[go: up one dir, main page]

JP2003508030A - 新規ポリペプチドおよびそれをコードする核酸 - Google Patents

新規ポリペプチドおよびそれをコードする核酸

Info

Publication number
JP2003508030A
JP2003508030A JP2001515709A JP2001515709A JP2003508030A JP 2003508030 A JP2003508030 A JP 2003508030A JP 2001515709 A JP2001515709 A JP 2001515709A JP 2001515709 A JP2001515709 A JP 2001515709A JP 2003508030 A JP2003508030 A JP 2003508030A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
prox
nucleic acid
polypeptide
protein
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2001515709A
Other languages
English (en)
Inventor
リチャード エイ． シムケッツ，
エルマ フェルナンデス，
Original Assignee
キュラジェン コーポレイション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by キュラジェン コーポレイション filed Critical キュラジェン コーポレイション
Publication of JP2003508030A publication Critical patent/JP2003508030A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＰＲＯＸポリペプチドとして本明細書において設計されたポリペプチド、ならびにＰＲＯＸポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびＰＲＯＸポリペプチドもしくはポリヌクレオチドに免疫特異的に結合する抗体、またはその誘導体、改変体、変異体、もしくはフラグメントを提供する。本発明はさらに、ＰＲＯＸのポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体が、広い範囲の病理学的状態の検出、予防および処置に用いられる方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。 （発明の背景） 真核生物細胞は、膜によって複数の機能的の異なる区画に細分され、これらは
、オルガネラと呼ばれている。各オルガネラは、その適切な機能に必須であるタ
ンパク質を含む。これらのタンパク質は、しばしばソーティングシグナル（ｓｏ
ｒｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ）と呼ばれる配列モチーフを含み得る。このソーティ
ングシグナルは、適切な細胞オルガネラに対してそのタンパク質を標的化するの
を補助し得る。さらに、ソーティングシグナルは、いくつかのタンパク質が細胞
から輸送または分泌されることを指示し得る。
【０００２】 １つの型のソーティングシグナルは、シグナル配列（シグナルペプチドまたは
リーダー配列とも呼ばれる）である。このシグナル配列は、新たに合成されるポ
リペプチド鎖におけるアミノ末端伸長として存在する。シグナル配列は、小胞体
（ＥＲ）と呼ばれる細胞内オルガネラにタンパク質を標的化し得る。
【０００３】 シグナル配列は、一連のタンパク質−タンパク質またはタンパク質−脂質の相
互作用に関与し、これは、シグナル配列を含むポリペプチドを、ＥＲにおけるチ
ャネルを介してトランスロケーションさせる。トランスロケーション後、膜結合
型酵素（シグナルペプチダーゼと称される）は、成熟タンパク質をシグナル配列
から遊離させる。
【０００４】 ＥＲは、膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質とを、細胞質に残るタンパク
質から分離するように機能する。一旦ＥＲに標的化されると、分泌型および膜結
合型の両方のタンパク質は、ゴルジ装置と呼ばれる別の細胞オルガネラへとさら
に再分配され得る。そのゴルジは、ベシクル、リソソーム、原形質膜、ミトコン
ドリア、およびマイクロボディのような他の細胞オルガネラに対してタンパク質
を指向させる。
【０００５】 ヒト膜結合型および分泌型のタンパク質をコードする、わずかに限られた数の
遺伝子が同定されている。既知の分泌型タンパク質の例としては、ヒトインスリ
ン、インターフェロン、インターロイキン、トランスフォーミング増殖因子β、
ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、およびリンホカインが挙げられる。
【０００６】 （発明の要旨） 本発明は、一部、新規核酸およびそれによってコードされる分泌型ポリペプチ
ドの発見に基づく。この核酸およびポリペプチドは、本明細書中では集合的に、
「ＰＲＯＸ」核酸およびポリペプチドという。 従って、一つの局面において、本発明は、ＰＲＯＸポリペプチド、またはその
フラグメント、ホモログ、アナログ、もしくは誘導体をコードする単離された核
酸を含む。例えば、この核酸は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、
１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および／または３４
のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して少なくとも８５％同一なポリペプチ
ドをコードし得る。この核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡ
分子であり得る。いくつかの実施形態では、この配列に含まれる核酸として、本
発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、
２３、２５、２７、２９、３１、および／または３３のいずれかの核酸配列を含
む、単離された核酸分子を提供する。
【０００７】 また、本明細書中に記載される核酸の一つ以上を含むベクター、および本明細
書中に記載されるベクターまたは核酸を含む細胞が、本発明の範囲に含まれる。
【０００８】 本発明はまた、上記核酸分子のいずれかを含むベクターで形質転換された宿主
細胞に関する。
【０００９】 別の局面において、本発明は、ＰＲＯＸ核酸および薬学的に受容可能なキャリ
アまたは希釈剤を含む薬学的組成物を包含する。
【００１０】 さらなる局面において、本発明は、実質的に精製されたＰＲＯＸポリペプチド
（例えば、ＰＲＯＸ核酸によってコードされるＰＲＯＸポリペプチドのいずれか
、ならびにそのフラグメント、ホモログ、アナログ、および誘導体）を包含する
。本発明はまた、ＰＲＯＸポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアまた
は希釈剤を含む薬学的組成物を包含する。
【００１１】 なおさらなる局面において、本発明は、ＰＲＯＸポリペプチドに特異的に結合
する抗体を提供する。この抗体は、例えば、モノクローナル抗体またはポリクロ
ーナル抗体、ならびにそれらのフラグメント、ホモログ、アナログ、および誘導
体であり得る。本発明はまた、ＰＲＯＸ抗体および薬学的に受容可能なキャリア
または希釈剤を含む薬学的組成物を包含する。本発明はまた、上記核酸分子のい
ずれかによってコードされるポリペプチドにおけるエピトープに結合する単離さ
れた抗体に関する。
【００１２】 本発明はまた、上記薬学的組成物のいずれかを備えるキットを包含する。
【００１３】 本発明はさらに、ＰＲＯＸ核酸（例えば、ＰＲＯＸ核酸を含むベクター）を含
む細胞を提供する工程、およびこの核酸によってコードされるＰＲＯＸポリペプ
チドを発現させるに十分な条件下でこの細胞を培養する工程によって、ＰＲＯＸ
ポリペプチドを産生する方法を提供する。次いで、発現されたＰＲＯＸポリペプ
チドは、細胞から回収される。好ましくは、細胞は、ほとんどまたは全く内因性
のＰＲＯＸポリペプチドを産生しない。この細胞は、例えば、原核生物細胞また
は真核生物細胞であり得る。
【００１４】 本発明はまた、サンプルをＰＲＯＸポリペプチドまたはＰＲＯＸ核酸に特異的
に結合する化合物と接触させる工程、そして複合体形成が存在するならば、その
複合体形成を検出する工程によって、このサンプル中のＰＲＯＸポリペプチドま
たはＰＲＯＸ核酸を同定する方法に関する。
【００１５】 本発明はさらに、ＰＲＯＸポリペプチドを化合物と接触させる工程、およびこ
のＰＲＯＸポリペプチドの活性が改変されるか否かを決定する工程によって、Ｐ
ＲＯＸポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法を提供する。
【００１６】 本発明はまた、ＰＲＯＸポリペプチドを化合物と接触させる工程、および、そ
の化合物が、ＰＲＯＸポリペプチドの活性を改変するか、ＰＲＯＸポリペプチド
に結合するか、またはＰＲＯＸポリペプチドをコードする核酸分子に結合するか
を決定する工程によって同定されるＰＲＯＸポリペプチド活性を調節する化合物
に関する。
【００１７】 別の局面において、本発明は、被験体のＰＲＯＸ関連障害の存在または素因を
決定する方法を提供する。この方法は、被験体からサンプルを提供する工程、お
よびこの被験体サンプル中のＰＲＯＸポリペプチドの量を測定する工程を包含す
る。次いで、被験体サンプル中のＰＲＯＸポリペプチドの量を、コントロールサ
ンプル中のＰＲＯＸポリペプチドの量と比較する。コントロールタンパク質サン
プル中のＰＲＯＸポリペプチドの量に対する被験体のタンパク質サンプル中のＰ
ＲＯＸポリペプチドの量における変化は、この被験体が、組織増殖関連状態を有
することを示す。コントロールサンプルは、好ましくは、対等の個体（すなわち
、年齢、性別、または他の全身的状態の類似する個体であるが、組織増殖関連状
態を有する疑いのない個体）から採取される。あるいは、コントロールサンプル
は、被験体が組織増殖関連障害を有すると疑われていない時点のその被験体から
採取され得る。いくつかの実施形態において、ＰＲＯＸは、ＰＲＯＸ抗体を使用
して検出される。
【００１８】 さらなる局面において、本発明は、被験体のＰＲＯＸ関連障害の存在または素
因を決定する方法を提供する。この方法は、核酸サンプル（例えば、ＲＮＡもし
くはＤＮＡまたはその両方）を被験体から提供する工程、および被験体の核酸サ
ンプル中のＰＲＯＸ核酸の量を決定する工程を包含する。次いで、被験体核酸中
のＰＲＯＸ核酸サンプルの量を、コントロールサンプル中のＰＲＯＸ核酸の量と
比較する。コントロールサンプル中のＰＲＯＸの量に対するサンプル中のＰＲＯ
Ｘ核酸の量における変化は、この被験体が組織増殖関連障害を有することを示す
。
【００１９】 なおさらなる局面において、本発明は、ＰＲＯＸ関連障害を処置するか予防す
るかまたは遅延させる方法を提供する。本方法は、このような処置または予防ま
たは遅延が望まれる被験体に対して、ＰＲＯＸ核酸、ＰＲＯＸポリペプチド、ま
たはＰＲＯＸ抗体を、この被験体の組織増殖関連障害を処置、予防、または遅延
させるに十分な量で投与する工程を包含する。
【００２０】 他に規定しない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術
用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味
を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な方法およ
び材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および
材料は以下に記載される。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願、
特許、および他の文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合には
、定義を含む本明細書が規制する。さらに、材料、方法、および実施例は、例示
のみであって限定することを意図しない。
【００２１】 本発明の他の特徴および他の利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲
から明らかとなる。
【００２２】 （発明の詳細な説明） 本発明は、新規なポリヌクレオチドおよびそれによってコードされるポリペプ
チドを提供する。本発明は、一部、１７個のタンパク質をコードする核酸の発見
に基づく。これらの核酸は、そのタンパク質を分泌させるか、細胞オルガネラに
局在化させるか、または膜に結合させることを示唆する配列を含む。本発明は、
１８個のＰＲＯＸ核酸、ＰＲＯＸポリペプチド、ＰＲＯＸ抗体、またはそれらの
核酸に基づく化合物もしくは方法を包含する。これらの核酸、およびそれらに関
連するポリペプチド、抗体、および他の組成物を、それぞれ、ＰＲＯ１、ＰＲＯ
２、ＰＲＯ３．．．ＰＲＯ１７までとして言及する。これらの配列は、集合的に
「ＰＲＯＸ核酸」または「ＰＲＯＸポリヌクレオチド」と呼ばれ（ここでＸは、
１と１７との間の整数である）、そしてその対応するコードされたポリペプチド
を、「ＰＲＯＸポリペプチド」または「ＰＲＯＸタンパク質」という。
【００２３】 表１は、本発明のＰＲＯＸ核酸またはポリペプチドの間の相互参照を提供し、
表は、本発明の示されるＰＲＯＸ核酸またはポリペプチドによって包含される核
酸およびコードポリペプチド、ならびに対応する配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：）を開示する。また、開示された核酸およびコードポリペプチドについてのク
ローン識別子番号（Ｃｌｏｎｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ
）もまた提供する。他に示さない限り、「クローン」を参照して、本明細書中で
は、個々のインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）核酸配列をいう。
【００２４】
【表１】 ＰＲＯＸ核酸、ＰＲＯＸポリペプチド、ＰＲＯＸ抗体、および関連の化合物は
、種々の適用および状況下で有用である。例えば、本発明に従う種々のＰＲＯＸ
核酸およびポリペプチドは、とりわけ、以前に記載されたタンパク質に対するド
メインおよび配列の関連性の存在に従ってタンパク質ファミリーの新規なメンバ
ーとして有用である。
【００２５】 本発明に従うＰＲＯＸ核酸およびポリペプチドは、本発明に従う種々のＰＲＯ
Ｘ核酸の存在または非存在に基づいて細胞型を同定するために使用され得る。Ｐ
ＲＯＸ核酸およびポリペプチドのさらなる有用性を、以下に考察する。
【００２６】 （ＰＲＯ１核酸およびＰＲＯ１ポリペプチドならびにＰＲＯ２核酸およびＰＲ
Ｏ２ポリペプチド） 本発明に従うＰＲＯ１核酸は、クローン２０４６８７５２．０．１８に示され
る核酸配列を含む。このクローンに相同なＲＮＡ配列は、胎盤に見出される。
【００２７】 クローン２０４６８７５２．０．１８のヌクレオチド配列の提示は、表２に示
され、そして１８６７ｂｐのヌクレオチド配列（配列番号１）を含む。このヌク
レオチド配列は、推定分子量６３３２７ダルトンを有する５６７個のアミノ酸残
基（配列番号２）のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（
ＯＲＦ）を有する。開始コドンは、ヌクレオチド１２８〜１３０に位置づけられ
、そして終止コドンは、ヌクレオチド１８２９〜１８３１に位置づけられる。ク
ローン２０４６８７５２．０．１８によってコードされるタンパク質（配列番号
２）は、ＰＳＯＲＴプログラムによって、０．３７００の信頼度で細胞外に位置
づけられると推定された。ＰＳＯＲＴおよびＳｉｇｎａｌＰコンピュータープロ
グラムを使用する分析によって、残基２１と２２との間の配列ＩＳＳ−ＬＰで、
最も切断が生じる可能性が高いシグナルペプチドが存在し得ることが推定された
。クローン２０４６８７５２．０．１８の核酸（配列番号１）およびアミノ酸（
配列番号２）の配列を、以下の表２に示す。
【００２８】
【表２】 クローン２０４６８７５２．０．１８によってコードされるポリペプチドは、
ＰＲＯ１３４４と称される７２０残基のヒトタンパク質（ＰＣＴ公開ＷＯ９９６
３０８８−Ａ２（１９９９年１２月９日公開）を参照のこと）と同一であるかま
たはポジティブである、５６５残基のうちの５６２残基（９９％）を有する。さ
らに、これは、ＲＡ反応因子前駆体の６９９残基のヒト補体活性化成分（ＥＣ
３．４．２１．−）（ＲＡ反応因子セリンプロテアーゼＰ１００）（ＲＡＲＦ）
（マンノース結合タンパク質関連セリンプロテアーゼ）（ＭＡＳＰ）（ＡＣＣ：
Ｐ４８７４０）に対して同一である、１５０残基のうちの５１残基（３４％）、
そしてポジティブである、１５０残基のうちの７１残基（４７％）を有する。
【００２９】 本発明に従うＰＲＯ２核酸は、クローン２０４６８７５２．０．１８−Ｕに示
される核酸配列を含む。このクローンに対して相同な配列は、胎盤ＲＮＡにおい
て見出される。クローン２０４６８７５２．０．１８のヌクレオチド配列の提示
を表３に提供する。これは、２３０６ｂｐのヌクレオチド配列（配列番号３）を
含む。
【００３０】 クローン２０４６８７５２．０．１８−Ｕの核酸配列は、推定分子量６３３２
７ダルトンを有する７２０個のアミノ酸残基（配列番号４）のポリペプチドをコ
ードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。クローン２０４６
８７５２．０．１８−Ｕによってコードされするアミノ酸の配列を、表３に示す
。開始コドンは、ヌクレオチド１２８〜１３０に位置づけられ、そして終止コド
ンは、ヌクレオチド２２８７〜２２８９に位置づけられる。
【００３１】 クローン２０４６８７５２．０．１８−Ｕによってコードされるタンパク質（
配列番号４）は、ＰＳＯＲＴプログラムによって、０．３７００の信頼度で細胞
外に位置づけられると推定される。ＰＳＯＲＴおよびＳｉｇｎａｌＰコンピュー
タープログラムでの分析によって、残基２１と２２との間の配列ＩＳＳ−ＬＰで
、最も切断が生じる可能性が高いシグナルペプチドが存在し得ることが推定され
た。クローン２０４６８７５２．０．１８−Ｕの核酸（配列番号３）およびアミ
ノ酸（配列番号４）の配列を、以下の表３に示す。
【００３２】
【表３】 クローン２０４６８７５２．０．１８−Ｕによってコードされたタンパク質は
、ＰＲＯ１３４４と呼ばれる７２０残基のヒトタンパク質に対して７２０残基中
７１８残基が同一であり（９９％）、そして７２０残基中７２０残基がポジティ
ブである（１００％）（ＰＣＴ公開ＷＯ９９６３０８８−Ａ２、１９９９年１２
月９日公開）。さらに、このコードされたタンパク質はまた、仮想のヒト２０．
０Ｋｄａｌタンパク質の１８８残基フラグメント（ＴＲＥＭＢＬＮＥＷ−ＡＣＣ
：ＣＡＢ４３３１７）に対して１８１残基中１８０残基が同一であり（９９％）
、そして１８１残基中１８１残基がポジティブである（１００％）であることを
見出した。
【００３３】 クローン２０４６８７５２．０．１８および２０４６８７５２．０．１８−Ｕ
によってコードされた本発明のタンパク質は、本明細書中に記載されるＯＲＦに
よってコードされるものとして開示されたタンパク質、および転写後の改変の結
果として生じる任意の変異タンパク質を含む。従って、本発明のタンパク質は、
２０４６８７５２．０．１８および２０４６８７５２．０．１８−Ｕタンパク質
の前駆体および任意の活性形態の両方を含む。
【００３４】 実施例１６に示される実験結果は、クローン２０４６８７５２が、同一の組織
由来のそれぞれの正常細胞サンプルと比較して、特定の中枢神経系腫瘍および黒
色腫において比較的強力に発現され；ほとんどの結腸癌、乳癌、卵巣癌、前立腺
癌、肺癌、および肝臓癌のサンプルにおいて抑制されることを示した。これらの
結果は、核酸またはアミノ酸配列のクローンが、これらの癌の決定、診断、また
は処置に有用であり得ることを示唆する。さらに、実施例１７に示される結果は
、この核酸配列の発現がまた、ＮＨｏｓｔ細胞の増殖を含むことを示唆する。
【００３５】 （ＰＲＯ３） 本発明に従うＰＲＯ３核酸は、クローン１１６９２０１０．０．５１に示され
る核酸配列を含む。このクローンと相同性のＲＮＡ配列は、胎児の脳組織におい
て見出される。クローン１１６９２０１０．０．５１のヌクレオチド配列の表示
は、表４に提供され、そして２８５２ｂｐのヌクレオチド配列（配列番号５）を
含む。このヌクレオチド配列は、７２９９３．５ダルトンの予測された分子量を
有する、６４９個のアミノ酸残基（配列番号６）のポリペプチドをコードするオ
ープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。この開始コドンは、ヌクレオ
チド４５８〜４６０に配置され、そして終止コドンは、ヌクレオチド２４０５〜
２４０７に配置される。このタンパク質（配列番号６）は、０．６９７６の確実
性で原形質膜に位置されると、ＰＳＯＲＴコンピュータプログラムによって予測
された。このＳｉｇｎａｌＰコンピュータプログラムは、ほとんどの切断部位が
、配列ＶＭＡ−ＫＳの残基２８と２９との間に占有する状態で、シグナルペプチ
ドが存在することを予測した。クローン１１６９２０１０．０．５１の核酸（配
列番号５）およびアミノ酸（配列番号６）配列を、以下の表４に示す。
【００３６】 （表４） クローン１１６９２０１０−０−５１ 翻訳されたタンパク質−フレーム：２−ヌクレオチド４５８から２４０４
【００３７】
【表４】 ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸ分析は、クローン１１６９２０１０．０．５
１によってコードされたタンパク質が、６６０残基ヒトＫＩＡＡ０４０５タンパ
ク質（ＡＣＣ：Ｏ４３１５５）に対して６３７残基中３０６残基が同一であり（
４８％）、そして６３７残基中４２７残基がポジティブである（６７％）ことを
示す。さらに、クローン１１６９２０１０．０．５１によってコードされたタン
パク質は、配列番号３０５と命名した６４９残基のマウス皮膚細胞タンパク質に
対して６４９残基中６２６残基が同一であり（９６％）、そして６４９残基中６
３７残基がポジティブである（９８％）ことを見出した（ＰＣＴ公開ＷＯ９９５
５８６７−Ａ１；１９９９年１１月４日公開を参照のこと）。
【００３８】 クローン１１６９２０１０．０．５１（配列番号６）によってコードされたタ
ンパク質は、（ｉ）ケラチノサイトの増殖性および運動性を刺激するため；（ｉ
ｉ）黒色腫を含む癌細胞の増殖を阻害するため；（ｉｉｉ）血管形成および腫瘍
血管新生を調節するため；（ｖｉ）皮膚の炎症を調節するため；および（ｖ）上
皮細胞の増殖を調節するため強力に使用され得る。
【００３９】 クローン１１６９２０１０．０．５１によってコードされた本発明のタンパク
質は、本明細書中に記載されたＯＲＦによってコードされるとして開示されたタ
ンパク質、および翻訳後の改変の結果として生じる任意の変異タンパク質を含む
。従って、本発明のタンパク質は、１１６９２０１０．０．５１タンパク質の前
駆体および任意の活性形態の両方を含む。
【００４０】 実施例１６に示される実験結果は、クローン１１６９２０１０．０．５１によ
ってコードされたアミノ酸配列が、特定の卵巣癌細胞株、胃癌、および結腸癌細
胞株において高い発現レベルを示す（正常な細胞と比較して）ことを実証する。
さらに、クローン１１６９２０１０．０．５１によってコードされたアミノ酸配
列はまた、種々の肺癌および特定のＣＮＳ癌細胞において広範に発現されること
を見出す。これらの結果は、このクローンがこれらの癌の決定または診断のため
の選択プローブとして使用され得、そしてこのクローンまはたこれらの遺伝子産
物が、このような癌の処置において有用な治療または標的であり得ることを示唆
する。さらに、この遺伝子産物は、実施例１７においてセリンプロテアーゼ活性
を阻害することが示された。この特性は、組織の再構築を調節または特定の癌を
処置するのを有用にする。
【００４１】 （ＰＲＯ４） 本発明に従うＰＲＯ４核酸は、クローン２７８３５９８１．０．１に示された
核酸配列を含む。このクローンと相同性のＲＮＡ配列は、脾臓において見出され
る。
【００４２】 クローン２７８３５９８１．０．１のヌクレオチド配列の表示は、表５に示さ
れ、そして１６５３ｂｐのヌクレオチド配列（配列番号７）を含む。クローン２
７８３５９８１．０．１ののヌクレオチド配列は、１７８４４．２ダルトンの予
測された分子量を有する、１６０個のアミノ酸残基（配列番号８）のポリペプチ
ドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。この開始コ
ドンは、ヌクレオチド９６４〜９６６に配置され、そして終止コドンは、ヌクレ
オチド１４４４〜１４４６に配置される。このタンパク質（配列番号８）は、０
．６０９０の確実性で細胞外に位置されと、ＰＳＯＲＴコンピュータプログラム
によって予測された。このＳｉｇｎａｌＰコンピュータプログラムは、ほとんど
の切断部位が、配列ＴＭＡ−ＥＡの残基２４と２５との間に配置された状態で、
シグナルペプチドが存在することを予測した。クローン２７８３５９８１．０．
１の核酸（配列番号７）およびアミノ酸（配列番号８）配列を、以下の表５に示
す。
【００４３】 （表５） クローン２７８３５９８１．０．１ 翻訳されたタンパク質−フレーム：１−ヌクレオチド９６４から１４４３
【００４４】
【表５】 ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸコンピュータプログラムを使用する配列デー
タベースの分析は、クローン２７８３５９８１．０．１によってコードされたタ
ンパク質が、６０７残基のラット子宮／卵巣特異的推定膜貫通タンパク質（ＡＣ
Ｃ：Ｏ３５３６０）に対して１４６残基中９９残基が同一であり（６７％）、そ
して１４６残基中１２０残基がポジティブである（８２％）ことを明らかにした
。さらに、コードされたタンパク質はまた、ヒト膵臓ＰＡ１５３コンセンサスタ
ンパク質の６０７アミノ酸残基のアミノ末端に対して１〜１４９残基が１００％
同一であり（ＰＣＴ公開ＷＯ９９３１２７４−Ａ２、１９９９年６月２４日公開
）、そして６０７アミノ酸残基を含むヒトタンパク質ＰＲＯ２５７と残基が１０
０％同一である（ＰＣＴ公開ＷＯ９９１４３２８−Ａ２、１９９９年３月２５日
公開）ことを見出した。
【００４５】 クローン２７８３５９８１．０．１によってコードされた本発明のタンパク質
は、本明細書中に記載されたＯＲＦによってコードされるのもとして開示された
タンパク質、および翻訳後の改変の結果として生じる任意の変異タンパク質を含
む。従って、本発明のタンパク質は、２７８３５９８１．０．１タンパク質の前
駆体および任意の活性形態の両方を含む。
【００４６】 実施例１６に示された実験結果は、同一の組織の各正常細胞株と比較して、ク
ローン２７８３５９８１．０．１が、試験された全癌細胞株を実質的に過剰発現
することを示した。これらの結果は、このクローンがこれらの癌の検出または診
断のための選択的なプローブとして使用され得ること、ならびにこのクローンま
たはこれらの遺伝子産物が、このような癌の処置において有用な治療または標的
であり得ることを示唆する。
【００４７】 （ＰＲＯ５核酸およびポリペプチド） 本発明に従ってＰＲＯ５核酸は、クローン２１３９９２４７．０．１で表され
る核酸配列を含む。このクローンと相同性のＲＮＡ配列は、甲状腺において見出
される。クローン２１３９９２４７．０１のヌクレオチド配列の表示は、表６に
提供され、そして２４７８ｂｐのヌクレオチド配列（配列番号９）を含む。この
クローン２１３９９２４７．０．１のヌクレオチド配列は、６６６１４．６ダル
トンの予測された分子量を有する、５８０個のアミノ酸残基（配列番号１０）の
ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。
この開始コドンは、ヌクレオチド２７３〜２７５に配置され、そして終止コドン
は、ヌクレオチド２０１３〜２０１５に配置される。クローン２１３９９２４７
．０．１によってコードされたタンパク質（配列番号１０）は０．８６５０の確
実性でミクロソーム（管腔）に位置されると、ＰＳＯＲＴコンピュータプログラ
ムによって予測された。このＰＳＯＲＴおよびＳｉｇｎａｌＰコンピュータプロ
グラムはまた、ほとんどの切断部位が、配列ＶＬＡ−ＡＶの残基１６と１７との
間に配置された状態で、シグナルペプチドが存在することを予測した。クローン
２１３９９２４７．０．１の核酸（配列番号９）およびアミノ酸（配列番号１０
）配列を、以下の表６に示す。
【００４８】 （表６） クローン２１３９９２４７．０．１ 翻訳されたタンパク質−フレーム：３−ヌクレオチド２７３から２０１２
【００４９】
【表６】 ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸを使用する配列データベースの調査は、任意
の公知の動物タンパク質と統計学的に有意に同一でないことを明らかにする。
【００５０】 クローン２１３９９２４７．０．１によってコードされた本発明のタンパク質
は、本明細書中に記載されたＯＲＦによってコードされるものとして開示された
タンパク質、および転写後の改変の結果として生じる任意の変異タンパク質を含
む。従って、本発明のタンパク質は、２１３９９２４７．０．１タンパク質の前
駆体および任意の活性形態の両方を含む。
【００５１】 実施例１６に示された実験結果は、クローン２１３９９２４７．０．１が、試
験された組織のほとんどにおいて広範に発現されることを示す。これは、特に、
特定の癌（例えば、黒色腫、前立腺癌、肺癌および結腸癌）において特に強力に
発現されることを見出した。これらの結果は、このクローンが、これらの癌の決
定、診断、または処置のための選択的なプローブとして有用であり得ること、お
よびこのクローンまたはこれらの遺伝子が、このような処置において有用な治療
または標的であり得ることを示唆する。
【００５２】 （ＰＲＯ６） 本発明に従うＰＲＯ６核酸は、クローン１７１３２２９６．０．４に示された
核酸配列で示された核酸配列を含む。このクローンと相同性のＲＮＡ配列は、精
巣において見出される。クローン１７１３２２９６．０．４のヌクレオチド配列
の表示は、表７に提供され、そして５２３ｂｐのヌクレオチド配列（配列番号１
１）を含む。このヌクレオチド配列は、１３１３２ダルトンの予測された分子量
を有する、１２１個のアミノ酸残基（配列番号１２）のポリペプチドをコードす
るオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。この開始コドンは、ヌク
レオチド１４１〜１４３に配置され、そして終止コドンは、ヌクレオチド５０４
〜５０６に配置される。クローン１７１３２２９６．０．４によってコードされ
たタンパク質（配列番号１２）は、０．６４００の確実性でマイクロボディー（
ペルオキシソーム）に位置されると、ＰＳＯＲＴコンピュータプログラムによっ
て予測された。このＰＳＯＲＴおよびＳｉｇｎａｌＰコンピュータプログラムは
、シグナルペプチドが存在しないことを予測した。クローン１７１３２２９６．
０．４の核酸（配列番号１１）およびアミノ酸（配列番号１２）配列を、以下の
表７に示す。
【００５３】 （表７） クローン１７１３２２９６．０．４ 翻訳されたタンパク質−フレーム：３−ヌクレオチド１４１から５０３
【００５４】
【表７】 ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸコンピュータプログラムを使用する配列デー
タベースの調査は、クローン１７１３２２９６．０．４によってコードされたタ
ンパク質が、９９５残基のヒト萎縮性−関連タンパク質ＡＲＰ（ＡＣＣ：ＡＡＤ
２７５８４）に対して１０５残基中３８残基が同一であり（３６％）、そして１
０５残基中４４残基がポジティブである（４１％）ことを明らかにした。
【００５５】 クローン１７１３２２９６．０．４によってコードされたタンパク質は、本明
細書中に記載されたＯＲＦによってコードされるものとして開示されたタンパク
質、および転写後の改変の結果として生じる任意の変異タンパク質を含む。従っ
て、本発明のタンパク質は、１７１３２２９６．０．４タンパク質の前駆体およ
び任意の活性形態の両方を含む。
【００５６】 実施例１６に示された実験結果は、クローン１７１３２２９６．０．４が、正
常な組織細胞株に対して、卵巣癌、乳癌、および結腸癌において過剰発現される
。これらの結果は、核酸またはアミノ酸配列クローンが、このような癌の決定、
診断、または処置に有用であり得ることを示唆する。
【００５７】 （ＰＲＯ７およびＰＲＯ８の核酸およびポリペプチド） 本発明に従うＰＲＯ７核酸は、クローン１７９３１３５４．０．３５．１に示
された核酸配列を含む。本発明に従ってＰＲＯ８核酸は、クローン１７９３１３
５４．０．３５．２（ＰＲＯＸ８）に示された核酸配列を含む。この２つのクロ
ーンは、ほとんどの共通の配列（すなわちアミノ酸残基１〜９８４をコードする
核酸配列）にわたって同一であるという点で互いに類似しており、そしてカルボ
キシル末端のみが異なる（図１を参照のこと）。さらに、クローン１７９３１３
５４．０．３５．２は、さらにカルボキシル末端において、クローン１７９３１
３５４．０．３５．１よりも１個のアミノ酸残基長い。
【００５８】 クローン１７９３１３５４．０．３５．１およびクローン１７９３１３５４．
０．３５．２に示された核酸配列が、下垂体において観測され、そして脳、胎児
の脳、および胎児の肝臓において占有されることもまた見出された。
【００５９】 クローン１７９３１３５４．０．３５．１（ＰＲＯＸ７）のヌクレオチド配列
の表示は、表８に示され、そして３８６３ｂｐの核酸配列（配列番号１３）を含
む。このヌクレオチド配列は、１０７５２３．８ダルトンの予測された分子量を
有する、９９３個のアミノ酸残基（配列番号１４）のポリペプチドをコードする
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。この開始コドンは、ヌクレ
オチド１７８〜１８０に配置され、そして終止コドンは、ヌクレオチド３１５７
〜３１５９に配置される。クローン１７９３１３５４．０．３５．１によってコ
ードされたタンパク質（配列番号１４）は、０．６７６０の確実性で原形質膜に
位置されると、ＰＳＯＲＴコンピュータプログラムによって予測された。このＰ
ＳＯＲＴおよびＳｉｇｎａｌＰコンピュータプログラムは、ほとんどの切断部位
が、配列ＡＨＧ−ＬＳの残基１９と２０との間に存在する状態で、シグナルペプ
チドが存在することを予測した。クローン１７９３１３５４．０．３５．１の核
酸（配列番号１３）およびアミノ酸（配列番号１４）配列を、以下の表８に示す
。
【００６０】 （表８） クローン１７９３１３５４．０．３５．１ 翻訳されたタンパク質−フレーム：１−ヌクレオチド１７８から３１５６
【００６１】
【表８】 クローン１７９３１３５４．０．３５．２（ＰＲＯＸ８）のヌクレオチド配列
の表示は、表９に与えられ、そして３８７９ｂｐのヌクレオチド配列（配列番号
１５）を含む。このヌクレオチド配列は、１０７４９２．８ダルトンの予測され
た分子量を有する、９９４個のアミノ酸残基（配列番号１６）のポリペプチドを
コードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。この開始コドン
は、ヌクレオチド１７８〜１８０に配置され、そして終止コドンは、ヌクレオチ
ド３１６０〜３１６２に配置される。クローン１７９３１３５４．０．３５．２
によってコードされたタンパク質（配列番号１６）は、０．６７６０の確実性で
原形質膜に位置されると、ＰＳＯＲＴコンピュータプログラムによって予測され
た。このＰＳＯＲＴおよびＳｉｇｎａｌＰコンピュータプログラムは、ほとんど
の切断部位が、配列ＡＨＧ−ＬＳの残基１９と２０との間に配置された状態で、
シグナルペプチドが存在することを予測した。クローン１７９３１３５４．０．
３５．２（ＰＲＯＸ８）の核酸（配列番号１５）およびアミノ酸（配列番号１６
）配列を、以下の表９に示す。
【００６２】 （表９） クローン１７９３１３５４．０．３５．２ 翻訳されたタンパク質−フレーム：１−ヌクレオチド１７８から３１５９
【００６３】
【表９】ｐ２８〜３１ ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸコンピュータプログラムを使用する配列デー
タベースの分析は、クローン１７９３１３５４．０．３５．１（ＰＲＯＸ７）に
よってコードされたタンパク質が、９９１残基のマウス発作関連タンパク質６前
駆体（発作関連タンパク質産物６、２型）（ＡＣＣ：Ｑ６２２２３）に対して９
８４残基中８８２残基が同一であり（８９％）、そして９８４残基中９２１残基
がポジティブである（９３％）ことを明らかにした。さらに、クローン１７９３
１３５４．０．３５．１によってコードされたタンパク質は、ヒトＫＩＡＡ０９
２７タンパク質の７７７残基フラグメント（ＡＣＣ：ＢＡＡ７６７７１）に対し
て７８５残基中３９１残基が同一であり（４９％）、そして７８５残基中５４４
残基がポジティブである（６９％）であることをまた見出した。
【００６４】 ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸコンピュータプログラムを使用する配列デー
タベースの調査は、クローン１７９３１３５４．０．３５．２（ＰＲＯＸ８）に
によってコードされたタンパク質が、クローン１７９３１３５４．０．３５．１
ついて先に同定されたマウス発作関連タンパク質６前駆体（ＡＣＣ：Ｑ６２２２
３）に対して、９９４残基中８９２残基が同一であり（８９％）、そして９９４
残基中９３１残基がポジティブである（９３％）ことを明らかとした。さらに、
クローン１７９３１３５４．０．３５．２によってコードされたタンパク質はま
た、７７５残基のヒトＤＪ２６８Ｄ１３．１（マウス発作関連遺伝子産物６様タ
ンパク質）（ＡＣＣ：ＣＡＢ４６６２５）に対して、６９３残基中３４８残基が
同一であり（５０％）、そして６９３残基中４８４残基がポジティブである（６
９％）ことを見出した。
【００６５】 クローン１７９３１３５４．０．３５．１およびクローン１７９３１３５４．
０．３５．２によってコードされた本発明のタンパク質は、本明細書中に記載さ
れたＯＲＦによってコードされるものとして開示されたタンパク質、および転写
後の改変の結果として生じる任意の変異タンパク質を含む。従って、本発明のタ
ンパク質は、１７９３１３５４．０．３５．１および１７９３１３５４．０．３
５．２タンパク質の前駆体および任意の活性形態の両方を含む。
【００６６】 実施例１６に示される実験結果は、クローン１７９３１３５４が、２種の肺癌
細胞株において著しく高いレベルで発現されるが、正常の肺細胞では発現されな
い。これらの結果は、核酸またはアミノ酸配列クローンが、このような癌の決定
、診断、または処置に有用であり得ることを示唆する。 （ＰＲ０９、ＰＲＯ１０、ＰＲＯ１１、ＰＲＯ１２、およびＰＲＯ１３の核酸
およびポリペプチド） 本発明に従うＰＲ０９、ＰＲＯ１０、ＰＲＯ１１、ＰＲＯ１２、またはＰＲＯ
１３の核酸としては、クローン７５２０５００．０．５４＿１（ＰＲＯＸ ９）
、７５２０５００．０．５４＿２（ＰＲＯＸ １０）、７５２０５００．０．５
４＿３（ＰＲＯＸ １１）、７５２０５００．０．５４＿４（ＰＲＯＸ １２）
、および７５２０５００．０．２１（ＰＲＯＸ １３）に示される核酸配列が挙
げられる。これらのクローンは、その共通配列の大部分にわたって同一である点
で、互いに似ている。例えば、クローン７５２０５００．０．５４＿２（ＰＲＯ
Ｘ １０）およびクローン７５２０５００．０．５４＿３（ＰＲＯＸ １１）は
、同一のタンパク質をコードするが、その非翻訳領域が異なる。同様に、クロー
ン７５２０５００．０．５４＿４（ＰＲＯＸ １２）およびクローン７５２０５
００．０．２１（ＰＲＯＸ １３）は、アミノ末端方向で同一の配列を含む伸長
を保有し、そしてそのアミノ末端アミノ酸残基がメチオニンではないので、完全
ではないようである、タンパク質をコードする。さらに、クローン７５２０５０
０．０．２１（ＰＲＯＸ １３）は、他の４つのクローンに対する３’スプライ
ス改変体であるようである。なぜなら、これは他よりもはるかに早く終結するか
らである。これらクローン間に存在するこれらの差異および他の差異は、図２を
参照することにより観察され得、この図２は、これらのクローンによりコードさ
れる５つすべてのタンパク質のアラインメントを提供する。
【００６７】 クローン７５２０５００．０．５４＿１、クローン７５２０５００．０．５４
＿２、クローン７５２０５００．０．５４＿３、クローン７５２０５００．０．
５４＿４、およびクローン７５２０５００．０．２１に示される核酸配列は、脳
（特に、胎児脳）、および胎児肝臓にて見出された。クローン７５２０５００．
０．５４＿１、クローン７５２０５００．０．５４＿２、およびクローン７５２
０５００．０．５４＿３のヌクレオチド配列の提示が、それぞれ、表１０、１１
、および１２に示される。
【００６８】 クローン７５２０５００．０．５４＿１（ＰＲＯＸ ９）は２１２７ｂｐのヌ
クレオチド配列（配列番号１７）を含む。このヌクレオチド配列は、推定分子量
５６２８４ダルトンの５２５アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号１８）をコ
ードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。開始コドンは、ヌ
クレオチド１７８−１８０に位置し、そして終止コドンはヌクレオチド１７５３
−１７５５に位置する。クローン７５２０５００．０．５４＿１（ＰＲＯＸ ９
）の核酸配列（配列番号１７）およびアミノ酸配列（配列番号１８）は、下記に
表１０にて示される。
【００６９】 （表１０） （クローン７５２０５００．０．５４．１） 翻訳されたタンパク質−フレーム：１−ヌクレオチド１７８〜１７５２
【００７０】
【表１０】 クローン７５２０５００．０．５４＿２（ＰＲＯＸ １０）は、２１２７ｂｐ
のヌクレオチド配列（配列番号１９）を含む。このヌクレオチド配列は、推定分
子量５６４６３ダルトンの５２５アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号２０）
をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。開始コドンは
ヌクレオチド１７８−１８０に位置し、そして終止コドンはヌクレオチド１７５
３−１７５５に位置する。クローン７５２０５００．０．５４＿２（ＰＲＯＸ
１０）の核酸配列（配列番号１９）およびアミノ酸配列（配列番号２０）は、下
記に表１１にて示される。
【００７１】 （表１１） （クローン７５２０５００．０．５４．２） 翻訳されたタンパク質−フレーム：１−ヌクレオチド１７８〜１７５２
【００７２】
【表１１】 クローン７５２０５００．０．５４＿３（ＰＲＯＸ １１）は、１９８８ｂｐ
のヌクレオチド配列（配列番号２１）を含む。このヌクレオチド配列は、推定分
子量５６４６３ダルトンの５２５アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号２２）
をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。この核酸配列
によりコードされるポリペプチド（配列番号２２）は、クローン７５２０５００
．０．５４＿２（ＰＲＯＸ １０）によりコードされるポリペプチド（配列番号
２０）と同じである。開始コドンはヌクレオチド１７８−１８０に位置し、そし
て終止コドンはヌクレオチド１７５３−１７５５に位置する。クローン７５２０
５００．０．５４＿３（ＰＲＯＸ １１）の核酸配列（配列番号２１）およびア
ミノ酸配列（配列番号２２）は、下記表１２にて示される。
【００７３】 （表１２） （クローン７５２０５００．０．５４．３） 翻訳されたタンパク質−フレーム：１−ヌクレオチド１７８〜１７５２
【００７４】
【表１２】 配列番号１８、配列番号２０、および配列番号２２のタンパク質（すなわち、
クローン７５２０５００．０．５４＿１（ＰＲＯＸ ９）；クローン７５２０５
００．０．５４＿２（ＰＲＯＸ １０）およびクローン７５２０５００．０．５
４＿３（ＰＲＯＸ １１）によりコードされるタンパク質は、ＰＳＯＲＴコンピ
ュータープログラムにより、確実性０．８２００で細胞外に位置すると推定され
た。。ＰＳＯＲＴおよびＳｉｇｎａｌＰコンピュータープログラムはまた、切断
可能なシグナルペプチドが存在し、最も見込みのある切断部位が残基１９と２０
との間、配列ＡＨＧ−ＬＳに位置することを予測した。
【００７５】 ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸコンピュータープログラムを使用するタンパ
ク質配列データベースの分析は、クローン７５２０５００．０．５４＿１（ＰＲ
ＯＸ ９）、クローン７５２０５００．０．５４＿２（ＰＲＯＸ １０）、およ
び７５２０５００．０．５４＿３（ＰＲＯＸ １１）によりコードされるタンパ
ク質が、４９４残基のうち、９７７残基のマウス発作関連タンパク質６前駆体（
ＡＣＣ：Ｑ６２２６９）と同一な４２１残基（８５％）およびポジティブな４４
８残基（９０％）を有することを示した。さらに、クローン７５２０５００．０
．５４＿１（ＰＲＯＸ ９）によりコードされるタンパク質が、２６８残基のう
ち、ヒトＫＩＡＡ０９２７タンパク質由来の７７７フラグメント（ＡＣＣ：ＢＡ
Ａ７６７７１）と同一な１３３残基（４９％）およびポジティブな１８７残基（
６９％）を有し；そしてクローン７５２０５００．０．５４＿２（ＰＲＯＸ １
０）およびクローン７５２０５００．０．５４＿３（ＰＲＯＸ １１）によりコ
ードされるタンパク質が、２８６残基のうち、ヒトＫＩＡＡ０９２７タンパク質
（ＡＣＣ：ＢＡＡ７６７７１）由来の７７７フラグメントと、同一な１３８残基
（４８％）およびポジティブな１９６残基（６８％）を有する。
【００７６】 クローン７５２０５００．０．５４＿４（ＰＲＯＸ １２）およびクローン７
５２０５００．０．２１（ＰＲＯＸ １３）のヌクレオチド配列の提示が、表１
３および１４に、それぞれ示される。クローン７５２０５００．０．５４＿４（
ＰＲＯＸ １２）は、２１４３ｂｐのヌクレオチド配列（配列番号２３）を含む
。このヌクレオチド配列は、推定分子量５６２５３ダルトンの５２５アミノ酸残
基のポリペプチド（配列番号２４）をコードするオープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）を有する。開始コドンはヌクレオチド１７８−１８０に位置し、そし
て終止コドンはヌクレオチド１７５６−１７５８に位置する。クローン７５２０
５００．０．５４＿４によりコードされるタンパク質（配列番号２４）は、ＰＳ
ＯＲＴコンピュータープログラムにより、確実性０．８２００で細胞外に位置す
ると予測された。ＰＳＯＲＴおよびＳｉｇｎａｌＰコンピュータープログラムも
また、切断可能な部位が存在し、最も見込みのある切断部位が残基１９と２０と
の間、配列ＡＨＧ−ＬＳに位置することを予測した。クローン７５２０５００．
０．５４＿４（ＰＲＯＸ １２）核酸配列（配列番号２３）およびアミノ酸配列
（配列番号２４）は、下記に表１３にて示される。
【００７７】 （表１３） （クローン７５２０５００．０．５４．４） 翻訳されたタンパク質−フレーム：１−ヌクレオチド１７８〜１７５５
【００７８】
【表１３】 クローン７５２０５００．０．２１（ＰＲＯＸ １３）は、１４８２ｂｐのヌ
クレオチド配列（配列番号２５）を含む。このヌクレオチド配列は、推定分子量
５６２５３ダルトンの２６１アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号２６）をコ
ードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。開始コドンはヌク
レオチド１７８−１８０に位置し、そして終止コドンはヌクレオチド９６１−９
６３に位置する。クローン７５２０５００．０．２１によりコードされるタンパ
ク質（配列番号２６）は、ＰＳＯＲＴコンピュータープログラムにより、確実性
０．８２００で、細胞外に位置すると予測された。クローン７５２０５００．０
．２１（ＰＲＯＸ １３）の核酸配列（配列番号２５）およびアミノ酸配列（配
列番号２６）は、下記に表１４にて示される。
【００７９】 （表１４） （クローン７５２０５００．０．２１） 翻訳されたタンパク質−フレーム：１−ヌクレオチド１７８〜９６０
【００８０】
【表１４】 ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸコンピュータープログラムを使用するタンパ
ク質配列データベースの分析は、クローン７５２０５００．０．５４＿４（ＰＲ
ＯＸ １２）によりコードされるタンパク質が、４８４残基のうちに、９９１残
基のマウス発作関連タンパク質６前駆体（２型）（ＡＣＣ：Ｑ６２２６９）と同
一な４１２残基（８５％）およびポジティブな４３９残基（９０％）を有するこ
とを示した。コードされるタンパク質はまた、２６８残基のうちに、ヒトＫＩＡ
Ａ０９２７タンパク質（ＡＣＣ：ＢＡＡ７６７７１）の７７７残基フラグメント
と同一な１３３残基（４９％）およびポジティブな１８７残基（６９％）を有す
る。
【００８１】 ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸコンピュータープログラムを使用するタンパ
ク質配列データベースの分析は、クローン７５２０５００．０．２１（ＰＲＯＸ
１３）によりコードされるタンパク質が、２４２残基のうちに、９７７残基の
マウス発作関連タンパク質６前駆体（ＡＣＣ：Ｑ６２２６９）と同一な１８６残
基（７６％）およびポジティブな２０６残基（８５％）を有することを示した。
【００８２】 クローン７５２０５００．０．５４＿１（ＰＲＯＸ ９）；クローン７５２０
５００．０．５４＿２（ＰＲＯＸ １０）；クローン７５２０５００．０．５４
＿３（ＰＲＯＸ １１）；クローン７５２０５００．０．５４＿４（ＰＲＯＸ
１２）；およびクローン７５２０５００．０．２１（ＰＲＯＸ １３）によりコ
ードされる本発明のタンパク質は、本明細書中に記載されるＯＲＦによりコード
されるような開示されるタンパク質、ならびに翻訳後修飾の結果としてそれから
生じるすべての成熟タンパク質を含む。従って、本発明のタンパク質は、７５２
０５００．０．５４＿１、７５２０５００．０．５４＿２、７５２０５００．０
．５４＿３、７５２０５００．０．５４＿４および７５２０５００．０．２１タ
ンパク質の前駆体およびすべての活性な形態の両方を含む。
【００８３】 実施例１６に示される実験結果は、７５２０５００ファミリーの種々のクロー
ンが、２つの肺癌細胞株において顕著に検出されるが、正常な肺細胞では検出さ
れないことを示す。これらの結果は、このクローンが、これらの癌の検出または
診断のための選択プローブとして使用され得ること、およびこのクローンまたは
その遺伝子産物が、このような癌の処置における有用な標的であり得ることを示
唆する。
【００８４】 （ＰＲＯ１４およびＰＲＯ１５の核酸およびポリペプチド） 本発明によるＰＲＯ １４またはＰＲＯ１５の核酸は、クローン１７９４１７
８７．０．１（ＰＲＯＸ １４）およびクローン１７９４１７８７．０．３１（
ＰＲＯＸ １５）に示される核酸配列を含む。これらのクローンは、それらがコ
ードするタンパク質が互いのスプライス改変体であるという点で互いに似ている
。例えば、クローン１７９４１７８７．０．１（ＰＲＯＸ １４）にコードされ
るタンパク質には、クローン１７９４１７８７．０．３１（ＰＲＯＸ １５）と
比較した場合、残基２６で始まる１９アミノ酸残基の欠失が存在する。さらに、
クローン１７９４１７８７．０．３１（ＰＲＯＸ １５）は、クローン１７９４
１７８７．０．１（ＰＲＯＸ １４）よりもカルボキシル末端でかなりさらなる
程度まで伸長している。
【００８５】 クローン１７９４１７８７．０．１（ＰＲＯＸ １４）を表す核酸が、乳腺、
ならびに胎児の腎臓および下垂体にて見出された。クローン１７９４１７８７．
０．１のヌクレオチド配列の提示が、表１５に示され、そしてそれは、３３３６
ｂｐのヌクレオチド配列（配列番号２７）を含む。このヌクレオチド配列は、推
定分子量９３１２２ダルトンの８４０アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号２
８）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。開始コド
ンはヌクレオチド１２０−１２２に位置し；そして終止コドンはヌクレオチド２
６４０−２６４２に位置する。クローン１７９４１７８７．０．１によりコード
されるタンパク質（配列番号２８）は、ＰＳＯＲＴコンピュータープログラムに
より、原形質膜に位置すると予測された。ＰＳＯＲＴおよびＳｉｇｎａｌＰコン
ピュータープログラムもまた、切断可能なシグナルペプチドが存在し、最も見込
みのある切断部位が残基２７と２８との間、配列ＶＹＡ−ＣＧに位置すると予測
した。クローン１７９４１７８７．０．１（ＰＲＯＸ １４）の核酸配列（配列
番号２７）およびアミノ酸配列（配列番号２８）は、下記に表１５にて示される
。
【００８６】 （表１５） （クローン１７９４１７８７．０．１） 翻訳されたタンパク質−フレーム：３−ヌクレオチド１２０〜２６３９
【００８７】
【表１５】 ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸコンピュータープログラムは、クローン１７
９４１７８７．０．１（ＰＲＯＸ １４）によりコードされるタンパク質が、８
２０残基のうちに、８５９残基のヒトＳＴ７タンパク質（ＳＰＴＲＥＭＢＬ−Ａ
ＣＣ：Ｑ９Ｙ５６１；本願の出願日後に寄託された）（いくつかのヒトの形質転
換細胞株および腫瘍由来細胞株において発現が変化した推定膜タンパク質）と同
一な８１６残基（９９％）およびポジティブな８１８残基（９９％）を有するこ
とを示した。さらに、コードされるタンパク質はまた５８６残基のうちに、７７
０残基のヒトＬＤＬレセプター関連タンパク質１０５（ＡＣＣ：０７５０７４）
と同一な３０１残基（５１％）およびポジティブな３９７残基（６７％）を有す
ることが見出された。さらに、コードされるタンパク質は、８２０残基のうちに
、シグナル配列捕捉法（ＰＣＴ公開ＷＯ ９９１８１２６−Ａ１（１９９９年４
月１５日公開））により同定されたヒト８５９残基ポリペプチドと同一な８１６
残基（９９％）およびポジティブな８１８残基（９９％）を有することが見出さ
れた。
【００８８】 クローン１７９４１７８７．０．３１に相同なＲＮＡが、乳腺、ならびに胎児
の腎臓および下垂体にて見出される。クローン１７９４１７８７．０．３１（Ｐ
ＲＯＸ １５）のヌクレオチド配列の提示が、表１６に提供され、そしてそれは
、１４９８ｂｐのヌクレオチド配列（配列番号２９）を含む。このヌクレオチド
配列は、推定分子量５０６５４ダルトンの４４９アミノ酸残基のポリペプチド（
配列番号３０）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する
。開始コドンはヌクレオチド１２０−１２２に位置し；そして終止コドンはヌク
レオチド１４６７−１４６９に位置する。クローン１７９４１７８７．０．３１
によりコードされるタンパク質（配列番号３０）は、ＰＳＯＲＴコンピューター
プログラムにより、確実性０．５６６０で細胞外に位置すると予測された。ＰＳ
ＯＲＴおよびＳｉｇｎａｌＰコンピュータープログラムは、切断可能なシグナル
ペプチドが存在し、最も見込みのある切断部位が残基２７と２８との間、配列Ｖ
ＹＧ−ＮＧに位置すると予測した。クローン１７９４１７８７．０．３１（ＰＲ
ＯＸ １５）の核酸配列（配列番号２９）およびアミノ酸配列（配列番号３０）
は、下記表１６にて示される。
【００８９】 （表１６） （クローン１７９４１７８７−０−３１） 翻訳されたタンパク質−フレーム：３−ヌクレオチド１２０〜１４６６
【００９０】
【表１６】 ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸ分析は、クローン１７９４１７８７．０．３
１（ＰＲＯＸ １５）によりコードされるタンパク質が、４４２残基のうちに、
８５９残基ヒトＳＴ７タンパク質（ＡＣＣ：ＡＡＤ４４３６０）（いくつかのヒ
ト形質転換細胞株および腫瘍由来細胞株において発現が変化した推定膜タンパク
質）と同一な４４１残基（９９％）およびポジティブな４４１残基（９９％）を
有すると示す。さらに、クローン１７９１７８７．０．３１によりコードされる
タンパク質はまた、５８６残基のうちに、７７０残基ヒトＬＤＬレセプター関連
タンパク質１０５（ＡＣＣ：０７５０７４）と同一な３０１残基（５１％）およ
びポジティブな３９７残基（６７％）を有することが見出された。さらに、コー
ドされるタンパク質は、４４２残基のうちに、シグナル配列捕捉法（ＰＣＴ公開
ＷＯ ９９１８１２６−Ａ１（１９９９年４月１５日公開））により同定された
ポリペプチドと同一かつポジティブな４４１残基（９９％）を有する。
【００９１】 クローン１７９４１７８７．０．１（ＰＲＯＸ １４）およびクローン１７９
４１７８７．０．３１（ＰＲＯＸ １５）によりコードされる本発明のタンパク
質は、本明細書中に記載されるＯＲＦによりコードされるような開示されるタン
パク質、ならびに翻訳後修飾の結果としてそれから生じるすべての成熟タンパク
質を含む。従って、本発明のタンパク質は、１７９４１７８７．０．１および１
７９４１７８７．０．３１タンパク質の前駆体およびすべての活性な形態の両方
を含む。
【００９２】 実施例１６に示される実験結果は、正常な組織由来の細胞と比較して、前立腺
癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、ＣＮＳ癌、および膵臓癌細胞株において、ク
ローン１７９４１７８７が強力に過剰発現されることを示す。これらの結果は、
このクローンが、これらの癌の検出または診断のための選択プローブとして使用
され得ること、およびこのクローンまたはその遺伝子産物が、このような癌の処
置における有用な標的であり得ることを示唆する。
【００９３】 （ＰＲＯ１６およびＰＲＯ１７の核酸およびポリペプチド） 本発明によるＰＲＯ１６またはＰＲＯ１７の核酸は、クローン１６４６７９４
５．０．８５（ＰＲＯＸ １６）およびクローン１６４６７９４５．０．８８（
ＰＲＯＸ １７）に示される核酸配列を含む。これらのクローンは、それらがコ
ードするタンパク質が互いのスプライス改変体であるようである点で、互いに似
ている。それらは、アミノ末端部分で本質的に同一であり、短い方のタンパク質
（すなわち、クローン１６４６７９４５．０．８５によりコードされるタンパク
質）のカルボキシル末端で異なるようになる。
【００９４】 クローン１６４６７９４５．０．８５（ＰＲＯＸ １６）およびクローン１６
４６７９４５．０．８８（ＰＲＯＸ １７）に相同なＲＮＡが、胎児の肺、精巣
および胎児の腎臓において見出される。
【００９５】 クローン１６４６７９４５．０．８５（ＰＲＯＸ １６）のヌクレオチド配列
の提示が、表１７に提示され、そしてそれは、６９１ｂｐのヌクレオチド配列（
配列番号３１）を含む。このヌクレオチド配列は、推定分子量１３８４４ダルト
ンの１２３アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号３２）をコードするオープン
リーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。開始コドンはヌクレオチド２０３−
２０５に位置し；そして終止コドンはヌクレオチド５７２−５７４に位置する。
クローン１６４６７９４５．０．８５（ＰＲＯＸ １６）によりコードされるタ
ンパク質（配列番号３２）は、ＰＳＯＲＴコンピュータープログラムにより、確
実性０．７４７５で細胞外に位置すると予測された。ＰＳＯＲＴおよびＳｉｇｎ
ａｌＰコンピュータープログラムは、切断可能なシグナルペプチドが存在し、最
も見込みのある切断部位が残基１９と２０との間、配列ＡＡＡ−ＥＹに位置する
と予測した。クローン１６４６７９４５．０．８５（ＰＲＯＸ １６）の核酸配
列（配列番号３１）およびアミノ酸配列（配列番号３２）は、下記表１７にて示
される。
【００９６】 （表１７） （クローン１６４６７９４５．０．８５） 翻訳されたタンパク質−フレーム：２−ヌクレオチド２０３〜５７１
【００９７】
【表１７】 ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸコンピュータープログラムを使用する配列デ
ータベースの分析は、クローン１６４６７９４５．０．８５（ＰＲＯＸ １６）
によりコードされるタンパク質が、１３１残基のうちに、ヒトＰＲ０３３４タン
パク質と同一な７７残基（５８％）およびポジティブな８３残基（６３％）を有
すると示した。さらに、コードされるタンパク質はまた、４７残基のうちに、マ
ウスハリネズミ（ｈｅｄｇｅｈｏｇ）相互作用タンパク質（ＡＣＣ：ＡＡＤ３１
１７２）と同一な２１残基（４４％）およびポジティブな２７残基（５７％）を
有することが見出された。
【００９８】 クローン１６４６７９４５．０．８８（ＰＲＯＸ １７）のヌクレオチド配列
の提示が、表１８に提示され、そしてそれは、２１１２ｂｐのヌクレオチド配列
（配列番号３３）を含む。このヌクレオチド配列は、推定分子量６３９９２ダル
トンの５８２アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号３４）をコードするオープ
ンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。開始コドンはヌクレオチド２０３
−２０５に位置し；そして終止コドンはヌクレオチド１９４９−１９５１に位置
する。クローン１６４６７９４５．０．８８（ＰＲＯＸ １７）によりコードさ
れるタンパク質（配列番号３４）は、ＰＳＯＲＴコンピュータープログラムによ
り、確実性０．７４７５で細胞外に位置すると予測された。ＰＳＯＲＴおよびＳ
ｉｇｎａｌＰコンピュータープログラムはまた、切断可能なシグナルペプチドが
存在し、最も見込みのある切断部位が残基１９と２０との間、配列ＡＡＡ−ＥＹ
に位置すると予測した。クローン１６４６７９４５．０．８８（ＰＲＯＸ １７
）の核酸配列（配列番号３３）およびアミノ酸配列（配列番号３４）は、下記表
１８にて示される。
【００９９】
【表１８】 ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸコンピュータープログラムを使用する配列デ
ータベースの分析は、クローン１６４６７９４５．０．８８（ＰＲＯＸ１７）に
よってコードされるタンパク質が、５０９残基のヒトＰＲＯ３３４タンパク質（
ＡＣＣ：Ｙ１３３９７）に対して３３２残基のうち３２６残基（９８％）同一で
あり、そして３３２残基のうち３２７残基（９８％）ポジティブを有することを
示した。さらに、コードされるタンパク質はまた、１２２１残基のマウスタンパ
ク質フィブリン−２（ＡＣＣ：ＡＡＤ３４４５６）に対して３３２残基のうち３
２６残基（９８％）同一であり、そして３３２残基のうち３２７残基（９８％）
ポジティブを有することを見出した。さらに、コードされるタンパク質はまた、
５５３残基のヒト上皮増殖因子繰り返し含有タンパク質（ＴＲＥＭＢＬＮＥＷ−
ＡＣＣ：ＡＡＦ２７８１２（本発明の出願日後に公表された））と約６０％の同
一性を有し、そして約８０％ポジティブである。
【０１００】 クローン１６４６７９４５．０．８５（ＰＲＯＸ１６）およびクローン１６４
６７９４５．０．８８（ＰＲＯＸ１７）によってコードされる本発明のタンパク
質は、本明細書中に記載のＯＲＦによってコードされるような開示されたタンパ
ク質および翻訳後修飾の結果としてそこから生じる任意の成熟タンパク質を含む
。従って、本発明のタンパク質は、１６４６７９４５．０．８５タンパク質およ
び１６４６７９４５．０．８８タンパク質の前駆体および任意の活性形態の両方
を包含する。
【０１０１】 実施例１６において示される実験結果は、正常組織由来の細胞と比較して、ク
ローン１６４６７９４５．０．８５（ＰＲＯＸ１６）およびクローン１６４６７
９４５．０．８８（ＰＲＯＸ１７）によってコードされるタンパク質が、特定の
乳癌細胞株、卵巣癌細胞株、腎臓癌細胞株および結腸癌細胞株において高度に過
剰発現していることを示す。さらに、コードされるタンパク質は、正常肺細胞と
比較して肺癌細胞株において強度に抑制される。これらの結果は、このクローン
が、これらの癌の検出または診断のための選択プローブとして使用され得ること
、およびこれらのクローンまたはそれらの遺伝子産物は、このような癌の治療に
おける有用な治療剤または標的であり得ることを示唆する。
【０１０２】 （ＰＲＯＸ核酸） 本発明の新規な核酸は、ＰＲＯＸまたはＰＲＯＸ様タンパク質、またはその生
物学的に活性な部分をコードする核酸を含む。核酸は、配列番号２ｎ（ｎ＝１〜
１７）の１つ以上のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。
従って、コードされるポリペプチドは、例えば、配列番号２、４、６、８、１０
、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、およ
び／または３４のアミノ酸配列を含み得る。
【０１０３】 いくつかの実施形態において、配列番号２ｎ（ｎ＝１〜１７）の１つ以上のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２ｎ−１（ここ
で、ｎ＝１〜１７）のいずれかの核酸配列、またはそれらのフラグメントを含み
、そして従って、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１
７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、および／または３３の核酸配
列を含み得る。さらに、本発明は、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）
のいずれかの変異体または改変体の核酸、またはそれらのフラグメントを含み、
これらの塩基のいずれかは、開示された配列から変化され得るが、なお、そのＰ
ＲＯＸ様生物学的活性および生理学的機能を維持するタンパク質をコードする。
本発明はさらに、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）のいずれかの核酸
配列（それらのフラグメント、誘導体、アナログおよびホモログを含む）の相補
体を含む。さらに、本発明は、核酸または核酸フラグメント、それに対する相補
体を含み、それらの構造は、化学的な変更を含む。
【０１０４】 ＰＲＯＸをコードする核酸（例えば、ＰＲＯＸ ｍＲＮＡ）を同定するために
ハイブリダイゼーションプローブとして使用するための十分な核酸フラグメント
およびＰＲＯＸ核酸分子の増幅または変異のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）プライマーとして使用するためのフラグメントも含まれる。本明細書におい
て使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたは
ゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを使
用して産生されるＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ、ならびにそれらの誘導体、フ
ラグメントおよびホモログを含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖または
二本鎖であり得るが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。
【０１０５】 本明細書中で利用される場合、用語「プローブ」とは、種々の長さの核酸配列
をいい、好ましくは、特定の使用に依存して、少なくとも約１０ヌクレオチド（
ｎｔ）、１００ｎｔ、または例えば、約６，０００ｎｔほどの大きさの間である
。プローブは、同一、類似または相補的な核酸配列の検出において使用される。
より長いプローブは、通常、天然供給源または組換え供給源から入手され、非常
に特異的であり、そしてオリゴマーよりもはるかに遅くハイブリダイズする。プ
ローブはまた、一本鎖または二本鎖であり得、そしてＰＣＲ、メンブレンベース
のハイブリダイゼーション技術またはＥＬＩＳＡのような技術において特異性を
有するように設計され得る。
【０１０６】 本明細書中で利用される場合、用語「単離された」核酸分子は、この核酸の天
然の供給源中に存在するその他の核酸分子から分離されている核酸である。単離
された核酸分子の例としては、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子、異種宿
主細胞中に維持される組換えＤＮＡ分子、部分的または実質的に精製された核酸
分子、および合成ＤＮＡまたはＲＮＡ分子が挙げられるが、これらに限定されな
い。好ましくは、「単離された」核酸は、この核酸が由来する生物のゲノムＤＮ
Ａ中でこの核酸に天然に隣接する配列（すなわち、この核酸の５’末端および３
’末端に位置する配列）を含まない。例えば、種々の実施形態で、単離されたＰ
ＲＯＸ核酸分子は、この核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中でこの核酸分子に
天然で隣接する、約５０ｋｂ、２５ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１
ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。さら
に、「単離された」核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ分子は、組換え技術により産生
される場合、その他の細胞物質も培養培地も実質的に含まないか、または化学的
に合成される場合、化学物質前駆体もその他の化学物質も実質的に含まないもの
であり得る。
【０１０７】 本明細書中で使用される場合、ポリペプチドまたはタンパク質の用語「成熟」
形態は、天然に存在するポリペプチドあるいは前駆体形態またはＰＲＯＸタンパ
ク質の産物である。天然に存在するポリペプチド、前駆体またはＰＲＯＸタンパ
ク質としては、非限定的な例として、対応する遺伝子によってコードされる完全
長遺伝子産物が挙げられる。あるいは、本明細書中で記載されるオープンリーデ
ィングフレームによってコードされる、ポリペプチド、前駆体またはＰＲＯＸタ
ンパク質として定義され得る。産物「成熟」形態は、さらに非限定的な例として
、遺伝子産物が産生される細胞中、または宿主細胞中で発生し得る、１以上の天
然に存在するプロセシング工程の結果として発生する。ポリペプチドまたはタン
パク質の「成熟」形態に導くこのようなプロセッシング工程の例としては、オー
プンリーディングフレームの開始コドンによってコードされる、Ｎ末端メチオニ
ン残基の切断、またはシグナルペプチドまたはリーダー配列のタンパク分解性切
断が挙げられる。従って、残基１〜Ｎ（ここで、残基１は、Ｎ末端メチオニンで
ある）を有する、前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、
Ｎ末端メチオニンの除去後に残った残基２〜Ｎを有する。あるいは、残基１〜Ｎ
を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態（ここで、残
基１〜残基ＭのＮ末端シグナル配列が切断される）は、残った残基Ｍ＋１〜残基
Ｎを有する。本明細書中でさらに使用される場合、ポリペプチドまたはタンパク
質の「成熟」形態は、タンパク質分解性切断事象以外の、翻訳後改変事象の工程
から生じ得る。このようなさらなるプロセスとしては、非限定的な例として、グ
リコシル化、ミリストイル化、またはリン酸化が挙げられる。一般に、成熟ポリ
ペプチドまたは成熟タンパク質は、これらのプロセスの１つのみの作用、または
それらのいずれかの組み合わせから生じ得る。
【０１０８】 本発明の核酸分子、例えば、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）のヌ
クレオチド配列を有する核酸分子、またはこれらのヌクレオチド配列のいずれか
の相補体は、標準的な分子生物学的技法および本明細書で提供される配列情報を
用いて単離され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして、配列番号２ｎ−
１（ここで、ｎ＝１〜１７）のいずれかの核酸配列の全てまたは一部を用いて、
ＰＲＯＸ核酸配列は、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術
（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：
Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＹ ＭＡＮＵＡＬ第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら、（編）、ＣＵＲＲＥ
ＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３）を用いて単
離され得る。
【０１０９】 本発明の核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技法に従って、テンプレートとしてｃＤ
ＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡ、および適切なオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いて増幅され得る。このように増幅された核酸は、適切なベクター中に
クローン化され、そしてＤＮＡ配列分析により特徴付けられ得る。さらに、ＰＲ
ＯＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術、例
えば、自動化ＤＮＡ合成機を用いることにより調製され得る。
【０１１０】 本明細書で用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」とは、一連の連結し
たヌクレオチド残基をいい、このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応で用いられ
る十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノ
ム配列もしくはｃＤＮＡ配列に基づき得るか、またはそれらから設計され得、そ
して特定の細胞もしくは組織において、同一、類似もしくは相補的ＤＮＡまたは
ＲＮＡを増幅し、確認し、もしくはその存在を示すために用いられる。オリゴヌ
クレオチドは、約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔの長さ、好ましくは約
１５ｎｔ〜３０ｎｔの長さを有する核酸配列の部分を含む。１つの実施形態では
、１００ｎｔより短い長さの核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、さらに、配
列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）のいずれかの少なくとも６個連続する
ヌクレオチドまたはその相補体を含む。オリゴヌクレオチドは、化学的に合成さ
れ得、そしてプローブとして用いられ得る。
【０１１１】 別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ここ
で、ｎ＝１〜１７）のいずれかにおいて示されたヌクレオチド配列の相補体であ
る核酸分子を含む。なお別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は
、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）のいずれかにおいて示されたヌク
レオチド配列、またはこのヌクレオチド配列の一部の相補体である核酸分子を含
む。配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）のいずれかに示されたヌクレオ
チド配列に相補的である核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７
）のいずれかに示されたヌクレオチド配列に十分に相補的である核酸分子であり
、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）のいずれかに示されたヌクレオチ
ド配列に対しミスマッチがほとんどまたは全くなく水素結合し得、それによって
安定な二本鎖を形成する。
【０１１２】 本明細書で使用する場合、用語「相補的」とは、核酸分子のヌクレオチド単位
間のＷａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成をいい、こ
れに対して、用語「結合」は、２つのポリペプチドまたは化合物または関連ポリ
ペプチドまたは化合物またはその組合せ間の物理的または化学的相互作用として
定義される。結合は、イオン性、非イオン性、ファンデルワールス性、疎水性相
互作用などを含む。物理的相互作用は直接的であるかまたは間接的であり得る。
間接的相互作用は、別のポリペプチドもしくは化合物を介するか、またはその効
果に起因し得る。直接的結合とは、別のポリペプチドもしくは化合物を介するか
、またはその効果に起因して生じないが、その代わり、その他の実質的な化学的
中間体がない相互作用をいう。
【０１１３】 さらに、本発明の核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）の
いずれかの核酸配列の一部のみ（例えば、プローブまたはプライマーとして使用
され得るフラグメント、あるいはＰＲＯＸの生物学的に活性な部分をコードする
フラグメント）を含み得る。本明細書中に提供されるフラグメントは、少なくと
も６個の（連続する）核酸配列または少なくとも４個の（連続する）アミノ酸配
列（それぞれ、核酸の場合には、特異的なハイブリダイゼーションを可能にし、
またはアミノ酸の場合には、エピトープの特異的な認識を可能にするのに十分な
長さ）として定義され、そして全長配列未満のせいぜいいくらかの部分である。
フラグメントは、選択された核酸配列またはアミノ酸配列の任意の連続する部分
に由来し得る。誘導体は、直接的にかまたは改変もしくは部分的置換のいずれか
によってネイティブな化合物から形成される核酸配列またはアミノ酸配列である
。アナログは、ネイティブな化合物に類似する構造を有する（しかし、同一では
ない）が、特定の成分または側鎖に関してそれとは異なる核酸配列またはアミノ
酸配列である。アナログは、合成物であり得るか、または進化的に異なる起源に
由来し得、そして野生型と比較して、類似の代謝活性または反対の代謝活性を有
し得る。
【０１１４】 誘導体およびアナログは、以下に記載のように、誘導体またはアナログが、修
飾された核酸またはアミノ酸を含む場合、全長、または全長以外のものであり得
る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体またはアナログは、種々の実施形態
において、本発明の核酸もしくはタンパク質に、同一の大きさの核酸またはアミ
ノ酸配列にわたって、または整列した配列と比較した場合（この整列は、当該分
野で公知であるコンピューター相同性プログラムによって実施される）、少なく
とも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％もの
同一性（好ましい同一性は、８０〜９９％）で実質的に相同であるか、あるいは
そのコードする核酸がストリンジェントの、中程度にストリンジェントの、また
は低いストリンジェントの条件下で上記のタンパク質をコードする配列の相補体
にハイブリダイズし得る、領域を含む分子を包含するが、これらに限定されない
。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ Ｍ
ＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３、および以下を参照のこと。例示のプログラム
は、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓ
ｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ ＵＮＩＸ（登録商標）、
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）（デフォルト設定を使用、
これは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ
．Ｍａｔｈ．、１９８１、２：４８２−４８９、これらは、その全体が参考とし
て本明細書中に援用される）を使用する）である。
【０１１５】 本明細書中で利用する場合、用語「相同な核酸配列」もしくは「相同なアミノ
酸配列」、またはその改変体とは、上記で考察したように、ヌクレオチドレベル
またはアミノ酸レベルにおける相同性によって特徴付けられる配列をいう。相同
なヌクレオチド配列は、ＰＲＯＸポリペプチドのアイソフォームをコードする配
列をコードする。アイソフォームは、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの
結果として、同一の生物の異なる組織において発現され得る。あるいは、アイソ
フォームは、異なる遺伝子によってコードされ得る。本発明において、相同なヌ
クレオチド配列は、ヒト以外の種（哺乳動物が挙げられるが、これに限定されず
、従って、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよび他
の生物が挙げられ得る）のＰＲＯＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
を含む。相同なヌクレオチド配列としてはまた、天然に生じる対立遺伝子改変体
および本明細書に記載されるヌクレオチド配列の変異体が挙げられるが、これら
に限定されない。しかし、相同なヌクレオチド配列は、ヒトＰＲＯＸタンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含まない。相同な核酸配列は、配列番号２ｎ−
１（ここで、ｎ＝１〜１７）のいずれかの保存的アミノ酸置換（以下を参照のこ
と）、およびＰＲＯＸ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
ＰＲＯＸタンパク質の生物学的活性は以下に記載されている。相同なアミノ酸配
列は、ヒトＰＲＯＸポリペプチドのアミノ酸配列をコードしない。
【０１１６】 ヒトＰＲＯＸ遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列は、他の
細胞型（例えば、他の組織由来）におけるＰＲＯＸホモログ、ならびに他の哺乳
動物由来のＰＲＯＸホモログを開示および／またはクローニングする細胞型を同
定する際の使用のために設計されるプローブおよびプライマーの作製を可能にす
る。このプローブ／プライマーは、代表的には、実質的に精製されたオリゴヌク
レオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、代表的には、配列番号２ｎ−１（
ここで、ｎ＝１〜１７）の少なくとも約１２個、約２５個、約５０個、約１００
個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個または約４
００個以上の連続するセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号２ｎ−１（こ
こで、ｎ＝１〜１７）のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；あるいは配列番号２
ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）の天然に存在する変異体の少なくとも約１２個
、約２５個、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約
３００個、約３５０個または約４００個以上の連続するセンス鎖ヌクレオチド配
列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域
を含む。
【０１１７】 ヒトＰＲＯＸヌクレオチド配列に基づくプローブは、同じまたは相同なタンパ
ク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために使用され得る。種々
の実施形態において、このプローブはさらに、プローブに付着した標識基を含み
、例えば、この標識基は放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子で
あり得る。このようなプローブは、ＰＲＯＸタンパク質を誤って発現する細胞ま
たは組織を同定するための診断試験キットの一部として、例えば、被験体由来の
細胞のサンプル中のＰＲＯＸをコードする核酸のレベルを測定すること（例えば
、ＰＲＯＸ ｍＲＮＡレベルを検出すること、またはゲノムＰＲＯＸ遺伝子が変
異しているかまたは欠失しているか否かを決定すること）によって使用され得る
。
【０１１８】 本明細書中において利用される場合、用語「ＰＲＯの生物学的に活性な部分を
有するポリペプチド」とは、本発明のポリペプチドの活性に類似するが必ずしも
同一ではない活性を示すポリペプチドをいい、用量依存性の有無に関わらず、特
定の生物学的アッセイにおいて測定されるような成熟形態を含む。「ＰＲＯの生
物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントは、ＰＲＯＸの生物学的活
性を有するポリペプチドをコードする、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１
７）の一部を単離し、ＰＲＯＸタンパク質のコードされた部分を発現させ（例え
ば、インビトロでの組換え発現によって）、そしてＰＲＯのコードされた部分の
活性を評価することによって調製され得る。
【０１１９】 （ＰＲＯＸ改変体） 本発明はさらに、遺伝コードの縮重に起因して、開示されたＰＲＯＸヌクレオ
チド配列とは異なる核酸分子を包含する。それにより、これらの核酸は、配列番
号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）に示されるヌクレオチド配列によってコー
ドされるタンパク質と同じＰＲＯＸタンパク質をコードする。別の実施形態にお
いて、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１
７）のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレ
オチド配列を有する。
【０１２０】 配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）のいずれかに示されるヒトＰＲＯ
Ｘヌクレオチド配列に加えて、ＰＲＯＸのアミノ酸配列における変化を導くＤＮ
Ａ配列多型は、集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることが、当業者によっ
て理解される。ＰＲＯＸ遺伝子中のこのような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子
のバリエーションに起因して、集団内の個体間に存在し得る。本明細書中で使用
される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＰＲＯＸタンパク質、
好ましくは哺乳動物のＰＲＯＸタンパク質をコードするオープンリーディングフ
レームを含む核酸分子をいう。このような天然の対立遺伝子のバリエーションは
、代表的には、ＰＲＯＸ遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の変動性を
生じ得る。天然の対立遺伝子バリエーションの結果であり、そしてＰＲＯＸの機
能的活性を変化させない、ＰＲＯＸ内の任意および全てのこのようなヌクレオチ
ドのバリエーションならびに得られるアミノ酸多型は、本発明の範囲内であると
意図される。 さらに、他の種からのＰＲＯＸタンパク質をコードし、そしてそれ故、配列番
号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）のいずれかのヒト配列とは異なるヌクレオ
チド配列を有する核酸分子が、本発明の範囲内に含まれることが意図される。本
発明のＰＲＯＸｃＤＮＡの天然の対立遺伝子改変体および相同体に相当する核酸
分子は、ヒトｃＤＮＡ、またはその一部分を、ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件下、標準的なハイブリダイゼーション技法によるハイブリダイゼ
ーションプローブとして用い、本明細書に開示されたヒトＰＲＯＸ核酸に対する
それらの相同性を基に単離され得る。
【０１２１】 別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、長さが少なくとも６ヌク
レオチドであり、そしてストリンジェントな条件下で、配列番号２ｎ−１（ここ
で、ｎ＝１〜１７）のいずれかのヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダ
イズする。別の実施形態では、この核酸は、長さが少なくとも１０、２５、５０
、１００、２５０、５００または７５０ヌクレオチドである。なお別の実施形態
では、本発明の単離された核酸分子はコード領域にハイブリダイズする。本明細
書で用いられる用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、そ
の条件下で、互いに少なくとも６０％相同性であるヌクレオチド配列が、代表的
には互いにハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションおよび洗浄
のための条件を記載することを意図する。
【０１２２】 相同体（すなわち、ヒト以外の種に由来するＰＲＯＸタンパク質をコードする
核酸）またはその他の関連配列（例えばパラログ）は、核酸ハイブリダイゼーシ
ョンおよびクローニングの分野において周知の方法を用い、プローブとして特定
のヒト配列のすべてまたは一部分との、低、中程度または高ストリンジェンシー
ハイブリダイゼーションにより得られ得る。
【０１２３】 本明細書で用いられる語句「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」
は、その条件下で、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが、その標
的配列にハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない条件を
いう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる状況で異なる
。より長い配列は、より短い配列より高い温度で特異的にハイブリダイズする。
一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで、特定
の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。このＴｍは、標的
配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする
（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下）温度である。標的配列は一般
に過剰で存在するので、Ｔｍでは、５０％のプローブが平衡状態で占有されてい
る。代表的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が
約１．０Ｍナトリウムイオンより少なく、代表的には約０．０１〜１．０Ｍナト
リウムイオン（またはその他の塩）、そして温度が短いプローブ、プライマーま
たはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）について少なくとも約
３０℃、そしてより長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドについ
て少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェントな条件はまた
、ホルムアミドのような、脱安定化材の添加で達成され得る。
【０１２４】 ストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、そしてＣＵＲＲＥＮＴ Ｐ
ＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗ
ｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１−６．３．６に見出さ
れ得る。好ましくは、この条件は、代表的には、互いに少なくとも約６５％、７
０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同な配列が、
互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。ストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件の非制限的な例は、６５℃における、６×ＳＳＣ、５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶ
Ｐ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌ変性
サケ精子ＤＮＡ、次いで５０℃における０．２×ＳＳＣ、０．０１％ＢＳＡ中の
１回以上の洗浄である。配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）のいずれか
の配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする本発明の単離された核
酸分子は、天然に存在する核酸分子に相当する。本明細書で用いられる「天然に
存在する」核酸分子は、天然にある（例えば、天然のタンパク質をコードする）
ヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子をいう。
【０１２５】 第２の実施形態では、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）のいずれか
のヌクレオチド配列、またはそのフラグメント、アナログまたは誘導体に、中程
度のストリンジェンシーの条件下で、ハイブリダイズ可能である核酸配列が提供
される。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非制限的な
例は、５５℃における、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．５％
ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中のハイブリダイゼーション
、次いで３７℃における１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中における１回以上の洗浄
である。用いられ得る中程度のストリンジェンシーのその他の条件は、当該分野
で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９３、ＣＵＲＲＥＮＴ
ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ、およびＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０、ＧＥＮＥ
ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ
ＭＡＮＵＡＬ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照のこと。
【０１２６】 第３の実施形態では、低ストリンジェンシーの条件下で、配列番号２ｎ−１（
ここで、ｎ＝１〜１７）のいずれかのヌクレオチド配列、またはそのフラグメン
ト、アナログまたは誘導体にハイブリダイズ可能である核酸が提供される。低ス
トリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非制限的な例は、４０℃におけ
る、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２
％ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）硫酸
デキストラン中のハイブリダイゼーション、次いで５０℃における２×ＳＳＣ、
２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．１
％ＳＤＳ中の１回以上の洗浄である。用いられ得る（例えば、クロススピーシー
ズハイブリダイゼーション）低ストリンジェンシーのその他の条件は当該分野で
周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９３、ＣＵＲＲＥＮＴ Ｐ
ＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗ
ｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ、およびＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０、ＧＥＮＥ Ｔ
ＲＡＮＳＦＥＲ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ
ＭＡＮＵＡＬ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉ
ｎｂｅｒｇ、１９８１、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８
：６７８９−６７９２を参照のこと。
【０１２７】 （保存的変異） 集団中に存在し得るＰＲＯＸ配列の天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて
、当業者は、変化が、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）のいずれかの
ヌクレオチド配列中に変異により導入され得、それによってＰＲＯＸタンパク質
の機能的能力を改変することなく、コードされたＰＲＯＸタンパク質のアミノ酸
中の変化に至ることをさらに認識する。例えば、「非必須」アミノ酸残基におけ
るアミノ酸置換に至るヌクレオチド置換が、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１
〜１７）のいずれかの配列中に作成され得る。「非必須」アミノ酸残基は、生物
学的活性を改変することなく、ＰＲＯＸの野生型配列から改変され得る残基であ
り、ここで「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要である。例えば、本発
明のＰＲＯＸタンパク質間で保存されているアミノ酸残基は、特に改変されにく
いことが予測される。
【０１２８】 ＰＲＯＸタンパク質のファミリーメンバー間で保存されているアミノ酸残基は
、変更に対して特に扱いにくいことが予測される。例えば、本発明に記載のＰＲ
ＯＸタンパク質は、ＰＲＯＸファミリーメンバーにおいて代表的に保存されてい
る少なくとも１つのドメインを含み得る。このようなものとして、これらの保存
性ドメインは、変異に対しておそらく扱いにくい。しかし、他のアミノ酸残基（
例えば、ＰＲＯＸファミリーのメンバー間で保存性でないか、または半保存性で
しかない残基）は、活性に必須でないかもしれないし、従って、変更に対してお
そらく扱いにくい。
【０１２９】 本発明の別の局面は、活性に必須ではないアミノ酸残基中の変化を含むＰＲＯ
Ｘタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＰＲＯＸタンパク質は
、アミノ酸配列において、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）のいずれ
かとは異なり、なお生物学的活性を保持する。１つの実施形態では、単離された
核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このタ
ンパク質は、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）のいずれかのアミノ酸
配列に少なくとも約７５％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、この核
酸分子によりコードされるタンパク質は、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜
１７）のいずれかに少なくとも約８０％相同であり、より好ましくは少なくとも
約９０％、９５％、９８％相同であり、そして最も好ましくは配列番号２ｎ−１
（ここで、ｎ＝１〜１７）に少なくとも約９９％相同である。
【０１３０】 配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）のいずれかのタンパク質に相同で
あるＰＲＯＸタンパク質をコードする単離された核酸分子は、１つ以上のアミノ
酸置換、付加または欠失がコードされたタンパク質中に導入されるように、対応
するヌクレオチド配列（すなわち、対応するｎについて、配列番号２ｎ−１）中
に１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することにより作成され
得る。
【０１３１】 変異は、標準的な技法、例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘
発により、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）中に導入され得る。好ま
しくは、保存的アミノ酸置換は、１つ以上の予測された非必須アミノ酸残基にお
いて作成される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有
するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基の
ファミリーは当該分野で規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖も
つアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖もつアミノ
酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖もつアミノ酸（
例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン
、システイン）、非極性側鎖もつアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシ
ン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン
）、β分岐側鎖もつアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、
および芳香族側鎖もつアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプ
トファン、ヒスチジン）を含む。従って、ＰＲＯＸ中の予測された非必須アミノ
酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換される。あるいは
、別の実施形態では、変異は、ＰＲＯＸコード配列のすべてまたは一部分に沿っ
て、例えば、飽和変異誘発によりランダムに導入され得、そして得られる変異体
をＰＲＯＸ生物学的活性についてスクリーニングされ、活性を保持する変異体を
同定し得る。配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）の変異誘発の後、コー
ドされたタンパク質は、当該分野で公知の任意の組換え技法により発現され得、
そしてタンパク質の活性が測定され得る。
【０１３２】 １つの実施形態では、変異体ＰＲＯＸタンパク質は、（ｉ）他のＰＲＯＸタン
パク質、他の細胞表面タンパク質、またはその生物学的に活性な部分とタンパク
質：タンパク質相互作用を形成する能力、（ｉｉ）変異体ＰＲＯＸタンパク質と
ＰＲＯＸリガンドとの間の複合体形成；（ｉｉｉ）細胞内標的タンパク質または
その生物学的に活性な部分に結合する変異体ＰＲＯＸタンパク質の能力；（例え
ばアビジンタンパク質）；（ｉｖ）ＢＲＡタンパク質を結合する能力；または（
ｖ）抗ＰＲＯＸタンパク質抗体を特異的に結合する能力についてアッセイされ得
る。
【０１３３】 （アンチセンス核酸） 本発明の別の局面は、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）の核酸分子
、またはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体にハイブリダイズし得るか
または相補的である単離されたアンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス
」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的であるヌクレオチド
配列、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるか、またはｍＲＮ
Ａ配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。特定の局面では、ＰＲＯＸコー
ド鎖全体の少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０または５００ヌクレ
オチドに相補的、またはその一部分にのみ相補的な配列を含むアンチセンス核酸
分子が提供される。配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）のいずれかのＰ
ＲＯＸタンパク質のフラグメント、相補体、誘導体およびアナログをコードする
核酸分子、または配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）のＰＲＯＸ核酸配
列に相補的なアンチセンス核酸がさらに提供される。
【０１３４】 １つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＰＲＯＸをコードするヌクレ
オチド配列のコード鎖の「コード領域」に対するアンチセンスである。用語「コ
ード領域」は、アミノ酸残基（例えば、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１
７）のいずれかに対応するヒトＰＲＯＸのタンパク質コード領域）に翻訳される
コドンを含むヌクレオチド配列の領域をいう。別の実施形態では、このアンチセ
ンス核酸分子は、ＰＲＯＸをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コー
ド領域」に対するアンチセンスである。用語「非コード領域」は、アミノ酸に翻
訳されない、コード領域に隣接する５’および３’配列をいう（すなわち、５’
および３’非翻訳領域ともいう）。
【０１３５】 本明細書に開示されるＰＲＯＸをコードするコード鎖配列（例えば、配列番号
２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７））が与えられれば、本発明のアンチセンス核
酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対合の規則
に従って設計され得る。このアンチセンス核酸分子は、ＰＲＯＸｍＲＮＡの全コ
ード領域に相補的であり得るが、より好ましくは、ＰＲＯＸｍＲＮＡのコードま
たは非コード領域の一部分に対してのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチド
である。例えば、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＲＯＸｍＲＮＡの
翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオ
チドは、例えば、長さが約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４
５または５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野
で公知の手順を用いる化学的合成または酵素的連結を用いて構築され得る。例え
ば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に
存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増大するため、もしくは
アンチセンスとセンス核酸との間に形成される二本鎖の物理的安定性を増大する
ために設計された種々に改変されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート
誘導体およびアクリジン置換されたヌクレオチドが用いられ得る）を用いて化学
的に合成され得る。
【０１３６】 アンチセンス核酸を生成するために用いられ得る改変されたヌクレオチドの例
は：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨ
ードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カ
ルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−
２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラ
シル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニ
ン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２
−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシト
シン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル
、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン
、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチ
ルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ヴ
ィブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎ）、プソイドウラシル、ケオシン（ｑ
ｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チ
オウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢
酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウ
ラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａ
ｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む。あるいは、このアンチセン
ス核酸は、核酸がアンチセンス方向にサブクローン化された発現ベクターを用い
て生物学的に産生され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは
、以下のサブセクションでさらに記載されるように、目的の標的核酸に対してア
ンチセンス配向である）。
【０１３７】 代表的には、本発明のアンチセンス核酸分子は、それらがＰＲＯＸタンパク質
をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか
、またはそれに結合するように被検体に投与されるか、またはインサイチュ（ｉ
ｎ ｓｉｔｕ）で生成され、それによって、例えば、転写および／または翻訳を
阻害することによりタンパク質の発現を阻害する。このハイブリダイゼーション
は、従来のヌクレオチド相補性により、安定な二本鎖を形成するか、または、例
えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重らせんの主溝
における特異的相互作用を通じてであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の
投与の経路の例は、組織部位における直接注入を含む。あるいは、アンチセンス
核酸分子は、改変されて、選択された細胞を標的にし、次いで全身的に投与され
る。例えば、全身投与には、アンチセンス分子は、それらが選択された細胞表面
上に発現されたレセプターまたは抗原に特異的に結合するように改変され得る。
例えば、これは、このアンチセンス核酸分子を、細胞表面レセプターまたは抗原
に結合するペプチドまたは抗体に連結することによる。このアンチセンス核酸分
子はまた、本明細書に記載のベクターを用いて細胞に送達され得る。アンチセン
ス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐ
ｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御下に配置されるベクター構築物
が好適である。
【０１３８】 なお別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子は、αアノマー核酸分
子である。αアノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッド
を形成し、そこでは、通常のβユニットとは反対に、鎖は互いに平行に走る（Ｇ
ａｕｌｔｉｅｒら、（１９８７）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １５：６６２５
−６６４１）。このアンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレ
オチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５：６１
３１−６１４８）、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら、（１
９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ２１５：３２７−３３０）を含み得る。
【０１３９】 （リボザイムおよびＰＮＡ部分） このような改変は、非制限的な例として、改変された塩基、および糖リン酸骨
格が改変または誘導体化されている核酸を含む。これらの改変は、少なくとも一
部分、改変された核酸の化学的安定性を、それらが、例えば、被験体における治
療的適用にアンチセンス結合性核酸として用いられ得るように増大するために実
施される。
【０１４０】 なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸は、リボザイムである
。リボザイムは、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子であり、一本
鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）（リボザイムは、これらに対して相補的な領域を有
する）を切断し得る。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム
（ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４
：５８５−５９１に記載される））を使用して、ＰＲＯＸ ｍＲＮＡ転写物を触
媒的に切断し得、それによって、ＰＲＯＸ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。ＰＲＯ
Ｘコード核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示される、
ＰＲＯＸ ＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号２ｎ−１（ここで、
ｎ＝１〜１７））に基づいて設計され得る。例えば、活性部位のヌクレオチド配
列がＰＲＯＸコードｍＲＮＡにおいて切断されるヌクレオチド配列に相補的であ
る、テトラヒメナＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体が構築され得る。例えば、
Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら、米国特許第
５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいは、ＰＲＯＸ ｍＲＮＡを使用して
、ＲＮＡ分子のプールからの特定のリボヌクレアーセ活性を有する触媒性ＲＮＡ
を選択し得る（Ｂａｒｔｅｌら、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１
１−１４１８）。
【０１４１】 あるいは、ＰＲＯＸ遺伝子発現は、ＰＲＯＸ核酸（例えば、ＰＲＯＸプロモー
ターおよび／またはエンハンサー）の調節領域に相補的なヌクレオチド配列を標
的化することによって阻害され、標的細胞中のＰＲＯＸ遺伝子の転写を妨げる三
重らせん構造を形成し得る。例えば、Ｈｅｌｅｎｅ（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎ
ｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．６：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅら、（１９９２）
Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；およびＭａｈｅｒ（
１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ１４：８０７−１５を参照のこと。
【０１４２】 種々の実施形態において、ＰＲＯＸの核酸は、塩基部分、糖部分またはリン酸
骨格で改変され、例えば、その分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは可
溶性を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を改変して、ペ
プチド核酸を生成し得る（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ．Ｃ
ｈｅｍ．４：５〜２３を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「ペ
プチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド骨
格によって置換され、そして４つの天然の核塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）のみ
が保持されている核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの中性の
骨格は、低いイオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリ
ダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、
上記のＨｙｒｕｐら（１９９６）；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１４６７０〜１４６６
７５において記載されるような標準的固相ペプチド合成プロトコルを用いて行わ
れ得る。
【０１４３】 ＰＲＯＸのＰＮＡは、治療的適用および診断的適用において使用され得る。例
えば、ＰＮＡは、例えば転写もしくは翻訳の停止を誘導することまたは複製を阻
害することによる、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗
遺伝子剤として使用され得る。ＰＲＯＸのＰＮＡはまた、例えばＰＮＡ指向性Ｐ
ＣＲクランピングによる遺伝子における一塩基対変異の分析において；他の酵素
（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合の人工制限酵素と
して（Ｈｙｒｕｐ（１９９６）上記を参照のこと）；またはＤＮＡ配列およびハ
イブリダイゼーションのプローブもしくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐら（１
９９６）；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ（１９９６）、上記を参照のこと）、使
用され得る。
【０１４４】 別の実施形態において、ＰＲＯＸのＰＮＡは、例えば、それらの安定性または
細胞性取り込みを増強するために、ＰＮＡに親油性基または他のヘルパー基を結
合することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソーム
もしくは当該分野において公知の薬物送達の他の技術の使用によって改変され得
る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組合せ得る、ＰＲＯＸのＰＮＡ
−ＤＮＡキメラが生成され得る。ＰＮＡ部分が高い結合親和性および特異性を提
供する一方で、そのようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ
およびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用するのを可能にする。ＰＮ
Ａ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、核塩基間の結合数および方向を考慮
して選択される適切な長さのリンカーを使用して連結され得る（Ｈｙｒｕｐ（１
９９６）上記を参照のこと）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｆｉｎｎら（１
９９６Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：３３５７〜３３６３）において記
載されるように行われ得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホルアミダイト
カップリング化学を用いて固体支持体上で合成され得、そして改変されたヌクレ
オシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオ
キシ−チミジンホスホルアミダイト）が、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間に使
用され得る（Ｍａｇら（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７：５９７
３〜５９８８）。次いで、ＰＮＡモノマーが段階様式でカップリングされ、５’
ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（
Ｆｉｎｎら（１９９６）上記を参照のこと）。あるいは、５’ＤＮＡセグメント
および３’ＰＮＡセグメントを用いて、キメラ分子が合成され得る。例えば、Ｐ
ｅｔｅｒｓｅｎら（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５
：１１１９〜１１１２４を参照のこと。
【０１４５】 他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下のような他の付属の基を
含み得る：ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため
）、または細胞膜を横切る輸送を容易にする因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ
ら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６
５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を
参照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３
４を参照のこと）。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘
発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：
９５８〜９７６を参照のこと）、またはインターカレーター剤（例えば、Ｚｏｎ
，１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと）で改変さ
れ得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチ
ド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発
切断剤など）に結合され得る。
【０１４６】 （ＰＲＯＸポリペプチドの特徴付け） 本発明のＰＲＯＸポリペプチドは、その配列が配列番号２ｎ（ここで、ｎ＝１
〜１７）であって、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、
２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および／または３４を含む配列番
号のいずれかに提供されるＰＲＯＸポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプ
チドを含む。本発明はまた、なおそのＰＲＯＸ活性および生理学的機能を維持す
るタンパク質、またはその機能的フラグメントをコードするが、その任意の残基
が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４
、２６、２８、３０、３２、および／または３４に示される対応する残基から変
化し得る、変異体または改変体タンパク質を含む。
【０１４７】 一般に、ＰＲＯＸ様機能を保持するＰＲＯＸ改変体は、配列中の特定位置の残
基が他のアミノ酸により置換される改変体を含み、そしてさらに、親タンパク質
の２つの残基間にさらなる残基を挿入する可能性、および親配列から１つ以上の
残基を欠失する可能性を含む。任意のアミノ酸置換、挿入または欠失が、本発明
に包含される。好適な状況では、この置換は、上記で定義されるような保存的置
換である。
【０１４８】 本発明の１つの局面は、単離されたＰＲＯＸタンパク質、およびその生物学的
に活性な部分、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに
関する。抗ＰＲＯＸ抗体を惹起するための免疫原としての使用に適するポリペプ
チドフラグメントもまた提供される。１つの実施形態では、ネイティブなＰＲＯ
Ｘタンパク質が、標準的なタンパク質精製技法を用いる適切な精製スキームによ
り、細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態では、ＰＲＯＸタン
パク質は、組換えＤＮＡ技法により生産される。組換え発現の代替えとして、Ｐ
ＲＯＸタンパク質またはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技法を用いて化
学的に合成され得る。
【０１４９】 「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはタンパク質またはそ
の生物学的に活性な部分は、ＰＲＯＸタンパク質の由来する細胞または組織供給
源由来の細胞性物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは
化学合成される場合に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語
「細胞性物質を実質的に含まない」は、ＰＲＯＸタンパク質が単離または組換え
産生される細胞の細胞性成分から、ＰＲＯＸタンパク質が分離されている、ＰＲ
ＯＸタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、用語「細胞性物質を
実質的に含まない」は、非ＰＲＯＸタンパク質（本明細書中において「夾雑タン
パク質」とも呼ばれる）を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは非Ｐ
ＲＯＸタンパク質を約２０％未満、なおより好ましくは非ＰＲＯＸタンパク質を
約１０％未満、そして最も好ましくは非ＰＲＯＸタンパク質を約５％未満有する
、ＰＲＯＸタンパク質の調製物を含む。ＰＲＯＸタンパク質またはその生物学的
に活性な部分が組換え産生される場合、好ましくは、調製物はまた培養培地を実
質的に含まない。すなわち、培養培地は、ＰＲＯＸタンパク質調製物の容量の約
２０％未満、より好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは約５％未満を
示す。
【０１５０】 本明細書中で使用する場合に、用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的
に含まない」は、タンパク質が、そのタンパク質の合成に関与する化学前駆体ま
たは他の化学物質から分離されているＰＲＯＸタンパク質の調製物を含む。１つ
の実施形態において、用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない
」は、化学前駆体または非ＰＲＯＸの化学物質を約３０％未満（乾燥重量にて）
、より好ましくは化学前駆体または非ＰＲＯＸ化学物質を約２０％未満、なおよ
り好ましくは化学前駆体または非ＰＲＯＸ化学物質を約１０％未満、そして最も
好ましくは化学前駆体または非ＰＲＯＸ化学物質を約５％未満有する、ＰＲＯＸ
タンパク質の調製物を含む。
【０１５１】 ＰＲＯＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＰＲＯＸタンパク質より
少ないアミノ酸を含み、そしてＰＲＯＸタンパク質の少なくとも１つの活性を示
す、ＰＲＯＸタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列、またはＰ
ＲＯＸタンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む
。代表的には、生物学的に活性な部分は、ＰＲＯＸタンパク質の少なくとも１つ
の活性を有するドメインまたはモチーフを含む。ＰＲＯＸタンパク質の生物学的
に活性な部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００またはそれより多い
アミノ酸であるポリペプチドであり得る。
【０１５２】 本発明のＰＲＯＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、上記の同定された保
存されるドメインの少なくとも１つを含み得る。さらに、タンパク質の他の領域
が欠失している他の生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製され得、
そしてネイティブなＰＲＯＸタンパク質の機能的活性のうちの１つ以上について
評価され得る。
【０１５３】 １つの実施形態において、ＰＲＯＸタンパク質は、配列番号２ｎ（ここで、ｎ
＝１〜１７）のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態におい
て、ＰＲＯＸタンパク質は、配列番号２ｎ（ここで、ｎ＝１〜１７）に実質的に
相同であり、そして以下に詳細に議論されるように、天然の対立遺伝子改変また
は変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なるが、配列番号２ｎ（ここで、ｎ＝１
〜１７）のタンパク質の機能的活性を保持する。従って、別の実施形態において
、ＰＲＯＸタンパク質は、配列番号２ｎ（ここで、ｎ＝１〜１７）のアミノ酸配
列に少なくとも約４５％、そしてより好ましくは、約５５％、６５％、７０％、
７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％さえ相同なアミ
ノ酸配列を含み、そして、配列番号２ｎ（ここで、ｎ＝１〜１７）を有する対応
するポリペプチドのＰＲＯＸタンパク質の機能的活性を保持するタンパク質であ
る。
【０１５４】 （２つ以上の配列間の相同性の決定） ２つのアミノ酸配列または２つの核酸の相同性の百分率を決定するために、配
列は、至適な比較の目的のために整列される（例えば、第２のアミノ酸または核
酸の配列との最適な整列のために、ギャップが、第１のアミノ酸または核酸配列
の配列に導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位
置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が、
第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められ
る場合、分子はその位置で相同である（すなわち、本明細書中で使用される場合
、アミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と等価
である）。
【０１５５】 核酸配列の相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定され得る。相同
性は、当該分野において公知のコンピュータープログラム（例えば、ＧＣＧプロ
グラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェア）を用いて決定され得
る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ １９７０．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．４８：４４３〜４５３を参照のこと。核酸配列比較のための以下の設定（ＧＡ
Ｐ作製ペナルティー、５．０、およびＧＡＰ伸長ペナルティー、０．３）を用い
てＧＣＧ ＧＡＰソフトウェアを使用すると、上記で言及される類似の核酸配列
のコード領域は、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）、例えば、配列番
号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２
７、２９、３１、３３、３５、および／または３７に示されるＤＮＡ配列のＣＤ
Ｓ（コード）部分と、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なく
とも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なく
とも９８％または少なくとも９９％の同一性の程度を示す。
【０１５６】 用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列
が、特定の比較領域にわたって、残基毎を基準として同一である程度をいう。用
語「配列同一性のパーセンテージ」は、以下により算出される：この比較領域に
わたって最適に整列された２つの配列を比較すること、両方の配列において同一
の核酸塩基（例えば、核酸の場合にはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が存在す
る位置の数を決定し、一致した位置の数を導くこと、この一致した位置の数を、
比較領域の内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算すること、お
よびその結果を１００で乗算して、配列同一性のパーセンテージを導くこと。用
語「実質的な同一性」は、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド配列
の特徴を示し、ここでこのポリヌクレオチドは、比較領域にわたり参照配列と比
較して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同
一性、そして頻繁には９０〜９５％の配列同一性、より通常には少なくとも９９
％の配列同一性を有する配列を含む。
【０１５７】 （キメラタンパク質および融合タンパク質） 本発明はまた、ＰＲＯＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。
本明細書中で使用される場合、ＰＲＯＸ「キメラタンパク質」またはＰＲＯＸ「
融合タンパク質」は、非ＰＲＯＸポリペプチドに作動可能に連結された、ＰＲＯ
Ｘポリペプチドを含む。「ＰＲＯＸポリペプチド」は、配列番号２ｎ（ここで、
ｎ＝１〜１７）［例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、
１８、２０、２２、２４２６、２８、３０、３２、および／または３４］に示す
ＰＲＯＸタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうが、「
非ＰＲＯＸポリペプチド」は、ＰＲＯＸタンパク質に対して実質的に相同ではな
いタンパク質（例えば、ＰＲＯＸタンパク質とは異なり、かつ同一でかまたは異
なる生物体に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをいう。ＰＲＯＸ融合タンパク質において、このＰＲＯＸポリペプチドは、Ｐ
ＲＯＸタンパク質のすべてまたは一部分に対応し得る。１つの実施形態では、Ｐ
ＲＯＸ融合タンパク質は、ＰＲＯＸタンパク質の少なくとも１つの生物学的に活
性な部分を含む。別の実施形態では、ＰＲＯＸ融合タンパク質は、ＰＲＯＸタン
パク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。なお別の実施形態では
、ＰＲＯＸ融合タンパク質は、ＰＲＯＸタンパク質の少なくとも３つの生物学的
に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結された」
は、ＰＲＯＸポリペプチドおよび非ＰＲＯＸポリペプチドが、インフレームで互
いに融合されていることを示すことが意図される。非ＰＲＯＸポリペプチドは、
ＰＲＯＸポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に融合され得る。
【０１５８】 １つの実施形態においては、この融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＰＲＯＸ融合タ
ンパク質であり、ここではＰＲＯＸ配列が、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランス
フェラーゼ）配列のカルボキシル末端に融合される。このような融合タンパク質
は、組換えＰＲＯＸポリペプチドの精製を容易にし得る。
【０１５９】 別の実施形態では、この融合タンパク質は、そのアミノ末端に異種シグナル配
列を含むＰＲＯＸタンパク質である。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細
胞）では、ＰＲＯＸの発現および/または分泌を、異種シグナル配列の使用を通
して増加させ得る。
【０１６０】 なお別の実施形態においては、この融合タンパク質は、ＰＲＯＸ−免疫グロブ
リン融合タンパク質であり、ここで、ＰＲＯＸ配列が、免疫グロブリンタンパク
質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合される。本発明のこのＰＲＯＸ−
免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物中に取り込まれ、そして被験体
に投与されて、細胞の表面上でＰＲＯＸリガントとＰＲＯＸタンパク質との間の
相互作用を阻害し、それによってインビボのＰＲＯＸ媒介信号伝達を抑制し得る
。このＰＲＯＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を用い、ＰＲＯＸ同族リガンド
の生体利用性に影響を与え得る。ＰＲＯＸリガンド／ＰＲＯＸ相互作用の阻害は
、増殖障害および分化障害の処置、ならびに細胞生存を調節（例えば、促進また
は阻害）することの両方に、治療的に有用であり得る。さらに、本発明のこのＰ
ＲＯＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、被験体中で抗ＰＲＯＸ抗体を産生す
るための免疫原として、ＰＲＯＸリガンドを精製するため、およびＰＲＯＸリガ
ンドとのＰＲＯＸの相互作用を阻害する分子を同定するスクリーニングアッセイ
で用いられ得る。
【０１６１】 本発明のＰＲＯＸキメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技法
により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラ
グメントを、従来の技法に従って、例えば、連結のための平滑末端または粘着（
ｓｔａｇｇｅｒ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じ
て粘着（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端のフィルイン、所望しない連結を避けるための
アルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を採用することにより、インフ
レームで一緒に連結する。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成
機を含む従来技法により合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増
幅を、キメラ遺伝子配列を生成するために次いでアニールおよび再増幅され得る
、２つの連続遺伝子フラグメント間の相補的オーバハングを生じるアンカープラ
イマーを用いて実施し得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ
ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合成分（例えば、
ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードした多くの発現ベクターが市販されている
。ＰＲＯＸをコードする核酸は、この融合部分がＰＲＯＸタンパク質にインフレ
ーム連結されるように、このような発現ベクター中にクローン化され得る。
【０１６２】 （ＰＲＯＸアゴニストおよびアンタゴニスト） 本発明はまた、ＰＲＯＸアゴニスト（模倣物）として、またはＰＲＯＸアンタ
ゴニストとしてのいずれかで機能するＰＲＯＸタンパク質の改変体に関する。Ｐ
ＲＯＸタンパク質の改変体が、変異誘発（例えば、ＰＲＯＸタンパク質の離散し
た点変異または短縮）により生成され得る。ＰＲＯＸタンパク質のアゴニストは
、天然に存在する形態のＰＲＯＸタンパク質と実質的に同じ生物学的活性、また
はその生物学的活性のサブセットを保持し得る。ＰＲＯＸタンパク質のアンタゴ
ニストは、天然に存在する形態のＰＲＯＸタンパク質の１つ以上の活性を、例え
ば、ＰＲＯＸタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流メ
ンバーに競合的に結合することにより阻害し得る。従って、特異的生物学的効果
が、限られた機能の改変体を用いた処理により惹起され得る。１つの実施形態で
は、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学活性のサブセットを有する改
変体を用いた被験体の処置は、ＰＲＯＸタンパク質の天然に存在する形態を用い
た処置に対して被験体におけるより少ない副作用を有する。
【０１６３】 ＰＲＯＸアゴニスト（模倣物）として、またはＰＲＯＸアンタゴニストのいず
れかとして機能するＰＲＯＸタンパク質の改変体は、ＰＲＯＸタンパク質アゴニ
ストまたはアンタゴニスト活性について、ＰＲＯＸタンパク質の変異体（例えば
短縮型変異体）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによ
り同定され得る。１つの実施形態では、ＰＲＯＸ改変体の多彩なライブラリーは
、核酸レベルのコンビナトリアル変異誘発により生成され、そして多彩な遺伝子
ライブラリーによりコードされる。ＰＲＯＸ改変体の多彩なライブラリーは、例
えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、潜在的なＰＲＯＸ配列の縮重セット
が、個々のポリペプチドとして、ＰＲＯＸ配列のセットを含む（例えば、ファー
ジディスプレイのための）より大きな融合タンパク質のセットとして発現可能で
あるように、遺伝子配列に酵素的に連結することにより産生され得る。縮重オリ
ゴヌクレオチド配列から潜在的なＰＲＯＸ改変体のライブラリーを産生するため
に用いられ得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動化ＤＮＡ
合成機中で実施され得、次いでこの合成遺伝子は、適切な発現ベクター中に連結
され得る。遺伝子の縮重セットの使用は、１つの混合物において、潜在的なＰＲ
ＯＸ配列の所望のセットをコードする配列のすべての供給を可能にする。縮重オ
リゴヌクレオチドを合成する方法は当該分野で周知である。例えば、Ｎａｒａｎ
ｇ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８
４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１
９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと。
【０１６４】 （ポリペプチドライブラリー） さらに、ＰＲＯＸタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーを用い
て、ＰＲＯＸタンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のための
ＰＲＯＸフラグメントの多彩な集団を生成し得る。１つの実施形態では、コード
配列フラグメントのライブラリーは、ＰＲＯＸコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグ
メントを、１分子あたり約１つのみのニックが生じる条件下で、ヌクレアーゼで
処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、異なるニック産物からのセンス
／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成するためにこのＤＮＡを再生す
ること、Ｓ1ヌクレアーゼを用いた処理により再形成された二本鎖から一本鎖部
分を除去すること、および得られるフラグメントライブラリーを発現ベクター中
に連結することにより生成し得る。この方法により、ＰＲＯＸタンパク質の種々
のサイズのアミノ末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーが
得られ得る。
【０１６５】 点変異または短縮により作成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産
物をスクリーニングするため、選択された性質を有する遺伝子産物のｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技法が当該分野で公知である
。このような技法を、ＰＲＯＸタンパク質のコンビナトリアル変異誘発により生
成された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用可能である。大きな遺
伝子ライブラリーをスクリーニングするための、高スループット分析に適した最
も広く用いられる技法は、代表的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベ
クター中にクローニングすること、得られるベクターのライブラリーで適切な細
胞を形質転換すること、およびこのコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検
出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条
件下で発現することを含む。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増大する新
規技法であるリクルーシブエンセブル変異誘発（ＲＥＭ）を、スクリーニングア
ッセイと組み合わせて用い、ＰＲＯＸ改変体を同定し得る（ＡｒｋｉｎおよびＹ
ｏｕｒｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ
ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６：３２７−３３１）。
【０１６６】 （抗ＰＲＯＸ抗体） 本発明は、本発明のＰＲＯＸポリペプチドのいずれかに免疫特異的に結合する
抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆabまたは（Ｆab）2）を含む。
【０１６７】 単離されたＰＲＯＸタンパク質、その部分またはフラグメントを、ポリクロー
ナル抗体およびモノクローナル抗体調製のために標準技術を使用してＰＲＯＸポ
リペプチドに結合する抗体を産生するための免疫原として使用され得る。全長Ｐ
ＲＯＸタンパク質が使用され得るか、あるいは本発明は、免疫原として使用する
ためのＰＲＯＸタンパク質の抗原の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗
原性ＰＲＯＸペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ｎ（ここで、ｎ＝１〜１７）
に示されるアミノ酸配列の少なくとも４アミノ酸残基を含み、そしてＰＲＯＸの
エピトープを含み、その結果このペプチドに対して惹起された抗体は、ＰＲＯと
特定の免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも６、
８、１０、１５、２０または３０アミノ酸残基を含む。より長い抗原性ペプチド
は、使用に依存してそして当業者に周知の方法に従って、時々、より短い抗原性
ペプチドよりも好ましい。
【０１６８】 本発明の特定の実施形態では、抗原性ペプチドにより包含される少なくとも１
つのエピトープは、タンパク質の表面上に位置するＰＲＯＸの領域（例えば、親
水性領域）である。抗体産生を標的化する手段として、親水性および疎水性の領
域を示すヒドロパシープロットを、例えば、フーリエ変換と共にまたは無しで、
Ｋｙｔｅ ＤｏｏｌｉｔｔｌｅまたはＨｏｐｐ Ｗｏｏｄｓ法を含む、当該分野
で周知の任意の方法により作製し得る（例えば、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１
９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：３８２４−３８
２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ １９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
１５７：１０５−１４２（それぞれ、それらの全体が本明細書に参考として援用
される）を参照のこと）。
【０１６９】 本明細書中に開示されるように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ｎ（ここで、ｎ＝１
〜１７）のＰＲＯＸタンパク質配列、またはその誘導体、フラグメント、アナロ
グもしくはホモログは、これらのタンパク質化合物に免疫特異的に結合する抗体
の産生における免疫原として使用され得る。本願明細書において用いられる場合
、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に
活性な部分（すなわち、抗原に特異的に結合する（これと免疫反応する）抗原結
合部位を含む分子）（例えばＰＲＯ）をいう。このような抗体としては、ポリク
ローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、ＦabおよびＦ(ab')2フラグメント、
ならびにＦab発現ライブラリーが挙げられるがこれらに限定されない。特定の実
施形態において、ヒトＰＲＯＸタンパク質に対する抗体が、開示される。当該分
野で公知の種々の手順が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ｎ（ここで、ｎ＝１〜１７）
のＰＲＯＸタンパク質配列、あるいはそれらの誘導体、フラグメント、アナログ
またはホモログに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の生産の
ために用いられ得る。これらのタンパク質のうちいくつかは、上記で議論されて
いる。
【０１７０】 ポリクロナール抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ
、ヤギ、マウスまたは他の動物）は、ネイティブなタンパク質、その合成改変体
、または前記の誘導体を用いる注射によって免疫され得る。適切な免疫原性調製
物は、例えば、組換え的に発現されたＰＲＯＸタンパク質または化学的に合成さ
れたＰＲＯＸポリペプチドを含み得る。この調製物はさらに、アジュバントを含
み得る。種々のアジュバントが免疫学的応答を増加させるために使用され、この
ようなアジュバントとしては、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ（完全および不完全）、ミネラ
ルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン
、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油
乳濁液、ジニトロフェノールなど）、ヒトアジュバント（例えば、Ｂａｃｉｌｌ
ｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｐａｒｖｕｍ）または類似の免疫刺激剤が挙げられるが、これらに限定されない
。所望の場合、ＰＲＯＸに対する抗体分子が、哺乳動物から（例えば、血液から
）単離され得、そしてさらに、プロテインＡクロマトグラフィーのような周知の
技術によって精製され、ＩｇＧ画分を入手し得る。
【０１７１】 本明細書において用いられる場合、用語「モノクローナル抗体」または「モノ
クローナル抗体組成物」とは、ＰＲＯの特定のエピトープと免疫反応し得る抗原
結合部位の１つの種のみを含む抗体分子の集団をいう。従って、モノクローナル
抗体組成物は、代表的には、特に、それが免疫反応する特定のＰＲＯＸタンパク
質に対して、単一の結合親和性を示す。特にＰＲＯＸタンパク質、またはその誘
導体、フラグメント、アナログ、もしくはホモログに対するモノクローナル抗体
の調製のために、連続的細胞株培養により抗体分子の生成を提供する任意の技術
が利用され得る。このような技術としては以下が挙げられるがこれらに限定され
ない：ハイブリドーマ技術（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１
９７５ Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７を参照のこと）；トリオーマ技
術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（例えば、Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２を参照のこと）およびヒトモノクローナル抗
体を生産するＥＢＶハイブリドーマ技術（例えば、Ｃｏｌｅら、１９８５ ＭＯ
ＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡ
ＰＹ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７〜９６頁を参照のこと）。ヒト
モノクローナル抗体は、本発明の実行において利用され得、そしてヒトハイブリ
ドーマを用いること（例えば、Ｃｏｔｅら、１９８３．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａ
ｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：２０２６〜２０３０を参照のこと）、またはエ
プスタインバーウイルスを用いるインビトロでのヒトＢ細胞の形質転換（例えば
、Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮ
Ｄ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７
〜９６頁を参照のこと）によって生成され得る。上記の各々は、本明細書中でそ
の全体が参考として援用される。
【０１７２】 本発明に従って、ＰＲＯＸタンパク質に特異的な単鎖抗体の生成のために、技
術は適応され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。
さらに、方法は、Ｆab発現ライブラリーの構築に適応され得（例えば、Ｈｕｓｅ
ら、１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１を参照のこと）、
ＰＲＯＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、もしくはホ
モログに対して所望の特性を有するモノクローナルＦabフラグメントの迅速かつ
効果的な同定を可能にし得る。非ヒト抗体は、当該分野で周知の技術により「ヒ
ト化」され得る。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと。ＰＲ
ＯＸタンパク質に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントは、以下を含む
がこれに限定されない当該分野で公知の技術により生成され得る：（ｉ）抗体分
子のペプシン消化によって生産されるＦ(ab')2フラグメント；（ｉｉ）Ｆ(ab')2 フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生じるＦabフラグメン
ト；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤での抗体分子の処理によって生じるＦabフ
ラグメント、ならびに（ｉｖ）Ｆvフラグメント。
【０１７３】 さらに、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含むキメラモノクローナル抗体および
ヒト化モノクローナル抗体のような、組換え抗ＰＲＯＸ抗体（これらは、標準組
換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る）は、本発明の範囲内である。このような
キメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知
の組換えＤＮＡ技術により生成され得る。この技術は例えば、以下に記載の方法
を用いる：ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；欧州特許出願番
号１８４，１８７号；欧州特許出願番号１７１，４９６；欧州特許出願番号１７
３、４９４；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ ８６／０１５３３；米国特許第４，８１
６，５６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；欧州特許出願番号１２５，０
２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１〜１０
４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８４：３４３９〜３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９
：３５２１〜３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２１４〜２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４７：９９９〜１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔ
ｕｒｅ ３１４：４４６〜４４９；Ｓｈａｗら（１９８８）Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８０：１５５３〜１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８
５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２〜１２０７；Ｏｉら（１９８６）Ｂｉｏ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎ
ｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２〜５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａ
ｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；ならびにＢｅｉｄｌｅｒ
ら（１９８８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４１：４０５３〜４０６０。上記の各々
は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０１７４】 １つの実施形態において、所望の特異性を保有する抗体のスクリーニングのた
めの方法論は、当該分野内で公知の酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ
）および他の免疫学的に媒介される技術を含むが、これに限定されない。特定の
実施形態において、ＰＲＯＸタンパク質の特定のドメインに対して特異的である
抗体の選抜は、このようなドメインを所有しているＰＲＯＸタンパク質のフラグ
メントに結合するハイブリドーマの生成により容易にされる。このように、ＰＲ
ＯＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログ
がそれについてまたの内部のドメインについて特異的である抗体がまた、本願明
細書において提供される。
【０１７５】 抗ＰＲＯＸ抗体は、ＰＲＯＸタンパク質の局在化および／または定量に関する
当該分野で公知の方法において用いられ得る（例えば、適切な生理学的なサンプ
ル内のＰＲＯＸタンパク質のレベルを測定の際の使用のために、診断的方法にお
ける使用のために、タンパク質の画像化における使用のために、など）。所定の
実施形態において、ＰＲＯＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、ア
ナログもしくはホモログの抗体（抗体由来の結合ドメインを含む）は、薬理学的
に活性な化合物（本明細書中、以降において「治療剤」）として利用される。
【０１７６】 抗ＰＲＯＸ抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、標準技術（例えば、親和
性クロマトグラフィまたは免疫沈降）によって、ＰＲＯＸを単離するために用い
られ得る。抗ＰＲＯＸ抗体は、細胞からの天然のＰＲＯＸ、そして宿主細胞にお
いて発現される組換え的に産生されたＰＲＯＸの精製を容易にし得る。さらに、
抗ＰＲＯＸ抗体が、（例えば、細胞の溶菌液または細胞上清における）ＰＲＯＸ
タンパク質を検出するために用いられ、ＰＲＯＸタンパク質の発現の量およびパ
ターンを評価し得る。抗ＰＲＯＸ抗体は、例えば、所定の処置レジメンの有効性
を決定するために、臨床試験の手順の一部として組織におけるタンパク質レベル
を診断的にモニターするために用いられ得る。検出は、抗体を検出可能物質に連
結する（すなわち、物理的に連結する）ことにより容易になり得る。検出可能物
質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質
および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキ
シダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリ
ンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプ
トアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質
の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシ
アネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉ
ａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリ
トリンが挙げられる；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発
光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げら
れる；そして、適切な放射性物質の例としては125Ｉ、131Ｉ、35Ｓまたは3Ｈが
挙げられる。
【０１７７】 （ＰＲＯＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞） 本発明の別の局面は、ＰＲＯＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント
、アナログもしくはホモログをコードする核酸を含む、ベクター、好ましくは、
発現ベクターに関する。本明細書において使用する場合、用語「ベクター」は、
それに連結された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。１つの型のベクターは
、「プラスミド」である。これはさらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状
の二本鎖ＤＮＡループをいう。他の型のベクターは、ウイルスベクターであり、
ここでさらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムに連結され得る。特定のベ
クターは、ベクターが導入される宿主細胞中で自律複製し得る（例えば、細菌性
の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソームの哺乳動物ベクター）。他
のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入
の際、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そして、これにより宿主ゲノムとともに
複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子
の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター
」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術における有用な発現ベクターは、しば
しばプラスミドの形態である。本願明細書において、「プラスミド」および「ベ
クター」は、プラスミドが最も一般的に用いられる形態のベクターであるので、
互換可能に使用され得る。しかし、本発明は、等価の機能を果たすウイルスベク
ター（例えば、複製欠損レトロウィルス、アデノウィルス、およびアデノ随伴ウ
ィルス）のような、このような他の形態の発現ベクターを含むことを意図する。
【０１７８】 本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態の
本発明の核酸を含む。これは、組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列
に作動可能に連結されている、発現に用いられるべき宿主細胞に基づいて選択さ
れる、１つ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「
作動可能に連結する」とは、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発
現を可能にする様式で調節配列に連結されるという意味を意図する（例えば、イ
ンビトロの転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合
には、宿主細胞において）。
【０１７９】 本明細書中で使用される場合、句「調節配列」は、プロモーター、エンハンサ
ーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むこ
とを意図する。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥ Ｅ
ＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹ
ＭＯＬＯＧＹ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、
ＣＡ（１９９０）に記載されている。調節配列は、多くの型の宿主細胞において
ヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列、および特定の宿主細胞のみにお
いてヌクレオチド配列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的調節配列）を
含む。発現ベクターの設計が形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパ
ク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることは当業者に理解される。
本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され得、それにより、本明細書に記載
されるような核酸によりコードされる融合タンパク質または融合ペプチドを含む
タンパク質またはペプチドを生成し得る。
【０１８０】 本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における、
ＰＲＯＸの発現のために設計され得る。例えば、ＰＲＯＸは、細菌細胞（例えば
、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベク
ターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿
主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬ
ＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５、Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）においてさ
らに考察されている。あるいは、組換え型発現ベクターは、例えば、Ｔ7プロモ
ーター調節配列およびＴ7ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳
され得る。
【０１８１】 原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、融合タンパク質または
非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性
プロモーターを含むベクターを有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおい
て実行される。融合ベクターは、そこにコードされるタンパク質に、通常、組換
えタンパク質のアミノ末端に、多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベク
ターは、代表的には、以下の３つの目的を果たす：（ｉ）組換えタンパク質の発
現を増加させること；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度を増加させること；お
よび（ｉｉｉ）親和性精製においてリガンドとして作用することによって組換え
タンパク質の精製の際に補助すること。しばしば、融合発現ベクターにおいて、
タンパク質分解の切断部位が、融合部分の結合部に導入され、そして融合タンパ
ク質の精製の後に、組換えタンパク質が組換えタンパク質の融合部分から分離さ
れることを可能にする。このような酵素、およびその同族の認識配列は、第Ｘａ
因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクター
としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合
タンパク質、またはプロテインＡを、それぞれ、標的の組換えタンパク質に融合
するｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ａ
ｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およ
びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げ
られる。
【０１８２】 適切な誘導性非融合Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ発現ベクターの例には
、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）お
よびｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ Ｔ
ＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０
）６０−８９）が挙げられる。
【０１８３】 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化す
るための１つのストラテジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断す
る能力が損なわれた宿主細菌中でタンパク質を発現させることである。例えば、
Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ
：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を
参照のこと。別のストラテジーは、各アミノ酸についての個々のコドンが、Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるコドンであるように
発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更することである（例えば、Ｗａ
ｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１−２
１１８を参照のこと）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的なＤＮＡ
合成技術によって実行され得る。
【０１８４】 別の実施形態において、ＰＲＯＸ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベ
クターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、（１９８７）ＥＭＢＯ
Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉ
ｔｚ、（１９８２）Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈ
ｕｌｔｚら、（１９８７）Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉ
ｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【０１８５】 あるいは、ＰＲＯＸは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞
中で発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でタンパク質の発現
のために利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔ
ｈら（１９８３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３：２１５６−２１６５）およ
びｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ １７０：３１−３９）が挙げられる。
【０１８６】 なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用し
て、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８
（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（
Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられ
る。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、
ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロ
モーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシ
ミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方のため
の他の適切な発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬ
ＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を参照
のこと。
【０１８７】 別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型（例え
ば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現する）中で優先的に核酸の
発現を指向し得る。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切
な組織特異的なプロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝
臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８−２
７７を参照のこと）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏ
ｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５を参照のこと）
、Ｔ細胞レセプターの特定のプロモーターにおいて（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌ
ｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９−７３３を参照のこと）お
よび免疫グロブリンの特定のプロモーターにおいて（Ｂａｎｅｒｊｉら、１９８
３．Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，
１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８を参照のこと）、ニューロン特異的
プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅおよび
Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
６：５４７３−５４７７を参照のこと）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎ
ｄら、１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６を参照のこと）、な
らびに乳腺特異的プロモーター（例えば、ミルク乳清プロモーター；米国特許第
４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。
発生的に調節されるプロモーターもまた含まれる（例えば、マウスホックス（ｍ
ｕｒｉｎｅ ｈｏｘ）プロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ，１９９０
．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロ
モーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅ
ｖ．３：５３７−５４６を参照のこと）。
【０１８８】 本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発
明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、そのＤＮＡ分
子は、ＰＲＯＸ ｍＲＮＡに対するアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮ
Ａ分子の転写によって）を可能にする様式で調節配列に作動可能に連結される。
調節配列は、種々の細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の連続的な発現を指
向する、アンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動可能に連結される調
節配列（例えば、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサー）が選択
され得るか、または例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現
、または細胞特異的発現を指向する調節配列が、選択され得る。アンチセンス発
現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化されたウイルス
の形態であり得、ここではアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生
され、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチ
センス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の議論については、Ｗｅｉｎｔｒａｕ
ｂら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏ
ｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎ
ｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１巻（１）１９８６を参照のこと。
【０１８９】 本発明の別の局面は、本発明の組換え発現べクターが導入された宿主細胞に関
する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能
に使用される。このような用語は、特定の対象の細胞をいうのみでなく、そのよ
うな細胞の子孫または潜在的な子孫をいうことが理解される。変異または環境的
影響のいずれかに起因して、特定の改変が次の世代において生じ得るので、この
ような子孫は、実際、親の細胞と同一でないかもしれないが、なお、本明細書中
で使用されるような用語の範囲内に含まれる。
【０１９０】 宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、Ｐ
ＲＯＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）
、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細
胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業
者に公知である。
【０１９１】 ベクターＤＮＡは、従来的な形質転換またはトランスフェクション技術を介し
て原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場
合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（例
えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当該分野で認識される種々の技術を
いうことを意図し、これらには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿
、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、または
エレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェク
ションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ Ｃ
ＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の実験室マニュアルに見出され
得る。
【０１９２】 安定な哺乳動物細胞のトランスフェクションのために、使用される発現ベクタ
ーおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のほんの一部のみが外来Ｄ
ＮＡをそのゲノムに組み込み得ることが知られている。これらの要素を同定およ
び選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードす
る遺伝子が、一般的には目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々の選
択マーカーには、薬物（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレ
キサート）に対する耐性を付与するものが含まれる。選択マーカーをコードする
核酸は、ＰＲＯＸをコードするベクターと同じベクター上で宿主細胞に導入され
得るか、あるいは別々のベクター上で導入され得る。導入された核酸で安定にト
ランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば、選択マ
ーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存し、一方他の細胞は死滅する）。
【０１９３】 本発明の宿主細胞（例えば、培養中の原核生物宿主細胞または真核生物宿主細
胞）は、ＰＲＯＸタンパク質を産生（すなわち、発現）するために使用され得る
。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ＰＲＯＸタンパク質
を産生するための方法を提供する。１つの実施形態において、本発明の方法は、
ＰＲＯＸタンパク質が産生されるような適切な培地中で、本発明の宿主細胞（す
なわち、ここに、ＰＲＯＸをコードする組換え発現ベクターが導入された）を培
養する工程を包含する。別の実施形態において、本発明はさらに、培地または宿
主細胞からＰＲＯＸを単離する工程を包含する。
【０１９４】 （トランスジェニック動物） 本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使
用され得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＰＲＯＸ
タンパク質コード配列が導入された、受精した卵母細胞または胚性幹細胞である
。次いで、このような宿主細胞は、外因性のＰＲＯＸ配列がそのゲノムに導入さ
れた非ヒトトランスジェニック動物、または内因性のＰＲＯＸ配列が変更された
相同組換え動物を作製するために使用され得る。このような動物は、ＰＲＯＸタ
ンパク質の機能および／または活性を研究するため、ならびにＰＲＯＸタンパク
質活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明
細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」とは、非ヒト動物であり
、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、ラットまたはマウスのような齧
歯類であり、その動物の１つ以上の細胞が、導入遺伝子を含む。トランスジェニ
ック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワト
リ、両生類などが挙げられる。
【０１９５】 導入遺伝子は、細胞（この細胞からトランスジェニック動物が発生する）のゲ
ノムに組み込まれかつ成熟動物のゲノムに残存する、外因性のＤＮＡであり、そ
れによって、トランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織においてコ
ードされた遺伝子産物の発現を指示する。本明細書中で使用される場合、「相同
組換え動物」とは、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より好まし
くはマウスであり、ここで内因性のＰＲＯＸ遺伝子は、内因性の遺伝子と、その
動物の発生の前にその動物の細胞（例えば、その動物の胚細胞）に導入された外
因性のＤＮＡ分子との間の相同組換えによって変更されている。
【０１９６】 本発明のトランスジェニック動物は、ＰＲＯＸをコードする核酸を、（例えば
、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって）受精した卵母細胞
の雄性前核に導入すること、および卵母細胞が偽妊娠した雌性養育動物（ｆｏｓ
ｔｅｒ ａｎｉｍａｌ）中で発生することを可能にすることによって作製され得
る。配列番号２ｎ−１（ここでｎ＝１〜１７である）のヒトのＰＲＯＸ ｃＤＮ
Ａ配列は、非ヒト動物のゲノムに導入遺伝子として導入され得る。あるいは、ヒ
トのＰＲＯＸ遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、マウスのＰＲＯＸ遺伝子）は、
ヒトのＰＲＯＸ ｃＤＮＡに対するハイブリダイゼーションに基づいて単離され
得（以下にさらに記載される）、そして導入遺伝子として使用され得る。イント
ロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた導入遺伝子中に含まれ得、その導
入遺伝子の発現の効率を増大させ得る。組織特異的調節配列（単数または複数）
は、特定の細胞に対して、ＰＲＯＸタンパク質の発現を指示するように、ＰＲＯ
Ｘ導入遺伝子に作動可能に連結され得る。胚の操作およびマイクロインジェクシ
ョンを介するトランスジェニック動物（特に、マウスのような動物）を生成する
ための方法は、当該分野で慣習的になっており、そして例えば、米国特許第４，
７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；および同第４，８７３，１９１
号；ならびにＨｏｇａｎ １９８６、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ ＴＨＥ ＭＯ
ＵＳＥ ＥＭＢＲＹＯ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記
載されている。同様の方法は、他のトランスジェニック動物の作製のために使用
される。トランスジェニック初代（ｆｏｕｎｄｅｒ）動物は、そのゲノムにおけ
るＰＲＯＸ導入遺伝子の存在および／またはその動物の組織または細胞中のＰＲ
ＯＸ ｍＲＮＡの発現に基づいて同定され得る。次いで、トランスジェニック初
代動物は、導入遺伝子を有するさらなる動物を繁殖させるために使用され得る。
さらに、ＰＲＯＸタンパク質をコードする導入遺伝子を有するトランスジェニッ
ク動物は、さらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物に繁殖
させ得る。
【０１９７】 相同組換え動物を作製するために、ＰＲＯＸ遺伝子の少なくとも一部を含むベ
クターを調製する。この遺伝子において、欠失、付加、または置換が導入されて
、それによってそのＰＲＯＸ遺伝子が変化されている（例えば、機能的に破壊さ
れる）。ＰＲＯＸ遺伝子はヒト遺伝子（例えば、配列番号２ｎ−１（ここでｎ＝
１〜１７である）のｃＤＮＡ）であり得るが、より好ましくは、ヒトのＰＲＯＸ
遺伝子の非ヒトホモログである。例えば、配列番号２ｎ−１（ここでｎ＝１〜１
７である）のヒトのＰＲＯＸ遺伝子のマウスホモログは、マウスゲノムにおいて
内因性のＰＲＯＸ遺伝子を変更するのに適切な相同組換えベクターを構築するた
めに使用され得る。１つの実施形態において、そのベクターは、相同組換えに際
して、その内因性のＰＲＯＸ遺伝子が、機能的に破壊されるように設計される（
すなわち、機能的タンパク質をもはやコードしない；「ノックアウト」ベクター
ともいわれる）。
【０１９８】 あるいは、このベクターは、相同組換えに対して、内因性ＰＲＯＸ遺伝子が変
異されるか、あるいはさもなければ、変更されるが、なお機能性タンパク質をコ
ードするように、設計され得る（例えば、上流の調節領域が変更され、それによ
って内因性ＰＲＯＸタンパク質の発現を変更し得る）。相同組換えベクターにお
いて、ＰＲＯＸ遺伝子の変更された部分は、ＰＲＯＸ遺伝子のさらなる核酸によ
って、その５’末端および３’末端で隣接され、相同組換えが、ベクターによっ
て保有される外因性ＰＲＯＸ遺伝子と胚幹細胞中の内因性ＰＲＯＸ遺伝子との間
で起こることを可能にする。さらなる隣接するＰＲＯＸ核酸は、内因性遺伝子と
の首尾よい相同組換えのために十分な長さである。典型的に、数キロベースの隣
接するＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方における）が、ベクターに含まれ
る。例えば、相同組換えベクターの記述についてＴｈｏｍａｓら、１９８７．Ｃ
ｅｌｌ ５１：５０３を参照のこと。このベクターは、（例えば、エレクトロポ
レーションによって）胚幹細胞株に導入され、導入されたＰＲＯＸ遺伝子が内因
性ＰＲＯＸ遺伝子と相同組換えした細胞が、選択される（例えば、Ｌｉら（１９
９２）Ｃｅｌｌ ６９：９１５を参照のこと）。
【０１９９】 次いで、選択された細胞が、動物（例えば、マウス）の胚盤胞へ注入され、凝
集キメラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，１９８７のＴｅｒａｔｏｃａｒ
ｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐ
ｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ、Ｏｘｆ
ｏｒｄ、１１３頁〜１５２頁を参照のこと。次いで、キメラ胚が、適切な偽妊娠
雌性養育動物に移植され得、そしてその胚は分娩に到る。その生殖細胞中に相同
組換えされたＤＮＡを保有する子孫が、動物を繁殖させるために使用され得、こ
の動物の全ての細胞は、導入遺伝子の生殖系列伝達による、相同組換えされたＤ
ＮＡを含む。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築するための方法が
、さらに以下に記載される；Ｂｒａｄｌｅｙ，１９９１．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：８２３−８２９；ＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ９０／
１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８；およびＷＯ／９３／
０４１６９。
【０２００】 別の実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された
系を含む非ヒトトランスジェニック動物が産生され得る。このような系の１つの
例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃ
ｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の記述については、例えば、Ｌａｋｓｏら、１
９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６
２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ
ら、１９９１．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５を参照のこと）。
ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を調節するために使用さ
れる場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードす
る導入遺伝子を含む動物が必要となる。このような動物は、例えば、２種のトラ
ンスジェニック動物（一方は選択されたタンパク質をコードした導入遺伝子を含
み、他方はリコンビナーゼをコードした導入遺伝子を含む）を交配することによ
る「二重の」トランスジェニック動物の構築によって提供され得る。
【０２０１】 本明細書中に記載されるトランスジェニック非ヒト動物のクローンがまた、Ｗ
ｉｌｍｕｔら、１９９７．Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３に記載される
方法に従って、産生され得る。簡単には、トランスジェニック動物からの細胞（
例えば、体細胞）は単離および誘導され、増殖サイクルから出、そしてＧ0フェ
イズに入り得る。次いで、静止性細胞が、例えば、電気パルスの使用により、そ
の静止性細胞が単離される同種の動物から摘出された卵母細胞へ融合され得る。
次いで、この再構築された卵母細胞は培養され、これにより、これは桑実胚また
は未分化胚芽細胞に発達し、次いで、偽妊娠雌性養育動物に移される。この雌性
養育動物から産まれた子孫は、その細胞（例えば、その体細胞）が単離された動
物のクローンである。
【０２０２】 （薬学的組成物） 本発明のＰＲＯＸ核酸分子、ＰＲＯＸタンパク質、および抗ＰＲＯＸ抗体（こ
れはまた、本明細書中で、「活性な化合物」とも呼ばれる）、ならびにそれらの
誘導体、フラグメント、アナログ、および相同体が、投与に適した薬学的組成物
に組み込まれ得る。このような組成物は、典型的に、核酸分子、タンパク質また
は抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場
合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的な投与に適合した、任意および
全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収
遅延剤（ｄｅｌａｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）などを含むことが意図される。適切な
キャリアは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ（当該分野の標準的参考文献）（本明細書中に参考として援用される
）の最新版に記載される。このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例として
は、水、生理食塩水、ｆｉｎｇｅｒ溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト
血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび非水
性（すなわち、疎水性）ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた、使用され得る
。薬学的に活性な物質におけるこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で
周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性な化合物と不適合である範囲を
除いて、組成物におけるその使用が考慮される。補助活性化合物はまた、組成物
へ組み込まれ得る。
【０２０３】 本発明の薬学的組成物は、その意図される投与の経路と適合するように処方さ
れる。投与の経路の例には、非経口（例えば、静脈、皮内、皮下）投与、経口（
例えば、吸入）投与、経皮（局所的）投与、経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ
）投与、および直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用または皮下適用の
ために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理
食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレング
リコールまたは他の合成溶媒のような、滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたは
メチルパラベンのような、抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムの
ような、抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような、キレート剤
；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような、緩衝液、および塩化ナトリウム
またはデキストロースのような、張度の調節のための薬剤。ｐＨは、塩酸または
水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整され得る。非経口調製物は、アン
プル、使い捨てシリンジ、あるいはガラスまたはプラスチックから作製される多
用量のバイアル中に入れられ得る。
【０２０４】 注入使用に適した薬学的組成物は、滅菌水性溶液（ここで、水溶解性）または
分散液、および滅菌の注入可能な溶液または分散液の即座の調製のための滅菌粉
末を含む。静脈投与において、適切なキャリアには、生理食塩水、静菌水、Ｃｒ
ｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬTM（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）または
リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成
物は、滅菌性でなければならず、そして容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉ
ｔｙ）が存在する程度に流動性であるべきである。これは、製造および保存の条
件下で安定でなければならず、そして、細菌および真菌のような微生物の汚染行
為に対して保護されるべきである。このキャリアは、例えば、以下を含む溶媒ま
たは分散媒であり得る：水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、
プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）ならびにそれ
らの適切な混合物。適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティングの
使用によって、分散液の場合に、要求される粒子サイズを維持することによって
、および界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の作用の防止
は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェ
ノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場
合、組成物中に等張剤（例えば、砂糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール
（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトール）塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。
注入可能組成物の長時間吸収は、組成物に吸収を遅らせる薬剤（例えば、アルミ
ニウムモノステアレートおよびゼラチン）を含ませることによってもたらされ得
る。
【０２０５】 滅菌注射可能溶液は、必要量のこの活性化合物（例えば、ＰＲＯＸタンパク質
あるいは抗ＰＲＯＸ抗体））を、適切な溶媒中に、上記で列挙される成分の１つ
または組み合わせと共に組み込み、必要な場合、続いて濾過滅菌することによっ
て調製され得る。一般的に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒および上記
で列挙される成分から必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中へ組み込むこ
とによって調製される。滅菌注射可能液剤の調製のための滅菌散剤の場合におい
て、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性成分および
既に滅菌濾過されたその液剤からの任意のさらなる所望の成分の散剤を得る。
【０２０６】 経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは
、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へと圧縮され得る。経口治療
投与の目的のために、この活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして
錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた
、マウスウォッシュとしての使用のために流体キャリアを使用して調製され得、
ここで、この流体キャリア中のこの化合物は、経口的に適用され、そしてさっと
動かされ、そして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合
剤、および／またはアジュバント材料が、この組成物の一部として含まれ得る。
錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などが、任意の以下の成分または同様の性
質を有する化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、ガムトラガ
ントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤
（例えば、アルギン酸）、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ）；滑沢剤
（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；滑り剤（ｇｌ
ｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロー
スまたはサッカリン）；あるいは香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メ
チル、またはオレンジフレーバー）。 吸入による投与について、この化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素
のような気体）を含む圧縮容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エ
アロゾル噴霧の形態で送達される。
【０２０７】 全身的投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または
経皮投与について、浸透されるバリアに適切な浸透剤が、処方において使用され
る。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして、例えば、
経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げ
られる。経粘膜投与は、鼻噴霧または坐剤によって達成され得る。経皮投与につ
いては、この活性成分は、当該分野で一般的に公知である軟膏剤、軟膏、ゲル、
またはクリーム剤へ処方される。
【０２０８】 この化合物はまた、直腸送達のための坐剤（例えば、ココアバターおよび他の
グリセリドのような従来の坐剤ベースと共に）または保持浣腸の形態で調製され
得る。
【０２０９】 １つの実施形態において、この活性化合物は、身体からの迅速な排出に対して
この化合物を保護するキャリアを用いて調製され（例えば、制御放出処方物）、
これには、移植片およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。エチレ
ン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステ
ル、およびポリ乳酸のような、生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。
このような処方物の調製のための方法は、当該業者には明らかである。これらの
材料はまた、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｏｖａ Ｐｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販され、手に入れることができる。リ
ポソーム懸濁剤（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を含む、感染させた
細胞へ標的化されるリポソームを含む）がまた、薬学的に受容可能なキャリアと
して使用され得る。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載さ
れるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０２１０】 投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で、経口組成物ま
たは非経口組成物を処方することが、特に有益である。本明細書で使用される投
薬単位形態は、処置される被験体のための単位投薬量として適切な物理的に個々
の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと関連して所望の治療的
効果を生じるように計算された、所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位
形態についての詳細は、この活性化合物、および達成される特定の治療効果、な
らびに個体の処置のためのこのような活性化合物を調合する当該分野に固有の制
限によって決定されるか、あるいはこれらに直接依存する。
【０２１１】 本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとし
て使用され得る。遺伝子治療ベクターは、被験体へ、例えば静脈注射、局所投与
（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）によって、または定位注射（
例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）ＰＮＡＳ９１：３０５４−３０５７を参照のこ
と）によって送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物には、受容可能
な希釈剤中の遺伝子治療ベクターが挙げられ得、または遺伝子送達ビヒクルが組
み込まれる徐放性マトリックスが挙げられ得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベ
クターが組換え細胞からインタクトで産生され得（例えば、レトロウイルスベク
ター）、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１以上の細胞を含み得る。
【０２１２】 薬学的組成物は、投与のための使用説明書と共の容器、包装、またはディスペ
ンサーに含まれ得る。
【０２１３】 （スクリーニング方法および検出方法） 本明細書中で記載される核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体、および抗
体が、以下の１つ以上の方法において使用され得る：（ｉ）スクリーニングアッ
セイ；（ｉｉ）検出アッセイ（例えば、染色体マッピング、細胞および組織タイ
ピング、法医学生物学）；（ｉｉｉ）予測医学（例えば、診断アッセイ、予後ア
ッセイ、臨床試験モニタリング、および薬理ゲノミックス）；ならびに（ｉｖ）
処置の方法（例えば、治療および予防）。
【０２１４】 本発明の単離された核酸分子は、以下にさらに説明されるように、ＰＲＯＸタ
ンパク質（例えば、遺伝子治療用途における宿主細胞中の組換え発現ベクターに
よる）を発現するため、ＰＲＯＸ ｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプルにおい
て）またはＰＲＯＸ遺伝子における遺伝子損傷を検出するため、ならびにＰＲＯ
Ｘ活性を調節するために使用され得る。さらに、ＰＲＯＸタンパク質は、ＰＲＯ
Ｘ活性または発現を調節する薬物または化合物をスクリーニングするために、な
らびにＰＲＯＸタンパク質の不十分なもしくは過剰な産生によって、あるいはＰ
ＲＯＸ野生型タンパク質と比較して減少したもしくは異常な活性を有するＰＲＯ
Ｘタンパク質の産生によって特徴付けられる障害を処置するために使用され得る
。さらに、本発明の抗ＰＲＯＸ抗体が、ＰＲＯＸタンパク質を検出して単離する
ため、およびＰＲＯＸ活性を調節するために使用され得る。
【０２１５】 本発明は、さらに、本明細書中で記載されるようなスクリーニングアッセイに
よって同定される新規の薬剤、および上述の処置のためのそれらの使用に関する
。
【０２１６】 （スクリーニングアッセイ） 本発明は、モジュレーター（すなわち、ＰＲＯＸタンパク質に結合するかある
いは例えば、ＰＲＯＸタンパク質発現またはＰＲＯＸタンパク質活性に刺激効果
または阻害効果を有する候補物または試験の化合物または薬剤（例えば、ペプチ
ド、ペプチド模倣体、低分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書
中において、「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる）を提供する。本発明は
また、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイにおいて同定された化合
物を包含する。
【０２１７】 １つの実施形態において、本発明は、ＰＲＯＸのタンパク質またはポリペプチ
ド、あるいはその生物学的に活性な部分の膜結合形態に結合するか、またはそれ
ら膜結合形態の活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニン
グするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公
知のコンビナトリアルライブラリー法における任意の多数のアプローチを使用し
て得られ得、これらのライブラリーには、以下が挙げられる：生物学的ライブラ
リー；空間的にアドレセス可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳
を要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびア
フィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的
ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのア
プローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラ
リーに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ
Ｄｅｓｉｇｎ １２：１４５）。
【０２１８】 本明細書中で使用される場合、「低分子」とは、約５ｋＤ未満の分子量、最も
好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物をいうように意味される。低分
子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、炭水化物、脂
質または他の有機分子もしくは無機分子であり得る。化学的および／または生物
学的混合物（例えば、真菌、細菌または藻類抽出物）のライブラリーは、当該分
野で公知であり、そして本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングさ
れ得る。
【０２１９】 分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下
に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔ
ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ
ら（１９９４）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ
Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９
９４）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ３３：２０６１；およ
びＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３７：１２３３。
【０２２０】 化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌ
ａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ
（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ
米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ 米国特許第５，２３
３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａ
ｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（Ｓｃ
ｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６〜３９０
；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉ
ｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８
７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２
２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２３３，４０９号）にお
いて示され得る。
【０２２１】 １つの実施形態において、アッセイは細胞ベースのアッセイであり、ここで、
膜結合形態のＰＲＯＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分を細胞表面
上に発現する細胞が、試験化合物と接触され、そしてこの試験化合物が、ＰＲＯ
Ｘタンパク質に結合する能力が、決定される。例えば、細胞は、哺乳動物起源ま
たは酵母細胞であり得る。この試験化合物がＰＲＯＸタンパク質に結合する能力
の決定は、例えば、その試験化合物を放射性同位体標識または酵素標識とカップ
リングさせて、その結果、この試験化合物のＰＲＯＸタンパク質またはその生物
学的に活性な部分に対する結合が、複合体におけるその標識化合物を検出するこ
とによって決定され得ることによって達成され得る。例えば、試験化合物は、12 5 Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、または3Ｈで直接的または間接的のいずれかで標識され得、そ
してその放射性同位体が、放射線放射の直接の計数により、またはシンチレーシ
ョン計数により、検出され得る。あるいは、試験化合物は、例えば、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に
標識され得、そしてこの酵素的標識が、適切な基質の生成物への転換を決定する
ことにより、検出され得る。１つの実施形態において、このアッセイは、膜結合
形態のＰＲＯＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分をその細胞表面上
に発現する細胞を、ＰＲＯＸと結合する公知の化合物と接触させて、アッセイ混
合物を形成する工程、このアッセイ混合物に試験化合物を接触させる工程、なら
びにこの試験化合物がＰＲＯＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を
包含し、ここで、この試験化合物がＰＲＯＸタンパク質と相互作用する能力を決
定する工程が、この試験化合物が、公知の化合物と比較して、ＰＲＯＸまたはそ
の生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０２２２】 別の実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、これは、
膜結合形態のＰＲＯＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上
で発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物が、
ＰＲＯＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺
激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物が、ＰＲＯ
Ｘまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する能力の決定は、例えば、Ｐ
ＲＯＸタンパク質が、ＰＲＯＸ標的分子に結合またはこれら標的分子と相互作用
する能力を決定することによって、達成され得る。本明細書中において使用する
場合には、「標的分子」とは、ＰＲＯＸタンパク質が自然に結合または相互作用
する分子であり、例えば、ＰＲＯＸ相互作用タンパク質を発現する細胞表面上の
分子、第二の細胞表面上の分子、細胞外環境中の分子、細胞膜の内部表面と会合
する分子、または細胞質分子である。ＰＲＯＸ標的分子は、非ＰＲＯＸ分子ある
いは本発明のＰＲＯＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。１つの実施形
態において、ＰＲＯＸ標的分子は、シグナル伝達経路の構成要素であり、これは
、細胞膜を通って細胞内への細胞外シグナル（例えば、化合物が膜結合ＰＲＯＸ
分子に結合することにより発生するシグナル）の伝達を促進する。その標的は、
例えば、触媒活性を有する第二の細胞内タンパク質、または下流シグナル分子の
ＰＲＯＸとの会合を容易にするタンパク質であり得る。
【０２２３】 ＰＲＯＸタンパク質がＰＲＯＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相
互作用する能力の決定は、直接的結合を決定するための上記方法の１つにより、
達成され得る。１つの実施形態において、ＰＲＯＸタンパク質がＰＲＯＸ標的分
子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、その標的分子
の活性を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の活性は、
その標的の細胞セカンドメッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ2+、ジアシルグ
リセロール、ＩＰ3など）の誘導を検出すること、適切な基質への標的の触媒活
性／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー（例えば
、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動的に連結されたＰＲＯＸ応答性調節
エレメントを含む）の誘導を検出すること、または細胞応答（例えば、細胞生存
度、細胞分化、または細胞増殖）を検出することにより、決定され得る。
【０２２４】 なお別の実施形態において、本発明のアッセイは、無細胞アッセイであり、Ｐ
ＲＯＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物に接触させる工
程、ならびにその試験化合物がＰＲＯＸタンパク質またはその生物学的に活性な
部分と結合する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物の、ＰＲＯＸタ
ンパク質への結合は、上記のように、直接的または間接的にのいずれかで決定さ
れ得る。１つのこのような実施形態において、このアッセイは、ＰＲＯＸタンパ
ク質またはその生物学的に活性な部分を、ＰＲＯＸを結合する公知の化合物に接
触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物に
接触させる工程、ならびにその試験化合物がＰＲＯＸタンパク質と相互作用する
能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＰＲＯＸタンパク質と
相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、公知の化合物と比較し
て、ＰＲＯＸ、またはその生物学的に活性な部分と優先的に相互作用する能力を
決定する工程を包含する。
【０２２５】 さらに別の実施形態において、アッセイは、無細胞アッセイであり、ＰＲＯＸ
タンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させる工程、な
らびにその試験化合物がＰＲＯＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の
活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。こ
の試験化合物がＰＲＯＸの活性を調節する能力の決定は、例えば、ＰＲＯＸタン
パク質が、ＰＲＯＸ標的分子に結合する能力を、直接的結合の決定のための上記
方法の１つによって決定することにより、達成され得る。代替の実施形態におい
て、この試験化合物がＰＲＯＸタンパク質の活性を調節する能力の決定は、ＰＲ
ＯＸタンパク質が、ＰＲＯＸ標的分子をさらに調節する能力を決定することによ
り、達成され得る。例えば、この標的分子の適切な基質に対する触媒活性／酵素
活性は、上記のように決定され得る。
【０２２６】 なお別の実施形態において、無細胞アッセイは、ＰＲＯＸタンパク質またはそ
の生物学的に活性な部分を、ＰＲＯＸタンパク質を結合する公知の化合物に接触
させてアッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物と接触
させる工程、ならびにこの試験化合物がＰＲＯＸタンパク質と相互作用する能力
を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＰＲＯＸタンパク質と相互
作用する能力の決定は、ＰＲＯＸタンパク質が、ＰＲＯＸ標的分子と優先的に結
合するか、またはその標的分子の活性を優先的に調節する能力を決定する工程を
包含する。
【０２２７】 本発明の無細胞アッセイは、ＰＲＯＸタンパク質の、可溶性の形態または膜結
合形態の両方の使用に受け入れられる。膜結合形態のＰＲＯＸタンパク質を含む
無細胞アッセイの場合には、ＰＲＯＸタンパク質の膜結合形態が溶液中に維持さ
れるように、可溶化剤を利用することが望ましくあり得る。このような可溶化剤
の例には、非イオン性界面活性剤が挙げられ、例えば、ｎ−オクチルグルコシド
、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチ
ルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）
Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）
、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）n（Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃ
ｙｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｅｔｈｅｒ）n、Ｎ−ドデシル
−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（３−
コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート（３−（３
−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−１−
ｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳ）、または３−（３−コラ
ミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネー
ト（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎ
ｉｏｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（Ｃ
ＨＡＰＳＯ）である。
【０２２８】 本発明の上記アッセイ方法の１つより多い実施形態において、ＰＲＯＸタンパ
ク質またはその標的分子のいずれかを固定して、そのタンパク質の一方または両
方の非複合形態からの複合形態の分離を促進し、そしてそのアッセイの自動化に
適用させることが、望ましくあり得る。試験化合物の、ＰＲＯＸタンパク質への
結合、または候補化合物の存在下および非存在下での、ＰＲＯＸタンパク質の標
的分子との相互作用は、これらの反応物を収容するために適切な任意の容器内で
、達成され得る。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管
、および微小遠心管が挙げられる。１実施形態において、そのタンパク質の一方
または両方がマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合
タンパク質が、提供され得る。例えば、ＧＳＴ−ＰＲＯＸ融合タンパク質または
ＧＳＴ標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイ
クロタイタープレート上に吸着され得、次いでこれらは、試験化合物と合わせら
れるか、あるいは試験化合物および吸着されない標的タンパク質、またはＰＲＯ
Ｘタンパク質のいずれかと合わせられ、そしてこの混合物が、複合体形成に貢献
する条件下（例えば、塩およびｐＨに関して生理学的条件）でインキュベートさ
れる。インキュベーションに続いて、ビーズまたはマイクロタイタープレートウ
ェルを洗浄して、結合していないあらゆる成分を除去し、ビーズの場合にはマト
リックスを固定し、例えば上記のように、複合体を直接的または間接的のいずれ
かで決定する。あるいは、複合体がマトリックスから解離され得、そしてＰＲＯ
Ｘタンパク質の結合レベルまたは活性レベルを、標準的な技術を使用して決定し
得る。
【０２２９】 タンパク質をマトリックスに固定するための他の技術がまた、本発明のスクリ
ーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、ＰＲＯＸタンパク質、または
その標的分子のいずれかが、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用して
、固定され得る。ビオチニル化ＰＲＯＸタンパク質、または標的分子は、当該分
野において周知の技術を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミド）から調製され得（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）、そしてストレプトアビジンで被
覆した９６ウェルのプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固
定され得る。あるいは、ＰＲＯＸタンパク質、または標的分子と反応性であるが
ＰＲＯＸタンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体が、そのプレート
のウェルに誘導体化され得、そして結合していない標的またはＰＲＯＸタンパク
質が、抗体の結合によってウェル内にトラップされ得る。このような複合体を検
出するための方法には、ＧＳＴ固定複合体に関しての上記のものに加えて、ＰＲ
ＯＸタンパク質または標的分子と反応性の抗体を使用する、複合体の免疫検出、
ならびにＰＲＯＸタンパク質、または標的分子に関する酵素活性の検出に依存す
る酵素結合アッセイが挙げられる。
【０２３０】 別の実施形態において、ＰＲＯＸタンパク質発現のモジュレーターは、細胞を
候補化合物と接触させ、そして細胞中のＰＲＯＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の
発現を決定する方法において同定される。候補化合物の存在下でのＰＲＯＸ ｍ
ＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、候補化合物の非存在下でのＰＲＯＸ
ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較される。次いで、候補化合物は、
この比較に基づいて、ＰＲＯＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のモジュレータ
ーとして同定され得る。例えば、ＰＲＯＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が
候補化合物の非存在下より、その存在下における方が大きい（すなわち、統計的
に有意に大きい）場合、この候補化合物は、ＰＲＯＸ ｍＲＮＡまたはタンパク
質の発現の刺激物質として同定される。あるいは、ＰＲＯＸ ｍＲＮＡまたはタ
ンパク質の発現が候補化合物の非存在下よりその存在下の方が少ない（統計的に
有意に少ない）場合、この候補化合物は、ＰＲＯＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質
の発現のインヒビターとして同定される。細胞中のＰＲＯＸ ｍＲＮＡまたはタ
ンパク質の発現レベルは、ＰＲＯＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するため
に本明細書中に記載の方法によって決定され得る。
【０２３１】 本発明のなお別の局面において、ＰＲＯＸタンパク質を、ツーハイブリッドア
ッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおいて「ベイト（餌）（ｂａｉｔ）
タンパク質」として使用して（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅ
ｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら、１
９９３ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔ
ｅｌら、１９９３ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４；Ｉｗ
ａｂｕｃｈｉら、１９９３ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６；およ
びＢｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）、ＰＲＯＸ（「ＰＲＯＸ結
合タンパク質」または「ＰＲＯＸ−ｂｐ」）に結合するか、またはこれと相互作
用し、そしてＰＲＯＸ活性を調節する他のタンパク質を同定し得る。このような
ＰＲＯＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＰＲＯＸ経路の上流または下流エレメ
ントとしてＰＲＯＸタンパク質によるシグナル伝達に関与するようである。
【０２３２】 ツーハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ド
メインからなる、大部分の転写因子のモジュール的性質に基づく。簡潔には、こ
のアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物においては
、ＰＲＯＸをコードする遺伝子が、公知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤ
ＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構築物においては、
ＤＮＡ配列のライブラリー由来の、未同定タンパク質（「プレイ（捕食）」また
は「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列が、その公知の転写因子の活性化ドメ
インをコードする遺伝子に融合される。「ベイト」および「プレイ」タンパク質
がインビボで相互作用して、ＰＲＯＸ依存性複合体を形成し得る場合、この転写
因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、非常に近接される。このよ
うに近接されることにより、その転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に
連結されたレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を可能にする。レポー
ター遺伝子の発現が検出され得、そして機能的転写因子を含む細胞コロニーを単
離および使用して、そしてＰＲＯと相互作用するタンパク質をコードするクロー
ニングされた遺伝子を獲得し得る。
【０２３３】 本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規な薬剤
および本明細書中に記載されるような処置のためのこの薬剤の使用に関する。
【０２３４】 （検出アッセイ） 本明細書中で同定されるｃＤＮＡ配列の一部分またはフラグメント（および対
応する完全な遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法で使用さ
れ得る。例えば（限定はされない）、これらの配列を使用して、（ｉ）染色体上
にそれぞれの遺伝子をマッピングし得；従って遺伝病と関連する遺伝子領域を位
置決定し得る；（ｉｉ）微量の生物学的サンプルから個体を同定し得る（組織型
決定）；および（ｉｉｉ）生物学的サンプルの法医学的識別を助け得る。これら
の適用は、以下の節において記載される。
【０２３５】 （染色体マッピング） 一旦遺伝子の配列（または配列の一部分）が単離されると、この配列を用いて
染色体上に遺伝子の位置をマッピングし得る。このプロセスは、染色体マッピン
グとよばれる。従って、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）に示される
ＰＲＯＸ配列の一部またはフラグメント、あるいはそのフラグメントはまたは誘
導体を用いて、それぞれ、ＰＲＯＸ遺伝子の位置を染色体上にマッピングし得る
。ＰＲＯＸ配列を染色体にマッピングすることは、これらの配列を疾患に関連す
る遺伝子と相関付ける際の重要な第一工程である。
【０２３６】 簡潔には、ＰＲＯＸ遺伝子は、ＰＲＯＸ配列からＰＣＲプライマー（好ましく
は、１５〜２５ｂｐの長さ）を調製することにより染色体にマッピングし得る。
ＰＲＯのコンピューター分析が、ゲノムＤＮＡにおける１つを超えるエキソンに
またがらないプライマー（従って、これは、増幅プロセスを複雑する）を迅速に
選択するために使用され得る。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色
体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用され得る。Ｐ
ＲＯＸ配列に対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅されたフラグメ
ントを生じる。
【０２３７】 体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物由来の体細胞（例えば、ヒト細胞およ
びマウス細胞）を融合することにより調製される。ヒトおよびマウスの細胞のハ
イブリッドが増殖および分裂するにつれ、それらは、無作為な順序で徐々にヒト
染色体を失うが、マウス染色体を維持する。マウス細胞は、それらが特定の酵素
を欠いているので増殖できないが、ヒト細胞が増殖できる培地を使用することに
より、必要な酵素をコードする遺伝子を含む１つのヒト染色体が維持される。種
々の培地を使用することによって、ハイブリッド細胞株のパネルが確立され得る
。パネルにおける各細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体いずれ
かおよびマウス染色体の完全なセットを含み、これにより、個々の遺伝子を特定
のヒト染色体にマッピングすることが容易に可能になる（Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉ
ｏら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０：９１９−９２４）。ヒト染色体のフ
ラグメントのみを含む体細胞ハイブリッドはまた、転座および欠失を伴うヒト染
色体を使用することにより生成され得る。
【０２３８】 体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定の配列を割り
当てるためには迅速な手順である。１つのサーマルサイクラーを用いて一日に３
つ以上の配列が割り当てられ得る。ＰＲＯＸ配列を使用して、オリゴヌクレオチ
ドプライマーを設計することにより、二次位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔ
ｉｏｎ）が、特定の染色体由来のフラグメントのパネルを用いて達成され得る。
【０２３９】 中期染色体スプレッドに対するＤＮＡ配列の蛍光インサイチュハイブリダイゼ
ーション（ＦＩＳＨ）をさらに使用して、一工程で正確な染色体位置を提供し得
る。染色体スプレッドは、コルセミド（染色体紡錘体を破壊する）のような化学
物質により分裂が中期においてブロックされた細胞を使用して行われ得る。この
染色体は、トリプシンで短時間処理され得、次いで、ギムザ染色され得る。薄い
バンドおよび濃いバンドのパターンが各染色体で発生し、その結果、この染色体
は、個々に同定され得る。ＦＩＳＨ技術は、５００または６００塩基ほどの短さ
のＤＮＡ配列と共に使用され得る。しかし、１，０００塩基より大きなクローン
は、簡単な検出に十分なシグナル強度で、独特の染色体位置に結合する可能性が
より高い。好ましくは、１，０００塩基、そしてより好ましくは、２，０００塩
基が妥当な時間量で良好な結果を得るために十分である。この技術の総説につい
ては、Ｖｅｒｍａら、ＨＵＭＡＮ ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥＳ：Ａ ＭＡＮＵＡＬ
ＯＦ ＢＡＳＩＣ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８８）を参照のこと。
【０２４０】 染色体マッピングの試薬は、単一の染色体またはその染色体上の単一部位を印
付けするために個々に使用され得るか、または試薬集団が、複数部位および／ま
たは複数染色体を印付けするために使用され得る。遺伝子の非コード領域に対応
する試薬は、実際に、マッピング目的のために好ましい。コード鎖は、遺伝子フ
ァミリー内に保存されており、従って、染色体マッピングの間に交叉ハイブリダ
イゼーションの機会が増大する可能性が高い。
【０２４１】 一旦配列が正確な染色体位置にマッピングされると、その配列の染色体上の物
理的位置が、遺伝子マップデータと相関され得る。このようなデータは、例えば
、ＭｃＫｕｓｉｃｋ，ＭＥＮＤＥＬＩＡＮ ＩＮＨＥＲＩＴＡＮＣＥ ＩＮ Ｍ
ＡＮ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅ
ｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを通じてオンラインで入手可能）において見い出さ
れる。次いで、同じ染色体領域にマッピングされる遺伝子と疾患との間の関係は
、例えば、Ｅｇｅｌａｎｄら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２５：７８３−７８
７に記載される連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）によって同定さ
れ得る。
【０２４２】 さらに、ＰＲＯＸ遺伝子と関連する疾患に罹患した個体と、この疾患に罹患し
ていない個体との間のＤＮＡ配列における差異が決定され得る。罹患した個体の
いくらかまたは全てにおいて変異が認められるが、非罹患個体のいずれにおいて
も認められない場合、この変異は特定の疾患の原因因子である可能性が高い。罹
患個体と非罹患個体の比較は、一般に、染色体における構造的変化（例えば、染
色体スプレッドから可視できるか、またはそのＤＮＡ配列に基づいたＰＣＲを用
いて検出可能な、欠失または転座）を最初に探索する工程を包含する。最終的に
、いくらかの個体に由来する遺伝子の完全な配列決定を行って、変異の存在を確
認し、かつ多型に由来する変異を区別する。
【０２４３】 （組織型決定（ｔｉｓｓｕｅ ｔｙｐｉｎｇ）） 本発明のＰＲＯＸ配列は、わずかな生物学的サンプルから個体を識別するため
に使用され得る。この技術において、個体のゲノムＤＮＡは、１つ以上の制限酵
素で消化され、そしてサザンブロット上でプローブされて、同定のために固有の
バンドを生成する。本発明の配列は、ＲＦＬＰ（米国特許第５，２７２，０５７
号に記載の「制限フラグメント長多型」）のためのさらなるＤＮＡマーカーとし
て有用である。
【０２４４】 さらに、本発明の配列を用いて、個体のゲノムの選択された部分について実際
の塩基ごとにＤＮＡ配列を決定する代替的技術を提供し得る。従って、本明細書
中に記載のＰＲＯＸ配列を用いて、配列の５’末端および３’末端から２つのＰ
ＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを使用して、個体の
ＤＮＡを増幅し得、引き続いて、これを配列決定し得る。
【０２４５】 このように調製された個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、各個体が、
対立遺伝子差異に起因するこのようなＤＮＡ配列の固有のセットを有するので、
固有の個体識別を提供し得る。本発明の配列は、個体由来および組織由来の配列
のこのような識別を得るために使用され得る。本発明のＰＲＯＸ配列は、ヒトゲ
ノムの部分を固有に表す。対立遺伝子変異は、これらの配列のコード領域におい
てある程度生じ、そして非コード領域においてより大きな程度に生じる。個々の
ヒト間での対立遺伝子変異は、各５００塩基につき約１回の頻度で生じると見積
もられる。対立遺伝子変異の多さは、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）を含
む単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）に起因する。
【０２４６】 本明細書中で記載の配列の各々は、ある程度、標準（これに対して、個体由来
のＤＮＡが、識別の目的で比較され得る）として使用され得る。より多くの多型
が非コード領域で生じるので、個体を区別するために、それほど多くの配列が必
要であるわけではない。非コード配列は、おそらく１０〜１，０００プライマー
のパネルを用いてポジティブな個体識別を不自由なく提供し得る。これらのプラ
イマーは、各々が１００塩基の増幅された非コード配列を生じる。推定コード配
列（例えば、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）における配列）が使用
される場合、ポジティブな個体識別に関するプライマーのより適切な数は、５０
０〜２，０００である。
【０２４７】 （予測医療） 本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬物ゲノム学（ｐｈａｒｍａｃ
ｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）およびモニタリング臨床試験が、予後（予測）の目的に使
用され、これによって個体を予防的に処置する、予測医療の分野に関する。従っ
て、本発明の１つの局面は、ＰＲＯＸタンパク質および／または核酸の発現、な
らびにＰＲＯＸの活性を、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織
）状況下で決定し、これによって、個体が、異常なＰＲＯＸの発現または活性に
関連する疾患または障害に罹患しているか否か、あるいはこの障害を発症するリ
スクがあるか否かを決定する。本発明はまた、個体が、ＰＲＯＸのタンパク質、
核酸の発現または活性と関連した障害を発症するリスクがあるか否かを決定する
ための予後的（または予測的）アッセイを提供する。例えば、ＰＲＯＸ遺伝子に
おける変異が、生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このようなアッセ
イは、予後的または予測的な目的に使用され得、これによってＰＲＯＸのタンパ
ク質、核酸の発現または生物学的活性によって特徴付けられるかまたはそれに関
連した障害の発症の前に個体を予防的に処置する。
【０２４８】 本発明の別の局面は、個体におけるＰＲＯＸタンパク質、核酸の発現またはＰ
ＲＯＸ活性を決定するための方法を提供し、これによって、その個体についての
適切な治療的または予防的薬剤を選択する（本明細書において「薬物ゲノム学」
とよばれる）。薬物ゲノム学は、個体の遺伝型（例えば、特定の薬剤に対して応
答する個体の能力を決定するために試験された個体の遺伝型）に基づいて、個体
の治療的または予防的処置のための薬剤（例えば、薬物）の選択を可能にする。
【０２４９】 本発明のなお別の局面は、臨床試験におけるＰＲＯＸの発現または活性に対す
る因子（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることに関する。
【０２５０】 （法医学的生物学におけるＰＲＯＸ配列の使用） ＤＮＡに基づく識別技術はまた、法医学的生物学において使用され得る。法医
学的生物学は、例えば、犯罪者をポジティブに識別するための手段として、犯罪
現場で見いだされた生物学的証拠の遺伝子型決定を利用する科学分野である。こ
のような識別を行うために、ＰＣＲ技術を用いて非常に少量の生物学的サンプル
（例えば、組織（例えば、犯罪現場で見いだされた毛髪もしくは皮膚、または血
液、唾液もしくは精液のような体液））から得られたＤＮＡ配列を増幅し得る。
次いで、増幅された配列は標準と比較され、それによって、生物学的サンプルの
起源の識別を可能にし得る。
【０２５１】 本発明の配列を使用して、ヒトゲノムにおける特定の遺伝子座に標的化され得
るポリヌクレオチド試薬（例えば、ＰＣＲプライマー）を提供し得る。このポリ
ヌクレオチド試薬は、例えば、別の「識別マーカー」（すなわち、特定の個体に
固有の別のＤＮＡ配列）を提供することにより、ＤＮＡベースの法医学的識別の
信頼性を増大し得る。上記のように、実際の塩基配列情報は、制限酵素で生成し
たフラグメントにより形成されるパターンに対する、正確な代替手段として識別
のために使用され得る。配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７）の非コード
領域に標的化される配列は、より多くの多型が非コード領域に生じ、このことに
より、この技術を使用して個体を区別することがより容易になるので、この用途
のために特に適切である。ポリヌクレオチド試薬の例としては、ＰＲＯＸ配列ま
たはその部分（例えば、本明細書中に記載の配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１
〜１７）の１７以上の非コード領域に由来するフラグメント）が挙げられ得、こ
の部分は、少なくとも２０塩基、好ましくは３０塩基の長さを有する。
【０２５２】 本明細書中に記載のＰＲＯＸ配列は、ポリヌクレオチド試薬（例えば、インサ
イチュハイブリダイゼーション技術において使用され得る、標識プローブまたは
標識可能なプローブ）を提供して、特定の組織（例えば、脳組織など）を同定す
るためにさらに使用され得る。これは、法医学的病理学者に未知の起源の組織が
提示された場合に非常に有用である。このようなＰＲＯＸプローブのパネルを使
用して、種および／または起源の型によって、組織を同定し得る。
【０２５３】 類所の様式で、これらの試薬（例えば、ＰＲＯＸプライマーまたはプローブ）
を用いて、組織培養物を夾雑物質についてスクリーニングし得る（すなわち、培
養物中の異なる型の細胞の混在についてのスクリーニング）。
【０２５４】 （予測医療） 本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬物ゲノム学（ｐｈａｒｍａｃ
ｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）およびモニタリング臨床試験が、予後（予測）の目的に使
用され、これによって個体を予防的に処置する、予測医療の分野に関する。従っ
て、本発明の１つの局面は、ＰＲＯＸタンパク質および／または核酸の発現、な
らびにＰＲＯＸの活性を、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織
）状況下で決定し、これによって、個体が、異常なＰＲＯＸの発現または活性に
関連する疾患または障害に罹患しているか否か、あるいはこの障害を発症するリ
スクがあるか否かを決定する。本発明はまた、個体が、ＰＲＯＸのタンパク質、
核酸の発現または活性と関連した障害を発症するリスクがあるか否かを決定する
ための予後的（または予測的）アッセイを提供する。例えば、ＰＲＯＸ遺伝子に
おける変異が、生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このようなアッセ
イは、予後的または予測的な目的に使用され得、これによってＰＲＯＸのタンパ
ク質、核酸の発現または生物学的活性によって特徴付けられるかまたはそれに関
連した障害の発症の前に個体を予防的に処置する。
【０２５５】 本発明の別の局面は、個体におけるＰＲＯＸタンパク質、核酸の発現または活
性を決定するための方法を提供し、これによって、その個体についての適切な治
療的または予防的薬剤を選択する（本明細書において「薬物ゲノム学」とよばれ
る）。薬物ゲノム学は、個体の遺伝型（例えば、特定の薬剤に対して応答する個
体の能力を決定するために試験された個体の遺伝型）に基づいて、個体の治療的
または予防的処置のための薬剤（例えば、薬物）の選択を可能にする。
【０２５６】 本発明のなお別の局面は、臨床試験におけるＰＲＯＸの発現または活性に対す
る因子（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることに関する。
【０２５７】 これらおよび他の因子は、以下の節でさらに詳細に記載される。 （診断アッセイ） 生物学的サンプルにおけるＰＲＯＸの存在または非存在を検出するための例示
的な方法は、試験被験体から生物学的サンプルを得る工程、およびその生物学的
サンプルをＰＲＯＸタンパク質またはＰＲＯＸタンパク質をコードする核酸（例
えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物もしくは薬剤とを接触させ
、その結果、ＰＲＯＸの存在が、その生物学的サンプルにおいて検出される、工
程を包含する。ＰＲＯＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するための薬剤は
、ＰＲＯＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る、標識された
核酸プローブである。この核酸プローブは、例えば、全長のＰＲＯＸ核酸（例え
ば、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜１７））またはその部分（例えば、少
なくとも、１５、３０、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチド長の
オリゴヌクレオチドであり、そしてストリンジェントな条件下でＰＲＯＸのｍＲ
ＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするに十分である）であり得
る。本発明の診断アッセイにおける使用のための他の適切なプローブは本明細書
中に記載される。
【０２５８】 ＰＲＯＸタンパク質を検出するための１つの薬剤は、ＰＲＯＸと結合し得る抗
体、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナル
であり得るか、またはより好ましくはモノクローナル抗体であり得る。インタク
トな抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦabまたはＦ（ａｂ’）2）が使用
され得る。本明細書中で使用される場合、用語「標識（された）」とは、プロー
ブまたは抗体に関して、そのプローブもしくは抗体への検出可能な物質のカップ
リング（すなわち、物理的に連結する）による、そのプローブまたは抗体の直接
標識、ならびに、直接標識される別の試薬との反応性による、そのプローブもし
くは抗体の間接的標識を包含することが意図される。間接的な標識の例としては
、蛍光標識された二次抗体を用いる一次抗体の検出、および蛍光標識されたスト
レプトアビジンを用いて検出され得るようなビオチンでのＤＮＡプローブの末端
標識が挙げられる。用語「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された、組
織、細胞および生物学的流体ならびに被験体に存在する組織、細胞および流体を
含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法を用いて、生物学的サンプ
ル中のＰＲＯＸのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを、インビトロおよ
びインビボで検出し得る。例えば、ＰＲＯＸ ｍＲＮＡの検出のためのインビト
ロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリ
ダイゼーションが挙げられる。ＰＲＯＸタンパク質の検出のためのインビトロ技
術としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、
免疫沈降および免疫蛍光が挙げられる。ＰＲＯＸゲノムＤＮＡを検出するための
インビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに
、ＰＲＯＸタンパク質の検出のためのインビボ技術としては、標識された抗ＰＲ
ＯＸ抗体を被験体に導入することが挙げられる。例えば、その抗体は、放射性マ
ーカーを用いて標識され得る。この被験体における放射性マーカーの存在および
位置は、標準的な画像化技術によって検出され得る。 １つの実施形態において、この生物学的サンプルは、その試験被験体からのタ
ンパク質分子を含む。あるいは、その生物学的サンプルは、その試験被験体から
のｍＲＮＡ分子またはその試験被験体からのゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ま
しい生物学的サンプルは、被験体から従来の手段によって単離された末梢血白血
球サンプルである。
【０２５９】 別の実施形態において、本発明の方法はさらに、コントロール被験体からコン
トロール生物学的サンプルを得る工程、そのコントロールサンプルを、ＰＲＯＸ
のタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムを検出し得る化合物または薬剤と接触さ
せ、その結果、ＰＲＯＸのタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在がそ
の生物学的サンプルにおいて検出される、工程、およびそのコントロールサンプ
ルにおけるＰＲＯＸのタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と、その
試験サンプルにおけるＰＲＯＸのタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存
在とを比較する工程を包含する。
【０２６０】 本発明はまた、生物学的サンプルにおけるＰＲＯＸの存在を検出するためのキ
ットを包含する。例えば、このキットは、以下を備え得る：生物学的サンプルに
おいてＰＲＯＸのタンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る、標識された化合物ま
たは薬剤；そのサンプルにおいてＰＲＯＸの量を決定するための手段；およびそ
のサンプルにおけるＰＲＯＸの量を標準と比較するための手段。この化合物また
は薬剤は、適切な容器内にパッケージングされ得る。このキットは、さらに、Ｐ
ＲＯＸタンパク質または核酸を検出するためにキットを用いるための説明書を備
え得る。
【０２６１】 （予後アッセイ） 本明細書において記載された診断方法をさらに利用して、ＰＲＯＸの異常発現
または異常活性に関連した疾患もしくは障害を有するか、またはその発症の危険
性を有する被験体を同定し得る。例えば、本明細書に記載されるアッセイ（例え
ば、上述の診断アッセイまたは下記のアッセイ）を利用して、ＰＲＯＸのタンパ
ク質、核酸の発現または活性に関連する障害を有するかまたはその発症の危険性
を有する被験体を同定し得る。あるいは、この予後アッセイを利用して、疾患ま
たは障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。従っ
て、本発明は、ＰＲＯＸの異常発現または異常活性に関連する疾患もしくは障害
を同定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルは、被験体から得られ
、そしてＰＲＯＸのタンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）
が検出され、ここで、ＰＲＯＸのタンパク質または核酸の存在は、ＰＲＯＸの異
常発現または異常活性に関連する疾患または障害を有するかまたはその発症の危
険性を有する被験体についての診断指標である。本明細書において使用される場
合「試験サンプル」とは、目的の被験体から得られた生物学的サンプルをいう。
例えば、試験サンプルは、生物学的流体（例えば、血清）、細胞サンプル、また
は組織であり得る。
【０２６２】 さらに、本明細書に記載される予後アッセイを使用して、被験体に薬剤（例え
ば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核
酸、低分子、または他の薬物候補）を投与してＰＲＯＸの異常発現または異常活
性に関連する疾患または障害を処置し得るか否かを、決定し得る。例えば、この
ような方法を使用して、被験体が障害のための薬剤で有効に処置され得るか否か
を決定し得る。従って、本発明は、ＰＲＯＸの異常発現または異常活性に関連す
る障害についての薬剤を用いて、被験体が有効に処置され得るか否かを決定する
ための方法を提供する。ここで、試験サンプルが得られ、そしてＰＲＯＸのタン
パク質または核酸が検出される（例えば、ここで、ＰＲＯＸのタンパク質または
核酸の存在は、この薬剤が投与されてＰＲＯＸの異常発現または異常活性に関連
する障害が処置され得る被験体についての、診断指標である）。
【０２６３】 本発明の方法はまた、ＰＲＯＸ遺伝子における遺伝的損傷を検出し、それによ
って、その損傷遺伝子を有する被験体が異常な細胞増殖および／または分化によ
って特徴付けられる障害についての危険性を有するか否かを決定するためにも使
用され得る。種々の実施形態において、この方法は、その被験体からの細胞のサ
ンプルにおいて、ＰＲＯＸタンパク質をコードする遺伝子の統合性に影響を与え
る少なくとも１つの変更によって特徴付けられる遺伝的損傷の存在または非存在
、あるいはＰＲＯＸ遺伝子の誤発現を検出する工程を包含する。例えば、そのよ
うな遺伝的損傷は、以下の少なくとも１つの存在を確認することによって検出さ
れ得る：（ｉ）ＰＲＯＸ遺伝子からの１つ以上のヌクレオチドの欠失；（ｉｉ）
ＰＲＯＸ遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの付加；（ｉｉｉ）ＰＲＯＸ遺伝子
の１つ以上のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）ＰＲＯＸ遺伝子の染色体再配置；（
ｖ）ＰＲＯＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける変更、（ｖ
ｉ）ＰＲＯＸ遺伝子の異常改変（例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異
常改変）、（ｖｉｉ）ＰＲＯＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型
スプライシングパターンの存在、（ｖｉｉｉ）ＰＲＯＸタンパク質の非野生型レ
ベル、（ｉｘ）ＰＲＯＸ遺伝子の対立遺伝子の欠失、ならびに（ｘ）ＰＲＯＸタ
ンパク質の不適切な翻訳後修飾。本明細書において記載されるように、当該分野
において、ＰＲＯＸ遺伝子における損傷を検出するために使用され得る、多数の
公知のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的サンプルは、従来手段によっ
て被験体から単離された末梢血白血球サンプルである。しかし、有核細胞を含む
任意の生物学的サンプルが使用され得、これには、例えば、頬粘膜細胞が挙げら
れる。
【０２６４】 特定の実施形態において、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（
例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参
照のこと）（例えば、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲ）、あるいは、連
結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ ９１：３６０−３６４を参照の
こと）におけるプローブ／プライマーの使用を包含する。後者は、ＰＲＯＸ遺伝
子における点変異を検出するために特に有用であり得る）（Ａｂｒａｖａｙａら
，１９９５ Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２３：６７５−６８２を参照のこ
と）。この方法は、患者から細胞のサンプルを収集する工程、核酸（例えば、ゲ
ノム、ｍＲＮＡまたはその両方）をそのサンプルの細胞から単離する工程、ＰＲ
ＯＸの遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーとその核酸サ
ンプルとを、ＰＲＯＸ遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび
増幅が生じるような条件下で接触させる工程、ならびに増幅産物の存在もしくは
非存在を検出する工程、またはその増幅産物のサイズを検出する工程およびその
長さをコントロールサンプルと比較する工程を包含し得る。ＰＣＲおよび／また
はＬＣＲは、本明細書中に記載される変異を検出するために使用される技術のい
ずれかとともに予備的増幅工程として使用されることが望ましくあり得ることが
予想される。
【０２６５】 代替的な増幅方法としては、以下が挙げられる：当業者に周知な技術を用いた
、その増幅された分子の検出の前の、自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、
１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−
１８７８を参照のこと）、転写増幅系（Ｋｗｏｈら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７を参照のこと）、
Ｑβレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
６：１１９７を参照のこと）、または他の任意の核酸増幅方法。これらの検出
スキームは、核酸分子が非常に極少数で存在する場合に、そのような核酸分子の
検出のために特に有用である。
【０２６６】 代替の実施形態において、サンプル細胞からのＰＲＯＸ遺伝子における変異は
、制限酵素切断パターンにおける変更によって同定され得る。例えば、サンプル
およびコントロールのＤＮＡが単離され、増幅され（必要に応じて）、１つ以上
の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化され、そしてフラグメント長の大きさが
ゲル電気泳動によって決定され、そして比較される。サンプルＤＮＡとコントロ
ールＤＮＡとの間のフラグメント長の大きさにおける差異は、そのサンプルＤＮ
Ａにおける変異を示す。さらに、配列特異的なリボザイムの使用（例えば、米国
特許第５，４９３，５３１号を参照のこと）を使用して、リボザイム切断部位の
発生または喪失によって特異的な変異の存在についてスコア付けし得る。
【０２６７】 他の実施形態において、ＰＲＯＸにおける遺伝子変異は、サンプル核酸および
コントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、数百または数千のオリゴ
ヌクレオチドプローブを含む高密度アレイに対してハイブリダイズさせることに
よって同定され得る（例えば、Ｃｒｏｎｉｎら（１９９６）Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔ
ａｔｉｏｎ ７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌら（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．
２：７５３−７５９を参照のこと）。例えば、ＰＲＯＸにおける遺伝子変異は、
Ｃｒｏｎｉｎら（前出）に記載されるように光生成ＤＮＡプローブを含む二次元
アレイにおいて同定され得る。手短には、プローブの第一ハイブリダイゼーショ
ンアレイを用いて、サンプルおよびコントロールにおける長いストレッチのＤＮ
Ａにわたって走査し、連続的に重複するプローブの線形アレイを作成することに
よって、その配列間の塩基変化を同定し得る。この工程は、点変異の同定を可能
にする。この工程に第二のハイブリダイゼーションアレイが続き、これは、検出
される全ての改変体または変異体に相補的な、より小さな特化されたプローブア
レイを用いることによる特定の変異の特徴付けを可能にする。各変異アレイは、
一方が野生型遺伝子に対して相補的であり、そして他方が変異遺伝子に対して相
補である並行プローブセットから構成される。
【０２６８】 なお別の実施形態において、当該分野で公知の種々の配列決定反応のいずれか
を使用して、ＰＲＯＸ遺伝子を直接配列決定し得、そしてサンプルＰＲＯＸ配列
と対応する野生型（コントロール）配列とを比較することによって、変異を検出
し得る。配列決定反応の例としては、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７
７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ ７４：５６０またはＳａ
ｎｇｅｒ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ ７４：
５４６３によって開発された技術に基づくものが挙げられる。診断アッセイを実
施する場合、種々の自動化配列決定手順のいずれかを利用し得ることもまた意図
される（例えば、Ｎａｅｖｅら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９
：４４８を参照のこと）。これらには、質量分析法による配列決定法（例えば、
ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉ
ｎら（１９９３）Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３８．：
１４７−１５９を参照のこと）が含まれる。
【０２６９】 ＰＲＯＸ遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、切断剤から
の保護を使用して、ＲＮＡ／ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二重鎖に基
づくミスマッチ塩基を検出する方法が挙げられる（例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９
８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２を参照のこと）。一般に、「ミスマッ
チ切断」の当該分野の技術は、野生型のＰＲＯＸ配列を含む（標識された）ＲＮ
ＡまたはＤＮＡを、組織サンプルから得られた潜在的な変異体ＲＮＡまたはＤＮ
Ａとハイブリダイズさせることによって形成されるヘテロ二重鎖を提供する工程
によって始まる。この二本鎖の二重鎖を、二重鎖の一本鎖領域（例えば、そのコ
ントロールとサンプルの鎖との間の塩基対ミスマッチに起因して存在するもの）
を切断する薬剤を用いて処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を、ＲＮａｓ
ｅを用いて処理し得、そしてＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、そのミスマッチ領
域を酵素的に消化することに対して、Ｓ1ヌクレアーゼを用いて処理し得る。他
の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡのいずれかの二重鎖
を、ミスマッチ領域を消化するために、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミ
ウム、およびピペリジンを用いて処理し得る。そのミスマッチ領域の消化後、次
いで、得られた物質を変性ポリアクリルアミドゲル上で、大きさにより分離して
、変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａ
ｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら（１９９
２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２１７：２８６−２９５を参照のこと。
１つの実施形態において、コントロールのＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のために
標識され得る。 なお別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、二本鎖ＤＮＡにおけるミ
スマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ
修復」酵素）を、細胞のサンプルから得られたＰＲＯＸ ｃＤＮＡにおける点変
異を検出およびマッピングするために規定された系において使用する。例えば、
Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、そしてＨｅＬ
ａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断す
る（例えば、Ｈｓｕら（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １５：１６
５７〜１６６２を参照のこと）。例示的な実施形態に従って、ＰＲＯＸ配列（例
えば、野生型ＰＲＯＸ配列）に基づくプローブは、試験細胞由来のｃＤＮＡまた
は他のＤＮＡ産物にハイブリダイズされる。二重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵
素を用いて処理され、そしてその切断産物（もしあれば）は、電気泳動プロトコ
ルなどから検出され得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこ
と。
【０２７０】 他の実施形態において、電気泳動の移動度における変化は、ＰＲＯＸ遺伝子に
おける変異を同定するために使用される。例えば、一本鎖コンホメーション多型
（ＳＳＣＰ）は、変異体と野生型核酸との間の電気泳動の移動度における差異を
検出するために使用され得る（例えば、Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎ
ａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ：８６：２７６６、またＣｏｔｔｏｎ（１９
９３）Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ２８５：１２５〜１４４；Ｈａｙａｓｈｉ（１９９
２）Ｇｅｎｅｔ Ａｎａｌ Ｔｅｃｈ Ａｐｐｌ ９：７３〜７９を参照のこと
）。サンプルおよびコントロールＰＲＯＸ核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは、
変性され、そして再生される。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、
電気泳動の移動度において得られる変化は、１つの塩基変化の検出さえも可能に
する。ＤＮＡフラグメントは、標識され得るか、または標識されたプローブを用
いて検出され得る。アッセイの感度は、ＤＮＡよりもむしろ、二次構造が配列中
の変化に対してより感受的であるＲＮＡを使用することによって増強され得る。
１つの実施形態において、本発明の方法は、ヘテロ二重鎖分析を利用して、電気
泳動の移動度における変化に基づいて二本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離する。例
えば、Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ ７：５を参照のこと
。
【０２７１】 なお別の実施形態において、一定勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミド
ゲルにおける変異体または野生型フラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動
（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイされる。例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎ
ａｔｕｒｅ ３１３：４９５を参照のこと。ＤＧＧＥが分析の方法として使用さ
れる場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲにより約４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮ
ＡのＧＣクランプを付加することによって、完全には変性されないことを保証す
るように改変される。さらなる実施形態において、温度勾配は、コントロールお
よびサンプルＤＮＡの移動度における差異を同定するために、変性剤勾配の代わ
りに使用される。例えば、ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８
７）Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ ２６５：１２７５３を参照のこと。
【０２７２】 点変異を検出するための他の技術の例としては、以下が挙げられるが、これら
に限定されない：選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増
幅、または選択的プライマー伸長。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、
既知の変異が中心的に配置されるように調製され得、次いで、完全なマッチが見
出される場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的ＤＮＡにハ
イブリダイズされる。例えば、Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４
：１６３）；Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
ＵＳＡ ８６：６２３０を参照のこと。このような対立遺伝子特異的オリゴヌ
クレオチドは、このオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に付着され、そして
標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズされる場合に、ＰＣＲ増幅された標的Ｄ
ＮＡまたは多くの異なる変異にハイブリダイズされる。
【０２７３】 あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明
と合わせて使用され得る。特異的増幅についてのプライマーとして使用されるオ
リゴヌクレオチドは、分子の中心において（その結果、増幅は、差次的ハイブリ
ダイゼーションに依存する）（例えば、Ｇｉｂｂｓら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １７：２４３７〜２４４８を参照のこと）か、あるい
は適切な条件下でミスマッチが妨げられ得るかまたはポリメラーゼ伸長を減少し
得る、１つのプライマーの３’の最末端で、目的の変異を保有し得る（例えば、
Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ １１：２３８を参照のこと）。
さらに、切断に基づく検出を行うために、変異領域に新規な制限部位を導入する
ことは、望ましくあり得る。例えば、Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２）Ｍｏｌ
Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ６：１を参照のこと。特定の実施形態において、増
幅はまた、増幅用Ｔａｑリガーゼを使用して実施され得ることが予測される。例
えば、Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ
Ａ ８８：１８９を参照のこと。このような場合において、連結は、５’配列の
３’末端に完全なマッチが存在する場合にのみ生じ、増幅の存在または非存在を
探索することによって、特定の部位における既知の変異の存在を検出することを
可能にする。
【０２７４】 本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書中に記載される少なくとも
１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む、予めパッケージングされた診断キッ
トを利用することによって実施され得、これは、例えば、ＰＲＯＸ遺伝子を含む
疾患または疾病の症状または家族病歴を示す患者を診断するための臨床的設定に
おいて簡便に使用され得る。
【０２７５】 さらに、ＰＲＯＸが発現される任意の細胞型または組織（好ましくは、末梢血
白血球）は、本明細書中に記載される予後アッセイにおいて利用され得る。しか
し、有核細胞を含む任意の生物学的サンプル（例えば、頬粘膜細胞を含む）が、
使用され得る。
【０２７６】 （薬理ゲノム学（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）） ＰＲＯＸ活性（例えば、ＰＲＯＸ遺伝子発現）に対する刺激性または阻害性の
影響を有する因子、すなわちモジュレーターは、本明細書中に記載されるスクリ
ーニングアッセイによって同定されるように、異常なＰＲＯＸ活性と関連した障
害（例えば、癌）または免疫障害を処置（予防的または治療的に）するために、
個体に投与され得る。このような処置と合わせて、個体の薬理ゲノム学（すなわ
ち、個体の遺伝子型と外来化合物または薬物に対するその個体の応答との間の関
係についての研究）が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的
に活性な薬物の用量と血中濃度との間の関係を変更することによって、重篤な毒
性または治療の失敗を導き得る。従って、個体の薬理ゲノム学は、個体の遺伝子
型の考慮に基づく予防的または治療的処置のために有効な薬剤（例えば、薬物）
の選択を許容する。このような薬理ゲノム学は、さらに、適切な投薬量および治
療剤レジメンを決定するために使用され得る。従って、ＰＲＯＸタンパク質の活
性、ＰＲＯＸ核酸の発現、あるいは個体におけるＰＲＯＸ遺伝子の変異含量が決
定されて、それによって個体の治療的または予防的処置のために適切な薬剤を選
択し得る。
【０２７７】 薬理ゲノム学は、罹患された人における変更された薬物の性質および異常な作
用に起因して、薬物に応答する臨床的に有意な遺伝性変更を扱う。例えば、Ｅｉ
ｃｈｅｌｂａｕｍ、１９９６、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ，２３：９８３〜９８５およびＬｉｎｄｅｒ、１９９７、Ｃｌｉｎ Ｃ
ｈｅｍ，４３：２５４〜２６６を参照のこと。一般に、２つの型の薬理ゲノム学
状態が、区別され得る。薬物が身体に作用する方法を変更する１つの因子として
伝達される遺伝的状態（変更された薬物作用）、または身体が薬物に作用する方
法を変更する１つの因子として伝達される遺伝的状態（変更された薬物代謝）。
これらの薬理ゲノム学状態は、稀な欠損としてか、または多型としてのいずれか
で生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠
損は、一般的な遺伝性酵素病であり、この主な臨床的合併症は、酸化剤薬物（抗
マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの
消費後の溶血である。
【０２７８】 例示的な実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続
期間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトラ
ンスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およ
びＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、幾人かの患者が予期される薬物効果
を得ないか、または標準的かつ安全な用量の薬物を摂取した後に過大な薬物応答
および深刻な毒性を示すことに関しての説明を提供した。これらの多型は、集団
において２つの表現型（高い代謝能を持つ人（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｍｅｔａｂ
ｏｌｉｚｅｒ）（ＥＭ）および低い代謝能を持つ人（ｐｏｏｒ ｍｅｔａｂｏｌ
ｉｚｅｒ）（ＰＭ））で表現される。ＰＭの有病率は、異なる集団の間で異なる
。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型であり、そしていくら
かの変異がＰＭにおいて同定されており、この全ては機能的ＣＹＰ２Ｄ６の非存
在に至る。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低い代謝能を持つ人は、彼らが
標準的な用量を受ける場合に、かなり頻繁に過大な薬物応答および副作用を経験
する。代謝産物が活性な治療的部分である場合、そのＣＹＰ２Ｄ６形成代謝産物
であるモルヒネによって媒介されるコデインの鎮痛効果について実証されるよう
に、ＰＭは治療的応答を示さない。他の極端なものは、標準的な用量に応答しな
い、いわゆる超迅速な代謝能を持つ人である。最近、超迅速な代謝の基準となる
分子は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因していることが同定されている。
【０２７９】 従って、ＰＲＯＸのタンパク質の活性、ＰＲＯＸの核酸の発現、あるいは個体
におけるＰＲＯＸの遺伝子の変異内容を決定して、それによって、その個体の治
療的または予防的処置のために適切な薬剤を選択し得る。さらに、薬理ゲノム学
の研究を使用して、個体の薬物応答性の表現型の同定に対して薬物代謝酵素をコ
ードする多型対立遺伝子の遺伝子型を適用し得る。この知見は、用量または薬物
選択に適用される場合、有害な反応または治療の失敗を回避し得、従って、被験
体をＰＲＯＸの調節因子（例えば、本明細書中に記載される例示的なスクリーニ
ングアッセイの１つによって同定される調節因子）を用いて処置する場合に治療
的または予防的効率を増強し得る。
【０２８０】 （臨床試験中の効果のモニタリング） ＰＲＯＸの発現または活性（例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調
節する能力）に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングする
ことは、基本的な薬物スクリーニングおよび臨床試験に適用され得る。例えば、
本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイによって決定される、Ｐ
ＲＯＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを増加するため、またはＰＲＯＸ活性を
アップレギュレートする薬剤の効力は、減少したＰＲＯＸの遺伝子発現、タンパ
ク質レベル、またはダウンレギュレートしたＰＲＯＸの活性を示す被験体の臨床
試験においてモニターされ得る。あるいは、スクリーニングアッセイによって決
定される、ＰＲＯＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを減少、またはＰＲＯＸの
活性をダウンレギュレートする薬剤の効力は、増加したＰＲＯＸの遺伝子発現、
タンパク質レベル、またはアップレギュレートしたＰＲＯＸの活性を示す被験体
の臨床試験においてモニターされ得る。このような臨床試験において、ＰＲＯＸ
の発現または活性、および好ましくは、例えば、増殖または神経障害に関与する
ような他の遺伝子が、「リードアウト（読み出し）（ｒｅａｄ ｏｕｔ）」、す
なわち、特定の細胞の応答性のマーカーとして使用され得る。
【０２８１】 例示の目的で、限定する目的ではなく、例えば、ＰＲＯを含む遺伝子（これは
、ＰＲＯＸ活性（例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセ
イにおいて同定される）を調節する薬剤（例えば、化合物、薬物または低分子）
を用いる処置によって、細胞内で調節される）が、同定され得る。従って、細胞
性増殖障害に対する薬剤の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、
細胞が単離され得、そしてＲＮＡが調製され得、そしてＰＲＯＸおよびこの障害
に関与する他の遺伝子の発現のレベルについて分析され得る。遺伝子発現のレベ
ル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるように、ノー
ザンブロット分析もしくはＲＴ−ＰＣＲによるか、あるいは産生されるタンパク
質の量を測定することによるか、本明細書中に記載されるような方法の１つによ
るか、あるいはＰＲＯＸまたは他の遺伝子の活性のレベルを測定することによっ
て、定量され得る。この様式で、この遺伝子発現パターンは、この薬剤に対する
細胞の生理学的応答の指標であるマーカーとして作用し得る。従って、この応答
状態は、この薬剤を用いる個体の処置の前、および処置の間の種々の時点で、決
定され得る。
【０２８２】 １つの実施形態において、本発明は、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニ
スト、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド模倣物、低分子、または本明細書
中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される他の薬物候補物）を
用いる、被験体の処置の効力をモニタリングするための方法を提供し、これは、
以下の工程を包含する：（ｉ）薬剤の投与の前に、被験体から投与前サンプルを
得る工程；（ｉｉ）この投与前サンプルにおいて、ＰＲＯＸのタンパク質、ｍＲ
ＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出する工程；（ｉｉｉ）この被験
体から１つ以上の投与後サンプルを得る工程；（ｉｖ）この投与後サンプルにお
いて、ＰＲＯＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性
のレベルを検出する工程；（ｖ）この投与前サンプルにおけるＰＲＯＸのタンパ
ク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、この投与後
サンプルにおけるＰＲＯＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現
または活性のレベルと比較する工程；ならびに（ｖｉ）従って、この被験体に対
する薬剤の投与を変更する工程。例えば、この薬剤の増加した投与は、検出され
るよりも高いレベルにＰＲＯＸの発現または活性を増加することが（すなわち、
この薬剤の効力を増加すること）望ましくあり得る。あるいは、この薬剤の減少
した投与は、検出されるよりも低いレベルにＰＲＯＸの発現または活性を減少す
ることが（すなわち、この薬剤の効力を減少すること）望ましくあり得る。
【０２８３】 （処置方法） 本発明は、異常なＰＲＯＸの発現または活性に関連する障害の危険性のある（
または感受性）か、またはこの障害を有する被験体を処置する予防的および治療
的の両方の方法を提供する。これらの治療方法は、以下により詳細に記載される
。
【０２８４】 （疾患および障害） （その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）増加したレベルま
たは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を拮抗する（
すなわち、低減または阻害する）治療剤を用いて処置され得る。活性を拮抗する
治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤と
しては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）上記ペプチド、ま
たはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；（ｉｉ）上記ペプ
チドに対する抗体；（ｉｉｉ）上記ペプチドをコードする核酸；（ｉｖ）相同組
換えによって上記ペプチドの内因性機能を「ノックアウトする」ために利用され
る、アンチセンス核酸および「機能不全性」である（すなわち、上記ペプチドに
対するコード配列のコード配列内の異種挿入に起因する）核酸の投与、（例えば
、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８〜１２９２
を参照のこと）；または（ｖ）上記ペプチドとその結合パートナーとの間の相互
作用を変化させる、調節因子（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアン
タゴニスト（本発明のさらなるペプチド模倣物または本発明のペプチドに対して
特異的な抗体を含む））。
【０２８５】 （その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）減少したレベルま
たは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を増加させる
（すなわち、活性に対するアゴニストである）治療剤を用いて処置され得る。活
性をアップレギュレートする治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され
得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されな
い：上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモロ
グ；あるいはバイオアベイラビリティーを増加させるアゴニスト。
【０２８６】 増加したレベルまたは減少したレベルは、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定
量することによって、容易に検出され得る。この定量は、患者の組織サンプルを
（例えば、生検組織から）入手し、そしてそのサンプルを、その発現したペプチ
ド（または上記ペプチドのｍＲＮＡ）のＲＮＡレベルまたはペプチドレベル、構
造および／または活性をインビトロでアッセイすることによる。当該分野におい
て周知の方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イムノア
ッセイ（例えば、ウェスタンブロット分析、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
ポリアクリルアミドゲル電気泳動が後に続く免疫沈降、免疫細胞化学などによる
）および／またはｍＲＮＡの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッ
セイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイ
ゼーションなど）。
【０２８７】 （予防的方法） １つの局面において、本発明は、被験体において異常なＰＲＯＸの発現または
活性と関連する疾患または状態を、ＰＲＯＸの発現または少なくとも１つのＰＲ
ＯＸ活性を調節する薬剤をこの被験体に投与することによって予防するための方
法を提供する。異常なＰＲＯＸの発現または活性によって引き起こされるかまた
はこれらに起因する、疾患にかかる危険がある被験体は、例えば、本明細書中に
記載の診断アッセイまたは予後アッセイのいずれか、またはそれらの組み合わせ
によって、同定され得る。予防薬剤の投与は、疾患または障害が予防されるか、
あるいはその進行を遅らせられるように、このＰＲＯＸ異常の特徴である症状の
発現の前に行い得る。このＰＲＯＸ異常の型に依存して、例えば、ＰＲＯＸアゴ
ニスト薬剤またはＰＲＯＸアンタゴニスト薬剤が、その被験体を処置するために
使用され得る。その適切な薬剤は、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイ
に基づいて決定され得る。本発明の予防方法は、以下の小区分において、さらに
議論される。
【０２８８】 （治療方法） 本発明の別の局面は、治療目的のためにＰＲＯＸの発現または活性を調節する
方法に関する。本発明の調節方法は、細胞を、その細胞に関するＰＲＯＸタンパ
ク質活性の活性のうちの１つ以上を調節する薬剤と接触させる工程を包含する。
ＰＲＯＸタンパク質活性を調節する薬剤は、核酸またはタンパク質、ＰＲＯＸタ
ンパク質の天然に存在する同族リガンド、ペプチド、ＰＲＯＸペプチド模倣物、
または他の低分子のような、本明細書中に記載されるような薬剤であり得る。１
つの実施形態において、この薬剤は、ＰＲＯＸタンパク質活性のうちの１つ以上
を刺激する。このような刺激薬剤の例としては、活性なＰＲＯＸタンパク質、お
よびその細胞に導入されたＰＲＯＸをコードする核酸分子が挙げられる。別の実
施形態において、この薬剤は、ＰＲＯＸタンパク質活性のうちの１つ以上を阻害
する。このような阻害薬剤の例としては、アンチセンスＰＲＯＸ核酸分子、およ
び抗ＰＲＯＸ抗体が挙げられる。これらの調節方法は、インビトロで（例えば、
その薬剤とともにその細胞を培養することによって）、あるいはインビボで（例
えば、被験体にその薬剤を投与することによって）実施され得る。このように、
本発明は、ＰＲＯＸのタンパク質または核酸分子の、異常な発現または異常な活
性によって特徴付けられる、疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提
供する。１つの実施形態において、この方法は、ＰＲＯＸの発現または活性を調
節する（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）薬剤（例
えば、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される薬剤）あ
るいはそのような薬剤の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態に
おいて、この方法は、ＰＲＯＸのタンパク質または核酸分子を、低減したかまた
は異常な、ＰＲＯＸの発現または活性を補償するための治療として、投与する工
程を包含する。
【０２８９】 ＰＲＯＸ活性の刺激は、ＰＲＯＸが異常にダウンレギュレートされている状況
、および／またはＰＲＯＸ活性の増加が有益な効果を有するようである状況にお
いて、望ましい。このような状況の１つの例は、被験体が、異常な細胞増殖およ
び／または細胞分化によって特徴付けられる障害（例えば、癌または免疫関連）
を有する場合である。このような状況の別の例は、被験体が免疫不全疾患（例え
ば、ＡＩＤＳ）を有する場合である。
【０２９０】 （治療剤の生物学的効果の決定） 本発明の種々の実施形態において、適切なインビトロまたはインビボアッセイ
を行って、特定の治療剤の効果およびその投与が罹患組織の処置を示すか否かを
決定する。
【０２９１】 種々の特定の実施形態において、インビトロアッセイが患者の障害に関与する
代表的な細胞型で行われ、所定の治療剤がこの細胞型に対して所望の効果を発揮
するか否かを決定し得る。治療において使用する化合物は、ヒト被験体において
試験する前に適切な動物モデル系において試験され得る。これらの動物モデル系
としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ラット、マウス、ニワ
トリ、ウシ、サル、ウサギなど。同様に、インビボ試験については、当該分野で
公知の任意の動物モデル系が、ヒト被験体に対する投与の前に使用され得る。
【０２９２】 （本発明の組成物の予防的および治療的使用） 本発明のＰＲＯＸ核酸およびタンパク質は、種々の潜在的な予防的および治療
適用において有用であり得る。非限定的な例により、本発明のＰＲＯＸタンパク
質をコードするｃＤＮＡは遺伝子治療において有用であり得、そしてタンパク質
は、その必要性に応じ、患者に投与される場合、有用であり得る。
【０２９３】 ＰＲＯＸタンパク質をコードする新規な核酸、本発明のＰＲＯＸタンパク質、
およびそのフラグメントは、診断適用において有用であり、ここで、核酸または
タンパク質の存在または量が、評価される。これらの物質は、さらに、治療あま
たは診断方法における使用のための本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する
抗体の生成において、有用である。 本発明はさらに、以下の実施例において記載され、この実施例は、特許請求の範
囲において記載される本発明の範囲を限定しない。
【０２９４】 （実施例） （実施例１． ＰＲＯ１およびＰＲＯ３核酸の染色体位置をマッピングすること
） ヒト染色体マーカーを用いる放射ハイブリッドマッピングを、ＰＲＯ１および
ＰＲＯ３について実施した。これらの結果を得るために使用した手順は、当該分
野において公知の方法（例えば、Ｓｔｅｅｎら，１９９９，Ａ Ｈｉｇｈ−Ｄｅ
ｎｓｉｔｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｌｉｎｋａｇｅ ａｎｄ
Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｈｙｂｒｉｄ Ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｒａｔ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．（１９９９年５月２１日にオンライン
で公開）９：ＡＰ１−ＡＰ８）に類似する。無作為化した放射により誘導したヒ
ト染色体フラグメントを含む９３細胞クローンのパネルを、９６ウェルプレート
内で、所定のクローンを独特の様式で同定するよう設計したＰＣＲプライマーを
使用して、スクリーニングした。表１９は、本発明の２つのクローンのそれぞれ
（すなわち、クローン２０４６８７５２．０．１８（ＰＲＯＸ１）およびクロー
ン１１６９２０１０．０．５１（ＰＲＯＸ３））が見出される２つのマーカーお
よびクローンからの距離を示す。
【０２９５】
【表１９】 （実施例２．クローン２０４６８７５２．０．１８−Ｕ，ＰＲＯ２核酸の分子
クローニング） クローン２０４６８７５２．０．１８−Ｕに関して予測された全長７２０残基
タンパク質および２１残基の単一ペプチドを取り除いた成熟ポリペプチドの両方
をコードするｃＤＮＡをクローニングのために標的化した。
【０２９６】 （Ａ．成熟タンパク質） 以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、成熟形態をコードするｃＤＮＡをク
ローニングするために使用した：
【０２９７】
【化１】 下流クローニングのために、正方向プライマーは、インフレームＥｃｏＲＩま
たはＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含み、そして逆方向プライマーは、インフレーム
ＸｈｏＩ制限部位を含む。
【０２９８】 ＰＣＲ増幅反応を、５ｎｇのヒト胎児脳ｃＤＮＡを鋳型として用いて実施した
。反応混合物は、各々、１μＭの２０４６８７５２Ｅｃｏ正方向または２０４６
８７５２Ｈｉｎｄ正方向プライマーおよび２０４６８７５２Ｎｅｗ逆方向プライ
マー；５μモルのｄＮＴＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐ
ａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）および１μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦ２ポ
リメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔ
ｏ ＣＡ）（５０マイクロリットル容量中）を含んだ。以下のＰＣＲ増幅反応条
件を使用した： ａ） ９６℃ ３分間 ｂ） ９６℃ ３０秒間変性 ｃ） ６０℃ ３０秒間、プライマーアニーリング ｄ） ７２℃ ４分間伸長 工程（ｂ）〜（ｄ）を３５回繰り返す ｅ） ７２℃ ５分間最終伸長。
【０２９９】 約２ｋｂｐの予測した増幅産物を、アガロースゲル電気泳動により検出した。
このフラグメントをゲルから単離し、製造者の推奨にしたがって、ｐＣＲ２．１
ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結した。クロ
ーニングした挿入物を、Ｍ１３正方向プライマー、Ｍ１３逆方向プライマーを使
用して、以下の遺伝子特異的プライマーと組み合わせて、配列決定した：
【０３００】
【化２】 挿入物が、残基２２と残基７２０との間の２０４６８７５２．０．１８−Ｕタ
ンパク質（ＰＲＯＸ２）の予測した成熟細胞外ドメインをコードするオープンリ
ーディングフレーム（ＯＲＦ）を有することを確かめた。翻訳されたアミノ酸配
列は、クローン２０４６８７５２．０．１８−Ｕの成熟形態に予測された配列と
１００％同一である。この構築物は、ｐＣＲ２．１−２０４６８７５２−Ｓ４１
４Ａと呼ばれる。
【０３０１】 （Ｂ．全長クローン２０４６８７５２．０．１８−Ｕ） 全長ｃＤＮＡをクローニングするために、ＰＣＲプライマーをＡＴＧ開始部位
から固有のＢａｍＨＩ部位のｃＤＮＡの５’位置を増幅するように、設計した。
以下のプライマーを使用した：
【０３０２】
【化３】 正方向プライマーは、ＮｈｅＩ制限部位をおよびコンセンサスＫｏｚａｋ配列
（ＣＣＡＣＣ）を含む。逆方向プライマーは、ｃＤＮＡ配列の位置７５９にＢａ
ｍＨＩ制限部位を含む領域にかかる。
【０３０３】 ＰＣＲ増幅反応を、５ｎｇのヒト胎児脳ｃＤＮＡを鋳型として用いて実施した
。反応混合物は、各々、１μＭの２０４６８７５２Ｎａｔ Ｆｏｒｗプライマー
および２０４６８７５２Ｎａｔ Ｒｅｖプライマー；５μモルのｄＮＴＰ（Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）および
１μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦ２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）（５０マイクロリット
ル容量中）を含んだ。反応条件は、上記と同じであるが、工程（ｄ）の伸長時間
が、２分である。
【０３０４】 予測したサイズの増幅産物を、アガロースゲル電気泳動により検出した。次い
で、ＰＣＲ産物をアガロースゲルから単離し、ｐＣＲ２．１ベクターにクローニ
ングした。この構築物の配列を、ＡＴＧ開始ぶいからＢａｍＨＩ−７５９部位に
またがるクローン２０４６８７５２の５’セグメントとして確認した。得られた
構築物をｐＣＲ２．１−２０４６８７５２−Ｎａｔ−Ｓ５３０−１７Ｃと呼んだ
。
【０３０５】 ２０４６８７５２．０．１８−Ｕセグメント（ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−２０４６
８７５２と称される；以下の実施例４を参照のこと）を含む発現構築物を、Ｎｈ
ｅＩおよびＢｍａＨＩで消化し、線状化ベクターをゲル精製した。ｐＣＲ２．１
−２０４６８７５２−Ｎａｔ−Ｓ５３０−１７Ｃをまた、ＮｈｅＩおよびＢａｍ
ＨＩで消化し、そして得られたフラグメント（これは、ＡＴＧ開始部位からＢａ
ｍＨＩ−７５９部位までを含む）を、単離した。このフラグメントを、続いて、
線状化発現ベクターに連結した。クローニングされたポリヌクレオチドの配列は
、残基１〜残基６７８の、クローン２０４６８７５２．０．１８−Ｕによってコ
ードされるタンパク質について予測される配列と１００％同一である配列のポリ
ペプチドをコードすることが見出された。
【０３０６】 （実施例３：哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４／Ｓｅｃの調製） ２つのオリゴヌクレオチドプライマーを設計して、Ｖ５およびＨｉｓ６を含む
発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌ
ｓｂａｄ，ＣＡ）からフラグメントを増幅した。これらのプライマーは以下を含
む：
【０３０７】
【化４】 ＰＣＲ増幅に続いて、この産物を、ＸｈｏＩおよびＡｐａＩで消化し、そして
、ｉ−ｋａｐｐａリーダー配列を保有し、ＸｈｏＩ／ＡｐａＩで消化したｐＳｅ
ｃＴａｇ２Ｂベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連
結した。インフレームでｉ−ｋａｐｐａリーダーおよびＶ５−Ｈｉｓ６を含む、
生じたベクター（ｐＳｅｃＶ５Ｈｉｓと名付けた）の正しい構造を、ＤＮＡ配列
決定分析によって確認した。次いで、このベクターｐＳｅｃＶ５Ｈｉｓを、Ｐｍ
ｅＩおよびＮｈｅＩで消化し、正しいフレームに上記のエレメントを保持するフ
ラグメントを提供した。ＰｍｅＩ／ＮｈｅＩで消化したフラグメントを、Ｂａｍ
ＨＩ／Ｋｌｅｎｏｗ処理およびＮｈｅＩ処理したベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結した。この生じたベクターはｐ
ＣＥＰ４／Ｓｅｃと名付けられ、そしてＰＣＭＶプロモーターおよび／またはＰ
Ｔ７プロモーターの制御下で、インフレームでのｉ−ｋａｐｐａリーダー、目的
のクローンの挿入部位、ならびにＶ５部位およびＨｉｓ６部位を含んだ。ｐＣＥ
Ｐ４／Ｓｅｃは、ｉ−Ｋａｐｐａ鎖シグナルペプチドに任意のタンパク質を融合
させることによる、異種性タンパク質の発現および分泌を可能にする発現ベクタ
ーである。発現タンパク質の検出および精製を、カルボキシ末端でのＶ５エピト
ープタグおよび６×Ｈｉｓタグ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃ
Ａ）の存在により援助した。
【０３０８】 （実施例４：ヒト胚性腎臓２９３細胞における２０４６８７５２．０．１８−
Ｕの発現） 成熟２０４６８７５２．０．１８−Ｕ配列を含むＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグ
メントをｐＣＲ２．１−２０４６８７５２−Ｓ４１４Ａ（実施例２、先述）から
単離し、そしてベクターｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ
）にサブクローニングした。この生じたベクター（ｐＥＴ２８ａ−２０４６８７
５２と名付けた）を、ＢａｍＨＩで部分的に消化し、次いで、ＸｈｏＩで完全に
消化した。この生じた２．０ｋｂのフラグメントを単離し、そしてＢａｍＨＩ−
ＸｈｏＩで消化したｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ（実施例ＡＢ３、前述を参照のこと）に
連結し、ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−２０４６８７５２と名付けた発現ベクターを作製
した。引き続き、ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−２０４６８７５２ベクターを、製造業者
の説明書に従って、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ（登録商標）試薬（Ｇ
ｉｂｃｏ／ＢＲＬ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して、ヒト胚性腎臓２９
３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの約７２時間後に、トラ
ンスフェクションの約７２時間後に、細胞のペレットおよび上清を回収し、そし
て抗Ｖ５抗体を用いるウエスタンブロッティング（還元条件下）によってｈ２０
４６８７５２の発現について試験した。図３は、成熟２０４６８７５２．０．１
８−Ｕが、２９３細胞によって分泌される約９８０００ダルトンのおよその分子
量（Ｍｒ）を有するタンパク質として発現されることを示す。
【０３０９】 （実施例５：１１６９２０１０．０．５１の分子クローニング） クローン１１６９２０１０．０．５１の予想されるオープンリーディングフレ
ーム（ＯＲＦ）は、６４９アミノ酸のＩａ型膜貫通タンパク質をコードする。Ｓ
ＩＧＮＡＬＰコンピュータープログラムは、おそらく残基２８と２９との間に位
置するペプチダーゼ切断部位を有するシグナル配列を予想した。ＰＳＯＲＴコン
ピュータープログラムは、膜貫通領域が残基５３２と５４８との間に位置すると
予想した。従って、成熟形態の細胞外セグメント（すなわち、残基２９と５３１
との間）をコードするｃＤＮＡを、次のクローニングのために選択した。以下の
オリゴヌクレオチドプライマーを、このｃＤＮＡをＰＣＲ増幅するために設計し
た：
【０３１０】
【化５】 引き続くクローニングの目的に、順方向（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマーは、イ
ンフレームでＢａｍＨＩ制限部位を含み、一方、逆方向（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プラ
イマーは、インフレームでＸｈｏＩ制限部位を含んだ。上述の、１１６９２０１
０の順方向および１１６９２０１０の逆方向についての配列において、制限部位
配列に下線を付した。
【０３１１】 総量５ｎｇのヒト胎児脳ｃＤＮＡをテンプレートとして使用して、ＰＣＲ増幅
反応を実施した。反応混合物は、５０μｌの総反応容量中に以下の試薬を含んだ
：それぞれ１μＭの１１６９２０１０の順方向プライマーおよび１１６９２０１
０の逆方向プライマー；５μモルのｄＮＴＰ混合物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）および１μｌの５０×Ａｄｖ
ａｎｔａｇｅ−ＨＦ２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）。実施例２のＢ項に先述したような反応条件
を利用した。
【０３１２】 約１５００ｂｐの予想サイズを有する増幅した産物を、アガロースゲル電気泳
動によって検出した。このフラグメントをゲルから精製し、そして、製造業者の
推薦書に従ってｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａ
ｄ，ＣＡ）に連結した。次いで、このクローニングした挿入物を、（ベクター特
異的Ｍ１３順方向プライマーおよびＭ１３逆方向プライマーを使用して）以下の
遺伝子特異的プライマーと組み合わせて配列決定した：
【０３１３】
【化６】 予想される１１６９２０１０．０．５１タンパク質の残基２９と３５１との間
をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として、挿入物を確認し
た。この構築物を、１１６９２０１０．０．５１−ｐＣＲ２．１−Ｓ２１４−３
Ｃと名付けた。この構築物によってコードされた翻訳されたタンパク質配列が、
クローン１１６９２０１０．０．５１の対応する位置に１００％同一であること
を見出した。
【０３１４】 （実施例６：ヒト胚性腎臓２９３細胞における１１６９２０１０．０．５１の
発現） １１６９２０１０．０．５１配列のクローニングされたフラグメントを含むＢ
ａｍＨＩ／ＸｈｏＩフラグメントを、ｐＣＲ２．１ベクター−Ｓ２１４−３Ｃ中
の１１６９２０１０（実施例５、前出を参照のこと）より単離し、そしてＢａｍ
ＨＩ／ＸｈｏＩで消化したｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ（実施例３、前出を参照のこと）
中にサブクローニングして、ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−１１６９２０１０と名付けた
発現ベクターを作製した。次いで、ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−１１６９２０１０構築
物を、製造業者の説明書に従って、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ（登録
商標）試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して、ヒ
ト胚性腎臓２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの約７２
時間後に、細胞のペレットおよび上清を回収し、そして抗Ｖ５抗体を用いるウエ
スタンブロッティング（還元条件下）によって１１６９２０１０の発現について
試験した。図４は、１１６９２０１０が、２９３細胞によって分泌される約８０
０００ダルトンのＭｒを有するタンパク質として発現されることを示す。
【０３１５】 （実施例７：クローン２７８３５９８１．０．１、ＰＲＯ４核酸の分子クロー
ニング） オリゴヌクレオチドプライマーを設計して、成熟形態の２７８３５９８１．０
．１タンパク質（すなわち、残基２５〜１６０）をコードするＯＲＦを示すＤＮ
ＡフラグメントをＰＣＲ増幅した。順方向プライマーは、インフレームでＢａｍ
ＨＩ制限部位を含み、一方、逆方向プライマーは、インフレームでＸｈｏＩ制限
部位を含んだ。これらのプライマーは、以下の配列を有した：
【０３１６】
【化７】 以下を使用して、５０μｌの総反応容量中において、ＰＣＲ増幅反応を実施し
た：５ｎｇのヒト膵臓ｃＤＮＡテンプレート；それぞれ１μＭの２７８３５９８
１の順方向プライマー（配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）８５）および２７８
３５９８１の逆方向プライマー（配列番号８７）；５μモルのｄＮＴＰ混合物（
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）；
および１μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦ２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）。引き続くＰＣ
Ｒ増幅反応条件は以下を使用した： （ａ）９６℃で３分間 （ｂ）９６℃で３０秒間の変性 （ｃ）７０℃で３０秒間のプライマーアニーリング。この温度を１サイクル当
たり１℃ずつ徐々に減少した （ｄ）７２℃で１分間の伸長 工程（ｂ）〜（ｄ）を合計１０回反復した （ｅ）９６℃で３０秒間の変性 （ｆ）６０℃で３０秒間のアニーリング （ｇ）７２℃で１分間の伸長 工程（ｅ）〜（ｇ）を合計２５回反復した （ｈ）７２℃で５分間、最終伸長。
【０３１７】 約４００ｂｐのサイズを有する増幅した産物を、アガロースゲル電気泳動によ
って検出した。次いで、総量２０μｌ中でのＱＩＡＥＸ ＩＩ（登録商標）ゲル
抽出システム（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）の使用によっ
て、この産物を単離した。
【０３１８】 この単離した産物を、続いてｐＣＲ２．１ベクターに連結し、そして配列決定
した。この挿入物が成熟２７８３５９８１．０．１タンパク質に１００％同一で
ある配列をコードするＯＲＦとして、配列を確認した。この構築物を、ｐＣＲ２
．１−２７８３５９８１−Ｓ２１６と名付けた。
【０３１９】 （実施例８：ヒト肺性腎臓２９３細胞における２７８３５９８１．０．１の発
現） ２７８３５９８１．０．１配列を含むＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩフラグメントを、
ｐＣＲ２．１−２７８３５９８１−Ｓ２１６構築物（実施例７、前出を参照のこ
と）より単離し、そしてＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化したｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ（
実施例３、前出を参照のこと）にサブクローニングして、ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−
２７８３５９８１と名付けた新たな構築物を作製した。次いで、ｐＣＥＰ４／Ｓ
ｅｃ−２７８３５９８１構築物を、製造業者の説明書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃ
ｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ（登録商標）試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ；Ｒｏｃｋｖｉｌ
ｌｅ，ＭＤ）を使用して、ヒト胚性腎臓２９３細胞にトランスフェクトした。ト
ランスフェクションの約７２時間後に、細胞のペレットおよび上清を回収し、そ
して抗Ｖ５抗体を用いるウエスタンブロッティング（還元条件下）によって２７
８３５９８１．０．１の発現について試験した。図５は、２７８３５９８１．０
．１が、３００００ダルトンのおよそのＭｒを有するタンパク質として発現し、
そして２９３細胞によって分泌されることを示す。
【０３２０】 （実施例９：クローン２１３９９２４７．０．１、ＰＲＯ５核酸の分子クロー
ニング） クローン２１３９９２４７．０．１の予想されるオープンリーディングフレー
ム（ＯＲＦ）は、５８０アミノ酸残基のタンパク質をコードする。ＳＩＧＮＡＬ
Ｐコンピュータープログラムは、おそらく残基１６と１７との間に位置する切断
部位を有する分泌シグナル配列を予想した。オリゴヌクレオチドプライマーを設
計して、成熟２１３９９２４７．０．１タンパク質（すなわち、残基１７〜５８
０）をコードするＯＲＦを示すＤＮＡセグメントをＰＣＲ増幅した。順方向プラ
イマーは、インフレームでＢａｍＨＩ制限部位を含み、一方、逆方向プライマー
は、インフレームでＸｈｏＩ制限部位を含んだ。プライマーは、以下の配列を含
んだ：
【０３２１】
【化８】 以下を使用して、５０μｌの総反応容量中において、ＰＣＲ増幅反応を実施し
た：５ｎｇのヒト甲状腺ｃＤＮＡテンプレート；それぞれ１μＭの２１３９９２
４７の順方向プライマー（配列番号８９）および２１３９９２４７の逆方向プラ
イマー（配列番号９１）；５μモルのｄＮＴＰ混合物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）；および１μｌの５０×Ａ
ｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦ２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）。増幅反応条件は、工程（ｄ）および（
ｇ）における伸長を３分間実施したことを除いて、実施例７で使用したものと同
一であった。
【０３２２】 １．７ｋｂｐの増幅産物を、アガロースゲル電気泳動によって検出した。総量
２０μｌ中でのＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅ
ｍ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して
、産物を単離した。
【０３２３】 この単離した産物をｐＣＲ２．１ベクターに連結し、そしてベクター特異的プ
ライマーおよび以下の遺伝子特異的プライマーを使用して配列決定した：
【０３２４】
【化９】 挿入物が対応する成熟２１３９９２４７．０．１タンパク質に１００％同一で
あるポリペプチドをコードするＯＲＦであるという配列分析を確認した。この構
築物を、ｐＣＲ２．１−２１３９９２４７．０．１−Ｓ２０３＃１５と名付けた
。
【０３２５】 （実施例１０：ヒト胚性腎臓２９３細胞における２１３９９２４７．０．１の
発現） 成熟２１３９９２４７．０．１配列を含むＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩフラグメント
を、ｐＣＲ２．１−２１３９９２４７−Ｓ２０３＃１５構築物（実施例９、前出
を参照のこと）より単離し、そしてＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化したｐＣＥＰ４
／Ｓｅｃ（実施例３、前出を参照のこと）中にサブクローニングしてｐＣＥＰ４
／Ｓｅｃ−２１３９９２４７と名付けた新たな構築物を作製した。次いで、ｐＣ
ＥＰ４／Ｓｅｃ−２１３９９２４７構築物を、製造業者の説明書に従って、Ｌｉ
ｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ／
ＢＲＬ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して、ヒト胚性腎臓２９３細胞にト
ランスフェクトした。トランスフェクションの約７２時間後に、細胞のペレット
および上清を回収し、そして抗Ｖ５抗体を用いるウエスタンブロッティング（還
元条件下）によって２１３９９２４７．０．１の発現について試験した。図６は
、２１３９９２４７．０．１が、約６２０００ダルトンのＭｒを有するタンパク
質として発現し、そして２９３細胞によって分泌されることを示す。
【０３２６】 （実施例１１：クローン１７９４１７８７．０．１、ＰＲＯ１４核酸の分子ク
ローニング） クローン１７９４１７８７．０．１の予想されるオープンリーディングフレー
ム（ＯＲＦ）は、８４０アミノ酸残基のタンパク質をコードすることを示す。Ｓ
ＩＧＮＡＬＰコンピュータープログラムは、おそらくアミノ酸残基２７と２８と
の間に位置する切断部位を有する分泌シグナル配列を予想した。ＰＳＯＲＴコン
ピュータープログラムは、膜貫通領域がアミノ酸残基４７７と４９３との間に位
置すると予想した。次いで、オリゴヌクレオチドプライマーを設計して、成熟１
７９４１７８７．０．１タンパク質（すなわち、残基２８〜４７６）をコードす
るＤＮＡセグメントをＰＣＲ増幅した。順方向プライマーは、インフレームでＫ
ｐｎＩ制限部位を含み、一方、逆方向プライマーは、インフレームでＸｈｏＩ制
限部位を含んだ。プライマーは、以下の配列を含んだ：
【０３２７】
【化１０】 以下を使用して、５０μｌの総反応容量中において、ＰＣＲ増幅反応を実施し
た：５ｎｇのヒト乳腺ｃＤＮＡテンプレート；それぞれ１μＭの１７９４１７８
７の順方向プライマー（配列番号１０５）および１７９４１７８７の逆方向プラ
イマー（配列番号１０７）；５μモルのｄＮＴＰ混合物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）；および１μｌの５０×
Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦ２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）。ＰＣＲ増幅反応条件は、工程（ｄ）
および（ｇ）における伸長を３分間実施したことを除いて、実施例９で使用した
ものと同一であった。
【０３２８】 約１．３ｋｂｐのサイズのＰＣＲ増幅産物を、アガロースゲル電気泳動によっ
て検出した。総量２０μｌ中でのＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉ
ｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，
ＣＡ）の使用によって、産物を単離した。
【０３２９】 次いで、この単離したＰＣＲ増幅産物をｐＣＲ２．１ベクターに連結し、そし
てベクター特異的プライマーおよび遺伝子特異的プライマーの相伴う使用によっ
て配列決定した。遺伝子特異的プライマーの配列は、以下である：
【０３３０】
【化１１】 ＤＮＡ配列分析によって得られた配列を、挿入物が成熟１７９４１７８７．０
．１に１００％同一であるＯＲＦであるとして、確認した。構築物を、ｐＣＲ２
．１−１７９４１７８７．０．１−Ｓ３２３−６と名付けた。
【０３３１】 （実施例１２：ヒト胚性腎臓２９３細胞における１７９４１７８７．０．１の
発現） 成熟１７９４１７８７．０．１配列を含むＫｐｎＩ／ＸｈｏＩフラグメントを
、ｐＣＲ２．１−１７９４１７８７−Ｓ３２３−６Ｃ構築物（実施例１１、前出
を参照のこと）より単離し、ついで、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩで消化したｐＣＥＰ４
／Ｓｅｃ（実施例３、前出を参照のこと）中にサブクローニングして、ｐＣＥＰ
４／Ｓｅｃ−１７９４１７８７を作製した。ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−１７９４１７
８７構築物を、続いて、製造業者の説明書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ
ｅＰｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ；Ｒｏｃｋｖｉ
ｌｌｅ，ＭＤ）を使用して、ヒト胚性腎臓２９３細胞にトランスフェクトした。
トランスフェクションの約７２時間後に、細胞のペレットおよび上清を回収し、
そして抗Ｖ５抗体を用いるウエスタンブロッティング（還元条件下）によって１
７９４１７８７．０．１の発現について試験した。図７は、１７９４１７８７．
０．１が、約５５ｋＤａのＭｒを有するタンパク質として２９３細胞によって細
胞内に発現されることを示す。
【０３３２】 （実施例１３：クローン１６４６７９４５．０．８５、ＰＲＯ１６核酸、およ
びクローン１６４６７９４５．０．８８、ＰＲＯ１７核酸の分子クローニング） （Ａ．成熟した安定な１６４６７９４５．０．８５のクローニング） 予想されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、１２３アミノ酸残基
を含むタンパク質をコードする。ＳＩＧＮＡＬＰコンピュータープログラムは、
おそらくアミノ酸残基１９と２０との間に位置する切断部位を有する分泌シグナ
ル配列を予想した。従って、オリゴヌクレオチドプライマーを設計して、成熟１
６４６７９４５．０．８５タンパク質（すなわち、アミノ酸残基２０〜１２３）
をコードするＤＮＡセグメントをＰＣＲ増幅した。順方向プライマーは、インフ
レームでＢａｍＨＩ制限部位を含み、そして、逆方向プライマーは、インフレー
ムでＸｈｏＩ制限部位を含んだ。プライマーの配列は、以下の配列である：
【０３３３】
【化１２】 以下を使用して、５０μｌの総反応容量中において、ＰＣＲ増幅反応を実施し
た：５ｎｇのヒト胎児肺ｃＤＮＡテンプレート；それぞれ１μＭの１６４６７９
４５．８５８８の順方向プライマーおよび１６４６７９４５．８５の逆方向プラ
イマー；５μモルのｄＮＴＰ混合物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）；および１μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ
−ＨＦ２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｐａｌ
ｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）。ＰＣＲ増幅反応は、実施例９で使用したものと同一であ
った。
【０３３４】 約３００ｂｐのサイズを有する増幅産物を、アガロースゲル電気泳動によって
検出した。この産物を、総量２０μｌ中でのＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔ
ｒａｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ；Ｖａｌｅ
ｎｃｉａ，ＣＡ）の使用によって、産物を単離した。
【０３３５】 次いで、単離したＰＣＲ増幅産物をｐＣＲ２．１ベクターに連結し、そしてベ
クター特異的プライマーを使用して配列決定した。得られたヌクレオチド配列な
らびに翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列を、表２０に示す。 （表２０） （１）１６４６７９４５．０．８５−Ｓ２５９．Ａの核酸配列
【０３３６】
【表２０】 （２）１６４６７９４５．０．８５−Ｓ２５９．Ａのアミノ酸配列
【０３３７】
【化１３】 挿入物を成熟１６４６７９４５．０．８５をコードするＯＲＦとして、核酸配
列分析を確認した。この構築物を、ｐＣＲ２．１−１６４６７９４５．０．８５
−Ｓ２５９Ａと名付けた。
【０３３８】 （Ｂ．成熟した１６４６７９４５．０．８８のクローニング） １６４６７９４５．０．８８を増幅するために使用した同一のＰＣＲ条件を、
１６４６７９４５．０．８８の増幅において使用した。生じた構築物は、１６４
６７９４５．０．８８−Ｓ２６１．Ｄと名付けられた。核酸配列（配列番号８１
）およびアミノ酸配列（配列番号８２）を、以下の表２１に示す。
【０３３９】 （表２１） （１）１６４６７９４５．０．８８−Ｓ２６１．Ｄの核酸配列
【０３４０】
【表２１】 （２）１６４６７９４５．０．８８−Ｓ２６１．Ｄのアミノ酸配列
【０３４１】
【化１４】 １６４６７９４５．０．８５−Ｓ２５９．Ａの核酸およびアミノ酸配列、およ
び１６４６７９４５．０．８８−Ｓ２６１．Ｄの核酸およびアミノ酸配列は、互
いに重なるが、これらの配列のセットの両方は、それらが、クローン１６４６７
９４５．０．８５およびクローン１６４６７９４５．０．８８（それぞれ、配列
番号３３および配列番号３４）について、上記に示される核酸およびアミノ酸配
列に対してスプライス改変体を提示することを保証する。詳細には、本実施例に
おける分子クローニングの結果（すなわち、構築物１６４６７９４５．０．８５
−Ｓ２５９．Ａおよび１６４６７９４５．０．８８−Ｓ２６１．Ｄ）は、クロー
ン１６４６７９４５．０．８５およびクローン１６４６７９４５．０．８８の配
列と比較した場合、欠失を含む。この関係を以下に図示する。欠失を含む配列の
領域のみが以下に示されることに注意すべきである。
【０３４２】
【化１５】 （実施例１４：ヒト胚腎臓２９３細胞における１６４６７９４５．０．８８の
発現） １６４６７９４５．０．８８配列（実施例１３、前出を参照のこと）を含むＫ
ｐｎＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ｐＣＲ２．１ベクター中の１６４６７９５６
．０．８８（すなわち、Ｓ３２３−６ｃ）から単離し、そしてＢａｍＨＩ／Ｘｈ
ｏＩ消化ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃにサブクローン化し（実施例３、前出を参照のこと
）、新しい構築物ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−１６４６７９４５．０．８８を生成した
。次いで、ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−１６４６７９４５．０．８８構築物を、Ｌｉｐ
ｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ試薬（登録商標）を用いて製造者指示（Ｇｉｂｃ
ｏ／ＢＲＬ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に従ってヒト胚腎臓２９３細胞にトラ
ンスフェクトした。細胞ペレットおよび上清をトランスフェクションの７２時間
後に収集し、そして抗Ｖ５抗体を用いてウエスタンブロット（還元条件下）によ
る１６４６７９４５．０．８８発現を調査した。図ＡＧ２は、１６４６７９４５
．０．８８は、２９３細胞によって分泌される約９５０００ダルトンおよび２３
０００ダルトンの分子量を有する２つのタンパク質として発現されることを示す
。この２３０００ダルトンのタンパク質は、９５０００ダルトンのタンパク質の
分解産物と考えられる。
【０３４３】 （実施例１５：ＰＲＯＸ核酸の発現の組織分布の定量分析） 本発明の種々のクローンの定量的発現を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍａｒ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍで実施される実時間定量的ＰＣＲ分析（ｒ
ｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ）（
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））によって、４１の正常サンプルおよび５５の腫瘍サ
ンプル（以下の表で同定される）において評価した。
【０３４４】 以下の表において、これらの略語が使用される： Ｃａ．＝癌* ＝転移から定着される ｍｅｔ＝転移 ｓ ｃｅｌｌ ｖａｒ＝小細胞の改変体 ｎｏｎ−ｓ＝ｎｏｎ−ｓｍ＝ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｓｑｕａｍ＝鱗状 ｐｌ．ｅｆｆ＝胸水 ｇｌｉｏ＝神経膠腫 ａｓｔｒｏ＝星状細胞腫 ｎｅｕｒｏ＝神経芽細胞腫 ９６のＲＮＡサンプルを、最初にβ−アクチンおよびＧＡＰＤＨに対して正規
化した。ＲＮＡ（合計約５０ｎｇ〜約１ｎｇポリＡ＋）を、ＴＡＱＭＡＮ（登録
商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉ
ｔ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ；ｃａｔ＃Ｎ
８０８−０２３４）およびランダムな６量体を使用し、製造者のプロトコールに
従って、ｃＤＮＡに変換した。反応を、２０μｌの全反応容量で実施し、そして
３０分間４８℃でインキュベートした。次いで、ｃＤＮＡ（５μｌ）を、製造業
者の指示に従って、β−アクチンおよびＧＡＰＤＨ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）
Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ｃａｔ．＃’ｓ
４３１０８８１Ｅおよび４３１０８８４Ｅの各々）およびＴＡＱＭＡＮ（登録商
標）ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ；ｃａｔ＃４３０４４４７）を使用するＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応
のために、分離プレートに移した。反応を、以下のパラメータを使用して２５μ
ｌ中で実施した：５０℃で２分；９５℃で１０分；９５℃で１５秒／６０℃で１
分（計４０サイクル）。結果を、ログスケールを使用するＣＴ値（所与のサンプ
ルは、蛍光の閾値レベルを通過するサイクル）として記録し、２つのサンプル間
のＲＮＡ濃度の差は、２のΔＣＴ乗として示した。次いで、％相対発現を、この
ＲＮＡの差の逆数をとり、そして１００をかけることによって得る。β−アクチ
ンおよびＧＡＰＤＨについて得られた平均ＣＴ値を、ＲＮＡサンプルを正規化す
るために使用した。最も高いＣＴ値を発生するＲＮＡサンプルは、さらなる希釈
を必要としないが、他の全てのサンプルは、それらのβ−アクチン／ＧＡＰＤＨ
の平均ＣＴ値に従って、サンプルと比較して希釈した。
【０３４５】 正規化ＲＮＡ（５μｌ）を、ｃＤＮＡに転換し、製造者の指示に従って、Ｏｎ
ｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ｃａｔ．＃４３０９１６９）および遺伝子特異的プラ
イマーを使用するＴＡＱＭＡＮ（登録商標）によって分析した。プローブおよび
プライマーを、インプットとしてクローン１０３２６２３０．０．３８の配列を
使用する、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ’ｓ Ｐｒｉｍｅｒ
Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｐｐｌｅ Ｃｏｍｐｕｔｅ
ｒ’ｓ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ Ｐｏｗｅｒ ＰＣ用のヴァージョンＩ）に従って
、各アッセイに対して設計した。デフォルトの設定を、反応条件に対して使用し
、そして以下のパラメータを、プライマーを選択する前に設定した。これらのプ
ライマーは、以下を含んだ：プライマーの濃度＝２５０ｎＭ、プライマーの融解
温度（Ｔm）範囲＝５８℃〜６０℃、プライマーの最適Ｔm＝５９℃、プライマー
の最大差＝２℃、プローブは、５’末端Ｇを有さず、プローブのＴmは、プライ
マーのＴmよりも１０℃高くなければならず、アンプリコンサイズは７５ｂｐ〜
１００ｂｐである。選択されるプローブおよびプローブ（以下を参照のこと）は
、Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）によって合成された。
プローブを、未結合の色素を除去するために２回ＨＰＬＣ精製し、プローブの５
’末端および３’末端へのレポーター色素およびクエンチャー色素のカップリン
グを立証するために、質量分析法によって評価した。正方向プライマーおよび逆
方向プライマーの最終濃度は、９００ｎＭであり、そしてプローブの濃度は、２
００ｎＭであった。
【０３４６】 以下のＰＣＲ増幅反応条件を使用した。各組織および各細胞株由来の正規化Ｒ
ＮＡを、９６ウエルＰＣＲプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ）の各ウエルにスポットした。ＰＣＲ増幅反応混合物は、以下の試薬を
含んだ：２つのプローブ（ＰＲＯＸ特異的プローブで多重化されたＳＥＣＸ特異
的プローブおよび別の遺伝子特異的プローブ）；ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
７７０の１×ＴａｑＭａｎTMＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ；５ｍＭのＭｇＣｌ 2 ；ｄＮＴＰ混合物（ｄＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕ（１：１：１：２の比）；０．２５Ｕ／
ｍｌ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄTM（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；０．４
Ｕ／μｌのＲＮａｓｅインヒビター；および０．２５Ｕ／μｌの逆転写酵素。逆
転写を、４８℃で３０分間実施し、次いで増幅／ＰＣＲサイクルを以下のように
実施した：９５℃で１０分、次いで９０℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サ
イクル。
【０３４７】 以下のセクションにおいて、多数の表は、本発明のプライマーおよびプローブ
について使用される配列、ならびに用いられた様々な細胞培養物について得られ
た相対発現結果を示す。
【０３４８】 （Ａ．クローン２０４６８７５２） 表２２および表２３は、それぞれ、クローン２０４６８７５２のプライマー配
列情報および相対発現結果を示す。表２３に示されるクローン２０４６８７５２
の相対発現結果は、同じ色素由来の正常な細胞サンプルと比較して、特定の中枢
神経系腫瘍および黒色腫における比較的高い発現、およびほとんどの結腸癌、乳
癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌および肝臓癌細胞における抑制を示す。
【０３４９】
【表２２】
【０３５０】
【表２３】 表２４および表２５は、それぞれ、クローン１１６９２０１０．０．５１のプ
ライマー配列情報および相対発現結果を示す。図２５に示されるように、正常な
細胞と比較して、高レベルの発現が、特定の卵巣癌細胞株、胃ガン、および結腸
癌細胞株において見られる。さらに、このクローンによってコードされるタンパ
ク質はまた、肺癌および特定のＣＮＳ癌細胞において広範に発現される。
【０３５１】
【表２４】
【０３５２】
【表２５】 （Ｃ．クローン２７８３５９８１．０．１） 表２６および表２７は、それぞれ、クローン２７８３５９８１．０．１のプラ
イマー配列情報および相対発現結果を示す。クローン２７８３５９８１．０．１
の相対発現レベルは、表２７に示されるように、このクローによってコードされ
るタンパク質が、同じ組織のそれぞれの正常な細胞株と比較して、試験される実
質的に全ての癌細胞株において過剰発現されることを示す。
【０３５３】
【表２６】
【０３５４】
【表２７】 （Ｄ．クローン２１３９９２４７．０．１） 表２８は、クローン２１３９９２４７．０．１のプライマー配列情報を示す。
クローン２１３９９２４７．０．１の発現分析は、合計６回繰り返された。この
クローンによってコードされるタンパク質は、試験されたほとんどの組織で広範
に発現した（すなわち、他の表と同じ細胞株は、このセクションの詳細な実施例
に含まれる）。さらに、コードされたタンパク質はまた、特定の癌（例えば、黒
色腫、前立腺癌、肺癌および結腸癌）において特に強力に発現される。
【０３５５】
【表２８】 （Ｅ．クローン１７１３２２９６） 表２９および表３０は、それぞれ、クローン１７１３２２９６のプライマー配
列情報および相対発現結果を示す。表３０に示されるクローン１７１３２２９６
の発現分析は、このクローンによってコードされるタンパク質は、卵巣癌、乳癌
および結腸癌において、正常な組織細胞株と比較して過剰発現されることを示す
。
【０３５６】
【表２９】
【０３５７】
【表３０】 （Ｆ．クローン１７９３１３５４） 表３１および表３２は、それぞれ、クローン１７９３１３５４のプライマー配
列情報および相対発現結果を示す。クローン１７９３１３５４の発現分析は、表
３２に示される。興味深いことに、このクローンによってコードされるタンパク
質は、２つの肺癌細胞株においては顕著に検出されるが、正常な肺組織において
は検出されない。
【０３５８】
【表３１】
【０３５９】
【表３２】 （Ｇ．クローン７５２０５００） 表３３および表３４は、それぞれ、クローン７５２０５００のプライマー配列
情報および相対発現結果を示す。クローン７５２０５００によってコードされる
タンパク質の発現分析結果は、表３４に示される。クローン１７９３１３５４で
見出されたように、このクローン７５２０５００によってコードされるタンパク
質は、２つの肺癌細胞株においては顕著に検出されるが、正常な肺細胞において
は検出されない。
【０３６０】
【表３３】
【０３６１】
【表３４】 （Ｈ．クローン１７９４１７８７） 表３５および表３６は、それぞれ、クローン１７９４１７８７のプライマー配
列情報および相対発現結果を示す。クローン１７９４１７８７の発現分析結果は
、合計２回の試験について表３６に示される。これらの結果から、正常組織由来
の細胞と比較して、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、ＣＮＳ癌および膵
臓癌の細胞株は、このクローンによってコードされるタンパク質を非常に高レベ
ルまで過剰発現するようである。
【０３６２】
【表３５】
【０３６３】
【表３６】 （Ｉ．クローン１６４６７９４５） 表３７および表３８は、それぞれ、クローン１６４６７９４５のプライマー配
列情報および相対発現結果を示す。クローン１６４６７９４５の組織発現分析は
、表３８に示される。これらの結果は、このクローンにコードされるタンパク質
は、乳癌、卵巣癌、腎臓癌および結腸癌由来の特定の細胞株において高度に過剰
発現されることを示す。さらに、コードされたタンパク質は、正常肺細胞と共に
、肺癌細胞株において強度に抑制されることが見出される。
【０３６４】
【表３７】
【０３６５】
【表３８】 （実施例１６：クローン１１６９２０１０．０．５１によってコードされるタ
ンパク質、ＰＲＯ３核酸によるセリンプロテアーゼ活性の阻害） ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃ
ｃｏの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で約９０％のコンフルーエンスまで増殖
させた。これらの細胞を、メーカーの仕様書に従って、ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ（モ
ックトランスフェクションベクター）またはｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−１１６９２０
１０（実施例６、前出を参照のこと）で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２００
０（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用してトランスフェクトした。トランスフェク
トした細胞を、ＤＭＥＭと共に２日間インキュベートし、次いで馴化培地を細胞
上清を収集することによって調製した。
【０３６６】 この馴化培地を、６×Ｈｉｓタンパク質融合の精製のために意図される、ＴＡ
ＬＯＮ（登録商標）メタルアフィニティークロマトグラフィー（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）によって濃縮した。簡潔には、この手順は以下
のとおりであった。数ｍｌの馴化培地を１ｍｌのＴＡＬＯＮ（登録商標）メタル
アフィニティー樹脂と共にスピンカラム中でインキュベートした。このスピンカ
ラムを初めに１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。次いで
、このカラムを０．６５ｍｌのＰＢＳ／０．５Ｍイミダゾール（ｐＨ８．０）で
２回溶出し、そして溶出液をプールした。イミダゾールを、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（
登録商標）遠心分離フィルターデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．；Ｂ
ｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して緩衝液交換透析によってＰＢＳに除去した。１
１６９２０１０遺伝子産物を濃縮した馴化培地を４℃で貯蔵した。
【０３６７】 この１１６９２０１０遺伝子産物のプロテアーゼ活性を阻害する能力を決定す
るために、コードされたタンパク質を異なる２つのアリコートサイズ（すなわち
、２５７μｌおよび５０μｌ）で、約３５０ｎｇの酵素を含有する標準希釈のト
リプシンに添加した。得られた混合物および適切な陽性コントロールおよび陰性
コントロール（すなわち、それぞれ、血清およびモックトランスフェクション由
来の馴化培地）を、次いで、ＰＤＱ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ＡｓｓａｙTM（Ａｔｈ
ｅｎａ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｂａｌｔ
ｉｍｏｒｅ，ＭＤ）を使用して、トリプシン活性についてアッセイした。簡潔に
は、このアッセイは、特許の物質（すなわち、タンパク質および色素−タンパク
質結合体を含む架橋マトリクス）を使用する比色アッセイであり、そして広範な
プロテアーゼを同定し得る。プロテアーゼ活性および推定阻害物質を含む試験サ
ンプルを、バイアルに等分し、そして３７℃で８時間インキュベートした。プロ
テアーゼ活性を、分光光度計で４５０ｎｍで検出し、酵素活性が増加するにつれ
て光学密度が増加した。
【０３６８】 図８に示される結果は、２５μｌの濃縮された馴化培地の添加に対応する５０
％阻害レベルで、１１６９２０１０遺伝子産物がトリプシンを阻害することを示
す。この５０％のレベルは、モックトランスフェクションによる馴化培地を添加
しいないか、または添加しているトリプシンに関連する。
【０３６９】 クローン１１６９２０１０．０．５１タンパク質に対して幾分かの類似性を示
すタンパク質は、以下のために潜在的に有用であると考えられる：（ｉ）増殖の
刺激およびケラチノサイトの運動性；（ｉｉ）癌細胞（例えば、黒色腫）の増殖
の阻害；（ｉｉｉ）新脈管形成および腫瘍血管新生の変調；（ｉｖ）皮膚炎症の
変調；および（ｖ）上皮細胞増殖の変調。
【０３７０】 さらに、クローン１１６９２０１０．０．５１によってコードされるタンパク
質はまた、フィブロモジュリン（細胞外マトリクスの再造形を潜在的に調節する
タンパク質）に対するある程度の類似性を有する。本明細書中に開示されるよう
に、クローン１１６９２０１０．０．５１によってコードされるタンパク質は、
プロテアーゼ活性を阻害し、このタンパク質はまた、腫瘍細胞転移および侵襲を
阻害するように作用し得ることが可能であることがここで示される。
【０３７１】 （実施例１７：クローン２０４６８７５２．０．１８−Ｕによってコードされ
るタンパク質、ＰＲＯ２核酸によるＮＨｏｓｔ細胞の増殖の誘発） ヒト一次骨芽細胞（ＮＨｏｓｔ；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，
ＣＡ）を、４０％のコンフルエンシーでプレートし、そして１０％ウシ胎児血清
または１０％ウシ血清を補充したＤＭＥＭ中で２４時間培養した。この培養培地
を除去し、そしてｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−２０４６８７５２（実施例４、前出を参
照のこと）またはｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ（モックトランスフェクションベクター；
実施例３、前出を参照のこと）を使用して、トランスフェクションを行ったこと
以外は、実施例１６に記載されるように調製した等量の濃縮馴化培地と共に再び
プレート下した。約４８時間後、この細胞をＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １
００で撮影した。次いで、トリプシン処理し、続いてＣｏｕｌｔｅｒ Ｚ１ Ｐ
ａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｕｎｔｅｒを使用してカウントすることによって、細胞数
を決定した。
【０３７２】 ＮＨｏｓｔ細胞を、２０４６８７５２．０．１８−Ｕでトランスフェクトした
ＨＥＫ２９３細胞由来の馴化培地で処理することによって、モックトランスフェ
クションと比較して、２日間にわたって細胞数は２倍に増加した（図９を参照の
こと）。関係のない増殖因子を含む陰性コントロールで処理した細胞は、増殖を
示さなかった（図９）。
【０３７３】 （他の実施形態） 本発明は、その詳細な説明と共に記載されてきたが、上記の記載は、添付の特
許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示し、制限することは意図し
ない。他の局面、利点および改変は、本発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、クローン１７９３１３５４．０．３５．１および１７９３１３５４．
０．３５．２によってコードされるタンパク質のアラインメントである。
【図２】 図２は、クローン７５２０５００．０．５４＿１；クローン７５２０５００．
０．５４＿２；クローン７５２０５００．０．５４＿３；クローン７５２０５０
０．０．５４＿４；およびクローン７５２０５００．０．２１によってコードさ
れるタンパク質のアラインメントである。
【図３】 図３は、ＨＥＫ２９３細胞における２０４６８７５２．０．１８−Ｕタンパク
質の発現を示す、ゲル電気泳動図である。
【図４】 図４は、ＨＥＫ２９３細胞における１１６９２０１０．０．５１タンパク質の
発現を示す、電気泳動図である。
【図５】 図５は、ＨＥＫ２９３細胞における２７８３５９８１．０．１タンパク質の発
現を示す、電気泳動図である。
【図６】 図６は、ＨＥＫ２９３細胞における２１３９９２４７．０．１タンパク質の発
現を示す、電気泳動図である。
【図７】 図７は、ＨＥＫ２９３細胞における１７９４１７８７．０．１タンパク質の発
現を示す、電気泳動図である。
【図８】 図８は、クローン１１６９２０１０．０．５１によってコードされるタンパク
質による、トリプシン活性の阻害を示す棒グラフである。
【図９】 図９は、クローン２０４６８７５２．０．１８−Ｕによってコードされるタン
パク質によって誘導されるＮＨｏｓｔ細胞の増殖を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｃ０８５ Ａ６１Ｐ 35/00 16/28 ４Ｃ０８６ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｈ０４５ 16/28 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｍ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA02 DA05 DA06 DA11 DA12 EA02 EA04 FA02 FA17 GA11 HA12 4B063 QA19 QA20 QQ08 QQ43 QR08 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 4B064 AG01 AG27 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA72X AA90X AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA01 BA22 CA53 DC50 ZB262 4C085 AA13 AA14 BB11 DD63 DD88 4C086 AA01 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 ZB26 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA75 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (41)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離されたポリペプチドであって、以下： ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、
    ２４、２６、２８、３０、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸
    配列の成熟形態； ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、
    ２４、２６、２８、３０、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸
    配列の成熟形態の改変体であって、ここで、該改変体が、該成熟形態のアミノ酸
    配列中と異なっているのは１５％以下のアミノ残基であるという条件で、該改変
    体中の１つ以上のアミノ酸残基が該成熟形態のアミノ酸配列と異なっている、改
    変体； ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、
    ２４、２６、２８、３０、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸
    配列；および ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、
    ２４、２６、２８、３０、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸
    配列の改変体であって、ここで、該改変体が該アミノ酸配列と異なっているのは
    １５％以下のアミノ酸残基であるという条件で、該改変体中の１つ以上のアミノ
    酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列とは異なっている、改変体； からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが
    、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４
    、２６、２８、３０、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸配列
    の天然に存在する対立遺伝子改変体のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  3. 【請求項３】 請求項２に記載のポリペプチドであって、ここで、前記対立
    遺伝子改変体が配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、
    ２１、２３、２５、２７、２９、３１、および３３からなる群より選択される核
    酸配列とは１つのヌクレオチドが異なる核酸配列の翻訳であるアミノ酸配列を含
    む、ポリペプチド。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載のポリペプチドであって、前記改変体の前記
    アミノ酸配列が保存的アミノ酸置換を含む、ポリペプチド。
  5. 【請求項５】 単離された核酸分子であって、以下： ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、
    ２４、２６、２８、３０、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸
    配列の成熟形態； ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、
    ２４、２６、２８、３０、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸
    配列の成熟形態の改変体であって、ここで、該改変体が、該成熟形態のアミノ酸
    配列中と異なっているのは１５％以下のアミノ残基であるという条件で、該改変
    体中の１つ以上のアミノ酸残基が該成熟形態のアミノ酸配列と異なっている、改
    変体； ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、
    ２４、２６、２８、３０、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸
    配列； ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、
    ２４、２６、２８、３０、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸
    配列の改変体であって、ここで、該改変体が該アミノ酸配列と異なっているのは
    １５％以下のアミノ酸残基であるという条件で、該改変体中の１つ以上のアミノ
    酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列とは異なっている、改変体； ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、
    ２４、２６、２８、３０、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸
    配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの改変体の少なくとも一部をコー
    ドする核酸フラグメントであって、ここで、該改変体が該アミノ酸配列と異なっ
    ているのは１５％以下のアミノ酸残基であるという条件で、該改変体中の１つ以
    上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列とは異なっている、改変体；な
    らびに ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の相補体を含む核酸分子、
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配
    列を含む、核酸分子。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が
    天然に存在する対立遺伝子核酸改変体のヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
  7. 【請求項７】 請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が
    天然に存在するポリペプチド改変体のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード
    する、核酸分子。
  8. 【請求項８】 請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が
    配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２
    ５、２７、２９、３１、および３３からなる群より選択される核酸配列とは１つ
    のヌクレオチドが異なる、核酸分子。
  9. 【請求項９】 請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が
    以下： ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２
    ３、２５、２７、２９、３１、および３３からなる群より選択されるヌクレオチ
    ド配列； ｂ）ヌクレオチド配列であって、ここで、配列番号１、３、５、７、９、１１
    、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３か
    らなる群より選択されるヌクレオチド配列中の１つ以上のヌクレオチドが異なっ
    ており、ただし、該ヌクレオチド配列と異なっているのは、該ヌクレオチドの２
    ０％以下である、ヌクレオチド配列； ｃ）（ａ）の核酸フラグメント；および ｄ）（ｂ）の核酸フラグメント、 からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
  10. 【請求項１０】 請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子
    が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３
    、２５、２７、２９、３１および３３からなる群より選択されるヌクレオチド配
    列または該ヌクレオチド配列の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダ
    イズする、核酸分子。
  11. 【請求項１１】 請求項５に記載の核酸分子であって、以下： （ａ）前記アミノ酸配列をコードするコード配列とは１つ以上のヌクレオチド
    配列が異なるコード配列を含む第１のヌクレオチド配列であって、ただし、該コ
    ード配列中のコード配列のヌクレオチドが該コード配列と異なっているのは２０
    ％以下である、第１のヌクレオチド配列； （ｂ）第１のポリヌクレオチドの相補体である単離された第２のポリヌクレオ
    チド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸フラグメント、 からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
  12. 【請求項１２】 請求項１１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  13. 【請求項１３】 前記核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターをさら
    に含む、請求項１２に記載のベクター。
  14. 【請求項１４】 請求項１２に記載のベクターを含む、細胞。
  15. 【請求項１５】 請求項１に記載のポリペプチドに免疫特異的に結合する、
    抗体。
  16. 【請求項１６】 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１５に記載
    の抗体。
  17. 【請求項１７】 前記抗体がヒト化抗体である、請求項１５に記載の抗体。
  18. 【請求項１８】 サンプル中の請求項１に記載のポリペプチドの存在または
    量を測定するための方法であって、該方法は、以下： （ａ）該サンプルを提供する工程； （ｂ）該サンプルを該ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体と接触する工
    程；および （ｃ）該ポリペプチドに結合する抗体の存在または量を測定して、それによっ
    て該サンプル中のポリペプチドの存在または量を測定する工程 を包含する、方法。
  19. 【請求項１９】 請求項５に記載の核酸分子のサンプル中における存在また
    は量を測定するための方法であって、該方法は、以下： （ａ）該サンプルを提供する工程； （ｂ）該サンプルを該核酸分子に結合するプローブ接触させる工程；および （ｃ）該核酸分子に結合する該プローブの存在または量を測定して、それによ
    って該サンプル中の該核酸分子の存在または量を測定する工程 を包含する、方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１に記載のポリペプチドに結合する因子を同定する
    方法であって、該方法は、以下： （ａ）該ポリペプチドを該因子と接触させる工程；および （ｂ）該因子が該ポリペプチドに結合するか否かを測定する工程 を包含する、方法。
  21. 【請求項２１】 請求項１に記載のポリペプチドの発現または活性を調節す
    る因子を同定する方法であって、以下： （ａ）該ポリペプチドを発現する細胞を提供する工程； （ｂ）該細胞を該因子と接触させる工程；および （ｃ）該因子が該ポリペプチドの発現または活性を調節するか否かを測定し、
    これによって、該ペプチドの発現または活性の変化は、該因子が該ポリペプチド
    の発現または活性を調節することを示す、工程 を包含する、方法。
  22. 【請求項２２】 請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節するための方
    法であって、該方法は、該ポリペプチドを発現する細胞サンプルと、該ポリペプ
    チドに結合する化合物とを、該ポリペプチドの活性を調節するに十分な量で、接
    触させる工程を包含する、方法。
  23. 【請求項２３】 ＰＲＯＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該
    方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体の該ＰＲＯ
    Ｘ関連障害を処置または予防するに十分な量で、請求項１に記載のポリペプチド
    を投与する工程を包含する、方法。
  24. 【請求項２４】 前記被験体がヒトである、請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 ＰＲＯＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該
    方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体のＰＲＯＸ
    関連障害を処置または予防するに十分な量で、請求項５に記載の核酸を投与する
    工程を包含する、方法。
  26. 【請求項２６】 前記被験体がヒトである、請求項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 ＰＲＯＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該
    方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体のＰＲＯＸ
    関連障害を処置または予防するに十分な量で請求項１５に記載の抗体を投与する
    工程を包含する、方法。
  28. 【請求項２８】 前記被験体がヒトである、請求項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 請求項１に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能な
    キャリアを含有する、薬学的組成物。
  30. 【請求項３０】 請求項５に記載の核酸分子および薬学的に受容可能なキャ
    リアを含有する、薬学的組成物。
  31. 【請求項３１】 請求項１５に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリ
    アを含有する、薬学的組成物。
  32. 【請求項３２】 請求項２９に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む
    、キット。
  33. 【請求項３３】 請求項３０に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む
    、キット。
  34. 【請求項３４】 請求項３１に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む
    、キット。
  35. 【請求項３５】 ヒトの疾患と関連する症候群を処置するための医薬品の製
    造における治療剤の使用であって、該疾患がＰＲＯＸ関連障害から選択され、こ
    こで、該治療剤がＰＲＯＸポリペプチド、ＰＲＯＸ核酸、およびＰＲＯＸ抗体か
    らなる群より選択される、使用。
  36. 【請求項３６】 ＰＲＯＸ関連障害に対する活性もしくは潜伏のモジュレー
    ターまたは素因をスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下： ａ）ＰＲＯＸ関連障害に対する危険性が増加した試験動物に試験化合物を投与
    する工程であって、ここで、該試験動物は請求項１に記載のポリペプチドを組み
    換え発現する、工程； ｂ）工程（ａ）の該化合物を投与する工程の後に該試験動物中の該ポリペプチ
    ドの活性を測定する工程；および ｃ）該試験動物における該タンパク質の活性を、該ポリペプチドが投与されて
    いないコントロール動物における該ポリペプチドの活性と比較する工程であって
    、ここで、該コントロール動物と比較した該試験動物中の該ポリペプチドの活性
    における変化は、該試験化合物がＰＲＯＸ関連障害の潜伏のモジュレーターまた
    は素因であることを示す、工程 を包含する、方法。
  37. 【請求項３７】 請求項３６に記載の方法であって、ここで、前記試験動物
    が、プロモーターの制御下で、野生型試験動物と比較して増加したレベルで、試
    験タンパク質導入遺伝子を発現するかまたは該導入遺伝子を発現する、組換え試
    験動物であり、ここで、該プロモーターは、該導入遺伝子のネイティブな遺伝子
    プロモーターではない、方法。
  38. 【請求項３８】 第１の哺乳動物被験体における請求項１に記載のポリペプ
    チドの変化したレベルと関連する疾患の存在または素因を決定するための方法で
    あって、該方法は、以下： ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプル中の該ポリペプチドの発現レベル
    を測定する工程；および ｂ）工程（ａ）の該サンプル中の該ポリペプチドの量を、該疾患を有さないこ
    とが既知であるかまたは該疾患にかかりにくいことが既知の、第２の哺乳動物被
    験体由来のコントロールサンプル中に存在する該ポリペプチドの量と比較する工
    程であって、 ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の該第１の被験体における該
    ペプチドの発現レベルにおける変化が、該疾患の存在または該疾患の素因を示す
    、工程 を包含する、方法。
  39. 【請求項３９】 第１の哺乳動物被験体における請求項５に記載の核酸分子
    の変化したレベルと関連する疾患の存在または該疾患の素因を決定するための方
    法であって、該方法は、以下： ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプル中の該核酸の量を測定する工程；
    および ｂ）工程（ａ）の該サンプル中の該核酸の量を、該疾患を有さないことが既知
    であるかまたは該疾患にかかりにくいことが既知の、第２の哺乳動物被験体由来
    のコントロールサンプル中に存在する該核酸の量と比較する工程であって、 ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の該第１の被験体における該
    核酸のレベルにおける変化が、該疾患の存在または該疾患の素因を示す、工程 を包含する、方法。
  40. 【請求項４０】 哺乳動物において病理学的状態を処置する方法であって、
    該方法は、該病理状態を緩和するに十分な量でポリペプチドを該哺乳動物に投与
    する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０
    、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、およ
    び３４、またはそれらの生物学的に活性なフラグメントからなる群の少なくとも
    １つのアミノ酸配列を含むポリペプチドに少なくとも９５％同一なアミノ酸配列
    を有するポリペプチドである、方法。
  41. 【請求項４１】 哺乳動物の病理学的状態を処置する方法であって、該方法
    は、該病理学的状態を緩和するに十分な量で請求項１５に記載の抗体を該哺乳動
    物に投与する工程を包含する、方法。
JP2001515709A 1999-08-11 2000-08-11 新規ポリペプチドおよびそれをコードする核酸 Withdrawn JP2003508030A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14843399P 1999-08-11 1999-08-11
US60/148,433 1999-08-11
US63594900A 2000-08-10 2000-08-10
US09/635,949 2000-08-10
PCT/US2000/021857 WO2001010902A2 (en) 1999-08-11 2000-08-11 Nucleoc acids and secreted polypeptides encoded thereby

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003508030A true JP2003508030A (ja) 2003-03-04

Family

ID=26845855

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001515709A Withdrawn JP2003508030A (ja) 1999-08-11 2000-08-11 新規ポリペプチドおよびそれをコードする核酸

Country Status (5)

Country Link
US (2) US20030004310A1 (ja)
EP (1) EP1218406A1 (ja)
JP (1) JP2003508030A (ja)
CA (1) CA2381396A1 (ja)
WO (1) WO2001010902A2 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007536931A (ja) * 2004-05-12 2007-12-20 ジェネンテック・インコーポレーテッド 新規の遺伝子破壊、組成物およびそれらに関連する方法

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7083786B2 (en) 1997-04-03 2006-08-01 Jensenius Jens Chr MASP-2, a complement-fixing enzyme, and uses for it
US6573095B1 (en) 1998-04-29 2003-06-03 Genesis Research & Development Corporation Limited Polynucleotides isolated from skin cells
US20030190669A1 (en) * 1998-12-30 2003-10-09 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20040067490A1 (en) * 2001-09-07 2004-04-08 Mei Zhong Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
EP1892249A1 (en) * 1999-09-01 2008-02-27 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU7377300A (en) * 1999-09-13 2001-04-17 Curagen Corporation Novel human proteins, polynucleotides encoding them and methods of using the same
AU2001256977A1 (en) * 2000-04-28 2001-11-12 Eli Lilly And Company Human sez6 nucleic acids and polypeptides
AU2001260847A1 (en) * 2000-05-24 2001-12-03 Genesis Research And Development Corporation Limited Compositions isolated from skin cells and methods for their use
AU2001279586A1 (en) * 2000-07-13 2002-01-30 Jens Christian Jensenius Masp-2, a complement-fixing enzyme, and uses for it
FR2828212B1 (fr) * 2001-08-03 2003-10-31 Aventis Pharma Sa Methodes de diagnostic et de pronostic de la maladie de parkinson
US20030077775A1 (en) * 2001-10-17 2003-04-24 Pe Corporation (Ny) Isolated human secreted proteins, nucleic acid molecules encoding human secreted proteins, and uses thereof
EP1576008A2 (en) * 2002-12-27 2005-09-21 Applied Research Systems ARS Holding N.V. Novel fibrillin-like polypeptides
PL2374819T3 (pl) 2003-05-12 2017-09-29 Helion Biotech Aps Przeciwciała przeciwko MASP-2

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5707829A (en) * 1995-08-11 1998-01-13 Genetics Institute, Inc. DNA sequences and secreted proteins encoded thereby
WO1999063088A2 (en) * 1998-06-02 1999-12-09 Genentech, Inc. Membrane-bound proteins and nucleic acids encoding the same
JP2001505783A (ja) * 1996-12-11 2001-05-08 カイロン コーポレイション 分泌ヒトタンパク質
CA2286303A1 (en) * 1997-04-08 1998-10-15 Human Genome Sciences, Inc. 20 human secreted proteins
WO1999005256A2 (en) * 1997-07-24 1999-02-04 President And Fellows Of Harvard College Method for cloning secreted proteins
CA2296287A1 (en) * 1997-08-01 1999-02-11 Genset 5' ests for secreted proteins expressed in prostate
US20040067490A1 (en) * 2001-09-07 2004-04-08 Mei Zhong Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007536931A (ja) * 2004-05-12 2007-12-20 ジェネンテック・インコーポレーテッド 新規の遺伝子破壊、組成物およびそれらに関連する方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2381396A1 (en) 2001-02-15
WO2001010902A2 (en) 2001-02-15
EP1218406A1 (en) 2002-07-03
WO2001010902A3 (en) 2001-06-07
WO2001010902A8 (en) 2001-07-26
US20050208040A1 (en) 2005-09-22
US20030004310A1 (en) 2003-01-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1009752B1 (en) Novel molecules of the tango-77 related protein family and uses thereof
JP2003508030A (ja) 新規ポリペプチドおよびそれをコードする核酸
US20020137135A1 (en) Novel NPG-1 gene that is differentially expressed in prostate tumors
US20100158918A1 (en) Polypeptides and polynucleotides encoding same
JP2003521885A (ja) ポリヌクレオチドおよびそれらによってコードされるポリペプチド
US20050032172A1 (en) Novel molecules of the FTHMA-070-related protein family and the T85-related protein family and uses thereof
WO1999054437A2 (en) Novel molecules of the t125-related protein family and uses thereof
WO2000008045A2 (en) Novel molecules of the tango-93-related protein family and uses thereof
AU3755699A (en) Novel lrsg protein and nucleic acid molecules and uses therefor
JP2002528067A (ja) オステオプロテゲリン様タンパク質をコードする核酸およびその使用方法
CA2344714A1 (en) Hrpca 9 and hrpca 10 nucleic acids and polypeptides
WO2000012762A1 (en) A novel protein related to melanoma-inhibiting protein and uses thereof
JP2003527831A (ja) エンドゼピン様ポリペプチドおよびエンドゼピン様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
US7001766B2 (en) Nucleic acid sequences encoding human angiopoietin-like polypeptides
WO1999052924A1 (en) Novel molecules of the t129-related protein family and uses thereof
JP2004500046A (ja) 新規ポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチド
JP2003527840A (ja) ポリペプチド、およびそれをコードするポリヌクレオチド
WO2002028900A2 (en) Tach: new tnf-receptor family nucleic acids and polypeptides
JP2003531571A (ja) 新規なヒトタンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、およびそれらを使用する方法
US20020164330A1 (en) Novel molecules of the tango-77 related protein family and uses thereof
WO2000037634A2 (en) Novel polypeptides and nucleic acids encoding same
JP2002529053A (ja) Ｌｄｌ関連タンパク質およびその使用
WO2001032875A1 (en) Torsin c nucleic acids and polypeptides
US20040142420A1 (en) Novel molecules of the TANGO-93-related protein family and uses thereof
EP1080101A1 (en) Novel molecules of the t139-related protein family and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A300 Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300

Effective date: 20071106