JP2003513005A

JP2003513005A - α１β１インテグリンＩ−ドメインの結晶およびそれらの使用

Info

Publication number: JP2003513005A
Application number: JP2000574570A
Authority: JP
Inventors: マイケルカープサス，; マシアスノルテ，
Original assignee: バイオジェンインコーポレイテッド
Priority date: 1998-10-06
Filing date: 1999-10-06
Publication date: 2003-04-08
Also published as: EP1119583A1; AU6292499A; US20020034802A1; WO2000020459A1; CA2340333A1; AU751157B2; HK1039341A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、α１β１インテグリン（「α１β１」）のフラグメントの結晶に関し、詳細には、α１β１インテグリンのα１鎖（１４３〜３４０）の可溶性フラグメントに関する。本発明はさらに、目的の特性を有する化学的実体を設計、同定、最適化または特徴付けるようなこれらの結晶およびそれらの座標に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）細胞外マトリクス（「ＥＣＭ」）（例えば、コラーゲン、ラミニン）の構成成
分と相互作用する細胞レセプターの主要なクラスは、非共有的に会合したαサブ
ユニットおよびβサブユニットから構成される膜貫通ヘテロダイマー糖タンパク
質であるインテグリンである。このインテグリンファミリーは、少なくとも１６
のαサブユニットを含み、このうちの７つは、様々に「Ｉドメイン」または「Ａ
ドメイン」と呼ばれるＮ末端領域中の約２００アミノ酸挿入ドメインを含む。

【０００２】胚発生における細胞分化、細胞増殖および細胞移動のようなプロセス、ならび
にリモデリング（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）および細胞／組織修復事象は、細胞と
ＥＣＭとの連絡に依存する。α１β１インテグリン（「α１β１インテグリン」
）は、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶおよびラミニンについての細胞表面レセプ
ターである。これはまた、ＶＬＡ−１としても公知である。実際、α１β１は、
コラーゲン依存性の接着および移動を支持するのみでなく、傷害後のＥＣＭリモ
デリングに関与し得る間葉性由来細胞上の重要なコラーゲンレセプターでもある
らしい（Ｇｏｔｗａｌｓら（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：２
４６９〜２４７７頁）。細胞がコラーゲンマトリクスを収縮および組織化する能
力は、任意の創傷治癒応答の重要な成分である。α１β１インテグリンの不適当
な調節は、線維症のような特定の病理学的状態を生じ得る。

【０００３】さらに、α１β１がＴ細胞／単球駆動性疾患において役割を果たし得ることを
示唆する、限定されるが刺激的な文献が、存在する。抗−α１β１抗体は、Ｔ細
胞依存性サイトカイン発現をブロックする。Ｍｉｙａｋｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１７７：８６３〜８６８（１９９３）。α１β１の発現は、持続的に活性化
された、２〜４週間培養されたＴ細胞においてアップレギュレートされ（Ｈｅｍ
ｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：５０２〜５０８（１９８５））
、そしてα１β１の発現はまた、慢性関節リウマチを有する患者の滑膜から単離
された高い割合のＴ細胞上で発現される。Ｈｅｍｌｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ．，７８：６９６〜７０２（１９８６）。慢性の組織損傷は、常在する
活性化Ｔ細胞およびまたＴ細胞由来サイトカインによって補充される単球／線維
芽細胞の両方から生じる。α１β１誘導化Ｔ細胞相互作用のブロッキングは、活
性化Ｔ細胞の除去および／または炎症性サイトカインレベルの減少によって組織
損傷を軽減し得る。

【０００４】従って、α１β１インテグリン−ＥＣＭまたはＴ細胞相互作用を干渉する強力
な薬物候補物を設計、同定または獲得することは有用である。生理学的に関連す
る生物学的経路において役割を果たす候補物を同定するための薬物設計の最近の
出現は、薬物についてののリード化合物を獲得または設計するための有用なアプ
ローチを提供してきた。

【０００５】一般に、このアプローチは、生理学的に関連する生物学的経路において役割を
果たすタンパク質標的分子を選択することを必要とする。代表的に、一旦、天然
のまたは合成された、インヒビターまたはアゴニストが、標的分子について見出
されると、このインヒビターまたはアゴニストは、所望の特性を有する候補物を
生成するために改変されるか、あるいは最適化される。

【０００６】リガンドをより有効に設計または改変するために、標的タンパク質分子に結合
するような公知のリガンドの生物活性コンホメーションのための三次元構造を有
することが有用である。さらに、その公知のリガンドを有する複合体においてタ
ンパク質標的の三次元構造を試験することによってそのリガンドとその標的タン
パク質との詳細な相互作用を理解することは価値がある。このことは、当業者に
、タンパク質との重要な相互作用を保存することを可能にする一方、タンパク質
とより正確に相互作用するように候補リガンドを改変し、より良好な能力および
特異性を生じる。

【０００７】しかし、このタンパク質標的の三次元結晶構造は、頻繁に利用可能ではない。
これは、その構造に関する正確な情報を提供するに十分なサイズおよび質の結晶
を得るために必要である有意な試みに起因する。例えば、それは、時間がかかり
、タンパク質を発現、精製および特徴付けすることがしばしば困難である。さら
に、一旦十分な純度のタンパク質が得られると、ｘ線回折および続く構造解析の
ために有用なサイズおよび質に結晶化されねばならない。従って、結晶構造は薬
物設計および薬物開発の分野において価値ある情報を提供し得るが、特定の生物
学的に関連する分子（例えば、α１β１インテグリン）の結晶は、当業者に容易
に利用可能ではない。

【０００８】さらに、標的タンパク質（例えば、α１β１インテグリン）のアミノ酸配列は
公知であるが、この配列情報は、このタンパク質の結晶構造の正確な予測を可能
にしない。この配列情報は、リガンド（例えば、α１β１インテグリン）とその
標的との間の構造、コンホメーションおよび化学的相互作用の理解を提供しない
。

【０００９】従って、α１β１インテグリン−ＥＣＭおよび／またはＴ細胞相互作用を干渉
し得る化合物を有効に設計、スクリーニングまたは最適化するために、α１β１
インテグリンの細胞外ドメインの結晶三次元構造の詳細な知見についての必要性
が存在する。

【００１０】 α１β１インテグリンの可溶性バージョンは、その細胞外領域またはそのフラ
グメントから作製され得る。本明細書において使用される場合、用語「α１β１
インテグリン」は、α１β１インテグリンまたはその誘導体の、膜貫通領域およ
び細胞外領域を欠く可溶性α１β１インテグリンポリペプチド、ホモログおよび
アナログを含む。本明細書に記載されるようなサイズおよび質のα１β１インテ
グリンまたはそのフラグメントのα１鎖の結晶は、ｘ線回折の実行を可能にし、
当業者にα１β１インテグリンの結合特性ならびにα１β１インテグリンまたは
そのフラグメントに会合し得る分子または分子複合体の結合特性に関連する研究
を実施させ得る。

【００１１】（発明の要旨）従って、本発明は、α１β１インテグリンの特性ならびにそれに会合し得る分
子または複合体についての有用な情報を得るに十分なサイズおよび質の、α１β
１インテグリンのα１鎖の結晶およびα１鎖のフラグメントの結晶に関する。本
願発明は、α１β１インテグリンのα１鎖のＣｙｓ１４３〜Ａｌａ３４０フラグ
メントの三次元結晶構造を提供し、この結晶構造を使用して、未知の結晶の構造
を解析するために結合部位を同定し得、望ましい結合特性を有する変異体を提供
し得、そして最終的には、コラーゲンもしくは他のリガンドとα１β１との間の
相互作用を干渉し得る分子または化学的実体を設計、特徴付け、あるいは同定し
得る。

【００１２】本発明のさらなる特徴および利点は、以下の説明に示され、そして一部は、そ
の説明から明らかであるか、あるいは、本発明の実施によって学ばれ得る。本発
明の目的および他の利点は、本明細書の記載された説明および請求の範囲ならび
に添付の図面に特に指摘される組成物および方法によって実現され、そして達成
される。

【００１３】これらおよび他の利点を達成するために、そして本発明の目的に従って、本明
細書において具体化され、そして広範に記載されるように、本発明は、α１β１
インテグリンの結晶に関する。より詳細には、本発明は、α１β１（Ｃｙｓ１４
３〜Ａｌａ３４０）のα１鎖の細胞外ドメインの機能的フラグメントによって形
成される結晶に関し、ここで、この結晶は、格子定数ａ＝３４．７７□□、ｂ＝
８５．９２□、ｃ＝１３２．５６□、α＝β＝γ＝９０□およびＰ２₁２₁２₁の
空間群およびその結晶の等価物を有する。本願のα１β１の結晶は、表ＩＩにお
いて同定される構造座標によって実質的に記載される。特定の実施態様において
本願の結晶は、Ａｓｐ１５４、Ｓｅｒ１５６、Ａｓｎ１５７、Ｓｅｒ１５８．Ｌ
ｅｕ２２２、Ｇｌｎ２２３、Ｔｈｒ２２４、Ａｓｐ２５７、Ｇｌｕ２５９、Ｈｉ
ｓ２６１、Ｈｉｓ２８８、Ｔｙｒ２８９、Ｇｌｙ２９２、Ｌｅｕ２９４およびＬ
ｙｓ２９８を含む結合部位部分によって特徴付けられる。本願の結晶の変異体、
ホモログ、共複合体およびフラグメントもまた、本明細書において意図される。

【００１４】特定の実施態様における本願発明は、α１β１インテグリン（１４３〜３４０
）の結晶化形態の重原子誘導体に関し、そしてより詳細には、上記に記載される
α１β１の結晶化形態の重原子誘導体に関する。種々の実施態様において、本願
発明は、α１β１の少なくともフラグメントを含む水溶液を提供する工程、沈殿
剤を含むリザーバー溶液を提供する工程、一定量のα１β１溶液と一定量のこの
リザーバー溶液とを混合する工程および得られた混合容量を結晶化する工程、に
よって、α１β１またはそのフラグメントの結晶化形態を調製する方法に関する
。特定の実施態様において、この結晶は、α１β１（Ｃｙｓ１４３〜Ａｌａ３４
０）のα１鎖を含む水溶液に由来する。種々の実施態様において、水溶液中のα
１β１の濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約５ｍｇ／ｍ
ｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ、そして最も好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌである。本発明
において使用される沈殿剤は、当該分野で公知の任意の沈殿剤であり得、好まし
くは、クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウムおよびポリエチレングリコールか
らなる群より選択される。任意の濃度の沈殿剤が、このリザーバー溶液において
使用され得るが、濃度が約２０％重量／容量（「ｗ／ｖ」）〜約５０％ｗ／ｖで
ある濃度が好ましく、より好ましくは、約２５％ｗ／ｖであることが好ましい。
同様に、このリザーバー溶液のｐＨは、好ましくは約４〜約１０の間で変化され
得、最も好ましくは約６．５であり得る。

【００１５】結晶化の種々の方法が、本願発明において使用され得る。この方法には、以下
が挙げれられるが、これらに限定されない：拡散蒸着、バッチ（ｂａｔｃｈ）、
液橋（ｌｉｑｕｉｄｂｒｉｄｇｅ）または透析。拡散蒸着結晶化が、好ましい
。

【００１６】さらに、本願発明は、α１β１リガンド（例えば、細胞外マトリクスのメンバ
ー（例えば、コラーゲン））とα１β１との間の相互作用に干渉し得る分子また
は他の化学的実体をスクリーニング、設計、または最適化する方法において、本
願の結晶、および構造座標を使用する方法に関する。従って、α１β１またはそ
の一部の構造座標を使用して、α１β１またはそのフラグメントの変異体、ホモ
ログまたは共複合体の結晶構造を解析し得、ならびにα１β１またはそのフラグ
メントと会合する他の未知の結晶を解析し得る。

【００１７】いくつかの実施態様において、α１β１のα１鎖の構造座標（表ＩＩにおいて
例示されるような）を使用して、化学的実体を評価し、その化学的実体のα１β
１への結合についての情報を獲得し得る。この構造座標は、細胞外マトリクス（
すなわち、コラーゲンまたはラミニン）とα１β１との間の関係に干渉する化学
的実体（例えば、インヒビターまたはアゴニスト）を特徴付け得る。この座標は
また、結合特性を最適化してα１β１の結合部位におけるリガンドの配向を決定
するために使用され得る。薬物設計、薬物候補物のスクリーニングおよび最適化
の領域における、ならびにさらなる未知の結晶構造の決定における、本願発明の
多くの使用が、当業者に明らかである。

【００１８】種々の実施態様において、本願発明は、機械読み取り可能データでコードされ
るデータ記憶材料を有する機械読み取り可能データ記憶媒体に関し、適切な機械
によって読み取られる場合、この媒体は、結晶の三次元表示を提示し得る。提示
される結晶は、表ＩＩ中の座標によって記載されるようなα１β１のフラグメン
トを含むか、またはアミノ酸Ａｓｐ１５４、Ｓｅｒ１５６、Ａｓｎ１５７、Ｌｅ
ｕ２２２、Ｇｌｎ２２３、Ｔｈｒ２２４、Ａｓｐ２５７、Ｇｌｕ２５９、Ｈｉｓ
２６１、Ｈｉｓ２８８、Ｔｙｒ２８９、Ｇｌｙ２９２、Ｌｅｕ２９４およびＬｙ
ｓ２９８を含む結合部位部分を有する結晶を含む。

【００１９】他の実施態様において、本願発明は、α１β１のフラグメントの結晶の構造座
標からの相の算出、得られる相からの電子密度マップの算出、次いでこの電子密
度マップに基づいて未知の構造の少なくとも一部の構造を決定することによって
、化学的実体または分子複合体の少なくとも一部の三次元構造を決定するための
方法に関する。

【００２０】なお他の実施態様において、本発明は、化学的実体がα１β１に会合する能力
を評価するための方法に関する。この方法は、化学的実体とα１β１との間の適
合操作を実施するためにコンピュータ手段または実験的手段を使用し、そしてデ
ータを分析して特徴を決定する。細胞外マトリクスとα１β１との間のインビボ
会合またはインビトロ会合を干渉し得る、これらの方法によって同定される化学
的実体はまた、本願発明によって包含される。本願の化学的実体は、α１β１の
結合部位と実質的に類似の結合部位を含み得るか、あるいは、α１β１の結合部
位に会合し得る結合部位を含み得る。

【００２１】上述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方が例示的および説明的であ
り、そして本願発明のさらなる解釈を提供することを意図することが、理解され
るべきである。

【００２２】付随する図面は、本発明のさらなる理解を提供するために含まれ、そしてこの
明細書の一部を組込みかつ構成し、本発明のいくつかの実施態様を例示し、そし
て説明とともに、本発明の原理を説明するために付与される。

【００２３】（発明の詳細な説明）本明細書中に記載される本発明がより完全に理解され得るように、以下の詳細
な説明を示す。

【００２４】本発明は、α１β１インテグリンの細胞外ドメインの可溶性フラグメントの結
晶に関する。詳細には、本発明は、α１β１インテグリンのα１鎖のＣｙｓ１４
３〜Ａｌａ３４０の配列（「ｓα１β１（１４３−３４０）」）を含む可溶性タ
ンパク質の結晶、Ｘ線結晶学により決定されるようなｓα１β１（１４３−３４
０）の構造、そしてα１β１活性の候補インヒビターまたは候補アゴニストを設
計、同定、特徴付け、スクリーニングおよび／または最適化するための、ｓα１
β１（１４３−３４０）構造ならびにそのホモログ、変異体、および共複合体の
構造の使用に関する。

【００２５】（Ａ．定義）本明細書中で、用語α１β１インテグリン（「ＶＬＡ−１」または「α１β１
」または「α１β１インテグリン」と交換可能に使用する）は、ラミニンまたは
コラーゲンのような細胞外マトリクスタンパク質のメンバーに結合し得るポリペ
プチドの種類、またはそのホモログもしくはフラグメントをいう。この用語は、
本明細書中で使用される場合、ｓα１β１インテグリン（１４３−３４０）、そ
のホモログ、変異体、等価物、およびフラグメントを含む。

【００２６】用語「共複合体（ｃｏ−ｃｏｍｐｌｅｘ）」は、化学的実体と共有的会合また
は非共有的会合にあるα１β１、またはα１β１の変異体もしくはホモログをい
う。

【００２７】用語「ホモログ」または「相同な」は、本明細書中で使用される場合、用語「
同一性」と同義であり、そして２つのポリペプチド間、２つの分子間、または２
つの核酸間の配列類似性をいう。２つの比較される配列の両方における１つの位
置が、同一の塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットにより占められる場合（
例えば、２つのＤＮＡ分子の各々における１つの位置がアデニンで占められる場
合、または２つのポリペプチドの各々における１つの位置がリジンで占められる
場合）、個々の分子はその位置で相同である。２つの配列間の相同性パーセンテ
ージは、２つの配列で共有される整合位置または相同位置の数÷比較される位置
の数×１００の関数である。例えば、２つの配列における位置の１０個のうち６
個が整合または相同である場合、この２つの配列は６０％相同である。例として
、ＤＮＡ配列のＣＴＧＡＣＴおよびＣＡＧＧＴＴは、５０％の相同性を共有する
（合計位置６個のうち３個が整合している）。一般的に、最大の相同性を与える
ように２つの配列を整列させて比較をなす。このようなアラインメントを、例え
ば、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）のようなコンピュータ
ープログラムによって簡便に実行されるＮｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）の方法を使用して、提供し得る。相
同配列は、同一性または類似性のアミノ酸残基を共有する。ここで類似性残基と
は、整列した参照配列において対応するアミノ酸残基に対して保存的置換である
か、またはこの対応するアミノ酸残基の「許容される点変異」である。これに関
して、参照配列における残基の「保存的置換」とは、対応する参照残基に対して
物理的または機能的に類似な残基の置換（例えば、類似のサイズ、形状、電荷、
化学的特性（共有結合または水素結合を形成する能力を含む）などを有する残基
の置換）である。特に好ましい保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆら、５：Ａｔｌａ
ｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ、
５：補遺３、第２２節：３５４−３５２、Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏ
ｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７８）の「許容され
る点変異（ａｃｃｅｐｔｅｄｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎ）」に規定される
基準を満たしている置換である。

【００２８】用語「変異体」は、野生型からの少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失、ま
たは挿入によって特徴付けられる、α１β１インテグリンまたはそのフラグメン
トをいう。このような変異体は、例えば、オリゴヌクレオチド部位特異的変異誘
発によりそのコード配列中で以前に改変されたα１β１インテグリンを発現させ
ることによって、調製され得る。

【００２９】用語「正に荷電したアミノ酸」は、通常の生理学的条件下で正に荷電した側鎖
を有する、天然または非天然の任意のアミノ酸を含む。正に荷電した天然に存在
するアミノ酸の例は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンである。

【００３０】用語「負に荷電したアミノ酸」は、通常の生理学的条件下で負に荷電した側鎖
を有する、天然または非天然の任意のアミノ酸を含む。負に荷電した天然に存在
するアミノ酸の例は、アスパラギン酸およびグルタミン酸である。

【００３１】用語「疎水性アミノ酸」は、水中において比較的不溶性である、非電荷の非極
性側鎖を有する任意のアミノ酸を意味する。例は、アラニン、ロイシン、イソロ
イシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオ
ニンである。

【００３２】用語「親水性アミノ酸」は、水中において比較的可溶性である、非電荷の極性
側鎖を有する任意のアミノ酸を意味する。例は、セリン、トレオニン、チロシン
、アスパラギン、グルタミン、およびシステインである。

【００３３】用語「改変された表面電荷」は、生理学的ｐＨにおいて、α１β１インテグリ
ンと比較した場合の、変異体ポリペプチドの１つ以上の電荷ユニットにおける変
化を意味する。表面電荷における変化は、置換されたアミノ酸を含むポリペプチ
ド分子の等電点（ｐＩ）を測定すること、およびそれを野生型分子のｐＩと比較
することによって決定され得る。

【００３４】用語「〜と会合する」は、２つの化学的実体の間またはその部分の間（例えば
、α１β１インテグリンまたはその部分と化学的実体との間）の近接の状態をい
う。会合は、非共有的会合（ここで近位は、水素結合、ファンデルワールス相互
作用、または静電気的相互作用によってエネルギー的に支持される）であり得る
か、または会合は共有的会合であり得る。

【００３５】用語「結合部位」は、化学的実体が別の実体と会合するかまたは結合する部位
のいずれかまたはすべてをいう。

【００３６】用語「構造座標」は、結晶形態の分子中の原子（散乱中心（ｓｃａｔｔｅｒｉ
ｎｇｃｅｎｔｅｒ））によるＸ線の単色ビームの回折で得られたパターンに関
して、数学的方程式から導き出される座標をいう。この回折データを使用して、
結晶の反復単位の電子密度マップを算出する。当業者は、得られるデータが使用
された特定の系に依存し、従って、このような座標が、本明細書中に記載される
のと実質的に同じ関係を規定する場合には、異なる座標が実際は同一の結晶を記
載し得るということを理解する。電子密度マップを使用して、結晶の単位格子内
の個々の原子の位置を確証する。

【００３７】当業者は、Ｘ線結晶学によって決定された構造座標のセットが、標準誤差を伴
わないものではないことを理解する。表ＩＩは、α１β１インテグリン（１４３
−３４０）のα１鎖のＩ−ドメインの原子座標である。本発明の目的のため、表
ＩＩの構造座標に（骨格原子を用いて）重ねられた場合に、約２□未満である等
価タンパク質骨格原子の平方自乗平均偏差を有するα１β１（１４３−３４０）
の構造座標の任意のセットが、同一とみなされる。好ましくは、この偏差は、約
１オングストローム未満、そしてより好ましくは約０．５オングストローム未満
である。

【００３８】用語「重原子誘導体化」は、結晶化したα１β１インテグリンの化学的改変形
態を生成する方法をいう。実際には、結晶を、重金属原子の塩、または有機金属
化合物（例えば、塩化鉛、チオリンゴ酸金（ｇｏｌｄｔｈｉｏｍａｌａｔｅ）
、チメロサールまたは酢酸ウラニル）（これらは、結晶を通して拡散し得、そし
てタンパク質の表面に結合し得る）を含有する溶液中に浸漬する。結合した重金
属原子（１つまたは複数）の位置を、浸漬した結晶のＸ線回折分析によって決定
し得る。この情報を使用して、この分子の三次元構造を構築するために用いられ
る位相情報を作製し得る。

【００３９】用語「単位格子」は、基礎の形状化ブロックをいう。結晶の容量全体は、この
ようなブロックの規則的な組み立てにより構築され得る。各単位格子は、パター
ンの単位の完全な提示を含み、この反復が結晶を組み立てる。

【００４０】用語「空間群」は、結晶の対称エレメントの配置をいう。

【００４１】用語「分子置換」は、未知の結晶について観察された回折パターンを最も良く
説明するために、この未知の結晶の単位格子内で、構造座標が既知（例えば、表
ＩＩにおけるα１のＩ−ドメインの座標）の分子を配向および位置付けることに
より、構造座標が未知である結晶の予備的構造モデルを作製することを包含する
方法をいう。次いで、位相がこのモデルから算出され得、そして観察された振幅
と組合わせて、座標が未知である構造のおおよそのフーリエ合成を与え得る。こ
れを次いで、任意のいくつかの精製の形態に供して、未知の結晶の最終的な正確
な構造を与え得る。例えば、Ｌａｔｔｍａｎ，Ｅ．「ＵｓｅｏｆｔｈｅＲ
ｏｔａｔｉｏｎａｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎＦｕｎｃｔｉｏｎｓ」、Ｍ
ｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１１５、第５５〜７７頁（１９８
５）；Ｒｏｓｓｍａｎ編「ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｐｌａｃｅｍｅｎ
ｔＭｅｔｈｏｄ」Ｉｎｔ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｓｅｒ．、Ｎｏ．１３、Ｇｏｒｄ
ｏｎおよびＢｒｅａｃｈ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９７２）（すべて、特に、本明
細書中で参考として援用する）を参照のこと。本発明によって提供される構造座
標を用いると、分子置換を使用して、結晶性共複合体、未知のリガンド、変異体
、ホモログ、またはα１β１もしくはそのフラグメントの異なる結晶形態の構造
座標を決定し得る。さらに、特許請求される結晶およびその座標を用いて、α１
β１もしくはフラグメントと会合するか、またはα１β１またはそのフラグメン
トのリガンドである細胞外マトリクスのメンバーと会合する化学的実体の構造座
標を決定し得る。

【００４２】用語「化学的実体（ｃｈｅｍｉｃａｌｅｎｔｉｔｙ）」は、本明細書中で使
用される場合、例えば、任意の分子、分子複合体、化合物、またはそれらのフラ
グメントを意味する。

【００４３】 α１β１またはそのフラグメントの変異体は、当業者に公知の一般的な生合成
方法を使用した、α１β１またはフラグメント内への天然または非天然のアミノ
酸の部位特異的組み込みによって生成され得る。例えば、α１β１の野生型のα
１鎖において目的のアミノ酸をコードするコドンを、オリゴヌクレオチド部位特
異的変異誘発を用いて、「ブランク」の意味のないコドン（例えば、ＴＡＧ）に
よって置換し得る。次いで、このコドンに対して指向されたサプレッサーｔＲＮ
Ａを、所望のアミノ酸を用いてインビトロで化学的にアミノアシル化し得る。次
いで、このアミノアシル化されたｔＲＮＡをインビトロ翻訳系に添加して、部位
特異的に組み込まれたアミノ酸を有する変異体α１β１を産生し得る。

【００４４】用語α１β１の「可溶性フラグメント」および本明細書中で用いられる任意の
等価な用語は、α１β１の機能的フラグメントをいい、そしてより好ましくは機
能的α１鎖をいう。用語「機能的」は、この文脈で使用される場合、コラーゲン
またはラミニンのような細胞外マトリクスのメンバーまたはその任意のフラグメ
ントもしくはホモログ（そのフラグメントを含む分子複合体を含む）に結合し得
るか、またはそれらと会合し得る細胞外ドメインの可溶性フラグメントをいう。
このような結合は、当該分野において公知の標準的プロトコルを使用する、免疫
沈降実験を通して実証され得る。

【００４５】（Ａ．α１β１インテグリン、その結晶、およびその生物学的意味）本願明細書および特許請求の範囲を通して、記載されるアミノ酸の位置的配置
は絶対値ではなく、むしろ残基の相対的関係を規定していることが理解される。
従って、本発明は、同一または類似の相対的位置を有する配列を包含することを
意図する。

【００４６】最初に、本発明は、全体または一部分において、α１β１の活性部位または補
助的結合部位に結合し得る化学的実体または化合物（阻害性化合物を含む）を設
計、スクリーニング、および最適化するための分子設計技術の使用を可能にする
。α１β１インテグリンは、コラーゲンのような細胞外マトリクスへのその結合
によって媒介される重要な機能への関与が理由で、医用生体的にかなり興味深い
膜結合タンパク質である。α１β１は、種々の脊椎動物（例えば、哺乳動物）生
物（例えば、ヒト、マウス、ラット、およびブタ）において見出されているので
、本願発明は、任意の特定の種または生物に限定されることを意図しない。

【００４７】 α１β１インテグリン（ＶＬＡ−１）は、タンパク質のインテグリンファミリ
ーのメンバーである。このファミリーの他のメンバー（αＭ、αＬ、およびα２
）由来のＩ−ドメインの結晶構造が記載された。概説については、Ｄｉｃｋｅｓ
ｏｎおよびＳａｎｔｏｒｏ（１９８８）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．ＬｉｆｅＳｃｉ．
５４：５５６−５６６、およびＥｍｓｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
２、２８５１２−２８５１７を参照のこと。

【００４８】これらのＩ−ドメインを、ｓα１β１インテグリン（１４３−３４０）結晶構
造を理解するための骨組みとして使用した。しかし、確かな類似性にもかかわら
ず、α１のＩ−ドメインとαＭ、αＬおよびα２インテグリンのＩ−ドメインと
の間の差異は、これらのリガンド−レセプター系が、空間的には重複するが、異
なる分子の結合決定基を有する接触残基の非同一性でかつ非保存性の部位を利用
することを確証する。

【００４９】種々のインテグリンの複雑性および重複、ならびにそれらの生物学的プロセス
を考慮すると、α１β１がそのリガンドに特異的に結合するという知見は、α１
β１シグナル伝達を阻害することが重要な治療的適用を有し得ることを示唆する
。本明細書中に提示されるｓα１β１（１４３−３４０）の結晶構造は、そのよ
うな治療剤の設計、同定、特徴付け、および最適化に有用であると予期される。

【００５０】出願した本発明の以下の詳細な説明は、以下を含む：（ａ）α１β１インテグ
リンのα１鎖のＩ−ドメイン（Ｃｙｓ−１４３〜Ａｌａ−３４０）の結晶構造お
よびその座標、（ｂ）その結合部位、（ｃ）α１β１結晶またはそのフラグメン
トを作製する方法、ならびに（ｄ）α１β１結晶またはそのフラグメント、およ
びその構造座標を使用する方法。

【００５１】（（ａ）α１のＩ−ドメインの結晶構造）本願発明は、α１β１インテグリンの結晶、ならびにそれに由来する構造を提
供する。結晶は、ラットのα１のＩ−ドメインに由来する。それにもかかわらず
、ラットのα１のＩ−ドメインとヒトのα１のＩ−ドメインとの間の配列同一性
は、約９５％である。詳細には、ラットのα１のＩ−ドメインとヒトのα１のＩ
−ドメインとの間で異なるアミノ酸は、Ｉｌｅ１６６、Ａｓｎ２１４、Ｇｌ
ｙ２１７、Ａｒｇ２１８、Ｇｌｎ２１９、Ｌｅｕ２２２、Ｔｙｒ２６
２、Ｇｌｎ２６７、Ｈｉｓ２８８、Ａｌａ３３０（ラットのＩ−ドメイン
配列）である。これらの大半は、α１のＩ−ドメインの金属イオン依存性接着部
位（ＭＩＤＡＳ）（この部位は、リガンド結合に関与するようである）から比較
的遠く離れて位置する。リガンド結合に関与すると予期されるわずか２個のアミ
ノ酸は、Ｌｅｕ２２２およびＨｉｓ２８８である。この高い程度の一次アミ
ノ酸配列同一性は、ラットの１Ｉ−ドメインおよびヒトの１Ｉ−ドメインの
３次元構造が類似していると予期されることを示す。従って、本発明者らは、本
願特許で考察する目的のためにラットの１Ｉ−ドメインの結晶構造を使用した
。そして本発明者らは、ヒトの１Ｉ−ドメインの３次元構造が、主鎖の原子に
ついて実質的に同一の座標を有することを十分に予期している。

【００５２】本願発明は、斜方六面体である単位格子を有し、かつ以下の寸法：ａ＝３４．
７７□□□；ｂ＝８５．９２□およびｃ＝１３２．５６□；α＝β＝γ＝９０□
を有するα１β１インテグリン（１４３−３４０）のα１鎖由来のフラグメント
の結晶を提供する。Ｎ末端の残基１４３〜１４４およびＣ末端の３３６〜３４０
を除いて、α１β１インテグリンのα１鎖のＩ−ドメインのほぼ全ての残基が、
図１に示される最終的電子密度マップにおいて十分に規定される。この現在のモ
デルは、３８６個のアミノ酸残基および１９９個の水分子からなり、これは１０
０□と２．２□との間のデータについて、２３．５％の結晶学的Ｒ因子および３
０．２％のＲ_freeを有する。

【００５３】不斉単位においてこの分子の２つのコピー（「Ａ」および「Ｂ」と呼ぶ）が存
在する。ラマチャンドランの図は、３８６アミノ酸残基のうちから３８４アミノ
酸残基が、許容された領域内で（φ、ψ）角を有することを示す。例外は、残基
Ｇｌｕ１９２（ＡおよびＢ）である。ラットのＩ−ドメイン結晶構造の原子座
標では（表ＩＩ）、分子Ａの残基Ｔｈｒ１４５、Ｇｌｎ１４６、Ａｒｇ２
３４、ならびに分子ＢのＴｈｒ１４５およびＡｒｇ１７５は、側鎖の電子密
度の非存在が理由でアラニンとしてモデル化されている。さらに、分子Ａの残基
１４３、１４５、３３７、３３８、３３９、３４０、および分子Ｂの残基１４３
、１４４、３３９、３４０を、弱い電子密度に起因して、このモデルに含ませて
いない。

【００５４】Ｉ−ドメインは、５つの平行な□−鎖および１つの逆平行な□−鎖のコアを取
り囲む７つのヘリックスの存在により特徴付けられるヌクレオチド結合折りたた
み（図２）に適合する。この分子の寸法は、２５□×３０□×５０□である。全
体的な折りたたみは、αＭ、αＬ、およびα２のＩ−ドメイン、そして特にα２
のＩ−ドメインの折りたたみに類似する。他のＩ−ドメインに対する相同性によ
り、□１のＩ−ドメインの金属イオン依存性接着部位（ＭＩＤＡＳ）は、残基Ａ
ｓｐ１５４、Ｓｅｒ１５６、Ｓｅｒ１５８、Ｔｈｒ２２４、Ａｓｐ２
５７からなると推測される。ＭＩＤＡＳ部位は、ＭｇカチオンまたはＭｎカチオ
ンの結合の部位であり、そしてリガンド結合に関与すると予期される。結晶は、
ＭｇカチオンまたはＭｎカチオンの非存在下（夾雑物を除く）で発達し、そして
カチオンに対応する箇所で可視的な電子密度は全く存在しない。この構造は、Ｌ
ｅｅら（１９９５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ３、１３３３−１３４０において提案
されたモデルにより、「不活性な」コンホメーションを有するようである。分子
Ａおよび分子Ｂのコンホメーションは、非常に類似している。

【００５５】（（ｂ）結合部位） α２Ｉドメインに対するするコラーゲン結合についてなされたモデル化研究
（Ｅｍｓｌｅｙら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、２８５１２−
２８５１７）は、コラーゲンに対する結合部位が、ＭＩＤＡＳ部位およびいくつ
かの隣接する残基を含むと推定されることを示唆する。類推によって、コラーゲ
ンに対するα１Ｉドメインの結合部位は、残基Ａｓｐ１５４、Ｓｅｒ１５６、
Ａｓｎ１５７、Ｓｅｒ１５８、Ｌｅｕ２２２、Ｇｌｎ２２３、Ｔｈｒ２２４、Ａ
ｓｐ２５７、Ｇｌｕ２５９、Ｈｉｓ２６１、Ｈｉｓ２８８、Ｔｙｒ２８９、Ｇｌ
ｙ２９２、Ｌｅｕ２９４およびＬｙｓ２９８を含むと推定される。α１Ｉドメ
インのＭＩＤＡＳ部位（その結晶内の分子Ａ）が分子ＢのＡｒｇ２４６と相互作
用を形成するという観察は興味深い。アルギニン側鎖の正電荷が失われている金
属イオンの正電荷と取って代わることが可能である。

【００５６】（（ｃ）α１β１結晶を生成する方法）種々の実施態様において、本願発明は、α１β１またはα１β１のフラグメン
トを含む水溶液を１番目に提供することにより、結晶形態のα１β１またはその
フラグメントを調製する方法に関する。次いで、沈殿剤を含むリザーバー溶液が
、ある容量のα１β１溶液と混合され、次いで、得られた混合された容量が結晶
化される。特定の実施態様において、この結晶は、ｓα１β１（１２７〜３４０
）を含む水溶液に由来する。好ましい実施態様において、この結晶は、ｓα１β
１（１４３〜３４０）を含む水溶液に由来する。この水溶液中のα１β１または
フラグメントの濃度は変化し得、好ましくは約１ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ
、より好ましくは約５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ、そして最も好ましくは約
１０ｍｇ／ｍｌである。同様に、本発明において使用される沈殿剤は変更され得
、当該分野に公知の任意の沈殿剤から選択され得る。好ましくは、沈殿剤は、ク
エン酸ナトリウム、硫酸アンモニウムおよびポリエチレングリコールからなる群
より選択され、ポリエチレングリコール８０００が最も好ましい。任意の濃度の
沈殿剤が、リザーバー溶液中に使用され得るが、その濃度は約２０％ｗ／ｖ〜約
３５％ｗ／ｖ、より好ましくは約２５％ｗ／ｖであることが好ましい。リザーバ
ー溶液のｐＨもまた変動し得、好ましくは約４と約１０との間、最も好ましくは
約６．５である。当業者は、各これらのパラメーターが、過度の実験をせずに変
更され得、そして受容可能な結晶がなおも得られることを理解する。実際、一旦
、適切な沈殿剤、緩衝剤または他の実験的変数が、任意の所定の成長方法につい
て決定されると、任意のこれらの方法または任意の他の方法を使用して、本願結
晶を成長させ得る。当業者は、各自の特定の必要に応じてこの変数を決定し得る
。

【００５７】結晶化の種々の方法が、本願発明において使用され得、その方法としては、拡
散蒸着法（ｖａｐｏｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、バッチ法、液橋法、または透析
法が挙げられるが、これらに限定されない。拡散蒸着結晶化が好ましい。特に本
明細書中で参考として援用される、例えば、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、「Ｐｒｅｐ
ａｒａｔｉｏｎａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＣｒｙｓ
ｔａｌｓ」、Ｇｌｉｃｋ編、８２〜１５９頁、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｃｏ．（
１９８２）；Ｊａｎｃａｒｉｋら、「Ｓｐａｒｓｅｍａｔｒｉｘｓａｍｐｌ
ｉｎｇ：ａｓｃｒｅｅｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄｆｏｒｃｒｙｓｔａｌｌｉ
ｚａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．２４、４
０９〜４１１（１９９１）を参照のこと。

【００５８】拡散蒸着結晶化において、少容量（すなわち数ｍｌ）のタンパク質溶液が、沈
殿剤を含む溶液と混合される。この混合容量を、少量（すなわち約１ｍｌ）の沈
澱溶液を含む１ウェルの上に懸垂させる。ドロップからウェルの拡散蒸着が、そ
のドロップ中での結晶形成を生じる。

【００５９】結晶化の透析方法は、タンパク質は保持するが、低分子（すなわち、緩衝剤お
よび沈殿剤）は内および外に拡散させる、半透性サイズ排除膜を利用する。透析
において、蒸発によりタンパク質および沈殿剤を濃縮しているというよりはむし
ろ、沈殿剤を、膜を通してゆっくりと拡散させ、そしてタンパク質濃度を固定し
たままタンパク質の溶解度を減少させる。

【００６０】バッチ方法は、通常、ちょうど溶液が濁るときまで、タンパク質の水溶液に沈
殿剤をゆっくりと添加することを含み、この時点で、その容器が封され得、そし
て結晶化が生じるまで一定期間、静置され得る。

【００６１】従って、出願人は、本願発明が、任意のおよびすべての結晶化方法を含むこと
を意図する。当業者はそのような任意の方法を選択し得、そして選択された方法
によって所望の結晶を生じるようにパラメーターを変更し得る。。

【００６２】（（ｄ）α１β１インテグリン結晶およびその座標の使用）本願結晶およびそれらを記載する座標は、分子設計技術を使用して、化学的実
体および化合物（全体または一部においてα１β１インテグリンの結合部位に結
合し得るか、または会合し得る阻害性化合物またはアゴニストを含む）を設計、
選択、および合成することを可能にする。

【００６３】本発明により可能とされた１つのアプローチは、α１β１またはα１β１のフ
ラグメントと結合または会合する化学的実体を設計し、そして異なる方法でその
化合物の物理的特性を変更するための本明細書中で定義される構造座標の使用で
ある。従って、例えば、溶解度、親和性、特異性、効力、結合速度／解離速度（
ｏｎ／ｏｆｆｒａｔｅｓ）または他の結合特性のような特性がすべて変更およ
び／または最適化され得る。

【００６４】化学的実体の候補とα１β１またはα１β１のフラグメントとの間の相互作用
に最適な部位を決定するために異なる実体のライブラリーを用いて本発明の結晶
を精査することにより所望される化学的実体を設計し得る。例えば、溶媒で飽和
された結晶から収集された高分解能Ｘ線回折データは、各型の溶媒分子が付着す
る場所の決定を可能にする。次いで、それらの部位としっかり結合する低分子が
設計され得、そして合成され得、そして所望される活性について試験され得る。
一旦、所望される活性が得られると、この分子はさらに最適化され得る。

【００６５】本願発明はまた、低分子データベースを計算的にスクリーニングすること、ま
たは細胞外マトリックスタンパク質またはα１β１もしくはα１β１のフラグメ
ントに全体的に、または部分的に結合し得る化学的実体または化合物を計算的に
設計することを可能にする。またそれらを使用し、α１β１の変異体、共複合体
の結晶構造、またはα１β１の少なくとも一部（すなわち、α１鎖のＩドメイン
）に相同的であるか、または会合し得る任意の他の分子の結晶形態の結晶構造を
解明し得る。

【００６６】この目的のために使用され得る１つの方法は、分子置換である。例えば、α１
β１、α１β１変異体の別の結晶形態、もしくは細胞外マトリックスタンパク質
（例えば、ラミニンまたはコラーゲン）との共複合体の別の結晶形態のような未
知の結晶構造（これは任意の未知の構造であり得る）、またはα１β１もしくは
目的のフラグメントに会合する化学的実体の任意の他の未知の結晶が、本発明の
構造座標（表２に示す）を使用して決定され得る。α１β１またはフラグメント
との共複合体としては、ラミニン−α１β１、コラーゲン−α１β１、および「
低分子」−α１β１が挙げられ得るが、これらに限定されない。この方法は、本
願発明なしでこのような情報を決定する試みよりも速くかつ効率的に、未知の結
晶についての正確な構造形態を提供する。従って、得られた情報を使用し、α１
β１の潜在的インヒビターまたはアゴニストを最適化し得、そしてより重要なこ
とに、細胞外マトリックスにおいてα１β１とそのリガンドとの間の関係に影響
を及ぼす新規クラスの化学的実体を設計し、合成し得る。

【００６７】 α１β１を阻害するか、または拮抗する、本発明に従う化合物の設計は、一般
的に少なくとも２つの因子の考慮を伴なう。第一に、この化合物は、物理的にま
たは構造的にα１β１またはそのフラグメントと会合し得なければならない。こ
の会合は任意の物理的、構造的、または化学的会合であり得る（例えば、共有結
合または非共有結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用または静電
的相互作用など）。

【００６８】第二に、この化合物は、α１β１またはそのフラグメントとの会合を可能にす
るコンホメーションをとり得なければならない。この化合物の全ての部分が、α
１β１またはフラグメントとの会合に必ずしも関与するわけではないが、その関
与しない部分が、依然としてその分子の全体のコンホメーションに影響を及ぼし
得る。このことは次に、化合物の望ましさに重大な影響を与え得る。このような
コンホメーションの要件は、３次元構造全体および結合部位のすべてまたは一部
に関連する化学的実体または化合物の配向を含む。

【００６９】計算機モデル化技術の使用による実際の合成および試験の前に、α１β１また
はフラグメントに対する化学的化合物の潜在的阻害効果または結合効果が分析さ
れ得る。所定の化合物の理論構造が、所定の化合物とα１β１またはそのフラグ
メントとの間の不十分な相互作用および会合を示唆する場合、その化合物の合成
および試験についての必要性が除外される。しかし、計算機モデル化が強力な相
互作用を示すならば、その分子は合成され、そしてその分子がα１β１またはそ
のフラグメントに結合する能力について試験される。したがって、効力のない化
合物の高価で時間を費やす合成が避けられ得る。

【００７０】 α１β１またはフラグメントの阻害性化合物または他の結合性化合物は、化学
的実体またはフラグメントがスクリーニングされ、そしてα１β１の個々の結合
部位と会合する能力について選択される一連の工程により計算的に評価および設
計され得る。

【００７１】従って、当業者はいくつかの方法のうちの一つを使用し、α１β１と、そして
より詳細にはα１β１のα１鎖のＩドメイン（１４０〜３４０）の個々の結合部
位と会合する能力について化学的実体またはフラグメントをスクリーニングし得
る。例えば、このプロセスは、表ＩＩの座標に基づく計算機画面上の結合部位の
視覚的検査により始まり得る。次いで、選択されたフラグメントまたは化学的実
体は、α１β１の個々の結合ポケット内で種々の配向で配置され得るか、または
「ドッキングされ」得る。ドッキングは、ソフトウエア（例えば、Ｑｕａｎｔａ
およびＳｙｂｙｌ）を使用後、標準分子力学力場（例えば、ＣＨＡＲＭＭおよび
ＡＭＢＥＲ）とともにエネルギー最小化および分子動力学を用いて達成され得る
。

【００７２】特殊化した計算機プログラムは、目的のフラグメントまたは化学的実体を選択
することに有用であり得る。（ＧＲＩＤ、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫより入手可能；ＭＣＳＳまたはＣＡＴＡＬＹＳＴ、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒＳｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡより入手
可能；ＡＵＴＯＤＯＣＫ、ＳｃｒｉｐｐｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕ
ｔｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡより入手可能；ＤＯＣＫ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ、ＸＳＩＴ
Ｅ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｏｎｄｏｎ，ＵＫより入
手可能）。

【００７３】一旦、適切な化学的実体またはフラグメントが選択されると、それらはインヒ
ビターまたはアゴニストの中に組み合わせられ得る。組み合わせは、本明細書中
に開示される構造座標に関した計算機画面上に表示される三次元画像に対する互
いのフラグメントの関係の視覚的検査によるものであり得る。

【００７４】あるいは、所望の化学的実体を「デノボ」で実験的にいずれかの空の結合部位
を使用して、または必要に応じて所望の活性を有する分子の一部を含めて設計し
得る。従って、例えば、固相スクリーニング技術を使用し得、その技術において
、α１β１もしくはそのフラグメントのいずれか、または評価されるべき化学的
実体候補を固相に付着させ、それによりさらなる研究または最適化のための潜在
的なバインダーを同定する。

【００７５】基本的に、任意の分子モデル化技術が本発明に従って使用され得る；これらの
技術は公知であるか、または当業者に対して容易に入手可能である。本明細書中
に開示される方法および組成物を使用して、α１β１またはそのフラグメントに
会合、または結合する実体を同定し得、設計し得、または特徴付け得るのみなら
ず、細胞外マトリックスタンパク質に結合し、それにより、α１β１−ＥＣＭ相
互作用を崩壊させることが理解される、α１β１の様な実体もまた同定し得、設
計し得、または特徴付け得る。本願発明は、これらの方法および組成物を広範に
含むことが意図される。

【００７６】一旦、化合物が、上記の方法により設計または選択されると、計算的または実
験的評価を使用して、その化合物がα１β１またはそのフラグメントに結合し得
る効率が試験または最適化され得る。種々のパラメーターが、所望した結果に依
存して最適化され得る。そのパラメーターとしては、特異性、親和性、結合速度
／解離速度、疎水性、溶解性および当業者により容易に同定可能な他の特徴が挙
げられるが、それらに限定されない。従って、必要に応じて、結合性質を改善ま
たは改変するために、その化学的実体のいくつかの成分において置換、欠失、ま
たは挿入し得る。一般的に、最初の置換は保存的である。すなわち置換基は、最
初の成分とほぼ同じサイズ、形状、疎水性、および電荷を有する。

【００７７】本発明はまた、α１β１の変異体の設計およびそれらの結晶構造の解析を可能
にする。より詳細には、本願発明は当業者が（特にα１鎖のＩドメインにおける
）結合部位および境界面の位置を決定し、それによって、変異に望ましい部位を
同定することを可能にする。

【００７８】例えば、一つ以上のアミノ酸残基を交替または置換することにより、変異はＩ
ドメイン上の特定の部位または部位の組合せに指向され得る。このような変異は
、所望であっても所望でなくともよい変更された結合特性を有し得る。

【００７９】この変異体は、当該分野において公知の任意の方法（例えば、部位特異的変異
誘発、欠失または付加のような）により調製され得、次いで、目的の任意の性質
について試験され得る。例えば、変異体は、特定のｐＨにおいて、変更された電
荷、より強固な結合、より良い特異性などについてスクリーニングされ得る。

【００８０】さらに、本願発明は、潜在的な低分子薬物候補の最適化に有用である。従って
、本願結晶構造はまた、α１β１インテグリンと低分子インヒビターの複合体の
結晶構造についての情報を得るために使用され得る。例えば、その低分子インヒ
ビターがα１β１またはそのフラグメントとともに共結晶化されるならば、その
複合体の結晶構造は、位相の計算のためにα１β１またはフラグメントの既知の
座標を使用して分子置換により解明され得る。例えば、このような情報は、α１
β１インテグリンのＩドメインと低分子インヒビターとの間の相互作用の性質を
決定することに有用であり、従って、結合特徴（例えば、親和性、特異性および
反応速度）を改善する改変を示唆し得る。

【００８１】（実施例１：α１インテグリンＩドメイン（１２７〜３４０）の結晶構造の決
定）（Ａ．α１インテグリンＩドメインの発現および精製）アミノ酸残基Ｖａｌ１２７〜Ｃ末端残基Ａｌａ３４０を含むラットインテグリ
ンα１β１のα１鎖の細胞外ドメインの可溶性フラグメントを、以下のように可
溶化形態で産生し、そして精製した：α１鎖のアミノ酸Ｖａｌ１２７〜Ａｌａ３
４０のラットα１β１のＩドメイン配列をコードする遺伝子を、ラット特異的プ
ライマー（５’−ＣＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＴＣＣＴＡＣＡＴＴＴＣＡＡ−３
’［正方向］［配列番号１］；５’−ＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＣＴＴＣＣＡＡＡＧ
ＣＧＡＡＴＡＴ−３’［逆方向］［配列番号２］を使用した、ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）（ＰＣＲＣＯＲＥＫｉｔ；ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎ
ｈｅｉｍ，ＧｍｂＨＧｅｒｍａｎｙ）により、全長ｃＤＮＡから増幅した。

【００８２】生じたＰＣＲ増幅産物は、ＰＣＲ選択ＩＩカラム（５ｐｒｉｍｅ−３ｐｒ
ｉｍｅ）で精製し、ＢａｍＨ１およびＸｈｏ１制限酵素で消化し、再び、Ｐ
ＣＲ選択ＩＩカラムで精製し、そしてｐＧＥＸ４ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（こ
れは、予めＢａｍＨ１およびＸｈｏ１で消化し、子牛の腸のアルカリフォス
ファターゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）で脱リン酸化され、そ
してゲル精製した）中に連結した。連結産物を、コンピテントＤＨ５ＡＥ．Ｃ
ｏｌｉ細胞（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に形質転換し、そして生じたアンピシリン耐
性コロニーを、約４５ｋＤａグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−Ｉドメイン
融合タンパク質の発現についてスクリーニングした。このＩドメインは、この配
列の連結部にトロンビン切断部位を有するＧＳＴ融合タンパク質として発現され
た。

【００８３】ＰＢＳ中の細胞（４部の緩衝液に対して１部の湿細胞重量）を、Ｇａｕｌｉｎ
プレスにおいて溶解し、そして遠心分離（１４，０００×ｇ、３０分）によって
粒子を除去した。１８０ｇの細胞ペーストからの６５０ｍｌの溶解物を、２５ｍ
ｌのグルタチオンＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にロ
ードした。このカラムを１００ｍｌのＰＢＳで洗浄し、そしてラットのα１イン
テグリンＩドメイン−ＧＳＴ融合タンパク質が、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（
ｐＨ８．０）、５ｍＭグルタチオン（還元型）によってこのカラムから溶出した
。５ｍｌの画分を収集し、そして２８０ｎｍでの吸光度によって総タンパク質に
ついて分析し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度について分析した。ピーク
画分をプールし、アリコートし、そして−７０℃で保存した。９０％を超える純
度で合計３７５ｍｇの融合タンパク質（１５ｍｇ／ｍｌ）が回収された。

【００８４】精製されたＩドメインの調製のために、６ｍｌの融合タンパク質を、１リット
ルの５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）に対して一晩透析した。このサンプルを
、１００μｇのトロンビン（ＪｏｈｎＦｅｎｔｏｎ博士、ＮｅｗＹｏｒｋ
ＳｔａｔｅＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈ，Ａｌｂａｎｙ，ＮＹ
からの贈与物）で室温にて１５０分間処理した。ＤＴＴを２ｍＭになるように添
加し、そしてこのサンプルを、７ｍｌグルタチオンＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商
標）４Ｂカラムにロードした。このカラムからのフロースルーを１．５ｍｌ画分
として収集し、そしてこのカラムを５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５、
２ｍＭＤＴＴ緩衝液）でさらに洗浄した。フロースルーおよび洗浄画分を、２
８０ｎｍで吸光度について分析した。ピーク画分をプールし、そして２．４ｍｌ
のＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にロ
ードした。

【００８５】このＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを、２ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、２ｍＭＤＴＴ；２ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、１０ｍＭ２−メルカプトエタノールで洗浄し；２ｍｌの５０ｍＭ
ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、２５
ｍＭＮａＣｌで２回洗浄し；そしてα１インテグリンＩドメインが５０ｍＭ
ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、７５
ｍＭＮａＣｌで溶出した。ピーク画分をプールし、０．２μｍフィルターを通
して濾過し、そして４℃にて保存した。最終産物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって
９９％を超える純度であり、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６カラム（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ）でのサイズ排除クロマトグラフィーによって、
その推定質量と一致した単一のピークとして溶出し、そしてエレクトロスプレー
イオン化質量分析（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｍａｓ
ｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（ＥＳＩ−ＭＳ，Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，Ｑｕａ
ｔｔｒｏ−ＩＩ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）によって、２４，８６８Ｄａの
質量の単一イオンが含まれており、これは、操作されたトロンビン切断部位での
切断から生じる、ＧＳリンカーを加えたラットα１のＩドメイン配列についての
２４８７１．２Ｄａの推定質量と一致した。７２ｍｇの融合タンパク質から、２
４ｍｇの精製されたＩ−ドメインが回収された（この１−ドメインの１ｍｇ／ｍ
ｌ溶液についての２８０ｎｍでの０．５という理論的吸光係数に基づく）。

【００８６】予備研究では、本発明者らは、この形態のラットα１インテグリンＩドメイン
は、いずれの試験条件下でも結晶化せず、そして他のＩドメインについて観察さ
れていたように（Ｒ．Ｌｉｄｄｉｎｇｔｏｎ、私信）、このＩドメイン構築物の
Ｎ末端配列は不確定であることを見出した。簡便なタンパク質分解方法を開発し
て、精製されたラットのＩドメインを、結晶化し得る形態に変換した。

【００８７】手短には、２４０μｌの精製されたα１インテグリンＩドメイン（１６ｍｇ／
ｍｌ）を３６０μｌの５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）で希釈し、そ
して５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡化した１．２ｍｌのＶ８
プロテアーゼカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）にロードした。このＩドメイン溶液を室温
にて３５分間、この樹脂と接触させたままにし、次いでこのカラムを５０ｍＭ
ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄することにより回収した。次いで、この
Ｉドメインを１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ２−メルカプトエ
タノールに対して一晩透析し、そしてｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０限外濾過ユニッ
ト（Ａｍｉｃｏｎ）において１１ｍｇ／ｍｌになるように濃縮した。Ｖ８プロテ
アーゼ消化産物のＥＳＩ−ＭＳ分析は、この産物が、融合タンパク質構築物にお
いてＣｙｓ１４３で始まるｄｅｓ１−１８形態に変換されたことを示した。

【００８８】（Ｂ．結晶化）緩衝剤化学物質を、Ｆｉｓｈｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。結晶
化条件のスクリーニングを、ＨａｍｐｔｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｒｉｖｅｒｓ
ｉｄｅ，ＣＡ）からのＣｒｙｓｔａｌＳｃｒｅｅｎＩキットを用いて行った
。結晶を、ＪａｎｃａｒｉｋおよびＫｉｍ（１９９１）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓ
ｔａｌｌｏｇｒ．２４，４０９−４１１の拡散蒸着法によって成長させた。

【００８９】結晶化の条件を見出すために、不完全要因スクリーンを設定した。代表的実験
において、タンパク質溶液を等容量のレザーバ溶液と混合し、そしてこの混合物
の滴を、レザーバ溶液上のガラスのカバーガラスの下に懸垂した。結晶を、２５
％ｗ／ｖポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００、０．１Ｍカコジル酸ナ
トリウム（ｐＨ６．５）、０．２Ｍ酢酸ナトリウムレザーバ溶液から成長させた
。プレートとして形成させたこの結晶は、再現が容易であり、そして一方の側が
ほぼ０．５ｍｍの最大寸法に到達し得る。６と７との間のｐＨのバリエーション
は、結晶の質には影響を与えなかった。

【００９０】当業者は、上記の結晶化条件を変動させ得ることを認識する。結晶化条件を変
動させることにより、α１β１インテグリン１ドメインの他の結晶形態が得られ
得る。このようなバリエーションは、単独でまたは組み合わせて用いられ得る。
そしてこのようなバリエーションとしては、以下が挙げられる：５ｍｇ／ｍｌと
３５ｍｇ／ｍｌとの間の最終タンパク質濃度の変動；ｓα１β１インテグリンＩ
−ドメインと沈殿物との比の変動；１５％ｗ／ｖと３５％ｗ／ｖとの間のＰ
ＥＧ濃度の変動；４００〜８０００のポリエチレングリコールの分子量の変動；
５．０と９．５との間のｐＨ範囲の変動；５ｍＭと３９５ｍＭとの間のカコジル
酸ナトリウム濃度の変動；５ｍＭと４９５ｍＭとの間の酢酸ナトリウム濃度の変
動；界面活性剤の濃度または型の変動；−５℃と３０℃との間の温度変動；およ
びバッチ、液橋、もしくは上記条件を用いる透析方法またはそれらのバリエーシ
ョンによる、α１β１インテグリン１ドメインの結晶化。本明細書中に参考とし
て具体的に援用される、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ａ．（１９８２）．Ｐｒｅｐａｒ
ａｔｉｏｎａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＣｒｙｓｔａ
ｌｓ．（Ｇｌｉｃｋ，編）８２−１５９頁，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｃｏ．
，Ｎ．Ｙ．を参照のこと。

【００９１】（Ｃ．データ収集および処理）結晶を、２０％グリセロール、２５％ｗ／ｖＰＥＧ８０００、０．１Ｍ
カコジル酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、０．２Ｍ酢酸ナトリウムの凍結保護溶
液中で徐々に平衡化し、そしてループ上にマウントし、そして−１５０℃の液体
窒素気流中で直ちに凍結した。結晶を凍結する技術は、本質的にこれらを永久化
し、そしてずっと高質のデータセットを生じた。

【００９２】３．０Å解像度までの未処理のＸ線データセットを、Ｒ−ＡＸＩＳＩＩイメ
ージプレートディテクターシステム（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｔｒｕｃｔｕｒｅ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）を用いることにより、
１つの結晶から収集した。２．２Å解像度までの第２のデータセットを、より大
きな結晶を用いることにより、後で収集した。これらのデータを、ＨＫＬプログ
ラムパッケージ（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉら（１９９３）Ｄａｔａｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎａｎｄＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，８０−８６頁，ＳＥＲＣＤａｒｅ
ｓｂｕｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）を用いて積
分および換算した。データ収集には約４日必要であった。データ処理は、およそ
の格子寸法ａ＝３４．７７Å、ｂ＝８５．９２、ｃ＝１３２．５６およびα＝β
＝γ＝９０を有する斜方単位格子を示唆した。空間群は、Ｐ２_l２_l２_lと同定さ
れた。２．２Åデータセットは９１．３％完全であり、そして５．６％のＲマー
ジを有した。Ｍａｔｔｈｅｗｓ容積を算出すると、２３，０００ダルトンの分子
量と仮定して、ＶＭ＝４．２２となった。これは、非対称単位において２モルで
あることを示唆した。

【００９３】（Ｄ．分子置換）全てのその後の分子置換の計算を、ＣＣＰ４プログラムパッケージ（Ｔｈｅ
ＳＥＲＣ（ＵＫ）ＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＣｏｍｐｕｔｉｎｇＰｒｏｊ
ｅｃｔＮｏ４，ＤａｒｅｓｂｕｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＵＫ１９７
９）からのプログラムＡｍｏｒｅ（Ｎａｖａｊａら（１９９４）ＡｃｔａＣｒ
ｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ５０，１５７−１６３）を用いて行った。分子グラフ
ィック操作を、ＱＵＡＮＴＡ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，
Ｉｎｃ．）および「Ｏ」ソフトウェア（Ｊｏｎｅｓら、１９９１ＡｃｔａＣ
ｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ４７，１１０−１１９）を用いて行った。ヒトα２
のＩドメイン（Ｅｍｓｌｅｙら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，
２８５１２−２８５１７）からの結晶構造の座標を、３Åデータセットを用いる
回転調査および並進調査のためのプローブとして用いた。

【００９４】本発明者らは、側鎖を含む全ての原子の全ての座標を用いた。回転関数は、９
．７という最大相関係数（ｃｃ）を有する解を与えた。この解を、最初の並進関
数に用い、これは、２４．６というｃｃおよび４８．７％というＲ因子を与えた
。剛体細分（ｒｉｇｉｄｂｏｄｙｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）を用いて、これら
の値は、ｃｃ＝４０．３、Ｒ因子＝４８．７％まで細分された。この最初の解を
用いて、本発明者らは、最初の回転調査のピークを取得し、そして本発明者らの
最初の解を固定したまま、これらを第２の分子についての調査に用いた。並進調
査は、ｃｃ＝３７．３を有する最大のピークおよび４４．８％のＲ因子を生じた
。これらの２つの解についての剛体細分は、ｃｃ＝５６．３およびＲ因子＝４３
．３％を生じた。

【００９５】２番目に高い解を得た：ｃｃ＝３６．６、Ｒ因子＝４９．９％。対称に関連し
た分子を生成し、そしてコンピュータグラフィックを用いてこれらを表示するこ
とにより、これらが単位内に充分に充填されることが見出された。２つの分子の
非対称単位の間での回転行列が決定され、そして一方の分子を、モデル構築の最
初の段階のために用いた。

【００９６】（Ｅ．モデル構築および結晶学的細分）全てのその後の細分計算を、ＸＰＬＯＲプログラム（Ｂｒｕｎｇｅｒら（１９
８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３５，４５８−４６０）を用いて行った。データの１
０％を、Ｒ−ｆｒｅｅの計算のために用いた。モデルの偏りを減らすために、部
分的モデルを、マップ計算および細分のために用いた。α２のＩドメイン構造か
らのポリアラニン鎖の二次構造エレメントのみを含む最初の部分的モデルを、従
来の位置細分および厳格な非結晶学的対称拘束を有するグループ化Ｂ因子細分に
供した。

【００９７】Ｒ因子およびＲ−ｆｒｅｅ因子は、それぞれ３２．３％および３９．４％に低
下した。３Ｆｏ−２Ｆｃマップを、モデル構築および細分のサイクルに用いた。
用いた解像度の範囲は、８Å〜３Åであった。代表的には、サイクルは、モデル
構築、位置の細分およびＢ因子の細分からなっていた。ＲおよびＲ−ｆｒｅｅが
それぞれ２６％および３６％達した場合、３Åのデータセットは、このモデルの
さらなる改善を可能にしなかった。２．２Åのデータセットをこの時点で収集し
、そして全てのその後のモデル構築および細分のために用いた。２．２Åでの最
初の剛体細分後のＲ因子およびＲ−ｆｒｅｅ因子は、それぞれ、４１．３％およ
び４２．２％であった。

【００９８】このより大きなデータセットは、シミュレートされたアニーリング細分（ｓｉ
ｍｕｌａｔｅｄａｎｎｅａｌｉｎｇｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）およびねじれ角
力学細分の使用を可能にした。位相が改良されるにつれ、より多くの原子がこの
モデルに加えられた。最初に、グループ化されたＢ因子を、各残基に割り当てた
（１つを主鎖に、そして１つを側鎖原子に）。後に、非結晶学的対称的制約を外
し、そして個々の原子のＢ因子をここで各残基に細分した。さらに、体積溶媒補
正（ｂｕｌｋｓｏｌｖｅｎｔｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）を、このデータセット
に適用した。残渣および側鎖を、これらが３Ｆｏ−２Ｆｃ電子密度マップにおい
て充分に規定される場合は、モデルに組み込んだ。細分の後のより低いＲ−ｆｒ
ｅｅを生じた手動構造改善のみを受け入れた。

【００９９】ＲおよびＲ−ｆｒｅｅがそれぞれ２９％および３４．８％に到達した場合、Ｑ
ＵＡＮＴＡのＸ−溶媒和ユーティリティーを用いて水分子を加えた。最終的に、
最大尤度細分を用い（Ａｄａｍｓら（１９９７）Ｐｒｏ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉＵＳＡ９４，５０１８−５０２３頁）、そして１００Åと２．２Åとの
間の解像度のデータについて、それぞれ、２３．５％および３０．２％のＲおよ
びＲ−ｆｒｅｅを有する最終構造を生じた。表Ｉは、結晶学的データおよび細分
に関する情報を要約する。表ＩＩは、ラットα１β１インテグリンのα１鎖のＩ
ドメインの原子座標を列挙する。この１ドメインの結晶構造のこの座標を、α１
β１の低分子インヒビターの構造に基づく設計、コンピュータ薬物設計および反
復構造最適化に用い得る。

【０１００】（ａ．コンピュータ薬物設計）低分子インヒビターが、コンピュータアプローチを用いて設計され得る。これ
らのアプローチはまた、デノボ薬物設計として公知である。手短には、α１βイ
ンテグリンまたはそのフラグメントの結晶構造座標は、コンピュータプログラム
（例えば、ＤＯＣＫ）への入力である。ＤＯＣＫのようなプログラムは、α１β
１またはこのフラグメントに結合すると予測される低分子構造のリストを出力す
る。次いで、これらの分子は、α１β１結合について生化学的アッセイによって
スクリーニングされ得る。代表的には、分子を、α１β１またはそのフラグメン
トへの結合能についてスクリーニングする生化学的アッセイは、競合型アッセイ
である。このようなアッセイにおいて、この分子は、アッセイ溶液に添加され、
そして阻害の程度が、従来の方法論を用いて測定される。このようなアッセイの
１例は以下の通りである：９６ウェルプレートを、コラーゲンＩＶまたはコラー
ゲンでコーティングし、そして３％ウシ血清アルブミン溶液でブロックし得る。
α１のＩドメインの溶液を、試験中の低分子と一緒に、このコーティングしたプ
レート上で室温にて１時間インキュベートし、そしてｔｒｉｔｏｎ緩衝液中で洗
浄する。結合したα１の１ドメインを、ビオチン化抗Ｉドメイン抗体を用いて検
出する。プレートを、マイクロプレートリーダーでＯＤ₄₀₅で読み取る。結合し
た１ドメインの量を、低分子が存在しないコントロール実験と比較する。結合し
た１ドメインの量がコントロール実験の場合よりも低ければ、このことは、この
低分子による阻害を示唆する。

【０１０１】（ｂ．反復サイクルの構造最適化） α１β１またはフラグメントと低分子インヒビターとの間で形成された複合体
の結晶構造が、解明され得る。手短には、低分子インヒビターが、代表的には、
上記のコンピュータアプローチまたは低分子ライブラリーのスクリーニングのい
ずれかによって、ｓα１β１インテグリンまたはフラグメントの結晶構造座標を
用いて見出される。次いで低分子インヒビターは、α１β１またはフラグメント
を用いて共結晶化され、そしてこの複合体の結晶構造は、分子置換によって解明
される。分子置換は、位相の計算のために、ｓα１β１またはフラグメントの座
標を必要とする。これらの実験から収集された情報を用いて、どのようにして低
分子がこのタンパク質標的と相互作用するかを明確にすることによって低分子イ
ンヒビターの構造を最適化し得る。このことは、この低分子を改変して、α１β
１標的に関するその物理化学的特性（例えば、親和性、特異性および速度定数）
を改善する方法を示唆する。

【０１０２】コンピュータ薬物設計および構造最適化に必要であることに加えて、本明細書
中に記載される結晶座標は、α１β１結合部位を解析するために有用である。こ
のような解析を通して、薬物標的化に特に魅力的な領域が、残基Ａｓｐ１５４、
Ｓｅｒ１５６、Ａｓｎ５７、Ｓｅｒ１５８、Ｌｅｕ２２２、Ｇｌｎ２２３、Ｔｈ
ｒ２２４、Ａｓｐ２５７、Ｇｌｕ２５９、Ｈｉｓ２６１、Ｈｉｓ２８８、Ｔｙｒ
２８９、Ｇｌｙ２９２、Ｌｅｕ２９４およびＬｙｓ２９８の近位にあることが決
定された。上記の観察および仮説は、この領域が、α１β１／ＥＣＭ相互作用の
結合エネルギーにかなり寄与し得、それゆえ、インヒビター設計のための魅力的
な標的であることを示唆する。部位変異研究を、上記のプロセスとともに用いて
、結合部位をさらに規定し得る。

【０１０３】種々の改変および変更が、本発明の精神または範囲から逸脱することなく本発
明の方法および組成物において行われ得ることが当業者に明らかである。従って
、本発明が、本発明の改変物および変更物が添付の特許請求の範囲およびそれら
の等価物の範囲内に入る限り、本発明の改変物および変更物を包含することが意
図される。

【０１０４】

【表１】

【０１０５】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１：１□で輪郭を示される、□１Ｉ−ドメイン結晶構造の代表的な領域に
ついての２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度マップ。

【図２】図２：□１Ｉ−ドメイン分子の折り畳みのリボン表示、矢印は、ＭＩＤＡＳ
結合部位を指す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０６Ｆ 17/30 １７０Ｇ０６Ｆ 17/30 １７０Ｆ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ノルテ，マシアスアメリカ合衆国マサチューセッツ 03079，セーラム，ポーキュパインサークル 140 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB08 DA36 FB02 JA01 4B024 AA01 AA20 BA63 CA02 DA06 GA07 GA11 4H045 AA20 BA10 CA40 DA50 EA45 EA60 GA40 5B075 ND20 ND22 ND23 ND34 UU18

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも一部のα１β１インテグリンの結晶を調製する方
法であって、以下の工程：ａ）少なくとも一部のα１β１インテグリンを含む水溶液を提供する工程；ｂ）沈殿剤を含むリザーバー溶液を提供する工程；ｃ）一定量の該水溶液と一定量の該リザーバー溶液を混合し、それによって混合
容量を形成する工程；およびｄ）少なくとも一部の該混合容量を結晶化する工程、を包含する、方法。
【請求項２】請求項１に記載の方法であって、工程ａ）において提供され
る前記少なとも一部のα１β１インテグリンの水溶液が、約１ｍｇ／ｍｌ〜約５
０ｍｇ／ｍｌのα１β１インテグリンの濃度を有する、方法。
【請求項３】前記水溶液が、約５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌのα１β
１インテグリンの濃度を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記水溶液が、約１０ｍｇ／ｍｌのα１β１インテグリンの
濃度を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】前記沈殿剤が、クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウムおよ
びポリエチレングリコールからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記リザーバー溶液中の沈殿剤の濃度が約１５％ｗ／ｖ〜約
３５％ｗ／ｖである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記沈殿剤の濃度が約２５％ｗ／ｖである、請求項６に記載
の方法。
【請求項８】前記リザーバー溶液のｐＨが約４〜約１０である、請求項１
に記載の方法。
【請求項９】前記ｐＨが約６．５である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】請求項１に記載の方法であって、ここで、工程ｄ）が拡散
蒸着結晶化、バッチ結晶化、液橋結晶化または透析結晶化による、方法。
【請求項１１】前記少なくとも一部のα１β１インテグリンが、α１β１
インテグリンの少なくとも一部のα１鎖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】前記一部のα１鎖がＩドメインを含む、請求項１１に記載
の方法。
【請求項１３】 α１β１インテグリンの細胞外ドメインの機能的フラグメ
ントまたはそのホモログによって形成される結晶であって、およそ以下の格子定
数：ａ＝３４．７７；ｂ＝８５．９２；ｃ＝１３２．５６、γ＝９０およびＰ２ ₁ ２₁２₁の空間群を有する、結晶。
【請求項１４】前記細胞外ドメインが、α１β１インテグリンのＣｙｓ１
４３からＡｌａ３４０に及ぶ、請求項１３に記載の結晶。
【請求項１５】表ＩＩにおいて同定される構造座標によって記載される、
請求項１３に記載の結晶。
【請求項１６】請求項１３に記載のα１β１インテグリンまたはそのホモ
ログの結晶であって、ここで該結晶が、アミノ酸Ａｓｐ１５４、Ｓｅｒ１５６、
Ａｓｎ１５７、Ｌｅｕ２２２、Ｇｌｎ２２３、Ｔｈｒ２２４、Ａｓｐ２５７、Ｇ
ｌｕ２５９、Ｈｉｓ２６１、Ｈｉｓ２８８、Ｔｙｒ２８９、Ｇｌｙ２９２、Ｌｅ
ｕ２９４およびＬｙｓ２９８を含む結合部位を有する、結晶。
【請求項１７】機械読み取り可能データでコードされるデータ記憶材料を
備える機械読み取り可能データ記憶媒体であって、ここで、適切な機械によって
読み取られる場合、アミノ酸Ａｓｐ１５４、Ｓｅｒ１５６、Ａｓｎ１５７、Ｌｅ
ｕ２２２、Ｇｌｎ２２３、Ｔｈｒ２２４、Ａｓｐ２５７、Ｇｌｕ２５９、Ｈｉｓ
２６１、Ｈｉｓ２８８、Ｔｙｒ２８９、Ｇｌｙ２９２、Ｌｅｕ２９４およびＬｙ
ｓ２９８を含む結合部位を有するα１β１インテグリンのフラグメントを含む分
子または分子複合体の結晶の三次元表示を提示し得る、機械読み取り可能データ
記憶媒体。
【請求項１８】少なくとも一部のα１β１インテグリンを含む分子複合体
の少なくとも一部の三次元構造を決定するための方法であって、該方法は、以下
の工程：ａ）α１β１インテグリンのフラグメントの結晶の構造座標を決定する工程；ｂ）該構造座標からの相を算出する工程；ｃ）該工程ｂ）において得られる相からの電子密度マップを算出する工程；ｄ）該電子密度マップに基づいて該複合体の少なくとも一部の構造を決定する工
程、を包含する、方法。
【請求項１９】請求項１８に記載の方法であって、ここで、前記工程ａ）
において使用される構造座標が、（１）表ＩＩにおいて記載される座標と実質的
に同一であるか、または（２）表ＩＩにおける座標と実質的に同一の結晶を記載
する、方法。
【請求項２０】化学的実体が、少なくとも一部のα１β１インテグリンと
会合する能力もしくは少なくとも一部のα１β１インテグリンレセプターと会合
する能力、またはα１β１インテグリンを含む複合体、該レセプター、もしくは
それらのホモログの能力を評価するための方法であって、該方法が、以下の工程
：ａ）該化学的実体と該少なくとも一部のα１β１インテグリンもしくはレセプタ
ーまたはそれらの複合体との間の適合操作を実施するためにコンピュータ手段ま
たは実験的手段を使用して、それにより、該会合に関連するデータを得る工程；
およびｂ）工程ａ）において得られたデータを分析して、該化学的実体と該少なくとも
一部のα１β１インテグリンもしくはレセプターまたは複合体との間の会合の特
徴を決定する工程、を包含する、方法。
【請求項２１】請求項２０に記載の方法により同定される化学的実体であ
って、ここで、該化学的実体が、細胞外マトリクスタンパク質と前記少なくとも
一部のα１β１インテグリンとの間のインビボ会合またはインビトロ会合を干渉
し得る、化学的実体。
【請求項２２】請求項２０に記載の方法によって同定される化学的実体で
あって、ここで、該化学的実体が前記少なくとも一部のα１β１インテグリン上
の結合部位と会合し得、ここで、該結合部位がアミノ酸Ａｓｐ１５４、Ｓｅｒ１
５６、Ａｓｎ１５７、Ｌｅｕ２２２、Ｇｌｎ２２３、Ｔｈｒ２２４、Ａｓｐ２５
７、Ｇｌｕ２５９、Ｈｉｓ２６１、Ｈｉｓ２８８、Ｔｙｒ２８９、Ｇｌｙ２９２
、Ｌｅｕ２９４およびＬｙｓ２９８を含む、化学的実体。
【請求項２３】少なくとも一部のα１β１インテグリンの結晶化形態の重
原子誘導体。
【請求項２４】請求項２３に記載の結晶の重原子誘導体。
【請求項２５】分子置換による少なくとも一部のα１β１インテグリンの
変異体、ホモログまたは共複合体の結晶形態を解析するための少なくとも一部の
α１β１インテグリンの構造座標の、使用。
【請求項２６】化学的実体と、少なくとも一部のα１β１インテグリンの
結合部位との会合に関する情報を得る方法であって、該方法が、少なくとも一部
のα１β１インテグリン、または該α１β１インテグリンの変異体、またはホモ
ログもしくは共複合体の結晶を形成する工程を包含する、方法。
【請求項２７】前記結晶が表ＩＩに記載される構造座標を有する、請求項
２６に記載の方法。
【請求項２８】少なくとも一部のα１β１インテグリンとの所望の会合を
有する化学的実体を同定、特徴付けまたは設計するための方法であって、構造座
標が表ＩＩに記載されるα１β１インテグリンの結晶と実質的に同一である結晶
の構造座標を決定する工程を包含する、方法。
【請求項２９】請求項２８に記載の方法であって、さらに、同定、特徴付
けまたは設計される前記化学的実体の結合特徴を最適化する工程を包含する、方
法。
【請求項３０】請求項２８に記載の方法であって、さらに、少なくとも一
部のα１β１インテグリンの結合部位においてリガンドの配向を決定する工程を
包含する、方法。
【請求項３１】請求項２８に記載の同定または設計される、化学的実体。
【請求項３２】化学的実体と少なくとも一部のα１β１インテグリンとの
間の結合相互作用を決定する方法であって、該方法は、少なくとも一部のα１β
１インテグリンの結晶を形成する工程およびその構造座標を決定する工程を包含
する、方法。
【請求項３３】請求項３２に記載の方法であって、ここで、前記少なくと
も一部のα１β１インテグリンの結晶が請求項１３に記載の結晶である、方法。