JP2003503066A

JP2003503066A - 送達系

Info

Publication number: JP2003503066A
Application number: JP2001506849A
Authority: JP
Inventors: マリアクラツィアピッツア，
Original assignee: カイロンエセ．ピー．アー．
Priority date: 1999-06-25
Filing date: 2000-06-23
Publication date: 2003-01-28
Also published as: WO2001000857A1; EP1194576A1; CA2377534A1; GB9914960D0

Abstract

(57)【要約】本発明は、異種抗原の送達系に関する。本発明において、ｒＲＮＡオペロン内の染色体遺伝子座（例えば、１６Ｓ遺伝子の染色体遺伝子座または２３Ｓ遺伝子の染色体遺伝子座）が、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ細菌の染色体内への核酸の組み込みのために有用な部位として同定された。また、本発明において、このＶｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ細菌における異種抗原の高レベルの発現の指向に特に有用な調節配列が、ＯｍｐＵプロモーターとして同定された。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、異種抗原についての送達系に関する。本発明の１つの局面は、Ｖｉ
ｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅの染色体への核酸の組み込みに有用な染色体遺伝子
座の同定に関する。本発明の別の局面は、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅにお
ける異種抗原の高レベル発現を指向するための、ＯｍｐＵプロモーターの使用に
関する。

【０００２】疾患に対してヒトを防御するための熟考された試みとしてのワクチン接種には
、長い歴史がある。しかし、精巧なワクチン接種技法の開発を可能にした技術を
有したのは、２０世紀後半にすぎない。分子遺伝学の新たな手順の出現によって
、ワクチンを設計するために使用され得る技法の数は、大いに拡大しつつある。

【０００３】ワクチン接種に対する一般的アプローチは、歴史的に、特定の疾患の原因であ
る生物体に由来する生物学的物質を、ヒト被験体に投与することであった。この
ような物質は通常、何らかの様式で弱毒化され、その結果、その物質は実際には
疾患を引き起こさない。弱毒化された外来性タンパク質に対する免疫系によって
備え付けられた体液性応答は、その後の「本物」の感染に対して身体を初回刺激
し、そのようにして重篤な疾患の発生率を減少させる。

【０００４】遺伝子工学における近年の進歩は、ワクチンの候補としての適合性についてス
クリーニングされ得る変異タンパク質の産生を容易にした。首尾良いワクチンの
潜在的な重要性の観点から、多くのグループが、これらの疾患の原因である病原
性因子を解毒することを試みてきた。

【０００５】例えば、腸病原性疾患の場合、哺乳動物の身体において病原性作用をもはや誘
導しないが、構造的にはほとんど改変されていない、弱毒化された非毒性変異腸
毒素が開発された。従って、これらのタンパク質を異物として認識すると、免疫
系は、この弱毒化された毒素に対する特異的抗体を指向する。次いで、これらの
抗体は、生細菌による本当の感染の発生に際して、野生型毒素に対して有効とな
る。Ｋａｓｌｏｗら（１９９２）は、コレラ毒素タンパク質（ＣＴ）のＡｓｐ９
およびＨｉｓ４４を別々に変異させ、そして残基１８０より後のタンパク質を切
り詰めた。これらの変異は、毒素の酵素的活性を弱毒化した。類似の研究が、易
熱性毒素タンパク質（ＬＴ；Ｓｉｘｍａら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５１（
６３２５）：３７１−３７７；Ｔｓｕｊｉら（１９９０），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６５（３６）２２５２０−２２５２５頁；Ｈａｒｆｏｒｄら（１９８９
），ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ１８３（２）３１１−３１６頁）で実施され
ている。

【０００６】百日咳毒素の解毒変異体が、直接的な鼻腔内ワクチン接種のため、および他の
ワクチンについての粘膜アジュバントとしての両方について有用であることが報
告されている（Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９５）ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ６３
（６）２１００−２１０８頁）。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓの
Ａサブユニットにおける既知の解毒変異が、ＣＴにおいて類似の作用を有するこ
とが見出された（Ｂｕｒｎｅｔｔｅら，（１９９１）ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ
５９（１１）４２６６−４２７０頁）。

【０００７】多くの試みが、弱毒化された病原性を有する生株を生成するように、細菌また
はウイルスのタンパク質の機能を直接変更する能力を利用している。このような
「生」ワクチンは、宿主において制限された複製のみを受け得るか、またはこの
ような「生」ワクチンは、解毒されたタンパク質をコードする。通常、広範なス
ペクトルの免疫は、単回接種後に生じ得；この免疫は、生涯にわたって持続し得
る。このようなワクチン接種方法は、高価でありかつ長期間にわたる効力を保証
するために再投与を通常必要とする、精製弱毒化タンパク質を用いる多段階接種
レジメンを超える明白な利点を有する。特に、身体への送達のための抗原精製プ
ロセスは、高価であり、そして多くの場合、タンパク質の変性をもたらし得る。

【０００８】弱毒化された「生」ワクチンの使用に付随する種々の問題もまた存在する。代
表的に、これらのワクチンはウイルスに基づいており、そして一般的に可塑性（
ｐｌａｓｔｉｃ）である。従って、複製するウイルスが、より病原性の形態へと
復帰し得、そしてワクチン接種された患者、またはこの患者と接触したヒトにお
いて、有害な反応を引き起こし得る。

【０００９】弱毒化された細菌が、近年、抗原の送達についての候補として研究されている
。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ（ＣＤＶ９０８）の株は、抗原の送達につ
いての有望な候補であるように思われ、そしてこのような株での粘膜免疫化は、
血清抗体を刺激することに加えて、粘膜および細胞に媒介される免疫応答の両方
を誘発するという、さらなる利点を有する。

【００１０】このような株の遺伝的操作は、複数の抗原の同時投与を可能とすべきであり、
このようにして広範なスペクトルの防御を与える。いくつかのグループが、安全
かつ有効な多価の経口ジフテリア−破傷風−百日咳（ＤＴＰ）ワクチンを生成す
る目的で、このアプローチを研究している。現在までに、研究者らによって、Ｓ
．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍにおける破傷風毒素の非毒性免疫原性フラグメントＣ
（ＦｒａｇＣ）の首尾良い発現および防御能力が実証されている（Ｃｈａｔｆｉ
ｅｌｄら、（１９９２）Ｖａｃｃｉｎｅ１０（１）５３〜６０頁；Ｆａｉｒｗ
ｅａｔｈｅｒら、（１９９０）ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ５８（５）１３２３
〜１３２６頁；Ｇａｌｅｎら、（１９９７）Ｖａｃｃｉｎｅ１５（７）７００
〜７０８頁）。

【００１１】Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ細菌は、以前に、腸病原性大腸菌（Ｂｕｔｔ
ｅｒｔｏｎら、１９９５；Ａｃｈｅｓｏｎら、１９９６）およびＳｈｉｇｅｌｌ
ａｓｏｎｎｅｉ（Ｖｉｒｅｔら、１９９６；Ｆａｖｒｅら、１９９６）の志賀
毒素のキャリアとしての適合性について研究された。

【００１２】これらの生経口ワクチンに伴なう１つの問題は、現在までに、ヒト腸における
弱毒化抗原の有効な高レベル発現のための優良なベクターが存在していないとい
うことである。

【００１３】従って、細菌およびウイルスに基づく疾患は、特に開発途上中の世界において
、罹患および死亡の主な原因であり続けている。これらの領域における貧弱な健
康管理および全体的な貧困は、持続的に有効であるために反復投与を必要としな
い、安価で有効なワクチンについての深刻な必要性が存在することを意味する。
このようなワクチンはまた、先進世界において、有意に、予防医療の効力を増加
させ、そして健康管理費用を減少させる。

【００１４】細菌性「生」ワクチン株において到達可能な異種抗原の発現レベルが、ワクチ
ン接種レジメンを最適化するために、そして有効なワクチン接種を保証するため
に、明らかに極めて重要である。ここで本発明者らは、弱毒化された細菌ワクチ
ンの作製を容易にし、そしてこれらの株における異種抗原の発現レベルを改善す
るための系を開発した。

【００１５】（発明の要旨）本発明により、その染色体中の１６Ｓ遺伝子または２３Ｓ遺伝子内の遺伝子座
に挿入された異種タンパク質またはタンパク質フラグメントをコードする核酸を
含む、組換えＶｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ細菌が提供される。

【００１６】この系は、その細菌の生存にとって重要でないことが見出されている部位にお
ける、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅに対して異種のタンパク質の発現を可能
にする、核酸の安定な染色体組み込みに依存する。現在まで問題であると示され
ている現象は、遺伝子が細菌染色体にランダムに挿入された場合に、このことが
しばしば、その増殖速度またはその一般的生存能のいずれかをその細菌がいくら
かの程度損うことを引き起こすことである。このことは、多くの場合において、
異種タンパク質の安定な高レベル発現に適切でない、プラスミドベクターまたは
バクテリオファージベクターの広汎な使用をもたらす。

【００１７】驚くべきことに、ｒＲＮＡオペロン（例えば、１６Ｓオペロンおよび２３Ｓオ
ペロン）が、外来核酸フラグメントの染色体組み込みに特に適切な標的であるこ
とが見出された。これらの部位での外来核酸の挿入は、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌ
ｅｒａｅ細菌の増殖速度または生存能特徴を損うことなく、異種タンパク質の有
効な高レベル発現を可能にすることが見出されている。

【００１８】この遺伝子ターゲッティング方法は、野生型ｒＲＮＡ遺伝子の一部をその遺伝
子の分断された（ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ）コピーで置換することを包含し、その遺
伝子の分断されたコピーにおいて、異種タンパク質をコードする核酸が挿入され
ている。この組み込み事象は、相同組換えによって最も適切に実行され得る。そ
の外来遺伝子は、ターゲッティングされたｒＲＮＡ遺伝子の配列に対応する配列
が隣接して、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ細菌に導入され、それにより、組換えが生じ
るのが可能になる。相同組換えの技術は、当該分野で周知であり、そして例えば
、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）において記載されている。

【００１９】ｒＲＮＡ遺伝子を使用することの利点は、これらの遺伝子が、Ｖ．ｃｈｏｌｅ
ｒａｅのゲノム全域に１つより多くのコピーで存在し、その結果、１コピーの破
壊によりその株の生存能にもその株が感染した宿主にて接着、コロニー形成、そ
して増殖する能力にも影響しないという点である。挿入のために部位特異的組換
えを使用する利点は、挿入部位が周知であり、容易に特徴付けられ得ることであ
る。

【００２０】好ましくは、異種抗原をコードする核酸が、細菌染色体中の２３ＳｒＲＮＡ
オペロンに挿入される。

【００２１】本発明のさらなる局面により、異種タンパク質または異種タンパク質フラグメ
ントをコードする核酸がＯｍｐＵプロモーター（好ましくは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒ
ａｅＯｍｐＵプロモーター）の制御下にクローニングされている組換え細菌が
提供される。このプロモーターは、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅにおける外
来抗原の高レベル発現の導入のための理想的プロモーターとして同定されている
。なぜなら、高レベル発現が、その株の増殖速度または生存能を損うことなく達
成され得るからである。

【００２２】Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅにおけるその天然の状況において、ＯｍｐＵプロモータ
ーは、３８ｋＤａ外膜タンパク質の発現を駆動し、このタンパク質は、本明細書
中で、細胞中で非常に高レベルで発現されることが示されている。好ましくは、
使用されるＯｍｐＵプロモーターは、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅにて見出
される天然のプロモーターであるが、このプロモーターの効力の改善が、反復し
た回数の突然変異および選択により達成され得ることが、認識される。このよう
な方法は、当業者に公知である（例えば、ＬｉｎｇおよびＲｏｂｉｎｓｏｎ、１
９９７、ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ２５４：１５７〜１７８；Ｇｏｒｂら、１
９９７、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：５３９８〜５４０６を参照のこと）
。

【００２３】本発明のさらなる局面によると、異種タンパク質またはタンパク質フラグメン
トをコードする核酸がＯｍｐＵプロモーターの制御下にクローニングされており
、かつＶｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ染色体のｒＲＮＡオペロン内の遺伝子座
に挿入されている、組換え細菌が提供される。遺伝子挿入のための選択的ターゲ
ッティングおよびＯｍｐＵプロモーターの使用のこの組み合わせは、特に高レベ
ルの異種タンパク質発現を、その細菌株の増殖速度または一般的生存能もなお損
うことなく、提供することが見出された。好ましくは、この核酸は、Ｖｉｂｒｉ
ｏｃｈｏｌｅｒａｅ染色体において、１６Ｓ遺伝子または２３Ｓ遺伝子内の遺
伝子座、より好ましくは２３Ｓ遺伝子内の遺伝子座に挿入される。

【００２４】「異種タンパク質または異種タンパク質フラグメント」とは、Ｖ．ｃｈｏｌｅ
ｒａにとって内因性でない、任意のタンパク質またはフラグメントを意味する。
従って、このタンパク質は、任意の供給源に由来し得、そして免疫される宿主被
験体に内因性のタンパク質（例えば、ヒト腫瘍抗原）または付着因子（例えば、
線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、パータクチン（ｐｅｒｔａｃｔｉｎ）または線
毛）でさえあり得る。適切なタンパク質は、免疫原性であり、従って、本発明に
よるＶｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ細菌に故意に感染された哺乳動物宿主にて
発現された場合に、免疫応答を惹起する。従って、最も適切なのは、特に免疫原
性であることが既知であるタンパク質である。この免疫応答は、細胞性応答であ
っても、または体液性応答であってもよい。

【００２５】好ましくは、本発明により産生される異種タンパク質は、既知の病原体（例え
ば、ウイルスおよび細菌）に由来する。

【００２６】１つより多くの異種タンパク質またはタンパク質フラグメントがその染色体中
のｒＲＮＡ遺伝子にターゲッティングされ得ること、および／またはそれらがＯ
ｍｐＵプロモーターの制御下にクローニングされ得ることもまた、認識される。
従って、この様式での複数の抗原の発現は、多数の異なる疾患に対して広汎なス
ペクトルの防御を提供し得る。

【００２７】本発明のさらなる局面によると、本発明の上記の局面のいずれか１つによる組
換え細菌であって、アジュバントとして宿主中で有効である少なくとも１つの異
種タンパク質と、抗原として宿主中で有効である少なくとも１つの異種タンパク
質を発現する、組換え細菌が提供される。

【００２８】特に、２つ、３つ、４つまたはそれより多くの異種タンパク質が、本発明の組
換え細菌にて同時発現され得ることが、認識される。これらのタンパク質のうち
の１つ以上が、アジュバントとして作用し得、一方その他のタンパク質は抗原と
して作用し得る。例えば、ＬＴＫ６３抗原およびＣＴＫ６３抗原（これらは、サ
ブユニットＡの６３位にセリンからリジンへの置換を含む）ならびにＬＴＲ７２
抗原（これは、サブユニットＡの７２位にアラニンからアルギニンへの置換を含
む）は、動物モデル中で粘膜アジュバントとして十分に機能する。従って、異種
タンパク質（例えば、、ＬＴＫ６３遺伝子、ＣＴＫ６３遺伝子および／またはＬ
ＴＲ７２遺伝子）がＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ染色体中ｒＲＮＡ遺伝子標的部位に、
好ましくはＯｍｐＵプロモーターに作動可能に連結されて、挿入され得ることが
、認識される。そのＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ染色体は、すでに他のｒＲＮＡオペロ
ン挿入部位、１つ以上の異種タンパク質（例えば、ＮＡＰおよび／もしくはＣａ
ｇＡ）をコードする遺伝子（単数または複数）を、これもまた好ましくはタンパ
ク質発現を最大にするようにＯｍｐＵプロモーターに作動可能に連結されて含み
得る。この様式で、組換え「生」細菌は、免疫学的能力を保有するのみではなく
、ワクチン因子としてのその効力を増加するための有効なアジュバントとしても
作用する。

【００２９】多くの場合において、その異種タンパク質は、改変されていない場合に宿主に
対して有害であり得、従って、野生型タンパク質の誘導体が使用されるべきであ
る。本明細書中で使用される場合、用語「誘導体」は、例えば、そのタンパク質
の免疫原性を有意には変更しない、アミノ酸の置換、挿入または欠失を含む変異
体を包含する。特に、保存的アミノ酸置換は、一般的には、タンパク質分子の活
性に対してほとんど効果を有さず、特に適切である。Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅ
ｒａｅに対して内因性であるタンパク質（例えば、コレラ毒素タンパク質（ＣＴ
）の誘導体もまた、本発明による使用に適切であると考えられる。

【００３０】タンパク質フラグメントもまた、本発明による細菌における発現に適切である
。これらの分子の利点は、一般的には、これらの分子が有意に減少した毒性を示
すがなおその免疫原性を保持するという点である。最も適切なのは、最も免疫原
性であることが公知のエピトープを含むフラグメント（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍｔｅｔａｎｉ由来の破傷風毒度のフラグメントＣ）である。用語「フ
ラグメント」は、抗原性エピトープを含むかまたは規定する、抗原性ペプチドを
包含する。

【００３１】本発明における使用に適切な異種タンパク質または異種タンパク質フラグメン
トとしてはまた、例えば、以下のタンパク質が挙げられる：Ｅ．ｃｏｌｉの株由
来の易熱性毒素タンパク質、破傷風毒素、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の気管コ
ロニー形成因子（ｔｒａｃｈｅａｌｃｏｌｏｎｉｓａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ
）および百日咳毒素、ＮＡＰ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ由来のＶａｃＡおよびＣａｇＡ
、パピローマウイルス由来のＥ６およびＥ７、ヘルペスウイルス由来のｇＤ２、
ＨＣＶ由来のＥ１コア抗原またはＥ２コア抗原、ＨＩＶ由来のｇｐ１２０、髄膜
炎菌抗原および淋菌抗原、ロタウイルス由来の抗原、インフルエンザウイルス由
来の抗原およびマラリア寄生生物由来の抗原。他の適切な毒素は、当業者に公知
である。

【００３２】異種抗原として本発明に特に適切なのは、好中球活性タンパク質（ＮＡＰ）で
ある。ＮＡＰは、１５ｋＤａサブユニットのホモ１０量体であり、好中球の活性
化および内皮細胞への好中球の接着を促進する。この機能はその細胞内機能に関
連がありそうもないと示唆されていたが、その接着促進（ｐｒｏａｄｈｅｓｉｖ
ｅ）活性は抗血清により中和され得る。好中球活性化および内皮細胞への接着は
、炎症機構を構成するので、そしてＨ．ｐｙｌｏｒｉは胃の炎症の原因であるの
で、おそらく、胃の表面粘膜における好中球の豊富な蓄積が観察される胃潰瘍疾
患の初期段階において、ＮＡＰは、炎症の原因であるＨ．ｐｙｒｏｌｉの因子、
または一因を示す。この理由により、ＮＡＰは、生細菌ワクチンにおける使用に
理想的な候補である。

【００３３】本発明により発現される異種タンパク質は、毒素または毒素誘導体であり得る
。本明細書中で使用される場合、用語「毒素」は、宿主動物に対して毒性である
病原体により産生される任意のタンパク質をいい、合成であってもまたは天然に
由来（例えば、細菌またはウイルスに由来）してもよい。好ましくは、細菌病原
体由来の毒素が、本発明に従って使用される。

【００３４】毒素は、本発明による使用に特に適切である。なぜなら、その毒素に対して惹
起される任意の免疫応答が、認識されるエピトープを有する毒素を発現する細菌
を根絶するだけでなく、その細菌自体がその免疫系により殺傷されてしまう前に
その細菌から分泌されるその毒素タンパク質の任意のコピーを中和（ｔｉｔｒａ
ｔｅ）するからである。

【００３５】腸内細菌の毒素タンパク質は非常に詳細に研究されており、そして異なる病原
体種由来の多くの公知の毒素の解毒化された変異体（トキソイド）を生成する方
法が公知である。用語「トキソイド」が本明細書中で使用される場合、解毒化さ
れた変異体毒素タンパク質をいう。

【００３６】用語「解毒化」とは、その変異体分子が野生型タンパク質と比較して低下した
毒性を、宿主中で示すことを意味する。毒性は、完全に排除される必要はないが
、感染した被験体において有意な副作用を引き起こすことなく、有効な免疫原性
組成物にて使用されるに十分低くなければならない。

【００３７】毒性は、いくつかの方法のうちの１つを使用して測定され得る。このような方
法としては、マウス細胞またはＣＨＯ細胞における毒性の試験、あるいはＹ１細
胞において誘導される形態学的変化の評価が挙げられる。好ましくは、毒性は、
ウサギ回腸ループアッセイにより評価される。好ましくは、トキソイドの毒性は
、Ｙ１細胞にて測定した場合に、その野生型対応物と比較して１０，０００分の
１に減少しているか、または回腸ループアッセイにより測定した場合は１０分の
１より減少している。

【００３８】組換えＤＮＡ方法論の現在の従来技術を使用して、ランダムに指向された変異
または合理的に指向された変異を、毒素分子のアミノ酸配列に導入し、トキソイ
ド性分子を生成し得る。好ましくは、部位特異的変異誘発（ＳＤＭ）によって変
異が導入される。現在、当業者に公知のＳＤＭの多くの技術が存在し、それらの
技術としては、ＰＣＲを使用して（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒｃｌｏｎｉｇ，Ａｌａｂｏｒａｔｏｙｍａｎｕａｌ．（１９８９
）第２版．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰ
ｒｅｓｓに記載されるように）か、または市販のキットを使用する、オリゴヌク
レオチド指向的変異誘発が挙げられる。

【００３９】本発明のこの局面における使用に適した、多くの毒素のコード遺伝子は、当該
分野で公知である。Ｅ．ｃｏｌｉの種々の腸管毒株由来の毒素Ａサブユニットお
よび毒素Ｂサブユニットの配列を総説する、Ｄｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉら、（１９
９５）Ｍｏｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌ１５（６）、１１６５−１１６７頁）によ
る決定的な参考文献に特に注意のこと。

【００４０】例えば、有意に免疫原性を減少することなく解毒効果を有する、毒素（例えば
、ＬＴ毒素およびＣＴ毒素）の任意のサブユニットのアミノ酸配列における任意
の改変（本明細書中でＬＴ−ＡおよびＣＴ−Ａと呼ばれる）は、本発明の使用に
適切である。免疫原性の解毒化されたタンパク質は、野生型の天然に存在する毒
素と実質的に同じ構造的なコンフォメーションを選択し得る。それは免疫学的に
活性であり、そして野生型毒素に対する抗体と交差反応し得る。

【００４１】ＣＴ−ＡおよびＬＴ−Ａについて、Ｖａｌ−５３、Ｓｅｒ−６３、Ｖａｌ−９
７、Ａｌａ−７２、Ｔｙｒ−１０４、またはＰｒｏ１０６に対応する位置での、
またはその位置における、任意の挿入変異、置換変異または欠失変異が、所望の
効果を有する。好ましくは、その変異は、異なるアミノ酸への置換である。好ま
しい置換としては、Ｖａｌ−５３−Ａｓｐ、Ｓｅｒ−６３−Ｌｙｓ、Ａｌａ−７
２−Ａｒｇ、Ｔｙｒ−１０４−Ｌｙｓ、またはＰｒｏ１０６−Ｓｅｒが挙げられ
る。

【００４２】必要に応じて、ＣＴトキソイドまたはＬＴトキソイドは、他の変異を含み得る
。他の変異としては、例えばＡｒｇ−７、Ａｓｐ−９、Ａｒｇ−１１、Ｈｉｓ−
４４、Ａｒｇ−５４、Ｓｅｒ−６１、Ｈｉｓ−７０、Ｈｉｓ−１０７、Ｇｌｕ−
１１０、Ｇｌｕ−１１２、Ｓｅｒ−１１４、Ｔｒｐ−１２７、Ａｒｇ−１４６ま
たはＡｒｇ−１９２のうちの１以上での置換が挙げられる。これらの変異は、上
記のアッセイによって測定された場合、完全に非毒性であるか、または低い残留
毒性を有すると測定された。

【００４３】特に適切なものは、Ｅ．ｃｏｌｉの易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）の変異体
であり、具体的には、置換Ｓｅｒ−６３−Ｌｙｓを含む変異体（ＬＴＫ６３）で
ある。

【００４４】野生型のタンパク質配列を置換するアミノ酸残基（単数または複数）は、天然
に存在してもよいし、または合成であってもよい。好ましい置換は、タンパク質
の構造的な完全性を可能な限り保持すると同時に毒素の両性および／または親水
性を変更する、置換である。このようなアミノ酸は、野生型残基と同様な立体的
な効果を有する。

【００４５】好ましくは、ＣＴに関して、使用される変異はＳｅｒ−６３−Ｌｙｓ（本明細
書中では、ＣＴＫ６３）であり、そしてＬＴについては、使用される変異はＳｅ
ｒ−６３−Ｌｙｓ（本明細書中では、ＬＴＫ６３）である。

【００４６】本発明における使用のための細菌Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ株の選択は
、インビトロで容易に培養され得る任意の株を含み、そしてどのような目的が望
まれるのかに依存する。例えば、高レベルの発現がタンパク質精製の目的のため
に必要とされる場合、高レベルの産生株が使用される。より通常には、目的は、
ヒトにおいて特定の病原体からの感染を予防するために有効である、生ワクチン
を生成することである。このシナリオにおいて、弱毒化Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌ
ｅｒａｅ株が使用されるべきである。

【００４７】Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅの弱毒化株は、ヒト腸に効果的だが安全にコ
ロニー形成し、そして高殺菌活性または高ウイルス活性を有する抗体を生成する
。このような「生きた」株は、弱毒化した病原性を保持し、そして宿主における
増殖が制限され得るか、または解毒されたタンパク質をコードするかのいずれか
であり得る。一般に、広いスペクトルの免疫が、１度の接種後に生じ得る。この
免疫は、生涯持続し得る。

【００４８】本明細書中で使用される場合、用語「弱毒化」は、細菌株の毒性が、哺乳動物
において無視できるレベルまで減少されることを意味する。このような株は生存
し、正常な生活環であり、さらに非毒性の変異したタンパク質または変異体タン
パク質フラグメントを分泌する。従って、宿主は、野生型（非弱毒化）株と関連
した病原性症状いずれにも苦しまないが、宿主の免疫系は、なお細菌性因子によ
って発現された外来タンパク質に曝露されている。好ましくは、本発明における
使用に適切な細菌株は、天然にて弱毒化されている細菌である。

【００４９】この状況において、抗原提示のための生きたベクターとしての使用に特に適し
た株は、ＩＥＭ１０１株であり、「Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄｃｈｏｌｅｒａｅ
ｓｔｒａｉｎｓ」と題された共有に係る同時係属中の欧州特許出願第９８３０５
０６０．０号の主題である。この株は多数で小腸に到達し、そしてコロニー形成
する。この細菌は、粘液層に浸透可能であり、そして粘膜上皮に付着可能である
。このことは、これらが免疫応答を成功裡に誘発することを示す。

【００５０】本発明のさらなる局面に従って、薬学的に受容可能なキャリアと共に、本発明
の上記の局面のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの組換え株を含む免疫原性組成物が提供さ
れる。

【００５１】薬学的に受容可能なキャリアとしては、この組成物を受ける個体に有害な抗体
の産生をそれ自体は誘導しない、任意のキャリアが挙げられる。適切なキャリア
は、代表的には大きく、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、多
糖、ポリ乳酸、グリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質
凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）および不活性ウイルス粒子）である。
このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは免疫
刺激因子（アジュバント）として機能し得る。

【００５２】その組成物は、ワクチンとして使用され得、従って必用に応じてアジュバント
を含み得る。

【００５３】本発明に従う免疫原性組成物の有効性を増強するために、適切なさらなるアジ
ュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）易熱性
毒素タンパク質または百日咳毒素タンパク質の非毒性変異体（例えば、Ｔｓｕｊ
ｉら、（１９９０）；Ｈａｒｆｏｒｄら、（１９８９）およびＲｏｂｅｒｔｓら
（１９９５）に記載される）；（２）水中油エマルジョン処方物（他の特異的免
疫刺激因子（例えば、ムラミルペプチド（以下参照のこと）または細菌細胞壁成
分）を含むか、または含まない）であって、これらとしては、例えば以下が挙げ
られる：（ａ）マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｉｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（
例えば、Ｍｏｄｅｌ１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉ
ｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ））を使用してミクロン以下の粒子へと処方され
た、ＭＦ５９（５％Ｓｑｕａｌｅｎｅ、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．
５％Ｓｐａｎ８５（種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）必要に応じ
て含むが、必要ではない）を含む）を含むがこれらに限定されない、ＰＣＴ公開
番号ＷＯ９０／１４８３７に記載される処方物，（ｂ）１０％Ｓｑｕａｌｅｎ
ｅ、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ
−ｂｌｏｃｋｅｄ）ポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこ
と）を含むＳＡＦであり、ミクロン以下のエマルジョンにマイクロフルイダイズ
された（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｄ）か、またはより大きな粒子サイズのメ
マルジョンを生成するようにボルテックスされたかのいずれかである，ならびに
（ｃ）２％Ｓｑｕａｌｅｎｅ、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、および１以上の細菌
細胞壁成分（モノホスホリルリピド（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）
Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷ
Ｓ）からなる群より選択され、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^TM））を
含む、Ｒｉｂｉ^TMアジュバント系（ＲＡＳ）、（ＲｉｂｉＩｍｍｕｎｏｃｈｅ
ｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）；（３）サポニンアジュバント（例えば、Ｓｔｉ
ｍｕｌｏｎ^TM（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＢｉｏｓｃｉｅｎｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ
，ＭＡ）またはそれから生成される粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体
）が使用され得る））；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不
完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インタ
ーロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、Ｉ
Ｌ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）
、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）な
ど）；ならびに（６）免疫刺激因子として作用し、この組成物の有効性を増強す
る他の物質。

【００５４】上記のような、ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−ス
レオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラニ
ル−１−アラニル−ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラニ
ル−ｌ−アラニル−ｄ−イソグルタミニル−ｌ−アラニン−２−（１’−２’−
ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチル
アミン（ＭＴＰ−ＰＥ）など、が挙げれるが、これらに限定されない。

【００５５】本発明のさらなる局面に従って、ワクチン組成物を処方するためのプロセスで
あって、本発明の上記の局面に従う組換え細菌を薬学的に受容可能なキャリア、
必要に応じてアジュバントを共に、組み合わせる工程を包含するプロセスが提供
される。

【００５６】本発明のなおさらなる局面に従って、疾患に対して哺乳動物をワクチン接種す
る方法であって、その疾患の原因である病原体に関連した抗原を発現する本発明
の上記の局面に従う細菌の調製物を投与する工程を包含する、方法が提供される
。

【００５７】本発明のさらなる局面に従って、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅに対して異
種であるタンパク質またはタンパク質フラグメントをコードする配列に隣接する
、ｒＲＮＡオペロンの５’および３’領域に由来する配列を含む核酸が提供され
る。このような核酸は、本発明の上記の局面に従う組換えＶｉｂｒｉｏｃｈｏ
ｌｅｒａｅ細菌の生成に有用である。ｒＲＮＡオペロンに由来する配列は、異種
タンパク質またはタンパク質フラグメントをコードする核酸がｒＲＮＡ配列に隣
接する、分断（ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ）バージョンについて、内因性ｒＲＮＡオペ
ロンの置換を生じる相同組換え事象が生じることを可能にする。好ましくは、ｒ
ＲＮＡオペロンは、１６Ｓ遺伝子または２３Ｓ遺伝子のいずれかである。本発明
のこの局面の最も好ましい実施形態において、異種タンパク質またはタンパク質
フラグメントをコードする核酸が、ＯｍｐＵプロモーターの制御下にクローニン
グされる。

【００５８】本発明のなおさらなる局面に従って、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅに対し
て異種であるタンパク質またはタンパク質フラグメントをコードする核酸に作動
可能に連結されたＯｍｐＵプロモーターを含む核酸が提供される。用語「作動可
能に連結された」は、プロモーターの下流にクローニングされた異種タンパク質
をコードする核酸の発現を駆動するのに必要な必須の制御配列をそのプロモータ
ーが含むことを意味する。

【００５９】本発明のなおさらなる局面に従って、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅに対し
て異種であるタンパク質またはタンパク質フラグメントをコードする核酸に作動
可能に連結されたＯｍｐＵプロモーターを含む核酸であって、その核酸が、Ｖｉ
ｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅｒＲＮＡ遺伝子（好ましくは、１６Ｓまたは２３
Ｓ遺伝子）の５’および３’領域に由来する配列に隣接される、核酸が提供され
る。

【００６０】本発明のこれらの局面の核酸は、プラスミドまたはバクテリオファージのよう
なベクターに組み込まれ得る。任意の適切なベクターは、当業者に明らかなよう
に、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ細菌の形質転換に使用され得る。特に適切
なベクターには、本研究において使用される、ＣＶＤ４２２（これは、宿主細胞
において複製し得ない）が含まれる。

【００６１】本発明のさらなる局面に従って、異種タンパク質またはタンパク質フラグメン
トをコードする核酸をＶｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ細菌の染色体に挿入する
ための位置としての、ｒＲＮＡオペロンの使用が提供される。好ましくは、ｒＲ
ＮＡオペロンは、１６Ｓ遺伝子かまたは２３Ｓ遺伝子のいずれかである。

【００６２】本発明はまた、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ細菌における異種抗原の発現
のためのＯｍｐＵプロモーターの使用を提供する。

【００６３】本発明のさらなる局面に従って、ｒＲＮＡオペロンにおける染色体遺伝子座、
好ましくは、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ細菌における１６Ｓまたは２３Ｓ
ＲＮＡ遺伝子へ、タンパク質またはタンパク質フラグメントをコードする核酸
をターゲッティングする工程を包含する、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ細菌
における異種タンパク質または異種タンパク質フラグメントの発現の方法が提供
される。

【００６４】本発明はまた、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ細菌における異種タンパク質
または異種タンパク質フラグメントの発現の方法が提供され、この方法は、その
異種タンパク質またはタンパク質フラグメントをコードする核酸をＯｍｐＵプロ
モーターの制御下にクローニングする工程を包含する。

【００６５】本発明のなおさらなる局面にしたがって、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ細
菌における異種タンパク質または異種タンパク質フラグメントの発現の方法が提
供され、この方法は、タンパク質またはタンパク質フラグメントをコードする核
酸を、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ細菌におけるｒＲＮＡオペロンにおける
染色体遺伝子座（好ましくは、１６Ｓまたは２３ＳＲＮＡ遺伝子）にターゲッテ
ィングする工程、およびその異種タンパク質またはタンパク質フラグメントをコ
ードする核酸を、ＯｍｐＵプロモーターの制御下で発現させる工程を包含する。

【００６６】本発明のさらなる局面に従って、疾患に対して哺乳動物をワクチン接種する方
法が提供され、この方法は、上記の本発明の局面にしたがって、その疾患の原因
である病原体と関連する異種タンパク質または異種タンパク質フラグメント発現
する組換え細菌の調製物を投与する工程を包含する。

【００６７】本発明の細菌によって感染されるための宿主は、ヒトである；ヒトは、Ｖ．ｃ
ｈｏｌｅｒａｅによる感染に対して感受性の唯一の生物体である。

【００６８】本明細書において言及された全ての文献は、本明細書において参考として援用
される。

【００６９】本発明の種々の局面および実施形態は、例示としてここにより詳細に記載され
る。詳細の改変は、本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることは理解さ
れる。

【００７０】（実施例）本発明の実施は、そうでないと明記されない限り、分子生物学、微生物学、組
換えＤＮＡ、および免疫学の従来的な技術を利用し、これらは、当業者の技術範
囲内である。このような技術は、文献において十分に説明される。例えば、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ；ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，
ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；ＤＮＡＣ
ｌｏｎｉｎｇ，ＶｏｌｕｍｅｓＩａｎｄｉｉ（Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５
）；ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇａｉｔ編、１９
８４）；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｈａｍｅｓ
＆Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄＴｒ
ａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｈａｍｅｓ＆Ｈｉｇｇｉｎｓ編１９８４）；Ａｎｉｍａ
ｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編１９８６）；Ｉｍｍｏｂ
ｉｌｉｚｅｄＣｅｌｌｓａｎｄＥｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬＰｒｅｓｓ，１
９８６）；ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｐｅｒｂａｌ，１９８４）；ｔｈｅＭｅｔｈｏｄｓｉ
ｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．
）、特に、１５４および１５５巻；ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒ
ｓｆｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ（Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｃａｌｏｓ編、
１９８７、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）；
ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓｉｎＣｅｌｌａｎｄＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ＆Ｗａｌｋｅｒ編，１９８７）
；ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ
Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｓｃｏｐｅｓ，１９８７）；ＨａｎｄｂｏｏｌｏｆＥ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＶｏｌｕｍｅｓＩ−ＩＶ（Ｗ
ｅｉｒ＆Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）。

【００７１】（実施例１：ＶｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅのリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ
）１６Ｓおよび２３Ｓをコードする遺伝子の増幅およびクローニング）リボソームＲＮＡ１６Ｓおよび２３Ｓ遺伝子（ｒＲＮＡ１６ＳおよびｒＲ
ＮＡ２３Ｓ）は、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａの染色体に沿って９個のコピーが存在す
る。本発明者らは、異種抗原をコードする遺伝子を挿入するための染色体遺伝子
座としてそれらを同定した。ＧｅｎｅＢａｎｋからのデータベースを使用して、
１６ＳｒＲＮＡおよび２３ＳｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列を、登録番
号Ｘ７４６９６およびＵ１０９５６をそれぞれ使用して同定した。その２つの遺
伝子のそれぞれの５’末端および３’末端をそれぞれ含む２つのフラグメントを
、ＰＣＲによって生成した。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の場合、１〜４３４のヌク
レオチドを含むフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチドを使用して増幅した
：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＴＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡ
Ｇ−３’（順方向）（ＸｂａＩ制限部位を含む）および５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣ
ＣＧＴＴＡＡＣＧＴＡＣＴＴＴＡＣＡＡＣＣＣＧＡＡＧＧＣＣ−３’（逆方向）
（ＢａｍＨＩおよびＨｐａＩ制限部位を含む）。１１１６〜１４５５のヌクレオ
チドを含むフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチドを使用して増幅した：５
’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＴＡＣＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＴＴＧＴＴＴＧＣ
ＣＡＧＣＡＣＧＴ−３’（順方向）（ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩ制限
部位を含む）および５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＣＣＧＡＡＧＧＴＴＡＡＡＣ
ＴＡＣＴＧＣＴＴＣ−３’（逆方向）（ＥｃｏＲＩ制限部位を含む）。２３Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子の場合、３３〜３７０のヌクレオチドを含むフラグメントを、以
下のオリゴヌクレオチドを使用して増幅した：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣ
ＡＧＴＣＡＧＡＧＧＣＧＡＴＧＡＧ−３’（順方向）（ＸｂａＩ制限部位を含む
）および５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＧＣＣＣＴＡＣＴＣＧＡＴ
ＴＴＣＡＧ−３’（逆方向）（ＢａｍＨ１およびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む
）。ヌクレオチド７０８〜１０７７を含むフラグメントを、以下のオリゴヌクレ
オチドを使用して増幅した：５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡ
ＡＣＴＧＧＡＧＧＡＣＣＧＡＡＣＣ−３’（順方向）（ＢａｍＨＩ、ＰｖｕＩＩ
、およびＰｓｔＩ制限部位を含む）および５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＴＣＴ
ＴＴＡＡＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＴＴＣＴＡＡＧ−３’（逆方向）（ＥｃｏＲＩ
制限部位を含む）。

【００７２】ｒＲＮＡ１６Ｓ遺伝子の５’および３’領域を含むＤＮＡフラグメントを一
緒に、以下のストラテジーを使用して、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＫＳベクター
にクローニングした：この４３４ｂｐの増幅したフラグメントをＸｂａＩおよび
ＢａｍＨＩを使用して消化し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化したこの増幅
した３３９ｂｐのフラグメントと連結し、そしてＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩで消化し
たＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳにクローニングし、ＢＳ−１６Ｓを生成した。

【００７３】ｒＲＮＡ２３Ｓの５’および３’領域を一緒にＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＫＳ
ベクターに、以下のストラテジーを使用してクローニングした：この３３７ｂｐ
の増幅したフラグメントを、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＢａｍＨＩお
よびＥｃｏＲＩで消化したその増幅した３６８ｂｐのフラグメントと連結し、そ
してＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩで消化したＢｌｕｅｓｃｒｐｔＫＳにクローニングし
て、ＢＳ−２３Ｓを生成した。

【００７４】（実施例２：ｒＲＮＡ２３Ｓ遺伝子においてノックアウトされたＶｉｂｒｉ
ｏ株を構築するために用いられるストラテジー）ＣＶＤ４２２自殺プラスミドを、カナマイシン耐性遺伝子をＶｉｂｒｉｏ染色
体中へ挿入することにより２３Ｓ遺伝子をノックアウトするために用いた。ＣＶ
Ｄ４２２は、選択のために有用なマーカーであるβ−ラクタマーゼ遺伝子および
ＳａｃＢ遺伝子を含む。カナマイシン耐性遺伝子を、ｐＵＣ４Ｋプラスミドから
約１．２ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントとして単離し、そしてＢａｍＨＩで消化
したＢＳ−２３Ｓにクローニングして、組換えＢＳ−２３ＳＫｍ^rプラスミドを
生成した。このＢＳ−２３ＳＫｍ^rプラスミドを、制限酵素ＳａｃＩおよびＥｃ
ｏＲＶで消化し、約２．０ｋｂのフラグメントを、ＳａｃＩ−ＳｍａＩ消化した
ＣＶＤ４２２中にクローニングして、ＣＶＤ−２３ＳＫｍ^rを生成した。このプ
ラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉＳＭ１０（ｐｉｒドナー株）に形質転換し、そして
この組換え株をＩＥＭ１０１レシピエント株（ポリミキシンＢ、ゲンタマイシン
耐性）の接合のために用いた。最初の組換え事象を、細菌をプレートすることに
より選択し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．７５μｇ／ｍｌのポリミキ
シンＢおよび０．７５μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含むＬＢアガー上で接合物
から回収した。第２の組換え事象（ここで、自殺ベクター（ＣＶＤ４２２、Ａｍ
ｐ^r、Ｓｕｃｒｏｓｅ^s）を染色体から欠失させた）を、１０％スクロースを含む
培地上で細菌を２８℃で増殖させることにより選択した。スクロース耐性細菌を
、１５μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充したＬ．Ｂ．アガー上に再プレートした
。染色体上のｒＲＮＡ２３Ｓ遺伝子中に組み込まれたカナマイシン耐性遺伝子
を有する組換えＩＥＭ１０１株（Ａｍｐ^s、Ｓｕｃ^r、Ｋｍ^r）を、ＩＥＭ−２３
ＳＫｍ^rと名付けた。

【００７５】（実施例３：ｒＲＮＡ２３Ｓ遺伝子においてノックアウトされたＩＥＭ１０
１株の特徴付け）リボソーム遺伝子２３Ｓの１コピーの妨害が、ＩＥＭ１０１株とＩＥＭ２３Ｓ
Ｋｍ^rの２つの株の細菌の生存および増殖に影響を及ぼすか否かを評価した。こ
れを行うために、ＩＥＭ１０１および４つのＩＥＭ２３Ｋｍ^r組換え株（１ａ、
１ｂ、２ａおよび２ｂ）を、３７℃で２０ｍｌのＬＢ培地中で、一晩培養物の１
：５０希釈物から開始して増殖させた。サンプルを、増殖の開始時（Ｔ₀）およ
び増殖の３時間後および６時間後に収集した。６００ｎｍでの光学密度（Ｏ．Ｄ
．₆₀₀）を評価し、培養物を希釈し、そして細菌希釈物をＬＢアガー上にプレー
トした。

【００７６】この実験の結果を、図１に示すグラフにプロットした。これらの結果により、
ｒＲＮＡ遺伝子の１コピーのノックアウトは増殖速度に影響を及ぼさないことが
示される。

【００７７】４つのＩＥＭ２３ＳＫｍ^r組換え株においてカナマイシン耐性遺伝子を挿入し
た染色体部位を、サザンブロット分析により特徴付けした。これを行うために、
ＩＥＭ１０１および組換えＩＥＭ２３ＳＫｍ^r １ａ、１ｂ、２ａおよび２ｂ株
に由来する染色体ＤＮＡをＰｖｕＩＩ制限酵素で消化し、そして０．８％アガロ
ースゲル上にロードした。ニトロセルロース膜に転写した後、染色体ＤＮＡを、
Ｋｍ^r遺伝子の標識した５２０ｂｐＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントで
プローブした。この実験の結果により、ＩＥＭ２３ＳＫｍ^r １ａおよび１ｂ株
は同じハイブリダイゼーションパターンを有したこと、そしてこのパターンはＩ
ＥＭ２３ＳＫｍ^r ２ａおよび２ｂ株のパターン（図２）とは異なったことが示
される。このことは、ＩＥＭ２３ＳＫｍ^r １ａおよび１ｂ、ならびにＩＥＭ２
３ＳＫｍ^r ２ａおよび２ｂにおけるカナマイシン耐性遺伝子の挿入が、ｒＲＮ
Ａ２３Ｓ遺伝子の２つの異なるコピー中で生じたことを示す。

【００７８】（実施例４：Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの総細胞抽出物における、高発現タンパク
質としてのＯｍｐＵ外膜タンパク質の同定）ＯｍｐＵプロモーターを以下のように同定した：ＩＥＭ１０１株を５０ｍｌの
Ｌ．Ｂ．培地中で一晩培養物の１：５０希釈物から開始して３７℃で増殖させた
。１ｍｌのサンプルを６．５時間の間にわたり、３０分ごとに収集した。サンプ
ルのＯ．Ｄ．₆₀₀を評価し、そして相対曲線を図３ａにおいて報告する。細菌サ
ンプルを遠心分離し、そしてペレットを、ＰＢＳ中に再懸濁して、Ｏ．Ｄ．₆₀₀
＝２８を得た。各サンプルのうちの１０μｌを、１０％ポリアクリルアミドゲル
にロードした。

【００７９】図３ｂにおいて報告した結果により、約３８ｋＤａのタンパク質が、総細胞抽
出物中に存在する他のタンパク質に対してより多量に発現されることが示された
。このタンパク質は、対数増殖期後期に優先的に高レベルで発現され、増殖の３
時間後で細菌培養物のＯ．Ｄ．₆₀₀が２の時に、最大に達した。

【００８０】タンパク質を同定するために、６時間の増殖に対応するサンプルを１０％ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにロードし、そしてＳｅｑｕｉ−ブロットＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏｒａ
ｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に転写した。オンラインフェニ
ルチオヒダントインアミノ酸分析器（ｓｙｓｔｅｍｇｏｌｄ）を備えたＢｅｃ
ｋｍａｎ配列決定機（ＬＦ３０００）で製造業者に従う自動化配列分析により、
アミノ末端を決定した。推定アミノ末端配列を用いて、ＮＣＢＩＢａｓｉｃ
ＢＬＡＳＴタンパク質データベースをスクリーニングし、そしてＶ．ｃｈｏｌｅ
ｒａｅＯｍｐＵ外膜タンパク質のアミノ末端部分（残基２２〜４１）として同
定した。

【００８１】（実施例５：ＯｍｐＵ外膜タンパク質プロモーター領域の増幅およびｐＧＥＭ
３ベクターにおけるクローニング）ＯｍｐＵ遺伝子に関するヌクレオチド配列を、登録番号Ｕ７３７５１を用いて
ＧｅｎｅＢａｎｋデータベースから得た。このプロモーターおよび上流の調節領
域を配列分析により同定し、そしてヌクレオチド６００〜８２４（ＡＴＧコドン
の直前）に由来するフラグメントを増幅した。以下のオリゴヌクレオチド：

【００８２】

【化１】（制限部位ＢａｍＨＩ、ＨｐａＩおよびＮｒｕＩを含む）およびオリゴヌクレオ
チド

【００８３】

【化２】（制限部位ＢａｍＨＩ、ＨｐａＩ、ＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩを含む）を、増幅
のために用いた。約２８０ｐの増幅フラグメントを、ＢａｍＨＩで消化した。こ
のフラグメントを、ＢａｍＨＩで消化したｐＧＥＭ３ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ
，ＷＩ．ＵＳＡ）にクローニングして、ｐＧＥＭ−ｏｍｐプラスミドを生成した
。

【００８４】（実施例６：ＯｍｐＵプロモーターの制御下でのＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ
ｐｙｌｏｒｉに由来するＮＡＰタンパク質をコードする遺伝子のクローニング）ＮＡＰタンパク質をコードする遺伝子を、プラスミドｐＳＭ２１４Ｇ（Ｒｏｂ
ｅｒｔｏＰｅｔｒａｃｃａ，ＩＲＩＳ，ＣｈｉｒｏｎＳ．ｐ．Ａ．，Ｓｉｅ
ｎａにより提供）から、以下のオリゴヌクレオチド：

【００８５】

【化３】（制限部位ＰｓｔＩおよびＸｈｏＩを含む）および

【００８６】

【化４】（制限部位ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＶを含む）を用いて増幅した。ＮＡＰについ
てのコード配列を含む約４７０ｂｐのこの増幅フラグメントを、酵素ＸｈｏＩお
よびＥｃｏＲＶで消化し、そしてＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＶ消化したｐＧＥＭ−ｏｍ
ｐにクローニングして、ｐ−ｏｍｐＮＡＰプラスミドを生成した。

【００８７】（実施例７：ＩＥＭ−ｏｍｐＮＡＰ組換え株の構築）ＯｍｐＵプロモーターの制御下にあるＮＡＰ遺伝子をＩＥＭ１０１のｒＲＮＡ
２３Ｓ染色体配列に挿入するために、ＯｍｐＵ−ＮＡＰＤＮＡ配列を２３Ｓ
遺伝子の５’および３’領域内にクローニングした。これを行うために、ｐ−ｏ
ｍｐＮＡＰプラスミドを、ＢａｍＨＩで消化し、そしてＢａｍＨＩで消化したｐ
ＢＳ−２３Ｓにクローニングして、ＢＳ−２３ＳｏｍｐＮＡＰプラスミドを生成
した。このプラスミドをＳａｃＩ−ＳａｌＩで消化し、そして得られた１．５ｋ
ｂのフラグメント（ｒＲＮＡ２３Ｓ遺伝子の５’および３’末端に隣接して、
ＯｍｐＵプロモーターの制御下でＮＡＰ遺伝子を含む）を、ＳａｃＩ−ＳａｌＩ
で消化したＣＶＤ４２２ベクターにクローニングして、ＣＶＤ−２３ＳｏｍｐＮ
ＡＰプラスミドを生成した。このプラスミドをＳＭ１０（ｐｉｒドナー株）に形
質転換することにより導入し、そしてこの組換え株をＩＥＭ−２３ＳＫｍ^rレシ
ピエント株（ゲンタマイシン、ポリミキシンおよびカナマイシン耐性）の接合の
ために用いた。

【００８８】接合後、この組換え株（単一の組換え事象から生じ、そして染色体上ｒＲＮＡ
２３Ｓ遺伝子座に組み込まれた組換えプラスミド全体を含む）を、１００μｇ
／ｍｌアンピシリン、０．７５μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび０．７５μｇ／
ｍｌポリミキシンおよび１５μｇ／ｍｌカナマイシンを補充したＬ．Ｂ．アガー
上にプレートすることにより選択した。

【００８９】プラスミド配列の喪失について、従って第２の組換え事象について選択するた
めに、Ａｍｐ、Ｇｍ、Ｐｏｌ、Ｋａｎ耐性組換えコロニーを、１０％スクロース
含有培地中、２８℃で一晩増殖させた。カナマイシン耐性をコードする遺伝子が
ＮＡＰをコードする遺伝子により置換されている細菌を選択するために、スクロ
ース耐性コロニーを、Ｌ．Ｂ．アガー、および１５μｇ／ｍｌカナマイシン補充
Ｌ．Ｂ．アガーの両方にプレートした。カナマイシン感受性コロニー（２３Ｓ遺
伝子に組み込まれたＯｍｐＵ−ＮＡＰ遺伝子を含む）を、ＩＥＭ２３Ｓ−ｏｍｐ
ＮＡＰと名付け、さらなる分析のために用いた。

【００９０】（実施例８：ＩＥＭ−ｏｍｐＮＡＰ株によるＮＡＰタンパク質の発現）ＩＥＭ２３Ｓ−ｏｍｐＮＡＰ株を、経時的実験において生存能、増殖およびＮ
ＡＰ発現について分析し、ＩＥＭ１０１野生型株をコントロールとして用いた。

【００９１】これを行うために、両株の一晩培養物をＢＬ培地で１：２５に希釈し、そして
３７℃で６時間インキュベートした。１ｍｌのサンプルを、３０分ごとに収集し
た。細菌の生存能を、ＬＢ上に種々のサンプル希釈物をプレートすることにより
分析した。ＮＡＰ発現のレベルを、抗ＮＡＰウサギポリクローナル抗血清を用い
て、０．５ｍｌの培養物からの細菌ペレットを超音波処理すること（３０秒ごと
に７インパルスを４回）によって得た細胞の可溶性画分１０μｌのウェスタンブ
ロット分析により評価した。

【００９２】この実験の結果を、図４および５において報告する。図４に示されるように、
増殖速度は２つの株（ＩＥＭ１０１およびＩＥＭ−ｏｍｐＮＡＰ）で同一であっ
た。このことは、ＯｍｐＵプロモーターの制御下でのＮＡＰ遺伝子挿入が、その
株の生存能に影響を及ぼさないことを示す。さらに、図５に示されるように、Ｎ
ＡＰ発現のレベルは、増殖の最初の２時間の間で非常に高く、５時間で減少し、
続いて６時間で増加した。

【００９３】Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅは、その十量体形態（同時係属中の国際特許
出願ＰＣＴ／ＩＢ９９／００６９５を参照のこと）でＮＡＰタンパク質を生成し
得ることが以前に示されている。ＮＡＰがＨ．ｐｙｌｏｒｉにおいて十量体とし
て産生されることもまた公知である（ＤｏｙｃｅおよびＥｖａｎｃｅ（１９９５
）ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ，６３：２２１３−２２２０）。Ｖｉｂｒｉｏによ
り発現されたＮＡＰが、ＯｍｐＵプロモーターにより発現を調節した場合ですら
なお十量体を形成し得るか否かを確認するために、可溶性画分を非還元かつ非変
性条件下のウェスタンブロットにより分析した。

【００９４】これを行うために、５０ｍｌの一晩培養物から得られた細菌ペレットを、１ｍ
ｌのＰＢＳ中に再懸濁し、そして超音波処理した。１０ｍｌの超音波処理物質を
、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに、非還元（ジチオスレイトールなし）および非変性（
加熱なし）の両方の条件下でロードし、そしてウェスタンブロットにより分析し
た。図６に報告された結果は、これらの条件下で、ＮＡＰ抗原がＳＤＳポリアク
リルアミドゲルにおいて１５０ｋＤタンパク質（十量体形態に対応する）として
移動することを示す。

【００９５】（実施例９：ＩＥＭｎｉｒＮＡＰ株の構築）嫌気条件によって誘導性のＥ．ｃｏｌｉｎｉｒＢプロモーターの制御下でＮ
ＡＰ抗原を発現する、組換えＩＥＭｎｉｒＮＡＰ株を、記載のように獲得した。
このｎｉｒＢプロモーターを、以下のオリゴヌクレオチド：５’−ＣＧＣＧＧＡ
ＴＣＣＧＴＴＡＡＣＴＣＧＣＧＡＧＡＡＴＴＣＡＧＧＴＡＡＡＴＴ−３’（順方
向）（ＢａｍＨｉ、ＨｐａＩ、ＮｒｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含む）およ
び５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＴＴＡＡＣＧＡＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＡＧＡＡ
ＡＧＴＣＴＣＣＴＧＴ−３’（逆方向）（ＢａｍＨＩ、ＨｐａＩ、ＥｃｏＲＶお
よびＸｈｏＩ制限部位を含む）を使用する、ｐｎｉｒ１００プラスミドからのＰ
ＣＲによって増幅した。この増幅された１４０ｂｐのＤＮＡフラグメントを、Ｂ
ａｍＨＩで消化し、そしてｐＧＥＭ３ベクターにクローニングして、ｐＧＥＭｎ
ｉｒプラスミドを得た。このプラスミドをＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、
そしてＮＡＰ遺伝子（以前に記載される）を含むＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＶフラグメ
ントに連結して、ｐｎｉｒＮＡＰプラスミドを生成した。このプラスミドをＢａ
ｍＨＩで消化し、そしてｎｉｒＢプロモーターの制御下にＮＡＰ遺伝子を含む、
この得られた６１０ｂｐのＤＮＡフラグメントを、ＢａｍＨＩで消化したＢＳ−
２３Ｓ（以前に記載される）と連結させて、ＢＳ−２３ＳｎｉｒＮＡＰプラスミ
ドを生成した。このプラスミドをＳａｃＩおよびＳａｌＩで消化し、そしてｒＲ
ＮＡ２３Ｓ遺伝子の５’末端および３’末端が隣接するｎｉｒＮＡＰ遺伝子を含
む、この生成された１５００ｂｐのＤＮＡフラグメントを、ＳａｃＩおよびＳａ
ｌＩで消化したＣＶＤ４４２ベクターに連結し、ＣＶＤ２３Ｓ−ｎｉｒＮＡＰを
生成した。このプラスミドを、ＳＭ１０λｐｉｒ株に形質転換し、そして接合に
よってＩＥＭ２３ＳＫｍ^r株に導入した。相同組換えから生じる組換え株を、上
記の選択を使用して単離した。２３ＳｒＲＮＡ遺伝子に組み込まれたｎｉｒＢ
−ＮＡＰ遺伝子を含有する、このカナマイシン感受性株を、ＩＥＭ２３Ｓ−ｎｉ
ｒＮＡＰと名付けた。

【００９６】（実施例１０：２つの異なるプロモーター：ＯｍｐＵおよびｎｉｒＢによって
発現が駆動される場合のＮＡＰのレベルの比較）以前の研究により、ｎｉｒＢプロモーターがＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅにおいて強
力なプロモーターであることが示された。本発明者らは、２つの株ＩＥＭｏｍｐ
ＮＡＰおよびＩＥＭｎｉｒＮＡＰによって産生されるＮＡＰの量を分析すること
によって、ｎｉｒＢプロモーターの活性を、ＯｍｐＵプロモーターの活性と比較
した。これら２つの株は、それぞれ、ＯｍｐＵプロモーターまたはｎｉｒＢプロ
モーターの制御下でＮＡＰをコードする遺伝子を含む。これらの株を、エアレー
ションを行いながら３７℃で一晩培養した。これらの培養物を、５０倍希釈し、
そしてＩＥＭｏｍｐＮＡＰ株については好気条件下、３７℃で２時間増殖させ、
またＩＥＭｎｉｒＮＡＰ株については低いエアレーション下で３７℃で４時間増
殖させた。これらの培養物を遠心分離し、そして細菌ペレットを、約１０¹⁰細胞
／ｍｌを得るようにＰＢＳ中に再懸濁した。１５μｌの各調製物を、１５％ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル上にロードし、そして抗ＮＡＰウサギモノクローナ
ル抗血清を使用する、ウエスタンブロット分析によってＮＡＰの存在について分
析した。図７に報告されるような、これらの結果は、ＮＡＰ抗原の発現レベルは
、発現がＯｍｐＵプロモーターによって駆動された場合に、ｎｉｒＢプロモータ
ーと比較して、有意により高かったことを示す。

【００９７】（実施例１０：マウスの免疫）ＩＥＭｏｍｐＮＡＰ株およびＩＥＭｎｉｒＮＡＰ株によってそれぞれ誘導され
る抗ＮＡＰ免疫応答を評価するために、ＢａｌｂＣマウス（各グループ８匹のマ
ウス）を、０日目、２８日目、４２日目および５６日目に１０⁸の生細菌で鼻内
的に免疫した。コントロール動物を、１０μｇの精製ＮＡＰ単独でかまたはアジ
ュバントとして１μｇのＣＴＫ６３と組み合わせた１０μｇの精製ＮＡＰで免疫
した（これらの場合において、各グループは５匹のマウスを含んだ）。動物を、
０日目、２７日目、４１日目、５５日目に採血し、そして７０日目に採血を完了
した。さらに、７０日目に、胆汁を回収し、そして鼻洗浄を行った。

【００９８】（実施例１１：抗ＮＡＰ抗体を測定するためのＥＬＩＳＡ）各免疫後のマウスの血清中の抗ＮＡＰＩｇ抗体応答、またはこの４回の免疫
後の鼻洗浄液および胆汁におけるＩｇＡ抗体応答を、ＥＬＩＳＡによって評価し
た。ＥＬＩＳＡ試験を以下のように行った。９６ウェルプレートの各ウェルに、
１００ｎｇの精製ＮＡＰを添加し（５０μｌ／ウェル）、そしてプレートを４℃
で一晩インキュベートした。次いで、ウェルを、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ−２０（ＰＢＴ）で３回洗浄し、そして３７℃で１時間、１００μｌ／ウェル
のＰＢＳ中の１％ＢＳＡで飽和させた。１００μｌの１：５０希釈の血清また
は胆汁および１００μｌの未希釈鼻洗浄液を添加し、そして段階希釈した。プレ
ートを、３７℃で２時間インキュベートし、そして上記のように洗浄した。全Ｉ
ｇの検出のために、ウェルを、５０μｌの１：１０００希釈のウサギ抗マウスＩ
ｇ（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化）と共に、３７℃で１時間
半インキュベートした。ＩｇＡの検出のために、ウェルを、５０μｌの１：１０
００希釈のビオチン結合体化ヤギ抗マウスＩｇＡ（α鎖特異的）と共に、３７℃
で１時間半インキュベートし、そしてＰＢＴでの洗浄後、５０μｌの１：１００
０希釈のＨＲＰ結合体化ストレプトアビジンを各ウェルに添加し、そしてプレー
トを３７℃で１時間インキュベートした。抗原結合抗体を、ｏ−フェニレンジア
ミン（ＯＰＤ）を基質として添加することによって可視化した。１５分後、この
反応を、最終濃度１Ｍでの５０μｌ／ウェルの１２．５％Ｈ₂ＳＯ₄の添加によ
ってブロックし、そして吸光度を、４９０ｎｍで読み取った。血清におけるＥＬ
ＩＳＡ力価を、免疫前の血清を０．３以上超えるＯＤ_490nmを生じた最終希釈度
の逆数として任意に決定し、一方、粘膜洗浄液および胆汁ＩｇＡ力価については
、免疫前の血清を０．２以上超えるＯＤ_490nmを生じた最終希釈度の逆数として
表した。これらの値を、各プレートにおけるポジティプコントロール血清を使用
して正規化した。

【００９９】図８に示されるように、Ｉｇ抗ＮＡＰ抗体は、ＩＥＭｏｍｐＮＡＰ株で免疫し
たマウス、またはアジュバントとしてのＣＴＫ６３の存在下で精製ＮＡＰで免疫
したマウスにおいてのみ検出可能であった。Ｉｇ免疫応答は、ＩＥＭｎｉｒＮＡ
Ｐ株または精製ＮＡＰ単独で免疫したマウスの血清中に検出されなかった。興味
深いことに、ＮＡＰ抗原を組換え体ＩＥＭ１０１株によってインビボで送達した
場合に誘導された抗ＮＡＰ免疫応答のレベルは、精製タンパク質を粘膜アジュバ
ントの存在下で投与した場合に誘導されたレベルよりも高かった。

【０１００】さらに、４回目の免疫後、ＩｇＡ免疫応答は、ＩＥＭｏｍｐＮＡＰ株で免疫し
たマウスの血清、またはＣＴＫ６３との組み合わせでの精製ＮＡＰで免疫したマ
ウスの血清においてのみ観察され（図９）、一方、ＩＥＭｎｉｒＮＡＰまたは精
製ＮＡＰで免疫したマウスにおいては、ＩｇＡ免疫応答は検出可能でなかった。
ＩｇＡ免疫応答は、各グループのマウスの胆汁および鼻洗浄液（図１０ａおよび
１０ｂ）においてもまた検出され、またこの場合において、このレベルは、マウ
スをＩＥＭｏｍｐＮＡＰまたはＮＡＰおよびＣＴＫ６３で免疫した場合に有意に
より高かった。

【０１０１】（考察）本研究において、本発明者らは、ＩＥＭ１０１が、可溶性形態および十量体形
態の高レベルのＨ．ｐｙｌｏｒｉＮＡＰタンパク質を発現し得、そして興味深
いことに、検出可能な量のＮＡＰもまた、培養上清中に存在することを示した。
さらに、本発明者らは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのＯｍｐＵプロモーターを、外来
抗原の高レベルの発現のための有用なプロモーターとして同定し、そして本発明
者らは、このプロモーターの活性を以前に記載されたＥ．ｃｏｌｉｎｉｒＢプ
ロモーターと比較した。

【０１０２】ＮＡＰ遺伝子を、この２つの異なるプロモーターの制御下のＩＥＭ１０１のｒ
ＲＮＡ２３Ｓ染色体遺伝子座に組み込み、そしてそれらの結果は、ｎｉｒＢプ
ロモーターおよびＯｍｐＵプロモーターの両方が、ＩＥＭ１０１において作動す
るが、タンパク質の量は、ＯｍｐＵプロモーターによって発現が駆動される場合
により高いことを示す。本発明者らは、高レベルの発現が株の増殖速度または生
存能を損うことなく達成され得るので、本発明者が、Ｖｉｂｒｉｏにおける外来
抗原の高レベルの発現を誘導するための理想的なプロモーターを同定したと結論
付け得る。

【０１０３】さらに、驚くことに、ｒＲＮＡオペロンは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅにおける外
来遺伝子の染色体組み込みのための特に適切な標的であることが見い出された。
実際に、この部位での外来核酸配列の挿入（結果として、染色体内に存在するｒ
ＲＮＡの９つのコピーのうちの１つの部分欠失を伴う）は、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ
ｅの増殖速度または生存能特徴を損うことなく、異種抗原の効果的な高レベルの
発現を可能にする。

【０１０４】組換え体株ＩＥＭｏｍｐＮＡＰの免疫学的応答は、鼻内免疫のマウスモデルに
おいて評価した。このＩＥＭｏｍｐＮＡｐ株は、血清Ｉｇおよび粘膜ＩｇＡに対
して最も高い抗体力価を誘発する。ＩＥＭｏｍｐＮＡＰ株によってインビボにて
高レベルで発現された場合のＮＡＰタンパク質による免疫応答刺激は、アジュバ
ントとしてＣＴＫ６３との組み合わせにおける精製ＮＡＰ抗原によって誘導され
る免疫応答よりも良好である。この知見は、発現されたタンパク質の量が、抗体
応答に影響することを示す。実際に、ＩＥＭｏｍｐＮＡＰ株は、より低い量で抗
原を発現するＩＥＭｎｉｒＮＡＰ株よりも、より免疫原性である。

【０１０５】結論として、生きた弱毒化ＩＥＭ１０１Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株は、粘膜表
面での抗原送達の良好なキャリアと考えられ、これは、高力価の全身性のＩｇお
よび分泌性のＩｇＡを刺激し得る。ＩＥＭｏｍｐＮＡＰ組換え株は、Ｖ．ｃｈｏ
ｌｅｒａおよびＨ．ｐｙｌｏｒｉに対する理想的なワクチン候補を表す。

【図面の簡単な説明】

【図１】２３ＳｒＲＮＡ遺伝子のコピーをノックアウトすることは、細菌の増殖速度
に影響を及ぼさない。

【図２】ＩＥＭ２３ＳＫｍ^r １ａおよび１ｂ、ならびにＩＥＭ２３ＳＫｍ^r ２ａおよ
び２ｂにおけるカナマイシン耐性遺伝子の挿入は、ｒＲＮＡ２３Ｓ遺伝子の２
つの異なるコピーにおいて生じる。

【図３】ａ）ＩＥＭ１０１Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ株の増殖曲線。ｂ）ＩＥ
Ｍ１０１増殖の種々の時点でのタンパク質発現。

【図４】２つの株ＩＥＭ１０１およびＩＥＭ−ｏｍｐＮＡＰについての増殖速度の比較
。

【図５】株ＩＥＭ−ｏｍｐＮＡＰにおけるＮＡＰの発現レベル。

【図６】ＮＡＰが、十量体の形態でＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅにおいて発現されることを示
すウェスタンブロット。

【図７】発現がＯｍｐＵまたはｎｉｒＢプロモーターによって駆動されるＮＡＰのレベ
ルの比較。１５％ＳＤＳＰＡＧＥ上にロードされた全細胞抽出物のウエスタン
ブロット。レーン１、精製ＮＡＰ。レーン２、ＩＥＭｏｍｐＮＡＰ。レーン３、
ＩＥＭｎｉｒＮＡＰ。

【図８】血清Ｉｇ抗ＮＡＰ力価。精製ＮＡＰ、精製ＣＴＫ６３と組み合わせた精製ＮＡ
Ｐ、ＩＥＭｏｍｐＮＡＰ、およびＩＥＭｎｉｒＮＡＰ生細菌で免疫化したマウス
の血清における、Ｉｇ抗ＮＡＰ平均力価。

【図９】血清ＩｇＡ抗ＮＡＰ力価。精製ＮＡＰ、ＣＴＫ６３と組み合わせた精製ＮＡＰ
、ＩＥＭｏｍｐＮＡＰ、およびＩＥＭＤＭＩＰｎｉｒＮＡＰ生細菌で免疫化した
マウスの血清における、Ｉｇ抗ＮＡＰ平均力価。

【図１０】粘膜ＩｇＡ抗ＮＡＰ。ａ）精製ＮＡＰ、精製ＮＡＰおよびＣＴＫ６３、ＩＥＭ
ｏｍｐＮＡＰおよびＩＥＭｎｉｒＮＡＰ株で免疫化したマウスの胆汁におけるＩ
ｇＡ抗ＮＡＰの個々の力価。ｂ）精製ＮＡＰ、精製ＮＡＰおよび精製ＣＴＫ６３
、ＩＥＭｏｍｐＮＡＰおよびＩＥＭｎｉｒＮＡＰで免疫化したマウスの鼻洗浄液
におけるＩｇＡ抗ＮＡＰの個々の力価。ａおよびｂにおける黒バーは、平均力価
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 31/12 Ｃ１２Ｒ 1:63 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 ＡＣ１２Ｒ 1:63） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:63）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】組換えＶｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ細菌であって、該細
菌の染色体のｒＲＮＡオペロン内の遺伝子座に挿入されている、異種タンパク質
または異種タンパク質フラグメントをコードする核酸を含む、組換え細菌。
【請求項２】組換えＶｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ細菌であって、Ｏｍ
ｐＵプロモーターの制御下にクローニングされている、異種タンパク質または異
種タンパク質フラグメントをコードする核酸を含む、組換え細菌。
【請求項３】組換えＶｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ細菌であって、Ｏｍ
ｐＵプロモーターの制御下にクローニングされており、かつ該細菌の染色体のｒ
ＲＮＡオペロン内の遺伝子座に挿入されている、異種タンパク質または異種タン
パク質フラグメントをコードする核酸を含む、組換え細菌。
【請求項４】前記ｒＲＮＡオペロンが、１６Ｓ遺伝子または２３Ｓ遺伝子
のいずれかである、請求項１または請求項３に記載の組換え細菌。
【請求項５】前記核酸が、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ染色体の２３
３Ｓ遺伝子内の遺伝子座に挿入されている、請求項４に記載の組換え細菌。
【請求項６】前記Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ細菌が、弱毒化された
細菌である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換え細菌。
【請求項７】前記Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ細菌が、天然にて弱毒
化されている、請求項６に記載の組換え細菌。
【請求項８】前記Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ細菌が、ＩＥＭ１０１
株の細菌である、請求項７に記載の組換え細菌。
【請求項９】前記異種タンパク質または異種タンパク質フラグメントが、
膜タンパク質であるか、または膜タンパク質の部分である、請求項１〜８のいず
れか１項に記載の組換え細菌。
【請求項１０】請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換え細菌であって
、前記異種タンパク質または異種タンパク質フラグメントが、以下であるかまた
はこれらの部分である、組換え細菌：ＮＡＰタンパク質、ヒト腫瘍抗原、または
線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、パータクチンもしくは線毛のような付着因子、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｅｔａｎｉ由来の破傷風毒素のフラグメントＣ、Ｅ
．ｃｏｌｉ株由来の易熱性毒素タンパク質およびその遺伝的に解毒化された誘導
体、髄膜炎菌抗原、淋菌抗原、インフルエンザ抗原、マラリア抗原、破傷風毒素
、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の気管コロニー形成因子または百日咳毒素、Ｈ．
ｐｙｌｏｒｉ由来のＶａｃＡおよびＣａｇＡ、パピローマウイルス由来のＥ６お
よびＥ７、ヘルペスウイルス由来のｇＤ２、ＨＣＶ由来のＥ１コアタンパク質ま
たはＥ２コアタンパク質、ＨＩＶ由来のｇｐ１２０、ＬＴ−ＡおよびＣＴ−Ａ、
ＬＴ変異体ＬＴＫ６３またはＬＴ変異体ＬＴＲ７２、ＣＴ変異体ＣＴＫ６３、あ
るいはこれらの他の改変体。
【請求項１１】請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組換え細菌であっ
て、該細菌は、２以上の異種タンパク質をコードする核酸を含み、該タンパク質
の少なくとも１つはアジュバントとして作用し得、そして少なくとも１つの異種
タンパク質が抗原として作用し得る、組換え細菌。
【請求項１２】薬学的に受容可能なキャリアと共に請求項１〜１１のいず
れか１項に記載の組換え細菌を含む、免疫原性組成物。
【請求項１３】薬学的に受容可能なキャリアと共に請求項１〜１１のいず
れか１項に記載の組換え細菌を含む、ワクチン組成物。
【請求項１４】アジュバントをさらに含む、請求項１３に記載のワクチン
組成物。
【請求項１５】請求項１３に記載のワクチン組成物の処方のためのプロセ
スであって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組換え細菌を、薬学的に受
容可能なキャリアと組み合わせる工程を包含する、プロセス。
【請求項１６】請求項１４に記載のワクチン組成物の処方のためのプロセ
スであって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組換え細菌を、アジュバン
トと組み合わせる工程を包含する、プロセス。
【請求項１７】医薬としての使用のための請求項１〜１１のいずれか１項
に記載の組換え細菌。
【請求項１８】アジュバントとしての使用のための請求項１〜１１のいず
れか１項に記載の組換え細菌。
【請求項１９】ワクチン組成物における、請求項１〜１１のいずれか１項
に記載の組換え細菌の使用。
【請求項２０】被験体における疾患を予防または処置するための方法であ
って、免疫学的に有効な用量の請求項１２または請求項１３に記載の組成物を、
該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２１】Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅに対して異種であるタン
パク質またはタンパク質フラグメントをコードする配列を含む核酸であって、該
核酸は、ｒＲＮＡオペロンの５’領域および３’領域に由来する配列の間に挿入
されており、その結果、該ｒＲＮＡ配列が該異種タンパク質をコードする配列に
隣接する、核酸。
【請求項２２】Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅに対して異種であるタン
パク質またはタンパク質フラグメントをコードする核酸に作動可能に連結された
ＯｍｐＵプロモーターを含む、核酸。
【請求項２３】Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅに対して異種であるタン
パク質またはタンパク質フラグメントをコードする核酸配列に作動可能に連結さ
れたＯｍｐＵプロモーターを含む核酸であって、該核酸は、Ｖｉｂｒｉｏｃｈ
ｏｌｅｒａｅｒＲＮＡ遺伝子の５’領域および３’領域に由来する配列に隣接
されている、核酸。
【請求項２４】前記ｒＲＮＡオペロンが、１６Ｓ遺伝子または２３Ｓ遺伝
子のいずれかである、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項２５】請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の核酸を含む、ベ
クター。
【請求項２６】Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ細菌の染色体内への異種
タンパク質または異種タンパク質フラグメントをコードする核酸の挿入のための
位置としての、ｒＲＮＡオペロンの使用。
【請求項２７】Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ細菌における異種抗原の
発現のための、ＯｍｐＵプロモーターの使用。
【請求項２８】Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ細菌において異種タンパ
ク質または異種タンパク質フラグメントを発現させる方法であって、該タンパク
質またはタンパク質フラグメントをコードする核酸を、該Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏ
ｌｅｒａｅ細菌のｒＲＮＡオペロンにおける染色体遺伝子座へとターゲッティン
グする工程を包含する、方法。
【請求項２９】Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ細菌において異種タンパ
ク質または異種タンパク質フラグメントを発現させる方法であって、ＯｍｐＵプ
ロモーターの制御下に該異種タンパク質または異種タンパク質フラグメントをコ
ードする核酸をクローニングする工程を包含する、方法。
【請求項３０】Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ細菌において異種タンパ
ク質または異種タンパク質フラグメントを発現させる方法であって、該タンパク
質またはタンパク質フラグメントをコードする核酸を、該Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏ
ｌｅｒａｅ細菌のｒＲＮＡオペロンにおける染色体遺伝子座へとターゲッティン
グする工程、およびＯｍｐＵプロモーターの制御下で該異種タンパク質または異
種タンパク質フラグメントをコードする核酸を発現させる工程を包含する、方法
。
【請求項３１】前記ｒＲＮＡオペロンが１６Ｓ遺伝子または２３Ｓ遺伝子
のいずれかである、請求項２６に記載の使用、あるいは請求項２８または請求項
３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】疾患に対して哺乳動物をワクチン接種する方法であって、
該疾患の原因である病原体に関連する異種タンパク質または異種タンパク質フラ
グメントを発現する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組換え細菌の調製
物を投与する工程を包含する、方法。