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JP2003509465A - ペプチドおよび核酸組成物を使用する、ｃ型肝炎ウイルスに対する細胞性免疫応答の誘導 - Google Patents

ペプチドおよび核酸組成物を使用する、ｃ型肝炎ウイルスに対する細胞性免疫応答の誘導

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JP2003509465A
JP2003509465A JP2001524613A JP2001524613A JP2003509465A JP 2003509465 A JP2003509465 A JP 2003509465A JP 2001524613 A JP2001524613 A JP 2001524613A JP 2001524613 A JP2001524613 A JP 2001524613A JP 2003509465 A JP2003509465 A JP 2003509465A
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JP
Japan
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peptide
hla
epitopes
peptides
epitope
Prior art date
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Pending
Application number
JP2001524613A
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English (en)
Inventor
アレッサンドロ セッテ，
ジョン シドニー，
スコット サウスウッド，
ブライアン ディー． リビングストン，
ロバート チェスナット，
デニス マリー ベイカー，
エステバン セリス，
ラルフ ティー． クボ，
ホワード エム． グレイ，
Original Assignee
エピミューン， インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by エピミューン， インコーポレイテッド filed Critical エピミューン， インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＨＣＶエピトープを同定および調製するために、ならびにＨＣＶに対して指向されるエピトープベースのワクチンを開発するために、抗原がＴ細胞によって認識される機構についての本発明者らの知識を使用する。より詳細には、本出願は、薬学的組成物、ならびにＨＣＶ感染の予防および処置における使用の方法についての本発明者らの発見を伝達する。本発明はまた、既知のＨＬＡ型を有する患者におけるＨＣＶへの免疫応答をモニタリングまたは評価するための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （連邦政府によって援助された研究および開発） 本発明は、一部、国立衛生研究所の助成の下で米国政府によって資金援助され
た。米国政府は、本発明の特定の権利を有する。
【０００２】 （索引） Ｉ． 発明の背景 ＩＩ． 発明の要旨 ＩＩＩ．図面の簡単な説明 ＩＶ． 発明の詳細な説明 Ａ．定義 Ｂ．ＣＴＬ応答およびＨＴＬ応答の刺激 Ｃ．ＨＬＡ分子に対するペプチドエピトープの結合親和性 Ｄ．ペプチドエピトープ結合モチーフおよびスーパーモチーフ（Ｓｕｐｅ
ｒｍｏｔｉｆ） １．ＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフ ２．ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ ３．ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ ４．ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフ ５．ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ ６．ＨＬＡ−Ｂ２７スーパーモチーフ ７．ＨＬＡ−Ｂ４４スーパーモチーフ ８．ＨＬＡ−Ｂ５８スーパーモチーフ ９．ＨＬＡ−Ｂ６２スーパーモチーフ １０．ＨＬＡ−Ａ１モチーフ １１．ＨＬＡ−Ａ２．１モチーフ １２．ＨＬＡ−Ａ３モチーフ １３．ＨＬＡ−Ａ１１モチーフ １４．ＨＬＡ−Ａ２４モチーフ １５．ＨＬＡ−ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフ １６．ＨＬＡ−ＤＲ３モチーフ Ｅ．ワクチンの増大する集団適用範囲 Ｆ．免疫応答刺激ペプチドエピトープアナログ Ｇ．スーパーモチーフまたはモチーフを含有するエピトープについての、
疾患関連抗原由来のタンパク質配列のコンピュータスクリーニング Ｈ．ペプチドエピトープの調製 Ｉ．Ｔ細胞応答を検出するためのアッセイ Ｊ．免疫応答を評価するためのペプチドエピトープの使用 Ｋ．ワクチン組成物 １．ミニ遺伝子ワクチン ２．ＣＴＬペプチドとヘルパーペプチドとの組合わせ Ｌ．治療目的または予防目的のためのワクチンの投与 Ｍ．キット Ｖ． 実施例 ＶＩ． 特許請求の範囲 ＶＩＩ．要約。
【０００３】 （Ｉ．発明の背景） Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、世界的なヒトの健康上の問題であり、米
国単独で毎年新たに約１５０，０００件の報告事例がある。ＨＣＶは、一本鎖Ｒ
ＮＡウイルスであり、そして輸血後および移植後の非Ａ型、非Ｂ型の肝炎のほと
んどの場合に同定される病因因子であり、そして急性散発性肝炎の共通の原因で
ある（Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：３５９，１９８９；Ｋｕｏら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４４：３６２，１９８９；およびＡｌｔｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｎ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，ｐ．８３，１９８
９）。ＨＣＶに感染した患者の５０％より多くが、慢性的感染となり、そしてそ
のうち２０％が２０年以内に肝硬変を発症することが推定される（Ｄａｖｉｓら
、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：１５０１，１９８９；Ａｌｔｅｒら
、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｎ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，ｐ
．８３，１９８９；Ａｌｔｅｒら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：１
８９９，１９９２；およびＤｉｅｎｓｔａｇ，Ｊ．Ｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒ
ｏｌｏｇｙ ８５：４３０，１９８３）。さらに、ＨＣＶ感染の処置に利用可能
な唯一の治療は、インターフェロン−αである。ほとんどの患者は非応答性であ
るが、応答者の間では、処置の停止の６〜１２ヶ月以内の高い再発率が存在する
（Ｌｉａｎｇら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．４０：６９，１９９３）。リバビロ
ン（ｒｉｂａｖｉｒｏｎ）（多くのＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスに対し
て広い範囲の活性を有するグアノシンアナログ）は、インターフェロン−αと組
合わせて使用される場合、臨床試行において、慢性ＨＣＶ感染に対して有効であ
ることが示されてきた（例えば、Ｐｏｙｎａｒｄら、Ｌａｎｃｅｔ ３５２：１
４２６−１４３２，１９９８；Ｒｅｉｃｈａｒｄら、Ｌａｎｃｅｔ ３５１：８
３−８７，１９９８を参照のこと）。しかし、応答速度はまだはるかに５０％未
満である。
【０００４】 ウイルス特異的な、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ制限の細胞傷害性Ｔリ
ンパ球（ＣＴＬ）は、インビボのウイルス感染の防止およびクリアランスにおい
て主要な役割を果たすことが公知である（Ｏｌｄｓｔｏｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ
３２１：２３９，１９８９；Ｊａｍｉｅｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３９
３０，１９８７；Ｙａｐら、Ｎａｔｕｒｅ ２７３：２３８，１９７８；Ｌｕｋ
ａｃｈｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：８１４，１９９４；ＭｃＭｉｃｈ
ａｅｌら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０９：１３，１９８３；Ｓｅｔｈｉら
、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６４：４４３，１９８３；Ｗａｔａｒｉら、Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．１６５：４５９，１９８７；Ｙａｓｕｋａｗａら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１４３：２０５１，１９８９；Ｔｉｇｇｅｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６
：１６２２，１９９３；Ｒｅｄｄｅｎｈａｓｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５５：２６
３，１９８５；Ｑｕｉｎｎａｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０７：６，１
９８２）。ＨＬＡクラスＩ分子は、ほとんど全ての有核細胞の表面上で発現する
。抗原の細胞内プロセシングに続いて、抗原由来のエピトープは、このような細
胞の表面上のＨＬＡクラスＩの分子との複合体として提示される。ＣＴＬは、ペ
プチド−ＨＬＡクラスＩ複合体を認識し、次いでこれは、ＣＴＬによって直接的
にか、そして／またはウイルスの複製を阻害する非破壊的機構（例えば、インタ
ーフェロンの産生）の活性化を介して、ＨＬＡ−ペプチド複合体を有する細胞の
破壊をもたらす。
【０００５】 ＨＣＶ感染で観察される異種免疫応答を考慮すると、複数のＨＣＶエピトープ
に対して同時に指向される多重特異的な細胞性免疫応答の誘導は、ＨＣＶに対す
る有効なワクチンの開発のために重要であると思われる。しかし、ＨＣＶ感染を
清澄する患者に見られる応答に対応する免疫応答を誘発する、ワクチンの実施形
態を確立する必要性が存在する。
【０００６】 この節において提供される情報は、本出願の出願日のこの分野の現在理解され
ている状況として開示されることが意図される。本出願の優先日の後に作製され
た情報が、この節に含まれる。従って、この節の情報は、いずれにしても本発明
の優先日を線引きするようには意図されない。
【０００７】 （ＩＩ．発明の要旨） 本発明は、例えば、ＨＣＶに対して指向されるエピトープベースのワクチンを
開発するために、抗原がＴ細胞に認識される機構についての本発明者らの知識を
適用する。より詳細には、本出願は、特定のエピトープ薬学的組成物ならびにＨ
ＣＶ感染の防止および処置における使用方法についての、本発明者らの発見を伝
達する。
【０００８】 適切な技術の開発の際に、エピトープベースのワクチンの使用は、特に、ワク
チン組成物における抗原全体の使用と比較したときに、現在のワクチンを超えた
いくつかの利点を有する。抗原全体に対する免疫応答は、抗原の可変領域に対し
て大部分が指向され、変異に起因する免疫の逸脱を可能にするという証拠が存在
する。エピトープベースのワクチン中に封入するためのエピトープは、ウイルス
または腫瘍関連抗原の保存領域から選択され、これによって逸脱変異体の可能性
が減少する。さらに、抗原全体に存在し得る免疫抑制性エピトープは、エピトー
プベースのワクチンの使用で回避され得る。
【０００９】 エピトープベースのワクチンアプローチのさらなる利点は、選択されるエピト
ープ（ＣＴＬおよびＨＴＬ）を組合わせる能力であり、そしてさらに、例えば、
増大した免疫原性を達成するエピトープの組成を改変する能力である。従って、
免疫応答は、適切な場合、標的疾患のために調節され得る。応答の同様の操作は
、従来のアプローチを用いては可能ではない。
【００１０】 エピトープベースの免疫刺激ワクチンの別の主要な利点は、その安全性である
。感染性因子またはタンパク質抗原全体（これは、それ自身の固有の生物学的活
性を有し得る）によって生じる、起こり得る病理学的な副作用が、排除される。
【００１１】 エピトープベースのワクチンはまた、同じ病原由来の複数の選択された抗原に
対する免疫応答を指向し、そしてこれに焦点を合わせる能力を提供する。従って
、特定の病原に対する免疫応答における患者間の可変性は、ワクチン組成物中の
病原から、複数の抗原由来のエピトープを包含することによって軽減され得る。
「病原」は、感染性因子または腫瘍関連分子であり得る。
【００１２】 しかし、広範に有効なエピトープベースの免疫療法の開発の最も手強い障壁の
１つは、ＨＬＡ分子の極度の多型性である。現在まで、集団の遺伝的に偏りのな
い有効な適用範囲は、かなりの複雑さの課題である；このような適用範囲は、各
個々のＨＬＡ対立遺伝子と対応するＨＬＡ分子に特異的であるエピトープが使用
されることを必要とし、その結果、民族的に多様な集団を網羅するために実施不
可能に多数のエピトープが使用されなければならない。従って、エピトープベー
スのワクチンにおける使用のために複数のＨＬＡ抗原分子によって結合されるペ
プチドエピトープの必要性が存在する。多数のＨＬＡ抗原分子が結合すればする
ほど、ワクチンによる集団適用範囲の幅が大きくなる。
【００１３】 さらに、本明細書中でより詳細に記載するように、ペプチド結合特性を調節す
る（例えば、複数のＨＬＡ抗原に結合し得るペプチドが、免疫応答を刺激する親
和性で結合するように）必要性が存在する。免疫原性と相関する親和性で１つ以
上のＨＬＡ対立遺伝子によって制限されたエピトープの同定は、集団適用範囲を
通して提供するため、そして集団の多様なセグメントにおける感染を防止または
清澄するために十分な効力の応答の誘発を可能にするために重要である。このよ
うな応答はまた、エピトープの広範な配列を標的化し得る。本明細書中に開示さ
れる技術は、このような好ましい免疫応答について提供される。
【００１４】 好ましい実施形態において、本発明のワクチン組成物に包含するためのエピト
ープは、既知の抗原のタンパク質配列がモチーフを有するエピトープまたはスー
パーモチーフを有するエピトープの存在について評価されるプロセスによって選
択される。次いで、モチーフを有するエピトープまたはスーパーモチーフを有す
るエピトープに対応するペプチドは、合成され、そして選択されるモチーフを認
識するＨＬＡ分子に結合する能力についてについて試験される。中程度または高
い親和性（すなわち、ＨＬＡクラスＩ分子について５００ｎＭ以下、あるいはＨ
ＬＡクラスＩＩ分子について１０００ｎＭ以下のＩＣ50（またはＫD値））で結
合するこれらのペプチドは、ＣＴＬまたはＨＴＬ応答を誘導するその能力につい
てさらに評価される。免疫原性ペプチドエピトープは、ワクチン組成物に包含す
るために選択される。
【００１５】 スーパーモチーフを有するペプチドは、ＨＬＡスーパータイプファミリー内の
複数の対立遺伝子に結合する能力についてさらに試験され得る。さらに、ペプチ
ドエピトープは、結合親和性および／またはＨＬＡスーパータイプ内の複数の対
立遺伝子に結合する能力を改変するためにアナログ化（ａｎａｌｏｇｕｅｄ）さ
れ得る。
【００１６】 本発明はまた、既知のＨＬＡ型を有する患者におけるＨＣＶへの免疫応答をモ
ニタリングまたは評価するための方法を含む実施形態を含み、この方法は、患者
由来のＴリンパ球サンプルを、本質的に表ＶＩＩ〜表ＸＸまたは表ＸＸＩＩに記
載されるアミノ酸配列からなるＨＣＶエピトープ（これは、この患者に存在する
少なくとも１つのＨＬＡ対立遺伝子の産物に結合する）を含むペプチド組成物と
共にインキュベートする工程、およびこのペプチドに結合するＴリンパ球の存在
を検出する工程を包含する。ＣＴＬペプチドエピトープは、例えばテトラマー複
合体を含み得る。
【００１７】 本発明に従うペプチドエピトープを定義するための代替的様式は、長さ；一次
構造；または荷電のような物理的性質（これらは、特定の対立遺伝子特異的ＨＬ
Ａ分子または対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子の群への結合と相関する）を列挙する
ことである。ペプチドエピトープを定義するためのさらなる様式は、ＨＬＡ結合
ポケットの物理的特性、またはいくつかの対立遺伝子特異的ＨＬＡ結合ポケット
によって共有される特性（例えば、ポケットの配置および電荷分布）を列挙する
こと、ならびにペプチドエピトープが、このポケットに一致および結合すること
を説明することである。
【００１８】 以下の議論から明らかなように、他の方法および実施形態もまた意図される。
さらに、本明細書中に記載されるいずれかの方法によって生成される新規な合成
ペプチドもまた、本発明の一部である。
【００１９】 （ＩＩＩ．図面の簡単な説明） 図１は、平均集団における、ＨＬＡ−ＡおよびＢ分子により結合したＨＣＶ候
補エピトープの数の関数としての遺伝子型の総頻度のグラフを提供する。
【００２０】 図２は、実験モデルのミニ遺伝子構築物中のペプチドエピトープの位置を示す
。
【００２１】 （ＩＶ．発明の詳細な説明） 本発明のペプチドエピトープおよび対応する核酸組成物は、ＣＴＬまたはＨＴ
Ｌ応答の生成を刺激することによって、ＨＣＶに対する免疫応答を刺激するため
に有用である。このペプチドエピトープ（ネイティブなＨＣＶアミノ酸配列から
直接的または間接的に誘導される）は、ＨＬＡ分子に結合し得、そしてＨＣＶに
対する免疫応答を刺激し得る。ＨＣＶおよびその改変体由来の完全なポリタンパ
ク質配列は、Ｇｅｎｂａｎｋから得られ得る。ペプチドエピトープおよびそれら
のアナログはまた、以下に提供される開示から明らかであるように、その後にこ
れまで未知のＨＣＶの改変体について発見され得る配列情報から容易に決定され
得る。
【００２２】 本発明のペプチドエピトープは、以下に議論されるように多くの方法において
同定されてきた。アナログペプチドを誘導し、そしてＨＬＡ分子についての結合
活性が、改変された免疫原性を示すペプチドアナログを作製するために特定のア
ミノ酸残基を改変することによって調節されることもまた、詳細に議論される。
さらに、本発明は、種々の遺伝的対立遺伝子によりコードされるＨＬＡ分子と相
互作用し得るエピトープベースのワクチンがこれまでのワクチンより広い範囲の
集団を提供することを可能にする、組成物および組成物の組合わせを提供する。
【００２３】 （ＩＶ．Ａ．定義） 本発明は、以下の定義に対する言及とともに、より効果的に理解され得る（定
義をアルファベット順に列挙する）。
【００２４】 「コンピューター」または「コンピューターシステム」は、一般に以下を備え
る：プロセッサ；少なくとも１つの情報格納／検索装置（例えば、ハードドライ
ブ、ディスクドライブまたはテープドライブのような）；少なくとも１つの入力
装置（例えば、キーボード、マウス、タッチスクリーンまたはマイクロフォン）
；およびディスプレイ構造。さらに、コンピューターは、ネットワークとつなが
った通信路を備える。このようなコンピューターは、多かれ少なかれ、上に列挙
したものを含み得る。
【００２５】 「交差反応性結合」は、ペプチドが１つより多いＨＬＡ分子により結合される
ことを示す；類義語は、変性結合（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）で
ある。
【００２６】 「潜在エピトープ」は、単離されたペプチドで免疫されることにより応答を誘
発するが、この応答は、このエピトープを含むインタクトな完全なタンパク質が
抗原として使用される場合、インビトロで交差反応性でない。
【００２７】 「優性エピトープ」は、完全なネイティブな抗原で免疫する際に免疫応答を誘
導するエピトープである（例えば、Ｓｅｒｃａｒｚら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１１：７２９−７６６，１９９３を参照のこと）。このような応答
は、単離されたペプチドエピトープとインビトロで交差反応性である。
【００２８】 特定のアミノ酸配列に関して、「エピトープ」は、特定の免疫グロブリンによ
る認識に関与するアミノ酸残基のセット、またはＴ細胞の状況において、Ｔ細胞
レセプタータンパク質および／または主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）レセ
プターによる認識に必要なアミノ酸残基のセットである。免疫系の状況において
、インビボまたはインビトロで、エピトープは、免疫グロブリン、Ｔ細胞レセプ
ターまたはＨＬＡ分子により認識される部位をともに形成する分子の集団的な特
色（例えば、一次ペプチド構造、二次ペプチド構造および三次ペプチド構造、な
らびに電荷）である。この開示を通して、エピトープおよびペプチドは、しばし
ば交換可能に用いられる。
【００２９】 本発明のエピトープおよびさらなるアミノ酸を含むタンパク質またはペプチド
分子は、なお本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。特定の実施形
態において、本発明のペプチドの長さに対しては制限がある（さもなければ、構
築物ではない）。長さが制限された実施形態は、本発明のエピトープを含むタン
パク質／ペプチドがネイティブな配列と１００％同一性を有する領域（すなわち
、連続した一続きのアミノ酸）を含む場合に起こる。例えば、完全な天然の分子
に対する解釈（ｒｅａｄｉｎｇ）からエピトープの規定を避けるために、ネイテ
ィブなペプチド配列と１００％同一性を有する任意の領域の長さに対しては制限
がある。従って、本発明のエピトープを含むペプチドおよびネイティブなペプチ
ド配列と１００％同一性を有する領域（さもなければ、構築物ではない）につい
て、ネイティブな配列に対して１００％同一性を有する領域は、一般に以下の長
さを有する：６００アミノ酸以下、しばしば５００アミノ酸以下、しばしば４０
０アミノ酸以下、しばしば２５０アミノ酸以下、しばしば１００アミノ酸以下、
しばしば８５アミノ酸以下、しばしば７５アミノ酸以下、しばしば６５アミノ酸
以下、およびしばしば５０アミノ酸以下。特定の実施形態において、本発明の「
エピトープ」は、５アミノ酸に至るまでの任意の増分（４９、４８、４７、４６
、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４
、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２
、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０
、９、８、７、６、５）において、ネイティブなペプチド配列に対して１００％
同一性を有する５１アミノ酸未満の領域を有するペプチドにより含まれる。
【００３０】 従って、６００アミノ酸より長いペプチドまたはタンパク質配列は、それらが
ネイティブなペプチド配列と１００％同一性を有する６００アミノ酸を超える任
意の連続する配列を含まない（さもなければ、構築物ではない）限り、本発明の
範囲内にある。ネイティブな配列に対応する５つ以下の連続する残基を有する任
意のペプチドについては、本発明の範囲内に入れるために、そのペプチドの最大
長さに対する制限はない。ＣＴＬエピトープが、８アミノ酸残基に至るまでの任
意の増分において６００残基長未満であることは現在好ましい。
【００３１】 「ヒト白血球抗原」または「ＨＬＡ」は、ヒトクラスＩまたはクラスＩＩの主
要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質である（例えば、Ｓｔｉｔｅｓら
，ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，第８版，Ｌａｎｇｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｓ
Ａｌｔｏｓ，ＣＡ（１９９４）を参照のこと）。
【００３２】 「ＨＬＡスーパータイプまたはファミリー」は、本明細書中で使用される場合
、共有されたペプチド結合特異性に基づいて分類されるＨＬＡ分子のセットを記
載する。特定のアミノ酸モチーフを有するペプチドに対していくらかの類似した
結合親和性を共有するＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡスーパータイプに分類され
る。用語ＨＬＡスーパーファミリー、ＨＬＡスーパータイプファミリー、ＨＬＡ
ファミリー、およびＨＬＡｘｘ様スーパータイプ分子（ここで、ｘｘは、特定の
ＨＬＡ型を示す）は、類義語である。
【００３３】 本開示全体を通して、結果は「ＩＣ50」によって表される。ＩＣ50は、参照ペ
プチドの結合の５０％阻害が観察される、結合アッセイにおけるペプチド濃度で
ある。このアッセイが行われる条件（すなわち、制限されたＨＬＡタンパク質お
よび標識ペプチド濃度）が与えられると、これらの値は、ＫD値に近似する。結
合を決定するためのアッセイは、以下に詳細に記載される（例えば、ＰＣＴ公開
ＷＯ９４／２０１２７およびＷＯ９４／０３２０５）。ＩＣ50値は、アッセイ条
件が変化する場合、しばしば劇的に変化し得、そして使用される特定の試薬（例
えば、ＨＬＡの調製物など）に依存することは注意すべきである。例えば、過剰
な濃度のＨＬＡ分子は、所定のリガンドの見かけの測定されたＩＣ50を増大させ
る。
【００３４】 あるいは、結合は、参照ペプチドに対して表される。特定のアッセイがより感
度が高くなるか、またはより感度が低くなる場合、試験されたペプチドのＩＣ50 はいくらか変化し得るが、参照ペプチドに対する結合は、有意には変化しない。
例えば、参照ペプチドのＩＣ50が１０倍増大する条件下でのアッセイ実施におい
て、試験ペプチドのＩＣ50値はまた、約１０倍シフトする。従って、曖昧さを回
避するために、ペプチドが良好か、中程度か、弱いか、またはネガティブなバイ
ンダーである否かの評価は、一般に、標準的なペプチドのＩＣ50に対するそのＩ
Ｃ50に基づく。
【００３５】 結合はまた、他のアッセイ系を用いて決定され得る。これらのアッセイ系とし
ては、以下を用いるものが挙げられる：生細胞（例えば、Ｃｅｐｐｅｌｌｉｎｉ
ら，Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３９２，１９８９；Ｃｈｒｉｓｔｎｉｃｋら，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３５２：６７，１９９１；Ｂｕｓｃｈら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
２：４４３，１９９９０；Ｈｉｌｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１８９，
１９９１；ｄｅｌ Ｇｕｅｒｃｉｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６８５，
１９９５）、界面活性剤溶解物を用いる無細胞系（例えば、Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ
ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２０６９，１９９１）、固定化された精製ＭＨ
Ｃ（例えば、Ｈｉｌｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２８９０，１９９４；
Ｍａｒｓｈａｌｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：４９４６，１９９４)、Ｅ
ＬＩＳＡ系（例えば、Ｒｅａｙら，ＥＭＢＯ Ｊ．１１：２８２９，１９９２）
、表面プラズモン共鳴（例えば、Ｋｈｉｌｋｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６８：１５４２５，１９９３）；高フラックス可溶性相アッセイ（Ｈａｍｍｅｒ
ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３５３，１９９４）、およびクラスＩ Ｍ
ＨＣ安定化またはアセンブリの測定（例えば、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎら，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３４６：４７６，１９９０；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら，Ｃｅｌｌ ６２：
５６３，１９９０；Ｔｏｗｎｓｅｎｄら，Ｃｅｌｌ ６２：２８５，１９９０；
Ｐａｒｋｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１８９６，１９９２）。
【００３６】 本明細書中で使用される場合、ＨＬＡクラスＩ分子に関する「高親和性」は、
５０ｎＭ以下のＩＣ50またはＫD値を有する結合として規定される；「中程度の
親和性」は、約５０ｎＭと約５００ｎＭとの間のＩＣ50またはＫD値を有する結
合である。ＨＬＡクラスＩＩ分子に対する結合に関する「高親和性」は、１００
ｎＭ以下のＩＣ50またはＫD値を有する結合として規定される；「中程度の親和
性」は、約１００ｎＭと約１０００ｎＭとの間のＩＣ50またはＫD値を有する結
合である。
【００３７】 ２つ以上のペプチド配列の状況において、用語「同一」またはパーセント「同
一性」は、比較ウィンドウで最大の対応に関して比較され、そして整列されたと
き、配列比較アルゴリズムを用いて、または手動の整列および目視により測定す
る場合、同じ２つ以上の配列または部分配列、あるいは同じアミノ酸残基の特定
の割合を有する２つ以上の配列または部分配列をいう。
【００３８】 「免疫原性ペプチド」または「ペプチドエピトープ」は、対立遺伝子特異的モ
チーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドであり、その結果、このペプチド
がＨＬＡ分子に結合し、そしてＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を誘導する。従
って、本発明の免疫原性ペプチドは、適切なＨＬＡ分子に結合し得、その後、免
疫原性ペプチドが由来する抗原に対するＨＬＡ拘束細胞傷害性Ｔ細胞またはヘル
パーＴ細胞の応答を誘導し得る。
【００３９】 句「単離された」または「生物学的に純粋な」とは、通常は、物質がそのネイ
ティブな形態で見出される場合に、この物質に付随する成分を実質的にまたは本
質的に含まない物質をいう。従って、本発明に従って単離されたペプチドは、好
ましくは、それらのインサイチュ環境において、ペプチドと通常関連する物質を
含まない。「単離された」エピトープとは、ペプチドが由来した抗原またはポリ
ペプチドの配列全体を含まないエピトープをいう。代表的には、「単離された」
エピトープは、ネイティブな配列と１００％同一性を有する配列を生じるさらな
るアミノ酸に結合していない。このネイティブな配列は、このエピトープが由来
した腫瘍関連抗原のような配列であり得る。
【００４０】 「主要組織適合遺伝子複合体」または「ＭＨＣ」は、生理学的免疫応答を担う
細胞相互作用の制御において役割を果たす遺伝子のクラスターである。ヒトにお
いて、ＭＨＣ複合体は、ＨＬＡ複合体としても公知である。ＭＨＣ複合体および
ＨＬＡ複合体の詳細な記載については、Ｐａｕｌ，ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ Ｉ
ＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，第３版，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１
９９３を参照のこと。
【００４１】 用語「モチーフ」とは、規定の長さのペプチド（通常は、クラスＩ ＨＬＡモ
チーフについては約８〜約１３アミノ酸のペプチドおよびクラスＩＩ ＨＬＡモ
チーフについては約６〜約２５アミノ酸のペプチド）における残基のパターンを
いい、これらのモチーフは、特定のＨＬＡ分子により認識される。ペプチドモチ
ーフは、代表的には、各ヒトＨＬＡ対立遺伝子によりコードされる各タンパク質
について異なり、そして一次および二次アンカー残基のパターンが異なる。
【００４２】 「ネガティブ結合残基」は、ペプチドエピトープの特定の位置（代表的には一
次アンカー位置ではない）に存在した場合、このペプチドの対応するＨＬＡ分子
に対するペプチドの結合親和性の減少を生じるアミノ酸である。
【００４３】 「非ネイティブ」配列または「構築物」とは、天然において見出されない（「
天然に存在しない」）配列をいう。このような配列としては、例えば、脂質化ペ
プチド、そうでなければ改変されたペプチドおよびネイティブなタンパク質配列
において連続していないエピトープを含むポリエピトープ組成物が挙げられる。
【００４４】 用語「ペプチド」は、本明細書中で「オリゴペプチド」と互換的に使用され、
代表的には、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボキシル基との間のペプチ
ド結合によって互いに連結された一連の残基（代表的には、Ｌ−アミノ酸）を意
味する。本発明の好ましいＣＴＬ誘導ペプチドは、長さが１３残基以下であり、
通常、約８残基と約１１残基との間で構成され、好ましくは９または１０残基で
ある。好ましいＨＴＬ誘導オリゴペプチドは、長さが約５０残基未満であり、そ
して通常、約６残基と約３０残基との間で構成され、より通常は、約１２残基と
約２５残基との間で構成され、そしてしばしば、約１５残基と約２０残基との間
で構成される。
【００４５】 「薬学的に受容可能な」とは、一般に、非毒性の、不活性かつ／または生理学
的に適合性の組成物をいう。
【００４６】 「薬学的賦形剤」は、アジュバント、キャリア、ｐＨ調節剤および緩衝化剤、
張度調節剤、湿潤剤、防腐剤などのような物質を含む。
【００４７】 「一次アンカー残基」は、免疫原性ペプチドとＨＬＡ分子との間の接触点を提
供すると理解されているペプチド配列に沿った特定の位置でのアミノ酸である。
規定された長さのペプチド内の１〜３つ（通常、２つ）の一次アンカー残基は、
一般に、免疫原性ペプチドについて「モチーフ」を規定する。これらの残基は、
ＨＬＡ分子のペプチド結合溝と最近接で適合し、その側鎖は、結合溝自体の特定
のポケットに埋め込まれていることが理解される。１つの実施形態において、一
次アンカー残基は、本発明に従う９残基のペプチドエピトープの二位（アミノ末
端位置から）およびカルボキシ末端位置に位置する。各モチーフおよびスーパー
モチーフの一次アンカー位置は、表１に示される。例えば、アナログペプチドは
、これらの一次アンカー位置における特定の残基の存在または非存在を変更する
ことによって作製され得る。そのようなアナログは、特定のモチーフまたはスー
パーモチーフを含むペプチドの結合親和性を調節するために使用される。
【００４８】 「不規則な認識（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）」は、
異なるペプチドが種々のＨＬＡ分子の状況において同じＴ細胞クローンにより認
識されることである。不規則な認識または結合は、交差反応性結合と類似である
。
【００４９】 「防御免疫応答」または「治療免疫応答」とは、感染因子または腫瘍抗原由来
の抗原に対するＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答をいう。この応答は、疾患症状
または進行を予防するか、または少なくとも部分的に停止する。この免疫応答は
また、ヘルパーＴ細胞の刺激により促進される抗体応答を含み得る。
【００５０】 用語「残基」とは、アミド結合またはアミド結合模倣物によってオリゴペプチ
ド中に取りこまれているアミノ酸またはアミノ酸模倣物をいう。
【００５１】 「二次アンカー残基」は、ペプチドにおける一次アンカー位置以外の位置のア
ミノ酸であり、これは、ペプチド結合に影響し得る。二次アンカー残基は、１つ
の位置におけるアミノ酸のランダムな分布によって予測される結合したペプチド
の中で有意により高い頻度で生じる。この二次アンカー残基は、「二次アンカー
位置」にて生じるといわれる。二次アンカー残基は、高い親和性結合ペプチドま
たは中程度の親和性結合ペプチドの中で高い頻度で存在する残基と同定され得る
か、あるいは高い親和性結合または中程度の親和性結合で会合する他の残基と同
定され得る。例えば、アナログペプチドは、これらの二次アンカー位置における
特定の残基の存在または非存在を変更することによって作製され得る。そのよう
なアナログは、特定のモチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドの結合親
和性を精密に調節するために使用される。
【００５２】 「亜優性エピトープ」は、エピトープを含むが、単離されたペプチドで免疫す
ることによって応答が得られ得る完全な抗原で免疫した際に、ほとんどまたは全
く応答を引き起こさないエピトープである。そしてこの応答（潜在エピトープの
場合とは異なる）は、完全なタンパク質を用いて、インビトロまたはインビボで
の応答を呼び戻す場合に検出される。
【００５３】 「スーパーモチーフ」は、２つ以上のＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるＨ
ＬＡ分子により共有されるペプチド結合特異性である。好ましくは、スーパーモ
チーフを有するペプチドは、２つ以上のＨＬＡ抗原により（本明細書中で規定さ
れるように）高親和性または中程度の親和性で認識される。
【００５４】 「合成ペプチド」とは、化学合成または組換えＤＮＡ技術のような方法を用い
た人工ペプチドをいう。
【００５５】 本明細書中で用いられる場合、「ワクチン」は、１つ以上の本発明のペプチド
を含む組成物である。本発明に従うワクチンの多くの実施形態が存在する（例え
ば、１つ以上のペプチドのカクテル；ポリエピトープペプチドにより構成された
本発明の１つ以上のエピトープ；あるいはこのようなペプチドまたはポリペプチ
ドをコードする核酸（例えば、ポリエピトープペプチドをコードするミニ遺伝子
）によるもの）。「１つ以上のペプチド」は、例えば、少なくとも２、３、４、
５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８
、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０
、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０
、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００以上の
本発明のペプチドを含み得る。このペプチドまたはポリペプチドは、必要に応じ
て、例えば、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、標的化配列または他の配列の付
加によって改変され得る。本発明のＨＬＡクラスＩ結合ペプチドは、ＨＬＡクラ
スＩＩ結合ペプチドと混合されるか、または連結されて、細胞傷害性Ｔリンパ球
およびヘルパーＴリンパ球の両方の活性化を促進し得る。ワクチンはまた、ペプ
チドパルス化抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を含み得る。
【００５６】 ペプチド化合物を記載するために用いた名称は、各アミノ酸残基のアミノ基が
左（Ｎ末端）に、そしてカルボキシル基が右（Ｃ末端）に示される従来の慣行に
従う。アミノ酸残基位置がペプチドエピトープにおいて言及される場合、それら
は、アミノからカルボキシルの方向に番号付けされ、１位は、エピトープ、また
はエピトープが一部分であり得るペプチドもしくはタンパク質のアミノ末端に最
も近い位置である。本発明の選択された特定の実施形態を示す式において、アミ
ノ末端基およびカルボキシル末端基（特に示されない）は、他に特定されなけれ
ば、それらが生理学的ｐＨ値において呈する形態にある。アミノ酸構造式におい
て、各残基は、一般に標準的な３文字または１文字表記により示される。アミノ
酸残基のＬ形態は、大文字の１文字記号または最初が大文字の３文字記号により
示される。そしてＤ形態を有するこれらのアミノ酸のＤ形態は、小文字の１文字
記号または小文字の３文字記号により示される。グリシンは、不斉炭素原子を有
さず、そして単に「Ｇｌｙ」または「Ｇ」と示される。アミノ酸の記号を以下に
示す。
【００５７】
【表１】 （ＩＶ．Ｂ．ＣＴＬ応答およびＨＴＬ応答の刺激） Ｔ細胞が抗原を認識する機構は、過去十年の間に詳細に示されてきた。免疫系
の本発明者らの理解に基づいて、本発明者らは、広範な集団においてＨＣＶに対
する治療的または予防的免疫応答を誘導し得る有効なペプチドエピトープワクチ
ン組成物を開発した。本願組成物の価値および有効性の理解のために、免疫学関
連技術の簡単な総説を提供する。
【００５８】 ＨＬＡ分子とペプチド抗原の複合体は、ＨＬＡ拘束Ｔ細胞により認識されるリ
ガンドとして働く（Ｂｕｕｓ，Ｓ．ら，Ｃｅｌｌ ４７：１０７１，１９８６；
Ｂａｂｂｉｔｔ，Ｂ．Ｐ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３１７：３５９，１９８５；Ｔｏ
ｗｎｓｅｎｄ，Ａ．およびＢｏｄｍｅｒ，Ｈ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．７：６０１，１９８９；Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｒ．Ｎ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：４０３，１９９３）。１つのアミノ酸を置換した抗原ア
ナログおよび内因的に結合した天然にプロセシングされたペプチドの配列決定の
研究を通して、ＨＬＡ抗原分子に対する特異的結合に必要なモチーフに対応する
重要な残基が同定され、そして本明細書中に記載され、そして表Ｉ、ＩＩおよび
ＩＩＩに示される（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６
０：３３６３，１９９８；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ ４１：１７８，１９９５；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら，ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（ウ
ェブを介して以下にアクセスすること：ｈｔｔｐ：／／１３４．２．９６．２２
１／ｓｃｒｉｐｔｓ．ｈｌａｓｅｒｖｅｒ．ｄｌｌ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍ）；Ｓｅ
ｔｔｅ，Ａ．およびＳｉｄｎｅｙ，Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１０：４７８，１９９８；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｖ．Ｈ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１３，１９９４；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．およびＧｒｅｙ，Ｈ
．Ｍ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：７９，１９９２；Ｓｉｎｉ
ｇａｇｌｉａ，Ｆ．およびＨａｍｍｅｒ，Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：５２，
１９９４；Ｒｕｐｐｅｒｔら，Ｃｅｌｌ ７４：９２９−９３７，１９９３；Ｋ
ｏｎｄｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４３０７−４３１２，１９９５；Ｓ
ｉｄｎｅｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３４８０−３４９０，１９９６；
Ｓｉｄｎｅｙら，Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３，１９９６；
Ｓｅｔｔｅ，Ａ．およびＳｉｄｎｅｙ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（印
刷中），１９９９もまた参照のこと）。
【００５９】 さらに、ＨＬＡ−ペプチド複合体のＸ線結晶解析により、対立遺伝子特異的様
式でペプチドリガンドが保有する残基と適応するＨＬＡ分子のペプチド結合溝（
ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｌｅｆｔ）内のポケットが明らかになった
；これらの残基は、次に、これらの残基が存在するペプチドのＨＬＡ結合能力を
決定する（例えば、Ｍａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｒ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１３：５８７，１９９５；Ｓｍｉｔｈら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４：２０３，１
９９６；Ｆｒｅｍｏｎｔら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：３０５，１９９８；Ｓｔｅ
ｒｎら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：２４５，１９９４；Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ｙ．Ｃ
ｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：７５，１９９７；Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｈ
．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３６４：３３，１９９３；Ｇｕｏ，Ｈ．Ｃ．ら，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８０５３，１９９３；Ｇｕｏ，
Ｈ．Ｃ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３６０：３６４，１９９２；Ｓｉｌｖｅｒ，Ｍ．Ｌ
．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３６０：３６７，１９９２；Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｍ．ら
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９２７，１９９２；Ｍａｄｄｅｎら，Ｃｅｌｌ ７
０：１０３５，１９９２；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｄ．Ｈ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５
７：９１９，１９９２；Ｓａｐｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｐ．Ｊ．お
よびＷｉｌｅｙ，Ｄ．Ｃ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：２７７，１９９１
を参照のこと）。
【００６０】 従って、クラスＩおよびクラスＩＩの対立遺伝子特異的ＨＬＡ結合モチーフ、
またはクラスＩもしくはクラスＩＩのスーパーモチーフの規定は、特定のＨＬＡ
抗原を結合する能力を有するタンパク質内の領域の同定を可能にする。
【００６１】 本発明者らは、結合親和性と免疫原性との相関（本明細書中に開示される）が
、候補ペプチドを評価する場合に考慮されるべき重要な因子であることを見出し
た。従って、モチーフ検索とＨＬＡ−ペプチド結合アッセイとの組合わせにより
、エピトープベースのワクチンの候補が同定された。それらの結合親和性を決定
した後、さらなる確認作業を行って、これらのワクチン候補の中で、集団適用範
囲、抗原性および免疫原性の点で好ましい特徴を有するエピトープを選択し得る
。
【００６２】 種々のストラテジーを利用して、免疫原性を評価し得る。これらのストラテジ
ーとしては、以下が挙げられる： １）正常個体由来の初代Ｔ細胞培養物の評価（例えば、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，
Ｐ．Ａ．ら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：６０３，１９９５；Ｃｅｌｉｓ，
Ｅ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２１０５，１
９９４；Ｔｓａｉ，Ｖ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１７９６，１９９７
；Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｉ．ら，Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５９：１，１９
９８）；この手順は、正常被験体由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、インビト
ロで抗原提示細胞の存在下で数週間にわたり試験ペプチドで刺激することを包含
する。このペプチドに特異的なＴ細胞は、この期間に活性化され、そして例えば
、ペプチド感作標的細胞に伴う51Ｃｒ放出アッセイを用いて検出される。
【００６３】 ２）ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫（例えば、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，
Ｐ．Ａ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：９７，１９９６；Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ
，Ｐ．Ａ．ら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５１，１９９６；Ａｌｅｘａｎ
ｄｅｒ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３，１９９７）；この方
法において、不完全フロイントアジュバント中のペプチドをＨＬＡトランスジェ
ニックマウスの皮下に投与する。免疫して数週間後に、脾細胞を取り出し、そし
てインビトロで約１週間にわたり試験ペプチドの存在下で培養する。ペプチド特
異的Ｔ細胞は、例えば、ペプチド感作標的細胞および内因的に生成した抗原を発
現する標的細胞に伴う51Ｃｒ放出アッセイを用いて検出される。
【００６４】 ３）有効にワクチン接種された個体、感染から回復した個体、および／または
慢性的に感染した患者の免疫からＴ細胞応答を呼び戻すという実証（例えば、Ｒ
ｅｈｅｒｍａｎｎ，Ｂ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：１０４７，１９９５
；Ｄｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：９７，１９９７；Ｂｅｒ
ｔｏｎｉ，Ｒ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３，１９９７；
Ｔｈｒｅｌｋｅｌｄ，Ｓ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１６４８，１
９９７；Ｄｉｅｐｏｌｄｅｒ，Ｈ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６０１１，
１９９７を参照のこと）。このストラテジーを適用する際に、応答を呼び戻すこ
とは、例えば、感染を通じて天然に抗原に曝された（従って、「天然に」免疫応
答を生成した）被験体由来のＰＢＬまたは感染に対してワクチン接種された患者
由来のＰＢＬを培養することによって検出される。被験体由来のＰＢＬを、イン
ビトロで試験ペプチドおよび抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で１〜２週間の間
培養して、「ネイティブな」Ｔ細胞と比較して、「記憶」Ｔ細胞の活性化を可能
にする。培養期間の終わりに、Ｔ細胞活性を、ペプチド感作された標的、Ｔ細胞
増殖、またはリンホカイン放出を伴う51Ｃｒ放出を含むＴ細胞活性についてのア
ッセイを用いて検出する。
【００６５】 以下は、本発明のペプチドエピトープおよび対応する核酸を記載する。
【００６６】 （ＩＶ．Ｃ．ＨＬＡ分子に対するペプチドエピトープの結合親和性） 高度なＨＬＡ多型は、ワクチン開発へのエピトープベースのアプローチと共に
考察するために重要な因子である。この因子に取り組むために、高いかまたは中
間の親和性で複数のＨＬＡ分子に結合し得るペプチドを同定する工程を包含する
エピトープの選択がしばしば使用され、最も好ましくは、これらのエピトープは
、高いかまたは中間の親和性で２つ以上の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子に結合す
る。
【００６７】 ワクチン組成物のための目的のＣＴＬ誘導ペプチドとしては、好ましくは、５
００ｎＭまたは５００μＭより優れたクラスＩ ＨＬＡ分子に対するＩＣ50また
は結合親和性の値（すなわち、この値は５００ｎＭ以下である）を有するペプチ
ドが挙げられる。ＨＴＬ誘導ペプチドとしては、好ましくは、１０００ｎＭまた
は１０００ｎＭより優れたクラスＩＩ ＨＬＡ分子に対するＩＣ50または結合親
和性の値（すなわち、この値は１，０００ｎＭ以下である）を有するペプチドが
挙げられる。例えば、ペプチド結合は、インビトロにおいて候補ペプチドが精製
ＨＬＡ分子に結合する能力を試験することによって評価される。次いで、高いか
または中間の親和性を示すペプチドは、さらなる分析のために考察される。選択
されたペプチドは、スーパータイプファミリーの他のメンバーについて試験され
る。好ましい実施形態において、交差反応結合を阻害するペプチドは、次いで、
ワクチンまたは細胞スクリーニング分析において使用される。
【００６８】 より高いＨＬＡ結合親和性は、典型的に、より大きな免疫原性と相関している
。より大きな免疫原性は、いくつかの異なる様式において明確であり得る。免疫
原性は、免疫応答が本当に誘発される否か、および任意の特定の応答の効力、な
らびに応答が誘発される集団の程度に対応する。例えば、ペプチドは、強力な応
答を生成する場合を除いて、集団の多様なアレイにおける免疫応答を引き起こし
得る。これらの原理に従って、９０％近い高結合ペプチドは、中間の親和性で結
合するペプチドの約５０％と対照してみると、免疫原性であることが見出されて
いる。さらに、高結合親和性ペプチドは、より強力な免疫原性応答を引き起こす
。結果として、高親和性結合ペプチドが使用される場合、ペプチドは同様の生物
学的効果を引き起こす必要はあまりない。従って、本発明の好ましい実施形態に
おいて、高親和性結合エピトープは特に有用である。
【００６９】 ＨＬＡクラスＩ分子に対する結合親和性と結合抗原上の別個のペプチドエピト
ープの免疫原性との間の関係は、本発明者によって当該分野で初めて決定された
。結合親和性と免疫原性との間の相関は、２つの異なる実験的なアプローチで分
析された（例えば、Ｓｅｔｔｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：５５８６−５
５９２，１９９４を参照のこと）。第１のアプローチにおいて、１０，０００倍
の範囲を超えるＨＬＡ結合親和性の範囲の潜在的エピトープの免疫原性が、ＨＬ
Ａ−Ａ*０２０１トランスジェニックマウスにおいて分析された。第２のアプロ
ーチにおいて、約１００個の異なるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来潜在的エピ
トープ（全てが、Ａ*０２０１結合モチーフを保有する）の抗原性は、急性肝炎
の患者由来のＰＢＬを使用することによって評価された。これらのアプローチに
従って、約５００ｎＭ（好ましくは，５０ｎＭ以下）の親和性閾値はペプチドエ
ピトープがＣＴＬ応答を引き起こす能力を決定することが決定された。これらの
データは、天然でプロセシングされたペプチドおよび合成Ｔ細胞エピトープに対
するクラスＩ結合親和性の測定について当てはまる。これらのデータはまた、Ｔ
細胞応答の具体化（ｓｈａｐｉｎｇ）における決定因子の選択の重要な役割を示
す（例えば、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８６：４６４９−４６５３，１９８９を参照のこと）。
【００７０】 ＨＬＡクラスＩＩ ＤＲ分子の状況における免疫原性に関連する親和性閾値が
また示されている（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
１６０：３３６３−３３７３，１９９８を参照のこと）。ＤＲ結合親和性の生
物学的に有意な閾値を規定するために、３２個のＤＲ拘束エピトープのそれらの
拘束エレメント（すなわち、モチーフに結合するＨＬＡ分子）に対する結合親和
性のデータベースが集計された。これらの場合の約半分（３２個のエピトープの
うち１５個）において、ＤＲ拘束は高結合親和性（すなわち、１００ｎＭ以下の
結合親和性値）に関連していた。これらの場合の残りの半分（３２個のうちの１
６個）において、ＤＲ拘束は中間の親和性（１００〜１０００ｎＭ範囲の結合親
和性値）に関連していた。３２個の場合のうちただ１つにおいて、ＤＲ制限は１
０００ｎＭ以上のＩＣ50に関連していた。従って、１０００ｎＭは、ＤＲ分子の
状況における免疫原性に関連する親和性閾値として定義され得る。
【００７１】 ＨＬＡ分子に対するペプチドの結合親和性は、以下の実施例１のように決定さ
れ得る。
【００７２】 （ＩＶ．Ｄ．ペプチドエピトープ結合モチーフおよびスーパーモチーフ） この数年間で、大部分のＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ分子が比較的少量の
スーパータイプ（これらの各々は、ペプチド結合範囲と主なペプチド結合ポケッ
トのコンセンサス構造とを大部分重ねることによって特徴付けられる）に分類さ
れ得ることを示す証拠が蓄積されている。
【００７３】 ＨＬＡ分子ポケット分析について、結晶学的研究において記載されるようなＨ
ＬＡクラスＩ分子のＢおよびＦポケットを含む残基が分析された（例えば、Ｇｕ
ｏ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６０：３６４，１９９２；Ｓａｐｅｒ，Ｍ．
Ａ．，Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｐ．Ｊ．およびＷｉｌｅｙ，Ｄ．Ｃ．，Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．２１９：２７７，１９９１；Ｍａｄｄｅｒｎ，Ｄ．Ｒ．，Ｇａｒｂｏ
ｃｚｉ，Ｄ．Ｎ．およびＷｉｌｅｙ，Ｄ．Ｃ．，Ｃｅｌｌ ７５：６９３，１９
９３；Ｐａｒｈａｍ，Ｐ．，Ａｄａｍｓ，Ｅ．Ｊ．，およびＡｒｎｅｔｔ，Ｋ．
Ｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１４３：１４１，１９９５を参照のこと）。こ
れらの分析において、残基９、４５、６３、６６、６７、７０および９９は、Ｂ
ポケットを構成すると考えられ；そしてそのＢポケットは、ペプチドリガンドの
２位におけるアミノ酸残基に対する特異性を決定すると考えられた。同様に、残
基７７、８０、８１および１１６は、Ｆポケットの特異性を決定すると考えられ
；このＦポケットは、ＨＬＡクラスＩ分子により結合されたペプチドリガンドの
Ｃ末端残基に対する特異性を決定するとみなされた。
【００７４】 単一のアミノ酸置換抗原アナログの研究、および内因的に結合し、天然でプロ
セシングされたペプチドの配列決定によって、ＨＬＡ分子への対立遺伝子特異的
結合に必要な重要な残基が同定された。これらの残基の存在は、ＨＬＡ分子に対
する結合親和性と相関する。高いかまたは中間の親和性結合に相関するモチーフ
および／またはスーパーモチーフの同定は、ワクチンに含有させるための免疫原
性ペプチドエピトープの同定に関する重要な問題である。Ｋａｓｔら（Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１５２：３９０４−３９１２，１９９４）は、モチーフ保有ペプチ
ドは、対立遺伝子特異的ＨＬＡクラスＩ分子に結合するエピトープの９０％を構
成することを示した。この研究において、９個のアミノ酸長かつ８個のアミノ酸
が重なる全ての可能なペプチド（２４０個のペプチド）（これはヒト乳頭腫ウイ
ルス属１６型のＥ６およびＥ７タンパク質の配列全体をカバーする）は、異なる
人種間で高頻度で発現される５個の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子への結合につい
て評価された。この偏りのないペプチドのセットは、ＨＬＡクラスＩモチーフの
予測値の評価を可能にした。２４０個のペプチドのセットから、高いかまたは中
間の親和性を有する対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子に結合する２２個のペプチドが
同定された。これらの２２個のペプチドのうち、２０個（すなわち、９１％）は
モチーフを保有していた。従って、この研究は、ワクチンに含有させるためのペ
プチドエピトープの同定のためのモチーフの値を立証し：モチーフベースの同定
技術の適用は、標的抗原タンパク質配列における潜在的エピトープの９０％のス
クリーニングを排除する。
【００７５】 このようなペプチドエピトープは、以下に記載される表で同定される。
【００７６】 本発明のペプチドはまた、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ分子に結合するエピトープ
を含み得る。ペプチドのＮ末端およびＣ末端に対する、モチーフのサイズおよび
結合フレームの位置の両方におけるより大きな程度の異質性は、クラスＩＩペプ
チドリガンドについて存在する。このＨＬＡクラスＩＩペプチドリガンドの増加
した異質性は、ＨＬＡクラスＩＩ分子の結合溝の構造に由来し、これはクラスＩ
の対応物と異なり、両端で開いている。ＨＬＡクラスＩＩ ＤＲＢ*０１０１ペ
プチド複合体の結晶学的分析は、結合の主なエネルギーが、ＤＲＢ*０１０１分
子上の相補的ポケットと複合化したペプチド残基に寄与されることを示した。重
要なアンカー残基は、最も深い疎水性ポケットに係合し（例えば、Ｍａｄｄｅｎ
，Ｄ．Ｒ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：５８７，１９９５を参照の
こと）、そして１位（Ｐ１）と称される。Ｐ１は、クラスＩＩ結合ペプチドエピ
トープのＮ末端残基を表すが、より代表的には、１つ以上の残基によって、Ｎ末
端に向かって隣接される。他の研究はまた、様々なＤＲ分子に結合するため、Ｐ
１に対してＣ末端に向かって６番目の位置のペプチド残基の重要な役割を指摘し
た。
【００７７】 従って、本発明のペプチドは、いくつかのＨＬＡ特異的アミノ酸モチーフの任
意の１つによって同定される（例えば、表Ｉ−ＩＩＩを参照のこと）。モチーフ
の存在がいくつかの対立遺伝子特異的ＨＬＡ抗原に結合する能力と対応する場合
、これはスーパーモチーフと称される。特定のアミノ酸モチーフを有するペプチ
ドに結合するＨＬＡ分子は、まとめてＨＬＡ「スーパーモチーフ」と称される。
【００７８】 以下に記載され、表Ｉ−ＩＩＩに要約されるペプチドモチーフおよびスーパー
モチーフは、本発明に従うペプチドエピトープの同定および使用のためのガイダ
ンスを提供する。
【００７９】 それぞれのスーパーモチーフまたはモチーフを保有するペプチドエピトープの
例は、以下の各モチーフまたはスーパーモチーフの説明において示されるような
表に挙げられる。これらの表は、ペプチドエピトープのいくつかについての結合
親和性比の表を含む。この比は以下の式を使用することによって、ＩＣ50に変換
され得る：標準ペプチドのＩＣ50／比＝試験ペプチド（すなわち、ペプチドエピ
トープ）のＩＣ50。クラスＩペプチドに対する結合親和性を決定するために使用
される標準ペプチドのＩＣ50値は、表ＩＶに示される。クラスＩＩペプチドに対
する結合親和性を決定するために使用される標準ペプチドのＩＣ50値は、表Ｖに
示される。本明細書中に記載される結合アッセイのための標準として使用される
ペプチドは、標準の例であり；代替の標準ペプチドはまた、このような分析を実
施する場合に使用され得る。
【００８０】 各表に列挙されるペプチドエピトープ配列を得るために、１４個のＨＣＶ単離
体のタンパク質配列データは、指定されたスーパーモチーフまたはモチーフの存
在について評価された。この１４個の株は、ＨＰＣＣＧＡＡ、ＨＰＣＰＬＹＰＲ
Ｅ、ＨＣＶ−Ｈ−ＣＭＲ、ＨＣＶ−Ｊ１、ＨＰＣＧＥＮＡＮＴＩ、ＨＰＣＧＥＮ
ＯＭ、ＨＰＣＨＵＭＲ、ＨＰＣＪＣＧ、ＨＰＣＪＴＡ、ＨＣＶ−Ｊ４８３、ＨＣ
Ｖ−ＪＫ１、ＨＣＶ−Ｎ、ＨＰＣＰＯＬＰ、およびＨＣＶ−Ｊ８を含む。ペプチ
ドエピトープは、さらに、これらの１４個の株の中の保存性に基づいて評価され
た。保存性の基準は、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの配列全体が、特定のタンパ
ク質について利用可能な配列の７９％において全体的に保存されていることを必
要とする。同様に、保存性の基準は、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの９マーの
コア領域全体が、特定のタンパク質について利用可能な配列の７９％において全
体的に保存されていることを必要とする。選択されたペプチドエピトープの保存
性％は、表に示される。頻度（すなわち、この１４個の株のうち全体的に保存さ
れるペプチド配列が同定された株の数）もまた示される。表中の「位置」のカラ
ムは、エピトープの最初のアミノ酸残基に対応するＨＣＶポリタンパク質のアミ
ノ酸位置を示す。「アミノ酸の数」は、エピトープ配列中の残基の数を示す。
【００８１】 （ＣＴＬ誘導ペプチドエピトープを示すＨＬＡクラスＩモチーフ） 以下に示されるＨＬＡクラスＩペプチドエピトープスーパーモチーフおよびモ
チーフの一次アンカー残基を、表Ｉに要約する。表Ｉ（ａ）に記載されるＨＬＡ
クラスＩモチーフは、本明細書中で、本願発明に最もよく関連するものである。
一次および二次アンカー位置は、表ＩＩに要約される。ＨＬＡクラスＩスーパー
タイプファミリーを含む対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表ＶＩに列挙される。
【００８２】 （ＩＶ．Ｄ．１．ＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフは、エピトープの２位における小さな（Ｔまた
はＳ）または疎水性の（Ｌ、Ｉ、ＶまたはＭ）一次アンカー残基のペプチドリガ
ンドにおける存在によって特徴付けられ、そしてエピトープのＣ末端位における
芳香族の（Ｙ、ＦまたはＷ）一次アンカー残基のペプチドリガンドにおける存在
によって特徴付けられる。Ａ１スーパーモチーフ（すなわち、ＨＬＡ−Ａ１スー
パータイプ）に結合するＨＬＡ分子の対応するファミリーは、少なくともＡ*０
１０１、Ａ*２６０１、Ａ*２６０２、Ａ*２５０１、およびＡ*３２０１を含む（
例えば、ＤｉＢｒｉｎｏ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：５９３０，１
９９３；ＤｉＢｒｉｎｏ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：６２０，１９
９４；Ｋｏｎｄｏ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４５：２４９，１
９９７を参照のこと）。Ａ１スーパーファミリーのメンバーであることが予測さ
れる他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表ＶＩに示される。個々のＨＬＡタン
パク質の各々に結合するペプチドは、一次および／または二次アンカー位置にお
ける置換によって、好ましくはスーパーモチーフに対して特異化されたそれぞれ
の残基を選択することによって調節され得る。
【００８３】 Ａ１スーパーモチーフを含むペプチドエピトープは、表ＶＩＩに記載される。
【００８４】 （ＩＶ．Ｄ．２．ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ） 対立遺伝子特異的ＨＬＡ−Ａ２．１分子に対する一次アンカーの特異性（Ｆａ
ｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０−２９６，１９９１；Ｈｕｎｔら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２５５：１２６１−１２６３，１９９２；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−３５８７，１９９２）、およびＨＬＡ Ａ２
ファミリー内の交差反応結合（Ｆｒｕｃｉら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３
８：１８７−１９２，１９９３；Ｔａｎｉｇａｋｉら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．３９：１５５−１６２，１９９４）が記載されている。本発明者らは、複
数の対立遺伝子特異的ＨＬＡ Ａ２分子への交差反応結合を決定するさらなる一
次アンカー残基を規定した（Ｒｕｐｐｅｒｔら、Ｃｅｌｌ ７４：９２９−９３
７，１９９３；Ｄｅｌ Ｇｕｅｒｃｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６８
５−６９３，１９９５；Ｋａｓｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９０４−
３９１２，１９９４）。ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフは、エピトープの２位に
一次アンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＴまたはＱを、Ｃ末端位に一次ア
ンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＡまたはＴを有するペプチドリガンドを含む
。
【００８５】 ＨＬＡ分子の対応するファミリー（すなわち、これらのペプチドに結合するＨ
ＬＡ−Ａ２スーパータイプ）は、少なくともＡ*０２０１、Ａ*０２０２、Ａ*０
２０３、Ａ*０２０４、Ａ*０２０５、Ａ*０２０６、Ａ*０２０７、Ａ*０２０９
、Ａ*０２１４、Ａ*６８０２、およびＡ*６９０１からなる。Ａ２スーパーファ
ミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、
表ＶＩに示される。以下に詳細に説明されるように、個々の対立遺伝子特異的Ｈ
ＬＡ分子の各々への結合は、一次アンカーおよび／または二次アンカー位置にお
ける置換、好ましくは、このスーパーモチーフに対して特異化されたそれぞれの
残基を選択することによって調節され得る。
【００８６】 Ａ２スーパーモチーフを含むペプチドエピトープは、表ＶＩＩＩに記載される
。２位において一次アンカー残基Ｖ、Ａ、ＴまたはＱを、そしてＣ末端位におい
てＬ、Ｉ、Ｖ、ＡまたはＴを含むモチーフは、ここで本願発明に特に最も関連す
るものである。
【００８７】 （ＩＶ．Ｄ．３．ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフは、エピトープの２位における一次アンカーと
して、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＳまたはＴのペプチドリガンドにおける存在によっ
て特徴付けられ、そしてエピトープのＣ末端（すなわち、９マーの９位）におけ
る一次アンカーとして、正電荷の残基ＲまたはＫの存在によって特徴付けられる
。Ａ３スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子（ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ）
の対応するファミリーの例示的なメンバーは、少なくともＡ*０３０１、Ａ*１１
０１、Ａ*３１０１、Ａ*３３０１およびＡ*６８０１を含む。Ａ３スーパーファ
ミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、
表ＶＩに示される。以下で詳細に説明されるように、個々の対立遺伝子特異的Ｈ
ＬＡタンパク質の各々に結合するペプチドは、ペプチドの一次および／または二
次アンカー位置におけるアミノ酸の置換、好ましくは、スーパーモチーフに特異
化されたそれぞれの残基を選択することによって調節され得る。
【００８８】 Ａ３スーパーモチーフを含むペプチドエピトープは、表ＩＸに記載される。
【００８９】 （ＩＶ．Ｄ．４．ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフは、エピトープの２位における一次アンカー
として、芳香族（Ｆ、ＷまたはＹ）または疎水性脂肪族（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍまたは
Ｔ）残基のペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられ、そしてエピト
ープのＣ末端位における一次アンカーとして、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｌ、ＩまたはＭの存
在によって特徴付けられる。Ａ２４スーパーモチーフ（すなわち、Ａ２４スーパ
ータイプ）に結合するＨＬＡ分子の対応するファミリーは、少なくともＡ*２４
０２、Ａ*３００１およびＡ*２３０１を含む。Ａ２４スーパーファミリーのメン
バーであることが予測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表ＶＩに示さ
れる。対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子の各々に結合するペプチドは、一次および／
または二次アンカー位置における置換、好ましくは、スーパーモチーフに特異化
されたそれぞれの残基を選択することによって調節され得る。
【００９０】 Ａ２４スーパーモチーフを含むペプチドエピトープは、表Ｘに記載される。
【００９１】 （ＩＶ．Ｄ．５．ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフは、一次アンカーとして、エピトープの２位に
おけるペプチド保有プロリンによって特徴付けられ、そしてエピトープのＣ末端
位における一次アンカーとして、疎水性または脂肪族のアミノ酸（Ｌ、Ｉ、Ｖ、
Ｍ、Ａ、Ｆ、ＷまたはＹ）によって特徴付けられる。Ｂ７スーパーモチーフに結
合するＨＬＡ分子（すなわち、ＨＬＡ−Ｂ７スーパータイプ）の対応するファミ
リーは、Ｂ*０７０２、Ｂ*０７０３、Ｂ*０７０４、Ｂ*０７０５、Ｂ*１５０８
、Ｂ*３５０１、Ｂ*３５０２、Ｂ*３５０３、Ｂ*３５０４、Ｂ*３５０５、Ｂ*３
５０６、Ｂ*３５０７、Ｂ*３５０８、Ｂ*５１０１、Ｂ*５１０２、Ｂ*５１０３
、Ｂ*５１０４、Ｂ*５１０５、Ｂ*５３０１、Ｂ*５４０１、Ｂ*５５０１、Ｂ*５
５０２、Ｂ*５６０１、Ｂ*５６０２、Ｂ*６７０１、およびＢ*７８０１を含む少
なくとも２６個のＨＬＡ−Ｂタンパク質からなる（例えば、Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２４７，１９９５；Ｂａｒｂｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｂ
ｉｏｌ．５：１７９，１９９５；Ｈｉｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３６０：４３４，
１９９２；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１：１７
８，１９９５を参照のこと）。Ｂ７スーパーファミリーのメンバーであることが
予測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表ＶＩに示される。以下に詳細
に説明されるように、個々の対立遺伝子特異的ＨＬＡタンパク質の各々に結合す
るペプチドは、ペプチドの一次および／または二次アンカー位置における置換、
好ましくは、スーパーモチーフに特異化されたそれぞれの残基を選択することに
よって調節され得る。
【００９２】 Ｂ７スーパーモチーフを含むペプチドエピトープは、表ＸＩに記載される。
【００９３】 （ＩＶ．Ｄ．６．ＨＬＡ−Ｂ２７スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ２７スーパーモチーフは、エピトープの２位における一次アンカー
として、正電荷の残基（Ｒ、ＨまたはＫ）のペプチドリガンドにおける存在によ
って特徴付けられ、そしてエピトープのＣ末端位における一次アンカーとして、
疎水性の残基（Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ｉ、ＡまたはＶ）のペプチドリガンドにお
ける存在によって特徴付けられる。Ｂ２７スーパーモチーフ（すなわち、Ｂ２７
スーパータイプ）に結合するＨＬＡ分子の対応するファミリーの例示的なメンバ
ーは、少なくともＢ*１４０１、Ｂ*１４０２、Ｂ*１５０９、Ｂ*２７０２、Ｂ*
２７０３、Ｂ*２７０４、Ｂ*２７０５、Ｂ*２７０６、Ｂ*３８０１、Ｂ*３９０
１、Ｂ*３９０２、およびＢ*７３０１を含む。Ｂ２７スーパーファミリーのメン
バーであることが予測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表ＶＩに示さ
れる。対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子の各々に結合するペプチドは、一次および／
または二次アンカー位置における置換、好ましくは、スーパーモチーフに特異化
されたそれぞれの残基を選択することによって調節され得る。
【００９４】 Ｂ２７スーパーモチーフを含むペプチドエピトープは、表ＸＩＩに記載される
。
【００９５】 （ＩＶ．Ｄ．７．ＨＬＡ−Ｂ４４スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ４４スーパーモチーフは、エピトープの２位における一次アンカー
として、負電荷の残基（ＤまたはＥ）のペプチドリガンドにおける存在によって
特徴付けられ、そしてエピトープのＣ末端位における一次アンカーとして、疎水
性残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、ＶまたはＡ）の存在によって特徴付けられる
。Ｂ４４スーパーモチーフ（すなわち、Ｂ４４スーパータイプ）に結合するＨＬ
Ａ分子の対応するファミリーの例示的なメンバーは、少なくともＢ*１８０１、
Ｂ*１８０２、Ｂ*３７０１、Ｂ*４００１、Ｂ*４００２、Ｂ*４００６、Ｂ*４４
０２、Ｂ*４４０３、およびＢ*４００６を含む。対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子の
各々に結合するペプチドは、一次および／または二次アンカー位置における置換
、好ましくは、スーパーモチーフに特異化されたそれぞれの残基を選択すること
によって調節され得る。
【００９６】 （ＩＶ．Ｄ．８．ＨＬＡ−Ｂ５８スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ５８スーパーモチーフは、エピトープの２位における一次アンカー
残基として、小さな脂肪族残基（Ａ、ＳまたはＴ）のペプチドリガンドにおける
存在によって特徴付けられ、そしてエピトープのＣ末端位における一次アンカー
残基として、芳香族または疎水性残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、ＭまたはＡ）
の存在によって特徴付けられる。Ｂ５８スーパーモチーフ（すなわち、Ｂ５８ス
ーパータイプ）に結合するＨＬＡ分子の対応するファミリーの例示的なメンバー
は、少なくともＢ*１５１６、Ｂ*１５１７、Ｂ*５７０１、Ｂ*５７０２、および
Ｂ*５８０１を含む。Ｂ５８スーパーファミリーのメンバーであることが予測さ
れる他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表ＶＩに示される。対立遺伝子特異的
分子の各々に結合するペプチドは、一次および／または二次アンカー位置におけ
る置換、好ましくは、スーパーモチーフに特異化されたそれぞれの残基を選択す
ることによって調節され得る。
【００９７】 Ｂ５８スーパーモチーフを含むペプチドエピトープは、表ＸＩＩＩに記載され
る。
【００９８】 （ＩＶ．Ｄ．９．ＨＬＡ−Ｂ６２スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ６２スーパーモチーフは、エピトープの２位における一次アンカー
として、極性の脂肪族残基Ｑまたは疎水性の脂肪族残基（Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｉまたは
Ｐ）のペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられ、そしてエピトープ
のＣ末端位における一次アンカーとして、疎水性残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｖ
、ＬまたはＡ）の存在によって特徴付けられる。Ｂ６２スーパーモチーフ（すな
わち、Ｂ６２スーパータイプ）に結合するＨＬＡ分子の対応するファミリーの例
示的なメンバーは、少なくともＢ*１５０１、Ｂ*１５０２、Ｂ*１５１３、およ
びＢ*５２０１を含む。Ｂ６２スーパーファミリーのメンバーであることが予測
される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表ＶＩに示される。対立遺伝子特異
的ＨＬＡ分子の各々に結合するペプチドは、一次および／または二次アンカー位
置における置換、好ましくは、スーパーモチーフに特異化されたそれぞれの残基
を選択することによって調節され得る。
【００９９】 Ｂ６２スーパーモチーフを含むペプチドエピトープは、表ＸＩＶに記載される
。
【０１００】 （ＩＶ．Ｄ．１０．ＨＬＡ−Ａ１モチーフ） ＨＬＡ−Ａ１モチーフは、エピトープの２位における一次アンカー残基として
、Ｔ、ＳまたはＭのペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられ、そし
てエピトープのＣ末端位における一次アンカー残基として、Ｙの存在によって特
徴付けられる。代替の対立遺伝子特異的Ａ１モチーフは、２位よりむしろ３位に
おける一次アンカー残基によって特徴付けられる。このモチーフは、エピトープ
の３位における一次アンカー残基として、Ｄ、Ｅ、ＡまたはＳの存在によって特
徴付けられ、そしてＣ末端位における一次アンカー残基として、Ｙの存在によっ
て特徴付けられる。ＨＬＡ Ａ１に結合するペプチドは、一次および／または二
次アンカー位置における置換、好ましくは、このモチーフに特異化されたそれぞ
れの残基を選択することによって調節され得る。
【０１０１】 Ａ１モチーフのいずれかを含むペプチドエピトープは、表ＸＶに記載される。
２位にＴ、ＳまたはＭを、およびＣ末端位にＹを含むエピトープはまた、表ＶＩ
Ｉに列挙されるＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープの表に含
まれる。
【０１０２】 （ＩＶ．Ｄ．１１．ＨＬＡ−Ａ*０２０１モチーフ） ＨＬＡ−Ａ２*０２０１モチーフは、９残基ペプチドの２位における一次アン
カー残基として、ＬまたはＭのペプチドリガンドにおける存在によって特徴付け
られ、そして９残基ペプチドのＣ末端位における一次アンカー残基として、Ｌま
たはＶの存在によって特徴付けられることが決定された（Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３５１：２９０−２９６，１９９１）。Ａ*０２０１モチーフは、９アミ
ノ酸ペプチドの２位においてＩを、Ｃ末端においてＩまたはＡをさらに含むこと
が決定された（Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１２６１−１２６３，Ｍ
ａｒｃｈ ６，１９９２；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５
８０−３５８７，１９９２）。続いて、Ａ*０２０１対立遺伝子特異的モチーフ
は、本発明者らによって、Ｖ、Ａ、ＴまたはＱを、エピトープの２位における一
次アンカー残基としてさらに含むことが規定され、そしてＭを、Ｃ末端位におけ
る一次アンカー残基として含むことが規定されている。さらに、Ａ*０２０１対
立遺伝子特異的モチーフは、Ｃ末端位に、Ｔを含むことが見出された（Ｋａｓｔ
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９０４−３９１２，１９９４）。従って、
ＨＬＡ−Ａ*０２０１モチーフは、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＴまたはＱを有するペ
プチドリガンドを、エピトープの２位における一次アンカー残基として含み、そ
してＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＡまたはＴを、エピトープのＣ末端位における一次アンカ
ー残基として含む。ＨＬＡ−Ａ*０２０１モチーフの一次アンカー位置を特徴付
ける好ましくかつ寛容される残基は、Ａ２スーパーモチーフを示す残基と同一で
ある（関連のデータの総説については、例えば、Ｄｅｌ Ｇｕｅｒｃｉｏら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６８５−６９３，１９９５；Ｒｕｐｐｅｒｔら、Ｃ
ｅｌｌ ７４：９２９−９３７，１９９３；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｔｏｄａｙ １７：２６１−２６６，１９９６；ＳｅｔｔｅおよびＳｉｄｎｅｙ
，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４７８−４８２，１９９
８を参照のこと）。Ａ*０２０１モチーフを特徴付ける二次アンカー残基は、本
明細書中で開示されるように、さらに定義されている。これらは、表ＩＩに開示
される。ＨＬＡ−Ａ*０２０１分子に結合するペプチドは、一次および／または
二次アンカー位置における置換、好ましくは、このモチーフに特異化されたそれ
ぞれの残基を選択することによって調節され得る。
【０１０３】 Ａ*０２０１を含むペプチドエピトープは、表ＶＩＩＩに記載される。一次ア
ンカー残基Ｖ、Ａ、ＴまたはＱを、２位に含み、Ｌ、Ｉ、Ｖ、ＡまたはＴを、Ｃ
末端位に含むＡ*０２０１モチーフは、本明細書中で、本願発明に特に最も関連
するものである。
【０１０４】 （ＩＶ．Ｄ．１２．ＨＬＡ−Ａ３モチーフ） ＨＬＡ−Ａ３モチーフは、エピトープの２位における一次アンカー残基として
、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｃ、ＧまたはＤのペプチドリガンドにおけ
る存在によって特徴付けられ、そしてエピトープのＣ末端位における一次アンカ
ー残基として、Ｋ、Ｙ、Ｒ、Ｈ、ＦまたはＡの存在によって特徴付けられる。Ｈ
ＬＡ−Ａ３に結合するペプチドは、一次おおよび／または二次アンカー位置にお
ける置換、好ましくはこのモチーフに特異化されたそれぞれの残基を選択するこ
とによって調節され得る。
【０１０５】 Ａ３スーパーモチーフの一次アンカー残基は、Ａ３−およびＡ１１−対立遺伝
子特異的モチーフの一次アンカー残基のサブセットを含む。Ａ３モチーフを含む
ペプチドエピトープは、表ＸＶＩに記載される。Ａ３スーパーモチーフを含むペ
プチドエピトープはまた、表ＩＸに列挙される。
【０１０６】 （ＩＶ．Ｄ．１３．ＨＬＡ−Ａ１１モチーフ） ＨＬＡ−Ａ１１モチーフは、エピトープの２位における一次アンカー残基とし
て、Ｖ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｎ、Ｃ、ＤまたはＦのペプチドリガンド
における存在によって特徴付けられ、そしてエピトープのＣ末端位における一次
アンカー残基として、Ｋ、Ｒ、ＹまたはＨの存在によって特徴付けられる。ＨＬ
Ａ−Ａ１１に結合するペプチドは、一次および／または２次アンカー位置におけ
る置換、好ましくはこのモチーフに特異化されたそれぞれの残基を選択すること
によって、調節され得る。
【０１０７】 Ａ１１モチーフを含むペプチドエピトープは、表ＸＶＩＩに記載され、Ａ３対
立遺伝子特異的モチーフを含むペプチドエピトープもまた、Ａ３モチーフの一次
アンカー特異性とＡ１１モチーフの一次アンカー特異性との間の重なりのため、
この表に示される。さらに、Ａ３スーパーモチーフを含むペプチドエピトープも
また、表ＩＸに列挙される。
【０１０８】 （ＩＶ．Ｄ．１４．ＨＬＡ−Ａ２４モチーフ） ＨＬＡ−Ａ２４モチーフは、位置２における一次アンカー残基としてＹ、Ｆ、
Ｗ、またはＭ、およびこのエピトープのＣ末端位置における一次アンカー残基と
してＦ、Ｌ、Ｉ、またはＷのペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けら
れる。ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合するペプチドは、一次および／または二次のア
ンカー位置における置換；好ましくは、このモチーフに特異化されたそれぞれの
残基を選択することによって調節され得る。
【０１０９】 Ａ２４モチーフを含むペプチドエピトープは、表ＸＶＩＩＩに示される。これ
らのエピトープはまた、表Ｘにおいて列挙され、これは、Ａ２４対立遺伝子特異
的モチーフを特徴付ける一次アンカー残基が、Ａ２４スーパーモチーフ一次アン
カー残基のサブセットを含むので、ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフ保有ペプチ
ドエピトープを示す。
【０１１０】 （ＨＬＡクラスＩＩ結合モチーフ） 以下に描写したＨＬＡクラスＩＩペプチドエピトープスーパーモチーフならび
にモチーフの一次および二次のアンカー残基は、表ＩＩＩに要約される。
【０１１１】 （ＩＶ．Ｄ．１５．ＨＬＡ−ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフ） モチーフはまた、３つの共通のＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子
（ＨＬＡ ＤＲＢ１*０４０１、ＨＬＡ ＤＲＢ１*０１０１、およびＨＬＡ Ｄ
ＲＢ１*０７０１）に結合するペプチドについて同定された。集合的に、これら
のモチーフ由来の共通の残基は、ＨＬＡ ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフを
描写する。これらのＤＲ分子に結合するペプチドは、位置１における一次アンカ
ー残基として大きな芳香族残基または疎水性残基（Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、ま
たはＭ）、および９マーのコア領域の位置６における一次アンカー残基として小
さな非電荷残基（Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ａ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭ）によって特徴付
けられるスーパーモチーフを保有する。これらのＨＬＡ型の各々についての対立
遺伝子特異的二次エフェクター（ｅｆｆｅｃｔ）および二次アンカーはまた、同
定されている。これらは、表ＩＩＩにおいて示される。ＨＬＡ ＤＲＢ１*０４
０１、ＨＬＡ ＤＲＢ１*０１０１、および／またはＨＬＡ ＤＲＢ１*０７０１
に結合するペプチドは、一次および／または二次のアンカー位置における置換、
好ましくは、スーパーモチーフに特異化されたそれぞれの残基を選択することに
よって調節され得る。
【０１１２】 本分析のために使用されたＨＣＶ株の保存されたペプチドエピトープ（すなわ
ち、７９％以上（１１／１４以上）で保存されている）は、ＤＲ−１−４−７ス
ーパーモチーフを含む９残基のコア（９残基のコアが７９％以上で保存されてい
る）を含むエピトープに対応するように記載され得る（ここで、このモチーフの
位置１は、９残基のコアの位置１にある）。保存された９マーのコア領域は、表
ＸＩＸａにおいて示される。１５アミノ酸残基長のそれぞれの例示的なペプチド
エピトープ（その各々は、保存された９残基のコアを含む）はまた、表の「ａ」
節において示される。例示的な１５残基のスーパーモチーフ保有ペプチドについ
ての交差反応結合データは、表ＸＩＸｂにおいて示される。
【０１１３】 （ＩＶ．Ｄ．１６．ＨＬＡ−ＤＲ３モチーフ） ２つの代替的なモチーフ（すなわち、スーパーモチーフ）は、ＨＬＡ−ＤＲ３
分子に結合するペプチドエピトープを特徴付ける。第１のモチーフ（サブモチー
フＤＲ３Ａ）において、大きな疎水性残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、またはＹ）は
、９マーコアのアンカー位置１において存在し、そしてＤは、このエピトープの
カルボキシル末端に向かって位置４においてアンカーとして存在する。他のクラ
スＩＩモチーフなどの場合、コア位置１は、ペプチドＮ末端位置を占有してもよ
いし、占有しなくてもよい。
【０１１４】 代替のＤＲ３サブモチーフは、このエピトープのカルボキシル末端に向かう位
置６における正電荷の存在によって、アンカー位置１における大きな疎水性残基
の欠失、および／または位置４における負に荷電したアンカー残基か、もしくは
アミド様アンカー残基の欠失を規定する。従って、代替の対立遺伝子特異的ＤＲ
３モチーフ（スーパーモチーフＤＲ３Ｂ）について、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、
Ａ、またはＹは、アンカー位置１において存在する；Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｓ、また
はＴは、アンカー位置４において存在する；そしてＫ、Ｒ、またはＨは、アンカ
ー位置６において存在する。ＨＬＡ−ＤＲ３に結合するペプチドは、一次および
／または二次のアンカー位置における置換、好ましくは、このモチーフに特異化
されたそれぞれの残基を選択することによって調節され得る。
【０１１５】 ＤＲ３Ａスーパーモチーフを含む９残基の配列（ここで、このモチーフの位置
１は、９残基のコアの位置１にある）に対応する保存された９マーのコア領域（
すなわち、この分析のために使用された１４ＨＣＶ株の少なくとも７９％保存さ
れている配列）は、表ＸＸａにおいて示される。１５アミノ酸残基長のそれぞれ
の例示的なペプチドエピトープ（その各々は、保存された９残基のコアを含む）
はまた、表ＸＸａにおいて示される。表ＸＸｂは、例示的なＤＲ３サブモチーフ
Ａ保有ペプチドの結合データを示す。
【０１１６】 ＤＲ３Ｂサブモチーフを含む保存された９マーのコア領域（すなわち、この分
析のために使用された１４ＨＣＶ株の少なくとも７９％保存されている配列）お
よびＤＲ３サブモチーフＢエピトープを含むそれぞれの例示的な１５マーのペプ
チドは、表ＸＸｃにおいて示される。表ＸＸｄは、例示的なＤＲ３サブモチーフ
Ｂ保有ペプチドの結合データを示す。
【０１１７】 本明細書中の表に示されているＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩのペプチドエ
ピトープの各々は、本願の発明の局面であることが単独で判断される。さらに、
各々のペプチドエピトープが、任意の他のペプチドエピトープと組み合わせて使
用され得ることもまた、本願の発明の局面である。
【０１１８】 （ＩＶ．Ｅ．ワクチンの増大する集団適用範囲） 広範な集団適用範囲を有するワクチンが好ましい。なぜなら、このワクチンは
、より商業的に実行可能であり、そして一般的に、ほとんどの人々に適用可能で
あるからである。広範な集団適用範囲は、全てが考慮される場合、この集団のほ
とんどに存在するＨＬＡ対立遺伝子に結合するペプチドエピトープを選択するこ
とを通じて、本発明のペプチド（およびこのようなペプチドをコードする核酸組
成物）を用いて得られ得る。表ＸＸＩは、種々の民族性におけるＨＬＡクラスＩ
スーパータイプの全体の頻度（表ＸＸＩａ）、ならびにＡ２スーパータイプ、Ａ
３スーパータイプ、およびＢ７スーパータイプによって達成される組み合わされ
た集団適用範囲（表ＸＸＩｂ）を列挙する。このＡ２スーパータイプ、Ａ３スー
パータイプ、およびＢ７スーパータイプは、５つの主な民族集団の各々において
４０％を超える平均値でそれぞれ存在する。８０％より多い範囲は、これらのス
ーパーモチーフの組み合わせを用いて達成されることを示唆する。これらの結果
は、効果的で、かつ非民族的に偏った集団適用範囲は、制限数の交差反応ペプチ
ドの使用の際に達成される。これらの３つの主なペプチド特異性を用いて達した
集団適用範囲は高いが、範囲は拡大され、９５％およびそれを超える集団適用範
囲に達し得、そしてさらなるスーパーモチーフ保有ペプチドまたは対立遺伝子特
異的モチーフ保有ペプチドの使用の際の正確な多重特異性応答をより容易に達成
する。
【０１１９】 Ｂ４４スーパータイプ、Ａ１スーパータイプ、およびＡ２４スーパータイプは
、これらの主な民族集団において平均２５％〜４０％の範囲内で存在する（表Ｘ
ＸＩａ）。全体としてあまり一般的ではないが、Ｂ２７スーパータイプ、Ｂ５８
スーパータイプ、およびＢ６２スーパータイプは、各々、少なくとも１つの主な
民族集団において２５％を超える頻度で存在する（表ＸＸＩａ）。表ＸＸＩｂは
、５つの主な民族集団において同定されたＨＬＡスーパータイプの組み合わせの
評価された普及を要約する。Ａ２範囲、Ａ３範囲、およびＢ７範囲、または本明
細書中に記載されるスーパータイプの全てへの、Ａ１スーパータイプ、Ａ２４ス
ーパータイプ、およびＢ４４スーパータイプの包括によって得られる追加の範囲
が示される。
【０１２０】 Ａ２スーパータイプ、Ａ３スーパータイプおよびＢ７スーパータイプの先の定
義とともに本明細書中に示されるデータは、Ａ２９、Ｂ８、およびＢ４６の可能
な除外とともに全ての抗原は、全部で９つのＨＬＡスーパータイプに分類され得
ることを示す。６つの最も頻度の高いスーパータイプ由来のエピトープを含むこ
とによって、９９％の平均集団適用範囲が、５つの主な民族集団について得られ
得る。
【０１２１】 （ＩＶ．Ｆ．免疫応答刺激ペプチドアナログ） 一般的には、ＣＴＬおよびＨＴＬ応答は、全ての可能なエピトープに対して指
向されない。それどころか、それらは、少数の「免疫優性（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍ
ｉｎａｎｔ）」決定基に制限される（Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌら、Ａｄｖ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．２７：５１５９，１９７９；Ｂｅｎｎｉｎｋら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１６８：１９３５−１９３９（１９８８）；Ｒａｗｌｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１４６：３９７７−３９８４（１９９１））。免疫優性（Ｂｅｎａｃｅｒ
ｒａｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １７５：２７３−２７９（１９７２））は、所定の
エピトープの特定のＨＬＡタンパク質を選択的に結合する能力（決定基選択理論
）（Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：１６３５（１９８３）
；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら、Ｎａｔｕｒｅ ２６７：１５６−１５８（１９７７）
）または既存のＴＣＲ（Ｔ細胞レセプター）特異性（レパートリー理論）によっ
て選択的に認識する能力（Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．，ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＴＨＥ
ＳＣＩＥＮＣＥ ＯＦ ＳＥＬＦＮＯＮＳＥＬＦ ＤＩＳＣＲＩＭＩＮＡＴＩＯ
Ｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２７０−３１０
頁（１９８２））のいずれかによって説明され得る。主にプロセシング事象と関
連しているさらなる因子はまた、厳密な免疫原性を超えて決定することにおいて
重要な役割を果し得ることが証明された。多くの可能な決定基の厳密な免疫原性
は、免疫優性として示される（Ｓｅｒｃａｒｚら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１１：７２９−７６６（１９９３））。
【０１２２】 優性および亜優性の概念は、感染病および癌の両方の免疫療法と関連する。例
えば、慢性ウイルス疾患の経過において、亜優性エピトープの補充は、特に、優
性ＣＴＬ特異性または優性ＨＴＬ特異性が、ウイルス機構および他の機構の機能
的寛容、抑制、変異によって不活化されている場合、感染の首尾よいクリアラン
スのために重要であり得る（Ｆｒａｎｃｏら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．７：５２４−５３１（１９９５））。癌抗原および腫瘍抗原の場合、最も
高い結合親和性ペプチドの少なくともいくつかを認識するＣＴＬは、機能的に不
活化され得る。このような場合、より低い結合親和性ペプチドは、優先的に認識
され、従って、治療的または予防的な抗癌ワクチンにおいて好ましい。
【０１２３】 特に、公知の非ウイルス腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来の十分な数のエピトープ
が、ＨＬＡクラスＩに中間の親和性（５０〜５００ｎＭの範囲のＩＣ50）で結合
することが注目されている。例えば、１５個の公知のＴＡＡペプチドのうち８個
が、５０〜５００ｎＭ範囲で結合される腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）またはＣ
ＴＬによって認識したことが見出されている。これらのデータは、公知のウイル
ス抗原の９０％が、５０ｎＭ未満のＩＣ50でＨＬＡクラスＩ分子によって結合さ
れたが、５０〜５００ｎＭ範囲においては、約１０％のみが結合したという評価
とは対称的である（Ｓｅｔｔｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５３：５５８−５
５９２（１９９４））。癌の周辺環境において、この現象は、最も高い結合ペプ
チドのいくつかを認識するＣＴＬの排除または機能的阻害に起因する。これは、
おそらくＴ細胞寛容事象のためである。
【０１２４】 理論に拘束されることを意図しないで、優性エピトープに対するＴ細胞が、ク
ローン的に排除され得るので、亜優性エピトープの選択は、既存のＴ細胞を補充
することを可能にし得、次いで、これは、治療的または予防的応答を導くと考え
られる。しかし、ＨＬＡ分子の亜優性エピトープへの結合は、しばしば、優性の
エピトープに対してよりも活動的ではない。従って、１つ以上のＨＬＡ分子に対
する特定の免疫原性エピトープの結合親和性を調節し得、それによって、ペプチ
ドによって誘発される免疫応答を調節し、例えば、より活動的な応答を誘発する
アナログペプチドを調製することが必要である。この能力は、ペプチドベースの
ワクチンおよび治療剤の有用性を非常に増強する。
【０１２５】 スーパーファミリーの全ての対立遺伝子間の適切な交差反応性を有するペプチ
ドが上記のスクリーニング手順によって同定されるが、交差反応性は、必ず可能
な限り常に完全とは限らず、そして、特定の場合において、ペプチドの交差反応
性を増加させる手順は、有用であり得る；さらに、このような手順をまた使用し
て、このペプチドの他の特性（例えば、結合親和性またはペプチド安定性）を改
変し得る。所定のモチーフまたはスーパーモチーフ内のＨＬＡ対立遺伝子につい
てのペプチドの交差反応性を支配する一般的な規定を確立したが、特定の目的の
ペプチドの構造の変更（すなわち、アナログ化）は、より広範な（もしくは、他
の改変された）ＨＬＡ結合能力を達成するために、実行され得る。より詳細には
、最も広い交差反応パターンを示すペプチドが、本明細書中の教示に従って作製
され得る。本概念は、アナログ作製に関して、１／６／９９に出願された同時係
属中のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／２２６，７７５においてより詳細に示される。
【０１２６】 簡潔には、使用したストラテジーは、特定のＨＬＡ分子への結合と関連するモ
チーフまたはスーパーモチーフを利用する。このモチーフまたはスーパーモチー
フは、一次アンカーおよび多くの場合、二次アンカーを有することによって定義
される。アナログペプチドは、一次アンカー、二次アンカーにおいて、または一
次アンカー位置および二次アンカー位置においてアミノ酸残基を置換することに
よって作製され得る。一般的には、アナログは、すでにモチーフまたはスーパー
モチーフを保有するペプチドについて作製される。ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡ
クラスＩＩ結合ペプチドについて規定されているスーパーモチーフおよびモチー
フの好ましい二次アンカー残基は、表ＩＩおよびＩＩＩにそれぞれ示される。
【０１２７】 本発明に従って、多数のモチーフまたはスーパーモチーフについて、それぞれ
のモチーフまたはスーパーモチーフを結合するＨＬＡスーパータイプの対立遺伝
子特異的ＨＬＡ分子またはメンバーに結合することが有害である残基が規定され
る（表ＩＩおよびＩＩＩ）。従って、結合が有害であるこのような残基の除去が
、本発明に従って実行され得る。例えば、Ａ３スーパータイプの場合、このよう
な有害な残基を有する全てのペプチドが、分析されたペプチドの集団から除去さ
れると、交差反応性率が、２２％から３７％に上昇する（例えば、Ｓｉｄｎｅｙ
，Ｊ．ら、Ｈｕ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９，１９９６を参照のこと）。従っ
て、所定のスーパーモチーフ内のペプチドの交差反応性を改善する１つのストラ
テジーは、単に、ペプチド内に存在する１つ以上の有害なを除去し、そして（ペ
プチドのＴ細胞認識に影響を与えない）小さな「中性」残基（例えば、Ａｌａ）
を置換することである。ペプチド内の有害な残基の除去とともに、スーパーファ
ミリー内の、対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子に、または複数のＨＬＡ分子への高い
親和性での結合に関連する「好ましい」残基が挿入される場合、交差反応性の増
強の可能性が予期される。
【０１２８】 ワクチンとして使用される場合、アナログペプチドが、インビボでネイティブ
エピトープに対するＣＴＬ応答を実際に誘発する（またはクラスＩＩエピトープ
の場合、野生型ペプチドと交差反応するヘルパーＴ細胞を誘発する）ことを確実
にするために、このアナログペプチドは、適切なＨＬＡ対立遺伝子の個体からイ
ンビトロでＴ細胞を免疫するために使用され得る。その後、免疫された細胞の、
野生型ペプチドに感作した標的細胞の溶解を誘導する能力が評価される。これは
、内因的に産生された抗原がまた、関連のＴ細胞によって認識されるか否かを確
立するために、抗原提示細胞として、適切な遺伝子を用いて感染またはトランス
フェクトのいずれかをされた細胞、あるいはクラスＩＩエピトープのみの場合は
、タンパク質抗原全体を用いてパルスされた細胞を使用することが望ましい。
【０１２９】 本発明の別の実施形態は、弱く結合するアナログを作製し、それによって、適
当な数の交差反応細胞結合因子を確実にすることである。５００〜５０００ｎＭ
の結合親和性を示し、１つまたは両方の位置において適用可能であるが、最適下
限の一次アンカーを有するクラスＩ結合ペプチドは、それぞれのスーパータイプ
に従って、好ましいアンカー残基を置換することによって「固定」され得る。次
いで、このアナログペプチドは、交差結合活性について試験され得る。
【０１３０】 効果的なペプチドアナログを作製するための別の実施形態は、ペプチド安定性
または可溶性（例えば、液体環境下で）に対する不都合な影響を有する残基の置
換を含む。この置換は、ペプチドエピトープのいずれかの位置で生じ得る。例え
ば、システイン（Ｃ）は、αアミノ酪酸で優先して置換され得る。この化学的性
質のために、システインは、ジスルフィド結合を形成する性向を有し、そしてペ
プチドを構造的に十分に改変し、結合能力を減少する。Ｃのαアミノ酪酸での置
換は、この問題を多少とも解決するだけでなく、特定の例（例えば、Ｓｅｔｔｅ
らによる概説、Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ Ｖｉｒａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，Ｒ
．ＡｈｍｅｄおよびＩ．Ｃｈｅｎ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，英
国（１９９９）を参照のこと）において結合能力および交差結合能力を実際に改
善する。システインのαアミノ酪酸での置換は、ペプチドエピトープのいずれか
の残基（すなわち、アンカー位置または非アンカー位置のいずれかにおいて）に
おいて生じ得る。
【０１３１】 代表的なアナログペプチドは、表ＸＸＩＩに示される。表は、適切である場合
、アナログペプチドおよびモチーフまたはスーパーモチーフの長さもしくは配列
を示す。「固定された命名」の列にある情報は、それぞれのアナログについての
示された位置番号において置換された残基を示す。
【０１３２】 （ＩＶ．Ｇ．スーパーモチーフまたはモチーフを含有するペプチドについての
、疾患関連抗原由来タンパク質配列のコンピュータースクリーニング） 標的抗原におけるスーパーモチーフ保有エピトープまたはモチーフ保有エピト
ープを同定するために、ネイティブなタンパク質配列（例えば、腫瘍関連抗原）
、または感染生物由来の配列、または移植のためのドーナー組織由来の配列を、
例えば、理論的予測（ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ）を
計算するための手段またはコンピューターを使用してスクリーニングして、配列
内のスーパーモチーフまたはモチーフの存在を決定する。ネイティブなペプチド
の分析から得られた情報が、ネイティブなペプチドの状態を評価するために直接
使用され得るか、またはペプチドエピトープを生成するために引き続き利用され
得る。
【０１３３】 本願のスーパーモチーフまたはモチーフの発現のためのタンパク質配列を迅速
にスクリーニングすることを可能にするコンピュータープログラムは、本発明に
より包含され、アナログペプチドの生成を可能にするプログラムも同様に含まれ
る。これらのプログラムは、任意の同定されたアミノ酸配列を分析するかまたは
、未知の配列に関して操作し、そして同時に配列を決定し、そしてそのモチーフ
保有エピトープを同定することが実行され；アナログが、その上、同時に決定さ
れ得る。一般的に、同定された配列は、病原性生物または腫瘍関連ペプチド由来
である。例えば、本明細書中で考えられる標的分子としては、限定されず、ＨＣ
Ｖの、コア領域、Ｓ領域、Ｅ１領域、ＮＳ１／Ｅ２領域、ＮＳ２領域、ＮＳ３領
域、ＮＳ４領域、およびＮＳ５領域が挙げられる。
【０１３４】 同じ標的タンパク質の複数の改変体の配列が可能である場合、ペプチドはまた
、それらの保存に基づいて選択され得る。保存について現在好ましい基準は、Ｈ
ＬＡクラスＩ結合ペプチドの配列全体またはクラスＩＩ結合ペプチドの９マーコ
ア全体が、特定のタンパク質に関して、評価される配列の少なくとも７９％にお
いて完全に（すなわち、１００％）保存されることを規定する。保存のこの規定
は、本明細書中で使用されている；けれど、当業者に理解されるように、保存の
より高いかまたはより低い程度は、所定の抗原標的に対して適切であるように使
用され得る。
【０１３５】 ペプチド結合の予測のために利用される選択基準は、実際の結合と最も効率的
に対応するために、可能な限り正確であることが重要である。適切な一次アンカ
ーの存在に基づいて、例えば、ＨＬＡ−Ａ*０２０１に結合するペプチドの予測
は、約３０％の割合でポジティブである（例えば、Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．ら、Ｃ
ｅｌｌ ７４：９２９，１９９３）。しかし、本明細書中に開示されるペプチド
−ＨＬＡ結合データ、関連特許出願におけるデータ、および当該分野におけるデ
ータを徹底的に分析することにより、本発明者らは、一次アンカー残基単独の存
在に基づく同定に対して、予測値を劇的に増大する多数の対立遺伝子特異的多項
式アルゴリズムを開発した。これらのアルゴリズムは、一次アンカーの存在また
は非存在を考慮するだけでなく、（異なる位置における異なるアミノ酸の影響を
説明するために）二次アンカー残基の、ポジティブな（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）存在
または有害な（ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ）存在も考慮に入れる。このアルゴリズ
ムは、本質的に、ペプチドＨＬＡ相互作用の全体の親和性（またはΔＧ）がこの
型の一次多項式関数として近似され得るという前提に基づき： ΔＧ＝ａ1i×ａ2i×ａ3i・・・×ａni ここで、ａjiは、ｎ個のアミノ酸のペプチドの配列に沿った、所定の位置（ｉ）
における所定のアミノ酸（ｊ）の存在の効果を示す係数である。この方法の重要
な仮定は、各位置における効果が、本質的に、各他の位置の効果と独立している
ことである。この仮定は、このペプチドがＨＬＡ分子に結合され、かつ本質的に
延長された構造においてＴ細胞により認識されることを示す研究により立証され
る。特定のアルゴリズム係数の誘導が、例えば、Ｇｕｌｕｋｏｔａ，Ｋ．ら、Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６７：１２５８，１９９７に記載されている。
【０１３６】 特定のモチーフをまた利用する、好ましいペプチド配列を同定するためのさら
なる方法は、神経網の使用および分子モデルプログラムの使用を含む（例えば、
Ｍｉｌｉｋら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：７５３，１
９９８；Ａｌｔｕｖｉａら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５８：１、１９９７；Ａ
ｌｔｕｖｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４９：２４４，１９９５；Ｂｕｕｓ
，Ｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：２０９−２１３、１９９９
；Ｂｒｕｓｉｃ，Ｖ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４：１２１−１３
０、１９９８；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３，１９９
３；Ｍｅｉｓｔｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ １３：５８１、１９９５；Ｈａｍｍｅ
ｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３５３，１９９４；Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ
ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：５５５ １９９９を参照のこ
と）。
【０１３７】 例えば、少なくとも１つの好ましい二次アンカー残基を含むＡ*０２０１モチ
ーフ保有ペプチドのセットにおいて、任意の有害な二次アンカー残基の存在を回
避しながら、ペプチドの６９％が、５００ｎＭ未満のＩＣ50を有するＡ*０２０
１を結合することが示されている（Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ ７４：
９２９，１９９３）。これらのアルゴリズムはまた、カットオスコアが、所望の
ように、より大きいかまたはより低い予測結合特性を有するペプチドのセットを
選択するために調節され得る点で、柔軟である。
【０１３８】 ペプチドエピトープを同定するためのコンピュータースクリーニングを利用す
ることにおいて、タンパク質配列または翻訳された配列が、モチーフを探索する
ために開発されたソフトウェア（例えば、［ＦＩＮＤＰＡＴＴＥＲＮＳ］プログ
ラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７−３
９５、１９８４）またはＭｏｔｉｆＳｅａｒｃｈ １．４ソフトウェアプログラ
ム（Ｄ．Ｂｒｏｗｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を使用して分析され、適切
なＨＬＡ結合モチーフを含む潜在的なペプチド配列を同定し得る。同定されたペ
プチドは、変更された多項式アルゴリズムを使用してスコアされ、特異的なＨＬ
ＡクラスＩ対立遺伝子またはクラスＩＩ対立遺伝子を結合するそれらペプチドの
能力を予測し得る。当業者に理解されるように、コンピュータープログラミング
ソフトウェアおよびハードウェアオプションの大きなアレイが、（例えば、限定
されず、エピトープを同定するか、１つのペプチド長あたりのエピトープ集中（
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を同定するか、またはアナログを生成するため）
公知また未知のペプチド配列を評価するため、本発明のモチーフを実行する（ｉ
ｍｐｌｅｍｅｎｔ）ために使用され得る関連する技術が利用可能である。
【０１３９】 上記の手順に従って、ＨＬＡスーパータイプ群または対立遺伝子特異的ＨＬＡ
分子を結合し得るＨＣＶペプチドエピトープおよびそのアナログが、同定された
（表ＶＩＩ−ＸＸ；表ＸＸＩＩ）。
【０１４０】 （ＩＶ．Ｈ．ペプチドエピトープの調製） 本発明に従ったペプチドは、組換えＤＮＡ技術または化学合成により、あるい
は天然の供給源（例えば、ネイティブな腫瘍または病原性生物）から合成的に調
製され得る。ペプチドエピトープは、個々に合成され得るか、またはポリエピト
ープペプチドとして合成され得る。このペプチドは、好ましくは、実質的に他の
天然に存在する宿主タンパク質およびそのタンパク質のフラグメントを含まない
が、いくつかの実施形態において、このペプチドは、ネイティブなフラグメント
または粒子に合成的に結合体化され得る。
【０１４１】 本発明に従ったペプチドは、種々の長さであり得、そして、それらの中和（荷
電していない）形態または塩の形態のいずれかであり得る。本発明に従う、ペプ
チドは、改変（例えば、グリコシル化、側鎖の酸化、またはリン酸化）されてい
ないか；またはこのペプチドがこれらの改変を含み、本明細書中に記載されるよ
うに、ペプチドの生物学的活性を破壊しない条件に供される。
【０１４２】 本発明のペプチドは、広範な種々の方法において調製され得る。好ましい、比
較的短いサイズについて、このペプチドが、従来の技術に従って、溶液中または
固体支持体上で合成され得る。種々の自動合成装置が市販され、そして公知のプ
ロトコルに従って使用され得る（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ＆ Ｙｏｕｎｇ，Ｓ
ＯＬＩＤ ＰＨＡＳＥ ＰＥＰＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、２Ｄ．ＥＤ．，
Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，１９８４を参照のこと）。さらに、
個々のペプチドエピトープが、化学的連結を使用して結合され、本発明の範囲内
になおある、より大きいペプチドを産生し得る。
【０１４３】 あるいは、組換えＤＮＡ技術が利用され得、ここで、目的の免疫原性ペプチド
をコードするヌクレオチド配列が、発現ベクター中に挿入されるか、適切な宿主
細胞に、形質転換されるかまたはトランスフェクトされて、そして発現のための
適切な条件下で培養される。これらの手順は、一般に当該分野で公知であり、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴ
ＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に一般
に記載される。従って、本発明の１つ以上のペプチド配列を含む組換えポリペプ
チドが、適切なＴ細胞エピトープを提示するために使用され得る。
【０１４４】 本明細書中で実行される好ましい長さのペプチドエピトープについての配列を
コードするヌクレオチドが、化学的技術（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ．
Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５（１９８１）のホスホトリエステル
法）により合成され得る。ペプチドアナログは、ネイティブなペプチド配列をコ
ードする塩基を適切かつ所望の核酸塩基に置換することにより、簡単に作製され
得；例示的な核酸置換は、本明細書中のモチーフ／スーパーモチーフにより規定
されるアミノ酸をコードする核酸置換である。次いで、このコード配列は、適切
なリンカーを提供され得、そして当該分野で一般に利用可能な発現ベクター、お
よび所望の融合タンパク質を産生するために適切な宿主を形質転換するために使
用されるベクターに連結され得る。多数のこのようなベクターおよび適切な宿主
系が、現在利用可能である。融合タンパク質の発現のために、コード配列は、作
動可能に連結される開始コドンおよび停止コドン、プロモーター領域およびター
ミネーター領域ならびに所望の細胞性宿主における発現のための発現ベクターを
提供する通常の複製系を提供される。例えば、細菌性宿主と互換性のあるプロモ
ーター配列が、所望のコード配列の挿入のための都合の良い制限部位を含むプラ
スミドに提供される。得られた発現ベクターは、適切な細菌性宿主に形質転換さ
れる。もちろん、酵母細胞宿主、昆虫細胞宿主または哺乳動物細胞宿主もまた、
適切なベクターおよびコントロール配列を使用して、使用され得る。
【０１４５】 ネイティブなタンパク質の免疫学的活性の全てをなお実質的に維持しながら、
ペプチドエピトープは、可能な限り小さいことがしばしば好まれる。可能な場合
、約８個〜約１３個のアミノ酸残基、好ましくは９個〜１０個のアミノ酸残基の
長さに、本発明のＨＬＡクラスＩ結合ペプチドエピトープを最適化することが所
望され得る。ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドエピトープは、約６〜約３０アミノ
酸長の長さ、好ましくは約１３個と約２０個の残基との間に、最適化され得る。
好ましくは、ペプチドエピトープは、関連ＨＬＡ分子に結合される、内因的にプ
ロセスされた病原体由来ペプチドまたは腫瘍細胞ペプチドと、サイズにおいて等
しいが、しかし、他の長さのペプチドの同定および調製もまた、本明細書中に記
載される技術を使用して、実行され得る。
【０１４６】 代替の実施形態において、本発明のペプチドが、ポリエピトープペプチドとし
て、またはポリエピトープペプチドをコードするミニ遺伝子として連結され得る
。
【０１４７】 別の実施形態において、高濃度のクラスＩエピトープおよび／またはクラスＩ
Ｉエピトープを含むネイティブなペプチド領域を同定することが好まれる。この
ような配列は、一般に、この配列が１個のアミノ酸長あたりより多数のエピトー
プを含むことに基づいて、選択される。エピトープは、フレームシフトされた様
式で存在し得ることが理解され、例えば、１０個のアミノ酸長のペプチドは、２
つの、アミノ酸長のエピトープおよび１つの、１０アミノ酸長のエピトープを含
み得；細胞内プロセシングに際して、各エピトープが、このようなペプチドの投
与の際に、ＨＬＡ分子により曝露され得、かつ結合され得る。このより大きい、
好ましくは複数のエピトープのペプチドが、合成的に、または組換え的に、また
はネイティブな供給源からの切断を介して生成され得る。
【０１４８】 （ＩＶ．Ｉ．Ｔ細胞応答を検出するためのアッセイ） 一旦ＨＬＡ結合ペプチドが同定されると、それらはＴ細胞応答を惹起する能力
について試験され得る。モチーフ保有ペプチドの調製および評価は、ＰＣＴ公開
ＷＯ ９４／２０１２７およびＷＯ ９４／０３２０５に記載される。簡潔に、
特定の抗原由来のエピトープを含むペプチドが合成され、そして適切なＨＬＡタ
ンパク質に結合するそれらの能力について試験される。これらのアッセイは、放
射ヨウ素標識された参照ペプチドの結合に関連して、精製されたＨＬＡクラスＩ
分子への本発明のペプチドの結合を評価する工程を包含する。あるいは、エンプ
ティー（ｅｍｐｔｙ）クラスＩ分子（すなわち、そこにペプチドを欠く）を発現
する細胞は、免疫蛍光染色およびフロー微蛍光測定により、ペプチド結合につい
て評価され得る。ペプチド結合を評価するために使用され得る他のアッセイとし
ては、ペプチド依存性クラスＩアセンブリアッセイおよび／またはペプチド競合
によるＣＴＬ認識の阻害が挙げられる。典型的に５００ｎＭまたはそれより小さ
い親和性で、クラスＩ分子に結合するこれらのペプチドは、さらに、感染した個
体または免疫した個体由来のＣＴＬに対する標的として機能するそれらの能力、
および疾患に関連した選択された標的細胞と反応し得るＣＴＬ集団を生じる１次
のインビトロまたはインビボＣＬＴ応答を誘導し得るそれらの能力について評価
される。対応するアッセイは、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの評価のために使
用される。典型的に１０００ｎＭまたはそれより低い親和性で結合することが示
されるＨＬＡクラスＩＩモチーフ保有ペプチドは、さらに、ＨＴＬ応答を刺激す
る能力について評価される。
【０１４９】 Ｔ細胞応答を検出するために利用される従来のアッセイとしては、増幅アッセ
イ、リンホカイン分泌アッセイ、直接的細胞傷害性アッセイ、および限界希釈ア
ッセイが挙げられる。例えば、ペプチドとともにインキュベートされる抗原提示
細胞は、レスポンダー（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）細胞集団においてＣＴＬ応答を誘
導する能力についてアッセイされ得る。抗原提示細胞は、通常の細胞（例えば、
末梢血単核細胞または樹状細胞）であり得る。あるいは、内部的でプロセシング
されたペプチドでクラスＩ分子を負荷（ｌｏａｄ）するそれらの能力を欠失し、
そして適切なヒトクラスＩ遺伝子でトランスフェクトされた変異体非ヒト哺乳動
物細胞株が、インビトロ１次ＣＴＬ応答を誘導するペプチドの能力を試験するた
めに使用され得る。
【０１５０】 末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ＣＴＬ前駆体のレスポンダー細胞供給源とし
て使用され得る。適切な抗原提示細胞は、ペプチドとともにインキュベートされ
、その後、ペプチド負荷された抗原提示細胞が、次いで、最適化された培養条件
下でレスポンダー細胞集団とインキュベートされる。陽性ＣＴＬ活性は、放射線
標識された標的細胞（特異的ペプチドパルス標的およびペプチド配列が由来する
抗原の内因的にプロセシングされた形態を発現する標的細胞の両方）を殺傷する
ＣＴＬの存在について培養物をアッセイすることによって決定され得る。
【０１５１】 より最近、フルオレセイン標識ＨＬＡテトラマー複合体を用いて染色すること
によって、抗原特異的Ｔ細胞の直接的な定量を可能にする方法が考え出されてい
る（Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ９０：１０３３０，１９９３；Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７４：９４，１９９６）。他の比較的最近の技術的な発達は、細胞内リンホ
カインに対する染色、およびインターフェロン放出アッセイまたはＥＬＩＳＰＯ
Ｔアッセイを含む。テトラマー染色、細胞内リンホカイン染色およびＥＬＩＳＰ
ＯＴアッセイは、全て、より従来のアッセイより少なくとも１０倍感度が高いよ
うである（Ｌａｌｖａｎｉ，Ａ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９，１
９９７；Ｄｕｎｂａｒ，Ｐ．Ｒ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：４１３，１９９
８；Ｍｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａ，Ｋ．ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：１７７，
１９９８）。
【０１５２】 ＨＬＴ活性化もまた、Ｔ細胞増殖およびリンホカイン（例えば、ＩＬ−２）の
分泌のような、当業者に公知のこのような技術を使用して評価され得る（例えば
、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１−７６１，１９９４を
参照のこと）。
【０１５３】 あるいは、ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫化が、ペプチドエピトープ
の免疫原性を決定するために使用され得る。ヒトＡ２．１対立遺伝子、ヒトＡ１
１対立遺伝子（これらは、ＨＬＡ−Ａ３エピトープを分析するためにさらに使用
され得る）、およびヒトＢ７対立遺伝子を有するマウスを含むいくつかのトラン
スジェニックマウスモデルが特徴付けられ、そして他のもの（例えば、ＨＬＡ−
Ａ１およびＡ２４についてのトランスジェニックマウス）が開発されている。Ｈ
ＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ３マウスモデルもまた、開発されている。他の
ＨＬＡ対立遺伝子を有するさらなるトランスジェニックマウスモデルが、必要な
らば作製され得る。マウスは、不完全フロイントアジュバント中に乳化されたペ
プチドで免疫化され得、そして生じたＴ細胞を、ペプチドパルスされた標的細胞
および適切な遺伝子でトランスフェクトされた標的細胞を認識するそれらの能力
について試験した。ＣＴＬ応答が上記の細胞傷害性アッセイを使用して分析され
得る。同様に、ＨＴＬ応答が、Ｔ細胞増殖またはリンホカインの分泌のようなア
ッセイを使用して分析され得る。
【０１５４】 例示的な免疫原性ペプチドエピトープが、表ＸＸＩＩＩに記載される。
【０１５５】 （ＩＶ．Ｊ．診断薬剤としての、および免疫応答を評価するためのペプチドエ
ピトープの使用） 本発明の１つの実施形態において、本明細書中に記載されるＨＬＡクラスＩお
よびクラスＩＩ結合ペプチドは、免疫応答を評価するための試薬として使用され
る。評価される免疫応答は、免疫源として任意の薬剤を使用することによって誘
導され得、この任意の薬剤は、試薬として使用されるペプチドエピトープ（単数
または複数）を認識しそしてそれに結合する、抗原特異的ＣＴＬまたはＨＴＬを
産生を生じ得る。このペプチド試薬は、免疫原として使用される必要がない。こ
のような分析について使用され得るアッセイ系は、比較的最近の技術開発（例え
ば、テトラマー、細胞内リホカインについての染色およびインターフェロン放出
アッセイ、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）を含む。
【０１５６】 例えば、本発明のペプチドは、腫瘍細胞抗原または免疫原への暴露に続いて、
抗原特異的ＣＴＬの存在について末梢血単核細胞を評価するためのテトラマー染
色アッセイにおいて使用され得る。ＨＬＡ−テトラマー複合体は、抗原特異的Ｃ
ＴＬを直接可視化するために使用され（例えば、Ｏｇｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
７９：２１０３−２１０６，１９９８；およびＡｌｔｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
１７４：９４−９６，１９９６）、そして末梢血単核細胞のサンプル中におけ
る抗原特異的ＣＴＬ集団の頻度を決定する。本発明のペプチドを使用するテトラ
マー試薬は、以下のように生成され得る：ＨＬＡ分子に結合するペプチドを対応
するＨＬＡ重鎖およびβ2−ミクログロブリンの存在下でリフォールディリング
して、３分子複合体を生成する。この複合体は、以前にタンパク質に操作された
部位で重鎖のカルボキシル末端でビオチン化される。テトラマー形成が、次いで
、ストレプトマイシンの添加によって誘導される。蛍光標識されたストレプトア
ビジンによって、このテトラマーは、抗原特異的細胞を染色するために使用され
得る。これらの細胞が、次いで、例えば、フローサイトメトリーによって同定さ
れ得る。このような分析は、診断目的または予後目的のために使用され得る。こ
の手順によって同定された細胞はまた、治療目的のために使用され得る。
【０１５７】 本発明のペプチドはまた、免疫リコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を評価するため
の試薬として使用され得る。（例えば、Ｂｅｒｔｏｎｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ．１００：５０３−５１３，１９９７およびＰｅｎｎａら，Ｊ．Ｅｘｐ
．Ｍｅｄ．１７４：１５６５−１５７０，１９９１を参照のこと）。例えば、Ｈ
ＣＶ感染した個体由来の患者ＰＢＭＣサンプルは、特定のペプチドを使用して抗
原特異的ＣＴＬまたはＨＴＬの存在について分析され得る。単核細胞を含む血液
サンプルが、ＰＢＭＣを培養し、そして本発明のペプチドで細胞を刺激すること
によって評価され得る。適切な培養期間の後、拡大した細胞集団が、例えば、細
胞傷害活性（ＣＴＬ）またはＨＴＬ活性について分析され得る。
【０１５８】 このペプチドはまた、ワクチンの効力を評価するための試薬として使用され得
る。免疫原とともにワクチン接種された患者から得られたＰＢＭＣは、例えば、
上記の方法のいずれかを使用して分析され得る。患者は、ＨＬＡ型であり、そし
てその患者に存在する対立遺伝子特異的分子を認識するペプチドエピトープ試薬
が分析のために選択される。ワクチンの免疫原性は、ＰＢＭＣサンプル中のエピ
トープ特異的ＣＴＬおよび／またはＨＴＬの存在によって示される。
【０１５９】 本発明のペプチドはまた、当該分野で周知の技術を使用して、抗体を作製する
ために使用され得る（例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ Ｉ
ＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ；およびＡｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌ
ａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ
ｅｓｓ，１９８９を参照のこと）、これらは、癌を診断またはモニターするため
の試薬として有用であり得る。このような抗体は、ＨＬＡ分子の文脈においてペ
プチドを認識する抗体（すなわち、ペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する抗体）を
含む。
【０１６０】 （ＩＶ．Ｋ．ワクチン組成物） ワクチンおよび本明細書中に記載されるような免疫原性的に有効量の１つまた
は１より多いペプチドを含むワクチンを調製する方法は、本発明のさらなる実施
形態である。一旦適切に免疫原性ペプチドが規定されると、それらは、種々の手
段によって識別され、そして送達され得、本明細書中で、「ワクチン」組成物と
いわれる。このようなワクチン組成物としては、例えば、リポペプチド（例えば
、Ｖｉｔｉｅｌｌｏ，Ａ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：３４１，１
９９５）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）マイクロ
スフィアにカプセル化されたペプチド組成物（例えば、Ｅｌｄｒｉｄｇｅ，ら，
Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２８７−２９４，１９９１：Ａｌｏｎｓｏ
ら，Ｖａｃｃｉｎｅ １２：２９９−３０６，１９９４；Ｊｏｎｅｓら，Ｖａｃ
ｃｉｎｅ １３：６７５−６８１，１９９５を参照のこと）、免疫刺激複合体（
ＩＳＣＯＭＳ）に含まれるペプチド組成物（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３４４：８７３−８７５，１９９０；Ｈｕら，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：２３５−２４３，１９９８を参照のこと）、多重抗原
ペプチド系（ＭＡＰ）（例えば、Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５４０９−５４１３，１９８８；Ｔａｍ，Ｊ
．Ｐ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９６：１７−３２，１９９６
を参照のこと）、ウイルス送達ベクター（Ｐｅｒｋｕｓ，Ｍ．Ｅ．ら，Ｃｏｎｃ
ｅｐｔｓ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｋａｕｆｍａｎｎ
，Ｓ．Ｈ．Ｅ．，編，３７９頁，１９９６；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓ．ら，
Ｎａｔｕｒｅ ３２０：５３５，１９８６；Ｈｕ，Ｓ．Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ
３２０：５３７，１９８６；Ｋｉｅｎｙ，Ｍ．−Ｐ．ら，ＡＩＤＳ Ｂｉｏｌ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：７９０，１９８６；Ｔｏｐ，Ｆ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｉｎ
ｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２４：１４８，１９７１；Ｃｈａｎｄａ，Ｐ．Ｋ．ら，Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ １７５：５３５，１９９０）、ウイルスまたは合成起源の粒子
（例えば、Ｋｏｆｌｅｒ，Ｎ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９
２：２５，１９９６；Ｅｌｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｈ．ら，Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ
．３０：１６，１９９３；Ｆａｌｏ，Ｌ．Ｄ．，Ｊｒ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅ
ｄ．７：６４９，１９９５）、アジュバンド（Ｗａｒｒｅｎ，Ｈ．Ｓ．，Ｖｏｇ
ｅｌ，Ｆ．Ｒ．，およびＣｈｅｄｉｄ，Ｌ．Ａ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．４：３６９，１９８６；Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｖａｃｃｉｎｅ １１
：２９３，１９９３）、リポソーム（Ｒｅｄｄｙ，Ｒ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１４８：１５８５，１９９２；Ｒｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄ
ａｙ １７：１３１，１９９６）、あるいは、裸のｃＤＮＡまたは粒子吸収ｃＤ
ＮＡ（Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５，１９９３
；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｈｕｎｔ，Ｌ．Ａ．，およびＷｅｂｓｔｅｒ，
Ｒ．Ｇ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １１：９５７，１９９３；Ｓｈｉｖｅｒ，Ｊ．Ｗ．
ら，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｋａ
ｕｆｍａｎｎ，Ｓ．Ｈ．Ｅ．，編，４２３頁，１９９６；Ｃｅａｓｅ，Ｋ．Ｂ．
，およびＢｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｊ．Ａ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１２：９２３，１９９４ならびにＥｌｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｈ．ら，Ｓｅｍ．Ｈｅ
ｍａｔｏｌ．３０：１６，１９９３）が挙げられる。毒素標的化送達技術（レセ
プター媒介標的化としても公知であり、例えば、Ａｖａｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｔｈ
ｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｅｄｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔ
ｓ）の技術）もまた、使用され得る。
【０１６１】 本発明のワクチンは、核酸媒介様式を含む。本発明のペプチドの１以上をコー
ドするＤＮＡまたはＲＮＡもまた、患者に投与され得る。このアプローチは、例
えば、Ｗｏｌｆｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５（１９９０）ならびに
米国特許第５，５８０，８５９号；同第５，５８９，４６６号；同第５，８０４
，５６６号；同第５，７３９，１１８号；同第５，７３６，５２４号；同第５，
６７９，６４７号；ＷＯ ９８／０４７２０；および以下により詳細に記載され
る。ＤＮＡベースの送達技術の例には、「裸のＤＮＡ」、促進された（ブピバカ
イン（ｂｕｐｉｖｉｃａｉｎｅ）、ポリマー、ペプチド−媒介）送達、カチオン
性脂質複合体、および粒子媒介送達（「遺伝子銃」）または圧力媒介送達（例え
ば、米国特許第５，９２２，６８７号を参照のこと）が挙げられる。
【０１６２】 治療または予防免疫目的のために、本発明のペプチドはまた、ウイルスベクタ
ーまたは細菌ベクターによって発現され得る。発現ベクターの例としては、弱毒
化ウイルス宿主（例えば、ワクチンまたは鶏痘）が挙げられる。このアプローチ
の例として、ワクシニアウイルスが、本発明のペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列を発現するためのベクターとして使用される。腫瘍を有する宿主への導入
の際に、組換えワクシニアウイルスは、免疫原性ペプチドを発現し、そしてそれ
によって、宿主にＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を惹起させる。痘疹ベクター
および免疫化プロトコルにおいて有用な方法は、例えば、米国特許第４，７２２
，８４８号に記載される。別のベクターは、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）
である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６−
４６０（１９９１）に記載される。本発明のペプチドの治療的投与または免疫化
のために有用な広範な種々の他のベクター（例えば、アデノウイルスおよびアデ
ノ随伴ウイルスのベクター、レトロウイルスベクター、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉベクター、解毒化炭疽毒素ベクターなど）は、本明細書中の説明から
当業者に明らかである。
【０１６３】 さらに、本発明に従うワクチンは、特許請求されたペプチドの１つ以上の組成
物を包含する。ペプチドは、ワクチン中に、個々に存在し得る。あるいは、この
ペプチドは、同じペプチドの複数のコピーを含むホモポリマーとして、または種
々のペプチドのヘテロポリマーとして存在し得る。ポリマーは、免疫学的反応の
増加という利点を有し、そして異なるペプチドエピトープが、ポリマーを作り上
げるために使用される場合、免疫応答について標的化された病原性生物または腫
瘍関連ペプチドの異なる抗原決定基と反応する抗体および／またはＣＴＬを誘導
するさらなる能力を有する。組成物は、抗原の天然に存在する領域であり得るか
、または例えば、組換え的に、または化学合成によって調製され得る。
【０１６４】 本発明のワクチンとともに使用されるキャリアは、当該分野で周知であり、そ
して例えば、サイログロブリン、ヒト血清アルブミンのようなアルブミン、破傷
風トキソイド、ポリアミノ酸（例えば、ポリＬ−リジン、ポリＬ−グルタミン酸
）、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質などが挙げられる。この
ワクチンは、生理学的に許容可能な（すなわち、受容可能な）希釈剤（例えば、
水、または生理食塩水、好ましくはリン酸緩衝化生理食塩水）を含み得る。この
ワクチンはまた、代表的に、アジュバントを含む。不完全フロイントアジュバン
ト、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたはミョウバンのようなアジュ
バントは、当該分野で周知の材料の例である。さらに、本明細書中に記載される
ように、ＣＴＬ応答は、本発明のペプチドを脂質（例えば、トリパルミトイル−
Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ3ＣＳＳ））に結合することに
よってプライムされ得る。
【０１６５】 注射、エアロゾル、経口、経皮、経粘膜、胸膜腔内、鞘内または他の適切な経
路を介する、本発明に従うペプチド組成物を用いる免疫化の際に、宿主の免疫系
は、所望の抗原に特異的な、多量のＣＴＬおよび／またはＨＴＬを生成すること
によって、ワクチンに応答する。その結果、この宿主は、後の感染に対して少な
くとも部分的に免疫となるか、または進行中の慢性感染の発症に対して少なくと
も部分的に耐性となるか、あるいは抗原が腫瘍関連である場合、少なくともいく
つかの治療的利点を得る。
【０１６６】 いくつかの実施形態において、クラスＩペプチド成分を、目的の標的抗原、特
にウイルスエンベロープ抗原への中和抗体応答を誘導するか、または促進する成
分と組み合わせることが所望され得る。このような組成物の好ましい実施形態は
、本発明に従うクラスＩおよびクラスＩＩエピトープを含む。このような組成物
の代替の実施形態は、ＰＡＤＲＥTM（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，
ＣＡ）分子（例えば、米国特許第５，７３６，１４２号に記載される）とともに
、本発明に従うクラスＩおよび／またはクラスＩＩエピトープを含む。
【０１６７】 本発明のワクチンはまた、本発明のペプチドを提示するためのビヒクルとして
、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を含み得る。ワクチン組成物は、樹状細胞
の可動化および採取に続き、インビトロで作製され得、これによって、樹状細胞
の負荷がインビトロで起こる。例えば、樹状細胞は、例えば、本発明に従うミニ
遺伝子でトランスフェクトされる。次いで、この樹状細胞が、インビボで免疫応
答を惹起するために、患者に投与され得る。
【０１６８】 同様に、抗原性ペプチドが、エキソビボでＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を
惹起するために使用される。得られるＣＴＬまたはＨＴＬ細胞は、治療の他の従
来の形態に応答しない、または本発明に従う治療的ワクチンペプチドまたは核酸
に応答しない患者における腫瘍を処置するために使用され得る。特定の腫瘍関連
抗原へのエキソビボＣＴＬまたはＨＴＬ応答は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例え
ば、樹状細胞）の供給源とともに、患者の、または遺伝子的に適合性のＣＴＬも
しくはＨＬＴ前駆細胞、および適切な免疫原性ペプチドを、組織培養でインキュ
ベートすることによって誘導され得る。前駆細胞が活性化され、そしてエフェク
ター細胞に拡張される適切なインキュベート時間（代表的に、約７〜２８日間）
の後、これらの細胞は、患者に注入して戻され、ここで、それらは、それらの特
異的標的細胞（感染した細胞または腫瘍細胞）を破壊する（ＣＴＬ）か、または
これらの破壊を促進する（ＨＴＬ）。トランスフェクトされた樹状細胞まはた、
抗原提示細胞として使用され得る。
【０１６９】 本発明のワクチン組成物はまた、インターフェロン−αのような抗ウイルス薬
剤、またはウイルス感染に対する他の処置と組み合わせて使用され得る。
【０１７０】 好ましくは、ワクチンにおける使用のための多エピトープ性組成物において封
入のため、またはワクチンに含まれそして／またはミニ遺伝子のような核酸によ
ってコードされる個別のエピトープを選択するためにエピトープのアレイを選択
する場合、以下の原理が利用される。以下の原理の各々は、選択をなすために釣
り合いを取ることが好ましい。所定のワクチン組成物に組込まれる複数のエピト
ープは、エピトープから誘導されるネイティブな抗原中の配列において連続であ
り得るが、その必要はない。
【０１７１】 好ましくは、ワクチンにおける使用のための多エピトープ性組成物において封
入のため、またはワクチンに含まれそして／またはミニ遺伝子のような核酸によ
ってコードされる個別のエピトープを選択するためにエピトープのアレイを選択
する場合、以下の原理が利用される。ＨＣＶ感染を処置するか、または予防する
ためのワクチンにおいて利用され得る例示的なエピトープは、表ＸＸＶＩ〜ＸＸ
ＩＸ、および表ＸＸＸＩＩに記載される。以下の原理の各々は、選択をなすため
に釣り合いを取ることが好ましい。
【０１７２】 １．）投与の際、ＨＣＶクリアランスと相関されることが観測されている模倣
免疫応答エピトープが選択される。ＨＬＡクラスＩについて、これは、ＨＣＶの
少なくとも１つの抗原由来の３〜４エピトープを含む。ＨＬＡクラスＩＩについ
て、類似の原理が使用される；再び、３〜４エピトープが、少なくとも１つのＨ
ＣＶ抗原から選択される（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
７８：１４４７−１４５０を参照のこと）。
【０１７３】 ２．）免疫原性を相関付けされるように確立された必要な結合親和性を有する
エピトープが選択される：ＨＬＡクラスＩについて、５００ｎＭかまたはそれよ
り小さいＩＣ50、あるいはクラスＩＩについて、１０００ｎＭかまたはそれより
低いＩＣ50。
【０１７４】 ３．）十分なスーパーモチーフ保有ペプチド、または対立遺伝子特異的モチー
フ保有ペプチドの十分なアレイが、広い集団適用範囲を与えるために選択される
。例えば、少なくとも８０％の集団適用範囲を有することが好ましい。モンテカ
ルロ分析（当該分野で公知の統計的評価）は、集団適用範囲の広がりまたは重複
性を評価するために使用され得る。
【０１７５】 ４．）癌関連抗原からエピトープを選択する場合、アナログを選択することが
、しばしば好ましい。なぜなら、患者は、ネイティブのエピトープに対して発達
した寛容性を有し得るからである。感染性疾患関連抗原についてのエピトープを
選択する場合、ネイティブのエピトープまたはアナログエピトープのいずれかを
選択することが好ましい。
【０１７６】 ５．）「入れ子型（ｎｅｓｔｅｄ）エピトープ」といわれるエピトープが特に
適切である。入れ子型エピトープは、少なくとも２つのエピトープが所定のペプ
チド配列において重複する場合に生じる。入れ子型ペプチド配列は、ＨＬＡクラ
スＩおよびＨＬＡクラスＩＩの両方のエピトープを含み得る。入れ子型エピトー
プが提供される場合、提供された配列あたり最も大きな数のエピトープを有する
配列を提供することが望ましい。好ましくは、ペプチドにおける、アミノ末端エ
ピトープのアミノ末端およびカルボキシ末端エピトープのカルボキシル末端より
も長いペプチドを提供することが回避される。より長いペプチド配列（例えば、
入れ子型エピトープを含む配列）が提供される場合、病理学的または他の有害な
生物学的特性を有さないことを確実にするために配列をスクリーニングすること
が重要である。
【０１７７】 ６．）多エピトープ性タンパク質が作製される場合、またはミニ遺伝子を作製
する場合、目的のエピトープを包含する最も小さなペプチドを作製することが目
的である。この原理は、入れ子型エピトープを含むペプチドを選択する場合に使
用されるものと同じでない場合に、類似する。しかし、人工の多エピトープ性ペ
プチドの場合、サイズを最小化する目的は、多エピトープ性タンパク質中のエピ
トープの間の任意のスペーサー配列を組込む必要性に対して釣り合いが取られる
。スペーサーアミノ酸残基は、接合部エピトープ（免疫系によって認識されるが
、標的抗原に存在せず、そしてエピトープの人工並位（ｍａｎ−ｍａｄｅ Ｊｕ
ｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎ）によって作製されるのみのエピトープ）を回避するた
めに、またはエピトープ間の切断を容易にし、それによってエピトープ提示を増
強するために、導入され得る。接合部エピトープは、一般に、回避される、なぜ
なら、レシピエントは、非ネイティブエピトープに対する免疫応答を生成し得る
からである。「優性エピトープ」である接合部エピトープが、特に関係する。優
性エピトープは、他のエピトープに対する免疫応答が減少されるかまたは抑制さ
れる激しい（ｚｅａｌｏｕｓ）応答を導き得る。
【０１７８】 上の基準に基づいて設計される多エピトープ性ワクチン組成物の例としては、
ＨＣＶポリタンパク質のコア、Ｓ、Ｅｌ、ＮＳ１／Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ
４、およびＮＳ５ドメイン由来のエピトープが挙げられる。これらの領域は、プ
ロタイプＨＣＶ−１株に対して番号付けを使用する以下のアミノ酸配列（Ｇｅｎ
ｂａｎｋ登録番号Ｍ６２３２１；例えば、米国特許第５，６８３，８６４号およ
び同第５，６７０，１５３号）を包含する：Ｃドメイン（アミノ酸１〜１２０）
；Ｓ（アミノ酸１２０〜４００）；ＮＳ３（アミノ酸１０５０〜１６４０）；Ｎ
Ｓ４（アミノ酸１６４０〜２０００）；ＮＳ５（アミノ酸２０００〜３０１１）
；およびエンベロープタンパク質Ｅ１およびＥ２／ＮＳ１（アミノ酸１９２〜７
５０を含む）。アミノ酸７５０〜１０５０は、本発明に適用されるように、ドメ
インＸと命名される。当業者に理解されるように、各ドメインについてのアミノ
酸の範囲の表示は、ＨＣＶの株に依存してＨＣＶ−１の範囲からある程度異なり
得る。ＨＣＶポリタンパク質配列で見る場合、当業者は、ドメイン境界を容易に
決定可能である。
【０１７９】 本発明の多エピトープ性組成物の特定の実施形態は、薬学的に受容可能なキャ
リアおよびＨＣＶ−１のペプチドと免疫学的に交差反応性であるモチーフ保有ペ
プチドの組み合わせを含む薬学的組成物を含み、ここで、ペプチドの少なくとも
１つは、表Ｉａのモチーフを保有し、さらにここで、モチーフ保有ペプチドの組
み合わせは、以下からなる：ａ）ＨＣＶ Ｃドメイン由来の少なくとも８アミノ
酸を含む１つ以上のペプチド；ｂ）以下からなる群から選択されるさらなるドメ
インの少なくとも８アミノ酸を含む１つ以上のペプチド：Ｓドメイン、ＮＳ３ド
メイン、ＮＳ４ドメイン、またはＮＳ５ドメイン、および；ｃ）必要に応じて、
１つ以上のさらなるＨＣＶドメイン由来の１つ以上のモチーフ保有ペプチド（だ
だし、さらなるドメインが「ｂ」に列挙されるさらなるドメインではない）。好
ましくは、このような薬学的組成物は、さらに、Ｘドメインの少なくとも８アミ
ノ酸を含む１つ以上の個別のＨＣＶモチーフ保有ペプチドを含み得るか、あるい
はこの組成物はさらに、エンベロープメイン由来であるさらなるＨＣＶモチーフ
保有ペプチドを含み得、このエンベロープドメインペプチドは、エンベロープド
メインの少なくとも８アミノ酸を含む単一のＨＣＶペプチドの１つ以上のコピー
からなる。
【０１８０】 別の実施形態において、多エピトープ性の薬学的組成物は、薬学的に受容可能
なキャリアおよびＨＣＶ−１ペプチドと免疫学的に交差反応性であるモチーフ保
有ペプチドの組み合わせを含み得、これらのペプチドは、ＨＣＶの複数のドメイ
ン由来であり、ここで、これらのペプチドの少なくとも１つは、表Ｉａのモチー
フを保有し、そしてここで、モチーフ保有ペプチドの組み合わせは、本質的に以
下からなる：ａ）Ｃドメイン由来の少なくとも８アミノ酸を含む１つ以上のペプ
チド；およびｂ）Ｓ、ＮＳ３、ＮＳ４、またはＮＳ５ドメイン由来の少なくとも
８アミノ酸を含む１つ以上のペプチド、ならびにエンベロープドメインの少なく
とも８アミノ酸を含む１つのＨＣＶペプチド。このような組成物は、さらに、Ｘ
ドメインの少なくとも８アミノ酸を含む１つ以上のＨＣＶモチーフ保有ペプチド
を含み得る。
【０１８１】 あるいは、本発明の薬学的組成物は、以下を含み得る：ａ）薬学的に受容可能
なキャリア；および、ｂ）１つ以上のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ドメイン由来
の少なくとも８アミノ酸の１つ以上のモチーフ保有ペプチドの組み合わせであっ
て、ここで、上記ペプチドは、ＨＣＶ−１のペプチドと交差反応性であるが、だ
だし、組み合わせは、ＨＣＶ Ｃドメイン由来の少なくとも８アミノ酸のペプチ
ドを含まず、そしてここで、これらのペプチドの少なくとも１つは、表Ｉａのモ
チーフを保有し、上記ドメインは、Ｓドメイン；ＮＳ３ドメイン；ＮＳ４ドメイ
ン；ＮＳ５ドメイン；および、Ｘドメインからなる群から選択される、モチーフ
保有ペプチドの組み合わせ。このような組成物は、さらに、エンベロープドメイ
ンの少なくとも８アミノ酸を含む単一ＨＣＶペプチドの１つ以上のコピーからな
るモチーフ保有ＨＣＶエンベロープペプチドを含み得る。
【０１８２】 最後に、本発明の実施形態は、薬学的に受容可能なキャリアおよびＨＣＶ−１
株の単一ドメイン由来の２つ以上のモチーフ保有ペプチドの組み合わせを含む薬
学的組成物を含み得、上記ペプチドは、ＨＣＶ−１抗原のペプチドと免疫学的に
交差反応性であり、ここで、これらのペプチドの少なくとも１つは、表Ｉａのモ
チーフを保有し、そしてこれらのペプチドは、ＨＣＶ由来であり、そしてＨＣＶ
ドメインは、以下からなる群から選択される：Ｃドメイン；Ｓドメイン；ＮＳ３
ドメイン；ＮＳ４ドメイン；ＮＳ５ドメイン；Ｘドメイン；または、単一ＨＣＶ
株由来のエンベロープドメイン。但し、エンベロープドメインは、可変エンベロ
ープドメイン以外である。
【０１８３】 記載される実施形態において、「ＨＣＶ−１と免疫学的に交差反応性であるペ
プチド」とは、同じ抗体によって結合されたペプチドをいう；「由来の」とは、
そのフラグメントまたは部分配列および保存的に改変された改変体をいう。
【０１８４】 （ＩＶ．Ｋ．１．ミニ遺伝子ワクチン） 複数のエピトープの同時送達を可能にする多くの異なるアプローチが利用可能
である。本発明のペプチドをコードする核酸は、特に有用な、本発明の実施形態
である。ミニ遺伝子の封入のためのエピトープは、好ましくは、前節に記載され
るガイドラインに従って選択される。本発明のペプチドをコードする核酸を投与
する好ましい手段は、本発明の１または複数のエピトープを含むペプチドをコー
ドするミニ遺伝子構築物を使用する。
【０１８５】 多重エピトープミニ遺伝子の使用は、以下および例えば、同時係属出願Ｕ．Ｓ
．Ｓ．Ｎ．０９／３１１，７８４；Ａｎ，Ｌ．およびＷｈｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．
，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２２９２，１９９７；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｓ．Ａ．ら，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：８２２，１９９６；Ｗｈｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．ら
，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３４８，１９９３；Ｈａｎｋｅ，Ｒ．ら，Ｖａｃｃｉ
ｎｅ １６：４２６，１９９８に記載される。例えば、ＨＣＶポリタンパク質配
列の複数の領域由来のスーパーモチーフ保有ＨＣＶエピトープおよび／またはモ
チーフ保有ＨＣＶエピトープをコードする多重エピトープＤＮＡプラスミド、Ｐ
ＡＤＲＥTM万能（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ヘルパーＴ細胞エピトープ（またはＨＣ
Ｖ由来の複数のＨＴＬエピトープ）、および小胞体−転位シグナル配列が操作さ
れ得る。
【０１８６】 多重エピトープミニ遺伝子の免疫原性は、試験されるエピトープに対するＣＴ
Ｌ誘導応答の大きさを評価するために、トランスジェニックマウスにおいて試験
され得る。さらに、インビボでのＤＮＡコードエピトープの免疫原性は、ＤＮＡ
プラスミドでトランスフェクトされた標的細胞に対する特定のＣＴＬ株のインビ
トロ応答と相関され得る。従って、これらの実験は、ミニ遺伝子が、１．）ＣＴ
Ｌ応答を生成すること、そして２．）誘導されたＣＴＬが、コードされたエピト
ープを発現する細胞を認識することの両方に役立つということを示し得る。
【０１８７】 例えば、ヒト細胞における発現のための選択されたエピトープ（ミニ遺伝子）
をコードするＤＮＡ配列を作製するために、これらのエピトープのアミノ酸配列
を逆転写し得る。ヒトコドン使用頻度表を使用して、各アミノ酸についてのコド
ン選択を導き得る。これらのエピトープコードＤＮＡ配列は、翻訳された場合に
、連続的なポリペプチド配列が作製されるように、直接的に隣接され得る。発現
および／または免疫原性を最適化するために、さらなるエレメントが、そのミニ
遺伝子設計に組み込まれ得る。逆転写され得、そしてそのミニ遺伝子配列に含ま
れ得るアミノ酸配列の例としては、以下が挙げられる：ＨＬＡクラスＩエピトー
プ、ＨＬＡクラスＩＩエピトープ、ユビキチン化シグナル配列および／または小
胞体ターゲッティングシグナル。さらに、ＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピト
ープのＨＬＡ提示は、そのＣＴＬエピトープまたはＨＴＬエピトープに隣接する
、合成の（例えば、ポリアラニン）または天然に存在する隣接配列を含むことに
よって改変され得；そのエピトープを含むこれらのより大きいペプチドは、本発
明の範囲内にある。
【０１８８】 ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子の＋鎖および−鎖をコードするオリゴヌクレオ
チドをアセンブルすることによってＤＮＡに変換され得る。重複オリゴヌクレオ
チド（３０〜１００塩基長）が、周知技術を使用して適切な条件下で、合成、リ
ン酸化、精製およびアニーリングされ得る。これらのオリゴヌクレオチドの末端
は、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して連結され得る。次いで、エピトー
プポリペプチドをコードする、この合成ミニ遺伝子は、所望の発現ベクターにク
ローニングされ得る。
【０１８９】 好ましくは、当業者に周知の標準的な調節配列が、標的細胞における発現を確
実にするためにベクターに含まれる。以下のいくつかのベクターエレメントが所
望される：ミニ遺伝子挿入物のための下流クローニング部位を含むプロモーター
；効率的な転写終結のためのポリアデニル化シグナル；Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点；
およびＥ．ｃｏｌｉ選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性またはカナマイシ
ン耐性）。多くのプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ
）プロモーター）が、この目的に使用され得る。他の適切なプロモーター配列に
ついては、例えば、米国特許第５，５８０，８５９号および米国特許第５，５９
８，４６６号を参照のこと。
【０１９０】 さらなるベクター改変が、ミニ遺伝子の発現および免疫原性を最適化するため
に所望され得る。いくつかの場合において、イントロンが、効率的な遺伝子発現
に必要とされ、そして１以上の合成イントロンまたは天然に存在するイントロン
が、ミニ遺伝子の転写される領域に組み込まれ得る。ｍＲＮＡ安定化配列および
哺乳動物細胞における複製のための配列の包含もまた、ミニ遺伝子発現を増大す
るために考慮され得る。
【０１９１】 一旦、発現ベクターを選択すると、ミニ遺伝子を、プロモーターの下流のポリ
リンカー領域内にクローニングする。このプラスミドを、適切なＥ．ｃｏｌｉ株
に形質転換し、そしてＤＮＡを、標準的な技術を使用して調製する。ミニ遺伝子
の方向およびＤＮＡ配列、ならびにベクターに含まれる他の全てのエレメントは
、制限マッピングおよびＤＮＡ配列分析を使用して確認される。正しいプラスミ
ドを保有する細菌細胞は、マスター（ｍａｓｔｅｒ）細胞バンクおよびワーキン
グ（ｗｏｒｋｉｎｇ）細胞バンクとして保存される。
【０１９２】 さらに、免疫刺激配列（ＩＳＳまたはＣｐＧ）は、ＤＮＡワクチンの免疫原性
において役割を果たすようである。これらの配列は、免疫原性の増強が所望され
る場合に、そのベクター中のミニ遺伝子コード配列の外側に含まれ得る。
【０１９３】 いくつかの実施形態において、ミニ遺伝子コードエピトープおよび第２のタン
パク質（免疫原性を増強または減少するために含まれる）の両方の産生を可能に
する、二シストロン性（ｂｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）発現ベクターが使用され得
る。同時発現される場合に免疫応答を有利に増強し得るタンパク質またはポリペ
プチドの例としては、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−Ｃ
ＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例えば、ＬｅＩＦ）、同時刺激分子、またはＨ
ＴＬ応答について、汎ＤＲ結合（ｐａｎ−ＤＲ ｂｉｎｄｉｎｇ）タンパク質（
ＰＡＤＲＥTM、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が挙げられる。
ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープは、細胞内ターゲッティングシグナルに結合され
得、そして発現されるＣＴＬエピトープとは別々に発現され；これは、ＣＴＬエ
ピトープとは異なる、ＨＴＬエピトープの細胞区画への指向を可能にする。必要
ならば、これは、ＨＬＡクラスＩＩ経路へのＨＴＬエピトープのより効率的な進
入を促進し得、これによって、ＨＴＬ誘導を改善する。ＨＴＬ誘導またはＣＴＬ
誘導とは対照的に、免疫抑制分子（例えば、ＴＧＦ−β）の同時発現によって免
疫応答を特異的に減少することが、特定の疾患において有利であり得る。
【０１９４】 治療量のプラスミドＤＮＡは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ中での発酵、その後の精
製によって生成され得る。ワーキング細胞バンク由来のアリコートを使用して、
培養培地に播種し、そして周知技術に従って、シェーカーフラスコまたはバイオ
リアクター中で飽和になるまで増殖させる。プラスミドＤＮＡを、標準的なバイ
オ分離技術（例えば、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ
ｏｒｎｉａ）によって供給される固相陰イオン交換樹脂）を使用して精製し得る
。必要ならば、スーパーコイルＤＮＡを、ゲル電気泳動または他の方法を使用し
て、開環形態および線状形態から単離し得る。
【０１９５】 精製プラスミドＤＮＡは、種々の処方物を使用して、注入用に調製され得る。
これらの最も単純なものは、滅菌リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中での凍結
乾燥化ＤＮＡの再構成である。このアプローチ（「裸のＤＮＡ」としても知られ
る）は、臨床試験において筋内（ＩＭ）投与のために現在使用されている。ミニ
遺伝子ＤＮＡワクチンの免疫治療効果を最大化するために、精製プラスミドＤＮ
Ａを処方するための代替的方法が望ましくあり得る。種々の方法が記載されてお
り、そして新しい技術が利用可能になるかもしれない。カチオン性脂質もまた、
処方物中で使用され得る（例えば、ＷＯ９３／２４６４０；Ｍａｎｎｉｎｏおよ
びＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）：６
８２（１９８８）；米国特許第５，２７９，８３３号；ＷＯ９１／０６３０９；
およびＦｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８４：７４１３（１９８７）に記載されるような）。さらに、糖脂質、紡錘型（
ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）のリポソーム、ペプチドおよび化合物（まとめて、保護的
、相互作用的、非凝縮化合物（ＰＩＮＣ）と呼ばれる）もまた、精製プラスミド
ＤＮＡに複合体化され得、安定性、筋内分散、または特定の器官または細胞型に
対する輸送のような変数に影響する。
【０１９６】 標的細胞の感作が、ミニ遺伝子コードＣＴＬエピトープの発現およびＨＬＡク
ラスＩ提示についての機能的アッセイとして使用され得る。例えば、プラスミド
ＤＮＡが、標準的なＣＴＬクロム放出アッセイについての標的として適切である
哺乳動物細胞株に導入される。使用されるトランスフェクション方法は、最終処
方物に依存する。エレクトロポレーションは、「裸の」ＤＮＡのために使用され
得、一方、カチオン性脂質が、直接的なインビトロトランスフェクションを可能
にする。グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドを同時トラン
スフェクトして、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用する、トランスフェク
トした細胞の富化を可能にし得る。次いで、これらの細胞を、クロム５１（51Ｃ
ｒ）標識し、そしてエピトープ特異的ＣＴＬ株についての標的細胞として使用し
；51Ｃｒ放出によって検出される細胞溶解が、ミニ遺伝子コードＣＴＬエピトー
プの産生およびＨＬＡ提示の両方を示す。ＨＴＬエピトープの発現は、ＨＴＬ活
性を評価するためのアッセイを使用して、類似の様式で評価され得る。
【０１９７】 インビボ免疫原性は、ミニ遺伝子ＤＮＡ処方物の機能的試験のための第２のア
プローチである。適切なヒトＨＬＡタンパク質を発現するトランスジェニックマ
ウスを、このＤＮＡ産物で免疫する。投与の用量および経路は、処方物依存性で
ある（例えば、ＰＢＳ中のＤＮＡについてはＩＭ、脂質複合体化ＤＮＡについて
は腹腔内（ＩＰ））。免疫後２１日で、脾細胞を収集し、試験する各エピトープ
をコードするペプチドの存在下で１週間再刺激する。その後、ＣＴＬエフェクタ
ー細胞について、標準的な技術を使用して、ペプチドがロードされた51Ｃｒ標識
標的細胞の細胞溶解についてのアッセイを行う。ペプチドエピトープ（ミニ遺伝
子コードエピトープに対応する）でロードされたＨＬＡによって感作された標的
細胞の溶解は、ＣＴＬのインビボ誘導についてのＤＮＡワクチン機能を実証する
。ＨＴＬエピトープの免疫原性は、類似の様式でトランスジェニックマウスにお
いて評価される。
【０１９８】 あるいは、核酸は、例えば、米国特許第５，２０４，２５３号に記載されるよ
うな、銃式（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）送達を使用して投与され得る。この技術を使
用して、ＤＮＡのみから構成される粒子が投与される。さらなる代替的実施形態
において、ＤＮＡは、粒子（例えば、金粒子）に接着され得る。
【０１９９】 （ＩＶ．Ｋ．２．ＣＴＬペプチドとヘルパーペプチドとの組合わせ） 免疫刺激活性を有する、本発明のペプチドまたはそのアナログを含むワクチン
組成物は、所望の特性（例えば、改善された血清半減期）を提供するように、ま
たは免疫原性を増強するように改変され得る。
【０２００】 例えば、ＣＴＬ活性を誘導するペプチドの能力は、Ｔヘルパー細胞応答を誘導
し得る少なくとも１つのエピトープを含む配列にペプチドを連結させることによ
って増強され得る。免疫原性を増強するためのＣＴＬエピトープと組み合わせた
Ｔヘルパーエピトープの使用は、例えば、同時係属中の米国特許出願第０８／８
２０３６０号、米国特許出願第０８／１９７，４８４号、および米国特許出願第
０８／４６４，２３４号に例示される。
【０２０１】 特に好ましいＣＴＬエピトープ／ＨＴＬエピトープ結合体は、スペーサー分子
によって連結される。スペーサーは、代表的に、比較的小さい、中性の分子（例
えば、アミノ酸またはアミノ酸模倣物）からなり、これらは、生理学的条件下で
実質的に非荷電性である。スペーサーは、代表的に、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙあ
るいは非極性アミノ酸または中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択さ
れる。任意に存在するスペーサーは、必ずしも同じ残基からなる必要はなく、従
って、ヘテロオリゴマーであっても、ホモオリゴマーであってもよいことが理解
される。存在する場合、スペーサーは、通常、少なくとも１残基または２残基で
あり、より通常は、３〜６残基である。あるいは、ＣＴＬペプチドは、スペーサ
ーなしでＴヘルパーペプチドに連結され得る。
【０２０２】 ＣＴＬペプチドエピトープは、Ｔヘルパーペプチドエピトープに直接連結され
得るが、しばしば、ＣＴＬエピトープ／ＨＴＬエピトープ結合体は、スペーサー
分子に連結される。スペーサーは、代表的に、比較的小さい、中性の分子（例え
ば、アミノ酸またはアミノ酸模倣物）からなり、これらは、生理学的条件下で実
質的に非荷電性である。スペーサーは、代表的に、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙある
いは非極性アミノ酸または中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択され
る。任意に存在するスペーサーは、必ずしも同じ残基からなる必要はなく、従っ
て、ヘテロオリゴマーであっても、ホモオリゴマーであってもよいことが理解さ
れる。存在する場合、スペーサーは、通常、少なくとも１残基または２残基であ
り、より通常は、３〜６残基である。ＣＴＬペプチドエピトープは、ＣＴＬペプ
チドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで、直接的にかまたはスペー
サーを介してかのいずれかで、Ｔヘルパーペプチドエピトープに連結され得る。
免疫原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端は、アシル
化され得る。
【０２０３】 ＨＴＬペプチドエピトープはまた、それらの生物学的特性を変更するために改
変され得る。例えば、ＨＴＬエピトープを含むペプチドは、Ｄ−アミノ酸を含み
、プロテアーゼに対するそれらの耐性を増加し得、従って、それらの血清半減期
を伸ばし得る。また、本発明のエピトープペプチドは、他の分子（例えば、脂質
、タンパク質または糖、あるいは任意の他の合成化合物）に結合体化され得、そ
れらの生物学的活性を増加する。詳細には、Ｔヘルパーペプチドは、アミノ末端
またはカルボキシル末端のいずれかで１以上のパルミチン酸鎖に結合体化され得
る。
【０２０４】 特定の実施形態において、Ｔヘルパーペプチドは、その集団の大部分で存在す
るＴヘルパー細胞によって認識されるペプチドである。これは、多くの、ほとん
どの、または全てのＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するアミノ酸配列を選択するこ
とによって達成され得る。これらは、「大まかなＨＬＡ拘束」または「不規則な
」Ｔヘルパー配列として知られる。不規則なアミノ酸配列の例としては、以下の
ような抗原由来の配列が挙げられる：破傷風トキソイドの８３０〜８４３位（Ｑ
ＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ
ＣＳタンパク質の３７８〜３９８位（ＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶ
ＶＮＳ）およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ １８ｋＤタンパク質の１１６位（
ＧＡＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡ）。他の例としては、ＤＲ １−４−７スー
パーモチーフ、またはＤＲ３モチーフのいずれかを保有するペプチドが挙げられ
る。
【０２０５】 あるいは、天然に見い出されないアミノ酸配列を使用して、大まかなＨＬＡ拘
束様式で、Ｔヘルパーリンパ球を刺激し得る合成ペプチドを調製し得る（例えば
、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０７７０７を参照のこと）。汎ＤＲ結合（ｐａｎ−ＤＲ
ｂｉｎｄｉｎｇ）エピトープと呼ばれるこれらの合成化合物（例えば、ＰＡＤ
ＲＥTM、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、最も好
ましくは、ほとんどのＨＬＡ−ＤＲ（ヒトＨＬＡクラスＩＩ）分子を結合するよ
うに設計される。例えば、式：ａＫＸＶＷＡＮＴＬＫＡＡａ（ここで、「Ｘ」は
、シクロヘキシルアラニン、フェニルアラニンまたはチロシンのいずれかであり
、そしてａは、Ｄ−アラニンまたはＬ−アラニンのいずれかである）を有する、
汎ＤＲ結合エピトープペプチドは、ほとんどのＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子に結合し
、そしてほとんどの個体由来（それらのＨＬＡ型に拘わらず）のＴヘルパーリン
パ球の応答を刺激することが見い出されている。汎ＤＲ結合エピトープの代替物
は、全て「Ｌ」天然アミノ酸を含み、そしてこのエピトープをコードする核酸の
形態で提供され得る。
【０２０６】 いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物中に、細胞傷害性Ｔリン
パ球をプライムする少なくとも１つの成分を含むことが望ましくあり得る。脂質
は、ウイルス抗原に対してＣＴＬをインビボでプライムし得る因子として同定さ
れている。例えば、パルミチン酸残基は、リジン残基のε−アミノ基およびα−
アミノ基に結合され得、次いで、例えば、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ、
Ｓｅｒ−Ｓｅｒなどのような１以上の連結残基を介して、免疫原性ペプチドに連
結され得る。次いで、この脂質化ペプチドは、ミセルまたは粒子のいずれかで直
接的に投与され得るか、リポソーム内に組み込まれ得るか、またはアジュバント
（例えば、不完全フロイントアジュバント）中で乳化され得る。好ましい実施形
態において、特に効果的な免疫原性ペプチドは、Ｌｙｓのε−アミノ基およびα
−アミノ基に結合されたパルミチン酸を含み、これは、その免疫原性ペプチドの
アミノ末端に連結（例えば、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）を介して結合される。
【０２０７】 ＣＴＬ応答をプライムする脂質の別の例として、Ｅ．ｃｏｌｉリポタンパク質
（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルステイニルセリル−セリン（Ｐ3
ＣＳＳ））が、適切なペプチドに共有結合された場合にウイルス特異的ＣＴＬを
プライムするために使用され得る（例えば、Ｄｅｒｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３４
２：５６１、１９８９を参照のこと）。本発明のポリペプチドは、例えば、Ｐ3
ＣＳＳに結合され得、そしてこのリポペプチドが、個体に投与され、標的抗原に
対するＣＴＬ応答を特異的にプライムし得る。さらに、中和抗体の誘導もまた、
Ｐ3ＣＳＳ結合体化エピトープでプライムされ得るので、２つのこのような組成
物を組み合わせて、感染に対する体液性応答および細胞性応答の両方をより効果
的に誘発し得る。
【０２０８】 本明細書中に示されるように、さらなるアミノ酸がペプチドの末端に付加され
、ペプチドの互いの容易な連結、キャリア支持体またはより大きいペプチドへの
結合、ペプチドまたはオリゴペプチドの物理的特性または化学的特性の改変など
を提供し得る。チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸またはアスパラギ
ン酸などのアミノ酸が、ペプチドまたはオリゴペプチド（特に、クラスＩペプチ
ド）のＣ末端またはＮ末端に導入され得る。しかし、いくつかの場合において、
ＣＴＬエピトープのカルボキシル末端での改変は、ペプチドの結合特性を変更し
得ることに留意すべきである。さらに、ペプチドまたはオリゴペプチド配列は、
末端ＮＨ2アシル化（例えば、アルカノイル（Ｃ1〜Ｃ20）アセチル化またはチオ
グリコリルアセチル化）、末端カルボキシルアミド化（例えば、アンモニア、メ
チルアミンなど）によって改変されることによって、天然の配列とは異なり得る
。いくつかの例において、これらの改変は、支持体または他の分子に連結するた
めの部位を提供し得る。
【０２０９】 （ＣＴＬペプチドおよび／またはＨＴＬペプチドをパルスした樹状細胞を含む
ワクチン組成物） 本発明に従うワクチン組成物の実施形態は、患者の血液由来のＰＢＭＣ（また
はそこから単離されたＤＣ）へのエピトープ保有ペプチドの混液のエキソビボ投
与を包含する。ＤＣの収集を容易にするための医薬（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ／Ｉ
Ｌ−４）が使用され得る。ペプチドでのＤＣのパルス後および患者への再注入の
前に、ＤＣを洗浄し、結合されなかったペプチドを除去する。この実施形態にお
いて、ワクチンは、ペプチドをパルスしたＤＣを含み、このペプチドをパルスし
たＤＣは、その表面上でＨＬＡ分子と複合体化された、そのパルスされたペプチ
ドエピトープを提示する。次いで、このワクチンは、患者に投与される。
【０２１０】 （ＩＶ．Ｌ．治療目的または予防目的のためのワクチンの投与） 本発明のペプチドならびに本発明の薬学的組成物およびワクチン組成物は、Ｈ
ＣＶ感染を処置および／または予防するための哺乳動物（特に、ヒト）への投与
に有用である。本発明のペプチドを含むワクチン組成物は、ＨＣＶに感染した患
者、あるいはＨＣＶ感染に感受性の個体またはそうでなければＨＣＶ感染の危険
性がある個体に投与され、ＨＣＶ抗原に対する免疫応答を誘発し、従って、患者
自身の免疫応答能力を増強する。治療適用において、ペプチド組成物および／ま
たは核酸組成物は、ウイルス抗原に対する効果的なＣＴＬおよび／またはＨＴＬ
応答を誘発するのに、ならびに症状および／または合併症を治癒または少なくと
も部分的に阻止または遅延するのに十分な量で患者に投与される。このことを達
成するための十分な量は、「治療的有効用量」として定義される。この用途のた
めに効果的な量は、例えば、投与される特定の組成物、投与の形態、処置される
疾患の段階および重篤度、患者の体重および一般的な健康状態、ならびに処方す
る医師の判断に依存する。
【０２１１】 本発明のワクチン組成物はまた、予防薬剤として純粋に使用され得る。一般に
、初回の予防免疫のための用量は、一般に、単位投薬範囲にあり、低い値で、約
１、５、５０、５００または１０００μｇ、そして高い値で、約１０，０００；
２０，０００；３０，０００；または５０，０００μｇである。ヒトについての
投薬値は、代表的に、７０キログラム患者当たり、約５００μｇ〜約５０，００
０μｇの範囲である。これに続いて、約１．０μｇ〜約５０，０００μｇの間の
ペプチドの投薬量で追加免疫する。このペプチドは、ワクチンの初回投与後、約
４週間〜６ヶ月の規定された間隔で投与される。このワクチンの免疫原性は、患
者の血液のサンプルから得たＣＴＬおよびＨＴＬの比活性を測定することによっ
て評価され得る。
【０２１２】 上記のように、本発明のＣＴＬエピトープおよび／またはＨＴＬエピトープを
含むペプチドは、ＨＬＡ分子によって提示され、そしてそのペプチドに含まれる
エピトープに特異的なＣＴＬまたはＨＴＬを接触された場合に、免疫応答を誘発
する。このペプチドがＣＴＬまたはＨＴＬを接触される様式は、本発明に重要で
はない。例えば、このペプチドは、インビボまたはインビトロのいずれかでＣＴ
ＬまたはＨＴＬを接触され得る。その接触がインビボで生じる場合、ペプチド自
体が患者に投与され得るか、他のビヒクル（例えば、１以上のペプチドをコード
するＤＮＡベクター、ペプチドをコードするウイルスベクター、リポソームなど
）が、本明細書に記載のように、使用され得る。ペプチドがインビトロで接触さ
れる場合、ワクチン接種薬剤は、細胞の集団（例えば、ペプチドをパルスした樹
状細胞、ＴＡＡ特異的ＣＴＬ（これは、このペプチドをインビトロで抗原提示細
胞にパルスすることによって誘導された））を含み得る。このような細胞集団は
、その後、治療的有効用量で患者に投与される。
【０２１３】 ペプチドまたはペプチドをコードするＤＮＡは、個々で投与され得るか、また
は１以上のペプチド配列の融合体として投与され得る。
【０２１４】 薬学的組成物のために、本発明の免疫原性ポリペプチド、またはそれらをコー
ドするＤＮＡは、一般に、ＨＣＶに既に感染した患者に投与される。これらのペ
プチドまたはそれらをコードするＤＮＡは、個々で投与され得るか、または１以
上のペプチド配列の融合体として投与され得る。感染の潜伏期または急性期にあ
る個体は、それらの免疫原性ペプチドで別々に処置されるか、または他の処置と
適切に組み合わせて処置され得る。
【０２１５】 治療的用途のために、投与は、一般に、ＨＣＶ感染の最初の診断で開始すべき
である。この後に、少なくとも症状が実質的に寛解されるまで、およびその後の
期間の間で、追加免疫用量を行う。慢性感染において、負荷用量、その後の追加
免疫用量が、必要とされ得る。
【０２１６】 本発明の組成物での感染した個体の処置は、急性に感染した固体における感染
の消散を促進し得る。慢性感染の発症に感受性（または、その素因がある）の個
体のために、これらの組成物は、急性から慢性の感染への進化を妨げるための方
法において特に有用である。感受性の個体が、感染前または感染中に同定される
場合、その組成物を、それらの個体に標的化し得、これにより、より大きい集団
への投与の必要性を最小化する。
【０２１７】 ＨＣＶ感染の処置または予防のために使用されるペプチドもしくは他の組成物
が、例えば、疾患の明らかな症状を有しないが、疾患媒介者として作用するヒト
において使用され得る。この文脈において、細胞傷害性Ｔ細胞応答を有効的に刺
激するのに十分な投与の様式により送達されるペプチドエピトープの一定量を提
供することが一般的に重要であり、ヘルパーＴ細胞応答を刺激する組成物もまた
、本発明のこの実施形態に従って与えられ得る。
【０２１８】 初期の治療的免疫化のための投薬量は、単位投薬量範囲において一般的に生じ
、ここで、そのより低い値は約１、５、５０、５００または１０００μｇであり
、そしてより高い値は、約１０，０００；２０，０００；３０，０００；または
５０，０００μｇである。ヒトに対する投薬量値は、代表的に、７０ｋｇの患者
につき、約５００μｇ〜約５０，０００μｇの範囲に渡る。数週間〜数ヶ月に渡
るブースト養生法に従う、約１．０μｇ〜約５００００μｇの間のペプチドのブ
ースター投薬量は、患者の血液から得られるＣＴＬおよびＨＴＬの比活性を測定
することにより決定される患者の応答および状態に依存して投与され得る。本発
明のペプチドおよび組成物は、重篤な疾患状態（すなわち、生命を脅かす状況ま
たは潜在的に生命を脅かす状況）において使用され得る。そのような場合におい
て、本発明の好ましい組成物における最小量の外来基質および相対的非毒性のペ
プチドの結果として、これらの規定された投薬量に対して、実質的に過剰なこれ
らのペプチド組成物を投与することが可能であり、そして治療医師により所望さ
れると感じられ得る。
【０２１９】 従って、慢性感染の処置のために、代表的な用量は、上記の開示範囲内（すな
わち、より低い値は約１、５、５０、５００または１０００μｇであり、そして
より高い値は、約１０，０００；２０，０００；３０，０００；または５０，０
００μｇであり、好ましくは、７０ｋｇの患者につき約５００μｇ〜約５０，０
００μｇ）にある。初期用量に次いでブースター用量が、確立された間隔（例え
ば、４週間〜６ヶ月）において、個体を有効的に免疫化するように延長された期
間でおそらく必要とされ得る。慢性感染の場合において、投与は、少なくとも臨
床的症状または実験室の試験が、そのウイルス感染が除去されるか、または実質
的に無効にされることを示すまでおよびその後の一定期間の間継続すべきである
。投薬量、投与経路および用量スケジュールは、当該分野において公知の方法論
に従って調整される。
【０２２０】 治療処置のための薬学的組成物は、非経口投与、局所的投与、経口投与、髄腔
内投与または局所投与のために意図される。好ましくは、この薬学的組成物は、
非経口的（例えば、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内）に投与される。従って
、本発明は、非経口投与のための組成物を提供し、この組成物は、受容可能なキ
ャリア（好ましくは、水性キャリア）に溶解されているか、または懸濁されてい
る免疫原性ペプチドの溶液を含む。種々の水性キャリア（例えば、水、緩衝化水
、０．８％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸など）が使用され得る
。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌され得るか、または滅
菌濾過され得る。得られた水溶液は、そのままかもしくは凍結乾燥された状態で
の使用のために包装され得、凍結乾燥された調製物は、投与の前に滅菌溶液と合
わせられる。これらの組成物は、生理学的状態に近づけるために必要とされる場
合、薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調節剤および緩衝化剤、張度調
節剤、湿潤剤、防腐剤など（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナ
トリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエ
タノールアミンオレアートなど））を含み得る。
【０２２１】 薬学的処方物中の本発明のペプチドの濃度は、広範に変動し得（すなわち、約
０．１重量％未満（通常は約２重量％もしくは少なくとも約２重量％）から２０
重量％〜５０重量％以上と同程度まで）、そして選択された投与の特定様式に従
って、主に流体容量、粘性などによって選択される。
【０２２２】 ヒト単位用量形態のペプチド組成物は、ヒト単位用量の受容可能なキャリア、
好ましくは水性キャリアを含む薬学的組成物内に代表的に含まれて、そしてヒト
に対してそのような組成物を投与するために使用されることが当業者に公知であ
る一定容量の流体において投与される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ
，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐ
ｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９８５を参照のこと）。
【０２２３】 本発明のペプチドはまた、リポソームを介して投与され得、このリポソームは
、特定の組織（例えば、リンパ組織）に対してペプチドを標的とするためか、ま
たは感染細胞に対して選択的に標的とするため、およびペプチド組成物の半減期
を増加するために役に立つ。リポソームとしては、エマルジョン、泡沫、ミセル
、不溶性単分子膜、液晶、リン脂質分散系、ラメラ層（ｌａｍｅｌｌａｒ ｌａ
ｙｅｒ）などが挙げられる。これらの調製物において、送達されるべきペプチド
は、単独でか、もしくはリンパ系細胞の一般的なレセプターと結合する分子（例
えば、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体）と共にか、または他の治療
組成物もしくは免疫原性組成物と共にリポソームの一部として取り込まれる。従
って、本発明の所望のペプチドで満たされているか、または装飾されているかの
いずれかのリポソームは、リンパ系細胞の部位に指向され得、次いで、ここで、
そのリポソームは、そのペプチド組成物を送達する。本発明に従う使用のための
リポソームが、標準的なベシクル形成脂質から形成され、そのベシクル形成脂質
としては、一般的に中性リン脂質および負電荷リン脂質ならびにステロール（例
えば、コレステロール）が挙げられる。脂質の選択は、例えば、リポソームサイ
ズ、血流におけるリポソームの酸不安定性および酸安定性を考慮して、一般的に
導かれる。例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）および米国特許第４，２３５，
８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第
５，０１９，３６９号に記載されるように、リポソームを調製するための種々の
方法が利用可能である。
【０２２４】 免疫系の細胞を標的とするために、リポソーム内に組み込まれるべきリガンド
は、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に対して特異的な抗体またはそ
のフラグメントを含み得る。ペプチドを含むリポソーム懸濁物は、とりわけ、投
与の様式、送達されるペプチド、および処置される疾患の段階に従って変動する
用量において、静脈内に、局所に（ｌｏｃａｌｌｙ）、局所的（ｔｏｐｉｃａｌ
ｌｙ）などにおいて投与され得る。
【０２２５】 固体組成物のために、従来の非毒性固体キャリアが使用され得、そのキャリア
としては、例えば、薬学的等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸
マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、ショ
糖、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。経口投与のために、薬学的に受容可能
な非毒性組成物は、通常使用される任意の賦形剤（例えば、上記に列挙されたそ
れらのキャリア）、および一般的に１０〜９５％の活性成分（すなわち、本発明
の１つ以上のペプチド、およびより好ましくは２５％〜７５％の濃度にて）を取
り込むことによって形成される。
【０２２６】 エアロゾル投与のために、免疫原性ペプチドが、界面活性剤および噴霧剤と共
に微細に分割された形態で好ましくは提供される。ペプチドの代表的な割合は、
０．０１重量％〜２０重量％であり、好ましくは１重量％〜１０重量％である。
この界面活性剤は、当然ながら、非毒性でなければならず、そして好ましくは、
噴霧剤に可溶性である。そのような薬剤の代表的なものは、６〜２２個の炭素原
子を含む、脂肪酸のエステルまたは部分エステル（例えば、脂肪族多水酸基アル
コールまたはその環状無水物とカプロン酸、オクタン酸、ラウリル酸、パルミチ
ン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン（ｏｌｅｓｔｅｒ
ｉｃ）酸およびオレイン酸との）である。混合エステル（例えば、混合グリセリ
ドまたは天然グリセリド）が使用され得る。この界面活性剤は、組成物の０．１
重量％〜２０重量％、好ましくは０．２５〜５重量％を構成し得る。組成物の残
りは、通常、噴霧剤である。キャリアもまた、所望される場合、例えば、鼻腔内
送達のためにレシチンと共に含まれ得る。
【０２２７】 （ＩＶ．Ｍ．キット） 本発明のペプチドおよび核酸組成物は、ワクチン投与のための指示と共にキッ
ト中で提供され得る。代表的には、そのキットは、容器中の、好ましくは、単位
用量形態の所望のペプチド組成物および投与についての指示書を含む。別のキッ
トは、投与についての指示書と共に、好ましくは、単位用量形態で容器中に本発
明の所望の核酸を有するミニ遺伝子構築物を含む。ＩＬ−２またはＩＬ−１２な
どのリンホカインはまた、そのキットに含まれ得る。また所望され得る他のキッ
ト構成成分としては、例えば、滅菌シリンジ、追加免疫用量、および他の所望の
賦形剤が挙げられる。
【０２２８】 本発明は、特定の実施例によってより詳細に記載される。以下の実施例は、例
示的な目的について提供され、そして、いずれの方法においても本発明を制限す
ることを意図するものではない。当業者は、本発明に従って、種々の重要でない
パラメーターが、別の実施形態を生じるように変化され得るかまたは改変され得
ることを容易に理解する。
【０２２９】 （Ｖ．実施例） 多数のウイルス疾患におけるように、ＨＣＶの除去がＣＴＬによって媒介され
るという証拠が存在する。６匹のチンパンジーにおける初期のＨＣＶ感染の研究
において、４匹が慢性的感染へと進行した（Ｃｏｏｐｅｒら、要約、第１９回日
米肝炎共同パネルミーティング、１９９８年、１月２７〜２９日）。これらの４
匹の動物が、初期感染期間に、全くＣＴＬ応答を示さなかったか、または、非常
に狭く集中した応答のいずれかを示したことを見出した。対照的に、感染を解決
した残る２匹の動物では、広範なＣＴＬ応答が、複数のＨＣＶタンパク質（その
いくつかは、保存されている）に対して観察された。Ｗｅｉｎｅｒら（Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：２７５５−２７５９，１９９５
）は、ウイルスエスケープ（そこで、エピトープが、変異したＰＡＴＲクラスＩ
分子に提示される）が、慢性的感染への進行に関して関連していることを示した
。これらのデータは、ＨＣＶ疾患の経過を方向付ける際、および持続的に感染し
た宿主におけるＨＣＶ種の遺伝的組成を決定する際の、ＣＴＬについての役割を
示す。
【０２３０】 ヒトにおける研究では、Ｋｏｚｉｅｌらが、慢性的なＨＣＶ感染を有する患者
由来の肝浸潤におけるＨＣＶ特異的ＣＴＬの存在を確立し（Ｋｏｚｉｅｌら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３３３９，１９９２；およびＫｏｚｉｅｌら、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．６７：７５２２，１９９３）、そして、いくつかの異なったＨＬＡ
クラスＩ分子の文脈で認識される多数のＣＴＬエピトープをまた同定した。他の
研究者らは、ＨＣＶ特異的ＣＴＬが、慢性的なＣ型肝炎を有する患者の末梢血液
において検出され得ることを示してきた（Ｃｅｒｒｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ．９５：５２１，１９９５；Ｃｅｒｎｙら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓｉｎ
Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８９：１６９，１９９４；Ｃｅｒｎ
ｙら、Ａｂｓｔ．２ndＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ Ｈ
ｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ；Ｌａ Ｊｏ
ｌｌａ ＣＡ，１９９４；Ｂａｔｔｅｇａｙら、Ａｂｓｔ．２ｎｄ Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｎａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣ ａｎｄ Ｒｅ
ｌａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ；Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，１９９４；Ｓｈｉｒａ
ｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：３３３４，１９９４；Ｓｈｉｒａｉら、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１５４：２７３３，１９９５；Ｂａｔｔｅｇａｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６９：２４６２，１９９５）。さらに、エスケープ改変体が、慢性的にＨＣ
Ｖに感染した患者において示されてきた（Ｃｈａｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ．１００：２３７６−２３８５，１９９７；Ｔｓａｉら、Ｇａｓｔｒｏｅ
ｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１５：９５４−９６６，１９９８）。
【０２３１】 概して、ＨＣＶ感染患者で観察されるＣＴＬ応答の規模は、慢性的なＢ型肝炎
感染の場合に観察される応答よりも高く、このことは特定のＴ細胞免疫の障害は
、ＨＢＶ感染よりもより少ないことを示唆する。しかし、ＨＣＶ患者におけるＣ
ＴＬ応答の規模は、上手くＨＢＶ感染をクリアしたＨＢＶ感染個体で観察される
規模よりも低い。これらの結果は、ＨＣＶ感染患者が能動的な免疫治療に応答可
能であるという理解を支持し、そして、ＨＣＶに対するＴ細胞の応答の相乗作用
および増加は、慢性的なＨＣＶ感染の治療および予防において有用であり得る（
Ｐｒｉｎｃｅ，Ａ．Ｍ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ．Ｒｅｖ．１４：２７３，１９９
４）。
【０２３２】 いくつかの集団が、疾患抵抗性および病原性におけるＨＣＶ特異的なＣＴＬ応
答の潜在的役割を分析してきた。いくつかの研究において、個々のＨＣＶエピト
ープについてＣＴＬウイルス血症とＣＴＬ前駆体頻度との間の相関関係は全く見
出されなかった（Ｒｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：
１４３２−１４４０，１９９６；Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１
４７９−１４８８，１９９８）。しかし、他の研究では、多数のＣＴＬエピトー
プに対するグローバル応答を考慮するという条件で、ＨＣＶ感染のレベルとＣＴ
Ｌ応答との間の明白な相互関係が存在することが示唆された（Ｒｅｈｅｒｍａｎ
ｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：７０９２−７１０２，１９９６）。これらのデー
タは、保存されたＨＣＶ由来のエピトープの多重度に対する種々のＣＴＬ応答を
含み得るワクチン構築物の開発について強い理論的根拠を示す。
【０２３３】 Ｋｏｚｉｅｌらは、曝露されるがしかし血清陰性の個体において、ＨＣＶ特異
的なＣＴＬの存在およびＴヘルパー細胞応答を示してきた（Ｋｏｚｉｅｌら、Ｊ
．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ １７６：８５９−８６６，１９９７）。さ
らに、ＨＣＶ特異的ＣＴＬは、慢性的にＨＣＶ感染患者の健康な血清陰性の家族
メンバーにおいて検出され、このことは防御免疫が、検出可能な感染の非存在下
で、確立されていることを示す（Ｂｒｏｎｏｗｉｃｋｉら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．
Ｄｉｓ．１７６：５１８−５２２，１９９７；Ｓｃｏｇｎａｍｉｇｌｉｏら、準
備中）。
【０２３４】 実験的な証拠はまた、ＨＴＬエピトープがＨＣＶ感染に対する免疫応答性およ
び防御において重要な役割を果たすことを示す（Ｍｉｓｓａｌｅら、Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：７０６−７１４，１９９６）。Ｄｉｅｐｏｌｄｅｒら
（Ｌａｎｃｅｔ ３４６：１００６，１９９５）は、ＮＳ３遺伝子（ＮＳ３ １
００７−１５３４）の領域は、急性ＨＣＶ感染をクリアする患者によって認識さ
れるが、慢性的な感染を発症する患者によっては検出されないことを示す。続く
研究は、この特定の領域が高度に交差反応性のＨＴＬエピトープ（ＮＳ３ １２
４８−１２６１）（そのエピトープは、試験された１３ＤＲ分子の１０に対して
優れた親和性で結合する）を含むこと、そして、考慮される異なったＨＣＶ単離
体の３０／３３において高度に保存されることを示した（Ｄｉｅｐｏｌｄｅｒら
、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６０１１−６０１９，１９９７）。これらのデータは
、この型のエピトープにＨＴＬ応答を指向すること（より交差反応性でないおよ
び／または高度に可変性のエピトープに対してではなく）は、治療的および予防
的に有益であり、そして、ＨＣＶワクチン構築物において類似した特徴を有する
このエピトープまたは他のエピトープを含むことについて強く主張する。
【０２３５】 以下の実施例は、ワクチン組成物に含むための免疫原性クラスＩおよびクラス
ＩＩペプチドエピトープの同定、選択、および使用を例示する。
【０２３６】 （実施例１：ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ結合アッセイ） ＨＬＡ分子に結合するペプチドの以下の実施例は、ＨＬＡクラスＩおよびクラ
スＩＩペプチドの結合親和性の定量を示す。結合アッセイは、モチーフ保有であ
るかまたはモチーフ保有でないかのどちらかであるペプチドを使用して実施し得
る。
【０２３７】 エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）で形質転換したホモ結合性細胞株、線
維芽細胞、ＣＩＲ、または７２１．２２形質転換体を、ＨＬＡクラスＩ分子の供
給源として使用する。ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子の精製のために慣例
的に使用される特定の細胞株を、表ＸＸＩＶに列挙する。開示されたプロトコル
（Ｓｉｄｎｅｙら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ １８．３．１（１９９８）；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１５４：２４７（１９９５）；Ｓｅｔｔｅら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：
８１３（１９９４））に従って、細胞溶解物を調製し、そして、ＨＬＡ分子を精
製した。ＨＬＡ分子を、親和性クロマトグラフィーによって溶解物より精製した
。その溶解物を適切な抗体に対して結合したセファロースＣＬ−４Ｂビーズのカ
ラムを通過させた。細胞溶解物からＨＬＡの抽出のために使用した抗体を、表Ｘ
ＸＶに列挙する。次いで、抗ＨＬＡカラムを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ
８．０を含む１％ＮＰ−４０、ＰＢＳ、および０．４％ｎ−オクチルグルコシド
を含むＰＢＳで洗浄し、そして、ＨＬＡ分子を、５０ｍＭジエチルアミン含有０
．１５Ｍ ＮａＣｌ（０．４％ｎ−オクチルグルコシド含有）（ｐＨ１１．５）
を使用して溶解した。２．０Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ６．８の１／２５容量を溶出に
加え、ｐＨを約８．０に低下させた。次いで、溶出物をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３
０コンセントレータ（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で、遠心によって
遠心分離した。タンパク質含量を、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｉｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって評価し、そして
、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
【０２３８】 クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣへのペプチドの結合を測定するために利用
されるプロトコルの詳細な記載は、公開されている（Ｓｅｔｔｅら、Ｍｏｌ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．３１：８１３，１９９４；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｄ．
，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｓｅｃｔｉｏｎ １８
．３，１９９８）。手短には、精製されたＭＨＣ分子（５〜５００ｎＭ）を、プ
ロテアーゼインヒビター反応溶液の存在下で、０．０５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−
４０（ＮＰ４０）を含むＰＢＳ（またはＨ−２ ＩＡアッセイのための２０％ｗ
／ｖジギトニン）中で４８時間、種々の未標識ペプチドインヒビターおよび１〜
１０ｎＭ125Ｉ放射性標識プローブペプチドとインキュベートした。ＤＲＢ１*０
３０１（それは、ｐＨ４．５で行なった）ならびにＤＲＢ１*１６０１（ＤＲ２
ｗ２１β1）およびＤＲＢ４*０１０１（ＤＲｗ５３）（それはｐＨ５．０で実施
した）を除き、全てのアッセイをｐＨ７．０で行なった。
【０２３９】 インキュベーション後、ＭＨＣ−ペプチド複合体を７．８ｍｍ×１５ｃｍのＴ
ＳＫ２００カラム（ＴｏｓｏＨａａｓ １６２１５，Ｍｏｎｔｏｇｏｍｅｒｙｖ
ｉｌｌｅ，ＰＡ）上のゲルろ過によって、遊離ペプチドから分離した。ＤＲＢ１ * １５０１（ＤＲ２ｗ２１β1）アッセイに使用された大きなサイズの放射性標識
ペプチドは、このような条件下で未結合ピークから結合ピークを分離することが
より難しいので、全てのＤＲＢ１*１５０１（ＤＲ２ｗ２１β1）アッセイを、０
．６ｍｌｓ／分で溶出する７．８ｍｍ×３０ｃｍ ＴＳＫ２０００カラムを用い
て実施した。ＴＳＫカラムからの溶出液を、Ｂｅｃｋｍａｎ１７０放射性標識検
出器を通過させ、そして、放射活性をプロットしそしてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃ
ｋａｒｄ３３９６Ａインテグレーターを用いて積算し、そして結合したペプチド
の画分を決定した。
【０２４０】 放射性標識ペプチドを、クロラミンＴ法を用いてヨウ素化した。それぞれのア
ッセイおよびそのアッセイ特異的ＩＣ50ｎＭにおいて利用される代表的な放射性
標識プローブペプチドを、表ＩＶおよびＶに要約した。代表的には、予備実験に
おいて、ＭＨＣ調製物の各々を、総放射活性の１０〜２０％と結合するための必
要なＨＬＡ分子の濃度を決定するために、固定量の放射性標識ペプチドの存在下
で滴定した。続く全ての阻害および直接的結合アッセイを、これらのＨＬＡ濃度
で行なった。
【０２４１】 これらの条件［標識］＜［ＨＬＡ］および［ＩＣ50］≧［ＨＬＡ］下で、測定
したＩＣ50値は、真のＫD値の合理的な近似値であった。ペプチドインヒビター
は、代表的には、１２０μｇ／ｍｌから１．２ｎｇ／ｍｌまでの範囲の濃度で試
験し、そして、２〜４の完全に独立した実験で試験した。異なった実験で獲得さ
れたデータの比較を可能にするために、試験されたそれぞれのペプチドついての
ＩＣ50で、阻害についてのポジティブコントロール（代表的には、放射性標識プ
ローブペプチドの未標識バージョン）のＩＣ50を割ることによって、それぞれの
ペプチドについて相対的な結合数値を計算する。データベース目的および実験間
比較のために、相対結合値を編集した。これらの値は、目的のペプチドの相対結
合で、阻害についてのポジティブコントロールのＩＣ50ｎＭを割ることによって
、ＩＣ50ｎＭ値に引き続き変換し得る。データ編集のこの方法は最も正確であり
、そして異なった日数で試験されたペプチドまたは異なったロットの精製ＭＨＣ
との比較について一貫していることを証明する。
【０２４２】 ＨＬＡ−ＤＲ精製（ＬＢ３．１）について使用される抗体は、α鎖特異的であ
るため、β1分子は、β3（および／またはβ4およびβ5）分子から分離されない
。結合アッセイのβ1特異性は、ＤＲＢ１*０１０１（ＤＲ１）、ＤＲＢ１*０８
０２（ＤＲ８ｗ２）、およびＤＲＢ１*０８０３（ＤＲ８ｗ３）の場合で明らか
であるが、β3は全く発現されない。ＤＲＢ１*０３０１（ＤＲ３）およびＤＲＢ
３*０１０１（ＤＲ５２ａ）、ＤＲＢ１*０４０１（ＤＲ４ｗ４）、ＤＲＢ１*０
４０４（ＤＲ４ｗ１４）、ＤＲＢ１*０４０５（ＤＲ４ｗ１５）、ＤＲＢ１*１１
０１（ＤＲ５）、ＤＲＢ１*１２０１（ＤＲ５ｗ１２）、ＤＲＢ１*１３０２（Ｄ
Ｒ６ｗ１９）およびＤＲＢ１*０７０１（ＤＲ７）についてもまた示されてきた
。ＤＲＢ１*１５０１（ＤＲ２ｗ２β1）、ＤＲＢ５*０１０１（ＤＲ２ｗ２β2）
、ＤＲＢ１*１６０１（ＤＲ２ｗ２１β1）、ＤＲＢ５*０２０１（ＤＲ５１Ｄｗ
２１）、およびＤＲＢ４*０１０１（ＤＲｗ５３）アッセイついてのβ鎖特異性
の問題は、線維芽細胞の使用によって回避できる。ＤＲβ分子特異性に関するア
ッセイの開発および確証は、以前に記載されている（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏ
ｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３−３３７３，１９９８を参照のこ
と）。
【０２４３】 上記に概略される結合アッセイを、例えば、実施例２に記載されるように、ス
ーパーモチーフおよび／またはモチーフ保有エピトープを分析するために使用し
得る。
【０２４４】 （実施例２．保存されたＨＬＡスーパーモチーフ保有ＣＴＬ候補エピトープお
よびモチーフ保有ＣＴＬ候補エピトープの同定） 本発明のワクチン組成物は、広範な集団の適用範囲を達成するために、多数の
ＨＬＡスーパーモチーフまたはモチーフを含む多数のエピトープを含み得る。こ
の実施例は、そのようなワクチン組成物における封入についてのスーパーモチー
フ保有エピトープおよびモチーフ保有エピトープの同定を例示する。集団適用範
囲の計算を、以下に記載されるストラテジーを用いて実施した。
【０２４５】 （スーパーモチーフおよび／またはモチーフ保有エピトープの同定のためのコ
ンピューターサーチおよびアルゴリズム） ＨＬＡクラスＩのスーパーモチーフもしくはモチーフまたはＨＬＡクラスＩＩ
のスーパーモチーフもしくはモチーフを保有するエピトープについてのコンピュ
ーターサーチを、以下のように行なった。全ての翻訳されたＨＣＶ単離配列を、
適切なＨＬＡ結合モチーフを含む潜在的ペプチド配列を同定するために、テキス
トストリング（ｔｅｘｔ ｓｔｒｉｎｇ）サーチソフトウェアプログラム（例え
ば、ＭｏｔｉｆＳｅａｒｃｈ１．４（Ｄ．Ｂｒｏｗｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ））
を用いて分析した；代替のプログラムは、本明細書中に開示されるモチーフ／ス
ーパーモチーフを参照して、当該分野の情報に従って、容易に作製される。さら
に、そのような計算は、頭の中で行なわれ得る。同定されたＡ２スーパーモチー
フ配列、Ａ３スーパーモチーフ配列、およびＤＲスーパーモチーフ配列を、特定
のＨＬＡクラスＩ分子またはＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するそれらの能力を推
定するための多項式アルゴリズムを用いて、スコアリングした。これらの多項式
アルゴリズムは、伸長したモチーフおよび精製されたモチーフの両方を考慮し（
すなわち、異なる位置での異なるアミノ酸の影響を考慮するために）、かつ以下
の前提に基本的に基づく。この前提とは、ペプチドＨＬＡ分子相互作用の親和性
全体（言い換えるとΔＧ）は、以下の型の直線的な多項式関数： 「ΔＧ」＝ａ1i×ａ2i×ａ3i．．．．．．×ａni として近似し得、ここで、ａjiは、ｎアミノ酸のペプチドの配列に沿って、所定
の位置（ｉ）での所定のアミノ酸（ｊ）の存在効果を示す係数である。この方法
の重要な仮説は、それぞれの位置での効果が互いに実質的に独立している（すな
わち、個々の側鎖の独立した結合）ということである。残基ｊがペプチド中の位
置ｉで生じる場合、定常量ｊiが、ペプチドの残りの配列とは無関係なペプチド
の結合の自由エネルギーに貢献することが想定される。この仮説は、ペプチドが
実質的に伸長したコンフォメーションでＭＨＣに結合しかつＴ細胞によって認識
されることを示す本発明者らの研究室の研究（データは本明細書中に示されてい
ない）によって正当化される。
【０２４６】 特定のアルゴリズム係数の誘導法は、Ｇｕｌｕｋｏｔａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．２６７：１２５８−１２６，１９９７；（Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍａｎ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３，１９９６；およびＳｏｕｔｈｗｏｏｄら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３−３３７３，１９９８もまた参照のこと
）に記載されている。手短には、全てのｉ位置について、アンカーおよび非アン
カーも同様に、ｊを有する全てのペプチドの平均相対結合（ＡＲＢ）の相乗平均
を、集団の残りと比較して計算し、そして、ｊiの推定値として使用した。クラ
スＩＩペプチドについて、多数のアライメントが可能な場合、反復手順に従って
、最高のスコアリングのアライメントのみを利用した。試験セットにおける所定
のポリペプチドのアルゴリズムスコアを計算するために、そのペプチドの配列に
対応するＡＲＢ値を乗算した。この積が選択される閾値を超える場合、そのペプ
チドは、結合することが推定される。適切な閾値を、所望される推定のストリン
ジェンシーの度合いの関数として選択する。
【０２４７】 （ＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ交差反応性ペプチドの選択） １４のＨＣＶ単離体由来の完全ポリタンパク質配列をアライメントし、次いで
、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフの一次アンカー特異性を含む保存された９およ
び１０マーの配列を同定するために、モチーフ同定ソフトウェアを利用して、走
査した。
【０２４８】 全２３１の保存されたＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ陽性配列を同定した。次
いで、これらのペプチドを、Ａ*０２０１特異的多項式アルゴリズムを用いてＡ* ０２０１の好ましい二次アンカー残基の存在について評価した。全６７の保存さ
れたモチーフ保有配列およびアルゴリズム陽性配列を同定した。
【０２４９】 これらの保存されたモチーフ保有９または１０マーのペプチドのうち５０を、
精製したＨＬＡ−Ａ*０２０１分子にインビトロで結合するそれらの能力につい
て試験した（ＨＬＡ−Ａ*０２０１は、表現型Ａ２スーパータイプ分子と考えら
れる）。５０〜５００ｎＭの範囲で、１６ペプチドが５００ｎＭ以下のＩＣ50値
でＡ*０２０１と結合し；４ペプチドが高い結合親和性を有し（５０ｎＭ以下の
ＩＣ50値）および１２ペプチドが中間の結合親和性を有した（表ＸＸＶＩ）。
【０２５０】 次いで、これらの１６ペプチドは、さらなるＡ２−スーパータイプ分子（Ａ*
０２０２、Ａ*０２０３、Ａ*０２０６、およびＡ*６８０２）への結合について
試験した。表ＸＸＶＩに示されるように、これらのペプチドの多くは、Ａ２スー
パータイプ交差反応性結合因子であることを検出した。より特定には、１６ペプ
チドのうち１２（７５％）が、試験された５つのＡ２スーパータイプ分子の少な
くとも３つに結合した。
【０２５１】 （ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有エピトープの選択） 上記に走査された同じ１４の公知のＨＣＶ単離体由来の配列をまた、ＨＬＡ−
Ａ３スーパーモチーフの一次アンカーを使用して、保存されたペプチドの存在に
ついて試験した。全７１の保存された９または１０マーのモチーフ保有配列を同
定した。Ａ０３アルゴリズムおよびＡ１１アルゴリズムを用いたさらなる分析（
例えば、Ｇｕｌｕｋｏｔａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６７：１２５８−１２
６７，１９９７およびＳｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７
９−９３，１９９６を参照のこと）は、アルゴリズムのどちらかまたは両方で高
スコアである３９配列を同定した。３９ペプチド中の２７を合成し、かつ２つの
最も一般的なＡ３スーパータイプ分子であるＨＬＡ−Ａ*０３およびＨＬＡ−Ａ* １１への結合を試験した。５００ｎＭ以下の結合親和性で、Ａ３および／または
Ａ１１と結合した１５ペプチドを同定した（表ＸＸＶＩＩ）。次いで、これらの
ペプチドを、他の一般的なＡ３スーパータイプ対立遺伝子（Ａ*３１０１、Ａ*３
３０１、およびＡ*６８０１）に対する結合交差反応性について試験した。１５
ペプチドのうちの７つが、試験された５つのＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ分子の
少なくとも３つに結合した。
【０２５２】 独立した一連の実験の過程で（Ｋｕｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３
９１３−３９２４，１９９４）、１つのペプチド（ＨＣＶ ＮＳ５３ １２６２
）（上記で利用された選択規準によって同定されない、なぜならＡ３スーパーモ
チーフの一次アンカー特異性を有さないからである）が、Ａ*０３、Ａ*１１、お
よびＡ*６８０２１と結合しＡ３スーパータイプにおいて交差反応性であると決
定した。このペプチドはまた、表ＸＸＶＩＩに示す。興味深いことに、このペプ
チドは、ペプチド１０７３．１４の単一の残基のＮ末端欠失を示す（これもまた
、表ＸＸＶＩＩに示す）。
【０２５３】 要約すると、ＨＣＶゲノムの保存領域に由来する３以上のＡ３スーパータイプ
分子に結合する８ペプチドを同定した。
【０２５４】 （ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ保有エピトープの選択） 同じ１４のＨＣＶ単離体をまた、ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフを有する保存
された９または１０マーのペプチドの存在について試験した場合、３５の配列が
同定された。対応するペプチドを合成し、そして、最も一般的なＢ７スーパータ
イプ対立遺伝子（すなわち、Ｂ７スーパータイプ対立遺伝子体の原型）であるＨ
ＬＡ−Ｂ*０７０２に対する結合について試験した。１３のペプチドが、５００
ｎＭ以下のＩＣ50でＢ*０７０２と結合した（表ＸＸＶＩＩＩａ）。次いで、こ
れらの１３のペプチドを、他の一般的なＢ７スーパータイプ分子（Ｂ*３５０１
、Ｂ*５１、Ｂ*５３０１、およびＢ*５４０１）への結合について試験した。表
ＸＸＶＩＩＩａに示されるように、１つのペプチド（コア１６９）のみが、試験
された５つのＢ７スーパータイプ対立遺伝子体のうちの３つ以上に結合可能であ
った。
【０２５５】 さらなるＢ７スーパータイプエピトープを同定するために、さらなる研究を行
った。上記で利用された１４のＨＣＶ単離体由来のタンパク質配列を再び、保存
されたモチーフ保有８および１１マーを同定するために調査した。その単離体を
また、より低い保存性（５１％〜７８％）を考慮に入れて９マーおよび１０マー
配列について調査した。２５の８マー、１６の１１マー、および３５の９および
１０マーを同定し、合成し、そして、Ｂ*０７０２への結合について試験した。
１３のペプチドが、高いまたは中間の親和性（５００ｎＭ以下のＩＣ50）で結合
した（表ＸＸＶＩＩＩｂ）。これらのペプチドを、他のＢ７スーパータイプ分子
への結合についてさらにスクリーニングした。１つの交差反応性結合因子（ＮＳ
３ １３７８ ８マー（ペプチド２９．００３５／１２６０．０４））のみが同
定された（表ＸＸＶＩＩＩｂ）。
【０２５６】 要約すると、全部で２つの交差反応性Ｂ７スーパーサブタイプ結合因子が同定
された（スコア１６９およびＮＳ３ １３７８）。
【０２５７】 （Ａ１およびＡ２４モチーフ保有エピトープの選択） 集団適用範囲をさらに増加するために、ＨＬＡ−Ａ１およびＨＬＡ−Ａ２４エ
ピトープもまた、潜在的なワクチン構築物中に組み込み得る。
【０２５８】 以前の分析においては、２つのＡ１および３つのＡ２４結合因子（ＨＣＶの４
つの系統間で１００％保存されている）が同定された（Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈら、
Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５１−６５９，１９９６）。上記で利用された
１４のＨＣＶ系統由来のタンパク質配列データの分析は、これらのペプチドが、
７９％を超えて保存されることを示し、そしてまた、さらなる１１のＡ１モチー
フ保有保存配列および２５のＡ２４モチーフ保有保存配列を同定した（表ＸＸＩ
Ｘ ＡおよびＢを参照のこと）。このさらなる１１のＡ１ペプチドのうちの８つ
およびさらなる２５のＡ２４ペプチドのうち７つを、適切なＨＬＡ分子（すなわ
ちＡ１またはＡ２４）への結合について試験した。全体としては、表ＸＸＩＸに
示されるように、４つのＡ１モチーフペプチド（Ａ）および３つのＡ２４モチー
フペプチド（Ｂ）は、適切な対立遺伝子体特異的ＨＬＡ分子について５００ｎＭ
またはそれ未満の結合能力を有することが見出された。
【０２５９】 上記同定されたＨＬＡ−Ａ２およびＡ３スーパーモチーフ保有エピトープの分
析は、１４のうち１３の場合において、１００ｎＭ未満のＩＣ50で、スーパータ
イプ原型ＨＬＡ分子（すなわち、Ａ２スーパータイプについてはＡ*０２０１、
およびＡ３スーパータイプについてはＡ*０３０１）と結合するペプチドが、交
差反応性であり、そして続く実施例３に記載されるように、ＨＣＶ感染患者によ
っておよび認識されることを明らかにした。これらの観察に基づいて、２つのＡ
１ペプチドおよび１つのＡ２４ペプチドエピトープをまた、ワクチン組成物中の
封入のための化合物として選択した；これらのペプチドは、１００ｎＭ未満のＩ
Ｃ50で、適切なＨＬＡ分子と結合する。
【０２６０】 （実施例３：免疫原性の確認） （Ａ*０２０１免疫原性の評価） Ａ*０２０１／Ｋbトランスジェニックマウスで誘導されるＣＴＬは、ヒトの系
で誘導されるＣＴＬに類似した特異性を示すことが示されている（例えば、Ｖｉ
ｔｉｅｌｌｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７−１０１５，１９９１
；Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：９７−１０１，
１９９６を参照のこと）。従って、これらのマウスを、上記の実施例２で同定さ
れた１２の保存されたＡ２スーパータイプ交差反応ペプチドの免疫原性を評価す
るために使用した。
【０２６１】 ペプチド免疫化に続くトランスジェニックマウスにおいてのＣＴＬ誘導が記載
されている（Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７−１
０１５，１９９１；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７
５３−４７６１，１９９７）。これらの研究において、マウスに、過剰のＩＡb
制限ヘルパーペプチド（１４０μｇ／マウス）（ＨＢＶコア１２８−１４０，Ｓ
ｅｔｔｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：５５８６−５５９２，１９９４）の
存在下でＩＦＡ中に乳化したそれぞれのペプチド（５０μｇ／マウス）を、しっ
ぽの基部で皮下注射した。注射の１１日後、脾細胞を、ペプチド負荷した同質遺
伝子的なＬＰＳ芽細胞の存在下でインキュベートした。６日後、培養物をペプチ
ドパルス化標的を用いて、細胞傷害性活性についてアッセイした。表ＸＸＸに要
約したデータは、１２ペプチド中の７が（５８％）、Ａ*０２０１／Ｋbトランス
ジェニックマウスにおいて一次ＣＴＬ応答を誘導できたことを示す。（これらの
研究について、ペプチドは、それがＣＴＬを誘導した場合、陽性であるとみなし
た（少なくとも２つのトランスジェニック動物において、Ｌ．Ｕ．３０／１０6
細胞が２以上（Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：９
７−１０１，１９９６）））。
【０２６２】 保存された交差反応性候補ＣＴＬエピトープをまた、ＨＣＶ感染患者から獲得
したＰＢＭＣによるインビトロでの認識について試験した。手短には、ＨＣＶに
感染した患者由来のＰＢＭＣを、１０μｇ／ｍｌの合成ペプチド存在下で培養し
た。７および１４日後、その培養物をペプチドで再刺激した。その培養物を、標
準の４時間51Ｃｒ放出アッセイで、特定のペプチドを使用してパルス化した標的
細胞を用いて、２１日目に、細胞溶解性活性についてアッセイした。そのデータ
を表ＸＸＸに要約する。示されるように、１２のペプチドは全て、ＨＣＶ感染の
患者由来のＰＢＭＣによって認識されるＣＴＬエピトープである。表ＸＸＸのデ
ータから、ＨＬＡトランスジェニックが、リコール応答において陽性であったい
くつかのペプチドの免疫原性を十分に示さなかったことに興味深く留意される。
この見かけ上の矛盾は、利用される免疫化経路（例えば、ペプチド免疫化に対す
る自然感染）またはＣＴＬレパートリーにおける差異を反映し得る。
【０２６３】 （Ａ*０３／Ａ１１免疫原性の評価） 上記実施例２で同定された８つのＡ３スーパータイプ交差反応性ペプチドのう
ち６つの免疫原性を、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスについて上記に記
載したプロトコル（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７
５３−４７６１，１９９７）を使用して、ＨＬＡ−Ａ１１／Ｋbトランスジェニ
ックマウスにおいて評価した。これらの６つのペプチドのうち５つが、一次ＣＴ
Ｌ応答を誘導し得た（表ＸＸＸＩ）。
【０２６４】 ８つのペプチドの全てをまた、ＨＣＶ感染患者およびそのような患者の接触者
由来のＰＢＭＣ培養物を用いて、共同研究者によって研究した。このデータをま
た表ＸＸＸＩに要約する。手短には、８つのペプチドの全てが、ＨＣＶ感染個体
によって認識した。
【０２６５】 （Ｂ７免疫原性の評価） ２つのＢ７スーパータイプ交差反応性ペプチドのうちの１つ（１１４５．１２
、コア１６９）が、ＨＣＶ感染患者における免疫原性について評価した。２人の
別々の研究者が、このペプチドが、確かに免疫原性であり、そして、ＨＣＶ感染
患者由来のＴ細胞によって認識されることを示した（Ｃｈａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１６２：１１５６−１１６４，１９９９）。
【０２６６】 （実施例４：アナログを作製することによって天然のエピトープの結合能力を
改善するための伸長したスーパーモチーフの実施） 本明細書中に示されるように、ＨＬＡモチーフおよびスーパーモチーフ（一次
および／または二次の残基を含む）は、高度に交差反応性の天然のペプチドの同
定および調製において有用である。さらに、ＨＬＡモチーフおよびスーパーモチ
ーフの規定はまた、アナログ化、または「修正（ｆｉｘｅｄ）されて」、そのペ
プチドに特定の特徴（例えば、スーパータイプを含むＨＬＡ分子の群内のより優
れた交差反応性、および／またはそれらＨＬＡ分子のいくつかまたは全てについ
てのより優れた結合親和性）を与える天然のペプチド配列内の残基を同定するこ
とによって、当業者が高度に交差反応性のエピトープを操作するのを可能とする
。調整された結合親和性を示すアナログペプチドの例を、この実施例に示す。
【０２６７】 （一次アンカー残基でのアナログ化） 実施例２に示すように、１０を超える異なったＨＣＶ誘導のＡ２スーパータイ
プ制限エピトープが同定された。ペプチド操作ストラテジーを、試験したＡ２ス
ーパータイプ対立遺伝子体の３／５に結合する、上記で同定した候補エピトープ
の交差反応性をさらに増加させるために、実行する。開示された（例えば、関連
のおよび同時係属中のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ ０９／２２６，７７５において）データ
に基づいて、Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドの一次アンカーを、例えば、２
位に好ましいＬ、Ｉ、Ｖ、またはＭを導入するように、およびＣ末端にＩまたは
Ｖを導入するように、変化させる。
【０２６８】 アナログペプチドの交差反応性を分析するために、各操作されたアナログを、
プロトタイプのＡ２スーパータイプ対立遺伝子Ａ*０２０１に対する結合につい
て最初に試験し、次いで、Ａ*０２０１結合能力を維持する場合、Ａ２スーパー
タイプ交差反応性について試験する。
【０２６９】 同様に、エピトープを保有するＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフのアナログもま
た生成され得る。例えば、Ａ３スーパータイプの分子の３／５に結合するペプチ
ドを、位置２に好ましい残基（Ｖ、Ｓ、ＭまたはＡ）を保有するために一次アン
カー残基において操作し得る。
【０２７０】 次いで、アナログペプチドを、Ａ*０３およびＡ*１１（プロトタイプＡ３スー
パータイプ対立遺伝子）を結合する能力について試験する。次いで、５００ｎＭ
以下の結合能力を示すそれらのペプチドを、Ａ３スーパータイプ交差反応性につ
いて試験する。
【０２７１】 Ａ２モチーフ保有ペプチドおよびＡ３モチーフ保有ペプチドと同様に、３個以
上のＢ７スーパータイプ対立遺伝子を結合するペプチドを、可能な場合、増加し
た交差反応結合を達成するために改善し得る。Ｂ７スーパーモチーフ保有ペプチ
ドを、Ｓｉｄｎｅｙら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３４８０−３４９０、１
９９６）に示されるように、例えば、Ｃ末端の一次アンカー位置に好ましい残基
（Ｖ、Ｉ、ＬまたはＦ）を保有するために操作し得る。
【０２７２】 （二次アンカー残基におけるアナログ） さらに、ＨＬＡスーパーモチーフは、高い交差反応性のあるペプチドおよび／
またはこのような特性と関連する二次アンカー位置の特定の残基を同定すること
により、増加した親和性を有するＨＬＡ分子を結合するペプチドを操作すること
において価値がある。これを示して、位置１における目立たない単一のアミノ酸
置換を表すペプチドの結合能力を分析した。コア１６９配列の位置１のＬ〜Ｆの
置換を表すペプチド１１４５．１３（表ＸＸＶＩＩＩｃ）が、十分な親和性を有
する全ての５つのＢ７スーパータイプ分子を結合し（全てのＩＣ50値は、１３２
ｎＭ以下）、そして３つの場合において、３５倍を越えるまで、親ペプチドの親
和性より高い親和性を有する。
【０２７３】 これだけのＢ７スーパータイプ交差反応性エピトープを同定したことから、以
前の結合評価からの本発明者らの結果を分析して、最低でも、弱い親和性（５０
０ｎＭ〜５μＭのＩＣ50）を有する３／５のＢ７スーパータイプ分子を結合する
、保存された（８、９、１０、または１１マー）ペプチドを同定するために分析
した。この分析は、９個のペプチドを同定し、このうちの６個は、アナログであ
る（ａｎａｌｏｇｕｅｄ）（以前にアナログとされたコア１６９を含む）。これ
らのペプチドを、増強された結合親和性およびＢ７スーパータイプ交差反応性に
ついて試験する。
【０２７４】 十分に改善された結合能力または交差反応性を有する操作されたアナログを、
例えば、ＩＦＡ免疫またはリポペプチド免疫後に、ＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニ
ックマウスにおける免疫原性について試験する。
【０２７５】 結論として、これらのデータは、単一のアミノ酸置換でさえその使用により、
ＨＬＡスーパータイプ分子に対するペプチドリガンドの結合親和性および／また
は交差反応性を増加することが可能である。
【０２７６】 （実施例５：ＨＬＡ−ＤＲ結合モチーフを有する保存されたＨＣＶ由来配列の
同定） ＨＬＡクラスＩＩスーパーモチーフまたはモチーフを保有するペプチドエピト
ープをまた、実施例１〜３に記載の方法論と類似の方法論を使用して、以下に概
略を示すように、同定し得る。
【０２７７】 （ＨＬＡ−ＤＲ−スーパーモチーフ保有エピトープの選択） ＨＣＶ由来、ＨＬＡクラスＩＩ ＨＴＬエピトープを同定するために、ＨＬＡ
クラスＩスーパーモチーフ／モチーフ配列の同定のために使用される同じ１４個
のＨＣＶポリタンパク質配列を、ＨＬＡ−ＤＲモチーフまたはスーパーモチーフ
保有配列の存在について分析した。詳細には、ＤＲスーパーモチーフを含む１５
マー配列を選択し、これはさらに９マーコア、および３個の残基Ｎ末端隣接領域
およびＣ末端隣接領域をさらに含む（合計１５個のアミノ酸）。１５マー配列が
、分析されたＨＣＶ系統の少なくとも７９％（１１／１４）において保存される
こともまた必要とされた。これらの基準により、合計４９の非重複配列を同定し
、これは、表ＸＸＩＩＡにおいて示される（クラスＩＩエピトープの状況におい
て、配列を、配列の８０％より多くが、別のエピトープと重複する場合、その配
列は、操作上重複であるとみなす）。
【０２７８】 ＤＲ分子に結合するペプチドを予測するプロトコルを、開発した（Ｓｏｕｔｈ
ｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３−３３７３、１９９８）。
個々のＤＲ分子に特異的なこれらのプロトコルは、９マーコア領域のスコアリン
グ（ｓｃｏｒｉｎｇ）およびランキング可能にする。各々のプロトコルは、９マ
ーコア内のＤＲスーパーモチーフ一次アンカー（すなわち、位置１および位置６
）の存在についてペプチド配列をスコアリングするだけでなく、二次アンカーの
存在について配列をさらに評価する。対立遺伝子特異的選択表を使用して（例え
ば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、ｉｂｉｄを参照のこと）、これらのプロトコルは、
特定のＤＲ分子に結合する高い可能性を有するペプチド配列を効率的に選択する
ことを見出した。さらに、相前後してこれらのプロトコル（詳細には、ＤＲ１、
ＤＲ４ｗ４、およびＤＲ７についてのプロトコル）を実施することにより、ＤＲ
交差反応性ペプチドを効率的に選択し得ることを見出した。
【０２７９】 これらのプロトコルが、さらなるエピトープを同定するのに役立つかどうか調
べるため、上記で使用される同じＨＣＶポリタンパク質を、７９％以上（１１／
１４系統）が保存されている９マーコア領域を有する１５マーペプチドの存在に
ついて再スキャンした。これにより、１５２個の配列を同定し；このうちの４９
個が、上記のように、以前に同定された。次に、これらのペプチドの各々の９マ
ーコア領域を、ＤＲ１、ＤＲ４ｗ４、およびＤＲ７アルゴリズムを使用して、ス
コアリングした。２２のペプチド（１２個の新しい配列を含む）（１０個のペプ
チドが、４９個の本来のセットに由来した）が、交差反応性ＤＲバインダーを予
測するプロトコル由来スコアを有する９マーコアを有することを見出した。１２
個のさらなる配列を、表ＸＸＸＩＩＢにおいて示す。
【０２８０】 保存された、上記で同定されたＨＣＶ由来ペプチドを、種々の一般的なＨＬＡ
−ＤＲ分子についてのそれらの結合能力について試験した。全てのペプチドを、
一次パネル（ＤＲ１、ＤＲ４ｗ４、およびＤＲ７）においてＤＲ分子に対する結
合について試験した。次いで、これらの３個のＤＲ分子の少なくとも２個を結合
するペプチドを、二次アッセイにおいてＤＲ２ｗ２β１、ＤＲ２ｗ２β２、ＤＲ
６ｗ１９、およびＤＲ９分子に対する結合について試験した。最終的に、４個の
二次パネルＤＲ分子の少なくとも２個、および従って累積的に、７個の異なるＤ
Ｒ分子の少なくとも４個を、第３のアッセイにおいてＤＲ４ｗ１５、ＤＲ５ｗ１
１、およびＤＲ８ｗ２分子に対する結合についてスクリーニングした。一次、二
次、および三次スクリーニングアッセイを含む１０個のＤＲ分子のうちの少なく
とも７個に結合するペプチドを、交差反応性ＤＲバインダーとみなした。これら
のスクリーニングパネルの組成物、および関連する抗原の表現型の頻度を、表Ｘ
ＸＸＩＩＩにおいて示す。
【０２８１】 試験の際に、本来の７５個のペプチド（３９％）のうちの２９個が、２つ以上
の一次ＨＬＡ分子を結合したことを見出した。次いで、これらの交差反応性バイ
ンダーのうちの２６個を、二次アッセイにおいて試験し、そして１９個のペプチ
ドを、一次および二次パネルにおける、７個のＨＬＡ ＤＲ分子の少なくとも４
個を結合することを見出した。最終的に、二次スクリーニング相を通過する１９
個のペプチドを、三次アッセイにおいて結合について試験した。結果として、１
０個の一般的なＨＬＡ−ＤＲ分子の少なくとも７個を結合する、９個のペプチド
を同定した。表ＸＸＸＩＶは、一次〜三次パネルにおいて、これら９個のペプチ
ドおよび各対立遺伝子特異的ＨＬＡ−ＤＲ分子に対するそれらの結合能力を示す
。完全な結合分析を実施しなかった２個のペプチド（Ｆ１３４．０５およびＦ１
３４．０８）もまた、表ＸＸＸＩＶにおいて示す。しかし、これらのペプチドの
両方は、試験された７個のＨＬＡ ＤＲ分子のうちの６個に結合した。Ｆ１３４
．０８は、ペプチド１２８３．４４をネストし（ｎｅｓｔ）、これは、１０個の
対立遺伝子特異的ＨＨＬＡ分子の８個を結合した。
【０２８２】 結論として、ＨＣＶゲノムの６個の別々の（すなわち、非重複）領域由来の１
１個の交差反応性ＤＲ結合ペプチドを、同定した。これらのエピトープが由来す
る６個の領域のうちの２個を、複数の重複エピトープにより包含する。
【０２８３】 （保存されたＤＲ３モチーフペプチドの選択） ＨＬＡ−ＤＲ３が、白色人種集団、黒色人種集団、スペイン系人種集団におい
て優勢な対立遺伝子であることから、ＤＲ３結合能力は、ＨＴＬエピトープの選
択において重要な判定基準である。しかし、以前に得られたデータは、ＤＲ３の
みまれに、他のＤＲ対立遺伝子と交差反応性であることを示した（Ｓｉｄｎｅｙ
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２６３４−２６４０、１９９２；Ｇｅｌｕｋ
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５７４２−５７４８、１９９４；Ｓｏｕｔｈ
ｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３−３３７３、１９９８）。
これは、ＤＲ３ペプチド結合モチーフが、ほとんどの他のＤＲ対立遺伝子の特異
性とは異なるようであることにおいて、全く驚くべきでない。
【０２８４】 ＤＲ３を結合するペプチドを効率的に同定するために、標的タンパク質を、Ｇ
ｅｌｕｋら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５７４２−５７４８，１９９４）に
より報告される２個のＤＲ３特異的結合モチーフの１つを保有する保存された配
列について分析した。１５個の配列（上記で同定されたＤＲスーパーモチーフ配
列内にネストされたペプチド（ペプチドＰａｐｅ ２２）を含む）を、同定した
（表ＸＸＸＩＩｄ）。好ましくは、ＤＲ３モチーフを、ＤＲスーパーモチーフ領
域と近接してクラスター化されて見出される。
【０２８５】 ＤＲ３モチーフを含む１５個のペプチドの１４個を、それらのＤＲ３結合能力
について試験した。２個のペプチド（ＣＨ３５．０１０６およびＣＨ３５．０１
０７）が、１μＭ以下（表ＸＸＸＶ）の親和性を有してＤＲ３を結合し、かつそ
れによってＨＬＡクラスＩＩの高い親和性バインダーとして見なされることを見
出した。
【０２８６】 次いで、この様式において同定されるＤＲ３結合エピトープを、ＤＲスーパー
モチーフ保有ペプチドエピトープを有するワクチン組成物に含み得る。
【０２８７】 （実施例６：候補ＨＣＶ由来ＨＴＬエピトープの免疫原性および既知の優性Ｈ
ＣＶ ＨＴＬエピトープ） Ｇ．ＰａｐｅおよびＣ．Ｆｅｒｒａｒｉとの共同研究の過程で、８個の保存さ
れたＨＣＶ由来エピトープが同定され、このエピトープは、ＨＣＶ感染個体によ
り認識される。
【０２８８】 これらの研究の１つ（Ｄｉｅｐｏｌｄｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６０１
１−６０１９、１９９７）により、ペプチドＦ９８．０５（これは、ＮＳ３タン
パク質の残基１２４８〜１２６１にわたる）を、急性Ｃ型肝炎感染を有する４／
５の患者からの１４／２３のＮＳ３特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンにより認識さ
れた、免疫優性のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープとして同定した。ＨＬＡ−ＤＲ交差
反応性バインダーであると上記に示されるこのエピトープ（表ＸＸＸＩＶを参照
のこと）を、複数のＨＬＡ分子（ＤＲ４、ＤＲ１１、ＤＲ１２、ＤＲ１３、およ
びＤＲ１６）によりへルパーＣＤ４＋Ｔ細胞に提示することが可能であった。よ
り限定された状況で、相応じて、２個の他のペプチド（Ｐａｐｅ ２２およびＰ
ａｐｅ ２９）のどちらもＤＲ交差反応性バインダーではないが、これらのペプ
チドもまた、ＣＤ４＋ Ｔ細胞クローンにより認識された。
【０２８９】 直接的な末梢血Ｔ細胞刺激により、およびＨＣＶ特異的Ｔ細胞株およびクロー
ンの精密な特異性分析により、Ｆｅｒｒａｒｉのグループとの共同研究において
なされた研究は、６個の免疫優性エピトープ（Ｐａｐｅ共同研究において同定さ
れたものもまた１つ含む）を同定し、これらは、コアタンパク質、ＮＳ３タンパ
ク質、およびＮＳ４タンパク質の保存された領域由来である。これらのエピトー
プがまた、交差反応性であることを見出し、異なるクラスＩＩ分子の状況におい
て、Ｔ細胞に提示された。この６個のエピトープのうちの３つ（Ｆ９８．０４（
Ｆ１３４．０３）、Ｆ１３４．０５およびＦ１３４．０８）は、交差反応性のＨ
ＬＡ−ＤＲバインダーである（表ＸＸＸＩＶを参照のこと）。
【０２９０】 結論として、ＨＣＶゲノムの保存された領域由来の８個のエピトープの免疫原
性を示した。これらのエピトープの３つ（Ｆ９８．０５、Ｆ１３４．０５、およ
びＦ１３４．０８；表ＸＸＸＩＶを参照のこと）は、広範な交差反応性ＨＬＡ−
ＤＲ結合ペプチドである。
【０２９１】 （実施例７．集団の適用範囲の広さを決定するための種々の人種背景における
ＨＬＡスーパータイプの表現型の頻度の算出） この実施例は、複数のスーパーモチーフおよび／またはモチーフを含む複数の
エピトープを構成するワクチン組成物の集団の適用範囲の広さの評価を例証する
。
【０２９２】 集団の適用範囲を分析するために、ＨＬＡ対立遺伝子の遺伝子頻度を、決定し
た。各ＨＬＡ対立遺伝子についての遺伝子頻度を、二項分布式ｇｆ＝１−（ＳＱ
ＲＴ（１−ａｆ））を利用して、抗原または対立遺伝子頻度から算出した（例え
ば、Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３，１９９
６を参照のこと）。全体的な表現型頻度を得るために、蓄積（ｃｕｍｌａｔｉｖ
ｅ）遺伝子頻度を算出し、そして蓄積抗原頻度は、逆の式［ａｆ＝１−（１−Ｃ
ｇｆ）2］の使用により、導かれる。
【０２９３】 頻度データが、ＤＮＡタイピングのレベルにおいて利用可能でない場合、血清
学的に規定される抗原頻度への対応が、仮定された。合計の潜在的なスーパータ
イプ集団の適用を得るために、結合の不安定性を仮定せず、そしてスーパータイ
プの各々に属することが確認された対立遺伝子のみを含んだ（最小の評価）。遺
伝子座中の組み合わせにより達成される合計の潜在的適用の評価を、考えられる
Ｂ対立遺伝子により含まれることが期待され得るＡに含まれない集団の比率をＡ
の適用に足すことにより行った（例えば、合計＝Ａ＋Ｂ*（１−Ａ））。Ａ３様
スーパータイプの確認されたメンバーは、Ａ３、Ａ１１、Ａ３１、Ａ*３３０１
、およびＡ*６８０１である。Ａ３様スーパータイプはまた、Ａ３４、Ａ６６、
およびＡ*７４０１を含み得るが、これたの対立遺伝子を、全体の頻度の算出に
は含まなかった。同様に、Ａ２様スーパータイプファミリーの確認されたメンバ
ーは、Ａ*０２０１、Ａ*０２０２、Ａ*０２０３、Ａ*０２０４、Ａ*０２０５、
Ａ*０２０６、Ａ*０２０７、Ａ*６８０２、およびＡ*６９０１である。最終的に
、Ｂ７様スーパータイプの確認された対立遺伝子は、Ｂ７、Ｂ*３５０１−０３
、Ｂ*５１、Ｂ*５３０１、Ｂ*５４０１、Ｂ*５５０１−２、Ｂ*５６０１、Ｂ*６
７０１、およびＢ*７８０１である（潜在的にはまた、Ｂ*１４０１、Ｂ*３５０
４−０６、Ｂ*４２０１、およびＢ*５６０２）。
【０２９４】 Ａ２スーパータイプ、Ａ３スーパータイプおよびＢ７スーパータイプを組み合
わせることにより達成される集団適用範囲は、５つの主要な人種集団において約
８６％である（表ＸＸＩを参照のこと）。適用範囲を、Ａ１モチーフおよびＡ２
４モチーフを保有するペプチドを含むことにより拡大し得る。５つの異なる主要
な人種集団を越え、平均して、Ａ１は、集団の１２％そしてＡ２４は、集団の２
９％で存在する（白色人種、北米黒色人種、中国人、日本人、およびスペイン系
人種）。合わせて、これらの対立遺伝子は、これらの同じ人種集団において平均
３９％の頻度で示された。主要な人種を越えた合計の適用範囲は、Ａ１およびＡ
２４が、Ａ２スーパータイプ対立遺伝子、Ａ３スーパータイプ対立遺伝子および
Ｂ７スーパータイプ対立遺伝子の適用と組み合わさる場合、９５％より大きい。
類似のアプローチを使用して、クラスＩＩモチーフ保有エピトープの組み合わせ
を用いて達成された集団適用を評価し得る。
【０２９５】 （候補ＨＬＡクラスＩエピトープおよびクラスＩＩエピトープの要約） 要約すれば、上記の実施例において示されるデータに基づき、ＨＣＶウイルス
の保存された領域由来の２６個のＣＴＬ候補ペプチドエピトープを同定した（表
ＸＸＸＶＩａ）。これらとしては、１２個のＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有
エピトープ、８個のＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有エピトープ、および１個
のＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ保有エピトープが挙げられ、この各々は、複数
のＡ２スーパータイプ分子、Ａ３スーパータイプ分子、またはＢ７スーパータイ
プ分子に結合可能であり、そしてＨＬＡトランスジェニックマウスにおいて免疫
原性であるかまたはヒトＰＢＬに対して抗原性である（ペプチド２９．００３５
／１２６０．０４を例外として）。免疫原性について評価されないさらなるエピ
トープもまた挙げられる。それらは、さらなるＢ７スーパータイプ保有エピトー
プ、および２個のＨＬＡ−Ａ１および１個のＨＬＡ−Ａ２４の高い親和性結合ペ
プチドである。ＨＬＡ−Ａ３３もまた結合する、公知のＨＬＡ−Ａ３１に制限さ
れたエピトープ（ＶＧＩＹＬＬＰＮＲ）もまた、表ＸＸＸＶＩａに示され、そし
て他のクラスＩエピトープまたはクラスＩＩエピトープと組み合わせて有用であ
る。
【０２９６】 これらの２６個のＣＴＬエピトープ（本明細書中および当該分野で開示される
ように）と共に、平均の集団適用（すなわち、少なくとも１個のＨＣＶエピトー
プの認識）が、５つの主要な人種集団の各々において９５％より大きいことが予
測される。これらのエピトープのうちの２５個により付与される適用の潜在的重
複（ペプチド２４．００８６を含まなかった）を、ゲーム理論モンテカルロシミ
ュレーション分析を使用して推定し、これは、当該分野で公知である（例えば、
Ｏｓｂｏｒｎｅ、Ｍ．Ｊ．およびＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ａ．「Ａ ｃｏｕｒｓ
ｅ ｉｎ ｇａｍｅ ｔｈｅｏｒｙ」ＭＩＴ Ｐｒｅｓｓ、１９９４を参照のこ
と）。図１において示されるように、白色人種集団、北米黒色人種集団、日本人
種集団、中国人種集団、およびスペイン系人種集団から構成される集団の個体の
９０％が、本明細書中に記載される候補エピトープの２個以上を認識することが
推定される。
【０２９７】 ミニ遺伝子構築物または他のワクチン処方物の設計における使用のための好ま
しいＨＣＶ由来ＨＴＬエピトープの表を、表ＸＸＸＶＩｂに要約する。示される
ように、複数のＨＬＡ−ＤＲ分子に結合するかまたはＨＬＡ−ＤＲ３を結合する
、９個の異なるペプチド結合領域を、同定した（ＮＳ４ １９１４−１９３５領
域の場合、患者により認識されるより長いペプチド（Ｆ１３４．０８）を、より
短いペプチド（１２８３．４４）に関して選択した。より長いペプチドが、この
より短いペプチドを本質的に取り込み、そしてまた、このより短いペプチドが結
合しない、さらなるＤＲ分子を結合する）。これらのペプチドのうちの３個を、
ＨＣＶ感染患者において優性エピトープとして認識した。
【０２９８】 ＤＲスーパーモチーフ、およびＤＲ３を認識する１０個の一般的なＤＲ分子の
各々は、最小の２個のエピトープにより含まれることを推定する。相応じて、エ
ピトープのこのパネルにより示される合計の推定される集団適用は、５つの主要
な人種集団の各々において９１％を越える（表ＸＸＸＶＩＩ）。
【０２９９】 （実施例８：プライミング後の内因的にプロセスされる抗原の生成の認識） この実施例は、実施例１〜６に記載されるように同定されかつ選択されたネイ
ティブなペプチドエピトープまたは類似のペプチドエピトープにより誘導される
ＣＴＬが、内因的に合成される、すなわちネイティブな抗原を認識することを決
定する。
【０３００】 実施例３におけるようなペプチドエピトープ（例えば、ＨＬＡ−Ａ２スーパー
モチーフ保有エピトープ）を用いて免疫されたトランスジェニックマウスから単
離されたエフェクター細胞を、ペプチドでコートされた刺激細胞を使用してイン
ビトロで再刺激する。６日後、エフェクター細胞を、細胞傷害性についてアッセ
イし、そしてペプチド特異的細胞傷害性活性を含む細胞株をさらに再刺激する。
さらに６日後、これらの細胞株を、ペプチドの非存在下または存在下で、51Ｃｒ
標識Ｊｕｒｋａｔ−Ａ２．１／Ｋb標的細胞に関する細胞傷害性活性について試
験し、そしてまた、内因的に合成された抗原を保有する51Ｃｒ標識標的細胞（す
なわち、ＨＣＶ発現ベクターを用いて安定にトランスフェクトされる細胞）に関
して試験する。
【０３０１】 この結果は、ペプチドエピトープを用いてプライムされた動物から得られたＣ
ＴＬ系統が、内因的に合成されたＨＣＶ抗原を認識することを示す。このような
分析に使用されるトランスジェニックマウスモデルの選択は、評価されているエ
ピトープに依存する。ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋbトランスジェニックマウスに加
え、いくつかの他のトランスジェニックマウスモデル（ヒトＡ１１を有するマウ
スを含む）（これはまた、Ａ３エピトープ、およびＢ７対立遺伝子を評価するた
めに使用され得る）が特徴付けられており、そして他（例えば、ＨＬＡ−Ａ１お
よびＡ２４に対するトランスジェニックマウス）が開発されている。ＨＬＡ−Ｄ
Ｒ１マウスモデルおよびＨＬＡ−ＤＲ３マウスモデルもまた開発されており、こ
れを、ＨＴＬエピトープを評価するために使用し得る。
【０３０２】 （実施例９：トランスジェニックマウスにおけるＣＴＬ−ＨＴＬ結合体化エピ
トープの活性） 本実施例は、ＨＣＶ ＣＴＬ／ＨＴＬペプチド結合体の使用（これにより、ワ
クチン組成物が、ＨＣＶ感染患者またはＨＣＶの危険のある個体に投与されるペ
プチドを含む）によるトランスジェニックマウスにおけるＣＴＬおよびＨＴＬの
誘導を例示する。ペプチド組成物は、複数のＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピト
ープを含み得る。この分析は、ワクチン組成物における１つ以上のＨＴＬエピト
ープの含有により達成され得る増強された免疫原性を示す。このようなペプチド
組成物は、好ましいＣＴＬエピトープ（例えば、表ＸＸＶＩ−ＸＸＩＸから選択
される少なくとも１つのＣＴＬエピトープ、またはそのエピトープのアナログを
含む）に結合体化される脂質化された（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）ＨＴＬエピトープ
を含み得る。このＨＴＬエピトープを、例えば、表ＸＸＸＩＩから選択する。
【０３０３】 リポペプチド調製：リポペプチドを、適切な脂肪酸を、樹脂結合ペプチドのア
ミノ末端にカップリングすることにより調製する。代表的な手順は、以下のよう
である：４倍過剰の、適切な脂肪酸の予め形成された対称無水物のジクロロメタ
ン溶液を、その樹脂に添加し、この混合物を、２時間反応させる。この樹脂を、
ジクロロメタンを用いて洗浄し、そして乾燥する。次いで、この樹脂を、適切な
スカベンジャーの存在下で（例えば、５％（ｖ／ｖ）水）、６０分間、２０℃に
て、トリフルオロ酢酸を用いて処理する。過剰のトリフルオロ酢酸のエバポレー
ション後、粗ペプチドを、ジエチルエーテルを用いて洗浄し、メタノール中で溶
解し、そして水の添加により沈殿する。このペプチドを、濾過により回収し、そ
して乾燥する。
【０３０４】 免疫手順：トランスジェニックマウスの免疫を、記載されるように実施する（
Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３−４７６１、１
９９７）。例えば、ヒトＨＬＡ Ａ２．１対立遺伝子についてのトランスジェニ
ックであり、そしてＨＬＡ−Ａ*０２０１モチーフ保有エピトープまたはＨＬＡ
−Ａ２スーパーモチーフ保有エピトープの免疫原性アセスメントのために有用で
あるＡ２／Ｋbマウスを、生理食塩水、またはＤＭＳＯ／生理食塩水中で処方さ
れる０．１ｍｌのペプチド結合体を用いて皮下で（尾の基部）プライムする。プ
ライミングから７日後、これらの動物から得られる脾細胞を、ペプチドでコート
された、同族の照射されたＬＰＳで活性化されたリンパ芽球を用いて再刺激する
。
【０３０５】 細胞株：ペプチド特異的細胞傷害性アッセイのための標的細胞は、ＨＬＡ−Ａ
２．１／Ｋbキメラ遺伝子を用いてトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞で
ある（例えば、Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７，
１９９１）。
【０３０６】 インビトロのＣＴＬ活性：プライムの１週間後、脾臓細胞（３０×１０6細胞
／フラスコ）を、３７℃、１０ｍｌの培養培地／Ｔ２５フラスコ中で、同族の、
照射された（３０００ラド）、ペプチドコートされたリンパ芽球（１０×１０6
細胞／フラスコ）と、共培養する。６日後、エフェクター細胞を回収し、細胞毒
性活性についてアッセイする。
【０３０７】 細胞傷害性活性についてのアッセイ：標的細胞（１．０〜１．５×１０6）を
、３７℃で、２００μｌの51Ｃｒの存在下でインキュベートする。６０分後、細
胞を３回洗浄し、そしてＲ１０培地で再懸濁する。１μｇ／ｍｌの濃度で必要と
されるペプチドを添加する。アッセイについて、１０4 51Ｃｒ標識標的細胞を
、Ｕボトムの９６ウェルプレートにおいて、異なる濃度のエフェクター細胞（２
００μｌの最終用量）に添加する。３７℃のインキュベーション６時間後、上清
の０．１ｍｌのアリコートを、各ウェルから除去し、そして放射活性を、マイク
ロメディック（ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃ）自動γ計測器において計測する。百分率
特異的溶解を、式により測定する：百分率特異的放出＝１００×（実験的放出−
自発的放出）／（最大放出−自発的放出）。同じ条件下の別個のＣＴＬアッセイ
の実行の間で、比較を容易にするために、％51Ｃｒ放出データを、溶解単位／１
０6個の細胞として表す。１つの溶解単位を、６時間51Ｃｒ放出アッセイにおい
て１０，０００標的細胞の３０％の溶解を達成するために必要とされるエフェク
ター細胞の数として任意に規定する。特異的な溶解単位／１０6を得るために、
ペプチドの非存在下で得られた溶解単位／１０6を、ペプチドの存在下で得られ
た溶解単位／１０6から引く。例えば、３０％の51Ｃｒ放出を、ペプチドの非存
在下、５０：１のエフェクター（Ｅ）：標的（Ｔ）比（すなわち、１０，０００
個の表ＴＫＥＩＩ標的に対して、５×１０5個のエフェクター細胞）において得
て、そしてペプチドの存在下、５：１（すなわち、１０，０００個の標的に対し
て、５×１０4個のエフェクター細胞）において、特異的溶解単位は、［（１／
５０，０００）−（１／５００，０００）］×１０6＝１８ＬＵである。
【０３０８】 この結果を、免疫原性ＣＴＬ／ＨＴＬ結合体ワクチン沈殿物を注入された動物
のＣＴＬ応答の大きさを評価するために、分析し、そして実施例３で概略される
ようなＣＴＬエピトープを使用して達成されるＣＴＬ応答の大きさと比較する。
これと類似する分析を、複数のＣＴＬエピトープおよび／または複数のＨＴＬエ
ピトープを含むペプチド結合体の免疫原性を評価するために実施し得る。これら
の手順に従って、ＣＴＬ応答を誘導し、そして付随して、ＨＴＬ応答を、このよ
うな組成物の投与に際して誘導することを見出す。
【０３０９】 （実施例１０．ＨＣＶ特異的ワクチン中の含有のためのＣＴＬエピトープおよ
びＨＴＬエピトープの選択） 本実施例は、本発明のワクチン組成物のためのペプチドエピトープの選択につ
いての手順を例示する。この組成物中のペプチドは、核酸配列の形態で、ペプチ
ドをコードする単一または１つ以上の配列（すなわち、ミニ遺伝子）であり得る
か、または単一のエピトープおよび／またはポリエピトープのペプチドであり得
る。
【０３１０】 投与の際に、腫瘍クリアランスと相互に関係があることが観察されている免疫
応答を模倣するエピトープを選択する。例えば、ワクチンは、少なくとも１つの
ＨＣＶ抗原領域からとられる３〜４個のエピトープを含み得る。１つの領域由来
のエピトープを、１つ以上のさらなるＨＣＶ抗原領域由来のエピトープと組み合
わせて、使用し得る。エピトープのアナログもまた、ワクチンにおける含有のた
めに選択し得る。
【０３１１】 ＨＣＬクラスＩ分子に対する５００ｎＭ以下のＩＣ50の結合親和性を有するか
、またはクラスＩＩに対する１０００ｎＭ以下のＩＣ50の結合親和性を有するエ
ピトープを選択する。
【０３１２】 十分なスーパーモチーフ保有ペプチド、または対立遺伝子特異的モチーフ保有
ペプチドの十分なアレイを、広範な集団の適用を与えるために選択する。例えば
、エピトープを、少なくとも８０％の集団適用を提供するために選択する。モン
テカルロ分析（当該分野で公知の統計的評価）を使用して、集団適用の広さ、ま
たは重複を評価し得る。
【０３１３】 ポリエピトープの組成物（例えば、ミニ遺伝子）を作製する場合、代表的には
、目的のエピトープを含む可能な最も小さいペプチドを生成することが所望され
る。この使用される原理は、ネストされるエピトープを含むペプチドを選択する
場合に使用される原理と同じでない場合、類似する。さらに、しかし、ミニ遺伝
子として提供される核酸配列の決定の際、それによりコードされるペプチド配列
を、任意の「接合部エピトープ」が作製されているか否かを決定するために分析
する。接合部エピトープは、予想されるように（例えば、モチーフ分析により）
、潜在的なＨＬＡ結合エピトープである。接合部エピトープは、一般的に回避さ
れる。なぜなら、レシピエントは、ＨＬＡ分子に結合し得、そしてそのエピトー
プに対する免疫応答を生成するからであり、これは、ネイティブなタンパク質配
列には存在しない。
【０３１４】 ワクチン組成物のおける含有のためのペプチドエピトープを、例えば、表ＸＸ
ＶＩ〜ＸＸＩＸおよび表ＸＸＸＩＩに列挙されるエピトープから選択する。選択
されたペプチドから構成されるワクチン組成物は、投与される場合、安全で、効
果的であり、そして急性ＨＣＶ感染を排除する免疫応答の大きさに類似の免疫応
答を惹起する。
【０３１５】 （実施例１１：ミニ遺伝子の複数のエピトープＤＮＡプラスミドの構築） この実施例は、ミニ遺伝子発現プラスミドの構築のための誘導を提供する。ミ
ニ遺伝子プラスミドは、もちろん、本明細書中に記載されるようなＣＴＬおよび
／またはＨＴＬエピトープもしくはエピトープのアナログの種々の構造を含み得
る。発現プラスミドの構築および評価の例を、例えば、同時に係属しているＵ．
Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／３１１，７８４（５／１３／９９に出願される）において記
載する。ＨＣＶエピトープの発現のためのこのようなプラスミドの例を図２に示
し、これは、ミニ遺伝子構築物におけるＨＣＶペプチドエピトープの位置を例示
する。
【０３１６】 ミニ遺伝子発現プラスミドは、複数のＣＴＬペプチドエピトープおよびＨＴＬ
ペプチドエピトープを含み得る。本実施例において、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチ
ーフ保有ペプチドエピトープ、ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有ペプチドエピ
トープ、ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープならびにＨＬＡ
−Ａ１モチーフ保有ペプチドエピトープおよびＨＬＡ−Ａ２４モチーフ保有ペプ
チドエピトープを、ＤＲスーパーモチーフ保有エピトープおよび／またはＤＲ３
エピトープと共に使用する（図２）。好ましいエピトープを、例えば、表ＸＸＶ
Ｉ〜ＸＸＩＸおよびＸＸＸＩＩにおいて同定する。複数のＨＣＶ抗原（例えば、
コア、ＮＳ４、ＮＳ３、ＮＳ５、ＮＳ１／Ｅ２）由来のＨＬＡクラスＩスーパー
モチーフまたはモチーフ保有ペプチドエピトープを選択し、その結果、複数のス
ーパーモチーフ／モチーフを、広範な集団適用を保証するために示す。同様に、
ＨＬＡクラスＩＩエピトープを、複数のＨＣＶ抗原から選択し、広範な集団適用
を提供し、すなわち、ＨＬＡ ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフ保有エピトー
プおよびＨＬＡ ＤＲ−３モチーフ保有エピトープを、ミニ遺伝子構築物中の含
有のために選択する。次いで、選択したＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトー
プを、発現ベクターにおける発現のためにミニ遺伝子中に取り込む。
【０３１７】 本実施例は、このようなミニ遺伝子保有発現プラスミドの構築に使用される方
法を示す。ミニ遺伝子組成物のために使用され得る他の発現ベクターが利用可能
であり、そして当業者に公知である。
【０３１８】 ミニ遺伝子ＤＮＡプラスミドは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列ならびにコンセ
ンサスマウスκＩｇ軽鎖シグナル配列、続いて本明細書中に開示された原理に従
って選択されたＣＴＬエピトープおよび／またはＨＴＬエピトープを含む。この
配列は、ｐｃＤＮＡ３．１ Ｍｙｃ−Ｈｉｓベクターによってコードされた、Ｍ
ｙｃ抗体エピトープタグおよびＨｉｓ抗体エピトープタグに融合されたオープン
リーディングフレームをコードする。
【０３１９】 １５個のヌクレオチド重複を含む平均約７０ヌクレオチド長である重複オリゴ
ヌクレオチド（例えば、８個のオリゴヌクレオチド）を、合成し、そしてＨＰＬ
Ｃ精製する。このオリゴヌクレオチドは、選択されたペプチドエピトープならび
に適切なリンカーヌクレオチド、Ｋｏｚａｋ配列、およびシグナル配列をコード
する。最終的なマルチエピトープミニ遺伝子を、ＰＣＲを用いた３セットの反応
で重複オリゴヌクレオチドを伸長することによってアセンブルする。Ｐｅｒｋｉ
ｎ／Ｅｌｍｅｒ９６００ＰＣＲ機器を使用し、そして以下の条件を使用して全部
で３０サイクルを実施する：９５℃で１５分間、アニーリング温度（各プライマ
ー対の最も低く計算されたＴｍより５°下）で３０秒間、および７２℃で１分間
。
【０３２０】 第１回目のＰＣＲ反応について、２つのオリゴヌクレオチド（すなわち、増幅
プライマー対）の各々の５μｇを、アニーリングし、そして伸長する：オリゴヌ
クレオチド１＋２、３＋４、５＋６、および７＋８を、Ｐｆｕポリメラーゼ緩衝
液（ｌ×＝１０ｍＭ ＫＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−クロライド、ｐＨ８．７５、２ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ１００、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、０．２５ｍＭ 各ｄＮＴＰ、および２
．５ＵのＰｆｕポリメラーゼを含む１００μｌの反応物と合わせる。全長ダイマ
ー生成物を、ゲル精製し、そして、２つの反応物（１＋２と３＋４の生成物、な
らびに５＋６と７＋８の生成物を含む）を混合し、アニーリングし、そして１０
サイクルで伸長させる。次いで、この２つの反応物の半分を混合し、そして、５
サイクルのアニーリングおよび伸長を実施し、その後に、隣接プライマーを添加
して、全長生成物をさらに２５回サイクルで増幅する。全長生成物を、ゲル精製
し、そしてｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、そし
て、個々のクローンを、配列決定によってスクリーニングする。
【０３２１】 （実施例１２．プラスミド構築およびこの構築物が誘導する免疫原性の程度） 実施例１１に概説された方法論を用いて調製されたプラスミド構築物が免疫原
性を誘導し得る程度を、マウスへのインビボ注射ならびに引き続きＣＴＬ活性お
よびＨＴＬ活性のインビトロ評価（これらは、それぞれ、細胞傷害アッセイおよ
び増殖アッセイを用いて分析され、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／３１１，７
８４（１９９９年５月１３日出願）およびＡｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉ
ｔｙ １：７５１−７６１，１９９４に詳述される）を介して評価する。例えば
、ＨＬＡ−Ａ２スパーモチーフエピトープを含むｐＭｉｎミニ遺伝子構築物がＣ
ＴＬをインビボで誘導する能力を評価するために、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋbトラ
ンスジェニックマウスを、１００μｇの裸のｃＤＮＡを用いて筋内で免疫する。
ｃＤＮＡ免疫によって誘導されたＣＴＬのレベルを比較するための手段として、
コントロール群の動物もまた、実際のペプチド組成物（これは、ミニ遺伝子によ
ってコードされるのと同様に単一のポリペプチドとして合成される複数エピトー
プを含む）で免疫する。
【０３２２】 免疫動物からの脾細胞を、各それぞれの組成物（ミニ遺伝子にコードされるペ
プチドエピトープまたはポリエピトープペプチド）で２回刺激し、次いで、51Ｃ
ｒ放出アッセイにおいてペプチド特異的細胞傷害活性についてアッセイする。こ
の結果は、Ａ３制限されたエピトープに対するＣＴＬ応答の大きさを示し、従っ
て、ミニ遺伝子ワクチンおよびポリエピトープワクチンのインビボ免疫原性を示
す。従って、このミニ遺伝子が、ポリエピトープペプチドワクチンと同様に、Ｈ
ＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドエピトープに対して指向される免疫応答を
誘発することを見出した。同様の分析がまた、他のＨＬＡ−Ａ３トランスジェニ
ックマウスモデルおよびＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスモデルを用いて
実施され、ＨＬＡ−Ａ３モチーフおよびＨＬＡ−Ｂ７モチーフまたはＨＬＡ−Ａ
３スーパーモチーフおよびＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフによるＣＴＬ誘導を評
価する。
【０３２３】 ミニ遺伝子をコードするクラスＩＩエピトープがインビボでＨＴＬを誘導する
能力を評価するために、例えば、Ｉ−Ａb制限されたマウスを、１００μｇのプ
ラスミドＤＮＡを用いて筋内で免疫する。ＤＮＡ免疫によって誘導されたＨＴＬ
のレベルを比較するために、コントロール群の動物をまた、完全フロイントアジ
ュバント中にエマルジョン化された実際のペプチド組成物を用いて免疫する。
【０３２４】 ＣＤ４＋ Ｔ細胞（すなわち、ＨＴＬ）を、免疫動物の脾細胞から精製し、そ
して、各それぞれの組成物（ミニ遺伝子にコードされるペプチド）で刺激する。
ＨＴＬ応答を、3Ｈチミジン取り込み増殖アッセイを用いて測定する（例えば、
Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１−７６１、１９９４を参
照のこと）。この結果は、ＨＴＬ応答の大きさを示し、従って、このミニ遺伝子
のインビボでの免疫原性を示す。
【０３２５】 あるいは、プラスミド構築物は、エピトープ発現核酸構築物を用いたＡＰＣの
形質導入またはトランスフェクションに続く、ＡＰＣによるエピトープ提示につ
いて試験することによって、インビトロで評価され得る。このような研究は、「
抗原性」を決定し、そして、ヒトＡＰＣの使用を可能にする。このアッセイは、
ある状況においてＡＰＣによって提示されるこのエピトープの能力を示し、この
状況は、細胞表面上のエピトープ−ＨＬＡクラスＩ複合体の密度を定量すること
によって、Ｔ細胞により認識される。定量を、ＡＰＣから溶出されたペプチドの
量を直接測定することによって実施し得るか（例えば、Ｓｉｊｔｓら、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１５６：６８３−６９２、１９９６；Ｄｅｍｏｔｚら、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３４２：６８２−６８４、１９８９を参照のこと）；または、ペプチド−Ｈ
ＬＡクラスＩ複合体の数を、感染もしくはトランスフェクトされた標的細胞によ
って誘導された溶解物の量またはリンホカイン放出を測定し、次いで、等しいレ
ベルの溶解物またはリンホカイン放出を得るのに必要であるペプチドの濃度を決
定することによって概算され得る（例えば、Ｋａｇｅｙａｍａら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１５４：５６７−５７６、１９９５を参照のこと）。
【０３２６】 （実施例１３：予防的使用のためのペプチド組成物） 本発明のワクチン組成物を使用して、ＨＣＶ感染の危険性がある人のＨＣＶ感
染を予防する。例えば、実施例９および／または実施例１０に選択されるような
複数のＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープを含むポリエピトープペプチド
のエピトープ組成物（またはこれを含む核酸）（これはまた、集団の８０％より
多くを標的化するように選択される）を、ＨＣＶ感染の危険性がある個体に投与
する。この組成物を、複数のエピトープを含む単一脂質性ポリペプチド（ｓｉｎ
ｇｌｅ ｌｉｐｉｄａｔｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）として提供する。この
ワクチンを、フロイント不完全アジュバントからなる水性キャリア中で投与する
。最初の免疫のためのペプチドの用量は、７０ｋｇの患者について、約１〜約５
０，０００μｇ、一般的に１００〜５，０００μｇである。ワクチンの最初の投
与の後に、４週間でブースター用量が続き、ＰＢＭＣサンプル中のエピトープ−
特異的ＣＴＬ集団の存在を決定する技術によるこの患者における免疫応答の大き
さの評価が続く。さらなるブースター用量を、必要である場合、投与する。この
組成物は、ＨＣＶ感染に対する予防法として、安全かつ効果的の両方であること
が見出される。
【０３２７】 あるいは、ポリエピトープペプチド組成物は、当該分野で公知の方法論および
本明細書中に開示される方法論に従って、核酸として投与され得る。
【０３２８】 （実施例１４：ネイティブなＨＣＶ配列由来のポリエピトープワクチン組成物
） ネイティブなＨＣＶポリタンパク質配列を、好ましくは各クラスＩおよび／ま
たはクラスＩＩのスーパーモチーフまたはモチーフについて規定されたコンピュ
ーターアルゴリズムを用いてスクリーニングし、複数のエピトープを含むポリタ
ンパク質の「相対的に短い（ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｓｈｏｒｔ）」領域を同定
する。そして、この配列は、好ましくは、ネイティブ抗原全体よりも短い長さで
ある。複数の異なる（重複さえしている）エピトープを含むこの相対的に短い配
列を選択し、そして使用して、ミニ遺伝子構築物を作製する。この構築物を操作
して、ネイティブなタンパク質配列に対応するペプチドを発現させる。「相対的
に短い」ペプチドは、一般的に、２５０アミノ酸長より短く、しばしば１００ア
ミノ酸長より短く、好ましくは７５アミノ酸長より短く、そしてより好ましくは
５０アミノ酸長より短い。ワクチン組成物のタンパク質配列を選択する。なぜな
ら、この配列は、配列内に最大数のエピトープを含むからである（すなわち、こ
の配列は、高いエピトープの集中を有する）。本明細書中で述べられるように、
エピトープモチーフがネスト（ｂｅ ｎｅｓｔｅｄ）されてもよいし、重複（す
なわち、互いに関してフレームシフトする）であってもよい。例えば、フレーム
シフトした重複エピトープを有する、２つの９マーのエピトープおよび１つの１
０マーのエピトープは、１０アミノ酸ペプチド中に存在し得る。このようなワク
チン組成物を、治療目的または予防目的のために投与する。
【０３２９】 ワクチン組成物は、好ましくは、例えば、３つのＣＴＬエピトープおよびＨＣ
Ｖ抗原由来の少なくとも１つのＨＴＬエピトープを含む。このポリエピトープの
ネイティブな配列は、ペプチドとしてかまたはこのペプチドをコードする核酸配
列としてかのいずれかで投与される。あるいは、アナログが、このネイィブな配
列から作製され得、これによって、１つ以上のエピトープは、ポリエピトープペ
プチドの交差反応性および／または結合親和性特性を変化させる置換を含む。
【０３３０】 本実施例の実施形態は、免疫系プロセシングの今まで発見されていない局面が
、ネイティブなネスト配列（ｎｅｓｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に適用され、こ
れによって、治療的または予防的な免疫応答を誘導するワクチン組成物の生成を
容易にする可能性を提供する。さらなるこのような実施形態は、現在未知である
ＨＬＡ構造に関するモチーフ保有エピトープの可能性を提供する。さらに、本実
施形態（アナログを欠く）は、複数のペプチド配列に対する免疫応答（これは、
実際に、ネイティブなＨＣＶ抗原に存在する）を指向し、従って、任意の連結エ
ピトープを評価する必要を回避する。最後に、本実施形態は、核酸ワクチン組成
物を生成する場合における経済的な指標を提供する。
【０３３１】 本実施例に関連して、コンピュータープログラムは、当該分野における原理に
従って導かれ得、これは、標的配列において、１つの配列長あたりの最も大きい
数のエピトープを同定する。
【０３３２】 （実施例１５．複数の疾患に指向されるポリエピトープワクチン組成物） 本発明のＨＣＶペプチドエピトープを、１つ以上の他の疾患に関連する標的抗
原由来のペプチドエピトープと共に使用し、ＨＣＶならびに１つ以上の他の疾患
の、予防または処置に有用であるワクチン組成物を作製する。他の疾患の例とし
ては、ＨＩＶおよびＨＢＶが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３３３】 例えば、複数のＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープを含むポリエピトー
プペプチド組成物（これは、集団の９８％より多くを標的化する）は、ＨＣＶ感
染およびＨＩＶ感染の両方について危険性がある個体に投与するために作製され
得る。この組成物は、種々の疾患関連供給源由来の複数のエピトープを組込む単
一ポリペプチドとして提供され得るか、または１つ以上の別々のエピトープを含
む組成物として投与され得る。
【０３３４】 （実施例１６．免疫応答を評価するためのペプチドの使用） 本発明のペプチドを使用して、前立腺癌関連抗原を指向する特定のＣＴＬ集団
またはＨＴＬ集団の存在について、免疫応答を分析し得る。このような分析は、
例えば、Ｏｇｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：２１０３−２１０６、１９９８お
よびＧｒｅｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：
７５６８−７５７３、１９９８に記載されるようなマルチマー複合体を用いて実
施され得る。以下の実施例において、本発明に従うペプチドを、免疫原としてで
はなく、診断目的または予防目的のための試薬として使用する。
【０３３５】 本実施例において、高度に感受性なヒト白血球抗原テトラマー複合体（「テト
ラマー」）を、例えば、横断的（ｃｒｏｓｓ-ｓｅｃｔｉｏｎａｌ）分析（例え
ば、疾患の異なる段階のＨＬＡ Ａ*０２０１陽性個体由来のＨＣＶ ＨＬＡ−
Ａ*０２０１特異的ＣＴＬ頻度の分析、または引続く、Ａ*０２０１モチーフを含
むＨＣＶペプチドを用いた免疫の分析）に使用する。テトラマー複合体を、記載
されるように合成する（Ｍｕｓｅｙら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３７：１
２６７、１９９７）。簡単に言うと、精製ＨＬＡ重鎖（本実施例におけるＡ*０
２０１）およびβ２ミクログロブリンを、原核生物発現系の手段によって合成す
る。この重鎖を、膜貫通細胞質テイルの欠失およびＢｉｒＡ酵素ビオチン化部位
を含む配列のＣＯＯＨ末端添加によって改変する。重鎖、β２ミクログロブリン
、およびペプチドを、希釈によって再度折り畳む。４５ｋＤの再度折り畳まれた
生成物を、高速タンパク質液体クロマトグラフィーによって単離し、次いで、ビ
オチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、アデノシン５’
三リン酸、およびマグネシウムの存在下で、ＢｉｒＡによってビオチン化する。
ストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体を、１：４のモル比で添加し、そ
して、テトラマー生成物を、１ｍｇ／ｍｌに希釈する。生じる生成物を、テトラ
マー−フィコエリトリンと呼ぶ。
【０３３６】 患者の血液サンプルの分析に関して、約１００万個のＰＢＭＣを、３００ｇで
５分間遠心分離し、そして、５０μｌの冷リン酸緩衝化生理食塩水に再懸濁する
。三色分析を、抗ＣＤ８−Ｔｒｉｃｏｌｏｒ、および抗ＣＤ３８と共に、テトラ
マー−フィトエリトリンで実施する。ＰＢＭＣを、テトラマーおよび抗体を用い
て氷上で３０〜６０分間インキュベートし、次いで、ホルムアルデヒド固定の前
に２回洗浄する。ゲートが、９９．９８％を越えるコントロールサンプルを含む
ように適用する。テトラマーについてのコントロールとしては、Ａ*０２０１陰
性個体およびＡ*０２０１陽性未感染ドナーの両方が挙げられる。次いで、テト
ラマーで染色された細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーによって決
定する。この結果は、エピトープに制限されたＣＴＬを含むＰＢＭＣサンプル中
の細胞数を示し、これによって、ＨＣＶエピトープに対する免疫応答の程度を容
易に示し、このようにして、ＨＣＶ感染の段階または保護的応答もしくは治療的
応答を誘発するワクチンへの曝露を示す。
【０３３７】 （実施例１７：リコール応答（ｒｅｃａｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を評価する
ためのペプチドエピトープの使用） 本発明のペプチドエピトープを、患者におけるＴ細胞応答（例えば、急性応答
またはリコール応答）を評価するための試薬として使用する。個のような分析は
、感染から回復した患者、ＨＣＶに慢性的に感染した患者、またはＨＣＶワクチ
ンでワクチン接種された患者に対して実施され得る。
【０３３８】 例えば、ワクチン接種された個体のクラスＩ制限ＣＴＬ応答を、分析し得る。
このワクチンは、任意のＨＣＶワクチンであり得る。ＰＢＭＣを、ワクチン接種
された個体およびＨＬＡ型の個体から回収する。次いで、好ましくは高度に保存
され、かつ必要に応じて、複数のＨＬＡスーパータイプファミリーのメンバーと
の交差反応性を提供するスーパーモチーフを保有する本願の適切なペプチドエピ
トープを、そのＨＬＡ型を保有する個体由来のサンプルの分析のために使用する
。
【０３３９】 ワクチン接種された個体由来のＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｉｓｔｏｐａｑ
ｕｅ密度勾配（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍ
Ｏ）上で分離し、ＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で３回
洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（これ
は、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイ
シン（５０μｇ／ｍｌ）、およびＨｅｐｅｓ（ｌ０ｍＭ）が補充され、１０％
熱不活性化ヒトＡＢ血清を含む（完全ＲＰＭＩ））中に再懸濁し、そして、マイ
クロ培養（ｍｉｃｒｏｃｕｌｔｕｒｅ）形式を用いてプレートに播く。本発明の
エピトープを含む合成ペプチドを、１０μｇ／ｍｌで各ウェルに添加し、そして
ＨＢＶコア１２８〜１４０エピトープを、刺激の最初の週の間に、Ｔ細胞補助の
供給源として１μｇ／ｍｌで各ウェルに添加する。
【０３４０】 マイクロ培養形式において、４×１０5個のＰＢＭＣを、９６ウェルの丸底プ
レートにおいて１００μｌ／ウェルの完全ＲＰＭＩ中、８個の複製培養物におけ
いて、ペプチドで刺激する。３日目および１０日目に、１００ｍｌの完全ＲＰＭ
Ｉおよび２０Ｕ／ｍｌ最終濃度のｒＩＬ−２を各ウェルに添加する。７日目に、
培養物を、９６ウェルの平底プレートに移し、そして、ペプチド、ｒＩＬ−２お
よび１０5個の照射された（３，０００ｒａｄ）自系（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）
支持細胞で刺激する。培養物を、１４日目に、細胞傷害活性に関して試験する。
陽性のＣＴＬ応答は、以前に記載されたように（Ｒｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔ
ｕｒｅ Ｍｅｄ．２：１１０４，１１０８，１９９６；Ｒｅｈｅｒｍａｎｎら、
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１６５５−１６６５、１９９６；およびＲ
ｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１４３２−１４４０
、１９９６）未感染のコントロール被験体との比較に基づいて、１０％より大き
い特異的51Ｃｒ放出を示すために、８個の複製培養物のうちの２つ以上を必要と
する。
【０３４１】 標的細胞株は、自系および同種異系のＥＢＶ形質転換Ｂ−ＬＣＬであり、これ
らは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉ
ｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＡＳＨＩ、Ｂｏｓｔｏ
ｎ、ＭＡ）から購入されるか、または記載されたように（Ｇｕｉｌｈｏｔら、Ｊ
Ｖｉｒｏｌ．６６：２６７０−２６７８、１９９２）患者のプールから確立さ
れるかのいずれかである。
【０３４２】 細胞傷害性アッセイを、以下の様式で実施する。標的細胞は、同種異系のＨＬ
Ａが一致したＢリンパ芽球細胞株または自系ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球細胞株
のいずれかからなり、これらの細胞株を、１０μｌの本発明の合成ペプチドエピ
トープを共に一晩インキュベートし、そして１００μＣｉの51Ｃｒ（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ Ｃｏｒｐ．、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を用いて１
時間標識し、この後、これらをＨＢＳＳで４回洗浄する。
【０３４３】 細胞傷害活性を、３，０００個の標的／ウェルを含むＵ底の９６ウェルプレー
トを用いて、標準的な４−ｈ、分裂ウェル（ｓｐｌｉｔ ｗｅｌｌ）51Ｃｒ放出
アッセイにおいて決定する。刺激されたＰＢＭＣを、１４日目に、２０〜５０：
１のエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比で試験する。パーセント細胞傷害性を、式
：１００×［（実験的な放出−自発的な放出）／最大の放出−自発的な放出）］
から決定する。最大の放出は、界面活性剤（２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；
Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によって、
標的の溶解により決定する。自発的な放出は、全ての実験について、最大放出の
２５％未満である。
【０３４４】 このような分析の結果は、ＨＬＡ制限ＣＴＬ集団がＨＣＶまたはＨＣＶワクチ
ンへの以前の曝露によって刺激された程度を示す。
【０３４５】 クラスＩＩ制限ＨＴＬ応答がまた、分析され得る。精製されたＰＢＭＣを、９
６ウェル平底プレート中、１．５×１０5細胞／ウェルの密度で培養し、そして
１０μｇ／ｍｌの合成ペプチド、全抗原、またはＰＨＡを用いて刺激する。細胞
を、慣用的に、各条件について４〜６ウェルの複製でプレートに播く。培養の７
日後、この培地を取り除き、そして、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む新鮮な培地
で置きかえる。２日後、１μＣｉ 3Ｈ−チミジンを、各ウェルに添加し、そし
てさらなる１８時間インキュベーションを続ける。次いで、細胞性のＤＮＡを、
ガラスファイバーマット上に収集し、そして、3Ｈ−チミジン取りこみについて
分析する。抗原特異的Ｔ細胞増殖を、抗原の存在下での3Ｈ−チミジン取りこみ
を抗原の非存在下での3Ｈ−チミジン取り込みで割った比として、算出する。
【０３４６】 （実施例１８：ヒトにおける特異的ＣＴＬ応答の誘導） 本発明のＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープを含む免疫原性組成物に関
するヒト臨床試験を、ＩＮＤフェーズＩ、用量増大研究として設定し、そして、
無作為化、二重ブラインドのプラシーボ制御された試験をして実行する。このよ
うな試験は、例えば、以下のように設計される： 全部で約２７人の被験体を、登録し、そして３群に分ける： 群Ｉ：３人の被験体に、プラシーボを注射し、そして６人の被験体に、５μｇ
のペプチド組成物を注射する； 群ＩＩ：３人の被験体に、プラシーボを注射し、そして６人の被験体に、５０
μｇのペプチド組成物を注射する； 群ＩＩＩ：３人の被験体に、プラシーボを注射し、そして６人の被験体に、５
００μｇのペプチド組成物を注射する。
【０３４７】 最初の注射の４週間後、全ての被験体に同じ投薬量でブースター接種を受けさ
せる。
【０３４８】 本研究において測定された終点は、ペプチド組成物の安全性および寛容性なら
びにこの組成物の免疫原性に関連する。ペプチド組成物に対する細胞性免疫応答
は、このペプチド組成物の固有の活性の指標であり、従って、生物学的効果の測
定としてみなされ得る。以下は、臨床データおよび実験室データを要約し、これ
らのデータは、安全性および効果の終点に関する。
【０３４９】 安全性：有害事象の発生を、プラシーボ処置群および薬物処置群においてモニ
ターし、そして、程度および可逆性に関して評価する。
【０３５０】 ワクチン効果の評価：ワクチン効果の評価に関して、被験体を、注射の前およ
び注射の後に採血する。末梢血単核細胞を、新鮮なヘパリン処理された血液から
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって単離し、凍結培地に等
分し、そして凍結保存する。サンプルを、ＣＴＬ活性およびＨＴＬ活性について
アッセイする。
【０３５１】 ワクチンが、安全かつ有効であることの両方を見出した。
【０３５２】 （実施例１９：ＨＣＶで感染された患者におけるフェーズＩＩ試験） フェーズＩＩ試験を、慢性ＨＣＶ感染を有する患者へのＣＨＬ−ＨＴＬペプチ
ド組成物の投与の効果を研究するために実施する。この試験の主要な目的は、ア
ラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）における一過性拡大（ｔｒａｎｓｉ
ｅｎｔ ｆｌａｒｅ）、ＡＬＴの正規化、およびＨＣＶ ＤＮＡの減少によって
明らかにされるように、慢性的に感染されたＨＣＶ患者においてＣＴＬを誘導す
るための有効な用量およびレジメンを決定すること、これらの患者におけるＣＴ
Ｌ応答およびＨＴＬ応答を誘導することの安全性を確立すること、および、どの
程度までＣＴＬ活性化が慢性的に感染されたＣＴＬ患者の臨床状況を改善するか
を調べることである。このような研究は、例えば、以下のように設計される： 本研究は、複数の中心で実施する。試験の設計は、オープン標識、非制御、容
量増大プロトコール（ここで、ペプチド組成物を、単一用量として投与し、６週
間後に同じ用量の単一ブースター注射が続く）である。投薬量は、１回の注射当
たり５０、５００、および５，０００μｇである。薬物関連有害効果（重篤さお
よび可逆性）を、記録する。
【０３５３】 ３つの患者群が存在する。第１の群を、５０μｇのペプチド組成物で注射し、
そして第２群および第３群を、それぞれ、５００および５，０００μｇのペプチ
ド組成物で注射する。各群の中の患者は、年齢が２１〜６５歳の範囲であり、男
性および女性の両方を含み、そして多様な民族背景を表す。この患者ら全員を、
ＨＣＶで５年間以上感染させ、そして、彼ら全員は、ＨＩＶ陰性、ＨＢＶ陰性お
よびデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）陰性であるが、陽性レベルのＨＣＶ抗原を
有する。
【０３５４】 ＡＬＴ拡大の大きさおよび発生ならびに血液中のＨＣＶ ＤＮＡのレベルを、
ペプチド組成物の投与の効果を評価するためにモニターする。血液中のＨＣＶ
ＤＮＡのレベルは、処置の進行の間接的な指標である。ワクチン組成物が、慢性
ＨＣＶ感染の処置において、安全かつ有効であることの両方を見出す。
【０３５５】 （実施例２０．プライムブースト（ｐｒｉｍｅ ｂｏｏｓｔ）プロトコールを
用いたＣＴＬ応答の誘導） プライムブーストプロトコールをまた、ワクチンのヒトへの投与のために使用
し得る。このようなワクチンレジメンとしては、例えば、裸のＤＮＡの初回投与
、続くこのワクチンをコードする組換えウイルスを用いたブースト、または組換
えタンパク質／ポリペプチドもしくはアジュバント中に投与されたペプチド混合
物の初回投与が挙げられる。
【０３５６】 例えば、初回免疫は、実施例１１に構築されたような発現ベクターを用いて、
複数の部位に０．５〜５ｍｇの量で、ＩＭ（またはＳＣまたはＩＤ）で投与され
る裸の核酸の形態での形態で、実施され得る。核酸（０．１〜１０００μｇ）を
また、遺伝子銃を用いて投与し得る。３〜４週間のインキュベーション期間の後
、ブースター用量を投与する。このブースターは、例えば、５×１０7〜５×１
０9ｐｆｕの用量で投与される組換え鶏痘ウイルスであり得る。代替の組換えウ
イルス（例えば、ＭＶＡ、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、またはアデノ
随伴ウイルス）をまた、このブースターに使用し得るか、または、ポリエピトー
プタンパク質もしくはこのペプチドの混合物を投与し得る。ワクチン効果の評価
のために、患者の血液サンプルを、免疫前、ならびに処置ワクチンおよびブース
ター用量のワクチンの投与後の間に得る。末梢血単核細胞を、新鮮なヘパリン処
理された血液からＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって単離
し、凍結培地に等分し、そして凍結保存する。サンプルを、ＣＴＬ活性およびＨ
ＴＬ活性についてアッセイする。
【０３５７】 この結果の分析は、保護的免疫を達成するか、またはＨＣＶ感染を処置するの
に十分である大きさの応答が生成されることを示す。
【０３５８】 （実施例２１．樹状細胞を用いたワクチン組成物の投与） 本発明のペプチドエピトープを含むワクチンを、樹状細胞を用いて投与し得る
。本実施例において、ペプチドパルスされた樹状細胞を、ＣＴＬ応答をインビボ
で刺激するために患者に投与し得る。本方法において、樹状細胞を単離し、増殖
し、そして、本発明のペプチドＣＴＬエピトープおよびペプチドＨＴＬエピトー
プを含むワクチンでパルスする。樹状細胞を、患者に注入して戻し、インビボに
おいてＣＴＬ応答およびＨＴＬ応答を誘発する。次いで、誘導されたＣＴＬおよ
びＨＴＬは、特定の標的ＨＣＶ感染細胞（この細胞は、ワクチン中のエピトープ
が誘導されるタンパク質を保有する）を破壊するか（ＣＴＬ）またはこの細胞の
破壊を容易にする（ＨＴＬ）。
【０３５９】 あるいは、特定の腫瘍関連抗原に対するエキソビボのＣＴＬ応答またはＨＴＬ
応答は、組織培養物中、患者または一般的に適合性の、ＣＴＬまたはＨＴＬ前駆
体細胞を抗原提示細胞の供給源（例えば、樹状細胞）および適切な免疫原性ペプ
チドと共にインキュベートすることによって誘導され得る。前駆体細胞が活性化
され、エフェクター細胞に拡大される適切なインキュベーション時間（代表的に
は約７〜２８日間）の後、細胞を、患者に注射して戻し、ここで、これらの細胞
は、それらの特定の標的細胞（すなわち、腫瘍細胞）を破壊するか（ＣＴＬ）ま
たはそれらの破壊を容易にする（ＨＴＬ）。
【０３６０】 （実施例２２：モチーフ保有ペプチドを同定する代替方法） モチーフ保有ペプチドを同定するための別の方法は、規定されたＭＨＣ分子を
保有する細胞からこれらを溶出することである。例えば、組織型決定（ｔｉｓｓ
ｕｅ ｔｙｐｉｎｇ）に使用されるＥＢＶ形質転換されたＢ細胞株は、いずれの
ＨＬＡ分子をこの細胞が発現するかを決定するために徹底的に特徴付けられてき
た。特定の場合において、これらの細胞は、単一の型のＨＬＡ分子のみ発現する
。次いで、これらの細胞を、病原性生物（例えば、ＨＣＶ）で感染し得るか、ま
たは目的の抗原を発現する核酸でトランスフェクトし得る。その後、感染の結果
（またはトランスフェクトの結果として）産生されたペプチドの内因性抗原プロ
セシングによって産生されたペプチドは、細胞表面上に結合して提示される。次
いで、これらのペプチドを、温和な酸条件に曝露することによってＨＬＡ分子か
ら溶出し、そしてこれらのアミノ酸配列を、例えば、質量スペクトル分析によっ
て決定する（例えば、Ｋｕｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３、１
９９４）。なぜなら、本明細書中に開示されるように、特定のＨＬＡ分子に結合
する大部分のペプチドは、モチーフ保有であることから、これは、細胞上に発現
された特定のＨＬＡ分子と関連したモチーフ保有ペプチドを得るための、代替様
式である。
【０３６１】 あるいは、いずれの内因性ＨＬＡ分子も発現しない細胞株を、単一のＨＬＡ対
立遺伝子をコードする発現構築物でトランススフェクトし得る。次いで、これら
の細胞を、記載されるように使用し得、すなわち、これらの細胞を、病原もしく
は細胞表面上に提示された目的の抗原に対応するペプチドを単離するために、病
原性生物で感染し得るか、または目的の抗原をコードする核酸でトランスフェク
トし得る。このような分析から得られたペプチドは、この細胞中で発現される単
一のＨＬＡ対立遺伝子への結合に対応するモチーフを保有する。
【０３６２】 当業者に明らかなように、当業者は、１より多くのＨＬＡ対立遺伝子を保有す
る細胞について同様の分析を実施し得、そして引続いて発現される各ＨＬＡ対立
遺伝子に特異的なペプチドを決定し得る。さらに、当業者はまた、感染またはト
ランスフェクト以外の手段（例えば、タンパク質抗原を用いたローディング（ｌ
ｏａｄｉｎｇ））が、細胞に抗原の供給源を提供するために使用され得ることを
認識する。
【０３６３】 上記の実施例は、本発明の範囲を制限するためではなく、本発明を例示するた
めに提供した。例えば、主要組織適合遺伝子複合体（すなわち、ＨＬＡ）に関す
る人間用語を、本文書を通じて使用する。これらの原理が、他の種も同様に拡張
され得ることが理解される。従って、本発明の他の改変は、当業者に容易に明ら
かであり、そして添付の特許請求の範囲に含まれる。本明細書中に引用される全
ての刊行物、特許および特許出願は、全ての目的に関して本明細書中によって参
考として援用される。
【０３６４】
【表２】
【０３６５】
【表３】
【０３６６】
【表４】
【０３６７】
【表５】
【０３６８】
【表６】
【０３６９】
【表７】
【０３７０】
【表８】
【０３７１】
【表９】
【０３７２】
【表１０】
【０３７３】
【表１１】
【０３７４】
【表１２】
【０３７５】
【表１３】
【０３７６】
【表１４】
【０３７７】
【表１５】
【０３７８】
【表１６】
【０３７９】
【表１７】
【０３８０】
【表１８】
【０３８１】
【表１９】
【０３８２】
【表２０】
【０３８３】
【表２１】
【０３８４】
【表２２】
【０３８５】
【表２３】
【０３８６】
【表２４】
【０３８７】
【表２５】
【０３８８】
【表２６】
【０３８９】
【表２７】
【０３９０】
【表２８】
【０３９１】
【表２９】
【０３９２】
【表３０】
【０３９３】
【表３１】
【０３９４】
【表３２】
【０３９５】
【表３３】
【０３９６】
【表３４】
【０３９７】
【表３５】
【０３９８】
【表３６】
【０３９９】
【表３７】
【０４００】
【表３８】
【０４０１】
【表３９】
【０４０２】
【表４０】
【０４０３】
【表４１】
【０４０４】
【表４２】
【０４０５】
【表４３】
【０４０６】
【表４４】
【０４０７】
【表４５】
【０４０８】
【表４６】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、平均集団における、ＨＬＡ−ＡおよびＢ分子により結合したＨＣＶ候
補エピトープの数の関数としての遺伝子型の総頻度のグラフを提供する。
【図２】 図２は、実験モデルのミニ遺伝子構築物中のペプチドエピトープの位置を示す
。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/14 Ａ６１Ｐ 37/02 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/18 ＺＮＡ Ｃ０７Ｋ 14/18 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 サウスウッド， スコット アメリカ合衆国 カリフォルニア 92071， サンティー， ストラスモア ドライブ 10679 (72)発明者 リビングストン， ブライアン ディー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 92129， サン ディエゴ， チャコ コート 13555 (72)発明者 チェスナット， ロバート アメリカ合衆国 カリフォルニア 92007， カーディッフ−バイ−ザ−シー， キン グス クロス ドライブ 1473 (72)発明者 ベイカー， デニス マリー アメリカ合衆国 カリフォルニア 92126， サン ディエゴ， カミニト ラバー ナンバー21 11575 (72)発明者 セリス， エステバン アメリカ合衆国 ミネソタ 55902， ロ チェスター， ライト ロード エス．ダ ブリュー． 3683 (72)発明者 クボ， ラルフ ティー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 92009， カールスバッド， ペアー ツリー ド ライブ 6921 (72)発明者 グレイ， ホワード エム． アメリカ合衆国 カリフォルニア 92037， ラ ホヤ， カミニト バティー 1461 Ｆターム(参考） 4C076 AA19 BB11 CC06 CC07 CC16 CC35 EE59 FF11 FF68 4C084 AA01 AA02 AA14 BA01 BA08 BA17 BA18 BA22 BA23 CA01 MA05 MA66 NA05 NA10 NA13 NA14 ZA752 ZB072 ZB332 4H045 AA11 BA09 BA15 BA17 CA02 CA40 DA86 EA31 EA53 FA74

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 組成物であって、以下： 【化１】 からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、調製されたＣ型肝炎ウイルス
    （ＨＣＶ）エピトープを含む、組成物。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の群から選択される２つのエピトープをさら
    に含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載の群から選択される３つのエピトープをさら
    に含む、請求項２に記載の組成物。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載の組成物であって、ここで、該組成物は、以
    下： 【化２】 からなる群から選択されるＣＴＬエピトープをさらに含む、組成物。
  5. 【請求項５】 前記組成物が、ＨＴＬエピトープをさらに含む、請求項１に
    記載の組成物。
  6. 【請求項６】 前記ＨＴＬエピトープが、汎ＤＲ結合分子である、請求項５
    に記載の組成物。
  7. 【請求項７】 前記エピトープが、リポソーム上またはリポソーム内にある
    、請求項１に記載の組成物。
  8. 【請求項８】 前記ペプチドが脂質に結合される、請求項１に記載の組成物
    。
  9. 【請求項９】 前記エピトープが、ＨＬＡ重鎖、β２−ミクログロブリン、
    およびストレパビジン複合体に結合され、それによってテトラマーが形成される
    、請求項１に記載の組成物。
  10. 【請求項１０】 前記エピトープが、抗原提示細胞上のＨＬＡ分子に結合さ
    れる、請求項１に記載の組成物。
  11. 【請求項１１】 前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項１０に記載の
    組成物。
  12. 【請求項１２】 前記組成物が薬学的賦形剤をさらに含む、請求項１に記載
    の組成物。
  13. 【請求項１３】 前記エピトープがさらに単位用量形態である、請求項１に
    記載の組成物。
  14. 【請求項１４】 組成物であって、以下： 【化３】 からなる群から選択される少なくとも２つのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ペプチ
    ドエピトープを含む、２５０アミノ酸残基未満の調製されたペプチドを含む、組
    成物。
  15. 【請求項１５】 少なくとも２つのエピトープが、スペーサーを介して連結
    される、請求項１４に記載の組成物。
  16. 【請求項１６】 第３のエピトープをさらに含む、請求項１４に記載の組成
    物。
  17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の組成物であって、ここで前記第３のエ
    ピトープが、以下： 【化４】 からなる群から選択される、組成物。
  18. 【請求項１８】 ＨＴＬエピトープである第３のエピトープをさらに含む、
    請求項１６に記載の組成物。
  19. 【請求項１９】 前記ＨＴＬエピトープが汎用ＤＲ結合分子である、請求項
    １８に記載の組成物。
  20. 【請求項２０】 前記ペプチドが、リポソーム上またはリポソーム内にある
    、請求項１４に記載の組成物。
  21. 【請求項２１】 前記ペプチドが脂質に結合される、請求項１４に記載の組
    成物。
  22. 【請求項２２】 前記ペプチドが、請求項１４に記載の群のうちの少なくと
    も３つのエピトープをさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
  23. 【請求項２３】 前記ペプチドが、請求項１４に記載の群のうちの少なくと
    も４つのエピトープをさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
  24. 【請求項２４】 前記ペプチドが、請求項１４に記載の群のうちの少なくと
    も５つのエピトープをさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
  25. 【請求項２５】 前記ペプチドが、請求項１４に記載の群のうちの少なくと
    も６つのエピトープをさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
  26. 【請求項２６】 前記組成物が薬学的賦形剤をさらに含む、請求項１４に記
    載の組成物。
  27. 【請求項２７】 前記エピトープがさらに単位用量形態である、請求項１４
    に記載の組成物。
  28. 【請求項２８】 少なくとも６つの調製されたＨＣＶエピトープを含む組成
    物であって、該ＨＣＶエピトープの各々が、以下： 【化５】 からなる群から選択されるアミノ酸からなる、組成物。
  29. 【請求項２９】 請求項２８に記載の組成物であって、以下： 【化６】 からなる群から選択される少なくとも１つのエピトープをさらに含む、組成物。
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