JP2003511346A - 神経変性疾患関連遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、神経変性疾患の治療のための薬剤の製造における、プロテインキナーゼＣのＩ型サブタイプを含むＰＫＣγ遺伝子を含むポリヌクレオチドフラグメントの使用に関する。本発明はさらに、神経変性疾患の治療のための薬剤の製造における、プロテインキナーゼＣＩ型を含むポリペプチドの使用に関する。ＰＫＣγ遺伝子及び／またはそれに結合したプロモーターにおける変異の存在を検出することを含む神経変性疾患を有するまたは有する傾向にあると思われる、ヒトのような動物を試験する方法がさらに開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、プロテインキナーゼＣＩ型（ＰＫＣＩ型）同じくそのフラグメント
をコードしているポリヌクレオチドフラグメント、該ポリヌクレオチドフラグメ
ントの変異ポリヌクレオチドフラグメント、そのようなポリヌクレオチドフラグ
メントまたは変異ポリヌクレオチドフラグメントを含む組換えベクター、上記ポ
リヌクレオチドフラグメントまたは変異ポリヌクレオチドフラグメントを含む宿
主細胞、上記ポリヌクレオチドフラグメントまたは変異ポリヌクレオチドフラグ
メントを含む組換えベクターを含む宿主細胞、それに加えて組み換えまたは合成
ポリペプチド、上記ポリペプチドに特異的な抗体、上記ポリヌクレオチドフラグ
メントまたは変異ポリヌクレオチドフラグメントに相補のアンチセンスオリゴヌ
クレオチド、上記組換えまたは合成ポリペプチドを含む薬学組成物、上記アンチ
センスオリゴヌクレオチドを含む薬学組成物および動物、特にヒトにおける予防
薬における及び／または治療薬としての使用のための上記ポリヌクレオチドフラ
グメントを含む薬学組成物の使用、同じく診断及び／またはスクリーニングアッ
セイにおいて上記ポリヌクレオチドフラグメントまたは変異ポリヌクレオチドフ
ラグメント、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体及び／またはポリペプチド
の使用に関する。

【０００２】 パーキンソン病、アルツハイマー病およびハンチントン病のような神経系の変
性疾患は、基本的研究および臨床的状況の両方において、長年にわたり努力目標
を提供している。主な問題は、研究の多くの比率が中枢神経系（ＣＮＳ）の実験
的操作によって疾患を生み出している動物で最初に実行されることから、臨床的
状態を正確に模倣する実験動物の欠如である。パーキンソン病の分野におけるＣ
ＮＳの実験的操作の実例は、例えばトキシン６−ヒドロキシドーパミンでの黒質
線状体系の局在化によっている齧歯動物の研究を含む。そのような変異体の大部
分がより乏しい繁殖性であり、かつ各種条件での長期間の連続進行の研究用にそ
の有効性を制限する少ない平均寿命を持つとしても、運動性疾患のいくつかの遺
伝的マウスモデルは存在する。そのようなモデルの一つ、ウィーバーマウスは、
そのドーパミン作動性系における不全を有するとともに、かくしてパーキンソン
病のモデルとして提供されている。しかしながら、この変異体は、重篤な小脳異
常もまた所有し、さらに得られる挙動はパーキンソン病様ドーパミン欠損によっ
て生じるそれらがマスクされ得る。

【０００３】 グラスゴー大学解剖学部（ＡＧＵ）でのＡｌｂｉｎｏ−Ｓｗｉｓｓ（ＡＳ）ラ
ットの閉鎖繁殖コロニーにおいて自然発生的に生じた変異ラット系統（ＡＳ／Ａ
ＧＵ）は、ＣｌａｒｋｅとＰａｙｎｅ（１９９４） Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ６ ｐｐ８８５−８８８で最初に記載
された。その変異ラットは、千鳥足と後足の硬直とともに、運動の開始の困難性
を主としてなる運動疾患を示した。その動物は、全般的な健康は良好でかつ繁殖
力があった。影響を受けた個体間の成功裏の繁殖は、数世代後、同じ運動性欠乏
を生じる全て繁殖性のないものとなった。続く遺伝的解析は、その変異体が常染
色体劣性であることを示している。その歩行障害は生後１０日あたりで最初に検
出され、進行的により重篤となる。これらの動物の平均寿命は約１８ヶ月であり
、平均寿命が２年以上である親のＡｌｂｉｎｏ−Ｓｗｉｓｓ系統と比べた場合、
多少短縮される。

【０００４】 黒質部緻密層中のドーパミン作動性細胞体における６０％欠乏が、１２月齢で
ＡＳコントロールと比較してＡＳ／ＡＧＵ変異体で検出された。これは、基底神
経節関与のための証拠を提供するとともに、該疾患が黒質部緻密層（ＳＮｐｃ）
中のドーパミン作動性ニューロンの損失によって特徴付けられる、ヒトのパーキ
ンソン病と病理学的に非常に類似させることができることを示唆した。

【０００５】 ミクロパンチ法を用いたさらなる研究は、月齢適合コントロールと比べて１２
月齢ＡＳ／ＡＧＵ変異体においてそれぞれ３０％と２０％の背側および外側線条
体中の組織（結合した前シナプスのおよび放出された）ドーパミンの減少を明ら
かにした（Ｃａｍｐｂｅｌｌら １９９６ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ， ２１３ ｐｐ１７３−１７６）。これは、その線条に突出する、ＳＮｐ
ｃ中のドーパミン作動性ニューロンの損失したまたは減じられた機能の予期され
た結果であった。

【０００６】 年齢範囲研究が３月齢、６月齢、９月齢および１２月齢のラットで実行された
時、ＡＳ／ＡＧＵ変異体の背側および外側線条体中の組織ドーパミン減少が６月
齢前から増加することが見られ、それによって該疾患が進行性であったことが示
された（Ｃａｍｐｂｅｌｌら, １９９７ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ， ２３９ ｐｐ５４−５６）。

【０００７】 ドーパミンとその代謝産物、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ
）の細胞外レベルは、意識的なＡＳ／ＡＧＵ変異体ラットの線条体中のミクロ透
析によって測定された。ドーパミンの細胞外レベルは、月齢適合ＡＳコントロー
ルに比べて９月齢ＡＳ／ＡＧＵラットにおいてほぼ８０％非常に顕著に減じたこ
とが見出された。これは、年齢範囲にわたって進行性であることもまた見出され
た。ドーパミンの変性生成物、すなわちＤＯＰＡＣの細胞外レベルは、全ての年
齢でＡＳコントロールに比べてＡＳ／ＡＧＵラットにおいて上昇することが見出
された（Ｃａｍｐｂｅｌｌら，１９９８ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８５ ｐｐ
３２３−３２５）。

【０００８】 局所大脳グルコース利用率は、種々の脳の領域において細胞の代謝活性の目安
である。これはＡＳ／ＡＧＵラットで測定され、グルコース利用率の統計的に有
意な減少が１２月齢ラットにおいて検査した４４の脳領域の１２で現れた。最も
顕著な減少は、黒質部緻密層とmedidical膝状体で見出された。より劣る作用が
錐体外路領域といくつかの辺縁構造中の視床下核において観測された。小脳と白
質エリアは影響されなかった。この証拠は、ＳＮｐｃのドーパミン作動性細胞が
代謝的に構成されるいくつかの経路があることを示唆する（Ｌａｍら, １９９８
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １０
ｐｐ１９６３−１９６７）。

【０００９】 Ｌ−ドーパがＡＳ／ＡＧＵラットに投与された際、それは中空立直りおよび傾
斜路歩行のような多くの運動負荷を実行するためのＡＳ／ＡＧＵラットの能力を
非常の増大することが示された。これは、胎児中脳細胞が線条に移植された場合
にも観測された。Ｌ−ドーパ処置と胎児中脳移植は、ヒトのパーキンソン病患者
の症候性状態を改善することが知られる。この結果は、運動疾患の大部分、した
がってＡＳ／ＡＧＵにおける神経変性傷害が、ＳＮｐｃにおけるドーパミン作動
性ニューロン機能の損失のためであることを明らかにした（Ｐａｙｎｅら, １９
９８ Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ １３ ｐｐ８３２−８３４）。

【００１０】 この研究の全ては、ＡＳ／ＡＧＵラットがパーキンソン病用の表現型モデルと
して良好な候補となり得ることを示唆した。しかしながら、どのようにＡＳ／Ａ
ＧＵラットが遺伝的レベルで影響され得るかの証拠はなかった。

【００１１】 プロテインキナーゼＣＩ型（ＰＫＣＩ型）アイソザイムをコードしているＰＫ
Ｃガンマ遺伝子は、マウスにおいて研究されており、かつ該Ｉ型サブタイプを欠
いているトランスジェニックマウスが生産されている（Ａｂｅｌｉｏｖｉｃｈら
１９９３，Ｃｅｌｌ，７５，ｐｐ１２５３−１２６２）。生産されたゼロの変
異マウスは、挙動悪化を僅かに示すかまたは示さなかった。

【００１２】 ヒトにおいてＰＫＣγ遺伝子中の変異は、網膜色素変性疾患（ＲＰ）と関連す
ることが示されており、Ａｌ−Ｍａｇｈｔｈｅｈら, １９９８，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕ
ｍ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６２ ｐｐ１２４８−１２５２を参照。しかしながら、
その変異が、パーキンソン病、アルツハイマー病またはハンチントン病のような
付加の神経学的疾患と関連したことの示唆はない。

【００１３】 本発明は、プロテインキナーゼＣのＩ型サブタイプをコードしているＰＫＣ_γ 遺伝子内の変異がＡＳ／ＡＧＵラットと関連するとの本発明者らによる発見に基
づいている。

【００１４】 このように、最初の態様において、本発明は、神経変性疾患の治療のための薬
剤の製造におけるプロテインキナーゼＣのＩ型サブタイプをコードしているＰＫ
Ｃγ遺伝子を含むポリヌクレオチドフラグメントの使用を提供する。

【００１５】 さらなる態様において、本発明は、神経変性疾患の治療のための薬剤の製造に
おけるプロテインキナーゼＣＩ型を含むポリペプチドの使用を提供する。

【００１６】 典型的な薬剤は、哺乳動物、特にヒトを治療するために使用し得る。該神経変
性疾患は、アルツハイマー病中枢神経系の変性疾患、またはとりわけ、パーキン
ソン病、ハンチントン病／舞踏病、レビ小体による痴呆、多発性全身萎縮（線条
体黒質変性、散在性オリーブ橋小脳萎縮およびシャイ−ドレーガー症候群を含む
）、進行性核上性麻痺、皮質性基底神経節（大脳皮質基底核）変性、血管性パー
キンソン病およびバリズムのようなドーパミン作動性細胞変性及び／または運動
傷害と関連した神経変性疾患であり得る。

【００１７】 ここで用いたような「ポリヌクレオチドフラグメント」は、リボヌクレオチド
配列とデオキシリボヌクレオチド配列の両方の、いずれかの長さのポリマー形を
指す。特に、この用語はその分子の一次構造をさし、そのようにこの用語は二本
鎖および一本鎖ＤＮＡ、同じく二本鎖および一本鎖ＲＮＡ、およびその修飾体を
含む。

【００１８】 一般に、用語「ポリペプチド」は、生物学的活性を持ったアミノ酸の分子鎖を
指す。それは生産物の特有の長さを指すのではなく、もし必要なら、例えばグリ
コシル化、ミリストイル化、アミド化、カルボキシル化またはリン酸化によって
インビボ及び／またはインビトロで修飾できる；このようにとりわけペプチド、
オリゴペプチドおよびタンパク質が含まれる。ここに開示されるポリペプチドは
、例えば当該分野で周知の合成または組換え技術によって得ることができる。

【００１９】 したがって該用語は、ＰＫＣγ遺伝子からの種々の転移体およびこれら転移体
のスプライス変異体から得られるポリペプチドを包含するように拡張される。さ
らに、機能ドメインは、特有の使用をなし得るこれら機能ドメインに関係付けら
れるタンパク質と単離したポリペプチドにおいて観測され得る。例えば、調節ド
メイン、キナーゼドメインおよびＡＴＰ結合ドメインは、ＰＫＣＩ型ポリペプチ
ドにおいて観測されている。本発明は、そのような機能ドメインポリペプチドを
コードしているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドフラグメントにも関す
る。

【００２０】 ここに参照されるＰＫＣγヌクレオチドおよびポリペプチド配列のために、自
然の変異が個体間に存在できる。これらの変異は、全体の配列におけるアミノ酸
相違によってまたは上記配列におけるアミノ酸の欠失、置換、挿入または逆位に
よって表し得る。そのような変異の全ては、本発明の範囲内に含まれる。

【００２１】 当該分野で周知の通り、遺伝コードの縮重は、同じアミノ酸をコードしている
異なるコドンに帰着するコドンに基づく置換を与える。したがって、ここに開示
した配列に基づいたそのような誘導ヌクレオチド配列もまた、本発明の範囲内に
含まれることが明らかである。

【００２２】 したがって、本発明は、ここに開示したポリヌクレオチド配列と類似のヌクレ
オチド配列をも含む。類似配列はストリンジェント条件下で本発明のポリヌクレ
オチド配列にハイブリダイズしたままである配列を含むことが理解される。典型
的に、類似試験配列と本発明のポリヌクレオチド配列は、０．１％ドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）を含む生理食塩水で緩衝化した二倍強度ＳＳＣ（２×Ｎａ
Ｃｌ １７．５ｇ／ｌおよび８．８ｇ／ｌでクエン酸ナトリウム（ＳＣ））中、
５０と７０℃の間の温度で一般に特定された時間ハイブリダイズさせ、続いて同
じ温度であるが減じられたＳＳＣ濃度を有する緩衝液で濯がれる。該配列の類似
性の度合に基づいて、そのような減じた濃度の緩衝液は、典型的に、０．１％Ｓ
ＤＳを含む一倍強度ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む半分強度ＳＳＣおよび０．１
％ＳＤＳを含む十分の一強度ＳＳＣである。類似性のより大きな度合を有してい
る配列は、減じられた濃度の緩衝液中での洗浄によってハイブリダイゼーション
が最も小さな影響を受けるそれらである。類似および本発明配列は、それらの間
のハイブリダイゼーションが０．１％ＳＤＳを含む十分の一強度ＳＳＣ中での洗
浄またはインキュベーションによって実質的に影響を受けないような類似性であ
ることが最も好ましい。

【００２３】 さらに、ＰＫＣγ特異性またはＰＫＣＩ型特異性をなお示すＰＫＣγ遺伝子ま
たはＰＫＣＩ型タンパク質から得られたフラグメントもまた、本発明に含まれる
。「ＰＫＣγ特異性」は、自然発生ＰＫＣγ遺伝子に起因すると考えられる生物
学的機能を指すと理解され、かつ「ＰＫＣＩ型特異性」は、天然ＰＫＣＩ型タン
パク質に起因すると考えられる生物学的機能を指すと理解される。これは、融合
タンパク質を含み得る。

【００２４】 ＰＫＣγのそのような誘導体をもたらす上述したそのような全ての修飾は、特
徴的なＰＫＣγ特性が本質的に実質上影響を受けないままである限りは本発明に
包含される。

【００２５】 本発明は、「位置クローニング」（Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１，３−６）のプロセスを用いてＡＳ／ＡＧＵラットにお
いて示された遺伝子型変異を確かめるために遺伝地図技術に適用される。この地
図は、ＡＳ／ＡＧＵ変異が遺伝しマーカーＲ１５８（Ｓｅｒｉｋａｗａら, １９
９２，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３７, ｐｐ７０１−７２１）に密接していたことを
明らかにした。ヌクレオチド配列決定は、野生型ＡＳ配列と比較して実行し、Ｐ
ＫＣγ遺伝子中の変異が明らかになった。

【００２６】 点変異は、ＡＳ遺伝子配列中に存在するグアニン塩基がＡＳ／ＡＧＵ変異配列
においてチミン塩基に変異したようにラットＰＫＣγメッセンジャーＲＮＡ配列
（図１中に示され、ヌクレオチド番号はＡＴＧ開始コドンの塩基ＡがＮｏ．１で
あるようにしてある）のヌクレオチド８４１で観測された。このトランスバージ
ョン変異は、２８０アミノ酸となるであろう長さの成熟前終結タンパク質をもた
らすであろうＰＫＣγ遺伝子の翻訳においてフレーム内停止コドンの生成に帰着
する。この切断タンパク質は野生型タンパク質中に存在するドメインを所有して
いないであろうことが仮定される。すなわち、調節ドメインは切断タンパク質中
に存在し、キナーゼまたはＡＴＰ結合ドメインにはないであろう。

【００２７】 この遺伝子型変異がＡＳ／ＡＧＵ変異ラットにおいて観測された表現型運動疾
患と関連することから、ＰＫＣγ中のそのような変異の観測は、パーキンソン病
、アルツハイマー病またはハンチントン病のような神経変性疾患用の予測試験に
おいて使用し得る。代わりに、ＰＫＣＩ型タンパク質レベル及び／または活性の
レベル測定は、神経変性疾患用の予測または診断試験において有用となり得る。

【００２８】 したがって、さらなる態様において、本発明は、ＰＫＣγ遺伝子及び／または
それと関連したプロモーターにおける変異の存在を検出することを含む神経変性
疾患を有するまたは有する傾向にあると思われる動物の試験方法を提供する。

【００２９】 典型的に、該変異は、生産されるＰＫＣγ遺伝子からの切断生産物を生じ得る
。特にその変異は、該遺伝子の５’半分中で起こり得る。例えばその変異は、ラ
ットＰＫＣγ遺伝子または別の種からのＰＫＣγ遺伝子の類似領域の位置８４１
でのような点変異とし得る。熟練者は、ラットＰＫＣγ遺伝子に関するここに提
供した情報が、ヒトのような別の種からのＰＫＣγ遺伝子中の一致する位置で類
似の変異と容易に同一視または相互に関係付けできることを容易に理解するであ
ろう。したがって、本発明は、ヒトＰＫＣγ遺伝子中の類似の変異をヒトで試験
するためのおよび検体が例えばパーキンソン病、アルツハイマー病またはハンチ
ントン病のような神経変性疾患に罹っているまたは傾向にあるかどうかを予測す
るための手段を提供する。

【００３０】 変異を検出するための典型的な技術は、制限フラグメント長多型、ハイブリダ
イゼーション技術、ＤＮＡ配列決定、エキソヌクレアーゼ抵抗性、ミクロシーク
ェンシング、ｄｄＮＴＰｓを用いる固相延長、ｄｄＮＴＰｓを用いる溶液中延長
、オリゴヌクレオチド連結アッセイ、ダイナミックアレル特異的ハイブリダイゼ
ーションのような単一ヌクレオチド多型を検出するための方法、連結連鎖反応、
ミニ配列決定、ＤＮＡ「チップ」、ＰＣＲまたは分子ビーコンと結合した単独ま
たは二重標識プローブでのアレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーシ
ョン、などを含み得る。

【００３１】 切断ＰＫＣＩ型ポリペプチドをコードしているｍＲＮＡ転写物の変化したレベ
ルが観測されている。したがって、ｍＲＮＡ転写物または新生ＲＮＡのようなｍ
ＲＮＡ前駆体の変化したレベルの検出は、試験検体が神経変性疾患に罹ったまた
は進行することが予期されるならば診断するために使用できる。

【００３２】 ここに提供した情報は、例えば当該分野で周知の組換えＤＮＡ技術によってそ
の遺伝子をクローンするため、野生型ＰＫＣγ遺伝子、変異ＰＫＣγ遺伝子また
はその誘導体を遺伝的に操作するためにも、また使用できる。哺乳動物の他の種
からの相同遺伝子のクローニングは、周知の技術によってこの情報で実行し得る
；例えば、適当なプライマーは、図２中に示した配列のコンセンサス領域及び／
または機能的ドメインについて設計でき、またそのようなプライマーは、他の生
体からの相同な遺伝子をクローニングするためのプローブとして使用される。

【００３３】 さらに、本発明の哺乳動物ＰＫＣγ変異体と野生型ヌクレオチド配列は、発現
制御配列に好ましくは結合される。そのような制御配列は、プロモーター、オペ
レーター、インデューサー、リボソーム結合部位などを含み得る。一定の宿主の
ために適当な制御配列は、熟練した当業者によって選択され得る。

【００３４】 本発明に従うヌクレオチド配列は、結果的に組換え核酸分子と呼ばれる、種々
の発現制御ＤＮＡ配列に連結できる。したがって、本発明は、発現可能なＰＫＣ
γ変異体または野生型ヌクレオチド配列を含む発現ベクターもまた含む。上記組
換え核酸分子は、適当な宿主の形質転換用に用いることができる。

【００３５】 そのような組換え核酸分子は、例えばプラスミドから、またはバクテリオファ
ージまたはウイルス中に存在しかつベクター分子と称される核酸配列から好まし
くは得られる。

【００３６】 本発明に従うヌクレオチド配列をクローンするために使用できる特有なベクタ
ーは、当該分野で知られる（例えば、ＲｏｄｒｉｇｕｅｓとＤｅｎｈａｒｄｔ，
ベクター：分子クローニングベクターの概観とその使用, Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔ
ｈｓ，１９８８）。

【００３７】 本発明に従う組換え核酸分子の構築に使用される方法は熟練した当業者に知ら
れ、かつとりわけ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら, Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，コールドスプリングハーバーラボ
ラトリー，１９８９中に記載される。

【００３８】 本発明は、発現可能な型における変異または野生型核酸分子を含む形質転換細
胞にも関する。ここで用いたような「形質転換」は、用いる方法に関わりなく、
例えばリン酸カルシウム共沈殿法、直接取り込みまたは形質導入によって、イン
ビボで、エクスビボでまたはインビトロで宿主細胞への異種核酸配列の導入に言
及する。

【００３９】 異種核酸配列は、自律的複製を経て維持し得るか、あるいは代わりに宿主のゲ
ノム中に組み込まれ得る。組換えＤＮＡ分子は、挿入した核酸配列の発現を調節
できる設計した宿主と和合できる適切な制御配列とともに好ましくは提供される
。

【００４０】 組換え核酸分子の発現用に最も広く用いられる宿主は、細菌、酵母、昆虫細胞
および哺乳動物細胞である。各々の系は、用いるベクター、組換えポリペプチド
の生産と精製の潜在的容易差に関して、および三次元構造、グリコシル化状態、
生物学的活性および安定性に関して生産物の信頼性に関して効果と欠点を有し、
かつ熟達した研究者の選択の事項となるであろう。

【００４１】 一定の環境において、細胞中でのＰＫＣＩ型ポリペプチドの発現を促進するこ
とに加え、例えば薬剤スクリーニングにおける使用のための実験動物の生産のた
め、または特に固有ＰＫＣＩ型が変異型であるならば、宿主中の固有ＰＫＣＩ型
の発現または活性を実質上防ぐまたは減じるために有効となり得る。

【００４２】 したがって、本発明のさらなる態様に従い、本発明のＰＫＣγ遺伝子ヌクレオ
チド配列に相補のアンチセンスヌクレオチドフラグメントが提供される。「アン
チセンスヌクレオチドフラグメント」の範囲に含まれるのは、合成オリゴヌクレ
オチド配列の、または熟練した当業者に知られる均等な化学物質、例えばペプチ
ド核酸の使用である。さらに、そのような配列は、標的遺伝子調節用にも有用と
なり得るリボザイム及び／または三重ヘリックス配列の部分として使用できる。
細胞によって転写される際、そのようなアンチセンスフラグメントを生成する、
ヌクレオチド配列を含むヌクレオチドフラグメントもまた提供される。典型的に
、アンチセンスＲＮＡフラグメントは、該分子を切断することをＲＮアーゼＨに
与えかつ該細胞がポリペプチドに切断することを不可能にしているＲＮＡ二重ヘ
リックスを形成するための相補ＰＫＣγｍＲＮＡフラグメントに対する結合を提
供するであろう。

【００４３】 本発明のさらなる態様は、ここで同定したようなＰＫＣＩ型ポリペプチドまた
は切断ポリペプチドにまたはそれのエピトープに特異的な抗体を提供する。抗原
に特異的な抗体の生産と精製は、熟練した当業者の技術事項であり、かつ使用さ
れる方法は熟練した当業者に明白である。その用語抗体は、ポリクローナル抗体
、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆ
ａｂフラグメント，Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによ
り生成されたフラグメント、抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、および上記
のいずれかのエピトープ結合フラグメントを含むが、これらに制限されない。そ
のような抗体は、完全長または切断ＰＫＣＩ型ポリペプチドの発現または活性の
調節において、またはインビボまたはインビトロでの上記ポリペプチドの検出に
おいて使用し得る。

【００４４】 本発明は、哺乳動物において予防または治療薬として使用するための試薬の製
造のために組換えまたは合成ＰＫＣＩ型ポリペプチドをさらに提供する。特に、
本発明は、薬学上許容されるそのためのキャリアと一緒に組換えまたは合成ＰＫ
ＣＩ型ポリペプチドを含む薬学組成物を提供する。

【００４５】 本発明のさらなる態様に従い、例えば、薬剤スクリーニングにおいて使用し得
る動物モデルの製造においての使用のため神経系変性を促進するために前述した
通りのポリペプチドまたは核酸配列の使用が提供される。

【００４６】 神経系の変性を予防、遅延、治療または阻害することにおいて前述した通りの
ポリペプチドまたは核酸配列の使用もまた提供される。該神経系の変性を示して
いるまたは示すことが予測される被験者にＰＫＣＩ型ポリペプチドを提供するこ
とを含む神経系の変性を予防、遅延、治療または阻害する方法がさらに提供され
る。そのような方法は、アルツハイマー病のような中枢神経系の変性疾患、とり
わけパーキンソン病またはハンチントン舞踏病のような運動障害と関連する神経
変性疾患の治療において特有の適用を見出し得る。

【００４７】 変異ＰＫＣＩ型ポリペプチドの発現または活性を実質上防ぐまたは減じるヌク
レオチド配列または抗体を被験者に提供することを含む神経系の変性を予防、遅
延、治療または阻害する方法もまた提供される。

【００４８】 本発明のさらなる態様は、パーキンソン病、アルツハイマー病またはハンチン
トン病のような神経系の変性疾患の治療において前述したようなポリペプチドま
たは核酸配列の使用を提供する。予想されるそのような治療の一つは、野生型Ｐ
ＫＣγ遺伝子が、変異ＰＫＣγ遺伝子の作用をうち消すために変異ＰＫＣγ遺伝
子を持っている患者に導入される、いわゆる遺伝子治療によるものである。これ
は、隣接ニューロン中にそれ自身およびＰＫＣγが転移されるであろうヘルペス
ウイルスＶＰ２２タンパク質に融合したヒトまたは哺乳動物ＰＫＣγを発現する
繊維芽細胞のような細胞の移植によって実行し得る。移植する細胞の形質転換は
、ミクロインジェクション、エレクトロポレーション、バイオバリスチックまた
は粒子ボンバードメント、ジェット注射その他のような物理的手段；リン酸カル
シウム、ＤＥＡＥデキストラン、ポリリジン接合、「スターバースト」デンドリ
マー接合、ポリブレンジメチルスルホキシドを用いるような化学的手段によって
、いずれかの技術によってインビトロで実行し得る。適当な発現系に末端結合し
た適切なベクター内でＰＫＣγ遺伝子それ自身は、アシアロ糖タンパク質および
トランスフェリン、リポソーム、ウイルス様粒子、細胞内標的化リガンドなどの
ようなレセプター−介在取り込み系を経て；さらにモロニーネズミ白血病ウイル
スのようなレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ関
連ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、セムリキ森林熱ウイルス
ベクター、シンドビスウイルスベクターなどを含む生物学的手段によって直接誘
導し得る。

【００４９】 本発明は、神経系の種々の変性疾患の予後および診断評価のため、およびそれ
らがｍＲＮＡまたはポリペプチドまたはＰＫＣＩ型レベル及び／または活性の測
定かどうか、個人におけるＰＫＣγヌクレオチド配列の測定及び／またはＰＫＣ
γ遺伝子から得られた切断転写物の検出によってアレル変異体の測定のような、
そのような疾患になることが予想される被験者の同定のための方法にも関する。
さらに本発明は、そのような疾患用の薬剤の効力を評価するおよびそのような疾
患の治療のための臨床試験を受けさせた患者の進行をモニタリングするための方
法を提供する。

【００５０】 本発明は、神経系の変性疾患に関係のあるプロセスに関与し得る変異したまた
は野生型ＰＫＣγ遺伝子の発現及び／またはそのような変異または野生型ＰＫＣ
γ遺伝子の生産物の活性を調節する化合物の同定のための方法をさらに提供する
。そのような化合物は、変異したまたは野生型ＰＫＣγ遺伝子の発現及び／また
はそのような変異または野生型ＰＫＣγ遺伝子の生産物の活性を増加する化合物
として定義されるアゴニスト、及び／または変異したまたは野生型ＰＫＣγ遺伝
子の発現及び／またはそのような変異または野生型ＰＫＣγ遺伝子の生産物の活
性を減じる化合物として定義されるアンタゴニストを含む。したがって、さらな
る態様において本発明は、アゴニスト及び／またはアンタゴニストもまた提供す
る。

【００５１】 ＰＫＣγ遺伝子の生物学的機能は、インビボおよびインビトロ系で関係を利用
することによってより直接的に評価することができる。インビボ系は、神経系疾
患の徴候を自然に示す動物系、またはそのような徴候を示すように操作されてい
るそれを含めることができるが、これらに制限されない。さらに、そのような系
は、トランスジェニック動物系を含めることができるが、これに制限されない。
インビトロ系は、ＰＫＣγ遺伝子／ＰＫＣＩ型タンパク質発現細胞型を含む細胞
ベースの系を含むことができるが、これに制限されない。該細胞は、野生型細胞
とすることができ、または目的の疾患に寄与することが知られまたは予期される
修飾物を含む非−野生型細胞とすることができる。

【００５２】 ＰＫＣγ変異体または野生型遺伝子の生物学的機能のさらなる特徴付けにおい
て、ＰＫＣγ変異体または野生型遺伝子の発現は、インビボ及び／またはインビ
トロ系内で調節でき、すなわち例えばトランスジェニック動物及び／または細胞
系において過剰発現されるまたは下回る発現のいずれかであり、かつ該系につい
ての次の作用をアッセイすることができる。代わりに、同定した遺伝子の生産物
の活性は、目的のインビボ及び／またはインビトロ系において活性のレベルの増
加または減少の何れかによって調節でき、かつその次の作用がアッセイされる。

【００５３】 そのような特徴付けを経て得られた情報は、神経系疾患の治療または制御のた
めの関連方法を示唆できる。例えば、関連する治療は、遺伝子発現および遺伝子
生産物活性の調節を含むことができる。ここに記載したそれらのような特徴付け
の手順は、そのような調節が正または負の何れとすべきかを含むことができる。
ここで用いたような「正の調節」は、目的の遺伝子または遺伝子生産物の遺伝子
発現または活性における増加を指す。ここで用いたような「負の調節」は、遺伝
子発現または活性の減少を指す。

【００５４】 インビトロ系は、本発明のＰＫＣγ変異体または野生型遺伝子生産物を結合す
ることができる化合物を同定するために設計できる。同定した化合物は、例えば
野生型または変異ＰＫＣγ遺伝子生産物の活性を調節することにおいて有用とす
ることができ、ＰＫＣγ遺伝子生産物の生物学的機能を精査することにおいて有
用とすることができ、または正常なＰＫＣγ遺伝子生産物相互作用、例えば、Ｋ
ｅｅｎａｎら，１９９７，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４１５ ｐｐ１０１−１
０８中に開示されたようなＰＫＣＩタンパク質のアクチベーターまたはインヒビ
ターを崩壊させるまたは増強できる。そのような化合物は、運動障害及び／また
はドーパミン作動性細胞変性疾患を治療するまたは軽減することにおけるその使
用を研究し得る。

【００５５】 本発明のこれらおよび他の態様は、実例のみ方法で、かつ以下に示される添付
の図面を参照することによって、ここにさらに記載されるであろう。

【００５６】 （実験１−Ｒ１５８での戻し交雑子孫の遺伝子型によるｎｎｇ３変異の遺伝子詳 細マッピング ） 本発明者らは、「位置クローニング」（Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９２，Ｎａｔ
ｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１，３−６）のプロセスを用いてＡＳ／ＡＧＵ系統
中に示される遺伝子型の変異を確認するための遺伝子マッピング技術を提供した
。このアプローチの適用は、既知のマーカー遺伝子への連鎖を実証することによ
って遺伝子の染色体上配置を初めに測定することによる。これは該遺伝子を含む
遺伝子領域を狭めるための付加的な詳細マッピングに続き、該領域の配列決定ま
たは該領域からのｍＲＮＡ転写物の選択のいずれか一方でなされた。

【００５７】 遺伝的連鎖は、二倍体ゲノム内部の染色体相同体の特有のセットを表すＤＮＡ
分子の同じ対を持つ２つ以上の物理的結合の直接的結果である（Ｓｉｌｖｅｒ，
１９９５，Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：概念と適用，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）。一般に、交差は哺乳動物ゲノム中の染色体の全
てに沿ってランダムな部位で起こる。この無作為性の直接の結果は、さらに２つ
の結合した遺伝子座が互いに隔たって、交差事象がそれらの間にある染色体の長
さの範囲内の何処かで起こるであろうことが最もありそうに思われる（Ｓｉｌｖ
ｅｒ，１９９５）。したがって、組換え頻度は既知のマーカー遺伝子と前もって
未知の遺伝子の間の遺伝子の距離の相対的な見積もりを提供する。

【００５８】 ３つの戻し交雑は、ｎｎｇ３遺伝子のマッピングを与えるためＮＮＧ３系統と
系統Ｆ３４４，ＢＮおよびＤＡ（Ｆｅｓｔｉｎｇ，１９７９ Ｉｎｂｒｅｄ Ｓ
ｔｒａｉｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ロンドン: Ｔ
ｈｅ ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．）で確立された。Ｆ３４４，
ＢＮおよびＤＡラット系統は、ＮＮＧ３系統と比べた場合、ミクロサテライト配
列内部に最も高い変異をそれらが示すように選択した（Ｓｈｉｅｌｓら，１９９
５， Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ，６，２１４−２１５）。ミクロサテ
ライト配列は、種々の長さのアレル形で起こる単純ジヌクレオチドまたは他のＤ
ＮＡ配列のタンデム反復と定義される。それらは、利便的な遺伝子マーカーと見
なされ、かつゲル電気泳動を用いるミクロサテライトを含む短ポリメラーゼ連鎖
反応の長さを評価することによって検査される。

【００５９】 戻し交雑を確立するために、当該の各々の系統（ＤＡ，Ｆ３４４およびＢＮ）
は、ＮＮＧ３系統と交雑させ、得られるヘテロ接合Ｆ１子孫がＮＮＧ３系統に戻
し交雑された。得られた戻し交雑子孫は、交差事象が目的の遺伝子といずれかの
遺伝子マーカー間に起こっていたならば、さらに同定するために遺伝子型化した
。これは、特有な染色体またはサブ−染色体領域の内への該遺伝子の配置を与え
た。

【００６０】 総計で３１８８の戻し交雑子孫が３つの戻し交雑体からもたらされた。全ゲノ
ムスキャンは、ラット染色体あたり少なくとも１つの情報を与えるマーカーを遺
伝子型に含む７３ミクロサテライトマーカーで行った。これらのマーカーの全て
は、ｎｎｇ３変異との結合のためにアッセイした。遺伝的連鎖は、染色体１に局
在し、かつｎｎｇ３遺伝子からほぼ３０ｃＭにマップされたマーカーＲ３３（Ｓ
ｅｒｉｋａｗａら，１９９２，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３１，７０１−７２１）で
観測された。この染色体領域の範囲内からマーカーの距離は、戻し交雑子孫の全
ての遺伝子型に用いた。ｎｎｇ３変異を取り巻いている最も近いマーカー遺伝子
座が、正確なマッピングを実行するため染色体間隔内に確立するよう選択した。
この間隔は、図１中に示したように、各々の戻し交雑で異なった。これは、その
領域の明確な地図を与え、マーカー間の組換え事象を同定した。用いたマーカー
は、３つの戻し交雑（ＢＮ×ＮＮＧ３）Ｆ１×ＮＮＧ３、（Ｆ３４４×ＮＮＧ３
）Ｆ１×ＮＮＧ３および（ＤＡ×ＮＮＧ３）Ｆ１×ＮＮＧ３のための図１中に示
される。

【００６１】 研究下でその間隔内の組換え事象を有すると同定された全ての子孫は、遺伝子
マーカーＲ１５８（Ｓｅｒｉｋａｗａら，１９９２）を用いて遺伝子型化した。
遺伝子マーカーＲ１５８は、ＰＫＣγ遺伝子の３’ＵＴＲからの（ＣＡ）_２６ミ
クロサテライト反復を増幅するＰＣＲプライマーの対からなる。３つのラット系
統ＢＮ，Ｆ３４４およびＤＡは、Ｒ１５８のために有益であることが示され、す
なわちそのミクロサテライトの長さは、ＮＮＧ３ラット系統と比べた場合、系統
間で変化することが示された。その遺伝子型化は、ゲノムＤＮＡについて、以下
の実験的セクション中に記載されるように、ＰＣＲによって実行した。そのＰＣ
Ｒ生成物は、６％アクリルアミド上でまたは４％ｍｅｔａｐｈｏｒ（Ｆｌｏｗｇ
ｅｎ）アガロースゲル上での何れかの電気泳動によって決定した。

【００６２】 この実験から（ｎ＝３１８８）、ｎｎｇ３変異とマーカーＲ１５８の間の組換
え事象を含むことが観測された動物はいなかった。これは、ｎｎｇ３変異０±＜
遺伝子マーカーＲ１５８から０．０６ｃＭに位置した。マウスにおいて、０．０
６ｃＭは染色体ＤＮＡ長のほぼ６０ｋｂに相当する。これらのマッピング実験は
、ｎｎｇ３変異（および遺伝子）が、プロテインキナーゼＣのＩ型イソ型をコー
ドしている遺伝子ＰＫＣγの内部にそれ自身がある、Ｒ１５８ミクロサテライト
に非常に密接することを示す。したがって、ｎｎｇ３遺伝子は、ＰＫＣγそれ自
身または直に隣接する遺伝子であることはほぼ間違いない。

【００６３】 （実験２−その系統と親のＡＳ系統におけるＰＫＣγ遺伝子のアレル形の間のＤ ＮＡ配列相違の実証 ） 該遺伝地図の証拠は、ｎｎｇ３変異の位置としてＰＫＣγ遺伝子を関連付けた
。この結果が正しければ、ＤＮＡ配列相違は、ＮＮＧ３系統においておよび自然
発生的な変異によって生じたＮＮＧ３系統からのＡＳ系統においてのＰＫＣγ遺
伝子のアレル形間に存在していなければならない。したがって、以下の実験を配
列相違の証拠を提供するために行った。

【００６４】 ＲＮＡは、変異体（ＮＮＧ３）とコントロール（ＡＳ）系統の両方からの１２
月齢ラットから単離した。ＲＮＡは、製造者によって提供されたプロトコールに
よってＴＲＩ ＲＥＡＧＥＮＴ（商標）（Ｓｉｇｍａ）を用いて単離した。ＲＮ
Ａは脳組織の１ｇから単離し、ＴＲＩ ＲＥＡＧＥＮＴ（商標）の１０ｍｌ中に
均質化した。１μｇのＲＮＡが、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬからのＦｉｒｓｔ Ｓｔｒ
ａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ用のＯｌｉｇｏ（ｄｔ）_{１２−
１８}Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙ
ｓｔｅｍを用い、ｃＤＮＡを合成するために用いた。５０ｎｇのｃＤＮＡを、Ｐ
ＣＲ反応において鋳型として用いた。該ＰＣＲ反応は、１×マグネシウムフリー
のＴｈｅｒｍｏ緩衝液、１ｍＭ 塩化マグネシウム（全てＰｒｏｍｅｇａからの
Ｔａｑポリメラーゼとともに提供された）、１２５μＭ ｄＮＴＰｓ（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ）および各々５ｎｇ／μｌで前進と後進プライマーを含む反応においてＴ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の１単位を用いて行った。ホット
スタートが該ＰＣＲ反応において常に行われた。用いた全てのＰＣＲプライマー
の配列は、それらが用いられたＰＣＲ反応と共に表１中に与えられる。

【００６５】

【表１】 表１−利用したＰＣＲプライマー。用いたＰＣＲプライマーの配列はそれらが
用いられた反応と共に与えられる。

【００６６】 Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用に用いたＰＣＲパラメーターは以下の通りであ
った： 113前進／114逆進 120前進＋逆進 ９９℃−３分間 ９９℃−１０分間 ８０℃−Ｔａｑ添加 ８０℃−Ｔａｑ添加 続いて３５サイクルの： 続いて３０サイクルの： ９４℃−１５秒間 ９４℃−１５秒間 ５５℃−３０秒間 ５５℃−３０秒間 ７２℃−１分間、続いて： ７２℃−３０秒間、続いて： ７２℃、１０分間。 ７２℃−１０分間。

【００６７】 ＰＣＲ生産物は、２％アガロースゲル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ）上で分析し、次いで配列決定の前にＱｉａｑｕｉｃｋ（商標）ゲル抽出キ
ットを用いてゲルから抽出した。

【００６８】 ＰＣＲ生産物の配列決定は、Ｂｉｇ Ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてＡＢＩ ３７３ストレッチ自動
シークェンサーで実行した。ＰＣＲ反応で用いたプライマーの３．２ｐモルを配
列決定用に用いた。

【００６９】 ＰＣＲ反応は、両方のラット系統から取り出したラット脾臓から単離したラッ
トゲノムＤＮＡでも実行した。ＤＮＡはＰｕｒｅ Ｇｅｎｅ ＤＮＡ単離キット（
Ｇｅｎｔｒａ）を用いて単離した。ＰＣＲ反応は鋳型としてゲノムＤＮＡの１０
０ｎｇを含ませる前に行った。ＰＣＲ反応の最初の変性工程もまた、１０分間に
増加した。

【００７０】 ＰＣＲ反応はまた、ＤＮＡ重合の間のエラーを無くすためにプルーフ−リーデ
ィングＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いて行った。ＰＣＲ反応の酵素と修飾は以下
の通りとした：Ｔｌｉポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）反応は、７４℃で拡張す
る酵素の１．２５単位で行った。ＣｌｏｎｔｅｃｈからのＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌ
ｉｔｙ（ＨＦ）キットは、６８℃３分間で同時に自動ホットスタートし、アニー
ルし、かつ延長した。

【００７１】 ｃＤＮＡの３つの異なる集団が合成され、さらにＰＣＲ生成物が３つの配列か
ら得られた（実験結果の要約は表２中に与えられる）。すべてのＰＣＲ生成物は
、図２中に示した通り、位置８４１でＡＳラット系統においてＧヌクレオチドと
、ＮＮＧ３ラット系統において同じ位置でＴヌクレオチドを示した。このトラン
スバージョン変異は、成熟前終結タンパク質（図３）をもたらす、新たな終結ま
たはＰＫＣγの翻訳用の停止コドンを創生する。該タンパク質のキナーゼ活性ド
メインが失われるように、これは生物学的結果のカスケードに到る、標的タンパ
ク質基質をリン酸化するための能力の損失となるであろう。この機能の意図され
た損失は、成熟の劣性な本質を認めるものであることが明らかとなる。

【００７２】

【表２】 表２−行った配列決定実験の概要。該表は、配列決定用に実行したＰＣＲ反応
において用いた酵素と鋳型を明記する。表中で参照したヌクレオチド番号（８４
１）は、図２から採用される。

【００７３】 これらのマッピングと配列決定結果は、配列相違がＮＮＧ３とＡＳ系統間に起
こるらしいことを実証する。それは、ＮＮＧ３系統においてこの塩基変化（位置
８４１でＧからＴ、図２）が、この系統で観測された表現型を生じると考えられ
る。

【００７４】 （実験３−免疫細胞化学によるＰＫＣガンマの検出） ＮＮＧ３系統におけるＰＫＣγ中の停止コドンは、ＰＫＣＩ型ポリペプチドの
成熟前終結をもたらすと仮定した。これは、キナーゼ活性を有していないタンパ
ク質となるであろう。ＮＮＧ３系統から単離した脳に対するＰＫＣＩ型タンパク
質（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のカルボキシ末端部分に対して
生起した抗体の結合をさらに研究した。

【００７５】 ＰＫＣガンマは、以下の変更と共に標準的プロトコールを用いて免疫細胞化学
分析により検出した：ラットの脳は、９月齢オスラットから取り出し、４％パラ
ホルムアルデヒド中で一晩固定した。次いで脳を削り、ブロック上に置き、さら
にビブラトームを用いて５０ミクロンで切片に切断した。組にした切片はブロッ
キング血清（１０％ＮＧＳ−正常ヤギ血清）中に入れ、室温で一時間シェーカー
上に置いた。次いで切片を４℃で一晩、一次抗体（ラットＰＫＣγのアミノ酸３
０６−３１８と一致する合成ペプチドを用いて生成したウサギ抗−ペプチド抗体
、１：１００−１：２０００、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中に
入れた。スライドは、各々５分間ＰＢＳ中で３回洗浄した。次いで切片は１時間
、二次抗体（ビオチン化ヒツジ抗−ウサギＩｇＧ抗体、Ｖｅｃｔｏｒ）中に入れ
た。切片はＰＢＳ中で３回（各々５分間）再度洗浄した。Ｖｅｃｔａ ｓｔａｉ
ｎ ＡＢＣ ｃｏｍｐｌｅｘ（Ｖｅｃｔｏｒ）を１時間該切片に加え、シェーカー
上に置いた。切片をＰＢで３回（各々５分間）再度洗浄し次いで５分間ＰＢで一
度洗浄した。３，３’ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（ＤＡＢ）を
５−１０分間、該切片に注いだ。切片をＰＢ中で２回（各々５分間）洗浄し、該
切片を最後に脱水し、清浄とし、さらに据え付けた。

【００７６】 図４（ａ）と（ｂ）は、ＮＮＧ３系統と、ＮＮＧ３が得られたＡＳ親系統の間
の相違を示す。

【００７７】 ＮＮＧ３系統のプルキンエ細胞中のＰＫＣγ陽性細胞の非常に顕著な減少が、
月齢適合ＡＳコントロールと比較した際に観測された。該プルキンエ細胞層は、
ＰＫＣγが他のＰＫＣイソ型と比べた際に優先的に発現される領域である。

【００７８】 これらの結果は、ＰＫＣＩ型タンパク質のカルボキシ末端部分または全ての損
失と一致する。

【００７９】 （実験４−抗体ハイブリダイゼーションによって抽出したラット脳タンパク質中 のＩ型ＰＫＣのウエスタンブロット検出 ） ウエスタンブロット実験は、ラット系統ＡＳとＮＮＧ３からの脳中のＩ型ＰＫ
Ｃタンパク質の発現のレベルを測定するために行った。特に、ＮＮＧ３系統のＰ
ＫＣγＩ型タンパク質中の切断部位までのカルボキシ末端中に位置したペプチド
に対して生じた抗体が、タンパク質のこの領域の発現の欠損を確認するために用
いられた。

【００８０】 全部の脳タンパク質は、ＡＳとＮＮＢ３系統の両方からオスの９月齢ラットか
ら抽出した。該タンパク質は、ＴＲＩ−ＲＥＡＧＥＮＴ（商標）（Ｓｉｇｍａ）
を用いて脳組織の０．２ｇから単離し、２％ＳＤＳ中に懸濁させた。５０μｇの
全タンパク質は、４５分間、２００Ｖで１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリル
アミドゲル電気泳動）ゲルで分析した。該タンパク質は、３０Ｖで一晩、湿式ウ
エスタンブロッター中、ニトロセルロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ）に移した。該ニトロセルロースは、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｔ
ＢＳＴ）および１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＴｒｉｓ−緩衝化生理
食塩水（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）の溶
液中、室温で１時間ブロック化した。そのニトロセルロースは、２μｇ／ｍｌ抗
ＰＫＣγ（ＰＫＣγのアミノ酸３０６−３１８に一致する合成ペプチドを用いて
生成したウサギ抗−ペプチド抗体、ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を含む、ＴＢＳＴプラス
１％ＢＳＡ中でインキュベートした。次いで該ブロットは、１／１０００の希釈
で、抗−ウサギＩｇ、ペルオキシダーゼ−結合種特異的全抗体（ロバからの、Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を含むＴＢＳＴ中、室温で１時間
インキュベートした。次いで該ブロットを、上記詳述の通り洗浄した。洗浄後、
該ブロットを、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）と共にインキュベートし、次いでオート
ラジオグラフィーフィルム（Ｆｕｊｉ ＸＲ）に露光した。

【００８１】 この実験は、ＮＮＧ３系統とコントロールラット系統（ＡＳ）から抽出したタ
ンパク質で実行した。得られた結果は、図５中に示される。予測したサイズ（８
０ｋＤａ）のバンドがＡＳ系統タンパク質抽出物から得られた一方、ＮＮＧ３系
統タンパク質抽出物においてはシグナルなしの結果を得た。抗−ＰＫＣγ抗体は
、該タンパク質のアミノ酸３０６−３１８に一致するエピトープを認識する。Ｎ
ＮＧ３において、アミノ酸２８１で終結する切断タンパク質が生産されると仮定
される；したがって、これらの結果は、抗体結合用のエピトープが、予測した通
り、 ＮＮＧ３タンパク質中に存在しないことを示す。

【００８２】 （実験５−ＡＳとＮＮＧ３ラットにおいてＰＫＣγｍＲＮＡ転写物のｉｎ ｓｉ
ｔｕハイブリダイゼーション） ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験は、ラット系統ＡＳとＮＮＧ３中
のＩ型ＰＫＣをコードしているｍＲＮＡの発現のレベルを測定するために行った
。

【００８３】 アンチセンスオリゴヌクレオチドプローブは、ＰＫＣγ ＭＲＮＡ（ヌクレオ
チド２０８５−２３２６、番号は図２から採用した）の３’領域で設計し、合成
しかつＨＰＬＣ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）によって精製した。該オリゴヌクレオチド
の配列は以下の通りであった： ５’ＧＣＡ ＣＴＧ ＧＧＡ ＡＣＡ ＣＣＴ ＡＧＣ ＧＧＣ ＡＧＣ ＡＧ
Ａ ＴＧＡ ＧＡＴ ＴＡＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ３’

【００８４】 全部の脳を８月齢のＡＳおよびＮＮＧ３ラットから採取した。これらの脳は、
据え付けし、１３ミクロン切片で水平に切断し、さらに該切片をポリ−Ｌ−リシ
ン処理した顕微鏡スライドガラス上に解凍−据え置きした。次いで該切片を、氷
上で５分間、１×ＰＢＳ（リン酸塩緩衝化生理食塩水、全ての溶液は（ジエチル
ピロ炭酸塩−処理した水で作られた）中４％パラホルムアルデヒド中、続いて２
分間ＰＢＳで固定し、次いで２分間７０％エタノール中、５分間９５％エタノー
ル中で脱水し、必要になるまで４℃で１００％エタノール中で保管した。

【００８５】 ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプローブは標識し、以下の手法でハイ
ブリダイゼーション用に調製した：４０ｎｇのオリゴヌクレオチドは、１×反応
緩衝液（酵素と共に供給される）、２５μＣｉのＳ^３５α−ｄＡＴＰおよび３６
単位のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ，ＦＰＬ
Ｃ ｐｕｒｅ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ)を含むＤＥＰＣ−水で１２．５μｌの反応容
量として標識した。該反応物は３７℃で１時間インキュベートした。精製カラム
は、１ｍｌプラスチックシリンジ、該シリンジの底部にＮｏ．２のコルクボーラ
ーで切断したＧＦ／Ｃ濾紙を配し、かつ該シリンジにＧ５０セファデクッス（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）を充填して構築した。該カラムは、次いでセファデックスを
詰めるため１分間２，０００ｒｐｍで遠心分離した。８７．５μｌのＤＥＰＣ−
処理水を、１００μｌとするために該プローブに加えた。該プローブをカラムに
加え、採取用の１．５ｍｌ遠心チューブ中、２０００ｒｐｍでさらに１分間遠心
分離した。該溶出液を採取し、容量を測定した。該プローブの比活性は、シンチ
レーションバイアル中に溶出したプローブの２μｌを入れることおよびシンチラ
ントの５ｍｌを加えることによって測定した。該プローブの比活性を、トリチウ
ムチャネルを用いてシンチレーションカウンター中で測定した。該プローブは、
２×１０^３毎分崩壊数／ハイブリダイゼーション混合物 ５０％ホルムアミド、
４×ＳＳＣ、１０％デキストラン硫酸、５×Ｄｅｎａｒｄｔ’ｓ、２００μｇ／
ｍｌ酸−アルカリ精製サケ精子ＤＮＡ、１００μｇ／ｍｌ長鎖ポリアデニル酸、
１２０μｇ／ｍｌヘパリン、２５ｍｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７、１ｍｍピロリ
ン酸塩、が生成されるように標準化し、次いでＤＤＴを２０ｍｍの最終濃度まで
加えた。冷オリゴヌクレオチドの１００倍過量もまた、コントロールハイブリダ
イゼーション混合物に加えた。

【００８６】 連続切片は、対−適合させかつ脳全体に広げるようなハイブリダイゼーション
のために選択した。切片は、適当なハイブリダイゼーション混合物の２００μｌ
を塗りパラフィルムカバースリップで覆った。そのスライドは、４２℃で一晩イ
ンキュベートした。翌日、カバースリップを１×ＳＳＣ中、室温で浮上分離し、
さらに切片を３０分間、４ｍＭ ＤＴＴを含む１×ＳＳＣ中、５５℃で撹拌水浴
中で２回洗浄した。次いで切片を、３０秒間１×ＳＳＣ、４５秒間０．１×ＳＳ
Ｃ、次いで２分間７０％エタノールさらに最後に５分間１００％エタノールを経
て脱水した。切片は、次いで空気乾燥させた。一度乾燥した該切片は、３ＭＭ濾
紙にテープ止めし、１週間室温でオートラジオグラフィーフィルム（Ｋｏｄａｋ
Ｂｉｏ−ｍａｘ ＭＲ ｆｉｌｍ，ｓｉｎｇｌｅ ｃｏａｔｅｄ)に感光させた。

【００８７】 ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験の結果は図６中に示される。ＮＮ
Ｇ３系統においてＰＫＣγ ｍＲＮＡのレベルが、ＡＳ系統からの月齢適合コン
トロール脳と比べた場合に変化が生じることが明らかである。

【００８８】 （実験６−ラットとヒトからのＰＫＣγ ｃＤＮＡの単離） 完全長ｃＤＮＡクローンは、ラット系統Ａｌｂｉｎｏ Ｓｗｉｓｓ（ＡＳ）と
ヒトの両方から単離したＲＮＡから、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−Ｐ
ＣＲ）増幅によって、ＰＫＣγ遺伝子を単離した。脳は、断頭後の１２月齢オス
ＡＳラットから取り出し、１ｇの組織を取り出した。全部のＲＮＡは、製造者に
よって提供されたプロトコールに従って、ＴＲＩ ＲＥＡＧＥＮＴ（商標）（Ｓ
ｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ）を用いて組織から単離した。正常な個人
からのヒト脳ＲＮＡは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手した。各々からのＲＮＡ
の１μｇを、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｉｎｃｈｉｎｎａｎ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｐ
ａｒｋ，Ｐａｉｓｌｅｙ）からのＦｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ用のＯｌｉｇｏ （ｄｔ）_{１２−１８}Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉ
ｐｔ（商標） Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いてｃＤ
ＮＡを合成するために用いた。５０ｎｇのｃＤＮＡをＰＣＲ反応における鋳型と
して用いた。全てのＰＣＲ反応は、製造者（Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，Ｈａｍｐ
ｓｈｉｒｅ）の指示に従って、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商
標）−ＨＦ ＰＣＲ ｋｉｔを用いて実行した。完全長ＡＳ ｃＤＮＡは、プライ
マーＮｅｕｐ１１８Ｆ ５’−ＣＣＴ ＴＣＣ ＧＡＴ ＣＴＣ ＡＧＡ ＧＴ
Ｃ ＴＧＣ ＧＧ−３’およびＫ３Ｒ ５’−ＴＴＣ ＴＡＣ ＡＡＣ ＴＧＡ
ＡＧＴ ＧＧＡ ＧＧ−３’を用いて増幅した（ＰＣＲパラメーター：９４℃
１５秒間、９４℃１０秒間と６４℃４分間の２５サイクル、続いて６８℃３分間
）。完全長ヒトｃＤＮＡは、プライマーＮｅｕｐ １４４Ｆ ５’−ＴＧＡ ＴＣ
Ｃ ＴＴＣ ＧＡＧ ＴＣＴ ＣＣＡ ＧＣ−３’およびＮｅｕｐ １４４Ｒ ５
’−ＡＣＧ ＴＴＧ ＧＧＧ ＡＣＡ ＣＣＴ ＡＧＴ ＧＧ−３’を用いて増
幅した（ＰＣＲパラメーター：９４℃１５秒間、９４℃１０秒間と６４℃３分間
の２５サイクル、続いて６８℃３分間）。増幅したフラグメントは、Ｚｅｒｏ
Ｂｌｕｎｔ（登録商標） ＴＯＰＯ（登録商標） ＰＣＲ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉ
ｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＨ Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ
ｓ）を用いてクローンした。

【００８９】 配列解析は、ＰＣＲ増幅の間に何らかのエラーが導入されたかを調査するため
そのクローンについて行った。シークェンシング反応は、ＰＣＲ反応で用いたプ
ライマーの３．２ｐモルの存在中、ＢｉｇＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｋｉ
ｔ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｉｒｃｈｗｏｏｄ ｓｃｉｅｎｃｅ ｐ
ａｒｋ，ウエリントン）を用いて行った。その反応は、以下の通り、Ｐｅｒｋｉ
ｎ Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ
ｌｍｅｒ，Ｂｉｒｃｈｗｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ，ウエリントン）に
おいて行った：９６℃２分間、９４℃１０秒間と５０℃５秒間の２５サイクルお
よび６０℃４分間。シークェンシング反応は、ＡＢＩ ３７３ ｓｔｒｅｔｃｈ
ａｕｔｏｍａｔｉｃ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで分析した。配列データは
Ｓｅｑｅｄソフトウエア（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析した。

【００９０】 配列決定結果は、データベース中に登録された配列と比べた際、ＡＳ配列にお
いて同定された一つの塩基変化があった（ＮＣＢＩ受託番号：Ｘ０７２８７）。
この塩基変化ＣＡＡ−＞ＣＡＧ（塩基２０１，図７）はアミノ酸配列を変化させ
ず、多型を単純に示すことができる。ｍＲＮＡプロテインキナーゼＣガンマと比
べた時、ＡＳ中には存在しないＧもまたある（塩基２２３６）。この塩基欠失は
、停止コドンの後に起こり、かつ種の相違もまた表し得る。

【００９１】 いくつかの相違がＮＣＢＩデータベースに登録された２つの配列と比べた時、
ヒトｃＤＮＡクローンにおいてもまた観測された（表３および図８）が、しかし
再度アミノ酸の変更はなく、かつ多型を示し得る。実際、これらの多型の一つは
Ａｌ−ｍａｇｈｔｈｅｈら（Ａｌ−Ｍａｇｈｔｈｅｈ， Ｍ．，Ｖｉｔｈａｎａ
， Ｅ．Ｎ．，Ｉｎｇｌｅｈｅａｒｎ， Ｃ．Ｆ．，Ｍｏｏｒｅ， Ｔ．，Ｂｉｒ
ｄ, Ａ．Ｃ．とＢｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，Ｓ．Ａ．（１９９８）．２つのＲＰ
１１ファミリーにおけるＰＲＫＣＧ変異の隔離．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６２，１２４８−１２５１），Ａ
ＡＴ１８９ＡＡＣによって以前に記載されていた。データベースに登録された２
つの配列はまた、この塩基で多型であった。

【表３】 表３−塩基変化はＮＣＢＩデータベースに登録された配列と比較した際にヒト
クローン２８内で同定される（受託番号：Ｚ１５１１４、プロテインキナーゼＣ
ガンマ（部分）用のＨ．ｓａｐｉｅｎｓ ｍＲＮＡおよびＭ１３９７７、ヒト（
クローンラムダ−ｈＰＫＣ−ガンマ６）プロテインキナーゼＣ−ガンマ（ＰＲＫ
ＣＧ）。

【００９２】 （実験７： ＮＮＧ３ ＰＫＣγ ｃＤＮＡのクローニング） 完全長ｃＤＮＡのＰＣＲは図られているが、失敗している。したがって、２つの
分離した反応において、ＮＮＧ３ｃＤＮＡの５’および３’末端のＰＣＲ増幅を
行った。

【００９３】 （ｃＤＮＡ末端の５’急速増幅（ＲＡＣＥ）） ＮＮＧ３ラット脳からの全ＲＮＡは、製造者の指示にしたがってＴｒｉ−ｒｅ
ａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて調製した。この全ＲＮＡの１ｍｇを、５’Ｒ
ＡＣＥシステム（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で用いた。該キットで提供されたプロト
コールは、以下の通りであった。遺伝子特異的プライマー１０４Ｒ（５’−CTTA
AACTTGCCCAGTTGCT−３’）をＧＳＰ１として用いた。これはＰＫＣγ ｃＤＮＡ
の塩基１４８０と１５００の間のアンチセンス配列に一致する（図７と９参照）
。ＰＣＲ反応は、１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、５μｌ鋳型ｃＤＮＡ、５μｌ
１０×膨張緩衝液、３μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０μＭ短縮アンカープライ
マー（５’−GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG−３’）の１μｌおよび１
μＭ ＧＳＰ１の１μｌとともに、高い厳密性酵素、Ｅｘｐａｎｄ（Ｒｏｃｈｅ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｌｔｄ，Ｌｅｗｅｓ，ウェストサセックス）の０．
４μｌを用いて行った。以下の条件が、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡ
ｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００を用いてのＰＣＲに利用された：９４℃
で２分間、次いで９４℃１５秒間、５０℃３０秒間および７２℃２分間の３０サ
イクル、最後に７２℃で７分間。

【００９４】 このＰＣＲの生成物はスメアであった。したがって該ＤＮＡはＴ／Ｅ（１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）で１：５００に希釈し、ＰＣ
Ｒの第二ラウンドを行った。上記と同じ反応条件を用いたが、短縮アンカープラ
ーマーを、遺伝子特異的プライマー１１８Ｆ（５’−CCTTCCGATCTCAGACT−３’
）に置き換えた。

【００９５】 延長されたサイズ（１．３ｋＢ）の生成物がＰＣＲのこのラウンドから得られ
、さらにそれをＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標） ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣ
Ｒクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および製造者の指示を用いてベ
クターｐＣＲｂｌｕｎｔＩＩＴＯＰＯ内に直接クローンした。それはＮＮＧ３
５／１２と命名した。

【００９６】 （３’ＲＡＣＥ） ＮＮＧ３ラット脳からの全ＲＮＡは、製造者の指示に従ってＴｒｉ−ｒｅａｇ
ｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて調製した。この全ＲＮＡの１ｍｇを、３’ＲＡＣ
Ｅシステム（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で用いた。該キットで提供されたプロトコー
ルは、以下の通りであった。

【００９７】 ＰＣＲ反応は、上記条件および材料を用いて実行したが、そのプライマーは、
ユニバーサル増幅プライマー（５’−CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTAC−３’
）およびＰＫＣγ ｃＤＮＡの領域７９３乃至８１６塩基（図７と９参照）に一
致する遺伝子特異的プライマー１１３Ｆ（５’−GCTACTCAAGGCTCCTGTGGATGG−３
’）に代えた。

【００９８】 再びこのＰＣＲの生成物はスメアであった。したがって該ＤＮＡはＴ／Ｅで１
：５００に希釈し、ＰＣＲの第２ラウンドを行った。上記と同じ反応条件を用い
たが、ユニバーサル増幅プライマーは、ＰＫＣγ ｃＤＮＡの塩基２０７７と２
０９６（図７と９参照）の間のアンチセンス領域に一致する第２遺伝子特異的プ
ライマー１１４Ｒ（５’−TGAGATTACATGACGGGCACA−３’）に置き換えた。

【００９９】 予期したサイズ（１．３ｋＢ）の生成物がＰＣＲのこのラウンドから得られ、
さらにそれをＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標） ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲ
クローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および製造者の指示を用いてベク
ターｐＣＲｂｌｕｎｔＩＩＴＯＰＯ内に直接クローンした。それはＮＮＧ３ ３
／９と命名した。

【０１００】 ２つのＮＮＧ３クローンは塩基７９７と１３５７間に重複配列を提供する。１
１１２塩基で単一のＢａｍＨＩ制限消化部位を、それ故に２つのフラグメントを
一緒に接合するために用いた。

【０１０１】 ＮＮＧ３ ５／１２とＮＮＧ３ ３／９は、両方のプラスミドから５’ＮＮＧ３
フラグメントを放出するようＨｉｎｄＩＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とＢａｍＨＩ（
Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。ＮＮＧ３ ５’フラグメントは、ＮＮＧ３ ５／１
２消化物から精製し、一方該プラスミドはＮＮＧ３ ３／９消化物から精製した
。アガロースゲル精製は、Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行った。

【０１０２】 ＮＮＧ３ ５／１２から精製したフラグメントは、完全長ＮＮＧ３ ｃＤＮＡを
与えるようＮＮＧ３ ３／９中に連結することができた。該ＤＮＡは、配列をチ
ェックするためおよび変異はＰＣＲによって導入されていないことを確認するた
めに配列決定した。

【０１０３】 ２つのタンパク質は、次いでＳｅｑｅｄソフトウエア（ＰＥ ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ）を用いて翻訳し、かつそれはＮＮＧ３タンパク質がアミノ酸２８０（図
１０参照）で終結されると見なすことができた。

【０１０４】 （実験８−ＰＫＣγのウエスタンブロット） 正常なＡＳラットとＮＮＧ３ラットからの脳タンパク質抽出物は、氷冷０．２
Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．６の２．５ｍｌ中、組織の５００ｍｇをホモ
ジナイズすることにより調製した。該ホモジネートを４℃で１５分間、１０００
ｇで遠心分離した。各々のサンプルからの上清をシリンジで注意深く取り出し、
アリコートで−２０℃で保管した。

【０１０５】 各々のサンプルのタンパク質濃縮物は、ｂｉｃｉｎｃｈｉｎｉｃ ａｃｉｄ
ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて測定した。等量の
サンプル緩衝液（０．０６２５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、２％ドデシル硫酸ナ
トリウム、１０％グリセリン、５％β−メルカプトエタノール、０．００１％ブ
ロモフェノールブルー）を加えた、３０μｇの各々のタンパク質サンプルは、１
０％ポリアクリルアミドゲル（２８．２：０．８ アクリルアミド：ビスアクリ
ルアミド、０．３７５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．８、０．１％ドデシル硫酸ナトリ
ウム）と３％スタッキングゲル（２８．２：０．８ アクリルアミド：ビスアク
リルアミド、０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、０．１％ドデシル硫酸ナト
リウム）にロードした。予備染色したＢｅｎｃｈｍａｒｋタンパク質標準（Ｇｉ
ｂｃｏ ＢＲＬ）を、目的のタンパク質の分子量用の参考を提供するように該タ
ンパク質サンプルと一緒にロードした。ランニング緩衝液（０．０２５Ｍ Ｔｒ
ｉｓ（塩基）、０．１９２Ｍグリシン、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）をｍ
ｉｎｉ−ｇｅｌ装置（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ、Ｈｅｒ
ｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ）に加え、２００Ｖの電圧をＢｉｏｒａｄ Ｐｏｗｅｒ Ｐ
ａｃｋ ３００電気泳動電力供給ユニットを用いて該ゲルに印加した。

【０１０６】 ４５分後、染色前線が該ゲルの底部に到達し、該ゲルの電気泳動が完成したこ
とを示した。装置からゲルをはぎ取り、そのゲルを１枚のＰＶＤＦ膜（Ｒｏｃｈ
ｅ）に対してウエスタンブロッティング装置（Ｂｉｏｒａｄ）に配置した。タン
パク質は、Ｔｏｗｂｉｎ緩衝液（４ｌの容量中に１２．１１ｇ Ｔｒｉｓ（塩基
）、５７．６ｇグリシン、８００ｍｌメタノール、１．２ｍｌ塩酸）を用い、お
よび４０Ｖの電圧を一晩印加して、該膜上に転写した。

【０１０７】 結合したタンパク質と共に、その膜を装置から取り出し、３０分間ブロッキン
グ溶液（ＰＢＳ−Ｔ（８ｇ ＮａＣｌ、０．２ｇ ＫＣｌ、１．４４ｇ Ｎａ_２Ｈ
ＰＯ_４、０．２４ｇＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．４に調節し、０．１％ ｔｗｅｅｎ
８０とともに１ｌとした）中１０％（ｗ／ｖ）乾燥ミルク中に浸漬した。次いで
３０分間の二次洗浄を行った。

【０１０８】 ＰＫＣγに特異的な抗体（エピトープアミノ酸６８４−６９７）（ＲＢＩ，Ｓ
ｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ）は、１：１０００の濃度まで、ブロッキ
ング溶液で希釈し、かつ膜を温和に撹拌しつつ、３時間この中に入れた。インキ
ュベーション後、その膜をブロッキング溶液中で各々の洗浄を１０分間、３回洗
浄した。ブロッキング溶液で１：１０００に希釈した、ウサギ特異的ＨＲＰ−標
識二次抗体にその膜を浸漬し、温和に撹拌しつつ、１時間インキュベーションを
続行した。その膜は、最後にＰＢＳ−Ｔ中で各々の洗浄を１０分間、３回洗浄し
た。

【０１０９】 検出試薬は、等量のＥＣＬ試薬１と２（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて作製した
。その膜をこの中で１分間インキュベートし、サランラップ（Ｄｏｗ，ドイツ）
で包み、Ｘ２プロセッサー（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｒｕ
ｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｄｕｎｍｏｒｅ，エセックス）を用いて現像する前の５分
間、Ｘ線フィルム（コニカ、東京、日本）に露光した。

【０１１０】 図１１中に示したウエスタンブロットは、完全長ＰＫＣγがＮＮＧ３ラットの
脳において発現していなかったことを示す。しかしながら、そのタンパク質の切
断形が発現されるかどうか、またはＰＫＣγがＮＮＧ３ラットの脳から、その完
全な形でかけているかどうかを決定することはできない。

【０１１１】 （実験９−脳において発現させるためのＰＫＣγの微量注入） この研究は、Ｍａｒｔｅｓら（Ｍａｒｔｒｅｓ，Ｍ−Ｐ．，Ｄｅｍｅｎｅｉｘ
，Ｂ．，Ｈａｎｏｕｎ，Ｎ．，Ｈａｍｏｎ，Ｍ．とＧｉｒｏｓ，Ｂ．（１９９８
）．ラット脳中のプラスミドＤＮＡ転移によるドーパミントランスポーターの上
昇および低下発現。Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ，１０，３６０７−３６１６)の中で最初に報告されたプロトコール
に従う。前述したとおり、単離した完全長ＡＳ ｃＤＮＡは、ＨｉｎｄＩＩＩと
ＸｂａＩを用いる制限消化によってＴＯＰＯベクターから取り外し、ｐＲｃ／Ｃ
ＭＶ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローンした。ＤＮＡは、次いで
製造者のプロトコールにしたがって、Ｅｎｄｏｆｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉ
ｇａ ｋｉｔ（Ｑｕａｇｅｎ，Ｃｒａｗｌｅｙ，ウェストサセックス）を用いて
このクローンから単離した。

【０１１２】 ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）２５ｋＤａ，（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐｏｏｌｅ，
Ｄｏｒｓｅｔ）の３電荷当量（１μｇのＤＮＡと１μｌの０．１Ｍ ＰＥＩが３
ｎモルのリン酸と１００ｎモルのアミン窒素にそれぞれ相当することを考慮に入
れる）を１μｇのＤＮＡと合わせ、注射の前３０秒間渦動撹拌した。

【０１１３】 各々の動物は、２：１の割合でベタラー（塩酸ケタミン；１００ｍｇ／ｍｌ；
コードＶＭ １４８５１／４００９ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ Ｌｔ
ｄ，Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｃｒａｗｌｅｙ ＲＨ１０
２ＬＺ）とロンプン（塩酸キシラジン ２％；Ｂａｙｅｒ ｐｌｃ，Ａｎｉｍａｌ
Ｈｅａｌｔｈ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｇｒｏｕｐ，Ｅａｓｔｅｒｎ Ｗａｙ，Ｂｕｒ
ｙ Ｓｔ．Ｅｄｍｕｎｄｓ，Ｓｕｆｆｏｌｋ ＩＰ３２ ７ＡＨ）を用いて麻酔し
た。注射は１．１ｍｌ／ｋｇで腹腔内に与えた。

【０１１４】 完全な麻酔が確立された際に足の屈筋反射の無いことが観測された「パッドピ
ンチング」技術を用いて、深い麻酔は５−１０分後に確立された頭部の小エリア
を電気剃刀を用いて剃った。

【０１１５】 その動物には、定位フレーム（Ｋｏｐｆ，Ｍｕｎｉｃｈ，ドイツ）上のイヤー
バーに配した。頭部はティースバーを用い、かつノーズバーを水平に用い、適所
に保持した。

【０１１６】 切開は円刃刀を用いて行い、皮膚は皮膚レトラクタ（Ｍｅｒｃｋ Ｌｔｄ，Ｈ
ｕｎｔｅｒ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｇｎａ Ｐａｒｋ，Ｌｕｔｔｅｒｗｏｒｔ
ｈ，Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ ＬＥ１７ ４ＸＮ）を用いて頭蓋から引き
離した。頭蓋は、十字縫合が現れるように円刃刀を用いて切断し、そのエリアは
清浄にしかつ綿棒を用いて乾燥した。十字縫合を鉛筆を用いてマークし、十字縫
合座標をとる前に独自に確認した。横および前面後面座標は定位フレームを用い
て測定した。腹面座標はこの点で取らなかった。

【０１１７】 ＰａｘｉｎｏｓとＷａｔｓｏｎ定位脳アトラスを用いて座標を計算し、微量注
入は十字縫合の座標と比べた時、前面／後面（−３．８ｍｍ）、横面（＋１．８
ｍｍ）および腹面（−２．０ｍｍ）で行った。

【０１１８】 ＰＥＩ中にｐＲｃ／ＣＭＶ ＰＫＣγＤＮＡ、ＰＥＩ中に空のｐＲｃ／ＣＭＶ
ベクターまたは生理食塩水のいずれかの２μｌを含んでいる１０μｌハミルトン
ミクロシリンジニードルを、これらの新たな座標に相当する脳のエリアにわたり
直接配置した。これは、鉛筆を用いて再度マークし、かつ独自に確認した。

【０１１９】 ドリルヘッドのチップ（１ｍｍ）を鉛筆マークにわたって配置し、穴を頭蓋に
あけた。そのエリアを綿棒を用いて再度乾燥した。ミクロシリンジニードルを穴
にわたって配置し、ゆっくりとその中に下げた。次いでニードルを計算した腹側
座標に従う適切な深さにまで脳の中に下げた。

【０１２０】 ニードルは２分間その場に放置し、次いで１μｌ溶液を注射した。ニードルは
さらにしばらくその場に放置した。この時点で残る１μｌの溶液を注射した。該
ニードルはゆっくりと抜き去る前さらに２分間その場に放置した。

【０１２１】 その穴は、歯科用セメント（Ｒｅｄｉｆａｓｔ ２５０ｍｌ コード００２３６
３，Ｗｒｉｇｈｔ Ｈｅａｌｔｈ ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ，Ｋｉｎｇｓｗａｙ Ｗ
ｅｓｔ Ｄｕｎｄｅｅ）で封じ、その動物を定位フレームから注意深く取り外し
、切開部は標準綿縫合を用いて閉じた。

【０１２２】 その動物に０．１ｍｌアンチセダン（塩酸アチパメゾール；５ｍｇ／ｍｌ；コ
ードＶＭ００５７／４１１１，Ｐｈｉｚｅｒ Ｌｔｄ；Ｒａｍｓｇａｔｅ Ｒｏ
ａｄ，Ｓａｎｄｗｉｃｈ，Ｋｅｎｔ ＣＴ１３ ９ＬＵ）の皮下注射を与え、さ
らにそのケージ内に戻す前に回復させた。

【０１２３】 該実験は、十字縫合の座標と比べた時、前面／後面（−３．８ｍｍ）、横面（
＋１．８ｍｍ）および腹側（−３．５ｍｍ）の座標での微量注入について繰り返
した。

【０１２４】 （実験１０−動物挙動解析） 各々の動物は、上述したミクロ注入からの悪影響が生じていないことを確認す
るため、手術後２４時間観察した。非−侵襲性運動試験を、さらに２４時間後に
行い、７日まで４８時間毎に繰り返した。３シリーズの試験を第７日で断頭前の
各々の動物で行った。

【０１２５】 選択した試験は傾斜路試験であった。

【０１２６】 （傾斜路試験） 木の６つの厚板を、１０−１２０ｍｍの間の範囲内で用いた。用いた６つの厚
板は、１０，２０，５０，７０，９０および１２０ｍｍを用いた。各々のラット
を各々の厚板上に置き、それのバランスを維持するおよび外れることなしにその
厚板の底を歩くその能力を評価した。これは一度実行した。もしラットがこれを
実行できるなら、１のスコアを与え、もしそれが厚板から外れたら０のスコアを
与えた。これは全ての厚板で繰り返し、ビデオ録画した。

【０１２７】 これら２つの実験は、ＮＮＧ３ラットの脳への野生型ＰＫＣγの導入が、注射
していないその対応動物よりも、より良好な傾斜路試験を行うことをそれらに許
容することを実証する。予備の証拠はそれ故に、ＰＫＣγ発現がパーキンソン病
表現型を調整するための一助となり得ることを示唆する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、以下ｎｎｇ３と記す変異ＰＫＣγ遺伝子を含むインターバルにおける
戻し交雑子孫組換え体のパネルを確立するために用いた組換え物と遺伝子マーカ
ーを含むよう選択したラットゲノムの領域を説明する図である。３つの戻し交雑
（ＢＮ×ＮＮＧ３）Ｆ１×ＮＮＧ３、（Ｆ３４４×ＮＮＧ３）Ｆ１×ＮＮＧ３お
よび（ＤＡ×ＮＮＧ３）Ｆ１×ＮＮＧ３は、それぞれＢＮ，Ｆ３４４およびＤＡ
標識される。

【図２】 図２はラット系統ＮＮＧ３とＡＳ中のＰＫＣγ遺伝子から得られた配列の配列
アライメントである。配列は、ＮＣＢＩから得られたラット（Ｒａｔｔｕｓ ｒ
ａｔｔｕｓ）ｍＲＮＡ配列に整列される（受託番号：Ｘ０７２８７）。ｎｎｇ３
配列内に同定された点変異は、ヌクレオチド８４１で太字と下線で示される。翻
訳開始部位が下線で示され、かつマーカーＲ１５８を定めるミクロサテライト（
３’ＵＴＲの内部）はイタリックで示される。マーカーＲ１５８を定めるプライ
マーは、下線を付して示されさらに矢印によって示される。正常な翻訳停止部位
は、太字と下線中、ヌクレオチド２０９３で示される。

【図３】 図３は、推定したアミノ酸配列と共に図２において示したＰＫＣγＤＮＡ配列
のアライメントである。示した配列は、ラット系統Ｒａｔｔｕｓ ｒａｔｔｕｓ
からのものであり、図２において示した配列中で見られるヌクレオチド変換は、
アミノ酸数２８１の配列の下に太字で与えられる正常な翻訳開始および停止コド
ンは、太字で示される。アミノ酸Ｇｌｕをコードするコドンがポリペプチドター
ミネーターとなる停止コドンへの変異によって変化されるその部位もまた示され
、太字で示される。

【図４】 図４（ａ）と（ｂ）は、抗−ＰＫＣγ抗体でのラット脳の免疫細胞化学染色で
ある。図４（ａ）は、示されたプルキンエ細胞層１０と顆粒細胞層１５を伴った
、ＰＫＣγで染色したＡＳコントロールラット脳を示す。図４（ｂ）は、抗−Ｐ
ＫＣγ抗体で染色したＮＮＧ３ラット脳を示す。

【図５】 図５は、抗−ＰＫＣγ抗体でプローブしたＮＮＧ３とＡＳ系統からの全部の脳
タンパク質のウエスタンブロットを示す。そのレーンマーカー（Ｍ）は、ＢＥＮ
ＣＨＭＡＲＫ(商標)予備染色タンパク質ラダー（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を含み、そ
のバンドのサイズは左側に示される。ＡＳとＮＮＧ３とマークしたレーンは、そ
れぞれＡＳとＮＮＧ３ラット系統からの脳組織から単離したタンパク質を含む；
および。

【図６】 図６は、表記の通り、ラット系統ＮＮＧ３とＡＳにおいてＰＫＣγｍＲＮＡ転
写のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション測定を示す。各々の系統からの脳切
片は連続的であり、全ての切片は同時にプローブした。

【図７】 図７は、ＡＳクローン１７配列（底部）と、ＮＣＢＩデータベースからのラッ
トｍＲＮＡプロテインキナーゼＣガンマ（受託番号：Ｘ０７２８７）からの配列
（頂部）のアライメントを示す。配列間の黒いドットは同一塩基を示す。開始お
よび停止コドンは太字で示される。

【図８】 図８は、ＮＣＢＩデータベース（受託番号：Ｚ１５１１４、プロテインキナー
ゼＣガンマ用のＨ．ｓａｐｉｅｎｓ ｍＲＮＡ(部分的）およびＭ１３９７７、ヒ
ト（クローン ラムダ−ｈＰＫＣ−ガンマ６）プロテインキナーゼＣ−ガンマ（
ＰＲＫＣＧ）から得られた配列にアラインした、ヒトの完全長ｃＤＮＡのクロー
ン（クローン２８）から得られた配列のアライメントを示す。

【図９】 図９は、ラットＰＫＣγ ｃＤＮＡとＮＮＧ３ ｃＤＮＡのＤＮＡ配列の比較で
ある。ラットＰＫＣγ配列は頂部であり、ＮＮＧ３配列は底部である。開始およ
び停止コドンは太字で示される。停止コドン後、塩基１２８１でＮＮＧ３配列中
に塩基エラーがある。

【図１０】 図１０は翻訳したＰＫＣγとＮＧ３ ｃＤＮＡｓのアミノ酸配列の比較である
。ＮＮＧ３配列は頂部に示し一方ラットＰＫＣγ配列は下に示される。

【図１１】 図１１は、ラット脳タンパク質のウエスタンブロットを示す。（一次抗体：１
：１０００の希釈でＲＢＩポリクローナルＰＫＣガンマ、二次抗体希釈：１：１
０００）。

【図１２】 図１２は２つの独立した実験からの傾斜路試験の結果を示す。厚板１は１２０
ｍｍ幅であり、厚板２は１００ｍｍであり、厚板３は７０ｍｍ幅であり、厚板４
は５０ｍｍ幅であり、厚板５は２０ｍｍ幅であり、厚板６は１０ｍｍ幅である。
コントロール動物は、非−注射とした。該ベクター動物は、挿入なしでｐＲｃＣ
ＭＶ２を与えた。ＤＮＡはｐＲｃＣＭＶ２中にｒａｔＰＫＣγの注射を参照する
。ベクターまたはＤＮＡの１μｇが、表示通り、１：１００または１：１０００
のいずれかのチャージ比でＰＥＩに送達された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 21/00 Ａ６１Ｐ 25/00 ４Ｃ０８５ 25/00 25/14 ４Ｃ０８６ 25/14 25/16 ４Ｈ０４５ 25/16 25/28 25/28 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/573 Ａ 33/50 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/573 Ａ６１Ｋ 37/52 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 デイヴィス、 ロジャー ウエイン イギリス国 ジー11 ６エヌユー グラス ゴウ ダンバートン ロード 54、 アン ダーソン カレッジ、 ディヴィジョン オブ マレキュラー ジェネティクス、 インスティテュート オブ バイオメディ カル アンド ライフ サイエンスィズ、 ユニヴァースティ オブ グラスゴウ (72)発明者 ペイン、 アンソニー フィリップ イギリス国 ジー12 ８キューキュー グ ラスゴウ ユニヴァースティ アヴェニュ ー、 ウエスト メディカル ビルディン グ、 インスティテュート オブ バイオ メディカル アンド ライフ サイエンス ィズ、 ユニヴァースティ オブ グラス ゴウ （番地なし) (72)発明者 サトクリフ、 ロジャー グレアム イギリス国 ジー11 ６エヌユー グラス ゴウ ダンバートン ロード 54、 アン ダーソン カレッジ、 ディヴィジョン オブ マレキュラー ジェネティクス、 インスティテュート オブ バイオメディ カル アンド ライフ サイエンスィズ、 ユニヴァースティ オブ グラスゴウ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA36 FB01 FB03 4B024 AA01 AA11 BA10 CA04 CA06 HA12 HA15 4B063 QA19 QQ08 QQ44 QQ53 QR08 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01 DA13 4C084 AA02 AA13 BA03 CA53 DC25 ZA01 ZA02 ZA16 ZA94 4C085 AA13 AA14 EE01 4C086 EA16 ZA01 ZA02 ZA15 ZA16 4H045 AA11 AA30 CA45 DA76 DA89 EA21 EA50 FA72

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 神経変性疾患の治療のための薬剤の製造における、プロテイ
   ンキナーゼＣのＩ型サブタイプをコードしているＰＫＣγ遺伝子を含むポリヌク
   レオチドフラグメントの使用。
2. 【請求項２】 薬剤が哺乳動物を治療するために使用される請求項１に記載
   のポリヌクレオチドフラグメントの使用。
3. 【請求項３】 薬剤がヒトの治療のために使用される請求項１に記載のポリ
   ヌクレオチドフラグメントの使用。
4. 【請求項４】 神経変性疾患が中枢神経系の変性疾患である、前の請求項い
   ずれかに記載のポリヌクレオチドフラグメントの使用。
5. 【請求項５】 中枢神経系の変性疾患がアルツハイマー病である、請求項４
   に記載のポリヌクレオチドフラグメントの使用。
6. 【請求項６】 中枢神経系の変性疾患がドーパミン作動性細胞変性と関連す
   る、請求項４に記載のポリヌクレオチドフラグメントの使用。
7. 【請求項７】 中枢神経系の変性疾患が運動機能障害と関連する神経変性疾
   患である、請求項４に記載のポリヌクレオチドフラグメントの使用。
8. 【請求項８】 神経変性疾患がパーキンソン病、ハンチントン病／舞踏病、
   レビ小体による痴呆、多発性全身萎縮、進行性核上性麻痺、皮質性基底神経節（
   大脳皮質基底核）変性、血管性パーキンソン病およびバリスムを含む群から選択
   される、請求項６または７のいずれかに記載のポリヌクレオチドフラグメントの
   使用。
9. 【請求項９】 神経変性疾患の治療のための薬剤の製造におけるプロテイン
   キナーゼＣＩ型を含むポリペプチドの使用。
10. 【請求項１０】 薬剤が哺乳動物の治療のために使用される、請求項９に記
    載のポリペプチドの使用。
11. 【請求項１１】 薬剤がヒトの治療のために使用される、請求項９に記載の
    ポリペプチドの使用。
12. 【請求項１２】 神経変性疾患が中枢神経系の変性疾患である、請求項９〜
    １１のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
13. 【請求項１３】 中枢神経系の変性疾患がアルツハイマー病である、請求項
    １２に記載のポリペプチドの使用。
14. 【請求項１４】 中枢神経系の変性疾患がドーパミン作動性細胞変性と関連
    する、請求項１２に記載のポリペプチドの使用。
15. 【請求項１５】 中枢神経系の変性疾患が運動障害と関連する神経変性疾患
    である、請求項１２に記載のポリペプチドの使用。
16. 【請求項１６】 神経変性疾患がパーキンソン病、ハンチントン病／舞踏病
    、レビ小体による痴呆、多発性全身萎縮、進行性核上性麻痺、皮質性基底神経節
    （大脳皮質基底核）変性、血管性パーキンソン症候群およびバリスムを含む群か
    ら選択される、請求項１４または１５に記載のポリペプチドの使用。
17. 【請求項１７】 ポリペプチドが合成物である、請求項９〜１６のいずれか
    に記載のポリペプチドの使用。
18. 【請求項１８】 ＰＫＣγ遺伝子またはそれと関連したプロモーターにおけ
    る変異の存在を検出することを含む、神経変性疾患を有すると思われる動物の試
    験方法。
19. 【請求項１９】 ＰＫＣγ遺伝子またはそれと関連したプロモーターにおけ
    る変異の存在を検出することを含む、神経変性疾患を有する傾向にあると思われ
    る動物の試験方法。
20. 【請求項２０】 動物が哺乳動物である、請求項１８または１９に記載の方
    法。
21. 【請求項２１】 哺乳動物がヒトである、請求項２０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 神経変性疾患が中枢神経系の変性疾患である、請求項１８
    または１９のいずれかに記載の方法。
23. 【請求項２３】 中枢神経系の変性疾患がアルツハイマー病である、請求項
    ２２に記載の方法。
24. 【請求項２４】 中枢神経系の変性疾患がドーパミン作動性細胞変性と関連
    する、請求項２２に記載の方法。
25. 【請求項２５】 中枢神経系の変性疾患が運動障害と関連する神経変性疾患
    である、請求項２２に記載の方法。
26. 【請求項２６】 神経変性疾患がパーキンソン病、ハンチントン病／舞踏病
    、レビ小体による痴呆、多発性全身萎縮、進行性核上性麻痺、皮質性基底神経節
    （大脳皮質基底核）変性、血管性パーキンソン症候群およびバリスムを含む群か
    ら選択される、請求項２４または２５に記載の方法。
27. 【請求項２７】 変異が、生産されているＰＫＣγ遺伝子からの切断生産物
    をもたらす、請求項１８または１９に記載の方法。
28. 【請求項２８】 変異が該遺伝子の５’半分で生じる、請求項２７に記載の
    方法。
29. 【請求項２９】 変異が、ラットＰＫＣγ遺伝子の位置８４１、または別の
    種からのＰＫＣγ遺伝子の類似した領域での点変異である、請求項２８に記載の
    方法。
30. 【請求項３０】 ＰＫＣγ遺伝子中の変異の存在の検出が、ｍＲＮＡ転写ま
    たはｍＲＮＡ前駆体のレベル変化を検出することによって達成される、請求項１
    ８または１９に記載の方法。
31. 【請求項３１】 ＰＫＣγ遺伝子中の変異が、切断ＰＫＣＩ型ポリペプチド
    に対して生じた抗体を用いて検出される、請求項１８または１９に記載の方法。
32. 【請求項３２】 動物モデルの製造のために神経系変性を促進するための、
    切断ＰＫＣγポリヌクレオチドフラグメントの使用。
33. 【請求項３３】 動物モデルの製造のために神経系変性を促進するための、
    制限ＰＫＣＩ型ポリヌクレオチドの使用。
34. 【請求項３４】 神経系の変性を予防、遅延、治療または阻害するための、
    ＰＫＣＩ型ポリペプチドをコードしているＰＫＣγポリヌクレオチドフラグメン
    トの使用。
35. 【請求項３５】 神経系の変性を予防、遅延、治療または阻害するための、
    ＰＫＣＩ型ポリペプチドの使用。
36. 【請求項３６】 遺伝子治療における使用のための、ＰＫＣＩ型ポリペプチ
    ドをコードしているポリヌクレオチドフラグメント。
37. 【請求項３７】 神経変性疾患の治療における使用のための化合物同定のた
    めの、ＰＫＣγＩ型ポリペプチドの使用。
38. 【請求項３８】 ＰＫＣγ遺伝子から生産された切断ポリペプチド上に配置
    されたエピトープに特異的な抗体。
39. 【請求項３９】 エピトープがＰＫＣＩ型ポリペプチドのＣ末端半分中に配
    置される、請求項３８に記載の抗体。
40. 【請求項４０】 ポリペプチドのＣ末端半分が、天然ポリペプチドのアミノ
    酸数２８２で始まりＣ末端で終わる、請求項４２に記載の抗体。
41. 【請求項４１】 抗体がモノクローナル抗体である、請求項３８〜４０のい
    ずれかに記載の抗体。
42. 【請求項４２】 モノクローナル抗体がヒト化されている、請求項４１に記
    載のモノクローナル抗体。
43. 【請求項４３】 神経系の変性を予防、遅延、治療または阻害するための薬
    剤の製造における、請求項３８〜４２のいずれかに記載の抗体の使用。
44. 【請求項４４】 神経変性疾患を有する、または有する傾向にあると思われ
    るヒトを試験するための診断アッセイにおける、請求項３８〜４２のいずれかに
    記載の抗体の使用。