JP2003511419A

JP2003511419A - ウイルス／抗原処理された樹状細胞による抗原特異的ｔ細胞の活性化

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Publication number: JP2003511419A
Application number: JP2001529741A
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Inventors: トーステンアーラート
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Priority date: 1999-10-13
Filing date: 2000-10-11
Publication date: 2003-03-25
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Abstract

(57)【要約】本発明は、インビボで抗原特異的Ｔ細胞（ＴＣ）の活性化により得られる患者の免疫応答を刺激するためのワクチンとして使用され得る、ウイルス処理された抗原で処理された樹状細胞（ＤＣ）及び／又はウイルス及び抗原で別々に処理された樹状細胞を含むＴ細胞活性化剤、インビトロでＴ細胞活性化剤により活性化される活性化ＴＣを含む組成物、Ｔ細胞活性化剤及び／又は組成物を含む医薬組成物、並びにそれらの製造方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、インビボで抗原特異的Ｔ細胞（ＴＣ）の活性化により得ることがで
きる患者の免疫応答を刺激するためのワクチンとして使用され得る、ウイルス処
理された抗原で処理された樹状細胞（ＤＣ）及び／又はウイルス及び抗原で別々
に処理された樹状細胞を含むＴ細胞活性化剤、インビトロでＴ細胞活性化剤によ
り活性化される活性化ＴＣを含む組成物、Ｔ細胞活性化剤及び／又は組成物を含
む医薬組成物、並びにそれらの製造方法に関する。

【０００２】ガン患者だけでなく、慢性感染症、自己免疫疾患、透析を必要とする腎機能不
全又は遺伝性免疫機能障害に悩んでいる患者の免疫系は、非能率的に働き、外部
からの手助けを必要とする。この免疫不全症の原因は、疾患それら自身又は慣用
のガン治療による免疫抑制を含む外的に引き起こされた欠陥であり得る。さらに
、ガン又は感染のような疾患の免疫系による認識は、疾患特異的抗原の弱いまた
は不十分な提示のような問題に直面し得る。

【０００３】このように、特異的抗原に対する免疫適格性の再構成は、大きな研究の目的で
ある。インビトロ活性化同種異系又はオートロガス抗原特異的Ｔ細胞の転移、或
いはワクチン接種処置によるそのような細胞のインビボ誘導による細胞治療は、
免疫不全の上記問題を解決することを目的とした、現在のやり方である。

【０００４】Ｔ細胞は、いくつかの免疫機構に対する特異的及び非特異的免疫性手助けを提
供することができ、また、異物又は疾患関連細胞性抗原を直接攻撃及び全滅し得
るリンパ球である。それらは、そのような抗原に対し、何ヶ月、何年も免疫記憶
を発達及び／又は転移することができ、このように、それらは長期免疫保護の重
要なメディエータである。

【０００５】免疫不全に苦しむ患者に改善された適格性を与えるために開発された最初のア
プローチは、養子免疫細胞移入治療だった。これらの治療は主にガン治療に用い
られ、まず、いわゆるリンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）、後に、オー
トロガス転移のためのリンフォカイン活性化腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）に使
用された。用語“オートロガス”は、転移された細胞が患者自身に由来したこと
を意味する。該キラー細胞は、末梢血液又は手術により新しく得られた腫瘍組織
から生じた。主に、Ｔ細胞成長因子[参考文献1．、２．]であるインターロイキ
ン２（ＩＬ−２）を含む培地中で、得られたキラー細胞を培養し、活性化した。
養子オートロガス及び同種異系免疫細胞移入の他の試みは、それらがレシピエン
トに養子移入される前の、インビトロ又はインビボの腫瘍細胞及び／又は抗体或
いはサイトカインでのＴ細胞刺激を含む[参考文献３．〜７．]。用語“同種異系
(allogeneic)”は、転移された細胞が同一でない個人に由来したことを意味する
。

【０００６】抗原（ペプチド）特異的Ｔ細胞のインビボ又はインビトロ活性化に対する樹状
細胞（ＤＣ）の使用は、まさに近年確立されてきた[参考文献８．〜１３．]。Ｄ
Ｃは、抗原保持細胞自身よりもより強力なＴ細胞の抗原特異的活性化剤であり得
る、“プロフェッショナル”な抗原提示細胞である。ＤＣは、ペプチド又は細胞
ラーゼートのような抗原、例えば腫瘍細胞由来の抗原でパルス又はロードされる
ことができる。該ＤＣは、抗原材料を処理し、その生成物を、それらをＴ細胞に
提示することのできるＭＨＣクラスＩ及び／又はクラスII複合体に組み込む。キ
ラー細胞自身は、ＭＨＣクラスIにより提示を認識することができるだけである
が、キラーＴ細胞の完全な活性化のために、クラスＩ及びクラスII ＭＨＣ複合
体両方における、処理された材料の提示が必要である。ＭＨＣクラスIIは、ヘル
パーＴ細胞をさらに活性化するのに必要である。この発見により、ＭＨＣクラス
II組み込み可能なヘルパー抗原を示す、キーホール−リンペット（limpet）ヘモ
シアニン（ＫＬＨ）のような代用物を加えるようになった。さらに、そのような
代用物は、新抗原を示すことができ、このように、トレーサー分子として働くこ
とができる[参考文献８．]。

【０００７】ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）は、長い間ガン治療に用いられてきた鳥
パラミクソウイルスである。このウイルスは、インビトロ又はインビボでのガン
細胞の感染及び溶解のために直接使用されることができ、それは、ターゲット細
胞に対する刺激性細胞の改善された接着性を向上させるために、腫瘍細胞の修飾
のためにワクチンにおいて使用され得る。ＮＤＶはまた、細胞性ワクチンにおけ
る修飾に使用される場合、Ｔ細胞活性化のための広い範囲の共刺激シグナルを誘
起し得る[参考文献１４．〜２２．]。

【０００８】しかしながら、上記アプローチには、いくつかの問題と不利がある。

【０００９】インビトロの免疫細胞の活性化及び拡大のためサイトカインを使用する場合、
以前使用されてきた方法は、許容できる臨床リスク−利益関係を示していない。
これはほとんど、全体の免疫系の非特異的活性化、並びに、患者への適用後の、
インビボサイトカイン置換の転移細胞の依存性のためである。高用量サイトカイ
ンで患者の治療の結果は、大きな副作用を伴い、このため、このアプローチは放
棄された。抗原特異的成分又はＴ細胞受容体を使用する、より洗練された方法が
、ほんの制限された活性しか示さなかった細胞を生成する低用量のサイトカイン
に加え、Ｔ細胞のインビトロ活性化を引き起こす。通常、患者への転移後直ぐ細
胞の活性は容易に抑制され、つまり免疫細胞は、インビボでターゲット細胞を見
つけない（すなわち、ターゲット細胞に遊走しない）。それゆえ、このように作
られた免疫記憶は短命であるだけでなく、さらに、一時的治療成功の後、早期疾
患進行に導く。

【００１０】今まで、ＤＣは抗原特異的免疫応答のインビボ誘発のために臨床的に使用され
てきた。しかしながら、ＤＣを用いる治療の成功を妨げてきた問題は、治療適用
のための充分な量又は機能的に活性なＤＣの生成及び／又は分離であった。今ま
で開発されてきた方法は、不十分にパルスされた又は不十分に分化されたＤＣに
よる寛容誘導の可能性をほとんど考慮していなかった。さらに、ＤＣでのＴ細胞
応答のインビボ生成は、欠乏免疫系を有する患者には困難であり得る。

【００１１】ＮＤＶを用いるインビボ腫瘍細胞崩壊は、患者の免疫系によるウイルスの効率
的な不活性化のため、及び異種腫瘍におけるウイルス抵抗性腫瘍細胞のため、困
難であることが分かってきた。今まで抗原特異的Ｔ細胞のインビボ活性化のため
に使用されてきたウイルス修飾腫瘍細胞ワクチンは、早期ガンステージにおいて
のみ観察される、ほんの限られた効力を示す。ＮＤＶを用いるアプローチは、さ
らに免疫抑制された又は免疫不全患者、つまりＴ細胞のターゲット細胞により産
生される抑制因子のため、又はワクチン接種された患者における抗原オーバーロ
ードのため不十分に活性なＴ細胞のような障害にさらに直面する。さらに、抗原
を変化させる（antigen-varying）ターゲット（すなわち、この場合は、腫瘍）
細胞上へ、及びインビボ既存抗原提示細胞上への最適以下の抗原提示は、Ｔ細胞
活性化失敗の原因になり得る。

【００１２】今まで開発されてきたウイルス修飾細胞ワクチンの更なる問題は、充分な効率
に達するために、かなりの数の抗原保持生細胞を必要とすることである。これは
、これまで、臨床用途におけるウイルス修飾細胞ワクチンの使用を制限してきた
。なぜなら、臨床状況では、比較的大量の原料（ほとんど、外科的に切除可能な
腫瘍材料）が入手可能であるからであり、それはかなりの量の死細胞を含む。

【００１３】さらに、ウイルス修飾ワクチンにおける悪性生細胞の必要性のため、インビボ
使用前に、それらの不活性化のため、細胞の照射が必要であるという結果になる
。この不活性化法は効果的であるが、制御された製薬製造プロセスに関して応用
することは困難である[参考文献２０．、２３．〜２５．]。

【００１４】それゆえ、本発明の根底にある技術的問題は、高度に活性な抗原特異的免疫刺
激物のインビボ及びインビトロ誘発を改善することであり、その効果は、治療的
臨床使用の間、Ｔ細胞及びＴメモリー細胞により特に媒介される。この改善は、
Ｔ細胞活性化試みによる寛容誘導の可能性を減少させ、このようにして、処置の
安全性を増すことを含む。

【００１５】上記技術的問題の解決法は、請求項で特徴付けられるような実施態様を提供す
ることにより達成される。

【００１６】特に、本発明は、患者における特異的免疫応答を行い及び刺激することができ
る活性化Ｔ細胞を含む組成物に関し、ここで該Ｔ細胞は該患者又はその親類から
調製され、インビトロでＴ細胞活性化剤での処理により活性化される。ここで、
該Ｔ細胞活性化剤は、次のステップを含む方法により活性化される、活性化され
た樹状細胞を含む（ａ）抗原を調製し、必要に応じてインビトロで該抗原をウイルスで処理する、（ｂ）患者又はその親類から単球を調製する、（ｃ）インビトロでのインキュベーションにより該単球から樹状細胞を発育させ
る（ｄ）得られた樹状細胞を、ステップ（ａ）で得られたウイルス処理された抗原
とインビトロで及び／又はステップ（ａ）で得られた非処理抗原プラスウイルス
とインビトロでコインキュベートする、ここで、該ウイルスは抗原の樹状細胞への接着性及び樹状細胞による抗原の提示
を改善することができ、それは樹状細胞の活性化、成熟、安定性及びコシグナリ
ング（cosignalling）を調節することができる。

【００１７】本明細書で用いられているような“Ｔ細胞活性化剤”という用語は、患者にお
いて抗原に対する免疫応答を刺激することのできる活性化された樹状細胞を含む
組成物又は製剤を意味する。上記で定義されたＴ細胞活性化剤の活性化された樹
状細胞は、インビトロだけでなくインビボでＴ細胞を活性化することができる。

【００１８】それゆえ、１つの局面によると、本発明は、上記で定義された組成物に関し、
ここで、上記で特徴付けられるようなＴ細胞活性化剤は、インビトロでのＴ細胞
活性化に用いられる。更なる局面によると、本発明は、インビボでのＴ細胞活性
化のためのワクチンとして使用され得るＴ細胞活性化剤自身にも関する。

【００１９】このように、本発明は、次の２つの異なる治療プログラムにおいて用いられ得
る、高度に活性な抗原特異的免疫刺激剤の、インビボ及びインビトロ両方の誘導
の改善のための新しい系を提供する：（１）本発明の組成物は、細胞治療の方法において特に有用であり、ここで活性
化Ｔ細胞は患者に投与される。そのような方法はまた、養子又は受動的免疫療法
（ＡＤＩ）と呼ばれる。（２）本発明によるＴ細胞活性化剤は、高度に免疫原性の形態の腫瘍抗原のよう
な抗原で患者を免疫化するために、ワクチン、例えば腫瘍ワクチンを提供する。
そのような治療プログラムもまた、活性特異的免疫療法（ＡＳＩ）と呼ばれる。

【００２０】インビボでＴ細胞を刺激するために、例えば皮内、皮下又はリンパ管内に活性
化された樹状細胞が患者に投与され得、患者のＴ細胞は投与部位に遊走し、そこ
でそれらは樹状細胞により活性化される。本発明による組成物中のＴ細胞の活性
化のために使用されるＴ細胞活性化剤はまた、組換えＤＮＡ技術を用いて調製さ
れる物質も含み得る。好ましくは、本発明による組成物におけるＴ細胞活性化に
使用されるＴ細胞活性化剤は、相加的に又は相乗的に樹状細胞と作用する１つ以
上の他のＴ細胞活性化剤を含む。

【００２１】 “抗原”という用語は、それ自身により、或いは適したキャリア分子又は細胞
に結合した時、有機体の中で免疫応答を誘発することができるあらゆる構造物を
含む。それゆえ、本発明による抗原は、ハプテンのように働く低分子化合物、腫
瘍細胞のような全細胞、並びに、ポリペプチド、それらに由来するオリゴペプチ
ド、糖脂質のような脂質、多糖類及び核酸のようなそれらの部分を含む。さらに
、本発明による抗原は、ウイルスおよびそれらの部分、並びに、バクテリアのよ
うなあらゆる原核生物および真核生物である。上記で定義された組成物の好まし
い実施態様によると、抗原は患者から調製されるが、上記のように、抗原は、他
の有機体から調製されても良く、或いは合成又は生合成であり得る。

【００２２】好ましくは、ウイルス処理された腫瘍生細胞のような、ステップ（ａ）でウイ
ルス処理され得る抗原は、上記で定義された方法のステップ（ｄ）における樹状
細胞でのコインキュベーション前に、照射を用いずに不活性化され得る。腫瘍生
細胞のような生細胞の不活性化及び溶解の好ましい方法は、例えば、凍結−溶解
及び超音波処理（ultrasonification）を含む。照射以外の方法の使用は、より
少ない問題を薬品製造プロセスにもたらす。活性化される予定のＴ細胞の源とし
て、血液に加え又は血液の代わりに骨髄を用いると、ＮＤＶ−修飾ＤＣでのコイ
ンキュベーションによる刺激に対し、高度に活性な抗原特異的Ｔ細胞、例えばＴ
メモリー細胞の収量を増加させる。

【００２３】好ましくは、細胞のような抗原、例えば腫瘍細胞は、患者からの調製の間、例
えば免疫ビーズ（immunobead）技術によりさらに精製され得る。これらの技術は
、細胞または他の薬剤のような汚染成分に対して向けられた抗体に結合する小さ
な磁性金属ビーズ（例えば、Dynal又はMilteny製）の使用を含む。インキュベー
ションステップの間、抗体結合したビーズに結合した後、その汚染物は懸濁液か
らビーズを引き出す磁場をかけることにより、Ｔ細胞活性化剤、例えば活性化さ
れた樹状細胞の懸濁液から取り除かれる。さらに、該細胞は、上記ステップ（ａ
）における例えば患者からそれらの調製後、凍結保存（cryoconservate）され得
、ステップ（ａ）におけるウイルスでの処理及び／又は上記ステップ（ｄ）にお
ける樹状細胞でのコインキュベーション前又は後に、解凍され得る。

【００２４】樹状細胞は遺伝物質由来の抗原を処理することができるので、上記で定義され
たようなＤＣ活性化法のステップ（ｄ）において抗原自身の代わりに又は抗原自
身に加え、樹状細胞を活性化（パルス）するために、ウイルス処理／修飾された
抗原及び／又は前記ウイルス処理／修飾された抗原が提供する免疫シグナルをコ
ードする遺伝物質、即ちＤＮＡ又はＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）のような核酸
を使用することも可能である。例えば、樹状細胞は、トランスフェクションによ
り（例えばＣａ-フォスフェート、リポフェクション又はエレクトロポレーショ
ン法を用いる）、対応する核酸で処理され得る。核酸の好ましい源は、ウイルス
感染した抗原提示細胞である。これらの細胞は、抗原発現のための遺伝子産物だ
けでなく免疫シグナルとして働くウイルス感染により誘導される生成物、例えば
サイトカインのカクテル、熱ショックタンパク質などを処理する。例えば、その
ような生成物をコードするｍＲＮＡは、ＤＮＡに転写され得、その後、この遺伝
物質はＰＣＲの使用により増幅され得る。このように、製薬的に取り扱い易い、
多数の患者の継続処置のためのウイルス処理／修飾された抗原の絶え間ない源を
提供することができる。

【００２５】好ましくは、発育する樹状細胞もまた、インビトロでのインキュベーションス
テップ（ｃ）の間、ウイルスとコインキュベートされる。

【００２６】上記で定義された組成物及びＴ細胞活性化剤のさらに好ましい実施態様による
と、使用されるウイルスは、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）又はムンプス
ウイルスのようなパラミクソウイルス、ワクシニアウイルス、ミクソウイルス、
ヘルペスウイルス、ＡＩＤＳウィルス、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）及びマウ
ス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）からなる群から選択される。

【００２７】本発明による組成物中のＴ細胞活性化に使用されるＴ細胞活性化剤は、好まし
くは非常に障害のある免疫系を持つ患者から調製される抗原及びウイルスで活性
化される樹状細胞を含む。好ましくは、患者の免疫系のこの障害は、ガン、感染
症、透析により処置されなければならない腎不全、自己免疫疾患及び／又は遺伝
性免疫機能障害のような慢性の障害により引き起こされ得る。

【００２８】本明細書で使われているような“患者”という用語は、動物同様ヒトも含む。
好ましい患者はヒトである。該患者の“親類”は、それぞれヒト又は動物であり
、該患者、即ち該ヒト又は該動物と血液及び／又はＨＬＡタイプにより遺伝的に
関係している。

【００２９】上記で定義された組成物において、Ｔ細胞は、（ｉ）患者又はその親類からＴ細胞を調製する、及び（ｉｉ）上記で定義されたようなＴ細胞活性化剤でＴ細胞をインビトロ処理する
ステップを含む方法により活性化される。

【００３０】好ましくは、上記ステップ（ｉｉ）において本発明に従うＴ細胞活性化剤での
Ｔ細胞の処理は、短時間で、低又は中用量サイトカイン含有培地中のコインキュ
ベーションにより行なわれる。より好ましくは、培養培地は6000 U/ml以下のサ
イトカイン、例えばＩＬ‐２を含み、低用量サイトカイン含有培地中の培養は、
７日間より長くない。

【００３１】Ｔ細胞活性化剤及び本発明による組成物の好ましい実施態様によれば、上記で
定義されたＴ細胞活性化剤のステップ（ｂ）で調製された単球の少なくとも一部
及び上記で定義された組成物のステップ（ｉ）で調製されたＴ細胞の少なくとも
一部は、患者の又は親類の骨髄又は血液に由来し得る。それゆえ、従来技術の細
胞治療ワクチンと対照的に、骨髄は、単球から樹状細胞が発育する非常に効果的
な単球の源として、上記で定義されたＴ細胞活性化剤において使用され得、さら
に、それぞれ単球又はＴ細胞に加えてウイルス処理されたＤＣでのインビトロ活
性化のために末梢血液から得られる（メモリー）Ｔ細胞の非常に効果的な源とし
て、上記で定義された組成物において使用され得る。

【００３２】本発明によるＴ細胞活性化剤及び組成物の上記利点に加え、それらは、Ｔ細胞
活性化のための新しいアプローチにより、さらにいくつかの利点を示す。

【００３３】抗原として使用される時、ヒトインビボワクチン接種に、又は例えばヒト由来
のＴ細胞の合理的に効果的なインビトロ刺激に、1,5ｘ10⁶ ＮＤＶ修飾ＤＣ及び
対応する1,5ｘ10⁶ターゲット細胞（例えば腫瘍細胞）が必要である。これらを考
慮して、ＤＣによる材料の取り込み及び処理は、最後には生きたＴＣに対する抗
原提示に導くので、上記のようなＴ細胞活性化の方法は、死んでいるか生きてい
るどちらかの抗原としてターゲット細胞を使用する可能性を提供する。対照的に
、慣用のウイルス修飾された腫瘍細胞ワクチンにおいて、効果的なＴ細胞活性化
に導くためには少なくとも1,5ｘ10⁶ターゲット細胞が生きていなければならず、
６６％以下の死細胞は生きたターゲット細胞を汚染する[参考文献２０．、２４
．〜２６．]。しかしながら、例えば、新鮮な腫瘍細胞懸濁液において、粗原料
の貯蔵にたいてい必要な凍結保存（cryoconservation）の後、平均５０％のター
ゲット細胞が死んでいる。それゆえ、生きたターゲット細胞と同様に死んだター
ゲット細胞も抗原として使用されることができるので（生きたターゲット細胞は
、好ましくは、ショックフリージングにより又はウイルスでの感染により崩壊さ
れる）、オリジナルの抗原保持ターゲット生細胞の代わりにＮＤＶ修飾されたＤ
Ｃを使用すると、必要な粗原料の量を約５０％減らす。

【００３４】さらに、ＤＣ数を増やすため及びそれらの機能を高めるためのウイルス、例え
ばＮＤＶの使用は、（メモリー）Ｔ細胞のインビトロ又はインビボ活性化に使用
され得る有効なＤＣの生成を増加させ、容易にする。

【００３５】ウイルス、例えば、樹状細胞に対する抗原の接着性を改善することができ、上
記のような樹状細胞の活性化を刺激することのできるＮＤＶのようなパラミクソ
ウイルスの使用は、さらに患者におけるＤＣの非能率的な数及び／又は機能によ
る寛容性誘起の確率を減らす。この利点、並びにＤＣの数及びその機能を増やす
ために上記のようなウイルスを使用することが、効果的なＤＣの生成を改善及び
増加させるという事実は、腫瘍細胞修飾においてＮＤＶのようなウイルスの知ら
れた特性から予想されることのできない、本発明によるＴ細胞活性化剤のさらに
驚くべき特性を表している。一般的に、ＤＣそれ自体は、最適の抗原提示機能及
びＴ細胞活性化のための同時刺激シグナリングを行うことができるべきである。
それゆえ、理論上は、ＮＤＶのようなウイルスのＤＣに対する影響の明らかな必
要性はない。しかしながら、実際はＮＤＶのようなウイルスが、同時刺激サイト
カインの分泌を誘発し、上記腫瘍細胞ワクチンのような細胞性ワクチン調製のた
め、より長いＴ細胞‐ターゲット細胞相互作用のための接着分子を提供する一方
で、それぞれＤＣの成熟及び／又は分化及び／又は抗原提示を改善する。さらに
、ＮＤＶのようなウイルスはまた、改善されたＴ細胞活性化を発生させるために
ＤＣにおける同時刺激シグナリングを誘発することに加え又は代わりに、修飾も
され得る。

【００３６】また、本発明による組成物及びＴ細胞活性化剤の好ましい実施態様によれば、
ＮＤＶのようなウイルスは、樹状細胞の活性化のステップ（ｄ）において抗原及
び樹状細胞間の融合を、少なくともある程度誘発することができる。該融合は、
樹状細胞と細胞のようなウイルス処理された抗原間のハイブリッドに導く、ウイ
ルス融合タンパク質により媒介され得る。そのようなハイブリッドはさらに、抗
原提供能力及び樹状細胞のＴ細胞活性化活性を改善する。抗原は、好ましくは患
者由来の腫瘍細胞、または多重の腫瘍関連抗原にハイブリッドを与える腫瘍細胞
系由来の細胞のような細胞である。

【００３７】これらのＤＣへの影響は、腫瘍細胞及び腫瘍細胞ワクチンについてのＮＤＶの
ようなウイルスの知られている特性から予期されなかった。それどころか、従来
技術研究から、ウイルスはＤＣを抑制することが予想された。例えば、Jenneら[
参考文献２７．]は、ウイルスによるＴ細胞刺激特性の抑制を見出し、Rafteryら
[参考文献２８．]は、ＤＣのヒトサイトメガロウイルスでの感染後、ヒトサイト
メガロウイルス関連免疫抑制に貢献すると信じられていたＤＣ機能における変化
を見出した。

【００３８】さらに、本発明による組成物に含まれており、上記で定義したインビトロでの
Ｔ細胞活性化剤を用いる上記方法により活性化されるＴ細胞は、高い効果を示し
、本発明による組成物を用いた治療の潜在的副作用を減らすサイトカインのイン
ビトロ適用への依存を減らす。さらに、本発明に従って活性化されたＴ細胞は、
より分化され、より効果的に活性化されるので、上記の方法により活性化された
Ｔ細胞は、患者における不活性化機構に対する減少した感応性を示す。

【００３９】本発明の更なる実施態様は、好ましくはガン、感染症及び自己免疫疾患の治療
又は予防処置のための、薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤と必要に応じ
て組み合わせる、Ｔ細胞活性化剤及び／又は本発明による組成物の薬学的有効量
を含む医薬組成物に関する。さらに、本発明による医薬組成物は、本発明による
Ｔ細胞活性化剤及び／又は組成物と相加的に又は相乗的に作用し得る、１つ以上
の他のＴ細胞活性化剤を含み得る。本発明による医薬組成物は、例えば注入又は
注射による、静脈内、筋肉内、皮内、皮下及び／又はリンパ管内投与のようなワ
クチン接種又は細胞治療に使用されるあらゆる慣用の適用ルートに応用され得る
。

【００４０】本発明による医薬組成物は、ガン、感染症、腎不全、自己免疫疾患及び／又は
遺伝性免疫機能障害のような疾患により引き起こされ得る免疫系の機能障害に苦
しむ患者の処置方法に応用され得、その方法は、患者において特異的免疫応答を
行なうため及び／又は刺激するために充分な量の、上記で定義した医薬組成物を
投与するステップを含む。

【００４１】本発明のさらなる実施態様は、活性化された樹状細胞及び活性化されたＴ細胞
の調製法に関する。本発明による活性化された樹状細胞の調製法は、ステップ（ａ）抗原を調製し、必要に応じてインビトロで該抗原をウイルスと処理する（ｂ）患者又はその親類から単球を調製する（ｃ）インビトロでのインキュベーションにより単球から樹状細胞を発育させる（ｄ）得られた樹状細胞を、ステップ（ａ）で得られたウイルス処理された抗原
とインビトロで、及び／又はステップ（ａ）で得られた非処理抗原プラスウイル
スとインビトロでコインキュベートする、を含み、ここで該ウイルスは、抗原の樹状細胞への接着性及び樹状細胞による抗
原の提示を改善することができ、樹状細胞の活性化、成熟、安定性及びコシグナ
リング（cosignalling）を調節することができる。

【００４２】本発明による活性化されたＴ細胞の調製法は、ステップ（ｉ）患者又はその親類からＴ細胞を調製する、（ｉｉ）上記で定義されたＴ細胞活性化剤とインビトロでＴ細胞を処理するを含む。

【００４３】本発明は、更に次の非限定的実施例により説明される。

【００４４】実施例腫瘍細胞材料をロードしたＮＤＶ修飾ＤＣでインビトロ活性化されている同種
異系ＴＣでの養子細胞療法患者からの抗原の調製ＮＤＶ修飾された腫瘍細胞の調製は、次のステップを含む：（１）外科的介入による腫瘍材料の分離（２）機械的及び酵素学的手段により単細胞の懸濁液中への腫瘍細胞材料の解離
：コラゲナーゼ（5 U/ml）及びＤＮａｓｅ（15 U/ml）で３７℃で３０分間イン
キュベーションを４回。必要に応じて、汚染する非腫瘍細胞を減らす腫瘍細胞の
免疫ビーズ（immunobead）精製。（３）腫瘍細胞の凍結保存（cryoconservation）（４）腫瘍細胞の解凍及びＮＤＶでの修飾／感染：1 x 10⁷細胞当りウイルスの
２０〜１００赤血球凝集単位。（５）ショックフリージングと解凍の４〜５サイクルによる、ＮＤＶ修飾された
腫瘍細胞の不活性化。

【００４５】患者の親類からのＴ細胞及び樹状細胞の調製（１）親類から骨髄及び／又は血液を取る（２）骨髄及び／又は血液から単球を調製し、ＮＤＶあり及び無しで、インター
ロイキン４（ＩＬ−４）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳ
Ｆ）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）での標準的な培養によりＤＣ中に成熟及び分化
を促す（i）150 ml血液から細胞の単離（ii）RPMI 1640プラス2 mMグルタミン、100 U/mlペニシリン、100 μg/mlス
トレプトマイシン、並びに5%オートロガス、非不活性化血漿、1000 U/ml IL-4（
Promocell製）及び1000 U/ml GM-CSFで補足した中で、１日間単球の培養（iii）培地を変え、上記培地中で２日間培養（デイ１）（iv）培地を変え、10 ng/mlの最終濃度でＴＮＦα（Promocell製）の添加（
デイ４）（３）ライゼートをＤＣに加え、続いて細胞培養培地中インキュベーションによ
り、ウイルス修飾された腫瘍細胞ライゼートでＤＣをロード／パルスする（v）1 ml X-vivo培地中、３部の腫瘍死細胞に対し１部のＤＣの比で、ＤＣを
腫瘍細胞に加え、低速[１時間当り1000回転（rph）]での遠心分離、３７℃で４
時間インキュベーション（デイ５）（vi）蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析を用いた、抗原ロードさ
れたＤＣの制御（vii）３日間、ＲＰＭＩ＋５％血漿＋ＩＬ‐４＋ＧＭ-ＣＳＦ＋ＴＮＦα中、
抗原ロードされたＤＣの培養（デイ８まで）（４）免疫ビーズ濃縮ステップ（これはＴＣの生成／ローディング段階の間行わ
れ得る）を含む方法による、骨髄及び／又は血液からのＴＣの単離（viii）150 ml血液からのＴＣの単離（赤血球（erythroycte）溶解、粘着性
、PanＴ細胞単離キット）（ix）ＦＡＣＳ分析を用いたＴＣの制御（５）細胞培養物におけるＴＣの増大（６）これらのサイトカインに対するＴＣの依存性の誘発を避けるために、低又
は中用量のサイトカインの存在下での短いインキュベーションを含む、ＮＤＶ修
飾された腫瘍ライゼートでパルスされているＤＣ及びＴＣのコインキュベーショ
ン（x）３４部ＴＣに対して１部ＤＣの比で抗原ロードされたＤＣへのＴＣの添
加及び３日間、5％血漿で（しかしサイトカインは無し）補充された新鮮なＲＰ
ＭＩ中でのインキュベーション（デイ１１まで）（xi）デイ１１に培地を変え、ＩＬ−２（6000 U/ml）を加え、３日間の培養（xii）活性化されたＴＣを収集し、10 ml培地I中でＴＣを再懸濁させ、静脈
注射のために該懸濁液を注射器に満たし、ろ過する；ろ液を400 μl培地I中に取
りこみ、皮下注射する。（７）ELISPOTを用いる、活性化されたＴＣの抗腫瘍活性の分析Ｔ細胞は、20時間、抗原とコインキュベートされる（チャレンジされる（chal
lenged））。その後、γ-インターフェロン（ＩＦＮ‐γ）生成は、抗ＩＦＮ-γ
抗体でコートされたプレート上のそれぞれの単Ｔ細胞に対して検出される。結合
ＩＦＮ-γは、ＥＬＩＳＡ染色によりＴ細胞を囲んだスポットで検出される。

【００４６】治療（１）デイ１〜１４患者の親類の同種異系ＤＣ-ＮＤＶ腫瘍活性化ＴＣの拒絶を避けるために必要
である、中用量又は用量強化化学療法及び／又は放射線療法及び／又はコルチコ
ステロイド及びシクロスポリンでの患者の免疫抑制。

【００４７】連続２週間、１日当り80 mg/m²タキソール、40 mg/m²エピルビシン及び50 mg
のヒドロコーチゾルで該患者を処理する。さらに、骨転移の30 Gray照射を行な
った。（２）デイ１５ＮＤＶ−ＤＣ処理により活性化された同種異系ＴＣの静脈注射注入上記で記載された方法により活性化されている約5ｘ10⁸Ｔ細胞は、250 ml乳酸
リンゲル液の体積で注入される。（３）６週の休みの後、次の処置サイクル。

【００４８】材料リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）中に溶
解した組換えヒト（rHU）IL-4cc（ストック溶液：1 x 10⁵ U/ml、1 x 10⁵ μg/m
lに対応）ＰＢＳ／１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中に溶解したＧＭ−ＣＳＦ（スト
ック溶液：1 x 10⁵ U/ml） RPMI 1640／１％ＢＳＡ中に溶解したrHU TNFα（ストック溶液：1 μg/ml） X-vivo（ストック溶液：6 x 10⁵ U/ml、希釈1：100）、プロロイキン(proleuk
in)（Chiron製）中に溶解したＩＬ−２ウイルス処理された抗原対非処理抗原でパルスしたときの樹状細胞の増加した
Ｔ細胞活性化特性ウイルス処理対非処理抗原 10％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で補足されたＲＰＭＩ培地中で、ＭＣＦ−７細胞
を培養した。FCSを取り除くために1 x 10⁷細胞を洗い、３７℃で６０分間ウイル
ス溶液を加えることにより、ＲＰＭＩ培地中、ニューカッスル病ウイルス株アル
スター(Ulster)の60凝集素量(Hemaglutinating Unit)で感染させた。ＲＰＭＩ/2
％ＦＣＳ中37℃で２４時間インキュベーションを行なう前に、非吸着ウイルスを
もう一度洗い落とした。

【００４９】コントロール細胞はウイルスで感染しなかったが、その他の点は、感染細胞と
同様に処理された（すなわち、ＦＣＳなしでＲＰＭＩ中６０分間インキュベーシ
ョン、続いてＲＰＭＩ/２％ＦＣＳ中２４時間インキュベーション）。

【００５０】インキュベーションが完了した後、感染した（MCF-7-NDV）及びコントロール
細胞を凍結−解凍の３サイクルにより溶解した。タンパク質含有量を両方の調製
物において評価した。

【００５１】樹状細胞の調製（１）乳ガン患者から骨髄を取る（２）“患者の親類からのＴ細胞及び樹状細胞の調製”の項目（２）で上記記載
のように、骨髄から樹状細胞を調製する。

【００５２】抗原での樹状細胞のロード／パルス 1 x 10⁶樹状細胞を200 μg/ml溶解したMCF-7-NDVで、又は200 μg/ml溶解した
非感染したMCF-7-細胞でコインキュベートした。これは、樹状細胞を洗い、洗っ
た細胞を対応する抗原性タンパク質溶液に加えることにより行なった。

【００５３】抗原パルスされた樹状細胞でのＴ細胞の活性化 “患者の親類からのＴ細胞及び樹状細胞の調製”の項目（４）で上記記載の
ように、患者からのオートロガスＴ細胞を骨髄から調製した。抗原パルスされた
樹状細胞を、５つのＴ細胞に対し１つの樹状細胞の割合で、Ｔ細胞に加えた。イ
ンキュベーションを４８時間行なった。

【００５４】 ELISPOTでの抗腫瘍メモリーＴ細胞応答の測定活性化されたＴ細胞を、ELISPOTアッセイを用いたγ-インターフェロン産生に
より、単細胞ベースで測定した。“患者の親類からのＴ細胞及び樹状細胞の調製
”の項目（７）で上記記載のように、ELISA染色によりＴ細胞を囲むスポットに
おいて、結合γ-インターフェロンを検出する。

【００５５】結果 MCF-7-NDV-パルスされた樹状細胞での刺激後、2,5x10⁴個のＴ細胞において、
４１５個のスポット形成細胞が検出された。非感染MCF-7細胞で刺激された2,5x1
0⁴個のＴ細胞において、たった１９０個のスポット形成細胞が検出された。パル
スされていない樹状細胞で刺激された2,5x10⁴個のＴ細胞において、１５０個の
スポット形成細胞が検出された。全く刺激されていない2,5x10⁴個のＴ細胞にお
いて、１２個より少ないスポットが観察された。樹状細胞が非乳がん細胞系でパ
ルスされていた時、１６５個のスポットがカウントされた。

【００５６】結論上記結果は、乳ガン患者において、ウイルス感染した抗原でパルスされた樹状
細胞のＴ細胞刺激能は、非感染抗原でパルスされた樹状細胞、非パルス樹状細胞
及び非乳ガン細胞系でパルスされた樹状細胞に比べて、２倍より大きかったこと
を示している。

【００５７】ウイルス感染した腫瘍細胞でパルスされている樹状細胞の増加した刺激特性の
安定性抗原として使われた、照射MCF-7腫瘍細胞は、ＮＤＶで３０分間感染され、さ
らなるインキュベーションなしで４℃で終夜貯蔵された。

【００５８】コントロールとして、その他の点ではＮＤＶ−感染細胞と同様に処理された、
非感染MCF-7細胞を使用した。さらなるコントロールとして、末梢血白血球が使
用された。

【００５９】樹状細胞は、標準プロトコル(protocoll)を用い、５日間、ＧＭ−ＣＳＦ及び
インターロイキン‐４（ＩＬ−４）での、乳がん患者の末梢血からの単球のイン
キュベーションにより生成した（例えば、参考文献８．参照）。

【００６０】樹状細胞は、サイトカインのない培地中３７℃６時間コインキュベーションに
より、感染され照射されしかし溶解されてないＭＣＦ−７細胞、又はコントロー
ル細胞でパルスされた。６時間後、樹状細胞の最後の分化を援助するために、Ｔ
ＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６及びプロスタグランジンＥ２を培地に加えた。そ
の後、インキュベーションを４０時間続けた。

【００６１】サイトカインを取り除くために、パルスされた樹状細胞を洗った。その洗った
細胞を４℃６時間貯蔵し、続いて９０時間３７℃で、サイトカインは無いがオー
トロガス血清を含む培地中でインキュベーションした。この手順は、ワクチンの
４℃での貯蔵、それから、ワクチンの注射後のオートロガス患者におけるパルス
された樹状細胞のインビボ持続性を模倣する（immitate）。

【００６２】９０時間後、抗原パルスされた樹状細胞を、患者の末梢血から精製されたオー
トロガスＴ細胞の短期（４２時間）刺激に用いた。Ｔ細胞に対する樹状細胞の比
は、１対１０〜１対１００であった。

【００６３】短期刺激の４２時間後、Ｔ細胞におけるγ‐インターフェロン産生（活性化）
を、上記ELISPOT法により測定した。

【００６４】結果ウイルス感染した抗原（ＭＣＦ−７腫瘍細胞）でパルスした樹状細胞は、コン
トロール細胞でパルスされていたそれらの樹状細胞より、実質的により多くのγ
−インターフェロン産生（即ち活性化された）Ｔ細胞を誘導した。さらに、ウイ
ルス感染したＭＣＦ−７細胞でパルスされた樹状細胞は、ウイルス感染したＭＣ
Ｆ−７細胞のみ、非感染ＭＣＦ−７細胞のみ、ウイルスパルスされた樹状細胞又
は末梢血白血球でパルスされた樹状細胞より、Ｔ細胞をより効果的に刺激した。
このように、樹状細胞刺激活性のウイルス増強の効果は、サイトカインなしのイ
ンキュベーションの９０時間超後でさえ、安定だった。それゆえ、これらの細胞
を含むワクチンとして使用されるＴ細胞活性化剤は、少なくともこの期間、その
インビボＴ（メモリー）細胞刺激活性を維持することができる。

【００６５】参考文献１． Rosenberg SA, Lotze MT, Muul LM, Chang AE, Avis FP, Leitmann, Line
han WM, Robertson CN, Lee RE, Rubin JT, Seipp CA, Simpson RN, White DE:
A progress report on the treatment of 157 patients with advanced cancer
unsing lymphokine-activated killer cells and interleukin-2 or high-dose
interleukin-2 alone. N Engl J Med 316. (15) 889 - 897, 1987 ２． Rosenberg SA, Packard BS, Aeberseld PM, Soiomon D, Topalian SL, To
y ST, simon P, Lotze MT, Vang JC, Seipp CA, Simpson C, carter C, Bork S,
Schwarzentruber D, Wei JP, White DE: Use of tumorinfiltrating lymphocyt
es and interleukin-2 in the immunotherapy of patients with metastatic me
lanoma. New Engl J Med 319. 1676 - 1680, 1988 ３． Fichtner K-P, Schirrmacher V, Griesbach A, Hull WE: In Vivo 1H-NMR
microimaging with respiratory triggering for monitoring adoptive immuno
-therapiy of metastatic mouse lymphoma. Magnetic Resonance In Medicine (
MRM) 38. 440 - 455, 19 ４． Yamagishi H, Ueda Y, Oka T: A case report of immunotherapy on a pa
tient with advanced gastric cancer by adoptive transfer of OK-432 reacti
ve HLA-matched allogeneic lymphocytes. Cancer Immunol Immunother 46. 113
- 119, 1998 ５． Schirrmacher V, Beckhove P, Kruger A, Rocha M, Umanski V, Fichtner
K-P, Hull WE, Zangemeister-Wittke U, Griesbach A, Jurianz K, Hoegen Pv:
Effective immune rejection of advanced metastasized cancer. Int J Oncol
6. 505 - 521 . 1995 ６． Cardoso AA. Seamon MJ, Afonso HM, Ghia P, Boussiotis VA, Freeman G
J, Gribben JG, Sallan SE, Nadler LM: Ex vivo generation of human anti-pr
e-B leukemia-specicic autologous cytolytic T cells. Blood 90. (2) 549 -
561 , 1997 ７． Tani M, Tanimura H, Yamaue H, Mizobata S, Iwahashi M, Tsunoda T, N
oguchi K, Tamai M, Hotta T, Terasawa H, Arii K: Generation of CD4+ cytot
oxic T-lymphocytes stimulated by immobilized anti-CD3 monoclonal antibod
y and interleukin-2 in cancer patients. Int J Cancer 60. 802 - 807, 1 99
5 ８． Nestle FO, Alijagic S, Gilliet M, Sun Y, Grabbe S, Dummer R, Burg
G, Schadendorf D: Vaccination of melanom patients with peptide- or tumor
lysate-pulsed dendritic cells. Nature Medicine 4. (3) 328 - 332, 1998 ９． Holtl L, Rieser C, Papesh C, Ramoner R, Herold M, Klocker H, Radma
yr C, Stenzl A, Bartsch G, Thurnher M: Cellular and humoral immune respo
nses in patients with metastatic renal cell carcinoma after vaccination
with antigen pulsed dendritic cells. J Urol 161. 777 - 782, 1999 １０． Hsu FJ, Benike C, Fagoni F, Liles TM, Czerwinski D, Taidi B, Eng
leman EG, Levy R: Vaccination of patients with B-cell lymphoma using aut
ologous antigen-pulsed dendritic ceils. Nature Medicine 2. 52 - 58, 1996 １１． Salgaller ML, Lodge PA, McLean JG, Tjoa BA, Loftus DJ, Ragde H,
Kenny GM, Rogers M, Boynton AL, Murphy GP: Report of immune monitoring o
f prostate cancer patients undergoing T cell therapy using dendritic cel
ls pulsed with HSA-A2-specific peptides from prostate-specific membrane
antigen (PSMA). Prostate 35. 144 - 148, 1998 １２． Bennet SRM: Induction of a CD8- cytotoxic T lymphocyte response
by crosspriming requires cognate CD4-help. J Exp Med 186. 65 - 70, 1997 １３． Peters JH, Gieseler R, Thiele B, Steinbach F: Dendritic cells: f
rom ontogenetic orphans to myelomonocytic descendants. Immunology today
17. (6) 273 - 278, 1996 １４． Ahlert T and Schirrmacher V. Isolation of a human melanoma adapt
ed Newcastle Disease Virus mutant with highly selektive replication patt
erns. canc res 1990;505962-8. １５． Ahlert T, Kaufmann M, Bastert G, Schirrmacher V. : Active Specif
ic Immunotherapy (ASI) with virally modified autologous tumor cells in b
reast and cvarian cancer: factors influencing immunological vaccination
success. J of Canc Res and Clin Oncol 116 / supplement. :80, 1990 (abstr
) １６． Cassel WA, Murray DR: A ten-year follow-up on stage II malignang
melanoma patients treated postsurgically with Neuwcastle disease virus
oncolysate. Med Oncol & Tumor Pharmacother 9. 169 - 171, 1992 １７． Cassel WA, Garret RE: Newcastle Disease Virus as an antineoplast
ic agent. Cancer 66. (7) 1517 - 1523, 1965 １８． Csatary LK, Eckhard S, Bukosza l, Czegledi F, Fenyvesi C, Gergel
y P, Bodey B, Csatary CM: Attenuated veterinary virus vaccine for the tr
eatment of cancer. Cancer Detection and Prevention 17. 619 - 627, 1993 １９． Schirrmacher V, Haas C, Bonifer R, Ahlert T, Gerhards R, Ertel C
: Human tumor cell modification by virus infection: an efficient and saf
e way to produce cancer vaccine with pleiotropic immune stimulatory prop
erties when using Newcastle disease virus. Gene therapy 6. 63 - 73, 1999 ２０． Schirrmacher V, Ahlert T, Probstle T, Steiner H-H, Herold-Mende
C, Gerhards R, Hagmuller E: Immunisation with virus modified tumor cells
. Seminars in oncology 25. (6) 677 - 696, 1998 ２１． Schirrmacher V, Hoegen von P, Heicappell R: Virus modified tumor
cell vaccines for active specific immunotherapy of mecrometastases: Exp
ansion and activation of tumor-specific T cells. Immunity to Cancer 2. 3
91 - 399, 1989 ２２． Schirrmacher V, Ahlert T, Heicappell R, Appelhans B, Hoegen von
P: Successful application of non-oncogenic viruses for antimetastatic ca
ncer immunotherapy. Cancer Res 5. 19 - 49, 1986 ２３． Ahlert T, Sauerbrei W, Bastert G, Ruhland S, Bartik B, Simianton
aki N, Schumacher J, Hacker B, Schuhmacher M, Schirrmacher V: Tumor-cell
number and viabilitiy as quality and efficacy parameters of autologous
virus-modified cancer vaccines in patients with breast or ovarian cancer
- Errata. Journal of clinical oncology 15. (4) 2763, 1997 ２４． Schirrmacher V, Griesbach A, Zangemeister-Wittke U: y-irradiated
viable tumor cells as whole-celle vaccines can stimulate in situ syngen
elc antitumor cytotoxic T lymphocytes and delayed-type hypersensitivity
reactivity whereas tumor cell lysates elicit only delayed-type hypersens
itivity reactivity. Vaccine Res 3 - No.1. 31 - 48, 1994 ２５． Schirrmacher V, Hoegen von P: Importance of tumor cell membrane
integrity and viability for cytotoxic T lymphocyte activation by cancer
vaccines. Vaccine Res 2 - No. 3. 183 - 196, 1993 ２６． Ahlert T, Sauerbrei W, Bastert G, Ruhland S, Bartik B, Simianton
aki N, Schumacher J, Hacker B, Schumacher M, Schirrmacher V: Tumor cell
number and viability as quality and efficacy parameters of autologous vi
rus modified cancer vaccines. J Clin Oncol 15. 1354 - 1366, 1997 ２７． Jenne L et al., Immunobiology 200 (1999) 3-5, pp. 562 ２８． Raftery M et al., Immunobiology 200 (1999) 3-5, pp. 568

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１４年２月４日（２００２．２．４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｒ 1:93 //(Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＥＣ１２Ｒ 1:93） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】患者における特異的免疫応答を行ない及び刺激することができ
る活性化Ｔ細胞を含む組成物であって、該Ｔ細胞は該患者又はその親類から調製
され、インビトロでＴ細胞活性化剤での処理により活性化され、ここで、該Ｔ細
胞活性化剤は、次のステップを含む方法により活性化される樹状細胞を含む（ａ）抗原を調製し、必要に応じてインビトロで該抗原をウイルスで処理する、（ｂ）患者又はその親類から単球を調製する、（ｃ）インビトロでのインキュベーションにより該単球から樹状細胞を発育させ
る(develop)、（ｄ）得られた樹状細胞を、ステップ（ａ）で得られたウイルス処理された抗原
とインビトロで及び／又はステップ（ａ）で得られた非処理抗原プラスウイルス
とインビトロでコインキュベートする、ここで、該ウイルスは抗原の樹状細胞への接着性及び樹状細胞による抗原の提示
を改善することができ、それは樹状細胞の活性化、成熟、安定性及びコシグナリ
ング（cosignalling）を調節することができる。
【請求項２】Ｔ細胞の処理が７日間より長くない活性化された樹状細胞
での短期間インキュベーションを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】活性化されたＴ細胞は少なくとも部分的にＴメモリー細胞
である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】活性化されるＴ細胞の少なくとも一部及び／又は単球の少
なくとも一部は患者の又は親類の骨髄から調製される、請求項１〜３のいずれか
１つに記載の組成物。
【請求項５】Ｔ細胞の処理は6000 U/ml未満のＩＬ−２を含む培養培地
中で行なわれる、請求項１〜４のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項６】該方法は、照射を使用せずに、ステップ（ａ）で得られた
ウイルス処理された抗原を不活性化するステップをさらに含む、請求項１〜５の
いずれか１つに記載の組成物。
【請求項７】ウイルス処理された抗原が凍結−解凍又は超音波処理（ul
trasonification）により不活性化される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】ステップ（ｄ）において、樹状細胞は、抗原及び／又はウ
イルスでのコインキュベーションに加え又はその代わりに、ウイルス処理された
抗原をコードする（１つ以上の）核酸及び／又は前記ウイルス処理された抗原が
提示する対応する免疫シグナルで処理される、請求項１〜７のいずれか１つに記
載の組成物。
【請求項９】抗原が患者から調製される、請求項１〜８のいずれか１つ
に記載の組成物。
【請求項１０】抗原は細胞又はその一部である、請求項１〜９のいずれ
か１つに記載の組成物。
【請求項１１】細胞が腫瘍細胞である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】細胞が免疫ビーズ（immunobead）技術によりさらに精製
される、請求項１０又は１１に記載の組成物。
【請求項１３】細胞が、それらの調製後凍結保存（cryoconservated）
され、ステップ（ａ）でウイルスでの処理及び／又はステップ（ｄ）で樹状細胞
とのコインキュベーションの前又は後に解凍される、請求項１０〜１２のいずれ
か１つに記載の組成物。
【請求項１４】ステップ（ｃ）で、発育する樹状細胞がウイルスともコ
インキュベートされる、請求項１〜１３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１５】ステップ（ｄ）において、ウイルスが抗原及び樹状細胞
間の融合を少なくとも一部誘発する、請求項１〜１４のいずれか１つに記載の組
成物。
【請求項１６】ウイルスが、パラミクソウイルス、ワクシニアウイルス
、ミクソウイルス、ヘルペスウイルス、ＡＩＤＳウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス
及びマウス乳ガンウイルスからなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれ
か１つに記載の組成物。
【請求項１７】パラミクソウイルスがニューカッスル病ウイルス又はム
ンプスウイルスである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】患者の免疫系が著しく障害されている、請求項１〜１７
のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１９】免疫系の障害がガン、感染症、腎不全、自己免疫疾患及
び／又は遺伝性免疫機能障害により引き起こされる、請求項１８に記載の組成物
。
【請求項２０】患者がヒトである、請求項１〜１９のいずれか１つに記
載の組成物。
【請求項２１】１つ以上の他のＴ細胞活性化剤をさらに含む、請求項１
〜２０のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項２２】患者における特異的免疫応答を行い及び刺激するＴ細胞
の活性化のための活性化された樹状細胞を含むＴ細胞活性化剤であって、ここで、該樹状細胞はステップ（ａ）抗原を調製し、必要に応じてインビトロで該抗原をウイルスで処理する、（ｂ）患者又はその親類から単球を調製する、（ｃ）インビトロでのインキュベーションにより該単球から樹状細胞を発育させ
る、（ｄ）得られた樹状細胞を、ステップ（ａ）で得られたウイルス処理された抗原
とインビトロで及び／又はステップ（ａ）で得られた非処理抗原プラスウイルス
とインビトロでコインキュベートする、を含む方法により活性化され、ここで、該ウイルスは抗原の樹状細胞への接着性及び樹状細胞による抗原の提示
を改善することができ、それは樹状細胞の活性化、成熟、安定性及びコシグナリ
ング（cosignalling）を調節することができる。
【請求項２３】該方法は、照射を使用せずに、ステップ（ａ）で得られ
たウイルス処理された抗原を不活性化するステップをさらに含む、請求項２２に
記載のＴ細胞活性化剤。
【請求項２４】ウイルス処理された抗原が凍結−解凍又は超音波処理（ul
trasonification）により不活性化される、請求項２３に記載のＴ細胞活性化剤
。
【請求項２５】ステップ（ｄ）において、樹状細胞は、抗原及び／又は
ウイルスでのコインキュベーションに加え又はその代わりに、ウイルス処理され
た抗原をコードする（１つ以上の）核酸及び／又は前記ウイルス処理された抗原
が提示する対応する免疫シグナルで処理される、請求項２２〜２４のいずれか１
つに記載のＴ細胞活性化剤。
【請求項２６】抗原は患者から調製される、請求項２２〜２５のいずれ
か１つに記載のＴ細胞活性化剤。
【請求項２７】抗原は細胞又はその一部である、請求項２２〜２６のい
ずれか１つに記載のＴ細胞活性化剤。
【請求項２８】細胞が腫瘍細胞である、請求項２７に記載のＴ細胞活性
化剤。
【請求項２９】細胞が免疫ビーズ（immunobead）技術によりさらに精製
される、請求項２７又は２８に記載のＴ細胞活性化剤。
【請求項３０】細胞が、それらの調製後凍結保存（cryoconservated）
され、ステップ（ａ）でウイルスでの処理及び／又はステップ（ｄ）で樹状細胞
でのコインキュベーションの前又は後に解凍される、請求項２７〜２９のいずれ
か１つに記載のＴ細胞活性化剤。
【請求項３１】ステップ（ｃ）において、発育する樹状細胞もウイルス
とコインキュベートされる、請求項２２〜３０のいずれか１つに記載のＴ細胞活
性化剤。
【請求項３２】ステップ（ｄ）において、ウイルスが抗原及び樹状細胞
間の融合を少なくとも一部誘発する、請求項２２〜３１のいずれか１つに記載の
Ｔ細胞活性化剤。
【請求項３３】ウイルスが、パラミクソウイルス、ワクシニアウイルス
、ミクソウイルス、ヘルペスウイルス、ＡＩＤＳウィルス、ヒト乳頭腫ウイルス
及びマウス乳ガンウイルスからなる群から選択される、請求項２２〜３２のいず
れか１つに記載のＴ細胞活性化剤。
【請求項３４】パラミクソウイルスがニューカッスル病ウイルス又はム
ンプスウイルスである、請求項３３に記載のＴ細胞活性化剤。
【請求項３５】患者の免疫系が著しく障害されている、請求項２２〜３
４のいずれか１つに記載のＴ細胞活性化剤。
【請求項３６】免疫系の障害がガン、感染症、腎不全、自己免疫疾患及
び／又は遺伝性免疫機能障害により引き起こされる、請求項３５に記載のＴ細胞
活性化剤。
【請求項３７】患者がヒトである、請求項２２〜３６のいずれか１つに
記載のＴ細胞活性化剤。
【請求項３８】１つ以上の他のＴ細胞活性化剤をさらに含む、請求項２
２〜３７のいずれか１つに記載のＴ細胞活性化剤。
【請求項３９】必要に応じて医薬的に許容される担体及び／又は希釈剤
と組み合わせて、医薬的に有効量の請求項１〜２１のいずれか１つに記載の組成
物及び／又は請求項２２〜３８のいずれか１つに記載のＴ細胞活性化剤を含む医
薬組成物。
【請求項４０】ガン、感染症及び自己免疫疾患の治療又は予防処置のた
めの請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４１】以下のステップ（ａ）抗原を調製し、必要に応じてインビトロで該抗原をウイルスで処理する、（ｂ）患者又はその親類から単球を調製する、（ｃ）インビトロでのインキュベーションにより該単球から樹状細胞を発育させ
る、（ｄ）得られた樹状細胞を、ステップ（ａ）で得られたウイルス処理された抗原
とインビトロで及び／又はステップ（ａ）で得られた非処理抗原プラスウイルス
とインビトロでコインキュベートする、を含む活性化された樹状細胞の調製法であって、ここで、該ウイルスは抗原の樹状細胞への接着性及び樹状細胞による抗原の提示
を改善することができ、それは樹状細胞の活性化、成熟、安定性及びコシグナリ
ング（cosignalling）を調節することができる。
【請求項４２】（ｉ）患者又はその親類からＴ細胞を調製する、（ｉｉ）請求項２２〜３８のいずれか１つに記載のＴ細胞活性化剤でＴ細胞をイ
ンビトロ処理する、のステップを含む活性化されたＴ細胞の調製法。
【請求項４３】患者において特異的免疫応答を刺激及び／又は行なうの
に充分な量で、請求項３９又は４０に記載の医薬組成物を投与するステップを含
む、免疫系障害を患う患者の治療法。
【請求項４４】免疫系障害がガン、感染症、腎不全、自己免疫疾患及び
／又は遺伝性免疫機能障害により引き起こされる、請求項４３に記載の方法。