【００４５】 本発明のポリヌクレオチド 本発明の別の態様は、ヒトGPR14ポリペプチドをコードする単離されたポリヌ
クレオチドおよびそれに密接に関連するポリヌクレオチドに関する。
【００４６】 本発明のヒトGPR14は、ヒトGPR14をコードするcDNAの配列決定の結果が示すよ
うに、Gタンパク質結合受容体の他のタンパク質に構造的に関連する。該cDNA配
列は、390のアミノ酸からなるタンパク質をコードするオープンリーディングフ
レームを含む。図1のヒトGPR14（配列番号２）は、Rattus norvegicus GPR14オ
ーファン受容体と387アミノ酸残基において約84.25％同一（FASTAを使用）であ
る（Marchesら、Genomics 29(2):335-344,1995）。さらに、ヒトGPR14（配列番
号2）は、ヒトソマトスタチン-3受容体と331アミノ酸残基において31.7％同一で
ある（Y.Yamadaら、Mol. Endocrinol.6(12):2136-2142,1992）。図1のヒトGPR14
遺伝子（配列番号1）は、Rattus norvegicus GPR14オーファン受容体と1539bpヌ
クレオチド残基において約75.9％（blast使用）同一である（A.Marchesら、Geno
mics 29(2):335-344,1995）。さらに、ヒトGGPR14（配列番号１）は、Rattus no
rvegicus Ｇタンパク質共役受容体SENRと783bpにおいて79％同一である（M.Tal
ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 209(2):752-759 1995）。
【００４７】 ヒトGPR14をコードする本発明のポリヌクレオチドは、標準的なクローニング
およびスクリーニングにより、ヒト胎盤細胞中のmRNAから誘導されたcDNAライブ
ラリーから、発現配列タグ(ＥＳＴ)分析（Adams, M.D.ら, Science (1991) 252:
1651-1656; Adams, M.D.ら, Nature (1992) 355:632-634; Adams, M.D.ら, Natu
re (1995) 377 Supp:3-174）を用いて得ることができる。また、本発明のポリヌ
クレオチドはゲノムDNAライブラリーのような天然源から得ることができ、商業
的に入手可能な公知の技法を用いて合成することもできる。
【００４８】 従って、ヒトGPR14ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、図1のコー
ド配列（配列番号1）と全長にわたって同一でもよく、配列番号２のポリペプチ
ドをコードするこのヌクレオチド配列の縮重形でもよく、または配列番号２のポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列と高度の同一性を有するものでもよい
。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ヒトGPR14ポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列と、高度に同一、少なくとも75.9％同一であるか、図1に
示したヌクレオチドコード配列（配列番号１）と少なくとも75.9％同一であるか
、または配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なくとも
75.9％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【００４９】 本発明のポリヌクレオチドをヒトGPR14ポリペプチドの組換え体生産のために
用いる場合、そのポリヌクレオチドには、成熟ポリペプチドまたはその断片のコ
ード配列単独、他のコード配列（例えば、リーダーもしくは分泌配列、プレ−、
プロ−もしくはプレプロ−タンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコー
ドするもの）と同じリーディングフレーム内にある成熟ポリペプチドのコード配
列が含まれる。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコ
ードされ得る。本発明のこの態様の好ましい具体例として、マーカー配列は、ｐ
ＱＥベクター(Qiagen, Inc.)により提供されかつ Gentzら, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (1989) 86:821-824に記載されるような、ヘキサ−ヒスチジンペプチド
、またはＨＡタグである。また、このポリヌクレオチドは5'および3'非コード配
列、例えば、転写されるが翻訳されない配列、スプライシングおよびポリアデニ
ル化シグナル、リボソーム結合部位、およびmRNA安定化配列を含んでいてもよい
。
【００５０】 そのなかでも、特に好ましい本発明の実施形態は、図1（配列番号２）に示し
たアミノ酸配列を有するヒトGPR14ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
およびその変異体である。
【００５１】 更に好ましい実施形態は、図1（配列番号２）のヒトGPR14のアミノ酸配列にお
いて、いくつか、５〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、または１個のア
ミノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または付加されているアミノ酸配列を有
するヒトGPR14変異体をコードするポリヌクレオチドである。
【００５２】 本発明の更に好ましい実施形態は、図1（配列番号2）に示したアミノ酸配列を
有するヒトGPR14ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、その全長にわ
たって少なくとも75.9％同一のポリヌクレオチド、およびこのようなポリヌクレ
オチドに相補的なポリヌクレオチドである。この点に関しては、上記と同じポリ
ヌクレオチドとその全長にわたって少なくとも80％同一のポリヌクレオチドが特
に好ましく、また、少なくとも90％同一のものがとりわけ好ましい。さらに、少
なくとも97％同一のものが非常に好ましく、少なくとも98〜99％同一のものがさ
らに好ましく、少なくとも99％同一のものが最も好ましい。
【００５３】 本発明はさらに、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチ
ドに関する。この点に関して、本発明は特に、ストリンジェントな条件下で、本
明細書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書中で使用する用語「ストリンジェントな条件」は、配列間で少なく
とも95％および好ましくは少なくとも97％同一性があるときにのみハイブリダイ
ゼーションが起こる条件を意味する。
【００５４】 配列番号１に含まれるヌクレオチド配列と十分に同一である本発明のポリヌク
レオチドは、ヒトGPR14をコードする全長cDNAおよびゲノムクローンを単離する
ために、またヒトGPR14遺伝子に対して高い配列類似性を有する他の遺伝子のcDN
Aおよびゲノムクローンを単離するために、cDNAおよびゲノムDNA用のハイブリダ
イゼーションプローブとして用いることができる。このようなハイブリダイゼー
ション技術は当業者に公知である。一般的に、これらのヌクレオチド配列は基準
のヌクレオチド配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％同一である。
プローブはたいてい15個以上のヌクレオチドを含み、好ましくは30個以上を含み
、50個以上のヌクレオチドを有していてもよい。特に好ましいプローブは30〜50
個の範囲のヌクレオチドを有するものである。
【００５５】 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、動物およびヒトの疾患の治
療ならびに診断の発見のための研究用試薬および材料として使用し得る。
【００５６】 ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明の１以上のポリヌクレオチドを含有するベクター、およ
び本発明のベクターにより遺伝子操作された宿主細胞、および組換え法による本
発明ポリペプチドの生産にも関する。本発明のDNA構築物から誘導されたRNAを用
いてこの種のタンパク質を生産するために、無細胞翻訳系を使用することもでき
る。
【００５７】 組換え体生産に関しては、本発明のポリヌクレオチドの発現系またはその一部
を組み込むために宿主細胞を遺伝子操作する。宿主細胞へのポリヌクレオチドの
導入は、Davisら, Basic Methods in Molecular Biology (1986) および Sambro
okら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) などの多くの標準的な
実験室マニュアルに記載された方法により行うことができる。例えば、リン酸カ
ルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション
、トランスベクション(transvection)、スクレープローディング(scrape loadin
g)、弾丸導入(ballistic introduction)または感染などがある。
【００５８】 適当な宿主の代表的な例として、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフ
ィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵母、ア
スペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９）、動
物細胞（例：CHO、COSＳ、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK 293、Bowes メラノーマ
細胞）および植物細胞が挙げられる。
【００５９】 多種多様な発現系を使用することができる。こうした系として、とりわけ、染
色体、エピソームおよびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミド由来、バク
テリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入因子由来
、酵母染色体エレメント由来、ウイルス（例：バキュロウイルス、ＳＶ４０のよ
うなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮
性狂犬病ウイルス、レトロウイルス）由来のベクター、およびこれらの組合せに
由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバク
テリオファージの遺伝的要素に由来するものがある。これらの発現系は発現を起
こさせるだけでなく発現を調節する制御領域を含んでいてもよい。一般的に、宿
主内でのポリペプチドの産生のためにポリヌクレオチドを維持し、増やし、発現
することができる系またはベクターはどれも使用しうる。Sambrookら, Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual (前掲) に記載されるような、日常的に用いら
れる公知の技法のいずれかにより、適当なヌクレオチド配列を発現系に挿入する
ことができる。
【００６０】 翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または細胞外の環境
に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込むこと
ができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であっても、
異種シグナルであってもよい。
【００６１】 スクリーニングアッセイで使用するためヒトGPR14ポリペプチドを発現させよ
うとする場合、一般にそのポリペプチドを細胞の表面に産生させることが好適で
ある。その場合は、スクリーニングアッセイでの使用に先立って細胞を回収する
。ヒトGPR14ポリペプチドが培地に分泌される場合は、そのポリペプチドを回収
し精製するために培地を回収する。細胞内に産生される場合は、その細胞をまず
溶解し、その後にポリペプチドを回収する必要がある。
【００６２】 組換え細胞培養物からヒトGPR14ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエ
タノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホス
ホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよ
びレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いて回収し精製すること
ができる。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィーが精製に用いられる
。ポリペプチドが細胞内合成、単離および／または精製中に変性されるときは、
タンパク質を再生させるための公知の技法を用いて、活性のあるコンフォメーシ
ョンを復元することが可能である。
【００６３】 診断アッセイ 本発明はまた、診断薬としてのヒトGPR14ポリヌクレオチドの使用に関する。
機能障害と関連した、ヒトGPR14遺伝子の変異型の検出は、ヒトGPR14遺伝子の過
少発現、過剰発現または変化した発現により生ずる疾病またはその疾病への罹り
やすさの診断に追加しうる、またはその診断を下しうる診断用ツールを提供する
だろう。ヒトGPR14遺伝子に突然変異がある個体を、さまざまな技法によりDNAレ
ベルで見つけ出すことができる。
【００６４】 診断用の核酸は、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織の生検または剖
検材料由来の細胞から得ることができる。検出のためにゲノムDNAを直接使用し
てもよいし、分析前にPCRまたは他の増幅法を使ってゲノムDNAを酵素的に増幅し
てもよい。同様の方法でRNAまたはcDNAを使用することもできる。欠失および挿
入は、正常な遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化により検出でき
る。点突然変異は増幅DNAを標識ヒトGPR14ヌクレオチド配列とハイブリダイズさ
せることで同定できる。完全にマッチした配列とミスマッチの二重鎖とはRNアー
ゼ消化により、または融解温度の差異により区別できる。また、DNA配列の差異
は、変性剤を含むもしくは含まないゲルでのDNA断片の電気泳動の移動度の変化
により、または直接DNA塩基配列決定によっても検出できる（例えば、Myersら,
Science (1985) 230:1242 を参照のこと）。特定位置での配列変化はヌクレアー
ゼプロテクションアッセイ（例えば、RNアーゼおよびＳ１プロテクション）また
は化学的開裂法によっても確認できる（Cottonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1985) 85:4397-4401を参照のこと）。
【００６５】 該診断アッセイは、記載の方法によりヒトGPR14遺伝子内の突然変異の検出に
より、以下の疾患の診断または感受性の測定をするための方法を提供する。該疾
患とは、虚血性冠状動脈疾患（狭心症および心筋梗塞）、アテローム硬化症、代
謝病（例えば、糖尿病）、CHF/心筋機能不全、不整脈、再狭窄、高血圧、低血圧
、肺疾患（高血圧、COPD：慢性閉塞性肺疾患、喘息）、繊維性血管症（fibrotic
vasculorathies)（糖尿病、SLE： 全身性エリテマトーデス、AS、レーノー症候
群）、脳血管障害（例えば、出血性発作および虚血性発作）、神経性の炎症/片
頭痛、造血疾患、ARDS：成人呼吸促進症候群、癌、自己免疫疾患（例えば、HIV-
1および-2感染およびAIDS）、胃腸障害および尿生殖器障害（例えば、潰瘍）、
内分泌障害、繊維増殖性疾患（例えば、乾癬）、炎症疾患（例えば、RA、クロー
ン病、IBS)、良性前立腺肥大、腎不全および糸球体症、過度の血管収縮、心筋機
能不全および/または異常繊維増殖/炎症反応により特徴づけられる心臓血管疾患
のおよび非心臓血管疾患の両方の病状、精神病および神経系疾患（不安症、精神
分裂症、躁鬱病、せん妄、痴呆、重度の精神遅滞、パーキンソン病および運動障
害を含む）、細菌感染、真菌感染、原生生物感染およびウイルス感染、痛み、摂
食障害（肥満症、食欲不振、過食症など）、喘息、尿閉、骨粗鬆症、アレルギー
、ハンチントン病またはジル・ド・ラ・トゥーレット症候群である。
【００６６】 さらに、虚血性冠状動脈疾患（狭心症および心筋梗塞）、アテローム硬化症、
代謝病（例えば、糖尿病）、CHF/心筋機能不全、不整脈、再狭窄、高血圧、低血
圧、肺疾患（高血圧、COPD：慢性閉塞性肺疾患、喘息）、繊維性血管症（糖尿病
、SLE： 全身性エリテマトーデス、AS、レーノー症候群）、脳血管障害（例えば
、出血性発作および虚血性発作）、神経性の炎症/片頭痛、造血疾患、ARDS：成
人呼吸促進症候群、癌、自己免疫疾患（例えば、HIV-1および-2感染およびAIDS
）、胃腸障害および尿生殖器障害（例えば、潰瘍）、内分泌障害、繊維増殖性疾
患（例えば、乾癬）、炎症疾患（例えば、RA、クローン病、IBS)、良性前立腺肥
大、腎不全および糸球体症、過度の血管収縮、心筋機能不全および/または異常
繊維増殖/炎症反応により特徴づけられる心臓血管系および非心臓血管系の両方
の病状、精神病および神経系疾患（不安症、精神分裂症、躁鬱病、せん妄、痴呆
、重度の精神遅滞、パーキンソン病および運動障害を含む）、細菌感染、真菌感
染、原生生物感染およびウイルス感染、痛み、摂食障害（肥満症、食欲不振、過
食症など）、喘息、尿閉、骨粗鬆症、アレルギー、ハンチントン病またはジル・
ド・ラ・トゥーレット症候群は、被験者から得られたサンプルからヒトGPR14ポ
リペプチドまたはヒトGPR14mRNAのレベルの異常な低下または増加を測定するこ
とからなる方法により、診断を下すことができる。発現の低下または増加は、当
業界で公知のポリヌクレオチドの定量法、例えば、PCR、RT-PCR、RNアーゼプロ
テクション、ノーザンブロッティング、その他のハイブリダイゼーション法のい
ずれかによりRNAレベルで測定することができる。宿主から得られたサンプル中
のヒトGPR14のようなタンパク質のレベルを測定するために使用できるアッセイ
法は当業者によく知られている。こうしたアッセイ法として、ラジオイムノアッ
セイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイおよび
フローサイトメトリー分析などがある。
【００６７】 染色体アッセイ また、本発明のヌクレオチド配列は染色体の同定にも有用である。この配列は
個々のヒト染色体上の特定の位置を特異的にターゲッティングし、その特定位置
とハイブリダイズすることができる。本発明に従って関連配列の染色体地図を作
成することは、これらの配列と遺伝子関連疾患とを相関させるうえで重要な第一
段階である。ひとたび配列が正確な染色体位置にマップされたら、その染色体上
のその配列の物理的位置を遺伝地図データと相関させることができる。この種の
データは、例えば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (Johns Hopki
ns University Welch Medical Library からオンラインで入手可能) 中に見いだ
せる。その後、同一の染色体領域にマップされた遺伝子と疾患との関係を連鎖解
析（物理的に隣接した遺伝子の共遺伝）により確認する。
【００６８】 罹患個体と非罹患個体とのcDNAまたはゲノム配列の差異も調べることができる
。罹患個体の一部または全部に突然変異が観察されるが、どの正常個体にも観察
されない場合は、その突然変異が疾患の原因である可能性がある。
【００６９】 抗体 本発明のポリペプチド、その断片もしくは類似体、またはそれらを発現する細
胞は、ヒトGPR14ポリペプチドに免疫特異的な抗体を生産するための免疫原とし
ても使用することができる。「免疫特異的」とは、その抗体が従来技術における
他の関連ポリペプチドに対するその親和性よりも本発明のポリペプチドに対して
実質的に高い親和性を示すことを意味する。
【００７０】 ヒトGPR14ポリペプチドに対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物
（好ましくはヒト以外の動物）に該ポリペプチドまたはエピトープを含む断片、
類似体もしくは細胞を投与することにより得ることができる。モノクローナル抗
体の調製には、連続細胞系の培養物から抗体を産生させる任意の技法を用いるこ
とができる。例を挙げると、ハイブリドーマ法 (Kohler, G.およびMilstein, C.
, Nature (1975) 256:495-497)、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法 (
Kozborら, Immunology Today (1983) 4:72) およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法 (
Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp.77-96, Alan R. Liss
, Inc., 1985) などがある。
【００７１】 本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製
法（米国特許第4,946,778号）を適応させることができる。また、ヒト化抗体を
発現させるために、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物を含む他の生
物を利用することができる。
【００７２】 前記の抗体を用いて、そのポリペプチドを発現するクローンを単離・同定した
り、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもで
きる。
【００７３】 ヒトGPR14ポリペプチドに対する抗体は、とりわけ、以下の疾患の治療に使用
できる可能性がある。該疾患とは、虚血性冠状動脈疾患（狭心症および心筋梗塞
）、アテローム硬化症、代謝病（例えば、糖尿病）、CHF/心筋機能不全、不整脈
、再狭窄、高血圧、低血圧、肺疾患（高血圧、COPD：慢性閉塞性肺疾患、喘息）
、繊維性血管症（糖尿病、SLE： 全身性エリテマトーデス、AS、レーノー症候群
）、脳血管障害（例えば、出血性発作および虚血性発作）、神経性の炎症/片頭
痛、造血疾患、ARDS：成人呼吸促進症候群、癌、自己免疫疾患（例えば、HIV-1
および-2感染およびAIDS）、胃腸障害および尿生殖器障害（例えば、潰瘍）、内
分泌障害、繊維増殖性疾患（例えば、乾癬）、炎症疾患（例えば、RA、クローン
病、IBS)、良性前立腺肥大、腎不全および糸球体症、過度の血管収縮、心筋機能
不全および/または異常繊維増殖/炎症反応により特徴づけられる心臓血管系およ
び非心臓血管系の両方の病状、精神病および神経系疾患（不安症、精神分裂症、
躁鬱病、せん妄、痴呆、重度の精神遅滞、パーキンソン病および運動障害を含む
）、細菌感染、真菌感染、原生生物感染およびウイルス感染、痛み、摂食障害（
肥満症、食欲不振、過食症など）、喘息、尿閉、骨粗鬆症、アレルギー、ハンチ
ントン病またはジル・ド・ラ・トゥーレット症候群である。
【００７４】 ワクチン 本発明の更なる態様は哺乳動物において免疫学的応答を引き出す方法に関し、
この方法は、特に以下の疾患、虚血性冠状動脈疾患（狭心症および心筋梗塞）、
アテローム硬化症、代謝病（例えば、糖尿病）、CHF/心筋機能不全、不整脈、再
狭窄、高血圧、低血圧、肺疾患（高血圧、COPD：慢性閉塞性肺疾患、喘息）、繊
維性血管症（糖尿病、SLE： 全身性エリテマトーデス、AS、レーノー症候群）、
脳血管障害（例えば、出血性発作および虚血性発作）、神経性の炎症/片頭痛、
造血疾患、ARDS：成人呼吸促進症候群、癌、自己免疫疾患（例えば、HIV-1およ
び-2感染およびAIDS）、胃腸障害および尿生殖器障害（例えば、潰瘍）、内分泌
障害、繊維増殖性疾患（例えば、乾癬）、炎症疾患（例えば、RA、クローン病、
IBS)、良性前立腺肥大、腎不全および糸球体症、過度の血管収縮、心筋機能不全
および/または異常繊維増殖/炎症反応により特徴づけられる心臓血管系および非
心臓血管系の両方の病状、精神病および神経系疾患（不安症、精神分裂症、躁鬱
病、せん妄、痴呆、重度の精神遅滞、パーキンソン病および運動障害を含む）、
細菌感染、真菌感染、原生生物感染およびウイルス感染、痛み、摂食障害（肥満
症、食欲不振、過食症など）、喘息、尿閉、骨粗鬆症、アレルギー、ハンチント
ン病またはジル・ド・ラ・トゥーレット症候群から該動物を防御するための抗体
および／またはＴ細胞免疫応答を生ずるのに十分なヒトGPR14ポリペプチドまた
はその断片を哺乳動物に接種することを含んでなる。本発明のさらに別の態様は
、哺乳動物を疾患から防御する抗体を産生させるような免疫学的応答を引き出す
ために、in vivoでヒトGPR14ポリペプチドの発現を指令するベクターを介してヒ
トGPR14遺伝子を供給することを含んでなる、哺乳動物において免疫学的応答を
引き出す方法に関する。
【００７５】 本発明の更なる態様は、哺乳動物宿主に導入したとき、その哺乳動物において
ヒトGPR14ポリペプチドに対する免疫学的応答を引き出す免疫学的／ワクチン製
剤（組成物）に関し、この組成物はヒトGPR14ポリペプチドまたはヒトGPR14遺伝
子を含有する。ワクチン製剤は適当な担体をさらに含んでいてもよい。ヒトGPR1
4ポリペプチドは胃の中で分解される可能性があるので、非経口的に（例えば、
皮下、筋肉内、静脈内または皮内注射により）投与することが好ましい。非経口
投与に適した製剤としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤およびこの製剤を受容
者の血液と等張にする溶質を含みうる水性および非水性の無菌注射液、並びに懸
濁化剤または増粘剤を含みうる水性および非水性の無菌懸濁液がある。こうした
製剤は１回量容器または数回量容器（例えば、密閉アンプルおよびバイアル）で
提供することができ、また、使用直前に無菌の液状担体を添加するだけでよい凍
結乾燥状態で保管することもできる。ワクチン製剤はこの製剤の免疫原性を増強
するためのアジュバント系、例えば水中油型のアジュバント系や当業界で公知の
他のアジュバント系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの比活性により変化
するが、ルーチンな実験操作により簡単に決定できる。
【００７６】 スクリーニングアッセイ ヒトGPR14ポリペプチド（本発明の受容体）は、本発明の受容体ポリペプチド
に結合しそれを活性化する（アゴニスト）かまたは活性化を阻害する（アンタゴ
ニスト）化合物をスクリーニングする方法において使用し得る。従って、本発明
のポリペプチドを使用して、例えば細胞、細胞を含まない調製物、化学的ライブ
ラリー、および天然産物混合物内の小分子基質とリガンドの結合を評価し得る。
これらの基質およびリガンドは、天然の基質およびリガンドでもよいし、これら
の構造的もしくは機能的擬似物でもよい（Coliganら、Current Protocols in Im
munology 1(2)：Chapter 5（1991）参照）。
【００７７】 通常、このようなスクリーニング法は、その表面に本発明の受容体ポリペプチ
ドを発現する適切な細胞を提供することを含む。このような細胞としては、哺乳
動物、酵母、ショウジョウバエまたは大腸菌由来の細胞が挙げられる。特に、細
胞をトランスフェクトしてヒトGPR14ポリペプチドを発現させるために、本発明
の受容体をコードするポリヌクレオチドを使用する。次に発現した受容体を試験
化合物と接触させて、結合、機能応答の促進または阻害を観察する。
【００７８】 あるスクリーニング法では、ヒトGPR14ポリペプチドを発現するようにトラン
スフェクトしたメラニン細胞の使用を含む。このようなスクリーニング技術は19
92年2月6日公開のPCT WO 92/01810に記載されている。このようなアッセイを使
用して、受容体をコードするメラニン細胞と、ヒトまたは魚類ウロテンシンIIの
ような受容体リガンドおよびスクリーニングしようとする化合物の両方とを接触
させることにより、本発明の受容体の活性化を阻害する化合物をスクリーニング
できる。リガンドにより生成されるシグナルの阻害は、化合物が該受容体の潜在
的なアンタゴニストであること、すなわち該受容体の活性化を阻害することを示
す。
【００７９】 この技術を用いて、このような細胞を、スクリーニングしようとする化合物と
接触させ、この化合物がシグナルを生成するかどうか、すなわち受容体を活性化
するかどうかを決定することにより、本発明の受容体を活性化する化合物をスク
リーニングすることもできる。
【００８０】 他のスクリーニング技術は、受容体の活性化により引き起こされる細胞外のpH
変化を測定する系における、ヒトGPR14ポリペプチドを発現する細胞（例えば、
トランスフェクトしたCHO細胞）の使用を含む。この技術では、化合物を本発明
の受容体ポリペプチドを発現する細胞と接触させ得る。次に第2メッセンジャー
の応答、例えばシグナル伝達またはpH変化を測定し、その候補化合物が受容体を
活性化するか阻害するかを判定する。
【００８１】 別のスクリーニング技術は、ヒトGPR14ポリペプチドを発現させることを含む
。この場合、該受容体はホスホリパーゼCまたはDに結合している。このような細
胞の代表例としては、限定するものではないが、内皮細胞、平滑筋細胞、および
胚性腎細胞が挙げられる。該スクリーニングは、受容体の活性化または受容体の
活性化の阻害をホスホリパーゼ第2シグナルから検出することによって上述した
ように実施し得る。
【００８２】 別の方法は、アンタゴニストであり、それゆえに本発明の受容体ポリペプチド
の活性化を阻害する化合物のスクリーニングを含む。該スクリーニングは、標識
リガンド（例えば、魚類またはヒトウロテンシンII）の、その表面に受容体を有
する細胞、または受容体を含む細胞膜への結合の阻害を測定することによって行
う。このような方法は、細胞がその表面に該受容体を発現するように、真核細胞
をヒトGPR14ポリペプチドをコードするDNAでトランスフェクトすることを含む。
次に該細胞を、例えば、魚類またはヒトウロテンシンIIのようなリガンドの標識
形態の存在下で、潜在的なアンタゴニストと接触させる。該リガンドは、例えば
放射能により標識することができる。該受容体に結合した標識リガンドの量は、
例えば、トランスフェクトした細胞またはこれらの細胞由来の膜からの放射能活
性を計測することにより測定する。化合物が受容体に結合すると、受容体への標
識リガンドの結合が阻害されるが、これは受容体に結合する標識リガンドの減少
によって確認できる。この方法は結合アッセイと呼ばれている。
【００８３】 別のこのようなスクリーニング法は、本発明の受容体を発現するようにトラン
スフェクトした哺乳動物細胞の使用を含む。該細胞に、カルシウムに結合すると
蛍光シグナルを発する指示色素をロードし、該細胞を試験基質および受容体アゴ
ニスト（例えば魚類またはヒトウロテンシンII）と接触させる。どのような蛍光
シグナルも、例えば蛍光分光光度計または蛍光イメージングプレートリーダー（
Fluorescent Imaging Plate Reader: FLIPR)を用いて、一定期間にわたって測定
する。リガンドにより生成した蛍光シグナルパターンの変化は、化合物が該受容
体の潜在的なアンタゴニスト（またはアゴニスト）であることを示す。
【００８４】 別のこのようなスクリーニング法は、本発明の受容体を発現するようにトラン
スフェクトされ、さらに該受容体の活性化に関連するリポーター遺伝子構築物（
例えば、適当なプロモーター下流のルシフェラーゼまたはβ-ガラクトシダーゼ
）によってもトランスフェクトされた哺乳動物細胞の使用を含む。該細胞を試験
化合物および受容体アゴニスト（例えば魚類またはヒトウロテンシンII）と接触
させ、リポーター遺伝子によって生成されたシグナルを一定時間経過後に測定す
る。該シグナルは照度計、分光光度計、蛍光光度計または使用する特定のリポー
ター構築物に適したその他前記のような計器を用いて測定できる。リガンドによ
って生じたシグナルの阻害は、化合物が受容体の潜在的なアンタゴニストである
ことを示す。
【００８５】 別のこのようなアンタゴニストまたはアゴニストのスクリーニング技術は、ヒ
トGPR14ポリペプチドをコードするRNAをツメガエル卵母細胞に導入して、一時的
にまたは安定して受容体を発現させることを含む。次に該受容体卵母細胞を受容
体リガンド（例えばヒトまたは魚類ウロテンシンII）およびスクリーニングすべ
き化合物と接触させる。次に、該受容体の阻害または活性化を、例えばcAMP、カ
ルシウム、プロトンまたはその他のイオンなどのシグナルを検出することによっ
て決定する。
【００８６】 他の方法は、ヒトGPR14ポリペプチドにより媒介されるｃAMPおよび／またはア
デニル酸シクラーゼの蓄積または減少の阻害または刺激を測定することにより、
ヒトGPR14ポリペプチドインヒビターをスクリーニングするものである。こうし
た方法では、ヒトGPR14ポリペプチドを用いて真核細胞を一時的にまたは安定に
トランスフェクトして、その細胞表面に受容体を発現させることを含む。次いで
この細胞をヒトGPR14ポリペプチドリガンド（例えば魚類またはヒトウロテンシ
ンII）の存在下で候補アンタゴニストにさらす。次に、ラジオイムノアッセイま
たはタンパク質結合アッセイ（例えば、フラッシュプレート（Flashplate）また
はシンチレーション近接アッセイを用いる）によりcAMPの蓄積量を測定する。cA
MPの活性レベルの変化も、破砕細胞調製物内の酵素、アデニル酸シクラーゼの活
性を直接測定することによって測定することができる。候補アンタゴニストが該
受容体に結合し、これによりヒトGPR14ポリペプチドの結合を阻害する場合は、
ヒトGPR14ポリペプチドにより媒介されるcAMPまたはアデニル酸シクラーゼの活
性レベルは低下するかまたは増加するだろう。
【００８７】 アゴニストおよびアンタゴニストのための他のスクリーニング法は、酵母、Sa
ccharomyces cerevisiae内の内因性フェロモン応答経路に依存する。酵母の雌雄
異株は、有糸分裂的に安定な２つのハプロイド交配型、MATaおよびMATaとして存
在し得る。それぞれの細胞型は、相対する交配型の細胞上のＧタンパク質共役受
容体に結合する小ペプチドホルモンを分泌し、細胞融合の前兆としてのG1期の停
止に導くMAPキナーゼカスケードを開始させる。フェロモン応答経路における特
定の遺伝子の遺伝的改変は、フェロモンへの正常な応答を変化させることがあり
、内因性フェロモン受容体を欠いた酵母細胞内での、ヒトＧタンパク質共役受容
体とヒト化Ｇタンパク質サブユニットの異種発現および共役は、下流のシグナル
伝達経路およびリポーター遺伝子にリンクされ得る（米国特許第5,063,154号；
第5,482,835号；第5,691,188号参照）。このような遺伝的改変には、限定するも
のではないが、(i)内因性Ｇタンパク質共役フェロモン受容体をコードするSTE2
またはSTE3遺伝子の欠失、(ii)通常はサイクリン依存性キナーゼに結合して細胞
周期停止に至らせるタンパク質をコードするFAR1遺伝子の欠失、(iii)FUS1遺伝
子プロモーターに融合されたリポーター遺伝子の構築（FUS1は、細胞融合に必要
な膜固定糖タンパク質をコードする）、が含まれる。下流リポーター遺伝子は、
使用する特定のリポーター構築物に応じて、陽性増殖選択（positive growth se
lection)（例えば、FUS1-HIS3リポーターを用いたヒスチジン原栄養性）、また
は比色読取り、蛍光読取り、もしくは分光光度読取り（例えば、FUS1-LacZリポ
ーターを用いたβ-ガラクトシダーゼの誘導）のいずれかを可能にする。
【００８８】 酵母細胞をさらに遺伝子操作して、ランダムペプチドライブラリーからの小ペ
プチドを発現および分泌させることができる。該小ペプチドのなかには、異種発
現されたヒト（または哺乳動物）Ｇタンパク質共役受容体の自己分泌活性化を可
能にするものがある（Broach,J.R.およびThorner.J. Nature 384: 14-16, 1996;
Manfrediら、Mol. Cell. Biol. 16: 4700-4709, 1996)。これは、特性決定され
た受容体またはオーファン受容体を活性化する代用ペプチドアゴニストの迅速か
つ直接的増殖選択（例えば、FUS1-HIS3リポーターを使用）をもたらす。あるい
は、リポーター遺伝子リードアウト（例えば、FUSI-LacZ)に結合されたヒト（ま
たは哺乳動物）Ｇタンパク質共役受容体を機能的に発現する酵母細胞を、既知の
リガンド、生物学的抽出物の画分および天然または代用のリガンドのいずれかの
ための化学的化合物のライブラリーを高効率にスクリーニングするためのプラッ
トフォームとして使用することができる。十分な効力を有する機能的アゴニスト
（天然か代用物）は、Ｇタンパク質共役受容体アンタゴニストを同定するための
酵母細胞に基づくアッセイにおいて、スクリーニングツールとして使用すること
ができる。この目的のために、この酵母系は、使用が容易なこと、およびしばし
ばアゴニストまたはアンタゴニストの同定能力の妨害となるヌル受容体バックグ
ラウンド（内因性Ｇタンパク質共役受容体を欠くこと）のために、哺乳動物発現
系に比して利点を提供する。
【００８９】 本発明はまた、ヒトGPR14ポリペプチドに結合できるかわからないリガンドが
この受容体に結合できるかどうかを判定するための方法をも提供する。該方法は
、候補リガンドのヒトGPR14ポリペプチドへの結合を可能とする条件下で、ヒトG
PR14ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を、例えば魚類またはヒトウロテンシ
ンIIのようなリガンドと接触させ、受容体に結合する候補リガンドの存在を検出
し、そして該リガンドがヒトGPR14ポリペプチドに結合するかどうかを判定する
ことからなる。アゴニストおよび/またはアンタゴニストを決定するための上記
の系は、受容体に結合するリガンドを決定するためにも使用することができる。
【００９０】 本発明者らはさらに、魚類またはヒトウロテンシンIIがラットGPR14受容体に
同等によく結合することを見出した。従って、上記のアッセイ技術はすべて、魚
類またはヒトウロテンシンIIをリガンドとして使用することにより、ラットGPR1
4受容体のアゴニストおよびアンタゴニストを見つけ出すために使用することが
できる。さらに、このように同定されたアゴニストおよびアンタゴニストは、ヒ
トGPR14ポリペプチドにとってのアゴニストおよびアンタゴニストでもあると考
えられる。本発明のさらなる態様は、好ましくは魚類またはヒトウロテンシンII
の存在下で、ラットGPR14のアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニング
することを含む、ヒトGPR14ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの
スクリーニング法に関する。
【００９１】 潜在的なヒトGPR14ポリペプチドアンタゴニストの具体例には、抗体、ある場
合にはオリゴヌクレオチドが含まれ、これらは受容体に結合するが第2メッセン
ジャー応答を引き出さないため、受容体の活性が阻害される。
【００９２】 潜在的なアンタゴニストとしては、ヒトGPR14ポリペプチドのリガンドと密接
に関連するタンパク質、すなわちリガンドの断片も含むが、生物学的機能が喪失
しており、ヒトGPR14ポリペプチドに結合しても何の応答も引き出さない。
【００９３】 かくして、他の態様において、本発明は、ヒトGPR14ポリペプチドのアゴニス
ト、アンタゴニストおよびリガンドを同定するためのスクリーニングキットに関
し、このキットは、 (a)ラットGPR14またはヒトGPR14ポリペプチドで、好ましくは配列番号２のもの
、および好ましくは標識もしくは非標識の魚類またはヒトウロテンシンIIをさら
に含むもの、 (b)ラットGPR14またはヒトGPR14ポリペプチド、好ましくは配列番号２のものを
発現している組換え細胞、および好ましくは標識もしくは非標識の魚類またはヒ
トウロテンシンIIをさらに含むもの、または (c)ラットGPR14またはヒトGPR14ポリペプチド、好ましくは配列番号２のものを
発現している細胞膜、および好ましくは標識もしくは非標識の魚類またはヒトウ
ロテンシンIIをさらに含むもの、 を含んでなる。
【００９４】 このようなキットにおいて、(a)、(b)または (c)が実質的な構成成分からなる
ことが理解されよう。
【００９５】 潜在的なアンタゴニストとしては、アンチセンス技術を使用することによって
作製されるアンチセンス構築物も含む。アンチセンス技術を用いて、すなわち3
重らせん形成またはアンチセンスDNAもしくはアンチセンスRNAによって遺伝子発
現を制御することができる。これらの方法は両方とも、ポリヌクレオチドのDNA
またはRNAへの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド配列の5'コード部位を用いて、長さが10〜40塩基対のアンチセ
ンスRNAオリゴヌクレオチドを設計する。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関連
する遺伝子領域に相補的になるように設計する（3重鎖については、 Leeら, Nuc
l. Acids Res 6:3073 (1979); Cooneyら, Science 241:456 (1988); Dervanら,
Science 251:1360 (1991) を参照のこと）。そうしてヒトGPR14ポリペプチドの
転写および産生を阻害する。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、in vivoで
mRNAにハイブリダイズし、mRNA分子からヒトGPR14ポリペプチドへの翻訳をブロ
ックする（アンチセンスについては、Okano, J. Neurochem., 56：560 （1991）
; OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION (遺伝
子発現のアンチセンスインヒビターとしてのオリゴデオキシヌクレオチド), CRC
Press, Boca Raton, FL (1988)を参照のこと）。アンチセンスRNAまたはDNAをi
n vivoで発現させてヒトGPR14ポリペプチドの産生を阻害するように上記のオリ
ゴヌクレオチドを細胞内に送達することもできる。
【００９６】 他の潜在的なアンタゴニストはヒトGPR14ポリペプチドに結合する小分子であ
り、この小分子はヒトGPR14ポリペプチドをリガンドへ接近できないようにする
ため、通常の生物学的活性が阻害される。小分子の具体例としては、限定するも
のではないが、小ペプチドまたはペプチド様分子がある。
【００９７】 潜在的なアンタゴニストとして、ヒトGPR14ポリペプチドの可溶形態、例えば
ポリペプチドの断片も挙げられる。これは、リガンドに結合し、リガンドの膜結
合ヒトGPR14ポリペプチドとの相互作用を阻害する。
【００９８】 ヒトGPR14タンパク質は、哺乳動物宿主内に偏在し、多くの病理を含む多くの
生物学的機能に関与する。従って、一方でヒトGPR14を刺激し、他方でヒトGPR14
の機能を阻害できる化合物および薬剤の探索が望まれている。通常アゴニストは
、以下のような症状のための治療および予防目的で使用する。該症状とは例えば
、虚血性冠状動脈疾患（狭心症および心筋梗塞）、アテローム硬化症、代謝病（
例えば、糖尿病）、CHF/心筋機能不全、不整脈、再狭窄、高血圧、低血圧、肺疾
患（高血圧、COPD：慢性閉塞性肺疾患、喘息）、繊維性血管症（fibrotic vascu
lopathies)（糖尿病、SLE： 全身性エリテマトーデス、AS、レーノー症候群）、
脳血管障害（例えば、出血性発作および虚血性発作）、神経性の炎症/片頭痛、
造血疾患、ARDS：成人呼吸促進症候群、癌、自己免疫疾患（例えば、HIV-1およ
び-2感染およびAIDS）、胃腸障害および尿生殖器障害（例えば、潰瘍）、内分泌
障害、繊維増殖性疾患（例えば、乾癬）、炎症疾患（例えば、RA、クローン病、
IBS)、良性前立腺肥大、腎不全および糸球体症、過度の血管収縮、心筋機能不全
および/または異常繊維増殖/炎症反応により特徴づけられる心臓血管系および非
心臓血管系の両方の病状、精神病および神経系疾患（不安症、精神分裂症、躁鬱
病、せん妄、痴呆、重度の精神遅滞、パーキンソン病および運動障害を含む）、
細菌感染、真菌感染、原生生物感染およびウイルス感染、痛み、摂食障害（肥満
症、食欲不振、過食症など）、喘息、尿閉、骨粗鬆症、アレルギー、ハンチント
ン病またはジル・ド・ラ・トゥーレット症候群などである。アンタゴニストは以
下のような症状のための様々な治療および予防目的に使用することができる。該
症状とは例えば、虚血性冠状動脈疾患（狭心症および心筋梗塞）、アテローム硬
化症、代謝病（例えば、糖尿病）、CHF/心筋機能不全、不整脈、再狭窄、高血圧
、低血圧、肺疾患（高血圧、COPD：慢性閉塞性肺疾患、喘息）、繊維性血管症（
糖尿病、SLE： 全身性エリテマトーデス、AS、レーノー症候群）、脳血管障害（
例えば、出血性発作および虚血性発作）、神経性の炎症/片頭痛、造血疾患、ARD
S：成人呼吸促進症候群、癌、自己免疫疾患（例えば、HIV-1および-2感染および
AIDS）、胃腸障害および尿生殖器障害（例えば、潰瘍）、内分泌障害、繊維増殖
性疾患（例えば、乾癬）、炎症疾患（例えば、RA、クローン病、IBS)、良性前立
腺肥大、腎不全および糸球体症、過度の血管収縮、心筋機能不全および/または
異常繊維増殖/炎症反応により特徴づけられる心臓血管系および非心臓血管系の
両方の病状、精神病および神経系疾患（不安症、精神分裂症、躁鬱病、せん妄、
痴呆、重度の精神遅滞、パーキンソン病および運動障害を含む）、細菌感染、真
菌感染、原生生物感染およびウイルス感染、痛み、摂食障害（肥満症、食欲不振
、過食症など）、喘息、尿閉、骨粗鬆症、アレルギー、ハンチントン病またはジ
ル・ド・ラ・トゥーレット症候群などである。
【００９９】 予防的および治療的方法 本発明は、ヒトGPR14活性の過剰量および不足量の両方に関連する異常な症状
の治療方法を提供する。
【０１００】 ヒトGPR14の活性が過剰である場合は、いくつかのアプローチが利用可能であ
る。一つのアプローチは、リガンドのヒトGPR14への結合をブロックすることに
より、または第２のシグナルを抑制することで異常な状態を軽減することにより
、活性化を抑制するのに有効な量で、上記のインヒビター化合物（アンタゴニス
ト）を製剤学上許容される担体とともに患者に投与することを含んでなる。
【０１０１】 もう一つのアプローチでは、内因性のヒトGPR14との競合状態でリガンドと結
合する能力がまだある可溶性形態のヒトGPR14ポリペプチドを投与することがで
きる。このような競合物質の典型的な実施形態は、ヒトGPR14ポリペプチドの断
片である。
【０１０２】 さらに別のアプローチでは、発現阻止法を使って内因性ヒトGPR14をコードす
る遺伝子の発現を抑制することができる。こうした公知技術は、体内で産生され
るか別個に投与されるアンチセンス配列の使用を必要とする（例えば、Oligodeo xynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (遺伝子発現のア
ンチセンスインヒビターとしてのオリゴデオキシヌクレオチド), CRC Press, Bo
ca Raton, FL (1988) 中のO'Connor, J. Neurochem (1991) 56:560を参照のこと
）。あるいはまた、この遺伝子と共に三重らせんを形成するオリゴヌクレオチド
を供給することもできる（例えば、Leeら, Nucleic Acids Res (1979) 6:3073;
Cooneyら, Science (1988) 241:456; Dervanら, Science (1991) 251:1360 を参
照のこと）。これらのオリゴマーはそれ自体を投与することもできるし、関連オ
リゴマーをin vivo で発現させることもできる。
【０１０３】 ヒトGPR14およびその活性の過少発現に関係した異常な状態を治療する場合も
、いくつかのアプローチを取ることができる。一つのアプローチは、治療に有効
な量のヒトGPR14を活性化する化合物（すなわち、前記アゴニスト）を製剤学上
許容される担体とともに患者に投与して、異常な状態を緩和することを含んでな
る。別法として、患者の関連細胞においてヒトGPR14を内因的に産生させるため
に遺伝子治療を用いることができる。例えば、上で述べたような複製欠損レトロ
ウイルスベクターによる発現のために本発明のポリヌクレオチドを遺伝子操作す
る。次にレトロウイルス発現構築物を単離し、本発明のポリペプチドをコードす
るRNAを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入されたパッケー
ジング細胞に導入する。その結果、パッケージング細胞は対象の遺伝子を含有す
る感染性のウイルス粒子を産生するようになる。in vivo 細胞操作およびin viv
o ポリペプチド発現のために、これらのプロデューサー細胞を患者に投与する。
遺伝子治療の概論に関しては、Human Molecular Genetics, T Strachan and A P
Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996)中のChapter 20, Gene Therapy
and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches(およびその中の
引用文献) を参照のこと。
【０１０４】 製剤および投与 可溶形態のヒトGPR14ポリペプチド、およびアゴニストペプチドおよびアンタ
ゴニストペプチドまたは小分子などのペプチドを、適した製薬上の担体と組合せ
て製剤化できる。このような製剤は、治療上有効な量のポリペプチドまたは化合
物、および製薬上許容される担体または賦形剤を含む。このような担体として、
限定するものではないが、食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、
エタノール、およびこれらの組み合わせがある。製剤は投薬経路に適合させるべ
きであり、当技術分野で公知である。本発明はさらに、上記の本発明の組成物の
成分を１種以上充填した、容器を１個以上含んでなる医薬パックおよびキットに
関する。
【０１０５】 本発明のポリペプチドおよび他の化合物は単独で使用しても、他の化合物、例
えば治療用化合物と一緒に使用してもよい。
【０１０６】 該医薬組成物の全身投与に適した形態は、注入（注射）、典型的には静注であ
る。皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注入経路も使用できる。全身投与の
別の手段には、胆汁酸塩、フシジン酸、その他の界面活性剤などの浸透剤を用い
た経粘膜および経皮投与がある。さらに、腸溶剤またはカプセル剤として適切に
製剤化し得るのであれば、経口投与も可能である。これらの化合物を軟膏、ペー
スト、ゲルなどの剤形で局所に投与しても、かつ／または局在化させてもよい。
【０１０７】 必要な投与量範囲は、ペプチドの選択、投与経路、製剤の性質、患者の状態、
そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投与量は患者の体重１kgあたり
0.1〜100μgの範囲である。入手可能な化合物が多様であること、投与経路の効
率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測
される。例えば、経口投与は静注による投与よりも高い投与量を必要とすると予
想されよう。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているよう
な、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。
【０１０８】 治療に用いるポリペプチドは、上述したような「遺伝子治療」と称する治療法
において、患者の体内で産生させることもできる。例えば、患者由来の細胞を、
ポリペプチドをコードするDNAまたはRNAのようなポリヌクレオチドにより、例え
ばレトロウイルスプラスミドベクターを用いて、ex vivo で遺伝子工学的に操作
する。その後、これらの細胞を患者に導入する。
【０１０９】 実施例 以下の実施例は、特に詳細に記載した部分を除いて、当業者に公知かつ慣用の
標準的な技術を用いて実施した。実施例は例示であって、本発明を限定するもの
ではない。
【０１１０】 実施例1 Rattus norvegicusオーファン受容体のコード領域全体に対応する1.2ｋbのPCR
断片（GPR14, A. Marcheseら、Genomics, 29(2)：335-44, 1995）をプローブと
して用いてヒトゲノム胎盤ライブラリー（Strategene, LaJolla CA, カタログ#9
46206)由来の0.75M プラーク（plaque)全体をスクリーニングした。ゲノムライ
ブラリーのスクリーニング法は、Elginらが記載している（Strategies 4：8-9,
1991）。該プローブを、ランダムプライム標識キット（Random Primed Labeling
Kit; Boheringer Manheim, Germany, カタログ#1585584)を用いてα-32Pで標識
し、Sephadex G-50カラム（Pharmacia Biotech. カタログ#17-0855-02)を通して
精製した。ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、J. Sambrook, E.F.
FritchおよびT. Maniatis (1989) A Laboratory Manual, 2nd Ed. Vol. 1 pp. 2
.69-2.81 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に
従った。上記のスクリーニングによって得られた1つの陽性ファージクローンを
さらに精製した。消化したファージDNAに対してサザン分析を実施したところ、9
kb Sac I断片がこのクローンにハイブリダイズした。この断片をpBlueScript KS
ベクターにサブクローン化し、EcoRIでさらに消化し、サザン分析した。上記の
ラットGPR14プローブにハイブリダイズした、より小さい5kb断片を、配列決定の
ためにpBlueScriptにサブクローン化し、自動シーケンサーで配列を決定した。
全部で2126bpを配列決定した。これは、390残基のペプチドをコードするオープ
ンリーディングフレームを含む。この配列は、配列比較およびGenbank ヌクレオ
チドデータベースに対するfasta分析によって示されるように、ラットGPR14と高
度に相同であった。
【０１１１】 実施例２：哺乳動物細胞における発現 本発明の受容体を、ヒト胚腎293（HEK293）細胞または付着性dhfr CHO細胞の
いずれかにおいて発現させた。受容体の発現を最大にするために、ｐCDNまたは
ｐCDNA3ベクターへ挿入する前に、一般的には全ての５'および３'非翻訳領域（U
TRs）を受容体cDNAから取り除いた。これらの細胞をリポフェクチンを用いて個
々の受容体cDNAによりトランスフェクトし、400 mg／mlのＧ418の存在下で選択
した。3週間の選択後に、個々のクローンを拾い、さらなる分析のために増殖さ
せた。ベクターのみでトランスフェクトしたHEK293またはCHO細胞を陰性対照と
して使用した。個々の受容体を安定して発現している細胞系を単離するために、
一般的に約24個のクローンを選択し、ノーザンブロット分析により分析した。受
容体mRNAは、通常、分析したＧ418耐性クローンの約50％において検出可能であ
った。
【０１１２】 実施例３：結合アッセイおよび機能アッセイ用のリガンドバンク(bank) 200を越える推定上の受容体リガンドのバンクがスクリーニングのために集成
された。このバンクには以下のものが含まれる。すなわち、ヒトの７回膜貫通(7
TM)受容体を介して作用することが知られている伝達物質、ホルモンおよびケモ
カイン；ヒト7TM受容体の推定上のアゴニストでありうる、天然に存在する化合
物；非哺乳動物の生理活性ペプチド(哺乳動物の対応物は未だ同定されていない)
；および天然には見出せないが未知の天然リガンドと共に７TM受容体を活性化す
る化合物である。このバンクは結合アッセイと機能(すなわち、カルシウム、cAM
P、ミクロフィジオメーター( microphysiometer )、卵母細胞電気生理学など、
以下を参照)アッセイの両方を用いて、既知のリガンドに対する該受容体を最初
にスクリーニングするために使用された。
【０１１３】 実施例４：リガンド結合アッセイ リガンド結合アッセイは受容体薬理学をつきとめるための直接的な方法を提供
し、また高処理量方式にも適用が可能である。受容体の精製リガンドを結合実験
のために高い比活性( 50−2000 Ci／mmol )で放射性標識した。次に、放射性標
識化のプロセスがその受容体に対するリガンドの活性を低下させないことを確か
めた。緩衝液、イオン、pHおよびヌクレオチドのような他のモジュレーターにつ
いてのアッセイ条件を最適化し、膜および全細胞の両受容体源についての実施可
能な生じうるシグナル対ノイズ比を確立した。これらのアッセイのために、特異
的受容体結合を、全結合放射能から、過剰の未標識競合リガンドの存在下で測定
した放射能を差し引いた値として定義した。可能であれば、２以上の競合リガン
ドを用いて残留する非特異的な結合を確定する。
【０１１４】 実施例５：アフリカツメガエル卵母細胞における機能アッセイ 本発明の受容体cDNAをコードする線状化プラスミドの鋳型からのキャップした
RNA転写物を、標準的な手法に従い、in vitroでRNAポリメラーゼを使用して合成
した。in vitroでの転写物を最終濃度0.2 mg／mlで水中に懸濁した。卵巣葉(ova
rian lobes)を成熟雌カエルから取り出し、ステージVの脱濾胞化卵母細胞を得て
、RNA転写物(10ng／卵母細胞)を微量注入装置を用いて50nlで単回注入した。２
つの電極電位クランプを用いて、アゴニストへの暴露に応答した個々のアフリカ
ツメガエルの卵母細胞からの電流を測定した。室温でCa2+を含まないバース(Bar
th's)培地中で記録を行なった。このアフリカツメガエル系を使用して、活性化
用リガンドについての既知のリガンドおよび組織／細胞抽出物をスクリーニング
することができる。
【０１１５】 実施例６：ミクロフィジオメトリックアッセイ 多様な第二メッセンジャー系の活性化により、細胞から少量の酸が放出される
。この酸は主として細胞内のシグナル伝達プロセスを活気づけるために必要な代
謝活性が増強した結果として産出される。この細胞を取り巻く培地におけるｐＨ
の変化は非常に小さいが、サイトセンサー( CYTOSENSOR )ミクロフィジオメータ
ー（ Mole cular Devices Ltd., Menlo Park,CA ）により検出できる。したがっ
て、このサイトセンサーは本発明のＧタンパク質共役受容体のような、細胞内シ
グナル伝達経路を利用するエネルギーに共役する受容体の活性化を検出すること
ができる。
【０１１６】 実施例７：抽出物／細胞上清スクリーニング 多くの哺乳動物受容体が存在するが、今のところ同一動物種(cognate)の活性
化用リガンド(アゴニスト)は見つかっていない。したがって、これらの受容体を
活性化するリガンドは、今日までに同定されたリガンドバンクには含まれていな
い可能性がある。よって、本発明の７TM受容体もまた、天然のリガンドを同定す
るために組織抽出物に対して機能的に(カルシウム、cAMP、ミクロフィジオメー
ター、卵母細胞電気生理学などの機能スクリーンを使用して)スクリーニングさ
れた。陽性の機能的な応答を示す抽出物を、活性化用リガンドが単離され同定さ
れるまで順次サブ分画することができる。
【０１１７】 実施例８：カルシウムおよびcAMP機能アッセイ HEK293細胞で発現された7TM受容体は、ＰＬＣおよびカルシウムの動員活性化
および／またはcAMPの刺激または阻害と機能的に共役することが示された。受容
体トランスフェクト細胞またはベクター対照細胞におけるHEK293細胞中の基礎カ
ルシウムレベルは、正常な100nM〜200nMの範囲で観察された。組換え受容体を発
現しているHEK293細胞を、fura２を添加し、一日で＞150個の選択したリガンド
または組織／細胞抽出物をアゴニスト誘導カルシウム動員について評価した。同
様に、組換え受容体を発現しているHEK293細胞を標準的なcAMP定量アッセイを用
いて、cAMP産生の刺激または阻害について評価した。一時的にカルシウムを動員
する、またはcAMPの変動を示すアゴニストをベクター対照細胞で試験し、このと
きの応答が受容体を発現しているトランスフェクト細胞に特有なものであるかど
うかを決定した。
【０１１８】 実施例９：一過性のHEK293 GPR14および安定なHEK293 Gα16 GPR14細胞中の、 ウロテンシンIIにより誘導されるCa2+の動員 GPR14受容体は、HEK293細胞内に一過性にトランスフェクトすると、強力なカ
ルシウム応答を伴う濃度依存的様式でウロテンシンIIに対して応答する。一過性
にトランスフェクトしたラットおよびヒト受容体の双方は、同程度の親和性で魚
類ウロテンシンIIに応答する。図3は魚類ウロテンシンIIのラットおよびヒト受
容体に対する濃度応答曲線を示す。該データは96ウェルの蛍光イメージングプレ
ートリーダー（Fluorescent Imaging Plate Reader: FLIPR)を用いて得られた。
各点は、FLIPRで読み取った3〜4個の別々の96ウェルプレート内の、6〜8の個々
のウェルの平均である。魚類ウロテンシンIIのEC50は、ヒト受容体に対して0.5n
Mであり、ラット受容体に対して0.8nMであった。
【０１１９】 さらに、ヒト受容体はHEK293 Gα16細胞に安定にトランスフェクトされ、ヒト
ウロテンシンIIは濃度依存性カルシウム動員応答をもたらした。図4は、安定に
トランスフェクトされた細胞の3つのクローン（L2, L3およびL4と命名）につい
てのヒトウロテンシンIIの濃度応答曲線である。3つのクローンについてのヒト
ウロテンシンIIのEC50は0.1〜0.2nMであった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 １Aおよび１Bは、ヒトGPR14のヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列を
示す。配列番号１および２。
【図２】 2Aおよび２Bは、ラットGPR14受容体のアミノ酸配列およびポリヌクレオチド配
列を示す。配列番号４および６。
【図３】 FLIPRを使用した魚類ウロテンシンIIのHEK293ラットおよびヒトGPR14中間体＋
Gα−16に対する濃度応答曲線を示す。
【図４】 ヒトウロテンシンIIのヒトGPR14が安定にトランスフェクトされた細胞の3つの
クローンに対する濃度応答曲線を示す。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/72 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｃ０８４ 16/28 1/19 ４Ｃ０８６ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 ４Ｈ０４５ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/68 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (31)優先権主張番号 ０９／２３２，８５７ (32)優先日 平成11年１月15日(1999．1．15) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ (71)出願人 ラボラトワール グラクソスミスクライン フランス国 78163 マルリ−ル−ロワ セデックス，100 ルート ドゥ ベルサ イユ (72)発明者 ダグラス，ステファン，エー． アメリカ合衆国 19087 ペンシルバニア 州，ストラフォード ウェイネ，シュガー タウン ロード 219，ラ メゾン アパ ートメンツ ビー202 (72)発明者 ウィレッテ，ロバート，エヌ． アメリカ合衆国 19464 ペンシルバニア 州，ポッツタウン，コールド スプリング ス ロード 1534 (72)発明者 アイヤー，ナムビ，ヴィー． アメリカ合衆国 19312 ペンシルバニア 州，バーウィン，ラド−ビル サークル 1430 (72)発明者 アーノルド，アン，ロマニック アメリカ合衆国 19097 ペンシルバニア 州，ウェイネウッド，ダブ ロード 807 (72)発明者 カンドゥ−ディ，ナシラ フランス国 エフ−35760 サン−グレゴ ワール，アリー ジーン コクトー，１ (72)発明者 グート，ベルナルド フランス国 エフ−35000 レンヌ，アベ ニュー デ フランセーズ リブレ，24 (72)発明者 アル−バラザンジ，カマル イギリス国 シーエム23 ４ディーエック ス ハーツ，ビショップス ストートフォ ード，ソーリー パーク，ダルトン ガー デンズ 45 (72)発明者 アムス，ロバート，エス． アメリカ合衆国 19083 ペンシルバニア 州，ヘイバータウン，エリス ロード 276 (72)発明者 フォーレー，ジェームズ，ジェイ． アメリカ合衆国 19087 ペンシルバニア 州，ラドノール，ティモシーサークル 117 (72)発明者 サラウ，ヘンリー，エム． アメリカ合衆国 19438 ペンシルバニア 州，ハーレーズビル，メイプルアベニュー 348 (72)発明者 チャンバーズ，ジョン イギリス国 シービー３ ７エルエフ ケ ンブリッジ，ヘイスリングフィールド，バ ッドコック ロード 32， (72)発明者 シェイボン，ウズマン アメリカ合衆国 19081 ペンシルバニア 州，スワースモア，サウス スワースモア アベニュー 225 (72)発明者 バーグズマ，ダーク，ジェイ． アメリカ合衆国 19312 ペンシルバニア 州，バーウィン，アイリッシュ ロード 271 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 DB03 GC15 4B024 AA01 AA11 BA44 BA63 CA04 DA02 DA03 EA04 GA14 HA01 4B063 QA01 QQ43 QR32 QR55 QS34 4B064 AG20 AG27 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AA93X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17 BA44 DC50 ZA022 ZA082 ZA152 ZA182 ZA362 ZA402 ZA422 ZA432 ZA452 ZA512 ZA542 ZA592 ZA662 ZA702 ZA812 ZA892 ZA972 ZB072 ZB112 ZB132 ZB262 ZB332 ZB352 ZC352 ZC552 4C086 AA01 EA16 MA01 MA04 ZA02 ZA08 ZA15 ZA18 ZA36 ZA40 ZA42 ZA43 ZA45 ZA51 ZA54 ZA59 ZA66 ZA70 ZA81 ZA89 ZA97 ZB07 ZB11 ZB13 ZB26 ZB33 ZB35 ZC35 ZC55 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA50 EA20 EA50 FA74

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号２のポリペプチドまたはそれに対応する断片をコー
    ドするヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配
    列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、単離されたポリ
    ヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 DNAまたはRNAである請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 前記ヌクレオチド配列が配列番号１に含まれる配列と少なく
    とも80％同一である、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 前記ヌクレオチド配列が配列番号１に含まれている、請求項
    ３に記載のポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 前記ヌクレオチドコード配列が配列番号２のポリペプチドま
    たはその断片をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 請求項３に記載のポリヌクレオチドの少なくとも15の連続し
    たヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドプローブまたはプライマー。
  7. 【請求項７】 発現系を含むDNAまたはRNA分子であって、該発現系が適合性
    の宿主細胞内に存在するとき、該発現系が配列番号２のポリペプチドまたはその
    断片をコードするヌクレオチド配列と少なくとも80％の同一性を有するヒトGPR1
    4またはその断片を産生することができる、前記DNAまたはRNA分子。
  8. 【請求項８】 請求項７に記載の発現系を含む宿主細胞。
  9. 【請求項９】 ヒトGPR14ポリペプチドまたは断片を産生する方法であって
    、前記ポリペプチドまたは断片の産生に十分な条件下で、請求項８に記載の宿主
    を培養することを含む、前記方法。
  10. 【請求項１０】 前記ポリペプチドまたは断片が前記細胞の表面で発現され
    る、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の方法で産生された細胞。
  12. 【請求項１２】 前記ポリペプチドまたは断片を該培養物から回収すること
    をさらに含む、請求項９に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 ヒトGPR14ポリペプチドまたはその断片を産生する細胞を
    作製する方法であって、宿主細胞が適切な培養条件下でヒトGPR14ポリペプチド
    または断片を産生するように、請求項７に記載の発現系で宿主細胞を形質転換ま
    たはトランスフェクトすることを含む、前記方法。
  14. 【請求項１４】 配列番号２に含まれるアミノ酸配列と少なくとも85％同一
    のアミノ酸配列を含む、ヒトGPR14ポリペプチドまたはその断片。
  15. 【請求項１５】 配列番号２のアミノ酸配列を含む請求項１４に記載のポリ
    ペプチドまたはその断片。
  16. 【請求項１６】 請求項１２に記載の方法によって調製されたヒトGPR14ポ
    リペプチドまたは断片。
  17. 【請求項１７】 請求項１４に記載のヒトGPR14ポリペプチドに対して免疫
    特異的な抗体。
  18. 【請求項１８】 増強されたヒトGPR14活性を必要とする被験者を治療する
    方法であって、 (a) 治療上有効な量の、前記受容体に対するアゴニストを該被験者に投与するこ
    と、および／または (b)ヒトGPR14ポリヌクレオチドを、in vivoで該受容体活性を産生させるような
    形態で被験者に投与すること、 を含んでなる、前記方法。
  19. 【請求項１９】 ヒトGPR14活性の抑制を必要とする被験者を治療する方法
    であって、 (a) 治療上有効な量の、前記受容体に対するアンタゴニストを被験者に投与する
    こと、および／または (b)前記受容体をコードするヌクレオチド配列の発現を抑制する核酸分子を被験
    者に投与すること、および／または (c) 前記受容体と、そのリガンドについて競合する治療上有効な量のポリペプチ
    ドを被験者に投与すること、 を含んでなる、前記方法。
  20. 【請求項２０】 被験者におけるヒトGPR14の発現または活性に関連した該
    被験者の疾病または該疾病への罹りやすさを診断する方法であって、 (a)該被験者のゲノム内の前記ヒトGPR14をコードするヌクレオチド配列中に突然
    変異が存在するか否かを調べること、および／または (b)該被験者から得られたサンプル中のヒトGPR14発現の存在または量を分析する
    こと、 を含んでなる方法。
  21. 【請求項２１】 ヒトGPR14に結合する化合物を同定する方法であって、 (a)請求項１１に記載の細胞を候補化合物に接触させること、および (b)該候補化合物の前記細胞に結合する能力を評価すること、 を含んでなる、前記方法。
  22. 【請求項２２】 前記候補化合物が、細胞表面にあるヒトGPR14ポリペプチ
    ドの活性化によって生成されるシグナルをもたらすか否かを判定することをさら
    に含み、前記シグナルの生成をもたらす候補化合物をアゴニストとして同定する
    、請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 ヒトGPR14ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニス
    トを同定する方法であって、 化合物の該ポリペプチドへの結合に応答して検出可能なシグナルを提供し得る
    第2の構成成分と結合されている該ポリペプチドをその表面に発現している細胞
    に、スクリーニングしようとする化合物を該ポリペプチドへの結合を可能とする
    条件下で接触させること、 該化合物と該ポリペプチドとの相互作用により生成するシグナルのレベルを測
    定することによって、該化合物が該ポリペプチドに結合してそれを活性化するの
    か阻害するのかを、決定すること、 を含んでなる、前記方法。
  24. 【請求項２４】 標識されたもしくは標識されていない魚類またはヒトウロ
    テンシンIIの存在下でアゴニストまたはアンタゴニストの同定を実施することを
    さらに含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 ヒトGPR14ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニス
    トを同定する方法であって、 候補化合物の存在下に、該ポリペプチドへの結合を可能とする条件下で、その
    表面に該ポリペプチドを有する細胞または該ポリペプチドを含む細胞膜へのリガ
    ンドの結合の阻害を測定すること、および該ポリペプチドに結合したリガンドの
    量を測定し、リガンドの結合の減少を起こし得る化合物をアゴニストまたはアン
    タゴニストとして同定すること、 を含んでなる、前記方法。
  26. 【請求項２６】 リガンドが標識されたもしくは標識されていない魚類また
    はヒトウロテンシンIIである、請求項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 ラットGPR14受容体ポリペプチドのアゴニストまたはアン
    タゴニストを同定する方法であって、 化合物の該ポリペプチドへの結合に応答して検出可能なシグナルを提供し得る
    第2の構成成分とけつごうされている該ポリペプチドをその表面に発現している
    細胞に、スクリーニングしようとする化合物を該ポリペプチドへの結合を可能と
    する条件下で接触させること、 該化合物と該ポリペプチドとの相互作用により生成するシグナルのレベルを測
    定することによって、該化合物が該ポリペプチドに結合してそれを活性化するの
    か阻害するのかを決定すること、 を含んでなる、前記方法。
  28. 【請求項２８】 標識されたもしくは標識されていない魚類またはヒトウロ
    テンシンIIの存在下でアゴニストまたはアンタゴニストの同定を実施することを
    さらに含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 ラットGPR14受容体ポリペプチドのアゴニストまたはアン
    タゴニストを同定する方法であって、 候補化合物の存在下に、該ポリペプチドへの結合を可能とする条件下で、その
    表面に該ポリペプチドを有する細胞または該ポリペプチドを含む細胞膜へのリガ
    ンドの結合の阻害を測定すること、および該ポリペプチドに結合したリガンドの
    量を測定し、リガンドの結合の減少を起こし得る化合物をアゴニストまたはアン
    タゴニストとして同定すること、 を含んでなる、前記方法。
  30. 【請求項３０】 リガンドが標識されたもしくは標識されていない魚類また
    はヒトウロテンシンIIである、請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 請求項２２に記載の方法で同定されたアゴニスト。
  32. 【請求項３２】 前記細胞をヒトGPR14に対する既知のアゴニストと接触さ
    せること、および 前記アゴニストによって生成されたシグナルが前記候補化合物の存在下で減少
    するか否かを判定し、前記シグナルの減少をもたらす候補化合物を前記ヒトGPR1
    4のアンタゴニストとして同定することをさらに含む、請求項２１に記載の方法
    。
  33. 【請求項３３】 請求項２４に記載の方法で同定されたアンタゴニスト。
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