JP2003520580A

JP2003520580A - バニリンを生産するための酵素および遺伝子

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Publication number: JP2003520580A
Application number: JP2001545557A
Authority: JP
Inventors: ラベンホルスト，ユルゲン; シユタインビユヘル，アレクサンダー; プリーフエルト，ホルスト; アフテルホルト，サンドラ
Original assignee: ハーマン・ウント・ライマー・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング
Priority date: 1999-12-14
Filing date: 2000-12-01
Publication date: 2003-07-08
Also published as: WO2001044480A2; EP1240336A2; AU2839401A; US20030092143A1; CA2394140A1; DE19960106A1; WO2001044480A3

Abstract

(57)【要約】フェルラ酸からバニリンを合成するためのアミコラトプシス種（Amycolatopsis sp.）HR167(DSMZ9992）から得た酵素を使用することができる。これらの酵素をコードするDNAおよびこのDNAを使用して形質転換される宿主細胞は、バニリンの生産に使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、フェルラ酸からのバニリンの調製法、バニリンの調製におけるそれ
らの使用、該酵素をコードするDNAおよび該DNAで形質転換された宿主細胞に関す
る。

【０００２】欧州特許出願公開第0 583 687号明細書は、新規なシュードモナス種（Pseudom onas sp.）を使用した置換メトキシフェノールの調製を記載する。ここで出発材
料はオイゲノールであり、そして得られる最終生成物はフェルラ酸、バニラ酸、
コニフェリルアルコールおよびコニフェリルアルデヒドである。

【０００３】フェルラ酸の生物転換の可能性は、「フェルラ酸の生物触媒的な転換：豊富な
芳香族天然産物（Biocatalytic transformation of ferulic acid:an abundant
aromatic natural product)；J.Ind.Microbiol.15:457-471」に公開された。

【０００４】 Journal of Bioscience and Bioengineering、Vol.88,No.1,103-106(1999)は同
様に、フェルラ酸のバニリンへの生物転換を記載する。

【０００５】欧州特許出願公開第0 845 532号明細書は、コニフェリルアルコール、コニフ
ェリルアルデヒド、フェルラ酸、バニリンおよびバニラ酸合成のためのシュード
モナス種（Pseudomonas sp）の遺伝子および酵素を記載する。

【０００６】国際公開第97/35999号明細書、J.Biol.Chem.273:4163-4170およびMicrobiolog
y 144:1397-1405は、トランス−フェルラ酸をトランス−フェルロイル-SCoAエス
テルに、そしてさらにバニリンに転換するための酵素および該エステルを加水分
解する蛍光菌（Pseudomonas fluorescense）遺伝子を記載する。

【０００７】欧州特許出願公開第97 110 010号明細書およびAppl.Microbiol.Biotechnol.51
:456-461は、ストレプトミセスセントニー（Streptomyces sentonii）を使用
したバニリンの生産法を記載する。

【０００８】独国特許出願公開第198 50 242号明細書は、オイゲノールおよびフェルラ酸異
化の遺伝子の特異的不活性化により置換フェノールを調製するための生産菌の構
造を記載する。

【０００９】独国特許出願公開第195 32 317号明細書は、アミコラトプシス種（Amycolatop sis sp.）を使用して高い収率のフェルラ酸からの発酵的バニリン生産を記載す
る。

【００１０】フェルラ酸からのバニリン合成のためのアミコラトプシス種（Amycolatopsis
sp.）HR167(DSMZ 9992)酵素が見いだされた。

【００１１】この酵素は単離され、そして特性決定された。

【００１２】本発明の酵素は、少なくともフェルロイル-CoAシンテターゼ活性を発揮し、そ
して少なくとも20個、好ましくは少なくとも25個、特に好ましくは少なくとも30
個の連続するアミノ酸の距離にわたり、そして大変特に好ましくそれらの全長に
わたり、配列番号２による配列と少なくとも70％同一、好ましくは80％同一、特
に好ましくは90％同一、大変特に好ましくは95％同一であるアミノ酸配列を含ん
で成る酵素であり、ならびにエノイル-CoAヒドラターゼ／アルドラーゼ活性を発
揮し、そして少なくとも20個、好ましくは少なくとも25個、特に好ましくは少な
くとも30個の連続するアミノ酸の距離にわたり、そして大変特に好ましくそれら
の全長にわたり、配列番号３による配列と少なくとも70％同一、好ましくは80％
同一、特に好ましくは90％同一、大変特に好ましくは95％同一であるアミノ酸配
列を含んで成る酵素である。

【００１３】アミノ酸配列の同一性の程度は、好ましくはGCGプログラムパッケージ、バー
ジョン9.1のGAPプログラムにより標準設定で決定される（Nucleic Acids Resear
ch 12,387(1984)。

【００１４】本明細書で使用する用語「酵素」は、上記に記載した機能性を特徴とするタン
パク質を称する。これには翻訳後プロセッシングのような自然なプロセスにより
、あるいはそれ自体は既知の化学的プロセスによるいずれかで修飾することがで
きるアミノ酸鎖を含む。そのような修飾は、ポリペプチド中の様々な部位で、そ
して数回、例えばペプチド骨格上、アミノ酸側鎖上およびアミノおよび／または
カルボキシ末端で起こり得る。それらには例えばアセチル化、アシル化、ADPリ
ボシル化、アミド化、フラビン、ヘム部分、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド
誘導体、脂質もしくは脂質誘導体またはホスファチジルイノシトールへの共有結
合、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、シスチン形成、ホルミル化、
ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化
、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセス、リン酸化、セレノイル化(s
eleroylations)およびtRNAが媒介するアミノ酸の付加を含む。

【００１５】本発明の酵素は、「成熟」タンパク質の状態で、またはより大きなタンパク質
、例えば融合タンパク質の一部として存在することができる。さらにそれらは分
泌またはリーダー配列、プロ（pro）配列、多ヒスチジン残基のような容易な精
製またはアミノ酸のさらなる安定化を可能とする配列を有することができる。

【００１６】配列番号２および配列番号３によるアミノ酸配列を有する本発明の酵素を含ん
で成るフェルロイル-CoAシンテターゼおよびエノイル-CoAヒドラターゼ／アルド
ラーゼに比べて、50％まで上昇または減少した活性を発揮する酵素は、本発明に
従うものと考える。

【００１７】フェルロイル-CoAシンテターゼおよびエノイルCoAヒドラターゼ／アルドラー
ゼの自然に存在する対応する領域に比べて、本発明の酵素は完全な酵素の少なく
とも１つの酵素活性を発揮する限り、欠失またはアミノ酸置換を有してもよい。
保存的置換が好ましい。そのような保存的置換には、アミノ酸が以下の群からの
別のアミノ酸に置き換えられることを含む変化を含む：１．小さい脂質族の、非極性またはわずかに極性の残基：Ala、Ser、Thr、Proお
よびGly；２．極性の、負に荷電した残基およびそれらのアミド：Asp、Asn、GluおよびGln
；３．極性の、正に荷電した残基：His、ArgおよびLys；４．大きい脂肪族の非極性残基：Met、Leu、Ile、ValおよびCys；ならびに５．芳香族残基：Phe、TyrおよびTrp。

【００１８】以下のリストは好適な保存的置換を表す：

【００１９】

【表１】

【００２０】また本発明は、本発明の酵素をコードする核酸に関する。

【００２１】本発明の核酸は特に１本鎖または２本鎖のデオキシリボ核酸（DNA）またはリ
ボ核酸（RNA）である。好適な態様は、イントロンを含むことができるゲノムDNA
フラグメントおよびcDNAである。

【００２２】本発明の核酸の好適な態様は、配列番号１のヌクレオチド酸配列を有するcDNA
である。

【００２３】同様に本発明は、緊縮条件下で配列番号１の配列とハイブリダイズする核酸を
含んで成る。

【００２４】本明細書で使用する用語「ハイブリダイズする」とは、１本鎖核酸分子が相補
的鎖と塩基対を形成するプロセスを言う。このように本明細書に開示した配列情
報に基づき、例えば他の生物からフェルロイル-CoAシンテターゼおよび／または
エノイル-CoAヒドラターゼ／アルドラーゼ活性を有する酵素をコードするDNAフ
ラグメントを単離することが可能である。

【００２５】さらに本発明は、少なくとも20個、好ましくは少なくとも25個、特に好ましく
は少なくとも30個の連続するヌクレオチドの距離にわたり、そして大変特に好ま
しくそれらの全長にわたり、配列番号１による配列と少なくとも70％、好ましく
は80％、特に好ましくは90％、大変特に好ましくは95％同一である核酸を含んで
成る。

【００２６】核酸配列の同一性の程度は、好ましくはGCGプログラムパッケージ、バージョ
ン9.1のGAPプログラムにより標準設定で決定される（Nucleic Acids Research 1
2,387(1984)。

【００２７】本発明はさらに、本発明の核酸およびヘテロロガスなプロモーターを含んで成
るDNA構築物に関する。

【００２８】本明細書で使用する用語「ヘテロロガスなプロモーター」は、元の生物中の関
連する遺伝子発現を制御するプロモーターとは異なる特性を有するプロモーター
を称する。本明細書で使用する用語「プロモーター」は、一般に発現制御配列を
称する。

【００２９】ヘテロロガスなプロモーターの選択は、発現に原核または真核細胞または無細
胞系を使用するのかどうかに依存する。ヘテロロガスなプロモーターの例は、la
c系、trp系、ファージラムダの主オペレーターおよびプロモーター領域、fdコー
トタンパク質の制御領域、3-ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、初期ま
たは後期SV40、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルスプロモーター、酸性
ホスファターゼプロモーターおよび酵母接合因子αプロモーターである。

【００３０】本発明はさらに本発明の核酸または本発明のDNA構築物を含有するベクターに
関する。使用できるベクターは、分子生物学研究室で使用されているすべてのプ
ラスミド、ファスミド、コスミド、YACまたは人工的染色体である。

【００３１】また本発明は、本発明の核酸、本発明のDNA構築物または本発明のベクター含
有する宿主細胞に関する。

【００３２】本明細書で使用する「宿主細胞」は、本発明の核酸を自然には含有しない細胞
を称する。

【００３３】適当な宿主細胞はバチルス（Bacillus）、乳酸球菌（Lactococcus）、乳酸桿
菌（Lactobacillus）、シュードモナス（Pseudomonas）、ストレプトミセス（St reptomyces ）、ストレプトコッカス（Streptococcus）属のような原核細胞、好
ましくは大腸菌（E.coli）、およびサッカロミセス（Saccharomyces）属の酵母
、カンジダ（Candida）、ピヒア（Pichia）属、コウジカビ（Aspergilluus）、ア
オカビ（Penicillium）属の糸状菌類のような真核細胞の両方、ならびにタバコ
（Nicotiana）、ナス（Solanum）、アブラナ（Brassica）、フダンソウ（Beta）
、トウガラシ（Capsicum）およびバニラ（Vanilla）のような様々な属の植物細
胞または全植物である。

【００３４】本発明はさらに、本発明の酵素を調製する方法に関する。本発明の核酸により
コードされる酵素を調製するために、本発明の１つの核酸を含有する宿主細胞を
適切な条件下で培養することができる。これに関連して、発現する核酸を宿主細
胞のコドン利用に適合させることができる。次に所望の酵素を細胞または培養基
から通例の様式で単離することができる。酵素はインビトロ系でも生産すること
ができる。

【００３５】本発明の核酸を使用して宿主細胞により合成される本発明の酵素を単離するた
めの迅速な方法は、融合タンパク質の発現から出発し、単純な様式で融合パート
ナーをアフィニティー精製することが可能である。融合パートナーは、例えばグ
ルタチオンS-トランスフェラーゼでよい。次いで融合タンパク質はグルタチオン
アフィニティーカラム上で精製することができる。融合パートナーは、例えば融
合パートナーと精製する本発明のポリペプチドとの間のリンカーの部分的なタン
パク質分解的開裂により除去することができる。リンカーは、トリプシン開裂部
位を定めるアルギニンおよびリシン残基のような標的アミノ酸を含むように設計
することができる。そのようなリンカーを生成するために、オリゴヌクレオチド
を使用する標準的なクローニング法を応用することができる。

【００３６】さらに可能な精製法は、調製用電気泳動、FPLC、HPLC（例えばゲル濾過、逆相
またはわずかに疎水性のカラムを適用する）、ゲル濾過、分別沈殿、イオン交換
クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーに基づく。

【００３７】本明細書で使用する用語「単離または精製」とは、本発明の酵素が細胞の他
のタンパク質または他の高分子から取り出されることを意味する。好ましくは本
発明の酵素を含有する組成物は、宿主細胞からの調製物に比べてタンパク質濃度
に関して少なくとも10倍、そして特に好ましくは少なくとも100倍濃縮されてい
る。

【００３８】本発明の酵素は、該酵素に対する抗体の結合により融合パートナー無しでアフ
ィニティー精製することもできる。

【００３９】本発明はさらに、本発明の核酸を調製する方法に関する。本発明の核酸は通例
の様式で調製することができる。例えば核酸分子を完全に化学的に合成すること
が可能である。本発明の配列の短片（short pieces）のみを化学的に合成し、そ
してそのようなオリゴヌクレオチドを放射性で、または蛍光染料を用いて標識す
ることも可能である。標識したオリゴヌクレオチドは、細菌または植物mRNAから
出発して調製したcDNAバンク、あるいはゲノムの細菌もしくは植物DNAから出発
して調製されたゲノムバンクをスクリーニングするために使用することができる
。標識したオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするクローンを、問題のDNAを
単離するために選択する。単離したDNAの特性を決定した後、本発明の核酸は、
簡単な様式で得られる。

【００４０】本発明の核酸は化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを使用してPCR法によ
り調製することもできる。

【００４１】本明細書で使用する用語「オリゴヌクレオチド」とは、10〜50個のヌクレオチ
ド、好ましくは15〜30個のヌクレオチドから成るDNA分子を意味する。それらは
化学的に合成され、そしてプローブとして使用することができる。

【００４２】同様に、本発明はフェルラ酸からバニリンを調製するための個々の調製工程：
ａ）フェルロイル-CoAシンテターゼの存在下で起こるフェルラ酸からフェルロイ
ル-補酵素Ａの調製法；ｂ）エノイル-CoAヒドラターゼ／アルドラーゼの存在下で起こるフェルロイル-
補酵素Ａから4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル-β-ヒドロキシプロピオニル-補
酵素Ａの調製法；ｃ）エノイル-CoAヒドラターゼ／アルドラーゼの存在下で起こる4-ヒドロキシ-3
-メトキシフェニル-β-ヒドロキシプロピオニル-補酵素Ａからバニリンの調製法
に関する。

【００４３】上記の調製法は、該単離された酵素または該酵素を含有する細胞抽出物に基づ
く。

【００４４】同様に本発明は、上記遺伝子を含有する宿主細胞および該DNAまたは該ベクタ
ーで形質転換された宿主細胞に基づく調製法に関する。

【００４５】フェルラ酸は上記の宿主細胞を使用してバニリンを調製するために好適な基質
である。しかしさらなる基質の添加、またはフェルラ酸を他の基質に変えること
も可能となり得る。

【００４６】考えられる本発明に従い使用する宿主細胞用の栄養培地は、合成、半合成およ
び複合培養基であることができる。これらは炭素−含有および窒素−含有化合物
、無機塩、適当な場合は微量元素およびビタミンを含んでもよい。

【００４７】考えられる炭素−含有化合物は、炭水化物、炭化水素および有機塩基化合物で
ある。使用できる化合物の例には、好ましくは糖、アルコールまたは糖アルコー
ル、有機酸および複合混合物である。

【００４８】使用に好適な糖は、グルコースである。使用できる有機酸は好ましくは、クエ
ン酸または酢酸である。複合混合物には、例えば麦芽エキス、酵母エキス、カゼ
インおよびカゼン加水分解物を含む。

【００４９】考えられる窒素−含有基質は、無機化合物である。これらの例は硝酸塩および
アンモニウム化合物である。同様に、有機窒素源を使用することも可能である。
これらには酵母エキス、ダイズ粉、カゼイン、カゼイン加水分解物およびコーン
スティープリカーを含む。

【００５０】使用できる有機塩の例は、硫酸塩、硝酸塩、塩酸塩、炭酸塩およびリン酸塩で
ある。該塩に含有される金属は、好ましくはナトリウム、カリウム、マグネシウ
ム、マンガン、カルシウム、亜鉛および鉄である。

【００５１】培養温度は好ましくは５〜100℃の範囲である。特に好適であるのは15〜60℃
の範囲であり、そして最高に好適であるのは、22〜45℃である。

【００５２】培地のpHは、好ましくは２〜12である。特に好ましくは４〜８の範囲である。

【００５３】理論的には、本発明を行うために当業者に既知のすべての生物反応槽を使用す
ることが可能である。好ましくは液内法に適するすべての装置が考えられ、すな
わち本発明に従い機械的な混合デバイスを備えていない、または備えた容器を使
用することが可能である。前者には例えば振盪装置、気泡−カラム反応槽および
ループ反応槽を含む。後者は好ましくは任意の設計の撹拌機を備えたすべての既
知の装置を含む。

【００５４】本発明の方法は、連続的にまたはバッチ様式で行うことができる。最大の生産
物に達するまでの発酵時間は、使用する宿主細胞の具体的な型に依存する。しか
し理論には、発酵時間は２から200時間の間である。

【００５５】本発明は任意の宿主細胞を使用してフェルラ酸からバニリンを調製することを
可能とする。

【００５６】

【実施例】実施例手順： NMG突然変異誘発法の後、フェルラ酸異化の各工程を欠く突然変異体は、フェ
ルラ酸を利用するシュードモナス種（Pseudomonas sp.）HR199株から得た。アミ
コラトプシス種（Amycolatopsis sp.）の野生型HR167株のEcoRIで部分的に消化
した全DNAから出発して、遺伝子バンクを広い宿主スペクトルを有し、そしてシ
ュードモナス（Pseudomonas）で安定に複製されるコスミドpVK100中に構築した
。ファージ-λ粒子中にパーケージングした後、ハイブリッドコスミドを大腸菌
（Escherichia coli）S17-1に形質導入した。遺伝子バンクは大腸菌（E.coli）S
17-1クローンの5000個の組換え体から成った。各クローンのハイブリッドコスミ
ドを、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）HR199株の２つのフェルラ酸−陰性
突然変異体（突然変異体SK6167およびSK6202）に接合により移し、そして可能な
相補能力を検査した。ハイブリッドコスミドpVK1-1、pVK12-1、pVK15-1はこの方
法中に同定され、これにより突然変異体SK6167およびSK6202がフェルラ酸を再度
利用できるようになった。

【００５７】プラスミドpVK1-1、pVK12-1、pVK15-1の相補的特性は、20kbpのEcoRIフラグメ
ント（E200）に起因することが可能であった。フェルロイル-CoAシンテターゼお
よびエノイル-CoAヒドラターゼ／アルドラーゼをコードする遺伝子fcsおよびech は、４kbpのPstIサブフラグメントに位置した（P40）。

【００５８】これらの遺伝子の発現は、組換え大腸菌（E.coli）XL1-Blue株がフェルラ酸を
バニリンに転換できるようにする。材料および方法：細菌の増殖条件。大腸菌（Escherichia coli）の株は、37℃でルリア−ベルタ
ニ（LB）またはM9ミネラル培地で培養した（Sambrook,J.E.F.Fritsch and T.Man
iatis.1989.モレキュラークローニング:ラボラトリーマニュアル（Molecular Cl
oning：a laboratory manual）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラト
リー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）。シュードモナス種（ Pseudomonas sp.）株は30℃で栄養ブロス（NB、0.8重量／容量）、またはミネラ
ル培地（MM）中で培養した（Schlegel,H.G.et al.1961.Arch.Mikrobiol.38:209-
222）。アミコラトプシス種（Amycolatopsis sp.）の株は、42℃で酵母−エキス
−麦芽エキス−グルコース培地（YMG、酵母エキス0.4重量／容量％、麦芽エキス
１重量／容量％。グルコース0.4重量／容量％、pH7.2）で培養した。フェルラ酸
、バニリン、バニラ酸およびプロトカテク酸をジメチルスルフォキシドに溶解し
、そして各培地に0.1（重量／容量）％の最終濃度で加えた。シュードモナス種
（Pseudomonas sp.）の接合完了体の培養には、テトラサイクリンおよびカナマ
イシンをそれぞれ25μg/mlおよび300μg/mlの最終濃度で使用した。

【００５９】ニトロソグアニジン突然変異誘発法。シュードモナス種（Pseudomonas sp.）H
R199株のニトロソグアニジン突然変異誘発法は、Millerに従い変更して行った（
Miller,J.H.1972.分子遺伝学の実験（Experiments in molecular genetics）。
コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニュ
ーヨーク）。リン酸カリウム（KP）バッファー（100mM、pH7.0）をクエン酸バッ
ファーの代わりに使用した。N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジンの最終
濃度は、200μg/mlであった。得られた突然変異体は、増殖基質としてフェルラ
酸を利用する能力の損失についてスクリーニングした。

【００６０】培養上清中の代謝中間体の定性的および定量的検出。培養上清は高圧液体クロ
マトグラフィー（クナウアー（Knauer)HPLC）により直接、または二重蒸留H_aOで
希釈した後に分析した。クロマトグラフィーはNucleosil-100 C18（７μm、250
×４mm）で行った。使用した溶媒は0.1（容量／容量）％ギ酸およびアセトニト
リルであった。基質の溶出に使用した勾配は、以下の通りであった。 00:00−06:30 ----→ 26％アセトニトリル 06:30−08:00 ----→ 100％アセトニトリル 08:00−12:00 ----→ 100％アセトニトリル 12:00−13:00 ----→ 26％アセトニトリル 13:00−18:00 ----→ 26％アセトニトリルフェルロイル-CoAシンテターゼ（フェルラ−酸チオキナーゼ）活性の測定。FC
S活性は30℃でZenk et alに従い変更された至適酵素アッセイにより測定した（Z
enk et al.1980.Anal Biochem.101:182-187)。１ml容量の反応混合物は、0.09ミ
リモルのリン酸カリウム（pH7.0）、2.1ミリモルのMgCl₂、0.7ミリモルのフェル
ラ酸、２ミリモルのATP、0.4ミリモルの補酵素Ａおよび酵素溶液を含んだ。フェ
ルラ酸からCoAエステルの形成は、λ＝345nm（ε＝10cm²／ミリモル）で測定し
た。酵素活性は単位（Ｕ）で与え、１Ｕは１分に１ミリモルの基質を転換する酵
素の量に相当する。サンプル中のタンパク質濃度は、Lowry et alに従い測定し
た（Lowry,O.H.,N.J.Rosebrough,A.L.,Farr and R.J.Randall.1951.J.Biol.Chem
.193:265-275）。

【００６１】電気泳動法。タンパク質を含有する抽出物は、変性条件下で11.5（重量／容量
）％ポリアクリルアミドゲル中で、Laemmliの方法に従い分画した（Laemmli,U.K
.1970.Nature(London)227:680-685）。セルバ（Serva）のBlue Rを非特異的タン
パク質染色に使用した。

【００６２】ポリアクリルアミドゲルからPVDF膜へのタンパク質の移動。タンパク質は、半
乾燥−高速ブロット装置（B32/33、バイオメトラ（Biometra）、ゲッチンゲン、
独国）によりSDSポリアクリルアミドゲルからPVDF膜（ウォーターズ−ミリポア
（Waters-Millipore）、ベットフォード、マサチューセッツ州、米国）へ製造元
の使用説明に従い移した。

【００６３】 N-末端アミノ酸配列の決定。N-末端アミノ酸配列は、タンパク質ペプチドシー
クエンサー（477A型、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）、フ
ォスター市、米国）およびPTH分析機により製造元の使用説明に従い決定した。

【００６４】 DNAの単離および操作。ゲノムDNAはMarmurの方法に従い単離した（Marmur,J.1
961,J.Mol.Biol.3:208-218）。プラスミドDNAおよびDNA制限フラグメントを単離
そして分析し、ハイブリッドコスミドをファージ-λ粒子にパッケージングし、
そして大腸菌（E.coli）は標準法に従い形質導入した（Sambrook,J.,E.F.Fritsc
h and T.Maniatis.1989、モレキュラークローニング：アラボラトリーマニュア
ル。第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリン
グハーバー、ニューヨーク）。

【００６５】 DNAの転移。コンピテントな大腸菌（Escherichia coli）細胞を調製し、そし
てHanahanの方法に従い形質転換した（Hanahan,D.1983.J.Mol.Biol.166:557-580
）。プラスミドを持つ大腸菌（Escherichia coli）S17-1株（供与体）とシュー
ドモナス種（Pseudomonas sp.）株（受容体）との間の接合プラスミドの転移は
、NB寒天プレート上でFriedrich et alの方法に従い行うか（Friedrich,B.et al
.1981.J.Bacteriol.147:198-205）、あるいは炭素源として0.5（重量／容量）％
のグルコース、および25μg/mlのテトラサイクリンまたは300μg/mlのカナマイ
シンを含有するMM寒天プレート上の「ミニコンプレメンテーション法（mini co
mplementation method）により行った。受容細胞は一方向の接種画線を適用した
。５分後、供与株細胞を接種画線に適用し、受容体接種画線と交差させた。接種
から30℃で48時間後、接合完了体は交差点の後ろで直接増殖していたが、供与体
も受容体も増殖することはできなかった。

【００６６】 DNAシークエンシング。ヌクレオチド配列は、LI-COR DNAシークエンサーモデ
ル4000L（LI-COR 社、バイオテクノロジー部門、リンカン、ネブラスカ州、米国
）および7-デアザ-dGTP（アマーシャムライフサイエンス（Amersham Life Sci
ence）、アマーシャムインターナカョナルプラス、リトルカルホント、バッ
キンガムシャー、英国）を含むThermo Sequenase 蛍光標識プライマーサイクル
シークエンシングキットを使用して、Sanger et alのジデオキシチェーンター
ミネーション法に従い（Sanger et al.1977,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463-5
467）、各々の場合で製造元の手順に従い決定した。

【００６７】両DNA鎖は、Strauss et al.のプライマーホッピング法（primer hopping stra
tegy）に従い合成オリゴヌクレオチドにより配列決定した（Strauss，E.C.et al
.1986.Anal.Biochem.154:353-360）。

【００６８】化学品、生化学品および酵素。至適な酵素アッセイのための制限酵素、T4 DNA
リガーゼ、ラムダDNAおよび酵素および基質は、C.F.ベーリンガー＆シェーン（B
oehringer & Soehne）（マンハイム、独国）またはキブコ（GIBCO）／BRL（エッ
ゲンステイン、独国）から得た。NA型アガロースはファルマシア(Pharmacia)-LK
B（ウプサラ、スウェーデン）[欠落]であった。すべての他の化学品はハールマ
ン＆レイマー（Haarmann & Reimer）（ホルツミンデン、独国）、E.メルク社（M
erck AG）（ダルムスタット、独国）、フルカケミ（Fluka Chemie）（ブッフス
、スイス）、セルバフェインバイオケミカ（Serva Feinbiochemica）(ハイデル
ベルグ、独国）またはシグマケミ（Sigma Chemie）（ディーゼンホッヘン、独国
）からであった。

【００６９】

【実施例】実施例１フェルラ酸異化作用が欠失しているシュードモナス種（Pseudomonas sp.）HR1
90突然変異体の単離シュードモナス種（Pseudomonas sp.）HR190株は、フェルラ酸異化作用が欠失
している突然変異体を単離する目的でニトロソグアニジン突然変異誘発法に供し
た。得られた突然変異体は炭素およびエネルギー源としてフェルラ酸およびバニ
リンを利用する能力に関して分類した。突然変異体SK6167およびSK6202は、もは
や炭素およびエネルギー源としてフェルラ酸を利用することはできないが、野生
型と同様にバニリンを利用することができた。上記の突然変異体は、接合実験で
アミコラトプシス種（Amycolatopsis sp.）HR167遺伝子バンクの受容体として使
用した。実施例２コスミドベクターpVK100中のアミコラトプシス種（Amycolatopsis sp.）HR167
遺伝子バンクの構築アミコラトプシス種（Amycolatopsis sp.）HR167のゲノムDNAを単離し、そし
てEcoRIを用いた部分的制限消化に供した。このようにして得たDNA調製物は、Ec oR I-切断ベクターpVK100に連結した。DNA濃度は、コンカテマー連結生成物の形
成を強化するために比較的高かった。ライゲーション混合物はファージ-λ粒子
にパッケージングし、これを次いで大腸菌（E.coli）S17-1の形質導入に使用し
た。形質導入体はテトラサイクリンを含有するLB寒天プレート上で選択した。こ
のようにして、異なるハイブリッドコスミドを含有する5000個の形質導入体を得
た。実施例３フェルラ酸異化作用の必須遺伝子を持つハイブリッドコスミドの同定 5000個の形質導入体のハイブリッドコスミドは、ミニコンプレメンテーション
法により突然変異体SK6167およびSK6202に接合的に移した。得られた接合完了体
は、フェルラ酸で再度成長できる能力に関して、フェルラ酸を含有するMMプレー
ト上で分析した（突然変異体の相補性）。突然変異体SK6167およびSK6202は、ハ
イブリッドコスミドpVK1-1、pVK12-1、pVK15-1を得ることにより相補された（co
mplemented）。相補する特性は20kbpのEcoRIフラグメントに起因することが可能
であった。実施例４ハイブリッドコスミドpVK1-1の20kbpのEcoRIフラグメント（E200）の分析 E200フラグメントはEcoRIで消化したハイブリッドコスミドpVK1-1から調製的
に単離し、そしてEcoRIで消化したpBluescript SK^-DNAに連結した。ライゲーシ
ョン混合物は、大腸菌（E.coli）XL1-Blueを形質転換するために使用した。X-Ga
lおよびIPTGを含有するLB-Tc-Amp寒天プレート上での「青／白」選択後、pSKE20
0ハイブリッドプラスミドがクローン化されたE200フラグメントを含む「白色」
形質転換体を得た。このプラスミドにより、そして様々な制限酵素を使用するこ
とにより、フラグメントE200の物理的地図を作成した。

【００７０】突然変異体SK6167およびSK6202を相補する領域は、E200のサブフラグメントを
ベクターpVK101およびpMP92（この両ベクターは広い宿主スペクトルを有し、そ
してまたシュードモナス（Pseudomonas）中で安定である）にクローニングし、
そして引き続き突然変異体SK6167およびSK6202への接合を介して転移することに
より４kbpのPstIサブフラグメント(P40)に狭めた。該フラグメントをpBluescrip
t SK^-にクローニングした後、ヌクレオチド配列を決定し、そしてフェルロイル-
CoAシンテターゼおよびエノイル-CoAヒドラターゼ／アルドラーゼをコードする
遺伝子fcsおよびechをこの方法で同定した。491アミノ酸のfcs遺伝子産物は、マ
イコバクテリウムチューバキュロシス（Mycobacterium tuberculosis）に由来
するfadD13遺伝子産物と35％同一（491アミノ酸の範囲にわたる）であった（Col
e et al.1998.Nature 393:537-544）。287アミノ酸のech遺伝子産物は、蛍光菌
（Pseudomonas fluorecens）に由来するp-ヒドロキシシンナモイル-CoAヒドラタ
ーゼ／リアーゼと62％同一（267アミノ酸の範囲にわたる）であった（Gasson et
al.,1998.フェルラ酸のバニリンへの代謝。J.Biol.Chem.273:4163-4170）。実施例５大腸菌（Escherichia coli）中でのアミコラトプシス種（Amycolatopsis sp.
）HR167に由来するフェルラ酸異化遺伝子のヘテロロガスな発現４kbpのPstIサブフラグメント(P40)は、PstIで消化したpSKE2000ハイブリッド
プラスミドから調製的に単離し、そしてPstIで消化したpBluescript SK^-DNAに連
結した。ライゲーション混合物は、大腸菌（E.coli）XL1-Blueを形質転換するた
めに使用した。X-Galおよびイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)
を含有するLB-Tc-Amp寒天プレート上での「青／白」選択後、pSKP40ハイブリッ
ドプラスミドがクローン化されたP40フラグメントを含む「白色」形質導入体を
得た。組換え大腸菌(E.coli)XL1-Blue株は、0.54U／mgタンパク質のフェルロイ
ル-CoA-シンテターゼ活性を有した。実施例６アミコラトプシス種（Amycolatopsis sp.）HR167に由来するfcsおよびech遺伝
子を発現する組換え大腸菌（Escherichia coli）XL1-Blue株(pSKP40)の静止細胞
を使用したフェルラ酸のバニリンへの生物転換大腸菌（E.coli）XL1-Blue(pSKP40)は、12.5μg/mlのテトラサイクリンおよび
100μg/mlのアンピシリンを含有する50mlのLB培地で、37℃で24時間培養した。
細胞は滅菌条件下で回収し、100mMのリン酸カリウムバッファー(pH7.0)で洗浄し
、そして5.15mMのフェルラ酸を含有する50mlのHR-MMに再懸濁した。６時間後に2
.8mM、８時間後に2.8mM、そして23時間後に3.1mMのバニリンを上清中に検出でき
た。配列表に関する覚書配列番号１は、フェルロイル-CoA-シンテターゼおよびエノイル-CoA-ヒドラタ
ーゼ／アルドラーゼcDNAのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を表す。配列番号２
および配列番号３は、さらにフェルロイル-CoA-シンテターゼおよびエノイル-Co
A-ヒドラターゼ／アルドラーゼcDNA配列に由来するタンパク質のアミノ酸配列を
表す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｐ 19/32 ＢＣ１２Ｐ 7/24 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 19/32 5/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者プリーフエルト，ホルストドイツ34134カツセル・フンスリユクシユトラーセ44 (72)発明者アフテルホルト，サンドラドイツ48369ゼルベク・シユタレンベーク３Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA07 CA04 DA05 DA06 DA11 DA20 EA03 EA04 GA11 HA08 4B050 CC03 DD02 EE10 LL05 4B064 AC26 CA02 CA05 CA11 CA19 CB30 CC24 CD07 DA10 DA20 4B065 AA01X AA01Y AA26X AA57X AA88X AB01 BA02 BA23 CA08 CA29 CA51

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】フェルラ酸からバニリンを合成するためのアミコラトプシス
種（Amycolatopsis sp.）に由来する酵素。
【請求項２】フェルロイル-CoAシンテターゼまたはエノイル-CoAヒドラタ
ーゼ／アルドラーゼから成る群から選択される、請求項１に記載の酵素。
【請求項３】フェルロイル-CoAシンテターゼ活性を現し、そして少なくと
も20個の連続するアミノ酸の距離にわたり配列番号２による配列と少なくとも70
％同一であるアミノ酸配列を含んで成る、請求項１および２に記載の酵素。
【請求項４】エノイル-CoAヒドラターゼ／アルドラーゼ活性を現し、そし
て少なくとも20個の連続するアミノ酸の距離にわたり配列番号３による配列と少
なくとも70％同一であるアミノ酸配列を含んで成る、請求項１および２に記載の
酵素。
【請求項５】請求項１ないし４に記載の酵素およびそれらの機能的均等物
をコードするヌクレオチド配列を含んで成る核酸。
【請求項６】１本鎖または２本鎖DNAまたはRNAであることを特徴とする請
求項５に記載の核酸。
【請求項７】ゲノムDNAまたはcDNAのフラグメントであることを特徴とす
る、請求項５および６に記載の核酸。
【請求項８】少なくとも70％同一性の少なくとも20個のヌクレオチドの距
離にわたり、配列番号１による配列に対応するヌクレオチド配列であることを特
徴とする、請求項５ないし７に記載の核酸。
【請求項９】請求項５ないし８のいずれかに記載の核酸およびヘテロロガ
スなプロモーターを含んで成るDNA構築物。
【請求項１０】請求項５ないし８のいずれかに記載の核酸または請求項９
に記載したDNA構築物を含んで成るベクター。
【請求項１１】請求項５ないし９のいずれかに記載の核酸を含んで成るコ
スミドクローン。
【請求項１２】請求項５ないし８のいずれかに記載の核酸または請求項９
または１０に記載のDNA構築物を含んで成る宿主細胞。
【請求項１３】原核細胞であることを特徴とする、請求項１２に記載の宿
主細胞。
【請求項１４】大腸菌であることを特徴とする、請求項１３に記載の宿主
細胞。
【請求項１５】真核細胞であることを特徴とする、請求項１２に記載の宿
主細胞。
【請求項１６】単細胞的に、または糸状的に増殖する真菌類であることを
特徴とする、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】植物細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の宿主
細胞。
【請求項１８】ａ）請求項１２ないし１７のいずれかに記載の宿主細胞を
、請求項５ないし７のいずれかに記載の核酸の発現を確実とする条件下で培養す
るか、あるいはｂ）請求項５ないし１１のいずれかに記載の核酸をインビトロ系で発現させ、そ
してｃ）細胞、培養基またはインビトロ系から酵素を得る、ことを含んで成ることを特徴とする、請求項１ないし４に記載の酵素の調製法。
【請求項１９】反応がフェルロイル-CoAシンテターゼの存在下で起こるこ
とを特徴とする、フェルラ酸からフェルロイル-補酵素Ａを調製する方法。
【請求項２０】反応がエノイル-CoAヒドラターゼ／アルドラーゼの存在下
で起こることを特徴とする、4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル-β-ヒドロキシ
プロピオニル補酵素Ａの調製法。
【請求項２１】反応がエノイル-CoAヒドラターゼ／アルドラーゼの存在下
で起こることを特徴とする、4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル-β-ヒドロキシ
プロピオニル補酵素Ａからバニリンの調製法。