JP2003506031A - In vitro cultivation and use of togavirus and flaviviridae viruses - Google Patents
In vitro cultivation and use of togavirus and flaviviridae virusesInfo
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Abstract
(57)【要約】 本発明は、トガウィルス又はフラビウィルス科に属するウィルスをインビトロで、培養、増殖、及び複製させる方法であって、該方法において、トガウィルス又はフィラビウィルス科に属する少なくとも一のウィルスに感染した患者の血清から又は血漿から得られた少なくとも一のＬＶＰ分画が存在し、少なくとも一のリポタンパク質の受容体により中継され、かつ１６乃至２０の炭素原子を含む不飽和脂肪酸、又は不飽和脂肪酸の誘導体、又はそれらの混合物から選ばれる活性化剤により調節されるエンドサイトーシス経路を有する許容性細胞に、所定の時間、適当な培地中で、前記分画を接触させる方法に関する。本発明はまた前記方法により得られるウィルス粒子及びポリペプチドの使用にも関する。 (57) Abstract: The present invention provides a method for culturing, growing, and replicating a virus belonging to the family Togavirus or Flaviviridae in vitro, wherein the method comprises at least one virus belonging to the family Togavirus or Filaviviridae. At least one LVP fraction obtained from serum or from plasma of a patient infected with an unsaturated fatty acid that is relayed by at least one lipoprotein receptor and contains 16 to 20 carbon atoms, or The present invention relates to a method of contacting a permissive cell having an endocytosis pathway regulated by an activator selected from a derivative of a saturated fatty acid or a mixture thereof with a fraction for a predetermined time in an appropriate medium. The invention also relates to the use of the virus particles and polypeptides obtained by the method.
Description
【０００１】[0001]
本発明は、特に、ヒトウィルス病理学の進展に関与するＲＮＡウィルスの、イ
ンビトロでの培養及び増殖方法に関する。The invention particularly relates to a method for in vitro culture and propagation of RNA viruses involved in the development of human viral pathology.
【０００２】
本発明の培養及び増殖方法は、主に、トガウィルス及びフラビウィルス科に属
するウィルスに適用される。これらのウィルスは、エンベロープで包まれ、非セ
グメントの、ポジティブセンスの、一本鎖ＲＮＡウィルスであるという共通の性
質を有する。The culture and growth method of the present invention is mainly applied to viruses belonging to Togavirus and Flaviviridae. These viruses have the common property of being enveloped, non-segmented, positive-sense, single-stranded RNA viruses.
【０００３】[0003]
トガウィルス科はアルファウィルス及びルビウィルス属のウィルスを含む。ビ
リオンは７０ｎｍ径で、球形であり、エンベロープと、２つの糖タンパク質のヘ
テロダイマーからなるペプロマーを含む。ゲノムは、９．７乃至１１．８ｋｂの
一本鎖ＲＮＡの単一の分子からなる。構成タンパク質はキャプシドのタンパク質
と糖タンパク質の２つのエンベロープを含む。ビリオンは、宿主細胞膜由来の脂
質を含む。複製は、ゲノムＲＮＡの合成のマトリックスとして用いられる相補Ｒ
ＮＡ鎖の合成を含む。ゲノムＲＮＡは、中間複製ＲＮＡのマトリックスとして用
いられ、それが、ｍＲＭＡ合成と、構成及び非構成タンパク質を得るために開裂
するポリタンパク質前駆体の生産のマトリックスとして用いられる。複製は、細
胞質でおこり、アセンブリは膜を通った出芽を含む。The Togavirus family includes viruses of the genera Alphavirus and Rubivirus. Virions are 70 nm in diameter, spherical, and contain an envelope and a peplomer consisting of a heterodimer of two glycoproteins. The genome consists of a single molecule of 9.7 to 11.8 kb single stranded RNA. The constituent proteins include two envelopes, a capsid protein and a glycoprotein. Virions contain lipids from the host cell membrane. Replication is a complementary R used as a matrix for the synthesis of genomic RNA.
Includes NA chain synthesis. Genomic RNA is used as a matrix for intermediate replicative RNA, which is used as a matrix for mRMA synthesis and production of polyprotein precursors that are cleaved to obtain constitutive and non-constitutive proteins. Replication occurs in the cytoplasm and assembly involves sprouting through the membrane.
【０００４】
シンドビスウィルス、ウマ脳脊髄炎（西部、東部、ベネズエラ）、チクングニ
ヤウィルス、オニョンニョンウィルス、イグボオラウィルス、ロスリバーウィル
ス、マヤロウィルス、及びバーマーフォレストウィルスはアルファウィルス属に
属しており、ヒトに対する病原性因子である。Ｅ型肝炎ウィルスは、現在、アル
ファウィルス群に分類されているが、エンベロープで包まれず、サイズがより小
さい。風疹ウィルスは、ルビウィルスに分類され、やはりヒトに対する病原性因
子である。Sindbis virus, equine encephalomyelitis (western, eastern, Venezuela), Chikungunya virus, Onyonnyon virus, Igboora virus, Ross River virus, Mayaro virus, and Vermer Forest virus belong to the genus Alphavirus. And is a virulence factor for humans. Hepatitis E virus is currently classified into the alphavirus group but is not enveloped and smaller in size. Rubella virus is classified as a rubivirus and is also a virulence factor for humans.
【０００５】
フラビウィルス科に分類されるのは、フラビウィルス（フラビウィルス）、ペ
スチウィルス（粘膜病ウィルス）、及びヘパシウィルス（Ｃ型及びＧ型肝炎ウィ
ルス）属である。ビリオンは、４５乃至６０ｎｍ径の球形で、ゲノムを封入する
二十面体のキャプシドをエンベロープで包む脂質二重層からなる。ゲノムは、フ
ラビウィルスが１０．７ｋｂの、ペスチウィルスが１２．５ｋｂの、Ｃ型肝炎ウ
ィルスが９．５ｋｂの、ポジティブセンス、一本鎖、直鎖ＲＮＡの単一分子から
なる。ビリオンは、二又は三の膜結合タンパク質と一のコアタンパク質を含む。
ビリオンは、宿主細胞膜由来の脂質を含む。それらは、糖脂質と糖タンパク質の
形態の炭水化物を含む。複製は、ゲノムＲＮＡの合成のためのマトリックスとし
て用いられる相補ＲＮＡの合成を含む。単一のリーディングフレーム（ＯＲＦ）
は、ウィルス及び細胞プロテオリシスにより開裂するポリタンパク質をコードす
る。構成タンパク質は、５’末端によりコードされ、非構成タンパク質は、ＲＮ
Ａの３’末端によりコードされる。複製は、細胞質でおこり、アセンブリはパス
スルーと宿主小胞体の膜で封入することを含む。複製は、細胞内膜増殖の特徴的
な態様を伴う。Classified into the Flaviviridae are the flavivirus (flavivirus), pestivirus (mucosa disease virus), and hepacivirus (hepatitis C and G virus) genera. Virions are spherical with a diameter of 45-60 nm and consist of a lipid bilayer encapsulating an icosahedral capsid enclosing the genome. The genome consists of a single molecule of positive-sense, single-stranded, linear RNA of flavivirus 10.7 kb, pestivirus 12.5 kb, hepatitis C virus 9.5 kb. Virions contain two or three membrane-bound proteins and one core protein.
Virions contain lipids from the host cell membrane. They include carbohydrates in the form of glycolipids and glycoproteins. Replication involves the synthesis of complementary RNA that is used as a matrix for the synthesis of genomic RNA. Single reading frame (ORF)
Encodes a polyprotein that is cleaved by viral and cellular proteolysis. Constitutive proteins are encoded by the 5'end, non-constituent proteins are RN
It is encoded by the 3'end of A. Replication occurs in the cytoplasm and assembly involves pass-through and encapsulation at the host endoplasmic reticulum membrane. Replication is associated with a characteristic aspect of intracellular membrane proliferation.
【０００６】
黄熱病ウィルス、デング熱ウィルス、日本脳炎ウィルス、西ナイルウィルス、
セントルイス脳炎ウィルス、マリーバレーウィルス、マダニ伝染脳炎ウィルス及
びイスラエルターキー脳髄膜炎ウィルスは、フラビウィルス属に属し、ヒトに対
する病原性因子である。Yellow fever virus, Dengue virus, Japanese encephalitis virus, West Nile virus,
St. Louis encephalitis virus, Mary Valley virus, tick-borne encephalitis virus and Israeli turkey meningitis virus belong to the flavivirus genus and are virulence factors for humans.
【０００７】
ウシ下痢ウィルス、ブタコレラウィルス及びヒツジボーダー病ウィルスはペス
チウィルス属に属する。Bovine diarrhea virus, swine fever virus and sheep border disease virus belong to the pestivirus genus.
【０００８】
ヘパシウィルス属に関し、現在それはＣ型肝炎およびＧ型肝炎ウィルス（ＧＢ
Ｖ−Ｃ及びＧＢＶ−Ａ及びＧＢＶ−Ｂウィルス）を含み、それはヒトを感染する
因子としてよく知られている。 Regarding the genus Hepacivirus, currently it is hepatitis C and hepatitis G virus (GB
V-C and GBV-A and GBV-B viruses), which are well known agents that infect humans.
【０００９】
具体的には、Ｃ型肝炎は、輸血により起こる肝炎の主原因である。Ｃ型肝炎は
、他の経皮経路、例えば薬剤の静脈内注射によっても伝染し得る。さらに、保健
の職業人の汚染のリスクは、わずかとはいえない。Specifically, hepatitis C is the main cause of hepatitis caused by blood transfusion. Hepatitis C can also be transmitted by other transdermal routes, such as intravenous injection of drugs. Moreover, the risk of pollution for health professionals is not insignificant.
【００１０】
Ｃ型肝炎は、Ａ型、Ｂ型又はＤ型肝炎などのウィルスが関与する肝臓病の他の
形態とは異なる。Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ又はＶＨＣ）での感染はしばしば慢
性であり、多くの場合、肝炎、肝硬変、及びガンなどの肝臓病をもたらす。Hepatitis C is distinct from other forms of liver disease involving viruses such as hepatitis A, B or D. Infection with hepatitis C virus (HCV or VHC) is often chronic, often resulting in liver diseases such as hepatitis, cirrhosis, and cancer.
【００１１】
血液ドナーを選択することによって輸血によるウィルス伝染のリスクは減少し
たが、Ｃ型肝炎の頻度は高いままである。現在、世界中で約１億７０００万人の
人が慢性的にＨＣＶに感染している。高リスクの集団は、主に輸血を受けた人と
、静脈薬剤ユーザーであるが、これらの高リスクグループに属さないが、体内で
抗ＨＣＶ抗体が循環していることが見出される無症状血液ドナーは存在する。後
者は、感染経路が同定されていない。The choice of blood donor reduces the risk of viral transmission by transfusion, but the frequency of hepatitis C remains high. Currently, about 170 million people worldwide are chronically infected with HCV. The high-risk population is primarily transfused and intravenous drug users, but asymptomatic blood donors who do not belong to these high-risk groups but who have circulating anti-HCV antibodies in their bodies Exists. In the latter, the infection route has not been identified.
【００１２】
ＨＣＶは、分子生物学的技術を用いて単離された最初の肝臓向性ウィルスであ
った。ウィルスゲノムの配列は、ウィルス粒子が可視化された前にクローン化さ
れた。HCV was the first hepatotrophic virus isolated using molecular biology techniques. The sequence of the viral genome was cloned before the viral particles were visualized.
【００１３】
ＨＣＶは、９．５ｋｂのポジティブな一本鎖ＲＮＡウィルスであり、相補ＲＮ
Ａコピーを介して複製し、その翻訳産物は、約３０００アミノ酸の単一のポリタ
ンパク質の前駆体である。ＨＣＶゲノムの５’末端は、構成タンパク質、ヌクレ
オキャプシドのコアタンパク質と２つのエンベロープ糖タンパク質Ｅ１とＥ２／
ＮＳ１をコードする遺伝子に隣接する非翻訳領域に相当する。５’非翻訳領域と
コア遺伝子は、可変遺伝子タイプの中では比較的よく保存されているが、Ｅ２エ
ンベロープタンパク質は、互いに異なる形態の超可変領域によりコードされてい
る。ＨＣＶゲノムの３’末端は、非構成（ＮＳ）タンパク質をコードする遺伝子
と、良く保存された３’非コード領域を含む。HCV is a 9.5 kb positive single-stranded RNA virus that complements RN.
It replicates via the A copy and its translation product is the precursor of a single polyprotein of approximately 3000 amino acids. The 5'end of the HCV genome consists of a constituent protein, a core protein of nucleocapsid and two envelope glycoproteins E1 and E2 /
It corresponds to the untranslated region adjacent to the gene encoding NS1. The 5'untranslated region and the core gene are relatively well conserved among variable gene types, but the E2 envelope protein is encoded by different forms of hypervariable regions. The 3'end of the HCV genome contains a gene encoding a non-constituent (NS) protein and a well-conserved 3'non-coding region.
【００１４】
そのゲノム構成とその推定される複製方法により、ＨＣＶは、フラビウィルス
科の新規な属、ヘパシウィルス属に分類されている。HCV is classified into a new genus of the Flaviviridae, the genus Hepacivirus, based on its genomic organization and its putative replication method.
【００１５】
診断とＨＣＶ感染について多くの技術が開発されている。例えば、診断免疫ア
ッセイを行ない、患者の血清中にＨＣＶタンパク質に対する抗体を検出している
。ウィルスＲＮＡの逆転写によるｃＤＮＡの合成と、ＰＣＲによる増幅も、ＨＣ
Ｖゲノムを検出するために用いられており、例えば慢性的に感染したヒトの、又
は実験的に感染したチンパンジーの血清中の潜在的感染性ウィルスの間接測定な
どである。さらに、遺伝子クローニングに基づき、ＤＮＡプローブハイブリダイ
ゼーション技術も開発されている。Many techniques have been developed for diagnosis and HCV infection. For example, diagnostic immunoassays have been performed to detect antibodies to HCV proteins in patient sera. CDNA synthesis by reverse transcription of viral RNA and amplification by PCR
It has been used to detect the V genome, such as indirect measurement of potentially infectious virus in the serum of chronically infected humans or experimentally infected chimpanzees. Furthermore, a DNA probe hybridization technique has also been developed based on gene cloning.
【００１６】
しかしながら、既存の診断技術は感度及び／又は特異性を欠いており、実施の
困難性という問題がある。例えば、ハイブリダイゼーション法のプローブでは、
低感染力のウィルスと高感染力のウィルスとを区別することは不可能である。し
たがって、試験される必要があるウィルスをチンパンジーに接種すること、及び
動物で得られた感染を試験することが必要であるが、これは実施することが困難
である。However, existing diagnostic techniques lack sensitivity and / or specificity, and are problematic to implement. For example, in a hybridization probe,
It is impossible to distinguish between a virus with low infectivity and a virus with high infectivity. It is therefore necessary to inoculate chimpanzees with the virus that needs to be tested and to test the resulting infection in animals, which is difficult to carry out.
【００１７】
したがって、公衆保健の見地から、ＨＣＶキャリアを同定しスクリーニングす
るための、特異的、高感度、実用的な方法を開発できることが、最も重要である
。解決法の一つは、ＨＣＶについて非常に効率的なインビトロ培養システムを作
ることかもしれず、それは、特にその複製機構を研究するために、中和又は抗ウ
ィルス抗体を試験するために、及び生物学的物質、診断試験及びワクチン調製を
開発するために、ウィルスの増殖を得ることを可能にするかもしれない。実際に
、完全なＨＣＶ配列が１９８９から利用可能であった（Q.L.Chooら、Science 24
4,359,(1989)）が、ライフサイクル及びＨＣＶの複製方法の理解は、適当なイン
ビトロ培養システムが無かったために妨げられていた。Itoら（J.gen.Virol.77:
1043-1054(1996)）は、ＨＣＶ複製が、ＨＣＶを有し、疾患が慢性的に確立され
た患者から得られたヒト肝細胞の初代培養で保持されることを実際に確認し、感
染の継代を示唆したが、ウィルスの増殖に関する問題は残り（長期間培養するこ
とができない）、開発されたシステムは、ヒトの肝臓を供給する必要性と技術の
作業負荷により限定される。さらにこれまで、ＨＣＶの同質異形に関する一般的
なコンセンサスはなく、ウィルスに関する全ての細胞受容体が同定されたわけで
はなく、特にウィルスのエンドサイトーシスを許容する受容体についてそうであ
る（Pileriら、1998,Science,282,938-941頁）。Therefore, from a public health standpoint, it is of paramount importance to be able to develop specific, sensitive and practical methods for identifying and screening HCV carriers. One of the solutions might be to create a highly efficient in vitro culture system for HCV, which is specifically for studying its replication mechanism, for testing neutralizing or antiviral antibodies, and for biology. It may be possible to obtain viral growth for developing biological agents, diagnostic tests and vaccine preparations. In fact, the complete HCV sequence was available from 1989 (QLChoo et al., Science 24
4,359, (1989)), the understanding of life cycle and HCV replication methods was hampered by the lack of a suitable in vitro culture system. Ito et al. (J.gen.Virol.77:
1043-1054 (1996)) confirmed that HCV replication was maintained in primary cultures of human hepatocytes obtained from patients with HCV and chronically established disease, and Although suggested as passage, problems with viral growth remain (incapable of long term culture) and the system developed is limited by the need to supply human liver and the technical workload. Furthermore, to date, there is no general consensus on HCV allomorphism and not all cellular receptors for the virus have been identified, especially for those that tolerate viral endocytosis (Pileri et al. 1998. , Science, 282, 938-941).
【００１８】
ＨＧＶは、異なる２つのチーム、一方はＨＧＶで他方はＧＢＶ−Ｄにより、独
立して発見されたウィルスである。それは、フラビウィルスのそれに近いゲノム
構造を有する。その２９００アミノ酸ポリタンパク質は、９，４００ヌクレオチ
ドＲＮＡによりコードされており、その５’末端は構成タンパク質（先端を欠い
たヌクレオキャプシド及びエンベロープ）をコードしており、その３’末端は複
製の役割を有しているタンパク質をコードしている。それは血液の輸血により伝
染し、急性、慢性、激性の形態の肝炎の患者で検出することができる。その急性
及び慢性肝臓病における寄与は、いまだにあまり理解されていない。ＧＢＶ−Ａ
及びＧＢＶ−Ｂも記載されており、非常にＨＧＶに似ている。HGV is a virus independently discovered by two different teams, one with HGV and the other with GBV-D. It has a genomic structure similar to that of flavivirus. The 2900 amino acid polyprotein is encoded by a 9,400 nucleotide RNA, the 5'end of which encodes a constituent protein (nucleocapsid and envelope lacking a tip), and the 3'end plays a role of replication. It encodes a protein that it has. It is transmitted by blood transfusion and can be detected in patients with acute, chronic, and acute forms of hepatitis. Its contribution in acute and chronic liver disease is still poorly understood. GBV-A
And GBV-B have also been described and are very similar to HGV.
【００１９】
ウィルスＲＮＡを含む粒子は、密度が非常に均一で、ＨＣＶに感染した患者の
血漿に見出される。ウィルスＲＮＡを含む粒子のこの密度の均一性は、それらが
種々の割合でリポタンパク質と結合していることによるものと考えられる（Thom
senら、1993,Med.Microbiol.Immunol.182:639）。本特許出願の記載において、
発明者らは、これらのハイブリッド粒子をＬＶＰｓと称する（リポ‐ビロ‐粒子
）。密度勾配に沿ったこれらの形態の各々の分配は、患者によって変わる。低密
度粒子の既存の分析は、ＬＤＬｓ（低密度リポタンパク質）とＶＬＤＬｓ（超低
密度リポタンパク質）のそれらをカバーする密度を示す。記載されたサイズ（５
０ｎｍ）は、それをＶＬＤＬｓに近づける。さらに、粒子は沈澱することがある
（抗‐βリポタンパク質血清によりときどきそれらが全部沈澱することすらある
（Thomsenら、1992、Med.Microbiol.Immunol.181:293;Princeら,1996,J.Viral.H
epat.3:11））。Particles containing viral RNA are very uniform in density and are found in the plasma of patients infected with HCV. This density homogeneity of particles containing viral RNA is thought to be due to their varying proportions of binding to lipoproteins (Thom
sen et al., 1993, Med. Microbiol. Immunol. 182: 639). In the description of this patent application,
We refer to these hybrid particles as LVPs (lipo-bilo-particles). The distribution of each of these forms along the density gradient varies from patient to patient. Existing analyzes of low density particles show their covering densities of LDLs (low density lipoproteins) and VLDLs (very low density lipoproteins). Listed size (5
0 nm) brings it closer to VLDLs. In addition, particles may precipitate (sometimes even their total precipitation by anti-β lipoprotein serum (Thomsen et al., 1992, Med. Microbiol. Immunol. 181: 293; Prince et al., 1996, J. Viral). .H
epat.3: 11)).
【００２０】
Ｇ型肝炎ウィルスが沈澱することもあり、ＨＧＶで慢性的に感染した患者から
の抗リポタンパク質血清により、ときには全部が、沈澱することもあることも観
察される（Satoら、Biochem.Biophys.Res.Commun.229:719）。It is also observed that the hepatitis G virus may precipitate, and in some cases it may all precipitate with anti-lipoprotein sera from patients chronically infected with HGV (Sato et al., Biochem. Biophys.Res.Commun.229: 719).
【００２１】
さらに、ヒトの肝細胞のＨＣＶによる感染が、脂質ビシクルの細胞質内蓄積を
伴うことが観察された。キャプシドをコードするＨＣＶ遺伝子の、ヒト肝細胞（
Ｈｅｐ／Ｇ２）の連続ラインへのトランスフェクションは、同じ現象を誘導する
（Barbaら、1997,PNAS94:1200）。これらのビシクルは、トリグリセリドリッチ
である。ＨＣＶキャプシドタンパク質は、アポリポタンパク質アポA-IIのように
、ビシクルの表面に並んで、配置されている。Furthermore, it was observed that infection of human hepatocytes with HCV was accompanied by intracellular accumulation of lipid vesicles. Human hepatocytes (of the HCV gene encoding capsid)
Transfection of Hep / G2) into a continuous line induces the same phenomenon (Barba et al., 1997, PNAS94: 1200). These vesicles are rich in triglycerides. The HCV capsid protein is arranged side by side on the surface of the vehicle, like the apolipoprotein apo A-II.
【００２２】
アポリポタンパク質は、それらが結合しているリポタンパク質粒子へ、構造安
定性と溶解性を導入することにより、脂質の透過を可能にする。それらは、特に
受容体上へ標的化することにより、代謝内のこれらの粒子の結果を決定もする。Apolipoproteins allow lipid permeation by introducing structural stability and solubility into the lipoprotein particles to which they are attached. They also determine the consequences of these particles within metabolism, especially by targeting on the receptor.
【００２３】
アポB１００は、VLDLｓ、LDLｓ及びLDLｓ（中間密度リポタンパク質）の主な
アポリポタンパク質である。それらは肝臓で合成され、アセンブリと肝臓からの
VLDLsの分泌のために必須である。それは、それらの受容体にLDLsを結合させる
ためのリガンドを構成する。LDLsの受容体の一つは、LDL受容体であり、アポB１
００とアポＥを含むコレステロールリッチのリポタンパク質を結合し、内在化す
る細胞表面タンパク質である。アポＥは主に肝細胞で合成される。それは種々の
リポタンパク質をＬＤＬｓ受容体及びＬＲＰ（ＬＤＬ-受容体-関連タンパク質）
に結合させるリガンドを構成する。Apo B100 is the major apolipoprotein of VLDLs, LDLs and LDLs (intermediate density lipoproteins). They are synthesized in the liver, and from the assembly and liver
It is essential for the secretion of VLDLs. It constitutes a ligand for binding LDLs to their receptors. One of the receptors for LDLs is the LDL receptor, apo B1
It is a cell surface protein that binds and internalizes cholesterol-rich lipoproteins including 00 and apoE. Apo E is mainly synthesized in hepatocytes. It binds various lipoproteins to LDLs receptors and LRPs (LDL-receptor-related proteins)
Constitutes a ligand to be bound to.
【００２４】
アポＢ４８は、カイロミクロンのアセンブリと分泌のために必須である。それ
は同じ遺伝子と同じｍＲＮＡに、アポＢ１００としてコードされているが、腸で
は、変異がストップコドンを導入し、アポＢ４８が、アポＢ１００の全長の４０
％だけを含むようになっている。血漿中のカイロミクロンの代謝におけるその役
割は、ほとんど理解されていないが、その正常な合成を妨げる変異を示す個体は
、カイロミクロン、ＶＬＤＬｓ、ＩＤＬｓ及びＬＤＬｓを全く有していないか、
又は非常に低いレベルである。Apo B48 is essential for chylomicron assembly and secretion. It is encoded in the same gene and mRNA as apoB100, but in the intestine, a mutation introduced a stop codon, and apoB48 resulted in 40 of the full length of apoB100.
It is designed to include only%. Its role in the metabolism of chylomicrons in plasma is poorly understood, but individuals exhibiting mutations that interfere with its normal synthesis have no chylomicrons, VLDLs, IDLs and LDLs, or
Or a very low level.
【００２５】
ウィルスＲＮＡを含む前記ＬＶＰｓの性質は、これまでのところ、知られてい
ないが、本発明者らは、リポタンパク質の少なくとも一の細胞表面受容体が、細
胞培養において、トガウィルス及びフラビウィルス科に属するウィルスの感染と
増殖に寄与しているという仮説を提出し、確認した。それらは、実際に、ＬＶＰ
ｓが、受容体関連エンドサイトーシス経路のための、好ましくはＬＳＲ（リポリ
シス-刺激受容体）のリガンドであることを示した（Frances T.Yenら、Biochemi
stry,1994,33,1172-1180及びBernard E. Bihain及びFrances T.Yen,Biochemistr
y,1992,31,4628-4636）。それらはさらに、ＬＶＰｓがヒト免疫グロブリンに結
合しているかもしれないことを示した。Although the nature of said LVPs containing viral RNA has not been known so far, we have found that at least one cell surface receptor for lipoproteins is found in cell culture in Togavirus and Flavivirus. We submitted and confirmed the hypothesis that it contributes to the infection and proliferation of viruses belonging to the family. They are actually LVP
has been shown to be a ligand for the receptor-associated endocytic pathway, preferably of LSR (lipolysis-stimulating receptor) (Frances T. Yen et al., Biochemi.
stry, 1994, 33, 1172-1180 and Bernard E. Bihain and Frances T. Yen, Biochemistr.
y, 1992, 31, 4628-4636). They further showed that LVPs may be bound to human immunoglobulin.
【００２６】[0026]
これに基づき、彼等は、インビトロで、トガウィルス及びフラビウィルス科に
属するウィルスの培養、増殖、複製を可能にする新規の方法を開発した。これら
の方法は、これらのウィルスの増殖を得ることを可能にするものであり、特にそ
れらの複製機構を研究するために、中和及び抗ウィルス抗体を試験するために、
及び診断及び治療のための生物学的物質を開発するために有用である。さらに、
本発明の方法は、感染セルラインと抗ウィルス分子を接触させることにより、少
なくとも一の抗ウィルス分子をスクリーニング及び/又は選択のために有用な感
染セルラインを得ることを可能にする。On this basis, they have developed a novel method that allows in vitro culture, propagation and replication of viruses belonging to the Togavirus and Flaviviridae families. These methods make it possible to obtain the growth of these viruses, in particular to study their replication mechanism, to test neutralizing and antiviral antibodies,
And useful for developing biological materials for diagnosis and treatment. further,
The method of the invention makes it possible to obtain an infected cell line useful for screening and / or selection of at least one antiviral molecule by contacting the infected cell line with the antiviral molecule.
【００２７】[0027]
この方法によれば、トガウィルス又はフィラビウィルス科に属するウィルスで
感染した患者の血清から又は血漿から得られた少なくとも一のＬＶＰ分画、又は
ヒト免疫グロブリンに結合した少なくとも一のＬＶＰ分画が存在し、所定の時間
、適当な培地中で前記分画を、少なくとも一のリポタンパク質の受容体により中
継され、１６乃至２０の炭素原子を含む不飽和脂肪酸、又は不飽和脂肪酸の誘導
体、又はそれらの混合物から選ばれる活性化剤により調節されるエンドサイトー
シス経路を有する許容性細胞に接触させる。According to this method, there is at least one LVP fraction obtained from the serum or plasma of a patient infected with a virus belonging to the Togavirus or Filaviviridae family, or at least one LVP fraction bound to human immunoglobulin. The unsaturated fatty acid or derivative of unsaturated fatty acid containing 16 to 20 carbon atoms, which is relayed by the receptor of at least one lipoprotein, or a derivative thereof in a suitable medium for a predetermined time. Contacting permissive cells having an endocytic pathway regulated by an activator selected from the mixture.
【００２８】[0028]
リポタンパク質の受容体がＬＳＲ及び／又はＬＤＬｓの表面受容体であり、有
利には、前記許容性細胞は両方の受容体を有する。The receptor for lipoproteins is the surface receptor for LSR and / or LDLs, advantageously said permissive cell has both receptors.
【００２９】
不飽和脂肪酸は、オレイン酸、パルミトオレイン酸、リノール酸、リノレン酸
、アラキドン酸、トランスヘキサデセン酸及びエライジン酸又はそれらの誘導体
から選ばれる。本発明の好適な実施態様において、選ばれた脂肪酸がオレイン酸
であり、前記培地に０．１乃至１ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭの濃度で添加され
る。The unsaturated fatty acid is selected from oleic acid, palmitooleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, trans hexadecenoic acid and elaidic acid or their derivatives. In a preferred embodiment of the invention, the fatty acid selected is oleic acid, which is added to the medium at a concentration of 0.1 to 1 mM, preferably 0.5 mM.
【００３０】
細胞は、好ましくは、リンパ球関連又は非関連でもよい、ヒト又は動物の肝細
胞、ヒト又は動物の肝臓ガンのセルライン群、樹状突起細胞、マクロファージ細
胞、クッパー細胞及びそれらの組み合わせから選ばれる細胞である。有利には、
これらの細胞が、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５セルラインのヒト肝臓ガン細胞である。The cells are preferably human or animal hepatocytes, which may be lymphocyte-related or unrelated, human or animal liver cancer cell line populations, dendritic cells, macrophage cells, Kupffer cells and combinations thereof. Cells selected from. Advantageously,
These cells are human liver cancer cells of the PLC / PRF / 5 cell line.
【００３１】
好ましくは、培地は、培養に必要な成分と、脂肪酸又は脂肪酸の誘導体の他に
、少なくとも一のアポトーシス調節剤を含む。このアポトーシス調節剤は、イン
ターフェロン、抗インターフェロン、特に抗アルファ及びベータインターフェロ
ン；抗カスパーゼ３、特にペプチドアナログ、例えばｚＶＡＤｆｍｋ、すなわち
N-ベンジルオキシカルボニル-Val-Ala-Asp-フルオロメチルケトン、及び前記抗
カスパーゼ３に対する抗体から選ばれる。[0031] Preferably, the medium contains, in addition to the components necessary for culturing and the fatty acid or the derivative of the fatty acid, at least one apoptosis regulator. This apoptosis-regulating agent includes interferons, anti-interferons, especially anti-alpha and beta interferons; anti-caspase 3, especially peptide analogues, such as zVADfmk, ie
It is selected from N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone and an antibody against the anti-caspase-3.
【００３２】
実際に、本発明者らは、HIVとヘパシウィルスHCVの両方で感染した患者におい
て、あるHIVプロテアーゼ阻害剤、例えばRitonavir（商品名）を服用すると、肝
臓細胞溶解に関連するＨＣＶウィルス血症（virema）における増加を起すことを
観察した。その抗プロテアーゼ活性に加えて、アポトーシスの制御を変える医薬
品を服用した後の肝細胞溶解の観察は、アポトーシスのシグナルの誘導を示唆し
ている。この理由により、本発明の方法に、少なくとも一のアポトーシス調節剤
を添加することが有利である。In fact, we have shown that in patients infected with both HIV and hepacivirus HCV, taking one HIV protease inhibitor, eg Ritonavir (trade name), resulted in liver cell lysis-related HCV viremia. It was observed to cause an increase in (virema). In addition to its antiprotease activity, the observation of hepatocyte lysis after taking a drug that alters the regulation of apoptosis suggests induction of apoptotic signals. For this reason, it is advantageous to add at least one apoptosis regulator to the method of the invention.
【００３３】
選択される適当な培地は、特に、ＤＭＥＭ培地、又はＤＭＥＭ培地由来の培地
、ＲＰＭＩ培地又はＲＰＭＩ培地由来の培地である。好ましくは、ＧｉｂｃｏＢ
ＲＬ社から市販されている完全ＤＭＥＭ培地を含み、０乃至１０ｍＭのピルビン
酸ナトリウム、０乃至１０％の非必須アミノ酸、１乃至１０ｍＭのグルタミン、
１００乃至２００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００乃至２００ｍｇ／ｍｌのストレ
プトマイシン及び１乃至２０％のウシ血清が補足されたＤＭＥＭ培地由来の培地
である。The suitable medium selected is in particular DMEM medium, or DMEM medium-derived medium, RPMI medium or RPMI medium-derived medium. Preferably GibcoB
Containing complete DMEM medium commercially available from RL, 0-10 mM sodium pyruvate, 0-10% non-essential amino acids, 1-10 mM glutamine,
This is a DMEM medium-derived medium supplemented with 100 to 200 U / ml penicillin, 100 to 200 mg / ml streptomycin, and 1 to 20% bovine serum.
【００３４】
この培地は、有利には、Dixonら,1991,Journal of Biological Chemistry vol
.226,p.5080に従って、脂肪酸に結合した、０．１乃至０．５％のＢＳＡ（ウシ
血清アルブミン）又はＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）も含む。This medium is advantageously Dixon et al., 1991, Journal of Biological Chemistry vol.
.226, p.5080, also containing 0.1-0.5% BSA (bovine serum albumin) or HSA (human serum albumin) bound to fatty acids.
【００３５】
本発明の好ましい方法において、許容性細胞をＬＶＰ分画に接触させる前に、
それらを前もって約３７℃の温度に加熱したＰＢＳバッファーで洗浄する。In a preferred method of the invention, prior to contacting the permissive cells with the LVP fraction,
They are washed with PBS buffer preheated to a temperature of about 37 ° C.
【００３６】
こうして上記条件下で感染した許容性細胞は、数回継代培養し、ＲＴ−ＰＣＲ
により及び／又は免疫学的技術により、例えば、前記ウィルスに特異的な抗体を
用いた間接免疫蛍光により及び／又はフローサイトメトリーにより、前記ウィル
スの存在が、感染許容性細胞及び培養上清で示される。The permissive cells infected under the above conditions are subcultured several times, and then RT-PCR is performed.
And / or by immunological techniques, for example by indirect immunofluorescence using antibodies specific for said virus and / or by flow cytometry, the presence of said virus is shown in permissive cells and culture supernatants. Be done.
【００３７】
前記培養、増殖及び複製方法は、特にフィラビウィルス科、ヘパシウィルス属
に属するウィルス、特に、ＧＢＶ−Ａ、ＧＢＶ−Ｂ、及びＧＢＶ−Ｃウィルスを
含む、Ｃ型肝炎およびＧ型肝炎ウィルスの培養、増殖及び複製に適しており、そ
れらはこれまで効果的な培養方法が存在していなかったものである。The culturing, propagation and replication methods include hepatitis C and hepatitis G viruses, including in particular viruses belonging to the family Filaviviridae, genus Hepacivirus, in particular GBV-A, GBV-B and GBV-C viruses. Are cultivated, propagated and replicated for which no effective culturing method has existed so far.
【００３８】
本発明の主題はまた、トガウィルス及びフラビウィルス科に属するウィルスを
培養するための培地であって、上記の方法において、前記培地は、ＧｉｂｃｏＢ
ＲＬ社から市販されている完全ＤＭＥＭ培地を含み、０乃至１０ｍＭのピルビン
酸ナトリウム、０乃至１０％の非必須アミノ酸、１乃至１０ｍＭのグルタミン、
１００乃至２００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００乃至２００ｍｇ／ｍｌのストレ
プトマイシン及び１乃至２０％のウシ血清が補足されたＢＭＥＭ培地である。こ
の培地は、上記に例示した方法において、有利にはさらに脂肪酸に結合したＢＳ
Ａ（ウシ血清アルブミン）又はＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）０．１乃至０．５
％が補足される。The subject of the invention is also a medium for culturing viruses belonging to the family Togavirus and Flaviviridae, wherein in the above method said medium is GibcoB
Containing complete DMEM medium commercially available from RL, 0-10 mM sodium pyruvate, 0-10% non-essential amino acids, 1-10 mM glutamine,
BMEM medium supplemented with 100-200 U / ml penicillin, 100-200 mg / ml streptomycin and 1-20% bovine serum. This medium is preferably BS further bound to fatty acids in the method exemplified above.
A (bovine serum albumin) or HSA (human serum albumin) 0.1 to 0.5
% Is supplemented.
【００３９】
本発明の主題はまた、トガウィルス及びフラビウィルス科に属する少なくとも
一のウィルスに感染したセルラインでもあり、ここで、セルラインの細胞は、と
りわけ活性化剤により調節され得る少なくとも一のリポタンパク質受容体により
中継されるエンドサイトーシス経路を有する許容性細胞であり、前記細胞はウィ
ルスを増殖及び複製することができるものである。好ましくは、受容体はＬＳＲ
及び/又はＬＤＬｓの受容体であり、有利には許容性細胞は両方の受容体を有す
る。A subject of the invention is also a cell line infected with at least one virus belonging to the family Togavirus and Flaviviridae, wherein the cells of the cell line are at least one lipoprotein which can be regulated by activators, among others. A permissive cell having an endocytic pathway relayed by a protein receptor, said cell capable of propagating and replicating a virus. Preferably the receptor is LSR
And / or receptors for LDLs, preferably the permissive cells have both receptors.
【００４０】
特に、セルラインは、そこにおいて、ヒト又は動物の初代肝細胞、ヒト又は動
物の肝臓ガンのセルライン群の細胞、特に、脂肪酸により活性化されることがで
きるリポタンパク質の表面受容体を有するヒト肝臓ガンのセルラインＰＬＣ/Ｐ
ＲＦ/５に由来する細胞、樹状突起細胞、マクロファージ細胞、クッパー細胞か
ら選ばれる、細胞を感染させることにより細胞が誘導されるラインである。しか
しながら、本発明は、少なくともリポタンパク質のＬＳＲ表面受容体を有するセ
ルラインの細胞に制限されず、それらの表面で、ＬＳＲ受容体及び/又はＬＤＬ
ｓの受容体を発現することができる、トランスフェクト又は形質転換された細胞
も包含する。本発明の方法により得られた感染されたセルラインは、少なくとも
一の抗ウィルス分子のスクリーニング及び/又は選択のために用いることができ
、それにおいて抗ウィルス分子と感染されたセルラインを接触せしめる。In particular, the cell line is a surface receptor of a lipoprotein which can be activated by primary human or animal hepatocytes, cells of the human or animal liver cancer cell line group, in particular fatty acids. Cell line PLC / P for human liver cancer with
This line is selected from RF / 5-derived cells, dendritic cells, macrophage cells, and Kupffer cells, and is a line that is induced by infecting cells. However, the present invention is not limited to cells of a cell line having at least the LSR surface receptor for lipoproteins, at which surface the LSR receptor and / or LDL receptor
Also included are transfected or transformed cells capable of expressing the s receptor. The infected cell line obtained by the method of the invention can be used for the screening and / or selection of at least one antiviral molecule, in which the infected cell line is contacted with the antiviral molecule.
【００４１】
本発明はまた、試料中に、少なくとも一のトガウィルス及びフラビウィルス科
に属するウィルスに対する抗体を検出するための組成物を調製する方法にも関し
、それは前記方法の一を用いて得られた前記ウィルスのウィルス粒子又はポリペ
プチドの少なくとも一の部分的又は完全精製を含む。特に、前記ウィルス粒子又
は前記ポリペプチドは固相支持体に付着している。The present invention also relates to a method for preparing a composition for detecting in a sample an antibody against at least one Togavirus and a virus belonging to the Flaviviridae family, which is obtained by using one of said methods. And at least one partial or complete purification of viral particles or polypeptides of said virus. In particular, the viral particles or the polypeptide are attached to a solid support.
【００４２】
さらに、本発明は、トガウィルス及びフラビウィルス科に属する少なくとも一
のウィルスに対する抗体又は抗体断片を得る方法に関し、該方法において、動物
が、前記方法の一を用いて得られたウィルス粒子又はポリペプチドで免疫化され
る。ポリクローナル及びモノクローナル抗体又は抗体断片の生産は、当業者の一
般的な知識の一部である。例えば、Kohler G.及びMilstein C.(1975),Continuou
s culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity, N
ature,256:495-497及び、ポリクローナル抗体の生産についてGalfre G.ら（1977
）Nature,266:522-550、及びポリクローナル抗体の生産についてRoda A.,Bolell
i G.F.Production of high titer antibody to bile acids,Journal of Steroid
Biochemistry,13巻,449-454頁(1980)を挙げることができる。抗体は、本発明の
方法により得られたウィルス粒子又はポリペプチドでのマウス又はウサギの免疫
化して生産することができる。モノクローナル抗体の生産について、免疫原は、
免疫化のための支持体として、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に
、又は血清アルブミン（ＳＡペプチド）に結合し得る。動物は、完全フロイント
アジュバントを用いて免疫原の接種を与えられる。免疫化動物から由来する血清
及びハイブリドーマ培養上清は、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットアッセイな
どの従来の技術を用いて、それらの特異性とそれらの選択性について分析される
。最も特異的で最も感度の高い抗体を生産するハイブリドーマを選択する。モノ
クロナール抗体は、インビトロで、生産されるハイブリドーマの細胞培養により
、又はハイブリドーマをマウスへの腹腔内注射の後、腹水液の回収により生産す
ることができる。ついで、生産方法が、上清によるもの又は腹水によるもののい
ずれでも、抗体を精製する。用いられる精製方法は、必須のイオン交換ゲルろ過
及び排除クロマトグラフィー又は免疫沈降である。十分な数の抗体が、機能的ア
ッセイでスクリーニングされ、最も有効な抗体が同定される。抗体の、抗体断片
の、又は抗体誘導体、例えば遺伝子工学により生産されたキメラ抗体の、インビ
トロ生産は、当業者によりよく知られている。Furthermore, the present invention relates to a method for obtaining an antibody or antibody fragment against at least one virus belonging to the family Togavirus and Flaviviridae, wherein the animal is a viral particle obtained by using one of the above methods or Immunize with the polypeptide. Production of polyclonal and monoclonal antibodies or antibody fragments is part of the general knowledge of those skilled in the art. For example, Kohler G. and Milstein C. (1975), Continuou.
s culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity, N
ature, 256: 495-497 and the production of polyclonal antibodies by Galfre G. et al. (1977
) Nature, 266: 522-550, and production of polyclonal antibodies Roda A., Bolell
i GFProduction of high titer antibody to bile acids, Journal of Steroid
Biochemistry, 13: 449-454 (1980). Antibodies can be produced by immunizing mice or rabbits with viral particles or polypeptides obtained by the method of the invention. For the production of monoclonal antibodies, the immunogen is
As a support for immunization, it can be bound to keyhole limpet hemocyanin (KLH) or to serum albumin (SA peptide). Animals are inoculated with the immunogen using complete Freund's adjuvant. Serum and hybridoma culture supernatants from immunized animals are analyzed for their specificity and their selectivity using conventional techniques such as ELISA or Western blot assays. A hybridoma that produces the most specific and most sensitive antibody is selected. Monoclonal antibodies can be produced in vitro by cell culture of the produced hybridomas or by intraperitoneal injection of the hybridomas into mice followed by collection of ascites fluid. Then, the antibody is purified regardless of the production method using the supernatant or the ascites. The purification method used is requisite ion exchange gel filtration and exclusion chromatography or immunoprecipitation. A sufficient number of antibodies are screened in a functional assay to identify the most effective antibody. In vitro production of antibodies, antibody fragments, or antibody derivatives, such as genetically engineered chimeric antibodies, is well known to those of skill in the art.
【００４３】
より具体的には、「抗体断片」なる用語は、ネイティブ抗体のＦ（ａｂ）２、
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓＦｖ（Blazarら、1997,Journal of Immunology 159:5821-
5833及びBirdら、1988,Science 242:423-426）を意味することを意図するもので
あり、「誘導体」なる用語は、とりわけ、ネイティブ抗体のキメラ誘導体を意味
することを意図するものである（例えば、Arakawaら、1996,J.Biochem 120:657-
662及びChaudrayら,1989,Nature339:394-397参照）。More specifically, the term “antibody fragment” refers to the native antibody F (ab) 2,
Fab, Fab ', sFv (Blazar et al., 1997, Journal of Immunology 159: 5821-
5833 and Bird et al., 1988, Science 242: 423-426), and the term "derivative" is intended to mean, inter alia, a chimeric derivative of a native antibody ( For example, Arakawa et al., 1996, J. Biochem 120: 657-.
662 and Chaudray et al., 1989, Nature 339: 394-397).
【００４４】
本発明は、また、少なくとも、本発明の方法により得られたポリペプチドのウ
ィルス粒子、又は上記方法により得られた抗体を含む診断組成物、及びとりわけ
前記組成物を含む診断キット、及び、任意に、製薬的に許容されるビヒクル及び
／又は賦形剤及び／又はアジュバントとともに、少なくともウィルス粒子又はポ
リペプチドを含む免疫化組成物に関する。しかしながら、本発明は、インビボで
、前記ウィルスの増殖及び複製に、定性的及び／又は定量的に影響を与える治療
組成物を開発を可能にする他の治療の展望にも開かれており、それは、とりわけ
、少なくともリポタンパク質の受容体により中継されるエンドサイトーシス経路
を調節、抑制、又は阻害することができるリガンドであって、前記受容体に対す
る拮抗的な抗体（その生産は上述のごとく当業者の技術範囲である）、及び、非
天然タンパク質、すなわち前記受容体に結合する遺伝子組換えによる可溶性タン
パク質又は可溶性合成ポリペプチドから選ばれるリガンドを含むものや、とりわ
け、前記受容体をコードする遺伝子の発現、又は前記受容体をコードする遺伝子
のプロモーターの活性を調節、抑制又は阻害する少なくとも一の分子を含むため
である。The present invention also relates to a diagnostic composition comprising at least a viral particle of a polypeptide obtained by the method of the present invention or an antibody obtained by the above method, and in particular a diagnostic kit comprising said composition, and , Optionally with a pharmaceutically acceptable vehicle and / or excipient and / or adjuvant, and at least a viral particle or polypeptide. However, the present invention is also open to other therapeutic perspectives that allow the development of therapeutic compositions that qualitatively and / or quantitatively affect the growth and replication of the virus in vivo. In particular, a ligand capable of regulating, suppressing, or inhibiting at least the endocytic pathway relayed by the receptor of lipoprotein, which is an antagonistic antibody against said receptor (the production of which is described above by those skilled in the art. And non-natural proteins, that is, those containing a ligand selected from recombinant soluble proteins or soluble synthetic polypeptides that bind to said receptor, and in particular of the gene encoding said receptor. At least one that regulates, suppresses or inhibits expression or the activity of the promoter of the gene encoding the receptor This is because that contains the molecule.
【００４５】
最後に、本発明の主題は、少なくとも一の抗ウィルス分子をスクリーニング及
び／又は選択する方法であって、該方法において、前記抗ウィルス分子が、本発
明の一の方法により得られた感染セルラインと接触させる方法である。Finally, a subject of the invention is a method for screening and / or selecting at least one antiviral molecule, wherein said antiviral molecule is obtained by one method of the invention. This is a method of contacting with an infected cell line.
【００４６】
「トガウィルス及びフラビウィルス科に属するウィルス」なる用語は、本発明
で用いられるときは、あらゆるウィルス種を意味するものであり、その中には、
ヒトに病原性の株、変異株、弱毒化株および、前記株由来の欠損株が挙げられる
。実際に、ＲＮＡウィルスは、高い自然発生的変異率が高いことが知られている
。マルチプル株は、したがってビルレントがより高いか、又はより低いかもしれ
ない。そのような株を、例えば、対照株と比較した核酸の及び/又はペプチド配
列のホモロジーにより、及び／又は形態学的及び／又は免疫学的規準に対して株
又は単離体を同定することにより、同定することは当業者の技術範囲である。The term “virus belonging to the family Togavirus and Flaviviridae” as used in the present invention means any viral species, among which:
Examples include human pathogenic strains, mutant strains, attenuated strains, and defective strains derived from the strains. In fact, RNA viruses are known to have a high high spontaneous mutation rate. Multiple strains may therefore be more or less virulent. Such strains are, for example, by homology of nucleic acid and / or peptide sequences compared to control strains, and / or by identifying strains or isolates against morphological and / or immunological criteria. , Identifying is within the skill of one in the art.
【００４７】
「セルライン」なる用語は、最初の培養の後、そこでウィルスが増殖する許容
性細胞の培養を意味し、したがって、それに限定されるものではないが、それら
が対照セルラインの細胞に由来する限りにおいて、個別の細胞、採集細胞、及び
細胞を含む培養物を含むものである。保存又はトランスファーの間に、核型にお
ける自然発生又は誘導された変化が起こり得ることができることが知られている
。したがって、対照セルラインに由来する細胞は厳密には、元の細胞又は培養物
と同一でないかもしれず、「セルライン」は変異体も意味するものである。「セ
ルライン」なる用語は、不死化細胞も含む。The term “cell line” refers to a culture of permissive cells in which the virus grows after the initial culture, and thus includes, but is not limited to, those cells of a control cell line. To the extent it is derived, it includes individual cells, harvested cells, and cultures containing cells. It is known that spontaneous or induced changes in karyotype can occur during storage or transfer. Thus, cells derived from a control cell line may not be exactly the same as the original cell or culture, and "cell line" also means a variant. The term "cell line" also includes immortalized cells.
【００４８】
「許容性細胞」なる用語は、ウィルスを増殖させることができるすべての細胞
、すなわち、少なくとも一のリポタンパク質の受容体により中継される、エンド
サイトーシス経路を有する細胞を意味する。The term “permissive cell” means any cell capable of propagating a virus, ie, a cell having an endocytic pathway that is relayed by at least one receptor for lipoproteins.
【００４９】
免疫化組成物は、本発明の方法により得られた少なくとも一のウィルス粒子又
はポリペプチドを含むがそれに限定されず、適当な宿主細胞での遺伝子組換えの
技術を用いて得ることができる組換えタンパク質及びその断片もカバーする、組
成物である。そのような免疫化組成物は、必要であれば、それらが製薬的に許容
される条件において、ビヒクル及び／又は賦形剤及び／又はアジュバントを含む
ことができる。The immunizing composition includes, but is not limited to, at least one viral particle or polypeptide obtained by the method of the present invention, and may be obtained using the technique of gene recombination in a suitable host cell. A composition that also covers possible recombinant proteins and fragments thereof. Such immunizing compositions can optionally include vehicles and / or excipients and / or adjuvants in conditions where they are pharmaceutically acceptable.
【００５０】
「製薬的に許容されるビヒクル」なる用語は、例えばRemington's Pharmaceut
ical Science １６版、Mack Publishing Co.に記載されているように、ヒト又は
動物に投与することができる支持体及びビヒクルを意味することを意図するもの
である。製薬的に許容されるビヒクルは、好ましくは、等張性又は低張性であり
、又は弱い低張性と比較的低いイオン強度を示す。製薬的に許容される賦形剤及
びアジュバントの定義も、前記のRemington's Pharmaceutical Scienceに記載さ
れている。The term “pharmaceutically acceptable vehicle” refers to, for example, Remington's Pharmaceut.
It is intended to mean the supports and vehicles that can be administered to humans or animals as described in ical Science 16th edition, Mack Publishing Co. The pharmaceutically acceptable vehicle is preferably isotonic or hypotonic, or exhibits weak hypotonicity and relatively low ionic strength. Definitions of pharmaceutically acceptable excipients and adjuvants are also provided in Remington's Pharmaceutical Science, supra.
【００５１】[0051]
実施例１：生物学的材料の調製
リポタンパク質は、１２時間食事をとらなかった、Ｃ型肝炎陽性として検出さ
れた患者の血漿又は血清から分離される。Example 1 Preparation of Biological Material Lipoproteins are isolated from plasma or serum of patients who were detected as positive for hepatitis C who did not eat for 12 hours.
【００５２】
１％のＥＤＴＡ溶液（０．１５ＭのＮａＣｌ−０．１ＭのＥＤＴＡ）を患者か
ら採取した血液に添加する。混合物を１０分間３５００ｒｐｍ、４℃の温度で遠
心分離する。血漿はついで採集し、使用まで４℃において保存する。A 1% EDTA solution (0.15M NaCl-0.1M EDTA) is added to blood drawn from the patient. The mixture is centrifuged for 10 minutes at 3500 rpm and a temperature of 4 ° C. Plasma is then collected and stored at 4 ° C until use.
【００５３】
患者の血液は、乾燥したチューブに採集し、凝固の後、１０分間３０００ｒｐ
ｍで４℃の温度で遠心分離する。血清を取りだし、使用まで４℃で保存する。The patient's blood was collected in a dry tube, and after coagulation, 10 minutes at 3000 rp
Centrifuge at a temperature of 4 ° C. Serum is removed and stored at 4 ° C until use.
【００５４】
（ｉ）１．００６３ｇ／ｍｌ未満の密度でＬＶＰｓを含む分画、１．００６３ｇ
／ｍｌ乃至１．０６３ｇ／ｍｌの密度でＬＶＰｓを含む分画、及び１．０６３ｇ
／ｍｌを超えたＬＶＰｓを含む分画の生産(I) Fraction containing LVPs at a density of less than 1.0063 g / ml, 1.0063 g
Fraction containing LVPs at a density of 1.063 g / ml to 1.063 g / ml, and 1.063 g
Of fractions containing LVPs in excess of 1 / ml
【００５５】
血漿と血清は、各々、４時間１００，０００ｒｐｍで、４℃で、Beckman社に
より市販され、TL100.4ローターを備えたＴＬ１００機において、超遠心分離す
る。１．００６３ｇ／ｍｌ未満の密度でＬＶＰｓを含む上の分画を回収し、４℃
で保存する。下の分画を、分画１００ｍｌ当たり７．２１ｇのＮａＢｒを添加す
ることにより、１．０６３ｇ／ｍｌに調整する。下の分画をついで４時間１００
，０００ｒｐｍで、４℃で、TL100.4ローターを備えたＴＬ１００機において、
超遠心分離する。１．００６３ｇ／ｍｌ乃至１．０６３ｇ／ｍｌの密度での分画
を含む、得られた上の分画を回収し、４℃で保存する。Plasma and serum are each ultracentrifuged on a TL100 machine equipped with a TL100.4 rotor marketed by Beckman at 4 ° C. at 100,000 rpm for 4 hours. Collect the upper fraction containing LVPs at a density of less than 1.0063 g / ml and
Save with. The lower fraction is adjusted to 1.063 g / ml by adding 7.21 g NaBr per 100 ml fraction. The lower fraction is then 100 for 4 hours
At 4,000 rpm at 4 ° C in a TL100 machine equipped with a TL100.4 rotor,
Ultracentrifuge. The resulting upper fractions containing fractions at densities of 1.0063 g / ml to 1.063 g / ml are collected and stored at 4 ° C.
【００５６】
（ii）１．０２５ｇ／ｍｌ未満の密度でＬＶＰｓを含む分画、１．０２５ｇ／ｍ
ｌ乃至１．０６３ｇ／ｍｌの密度でＬＶＰｓを含む分画、及び１．０６３ｇ／ｍ
ｌを超えた密度のＬＶＰｓを含む分画の還元（reduction）(Ii) Fraction containing LVPs at a density of less than 1.025 g / ml, 1.025 g / m
Fraction containing LVPs at a density of 1 to 1.063 g / ml, and 1.063 g / m
Reduction of fractions containing LVPs with densities above 1
【００５７】
血漿と血清は、各々、分画１００ｍｌ当たり２．５１８ｇのＮａＢｒを添加す
ることにより、１．０２５ｇ／ｍｌの最終密度に調整する。４時間１００，００
０ｒｐｍで、４℃で、TL100.4ローターを備えたＴＬ１００機において、遠心分
離する。Plasma and serum are each adjusted to a final density of 1.025 g / ml by adding 2.518 g NaBr per 100 ml fraction. 4 hours 100,00
Centrifuge at 0 rpm at 4 ° C. in a TL100 machine with a TL100.4 rotor.
【００５８】
１．０２５ｇ／ｍｌ未満の密度の分画を含む上の分画を回収し、４℃で保存す
る。下の分画を、分画１００ｍｌ当たり４．８４ｇのＮａＢｒを添加することに
より、１．０６３ｇ／ｍｌに調整する。下の分画をついで４時間１００，０００
ｒｐｍで、４℃で、TL100.4ローターを備えたＴＬ１００機において、超遠心分
離する。ＬＤＬｓを含む、得られた上の分画を回収し、４℃で保存する。The above fractions containing fractions with a density less than 1.025 g / ml are collected and stored at 4 ° C. The lower fraction is adjusted to 1.063 g / ml by adding 4.84 g NaBr per 100 ml fraction. Fraction below for 100,000 for 4 hours
Ultracentrifuge at 4 ° C. at 4 ° C. in a TL100 machine equipped with a TL100.4 rotor. The resulting upper fractions containing LDLs are collected and stored at 4 ° C.
【００５９】
採集された種々の分画を、ついで、０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．２４ｍＭのＥ
ＤＴＡバッファーに対して、１８時間４℃で透析する。ついで分画は回収され、
０．４５μ膜でろ過される。タンパク質アッセイはローリー法（Sigma）により
行なう。The various fractions collected were then combined with 0.15 M NaCl / 0.24 mM E
Dialyze against DTA buffer for 18 hours at 4 ° C. Then the fractions are collected,
It is filtered through a 0.45μ membrane. The protein assay is performed by the Lowry method (Sigma).
【００６０】
実施例２：細胞培養
用いる培地は、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Gibco）、１％の非必須アミ
ノ酸(Boehringer Mannheim)、２ｍＭのグルタミン（Gibco BRL）、２００Ｕ／ｍ
ｌのペニシリン（bioMerieux）、２００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（bioM
erieux）及び１０％のウシ血清(Boehringe)が補足された、ＤＭＥＭ培地（Gibco
BRLにより市販されている）である。Example 2 Cell Culture The medium used is 1 mM sodium pyruvate (Gibco), 1% non-essential amino acid (Boehringer Mannheim), 2 mM glutamine (Gibco BRL), 200 U / m 2.
l penicillin (bioMerieux), 200 mg / ml streptomycin (bioMerieux)
erieux) and 10% bovine serum (Boehringe) supplemented DMEM medium (Gibco
Marketed by BRL).
【００６１】
細胞は、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５セルライン（Alexander cells）（ATCCレファレ
ンス：CRL 8024）由来であり、ヒト肝臓ガンから樹立されたラインである。この
ラインは、欠損Ｂ型肝炎ゲノムを組み込み、Ｂ型肝炎ウィルスのＨＢｓ抗原を分
泌するが、非感染ウィルスである。細胞は、前記の１０％ウシ胎児血清を補足し
た、完全ＤＭＥＭ培地（Gibco-BRL）で培養する。細胞はあらかじめ３７℃に加
熱したＰＢＳ（Gibco-BRL）で洗浄する。０．２％のＢＳＡ（Sigma）と各分画に
由来する５０μｇ／ｍｌのリポタンパク質、又は０．４５μｍ膜上でろ過した１
００μｌの血清を補足した１ｍｌのＤＭＥＭを添加した。同時に、前もって調製
した（１００ｍＭ）、イソプロパノール中のオレイン酸溶液を、０．１乃至０．
８ｍＭの濃度範囲で添加する。細胞はついで３時間３７℃に５％ＣＯ2雰囲気で
インキュベーションする。培地は、ついで１０％ウシ胎児血清を添加した完全Ｄ
ＭＥＭ培地で置換する。細胞は、上記条件下のインキュベーターに戻す。培養上
清は定期的に除き、ＲＴ-ＰＣＲによって、Ｃ型肝炎ウィルスのゲノムに使う。
同時に免疫蛍光による分析を、感染細胞で行ない、抗ＨＣＶ構成タンパク質モノ
クロナール抗体を用いて制御する。The cells are derived from PLC / PRF / 5 cell line (Alexander cells) (ATCC reference: CRL 8024) and are lines established from human liver cancer. This line integrates the defective hepatitis B genome and secretes the HBs antigen of hepatitis B virus, but is a non-infectious virus. The cells are cultured in complete DMEM medium (Gibco-BRL) supplemented with 10% fetal bovine serum as described above. The cells are washed with PBS (Gibco-BRL) preheated to 37 ° C. 0.2% BSA (Sigma) and 50 μg / ml lipoprotein from each fraction, or filtered on a 0.45 μm membrane 1
1 ml DMEM supplemented with 00 μl serum was added. At the same time, a pre-prepared (100 mM) solution of oleic acid in isopropanol, 0.1 to 0.
Add in a concentration range of 8 mM. The cells are then incubated for 3 hours at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere. The medium was then complete D supplemented with 10% fetal bovine serum.
Replace with MEM medium. The cells are returned to the incubator under the above conditions. The culture supernatant is removed periodically and used for the hepatitis C virus genome by RT-PCR.
At the same time, immunofluorescence analysis is performed on infected cells and controlled using anti-HCV constituent protein monoclonal antibodies.
【００６２】
実施例３：結果
ＨＣＶに感染した２人の患者の血漿から得られた種々のＬＶＰ分画を用いて、
研究を行なう。これらの種々の分画中のＨＣＶゲノムの存在は、セミネストＲＴ
‐ＰＣＲにより示された。Example 3: Results Using various LVP fractions obtained from plasma of two patients infected with HCV,
Conduct research. The presence of the HCV genome in these various fractions was determined by the semi-nested RT
-As indicated by PCR.
【００６３】 [0063]
【表１】 [Table 1]
【００６４】
これらの結果は、両患者において、ＰＣＲの第１ラウンド及びＰＣＲの第２ラ
ウンドのいずれでも、１．００６３ｇ／ｍｌ未満の密度の分画中のＨＣＶゲノム
の存在についてシグナルポジティブの存在を示す。These results show the presence of a signal positive for the presence of the HCV genome in the fractions with a density of less than 1.0063 g / ml, in both the first round of PCR and the second round of PCR in both patients. Show.
【００６５】
１．０６３乃至１．００６３ｇ／ｍｌの密度の分画の分析は、第１の患者のＨ
ＣＶゲノムの存在についてネガティブであるが、第２の患者のＰＣＲの第２ラン
ドでポジティブである。１．０６３ｇ／ｍｌを超える密度の分画は、両患者のＨ
ＣＶゲノムの存在についてポジティブであるが、反応は第２の患者よりも第１の
患者の方が弱い。１．０６３乃至１．００６３ｇ／ｍｌの密度の分画における、
第１と第２の患者の間のこれらの違いは、第１の患者におけるより低いウィルス
負荷により説明することができる。Analysis of fractions with densities of 1.063 to 1.0063 g / ml was carried out using H
Negative for the presence of the CV genome, but positive in the second land of the second patient's PCR. Fractions with densities above 1.063 g / ml are
Although positive for the presence of the CV genome, the response is weaker in the first patient than in the second. In the fraction with a density of 1.063 to 1.0063 g / ml,
These differences between the first and second patients can be explained by the lower viral load in the first patient.
【００６６】
結果は、０．５ｍＭオレイン酸の存在又は非存在で、第１と第２の患者から採
取された１００μｌの血清の感染の後、培養上清を用いて得られた。ネガティブ
対照は同じ条件で行なった。セミネストＲＴ−ＰＣＲにより行なわれた分析は、
両方の患者について、培養上清中のＨＣＶゲノムの存在が、オレエートの存在で
感染が行なわれたアッセイでより高い頻度で検出されることを示す。The results were obtained with the culture supernatant after infection with 100 μl of serum taken from the first and second patients in the presence or absence of 0.5 mM oleic acid. Negative controls were run under the same conditions. The analysis performed by semi-nested RT-PCR
For both patients, the presence of the HCV genome in the culture supernatant is shown to be detected more frequently in assays where infection was performed in the presence of oleate.
【００６７】
異なる密度（１．００６３ｇ／ｍｌ未満、１．００６３ｇ／ｍｌ乃至１．０６
３ｇ／ｍｌ、及び１．０６３ｇ／ｍｌを超えたもの）での分画を用いて行なわれ
た同様のアッセイは、これらの結果を確認し、オレイン酸が感染の時にＬＶＰｓ
のエンドサイトーシスの経路を促進することを示す。Different densities (less than 1.0063 g / ml, 1.0063 g / ml to 1.06
Similar assays performed with fractions at 3 g / ml, and> 1.063 g / ml) confirmed these results, confirming that oleic acid was infected with LVPs at the time of infection.
It shows that it promotes the endocytic pathway of.
【００６８】
実施例４：オレエートの存在又は非存在での、ＬＶＰｓの、肝細胞のＬＳＲ受容
体への付着の反応速度論の研究
１．０２５ｇ／ｍｌ乃至１．０５５ｇ／ｍｌの密度でＬＶＰｓを含む分画を、
実施例１で記載したＨＣＶ−ポジティブ血清から得た。Example 4: Kinetic study of the adhesion of LVPs to hepatocyte LSR receptors in the presence or absence of oleate LVPs at a density of 1.025 g / ml to 1.055 g / ml. The fraction containing
Obtained from the HCV-positive sera described in Example 1.
【００６９】
ＬＶＰ分画に存在するタンパク質の量は、「Protein Assay」キット（Sigma D
iagnostics）を用いたローリー法により決定し、ウィルス滴定は、RT-PCRとリア
ルタイム蛍光検出（LightCycler（登録商標）,Roche）（Wittwerら、Biotechniq
ues,22:176-181(1997)）によるHCV RNAの定量により評価した。The amount of protein present in the LVP fraction was determined by the “Protein Assay” kit (Sigma D
iagnostics) and virus titration was performed by RT-PCR and real-time fluorescence detection (LightCycler®, Roche) (Wittwer et al., Biotechniq).
ues, 22: 176-181 (1997)).
【００７０】
実施例２に記載され、ＤＭＥＭ培地‐１０％ＳＶＦで培養された、ＰＬＣ／Ｐ
ＲＦ／５セルラインは、オレエートの存在又は非存在でＬＶＰｓのＬＳＲ受容体
への付着を研究するために用いた。PLC / P as described in Example 2 and cultured in DMEM medium-10% SVF.
The RF / 5 cell line was used to study the adhesion of LVPs to the LSR receptor in the presence or absence of oleate.
【００７１】 結果は、以下のプロトコールに従って得た。[0071] Results were obtained according to the following protocol.
【００７２】
ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞は、１００万個細胞／ウェルでシードし、２４時間３
７℃、５％ＣＯ2のインキュベーションの後、約８０％コフルエンスを得た。PLC / PRF / 5 cells were seeded at 1 million cells / well and left for 24 hours 3
After incubation at 7 ° C., 5% CO 2 , about 80% cofluence was obtained.
【００７３】
冷却１×ＰＢＳバッファーで２回洗浄を行ない、ついで０．２％のＢＳＡを含
む１ｍｌの冷却完全ＤＭＥＭ培地を、氷床上に保持したＰＬＣ細胞に添加する。Wash twice with cold 1 × PBS buffer, then add 1 ml of cold complete DMEM medium containing 0.2% BSA to PLC cells kept on ice sheet.
【００７４】
ＬＶＰ分画（すなわち１０ｍｇのタンパク質及び１．７×１０6のＨＣＶ Ｒ
ＮＡコピー）を、０．５ｍＭオレエートの存在又は非存在で細胞に添加する。す
べてのアッセイを３連で行なった。LVP fraction (ie 10 mg protein and 1.7 × 10 6 HCV R
NA copy) is added to cells in the presence or absence of 0.5 mM oleate. All assays were done in triplicate.
【００７５】
インキュベーションを、１乃至９時間の範囲の時間、＋４℃で行なった。細胞
はついで３回冷却１×ＰＢＳで洗浄し、Rneasy kit(Qiagen)からの０．５ｍｌの
溶解バッファーで溶解させた。ＲＮＡｓはついで、同じキットを用いて精製し、
定量的ＲＴ‐ＰＣＲ（LightCycler（登録商標））により分析した。Incubations were carried out at + 4 ° C. for times ranging from 1 to 9 hours. The cells were then washed 3 times with cold 1 × PBS and lysed with 0.5 ml lysis buffer from Rneasy kit (Qiagen). RNAs were then purified using the same kit,
It was analyzed by quantitative RT-PCR (LightCycler®).
【００７６】
得られた結果は、添付する図に示す。この図において、X軸にインキュベーシ
ョン時間が、Y軸にＨＣＶ ＲＮＡコピーの数が示されている。この図のグラフ
表示において、濃いバーはオレエートなしの培養を表し、薄いバーはオレエート
添加内容を表す。結果は、オレエートの存在下で、ＬＶＰｓの、ＬＳＲ受容体へ
の付着が、オレエートなしのアッセイと比較して、著しく増加することを示す。The results obtained are shown in the attached figures. In this figure, the incubation time is shown on the X-axis and the number of HCV RNA copies is shown on the Y-axis. In the graphical representation of this figure, dark bars represent cultures without oleate and light bars represent oleate addition. The results show that in the presence of oleate, the attachment of LVPs to the LSR receptor is significantly increased compared to the assay without oleate.
【００７７】
実施例５：ヒト免疫グロブリンとのＬＶＰｓの結合を示すこと
ＨＣＶに感染した３人の患者の血漿から採取され、実施例１のプロトコールに
従って調製されたＬＶＰｓを含む種々の分画を、ＳＤＳ（ナトリウムドデシルサ
ルフェート）の存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）により分析した（Laemmli,Nature(1970),227:680-685）。３つの分
画での免疫グロブリン（Ｉｇｓ）の存在が、ウェスタンブロット技術（Towbinら
PNAS,(1979)76:4350-4354)を用いて、ペルオキシダーゼ結合抗ヒト免疫グロブリ
ンヤギ血清（Jackson ImmunoResearch Laboratories,France）を用いて、示され
た。結果は、ヒト免疫グロブリンが、患者によって異なる量で、ＬＶＰｓを含む
分画で常に検出されることを示す。Example 5: Demonstration of binding of LVPs to human immunoglobulins Various fractions containing LVPs taken from plasma of 3 patients infected with HCV and prepared according to the protocol of Example 1 were Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) (SDS) in the presence of SDS (sodium dodecyl sulfate)
-PAGE) (Laemmli, Nature (1970), 227: 680-685). The presence of immunoglobulins (Igs) in the three fractions was confirmed by the Western blot technique (Towbin et al.
PNAS, (1979) 76: 4350-4354) using peroxidase-conjugated anti-human immunoglobulin goat serum (Jackson ImmunoResearch Laboratories, France). The results show that human immunoglobulin is always detected in the fractions containing LVPs in different amounts in different patients.
【００７８】
これらのＬＶＰ分画でのＨＣＶゲノムの量は、ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＴ＝逆転写酵
素；ＰＣＲＥ＝ポリメラーゼ連鎖反応）によるＨＣＶ ＲＮＡとリアルタイム蛍
光検出（LIGHTCYSLER（登録商標）、ROCHE）(Wittwerら，Biotechniques(1977),
22:176-181)の定量により測定された。結果は、ＨＣＶ ＲＮＡが常に、患者に
よって異なる量で、ＬＶＰｓを含む分画に結合していることを示す。The amount of HCV genome in these LVP fractions was determined by RT-PCR (RT = reverse transcriptase; PCRE = polymerase chain reaction) with HCV RNA and real-time fluorescence detection (LIGHTCYSLER®, ROCHE) (Wittwer. Et al., Biotechniques (1977),
22: 176-181). The results show that HCV RNA is always bound to the fraction containing LVPs in varying amounts depending on the patient.
【００７９】
Ｉｇ結合ＬＶＰｓ（ＬＶＰ／Ｉｇ＋）は、さらに、ＭＳ＋分離カラム（Milten
yi Biotec,フランス）を通した後に、ビーズに結合した、MAGmol Protein A Mic
roBeadsタイプ（Miltenyi Biotec,フランス）のプロテインＡを用いて、又はプ
ロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂ（Pharmacia Biotech,フランス）を用いて精
製した。この場合、ＨＣＶ ＲＮＡの全て又は大部分が、以下の表に示されるよ
うにＩｇｓで共に精製された。その結果、ＬＶＰｓリッチ分画を用いて、感染の
ために用いた試料は、それらのＩｇｓを介して精製して、ＬＶＰ/Ｉｇ＋/ＲＮＡ
＋ｓを好ましく用いることができる。Ig-bound LVPs (LVP / Ig +) were further subjected to MS + separation column (Milten
yi Biotec, France), then bound to beads, MAGmol Protein A Mic
Purified with protein A of the roBeads type (Miltenyi Biotec, France) or with protein A Sepharose CL-4B (Pharmacia Biotech, France). In this case, all or most of the HCV RNA was co-purified with Igs as shown in the table below. As a result, using the LVPs-rich fraction, the samples used for infection were purified via their Igs to obtain LVP / Ig + / RNA.
+ S can be preferably used.
【００８０】[0080]
【表２】 [Table 2]
【００８１】[0081]
【表３】 [Table 3]
【００８２】 [0082]
【表４】 [Table 4]
【００８３】
これらの結果は、ＬＶＰｓを含む分画に免疫グロブリンが存在し、ウィルスＲ
ＮＡｓが主にヒト免疫グロブリンと結合したＬＶＰｓの分画に見出されることを
示す。These results indicate that immunoglobulin is present in the fraction containing LVPs and virus R
It is shown that NAs are found mainly in the fraction of LVPs associated with human immunoglobulin.
【図１】 X軸にインキュベーション時間が、Y軸にＨＣＶ ＲＮＡコピーの
数が示されている。この図のグラフ表示において、濃いバーはオレエートなしの
培養を表し、薄いバーはオレエート添加内容を表す。FIG. 1 shows the incubation time on the X-axis and the number of HCV RNA copies on the Y-axis. In the graphical representation of this figure, dark bars represent cultures without oleate and light bars represent oleate addition.
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成１４年２月６日（２００２．２．６）[Submission date] February 6, 2002 (2002.2.6)
【手続補正１】[Procedure Amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】特許請求の範囲[Name of item to be amended] Claims
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正の内容】[Contents of correction]
【特許請求の範囲】[Claims]
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/70 1/70 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ //(Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:93 Ｃ１２Ｒ 1:93） 1:91 (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｑ 1/70 Ｃ１２Ｒ 1:93） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 アンスティテュ ナスィヨナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ Ｄ Ｅ ＬＡ ＳＡＮＴＥ ＥＴ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＭＥＤＩＣＡＬＥ フランス国・75654 パリ セデ 13・リ ュ ドゥ トルビヤック，101 101， ｒｕｅ ｄｅ Ｔｏｌｂｉａｃ ／75654 ＰＡＲＩＳ ＣＥＤＥＸ 13 ／ＦＲＡＮＣＥ (72)発明者 パトリス・アンドレ フランス・Ｆ−69003・リヨン・リュ・セ ルヴィエン・５ (72)発明者 ヴィンセント・ロトー フランス・Ｆ−69390・ヴール・シュマ ン・バルム・68テール (72)発明者 グラウシア・パランホス−バカラ フランス・Ｆ−69003・リヨン・クール・ ガンベッタ・75 (72)発明者 フローレンス・コムリアン−プラデル フランス・Ｆ−69250・ポリミュー・シュ マン・デュ・パヴィロン・114 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA18 QQ20 QR69 QR77 QR79 QS24 QS25 QS33 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4B065 AA93X AA95X BB10 BB25 BB34 CA44 CA46 4C085 AA03 BA51 BA61 CC08 DD21 DD88 4H045 AA11 CA02 DA76 EA53 FA72─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) C12Q 1/02 C12Q 1/02 1/70 1/70 G01N 33/569 G01N 33/569 L // (C12N 7/00 C12R 1:93 C12R 1:93) 1:91 (C12N 7/00 C12R 1:91) (C12Q 1/70 C12R 1:93) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG) , KZ, MD RU, TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, BZ, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR , LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, MZ, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (71) Applicant Applicant: Institutional de la Sante de la Shellche Medical INSTITUTION NATURED E LA RECHERCHE MEDICAL France 75654 Paris Cedet 13 Rue de Tolubiac, 101 101, rue de Tolbiac / 75654 PARIS CEDEX 13 / FRANCE (72) Inventor Patrice Andre France F-69003 Lyon Ryuse Rouvien 5 (72) Inventor Vincent Roteau France F-69390 Vour Schmann Balm 68 Tails (72) Inventor Glaucia Palanjos-Baccara France F-69003 Lyon Cool Gambetta 75 ( 72) Inventor Florence Comrian-Prader France-F-69250-Polymu-Schmann du Paviron 114 F-term (reference) 4B063 QA01 QA18 QQ20 QR69 QR77 QR79 QS24 QS25 QS33 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4B065 AA93X AA95X BB10 BB25 BB34 CA44 CA46 4C085 AA03 BA51 BA61 CC08 DD21 DD88 4H045 AA11 CA02 D A76 EA53 FA72
Claims (24)
ンビトロで、培養、増殖、及び複製させる方法であって、トガウィルス又はフィ
ラビウィルス科に属する少なくとも一のウィルスに感染した患者の血清から又は
血漿から得られた少なくとも一のＬＶＰ分画が存在し、少なくとも一のリポタン
パク質の受容体により中継され、かつ１６乃至２０の炭素原子を含む不飽和脂肪
酸、又は不飽和脂肪酸の誘導体、又はそれらの混合物から選ばれる活性化剤によ
り調節されるエンドサイトーシス経路を有する許容性細胞に、所定の時間、適当
な培地中で、前記分画を接触させる方法。1. A method for culturing, multiplying and replicating a virus belonging to the Togavirus or Flaviviridae family in vitro, which is obtained from the serum of a patient infected with at least one virus belonging to the Togavirus family or the Filaviviridae or plasma. An unsaturated fatty acid, or a derivative of an unsaturated fatty acid, which has at least one LVP fraction obtained from, is relayed by at least one lipoprotein receptor, and contains 16 to 20 carbon atoms, or a mixture thereof. A method of contacting a permissive cell having an endocytosis pathway regulated by an activator selected from the above with a fraction in a suitable medium for a predetermined time.
ンビトロで、培養、増殖、及び複製する方法であって、トガウィルス又はフィラ
ビウィルス科に属する少なくとも一のウィルスに感染した患者の血清から又は血
漿から得られ、ヒト免疫グロブリンと結合した少なくとも一のＬＶＰ分画が存在
し、少なくとも一のリポタンパク質の受容体により中継され、１６乃至２０の炭
素原子を含む不飽和脂肪酸、又は不飽和脂肪酸の誘導体、又はそれらの混合物か
ら選ばれる活性化剤により調節されるエンドサイトーシス経路を有する許容性細
胞に、所定の時間、適当な培地中で前記分画を、接触させる方法。2. A method for culturing, multiplying and replicating a virus belonging to the Togavirus or Flaviviridae family in vitro, which is derived from the serum of a patient infected with at least one virus belonging to the Togavirus family or the Filaviviridae or plasma. An unsaturated fatty acid containing at least one LVP fraction bound to human immunoglobulin, which is relayed by the receptor for at least one lipoprotein and contains 16 to 20 carbon atoms, or a derivative of an unsaturated fatty acid Or a method in which the above-mentioned fraction is contacted with a permissive cell having an endocytosis pathway regulated by an activator selected from the above, or a mixture thereof in a suitable medium for a predetermined time.
ｓの表面受容体である請求項１又は２記載の方法。3. The lipoprotein receptor is LSR and / or LDL.
The method according to claim 1 or 2, which is a surface receptor of s.
リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、トランスヘキサデセン酸及びエライジ
ン酸又はそれらの誘導体から選ばれる、請求項１乃至３のいずれか１項記載の方
法。4. The unsaturated fatty acid is oleic acid, palmitooleic acid,
The method according to any one of claims 1 to 3, which is selected from linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, transhexadecenoic acid and elaidic acid or derivatives thereof.
ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭの濃度で添加される、請求項４記載の方法。5. The fatty acid is oleic acid, and the medium contains 0.1 to 1
The method according to claim 4, wherein the method is added at a concentration of mM, preferably 0.5 mM.
ト又は動物の初代肝細胞、ヒト又は動物の肝臓ガンのセルライン群、樹状突起細
胞、マクロファージ細胞、クッパー細胞及びそれらの組み合わせから選ばれる細
胞である、請求項１乃至５のいずれか１項記載の方法。6. The permissive cell may be a lymphocyte-related or non-related primary human or animal hepatocyte, human or animal liver cancer cell line group, dendritic cell, macrophage cell, Kupffer cell and The method according to any one of claims 1 to 5, which is a cell selected from a combination thereof.
肝臓ガン細胞である請求項６記載の方法。7. The method according to claim 6, wherein the permissive cells are PLC / PRF / 5 cell line human liver cancer cells.
導体の他に、アポトーシス調節剤を含む、請求項１乃至７のいずれか１項記載の
方法。8. The method according to claim 1, wherein the medium contains an apoptosis regulator in addition to the components necessary for culturing and fatty acid or a derivative of fatty acid.
ーフェロン、特に抗アルファ及びベータインターフェロン；抗カスパーゼ３、特
にペプチドアナログ、例えばｚＶＡＤｆｍｋ及び前記抗カスパーゼ３に対する抗
体から選ばれる請求項８記載の方法。9. The method according to claim 8, wherein the apoptosis regulator is selected from interferons, anti-interferons, especially anti-alpha and beta interferons; anti-caspase 3, especially peptide analogues such as zVADfmk and antibodies against said anti-caspase 3.
、ＲＰＭＩ培地又はＲＰＭＩ培地由来の培地である、請求項１乃至９のいずれか
１項記載の方法。10. The method according to claim 1, wherein the medium is a DMEM medium or a DMEM medium-derived medium, an RPMI medium or an RPMI medium-derived medium.
０乃至１０％の非必須アミノ酸、１乃至１０ｍＭのグルタミン、１００乃至２０
０Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００乃至２００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン及
び１乃至２０％のウシ血清が補足されたＤＭＥＭ培地である請求項１０記載の方
法。11. The medium is 0 to 10 mM sodium pyruvate,
0-10% non-essential amino acids, 1-10 mM glutamine, 100-20
The method according to claim 10, which is a DMEM medium supplemented with 0 U / ml penicillin, 100 to 200 mg / ml streptomycin, and 1 to 20% bovine serum.
０．５％のＢＳＡ又は０．１乃至０．５％のＨＳＡが補足される、請求項１１記
載の方法。12. The method according to claim 11, wherein the medium is supplemented with 0.1-0.5% BSA or 0.1-0.5% HSA, advantageously bound to fatty acids. .
して請求項１乃至１２のいずれか１項記載の条件において感染させた前記許容性
細胞を、数回継代培養し、ＲＴ−ＰＣＲにより及び／又は免疫学的技術により、
例えば、特に前記ウィルスに特異的な抗体を用いた間接免疫蛍光により及び／又
はフローサイトメトリーにより、前記許容性細胞で前記ウィルスの存在が示され
る、請求項１乃至１２のいずれか１項記載の方法。13. After contacting the permissive cells with the LVP fraction, the permissive cells infected under the conditions according to any one of claims 1 to 12 are subcultured several times. , By RT-PCR and / or by immunological techniques,
13. The presence of the virus in the permissive cells is indicated, for example, by indirect immunofluorescence and / or by flow cytometry, in particular with antibodies specific for the virus. Method.
属する請求項１乃至１３記載の方法。14. The method according to claim 1, wherein the virus belongs to the genus Hepacivirus of the Flaviviridae family.
スである請求項１４記載の方法。15. The method according to claim 14, wherein the virus is hepatitis C virus or hepatitis G virus.
一のウィルスをインビトロで、培養、増殖、及び複製するための培地であって、
０乃至１０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０乃至１０％の非必須アミノ酸、１乃
至１０ｍＭのグルタミン、１００乃至２００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００乃至
２００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１乃至２０％のウシ血清が補足され
たＢＭＥＭ培地であり、有利にはさらに脂肪酸に結合したＢＳＡ又はＨＳＡを０
．１乃至０．５％含む培地。16. A medium for culturing, growing and replicating in vitro at least one virus belonging to the family Togavirus or Flaviviridae, which comprises:
Supplemented with 0-10 mM sodium pyruvate, 0-10% non-essential amino acids, 1-10 mM glutamine, 100-200 U / ml penicillin, 100-200 mg / ml streptomycin and 1-20% bovine serum. BMEM medium, and preferably BSA or HSA bound to fatty acids
． A medium containing 1 to 0.5%.
少なくとも一のウィルスに対する抗体を検出するための組成物を調製する方法で
あって、請求項１又は２に記載された培養方法を用いて得られた、前記ウィルス
のウィルス粒子の、又はポリペプチドの、少なくとも一の部分的又は完全な精製
を含む方法。17. A method for preparing a composition for detecting an antibody against at least one virus belonging to Togavirus and Flaviviridae in a sample, which comprises using the culture method according to claim 1 or 2. A method comprising at least one partial or complete purification of the viral particles of said virus or of the polypeptide obtained thereby.
付着している請求項１７記載の方法。18. The method of claim 17, wherein said viral particle or said polypeptide is attached to a solid support.
一のウィルスに対する抗体又は抗体断片を得る方法であって、動物が、請求項１
又は２記載の培養方法を用いて得られたウィルス粒子又はポリペプチドで免疫化
される方法。19. A method for obtaining an antibody or antibody fragment against at least one virus belonging to the family Togavirus and Flaviviridae, wherein the animal comprises
Or a method of immunizing with a virus particle or polypeptide obtained by using the culture method according to 2.
粒子又はポリペプチド、又は請求項１９記載の方法により得られた抗体を少なく
とも含む診断組成物。20. A diagnostic composition comprising at least a virus particle or polypeptide obtained by the method according to claim 17 or 18, or an antibody obtained by the method according to claim 19.
はアジュバントとともに、請求項１７記載の方法により得られたウィルス粒子又
はポリペプチドを少なくとも含む免疫化組成物。22. An immunizing composition comprising at least a viral particle or polypeptide obtained by the method of claim 17, together with a pharmaceutically acceptable vehicle and / or excipient and / or adjuvant.
るウィルスの増殖及び複製に、定性的及び／又は定量的に影響を与えることがで
きる治療組成物であって、とりわけ、少なくともリポタンパク質の受容体により
中継されるエンドサイトーシス経路を調節、抑制、又は阻害することができるリ
ガンドを含み、該リガンドは、前記受容体に対する拮抗的な抗体、及び、前記受
容体に結合する可溶性組換えタンパク質及び可溶性合成ポリペプチドから選ばれ
るタンパク質から選ばれるものである組成物、又はとりわけ、前記受容体をコー
ドする遺伝子の発現、又は前記受容体をコードする遺伝子のプロモーターの活性
を調節、抑制又は阻害する少なくとも一の分子を含むものである組成物。23. A therapeutic composition capable of qualitatively and / or quantitatively affecting the growth and replication of viruses belonging to the family Togavirus and Flaviviridae in vivo, in particular at least the reception of lipoproteins. A ligand capable of regulating, suppressing, or inhibiting an endocytic pathway relayed by the body, the ligand comprising an antagonistic antibody to the receptor, and a soluble recombinant protein that binds to the receptor; A composition which is selected from proteins selected from soluble synthetic polypeptides, or at least regulates, suppresses or inhibits the expression of a gene encoding the receptor, or the activity of a promoter of the gene encoding the receptor. A composition comprising one molecule.
又は選択する方法であって、前記抗ウィルス分子を感染したセルラインと接触さ
せる方法。24. Screening and / or for at least one antiviral molecule
Alternatively, a method of selecting, wherein the antiviral molecule is contacted with an infected cell line.
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