JP2003506567A

JP2003506567A - 蛍光染料および／またはマーカーとしてのアシルスルホンアミド−置換ポリメチン染料の使用

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Publication number: JP2003506567A
Application number: JP2001515974A
Authority: JP
Inventors: デローバー，ゲールト; ミスフエルト，ミヒヤエル; ジモン，リデイア
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1999-08-05
Filing date: 2000-07-24
Publication date: 2003-02-18
Also published as: CA2381088C; CN1369062A; WO2001011370A1; DE19937024A1; US6995262B1; AU6986100A; EP1206703A1; CA2381088A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、式（I）（ここで、ｎ、Ｙ、ＡおよびＲは、特許請求の範囲に示した意味を有する）の少なくとも１つのアシルスルホンアミド基、および特許請求の範囲に示した少なくとも１つの式（ａ）〜（ｎ）の化合物を含む新規ポリメチン染料に関する。本発明のポリメチン染料は、染料および／またはマーカーとして、特に生体分子を染色またはマーキングするために有用である。【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）近年、特に分析に少量の物質しか利用することができないバイオテクノロジー
で使用される、より一層感度が高く、しかも取り扱い易い検出法が開発された。
ここでは例えば蛍光検出法はますます広がる用途を提供している。蛍光染料はタ
ンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭水化物、脂肪または全細胞のような生物物質を標
識するための標識として使用される。しかしそれらの部分を標識する物質の多く
が400nm〜500nmの範囲に蛍光性を有するので、標識に使用する染料は500nmより
上、通常は500から1200nmの間の範囲の波長を吸収すべきである。さらにこの波
長領域では、光源として廉価なレーザージオールを利用することができる。

【０００２】従来技術から知られている蛍光染料は、中性またはわずかに塩基性ｐＨでの水
溶性を確実とするために親水性基または酸性基により置換される場合が多い。こ
れにより主に水性媒質中で操作される生物材料を標識し易くする。さらに、比較
的長い照射を含んで成る測定法でも可能とするために、染料は光安定性でなけれ
ばならない。しかし比較的長い波長を吸収する多くの染料は十分な光安定性をも
っていない。

【０００３】染料は生物サンプルに共有的または吸着により結合する。例えばタンパク質の
スルフヒドリル基および遊離アミノ基は、染料分子との共有カップリングを可能
とする反応性基である。さらに親水性または親油性染料を、タンパク質の親水性
または疎水性ドメインとの吸着によりそれらに付加することができる。またイオ
ン的な相互作用によりイオン性染料をタンパク質に吸着させることも可能である
。

【０００４】これまでバイオアッセイによく使用されて来たシアニン染料（Waggoner et al
.,Bioconjugate Chemistry,4,105-111,(1993)、米国特許第5,268,486号明細書、
国際公開第97/13810号明細書）は、凝集を形成する傾向がある。単量体に加えて
、染料の化学的環境に依存して（例えばｐＨ）、Ｈ凝集物およびＪ凝集物が形成
し得る。これは単量体の吸収に比べて凝集物の吸収が浅色的または深色的にシフ
トするので写真に利用されている。しかし生体標識については、ここでも１以上
のさらなる吸収バンドが生じるので、この凝集効果は望ましくない。

【０００５】しばしばサンプルを異なる染料で標識したサンプルが、異なる波長で励起する
多重（multiplex）アッセイが行われる。励起および発光シグナルの十分な分離
を達成するためには、染料結合物の吸収が重複してはならない。ここでは鋭く、
再現性のある、しかもｐＨ-および溶媒-に依存しない染料の吸収が重要である。
よく使用されるシアニン染料が凝集を形成する傾向は、さらに消光により蛍光の
強度を減少させる。発光した放射は直接、再度吸収されるか、または無放射のエ
ネルギー損失となる。

【０００６】生体標識用の従来技術から知られている染料、すなわちシアニン染料は、ポリ
メチンの種類である。さらに国際公開第97/40104号明細書は、例えば生体標識用
の染料としてスクエア酸誘導体を開示する。

【０００７】本発明の目的は、従来技術から知られているシアニン染料に比べて、改善され
た特性を有する染色のための蛍光標識または染料として、新規な蛍光染料を提供
することであった。特に、生物学的バッファー系における溶解性および光安定性
が改善され、そして特に凝集を形成する傾向が減少した。しかし同時に、本発明
の化合物は高い量子収率およびより高い吸光係数を有する。

【０００８】本発明は、式（I）

【０００９】

【化８】

【００１０】（式中：ｎは、１、２、３、４、５、６、７または９を表し、Ｙ、Ａは、電子求引基、好ましくはＣ＝ＯまたはＳＯ２−を表し、そしてＲは、場合により置換されてもよいアルキルまたはアリール基を表す）の少なくとも１つのアシルスルホンアミド基を含有し、そして以下の式：

【００１１】

【化９】

【００１２】の少なくとも１つの結合基を含んで成るポリメチン染料を提供する。

【００１３】本発明は、生体分子を染色および／または生体標識するために、式（I）によ
る少なくとも１つのアシルスルホンアミド基を含有するポリメチン染料の使用を
提供する。

【００１４】染色するだけではなく、共有結合を形成することにより生体標識にも使用され
る本発明のポリメチン染料は、式（I）の基に加えて、そのような共有結合を形
成することができるさらに少なくとも１つの基を有し：そのような基は好ましく
は

【００１５】

【化１０】

【００１６】である。

【００１７】したがって、本発明はさらに式（I）の少なくとも１つのアシルスルホンアミ
ド基、および共有結合により生体分子を標識するために以下の化合物の一覧：

【００１８】

【化１１】

【００１９】から選択される共有結合を形成することができる少なくとも１つの基を含有する
ポリメチン染料の使用を提供する。

【００２０】本出願の目的に関して、生体分子はタンパク質およびまたＤＮＡおよび／また
はＲＮＡを意味すると理解される。さらに本出願の目的に関して、細胞も生体分
子と考えられ得る。また生物学的作用を有する小さな有機分子も含まれる。

【００２１】式（I）の化合物に加えて、さらに式（ａ）ないし（ｎ）の１つから選択され
る基を有するポリメチン染料は、これまで従来技術では知られておらず、そして
新規な化合物を表す。それらは共有結合を形成することができるので特に生体標
識に適している。

【００２２】本出願の目的に関して他に記載しない限り、電子求引基は好ましくはMarchの
、進歩した有機化学（Advanced Organic Chemisty）、第３版、第17および28頁
に記載されているような基を意味すると理解される。

【００２３】本出願の目的に関して、アルキルは特に定義しない限り、線状もしくは分枝の
、環式もしくは直鎖状の、置換もしくは非置換の炭化水素を意味すると理解され
る。これらは特に例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、
t-ブチル、ネオペンチルおよび2-エチルヘキシル基のような１〜12のＣ原子を有
するアルキル基である。

【００２４】本出願の目的に関して、アリールは特に定義しない限り、芳香族の炭化水素基
、好ましくは５-もしくは６-員の環系を意味すると理解され、これは単環式状態
または縮合環系で存在することができる。これらは置換された、または非置換環
系のいずれかであることができる。特に好適であるのは、例えばフェニルおよび
ナフチル基である。

【００２５】驚くべきことには、米国特許第5,268,486号明細書、国際公開第96/00902号、
同第97/13810号および同第97/40104号明細書に記載されたようなアルキルスルホ
ネートまたはアルキルカルボキシレートを持つシアニンまたはスクエア酸染料と
比べて、本発明の染料を生物系に使用した時、例えばタンパク質結合物中または
生物学的バッファー媒質中で、ポリメチンが凝集する傾向がかなり減少し得るこ
とが見いだされた。

【００２６】本発明に従い使用される染料のさらなる利点は、ポリメチンの発色特性が置換
により変化しないことである。例えばこれまで、シアニン染料の改善された溶解
性のための官能性は、発色団の一部であるアリール系にスルホ基を導入すること
により実現された。これはまた、置換基が電子求引効果を有するので、スペクト
ル特性のシフトをもたらす。非置換アリールシアニンのスペクトル特性はすでに
記載され、すなわちアシルスルホン酸基を導入することにより、例えば直接バイ
オアッセイに使用するために染料系を適合させることが可能である。すなわち時
間がかかる至適化およびスクリーニング実験を省略することができる。

【００２７】さらにアルキルカルボキシレートと比較して、アシルスルホンアミド基を有す
る染料は、高い吸光係数を有する。これは染料が標識として使用される時にさら
に有利となる：染料が標識として、例えばタンパク質または抗体に共有的に結合する場合、結
合物はモルの染料／タンパク質含量比を特徴とする。十分なシグナルを得るため
には、特定量の染料がタンパク質に結合しなければならない。0.05未満の吸収で
の蛍光の強度は、吸光係数と相関するので、染料の吸光係数、すなわちその強度
が高いほど、蛍光標識としての染料の感度が高い。

【００２８】

【表１】

【００２９】しかし、染料は蛍光的に近いと消えるので、染料／タンパク質比は、高すぎる
べきではない。これは蛍光強度の損失をもたらす。したがって高い吸光係数を有
する染料は、蛍光標識としての使用に特に適している。少量の染料でも低いモル
染料／タンパク質含量比で強い蛍光シグナルを与える。また消失プロセスも最少
となる。

【００３０】本発明に従い使用される適当なポリメチン染料は、好適な態様で以下により詳
細に記載するような特にシアニン染料、メロシアニン染料、ローダシアニン染料
、スチレン染料、スクエア酸染料およびクロトン酸染料であり、これらはすべて
本発明に使用するために、それらが少なくとも１つの式（I）の置換基を有する
ことが特徴である。さらなる態様では、式（I）ないし（５）のポリメチン染料
を互いに結合することもでき、２以上の同一または異なる染料を互いに結合する
両方が可能である。本発明に従い好適なポリメチン染料は、以下に示す式の染料
であり、これ等は式（I）の置換基に加え、さらに少なくとも１つの以下の化合
物：

【００３１】

【化１２】

【００３２】から選択される置換基を含む。１．シアニン染料：本発明に従い適当なシアニン染料は、特に式１ａ、１ｂおよび／または１ｃ

【００３３】

【化１３】

【００３４】式中、Ｒａ₁₀ないしＲａ₁₁₀は互いに独立して、任意の置換基を表してよく、ｎは、０、１、２、３または４を表し、Ｙａ₁₁、Ｙａ₁₂およびＹａ₁₃は互いに独立して、置換もしくは非置換のＣまた
はＮを表し、ここで置換基は５-もしくは６-員の脂肪族または芳香族炭素環また
は複素環を形成してもよく、そしてＡａ₁₁およびＢａ₁₁は互いに独立して、Ｏ、Ｓ、Se、Te、N-Ra₁₁₁、C(Ra₁₁₂)(
Ra₁₁₃)または-C(Ra₁₁₄)=C(Ra₁₁₅)-を表し、ここでRa₁₁〜Ra₁₁₅は互いに独立して
、Ｈ、場合により置換されてもよいアルキル、場合により置換されてもよいアリ
ール、または場合により置換されてもよい最高20Ｃ原子を有するアルケニルを表
すが、ただし、少なくとも１つの置換基Ｒa10〜Ｒa115は、-(CH₂)_l-SO₂-Z-SO₂-R、-(
CH₂)_l-CO-Z-SO₂-R、-(CH₂)_l-SO₂-Z-CO-Rおよび-(CH₂)_l-N(R)-SO₃ ^-から成る群か
ら選択され、ここでｌは１から６の間の数であり、Ｚは、NHまたはN^-を表し、そしてＲは、好ましくは場合により置換されたアルキルまたはアリールを表す、のものである。

【００３５】本発明に従い使用される特に好適な式１ａの化合物を以下に掲げる。式１ａの好適な化合物

【００３６】

【化１４】

【００３７】

【化１５】

【００３８】

【化１６】

【００３９】

【化１７】

【００４０】式中、Ｒb₁₀〜Ｒb₁₁₀は互いに独立して、任意の置換基を表してよく、ｍは、０、１、２、３または４を表し、そしてＹb₁₁、Ｙb₁₂およびＹb₁₃は互いに独立して、置換もしくは非置換のＣまたは
Ｎを表し、ここで置換基は５-もしくは６-員の脂肪族または芳香族炭素環または
複素環を形成することができるが、ただし、少なくとも１つの置換基Ｒb₁₁〜Ｒb₁₁₀は、-(CH₂)_l-SO₂-Z-SO₂-R、-(
CH₂)_l-CO-Z-SO₂-R、-(CH₂)_l-SO₂-Z-CO-Rおよび-(CH₂)_l-N(R)-SO₃ ^-から成る群か
ら選択され、ここでｌは１から６の間の数であり、Ｚは、NHまたはN^-を表し、そしてＲは、好ましくは場合により置換されたアルキルまたはアリールを表す。

【００４１】好適な態様では、以下の置換基は場合により縮合された５-もしくは６-員の炭
素環または複素環を形成する：置換基Ｒb₁₁はＲb₁₂および／またはＲb₁₄と一緒に、置換基Ｒb₁₂はＲb₁₃およ
び／またはＲb₁₁と一緒に、置換基Ｒb₁₄はＲb₁₅および／またはＲb₁₁と一緒に、
置換基Ｒb₁₈はＲb₁₉および／またはＲb₁₇と一緒に、置換基Ｒb₁₇はＲb₁₆および
／またはＲb₁₈と一緒に、置換基Ｒb₁₉はＲb₁₁₀および／またはＲb₁₈と一緒に。
式１ｂの特に好適な化合物

【００４２】

【化１８】

【００４３】

【化１９】

【００４４】

【化２０】

【００４５】式中、Ｒc₁₁〜Ｒc₁₁₀は互いに独立して、任意の置換基を表してよく、ｍは、０、１、２、３または４を表し、Ｙc₁₁、Ｙc₁₂およびＹc₁₃は互いに独立して、置換もしくは非置換のＣまたは
Ｎを表し、ここで置換基は５-もしくは６-員の脂肪族または芳香族炭素環または
複素環を形成してもよく、そしてＢc₁₁は、Ｏ、Ｓ、Se、Te、N-Rc₁₁₁、C(Rc₁₁₂)(Rc₁₁₃)または-C(Rc₁₁₄)=C(Ra₁ ₁₅ )-を表し、ここでRc₁₁〜Rc₁₁₅は互いに独立して、Ｈ、場合により置換されて
もよいアルキル、場合により置換されてもよいアリール、または場合により置換
されてもよい最高20Ｃ原子を有するアルケニルを表すことができるが、ただし、少なくとも１つの置換基Ｒc10〜Ｒc115は、-(CH₂)_l-SO₂-Z-SO₂-R、-(
CH₂)_l-CO-Z-SO₂-R、-(CH₂)_l-SO₂-Z-CO-Rおよび-(CH₂)_l-N(R)-SO₃ ^-から成る群か
ら選択され、ここでｌは１から６の間の数であり、Ｚは、NHまたはN^-を表し、そしてＲは、好ましくは場合により置換されたアルキルまたはアリールを表す。

【００４６】好適な態様では、以下の置換基は場合により縮合された５-もしくは６-員の炭
素環または複素環を形成する：置換基Ｒc₁₁はＲc₁₂および／またはＲc₁₄と一緒に、置換基Ｒc₁₂はＲc₁₃およ
び／またはＲc₁₁と一緒に、置換基Ｒc₁₄はＲc₁₅および／またはＲc₁₁と一緒に。

【００４７】置換基Ｒc₁₇〜Ｒc₁₁₀は、好ましくは場合により複数の置換基を持つことがで
きる最高４個の環を含むことができる炭素環または複素環系の残りの員を形成す
る。Ｒc₁₈はＲc₁₉と一緒にπ結合を形成してもよく、そしてＲc₁₇およびＲc₁₁₀
は置換基を表してもよい。式１ｃの特に好適な化合物：

【００４８】

【化２１】

【００４９】

【化２２】

【００５０】２．メロシアニン本発明の目的に特に適するのは、式２ａおよび／または２ｂのメロシアニン

【００５１】

【化２３】

【００５２】式中、Ｒa₂₁およびＲa₂₅は互いに独立して、任意の置換基を表し、Ｙa₂₁、Ｙa₂₂、Ｙa₂₃、Ｙa₂₄は互いに独立して、置換もしくは非置換のＣまた
はＮを表し、ここで置換基は５-もしくは６-員の脂肪族または芳香族炭素環また
は複素環を形成してもよい、である。

【００５３】ｍは、０、１、２、３、４を表し、ｏは、０、１、２を表し、Ｆa₂₁およびＣa₂₁は互いに独立して、C=O、C=SまたはC(Ra₂₇)=を表し、Ｂa₂₁およびＤa₂₁は互いに独立して、場合により置換されたＣ、Ｎ、Ｏまたは
Ｓを表し、Ｒa₂₆は、Ｏ、Ｓまたはさらに複素環式の、場合により置換された５-もしくは
６-員の環を表し、ｋ、ｉおよびｊは、互いに独立して０または１を表し、Ｒa₂₇は、Ｈまたは場合により置換されたアルキルまたはアリールを表し、Ａa₂₁は、Ｏ、Ｓ、Se、Te、N-Ra₂₈、C(Ra₂₉)(Ra₂₁₀)、-C(Ra₂₁₁)=C(Ra₂₁₂)-を
表し、ここでＲa₂₈〜Ｒa₂₁₂は、Ｈまたは場合により置換されたアルキル、アリー
ル、または最高20Ｃ原子を有するアルケニルを表すことができるが、ただし、少なくとも１つの置換基Ra₂₁〜Ra₂₅またはRa₂₇〜Ra₂₁₂は、-(CH₂)_l-S
O₂-Z-SO₂-R、-(CH₂)_l-CO-Z-SO₂-R、-(CH₂)_l-SO₂-Z-CO-Rおよび-(CH₂)_l-N(R)-SO₃ ^- から成る群から選択され、ここでｌは１から６の間の数であり、Ｚは、NHまたはN^-を表し、そしてＲは、好ましくは場合により置換されたアルキルまたはアリールを表す。

【００５４】置換基Ｒa₂₂〜Ｒa₂₅は好ましくは、場合により複数の置換基を持つことができ
る最高４個の環を含むことができる炭素環または複素環式環系の残りの員を形成
する。Ｒa₂₂はＲa₂₅と一緒にπ結合を形成してもよく、そしてＲa₂₃およびＲa₂₄ は置換基を表してもよい。式２ａの特に好適な化合物：

【００５５】

【化２４】

【００５６】

【化２５】

【００５７】

【化２６】

【００５８】

【化２７】

【００５９】式中、Ｒb₂₁〜Ｒb₂₅は互いに独立して、任意の置換基を表し、Ｙb₂₁、Ｙb₂₂、Ｙb₂₃、Ｙb₂₄は互いに独立して、置換もしくは非置換のＣまた
はＮを表し、ここで置換基は５-もしくは６-員の脂肪族または芳香族炭素環また
は複素環を形成する。

【００６０】ｍは、０、１、２、３または４を表し、ｏは、０、１、２、３または４を表し、Ｆb₂₁およびＣb₂₁は互いに独立して、C=O、C=SまたはC(Ra₂₇)=を表し、Ｂb₂₁およびＤb₂₁は互いに独立して、場合により置換されたＣ、Ｎ、Ｏまたは
Ｓを表し、Ｒb₂₆は、Ｏ、Ｓまたはさらに複素環式の、場合により置換された５-もしくは
６-員の環を表し、ｋ、ｉおよびｊは互いに独立して、０または１を表し、Ｒb₂₇は、Ｈまたは場合により置換されたアルキルまたはアリールを表し、以下の置換基は好ましくは、場合により縮合した５-もしくは６-員の炭素環ま
たは複素環を形成してもよく：置換基Rb₂₃はRb₂₄および／またはRb₂₂と一緒に、置換基Rb₂₂はRb₂₁および／ま
たはRb₂₃と一緒に、置換基Rb₂₄はRb₂₅および／またはRb₂₃と一緒に。

【００６１】Ａb₂₁：Ｏ、Ｓ、Se、Te、N-Rb₂₈、C(Rb₂₉)(Rb₂₁₀)、-C(Rb₂₁₁)=C(Rb₂₁₂)-、Ｒb₂₈〜Ｒb₂₁₂は、水素、場合により置換されたアルキル、または場合により
置換されたアリール、場合により置換された最高20Ｃ原子を有するアルケニル、
あるいは以下に掲げる置換基の１つを表すことができるが、ただし、置換基Ｒb₂₁〜Ｒb₂₅またはＲb₂₇〜Ｒb₂₁₂の少なくとも１つの置換基
は、-(CH₂)_l-SO₂-Z-SO₂-R、-(CH₂)_l-CO-Z-SO₂-R、-(CH₂)_l-SO₂-Z-CO-Rおよび-(C
H₂)_l-N(R)-SO₃ ^-から成る群から選択され、ここでｌは１から６の間の数を表し、Ｚは、NHまたはN^-を表し、そしてＲは、好ましくは場合により置換されたアルキルまたはアリールを表す。式２ｂの特に好適な化合物

【００６２】

【化２８】

【００６３】

【化２９】

【００６４】ローダシアニン本出願の目的のために、使用するローダシアニンは特に式３ａおよび／または
３ｂ

【００６５】

【化３０】

【００６６】式中、Ｒa₃₁〜Ｒa₃₁₁は互いに独立して、任意の置換基を表し、Ｙa₃₁、Ｙa₃₂、Ｙa₃₃、Ｙa₃₄、Ｙa₃₅は、互いに独立して置換もしくは非置換
のＣまたはＮを表し、ここで置換基は５-もしくは６-員の脂肪族または芳香族炭
素環または複素環を形成してよく、ｐおよびｒは互いに独立して、０、１または２を表し、Ｑa₃₁は、Ｏ；N(Ra₃₁₂)、ＳまたはSeを表し、Ａa₃₁、Ｂa₃は互いに独立して、Ｏ、Ｓ、Se、Te、N-Ra₃₁₃、C(Ra₃₁₄)(Ra₃₁₅)
または-C(Ra₃₁₆)=C(Ra₃₁₇)-を表し、ここでＲa₃₁₂〜Ｒa₃₁₇は、Ｈ、場合により
置換されたアルキル、アリールまたは最高20Ｃ原子を有するアルケニル、あるい
は任意の置換基を表すことができるが、ただし置換基Ｒa₃₁〜Ｒa₃₁₇の少なくとも１つは、-(CH₂)_l-SO₂-Z-SO₂-R、-(CH ₂ )_l-CO-Z-SO₂-R、-(CH₂)_l-SO₂-Z-CO-Rおよび-(CH₂)_l-N(R)-SO₃ ^-から成る群から
選択され、ここでｌは１から６の間の数を表し、Ｚは、NHまたはN^-を表し、そしてＲは、好ましくは場合により置換されたアルキルまたはアリールを表す、のものである。

【００６７】好適な態様では、置換基Ｒa₃₂〜Ｒa₃₅またはＲa₃₆〜Ｒa₃₉は、場合により複数
の置換基を持つことができる最高４個の環を含むことができる炭素環または複素
環式環系の残りの員を形成する。Ｒa₃₂はＲa₃₅と一緒に、および／またはＲa₃₆
はＲa₃₉と一緒にπ結合を形成してもよく、そしてＲa₃₃およびＲa₃₄またはＲa₃₇ およびＲa₃₈は置換基を表してもよい。式３ａの特に好適な化合物

【００６８】

【化３１】

【００６９】

【化３２】

【００７０】式中、Ｒb₃₁〜Ｒb₃₁₁は互いに独立して、任意の置換基を表し、Ｙb₃₁、Ｙb₃₂、Ｙb₃₃、Ｙb₃₄、Ｙb₃₅は互いに独立して、置換もしくは非置換
のＣまたはＮを表し、ここで置換基は５-もしくは６-員の脂肪族または芳香族炭
素環または複素環を形成してよく、ｐおよびｒは互いに独立して、０、１または２を表し、Ｑb₃₁は、Ｏ；N(Rb₃₁₂)、ＳまたはSeを表し、Ａb₃₁、Ｂb₃は互いに独立して、Ｏ、Ｓ、Se、Te、N-Rb₃₁₃、C(Rb₃₁₄)(Rb₃₁₅)
または-C(Rb₃₁₆)=C(Rb₃₁₇)-を表し、ここでＲb₃₁₁〜Ｒb₃₁₇は、Ｈ、場合により
置換されたアルキル、アリールまたは最高20Ｃ原子を有するアルケニル、あるい
は任意の置換基を表すことができるが、ただし置換基Ｒb₃₁〜Ｒb₃₁₇の少なくとも１つは、-(CH₂)_l-SO₂-Z-SO₂-R、-(CH ₂ )_l-CO-Z-SO₂-R、-(CH₂)_l-SO₂-Z-CO-Rおよび-(CH₂)_l-N(R)-SO₃ ^-から成る群から
選択され、ここでｌは１から６の間の数を表し、Ｚは、NHまたはN^-を表し、そしてＲは、好ましくは場合により置換されたアルキルまたはアリールを表す。

【００７１】好適な態様では、置換基Ｒb₃₆〜Ｒb₃₉は、場合により複数の置換基を持つこと
ができる最高４個の環を含むことができる炭素環または複素環式環系の残りの員
を形成する。Ｒb₃₆はＲb₃₉と一緒にπ結合を形成してもよく、そしてＲa₃₇およ
びＲa₃₈は置換基を表してもよい。以下の置換基は、場合により縮合した５-もし
くは６-員の炭素環または複素環を形成することができる。

【００７２】置換基Ｒb₃₃はＲb₃₂および／またはＲb₃₄と一緒に、置換基Ｒb₃₂はＲb₃₃およ
び／またはＲb₃₁と一緒に、置換基Ｒb₃₄はＲb₃₅および／またはＲb₃₃と一緒に。式３ｂの特に好適な化合物

【００７３】

【化３３】

【００７４】

【化３４】

【００７５】スチリル染料本発明の目的に特に好ましく使用されるスチリル染料は、式４ａ、４ｂ、４ｃ
および／または４ｄの化合物である。

【００７６】

【化３５】

【００７７】式中、Ｒa₄₁〜Ｒa₄₁₁は互いに独立して、任意の置換基を表し、Ｙa₄₁およびＹa₄₂は互いに独立して、置換もしくは非置換のＣまたはＮを表し
、ここで置換基は５-もしくは６-員の脂肪族または芳香族炭素環または複素環を
形成してよい。

【００７８】Ａa₄は、Ｏ、Ｓ、Se、Te、N-Ra₄₁₂、C(Ra₄₁₃)(Ra₄₁₄)または-C(Ra₄₁₅)=C(Ra₄₁ ₆ )-を表し、ここでＲa₄₁₂〜Ｒa₄₁₆は、Ｈ、場合により置換されたアルキル、ア
リールまたは最高20Ｃ原子を有するアルケニルを表すことができるが、ただし置換基Ｒa₄₁〜Ｒa₄₁₆の少なくとも１つは、-(CH₂)_l-SO₂-Z-SO₂-R、-(CH ₂ )_l-CO-Z-SO₂-R、-(CH₂)_l-SO₂-Z-CO-Rおよび-(CH₂)_l-N(R)-SO₃ ^-から成る群から
選択され、ここでｌは１から６の間の数を表し、Ｚは、NHまたはN^-を表し、そしてＲは、好ましくは場合により置換されたアルキルまたはアリールを表す。

【００７９】好適な態様では、置換基Ｒa₄₈〜Ｒa₄₁₁は、場合により複数の置換基を持つこ
とができる最高４個の環を含むことができる炭素環または複素環式環系の残りの
員を形成する。Ｒa₄₈はＲa₄₁₁と一緒にπ結合を形成してもよく、そしてＲa₄₉お
よびＲa₄₁₀は置換基を表してもよい。

【００８０】以下の置換基は、場合により縮合した５-もしくは６-員の炭素環または複素環
を形成することができる：置換基Ｒa₄₅はＲa₄₆と、またはＲa₄₅はＲa₄₄と、またはＲa₄₆はＲa₄₁と、およ
び／またはＲa₄₁はＲa₄₂と、およびまたはＲa44はＲa₄₃と一緒に。式４ａの特に好適な化合物

【００８１】

【化３６】

【００８２】

【化３７】

【００８３】

【化３８】

【００８４】式中、Ｒa₄₁〜Ｒa₄₁₁は互いに独立して、任意の置換基を表し、Ｙb₄₁およびＹb₄₂は互いに独立して、置換もしくは非置換のＣまたはＮを表し
、ここで置換基は５-もしくは６-員の脂肪族または芳香族炭素環または複素環を
形成してもよく、ｎは、０、１、２、３、４または５を表すが、ただし置換基Ｒb₄₁〜Ｒb₄₁₁の少なくとも１つは、-(CH₂)_l-SO₂-Z-SO₂-R、-(CH ₂ )_l-CO-Z-SO₂-R、-(CH₂)_l-SO₂-Z-CO-Rおよび-(CH₂)_l-N(R)-SO₃ ^-から成る群から
選択され、ここでｌは１から６の間の数を表し、Ｚは、NHまたはN^-を表し、そしてＲは、好ましくは場合により置換されたアルキルまたはアリールを表す。

【００８５】好適な態様では、以下の置換基が場合により縮合した５-または６-員の炭素環
または複素環を形成する：置換基Ｒb₄₅はＲb₄₆と、および／またはＲb₄₅はＲb₄₄と、および／またはＲb₄ ₆ はＲb₄₁と、および／またはＲb₄₁はＲb₄₂と、およびまたはＲb₄₄はＲb₄₃と一緒
に。

【００８６】置換基Ｒb₄₉はＲb₄₁₀および／またはＲb₄₈と一緒に、置換基Ｒb₄₁₀はＲb₄₁₁と
一緒に、および／またはＲb₄₈はＲb₄₇と一緒に。式４ｂの特に好適な化合物

【００８７】

【化３９】

【００８８】

【化４０】

【００８９】式中、Ｒc₄₁〜Ｒc₄₁₀は互いに独立して、任意の置換基を表し、Ｙc₄₁およびＹc₄₂は互いに独立して、置換もしくは非置換のＣまたはＮを表し
、ここで置換基は５-もしくは６-員の脂肪族または芳香族炭素環または複素環を
形成してもよく、Ａc₄₁は、Ｏ、Ｓ、Se、Te、N-Rc₄₁₁、C(Rc₄₁₂)(Rc₄₁₃)または-C(Rc₄₁₄)=C(Rc₄ ₁₅ )-を表し、ここでＲc₄₁₁〜Ｒc₄₁₅は、Ｈ、場合により置換されたアルキル、ア
リールまたは最高20Ｃ原子を有するアルケニルを表すことができ、そしてｎは、０、１、２、３、４または５を表すが、ただし置換基Ｒc₄₁〜Ｒc₄₁₅の少なくとも１つは、-(CH₂)_l-SO₂-Z-SO₂-R、-(CH ₂ )_l-CO-Z-SO₂-R、-(CH₂)_l-SO₂-Z-CO-Rおよび-(CH₂)_l-N(R)-SO₃ ^-から成る群から
選択され、ここでｌは１から６の間の数を表し、Ｚは、NHまたはN^-を表し、そしてＲは、好ましくは場合により置換されたアルキルまたはアリールを表す。

【００９０】好適な態様では、以下の置換基が場合により縮合した５-または６-員の炭素環
または複素環を形成することができる：置換基Ｒc₄₅はＲc₄₆と一緒に、またはＲc₄₅はＲc₄₄と一緒に、またはＲc₄₆は
Ｒc₄₁と一緒に、および／またはＲc₄₁はＲc₄₂と一緒に、およびまたはＲc₄₄はＲ
c₄₃と一緒に。

【００９１】置換基Ｒc₄₇〜Ｒc₄₁₀は、場合により複数の置換基を持つことができる最高４
個の環を含むことができる炭素環または複素環式環系の残りの員を形成する。Ｒ
c₄₇はＲc₄₁₀と一緒にπ結合を形成してもよく、そしてＲc₄₈およびＲc₄₉は置換
基を表してもよい。特に好ましく使用される式４ｃの化合物

【００９２】

【化４１】

【００９３】

【化４２】

【００９４】式中、Ｒd₄₁〜Ｒd₄₁₀は互いに独立して、任意の置換基を表し、Ｙd₄₁およびＹd₄₂は互いに独立して、置換もしくは非置換のＣまたはＮを表し
、ここで置換基は５-もしくは６-員の脂肪族または芳香族炭素環または複素環を
形成してもよく、ｎは、０、１、２、３、４または５を表すが、ただし置換基Ｒd₄₁〜Ｒd₄₁₀の少なくとも１つは、-(CH₂)_l-SO₂-Z-SO₂-R、-(CH ₂ )_l-CO-Z-SO₂-R、-(CH₂)_l-SO₂-Z-CO-Rおよび-(CH₂)_l-N(R)-SO₃ ^-から成る群から
選択され、ここでｌは１から６の間の数を表し、Ｚは、NHまたはN^-を表し、そしてＲは、好ましくは場合により置換されたアルキルまたはアリールを表す。

【００９５】好適な態様では、以下の置換基が場合により縮合した５-または６-員の炭素環
または複素環を形成することができる：置換基Ｒd₄₅はＲd₄₆と、および／またはＲd₄₅はＲd₄₄と、および／またはＲd₄ ₆ はＲd₄₁と、および／またはＲd₄₁はＲd₄₂と、および／またはＲd₄₄はＲd₄₃と一
緒に。

【００９６】置換基Ｒd₄₉はＲd₄₁と一緒に、および／または置換基Ｒd₄₈はＲd₄₇と一緒に。特に好ましく使用される式４ｄの化合物

【００９７】

【化４３】

【００９８】５．スクエア酸本発明の目的のために、好ましく使用されるスクエア酸は、式５ａ、５ｂおよ
び／または５ｃ

【００９９】

【化４４】

【０１００】式中、Ｒa₅₁〜Ｒa₅₁₀は互いに独立して、任意の置換基を表し、Ｙa₅₁、Ｙa₅₄は互いに独立して、置換もしくは非置換のＣまたはＮを表し、こ
こで置換基は５-もしくは６-員の脂肪族または芳香族炭素環-または複素環を形
成してもよい。

【０１０１】ｓおよびｔは互いに独立して、０、１、２または３を表し、ｋは、１または２を表し、Ｙa₅₂は、Ｏ、Ｓまたは=NRa₅₁₁を表し、Ｙa₅₃は、O-Ra₅₁₂、S-Ra₅₁₃、またはN(Ra₅₁₂)(Ra₅₁₅)を表し、ここでＲa₅₁₁〜Ｒa₅₁₅は互いに独立して、任意の置換基を表し、Ａa₅₁およびＢa₅₁は互いに独立して、Ｏ、Ｓ、Se、Te、N-Ra₅₁₆、C(Ra₅₁₇)(Ra ₅₁₈ )または-C(Ra₅₁₉)=C(Ra₅₂₀)-を表し、ここでＲa₅₁₆〜Ｒa₅₂₀は任意の置換基
、好ましくはＨ、場合により置換されたアルキル、アリールまたは最高20Ｃ原子
を有するアルケニルを表すことができるが、ただし置換基Ｒa₅₁〜Ｒa₅₂₀の少なくとも１つは、-(CH₂)_l-SO₂-Z-SO₂-R、-(CH ₂ )_l-CO-Z-SO₂-R、-(CH₂)_l-SO₂-Z-CO-Rおよび-(CH₂)_l-N(R)-SO₃ ^-から成る群から
選択され、ここでｌは１から６の間の数を表し、Ｚは、NHまたはN^-を表し、そしてＲは、好ましくは場合により置換されたアルキルまたはアリールを表す、のものである。

【０１０２】好適な態様では、置換基Ｒa₅₂〜Ｒa₅₅またはＲa₅₆〜Ｒa₅₉は、場合により複数
の置換基を持つことができる最高４個の環を含むことができる炭素環または複素
環式環系の残りの員を形成する。Ｒa₅₂はＲa₅₅と一緒に、および／またはＲa₅₆
はＲa₅₉と一緒にπ結合を形成してもよく、そしてＲa₅₃およびＲa₅₄またはＲa₅₇ およびＲa₅₈は置換基を表してもよい。式５ａの特に好適な化合物

【０１０３】

【化４５】

【０１０４】

【化４６】

【０１０５】

【化４７】

【０１０６】

【化４８】

【０１０７】

【化４９】

【０１０８】

【化５０】

【０１０９】

【化５１】

【０１１０】

【化５２】

【０１１１】式中、Ｒb₅₁〜Ｒb₅₁₂は互いに独立して、任意の置換基を表すことができ、Ｙb₅₁〜Ｙb₅₄は互いに独立して、置換もしくは非置換のＣまたはＮを表し、こ
こで置換基は５-もしくは６-員の脂肪族または芳香族炭素環または複素環を形成
してもよく、ｓおよびｔは互いに独立して、０、１、２または３を表し、ｋは、１または２を表し、Ｙb₅₂は、Ｏ、Ｓまたは=NRb₅₁₃を表し、Ｙb₅₃は、O-Rb₅₁₄、S-Rb₅₁₅、またはN(Rb₅₁₆)(Rb₅₁₇)を表し、ここでＲb₅₁₃〜Ｒb₅₁₇は互いに独立して、任意の置換基を表すことができる
が、ただし置換基Ｒb₅₁〜Ｒb₅₁₇の少なくとも１つは、-(CH₂)_l-SO₂-Z-SO₂-R、-(
CH₂)_l-CO-Z-SO₂-R、-(CH₂)_l-SO₂-Z-CO-Rおよび-(CH₂)_l-N(R)-SO₃ ^-から成る群か
ら選択され、ここでｌは１から６の間の数を表し、Ｚは、NHまたはN^-を表し、そしてＲは、好ましくは場合により置換されたアルキルまたはアリールを表す。

【０１１２】好適な態様では、以下の置換基は、場合により縮合した５-もしくは６-員の炭
素環または複素環を形成することができる。

【０１１３】置換基Ｒb₅₅はＲb₅₆と、および／またはＲb₅₅はＲb₅₄と、および／またはＲb₅ ₆ はＲb₅₁と、および／またはＲb₅₁はＲb₅₂と、および／またはＲb₅₄はＲb₅₃と一
緒に。

【０１１４】置換基Ｒb₅₉はＲb₅₈と一緒に、またはＲb₅₁₀はＲb₅₁₁と一緒に、置換基Ｒb₅₁₁ はＲb₅₁₂と一緒に、および／または置換基Ｒb₅₈はＲb₅₇と一緒に。式５ｂの特に好適な化合物

【０１１５】

【化５３】

【０１１６】

【化５４】

【０１１７】

【化５５】

【０１１８】

【化５６】

【０１１９】

【化５７】

【０１２０】式中、Ｒc₅₁〜Ｒc₅₁₁は互いに独立して、任意の置換基を表し、Ｙc₅₁〜Ｙc₅₄は互いに独立して、置換もしくは非置換のＣまたはＮを表し、こ
こで置換基は５-もしくは６-員の脂肪族または芳香族炭素環または複素環を形成
してもよく、ｓおよびｔは互いに独立して、０、１、２または３を表し、ｋは、１または２を表し、Ｙc₅₂は、Ｏ、Ｓまたは=NRc₅₁₂を表し、Ｙc₅₃は、O-Rc₅₁₃、S-Rc₅₁₄、またはN(Rc₅₁₅)(Rc₅₁₆)を表し、Ａc₅₁は、Ｏ、Ｓ、Se、Te、N-Rc₅₁₇、C(Rc₅₁₈)(Rc₅₁₉)または-C(Rc₅₂₀)=C(Rc₅ ₂₁ )-を表し、ここでＲc₅₁₂〜Ｒc₅₂₁は任意の置換基、好ましくはＨ、場合により
置換されたアルキル、アリールまたは最高20Ｃ原子を有するアルケニルを表すこ
とができるが、ただし置換基Ｒc₅₁〜Ｒc₅₂₁の少なくとも１つは、-(CH₂)_l-SO₂-Z-SO₂-R、-(C
H₂)_l-CO-Z-SO₂-R、-(CH₂)_l-SO₂-Z-CO-Rおよび-(CH₂)_l-N(R)-SO₃ ^-から成る群から
選択され、ここでｌは１から６の間の数を表し、Ｚは、NHまたはN^-を表し、そしてＲは、好ましくは場合により置換されたアルキルまたはアリールを表す。

【０１２１】好適な態様では、以下の置換基は、場合により縮合した５-もしくは６-員の炭
素環または複素環を形成することができる。

【０１２２】置換基Ｒc₅₅はＲb₅₆と、および／またはＲc₅₅はＲc₅₄と、および／またはＲc₅ ₆ はＲc₅₁と、および／またはＲc₅₁はＲc₅₂と、および／またはＲc₅₄はＲc₅₃と一
緒に。

【０１２３】置換基Ｒc₅₇〜Ｒc₅₁₀は、好ましくは場合により複数の置換基を持つことがで
きる最高４個の環を含むことができる炭素環または複素環式環系の残りの員を形
成する。Ｒc₅₈はＲc₅₉と一緒にπ結合を形成してもよく、そしてＲc₅₇およびＲc ₅₁₀ は置換基を表してもよい。式５ｃの特に好適な化合物

【０１２４】

【化５８】

【０１２５】

【化５９】

【０１２６】本出願の目的のためには、置換基は例えば特にＦ、ClまたはBrのようなハロゲ
ン、さらにアルコキシ、アルキルチオ、アリールオキシ、アリールチオ、アシル
アミノ、アルキルスルホンアミド、アルキルスルファモイル、アルキルカルバモ
イル、アリールスルホンアミド、アリールスルファモイル、アリールカルバモイ
ル、アルキル、アルケニル、アリール、ヘトアリール、アリーレン、ヘトアリー
レン、アルキレン、アルコキシカルボニル、ウレイドまたはシアノ基を意味する
と理解される。好適であるのは、さらに置換およびまた非置換のシクロアルキル
およびまた置換および非置換のアリール、特にフェニル基；特に好適な置換基は
、場合により置換されたアルキル、アリール、スルホアルキル、カルボキシアル
キル、-(CH₂)_l-SO₂-Z-SO₂-R、-(CH₂)_l-CO-Z-SO₂-R、-(CH₂)_l-SO₂-Z-CO-R、-(CH₂ )_l-N(R)-SO₃ ^-であり、ここでｌは１から６の間の数を表し、そしてＺは、NHまた
はN^-を表し、そしてＲは、好ましくは場合により置換されたアルキルまたはアリ
ールを表す。

【０１２７】本発明の目的のためには、アルケニルは例えばエテニル、2-プロペニル、イソ
プロペニルのような直線状もしくは分枝の、環式もしくは直鎖状の、置換もしく
は非置換の不飽和炭化水素基を意味すると理解される。

【０１２８】本出願の目的のためには、炭素環もしくは複素環式環系は好ましくは４、５、
６、７または８個の炭素原子から成る環系を意味すると理解され、ここで最高３
個の炭素原子が特にＮ、Ｏ、SEまたはＳのようなヘテロ原子と置き換わることが
できる。この環系は脂肪族または芳香族環である；好ましくは２、３または４個
の同一もしくは異なる環が縮合系に存在してよい。本出願の目的のためには、炭
素環式芳香族基は、好ましくは５-もしくは６-員の縮合および／または置換され
た環系、特にフェニルおよびナフチルを意味すると理解される。不飽和の複素環
式基は好ましくは、単環状態で、しかしまた縮合環系としても存在することがで
きる５-もしくは６-員の環系を意味すると理解される。ここで適当なヘテロ原子
は、特にＮ、ＳおよびＯである。環系は好ましくは１から３の間のヘテロ原子を
有することができ、ヘテロ原子は同一もしくは異なってもよい。好適であるのは
：フリル、インドリル、チエニル、ピロリルおよびカルバゾイルである。これら
の基は非置換であるか、または好ましくは置換されることができる。ここでも炭
素環式芳香族基および不飽和複素環式基は、それらの一部に置換基が存在しても
よく、これはまた異なる環系の可能な縮合を含むことを意味する。

【０１２９】本発明に従い特に好適である式１〜５の１つの化合物を、以下に掲げる：

【０１３０】

【化６０】

【０１３１】

【化６１】

【０１３２】

【化６２】

【０１３３】

【化６３】

【０１３４】

【化６４】

【０１３５】本発明に従い、染料は抗体に結合することもでき、そして例えばフローサイト
メトリーに使用することができる。これらのポリメチン染料の１つの利点は、染
料が500から900nmの間のほとんど任意の波長に調整することができるという事実
である。その結果、多色検出も可能である。フローサイトメトリーでは、例えば
各々の場合で異なる抗体を１つの蛍光染料で標識し、そして次いで１つの実験で
安定な検出系を使用して同時に検出することができる。次いで特異的な抗体が細
胞上の異なるエピトープを同定する。この系を使用して、被検物を定量すること
も可能である。すなわち複数の蛍光標識した抗体を使用することにより、実験あ
たりより高い情報量を与える。これは特に例えば臨床試験に関する経費的な利点
を意味する。

【０１３６】さらに蛍光共鳴エネルギー移動により互いに相互反応している生体分子の標識
により、定性的および／または定量的検出法を行うことも可能である。

【０１３７】本発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡのようなヌクレオチド同族体を標識す
るための染料の使用も提供し、そしてこのために、染料は核酸アッセイに使用す
ることができる。ここで通常は、活性化された染料分子をヌクレオチド、ヌクレ
オシド、ヌクレオチド同族体またはオリゴヌクレオチドまたはそれらの同族体に
結合させる。結合は活性化された染料と反応するヌクレオチドまたは同族体の求
核性基を介して起こる。通例の求核性基はアミノ基、チオール基、ヒドロキシル
基または他の基である。活性化された基は一般に、N-ヒドロキシスクシンイミデ
ート、イソチオシアネート、マレイミドまたはヨードアセトアミド誘導体のよう
なカルボキル基の誘導体である。さらに求核性基はホスホアミデート基と反応す
ることもでき、染料分子と生体分子との間に共有結合を生じる。

【０１３８】さらなる応用では、染料は例えばポリマー性ビーズのような固相に結合するか
、またはそれに取り込むことができる。ポリマー性ビーズは官能化され、そして
それらの一部は生体分析で蛍光標識として作用する。

【０１３９】すでに記載したように、式（I）の基を含むポリメチン染料は写真ですでに知
られている：それらは例えば欧州特許第0,534,283号、同第0,530,511号明細書、
独国特許第1 081 311号明細書に記載されているように得ることが可能である。

【０１４０】対照的に式（I）の基および同時にそれらを共有結合できるようにする基を含
むポリメチン染料は、以下の化合物：

【０１４１】

【化６５】

【０１４２】の群から選択され、そして新規であり、そして従来技術には記載されたことはな
かった。したがって、これからそのような「活性化」染料を得るための合成手法
を記載する。

【０１４３】本発明に従い、染料ＦおよびＪを製造するための合成法。１．Ｆの合成

【０１４４】

【化６６】

【０１４５】Ａ 12時間、0.15モルの3,4-ジヒドロキシ-3-シクロブテン-1,2-ジオン（150mLの
無水エタノール中）を加熱還流する。反応混合物を濃縮する。油をカラムクロマトグラフィーにより精製する。移動相：メチルtert-ブチルエーテル／イソ-オクタン 50:50 固定相；AMICOM 35-70mic 収率：48％

【０１４６】

【化６７】

【０１４７】Ｃ 0.055モルのＡ、0.0068モルのＢおよび0.0078モルのトリエチルアミン（50mL
の無水エタノール中）を、還流で沸騰させる。35分後、0.107モルのトリエチル
アミンを加える。3.5時間後、混合物を冷却する。酢酸エチルを加え、そして激
しく撹拌した後、混合物をデカントする。これらの工程をさらに３回繰り返す。
油（Ｃ）を与える。Ｄへの加水分解 0.145モルの(C₄H₉)₄NOH（１M、メタノール中）中の油Ｃを加熱還流する。30分
後、混合物を冷却する。500mlのアセトンおよび16mLの濃HClを加える。沈殿した
固体を濾過する。収量：28g

【０１４８】

【化６８】

【０１４９】Ｅ 0.63モルの2,3,3-トリメチルインドーレニンおよび0.5モルのBr(CH₂)₅COOH（
少量のアセトニトリル中）を３時間、加熱還流する。反応混合物の温度は130℃
である。0.5モルの酢酸を加え、そして混合物を100℃に冷却する。250mLのメチ
ルエチルケトンを加え、そして混合物をさらに氷浴上で15℃に冷却する。沈殿し
た固体を濾過し、そして50℃で乾燥させる。収率：75％

【０１５０】

【化６９】

【０１５１】Ｇ 3.5モルのフェニルヒドラジン-4-スルホン酸および1.9Lの酢酸を、105℃で加
熱する。30分の期間にわたり、4.8モルの3-メチル-2-ブタノンを滴下する。１時
間50分後、加熱を外し、そして4.2モルの酢酸カリウム（3.5リットルのメタノー
ル中）を加える。混合物をさらに氷浴中で冷却し、そして沈殿した固体を濾過す
る。これを酢酸エチルで洗浄する。収率：77％

【０１５２】

【化７０】

【０１５３】Ｈ 26.8モルのクロロアセチルクロライドおよび25.5モルのメタンスルホンアミド
（10.2リットルの酢酸ブチル中）を、ゆっくりと還流で沸騰させる。８時間後、
混合物を20℃に冷却する。沈殿した固体を濾過し、そして４リットルの酢酸ブチ
ル中で撹拌する。沈殿した固体を50℃でファンを回した乾燥キャビネット中で乾
燥させる。収率74％

【０１５４】

【化７１】

【０１５５】Ｂ 2.5モルのＧおよび2.5モルのＨ（1.3リットルのスルホラン中）を130℃で加熱
する。５時間50分後、混合物を50℃に冷却する。2.5リットルのアセトンの加え
、そして混合物をさらに室温に冷却する。沈殿した固体を濾過し、そしてアセト
ンで洗浄する。沈殿した固体を1.6リットルの暖ためた脱イオン水中で撹拌する
。1.6リットルのエタノールを加え、そして混合物を冷却する。沈殿した固体を
濾過し、そしてエタノールで洗浄する。収率：53％

【０１５６】

【化７２】

【０１５７】Ｆディーン−スターク（Dean-Stark）分離器を備えたフラスコ中に、4.7gのＤ、
3.5gのＥおよび1.4mLのトリエチルアミン（n-ブタノール／トルエン中）を、還
流で沸騰させる。2.5時間後、混合物を冷却する。混合物を水で３回抽出する。
反応混合物を濃縮し、そしてエタノールに再溶解する。３gの酢酸カリウムを加
え、そして混合物を濾過する。沈殿した固体を水に溶解し、そしてアセトンを加
える。溶媒をデカントし、そしてさらにアセトンを加える。これらの工程を沈殿
が生じるまで繰り返す。沈殿した固体を濾過する。２．Ｊの合成

【０１５８】

【化７３】

【０１５９】Ｉ 0.1モルのＧおよび0.12モルのBr(CH₂)₅COOH（35mLのスルホラン中）を、130℃
で加熱する。３時間後、100mLのジメチルアセトアミドを加え、そして混合物を
室温に冷却する。沈殿した固体を濾過し、そしてフィルター上をジメチルアセト
アミドで洗浄する。沈殿した固体をアセトン中で沸騰させる。冷却後、混合物を
濾過し、そして生成物を50℃でファンを回した乾燥キャビネット中で乾燥させる
。収率：90％

【０１６０】

【化７４】

【０１６１】Ｊ２時間10分間、4.7gのＤおよび3.5gのＩ（80mLのn-ブタノール／ピリジン(7:1
)中）を、還流で沸騰させる。混合物を室温に冷却し、そして沈殿した固体を濾
過する。フィルター上の固体をn-ブタノールまたはアセトンで洗浄する。沈殿し
た固体を７mLの脱イオン水に溶解し、そして30mLのアセトニトリルを撹拌しなが
ら加える。液体相をデカントし、撹拌しながら、そしてさらにアセトニトリルを
加える。液体相をデカントし、そして油を40mLの飽和塩化ナトリウム溶液で撹拌
する。細かい懸濁物を遠心し、そして液体相をデカントする。沈殿した固体をメ
タノールに溶解し、そして塩化ナトリウムを濾過する。濾液を濃縮する。生成物
を50℃で乾燥させる。収量:1.57g(18.5％)カルボニル官能基を有するポリメチン染料からスクシンイミジルエステルの一般的調製法この手順は少なくとも１つのカルボキシル官能基を有するポリメチン染料から
のスクシンイミジルエステルの調製を記載する。これらのエステルは次いで、タ
ンパク質、抗体または核酸のような生体分子を標識するために使用することがで
きる。

【０１６２】 0.05ミリモルの染料およびジスクシンイミジルカーボネート（カルボキシル基
あたり1.5当量）を、40mLのDMSFに溶解し、そしてスパチュラ一杯のジメチルア
ミノピリジンを加える。混合物を40℃で３時間撹拌する。冷却後、上清を１mlの
アリコートでガラスバイアルに分ける。溶媒を減圧下で蒸発させ、そして生成物
を暗中４℃で使用するまで保存する。

【０１６３】粗生成物は、タンパク質を標識するために直接使用する。タンパク質を標識するための一般手順標識するために、粗生成物（１アリコート）を１mlのDMFに溶解する。50μlの
この溶液を1.5mL（＝１mg）の抗-HSA溶液（0.1M 炭酸バッファー、pH9.2中）に
ピペットで加える。反応溶液をRTで２時間撹拌する。

【０１６４】前以てPBS、pH7.4で平衡化したSephadex G50カラムでのゲル浸透クロマトグラ
フィーを使用して、結合物を次いで非結合染料から分離する。染料でオリゴヌクレオチドを標識するための一般手順この染料はＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドまたはヌクレオチド同族体を標識
するためにも使用することができる。

【０１６５】

【化７５】

【０１６６】 50ミリモルの活性化染料、例えばイソチオシアネートＫを、50mlのDMFまたは
アセトニトリルに溶解する。10ナノモルのNH2-オリゴヌクレオチドを最初に150
μlの50mM 炭酸バッファー、pH9.2に入れ、そして75ナノモルの染料をピペット
を使用してゆっくりと加える。溶液は、光を排除して25℃で３〜５時間撹拌した
。オリゴヌクレオチドの精製非結合の染料および非標識ＤＮＡから標識したオリゴヌクレオチドの精製は、
RP-HPLCによりC8カラムで行った。溶出は直線勾配、例えば30分間にわたる70％
水から100％メタノールを使用して行った。

【０１６７】 254nmおよび染料の吸収最大で同時に吸収された画分を集め、そして溶媒を減
圧下で除去した。

【０１６８】修飾したオリゴヌクレオチドをさらに使用するために、これをエタノール沈殿
により過剰な塩から分離することができる。

【０１６９】

【実施例】表１は、同じモル染料／タンパク質比での染料の相対的量子収率を表す。使用
したタンパク質はHSA（ヒト血清アルブミン）であった。

【０１７０】

【表２】

【０１７１】モルの染料／タンパク質比係数の決定タンパク質濃度は、ピアス（Pierce）のBCA法（文献：Bradford,M.M.;Anal Bi
ochem.(1976)72,248-254）を使用して決定する。抗-HSAに対するカリブレーショ
ンカーブを、前以て準備した。

【０１７２】染料濃度は吸収スペクトルから決定する。量子収率の決定量子収率はCy5に対して決定した。吸光係数の決定吸光係数は、ベールの法則を適用すると仮定して決定した。活性化染料Ｆの抗-HASへの標識標識には、粗生成物（１アリコート）を１mlのDMFに溶解する。この溶液50μl
を1.5mL（＝１mg）の抗-HSA溶液（炭酸バッファー、pH9.2中）にピペットで加え
る。反応溶液はRTで光の排除下にて２時間撹拌する。

【０１７３】 Sephadex G25カラムでのゲル浸透クロマトグラフィーを使用して、次いで結合
物を非結合染料から分離する。使用した溶出バッファーは、PBS、pH7.4である。

【０１７４】表１に掲げる他の染料のタンパク質結合物は、類似様式で調製した。

【０１７５】表１は、本発明の染料が例えばCy5より高い量子収率および吸光係数を有する
ことを示す。したがって、それらは生物分析における蛍光マーカーとしての使用
に特に適する。

【０１７６】本発明の染料の染料結合物は、これまで通例だったポリメチン染料よりも凝集
する傾向が低いことを示す。これは表２から明らかである。

【０１７７】

【表３】

【０１７８】

【化７６】

【０１７９】

【化７７】

【０１８０】単量体の吸光最大における吸収の強度は、溶液中の単量体の濃度に関する相対
的尺度である。同様にまた、凝集物の濃度にも適用する。これは凝集物の吸収最
大における吸収の強度にも相関し、これは単量体に比べて浅色的にシフトする。

【０１８１】表２は、単量体および凝集物の吸収最大の強度の比率を示す。塩濃度の上昇に
より、凝集物の形成を引き起こす。CY5に比べて、本発明の染料Ｊはかなり低い
凝集物形成を示す。Sq-1からSq-3のようなスクエア酸は、凝集物形成に関して安
定な特性をもたず、凝集物形成は塩濃度の上昇で増す。

【０１８２】対照的に、本発明の染料ＦおよびＪは安定な特性を有する。光安定性光安定性は染料溶液を日光に暴露することにより決定した。溶液の吸収は1.4
から1.6 O.D.の間で変動した。時間の経過による吸収の減少は、染料の光安定性
に関する尺度である。これらの条件は、染料の取り扱いには手による工程段階を
含み、その間にも染料が日光に暴露されるので選択した。CY5の場合、たとえ30
分後でも吸収が12 ％まで減少したことは明らかに注目すべきである。これは本
発明の染料にはあてはまらず、すなわち本発明の染料は安定な吸収を維持するこ
とにより、使用者により利用され易い。

【０１８３】

【表４】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ジモン，リデイアドイツ・デー−42489ビユルフラート・ツアイジクベーク10 Ｆターム(参考） 2G045 DA36 FA11 FB07 FB12 GC10 GC15 2G054 AA06 CA21 CA23 CE02 EA03 4C063 AA03 BB08 CC06 DD04 EE10 4H056 CA01 CA02 CA05 CB01 CC02 CC08 DD03 FA08

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式（I）【化１】（式中：ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８または９を表し、Ｙ、Ａは、電子求引基、好ましくはＣ＝ＯまたはＳＯ２−を表し、そしてＲは、場合により置換されてもよいアルキルまたはアリール基を表す）の少なくとも１つの置換基、ならびに【化２】から成る群から選択される少なくとも１つの置換基を含んで成るポリメチン染料
。
【請求項２】ポリメチン染料が、シアニン染料、メロシアニン染料、ロー
ダシアニン染料、スチレン染料、スクエア酸染料および／またはクロトン酸染料
であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】生体分子を共有結合により標識するための、請求項１または
２に記載の少なくとも１つの化合物の使用。
【請求項４】生体分子を染色するための式（I）の基を含有する、少なく
とも１つのポリメチン染料の使用。
【請求項５】生体分子を標識するための少なくとも１つの以下の化合物【化３】【化４】【化５】【化６】【化７】の使用。