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JP2003504351A - 筋萎縮を阻害する方法 - Google Patents

筋萎縮を阻害する方法

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JP2003504351A
JP2003504351A JP2001509553A JP2001509553A JP2003504351A JP 2003504351 A JP2003504351 A JP 2003504351A JP 2001509553 A JP2001509553 A JP 2001509553A JP 2001509553 A JP2001509553 A JP 2001509553A JP 2003504351 A JP2003504351 A JP 2003504351A
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JP
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atrophy
raf
ras
cells
mek
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JP2001509553A
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デイビッド ジェイ． グラス，
クリスチャン ロンメル，
ジョージ ディー． ヤンコパウロス，
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Regeneron Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals Inc
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、筋細胞における萎縮を阻害する方法を提供する。本発明はさらに、脊椎動物において、骨格筋萎縮を阻害するか、または骨格筋肥大を引き起こすための方法を提供する。本発明はまた、筋細胞において、タンパク質分解を減少させるか、またはタンパク質合成を増加させるために使用され得る、因子、遺伝子および遺伝子産物を同定する方法を提供する。本発明は、骨格筋萎縮を引き起こすシグナル伝達経路を阻害することによる、骨格筋萎縮を阻害する方法を提供する。Ｒａｓ活性化を阻害する因子またはＲａｓの下流のシグナル伝達分子（例えば、Ｒａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋ）を阻害する因子が、骨格筋細胞において萎縮を予防もしくは減少させ、および／または肥大を引き起こすために本発明において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本願は、米国仮出願番号６０／１４２，８５７（１９９９年７月７日出願）（
この全体が本明細書中で参考として援用される）の優先権を主張する。
【０００２】 （発明の背景） 筋肉の質量の減少または萎縮は、種々の生理学的状態および病理学的状態に関
連する。例えば、筋萎縮は、神経外傷；退行性、代謝性または炎症性の神経障害
（例えば、ギヤン−バレー症候群）；末梢神経障害；または環境毒素もしくは薬
物により生じる神経損傷に起因する脱神経から生じ得る。筋萎縮はまた、運動神
経障害（例えば、成人運動ニューロン疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬ
Ｓまたはルー・ゲーリグ病）；乳児性および若年性の脊髄性筋萎縮症；ならびに
多病巣性導体ブロックを伴う自己免疫運動神経障害）が挙げられる）に起因する
脱神経からも生じ得る。筋萎縮はまた、例えば、発作または脊髄傷害に起因する
麻痺；外傷（例えば、骨折、靱帯もしくは腱の傷害、捻挫または脱臼など）に起
因する骨格の固定；または長期のベッド療養から生じる慢性疾患からも生じ得る
。代謝ストレスまたは栄養不足（これらも、筋萎縮を生じ得る）としては、特に
、癌の悪質液および他の慢性的な疾病（ＡＩＤＳが挙げられる）、空腹または横
紋筋融解症、ならびに内分泌障害（例えば、甲状腺の障害および糖尿病）が挙げ
られる。筋萎縮はまた、筋ジストロフィー症候群（例えば、デュシェーヌ、ベッ
カー型、筋緊張性、筋膜肩甲上腕骨（ｆａｓｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａ
ｌ）、エメリー−ドライフス、眼咽頭筋、肩甲上腕骨、肢帯および先天性のタイ
プ、ならびに遺伝性遠位型ミオパシーとして公知であるジストロフィー）に起因
し得る。筋萎縮はまた、先天性ミオパシー（例えば、良性先天性緊張低下）、中
心コア病、ネマリンミオパシー（ｎｅｍａｌｅｎｅ ｍｙｏｐａｔｈｙ）、およ
び筋細管（中心核）ミオパシーにも起因し得る。筋萎縮はまた、加齢プロセスの
間にも生じる。
【０００３】 種々の病理学的段階における筋萎縮は、増強したタンパク質分解および筋タン
パクの質減少した産生に関連する。筋細胞は、リソソームプロテアーゼおよびサ
イトゾルプロテアーゼを含む。サイトゾルプロテアーゼとしては、Ｃａ2+活性化
中性プロテアーゼ（カルパイン）およびＡＴＰ依存性ユビキチンプロテアソーム
タンパク質分解系が挙げられる。リソソーム系およびサイトゾル系は、インビト
ロで筋タンパク質を分解し得るが、インビボでの筋タンパク質分解におけるそれ
らの役割についてはあまり知られていない。幾つかの研究は、プロテアソームイ
ンヒビターが萎縮しつつあるラット骨格筋におけるタンパク質分解を減少させる
ことを報告しており（例えば、Ｔａｗａら（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅ
ｓｔ．１００：１９７）、このことは、ユビキチン−プロテアソーム経路がタン
パク質分解の増強において役割を有するという示唆に至る。しかし、この萎縮し
つつある筋肉におけるタンパク質分解の正確な機構は、不十分にしか特徴付けら
れていないままである。
【０００４】 Ｒａｓは、身体における全ての細胞中で見出されるシグナル伝達分子である。
これは、種々の増殖因子（チロシンキナーゼレセプターをシグナル伝達する増殖
因子が挙げられる）により活性化される。Ｒａｓ活性化は、幾つかの下流シグナ
ル伝達経路（Ｒａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋ経路が挙げられる）の活性化を生じる。Ｒ
ａｓの潜在的な他の下流基質としては、以下のシグナル伝達分子が挙げられる：
ＰＫＣ、Ｒａｌ−ＧＤＳ、ＫＳＲおよびＲｉｎ−１（Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １９９９年４月；１５（４）：１４５−９）。Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｋおよび
Ｅｒｋ遺伝子は、進化を通して良好に保存されており、そしてホモログは、酵母
からヒトまでの真核細胞において見出され得る（Ｒａｓ：Ｔａｐａｒｏｗｓｋｙ Ｅら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ３００：７６２−５；Ｒａｆ：Ｈｅｉｄｅｃ
ｋｅｒら（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２５０３；Ｓａｍｕ
ｅｌｓら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：６２４１；Ｍｏｒｒ
ｉｓｏｎら（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：１７４
；Ｍｅｋ：Ｃｒｅｗｓ ＣＭら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：４７８−
８０；Ｅｒｋ：Ｂｏｕｌｔｏｎ ＴＧら（１９９１）Ｃｅｌｌ ６５：６６３−
７５）。
【０００５】 Ｒａｓの恒常的に活性な変異体がトランスジェニックマウス中の心筋において
発現された場合、この動物は、肥大性心臓組織を有して生まれた（Ｊ Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．１９９５年９月 ２９；２７０（３９）：２３１７３−８）。これ
は、Ｒａｓ活性化が同様に骨格筋における肥大の原因となり得る可能性を示唆し
、そしてＲａｓ活性化が骨格筋萎縮を回復するための有効な１つの方法であり得
ることを示す。
【０００６】 しかし、筋細胞におけるタンパク質分解または減少した合成がＲａｓおよび下
流のＲａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋ経路における細胞シグナル伝達分子の活性化により
実際に増加されることが、本発明に従って開示されている。
【０００７】 （発明の要旨） 本発明は、骨格筋萎縮を引き起こすシグナル伝達経路を阻害することによる、
骨格筋萎縮を阻害する方法を提供する。Ｒａｓ活性化を阻害する因子またはＲａ
ｓの下流のシグナル伝達分子（例えば、Ｒａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋ）を阻害する因
子が、骨格筋細胞において萎縮を予防もしくは減少させ、および／または肥大を
引き起こすために本発明において有用である。
【０００８】 導入遺伝子、トランスフェクトされたＥＳ細胞を宿主胚盤胞に注入し、さらに
偽妊娠養母宿主中へ注入し、続いて胚の発達そしてトランスジェニックマウスの
誕生が続く。Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭｅｋまたはＥｒｋの核酸の恒常的に活性な変異
形態は、トランスジェニックマウスの筋肉細胞において発現され、恒常的に活性
な変異形態のＲａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、Ｍｅｋタンパク質またはＥ
ｒｋタンパク質を筋細胞に提供する。
【０００９】 別の好ましい実施形態において、トランスジェニックマウスは、Ｈｏｇａｎら
（前出）に記載されるように、導入遺伝子を含むベクターを受精卵の前核に直接
注入することによって作製される。注入された卵は、偽妊娠養母宿主に挿入され
、胚の発達およびトランスジェニックマウスの誕生が続く。
【００１０】 Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、Ｍｅｋタンパク質、またはＥｒｋタン
パク質の恒常的に活性な変異形態の存在はまた、これらのタンパク質に特異的な
抗体を用いてか、またはこれらのタンパク質をコードするベクター中に遺伝的に
挿入されたエピトープタグに特異的な抗体によって、評価され得る。
【００１１】 筋細胞萎縮を阻害する因子の同定のための方法において、この因子は、当該分
野で公知の方法によって、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭｅｋまたはＥｒｋの恒常的に活性
な変異形態を発現する筋細胞と接触され得る。培養物中の細胞またはトランスジ
ェニック生物から得られた細胞に関して、これらの細胞は、例えば、直接的な適
用によって、この因子と接触され得る。この因子は、細胞への侵入を促進するた
めに、改変されてもよいし、送達ビヒクルに含まれてもよい。この因子は、単離
および精製されてもよく、または、本方法におけるポジティブな結果に続くさら
なる精製に供されるサンプルまたは組成物中に存在し得る。例えば、この試薬は
、細胞中に含まれ得る。骨格筋細胞がＭｅｋキナーゼ（これは、ＲａｓおよびＲ
ａｆの下流）のシグナル伝達をブロックする化学物質で処理される場合、生じる
細胞が、コントロール細胞と比較して肥大性のようであることが、本発明に従っ
て発見された。
【００１２】 従って、本出願者らは、Ｒａｓまたはその下流シグナル伝達分子Ｒａｆ／Ｍｅ
ｋ／Ｅｒｋのインヒビターが、骨格筋細胞における萎縮を減少または予防するた
めに有用であることを発見した。さらに、そのようなインヒビターは、骨格筋萎
縮が生じる、本明細書中に記載されるような状態を有する哺乳動物における萎縮
を減少および／または予防するのに使用され得る。好ましい実施形態において、
そのようなインヒビターは、Ｒａｓについての薬理学的アンタゴニスト［Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９９）４３（１）：
５０−８］、もしくはＲａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋについての薬理学的アンタゴニス
トであることが既に明らかになっているインヒビター（例えば、ＰＤ９８０５９
［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９５）９２：７６８６］また
はファルネシルトランスフェラーゼ（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ（１９９５）Ｄｅｃ
２（１２）：７８７−９１））である。この実施形態に従って、萎縮しつつある
骨格筋細胞、または筋細胞が萎縮しつつある上記のような状態を有する脊椎動物
は、インヒビターで処理されて、その結果筋細胞萎縮を予防または減少する。そ
のような処置は、筋萎縮発症の前に予防的に利用され得るか、またはそのような
状態が現れた後に利用され得る。脊椎動物としては、骨格筋および骨格を含む任
意の種（これは、ニワトリ、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ
、ヤギ、霊長類およびヒトを含む）が挙げられ、好ましくはヒトである。
【００１３】 別の実施形態において、Ｒａｓまたは下流のシグナル伝達分子であるＲａｆ／
Ｍｅｋ／Ｅｒｋのインヒビターは、骨格筋細胞における萎縮をもたらすために使
用され得る。さらに、そのようなインヒビターは、骨格筋萎縮が予測される本明
細書中に記載されるような状態を有する脊椎動物において筋萎縮をもたらすため
に使用され得る。いくつかの設定（例えば、食肉生産用に飼育される動物）にお
いて、このような因子は、食肉生産を増加するために使用され得る。好ましい実
施形態において、そのようなインヒビターは、Ｒａｓについての薬理学的アンタ
ゴニスト［Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９
９）４３（１）：５０−８］、またはＲａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋについての薬理学
的アンタゴニストであることが既に明らかになっているインヒビター（例えば、
ＰＤ９８０５９［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９５）９２：
７６８６］またはファルネシルトランスフェラーゼ（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ（１９
９５）Ｄｅｃ ２（１２）：７８７−９１））である。この実施形態に従って、
萎縮しつつある骨格筋細胞、または筋細胞が萎縮しつつある上記のような状態を
有する脊椎動物は、インヒビターで処理されて、その結果筋細胞萎縮を予防また
は減少する。そのような処置は、筋萎縮発症の前に予防的に利用され得るか、ま
たはそのような状態が現れた後に利用される。あるいは、そのような処置は、骨
格筋肥大を誘導するために使用され得る。
【００１４】 本発明はさらに、キャリア（これは、賦形剤、希釈剤または他の薬学的に活性
な化合物を含み得る）中のＲａｓアンタゴニストまたはＲａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋ
アンタゴニストを含む治療組成物を提供する。そのような組成物は、全身投与さ
れるか、または局所投与され得る。当該分野で公知の任意の適切な投与形態が使
用され得、これには、静脈内注射、髄腔内注射、動脈内注射、鼻腔内注入、経口
注入、皮下注射、腹腔内注射、または局所注射、あるいは外科移植を含むが、こ
れらに限定されない。徐放性処方物がまた、提供される。
【００１５】 脊椎動物における本発明の組成物の活性は、筋萎縮が存在する障害の実験動物
モデルを用いて評価され得る。例えば、この組成物の活性は、実施例２において
、本明細書中に記載される後肢固定モデルにおけるそれらの効果について試験さ
れ得る。あるいは、この組成物の活性は、肥大が測定され得る実験動物を用いて
評価され得る。例えば、この組成物の活性は、運動誘導肥大（ｅｘｅｒｃｉｓｅ
−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）または補償誘導肥大（ｃｏｍｐｅ
ｎｓａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）を受けている筋肉
に対するそれらの効果について試験され得る。あるいは、筋肉は、実験組成物で
処置された動物と比較されてコントロール動物中で評価されて、その処置動物が
、その処置の結果として骨格筋肥大を示すか否かを決定し得る。細胞培養アッセ
イおよび動物研究から得られたデータを使用して、脊椎動物（ヒトを含む）にお
ける使用のための投薬量の範囲を定式化し得る。本明細書中にの組成物の投薬量
は、毒性がほとんどまたは全くない、ある範囲の血清循環濃度内にあるべきであ
る。投薬量は、使用した投薬形態および投与経路に依存してこの範囲内で変化し
得る。
【００１６】 別の実施形態において、筋細胞において萎縮を阻害するかまたは肥大をもたら
す因子を同定する方法を提供する。この方法は、ＲａｓまたはＲａｆ／Ｍｅｋ／
Ｅｒｋの恒常的に活性な変異体を発現する筋細胞を作製する工程、この筋細胞を
、試験される因子と接触させる工程；および萎縮を経てない細胞または萎縮の量
がコントロール細胞と比較して減少されている細胞についてスクリーニングする
工程を包含する。
【００１７】 １つの実施形態において、本発明は、筋細胞において萎縮を阻害する因子また
は肥大をもたらす因子を同定する方法を提供する。この方法は、Ｒａｓ活性また
はＲａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋ活性についてのインビトロアッセイを調製する工程、
ＲａｓまたはＲａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋを、試験される因子と接触させる工程；お
よびＲａｓ活性またはＲａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋ活性をブロックする因子について
スクリーニングする工程を包含する。
【００１８】 本発明の別の好ましい実施形態は、筋細胞において萎縮を阻害するかまたは肥
大をもたらす遺伝子産物をコードする遺伝子を同定する方法を提供する。この方
法は、ＲａｓまたはＲａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋの恒常的に活性な変異体を発現する
筋細胞を調製する工程；これらの筋細胞に試験される遺伝子を、この試験遺伝子
が産物をコードする条件下で導入する工程、この試験遺伝子をコードする筋細胞
における萎縮量を測定する工程、および、この試験遺伝子をコードする細胞にお
ける萎縮量を、試験遺伝子が導入されていない筋細胞における萎縮量と比較する
工程（ここで、試験遺伝子をコードする筋細胞におけるより小さな萎縮量が、試
験遺伝子産物はＲａｓ経路またはＲａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋ経路を阻害し、それゆ
え、そのような萎縮が生じる条件下で細胞における萎縮を阻害することを示す）
を包含する。
【００１９】 ＲａｓまたはＲａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋの恒常的に活性な変異体形態を発現する
ために有用な細胞は、培養物中で維持されて、異種核酸を発現するように操作さ
れ得る、任意の筋細胞および全ての筋細胞を含む。これらの細胞は、初代培養物
または確立された細胞株であり得る。適切な筋細胞としては、筋芽細胞、例えば
、Ｂａｉｎｓら（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１４４９−１５
５３（この文献の開示は、本明細書中に参考として援用される）に記載されるよ
うなＣ２Ｃ１２細胞株が挙げられる。他の適切な筋細胞としては、Ｇｌａｓｓら
（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １６：８８４８
に記載されるＳｏｌ８細胞、およびＲｉｎｇｅｎｔｚら（１９７８）Ｅｘｐ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｒｅｓ．１１３：２３３に記載されるようなＬ６細胞（これらの文献の
開示は、本明細書中に参考として援用される）が挙げられる。
【００２０】 Ｒａｓ遺伝子またはＲａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋ遺伝子を発現する培養された筋細
胞を作製するため有用な細胞としてはまた、骨格筋細胞に分化し得る非筋細胞が
挙げられる；この細胞型の例は、胚性幹細胞（これは、Ｓｈａｎｉら（１９９２
）Ｓｙｍｐ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．４６：１９に記載されるように、筋特
異的転写因子であるＭｙｏＤの挿入によって骨格筋細胞に分化し得る）である。
骨格筋経路に沿って分化され得る非筋細胞の別の例は、横紋筋肉腫の腫瘍細胞で
あり、この細胞は、Ｇａｂｂｅｒｔら（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８
：５２６４によって記載されるようにレチノイン酸と接触することによって分化
し得る。
【００２１】 適切な転写調節配列および翻訳調節配列の制御下である、ＲａｓまたはＲａｆ
／Ｍｅｋ／Ｅｒｋの恒常的に活性な変異形態の核酸は、当該分野で公知の方法（
例えば、形質転換、トランスフェクト、感染、形質導入、および注入を含む）に
よって細胞に導入され得る。好ましい実施形態において、Ｒａｓ遺伝子、Ｒａｆ
遺伝子、Ｍｅｋ遺伝子、またはＥｒｋ遺伝子は、筋細胞において発現を引き起こ
す適切なプロモーターの制御下で、発現ベクターに含まれる。好ましいプロモー
ターとしては、ヒト骨格アクチン（ＨＳＡ）、ニワトリ骨格アクチン（ＣＳＡ）
、マウス骨格アクチン（ＭＳＡ）、ラット骨格アクチン（ＲＳＡ）のような骨格
アクチン；筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）；ＭｙｏＤ；ＭＲＦ４；ミオゲニン
；ジストロフィン；ユートロフィン；ＭｕＳＫ；ミオシン軽鎖（ＭＬＣ１／３）
；ミオシン重鎖（ＭＨＣ）が挙げられる。他の非筋特異的プロモーターとしては
、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）；ＬＴＲ（長い末端反復配列（これは、モロ
ニーマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）を含むレトロウイルス中に見出される）
）；ＨＴＬＶ−１（ヒトＴ細胞白血病ウイルス１のプロモーター）；後期（ｌａ
ｔｅ）アデノウイルス、中期（ｍｉｄｄｌｅ）アデノウイルス、または初期（ｅ
ａｒｌｙ）アデノウイルスが挙げられる。
【００２２】 細胞中の萎縮量は、直径の定量、タンパク質量の定量によってか、またはタン
パク質合成を刺激するｐ７０Ｓ６キナーゼもしくはＰｈａｓ−１タンパク質の活
性化によって、測定され得る。トランスジェニック生物において、筋萎縮は、本
明細書中の実施例２に記載されるように測定され得る。
【００２３】 さらに別の好ましい実施形態において、Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質
、Ｍｅｋタンパク質、またはＥｒｋタンパク質は、インビトロアッセイで発現さ
れ、その結果、これらのシグナル伝達分子を阻害する因子がスクリーニングされ
得る。あるいは、インビトロ結合アッセイが利用されて、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅ
ｋ、またはＥｒｋの下流のシグナル伝達成分への結合をブロックする因子が同定
され得る。これには、例えば、Ｅｎｄら（１９９３）Ｊ．ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６８（１４）：１００６６−１００７５に記載されるような技術が用いられる
。
【００２４】 適切なプロモーターの制御下でＲａｓ、Ｒａｆ、ＭｅｋまたはＥｒｋの恒常的
に活性な変異形態の核酸を含む発現ベクターは、公知の方法（例えば、リポソー
ム媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、Ｄ
ＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、裸のＤＮＡのトランスフェクショ
ン、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、レトロウイルス媒介
感染、アデノウイルス媒介感染、またはアデノ随伴ウイルス媒介感染）によって
細胞に導入される。Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭｅｋまたはＥｒｋの恒常的に活性な変異
形態の核酸は、安定または一過性で、細胞に導入され得る。異種核酸を真核生物
細胞に導入するための方法は、多数の実験室手引書（例えば、ＤＮＡ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９８
５）Ｇｌｏｖｅｒら、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、お
よびＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ、ＮＹに記載されている。
【００２５】 好ましい実施形態において、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭｅｋまたはＥｒｋの恒常的に
活性な変異形態の核酸は、例えば、Ｐｅａｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８３９２（本明細書中に参考として援用さ
れる）によって記載されるように、レトロウイルスベクターに挿入される。この
実施形態において、ウイルスＬＴＲプロモーターは、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｋま
たはＥｒｋの恒常的に活性な変異形態の核酸を制御する。このベクターは、レト
ロウイルスパッケージング株に一過性にトランスフェクトされ、そして生じた、
Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｋ、またはＥｒｋの恒常的に活性な変異形態の核酸を含む
組換えウイルスが、Ｐｅａｒら（同上）によって記載されるように収集される。
次いで、組換えウイルスは、Ｈｏｆｆｍａｎら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５１８５（本明細書中に参考として援用さ
れる）によって記載されるように筋芽細胞を感染するために使用される。骨格筋
細胞の例として、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｋ、またはＥｒｋの恒常的に活性な変異
形態を発現するＣ２Ｃ１２細胞は、少なくとも１０％ウシ胎仔血清を含む組織培
養培地中で増殖させることによって未分化状態に維持され得るか、または２％ウ
マ血清を含む培地中で増殖させることによって骨格筋筋管に分化され得る。必要
な組織培養方法は、当業者に公知である。Ｃ２Ｃ１２細胞は、Ｂａｉｎｓら（１
９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４：１４４９（本明細書中に参考として
援用される）に記載される。
【００２６】 Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭｅｋまたはＥｒｋの恒常的に活性な変異形態の核酸を発現
する筋細胞は、トランスジェニック生物内に含まれ得るか、またはトランスジェ
ニック生物体から得られ得る。本明細書中に使用される場合、用語、トランスジ
ェニック生物は、それらのゲノム中に組み込まれる外来遺伝子（特に、Ｒａｓ、
Ｒａｆ、ＭｅｋまたはＥｒｋの恒常的に活性な変異形態の核酸）を有する、筋細
胞含有多細胞生物を含む。本発明に従って意図されるトランスジェニック生物体
は、蠕虫、鳥類、ニワトリ、シチメンチョウ、ハエ、および非ヒト哺乳動物（例
えば、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマおよ
びウシなど）を含む。トランスジェニック蠕虫およびトランスジェニックマウス
は、本発明に従う研究用途に関して特に好ましい。
【００２７】 本発明のトランスジェニック生物において、筋特異的調節因子の調節下で、Ｒ
ａｓ、Ｒａｆ、ＭｅｋまたはＥｒｋ核酸の恒常的に活性な変異形態のコード領域
は、宿主生物のゲノムに組み込まれる。筋特異的調節因子は、宿主生物の筋細胞
中のこれらの核酸の発現を提供するために、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭｅｋまたはＥｒ
ｋ核酸の恒常的に活性な変異形態の発現に指向し、そして宿主生物に対してネイ
ティブであり得るか、または宿主生物に対して異種であり得る。本発明に有用な
好ましい筋特異的調節因子が、特定の宿主における最適な発現について選択され
る。非ヒトトランスジェニック哺乳動物での使用について好ましい筋特異的調節
因子としては、ヒト骨格アクチン（ＨＳＡ）プロモーター（Ｂｒｅｎｎａｎら（
１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：７１９、本明細書中に参考として
援用される）および筋ケラチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター（Ｊｏｈｎｓｏ
ｎら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：３３９３、本明細書中に参
考として援用される）が挙げられる。
【００２８】 本発明のトランスジェニック生物は、宿主生物に入る筋特異的プロモーターに
作動可能に連結されるＲａｓ、Ｒａｆ、ＭｅｋまたはＥｒｋ核酸の恒常的に活性
な変異形態のコード領域を含む導入遺伝子ＤＮＡ構築物を移入することによって
作製され、その結果、宿主生物のゲノムに導入遺伝子が組み込まれる。トランス
ジェニック非ヒト生物を作製するための方法は、当該分野で公知であり、そして
例えば、ＤＮＡマイクロインジェクション、胚性幹（ＥＳ）細胞移入、レトロウ
イルス感染、割球胚凝集、奇形癌細胞移入、電気融合、核移植、および精子媒介
移入が挙げられる。その方法は、例えば、Ｐｉｎｋｅｒｔら、「Ｔｒａｎｓｇｅ
ｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｌｉｎｇ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｙｅｒｓ編、ＶＣＨ Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５，９０−９０７頁および、
例えば、Ｈｏｇａｎら（１９９４）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕ
ｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌ
ａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを含む多数の研究室マニュアルによって総説
され、それらの開示は、本明細書中で参考として援用される。本発明の好ましい
実施形態では、トランスジェニック非ヒト生物は、マイクロインジェクションに
よって作製される。本発明に従って意図されるトランスジェニック生物としては
、トランスジェニックハエ、蠕虫、鳥類、ニワトリ、シチメンチョウ、マウス、
ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギまたはウマが挙げられるが、
これらに限定されない。本発明の好ましい実施形態では、トランスジェニック生
物は、トランスジェニックマウスである。トランスジェニック蠕虫を作製する方
法（特に、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）がまた、当該分野
で公知であり、そして例えば、Ｍｅｌｌｏら（１９９１）ＥＭＢＯ．Ｊ．１０：
３９５９によって開示される。
【００２９】 本発明の好ましい実施形態では、トランスジェニック生物は、トランスジェニ
ックマウスであり、その生殖細胞および体細胞は、筋特異的プロモーターに作動
可能に連結されるＲａｓ、Ｒａｆ、ＭｅｋまたはＥｒｋ核酸の恒常的に活性な変
異形態のコード領域を含む導入遺伝子を含み、これによって、Ｒａｓ、Ｒａｆ、
ＭｅｋまたはＥｒｋタンパク質の恒常的に活性な変異形態は、従って、トランス
ジェニック生物の筋細胞にて産生される。そのトランスジェニックマウスは、好
ましくは、導入遺伝子を含むベクターを用いて、ＥＳ細胞をトランスフェクショ
ンし、トランスフェクトされたＥＳ細胞を宿主胚盤胞に注入し、さらに偽妊娠の
義母宿主へ注入し、続いて胚の発達そしてトランスジェニックマウスが誕生する
ことによって作製される。Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭｅｋまたはＥｒｋ核酸の恒常的に
活性な変異形態は、トランスジェニックマウスの筋細胞において発現され、筋細
胞中にＲａｓ、Ｒａｆ、ＭｅｋまたはＥｒｋタンパク質の恒常的に活性な変異形
態を提供する。
【００３０】 別の好ましい実施形態では、トランスジェニックマウスは、Ｈｏｇａｎら（前
出）に記載されるように、受精卵の前核に、導入遺伝子を含むベクターを直接注
入することによって、作製される。注入された卵は、偽妊娠義母宿主に挿入され
、胚の発達およびトランスジェニックマウスの誕生が続く。
【００３１】 Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭｅｋまたはＥｒｋタンパク質の恒常的に活性な変異形態の
存在はまた、これらのタンパク質に対して特異的な抗体を使用して、またはこれ
らのタンパク質をコードするベクターに遺伝子的に挿入されたエピトープタグに
特異的な抗体により、評価され得る。
【００３２】 筋細胞萎縮症を阻害する因子の同定のための方法において、その因子は、当該
分野で公知の方法によって、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭｅｋまたはＥｒｋの恒常的に活
性な変異形態を発現する筋細胞と接触され得る。培養物中の細胞またはトランス
ジェニック生物から得られた細胞について、細胞は、その因子と接触され得る（
例えば、直接適用によって）。その因子は、細胞への侵入を容易にするために、
改変されてもよいし、または送達ビヒクル中に含まれてもよい。その因子は、単
離および精製され得てもよいし、または本方法のポジティブな結果に続く、さら
なる精製に供されるサンプルまたは組成物に存在してもよい。例えば、その因子
は、細胞溶解産物、馴化細胞培養培地、または合成もしくは天然に存在する化合
物のライブラリー中に含まれ得る。トランスジェニック生物に存在する筋細胞に
ついて、その細胞は、当該分野で公知の方法（例えば、経口摂取、非経口投与、
または組織表面への直接適用）によって因子を送達することにより、その因子と
接触され得、そして、キャリアまたは希釈剤を含む組成物に存在し得る。本発明
の方法において試験され得る因子としては、例えば、タンパク質、ペプチド、リ
ピド、炭水化物、核酸などの有機および無機分子が挙げられ、これは、アンチセ
ンス、金属、塩などを含む。
【００３３】 遺伝子（その遺伝子産物は、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭｅｋまたはＥｒｋの恒常的に
活性な変異形態の存在下で、筋細胞の萎縮を阻害する）を同定する方法において
は、試験される遺伝子は、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭｅｋまたはＥｒｋシグナル伝達効
率の阻害について、当該分野で公知の方法および本明細書中上記に記載される方
法によって、筋細胞に導入され得る。その遺伝子は、本明細書中に記載されるよ
うに、プロモーターの制御下に存在し、かつ発現ベクター中に存在し得る。遺伝
子のプール（例えば、ｃＤＮＡライブラリー）は、タンパク質分解を妨害する遺
伝子プールの能力について試験され得る。タンパク質分解を阻害する遺伝子プー
ルの同定の際、そのプールは、次第に分割されそして単一の遺伝子が同定される
まで試験され得る。
【００３４】 遺伝子（その発現は、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭｅｋまたはＥｒｋの恒常的に活性な
変異形態を含む筋細胞における萎縮を阻害する）を同定する方法において、遺伝
的変異は、当該分野で公知の方法によって筋細胞中の遺伝子に導入され得る。定
方向変異誘発法は、当該分野で公知であり、そして例えば、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ
Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９
１）ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ
，Ｏｘｆｏｒｄを含む研究室マニュアルに見出され得る。好ましい実施形態では
、無作為変異誘発は、化学物質ＥＭＳを使用して達成され、これは、当業者によ
って達成され得る。１つの例が、Ｃｈａｎａｌら（１９９７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４６：２０において見出され得る。突然変異を誘導する方法は、Ａｎｄｅｒ
ｓｏｎ（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４８：３１によって
総説される。
【００３５】 本発明の方法は、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭｅｋまたはＥｒｋの恒常的に活性な変異
形態を含む筋細胞における萎縮を妨害する因子、遺伝子および遺伝子産物の同定
のために有用である。本方法によって同定される因子、遺伝子および遺伝子産物
は、筋萎縮症の処置および予防のために有用である。
【００３６】 本明細書中で引用される文献は、その全体が本明細書中で援用される。
【００３７】 以下の非制限的な実施例は、本発明をさらに例示するために役立つ。
【００３８】 （実施例） （実施例１） （筋細胞におけるＲａｆの活性化およびブロックの効果） 筋細胞においてＲａｆを活性化、およびブロックする効果を試験するために、
Ｃ２Ｃ１２と呼ばれる筋芽細胞株に、恒常的に活性なＲａｆ遺伝子［Ｈｅｉｄｅ
ｃｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２５
０３; Ｓａｍｕｅｌｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１３：６２４１; Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒ
．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：１７４］もしくはドミナントネガティブ
Ｒａｆ遺伝子［Ｂｒｕｄｅｒ、ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．
６：５４５］のいずれか、またはコントロールとしてどんな遺伝子も挿入されて
いない発現ベクターを含むＤＮＡ発現ベクターでトランスフェクトした。「ドミ
ナントネガティブな」構築物は内因性の遺伝子産物の活性をブロックし得る；「
恒常的に活性な」構築物は常に活性化状態にある遺伝子の変異形態をコードする
。これらの構築物を標準の分子生物学的技術を用いて作り、それからリン酸カル
シウムトランスフェクション法を用いてＣ２Ｃ１２細胞に安定にトランスフェク
トした。トランスフェクトした細胞を抗生物質選択によって選択した。それから
、得られた筋芽細胞をコンフルエントになるまで育成し、実際の筋線維に似た多
核の筋細胞である「筋管」にまで分化させた。
【００３９】 Ｒａｆのドミナントネガティブ形態を発現している筋管はコントロール筋管よ
りかなり長い−その筋管はより長く、そしてより広い直径を持っている、ことが
わかった。Ｐｈａｓ−１、すなわち、タンパク質合成に関与する分子［Ｘｕ，ｅ
ｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（８）：４４８５−４
４９１］の分析は、Ｒａｆの阻害がＰｈａｓ−１活性化において増加を引き起こ
すことを明らかにした。よってＲａｆをブロックすることは筋タンパク質合成を
増加することを明らかにした。
【００４０】 Ｒａｆの恒常的に活性な形態を発現する筋管はコントロール筋管よりかなり薄
いことがわかった。これらの筋管におけるＰｈａｓ−１の分析によって、Ｒａｆ
の活性化はＰｈａｓ−１活性化において減少を引き起こすことが明らかになり、
Ｒａｆの活性化は筋タンパク質量を減少させ、Ｒａｆの阻害は筋萎縮を減少また
は予防するために用いられ得ることが明らかになった。
【００４１】 さらに、Ｃ２Ｃ１２の筋管をＰＤ９８０５９［Ｄｕｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．（
１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２：７６８６］として
公知のＭｅｋ１／２インヒビターで処理し、ドミナントネガティブＲａｆを発現
している分化細胞と比較した。一日Ｍｅｋインヒビター３ｍＭで後分化処理した
細胞はドミナントネガティブＲａｆ細胞と区別不能であった。
【００４２】 （実施例２） （筋萎縮に対する試験をするための動物モデル） 筋萎縮に対する試験をするために、齧歯類の動物（マウスまたはラット）の足
関節を屈曲９０°に固定する。この手順は、種々の角度に足関節を動かす筋（例
えば、ヒラメ筋や、内側および外側ひ腹筋、前けい骨筋）の萎縮を引き起こす。
再現可能な萎縮量は１４日間にわたって後肢筋において測定され得る。
【００４３】 固定手順は足関節をギプス包帯（マウス）あるいはピン止め(ラット）するこ
とを含み得る。齧歯類動物にケタミン／キシラジンで麻酔をかけ、右足関節を固
定する。ラットでは、踵の部分に、足の軸に沿って０．５ｃｍの切開を行う。そ
れから、ねじくぎ（１．２×８ｍｍ）を踵骨と尾を通してけい骨の長幹に挿入す
る。創傷は皮膚接着剤で閉じる。マウスでは、足関節を関節の周りに軽量のギプ
ス包帯（ＶＥＴ−ＬＩＴＥ）で９０°に固定する。その材料を水に浸し、それか
ら肢の周りに包む。材料は乾いたとき固いが重量は軽い。
【００４４】 固定後７日および１４日に、動物に麻酔をかけ、頚部の脱臼によって殺す。前
けい骨筋（ＴＡ）、内側ひ腹筋（ＭＧ）、およびヒラメ筋（Ｓｏｌ）の筋肉を（
固定された）右と（無傷な）左の後肢から取り、重量を測り、固定長で液体窒素
冷却イソペンタン中で冷凍する。この実験動物と同じ体重および年齢であるコン
トロール動物のコホートもまた殺し、筋肉を取り出し、重量測定し、そして冷凍
する。固定された肢からの筋重量とコントロール動物からの筋重量を比較するこ
とによって、萎縮量を評価する。
【００４５】 （実施例３） （恒常的に活性なＲａｓと恒常的に活性なＲａｆについての筋特異的真核生物
発現構築物の調製） 恒常的に活性なＲａｓをコードしているＤＮＡと恒常的に活性なＲａｆをコー
ドしているＤＮＡを、標準な分子生物学的技術によって真核生物発現ベクターに
クローン化した。簡単には、恒常的に活性なＲａｓＶ１２をコードしているＤＮ
ＡおよびＲａｆのＣＯＯＨ末端（ＲａｆＣＴ）をコードしているＤＮＡ（これは
発現したとき恒常的に活性である）をゲル精製し、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣ
Ｋ）プロモーターを含む真核生物発現ベクターにクローン化した。これらのベク
ターをそれぞれ、ＭＣＫ ＲａｓＶ１２、ＭＣＫ ＲａｆＣＴと呼んだ。ＭＣＫ
プロモーターはマウスにおいて導入遺伝子の筋特有発現を引き起こすことが以前
に示されている［Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
．Ｂｉｏｌ．９：３３９３］。
【００４６】 （実施例４） （Ｃ２Ｃ１２細胞のトランスフェクト） マウスのＣ２Ｃ１２筋芽細胞を、細胞培養において導入遺伝子を研究する手法
として用いた。ＲａｓおよびＲａｆ遺伝子発現を行うために、実施例３で記述し
たように、マウスの筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）遺伝子プロモーターを使用
するベクターをリン酸カルシウム沈殿物によってＣ２Ｃ１２にトランスフェクト
した。トランスジェニックＣ２Ｃ１２細胞の陽性選択を可能にするために、薬物
Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ）を使用して、ｎｅｏ遺伝子を駆動するＬＴＲ遺伝子プロ
モーターを含むプラスミドと共にＭＣＫ−ＲａｓＶ１２およびＲａｆＣｔベクタ
ーを同時トランスフェクトした。プラスミドの発現は、細胞が薬物Ｇ４１８の殺
傷効果に抵抗することを可能とする；よって、Ｇ４１８で処理すると、うまくト
ランスフェクトした細胞のみが生き残る。
【００４７】 トランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞コロニーを収集し、トリプシン処理して
、そして２４ウェル培養プレートの個々のウェルに再プレートして増殖した。コ
ントロールのＣ２Ｃ１２細胞、ＭＣＫ ＲａｓＶ１２構築物を含むＣ２Ｃ１２細
胞およびＭＣＫ ＲａｆＣＴ構築物を含むＣ２Ｃ１２細胞をコンフルエントにな
るまで増やした。血清レベルを落とし、筋芽細胞の融合を分化筋細胞にまで行っ
た。Ｃ２Ｃ２Ｃ１２細胞は多核筋管にまで分化した。結果として生じた筋管の表
現型を直径、タンパク質量およびタンパク質合成を刺激するＰｈａｓ−１タンパ
ク質の活性化によって定量化した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 1/68 Ｚ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 5/00 Ｂ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/52 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ロンメル， クリスチャン スイス国 シーエイチ−1227 ジェネバ， レス アカシアス， ルート デス ア カシアス， ４， スタジオ ハウス (72)発明者 ヤンコパウロス， ジョージ ディー． アメリカ合衆国 ニューヨーク 10598， ヨークタウン ハイツ， バブチスト チャーチ ロード 1519 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA02 DA02 EA04 FA02 HA11 4B063 QA05 QA08 QQ21 QQ41 QQ43 QQ61 QQ79 QQ89 QR77 QR80 QS31 QS38 QX10 4B065 AA90Y AA91X AB01 AC14 BA02 BA16 BA30 BD50 CA44 CA46 4C084 AA02 AA17 BA44 DC25 NA14 ZA94 ZB21

Claims (41)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｒａｓ／Ｒａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋ経路のインヒビターで細胞
    を処理する工程を包含する、骨格筋細胞における萎縮を阻害する方法。
  2. 【請求項２】 前記インヒビターがＲａｓを阻害する、請求項１に記載の方
    法。
  3. 【請求項３】 前記インヒビターがＲａｆを阻害する、請求項１に記載の方
    法。
  4. 【請求項４】 前記インヒビターがＭｅｋを阻害する、請求項１に記載の方
    法。
  5. 【請求項５】 前記インヒビターがＥｒｋを阻害する、請求項１に記載の方
    法。
  6. 【請求項６】 前記インヒビターが、ＰＤ９８０５９またはファルネシルト
    ランスフェラーゼである、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 骨格筋細胞における萎縮を阻害する因子を同定する方法であ
    って、以下： （ａ）恒常的に活性な変異体形態のＲａｓ／Ｒａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋを発現す
    る筋細胞を調製する工程； （ｂ）該細胞を試験因子に供する工程； （ｃ）試験因子に供された該筋細胞における萎縮の量を測定する工程； （ｄ）試験因子に供された該筋細胞における萎縮の量と工程（ａ）の未処理ト
    ランスジェニック筋細胞における萎縮の量とを比較する工程であって、ここで、
    試験因子に供された該筋細胞における、より少量の萎縮は、該因子がＲａｓ／Ｒ
    ａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋ経路を阻害し、従って筋細胞における萎縮を阻害すること
    を示す、工程、 を包含する方法。
  8. 【請求項８】 前記測定する工程が、筋細胞直径、タンパク質量、ｐ７０Ｓ
    ６キナーゼ活性化またはＰｈａｓ−１活性化を利用する、請求項７に記載の方法
    。
  9. 【請求項９】 前記測定する工程が、Ｒａｓ／Ｒａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋの阻
    害を測定することを利用する、請求項７に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記筋細胞が培養細胞である、請求項７に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記培養細胞が筋芽細胞である、請求項１０に記載の方法
    。
  12. 【請求項１２】 前記筋芽細胞がＣ２Ｃ１２細胞である、請求項１１に記載
    の方法。
  13. 【請求項１３】 前記筋芽細胞が分化した筋芽細胞である、請求項１１に記
    載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記分化した筋芽細胞が筋管である、請求項１３に記載の
    方法。
  15. 【請求項１５】 前記筋細胞がトランスジェニック生物から得られる、請求
    項７に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記筋細胞がトランスジェニック生物内にある、請求項７
    に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記トランスジェニック生物が、トランスジェニックのハ
    エ、蠕虫、鳥類、ニワトリ、シチメンチョウ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウ
    サギ、ヒツジ、ブタ、ヤギまたはウマである、請求項１５に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記トランスジェニック生物が、トランスジェニックのハ
    エ、蠕虫、鳥類、ニワトリ、シチメンチョウ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウ
    サギ、ヒツジ、ブタ、ヤギまたはウマである、請求項１６に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 筋細胞における萎縮を阻害する因子を同定する方法であっ
    て、以下： ａ）未処理筋細胞におけるＲａｓ／Ｒａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋ経路の活性を測定
    する工程； ｂ）Ｒａｓ／Ｒａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋ経路を発現する筋細胞を試験因子に供す
    る工程、 ｃ）試験因子に供された該筋細胞におけるＲａｓ／Ｒａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋ活
    性の量を測定する工程； ｄ）試験因子に供された該筋細胞におけるＲａｓ／Ｒａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋ活
    性の量と未処理筋細胞における量とを比較する工程であって、これにより、試験
    因子で処理された該筋細胞におけるより多くの量は、該因子がＲａｓ／Ｒａｆ／
    Ｍｅｋ／Ｅｒｋ経路を阻害し、従って筋細胞における萎縮を阻害することを示す
    、工程、 を包含する、方法。
  20. 【請求項２０】 骨格筋萎縮を阻害する遺伝子産物をコードする遺伝子を同
    定する方法であって、以下： （ａ）恒常的に活性な変異体形態のＲａｓ／Ｒａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋを発現す
    る筋細胞を調製する工程； （ｂ）試験遺伝子が産物をコードする条件下で、（ａ）の細胞に該試験遺伝子
    を導入する工程； （ｃ）該試験遺伝子をコードする筋細胞における萎縮の量を測定する工程；お
    よび （ｄ）該試験遺伝子をコードする細胞における萎縮の量と工程（ａ）の該試験
    遺伝子が導入されていない筋細胞における萎縮の量とを比較する工程であって、
    ここで、該試験遺伝子をコードする筋細胞における萎縮のより少ない量は、該試
    験遺伝子産物がＲａｓ／Ｒａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋ経路を阻害し、従って筋細胞に
    おける萎縮を阻害することを示す、工程、 を包含する、方法。
  21. 【請求項２１】 前記測定する工程が、筋細胞直径、タンパク質量、ｐ７０
    Ｓ６キナーゼ活性化またはＰｈａｓ−１活性化を利用する、請求項２０に記載の
    方法。
  22. 【請求項２２】 前記筋細胞が培養細胞である、請求項２０に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記培養細胞が筋芽細胞である、請求項２２に記載の方法
    。
  24. 【請求項２４】 前記筋芽細胞が分化した筋芽細胞である、請求項２３に記
    載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記筋細胞がトランスジェニック生物から得られる、請求
    項２０に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記筋細胞がトランスジェニック生物内にある、請求項２
    ０に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記トランスジェニック生物が、トランスジェニックのハ
    エ、蠕虫、鳥類、ニワトリ、シチメンチョウ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウ
    サギ、ヒツジ、ブタ、ヤギまたはウマである、請求項２５に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記トランスジェニック生物が、トランスジェニックのハ
    エ、蠕虫、鳥類、ニワトリ、シチメンチョウ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウ
    サギ、ヒツジ、ブタ、ヤギまたはウマである、請求項２６に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 萎縮誘発状態を有する脊椎動物における萎縮を阻害する方
    法であって、ここで、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭｅｋまたはＥｒｋの有効量のインヒビ
    ターで該脊椎動物を処置する工程を包含する、方法。
  30. 【請求項３０】 前記脊椎動物が、ニワトリ、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ネ
    コ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、霊長類またはヒトである、請求項２９に記載の
    方法。
  31. 【請求項３１】 前記脊椎動物が、前記萎縮誘発状態に曝されるかまたはそ
    の発症の前に処置される、請求項２９に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記萎縮誘発状態が固定されている、請求項２９に記載の
    方法。
  33. 【請求項３３】 前記萎縮誘発状態が、脱神経、飢餓、栄養欠乏、代謝スト
    レス、糖尿病、加齢、筋ジストロフィーまたはミオパシーである、請求項２９に
    記載の方法。
  34. 【請求項３４】 Ｒａｓ／Ｒａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋ経路のインヒビターで細
    胞を処置する工程を包含する、骨格筋細胞における筋肥大を引き起こす方法。
  35. 【請求項３５】 前記インヒビターがＲａｓを阻害する、請求項３４に記載
    の方法。
  36. 【請求項３６】 前記インヒビターがＲａｆを阻害する、請求項３４に記載
    の方法。
  37. 【請求項３７】 前記インヒビターがＭｅｋを阻害する、請求項３４に記載
    の方法
  38. 【請求項３８】 前記インヒビターがＥｒｋを阻害する、請求項３４に記載
    の方法。
  39. 【請求項３９】 前記インヒビターがＰＤ９８０５９またはファルネシルト
    ランスフェラーゼである、請求項３４に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記筋細胞が脊椎動物内である、請求項３４に記載の方法
    。
  41. 【請求項４１】 前記脊椎動物が、ニワトリ、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ネ
    コ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、霊長類またはヒトである、請求項４０に記載の
    方法。
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