JP2003520599A - Ａｂｃ１パラログをコードする遺伝子及びそれに由来するポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質をコードする新規な３つの遺伝子及びそれからのポリペプチドに関する。本発明は、その遺伝子の遺伝的欠損の検出、そのポリペプチドの細胞下局在、化学データベースと関連付けた結合アッセイ、遺伝子治療、及びＰＤ−ＡＢＣ媒介疾患の治療に使用できる化学物質の同定にその新規な遺伝子及びポリペプチドを使用する方法も記載する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】

本発明は、ＰＤ−ＡＴＰ結合カセット遺伝子（以下、“ＰＤ−ＡＢＣ遺伝子”
）及びそれから誘導され且つ同定されるポリペプチドの同定、及び薬物スクリー
ニングアッセイのためのＰＤ−ＡＢＣ遺伝子の使用、及び突然変異体の発現によ
って又はＰＤ−ＡＢＣ遺伝子の異常なレベル又は活性によって媒介される心臓血
管疾患又は炎症性疾患の治療のための診断法及び治療法に関する。本発明は、Ｐ
Ｄ−ＡＢＣ遺伝子配列がＡＴＰ結合カセットトランスポーター遺伝子ファミリー
にパラロガス (paralogous) であるポリペプチドをコードする、そのヒト遺伝子
が心臓血管疾患及び異常ＨＤＬ代謝に関連した染色体領域に局在する、そして、
そのヒト遺伝子が心臓血管疾患又は炎症性疾患に関連した細胞中で発現されると
いう発見に基づいている。特に、ヒトＰＤ−ＡＢＣポリペプチドをコードする新
規ヒトＰＤ−ＡＢＣ遺伝子配列及びそれから誘導され且つ同定されるポリペプチ
ドを開示する。更に、ヒト染色体１９ｐ１３．３へのＰＤ−ＡＢＣの染色体局在
化、及び脾臓、胸腺、末梢血白血球、骨髄、リンパ節及び更に別の組織中でのＰ
Ｄ−ＡＢＣの発現を開示する。本発明は、更に、ＰＤ−ＡＢＣ遺伝子を含むベク
ター及び宿主細胞、及びＰＤ−ＡＢＣ遺伝子を使用する方法、及びＰＤ−ＡＢＣ
遺伝子の遺伝的変更の検出、ポリペプチドの細胞下局在、遺伝子治療応用、又は
化学的データベースに関連した結合アッセイにおいてそれらポリペプチドに特異
的に指向する抗体を記載する。本発明は、更に、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質活性を
変化させる分子についての有標スクリーニング戦略、変更されたＰＤ−ＡＢＣタ
ンパク質発現に関連した症候群の診断法、及びＰＤ−ＡＢＣ遺伝子／タンパク質
の発現、合成又は活性を変化させる化合物の同定方法の開発、及び例として冠状
動脈疾患（ＣＡＤ）が含まれるがこれに制限されるわけではないＰＤ−ＡＢＣに
媒介される疾患の治療における治療薬として同定されるものなどの化合物の使用
に関する。

【０００２】

【発明の背景】 ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターは、広範囲の基質を細胞膜を
横切って輸送する膜貫通タンパク質の大ファミリーを構成している（Higgins, C
.F., Annu. Rev. Cell Biol, 1992;8:67-113）。このトランスポーターファミリ
ーのメンバーは、それぞれ６個の膜貫通セグメントを含有する二つの疎水性ドメ
インを有する。更に、それらは、それぞれの疎水性ドメインのカルボキシル末端
に、二つの細胞質ＡＴＰ結合カセット又は核結合フォールド（nuclear binding
folds ）（ＮＢＦ）を有する。ＮＢＦでのＡＴＰ結合及び加水分解は、輸送活性
のエネルギー与える（Higgins, C. F., Annu. Rev. Cell Biol, 1992;8:67-113
）。いろいろなメンバーが有意の相同性を有するが、ＡＴＰトランスポーターは
異なった基質特異性を有する。多薬物耐性ｐ−糖タンパク質（ＭＤＲ）は、無関
係の構造を有する有機化学物質を輸送するが、関連したトランスポーターＭＲＰ
は、リン脂質の膜輸送に関連する（Gottesman, M. M., et al., Annu. Rev. Bio
chem., 1993;62:385-428; Smit, J. J, et al., Cell,1993;75:451-462; Ruetz,
S., et al., Cell, 1994;77:1071-1081）。ＡＢＣトランスポーターの生理学的
重要性は、若干のＡＢＣトランスポーターにおける遺伝的欠陥がヒト疾患に関連
するという知見によって強調されている。嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調
節遺伝子の突然変異は、嚢胞性線維症の原因である（Riordan, J.R., et al., S
cience, 1989;245:1066-1073）。ＡＢＣＡ（Broccardo, C., et al., Biochim.
Biophys. Acta, 1999; 1461:395-404 ）のＡＢＣトランスポーターであるＡＢＣ
Ｒ中の遺伝子突然変異又は切断は、変性網膜疾患であるシュタルガルト病を引き
起こす（Allikmets, R., et al., Nat. Genet., 1997; 15:236-246）。ＡＢＣ１
は、ＡＢＣＡスーパーファミリーのメンバーでもあるが、配列相同性に基づくＰ
ＣＲによってマウスから単離された（Luciani, MF, et al., Genomics, 1994;21
:150-159）。ＡＢＣ１は、最初、アポトーシス細胞の飲み込み及び膜を横切る陰
イオン輸送に必要であることが判明した（Luciani, MF, et al., EMBO J, 1996;
15:226235; Becq, F, et al., J Biol. Chem., 1997;272:2695-2699）。ヒトＡ
ＢＣ１の発現は、マクロファージ分化の際に及びコレステロールローディングに
よって調節される（Langmann, T., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 19
99;257:29-33）。最近になって、ＡＢＣ１は、リポタンパク質欠損症のまれな形
であるタンジアー病（ＴＤ）における欠陥遺伝子として同定された（Bodzioch,
M., et al., Nature Genetics, 1999;22:347-351; Broccardo, C, et al., Bioc
him. Biophys. Acta, 1999;1461:395-404; Brooks-Wilson, A., et al., Nature
Genetics, 1999;22:336-345; Rust, S., et al., Nature, Genetics, 1999;22:
352-355)。遺伝的及び薬理学的両方の証拠により、ＡＢＣ１は、コレステロール
及びリン脂質を、末梢組織中の細胞膜を横切って輸送するということが示唆され
る（Remaley, A. T., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999;96:12685-126
90; Young, S. G., et al., Nature Genetics, 1999;22:316-318）。ＴＤ患者の
場合に似た表現型は、ＡＢＣ１ノックアウトマウスで認められた（McNeish, J,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000;97:4245-4250; Orso, E., et al.,
Nature Genetics, 2000;24:192-196)。

【０００３】 リポタンパク質代謝におけるＡＢＣ１の関連性は、コレステロール流出及び逆
コレステロール輸送に関与すると考えられるＡＢＣ１に近いホモログについて探
求させる。ここで、本発明者は、現在のところ最も近いＡＢＣ１ホモログである
新規なＡＢＣトランスポーターの単離及び組織特異的発現を記載する。更に、本
発明者は、異なった組織特異的発現パターンを有する他にスプライシングされた
変異型も同定した。これら知見により、ＰＤ−ＡＢＣは、重要な生理学的役割を
有するかもしれないということが示唆される。

【０００４】 ＣＡＤについての高い危険性は、低レベルの高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）
粒子に関連付けられてきた。事実、ＣＡＤの全患者の約２分の１は、低レベルの
ＨＤＬコレステロールを有する。結果として、ＣＡＤ予防のための最近の努力は
ＨＤＬ粒子のレベルを増加させる方法に焦点を置いている。ＨＤＬ粒子は、コレ
ステロールの代謝及び最終的排出がそこで起こる肝臓に、細胞から、コレステロ
ールを輸送すること（逆コレステロール輸送）によって過剰のコレステロールを
体内から除去するのに重要である。タンジアー病及び家族性高比重リポタンパク
質欠損症（ＦＨＡ）は、極めて低い血漿ＨＤＬレベル及び増加した細胞コレステ
ロールレベルを特徴とし、早期アテローム性動脈硬化症を引き起こす（Rogler,
et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1995;15(5):68390; Marcil, et al.,
Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1999; 19(l):15969 ）。ＡＴＰ結合カセット
トランスポーター１（ＡＢＣ１）遺伝子の突然変異は、最近、ＴＤ及びＦＨＡの
患者で同定された（BrooksWilson, A., et al., Nature Genetics, 1999;22:336
345; Bodzioch, M., et al., Nature Genetics, 1999;22:347351）。これら研究
は、ＡＢＣ１タンパク質が、細胞からＨＤＬ粒子中へのコレステロールの流出に
おいて臨界的な役割を果たすということを示している（Marcil, et al., Lancet
, 1999;354:13401346 ）。低分子化合物の使用によってＡＢＣ１タンパク質の活
性を増加させることは、ＨＤＬレベルを上昇させ且つＣＡＤを予防する一つの方
法でありうるということが明らかになっている。

【０００５】 ＡＢＣ１遺伝子／タンパク質は、最近、ＨＤＬ代謝においてある役割を果たし
ていると確認されたが、他の遺伝子も含まれるであろうということは明らかであ
る。これら他の遺伝子はまだ同定されていない。このような遺伝子が同定された
とすれば、それは有益であろう。この経路の背後にある生化学的機構について理
解を得ることにより、ＨＤＬ粒子の異常（高又は低）生産に関係した疾患を治療
し且つ診断する新しい機会を得ることができる。別の言い方をすると、細胞内コ
レステロールのＨＤＬに媒介される流出の分子機構についてのよりよい理解は、
異常レベルのコレステロール及びＨＤＬ生産に関係した疾患を治療する治療薬の
改善された設計を可能にするであろう。

【０００６】 ＨＤＬ代謝の変化のような異常脂肪血症、又は異常脂肪血症によって生じるＣ
ＡＤは、多数の疾患に関連付けられている。このような疾患には、糖尿病（概説
については、Evans, et al., Curr Opin Lipidol, 1999;10(5):387-391）、脂肪
肝疾患（Marchesini, et al., Am J Med, 1999; 107(5):450-455）、肥満症（概
説については、Indulski, et al., Cent Eur J Public Health, 1999;7(3):122-
129)、インスリン抵抗性（概説については、Bailey, et al., Biochem Pharmaco
l, 1999;58(10):1511-1520）、アルコール中毒症（概説については、Baraona, e
t al., Recent Dev Alcohol, 1998; 14:97-134）、網膜変性（Gordon, et al.,
Am J Ophthalmol, 1991;112(4):385-391）、高血圧症（概説については、Gianna
ttasio, et. al., Pathol Biol (Paris), 1999;47(7):744-751）及び一般の血管
病が含まれる。

【０００７】

【発明の要旨】

コレステロールレベルの調節においても重要でありうる他の遺伝子が存在する
かどうか確認するために、商業的に入手可能な配列データベースを、１（ＡＴＰ
結合カセットトランスポーター１、以下、“ＡＢＣ１”）に関係した遺伝子につ
いて検索した。ＡＢＣトランスポーター遺伝子ファミリーは、最も大きい既知の
遺伝子ファミリーであり、それらＡＢＣトランスポーター遺伝子は、糖、アミノ
酸、ペプチド及び抗体を含む異なった基質を有する（概説については、Croop JM
, Methods Enzymol, 1998;292:101-116)。Compugen Systems, Ltd., からのアル
ゴリズム及びツールを用いて生じたクラスター化ＥＳＴ配列の有標データベース
の相同性検索を行うことにより、ＡＢＣ１にアミノ酸レベルで４８％同一であり
且つ６４％類似した新規なヒト遺伝子配列を同定した。これら遺伝子（以下、Ｐ
Ｄ−ＡＢＣフォーム１及びフォーム２と称される）は、これまでに同定されたＡ
ＢＣ１遺伝子の内で最も近いヒトパラログ (human paralogs) である。ＰＤ−Ａ
ＢＣ遺伝子及びそれらがコードするポリペプチドは、種々の細胞及び組織中で発
現され、そして、完全長遺伝子のポリヌクレオチド配列及びあらゆるスプライス
変異型及びそれらにコードされるタンパク質が両方とも本明細書中において同定
されている。ＰＤ−ＡＢＣフォーム１のポリヌクレオチド配列は配列番号：１に
特定され、その新規な遺伝子によってコードされるＰＤ−ＡＢＣフォーム１タン
パク質のアミノ酸配列は、配列番号：２に示される。ＰＤ−ＡＢＣフォーム２の
ポリヌクレオチド配列は配列番号：３に特定され、その新規な遺伝子によってコ
ードされるＰＤ−ＡＢＣタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：４に示される
。

【０００８】 更に、Genbank データベース中の高処理量ゲノム配列に対してこれら遺伝子を
整列させると、これら遺伝子のヒト染色体１９ｐ１３．３への“in silico ”局
在が分かった。Online Mendelian Inheritance in Man （ＯＭＩＭ）データベー
スの検索で、ヒト染色体１９のこの同じ領域が、アテローム性動脈硬化症罹病性
に遺伝的に関連するということを発見した（Nishina, et al., PNAS, 1992;89:7
08712; Naggert, et al., Clin Genet, 1997:236-240）。１９ｐ１３．３への連
鎖を示す家族からの罹病個体は、ＡＢＣ１遺伝子中の突然変異に特有な低レベル
のＨＤＬ粒子を有する。ＡＢＣ１遺伝子へのこれら新規な遺伝子の同一性レベル
及びアテローム性動脈硬化症罹病性に関連した遺伝子座への遺伝子連鎖は、これ
ら遺伝子を、ＣＡＤを予防する薬物の標的とする。言い換えると、ＰＤ−ＡＢＣ
フォーム１及びフォーム２タンパク質は、ＡＢＣ１タンパク質へのアミノ酸相同
性を有するので、それらは、ある程度の構造的及び機能的特性をＡＢＣ１と共有
する可能性が高い。

【０００９】 本発明の一つの側面は、精製されたＰＤ−ＡＢＣフォーム１及びフォーム２タ
ンパク質を提供することである。これら精製されたタンパク質は、組換え細胞か
又は天然に存在する細胞から得ることができる。本発明の精製されたＰＤ−ＡＢ
Ｃタンパク質は、哺乳動物起原であってよい。ヒトを含めた霊長類由来のＰＤ−
ＡＢＣタンパク質は、具体的に提供される種々のタンパク質の例である。本発明
は、更に、天然に存在するＰＤ−ＡＢＣタンパク質の対立遺伝子変異型及び生物
学的に活性な誘導体を提供する。

【００１０】 本発明のもう一つの側面は、本発明のＰＤ−ＡＢＣフォーム１及びフォーム２
タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供すること及びポリヌクレオチド
コーディング鎖に相補的なポリヌクレオチドを提供することである。本発明のこ
れらポリヌクレオチドは、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質の組換え発現を提供するのに
用いることができる。本発明のポリヌクレオチドは、（１）ＰＤ−ＡＢＣ遺伝子
の変化によって又はＰＤ−ＡＢＣ遺伝子／タンパク質を含む細胞経路の変化によ
って生じることがありうる疾患を治療するための、（２）ＰＤ−ＡＢＣ遺伝子／
タンパク質の変化又は欠失による疾患の存在又は疾患への罹病性について調べる
ための、（３）ＰＤ−ＡＢＣポリペプチドの細胞下局在化を分析又は変えるため
の、（４）ＰＤ−ＡＢＣ遺伝子に類似するＲＮＡの別々のクラスをクローン化す
るか又は単離するための、（５）ＰＤ−ＡＢＣ遺伝子のレベルを変えるためにＲ
ＮＡの別々のクラスを発現させるための、遺伝子治療目的に用いることもできる
。

【００１１】 本発明は、更に、プローブ又はプライマーとして有用なオリゴヌクレオチド分
子であって、ＰＤ−ＡＢＣ遺伝子を含む又はに関係したいずれかのヌクレオチド
配列、特に、配列番号：１及び３の配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌ
クレオチド分子に関する。これらオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ増幅及び微小配
列決定のような種々の方法で用いるためのプライマーとしてか又はハイブリダイ
ゼーション分析におけるＤＮＡ認識用のプローブとして有用である。 本発明による核酸プローブ又はプライマーは、配列番号：１又は３のポリヌク
レオチドの少なくとも８個連続したヌクレオチド、好ましくは８〜２００個連続
したヌクレオチド、より具体的には１０個、１５個、２０個又は３０〜１００個
連続したヌクレオチド、より好ましくは１０〜９０個のヌクレオチド、そして最
も好ましくは配列番号：１又は２のポリヌクレオチドの２０〜８０個連続したヌ
クレオチドを含んでなる。本発明の好ましいプローブ又はプライマーは、下の実
施例に示されるオリゴヌクレオチドから成る群より選択されるオリゴヌクレオチ
ドを含む。

【００１２】 本発明は、更に、ＰＤ−ＡＢＣ遺伝子のある領域の増幅方法に関する。この方
法は、目的のＰＤ−ＡＢＣ配列又はその一部分を含有すると推察される試験試料
を、上記のような１対の増幅プライマーであって、増幅されるＰＤ−ＡＢＣヌク
レオチド領域の両側に位置するプライマーを含む増幅反応試薬と接触させる工程
を含む。この方法は、増幅産物を検出する工程を更に含んでよい。例えば、増幅
産物は、増幅した配列の内部領域とハイブリダイズしうる検出プローブを用いて
検出することができる。或いは、増幅産物は、増幅反応自体に用いられるプライ
マーのいずれかを、場合により標識された形で用いて検出することができる。

【００１３】 本発明は、更に、試験試料中のＰＤ−ＡＢＣフォーム１又はフォーム２ＤＮＡ
の少なくとも１コピーの存在を検出するための診断用キットであって、本発明に
よるプライマー、１対のプライマー又はプローブを含有するキットに関する。 第一の態様において、キットは、ＰＤ−ＡＢＣ遺伝子又はそのフラグメントを
増幅するのに用いられる上記のようなプライマー、好ましくは、順方向及び逆方
向プライマーを含む。 第二の態様において、キットは、ハイブリダイゼーションＤＮＡプローブを含
み、これは、固体支持体上に固定されているか又は最終的に固定された状態にな
り、ＰＤ−ＡＢＣ遺伝子又はそのフラグメントとハイブリダイズすることができ
る。ヌクレオチドプライマー又はプローブを固体支持体上に固定する方法は、当
業者に周知である。

【００１４】 本発明のキットは、そのキットがプライマーを含む場合のＤＮＡポリメラーゼ
のような適当な増幅試薬、ハイブリダイゼーション反応において有用な試薬、及
び標識されたハイブリダイゼーションプローブとＰＤ−ＡＢＣ遺伝子との間のハ
イブリダイゼーション反応の存在を示すのに有用な試薬を含めた任意の要素を含
むこともできる。 本発明のもう一つの側面は、本発明のＰＤ−ＡＢＣタンパク質に結合すること
ができる抗体を提供することである。これら抗体は、ポリクローナルであってよ
いし又はモノクローナルであってよい。本発明は、更に、in vitroか又は in vi
voでのＰＤ−ＡＢＣタンパク質の発現を検出し且つ測定するための、又はＰＤ−
ＡＢＣタンパク質と相互作用するタンパク質、又はＰＤ−ＡＢＣタンパク質の活
性のいずれかを調節する分子を検出するための対象抗体を使用する方法を提供す
る。

【００１５】 本発明のもう一つの側面は、遺伝的アプローチを用いた、ＰＤ−ＡＢＣ遺伝子
／タンパク質と相互作用するタンパク質の検出アッセイを提供することである。
好ましい態様は、このスクリーニングのための酵母ツーハイブリッドアプローチ
の使用を含む（Bartel and Fields, The Yeast TwoHybrid System, Oxford Univ
ersity Press, 1997）。 本発明のもう一つの側面は、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質と、ＰＤ−ＡＢＣタンパ
ク質を結合するリガンドとの間の相互作用を妨げるか又はいずれにせよ模倣する
治療的化合物の検出又はスクリーニングのアッセイを提供することである。

【００１６】 第一の態様において、候補物質のこのようなスクリーニング方法は、次の、 （ａ）配列番号：２又は４のアミノ酸配列、又はそのペプチドフラグメント又
は変異型を含むポリペプチドを提供し； （ｂ）候補物質を入手し； （ｃ）そのポリペプチドをその候補物質と接触させ；そして （ｄ）そのポリペプチドとその候補物質との間に形成される複合体を検出する
工程を含む。

【００１７】 上に定義のスクリーニング法の一つの態様では、ポリペプチドと候補物質との
間に形成される複合体を、本発明のＰＤ−ＡＢＣタンパク質に又はそのペプチド
フラグメント又は変異型に特異的に結合するポリクローナル抗体又はモノクロー
ナル抗体の存在下で更にインキュベートする。 ＰＤ−ＡＢＣポリペプチドとの相互作用についてアッセイされる候補物質又は
分子は、ポリペプチドのような生物起源の天然の又は合成の有機化合物又は分子
が含まれるがこれに制限されるわけではない異なった性状を有していてよい。

【００１８】 本スクリーニング方法のもう一つの態様において、この方法の工程（ｃ）を行
う場合、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質への結合について、考えられる候補物質と拮抗
する増加濃度の物質を、候補物質又は分子の添加と同時に又はその前に加える。
この技法により、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質又はそのペプチドフラグメント又は変
異型と、スクリーニングされる候補物質又は分子との間に形成される複合体の検
出及び場合により定量化は、当業者が、このＰＤ−ＡＢＣタンパク質又はそのペ
プチドフラグメント又は変異型へのこの物質又は分子の親和値を決定することを
可能にする。

【００１９】 本発明は、更に、本明細書中に先に記載のスクリーニング法を実施するのに有
用なキットに関する。好ましくは、このようなキットは、配列番号：２又は４の
アミノ酸配列を有するＰＤ−ＡＢＣタンパク質又はそのペプチドフラグメント又
は変異型、及び場合により、このＰＤ−ＡＢＣタンパク質又はそのペプチドフラ
グメント又は変異型と候補物質との間に形成される複合体を検出するのに有用な
手段を含む。好ましい態様において、この検出手段は、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質
又はそのペプチドフラグメント又は変異型に対して向けられるモノクローナル抗
体又はポリクローナル抗体から成る。

【００２０】 本発明のアッセイは、したがって、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質と、ＰＤ−ＡＢＣ
タンパク質に結合するリガンドとの間の結合についての目的の化合物の作用を測
定する工程を含む。結合は、標識されたＰＤ−ＡＢＣタンパク質又は標識された
リガンドの使用を含めた種々の方法で測定することができる。 本発明のもう一つの側面は、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質と直接的に又は間接的に
相互作用するタンパク質の発見のためのアッセイを提供することである。本発明
のこれらアッセイは、細胞中又は生化学アッセイにおけるこのような相互作用を
検出する方法を含む。これら相互作用は、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質をコードする
ｃＤＮＡ、又はＰＤ−ＡＢＣタンパク質自体、又はそれらのフラグメント又は修
飾の使用を含めた種々の方法で検出することができる。

【００２１】 本発明の一つの好ましい態様において、ＰＤ−ＡＢＣ遺伝子は、ＰＤ−ＡＢＣ
の活性を増加させる化学物質及び相互作用性タンパク質の同定のための高処理量
スクリーニングを開発するのに用いることができる新規な標的である。究極的に
は、ＰＤ−ＡＢＣ遺伝子の活性を変化させる化合物は、ＣＡＤの予防における効
力について調べることができる。その遺伝子座は、ＨＤＬ代謝に関係した基礎研
究及び薬理学的研究のために用いることもできる。 本発明のもう一つの好ましい態様において、ＰＤ−ＡＢＣ遺伝子のタンパク質
産物は、ＣＡＤ及び異常脂肪血症の治療のための新規な治療的標的として役立ち
うる。

【００２２】 本発明のもう一つの好ましい態様において、ＣＡＤ及び異常脂肪血症を研究す
るための遺伝的モデルを、マウスのような動物のＰＤ−ＡＢＣ遺伝子を変化させ
ることによって作ることができる。 本発明の更に別の好ましい態様において、ＰＤ−ＡＢＣ遺伝子の多形は、ＣＡ
Ｄの危険性がある集団のメンバーを同定することができ、そしてこれら遺伝子の
配列を用いてこのような人々を同定するように遺伝的検査が創作され得る。 本発明の更に別の好ましい態様において、ＰＤ−ＡＢＣ遺伝子の配列の多形は
、ＣＡＤ及び異常脂肪血症に適当な治療方法を選択するのに用いられうるであろ
う。 本発明の更に別の好ましい態様において、ＰＤ−ＡＢＣ遺伝子の配列は、ＣＡ
Ｄ及び異常脂肪血症の治療的処置に引き続き用いうるアンチセンスＲＮＡ又は抗
体プローブを生じるのに用いうる。 本発明のまた更に別の好ましい態様において、ＰＤ−ＡＢＣ遺伝子の配列は、
それ自体が治療的標的として役立ちうる相互作用性遺伝子を同定するのに用いう
る。

【００２３】 本発明のまた更に別の好ましい態様において、ＰＤ−ＡＢＣ遺伝子を含めた及
び取り囲むヌクレオチド配列は、これら遺伝子のレベルを調節する因子を同定す
るのに用いうる。これら因子は、異常脂肪血症及びＣＡＤの治療的標的となりう
る。 本発明のまた更に別の好ましい態様において、ＰＤ−ＡＢＣ遺伝子のタンパク
質産物は、ＡＢＣトランスポーターファミリーの特定のメンバーに選択的である
化合物を同定するのに用いうる。

【００２４】 本明細書中に記載されているのは、本発明を行い且つ用いるのに好ましい配列
、ポリペプチド及び方法である。しかしながら、本発明が、記載された具体的な
配列、ポリペプチド及び方法にのみ制限されるのではないということは理解され
るべきである。これら配列、ポリペプチド及び方法は、変動してもよく、本明細
書中で用いられる術語は、具体的な態様を記載するためである。保護の範囲は最
終的には請求の範囲によるので、いずれにせよ、前述のことは、本発明を制限す
るものではなく、制限すると解釈されるべきではない。特に断らない限り、本明
細書中で用いられる専門用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野業者によ
って一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書中に記載の米国特
許及び公報は全て、参照により本明細書に組み込まれる。

【００２５】

【００２６】

【化１】

【００２７】

【化２】

【００２８】

【化３】

【００２９】

【化４】

【００３０】

【化５】

【００３１】 図２：スプライス変異型及びイントロン／エクソン編成体の構造。ダイヤグラ
ムＡは、各々の変異型におけるイントロン及びエクソンの位置、並びに、択一的
スプライス部位を示す。膜貫通ドメイン（ＴＭ１＝Ｎ末端，ＴＭ２＝Ｃ末端）及
びヌクレオチド結合性フォールド（ＮＢＦ）が示される。

【００３２】

【表１】

【００３３】 図３：多数の組織中でのＰＤ−ＡＢＣの発現。Ａ，種々のヒト組織中でのＰＤ
−ＡＢＣ発現のノーザンブロット分析。示される組織からのｍＲＮＡを有するブ
ロットを、ヒトＰＤ−ＡＢＣプローブ及びＧＡＰＤＨプローブそれぞれとハイブ
リダイズさせた。ＰＤ−ＡＢＣ及びＧＡＰＤＨのバンドが矢印で示されている。
Ｂ，免疫系の組織又は細胞中でのＰＤ−ＡＢＣ発現のノーザンブロット分析。ハ
イブリダイゼーションは上述のように行ったが、ＰＤ−ＡＢＣの二つのフォーム
が示されている。

【００３４】

【表２】

【００３５】 図４：ＰＤ−ＡＢＣスプライス変異型の組織分布。Rapid-Scan Gene Expressi
on Panels を鋳型として用い、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を、二つの変異型に
それぞれ特異的なプライマー対で行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分割
した；レーン１，胎児肝；レーン２，胎児脳；レーン３，骨髄；レーン４，ＰＢ
Ｌ（末梢血白血球）；レーン５，皮膚；レーン６，前立腺；レーン７，子宮；レ
ーン８，卵巣；レーン９，膵臓；レーン１０，副腎；レーン１１，甲状腺；レー
ン１２，唾液腺；レーン１３，胎盤；レーン１４，精巣；レーン１５，胃；レー
ン１６，筋肉；レーン１７，小腸；レーン１８，肺；レーン１９，結腸；レーン
２０，肝；レーン２１，脾臓；レーン２２，腎臓；レーン２３，心臓；レーン２
４，脳。

【００３６】

【表３】

【００３７】

【発明の詳しい説明】

本出願中、特に断らない限り、用いられる技術は、Molecular Cloning: A Lab
oratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess)、Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, edite
d by D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA) 、"Guide to Protei
n Purification" in Methods in Enzymology (M.P. Deutshcer, ed., (1990) Ac
ademic Press, Inc.) 、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications
(Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA)、Culture of Animal
Cells: A Manual of Basic Technique, 2 ^nd Ed. (R.I. Freshney. 1987. Liss,
Inc. New York, NY) 及び Gene Transfer and Expression Protocols, pp.109-
128, ed. E.J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.) Sequence Ana
lysis Primer (Gribskov, et al., 1994, Oxford University Press)のようない
くつかの周知の参考文献のいずれかに見出されうる。

【００３８】 一つの側面において、本発明は、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質をコードする、以下
、ＡＴＰ結合カセットトランスポーター１パラログ（ＰＤ−ＡＢＣ）遺伝子と称
される新規な単離され且つ精製されたポリヌクレオチドを提供するが、ここにお
いて、これらポリヌクレオチド配列は、配列番号：１及び３に示される配列と実
質的に類似しており、ポリペプチド配列は、配列番号：２及び４に示される配列
と実質的に類似している。“ＰＤ−ＡＢＣ”という用語は、本明細書中において
広い意味で用いられる。特に断らない限り、“ＰＤ−ＡＢＣ”という用語には、
あらゆる天然の哺乳動物由来の型のＰＤ−ＡＢＣ等が含まれる。ＰＤ−ＡＢＣと
いう用語には、霊長類及びヒトが含まれるがこれに制限されるわけではない全て
の哺乳動物が含まれるのが好適である。

【００３９】 提供されるポリヌクレオチドは、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質又はそれらの一部分
をコードしうる。本発明のポリヌクレオチドは、周知の固相合成法を用いた、ク
ローニング又はそれらの組合せによる in vitro 化学合成を含めた種々の方法に
よって製造することができる。本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ又はゲノ
ムライブラリーに由来してよい。当業者は、遺伝コードの縮重について公知であ
り、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質をコードする天然に存在するポリヌクレオチド配列
への部分的か又はポリヌクレオチド配列の相同性を有するＰＤ−ＡＢＣタンパク
質をコードするポリヌクレオチドを容易に設計することができる。本発明のポリ
ヌクレオチドは、一本鎖であってよいし又は二本鎖であってよい。ＰＤ−ＡＢＣ
タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドも提供す
る。

【００４０】 ＰＤ−ＡＢＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＰＤ−ＡＢＣタン
パク質又はｍＲＮＡを有し且つそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる
組織から製造されるｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。例えば、ｃＤ
ＮＡライブラリーは、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質を発現することが知られている細
胞系からポリアデニル化ｍＲＮＡを得、そのｍＲＮＡを鋳型として用いて二本鎖
ｃＤＮＡを合成することによって構築することができる。 ｃＤＮＡか又はゲノムのライブラリーは、目的の遺伝子又はそれによってコー
ドされるタンパク質を同定するように設計されたプローブでスクリーニングされ
る。ｃＤＮＡ発現ライブラリーについて、適当なプローブには、ＰＤ−ＡＢＣタ
ンパク質を認識し且つそれに特異的に結合するモノクローナル抗体及びポリクロ
ーナル抗体が含まれる。ｃＤＮＡライブラリーについて、適当なプローブには、
同じ又は異なった種からのＰＤ−ＡＢＣタンパク質の既知の又は考えられる一部
分をコードする慎重に選択されたオリゴヌクレオチドプローブ（通常は、約２０
〜８０塩基長さの）、及び／又は同じ又は類似した遺伝子をコードする相補的な
又は相同のｃＤＮＡ又はそれらのフラグメント、及び／又は相同のゲノムＤＮＡ
又はそれらのフラグメントが含まれる。選択されたプローブでｃＤＮＡ又はゲノ
ムライブラリーをスクリーニングすることは、Chapters 1012 of Sambrook, et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, 1989) に記載の標準法を用いて行うことができる。

【００４１】 本発明を実施する好ましい方法は、種々の組織からのｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングするように慎重に選択されたオリゴヌクレオチド配列を用いるこ
とである。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、長さが充分で
あるべきであり、しかも偽陽性を最小限にできるだけの明確さが必要がある。現
実のヌクレオチド配列は、通常は、最低のコドン重複性を有するＰＤ−ＡＢＣ遺
伝子の領域に基づいて設計される。それらオリゴヌクレオチドは、１か所又はそ
れ以上の位置で縮重していてよい。縮重オリゴヌクレオチドの使用は、優先的コ
ドン使用が知られていない種からライブラリーをスクリーニングする場合に特に
重要である。

【００４２】 オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされたライブラリー中のＤＮＡへのハ
イブリダイゼーションによってそれを検出することができるように標識される必
要がある。好ましい標識方法は、ＡＴＰ（例えば、Ｔ３２Ｐ）及びポリヌクレオ
チドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’末端を放射性標識することで
ある。しかしながら、ビオチニル化又は酵素標識が含まれるがこれに制限される
わけではない他の方法を用いてオリゴヌクレオチドを標識してよい。 ＰＤ−ＡＢＣタンパク質をコードするｃＤＮＡは、米国特許第４，６８３，１
９５号に、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, seco
nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989 の項目１
４に又は Chapters 15 of Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel,
et al. eds., Green Publishing Associates and WileyInterscience 1991に記
載のように、直接発現クローニングによる又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
を用いるような組換えＤＮＡ技術の他の既知の技法によって同定し且つ単離する
こともできる。この方法は、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質をコードするＤＮＡにハイ
ブリダイズするであろうオリゴヌクレオチドプローブの使用を必要とする。

【００４３】 本明細書中に定義の“実質的に類似した”には、同一の配列、更には、タンパ
ク質産物のいずれかの生物学的に活性な部分を維持し且つ保存モチーフのいずれ
かを有するＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質配列への欠失、置換又は付加が含まれ
る。これには、存在することが判っているＰＤ−ＡＢＣのあらゆるスプライス変
異型が含まれるが、これに制限されるわけではない。好ましくは、本発明による
ＤＮＡ配列は、配列番号：１又は３のＤＮＡ配列から本質的になる。これら新規
な精製され且つ単離されたＤＮＡ配列は、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質の発現を支配
するのに及びＰＤ−ＡＢＣタンパク質の機能の突然変異分析に用いることができ
る。 本発明による突然変異した配列は、本明細書中に与えられた内容及び当該技術
分野において周知の技術を用いて、当業者によって常套法で同定することができ
る。

【００４４】 好ましい態様において、本発明は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーシ
ョン条件下において配列番号：１又は３に示されるヌクレオチド配列にハイブリ
ダイズするヌクレオチド配列を含む。本明細書中で用いられる“高ストリンジェ
ンシーハイブリダイゼーション条件”とは、フィルター支持体上の低塩ハイブリ
ダイゼーション緩衝液中において６５℃で、２ｘ１０⁸ ｃｐｍ／μｇの目的のプ
ローブへの約８〜２４時間のハイブリダイゼーション後、１％ＳＤＳ、２０ｍＭ
リン酸緩衝液及び１ｍＭＥＤＴＡ中において６５℃で約３０分間〜４時間の洗浄
を意味する。好ましい態様において、この低塩ハイブリダイゼーション緩衝液は
、０．５％〜１0 ％ＳＤＳ及び０．０５Ｍ〜０．５Ｍリン酸ナトリウムを含む。
最も好ましい態様において、低塩ハイブリダイゼーション緩衝液は、７％ＳＤＳ
及び０．１２５Ｍリン酸ナトリウムを含む。

【００４５】 当該技術分野において知られているように、多数の等価条件を用いて、低いか
又は高いストリンジェンシー条件を含むことができる。配列の長さ及び性状（Ｄ
ＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、標的の性状（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成、溶液中の
存在又は固定化等）、及び塩類及び他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、デ
キストラン硫酸及び／又はポリエチレングリコールの存在又は不存在）のような
因子が考えられ、ハイブリダイゼーション溶液は、上に挙げた条件と異なる又は
均等な低いか又は高いストリンジェンシーの条件を生じるように変化してよい。 本明細書中で用いられる“ストリンジェント条件”は、ほぼＴｍ−５℃（プロ
ーブの融解温度（Ｔｍ）より５℃低い）〜Ｔｍより約２０℃〜２５℃低い範囲内
である“ストリンジェンシー”である。当業者によって理解されるであろうよう
に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、同一の又は関連したポリ
ヌクレオチド配列を同定する又は検出するために変更されてよい。

【００４６】 本発明のポリヌクレオチドは、種々の用途を有するが、そのいくつかは示され
ているし、又は以下で更に詳細に取り上げられるであろう。ある与えられたポリ
ヌクレオチドの具体的な用途は、一部分は、目的の具体的なポリヌクレオチド態
様に依る。本発明のポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションプローブとし
て用いられて、遺伝子ライブラリーからＰＤ−ＡＢＣヌクレオチド配列を回収す
ることができる。本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲ及び他の類似した増幅法
によって、ポリヌクレオチドをコードするＰＤ−ＡＢＣ遺伝子配列又はそれらの
一部分の増幅のためのプライマーとして用いることもできる。本発明のポリヌク
レオチドは、プローブ及び増幅プライマーとして用いられて、疾患、特に、ＰＤ
−ＡＢＣタンパク質の変更された機能に関係した疾患と相関していたＰＤ−ＡＢ
Ｃタンパク質エンコーディング遺伝子中の突然変異を検出することもできる。上
述の疾患が含まれるが、これに制限されるわけではない。

【００４７】 本発明は、更に、染色体外ベクター中にサブクローン化されたＰＤ−ＡＢＣ遺
伝子又はそれに実質的に類似した配列を含む種々のポリヌクレオチド発現ベクタ
ーを提供する。本発明のこの側面は、ＰＤ−ＡＢＣ遺伝子の in vitro 発現を可
能にし、それによって、ＰＤ−ＡＢＣ遺伝子調節及びＰＤ−ＡＢＣタンパク質の
構造及び機能の分析を可能にする。本明細書中で用いられる“染色体外ベクター
”という用語には、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、レトロウイル
ス及び人工染色体が含まれるが、これに制限されるわけではない。好ましい態様
において、染色体外ベクターは、組換えＤＮＡ分子が宿主細胞中に挿入される場
合、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質生産を可能にする発現ベクターを含む。このような
ベクターは、当該技術分野において周知であり、これには、Ｔ３又はＴ７ポリメ
ラーゼプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、又は遺伝子
発現を支配することができるか又は、遺伝子発現を支配する能力について調べた
いいずれかのプロモーターを含むものが含まれるが、これに制限されるわけでは
ない。

【００４８】 好ましい態様において、本発現ベクターは、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質（又は内
因性遺伝子の発現の阻害に適した配列のアンチセンスコピー）を発現させるよう
に、一つ又はそれ以上のプロモーター配列との機能的組合せで、ＰＤ−ＡＢＣタ
ンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。これらベクターは、遺伝子
発現、調節、又はベクターの好都合な操作のための追加のポリヌクレオチド配列
を含んでいてよく、このような追加の配列には、ターミネーター、レポーター、
エンハンサー、選択的マーカー、パッケージング部位等が含まれる。ポリヌクレ
オチド発現ベクター及びそれらの使用についての詳細な記述は、特に、Gene Exp
ression Technology: Methods in Enzymology, Vol 185 Goeddel, ed, Academic
Press Inc., San Diego, CA (1991), Protein Expression in Animal Cells, R
oth, ed., Academic Press, San Diego, CA (1994)に見出されうる。

【００４９】 本発明のポリヌクレオチド発現ベクターは、様々な用途を有する。このような
用途には、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質を発現させるための宿主細胞の遺伝子操作が
含まれる。もう一つの側面において、本発明は、染色体外ベクター中にサブクロ
ーン化された組換えＤＮＡ分子ＰＤ−ＡＢＣで安定して形質移入されている組換
え宿主細胞を提供する。本発明の宿主細胞は、細菌、酵母、哺乳動物細胞及びア
フリカツメガエル（Xenopus ）卵母細胞が含まれるがこれに制限されるわけでは
ない、いずれの種類からであってもよい。組換えＤＮＡ分子での宿主細胞の形質
移入は、当該技術分野において周知であり（Sambrook, et al., Molecular Clon
ing, A Laboratory Manual, 2 ^nd ed., Cold Spring Harbor Press, 1989）、本
明細書中で用いられるように、これには、リン酸カルシウム形質移入、デキスト
ラン硫酸形質移入、エレクトロポレーション、リポフェクション及びウイルス感
染が含まれるが、これに制限されるわけではない。本発明のこの側面は、ＰＤ−
ＡＢＣ及びそれらの遺伝子産物の in vitro 及び in vivo発現を可能にし、した
がって、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質の高レベル発現を可能にする。本発明のもう一
つの側面において、ＰＤ−ＡＢＣを含有するＲＮＡ分子を、Xenopus 卵母細胞中
に注入することができ、そして標準的な電気生理学的技法を用いて、基質の輸送
を測定することができる。

【００５０】 本発明のもう一つの側面において、適当な発現ベクター中にクローン化された
ＰＤ−ＡＢＣのヌクレオチド配列の生殖細胞中への注入によって、トランスジェ
ニック動物を作ることができる。 以下で更に詳細に論じられるポリヌクレオチド発現ベクターの他の用途には、
ＰＤ−ＡＢＣタンパク質を天然に存在する発現レベルより高いレベルで発現させ
ることが望ましい使用でありうる疾患及び状態の遺伝子治療のためのそれらの使
用が含まれる。或いは、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質の天然に存在するレベルを減少
させるアンチセンス発現のために本ベクターを用いることが望まれることがあり
うる。

【００５１】 配列番号：２及び４のポリヌクレオチド配列を、プローブを生じるライブラリ
ー源からのｃＤＮＡのヌクレオチド配列を用いてヒト染色体に地図で示した。こ
れら配列を、周知の技法を用いて、特定の染色体に又は染色体の具体的な領域に
地図で示した。これらには、染色体分布への in situハイブリダイゼーション、
及び標準的な放射線ハイブリッド細胞系からＤＮＡを増幅させることによるＰＣ
Ｒに基づく地図作成が含まれる。（Verma, et al., (1988) Human Chromosomes:
A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, NYC）。

【００５２】 もう一つの側面において、本発明は、配列番号：２又は４に示されるＰＤ−Ａ
ＢＣポリペプチドに実質的に類似したポリペプチドを含む実質的に精製された組
換えタンパク質を提供する。更に、本発明のこの側面は、下記のいくつかの in
vitro アッセイにおけるＰＤ−ＡＢＣタンパク質の使用を可能にする。本明細書
中で用いられる“実質的に類似した”という用語は、いずれの in vitro 手段に
よっても又は in vivoで天然に認められるいずれの遺伝的変化によっても導入さ
れる配列番号：２又は４の配列への欠失、置換及び付加を含む。本明細書中で用
いられる“実質的に精製された”という用語は、タンパク質が、検出可能な混入
タンパク質から分離されるべきであるが、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質が、相互作用
性タンパク質と一緒に又はオリゴマーとして同時精製されていてよいということ
を意味する。最も好ましい態様において、本発明によるタンパク質配列は、配列
番号：２又は４のアミノ酸配列を含む。本発明による突然変異した配列は、本明
細書中に与えられた内容及び当該技術分野において周知の技術を用いて、当業者
によって常套法で同定することができる。本発明のこの側面は、in vitroアッセ
イに及び医薬組成物の成分として用いることができる新規な精製されたタンパク
質を提供する。

【００５３】 ＰＤ−ＡＢＣタンパク質は、その活性を妨げる分子を発見するのに用いること
ができる。例えば、ＰＤ−ＡＢＣのリガンド又は他の分子への結合を妨げる分子
。 本発明のＰＤ−ＡＢＣタンパク質は、コレステロールの細胞流出をモジュレー
トさせる推定上の生物学的活性を有する。本発明のＰＤ−ＡＢＣタンパク質は、
様々な哺乳動物種から単離することができる。単離に好適な哺乳動物種は、霊長
類及びヒトである。本発明は、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質の対立遺伝子変異型を、
種々の哺乳動物組織から製造することができると考えている。好ましくは、ＰＤ
−ＡＢＣタンパク質は、有意の量のＰＤ−ＡＢＣタンパク質を発現するように遺
伝子操作された組換え宿主細胞から得られる。ＰＤ−ＡＢＣタンパク質は、非組
換え細胞又は組換え細胞から、当業者に周知のいろいろな方法で単離することが
できる。

【００５４】 本明細書中で用いられる“ＰＤ−ＡＢＣタンパク質”という用語は、天然に存
在するＰＤ−ＡＢＣタンパク質のアミノ酸残基配列を有するタンパク質を意味す
るのみならず、天然に存在するＰＤ−ＡＢＣタンパク質の機能性誘導体及び変異
型も意味する。天然のポリペプチドの“機能性誘導体”は、天然のＰＤ−ＡＢＣ
タンパク質と共通の定性的な生物学的活性を有する化合物である。したがって、
天然のＰＤ−ＡＢＣタンパク質の機能性誘導体は、天然のＰＤ−ＡＢＣタンパク
質と共通の定性的な生物学的活性を有する、例えば、生体膜を横切って基質を輸
送する化合物である。“機能性誘導体”には、あらゆる動物種（ヒトを含めた）
からの天然のポリペプチドのフラグメント、及び天然の （ヒト及び非ヒト）ポ
リペプチドの誘導体及びそれらのフラグメントが含まれるが、これに制限される
わけではなく、それらは、それぞれの天然のポリペプチドと共通の生物学的活性
を有するということを条件とする。“フラグメント”は、成熟天然ポリペプチド
の配列内の領域を含む。“誘導体”という用語は、アミノ酸配列及びグリコシル
化変異型、及び天然ポリペプチドの共有結合修飾を定義するのに用いられるが、
“変異型”という用語は、この定義の範囲内のアミノ酸配列及びグリコシル化変
異型を意味する。好ましくは、機能性誘導体は、該当する天然ポリペプチドの配
列に少なくとも約７０％のアミノ酸配列類似性、より好ましくは約８０％のアミ
ノ酸配列類似性、なお一層好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸配列類似性、
最も好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列類似性を有するポリペプチド
である。最も好ましくは、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質の機能性誘導体は、リガンド
結合に直接的に関与する天然ポリペプチド配列中の一つ又は複数の領域を保持す
る又は模倣する。“機能性誘導体”という句は、具体的には、天然のＰＤ−ＡＢ
Ｃタンパク質と共通の定性的な生物学的活性を有するペプチド及び有機低分子を
含む。

【００５５】 天然ポリペプチド及びその機能性誘導体に関する“同一性”又は“相同性”は
、本明細書中において、配列を整列させ、そして必要ならば最大相同％に達する
ようにギャップを導入後、該当する天然ポリペプチドの残基に類似する候補配列
中のアミノ酸残基の百分率として定義される。Ｎ−又はＣ末端の伸長も挿入も、
別にスプライシングされた変異型も、同一性又は相同性を減少させると解釈され
るべきではない。整列のための方法及び計算機プログラムは、当該技術分野にお
いて周知である。

【００５６】 天然のＰＤ−ＡＢＣタンパク質のアミノ酸配列変異型又はＰＤ−ＡＢＣタンパ
ク質フラグメントは、当該技術分野において知られている方法により、天然又は
変異型のＰＤ−ＡＢＣタンパク質エンコーディングＤＮＡ中に適当なヌクレオチ
ド変化を導入することによって、又は所望のポリペプチドの in vitro 合成によ
って製造される。アミノ酸配列変異型の構築には、二つの主な変数、すなわち、
突然変異部位の場所及び突然変異の性状がある。ＰＤ−ＡＢＣタンパク質をコー
ドするＤＮＡ配列の操作を必要としない天然に存在する対立遺伝子を除外して、
ＰＤ−ＡＢＣタンパク質のアミノ酸配列変異型は、好ましくは、このＤＮＡを、
対立遺伝子にか又は、天然に存在しないアミノ酸配列変異型に達するように突然
変異させることによって構築される。 或いは、又は更に、アミノ酸変更は、いろいろな種からのＰＤ−ＡＢＣタンパ
ク質が又は高度に保存された領域が、達成されるべき目的によって異なる部位で
行うことができる。

【００５７】 このような場所の部位は、典型的には、例えば、（１）最初に保存的選択で、
次に、得られた結果によって一層ラジカルな選択で置換し、（２）一つ又は複数
の標的残基を欠失させ、又は（３）位置決定された部位に隣接して同じ又は異な
ったクラスの残基を挿入することによって、又は選択肢１〜３の組合せによって
順次に修飾されるであろう。 一つの有用な技術は、“アラニン走査” Cunningham and Wells, Science, 19
89;244:1081-1085と称される。ここでは、標的残基の残基又は基を同定し、アラ
ニン又はポリアラニンによって置換する。次に、アラニン置換に機能的感受性を
示すドメインを、アラニン置換部位に又はの代わりに追加の又は他の置換基を導
入することによって精密にする。 一つ又は複数の所望の突然変異を同定後、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質変異型をコ
ードする遺伝子を、例えば、化学合成によって得ることができる。

【００５８】 より好ましくは、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質アミノ酸配列変異型をコードするＤ
ＮＡは、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質の初めに製造された変異型又は非変異型をコー
ドするＤＮＡの位置指定突然変異誘発によって製造される。位置指定（部位特異
的）突然変異誘発は、所望の突然変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌ
クレオチド配列、更には、充分に多数の隣接したヌクレオチドの使用によって、
ＰＤ−ＡＢＣタンパク質変異型の生産を可能にして、横断されている欠失結合部
の両側に安定な二重らせんを形成する充分なサイズ及び配列コンプレキシティー
のプライマー配列を提供する。典型的には、約２０〜２５ヌクレオチド長さのプ
ライマーが好適であり、その配列の結合部の両側の約５〜１０残基が変更されて
いる。概して、部位特異的突然変異誘発の技術は、Edelman, et al., DNA, 1983
;2:183などの公報によって示されるように、当該技術分野において周知である。
理解されるように、部位特異的突然変異誘発技術は、典型的には、一本鎖及び二
本鎖両方の形で存在するファージベクターを用いる。位置指定突然変異誘発にお
いて有用な典型的なベクターには、Ｍ１３ファージのようなベクターが含まれる
。この及び他のファージベクターは、商業的に入手可能であり、それらの使用は
、当業者に周知である。Ｍ１３由来ベクターを用いたＤＮＡフラグメント中のオ
リゴデオキシリボヌクレオチドに支配される部位特異的突然変異誘発の構築のた
めの多用性のある且つ有効な方法は、Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic A
cids Res., 1982; 10:6487-6500 によって公表された。更に、一本鎖ファージ複
製起点を含有するプラスミドベクター（Veira, et al., Meth. Enzymol., 1987;
153:3）は、一本鎖ＤＮＡを得るのに用いることができる。或いは、ヌクレオチ
ド置換は、適当なＤＮＡフラグメントを in vitro で合成し、そしてそれを当該
技術分野において知られているＰＣＲ法によって増幅することにより導入される
。

【００５９】 概して、部位特異的突然変異誘発は、関連のあるタンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列をその配列中に含む二本鎖か又は一本鎖のベクターを入手することによっ
て行うことができる。所望の突然変異した配列を有するオリゴヌクレオチドプラ
イマーを、概して、合成によって、例えば、Crea, et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1978;75:5765の方法によって製造する。次に、このプライマーを、一
本鎖タンパク質配列含有ベクターでアニーリングし、そしてＥ．coliポリメラー
ゼＩクレノウフラグメントのようなＤＮＡ重合酵素に委ねて、突然変異含有鎖の
合成を完了する。したがって、一方の鎖が元の非突然変異配列をコードし、もう
一方の鎖が所望の突然変異を含有するヘテロ二本鎖が形成される。次に、このヘ
テロ二本鎖ベクターを用いて、ＨＢ１０１細胞のような適当な宿主細胞を形質転
換し、そして突然変異した配列の配置を有する組換えベクターを含むクローンを
選択する。その後、突然変異した領域を取り出し、タンパク質生産に適当な発現
ベクター中に入れることができる。

【００６０】 ＰＣＲ技術は、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質のアミノ酸配列変異型を生じる場合に
用いることもできる。少量の鋳型ＤＮＡをＰＣＲにおいて出発物質として用いる
場合、鋳型ＤＮＡ中の該当する領域とは配列が僅かに異なるプライマーを用いて
、それらプライマーが鋳型とは異なる位置でのみ、鋳型配列とは異なる特定のＤ
ＮＡフラグメントを比較的多量に生じることができる。プラスミドＤＮＡ中への
突然変異の導入について、これらプライマーの一つは、突然変異の位置をオーバ
ーラップさせるように、及び突然変異を含有するように設計され、他のプライマ
ーの配列は、プラスミドの反対鎖の配列の伸長部分と一致しなければならないが
、この配列は、プラスミドＤＮＡに沿ったどこにでも位置することができる。し
かしながら、第二プライマーの配列は、末端において、それらプライマーによっ
て結合したＤＮＡの増幅した領域全体を容易に配列決定できるように、第一配列
から５００〜５０００ヌクレオチドの範囲内に位置することが好適である。ちょ
うど記載されたもののようなプライマー対を用いたＰＣＲ増幅は、鋳型コピーは
多少誤りがちであるので、プライマーによって規定される突然変異の位置で、そ
しておそらくは他の位置で異なるＤＮＡフラグメントの集団を生じる。

【００６１】 前述の及び類似した突然変異誘発技術の更に詳細は、一般的な教本、例えば、
Sambrook, et al., Molecular Cloning: H Laboratorv Manual 2nd edition, Co
ld Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor (1989),及び Current Protocols
in Molecular Biology, Ausubel, et al. eds., John Wiley and Sons (1995)
などに見出される。 天然に存在するアミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいて、グループに分けられ
る： （１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ； （２）中性疎水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｉｅｒ； （３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ； （４）塩基性：ａｓｎ、ｇｉｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ｅｒｇ； （５）鎖配向に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び （６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｉｎｅ。

【００６２】 保存的置換は、一つのグループ内のメンバーを同じグループ内の別のメンバー
に交換することを行うが、非保存的置換は、これらクラスの一つのメンバーを別
のものに交換することを必要とするであろう。非保存的置換によって得られる変
異型は、得られた変異型の生物学的性質／機能に有意の変化を生じると考えられ
、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質生物学的活性、すなわち、コレステロール流出のモジ
ュレーションを伴うＰＤ−ＡＢＣタンパク質変異型を生じることがありうる。い
ろいろな種の中に保存されるアミノ酸位置は、概して、生物学的機能を保持する
ことを目的とする場合、比較的保存的な方法で置換される。 アミノ酸配列欠失は、概して、約１〜３０残基、より好ましくは、約１〜１０
残基であり、典型的には、連続している。欠失は、リガンド結合に直接的に関与
しない領域中に導入することができる。

【００６３】 アミノ酸挿入には、長さが１残基から１００又はそれを越える残基を含有する
ポリペプチドまでのアミノ−及び／又はカルボキシル末端融合、並びに、１又は
複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。配列内挿入（すなわち、ＰＤ−Ａ
ＢＣタンパク質アミノ酸配列内の挿入）は、概して約１〜１０残基、より好まし
くは１〜５残基、より好ましくは１〜３残基であってよい。末端挿入の例には、
Ｎ末端メチオニル残基、天然に存在するＮ末端シグナル配列、細菌の組換え細胞
培養物中の直接発現のアーチファクト、及び組換え宿主細胞からの成熟ＰＤ−Ａ
ＢＣタンパク質の分泌を容易にするＰＤ−ＡＢＣタンパク質のＮ末端への異種Ｎ
末端シグナル配列の融合を含むＰＤ−ＡＢＣタンパク質が含まれる。このような
シグナル配列は、概して、予定の宿主細胞種から得られるであろうし、したがっ
て、それに同種であろう。適当な配列には、Ｅ．coli についてＳＴII又はＩｐ
ｐ、酵母についてα因子、及び哺乳動物細胞についてはヘルペスｇＤのようなウ
イルスシグナルが含まれる。天然のＰＤ−ＡＢＣタンパク質分子の他の挿入変異
型には、ＰＣＴ公開出願ＷＯ８９／０２９２２号に記載のように、免疫原性ポリ
ペプチド、例えば、β−ラクタマーゼのような細菌ポリペプチド又はＥ．coldｔ
ｒｐ遺伝子座によってコードされる酵素、又は酵母タンパク質へのＰＤ−ＡＢＣ
タンパク質のＮ−又はＣ末端の融合、及び免疫グロブリン領域（好ましくは、免
疫グロブリン定常領域）、アルブミン又はフェリチンのような長い半減期を有す
るタンパク質とのＣ末端融合が含まれる。

【００６４】 変異型ＰＤ−ＡＢＣタンパク質の特徴を予想することは、しばしば困難である
ので、最適の変異型を選択するのにスクリーニングが必要とされるということは
理解されるであろう。この目的には、本明細書中の下に記載されたような生化学
的スクリーニングアッセイが容易に利用可能であろう。 もう一つの側面において、本発明は、配列番号：２又は４のアミノ酸配列に実
質的に類似したアミノ酸配列を含むポリペプチドに選択的に結合する抗体を検出
するための抗体及び方法を提供する。以下で更に詳細に論じられるように、本発
明の抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、配列番号：
２又は４の配列の全部又は一部分、又はその修飾部分を用いることによって製造
され、宿主動物において標準的な技法によって免疫応答を引き出すことができる
（Harlow and Lane (1988), eds. Antibody: A Laboratory Manual, Cold Sprin
g Harbor Press）。好ましい態様において、配列番号：２又は４のポリペプチド
配列全体を用いて、宿主動物中でのポリクローナル抗体の産生を引き出す。

【００６５】 ＰＤ−ＡＢＣ抗体を検出する方法は、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質を認識する抗体
と細胞を接触させ、それら細胞を、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質−抗体複合体の検出
を可能にする方法でインキュベートすることを含む。抗原の抗体検出の標準条件
を用いて、本発明のこの側面を達成することができる（Harlow and Lane, 1988
）。本発明のこの側面は、in vitro及び in vivo両方のＰＤ−ＡＢＣタンパク質
の検出を可能にする。 本発明は、望ましくない異常な細胞レベルのＰＤ−ＡＢＣを特徴とする様々な
疾患の治療方法を提供する。疾患は、in vitroか又は in vivoの遺伝子治療によ
ることができる。ウイルスベクターの使用による遺伝子治療のプロトコルは、特
に、Viral Vector Gene Therapy and Neuroscience Applications, Kaplit and
Lowry, Academic Press, San Diego (1995) に見出されうる。遺伝子治療用途は
、典型的には、治療を必要とする標的宿主細胞又は組織を特定し、望ましい遺伝
子産物をその特定された細胞中で発現することができるベクター構築物を設計し
、そしてそれら構築物を、標的細胞の有効な形質導入を引き起こすようにそれら
細胞に供給することを行う。遺伝子治療によって標的とされる細胞又は組織は、
典型的には、治療するためにベクター構築物が設計される疾患に罹患しているも
のである。

【００６６】 本発明の遺伝子治療方法は、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質（又は阻害性アンチセン
スＲＮＡ）の発現のためのベクターを患者細胞中に導入する段階を含む。患者細
胞は、患者体内であっても、すなわち、in vivo 遺伝子治療であっても、患者体
外であって、後で患者体内に再導入されてもよく、すなわち、in vitro遺伝子治
療であってよい。本遺伝子治療方法によって治療することができる疾患には、異
常脂肪血症に関連したものが含まれるが、これに制限されるわけではない。ＨＤ
Ｌ代謝の変化のような異常脂肪血症、又は異常脂肪血症によって生じるＣＡＤは
、多数の疾患に関連している。このような疾患には、糖尿病、脂肪肝疾患、肥満
症、インスリン抵抗性、アルコール中毒症、網膜変性、高血圧症及び一般の血管
病が含まれる。

【００６７】 本発明の好ましい側面において、細胞中の異常レベルのＰＤ−ＡＢＣから哺乳
動物細胞を保護する方法であって、哺乳動物細胞中に、配列番号：１又は３に示
されるＤＮＡ配列に実質的に類似したＤＮＡ配列を含む、そのＤＮＡ配列の発現
を促進するＤＮＡ配列に機能的に結合している発現ベクターを導入し、そして配
列番号：１又は３のＤＮＡ配列が哺乳動物細胞中において高レベルで発現される
であろう条件下で細胞をインキュベートすることを含む方法を提供する。適当な
発現ベクターは、上記の通りである。好ましい態様において、ヒトＰＤ−ＡＢＣ
遺伝子のコーディング領域を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの
転写制御下で発現ベクター中にサブクローン化して、構成性ＰＤ−ＡＢＣ遺伝子
発現を可能にする。

【００６８】 本発明のもう一つ好ましい側面において、異常レベルのＰＤ−ＡＢＣを治療又
は予防する方法であって、配列番号：１又は３に示されるＤＮＡ配列に実質的に
類似した配列にアンチセンスであるＤＮＡを含んでなる発現ベクターであって、
そのアンチセンスＤＮＡ配列の発現を促進するＤＮＡ配列に機能的に結合してい
る発現ベクターを、哺乳動物細胞中に導入することを含んでなる方法を提供する
。次に、それら細胞を、配列番号：１又は３のアンチセンスＤＮＡ配列が哺乳動
物細胞中において高レベルで発現されるであろう条件下で増殖させる。 最も好ましい態様において、このＤＮＡ配列は、配列番号：１又は３から本質
的に成る。更に好ましい態様において、発現ベクターは、ＰＤ−ＡＢＣｃＤＮＡ
がＣＭＶプロモーターにアンチセンス配向で機能的に結合して、宿主細胞中での
ＰＤ−ＡＢＣアンチセンスｃＤＮＡの構成性発現を可能にするアデノウイルスベ
クターを含んでなる。好ましい態様において、ＰＤ−ＡＢＣアデノウイルス発現
ベクターを、哺乳動物への注射によって細胞中に導入する。

【００６９】 本発明のもう一つの側面は、目的の化合物がＰＤ−ＡＢＣタンパク質に結合で
きるかどうか決定するのに有用なアッセイを提供することである。この結合は、
ＡＢＣ１へのリガンドの結合を妨げるか又は模倣することがありうるし、又はこ
の結合は、膜を横切って基質を輸送する場合又はコレステロール流出をモジュレ
ートさせる場合のＰＤ−ＡＢＣの機能に影響を与えることがありうる。このアッ
セイは、目的の化合物のＰＤ−ＡＢＣタンパク質への結合を測定する工程を含む
。ＰＤ−ＡＢＣタンパク質か又はアッセイされる目的の化合物を、目的の化合物
とＰＤ−ＡＢＣタンパク質との間の複合体形成を検出させるように、検出可能な
標識、例えば、放射性標識又は蛍光標識で標識してよい。本アッセイのもう一つ
の態様において、これらアッセイは、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質と、ＡＢＣ１タン
パク質に結合することが既に知られているリガンドとの間の結合相互作用につい
ての目的の化合物の干渉、すなわち、競合的結合を測定することを含む。例えば
、放射性標識リガンドとＰＤ−ＡＢＣタンパク質との間の複合体形成への増加量
の目的の化合物の作用は、標識リガンドＰＤ−ＡＢＣタンパク質複合体形成を定
量することによって測定することができる。本アッセイのもう一つの態様におい
て、これらアッセイは、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質の活性を有する目的の化合物の
変化、すなわち、非競合阻害を測定することを含む。

【００７０】 ＰＤ−ＡＢＣタンパク質へのポリクローナル抗体は、一般に、ＰＤ−ＡＢＣタ
ンパク質及びアジュバントの皮下（ｓｅ）又は腹腔内（ｉｐ）注射を複数回する
ことによって動物中に発生する。ＰＤ−ＡＢＣタンパク質又は標的アミノ酸配列
を含有するフラグメントを、免疫感作される種に免疫原性であるタンパク質、例
えば、スカシガイのヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン又はダ
イズトリプシン阻害剤に、二官能又は誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイ
ルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基による複合）、Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド（リシン残基による）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、
ＳＯＣｌ₂ 又はＲ₁ 〜Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ₁ は異なったアルキル基で
ある）を用いて複合させることは、有用でありうる。

【００７１】 動物は、１ｍｇ又は１ｆｉｇの複合体（ウサギ又はマウスそれぞれについて）
を３容量のフロイント完全アジュバントと混合し、その溶液を複数部位に皮内注
射することにより、免疫原性複合体又は誘導体に対して免疫感作する。１ヶ月後
、それら動物に、フロイント完全アジュバント中の複合体の元の量の１／５〜１
／１０を、皮下注射によって複数部位にブースター投与する。７〜１４日後、被
験動物から採血し、その血清を抗ＰＤ−ＡＢＣタンパク質抗体力価についてアッ
セイする。力価がプラトーになるまで、被験動物にブースター投与する。好まし
くは、被験動物には、同じＰＤ−ＡＢＣタンパク質の複合体をブースター投与す
るが、異なったタンパク質に及び／又は異なった架橋試薬によって複合していて
よい。複合体は、組換え細胞培養物中でタンパク質融合として製造することもで
きる。更に、ミョウバンのような凝集剤は、免疫応答を増強するのに用いられる
。

【００７２】 モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られる、すなわち、
その集団を構成する一つ一つの抗体は、僅かに存在しうる可能性のある天然に発
生する突然変異を除いては一致する。したがって、“モノクローナル”という修
飾語は、別々の抗体の混合物ではないものとしての抗体特性を示す。例えば、本
発明の抗ＰＤ−ＡＢＣタンパク質モノクローナル抗体は、Kohler & Milstein, N
ature, 1975;256:495 によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて製造
することができるし、又は組換えＤＮＡ法（Cabilly, et al, 米国特許第４，８
１６，５６７号）によって製造することができる。

【００７３】 抗体は、タンパク質展示ファージを用いて生じることもできる。このアプロー
チの場合、ランダム配列のペプチドのライブラリーを、ファージ中にクローン化
された抗体遺伝子中で生じる。これらファージライブラリーは、不動化タンパク
質に対してスクリーニングすることにより、抗体についてスクリーニングされる
（HoogenboomHR, TrendsBiotechnol. 1997; 15(2):6270）。 ハイブリドーマ法の場合、マウス、又はハムスターのような他の適当な宿主動
物を、上記のように免疫感作して、免疫感作に用いられるタンパク質に特異的に
結合するであろう抗体を産生するか又は産生することができるリンパ球を引き出
す。或いは、リンパ球は、in vitroで免疫感作することができる。次に、リンパ
球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合
させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Coding, Monoclonal Antibodies: P
rinciples and Practice, pp.59-103 [academic Press, 1986]）。

【００７４】 本発明のＰＤ−ＡＢＣタンパク質特異的抗体は、多数の用途を有する。これら
抗体は、組換え細胞か又は非組換え細胞からＰＤ−ＡＢＣタンパク質を精製する
のに用いることができる。本抗体は、例えば、血液、皮膚等からの組織試料中の
ＰＤ−ＡＢＣタンパク質の存在を検出する及び／又は定量するのに用いることが
できる。ＰＤ−ＡＢＣタンパク質の定量化は、ＰＤ−ＡＢＣタンパク質発現レベ
ルの特定のレベルと相関していた疾患及び生理学的又は遺伝的状態についての診
断に用いることができる。 もう一つの側面において、本発明は、ＰＤ−ＡＢＣ欠失を含有する細胞を検出
する診断アッセイであって、細胞から全ゲノムＤＮＡを単離し、そのゲノムＤＮ
Ａに、配列番号：１又は３のＤＮＡ配列に由来するプライマーを用いたＰＣＲ増
幅を行うことを含む診断アッセイを提供する。

【００７５】 本発明のこの側面は、あらゆるタイプの細胞中のＰＤ−ＡＢＣ欠失の検出を可
能にし、遺伝的検査において又は実験室手段として用いることができる。これら
ＰＣＲプライマーは、ゲル電気泳動によって検出されるように充分に大きいＰＤ
−ＡＢＣ遺伝子フラグメントの増幅を可能にするいずれの方法でも選択すること
ができる。検出は、アガロースゲル又はポリアクリルアミドゲルの臭化エチジウ
ム染色、放射性標識されたＰＤ−ＡＢＣ遺伝子フラグメントのオートラジオグラ
フ検出、サザンブロットハイブリダイゼーション及びＤＮＡ配列分析が含まれる
がこれに制限されるわけではないあらゆる方法によることができる。好ましい態
様において、検出は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ＤＮＡ配列分析を行
って、欠失の同一性を証明することによって行われる。ＰＣＲ条件は、当該技術
分野において周知の技法によって選択されるプライマーの長さ及び塩基含量に基
づいて常套的に決定される（Sambrook, et al., 1989）。

【００７６】 本発明のもう一つの側面は、ＰＤ−ＡＢＣ欠失を含有する細胞を検出する診断
アッセイであって、全細胞ＲＮＡを単離し、そのＲＮＡに、配列番号：１又は３
のＤＮＡ配列に由来するプライマーを用いた逆転写−ＰＣＲ増幅を行うことを含
む診断アッセイを提供する。本発明のこの側面は、あらゆるタイプの細胞中のＰ
Ｄ−ＡＢＣ欠失の検出を可能にし、遺伝的検査において又は実験室手段として用
いることができる。 逆転写は、標準的な技法（Ausubel, et al., in Current Protocols in Molec
ular Biology, ed. John Wiley and Sons, Inc., 1994 ）によって常套的に行わ
れ、ＰＣＲは、上記のように行われる。 本発明は、単に例示のためのものであって、クレイムによって定義される発明
の範囲を制限すると解釈されるべきではない添付の実施例を参照して、よりよく
理解することができる。

【００７７】 材料及び方法配列分析 ＡＢＣ１及びＡＢＣＲタンパク質配列を検索子として用いたＴＢＬＡＳＴＮ検
索を、CompugenＬＥＡＤＳ^TMプラルフォーム（plarform）を用いて生じたクラス
ター化ＥＳＴデータベースに対して行った。４個のＥＳＴから成る単一ＥＳＴク
ラスターを同定した（受託番号ＡＩ７３３５５２，Ｈ２１５８５）。この４個の
ＥＳＴは、ＰＤ−ＡＢＣの二つの異なったイソフォームを示す。Genbank ^TMデー
タベースの高処理量ゲノム配列（ＨＴＧ）部分のＢＬＡＳＴＩＮ検索は、ＰＤ−
ＡＢＣの完全なコーディング領域を含有するＨＴＧ配列（受託番号ＡＣ０１１５
５８）の同定をもたらした。

【００７８】ＰＤ−ＡＢＣのｃＤＮＡの単離 データベース中の二つのＥＳＴ（Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．＃１６００３８及びＩ
．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．＃１８２９３３）は、翻訳後にヒトＡＢＣ１と有意な相同性
を共有する部分読み取り枠を含有する。これらＥＳＴをＡＴＣＣから得、完全に
配列決定した。これらＥＳＴは、それぞれ、１．２ｋｂ（Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．
＃１６００３８）及び１．１ｋｂ（Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．＃１８２９３３）のイ
ンサートサイズを有する。これら二つのクローンは、１ｋｂのそれらのオーバー
ラップ領域において一致する。プローブとして両方のＥＳＴに共通する領域を用
いて、ｃＤＮＡクローンを３種類の、すなわち、成人脳、骨格筋及び乳腺のヒト
ｃＤＮＡライブラリー混合物から単離した（EdgeBiosystems, Gaithersburg, MD
）。ＤＮＡ配列決定は、普遍的且つ合成のプライマーで行った。

【００７９】５’ｃＤＮＡ末端のＰＣＲ増幅 最長のクローンを配列決定し、そして５’末端を欠いていることが判明した。
ｃＤＮＡ配列との同一性を有する、データベース検索で生じた高処理量ゲノム配
列クラスターを得た。３対のプライマーを、この高処理量ゲノム配列に基づいて
合成した。これらプライマー対領域は次である。

【００８０】

【表４】 １．順方向プライマー ５’−ＴＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＡＣＡＧ−３’ 逆方向プライマー ５’−ＣＡＣＧＴＡＧＣＧＣＡＧＧＴＣＧＧＴＣＡＧＧＧ−３’ ２．順方向プライマー ５’−ＧＣＴＧＡＴＴＧＧＡＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡ−３’ 逆方向プライマー ５’−ＧＴＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡＣＧＧＡＴＡＧＧＧＣＡＴ−３’ ３．順方向プライマー ５’−ＴＣＧＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＧＴＧ−３’ 逆方向プライマー ５’−ＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＣＴＣＴＣＧＣＡＧＣＣ−３’

【００８１】 ＰＣＲ反応は、ヒト下垂体又は胸腺 MarathonReadyｃＤＮＡ（Clontech）で行
った。反応は、９４℃で５分間の初期変性で開始後、９４℃で３０秒間、６０℃
で２分間、７２℃で２分間を２８サイクルを行い、７２℃で１０分間の最後の伸
長を行った。３対のプライマーでのＰＣＲ反応は、次のサイズ、すなわち、１．
８ｋｂ、８００ｂｐ及び６００ｂｐをそれぞれ有する３本のバンドを生じた。こ
れらＰＣＲ産物を、ｐＣＲII−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen）中に連結し、普
遍的且つ合成のプライマーで配列決定した。

【００８２】ノーザンブロット分析 ノーザンブロット法のためのジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識プローブを、部分
ＰＤ−ＡＢＣ ｃＤＮＡフラグメントの配列に基づいたプライマーを含むＰＣＲ
ラベリングキット（Boehringer Mannheim ）を用いて生じた。順方向プライマー
は、５’−ＣＡＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＴＧＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＧ−３’であり
、逆方向プライマーは、５’−ＴＴＴＡＴＧＣＡＧＧＴＧＡＧＣＡＣＣＡＣＡＴ
ＡＧ−３’であった。２６２ｂｐのＰＣＲ産物をゲル精製し、ノーザンブロット
法に用いた。このＰＣＲ用の鋳型は、ＰＤ−ＡＢＣ部分ｃＤＮＡフラグメントか
又はヒト脾臓ｃＤＮＡ（Clontech）であった。１２組織マスターブロット（Orig
ene, Rockville, MD）及び６組織マスターブロット（Clontech）を、プローブと
ハイブリダイズさせ、そして製造者の取扱い説明書（Boehringer Mannheim ）に
したがって展開させた。同ブロットを取り、ＤＩＧ標識ＧＡＰＤＨ又は対照目的
のβアクチンプローブとハイブリダイズさせた。

【００８３】ＲＴ−ＰＣＲによる組織分布 二つのＰＤ−ＡＢＣ変異型の組織特異的発現を、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反
応（以下、“ＲＴ−ＰＣＲ”）によって行った。RapidScan Gene Expression Pa
nels（Origene ）をＰＣＲ鋳型として用いた。フォーム１に特異的なプライマー
は、５’−ＣＣＣＣＴＣＴＴＣＣＴＴＣＴＣＴＴＣＡＣＡＣＴＡＣ−３’（順方
向プライマー）及び５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＡＡＡＡＣＡＣＴＣＡＣＣＡＣ−３
’（逆方向プライマー）であり；フォーム２に特異的なプライマーは、５’−Ｔ
ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＡＴＧＴＡＧ−３’（順方向プライマー）
及び５’−ＡＧＧＴＧＴＴＣＡＧＴＡＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＧＧ−３’（逆方向
プライマー）である。ＰＣＲ反応は、次のように、すなわち、９５℃１分間；６
２℃１分間；７２℃１分間を３５サイクルで行った。ＰＣＲ産物は、１％ NuSie
veゲル（ＦＭＣ）上で分離した。

【００８４】 結果及び考察ＰＤ−ＡＢＣの単離及び一次構造 ＡＢＣ１は、ＡＢＣＡサブファミリーのメンバーであり（Broccardo, C. et a
l., Biochim. Biophys. Acta, 1999; 1461:395-404）、ＴＤと関連している。最
近の薬理学的実験は、ＡＢＣ１が、コレステロール及びリン脂質の輸送に関与す
ることを示した（Lawn, R. M., et al., J. Clin. Invest. 104, R25-31, 1999)
。二つの追加のＡＢＣＡサブファミリーメンバーＡＢＣ２及びＡＢＣＲが記載さ
れている（Luciani, MF., et al., EMBO J, 1996; 15:226235; Allikmets, R.,
et al., Nat. Genet., 1997; 15:236246）。ＡＢＣＲ及びＡＢＣ２の機能はまだ
知られていないが、ＡＢＣＲは、Ｎ−レチニリデンホスファチジルエタノールア
ミンのフリッパーゼ（flipase ）として報告されている（Weng, L, et al. Cell
, 1999;98:1323）。他のＡＢＣ１ホモログ、特に、コレステロール代謝にも関与
するものについて検索するために、本発明者は、ＡＢＣ１及びＡＢＣＲに相同性
を有する新規な配列についてデータベースを検索した。二つのオーバーラップＥ
ＳＴが同定されたが、これらは、部分読み取り枠を含有する。この読み取り枠の
５’末端８０％は、ＡＢＣ１に類似している。そして一方、読み取り枠の３’末
端２０％は、ＡＢＣ１との相同性を全く有していない。更に、この読み取り枠は
、ＡＢＣ１において予想されるように、該当するＮＢＦを含有しない（Bodzioch
, M., et al., Nature Genetics, 1999;22:347-351; BrooksWilson, A., et al.
, Nature Genetics, 1999;22:336-345; Rust, S., et al., Nature Genetics, 1
999;22:352-355）。

【００８５】 ＡＢＣ１に相同の配列に基づくプローブを用いて、本発明者は、ヒトｃＤＮＡ
ライブラリーからｃＤＮＡクローンを得た。最長のクローンを配列決定したが、
それは、５’末端中のＥＳＴ配列と一致する。興味深いことに、このクローンの
３’末端は、ＥＳＴのそれと異なる。更に、このクローンは、翻訳後の第二のＮ
ＢＦを含有し、アミノ酸配列全体がＡＢＣ１に相同性を有する。本発明者は、別
のスプライシングに由来するＰＤ−ＡＢＣの二つの型が存在すると予想した。ｃ
ＤＮＡクローンは、第二ＮＢＦを含有するフォーム１であり；ＥＳＴは、第二Ｎ
ＢＦを欠くフォーム２である。本発明者は、図２で示される別のスプライス部位
を同定し、イントロン及びエクソンのサイズ、更には、イントロン−エクソン結
合領域を、下の表１及び表２に示す。

【００８６】

【表５】

【００８７】

【表６】

【００８８】

【表７】

【００８９】

【表８】

【００９０】 種々の技法を用いて（材料及び方法）、本発明者は、完全長ＰＤ−ＡＢＣコー
ディング領域を得た。この完全長ＰＤ−ＡＢＣは、２１４６アミノ酸の読み取り
枠を含有し、典型的なＡＢＣトランスポーターである。ＰＤ−ＡＢＣは、現在の
ところ、公的データベース中においてＡＢＣ１に最も近いオーソログ (ortholog
) である。この配列を、ＡＢＣ１及びＡＢＣＲと一緒に整列させた（図１）。Ｐ
Ｄ−ＡＢＣとＡＢＣ１との間の相同性は６６％である。ＰＤ−ＡＢＣ列の最も保
存された領域は、膜貫通ドメイン及びヌクレオチド結合性ドメインに相当する。

【００９１】 ＰＤ−ＡＢＣの二つのスプライス変異型の存在、特に、フォーム２が第二ＮＢ
Ｆを含有しないということは興味深い（図２）。ＡＢＣトランスポーターでは、
ＮＢＦはＡＴＰの結合及び加水分解に必要であり、これが、基質の輸送のための
エネルギーを与える。他のＡＢＣトランスポーターにおける第二ＮＢＦの欠如は
、通常、機能不全トランスポーターを生じる。一定のＴＤ患者では、ＡＢＣ１の
Ｃ末端でのノンセンス突然変異又は欠失は、コレステロール流出の減少に関与し
ており、これは、トランスポーター活性に第二ＮＢＦが必要であるということが
示唆している。フォーム２ＰＤ−ＡＢＣにおける第二ＮＢＦの損失は、全く活性
を持たないトランスポーターを生じることがありうる。このトランスポーターは
、しかしながら、依然として基質に結合することができるので、基質についてフ
ォーム１トランスポーターと競合することによって輸送調節因子として役立ちう
る。或いは、第一ＮＢＦは、ＡＢＣ８のような半分のサイズのＡＢＣトランスポ
ーターの場合のように、輸送エネルギーを与えるのに不可欠であるかもしれない
（Klucken, L, et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 2000;97:817-822）。

【００９２】ＰＤ−ＡＢＣの予測される遺伝子構造 ＰＤ−ＡＢＣの全体構造の概略を図２に示す。完全長ｃＤＮＡ配列を用いて、
本発明者は、完全なＰＤ−ＡＢＣコーディング配列に整列している高処理量ゲノ
ムデータベース中で二つのオーバーラップゲノム配列を同定した。ＰＤ−ＡＢＣ
ゲノム配列中に停止コドンは見出されなかったので、これは偽遺伝子であること
が示された。ＰＤ−ＡＢＣのゲノム配列は両方とも、ヒト染色体１９ｐ１３．３
に由来する。

【００９３】 ＰＤ−ＡＢＣのｃＤＮＡ配列をそれらゲノム配列に整列させることにより、本
発明者は、その遺伝子のイントロン−エクソン境界を決定することができた（図
２Ｂ）。ＰＤ−ＡＢＣのフォーム１のコーディング領域は、４７個のエクソン中
に含まれ、２０ｋｂのゲノム配列をカバーする（図２）。ＰＤ−ＡＢＣのフォー
ム２は、イントロン番号３８に見出される別のポリアデニル化シグナルを利用す
る。これは、ＰＤ−ＡＢＣ転写物のトランケーションをもたらす。ＰＤ−ＡＢＣ
のイントロン／エクソン境界。興味深いことに、ＰＤ−ＡＢＣのイントロン／エ
クソン構造は、ＡＢＣ１及びＡＢＣＲの構造に極めて類似している（データは示
されていない）。

【００９４】ＰＤ−ＡＢＣの組織分布 ＰＤ−ＡＢＣの組織分布を、フォーム１及びフォーム２両方に共通のプローブ
を用いたノーザンブロット分析によって調べた。８〜９ｋｂのサイズのバンドが
認められた（図３Ａ）。その転写物は脾臓でしか検出されなかったので、ＰＤ−
ＡＢＣは、脾臓で特異的に発現されるということが示唆された。脳、心臓、肺、
肝及び筋肉を含めた、調べられた他の組織では発現が認められなかった。同じブ
ロットをＧＡＰＤＨプローブと更にハイブリダイズさせて、この脾臓特異的発現
が、ｍＲＮＡ試料の不均等な処理量の結果ではないということを示した。 この脾臓特異的発現は、本発明者に、免疫系の細胞又は組織中でのＰＤ−ＡＢ
Ｃの発現を調べるよう促した。実際に、本発明者は、リンパ節、胸腺、末梢血白
血球、骨髄及び胎児肝を含めた、調べられた免疫系組織中において、ＰＤ−ＡＢ
Ｃが高度に発現されるということを発見した（図３Ｂ）。興味深いことに、末梢
血白血球及び胎児肝には二つのバンドが存在する。これら二つの転写物は、両組
織中でほとんど等しく発現されるが、より少ないメッセージが骨髄において僅か
に弱く示される。二つの転写物は、本発明者が同定した二つの変異型でありうる
（図３Ａ）。より広い範囲のいろいろな組織中でのＰＤ−ＡＢＣ発現を更に評価
するために、本発明者は、ヒト組織についてドットブロット分析を行った（表３
）。

【００９５】

【表９】

【００９６】 図３Ｂのものと一致して、ＰＤ−ＡＢＣは、主に免疫系で発現される。更に、
それは下垂体でも高度に発現される。 免疫系におけるＰＤ−ＡＢＣの発現パターンは、ＰＤ−ＡＢＣが、それら組織
又は器官において生理学的役割を有することがありうるということを示唆してい
る。ＡＢＣトランスポーターの免疫系への関連は、以前に立証されている。ＡＢ
Ｃ１は、マクロファージによるアポトーシス細胞の飲み込みに必要とされる。更
に、ＡＢＣ１阻害剤の研究で示されたように、インターロイキン１β分泌とＡＢ
Ｃ１活性との間には密接な相関がある（Harmon, Y., et al., Blood, 1997;90:2
911-2915）。これら知見は、ＡＢＣ１が、インターロイキン１β分泌に関与し且
つ炎症反応において役割を果たしているかもしれないということを示唆する。Ｐ
Ｄ−ＡＢＣとＡＢＣ１との間に大きい相同性が与えられると、それら二つのトラ
ンスポーターは、類似の生物学的機能を有することがありうる。ＡＢＣ１の遍在
性発現とは対照的に、ＰＤ−ＡＢＣ発現は、ほぼ免疫系に特異的である。これは
、ＰＤ−ＡＢＣがある種の免疫学的経路に関与していたということを強く示すも
のである。

【００９７】ＰＤ−ＡＢＣの二つのイソフォームの発現 組織中での二つの変異型の発現をＲＴ−ＰＣＲで調べた。ＲＴ−ＰＣＲは完全
に定量的という訳ではないが、異なった組織からの鋳型でのＰＣＲ産物の外観は
転写物存在量の一般的な傾向を与えることができる。本発明者は、２４種類のヒ
ト組織中での二つのＰＤ−ＡＢＣ変異型の発現を調べ、それらの発現パターンが
異なるということを発見した。２４種類の組織の大部分は、フォーム１及びフォ
ーム２を両方とも発現する（図４）。しかしながら、前立腺及び卵巣は、選択的
にフォーム１を発現する。一方、胎児脳、皮膚、子宮、膵臓、副腎、唾液腺及び
結腸を含めた組織は、選択的にフォーム２を発現する（図４）。興味深いことに
、本発明者は、骨髄及び末梢血白血球中において、フォーム２に特異的なプライ
マーを含むより大きいバンドを発見した（図４）。これは、これら組織中に第二
ＮＢＦを含まない別の型のＰＤ−ＡＢＣが存在するかもしれないということを示
唆する。フォーム２における第二ＮＢＦの欠如は、殆ど間違いなく、トランスポ
ーター活性に影響を与えるので、この型の組織特異的発現は、特別な生理学的目
的に役立つかもしれない。

【００９８】結論 最も近いＡＢＣ１ホモログである新しいＡＢＣトランスポーターを同定し且つ
単離した。更に、別にスプライシングされた変異型を同定した。このトランスポ
ーターは、主に免疫系で発現され、免疫応答にある役割を果たすことがありうる
。更に、ＰＤ−ＡＢＣのより小さい、別にスプライシングされた転写物の発現は
元の型より制限されている。ＰＤ−ＡＢＣの組織特異的発現パターン及び別のス
プライシングは、ＰＤ−ＡＢＣはＡＢＣ１と類似の機能を有するが、一層制限さ
れ且つ調節されているかもしれないということを示唆する。 明白な修飾及び等価物が当業者に明らかであるように、本発明が、操作の正確
な詳細、又は示され且つ記載された正確な化合物、組成物、方法、手順又は態様
に制限されるものではないということは理解されるはずであり、したがって、本
発明は、クレイムの全範囲によってのみ制限されるべきである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

図１：ヒトＰＤ−ＡＢＣの予想のアミノ酸配列のヒトＡＢＣ１及びＡＢＣＲへ
のアラインメント。アミノ酸は一文字コードで示されている。全配列に沿って一
致する残基は黒い部分で強調され、相同性残基は影付き部分で示されている。点
は、アラインメントを最大にするために配列中に導入されるギャップを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/06 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｃ０８６ 25/08 16/18 ４Ｃ０８７ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｈ０４５ 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/68 5/00 Ａ Ｂ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＵ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＲ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｘ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ (72)発明者 タフリ，シェリー・レイ アメリカ合衆国ミシガン州48103，アン・ アーバー，アバディーン・ドライヴ 4773 (72)発明者 ワン，ミンガン アメリカ合衆国ミシガン州48105，アン・ アーバー，フォーンメドウ・コート 3130 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA04 CA09 CA11 HA14 HA17 4B063 QA18 QA19 QQ08 QQ43 QQ96 QR08 QR55 QR62 QS25 QS33 QS34 4B064 AG01 BA15 CA19 CC24 DA06 DA13 4B065 AA90 AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA22 BA23 CA17 NA14 ZA062 ZA362 ZB112 ZC332 4C086 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA06 ZA36 ZB11 ZC33 4C087 AA02 BC83 NA14 ZA06 ZA36 ZB11 ZC33 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 CA40 DA50 DA75 EA23 EA50 FA74 HA06

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１又は３に示されるＤＮＡ配列と実質的に類似の
   単離され且つ精製されたＤＮＡ配列。
2. 【請求項２】 高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下におい
   て配列番号：１又は３に示されるＤＮＡ配列にハイブリダイズする、単離され且
   つ精製されたＤＮＡ配列。
3. 【請求項３】 配列番号：１又は３に示されるＤＮＡ配列から本質的に成る
   、単離され且つ精製されたＤＮＡ配列。
4. 【請求項４】 配列番号：２又は４によって表されるポリペプチドをコード
   するポリヌクレオチドに少なくとも７０％の同一性を有する、単離され且つ精製
   されたＤＮＡ配列。
5. 【請求項５】 配列番号：１又は３に示されるＤＮＡ配列に充分に相補的で
   ある、単離され且つ精製されたＤＮＡ配列。
6. 【請求項６】 染色体外ベクター中にサブクローン化された請求項２又は３
   に記載の単離され且つ精製されたＤＮＡ配列を含んでなる組換えＤＮＡ分子。
7. 【請求項７】 請求項６に記載の組換えＤＮＡ分子で形質移入された宿主細
   胞を含んでなる組換え宿主細胞。
8. 【請求項８】 実質的に精製された組換えポリペプチドであって、該実質的
   に精製された組換えポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：２又は４に示さ
   れるアミノ酸配列に実質的に類似している、実質的に精製された組換えポリペプ
   チド。
9. 【請求項９】 ポリペプチドが、配列番号：２又は４に示されるアミノ酸配
   列に少なくとも約７０％のアミノ酸配列類似性を有する、請求項８に記載の実質
   的に精製された組換えポリペプチド。
10. 【請求項１０】 実質的に精製された組換えポリペプチドであって、該実質
    的に精製された組換えポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：２又は４に示
    されるアミノ酸配列から本質的に成る、実質的に精製された組換えポリペプチド
    。
11. 【請求項１１】 請求項８に記載のアミノ酸配列に実質的に類似のアミノ酸
    配列を有するポリペプチドを選択的に結合する抗体。
12. 【請求項１２】 細胞中のＰＤ−ＡＢＣタンパク質を検出する方法であって
    、細胞を請求項１１に記載の抗体と接触させ、そして該細胞をＰＤ−ＡＢＣタン
    パク質−抗体複合体の検出が可能になるようなやり方でインキュベートすること
    を含んでなる方法。
13. 【請求項１３】 ＰＤ−ＡＢＣ突然変異を含有する細胞を検出する診断アッ
    セイであって、該細胞から全ゲノムＤＮＡを単離し、該ゲノムＤＮＡを、請求項
    １、２又は３に記載の単離され且つ精製されたＤＮＡ配列から誘導されたプライ
    マーを用いるＰＣＲ増幅に付するか、又は該ゲノムＤＮＡをハイブリダイゼーシ
    ョン法によって直接分析し、そして、得られたＰＣＲ産物が突然変異を含有する
    かどうか確認することを含んでなる診断アッセイ。
14. 【請求項１４】 ＰＤ−ＡＢＣ突然変異を含有する細胞を検出する診断アッ
    セイであって、全細胞ＲＮＡを単離し、該ＲＮＡを、請求項１、２又は３に記載
    の単離され且つ精製されたＤＮＡ配列から誘導されたプライマーを用いる逆転写
    −ＰＣＲ増幅に付し、そして、得られたＰＣＲ産物が突然変異を含有するかどう
    か確認することを含む診断アッセイ。
15. 【請求項１５】 請求項１、２又は３に記載のＤＮＡ配列の領域の増幅方法
    であって、請求項１、２又は３に記載の目的の配列又はその一部分を含有すると
    推察される試験試料を、増幅反応試薬と接触させる工程を含んでなる方法。
16. 【請求項１６】 試験試料中の請求項１、２又は３に記載のＤＮＡ配列の少
    なくとも１コピーの存在を検出するための診断用キットであって、プライマー、
    １対のプライマー又はプローブ、及び場合により増幅試薬を含有するキット。
17. 【請求項１７】 請求項８、９又は１０に記載のポリペプチドと、請求項８
    、９又は１０に記載のポリペプチドに結合するリガンドとの間の相互作用を妨げ
    るか又は模倣する治療的化合物の検出又はスクリーニングのためのアッセイ。
18. 【請求項１８】 前記アッセイが、 （ａ）請求項８、９又は１０に記載のポリペプチドを提供する工程； （ｂ）候補物質を入手する工程； （ｃ）前記ポリペプチドを前記候補物質と接触させる工程；及び （ｄ）前記ポリペプチドと前記候補物質との間に形成される複合体を検出する
    工程 を含んでなる、請求項１７に記載のアッセイ。
19. 【請求項１９】 異常なカルシウムフラックスから哺乳動物細胞を保護する
    方法であって、哺乳動物細胞中に、請求項１、２又は３に記載の単離され且つ精
    製されたＤＮＡ配列を含んでなる発現ベクターであって、哺乳動物細胞中におけ
    る該単離され且つ精製されたＤＮＡ配列の高レベル発現を促進するＤＮＡ配列に
    機能的に結合している発現ベクターを導入することを含んでなる方法。
20. 【請求項２０】 てんかんを治療又は予防する方法であって、哺乳動物中に
    、請求項１、２又は３に記載の単離され且つ精製されたＤＮＡ配列を含んでなる
    発現ベクターであって、哺乳動物細胞中における該単離され且つ精製されたＤＮ
    Ａ配列のアンチセンス鎖の高レベル発現を促進するＤＮＡ配列に機能的に結合し
    ている発現ベクターを導入することを含んでなる方法。
21. 【請求項２１】 ＰＤ−ＡＢＣタンパク質を細胞から精製する方法であって
    、 宿主細胞中での遺伝子発現を支配することができるプロモーターに機能的に連
    結した、請求項１、２又は３に記載の単離され且つ精製されたＤＮＡ配列を含ん
    でなるベクターで宿主細胞を形質移入し； 該単離され且つ精製されたＤＮＡ配列の発現を該細胞中で誘発させ； 該細胞を溶解し； 該細胞からＰＤ−ＡＢＣタンパク質を単離し；そして 該単離物からＰＤ−ＡＢＣタンパク質を精製する ことを含んでなる方法。
22. 【請求項２２】 異常脂肪血症関連症候群を含んで成る群より選択される疾
    患を治療する又は予防する方法であって、それを必要とする哺乳動物に、治療有
    効量の請求項１、２又は３に記載のポリヌクレオチドを投与する段階を含んでな
    る方法。
23. 【請求項２３】 異常脂肪血症関連症候群を含んで成る群より選択される疾
    患を治療する又は予防する方法であって、それを必要とする哺乳動物に、治療有
    効量の請求項８、９又は１０に記載のポリペプチドを投与する段階を含んでなる
    方法。