JP2003503049A - 新規なヒトアミノペプチダーゼである１７８６７ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新しく同定されたヒトアミノペプチダーゼに関する。本発明はまた、アミノペプチダーゼをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はさらに、アミノペプチダーゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドを、アミノペプチダーゼ関連疾患の診断および治療の標的に使用する方法に関する。本発明はさらに、アミノペプチダーゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドを使用して、診断および治療のアゴニストおよびアンタゴニストを同定する、薬物スクリーニング法に関する。本発明はさらに、アミノペプチダーゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドに基づいたアゴニストおよびアンタゴニストを包含する。本発明はさらに、アミノペプチダーゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドを製造する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、新しく同定されたヒトアミノペプチダーゼに関する。本発明はまた
、アミノペプチダーゼをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はさらに
、アミノペプチダーゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドを、アミノペプチダ
ーゼ関連疾患の診断および治療の標的に使用する方法に関する。本発明はさらに
、アミノペプチダーゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドを使用して、診断お
よび治療のアゴニストおよびアンタゴニストを同定する、薬物スクリーニング法
に関する。本発明はさらに、アミノペプチダーゼポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドに基づいたアゴニストおよびアンタゴニストを包含する。本発明はさらに
、アミノペプチダーゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドを製造する方法に関
する。

【０００２】 （発明の背景） プロテアーゼは、細胞周期、分化、プログラム化細胞死、または、癌発達およ
び／または進行に影響を及ぼす他のプロセスの調節因子を不活性化または活性化
することにより癌発生に機能し得る。プロテアーゼ活性および腫瘍進行に関与す
るモデルと一致して、特定のプロテアーゼ阻害剤が、インビトロおよびインビボ
の両方で癌発生の効果的な阻害剤であることが示された。

【０００３】 アミノペプチダーゼ（ＡＰ）は、ポリペプチドおよびタンパク質のアミノ末端
のアミノ酸残基の加水分解を触媒する、広範に分布するエキソペプチダーゼの一
群である。この酵素は、植物および動物組織、真核生物および原核生物、および
分泌および可溶形で見出される。アミノペプチダーゼの生物学的機能は、タンパ
ク質成熟、タンパク質の末端分解、ホルモンレベル調節、および細胞周期制御を
含む。

【０００４】 この酵素は、加齢、癌、白内障、嚢胞性線維症および白血病を含む多くの容態
および疾患に関与している。真核生物では、ＡＰは、イニシエーターメチオニン
の除去に関連している。原核生物では、メチオニンは、メチオニンアミノペプチ
ダーゼにより除去され、次いで、イニシエーターのＮ−ホルミルメチオニンから
Ｎ−ホルミル基が除去され、Ｎ−アセチル化およびＮ−ミリストイル化などのそ
の後の修飾が容易になる。Ｅ．ｃｏｌｉＡＰ−Ａ（ｐｅｐＡ）では、ｘｅｒＢ遺
伝子産物が、不安定なプラスミド多量体の安定化に必要とされる。

【０００５】 ＡＰはまた、ホルモンおよび神経伝達物質などの分泌調節分子の代謝、および
、細胞細胞相互作用の調節にも関与している。哺乳動物細胞および組織では、こ
の酵素は、明らかに、タンパク質分解の終末段階、およびＥＧＦ−誘導細胞周期
制御に必要であり；タンパク質代謝回転および陳旧または欠陥タンパク質の選択
的排除に役割を果たし得る。さらに、この酵素は、飢餓および／または分化中の
アミノ酸およびエネルギーの供給、および栄養のための輸送された外来性ペプチ
ドのアミノ酸への分解に関与する。ロイコトリエンＡ４ヒドロラーゼは、アミノ
ペプチダーゼであり得るので、ＡＰはさらに炎症にも役割を果たし得る。酵素の
工業的使用は、組換え発現タンパク質のアミノ末端の修飾を含む。Ａ．Ｔａｙｌ
ｏｒ（１９９３）ＴＩＢＳ １８：１９９３：１６７〜１７２参照。

【０００６】 様々なアミノペプチダーゼが、ラット腎臓膜の亜鉛アミノペプチダーゼおよび
アミノペプチダーゼＭ；肝臓のアルギニンアミノペプチダーゼ；筋肉のアミノペ
プチダーゼＮ^b；ウシおよび雄ブタ水晶体および腎臓のロイシンアミノペプチダ
ーゼ（ＬＡＰ）；Ｅ．ｏｌｉのアミノペプチダーゼＡ（ｘｅｒＢ遺伝子産物）；
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｙｓｃｌＡＰＥ１／ＬＡＰ４およびアミノペプチダ
ーゼＡ（ｐｅｐ４遺伝子産物）；ａｅｒｏｍｏｎａｓのＬＡＰ；マウス腹水のジ
ペプチダーゼ；ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅおよび雄ブタ肝臓のメチオニンアミノペプチダーゼ；およびｏｃｈｒｏｂａｃ
ｔｒｕｍ ａｎｔｈｏｒｏｐｉＳＣＲＣ Ｃ１−３８のＤ−アミノ酸アミノペプ
チダーゼを含む、多種多様の組織および生物から同定されている。

【０００７】 これらのアミノペプチダーゼの中で、ウシ水晶体ロイシンアミノペプチダーゼ
（ｂｌＬＡＰ）の構造がよく特徴づけられ、大きな前駆体として合成されたホモ
ヘキサマーからなり、各々のモノマーは、大きなローブに３分の２のタンパク質
を含み、小さなローブに３分の１のタンパク質を含む。小さなローブは、Ｎ末端
の１５０残基を含む。おそらく阻害剤ベスタチンの結合部位でもある、全ての推
定活性部位の残基が、Ｃ末端ローブに見出され、Ａｌａ−３３３、Ａｓｎ−３３
０、Ｌｅｕ３６０、Ａｓｐ３３２、Ａｓｐ２５５、Ｇｌｕ−３３４、Ｌｙｓ２５
０、Ａｓｐ２７３、Ｍｅｔ−４５４、Ａｌａ−４５１、Ｇｌｙ３６２、Ｔｈｒ−
３５９、Ｍｅｔ２７０、Ｌｙｓ２６２、Ｇｌｙ３６２およびＩｌｅ−４２１を含
む。

【０００８】 多くのアミノペプチダーゼが、Ｚｎ²⁺またはＣｏ²⁺に特異性を有する二価カチ
オンを必要とする金属酵素であるが；しかし、特定のアミノペプチダーゼの特定
の部位は、容易に、Ｍｎ²⁺およびＭｇ²⁺を利用できる。リガンドＺｎ²⁺に使用さ
れる残基は、Ｈｉｓ Ｈｉｓ ＧｌｕおよびＡｓｐ Ｇｌｕ Ｌｙｓ立体配置を
含む。ベスタチンに加えて、ホウ酸およびホスホン酸、α−メチルロイシンおよ
びイソアミルチオアミドが、大半のアミノペプチダーゼの競合的阻害剤として同
定される。Ａ．Ｔａｙｌｏｒ（１９９３）ＴＩＢＳ １８：１９９３：１６７〜
１７２；Ｂｕｒｌｅｙら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：１１３〜
１４０；Ｔａｙｌｏｒら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：７８４
〜７９０参照。

【０００９】 様々な生物および生物内の様々な組織からのアミノペプチダーゼは、免疫学的
アッセイにより示されたように、高度の一次配列相同性を有する。いくつかの酵
素はまた、非常に類似した動力学的プロフィルを示す。ｂｌＬＡＰと、Ｅ．ｃｏ
ｌｉのアミノペプチダーゼ−Ａの直接的なアミノ酸配列の比較により、アミノお
よびカルボキシ末端および全タンパク質についてそれぞれ１８、４４および３５
％の同一性が示される。比較により、それぞれの領域の４６、６６および６０％
の同一性が示される。Ｂｕｒｌｅｙら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２
４：１１３〜１４０参照。

【００１０】 ウシ水晶体ロイシンアミノペプチダーゼ（ｂｌＬＡＰ）、ウシ腎臓ＬＡＰ、ヒ
ト水晶体および肝臓ＬＡＰ、雄ブタ、水晶体、腎臓および腸ＬＡＰ、プロリン−
ＡＰ、Ｅ．ｃｏｌｉＡＰ−Ａ、ＡＰ−ＩおよびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ｐ
ｅｐＡ遺伝子産物が、亜鉛結合にＡｓｐ Ｇｌｕ Ｌｙｓ残基を利用し、基質結
合にウシＬＡＰについて上記した活性部位アミノ酸立体配置を利用する、亜鉛ア
ミノペプチダーゼファミリーに属すると分類されている。このファミリーは、お
そらくＡｅｒｏｍｏｎａｓＬＡＰも含むが、これは、亜鉛結合にＨｉｓ Ｈｉｓ
Ｇｌｕ、基質結合にＡｒｇを利用する亜鉛プロテアーゼとは区別されると示唆
されている。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓメチオニン−ＡＰは、アミノ末端に２
つのジンクフィンガー様モチーフを含み、ｂｌＬＡＰとほとんど相同性を共有し
ないと特徴づけられている。Ａ．Ｔａｙｌｏｒ（１９９３）ＴＩＢＳ １８：１
９９３年５月：１６７〜１７１；Ｗａｔｔら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６４：５４８０〜５４８７参照。

【００１１】 ロイシンアミノペプチダーゼ発現は、転写レベルで調節され、これはインビト
ロの加齢および／または形質転換水晶体上皮細胞で血清を除去した時に、活性お
よびｍＲＮＡの両方が増強することにより証明されている。さらに、ＬＡＰｍＲ
ＮＡおよびタンパク質は、ヒトＡＣＨＮ腎癌、Ａ５４９肺癌、ＨＳ１５３線維芽
細胞およびＡ３７５メラノーマにおいてインターフェロンγにより誘導される。
発達および増殖による調節も関与する。Ｅ．ｃｏｌｉｐｅｐＮ遺伝子は、嫌気お
よびリン酸飢餓時に転写的に調節される。膜結合ＡＰ−Ｎ（ＣＤ１３）は、系統
限定的に、正常および悪性細胞のサブセットにより、明らかに物理的に別個のプ
ロモーターによる調節により発現される。酵母ｙｓｃＩ産物ＡＰＥ１の発現は、
ｙｓｃＡおよびＰＥＰ４遺伝子産物のレベルに依存している。ＡＰＥ１の合成は
、培地中グルコースレベルに感受性であり、酵母アミノペプチダーゼの活性は、
窒素源として、ペプトンよりむしろ、アンモニアの置換に感受性がある。Ｈａｒ
ｒｉｓら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：６８６５〜６８６９；
Ｊｏｎｅｓら（１９８２）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １０２：６６５〜６７７参照。

【００１２】 従って、アミノペプチダーゼは、薬物作用および開発の主要な標的である。そ
れ故、以前には知られていないアミノペプチダーゼを同定および特徴づける医薬
開発の分野に価値がある。本発明は、以前には同定されていなかったヒトアミノ
ペプチダーゼを提供することにより、当該分野を進展させる。

【００１３】 （発明の要約） 本発明の目的は、新しいアミノペプチダーゼを同定することである。 本発明のさらなる目的は、アミノペプチダーゼ関連疾患の治療および診断に適
用可能なアミノペプチダーゼアッセイにおける試薬または標的として有用である
、新しいアミノペプチダーゼポリペプチドを提供することである。

【００１４】 本発明のさらなる目的は、アミノペプチダーゼ関連疾患の治療および診断に適
用可能なアミノペプチダーゼアッセイにおける試薬または標的として有用であり
、組換え法により新しいアミノペプチダーゼポリペプチドを製造するのに有用で
ある、新しいアミノペプチダーゼポリペプチドに対応するポリヌクレオチドを提
供することである。

【００１５】 本発明の具体的な目的は、アゴニストおよびアンタゴニストとして作用し、新
しいアミノペプチダーゼの発現を調節する化合物を同定することである。

【００１６】 本発明のさらなる具体的な目的は、アミノペプチダーゼ関連疾患の治療および
診断のためにアミノペプチダーゼの発現を調節する化合物を提供することである
。

【００１７】 従って、本発明は、新しいヒトアミノペプチダーゼの同定に基づく。アミノ酸
配列は、配列番号１に示す。ヌクレオチド配列は、配列番号２として示す。

【００１８】 本発明は、配列番号１に示したアミノ酸配列または２０００年４月４日にＡＴ
ＣＣ番号ＰＴＡ−１６４２として米国ＶＡ州２０１１０−２２０９、マナッサス
、１０８０１ユニバーシティー通り、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションに寄託されたｃＤＮＡ（「寄託ｃＤＮＡ」）によりコードされるアミノ酸
配列を有するポリペプチドを含む、単離アミノペプチダーゼポリペプチドを提供
する。

【００１９】 本発明はまた、配列番号２または寄託ｃＤＮＡに示した配列を有する、単離ア
ミノペプチダーゼ核酸分子を提供する。

【００２０】 本発明はまた、配列番号１に示したまたは寄託ｃＤＮＡによりコードされるア
ミノ酸配列に実質的に相同である、アミノ酸配列を有する変異形ポリペプチドを
提供する。

【００２１】 本発明はまた、配列番号２または寄託ｃＤＮＡに示したヌクレオチド配列に実
質的に相同である、変異形核酸配列を提供する。

【００２２】 本発明はまた、配列番号１に示したポリペプチド断片および配列番号２に示し
たヌクレオチド配列、並びに、実質的に相同な前記ポリペプチドまたは核酸の断
片を提供する。

【００２３】 本発明はさらに、本明細書に記載した核酸分子を含む核酸作成物を提供する。
好ましい実施形態において、本発明の核酸分子は、調節配列に作動可能に連結し
ている。

【００２４】 本発明はまた、アミノペプチダーゼ核酸分子およびポリペプチドを発現するた
めのベクターおよび宿主細胞、および特に組換えベクターおよび宿主細胞を提供
する。

【００２５】 本発明はまた、ベクターおよび宿主細胞を製造する方法、および、それらを使
用して、アミノペプチダーゼ核酸分子およびポリペプチドを製造する方法を提供
する。

【００２６】 本発明はまた、アミノペプチダーゼポリペプチドおよび断片に選択的に結合す
る、抗体またはその抗原結合断片を提供する。

【００２７】 本発明はまた、アミノペプチダーゼポリペプチドまたは核酸（ＲＮＡまたはＤ
ＮＡ）の発現または活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する
。

【００２８】 本発明はまた、特にスクリーニングした化合物を使用して、アミノペプチダー
ゼポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するプロセスを提供する。調
節を用いて、アミノペプチダーゼポリペプチドまたは核酸の異常な活性または発
現に関連した容態を治療し得る。

【００２９】 本発明はまた、疾病の診断を含む、生体試料中のアミノペプチダーゼポリペプ
チドまたは核酸分子の活性または有無を決定するアッセイを提供する。

【００３０】 本発明はまた、疾病の診断を含む、ポリペプチドまたは核酸分子の変異の存在
を決定するアッセイを提供する。

【００３１】 またさらなる実施形態において、本発明は、それぞれ本発明の核酸およびポリ
ペプチドのヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を含む、コンピューター解
読手段を提供する。

【００３２】 （発明の詳細な説明） ポリペプチド 本発明は、新しいヒトアミノペプチダーゼの発見に基づく。特に、発現配列タ
グ（ＥＳＴ）は、アミノペプチダーゼ配列に対する相同性に基づいて選択した。
このＥＳＴを使用して、それが含む配列に基づいてプライマーを設計し、これを
使用して、内皮細胞ｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡを同定した。陽性クロー
ンをシークエンスし、重複断片を合わせた。合わせた配列の解析により、クロー
ニングされたｃＤＮＡ分子はアミノペプチダーゼをコードすることが判明した。

【００３３】 従って、本発明は、図１に示した推定アミノ酸配列（配列番号１）を有する、
または寄託ｃＤＮＡ、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１６４２によりコードされるアミノ
酸配列を有する、新しいアミノペプチダーゼに関する。

【００３４】 寄託物は、微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の項目下で維持
される。寄託物は、当業者に便宜として提供され、寄託物が米国特許法第１１２
条で必要とされるという許可ではない。寄託された配列、並びに、前記配列によ
りコードされるポリペプチドは、本明細書に参考として援用し、シークエンスエ
ラーなどの矛盾がある場合には、本出願の記載で制御する。

【００３５】 「アミノペプチダーゼポリペプチド」または「アミノペプチダーゼタンパク質
」は、配列番号１または寄託ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドを意味す
る。しかし、用語「アミノペプチダーゼタンパク質」または「アミノペプチダー
ゼポリペプチド」は、さらに、本明細書に記載した数多くの変異形、並びに、全
長アミノペプチダーゼから得られた断片および変異形を含む。

【００３６】 アミノペプチダーゼが見出される組織および／または細胞は、図５および６に
示した組織を含むがこれに限定されない。これらの組織に加えて、発現はまた、
大腸癌および乳癌および肺癌、特に扁平細胞癌に見出される。

【００３７】 従って、本発明は、単離または精製アミノペプチダーゼポリペプチドおよびそ
の変異形および断片を提供する。

【００３８】 ＢＬＡＳＴ探索に基づいて、インシスリン調節膜アミノペプチダーゼに対する
最も高い相同性が示された。

【００３９】 本明細書に使用したようなポリペプチドは、それが組換えまたは非組換え細胞
から単離された場合に、実質的に細胞物質を含まない場合に、または、それが化
学合成された場合に、化学物質前駆体または他の化学物質を含まない場合に、「
単離」または「精製」されたと言われる。しかし、ポリペプチドは、通常細胞内
で会合していない別のポリペプチドと接続し得、依然として「単離」または「精
製」と考えることができる。

【００４０】 アミノペプチダーゼポリペプチドは、均一に精製できる。しかし、ポリペプチ
ドが均一に精製されていない調製物も、有用であり、単離形のポリペプチドを含
むと考えるものと理解する。重要な特徴は、調製物が、かなりの量の他の成分の
存在下でさえ、所望のポリペプチド機能が可能であることである。従って、本発
明は、様々な程度の純度を包含する。

【００４１】 １つの実施形態において、「実質的に細胞物質を含まない」なる語は、約３０
％未満（乾燥重量で）の他のタンパク質（すなわち混入タンパク質）、約２０％
未満の他のタンパク質、約１０％未満の他のタンパク質、または約５％未満の他
のタンパク質を有するアミノペプチダーゼの調製物を含む。ポリペプチドを組換
え産生する場合、それは、実質的に培養培地も含まないことができ、すなわち、
培養培地は、約２０％未満、約１０％未満、または約５％未満の容量のタンパク
質調製物を示す。

【００４２】 アミノペプチダーゼポリペプチドまた、それが膜調製物の一部である場合、ま
たは、精製され、次いで膜小胞またはリポソームを用いて復元された場合に、単
離されたと考えられる。

【００４３】 「実質的に他の化学物質前駆体または他の化学物質を含まない」なる語は、合
成に関与する化学物質前駆体または他の化学物質から分離された、アミノペプチ
ダーゼポリペプチドの調製物を含む。１つの実施形態において、「実質的に化学
物質前駆体または他の化学物質を含まない」なる語は、約３０％未満（乾燥重量
で）の化学物質前駆体または他の化学物質、約２０％未満の化学物質前駆体また
は他の化学物質、約１０％未満の化学物質前駆体または他の化学物質、または約
５％未満の化学物質前駆体または他の化学物質を有するポリペプチドの調製物を
含む。

【００４４】 １つの実施形態において、アミノペプチダーゼポリペプチドは、配列番号１に
示したアミノ酸配列を含む。しかし、本発明はまた、配列変異形も包含する。変
異形は、生物の同じ遺伝子座によりコードされる実質的に相同なタンパク質、す
なわち対立遺伝子変異形を含む。変異形はまた、生物の他の遺伝子座に由来する
が、配列番号１のアミノペプチダーゼに実質的な相同性を有する、タンパク質も
包含する。変異形はまた、アミノペプチダーゼに実質的に相同であるが、別の生
物に由来するタンパク質、すなわちオルトログを含む。変異形はまた、化学合成
により製造されたアミノペプチダーゼに実質的に相同であるタンパク質も含む。
変異形はまた、組換え法により産生されたアミノペプチダーゼに実質的に相同で
あるタンパク質も含む。しかし、変異体は、本発明より前に開示された全てのア
ミノ酸配列を除外すると理解される。

【００４５】 本明細書に使用したような２つのタンパク質（またはタンパク質領域）は、少
なくとも約６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％、典型的には少なくとも
約８０〜８５％、最も典型的には少なくとも約９０〜９５％またはそれ以上相同
性である場合に、実質的に相同である。本発明に記載の実質的に相同なアミノ酸
配列は、配列番号２に示した配列の核酸配列またはその一部に、以下により完全
に記載したようなストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によ
りコードされる。

【００４６】 ２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一％を決定するために、配列を
、最適に比較するためにアラインさせる（例えば、ギャップを、最適なアライン
メントのために、第一および第二アミノ酸または核酸配列の一方または両方に導
入でき、非相同配列は、比較目的に関して無視できる）。好ましい実施形態にお
いて、比較目的でアラインした参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも
３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さら
により好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、
８０％、または９０％である（例えば、第二配列を、５０２アミノ酸残基を有す
るアミノ酸配列にアラインさせる場合、少なくとも１６５、好ましくは少なくと
も２００、より好ましくは少なくとも２５０、さらにより好ましくは少なくとも
３００、さらにより好ましくは少なくとも３５０、４００、４５０、および５０
０アミノ酸残基をアラインする）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレ
オチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一配列の位置が、
第二配列の対応する位置と同じアミノ酸またはヌクレオチドにより占有される場
合、分子は、その位置で同一である（本明細書で使用したようなアミノ酸または
核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と等価である）。２つの配列
間の同一％は、２つの配列の最適アラインメントのために導入が必要である、ギ
ャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列の共有する同一位置の数の
関数である。

【００４７】 本発明はまた、低い程度の同一性を有するが、アミノペプチダーゼにより実施
される同機能の１つ以上を実施するに十分な類似性を有する、ポリペプチドを包
含する。類似性は、保存アミノ酸置換により決定する。かかる置換は、ポリペプ
チド中のあるアミノ酸を、類似の特徴をもつ別のアミノ酸で置換するものである
。保存置換は、表現型的にサイレントのようである。保存置換として典型的に見
られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間の互いの
置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐとＧｌｕの間の
交換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇの間の
交換、および、芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒの間の置換である。アミノ酸変化が表
現型的にサイレントのようであることに関する指針は、Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２４７：１３０６〜１３１０（１９９０）に見出される。

【００４８】

【表１】

【００４９】 配列の比較、および、２つの配列間の同一および類似％の決定は、数学的アル
ゴリズムを使用して実行できる（コンピューター分子生物学；Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ
．編、オックスフォード大学出版、ニューヨーク、１９８８；バイオコンピュー
ティング；情報学およびゲノムプロジェクト、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、アカデ
ミックプレス、ニューヨーク、１９９３；配列データのコンピューター解析、第
１部、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａ
ｎａ Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー、１９９４；分子生物学の配列解析、ｖｏ
ｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ、アカデミックプレス、１９８７；および配列解析プライ
マー、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，ＭおよびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔ
ｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９１）。

【００５０】 かかる数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎら（１９
９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３〜５８７
７に記載されている。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２に記載のよう
なＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に取り込ま
れる。ＢＬＡＳＴおよびギャップを入れたＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合
、それぞれのプログラム（例えばＮＢＬＡＳＴ）のデフォールトパラメータを使
用できる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照。１
つの実施形態において、配列比較のパラメータは、スコア＝１００、ワード長さ
＝１２で設定できるか、または変動し得る（例えばＷ＝５またはＷ＝２０）。 好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間の同一％は、ＢＬＯＳＵＭ
６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、および、１６、１４、１２
、１０、８、６、または４のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５または
６の長さウェイトを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラ
ム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）に取り込まれた、Ｎｅ
ｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４〜４５３
）アルゴリズムを使用して決定する。さらに別の好ましい実施形態において、２
つのヌクレオチド配列間の同一％は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ、ＣＭＰマトリックス
および４０、５０、６０、７０または８０のギャップウェイトおよび１、２、３
、４、５、または６の長さウェイトを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ
のＧＡＰプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ１２（１）：３８７）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで
利用可能）を使用して決定する。

【００５１】 配列比較に使用される数学的アルゴリズムの別の好ましく非限定的な例は、Ｍ
ｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ、ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである
。かかるアルゴリズムは、ＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの
一部である、ＡＬＩＧＮ（バージョン２．０）に取り込まれている。アミノ酸配
列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合、ＰＡＭ１２０ウェイ
ト残基表、１２のギャップ長さペナルティ、および４のギャップペナルティを使
用できる。配列解析用のさらなるアルゴリズムが当分野で既知であり、Ｔｏｒｅ
ｌｌｉｓら（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：３〜５
に記載のようなＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ；および、Ｐｅａｒｓｏｎら（１
９８８）ＰＮＡＳ ８５：２４４４〜８に記載のＦＡＳＴＡを含む。

【００５２】 変異形ポリペプチドは、アミノ酸配列が、１つ以上の置換、欠失、挿入、逆位
、融合、および切断短縮またはこれらのいずれかの組合せにより、異なり得る。

【００５３】 変異形ポリペプチドは、完全に機能的であり得るか、または１つ以上の活性の
機能を欠失し得る。従って、この場合では、変化は、例えば、触媒領域、調節領
域、基質結合領域、亜鉛結合領域、膜会合に関与する領域、例えばリン酸化によ
る酵素修飾に関与する領域に対応する領域の１つ以上の機能に影響を及ぼし得る
。

【００５４】 完全に機能的な変異形は、典型的には、必須でない残基または必須でない領域
の、保存的変化または変化群のみを含む。機能的変異形はまた、機能の変化を全
く引き起こさないまたは重要な変化を引き起こさない、類似アミノ酸の置換を含
むことができる。別に、かかる置換は、ある程度まで、機能に正または負に影響
を及ぼし得る。

【００５５】 非機能的変異形は、典型的には、１つ以上の非保存的アミノ酸置換、欠失、挿
入、逆位、または切断短縮、或いは、重要な残基または重要な領域の置換、挿入
、逆位または欠失を含む。

【００５６】 示したような変異形は、天然であっても、アミノペプチダーゼポリペプチドに
有用かつ新しい特徴を提供する組換え手段または化学合成により製造してもよい
。これは、タンパク質凝集を防ぐことにより、医薬製剤から免疫原性を防ぐこと
を含む。

【００５７】 有用な変化は、さらに、触媒活性の変化を含む。例えば、１つの実施形態は、
ペプチド基質の結合を引き起こすが、加水分解は引き起こさない、ペプチド結合
部位の変化を含む。同じ部位でのさらに有用な変化は、ペプチド基質の親和性の
変化をもたらし得る。有用な変化はまた、別のペプチド基質に対する親和性を提
供する変化を含む。別の有用な変化は、１つ以上のドメインまたはサブ領域が、
別のアミノペプチダーゼ由来の１つ以上のドメインまたはサブ領域に作動可能に
融合している、融合タンパク質を提供する。

【００５８】 機能に必須であるアミノ酸は、部位特異的変異誘発またはアラニン走査変異誘
発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１〜
１０８５）などの、当分野で既知の方法により同定できる。後者の方法は、分子
のあらゆる残基に、１つのアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異分子
を、インビトロでのペプチド結合加水分解または増殖活性などの関連生物活性と
いった生物活性について試験する。結合に重要な部位はまた、結晶化、核磁気共
鳴または光親和性標識（Ｓｍｉｔｈら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２
４：８９９〜９０４；ｄｅ Ｖｏｓら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３
０６〜３１２）などの構造解析により決定できる。

【００５９】 実質的な相同性は、完全な核酸またはアミノ酸配列またはこれらの配列の断片
に対してであり得る。

【００６０】 従って、本発明は、アミノペプチダーゼのポリペプチド断片を含む。断片は、
配列番号１に示したアミノ酸配列から得ることができる。しかし、本発明はまた
、本明細書に記載したアミノペプチダーゼの変異形の断片も包含する。

【００６１】 しかし、本発明に関する断片は、本発明より前に開示され得る、断片を包含す
るとは捉えない。

【００６２】 従って、断片は、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、
４５、５０またはそれ以上の連続的アミノ酸を含むことができる。断片は、免疫
源として使用してアミノペプチダーゼ抗体を製造できる、タンパク質並びに断片
の、例えば標的ペプチドに結合または加水分解する能力などの、生物活性の１つ
以上を保持できる。

【００６３】 生物活性断片（例えば、５、７、１０、１２、１５、２０、３０、３５、３６
、３７、３８、３９、４０、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸長のペプチ
ド）は機能的部位を含むことができる。かかる部位は、触媒部位、調節部位、基
質認識または結合に重要な部位、亜鉛結合部位、メタロプロテアーゼモチーフ（
ＩＡＨＥＬＡＨＱＷ）を含む領域、Ｍ１ファミリーのアミノペプチダーゼに特徴
的なモチーフ（ＧＡＭＥＮ）を含む部位、エキソペプチダーゼ特異性に寄与する
部位、約アミノ酸６９から約アミノ酸４５８までのペプチダーゼドメイン、リン
酸化部位、グリコシル化部位、および本明細書に開示した他の機能的部位を含む
がこれに限定されない。

【００６４】 かかる部位またはモチーフは、慣用的なコンピュータによる相同性探索方法に
より同定できる。

【００６５】 例えば、断片は、機能的部位から一方または両方の方向に、５、１０、１５、
２０、３０、４０、５０または１００までのアミノ酸を包含するように伸長でき
る。さらに、断片は、本明細書に開示した特定の部位または領域のサブ断片を含
むことができ、このサブ断片は、それらが由来する部位または領域の機能を保持
している。

【００６６】 これらの領域は、コンピュータ相同性解析を含む公知の方法により同定できる
。

【００６７】 本発明はまた、免疫原性特性を有する断片も提供する。これらは、アミノペプ
チダーゼおよび変異形のエピトープ含有部分を含む。これらのエピトープ含有ペ
プチドは、アミノペプチダーゼポリペプチドまたは領域または断片に特異的に結
合する抗体を産生するのに有用である。これらのペプチドは、少なくとも１０、
１２、少なくとも１４に、または少なくとも約１５から約３０アミノ酸の間に含
むことができる。

【００６８】 抗体の産生に使用できる抗原性ポリペプチドの非限定的な例は、細胞外領域か
ら得られたペプチドを含むがこれに限定されない。高い抗原性係数を有する領域
を図２に示す。しかし、細胞内で製造された抗体（「体内」）も包含され、これ
は細胞内ペプチド領域を認識するだろう。

【００６９】 エピトープ含有アミノペプチダーゼポリペプチドは、任意の慣用的な手段によ
り産生し得る（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１〜５１３５）。同時の複数のペプチ
ド合成は、米国特許第４，６３１，２１１号に記載されている。

【００７０】 断片は、別個であっても（他のアミノ酸またはポリペプチドに融合していない
）、より大きなポリペプチド内にあってもよい。さらに、数個の断片が、１つの
より大きなポリペプチドに含まれることができる。１つの実施形態において、宿
主での発現に設計された断片は、アミノペプチダーゼ断片のアミノ末端に融合し
た異種プレおよびプロポリペプチド領域、および、断片のカルボキシ末端に融合
した追加の領域を有することができる。

【００７１】 従って、本発明は、キメラまたは融合タンパク質を提供する。これらは、アミ
ノペプチダーゼに実質的に相同ではないアミノ酸配列を有する異種ペプチドに作
動可能に連結したアミノペプチダーゼペプチド配列を含む。「作動可能に連結」
は、アミノペプチダーゼペプチドおよび異種ペプチドがインフレームで融合して
いることを示す。異種ペプチドは、アミノペプチダーゼのＮ末端またはＣ末端に
融合しても、内部に位置してもよい。

【００７２】 １つの実施形態において、融合タンパク質は、アミノペプチダーゼ機能それ自
体に影響を及ぼさない。例えば、融合タンパク質は、ＧＳＴ融合タンパク質であ
り得、ここで、アミノペプチダーゼ配列は、ＧＳＴ配列のＣ末端に融合している
。他のタイプの融合は、酵素的融合タンパク質、例えばβ−ガラクトシダーゼ融
合物、酵母二重ハイブリッドＧＡＬ４融合物、ポリ−Ｈｉｓ融合物およびＩｇ融
合物を含むがこれに限定されない。かかる融合タンパク質、特にポリ−Ｈｉｓ融
合物は、組換えアミノペプチダーゼの精製を容易にし得る。特定の宿主細胞（例
えば哺乳類宿主細胞）では、タンパク質の発現および／または分泌は、異種シグ
ナル配列を使用することにより増加できる。それ故、別の実施形態において、融
合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含む。

【００７３】 ＥＰ−Ａ−Ｏ４６４５３３は、免疫グロブリン定常領域を種々の割合で含む融
合タンパク質を開示する。Ｆｃは、治療および診断に有用であり、従って、薬物
動態特性は向上する（ＥＰ−Ａ０２３２２６２）。薬物発見では、例えば、ヒト
タンパク質を、アンタゴニストを同定するハイスループットスクリーニングアッ
セイのために、Ｆｃ部分と融合した（Ｂｅｎｎｅｔｔら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ
．Ｒｅｃｏｇ．８：５２〜５８（１９９５）およびＪｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９〜９４７１）。従って、本発明はまた、ア
ミノペプチダーゼポリペプチド、並びに、様々なサブクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、
ＩｇＡ、ＩｇＥ）の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域を種々の割合で
含む、可溶性融合タンパク質を包含する。免疫グロブリンとして好ましいのは、
ヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ１の重鎖の定常部分であり、ここでの融合はヒンジ領域
で生じる。いくつかの用途では、例えば、融合タンパク質を免疫化の抗原として
使用する場合には、融合タンパク質を意図する目的で使用した後にＦｃを除去す
ることが望ましい。特定の実施形態において、Ｆｃ部分は、切断配列（これも取
り込まれる）により簡単な方法で除去でき、Ｘａ因子で切断できる。

【００７４】 キメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術により産生できる
。例えば、異なるタンパク質配列をコードするＤＮＡ断片を、慣用的な技術に従
って、インフレームに共に連結する。別の実施形態において、融合遺伝子を、自
動ＤＮＡ合成機を含む慣用的な技術により合成できる。別に、ＰＣＲによる遺伝
子断片の増幅は、アンカープライマーを使用して実施し、２つの連続的遺伝子断
片の間の相補的オーバーハングを生じ、これを続いてアニーリングし、再増幅し
、キメラ遺伝子配列を作成できる（Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９２）分子生物学の
現在のプロトコル）。さらに、すでに融合部分（例えばＧＳＴタンパク質）をコ
ードしている多くの発現ベクターが市販されている。アミノペプチダーゼをコー
ドする核酸は、融合部分がアミノペプチダーゼにインフレームで連結されるよう
に、かかる発現ベクターにクローニングできる。

【００７５】 別の形の融合タンパク質は、アミノペプチダーゼ機能に直接影響を及ぼすもの
である。従って、アミノペプチダーゼ領域（またはその一部）の１つ以上が、別
のアミノペプチダーゼ由来の相同領域（またはその一部）で置換されている、ア
ミノペプチダーゼポリペプチドが本発明により包含される。従って、様々な順列
が可能である。従って、天然ドメインまたはサブ領域の１つ以上が、別のもので
置換されている、キメラアミノペプチダーゼを形成できる。

【００７６】 さらに、１つ以上の機能的部位が異なるアミノペプチダーゼに由来する、キメ
ラアミノペプチダーゼタンパク質を産生できる。しかし、その部位は、哺乳類ゲ
ノムに存在するが、依然として発見または特徴づけられていない、アミノペプチ
ダーゼから得ることができると理解される。

【００７７】 単離アミノペプチダーゼタンパク質は、図５および６に示した組織のいずれか
などの、それを天然に発現する細胞から精製できるか、特に、それを発現するよ
うに変化させた（組換え）細胞から精製できるか、または、既知のタンパク質合
成法を使用して合成できる。

【００７８】 １つの実施形態において、タンパク質は、組換えＤＮＡ技術により産生される
。例えば、アミノペプチダーゼポリペプチドをコードする核酸分子を発現ベクタ
ーにクローニングし、発現ベクターを宿主細胞に導入し、タンパク質を宿主細胞
で発現する。次いで、タンパク質を、標準的なタンパク質精製技術を使用して、
適切な精製スキームにより細胞から単離できる。

【００７９】 ポリペプチドは、しばしば、一般に２０個の天然アミノ酸と称される、２０個
のアミノ酸以外のアミノ酸を含む。さらに、末端アミノ酸を含む、多くのアミノ
酸を、天然プロセス、例えばプロセシングおよび他の翻訳後修飾により、または
当分野で公知の化学的修飾技術により修飾し得る。ポリペプチドに自然に存在す
る一般的な修飾は、基本的な教科書、詳細な研究論文、および研究文献に記載さ
れており、それらは当業者に公知である。

【００８０】 従って、ポリペプチドはまた、置換アミノ酸残基が遺伝子コードによりコード
されていないものである、置換基が含まれている、成熟ポリペプチドが別の化合
物、例えば、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えばポリエチレング
リコール）と融合している、または、追加のアミノ酸が、成熟ポリペプチド、例
えば、リーダーまたは分泌配列または成熟ポリペプチド精製用の配列またはプロ
タンパク質配列のに融合している、誘導体または類似体を包含する。

【００８１】 既知の修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラ
ビンの共有結合的付着、ヘム部分の共有結合的付着、ヌクレオチドまたはヌクレ
オチド誘導体の共有結合的付着、脂質または脂質誘導体の共有結合的付着、ホス
ファチジルイノシトールの共有結合的付着、架橋、環化、ジスルフィド結合形成
、脱メチル化、共有結合的架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形
成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒド
ロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロ
セシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫化、トランスフ
ァー−ＲＮＡにより媒介されるタンパク質へのアミノ酸の付加、例えばアルギニ
ン化、およびユビキチン化を含むがこれに限定されない。

【００８２】 かかる修飾は、当業者に公知であり、科学文献に詳細に記載されている。数個
の特に一般的な修飾である、グリコシル化、脂質付着、硫化、グルタミン酸残基
のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化は、例えば、
大半の基本的な教科書、例えば、タンパク質−構造および分子特性、第２版、Ｔ
．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ
、ニューヨーク（１９９３）に記載されている。この主題に関する多くの詳細な
総説は、Ｗｏｌｄ，Ｆ、タンパク質の翻訳後共有結合的修飾、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎ
ｓｏｎ編、アカデミックプレス、ニューヨーク１〜１２（１９８３）；Ｓｅｉｆ
ｔｅｒら（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６〜６４６）お
よびＲａｔｔａｎら（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：
４８〜６２などにより得ることができる。

【００８３】 これも公知であるように、ポリペプチドは常に完全に線形であるわけではない
。例えば、ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝し得、そして、それ
らは、天然プロセシング事象および天然に生じないヒト操作によりもたらされる
事象を含む、翻訳後事象の結果として一般に、分枝を含むまたは含まない、環状
であり得る。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは、非翻訳天然プロセスに
より、および合成法により合成し得る。

【００８４】 修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を
含む、ポリペプチドのいずれの箇所でも生じ得る。ポリペプチド中のアミノまた
はカルボキシル基またはその両方の、共有結合的修飾による遮断は、天然および
合成ポリペプチドで一般的である。例えば、タンパク質分解プロセシング前に、
Ｅ．ｃｏｌｉで作成されたポリペプチドのアミノ末端残基は、ほぼ不変的にＮ−
ホルミルメチオニンである。

【００８５】 修飾は、どのようにタンパク質が合成されるかの関数であり得る。組換えポリ
ペプチドでは、例えば、修飾は、宿主細胞の翻訳後修飾能およびポリペプチドア
ミノ酸配列中の修飾シグナルにより決定される。従って、グリコシル化を望む場
合、ポリペプチドは、グリコシル化している宿主、一般に真核細胞で発現すべき
である。昆虫細胞は、しばしば、哺乳類細胞と同じ翻訳後グリコシル化を実施し
、この理由から、昆虫細胞発現系は、天然のグリコシル化パターンを有する哺乳
類タンパク質を効率的に発現するように開発されている。類似の考察を他の修飾
にも適用する。

【００８６】 同じタイプの修飾は、特定のポリペプチドの数個の部位に、同程度または様々
な程度で存在し得る。また、特定のポリペプチドは、１つより多い修飾タイプを
含み得る。

【００８７】 ポリペプチド使用 本発明のタンパク質配列を「質問配列」として使用して、公共データベースに
対して探索を実施し、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定で
きる。かかる探索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
２１５：４０３〜１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョ
ン２．０）を使用して実施できる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド探索は、ＮＢＬＡＳ
Ｔプログラム、スコア＝１００、ワード長さ＝１２を用いて実施し、本発明の核
酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質探
索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長さ＝３を用いて実施し
、本発明のタンパク質に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のギ
ャップを入れたアラインメントを得るために、ギャップを入れたＢＬＡＳＴを、
Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（
１７）：３３８９〜３４０２に記載のように利用できる。ＢＬＡＳＴおよびギャ
ップを入れたＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（例
えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォールトパラメータを使用できる
。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照。

【００８８】 アミノペプチダーゼポリペプチドは、アミノペプチダーゼ、領域または断片に
特異的な抗体の製造に有用である。高い抗原性係数スコアを有する領域を図２に
示す。

【００８９】 アミノペプチダーゼポリペプチドは、アミノペプチダーゼに関連した生物アッ
セイに有用である。かかるアッセイは、アミノペプチダーゼ関連容態の診断およ
び治療に有用である、既知のアミノペプチダーゼ機能または活性または特性のい
ずれかに関与する。

【００９０】 アミノペプチダーゼポリペプチドは、細胞をベースとしたまたは細胞非含有系
における、薬物スクリーニングアッセイにも有用である。細胞をベースとした系
は、天然であり得、すなわち、生検としてまたは細胞培養液中で増殖した、アミ
ノペプチダーゼを普通に発現する細胞であり得る。しかし、１つの実施形態にお
いて、細胞をベースとしたアッセイは、アミノペプチダーゼを発現する組換え宿
主細胞を含む。

【００９１】 試験化合物がアミノペプチダーゼと相互作用する能力の決定はまた、試験化合
物が、優先的にポリペプチドに結合する能力を、既知の結合分子がポリペプチド
に結合する能力と比較して決定することを含むことができる。

【００９２】 ポリペプチドを使用して、アミノペプチダーゼ活性を調節する化合物を同定で
きる。かかる化合物は、例えば、ペプチド基質への結合親和性または速度を増加
または減少できるか、アミノペプチダーゼに対する結合に関してペプチド基質と
競合できるか、または、アミノペプチダーゼに結合したペプチド基質を置換でき
る。アミノペプチダーゼおよび適切な変異形および断片の両方を、ハイスループ
ットスクリーンに使用して、アミノペプチダーゼに結合する能力について候補化
合物をアッセイできる。これらの化合物をさらに、機能的アミノペプチダーゼに
対してスクリーニングして、アミノペプチダーゼ活性に対する化合物の効果を決
定できる。所望の程度でアミノペプチダーゼを活性化（アゴニスト）または不活
性化（アンタゴニスト）する、化合物を同定できる。調節法は、インビトロで（
例えば、物質と共に細胞を培養することにより）または別にインビボで（例えば
物質を対象に投与することにより）実施できる。

【００９３】 アミノペプチダーゼポリペプチドを使用して、アミノペプチダーゼタンパク質
と、アミノペプチダーゼタンパク質、例えば基質−ペプチドまたは亜鉛成分と普
通に相互作用する標的分子の間の相互作用を刺激または阻害する能力について化
合物をスクリーニングすることができる。アッセイは、アミノペプチダーゼタン
パク質または断片が、標的分子と相互作用し、アミノペプチダーゼタンパク質と
標的の間の複合体の形成を検出できるか、または、アミノペプチダーゼおよび標
的の相互作用の生化学的結果を検出することができる、条件下で、アミノペプチ
ダーゼタンパク質を候補化合物と合わせる段階を含む。

【００９４】 アミノペプチダーゼが標的分子に結合する能力の決定はまた、リアルタイム二
分子相互作用解析（ＢＩＡ）などの技術を使用して実行できる。Ｓｊｏｌａｎｄ
ｅｒら（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８〜２３４５およびＳｚ
ａｂｏら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９
９〜７０５。本明細書に使用したような「ＢＩＡ」は、相互作用反応物質を全く
標識することなく、リアルタイムで生体特異的相互作用を研究する技術である（
例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））。光学現象表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）
の変化を、生体分子間のリアルタイム反応の指標として使用できる。

【００９５】 本発明の試験化合物は、生物ライブラリー；空間的に指定可能な平行固相また
は液相ライブラリー；デコンボルーションを必要とする合成ライブラリー法；「
１ビーズに１化合物」のライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフ
ィー選択を使用した合成ライブラリー法を含む、当分野で既知のコンビナトリア
ルライブラリーの数多くのアプローチのいずれかを使用して得ることができる。
生物ライブラリーアプローチは、ポリペプチドライブラリーに限定され、一方、
他の４つのアプローチは、ポリペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の
小分子ライブラリーに適用できる（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａ
ｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）。

【００９６】 分子ライブラリーの合成法の例は、当分野で、例えばＤｅｗｉｔｔら（１９９
３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６９０９；Ｅｒｂ
ら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４
２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６
７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｅｌｌ
ら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５
９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇ
ｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ
．３７：１２３３に見出すことができる。化合物ライブラリーは、溶液中（例え
ばＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２〜
４２１）またはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２〜８
４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５〜５５６
）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅ
ｒ米国特許第’４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５〜１８６９）またはファー
ジ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８
６〜３９０）；（Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４〜
４０６）；（Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ９７：６３７８〜６３８２）；（Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１〜３１０）；（Ｌａｄｎｅｒ上記）で提示し得
る。

【００９７】 候補化合物は、例えば、１）Ｉｇ尾融合ペプチドおよびランダムペプチドライ
ブラリー（例えば、Ｌａｍら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２〜８４；
Ｈｏｕｇｈｔｅｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４〜８６）およびＤ
および／またはＬ−立体配置アミノ酸からなるコンビナトリアルケミストリーか
ら得られた分子ライブラリーのメンバーを含む、可溶性ペプチドなどのペプチド
；２）ホスホペプチド（例えば、ランダムおよび部分変性した、特異的ホスホペ
プチドライブラリーのメンバー、例えばＳｏｎｇｙａｎｇら（１９９３）Ｃｅｌ
ｌ ７２：７６７〜７７８）；３）抗体（例えば、ポリクローナル、モノクロー
ナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ、および単鎖抗体、並びに、抗体のＦ
ａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ発現ライブラリー断片、およびエピトープ含有断
片）；４）小有機および無機分子（例えば、コンビナトリアルおよび天然物ライ
ブラリーから得られた分子）を含む。

【００９８】 １つの候補化合物は、ペプチド結合に競合する、可溶性の全長アミノペプチダ
ーゼまたは断片である。他の候補化合物は、アミノペプチダーゼ機能に影響を及
ぼし、ペプチド基質と競合する、変異アミノペプチダーゼまたは変異を含む適切
な断片を含む。従って、基質に、例えば高い親和性で競合する断片、または、基
質に結合するがそれを分解しない断片は、本発明に包含される。

【００９９】 本発明は、アミノペプチダーゼ活性を調節（刺激または阻害）する化合物を同
定するための他の末端点を提供する。アッセイは、典型的には、アミノペプチダ
ーゼ活性を示す細胞事象のアッセイを含む。従って、アミノペプチダーゼ活性に
応答してアップまたはダウンレギュレートする遺伝子の発現をアッセイできる。
１つの実施形態において、かかる遺伝子の調節領域は、ルシフェラーゼなどの容
易に検出できるマーカーに作動可能に連結できる。別に、アミノペプチダーゼの
修飾も測定できる。

【０１００】 アミノペプチダーゼにより媒介される生物学的または生化学的機能のいずれか
を、終点アッセイとして使用できる。これらは、これらの終点アッセイ標的につ
いて参考として援用される、本明細書に引用した参考文献の、本明細書に記載の
生化学的または生化学的／生物学的事象の全部、および、当業者に既知の他の機
能を含む。

【０１０１】 アミノペプチダーゼの場合、特定の終点は、ペプチド結合加水分解を含むこと
ができる。

【０１０２】 化合物の結合および／または活性化は、本明細書に開示したような１つ以上の
領域、セグメント、部位等、またはその一部が、他のアミノペプチダーゼから得
られたその異種対応物により置換できる、キメラアミノペプチダーゼタンパク質
を使用することによりスクリーニングできる。例えば、天然アミノペプチダーゼ
とは異なるペプチド配列特異性および／または親和性で相互作用する、触媒領域
を使用できる。従って、異なるセットの成分が、活性化の終点アッセイとして利
用できる。さらなる代替法として、例えばリン酸化によるエフェクタータンパク
質による修飾部位は、異なるエフェクタータンパク質の部位と置換できる。活性
化はまた、アミノペプチダーゼの関与する天然経路の一部である転写調節配列に
作動可能に連結した、容易に検出できるコード領域を含む、レポーター遺伝子に
より検出できる。

【０１０３】 アミノペプチダーゼポリペプチドはまた、アミノペプチダーゼと相互作用する
化合物を発見するために設計された方法における競合結合アッセイに有用である
。従って、化合物を、化合物がポリペプチドに結合するか、またはさもなくばそ
れと相互作用することのできる条件下で、アミノペプチダーゼポリペプチドに曝
露する。可溶性アミノペプチダーゼポリペプチドも混合物に加える。試験化合物
が、可溶性アミノペプチダーゼポリペプチドと相互作用する場合、それは、形成
された複合体の量またはアミノペプチダーゼ標的の活性を減少させる。このタイ
プのアッセイは、特に、アミノペプチダーゼの特定の領域と相互作用する化合物
を探索する場合に有用である。従って、標的アミノペプチダーゼ領域と競合する
可溶性ポリペプチドは、目的の領域に対応するペプチド配列を含むように設計す
る。

【０１０４】 別のタイプの競合結合アッセイを使用して、特定の機能的部位と相互作用する
化合物を発見できる。例として、結合可能な亜鉛および候補化合物を、アミノペ
プチダーゼの試料に添加できる。亜鉛と同じ部位でアミノペプチダーゼと相互作
用する化合物は、アミノペプチダーゼと亜鉛の間に形成される複合体の量を減少
する。従って、アミノペプチダーゼと亜鉛成分の間の相互作用を特異的に防ぐ化
合物を発見することが可能である。別の例は、アミノペプチダーゼおよび基質ペ
プチドの試料に候補化合物を添加することを含む。ペプチドと競合する化合物は
、ペプチドの加水分解またはアミノペプチダーゼへの結合の量を減少させる。従
って、アミノペプチダーゼと直接相互作用し、ペプチドと競合する、化合物を発
見できる。かかるアッセイは、アミノペプチダーゼと相互作用する任意の他の成
分を含むことができる。

【０１０５】 細胞非含有薬物スクリーニングアッセイを実施するために、一方または両方の
タンパク質の非複合体形からの複合体の分離を容易にし、並びに、アッセイの自
動化を実行するために、アミノペプチダーゼ、または断片、またはその標的分子
を固定することが望ましい。

【０１０６】 タンパク質をマトリックス上に固定する技術は、薬物スクリーニングアッセイ
に使用できる。１つの実施形態において、タンパク質をマトリックスに結合させ
ることのできるドメインを加えた融合タンパク質を提供できる。例えば、グルタ
チオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／アミノペプチダーゼ融合タンパク質を、グル
タチオンセファロースビーズ（ＭＯ州セントルイス所在シグマケミカル社）また
はグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着でき、これを次いで細
胞溶解液（例えば³⁵Ｓ標識）および候補化合物と合わせ、混合物を、複合体形成
を実施する条件下（例えば塩およびｐＨに関する生理的条件）でインキュベート
する。インキュベート後、ビーズを洗浄して、全ての非結合標識を除去し、固定
マトリックスおよび放射標識を直接、または複合体を解離した後に上清で決定す
る。別に、複合体は、マトリックスから解離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し
、ビーズ画分に見出されるアミノペプチダーゼ結合タンパク質レベルを、標準的
な電気泳動技術を使用してゲルから定量できる。例えば、ポリペプチドまたはそ
の標的分子は、当分野で公知の技術を使用して、ビオチンおよびストレプトアビ
ジンのコンジュゲートを使用して固定できる。別に、タンパク質と反応性である
が、タンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体を、プレートのウェル
に誘導体化でき、タンパク質が、抗体コンジュゲートによりウェルに捕獲できる
。ペプチドまたは亜鉛成分などの、アミノペプチダーゼ結合標的成分および候補
化合物の調製物を、アミノペプチダーゼ提示ウェル中でインキュベートし、ウェ
ルに捕獲された複合体の量を定量できる。ＧＳＴ固定複合体について上記した方
法に加えて、かかる複合体を検出する方法は、アミノペプチダーゼ標的分子と反
応性であるか、またはアミノペプチダーゼと反応性であり、標的分子と競合する
抗体を使用した複合体の免疫検出；並びに、標的分子に関連した酵素活性の検出
に依拠した酵素結合アッセイを含む。

【０１０７】 これらの薬物スクリーニングアッセイに従って同定したアミノペプチダーゼ活
性の調節因子を使用して、図５および６で示した細胞のいずれかなどの、アミノ
ペプチダーゼを発現する細胞を処理することにより、アミノペプチダーゼに関連
した疾患に罹患する対象を治療できる。これらの治療法は、本明細書に記載した
ような医薬組成物中のアミノペプチダーゼ活性の調節因子を、かかる治療の必要
な対象に投与する段階を含む。

【０１０８】 肺に関与する疾患は、先天性異常；無気肺；肺うっ血、および、血行力学的肺
水腫および微小血管損傷により引き起こされた水腫を含む、水腫、成人呼吸困難
症候群（びまん性肺胞障害）、肺塞栓症、出血、および梗塞、および肺性高血圧
および血管硬化などの血管起源の疾病；気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、およ
び気管支拡張などの、慢性閉塞性肺疾患；じん肺、サルコイドーシス、特発性肺
線維症、剥離型間質性肺炎、過敏症肺炎、肺好酸球増加症（好酸球増加症を伴う
肺浸潤）、器質化肺炎を伴う閉塞性細気管支炎、グッドパスチャー症候群、特発
性肺血鉄症および他の出血症候群を含むびまん性肺出血、膠原病の肺併発、およ
び肺胞タンパク質症などの、びまん性間質性（浸潤性、限定性）疾患；薬物誘発
肺疾患、放射線誘発肺疾患、および肺移植などの治療法の合併症；腫瘍随伴症候
群を含む気管支癌、細気管支肺胞上皮癌、気管支カルチノイド、種々の腫瘍、お
よび転移性腫瘍などの神経内分泌腫瘍などの腫瘍；炎症性胸水、非炎症性胸水、
気胸、および、孤立線維性腫瘍（胸水）および悪性中皮種を含む胸膜腫瘍を含む
、胸膜の病態を含むがこれに限定されない。

【０１０９】 大腸に関与する疾患は、閉鎖症および狭窄、メッケル憩室、先天性神経節細胞
欠損巨大結腸−ヒルシュプルング病などの、先天性異常；下痢および赤痢、ウイ
ルス性胃腸炎、細菌性腸炎を含む感染性腸炎、壊死性腸炎、抗生物質関連腸炎（
偽膜性腸炎）および膠原性およびリンパ球性腸炎、寄生虫および原虫を含む種々
の腸炎症疾患、後天性免疫不全症候群、移植、薬物誘発腸損傷、放射線腸炎、好
中球減少性大腸炎（盲腸炎）、および分流性大腸炎などの腸炎；クローン病およ
び潰瘍性大腸炎などの特発性炎症性腸疾患；非腫瘍性ポリープ、腺腫、家族性症
候群、大腸直腸発癌、大腸直腸癌、およびカルチノイド腫瘍などの大腸の腫瘍を
含む。

【０１１０】 アミノペプチダーゼ発現が特に関連性がある疾患は、乳癌および大腸癌、肺癌
、特に扁平細胞癌、および糖尿病などのインスリン関連疾患を含むがこれに限定
されない。

【０１１１】 アミノペプチダーゼは、肺癌、乳癌および大腸癌の両方に過剰発現されている
。従って、遺伝子は、遺伝子の発現の阻害が、腫瘍発達および／または進行に影
響を及ぼし得る、これらの疾患の治療に特に関連性がある。

【０１１２】 アミノペプチダーゼはまた、図５および６に示した組織にも発現され、従って
、これらの組織に関連した疾患に特に関与している。

【０１１３】 従って、アミノペプチダーゼポリペプチドは、アミノペプチダーゼの異常発現
または活性により特徴づけられるアミノペプチダーゼ関連疾患の治療に有用であ
る。１つの実施形態において、この方法は、タンパク質の発現または活性を調節
（例えばアップレギュレートまたはダウンレギュレート）する物質（例えば、本
明細書に記載のスクリーニングアッセイにより同定された物質）または物質の組
合せを投与することを含む。別の実施形態において、この方法は、タンパク質の
減少したまたは異常な発現または活性を代償する治療法としてのアミノペプチダ
ーゼの投与を含む。

【０１１４】 治療法は、亜鉛またはアミノペプチダーゼを修飾する任意の酵素などの、アミ
ノペプチダーゼと直接相互作用する任意の他の成分に競合する、可溶性アミノペ
プチダーゼまたはアミノペプチダーゼタンパク質の断片の使用を含むがこれに限
定されない。これらのアミノペプチダーゼまたは断片は、効率的な競合を提供す
るように標的により高い親和性を有することができる。

【０１１５】 活性の刺激は、タンパク質が異常にダウンレギュレートされている、および／
または活性の増加が有益な効果をもたらすようである状況において望ましい。同
様に、活性の阻害は、タンパク質が異常にアップレギュレートされている、およ
び／または活性の減少が有益な効果をもたらすようである状況において望ましい
。かかる状況の一例では、対象は、異常な発達または細胞分化により特徴づけら
れる疾患を有する。別の例では、対象は、増殖疾患（例えば癌）または異常な造
血応答により特徴づけられる疾患を有する。別の例では、対象の組織再生を達成
することが望ましい（例えば、対象が、脳または脊髄損傷を受け、神経組織を調
節的に再生することが望ましい場合）。

【０１１６】 本発明のさらに別の態様において、本発明のタンパク質は、「バイトタンパク
質」として、二重ハイブリッドアッセイまたは三重ハイブリッドアッセイで使用
して（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）
Ｃｅｌｌ ７２：２２３〜２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６〜１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０〜９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９
３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３〜１６９６；およびＢｒｅｎｔ ＷＯ９４
／１０３００）、本発明のタンパク質に結合またはそれと相互作用し、その活性
を調節する他のタンパク質を同定（タンパク質を捕獲）できる。

【０１１７】 アミノペプチダーゼポリペプチドはまた、本明細書で考察した疾病、特に、肺
癌、乳癌、および大腸癌および糖尿病などのインスリン関連疾患を含むがこれに
限定されない、アミノペプチダーゼにより媒介される疾病または疾病の素因を診
断する標的を提供するのに有用である。標的は、図５および６で示した組織にお
いて、アミノペプチダーゼにより媒介される疾病または疾病の素因を診断するの
に有用である。従って、細胞、組織または生物中でのアミノペプチダーゼの存在
またはレベルを検出する方法が提供される。この方法は、生体試料を、相互作用
を検出できるように、アミノペプチダーゼと相互作用できる化合物と接触させる
ことを含む。

【０１１８】 アミノペプチダーゼを検出する１つの物質は、アミノペプチダーゼに選択的に
結合できる抗体である。生体試料は、対象から単離した組織、細胞および生体液
、並びに、対象内に存在する組織、細胞および液体を含む。

【０１１９】 アミノペプチダーゼはまた、変異形アミノペプチダーゼを有する患者において
、活発な疾病または疾病の素因を診断する標的を提供する。従って、アミノペプ
チダーゼを、生体試料から単離し、異常タンパク質を生じる遺伝子変異の存在に
ついてアッセイできる。これは、アミノ酸置換、欠失、挿入、転位、（異常スプ
ライシング事象の結果）および不適切な翻訳後修飾を含む。解析法は、電気泳動
度の変化、トリプシンペプチド消化の変化、細胞をベースとしたまたは細胞非含
有アッセイでのアミノペプチダーゼ活性の変化、ペプチド結合または分解の変化
、亜鉛結合または抗体結合パターン、等電点の変化、直接的アミノ酸シークエン
ス、および一般にタンパク質またはアミノペプチダーゼ特異性の変異を検出する
のに有用な既知の任意のその他のアッセイ技術を含む。

【０１２０】 インビトロでアミノペプチダーゼを検出する技術は、酵素結合イムノソルベン
トアッセイ（エリザ）、ウェスタンブロット、免疫沈降法および免疫蛍光法を含
む。別に、タンパク質は、対象でインビボで、対象に、標識抗アミノペプチダー
ゼ抗体を導入することにより検出できる。例えば、抗体を、対象中の存在および
位置が、標準的な造影技術により検出できる、放射性マーカーで標識できる。特
に有用なのは、対象において発現されるアミノペプチダーゼの対立遺伝子変異形
を検出する方法、および、試料中のアミノペプチダーゼ断片を検出する方法であ
る。

【０１２１】 アミノペプチダーゼポリペプチドはまた、薬理ゲノミクス解析にも有用である
。薬理ゲノミクスは、罹患したヒトにおける薬物廃棄の変化および異常作用に因
る、薬物に対する応答の臨床的に有意な遺伝的変化を扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅ
ｌｂａｕｍ，Ｍ（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ．２３（１０〜１１）：９８３〜９８５、およびＬｉｎｄｅｒ，Ｍ．Ｗ．
（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３（２）：２５４〜２６６参照。これらの
変化の臨床的結果は、代謝の個人差の結果、ある個体では治療薬物が重度に毒性
となり、または、ある個体では薬物が治療にきかない。従って、個体の遺伝子型
は、治療化合物が生体に作用する方法または生体が化合物を代謝する方法を決定
できる。さらに、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続時間の両方
に影響を及ぼす。従って、個体の薬理ゲノミクスにより、個体の遺伝子型に基づ
いた予防または治療のための、効果的な化合物およびかかる化合物の効果的な投
与量の選択が可能となる。いくつかの薬物代謝酵素の遺伝子多形の発見は、なぜ
患者が期待された薬物効果を得ないか、過度の薬物効果を示すか、または、標準
的な薬物投与量で重度の毒性を受けるかを説明する。多形は、代謝の強力な表現
型および代謝の弱い表現型において発現され得る。従って、遺伝子多形は、ある
個体群でのアミノペプチダーゼ機能の１つ以上が、別の個体群のそれとは異なっ
ている、アミノペプチダーゼの対立遺伝子タンパク質変異形をもたらし得る。従
って、ポリペプチドによって、標的は、治療様式に影響を及ぼすことのできる遺
伝子素因を確認できる。従って、ペプチドをベースとした治療において、多形は
、幾分活性である触媒領域をもたらし得る。従って、投与量は、必ず、修飾して
、多形を含む特定の個体群内での治療効果を最大化する。遺伝子型決定の代替法
として、特異的多形ポリペプチドを同定できる。

【０１２２】 アミノペプチダーゼポリペプチドはまた、臨床試験および他の治療中の治療効
果のモニタリングに有用である。従って、遺伝子発現、タンパク質レベルまたは
アミノペプチダーゼ活性を増加または減少するように設計された物質の治療効力
は、治療経緯を通じて、終点標的としてアミノペプチダーゼポリペプチドを使用
してモニタリングできる。モニタリングは、例えば、以下のようであり得る（ｉ
）物質の投与前に、対象から投与前試料を得；（ｉｉ）投与前試料中のタンパク
質の発現または活性のレベルを検出し；（ｉｉｉ）対象から１つ以上の投与後試
料を得；（ｉｖ）投与後試料中のタンパク質の発現または活性のレベルを比較し
；（ｖ）投与前試料中のタンパク質の発現または活性のレベルを、投与後試料ま
たは試料群中のタンパク質と比較し；そして（ｖ）それに応じて対象への物質の
投与を増加または減少させる。

【０１２３】 抗体 本発明はまた、アミノペプチダーゼおよびその変異形および断片に選択的に結
合する抗体を提供する。抗体は、アミノペプチダーゼと実質的に相同ではない他
のタンパク質にも結合したとしても、選択的に結合すると考える。これらの他の
タンパク質は、アミノペプチダーゼの断片またはドメインと相同性を共有する。
特定の領域でのこの保存により、相同性配列により両方のタンパク質に結合する
抗体が生じる。この場合、アミノペプチダーゼへの抗体の結合は依然として選択
的であると理解される。

【０１２４】 抗体を製造するために、単離アミノペプチダーゼポリペプチドを免疫原として
使用して、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製の標準的な技術を使用
して、抗体を製造する。全長タンパク質または抗原性ペプチド断片を使用できる
。高い抗原性係数を有する領域を図３に示す。

【０１２５】 抗体は、好ましくは、これらの領域から、またはこれらの領域の別個の断片か
ら調製する。しかし、抗体は、本明細書に記載のようなペプチドのいずれかの領
域から調製できる。好ましい断片は、ペプチドの加水分解または結合を消失また
は完全に防止する抗体を生じる。抗体は、完全アミノペプチダーゼまたは本明細
書に記載したようなアミノペプチダーゼのドメイン、例えば、亜鉛結合領域、メ
タロプロテアーゼモチーフ（ＩＡＨＥＬＡＨＱＷ）、ＧＡＭＥＮモチーフ、エキ
ソペプチダーゼ特異性に寄与する部位、およびそのペプチダーゼドメインまたは
サブ領域に対して発生できる。抗体はまた、本明細書に開示したような特定の機
能部位に対して発生できる。

【０１２６】 抗原性ペプチドは、少なくとも１２、１４、１５または３０個のアミノ酸残基
の連続配列を含むことができる。１つの実施形態において、断片は、タンパク質
の表面に位置する領域、例えば親水性領域に対応する。しかし、これらの断片は
、本発明より前に開示され得る任意の断片を含むものではない。

【０１２７】 抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよい。無傷抗体またはその断
片（例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）₂）を使用できる。

【０１２８】 検出は、抗体を、検出可能な物質にカップリング（すなわち物理的に連結）す
ることにより容易にし得る。検出可能な物質の例は、様々な酵素、接合団、蛍光
物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質を含む。適切な酵素の例は、
セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含み；適切な接合団複合体の例は、
ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み；適切な蛍光物
質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネ
ート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロ
リドまたはフィコエリトリンを含み；発光物質の例は、ルミノールを含み；生物
発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを含み；そ
して、適切な放射性物質の例は、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³⁵Ｓまたは³Ｈを含む。

【０１２９】 適切な免疫原性調製物は、天然、組換え発現、または化学合成ペプチドから得
ることができる。

【０１３０】 抗体使用 抗体を使用して、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降法などの
、標準的な技術によりアミノペプチダーゼを単離できる。抗体は、細胞からの天
然アミノペプチダーゼおよび宿主細胞で発現される組換え産生アミノペプチダー
ゼの精製を容易にし得る。

【０１３１】 抗体は、細胞または組織でのアミノペプチダーゼの存在を検出し、生物中の様
々な組織間でのおよび正常な発達の経過中のアミノペプチダーゼの発現パターン
を決定するのに有用である。

【０１３２】 抗体を使用して、インサイツ、インビトロまたは細胞溶解液または上清中でア
ミノペプチダーゼを検出し、発現の量およびパターンを決定できる。

【０１３３】 抗体を使用して、発達中の異常な組織分布または異常発現を評価できる。

【０１３４】 全長アミノペプチダーゼの循環断片の抗体による検出を使用して、アミノペプ
チダーゼ代謝回転を同定できる。

【０１３５】 さらに、抗体を使用して、疾病の活発な段階などの疾病状態における、または
、アミノペプチダーゼ機能に関連した疾病の素因を有する個体における、アミノ
ペプチダーゼの発現を評価できる。疾患が不適切な組織分布、発達発現、または
アミノペプチダーゼタンパク質発現レベルにより引き起こされる場合、正常アミ
ノペプチダーゼタンパク質に対する抗体を調製できる。疾患が、アミノペプチダ
ーゼの特定の変異により特徴づけられる場合、この変異タンパク質に特異的な抗
体を使用して、特定の変異アミノペプチダーゼの存在についてアッセイできる。
しかし、細胞内で作成された抗体（「体内」）も包含され、これは、細胞内アミ
ノペプチダーゼペプチド領域を認識するだろう。

【０１３６】 抗体を使用して、生物の様々な組織の細胞の正常および異常細胞下局在化も評
価できる。抗体は、全アミノペプチダーゼまたはアミノペプチダーゼの一部、例
えば基質認識部位を含む、アミノ酸６９〜４５８までのペプチダーゼドメインの
部分に対して発生できる。

【０１３７】 診断使用を、遺伝子試験だけでなく、治療様式のモニタリングにも適用できる
。従って、治療が最終的にアミノペプチダーゼ発現レベルまたは異常アミノペプ
チダーゼおよび異常組織分布または発達発現の存在の修正を目標とする場合、ア
ミノペプチダーゼまたは関連断片に指向された抗体を使用して、治療効力をモニ
タリングできる。

【０１３８】 従って、抗体を、例えば特定の治療措置の効力を決定するために、臨床試験方
法の一部として診断で使用して、組織のタンパク質レベルをモニタリングできる
。

【０１３９】 さらに、抗体は、薬理ゲノミクス解析に有用である。従って、多形アミノペプ
チダーゼに対して調製した抗体を使用して、修飾治療様式を必要とする個体を同
定できる。

【０１４０】 抗体はまた、電気泳動度、等電点、トリプシンペプチド消化および当分野で既
知の他の物理的アッセイにより解析された異常アミノペプチダーゼの免疫マーカ
ーとして診断手段として有用である。

【０１４１】 抗体はまた、組織型決定に有用である。従って、特定のアミノペプチダーゼが
、特定の組織での発現に関連している場合、このアミノペプチダーゼに特異的で
ある抗体を使用して、組織型を同定できる。

【０１４２】 抗体はまた、法医学的同定にも有用である。従って、個体が、特定の多形タン
パク質を生じる特定の遺伝子多形と関連している場合、多形タンパク質に特異的
な抗体を、同定の補助として使用できる。

【０１４３】 抗体はまた、アミノペプチダーゼ機能を阻害するのに、例えば、亜鉛結合、お
よびペプチド結合および／または加水分解を阻害するのに有用である。

【０１４４】 これらの使用はまた、治療がアミノペプチダーゼ機能の阻害を含む、治療内容
に適用できる。抗体は、例えば、ペプチド結合を遮断するのに使用できる。抗体
は、機能に必要な部位を含む特定の断片に対して、または、細胞に会合した無傷
アミノペプチダーゼに対して調製できる。

【０１４５】 完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療に特に望ましい。ヒト抗体を産生するこの技
術の概要については、Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９５）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１３：６５〜９３参照。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生
するこの技術およびかかる抗体を産生するプロトコルの詳細な考察は、例えば、
米国特許第５，６２５，１２６号；米国特許第５，６３３，４２５号；米国特許
第５，５６９，８２５号；米国特許第５，６６１，０１６号；および米国特許第
５，５４５，８０６号参照。

【０１４６】 本発明はまた、生体試料中のアミノペプチダーゼタンパク質の存在を検出する
ために抗体を使用するためのキットを包含する。このキットは、標識されたまた
は標識可能な抗体などの抗体、および、生体試料中のアミノペプチダーゼを検出
するための化合物または物質；試料中のアミノペプチダーゼの量を決定する手段
；および、試料中のアミノペプチダーゼを標準物質と比較する手段を含むことが
できる。化合物または物質は、適切な容器にパッケージングできる。このキット
はさらに、アミノペプチダーゼを検出するためにキットを使用するための説明書
を含むことができる。

【０１４７】 ポリヌクレオチド 配列番号２のヌクレオチド配列は、寄託ヒトｃＤＮＡをシークエンスすること
により得られた。従って、寄託クローンの配列は、２つの間のあらゆる矛盾に関
して制御し、配列番号２の配列への任意の言及は、寄託ｃＤＮＡの配列への言及
を含む。

【０１４８】 特に開示したｃＤＮＡは、配列番号２のコード領域および５’および３’非翻
訳配列を含む。

【０１４９】 本発明は、新しいアミノペプチダーゼをコードする単離ポリヌクレオチドを提
供する。用語「アミノペプチダーゼポリヌクレオチド」または「アミノペプチダ
ーゼ核酸」は、配列番号２または寄託ｃＤＮＡに示した配列を意味する。用語「
アミノペプチダーゼポリヌクレオチド」または「アミノペプチダーゼ核酸」はさ
らに、アミノペプチダーゼポリヌクレオチドの変異形および断片を含む。

【０１５０】 「単離」アミノペプチダーゼ核酸は、アミノペプチダーゼ核酸の天然源に存在
する他の核酸から分離されたものである。好ましくは、「単離」核酸は、核酸の
由来する生物のゲノムＤＮＡ中のアミノペプチダーゼ核酸（すなわち、核酸の５
’および３’末端に位置する配列）に天然にフランキングする配列を含まない。
しかし、例えば約５ＫＢまでの、いくつかのフランキングヌクレオチド配列が存
在し得る。重要な点は、アミノペプチダーゼ核酸が、組換え発現、プローブおよ
びプライマーの調製、およびアミノペプチダーゼ核酸配列に特定した他の使用な
どの、本明細書に記載した特定の操作を受けることができるように、フランキン
グ配列から単離されていることである。

【０１５１】 さらに、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ分子などの「単離」核酸分子は、他の細胞物質
、または組換え技術により産生された場合には培養培地、または、化学合成され
た場合には化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まないことができる
。しかし、核酸分子は、他のコードまたは調節配列に融合でき、依然として単離
されていると考える。

【０１５２】 いくつかの場合では、単離物質は、組成物（例えば、他の物質を含む粗抽出物
）、緩衝系または試薬混液の一部を形成する。他の環境では、物質は、例えばＰ
ＡＧＥまたはＨＰＬＣなどのカラムクロマトグラフィーにより決定されるように
、実質的に均一に精製し得る。好ましくは、単離核酸は、存在する全巨大分子種
の少なくとも約５０、８０または９０％（モルを基準に）を含む。

【０１５３】 例えば、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子は、単離されていると考える。
単離ＤＮＡ分子のさらなる例は、異種宿主細胞に維持されている組換えＤＮＡ分
子または溶液中の精製（部分または実質的に）ＤＮＡ分子を含む。単離ＲＮＡ分
子は、本発明の単離ＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物を含む
。本発明に記載の単離核酸分子は、合成的に製造されたかかる分子を含む。

【０１５４】 いくつかの場合、単離物質は、組成物（または例えば、他の物質を含む粗抽出
物）、緩衝系または試薬混液の一部を形成する。他の環境では、物質は、例えば
ＰＡＧＥまたはＨＰＬＣなどのカラムクロマトグラフィーにより決定されるよう
に、実質的に均一に精製し得る。好ましくは、単離核酸は、存在する全巨大分子
種の少なくとも約５０、８０または９０％（モルを基準に）を含む。

【０１５５】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドは、成熟タンパク質と、追加のアミノま
たはカルボキシ末端アミノ酸、または成熟ポリペプチドの内側のアミノ酸（成熟
形が、例えば１つより多いポリペプチド鎖を有する場合）をコードできる。かか
る配列は、とりわけ、前駆体から成熟形までタンパク質をプロセシングするのに
役割を果たし得、タンパク質輸送を容易にし得、タンパク質の半減期を延長また
は短縮し得、またはアッセイまたは産生のためにタンパク質の操作をし易くし得
る。一般にインサイツの場合、追加のアミノ酸は、細胞酵素により成熟タンパク
質からプロセシングを受けて除去され得る。

【０１５６】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのみをコードする
配列、成熟ポリペプチドおよびリーダー配列または分泌配列などの追加のコード
配列（例えばプレプロまたはプロタンパク質配列）をコードする配列、成熟ポリ
ペプチド、追加のコード配列を含むまたは含まない、および追加の非コード配列
、例えば転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシングおよびポリアデニル化シ
グナルを含む）、ｍＲＮＡのリボソーム結合および安定化に役割を果たす転写さ
れるが翻訳されない、イントロンおよび非コード５’および３’配列をコードす
る配列を含むがこれに限定されない。さらに、ポリヌクレオチドは、例えば、精
製を容易にするペプチドをコードするマーカー配列に融合させ得る。

【０１５７】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ形で、または
、クローニングにより得られたまたは化学合成技術またはその組合せにより製造
されたｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む、ＤＮＡ形であり得る。核酸、特にＤ
ＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖核酸は、コード鎖（センス鎖）
または非コード鎖（アンチセンス鎖）であり得る。

【０１５８】 アミノペプチダーゼ核酸は、ヒト内皮細胞ｃＤＮＡに対応する、配列番号２に
示したヌクレオチド配列を含むことができる。

【０１５９】 １つの実施形態において、アミノペプチダーゼ核酸は、コード領域のみを含む
。

【０１６０】 本発明はさらに、遺伝子コードの縮重に因り配列番号２に示したヌクレオチド
配列とは異なり、従って、配列番号２に示したヌクレオチド配列によりコードさ
れるのと同じタンパク質をコードする、変異形アミノペプチダーゼポリヌクレオ
チドおよびその断片を提供する。

【０１６１】 本発明はまた、本明細書に記載した変異形ポリペプチドをコードするアミノペ
プチダーゼ核酸分子を提供する。かかるポリヌクレオチドは、天然、例えば対立
遺伝子変異形（同じ遺伝子座）、相同体（異なる遺伝子座）およびオルトログ（
異なる生物）であり得るか、または、組換えＤＮＡ法により、または化学合成に
より作成し得る。かかる非天然変異形は、ポリヌクレオチド、細胞、または生物
に適用されるものを含む、変異誘発技術により作成し得る。従って、上記に考察
したように、変異形は、ヌクレオチド置換、欠失、逆位および挿入を含むことが
できる。

【０１６２】 典型的には、変異形は、配列番号２の核酸分子およびその相補物と実質的な同
一性を有する。変化は、コードおよび非コード領域の一方または両方で生じ得る
。変異は、保存的および非保存的アミノ酸置換の両方を生じ得る。

【０１６３】 オルトログ、相同体、および対立遺伝子変異形は、当分野で公知の方法を使用
して同定できる。これらの変異形は、典型的には、配列番号２に示したヌクレオ
チド配列またはこの配列の断片に少なくとも約６０〜６５％、６５〜７０％、７
０〜７５％、より典型的には少なくとも約８０〜８５％、最も典型的には約９０
〜９５％またはそれ以上相同性である、アミノペプチダーゼをコードするヌクレ
オチド配列を含む。かかる核酸分子は、ストリンジェントな条件下で、配列番号
２に示したヌクレオチド配列または配列の断片にハイブリダイズできるとして容
易に同定できる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、一般的な相同
性、例えばポリＡ配列、または全てまたは大半のタンパク質、メタロプロテアー
ゼ、全ての亜鉛結合タンパク質、Ｍ１ファミリーの全てのタンパク質、または全
てのアミノペプチダーゼに共通の配列などの一般的な相同性に因る場合、実質的
な相同性を示さないと理解される。さらに、変異形は、本発明より前に開示され
得る全ての核酸配列を含まないと理解する。

【０１６４】 本明細書に使用したような用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
する」は、互いに少なくとも約５０〜５５％相同であるポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列が、典型的に互いにハイブリダイズしたままである、ハイブ
リダイゼーションおよび洗浄の条件を記載するものとする。条件は、互いに少な
くとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０
％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％またはそれ以上同一である配列が
、互いにハイブリダイズしたままであるようなものであり得る。かかるストリン
ジェントな条件は当業者に公知であり、分子生物学の現在のプロトコル、Ｊｏｈ
ｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１〜６．３．６に
見出すことができ、これは参考として援用する。ストリンジェントなハイブリダ
イゼーションの一例は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム
（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、次いで、５０〜６５℃での０．２×
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄である。別の非限定的な例では、
核酸分子を、４５℃の６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で
ハイブリダイズさせ、次いで、室温の０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で１回
以上の低ストリンジェンシーで洗浄、または４２℃の０．２×ＳＳＣ／０．１％
ＳＤＳ中で１回以上中程度のストリンジェンシーで洗浄、またはより高ストリン
ジェンシーで６５℃の０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で洗浄する。１つの実
施形態において、ストリンジェントな条件下で配列番号２の配列にハイブリダイ
ズする単離核酸分子は、天然核酸分子に対応する。本明細書に使用したような「
天然」核酸分子は、天然に存在する（例えば天然タンパク質をコードする）ヌク
レオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を意味する。

【０１６５】 当業者に理解されるように、正にその条件は、経験的に決定でき、イオン強度
、温度およびホルムアミドなどの不安定化剤またはＳＤＳなどの変性剤の濃度に
依存する。所望のハイブリダイゼーション条件の決定に考慮する他の因子は、核
酸配列の長さ、塩基組成、ハイブリダイズしている配列間のミスマッチ％、およ
び、他の同一でない配列内の配列のサブセットの発生頻度を含む。従って、等価
な条件は、２つの核酸分子の間の類似した程度の同一性または類似性を維持しつ
つ、これらのパラメータの１つ以上を変化することにより決定できる。

【０１６６】 本発明はまた、ストリンジェントな条件下で配列番号２のヌクレオチド配列ま
たは配列番号２の相補物にハイブリダイズする、一本鎖または二本鎖断片または
部分を含む、単離核酸を提供する。１つの実施形態において、核酸は、配列番号
２および配列番号２の相補物のヌクレオチド配列の一部からなる。本発明の核酸
断片は、少なくとも約１５、好ましくは少なくとも約１８、２０、２３または２
５ヌクレオチドであり、３０、４０、５０、１００、２００、５００またはそれ
以上のヌクレオチド長であり得る。本明細書に記載した抗原性タンパク質または
ポリペプチドをコードする、より長い断片、例えば３０またはそれ以上のヌクレ
オチド長が有用である。

【０１６７】 さらに、本発明は、全長アミノペプチダーゼポリヌクレオチドの断片を含む、
ポリヌクレオチドを提供する。断片は、一本鎖または二本鎖であり得、ＤＮＡま
たはＲＮＡを含み得る。断片は、コードまたは非コード配列から得ることができ
る。

【０１６８】 別の実施形態において、単離アミノペプチダーゼ核酸は、全コード領域をコー
ドする。別の実施形態において、単離アミノペプチダーゼ核酸は、約アミノ酸６
から最後のアミノ酸までであり得る、成熟タンパク質に対応する、配列をコード
する。他の断片は、本明細書に記載したアミノ酸断片をコードするヌクレオチド
配列を含む。

【０１６９】 従って、アミノペプチダーゼ核酸断片は、さらに、本明細書に記載した領域に
対応する配列、これも記載したサブ領域、および特定の機能的部位を含む。アミ
ノペプチダーゼ核酸断片はまた、上記に記載した領域、セグメント、および他の
機能的部位の組合せを含む。当業者は、可能な多くの順列が分かるだろう。

【０１７０】 ドメインまたは部位の位置が、コンピューター解析により予測されている場合
、当業者は、これらのドメインを構成しているアミノ酸残基は、ドメインを規定
するのに使用した基準に応じて変化できることを理解するだろう。

【０１７１】 しかし、アミノペプチダーゼ断片は、全遺伝子を含まない、任意のアミノ酸配
列を含むと理解される。

【０１７２】 本発明はまた、本明細書に記載したアミノペプチダーゼタンパク質のエピトー
プ含有領域をコードする、アミノペプチダーゼ核酸断片を提供する。

【０１７３】 本発明に記載の核酸断片は、本発明より前に開示され得る断片を包含するもの
ではない。

【０１７４】 ポリヌクレオチド使用 本発明のヌクレオチド配列は、「質問配列」として使用して、公共データベー
スに対する探索を実施し、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同
定できる。かかる探索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２１５：４０３〜１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バー
ジョン２．０）を使用して実施できる。ＢＬＡＳＴタンパク質探索は、ＸＢＬＡ
ＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長さ＝３を用いて実施し、本発明のタン
パク質に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のギャップを入れた
アラインメントを得るために、ギャップを入れたＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕ
ｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）３３８９
〜３４０２に記載のように利用できる。ＢＬＡＳＴおよびギャップを入れたＢＬ
ＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ
およびＮＢＬＡＳＴ）のデフォールトプログラムを使用できる。ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照。

【０１７５】 本発明の核酸断片は、以下に記載したようなアッセイのプローブまたはプライ
マーを提供する。「プローブ」は、核酸の相補鎖に塩基特異的にハイブリダイズ
するオリゴヌクレオチドである。かかるプローブは、Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９１
）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７〜１５００に記載ような、ポリペプチド核
酸を含む。典型的には、プローブは、高ストリンジェントな条件下で、配列番号
２に示した核酸配列およびその相補物の少なくとも約１５、典型的には約２０〜
２５、より典型的には約４０、５０または７５の連続ヌクレオチドにハイブリダ
イズする、ヌクレオチド配列の領域を含む。より典型的には、プローブはさらに
、標識、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子を含む。

【０１７６】 本明細書に使用したような用語「プライマー」は、本明細書に記載したものを
含むがこれに限定されない、公知の方法（例えばＰＣＲ、ＬＣＲ）を使用して、
鋳型特異的ＤＮＡの開始点として作用する、一本鎖オリゴヌクレオチドを意味す
る。プライマーの適切な長さは、特定の用途に依存するが、典型的には約１５か
ら３０ヌクレオチドの範囲である。用語「プライマー部位」は、プライマーがハ
イブリダイズする標的ＤＮＡの領域を意味する。用語「プライマー対」は、増幅
する核酸配列の５’末端とハイブリダイズする５’（上流）プライマーおよび増
幅する配列の相補物とハイブリダイズする３’（下流）プライマーを含む、プラ
イマーセットを意味する。

【０１７７】 従って、アミノペプチダーゼポリヌクレオチドは、プローブ、プライマーに、
および生物学的アッセイに有用である。

【０１７８】 ポリヌクレオチドを使用して、本明細書に記載のアッセイのように、アミノペ
プチダーゼの特性または機能を評価する場合、全ｃＤＮＡの全部またはそれより
少ないものが有用であり得る。アゴニストまたはアンタゴニスト活性の評価など
の、アミノペプチダーゼ機能に特に指向したアッセイは、既知の断片の使用を包
含する。さらに、アミノペプチダーゼ機能を評価する診断法はまた、本発明より
前に知られ得る断片を含む、任意の断片を用いて実施できる。同様に、アミノペ
プチダーゼ機能不全の治療に関与する方法において、当分野で既知であり得る断
片を含む、全ての断片が包含される。

【０１７９】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのハイ
ブリダイゼーションプローブとして、配列番号１に記載のポリペプチドをコード
する全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離、および、配列番号１に示した同
じポリペプチドを生じる変異形または本明細書に記載した他の変異形に対応する
ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するのに有用である。変異形は、配列番号
１に示したポリペプチドを単離したのと同じ組織および生物、同じ生物の異なる
組織から、または異なる生物から単離できる。この方法は、発達的に制御され、
それ故、生物の発達中の異なる時点で同じ組織または異なる組織に発現され得る
、遺伝子およびｃＤＮＡの単離に有用である。

【０１８０】 プローブは、アミノペプチダーゼをコードする遺伝子の全長に沿った任意の配
列に対応できる。従って、それは、５’非コード領域、コード領域、および３’
非コード領域から得ることができる。

【０１８１】 核酸プローブは、例えば、配列番号２の全長ｃＤＮＡまたはその断片、例えば
少なくとも１２、１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド
長であり得、ストリンジェントな条件下でｍＲＮＡまたはＤＮＡに特異的にハイ
ブリッド形成するに十分である。

【０１８２】 本明細書に記載のポリヌクレオチド断片はまた、本明細書に記載したより大き
な断片または全長ポリヌクレオチドを合成するのに有用である。例えば、断片は
、ｍＲＮＡの任意の部分にハイブリッド形成でき、より長いまたは全長ｃＤＮＡ
を産生できる。

【０１８３】 断片はまた、所望の長さおよび配列のアンチセンス分子を合成するのに有用で
ある。

【０１８４】 本発明のアンチセンス核酸は、配列番号２のヌクレオチド配列を使用して設計
でき、当分野で公知の方法を使用して化学合成および酵素ライゲーション反応を
使用して作成できる。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌ
クレオチド）は、分子の生物学的安定性を増加させるように、または、アンチセ
ンス核酸とセンス核酸の間に形成される二本鎖の物理的安定性を増加させるよう
に設計された、天然ヌクレオチドまたは様々に修飾したヌクレオチドを使用して
、化学合成でき、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌク
レオチドを使用できる。アンチセンス核酸の作成に使用できる修飾ヌクレオチド
の例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５
−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−
（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル
−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウ
ラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルア
デニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン
、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチル
シトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラ
シル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエ
オシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２
−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ
）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５
−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチ
ルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ
酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−
カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリ
ンを含む。別に、アンチセンス核酸は、核酸をアンチセンス方向でサブクローニ
ングしておいた発現ベクターを使用して生物学的に産生できる（すなわち、挿入
核酸から転写されるＲＮＡは、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である
）。

【０１８５】 さらに本発明の核酸分子は、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で修飾して、
例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解度を向上できる。例
えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸を作成でき
る（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ４：５参照）。本明細書に使用したような用語「ペプチド核
酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格が、プソイドペプチド骨
格により置換され、唯４つの天然核塩基が保持されている、核酸模倣体、例えば
ＤＮＡ模倣体を意味する。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下で、ＤＮ
ＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能とすることが示された
。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐら（１９９６）上記；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ
’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９３：１４６７０に記載のような、標準的な固相ペプチド合成プロトコルを使用
して実施できる。ＰＮＡを、親油性または他のヘルパー基をＰＮＡに付着するこ
とにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成により、またはリポソームの使用または
当分野で既知の薬物送達の他の技術により、さらに修飾して、例えば、その安定
性、特異性または細胞取込みを増強できる。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈ
ｙｒｕｐ（１９９６）上記、Ｆｉｎｎら（１９９６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．２４（１７）：３３５７〜６３、Ｍａｇら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：５９７３、およびＰｅｔｅｒｓｅｒら（１９７５）
Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９に記載のよ
うに実施できる。

【０１８６】 本発明の核酸分子および断片はまた、ペプチド（例えばインビボで宿主細胞の
アミノペプチダーゼに標的化するための）、または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉ
ｎｇｅｒら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：
６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開公報ＷＯ８８／０
９１８参照）または血液脳関門（例えばＰＣＴ公開公報ＷＯ８９／１０１３４参
照）を横切って輸送を促進する物質などの他の添加基を含むことができる。さら
に、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションにより引き起こされる切断
物質（例えば、Ｋｒｏｌら（１９８８）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９
５８〜９７６参照）または介在物質（例えばＺｏｎ（１９８８）Ｐｈａｒｍ Ｒ
ｅｓ．５：５３９〜５４９参照）で修飾できる。

【０１８７】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドはまた、アミノペプチダーゼポリヌクレ
オチドの任意の特定の領域を増幅するためのＰＣＲプライマーとして有用である
。

【０１８８】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドはまた、組換えベクターの作成に有用で
ある。かかるベクターは、アミノペプチダーゼポリペプチドの一部または全部を
発現する、発現ベクターを含む。ベクターはまた、アミノペプチダーゼ遺伝子お
よび遺伝子産物のインサイツ発現を変化させるための、別のポリヌクレオチド配
列、例えば細胞ゲノムに組込むために使用される挿入ベクターを含む。例えば、
内因性アミノペプチダーゼコード配列は、１つ以上の特異的に導入した変異を含
む、コード領域の全部または一部を用いた相同的組換えを介して置換できる。

【０１８９】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドはまた、アミノペプチダーゼタンパク質
の抗原性部分を発現するのに有用である。

【０１９０】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドはまた、ＦＩＳＨなどのインサイツハイ
ブリダイゼーション法（この技術の総説については、Ｖｅｒｍａら（１９８８）
ヒト染色体：基本的技術マニュアル（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨ
ーク）および体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングの手段により、アミノペプ
チダーゼポリヌクレオチドの染色体位置を決定するプローブとして有用である。
染色体への配列のマッピングは、これらの配列を、疾病に関連した遺伝子と相関
させる重要な第一段階である。

【０１９１】 染色体マッピングの試薬を個々に使用して、１つの染色体またはその染色体上
の１つの部位に印しをつけることができるか、または試薬のパネルに、複数の部
位および／または複数の染色体に印しをつけるのに使用できる。遺伝子の非コー
ド領域に対応する試薬は、実際に、マッピングの目的に好ましい。コード配列は
、遺伝子ファミリー内に保存されているようであり、従って、染色体マッピング
中の交差ハイブリダイゼーションの機会は増加する。

【０１９２】 一旦配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理的
位置を、遺伝子マップデータと相関できる（かかるデータは、ジョンホプキンズ
大学ウェルチ医学図書館を通してオンラインで入手できる、例えば、Ｖ．ＭｃＫ
ｕｓｉｃｋ、ヒトのメンデル遺伝に見出される）。次いで、同じ染色体領域にマ
ッピングされた遺伝子と疾病の間の関係を、例えばＥｇｅｌａｎｄら（１９８７
）Ｎａｔｕｒｅ３２５：７８３〜７８７）に記載の、連鎖解析により同定できる
（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）。

【０１９３】 さらに、特定の遺伝子に関連した疾病に罹患した個体と、その疾患に罹患して
いない個体の間のＤＮＡ配列の差異を決定できる。変異が、罹患個体の幾人また
は全員に観察され、罹患していない個体には全く観察されない場合、変異は、特
定の疾病の原因物質である可能性がある。罹患個体と罹患していない個体の比較
は、一般に、最初に、染色体配列から見えるか、またはそのＤＮＡ配列に基づい
たＰＣＲを使用して検出できる、欠失または転位置などの染色体の構造的変化を
探すことを含む。最終的に、数人の個体由来の遺伝子の完全なシークエンスを実
施し、変異の存在を確認し、多形からの変異を識別できる。

【０１９４】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドプローブはまた、例えば、遺伝子複製が
生じるかどうか、および複製が全ての組織または組織のサブセットでのみ生じる
かどうかの、組織分布に関する、アミノペプチダーゼをコードする遺伝子および
その変異形の存在パターンを決定するのに有用である。遺伝子は、天然に存在し
得るか、または、細胞、組織、または生物に外的に導入できる。

【０１９５】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドはまた、本明細書に記載したポリヌクレ
オチドをコードする遺伝子から産生されたｍＲＮＡの全部または一部に対応する
リボザイムを設計するのに有用である。

【０１９６】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドはまた、アミノペプチダーゼポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドの一部または全部を発現している宿主細胞の作成に有
用である。

【０１９７】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドはまた、アミノペプチダーゼポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドの全部または一部を発現しているトランスジェニック
動物の作成に有用である。

【０１９８】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドはまた、アミノペプチダーゼポリペプチ
ドの一部または全部を発現する、ベクターを作成するのに有用である。

【０１９９】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドはまた、アミノペプチダーゼ核酸発現の
レベルを決定するハイブリダイゼーションプローブとして有用である。従って、
プローブを使用して、細胞、組織または生物中のアミノペプチダーゼ核酸の存在
を検出またはそのレベルを決定することができる。レベルが決定される核酸は、
ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。従って、本明細書に記載したポリペプチドに対応す
るプローブを使用して、特定の細胞、組織、または生物中の遺伝子コピー数を評
価できる。これは、アミノペプチダーゼ遺伝子の増幅がある場合には、特に関連
性がある。

【０２００】 別に、プローブを、インサイツハイブリダイゼーション内容に使用して、染色
体エレメント上として、またはアミノペプチダーゼ遺伝子が、例えば均一に染色
した領域として、普通見られない、染色体に組込まれたものとして、アミノペプ
チダーゼ遺伝子の余剰コピーの位置を評価できる。

【０２０１】 これらの使用は、正常に比べて、アミノペプチダーゼ発現の増加または減少に
関与する疾患、例えば増殖疾患、分化または発達疾患、または造血疾患の診断に
関連性がある。

【０２０２】 アミノペプチダーゼ発現が関連する疾患は、肺癌および大腸癌および糖尿病な
どのインスリン関連疾患を含むがこれに限定されない。

【０２０３】 アミノペプチダーゼは、図５および６に示した組織で発現される。従って、こ
の遺伝子は、これらの組織、特に肺、乳房および大腸に関与する疾患の治療に特
に関連性がある。

【０２０４】 従って、本発明は、試験試料を対象から得、核酸（例えばｍＲＮＡ、ゲノムＤ
ＮＡ）を検出する、アミノペプチダーゼ核酸の異常な発現または活性に関連した
疾病または疾患を同定する方法を提供し、ここでの核酸の存在は、核酸の異常な
発現または活性に関連した疾病または疾患に罹患またはその危険性のある対象の
診断となる。

【０２０５】 本発明の１つの態様は、異常な核酸発現または活性に関連した、疾病または疾
患に罹患しているか、または前記疾病または疾患を発達させる危険性があるかど
うかを決定するための、生体試料（例えば血液、血清、細胞、組織）に関する、
核酸発現並びに活性を決定する診断アッセイに関する。かかるアッセイは、予後
または予測目的で使用し、よって、核酸分子の発現または活性により特徴づけら
れるまたはそれに関連した、疾患の開始前に個体を予防的に治療することができ
る。

【０２０６】 インビトロでのｍＲＮＡの検出技術は、ノザンハイブリダイゼーションおよび
インサイツハイブリダイゼーションを含む。インビトロでのＤＮＡの検出技術は
、サザンハイブリダイゼーションおよびインサイツハイブリダイゼーションを含
む。

【０２０７】 プローブは、対象の細胞の試料中のアミノペプチダーゼをコードする核酸、例
えばｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを測定するなどの、アミノペプチダーゼを発現
する細胞または組織を同定するか、またはアミノペプチダーゼ遺伝子が変異した
かどうかを決定するための診断試験キットの一部として使用できる。

【０２０８】 核酸発現アッセイは、アミノペプチダーゼ核酸発現を調節する化合物（例えば
アンチセンス、ポリペプチド、ペプチド模倣体、小分子または他の薬物）を同定
する薬物スクリーニングに有用である。細胞を、候補化合物と接触させ、ｍＲＮ
Ａの発現を決定する。候補化合物の存在下でのｍＲＮＡの発現レベルを、候補化
合物の非存在下でのｍＲＮＡの発現レベルと比較する。次いで、候補化合物を、
この比較に基づいた核酸発現の調節因子として同定でき、例えば、異常核酸発現
により特徴づけられる疾患の治療に使用できる。調節因子は、核酸発現に影響を
及ぼす他の細胞成分と相互作用するなどにより、核酸に結合できるか、または間
接的に発現を調節できる。

【０２０９】 調節法は、インビトロ（例えば細胞を物質と共に培養することにより）または
別にインビボ（例えば遺伝子を対象に投与することにより）で患者またはトラン
スジェニック動物で実施できる。

【０２１０】 従って、本発明は、核酸によるアミノペプチダーゼ遺伝子発現に関連した疾患
を治療するのに使用できる化合物を同定する方法を提供する。この方法は、典型
的には、化合物が、アミノペプチダーゼ核酸の発現を調節する能力をアッセイし
、従って、望ましくないアミノペプチダーゼ核酸発現により特徴づけられる疾患
の治療に使用できる化合物を同定することを含む。

【０２１１】 アッセイは、細胞をベースとした系および細胞非含有系で実施できる。細胞を
ベースとしたアッセイは、アミノペプチダーゼ核酸を自然に発現している細胞ま
たは特定の核酸配列を発現するように遺伝子工学された組換え細胞を含む。

【０２１２】 別に、候補化合物は、インビボで患者でまたはトランスジェニック動物でアッ
セイできる。

【０２１３】 アミノペプチダーゼ核酸発現のアッセイは、ｍＲＮＡレベルなどの核酸レベル
の直接的アッセイ、または側副化合物のアッセイ（ペプチド加水分解）を含み得
る。さらに、アミノペプチダーゼ活性に応答してアップまたはダウンレギュレー
トされる遺伝子の発現もアッセイできる。この実施形態において、これらの遺伝
子の調節領域を、ルシフェラーゼなどのリポーター遺伝子に作動可能に連結でき
る。

【０２１４】 従って、アミノペプチダーゼ遺伝子発現の調節因子は、細胞を候補化合物と接
触させ、ｍＲＮＡの発現を決定する、方法で同定できる。候補化合物の存在下で
のアミノペプチダーゼｍＲＮＡの発現レベルを、候補化合物の非存在下でのアミ
ノペプチダーゼｍＲＮＡの発現レベルと比較する。次いで、候補化合物を、この
比較に基づいた核酸発現の調節因子として同定でき、例えば、異常な核酸発現に
より特徴づけられる疾患の治療に使用できる。ｍＲＮＡの発現が、候補化合物の
非存在下より存在下の方が、統計学的に有意に高い場合、候補化合物は、核酸発
現の刺激剤として同定される。核酸発現が、候補化合物の非存在下より存在下の
方が、統計学的に有意に低い場合、候補化合物は、核酸発現の阻害剤として同定
される。

【０２１５】 従って、本発明は、アミノペプチダーゼ核酸発現を調節する遺伝子調節因子と
して薬物スクリーニングにより同定された化合物を使用して、標的としての核酸
で治療する方法を提供する。調節は、核酸活性に対するアップレギュレーション
（すなわち活性化またはアゴニスト作用）またはダウンレギュレーション（抑制
またはアンタゴニスト作用）の両方を含む。治療は、核酸の異常な発現または活
性により特徴づけられる疾患のである。

【０２１６】 アミノペプチダーゼ発現が関連する疾患は、本明細書に考察した疾患、特に肺
癌および大腸癌および糖尿病などのインスリン関連疾患を含むがこれに限定され
ない。

【０２１７】 別に、アミノペプチダーゼ核酸発現の調節因子は、薬物または小分子が、アミ
ノペプチダーゼ核酸発現を阻害する限り、本明細書に記載したスクリーニングア
ッセイを使用して同定した小分子または薬物であり得る。

【０２１８】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドはまた、臨床試験または治療措置でアミ
ノペプチダーゼ遺伝子の発現または活性に対する化合物の調節効力をモニタリン
グするのに有用である。従って、遺伝子発現パターンは、化合物による、特に、
患者が耐性を発達し得る化合物による治療の効力を継続する指標として作用でき
る。遺伝子発現パターンはまた、化合物に対する罹患細胞の生理的応答を示すマ
ーカーとして作用できる。従って、かかるモニタリングにより、化合物の投与増
量または患者が耐性になっていない別の化合物の投与が可能となる。同様に、核
酸発現レベルが所望のレベルより低い場合、化合物の投与は相応して減少できる
。

【０２１９】 モニタリングは、例えば、以下のようであり得る：（ｉ）物質の投与前に、対
象から投与前試料を得；（ｉｉ）投与前試料中の本発明の特定のｍＲＮＡまたは
ゲノムＤＮＡの発現レベルを検出し；（ｉｉｉ）対象から１つ以上の投与後試料
を得；（ｉｖ）投与後試料中のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性の
レベルを検出し；（ｖ）投与前試料中のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現また
は活性のレベルを、投与後試料または試料群中のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと
比較し；そして（ｖｉ）それに応じて対象への物質の投与を増加または減少させ
る。

【０２２０】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドはまた、アミノペプチダーゼ核酸の質的
変化、特に、病態に至る質的変化の診断アッセイに有用である。ポリヌクレオチ
ドは、アミノペプチダーゼ遺伝子の変異およびｍＲＮＡなどの遺伝子発現産物の
検出に使用できる。ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションプローブとし
て使用し、アミノペプチダーゼ遺伝子の天然遺伝子変異を検出し、よって、変異
を有する対象が、変異により引き起こされる疾患の危険性があるかどうかを決定
できる。変異は、遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの欠失、付加、または置換、
逆位または転移などの染色体転位、異常なメチル化パターンなどのゲノムＤＮＡ
の修飾、または増幅などの遺伝子コピー数の変化を含む。機能不全に関連したア
ミノペプチダーゼ遺伝子の変異形の検出は、疾病がアミノペプチダーゼの過剰発
現、少量発現、または発現の変化から生じる場合に、活発な疾病または疾病への
感受性の診断手段を提供する。

【０２２１】 アミノペプチダーゼ遺伝子の変異は、様々な技術により核酸レベルで検出でき
る。ゲノムＤＮＡは直接解析できるか、または解析前にＰＣＲを使用することに
より増幅できる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡは、同じように使用できる。

【０２２２】 特定の実施形態において、変異の検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ Ｐ
ＣＲなどの、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３
，１９５号および第４，６８３，２０２号参照）、または別にライゲーション連
鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｒｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４１：１０７７〜１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）ＰＮ
ＡＳ ９１：３６０〜３６４）におけるプローブ／プライマーの使用を含み、後
者は、遺伝子の点変異の検出に特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａら（１９
９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６７５〜６８２参照）。こ
の方法は、患者から細胞の試料を収集し、試料の細胞から核酸（例えばゲノム、
ｍＲＮＡまたは両方）を単離し、核酸試料を、遺伝子（存在する場合）のハイブ
リダイゼーションおよび増幅が生じる条件下で遺伝子に特異的にハイブリダイズ
する１つ以上のプライマーと接触させ、そして、増幅産物の有無を検出するか、
または増幅産物のサイズを検出し、対照試料と長さを比較する段階を含み得る。
検出および挿入は、正常遺伝子型に比較した増幅産物のサイズの変化により検出
できる。点変異は、増幅ＤＮＡを、正常ＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡ配列に
ハイブリダイズすることにより同定できる。

【０２２３】 ＰＣＲ／ＬＣＲは、本明細書に記載の変異の検出法に使用する技術のいずれか
と共に、予備増幅段階として使用することが望ましくあり得ると期待される。

【０２２４】 別の増幅法は：自己維持配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４〜１８７８）、転写
増幅システム（Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８６：１１７３〜１１７７）、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ
ら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、または任意の
他の核酸増幅法を含み、次いで、当業者に公知の技術を使用して増幅分子を検出
する。これらの検出スキームは、かかる分子が非常に少数存在する場合には核酸
分子の検出に特に有用である。

【０２２５】 別に、アミノペプチダーゼ遺伝子の変異は、例えば、ゲル電気泳動により決定
される制限酵素消化パターンの変化により、直接同定できる。

【０２２６】 さらに、配列特異的リボザイム（米国特許第５，４９８，５３１号）を使用し
て、リボザイム切断部位の発生または消失により、特定の変異の存在について評
価できる。

【０２２７】 完全にマッチした配列を、ヌクレアーゼ切断消化アッセイにより、または融解
温度の差異により、ミスマッチ配列から識別できる。

【０２２８】 特定の位置の配列変化はまた、ＲＮアーゼおよびＳ１保護などのヌクレアーゼ
保護アッセイまたは化学的切断法により評価できる。

【０２２９】 さらに、変異アミノペプチダーゼ遺伝子と野生型遺伝子の間の配列の差異は、
直接的なＤＮＡシークエンスにより決定できる。様々な自動シークエンス方法を
、質量分析によるシークエンスを含む、診断アッセイ（（１９９５）Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４８）を実施する場合に利用できる（例えば、ＰＣ
Ｔ国際公開公報ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７〜１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３
）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７〜１５９）
。

【０２３０】 遺伝子の変異を検出する他の方法は、切断物質からの保護を使用して、ＲＮＡ
／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のミスマッチ塩基を検出し（Ｍｙｅｒｓら
（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２）；Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８
）ＰＮＡＳ ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら（１９９２）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ．２１７：２８６〜２９５）、変異および野生型核酸の電気泳動移動度
を比較し（Ｏｒｉｔａら（１９８９）ＰＮＡＳ ８６：２７６６；Ｃｏｔｔｏｎ
ら（１９９３）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５〜１４４；およびＨａｙａ
ｓｈｉら（１９９２）Ｇｅｎｅｌ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３〜
８９）、そして、勾配のある変性剤を含む、ポリアクリルアミドゲル中の変異ま
たは野生型断片の移動を、変性勾配ゲル電気泳動を使用してアッセイする（Ｍｙ
ｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５）方法を含む。アッセイの
感度は、二次構造が配列の変化に対してより感度の高い、（ＤＮＡよりむしろ）
ＲＮＡを使用することにより増強し得る。１つの実施形態において、対象の方法
は、電気泳動度の変化に基づいて、二本鎖ヘテロ二重鎖を分離するためのヘテロ
二重鎖を使用する（Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．７：５
）。点変異を検出する他の技術の例は、選択的なオリゴヌクレオチドハイブリダ
イゼーション、選択的増幅、および選択定プライマー伸長を含む。

【０２３１】 他の実施形態において、遺伝子変異は、試料および対照核酸、例えばＤＮＡま
たはＲＮＡを、数百または数千個のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度の
アレイにハイブリダイズすることにより同定できる（Ｃｒｏｎｉｎら（１９９６
）Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ７：２４４〜２５５；Ｋｏｚａｌら（１９９
６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：７５３〜７５９）。例えば、遺伝子
変異は、Ｃｒｏｎｉｎら、上記に記載のような容易に作成されたＤＮＡプローブ
を含む２次元アレイ中で同定できる。簡潔には、第一のハイブリダイゼーション
プローブアレイを使用して、試料または対照中のＤＮＡの長い配列中を走査し、
連続的に重複したプローブの線形アレイを作成することにより、配列間の塩基変
化を同定できる。この段階により、点変異の同定が可能となる。この段階に続い
て、検出される全ての変異形または変異体に相補的な、より小さな特殊プローブ
アレイを使用することにより、特定の変異の特徴づけが可能となる第二ハイブリ
ダイゼーションアレイを実施する。各変異アレイは、平行プローブセット、野生
型遺伝子に相補的なもの、および変異遺伝子に相補的なその他からなる。

【０２３２】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドはまた、必ずしも疾病を引き起こさない
が、治療様式に影響を及ぼす、遺伝子型について個体を試験するのに有用である
。従って、ポリヌクレオチドを使用して、個体の遺伝子型と、治療に使用する化
合物に対する個体の応答の間の関係（薬理ゲノミクス関係）を研究できる。この
場合、例えば、亜鉛に対する親和性の変化をもたらすアミノペプチダーゼ遺伝子
の変異により、標準的な亜鉛濃度で、過剰または減少した薬物作用が生じ得る。
従って、本明細書に記載したアミノペプチダーゼポリヌクレオチドを使用して、
個体における遺伝子変異含量を評価し、治療に適切な化合物または投与措置を選
択できる。

【０２３３】 従って、治療に影響を及ぼす遺伝子変異を示すポリヌクレオチドは、個体の治
療をテーラーメイドするのに使用できる診断標的を提供する。従って、これらの
多形を含む組換え細胞および動物の産生により、治療化合物および投与措置の効
果的な臨床設計が可能となる。

【０２３４】 この方法は、対照対象から対照生体試料を得、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡが
生体試料中で検出されるように、対照試料を、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検
出できる化合物または物質と接触させ、そして、対照試料中のｍＲＮＡまたはゲ
ノムＤＮＡの存在を、試験試料中のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と比較す
ることを含み得る。

【０２３５】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドはまた、配列が個体の染色体内の、染色
体上の特定の位置に同定された場合に、染色体同定にも有用である。第一に、Ｄ
ＮＡ配列を、インサイツまたは他の染色体特異的ハイブリダイゼーションにより
染色体に適合させる。配列はまた、所望の種からの個々の染色体を含む体細胞ハ
イブリッドのＰＣＲによるスクリーニングに使用できる、ＰＣＲプライマーを調
製することにより、特定の染色体に相関させることができる。プライマーに相同
な遺伝子を含む染色体を含むハイブリッドのみが、増幅断片を生じる。限局化は
、染色体断片を使用して達成できる。他の戦略は、標識したフロー選抜した染色
体でプレスクリーニングし、染色体特異的ライブラリーに対するハイブリダイゼ
ーションによりプレ選択することを含む。さらなるマッピング戦略は、伝統的に
使用されるものよりも短いプローブを用いたハイブリダイゼーションが可能とな
る、蛍光インサイツハイブリダイゼーションを含む。染色体マッピングの試薬を
個々に使用して、１つの染色体またはその染色体上の１つの部位に印しをつける
ことができるか、または試薬のパネルを、複数の部位および／または複数の染色
体に印しをつけるのに使用できる。遺伝子の非コード領域に対応する試薬は、実
際、マッピングの目的に好ましい。コード配列は、遺伝子ファミリー内に保存さ
れているようであり、従って、染色体マッピング中の交差ハイブリダイゼーショ
ンの機会は増加する。

【０２３６】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドはまた、少量の生体試料からの個体を同
定するのに使用できる。これは、例えば、制限酵素断片の長さ多形（ＲＦＬＰ）
を使用して実施し、個体を同定できる。従って、本明細書に記載のポリヌクレオ
チドは、ＲＦＬＰのＤＮＡマーカーとして有用である（米国特許第５，２７２，
０５７号参照）。

【０２３７】 さらに、アミノペプチダーゼ配列を使用して、個体のゲノム中の選択断片の実
際のＤＮＡ配列を決定する技術を提供することができる。従って、本明細書に記
載のアミノペプチダーゼ配列を使用して、配列の５’および３’末端から２つの
ＰＣＲプライマーを調製できる。次いで、これらのプライマーを使用して、その
後のシークエンス用に、個体由来のＤＮＡを増幅できる。

【０２３８】 このように調製した個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、各々の個体は
独特なセットのかかるＤＮＡ配列を有しているので、独特な個体の同定を提供で
きる。ヒトの対立遺伝子変異は、各５００塩基あたり、約１回の頻度で生じると
推定される。対立遺伝子変異は、これらの配列のコード領域である程度生じ、非
コード領域ではより頻度が高い。アミノペプチダーゼ配列を使用して、個体から
および組織からかかる同定配列を得ることができる。配列は、ヒトゲノムの独特
な断片を示す。本明細書に記載の各配列は、ある程度、標準物質として使用し、
これに対して個体由来のＤＮＡを、同定目的のために比較できる。

【０２３９】 配列からの試薬のパネルを使用して、個体に独特な同定データベースを作成す
る場合、それらの同じ試薬を使用して、その個体由来の組織を同定できる。独特
な同定データベースを使用して、生死を問わず個体の陽性の同定が、極めて少量
の組織試料から実施できる。

【０２４０】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドはまた、法医学的同定方法に使用できる
。ＰＣＲ技術を使用して、１つの毛包、体液（例えば血液、唾液または精液）な
どの、非常に少量の生体試料から採取したＤＮＡ配列を増幅できる。次いで、増
幅した配列を標準物質と比較でき、よって試料の起源の同定が可能となる。

【０２４１】 従って、アミノペプチダーゼポリヌクレオチドを使用して、例えば、別の「同
定マーカー」（すなわち、特定の個体に独特な別のＤＮＡ配列）を提供すること
により、ＤＮＡをベースとした法医学的同定の確実性を増強できる、ヒトゲノム
中の特定の遺伝子座に標的化した、例えばＰＣＲプライマーなどのポリヌクレオ
チド試薬を提供できる。上記したように、実際の塩基配列情報を、制限酵素によ
り生じた断片により形成されるパターンの正確な代替法として、同定に使用でき
る。非コード領域に標的化した配列は、より多くの多形が非コード領域に存在し
、よって、この技術を使用して個体を識別することがより容易になるために特に
有用である。

【０２４２】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドを使用してさらに、特定の組織を同定す
るための、例えばインサイツハイブリダイゼーション技術に使用できる、例えば
標識されたまたは標識可能なプローブなどのポリヌクレオチド試薬を提供できる
。これは、法医学病理学者が、起源が不明の組織を提示された場合に有用である
。アミノペプチダーゼプローブのパネルを使用して、種によりおよび／または臓
器の種類により組織を同定できる。

【０２４３】 同じように、これらのプライマーおよびプローブを使用して、混入について組
織培養物をスクリーニングできる（すなわち、培養液中の異なる細胞型の混合物
の存在についてスクリーニングする）。

【０２４４】 別に、アミノペプチダーゼポリヌクレオチドは、アンチセンスまたはリボザイ
ム作成物により、アミノペプチダーゼ遺伝子配列の転写または翻訳を遮断するの
に直接使用できる。従って、異常に高いまたは望ましくないアミノペプチダーゼ
遺伝子発現により特徴づけられる疾患において、核酸を直接治療に使用できる。

【０２４５】 従って、アミノペプチダーゼポリヌクレオチドは、細胞、組織および生物中で
のアミノペプチダーゼ遺伝子発現を制御するアンチセンス作成物として有用であ
る。ＤＮＡアンチセンスポリヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相
補的であるように設計され、転写を防止し、従ってアミノペプチダーゼタンパク
質の産生を防止する。アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡポリヌクレオチドは、ｍ
ＲＮＡにハイブリダイズし、従って、ｍＲＮＡのアミノペプチダーゼタンパク質
への翻訳を遮断する。

【０２４６】 核酸発現を阻害するに有用なアンチセンス分子の例は、開始コドンも含む配列
番号２の５’非翻訳領域の断片に相補的なアンチセンス分子、および、配列番号
２の３’非翻訳領域の断片に相補的であるアンチセンス分子を含む。

【０２４７】 別に、アンチセンス分子の１クラスを使用して、ｍＲＮＡを不活性化し、アミ
ノペプチダーゼ核酸の発現を減少できる。従って、これらの分子は、異常または
望ましくないアミノペプチダーゼ核酸発現により特徴づけられる疾患を治療でき
る。この技術は、ｍＲＮＡの翻訳能を減弱するｍＲＮＡの１つ以上の領域に相補
的なヌクレオチド配列を含む、リボザイムによる切断を含む。可能な領域は、コ
ード領域および特にアミノペプチダーゼタンパク質の触媒および他の機能的活性
に対応するコード領域を含む。

【０２４８】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドはまた、アミノペプチダーゼ遺伝子発現
の異常である、細胞を含む患者における、遺伝子療法用のベクターを提供する。
従って、生体外で工学して患者に戻した患者の細胞を含む、組換え細胞を、個体
に導入し、そこで、細胞は、所望のアミノペプチダーゼタンパク質を産生し、個
体を治療する。

【０２４９】 本発明はまた、生体試料中のアミノペプチダーゼ核酸の存在を検出するキット
を包含する。例えば、キットは、標識されたまたは標識可能な核酸などの試薬ま
たは生体試料中のアミノペプチダーゼ核酸を検出できる物質；試料中のアミノペ
プチダーゼ核酸の量を決定する手段；および、試料中のアミノペプチダーゼ核酸
の量を、標準物質と比較する手段を含む。化合物または物質は適切な容器にパッ
ケージングできる。キットはさらに、アミノペプチダーゼｍＲＮＡまたはＤＮＡ
を検出するキットの使用説明書を含むことができる。

【０２５０】 コンピューターで解読可能な手段 本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸配列はまた、その使用を容易にする様々
な媒体で提供される。本明細書に使用したような「提供される」は、本発明のヌ
クレオチドまたはアミノ酸配列を含む、単離核酸またはアミノ酸分子ではなく、
製造品を意味する。かかる製造品は、当業者が、天然または精製形で存在するよ
うな、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列、またはそのサブセットの検査に直接適
用できない手段を使用して、製造品を検査することのできる形でのヌクレオチド
またはアミノ酸配列、またはそのサブセット（例えばオープンリーディングフレ
ーム（ＯＲＦ）のサブセット）を提供する。

【０２５１】 この実施形態の１つの適用において、本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸配
列は、コンピューターで解読可能な媒体で記録できる。本明細書に使用したよう
な「コンピューターで解読可能な媒体」は、コンピューターにより直接解読およ
びアクセスできる任意の媒体を意味する。かかる媒体は、磁気保存媒体、例えば
フロッピーディスク、ハードディスク保存媒体、および磁気テープ；ＣＤ−ＲＯ
Ｍなどの光学保存媒体；ＲＡＭおよびＲＯＭなどの電子保存媒体；および、磁気
／光学保存媒体などのこれらのカテゴリーのハイブリッドを含むがこれに限定さ
れない。当業者は、現在知られているコンピューターで解読可能な媒体のいずれ
かを使用して、本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸配列が記録されているコン
ピューターで解読可能な媒体を含む製造品を創製する方法を容易に理解するだろ
う。

【０２５２】 本明細書に使用したような「記録」は、コンピューターで解読可能な媒体に情
報を保存するプロセスを意味する。当業者は、コンピューターで解読可能な媒体
に情報を記録する現在知られている方法のいずれかを採用して、本発明のヌクレ
オチドまたはアミノ酸配列情報を含む製造品を容易に作成できる。

【０２５３】 本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸配列が記録されているコンピューターで
解読可能な媒体を創製するための、様々なデータ保存構造が、当業者には入手可
能である。データ−保存構造の選択は、一般に、保存された情報にアクセスする
ために選択された手段に基づく。さらに、様々なデータプロセッサープログラム
およびフォーマットを使用して、コンピューターで解読可能な媒体上に本発明の
ヌクレオチド配列情報を保存できる。配列情報は、ワードパーフェクトおよびマ
イクロソフトワードなどの市販されているソフトウェアでフォーマットされたワ
ードプロセシングテキストファイルで提示できるか、または、ＤＢ２、Ｓｙｂａ
ｓｅ、Ｏｒａｃｌｅまたは類似物などのデータベース適用に保存された、ＡＳＣ
ＩＩファイルの形で提示できる。当業者は、任意の数のデータプロセッサー構造
化フォーマット（例えばテキストファイルまたはデータベース）を採用して、本
発明のヌクレオチド配列情報が記録されたコンピューターで解読可能な媒体を容
易に得ることができる。

【０２５４】 コンピューター解読形で本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸を提供すること
により、当業者は、慣用的に、様々な目的のために配列情報にアクセスできる。
例えば、当業者は、コンピューター解読形の本発明のヌクレオチドまたはアミノ
酸配列を使用して、データ保存手段内に保存された配列情報を用いて、配列また
は標的構造モチーフを配列情報と比較できる。探索手段を使用して、特定の標的
配列または標的モチーフに適合する、本発明の配列の断片または領域を同定する
。

【０２５５】 本明細書に使用したような「標的配列」は、６つ以上のヌクレオチドまたは２
つ以上のアミノ酸の任意のＤＮＡまたはアミノ酸配列であり得る。当業者は、標
的配列が長くなればなるほど、標的配列が、データベース中に無作為に存在する
可能性は低くなることを容易に認識できるだろう。標的配列の最も好ましい配列
長は、約１０から１００アミノ酸または約３０から３００ヌクレオチド残基であ
る。しかし、遺伝子発現およびタンパク質プロセシングに関与する配列断片など
の、市販の重要な断片は、より短い長さであり得ることがよく認識されるだろう
。

【０２５６】 本明細書に使用したような「標的構造モチーフ」または「標的モチーフ」は、
配列（群）が、標的モチーフのフォールディング時に形成される３次元立体配置
に基づいて選択された、任意の合理的に選択された配列または配列の組合せを意
味する。当分野で既知の様々な標的モチーフが存在する。タンパク質標的モチー
フは、酵素活性部位およびシグナル配列を含むがこれに限定されない。核酸標的
モチーフは、プロモーター配列、ヘアピン構造および誘導性発現エレメント（タ
ンパク質結合配列）を含むがこれに限定されない。

【０２５７】 当業者が、解析および他の配列との比較のための、コンピューター解読形で提
供された配列情報にアクセスできる、コンピューターソフトウェアは公共的に入
手できる。様々な既知のアルゴリズムが公共的に開示され、探索手段を実施する
ための様々な市販で入手できるソフトウェアがあり、本発明のコンピューターを
ベースとしたシステムで使用できる。かかるソフトウェアの例は、ＭａｃＰａｔ
ｔｅｒｎ（ＥＭＢＬ）、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸ（ＮＣＢＩＡ）を含む
がこれに限定されない。

【０２５８】 例えば、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．２１５：４０３〜４１０）およびＢＬＡＺＥ（Ｂｒｕｔｌａｇら（１９９３）
Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１７：２０３〜２０７）探索アルゴリズムをＳｙｂａｓｅ
システムで実行するソフトウェアを使用して、他のライブラリーからのＯＲＦま
たはタンパク質に対する相同性を含む、本発明の配列のオープンリーディングフ
レーム（ＯＲＦ）を同定できる。かかるＯＲＦは、タンパク質をコードする断片
であり、様々な反応および市販の有用な代謝物の産生に使用される酵素などの、
市販の重要なタンパク質の産生に有用である。

【０２５９】 ベクター／宿主細胞 本発明はまた、アミノペプチダーゼポリヌクレオチドを含むベクターを提供す
る。用語「ベクター」は、ベヒクル、好ましくは、アミノペプチダーゼポリヌク
レオチドを輸送できる核酸分子を意味する。ベクターが核酸分子である場合、ア
ミノペプチダーゼポリヌクレオチドは、ベクター核酸に共有結合している。本発
明のこの態様内で、ベクターは、プラスミド、一本鎖または二本鎖ファージ、一
本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクター、または人工染色体、例
えばＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、ＯＲ ＭＡＣを含む。

【０２６０】 ベクターは、染色体外エレメントとして宿主細胞で維持でき、そこでアミノペ
プチダーゼポリヌクレオチドのさらなるコピーを複製および産生する。別に、ベ
クターは、宿主細胞ゲノムに組込み得、宿主細胞が複製する時にアミノペプチダ
ーゼポリヌクレオチドのさらなるコピーを産生する。

【０２６１】 本発明は、アミノペプチダーゼポリヌクレオチドの維持（クローニングベクタ
ー）または発現用のベクター（発現ベクター）を提供する。ベクターは、原核細
胞または真核細胞またはその両方（シャトルベクター）で機能できる。

【０２６２】 発現ベクターは、ベクター中でアミノペプチダーゼポリヌクレオチドに作動可
能に連結し、よって、ポリヌクレオチドの転写が宿主細胞で可能である、シス作
用調節領域を含む。ポリヌクレオチドは、転写に影響を及ぼすことのできる別の
ポリヌクレオチドと共に、宿主細胞に導入できる。従って、第二のポリヌクレオ
チドは、シス調節制御領域と相互作用して、ベクターからのアミノペプチダーゼ
ポリヌクレオチドの転写を可能とする、トランス作用因子を提供し得る。別に、
トランス作用因子は、宿主細胞により提供され得る。最後に、トランス作用因子
は、ベクターそれ自体から産生し得る。

【０２６３】 しかし、いくつかの実施形態において、アミノペプチダーゼポリヌクレオチド
の転写および／または翻訳は、細胞非含有系で生じ得ることが理解される。

【０２６４】 本明細書に記載のポリヌクレオチドが作動可能に連結できる調節配列は、ｍＲ
ＮＡの転写を指令するプロモーターを含む。これらは、バクテリオファージλか
らの左プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉからのｌａｃ、ＴＲＰ、およびＴＡＣプロモ
ーター、ＳＶ４０からの初期および後期プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモータ
ー、アデノウイルス初期および後期プロモーター、およびレトロウイルス長反復
配列を含むがこれに限定されない。

【０２６５】 転写を促進する制御領域に加えて、発現ベクターはまた、転写を調節する領域
、例えばリプレッサー結合部位およびエンハンサーを含み得る。例は、ＳＶ４０
エンハンサー、サイトメガロウイルス最初期エンハンサー、ポリオーマエンハン
サー、アデノウイルスエンハンサー、およびレトロウイルスＬＴＲエンハンサー
を含む。

【０２６６】 転写開始および制御の部位を含むことに加えて、発現ベクターはまた、転写終
結に必要な配列、および転写領域では翻訳用のリボソーム結合部位を含むことが
できる。発現用の他の調節制御エレメントは、開始および終結コドン並びにポリ
アデニル化シグナルを含む。当業者は、発現ベクターに有用な、数多くの調節配
列を認識しているだろう。かかる調節配列は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１
９８９）分子クローニング：実験マニュアル第２版、コールドスプリングハーバ
ーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、ＮＹ）に記載されている
。

【０２６７】 様々な発現ベクターを使用して、アミノペプチダーゼポリヌクレオチドを発現
できる。かかるベクターは、染色体、エピソーム、およびウイルス由来ベクター
、例えば、細菌プラスミドから、バクテリオファージから、酵母エピソームから
、酵母人工染色体を含む酵母染色体エレメントから、バキュロウイルス、ＳＶ４
０などのパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウ
イルス、偽性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルスなどのウイルスから得られ
るベクターを含む。ベクターはまた、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝
子エレメントから得られたもの、例えばコスミドおよびファージミドなどの、こ
れらの起源の組合せから得られ得る。原核生物および真核生物宿主に適切なクロ
ーニングおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）分子クローニ
ング：実験マニュアル第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コー
ルドスプリングハーバー、ＮＹに記載されている。

【０２６８】 調節配列は、１つ以上の宿主細胞での構成的な発現（すなわち組織特異的）を
提供し得るか、または温度、栄養分添加、またはホルモンまたは他のリガンドな
どの外来性因子によるなどの、１つ以上の細胞型での誘導性発現を提供し得る。
原核生物および真核生物宿主で構成性および誘導性発現を提供する様々なベクタ
ーが、当業者には公知である。

【０２６９】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドは、公知の方法により、ベクター核酸に
挿入できる。一般に、最終的に発現されるＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列および発現
ベクターを、１つ以上の制限酵素で切断し、次いで断片をライゲートすることに
より、発現ベクターに接続する。制限酵素消化およびライゲーションの方法は、
当業者には公知である。

【０２７０】 適切なポリヌクレオチドを含むベクターを、公知の技術を使用して、増殖また
は発現に適切な宿主細胞に導入できる。細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐ
ｔｍｙｃｅｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを含むが
これに限定されない。真核細胞は、酵母、昆虫細胞、例えばショウジョウバエ、
動物細胞、例えばＣＯＳおよびＣＨＯ細胞、および植物細胞を含むがこれに限定
されない。

【０２７１】 本明細書に使用したように、融合タンパク質としてポリペプチドを発現するこ
とが望ましくあり得る。従って、本発明は、アミノペプチダーゼポリペプチドの
産生を可能とする、融合ベクターを提供する。融合ベクターは、組換えタンパク
質の発現を増加させ、組換えタンパク質の溶解度を増加させ、例えばアフィニテ
ィー精製用のリガンドとして作用することによりタンパク質の精製を補助するこ
とができる。タンパク質分解的切断部位を、融合部分に導入して、所望のポリペ
プチドを最終的に融合部分から分離できる。タンパク質分解酵素は、Ｘａ因子、
トロンビン、およびエンテロキナーゼを含むがこれに限定されない。典型的な融
合発現ベクターは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトー
スＥ結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ、標的組換えタンパク質に
融合する、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈら（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：３１〜４０）
、ｐＭＡＬ（ＭＡ州バーバーリー所在ニューイングランドバイオラブズ社）およ
びｐＲＩＴ（ＮＪ州ピスカタウェイ所在ファルマシア）を含む。適切な誘導性非
融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら（１９８８）Ｇ
ｅｎｅ ６９：３０１〜３１５）およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９
９０）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：６０〜８９）を含む。

【０２７２】 組換えタンパク質発現は、宿主細胞が、組換えタンパク質をタンパク質分解的
に切断する能力が損傷している、遺伝子的背景を提供することにより、宿主細菌
で最大化できる（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ（１９９０）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ １８５、アカデミックプレス、サンディエゴ、カルフォルニア１１９〜２８
）。別に、目的のポリヌクレオチド配列を変化して、例えばＥ．ｃｏｌｉなどの
特定の宿主細胞の優先的なコドン使用度を提供できる（Ｗａｄａら（１９９２）
Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１〜２１１８）。

【０２７３】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドはまた、酵母で作動する発現ベクターに
より発現できる。酵母、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの発現ベクターの例は
、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９
〜２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎら（１９８２）Ｃｅｌｌ ３０：９３３〜
９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｌｔｚら（１９８７）Ｇｅｎｅ ５４：１１３
〜１２３）、およびｐＹＥＳ２（ＣＡ州サンディエゴ所在インビトロゲン社）を
含む。

【０２７４】 アミノペプチダーゼポリヌクレオチドはまた、例えば、バキュロウイルス発現
ベクターを使用して、昆虫細胞で発現できる。培養昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞
）中でのタンパク質の発現に利用できるバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃシ
リーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１５６
〜２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗら（１９８９）Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ １７０：３１〜３９）を含む。

【０２７５】 本発明の特定の実施形態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、哺
乳類発現ベクターを使用して、哺乳類細胞で発現できる。哺乳類発現ベクターの
例は、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０
）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８
７〜１９５）を含む。

【０２７６】 本明細書に列挙した発現ベクターは、アミノペプチダーゼポリヌクレオチドの
発現に有用である、当業者に利用可能な公知のベクターのみを用いて提供する。
当業者は、本明細書に記載のポリヌクレオチドの維持増殖または発現に適切な他
のベクターを認識しているだろう。これらは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）
分子クローニング：実験マニュアル第２版、コールドスプリングハーバーラボラ
トリー、コールドスプリングハーバープレス、コールドスプリングハーバー、Ｎ
Ｙに見出される。

【０２７７】 本発明はまた、本明細書に記載の核酸配列が、逆配向でベクターにクローニン
グされているが、アンチセンスＲＮＡの転写を可能とする調節配列に作動可能に
連結している、ベクターを包含する。従って、アンチセンス転写物は、コードお
よび非コード領域の両方を含む、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列の全部
または一部に対して産生できる。このアンチセンスＲＮＡの発現は、センスＲＮ
Ａの発現に関して、上記した各パラメータにかける（調節配列、構成性または誘
導性発現、組織特異的発現）。

【０２７８】 本発明はまた、本明細書に記載のベクターを含む組換え宿主細胞を意味する。
それ故、宿主細胞は、原核細胞、酵母などの下等真核細胞、昆虫細胞などの他の
真核細胞、および哺乳類細胞などの高等真核細胞を含む。

【０２７９】 組換え宿主細胞は、本明細書に記載のベクター作成物を、細胞に、当業者には
容易に利用できる技術により導入することにより調製する。これらは、リン酸カ
ルシウム沈降法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン
性脂質媒介トランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、感染、リポフェクシ
ョン、およびＳａｍｂｒｏｏｋら（分子クローニング：実験マニュアル第２版、
コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバーラボラ
トリープレス、コールドスプリングハーバー、ＮＹ）に見出されるような他の技
術を含むがこれに限定されない。

【０２８０】 宿主細胞は、１より多くのベクターを含むことができる。従って、異なるヌク
レオチド配列を、同じ細胞の異なるベクター上に導入できる。同様に、アミノペ
プチダーゼポリヌクレオチドは、単独で、または、発現ベクターのトランス作用
因子を提供するようなアミノペプチダーゼポリヌクレオチドに関連していない他
のポリヌクレオチドと共に導入できる。１より多くのベクターを細胞に導入する
場合、ベクターは、独立的に導入するか、同時導入するか、またはアミノペプチ
ダーゼポリヌクレオチドベクターに接続できる。

【０２８１】 バクテリオファージおよびウイルスベクターの場合、これらは、感染および形
質導入の標準的な方法により、パッケージングまたは封入されたウイルスとして
細胞に導入できる。ウイルスベクターは、複製コンピテントでも、複製欠陥でも
よい。ウイルス複製が欠陥である場合、複製は、欠陥を補完する機能を提供する
宿主細胞で生じる。

【０２８２】 ベクターは、一般に、組換えベクター作成物を含む、細胞の亜個体群の選択を
可能とする、選択マーカーを含む。マーカーは、本明細書に記載のポリヌクレオ
チドを含む同じベクターに含まれ得るか、または別のベクターにあり得る。マー
カーは、原核宿主細胞では、テトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子、
および、真核宿主細胞ではジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性遺
伝子を含む。しかし、表現型特徴の選択を提供する任意のマーカーが効果的であ
る。

【０２８３】 成熟タンパク質を、細菌、酵母、哺乳類細胞、および他の細胞において、適切
な調節配列の制御下で産生できる場合、細胞非含有転写および翻訳系も、本明細
書に記載のＤＮＡ作成物から得られたＲＮＡを使用してこれらのタンパク質を産
生するのに使用できる。

【０２８４】 ポリペプチドの分泌が望まれる場合、適切な分泌シグナルをベクターに取込む
。シグナル配列は、アミノペプチダーゼポリペプチドに内因性でも、またはこれ
らのポリペプチドに異種であってもよい。

【０２８５】 ポリペプチドが培地に分泌されない場合、タンパク質を、凍結解凍、超音波処
理、機械的破壊、溶解剤の使用等を含む、標準的な破壊方法により、宿主細胞か
ら単離できる。次いで、ポリペプチドを、硫酸アンモニウム沈降法、酸抽出、ア
ニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラ
フィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、
または高速液体クロマトグラフィーを含む、公知の精製法により、回収および精
製できる。

【０２８６】 本明細書に記載のポリペプチドの組換え産生における宿主細胞に応じて、ポリ
ペプチドは、細胞に応じて、様々なグリコシル化パターンを有し得るか、または
、細菌で産生される場合にはおそらくグリコシル化されていないことも理解され
る。さらに、ポリペプチドは、宿主により媒介されるプロセスの結果として、い
くつかの場合では、最初に修飾されたメチオニンを含み得る。

【０２８７】 ベクターおよび宿主細胞の使用 「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、特定の対象細胞だけではなく、か
かる細胞の子孫または可能性ある子孫も意味すると理解する。特定の修飾は、変
異または環境的な影響に因り後代で生じ得るので、かかる子孫は、事実、親細胞
とは同一でないかもしれないが、依然として、本明細書に使用したような用語の
範囲内に含まれる。

【０２８８】 本明細書に記載のポリペプチドを発現する宿主細胞、特に組換え宿主細胞は、
様々な用途を有する。第一に、細胞は、アミノペプチダーゼタンパク質またはポ
リペプチドの産生に有用であり、これは、さらに精製して、所望の量のアミノペ
プチダーゼタンパク質または断片を産生できる。従って、発現ベクターを含む宿
主細胞は、ポリペプチド産生に有用である。

【０２８９】 宿主細胞はまた、アミノペプチダーゼまたはアミノペプチダーゼ断片に関与す
る細胞をベースとしたアッセイの実施に有用である。従って、天然アミノペプチ
ダーゼを発現している組換え宿主細胞は、アミノペプチダーゼ機能を刺激または
阻害する化合物についてアッセイするのに有用である。これは、亜鉛またはペプ
チド結合、転写または翻訳レベルでの遺伝子発現、および他の細胞成分との相互
作用を含む。

【０２９０】 宿主細胞はまた、これらの機能が影響を受ける、アミノペプチダーゼ変異体の
同定に有用である。変異体が天然に生じ、病態を発生する場合、変異を含む宿主
細胞は、天然アミノペプチダーゼに対するその効果により示されであろう、変異
アミノペプチダーゼに対して所望の効果を示す（例えば機能を刺激または阻害）
、化合物のアッセイに有用である。

【０２９１】 組換え宿主細胞はまた、本明細書に記載のキメラポリペプチドを発現して、本
明細書に開示したような異種ドメイン、セグメント、部位等により、活性化また
は活性化を抑制する化合物を評価するのに有用である。

【０２９２】 さらに、様々な機能の１つ以上が工学されて増加または減少している変異アミ
ノペプチダーゼを設計し、個体のアミノペプチダーゼタンパク質を増大または置
換するのに使用できる。従って、宿主細胞は、異常なアミノペプチダーゼを置換
するか、または治療結果を提供する異常アミノペプチダーゼを提供することによ
り、治療利点を提供できる。１つの実施形態において、細胞は、異常に活性であ
るアミノペプチダーゼを提供する。

【０２９３】 別の実施形態において、細胞は、異常に不活性であるアミノペプチダーゼを提
供する。これらのアミノペプチダーゼは、個体で内因性アミノペプチダーゼと競
合できる。

【０２９４】 別の実施形態において、活性化できないアミノペプチダーゼを発現している細
胞を、個体に導入して、亜鉛またはペプチドについて内因性アミノペプチダーゼ
と競合する。例えば、過剰な基質が治療様式の一部である場合、治療の特定の時
点で効率的に亜鉛を不活性化することが必要であり得る。分子について競合する
が、アミノペプチダーゼ活性化により影響を受け得ない分子を提供することは有
益であろう。

【０２９５】 宿主細胞ゲノムで内因性アミノペプチダーゼポリヌクレオチド配列のインサイ
ツ変化を可能とする、相同的組換え宿主細胞も産生できる。この技術は、ＷＯ９
３／０９２２２、ＷＯ９１／１２６５０、および米国特許第５，６４１，６７０
号に完全に記載されている。簡潔には、アミノペプチダーゼポリヌクレオチドに
対応する特定のポリペプチド配列またはアミノペプチダーゼ遺伝子に近位または
遠位の配列を、相同的組換えにより宿主細胞ゲノムに取込むことができ、ここで
遺伝子の発現に影響を及ぼすことができる。１つの実施形態において、内因性配
列の発現を増加または減少する調節配列を導入する。従って、アミノペプチダー
ゼタンパク質は、それを正常に発現していない細胞で産生できるか、または、ア
ミノペプチダーゼタンパク質の発現の増加により、特定のレベルでタンパク質を
正常に発現する細胞を得ることができる。別に、全遺伝子を欠失してもよい。ま
たさらに、特定の変異を、遺伝子の任意の所望の領域に導入して、変異アミノペ
プチダーゼタンパク質を産生できる。かかる変異は、例えば、本明細書に開示し
た特定の領域に導入できる。

【０２９６】 １つの実施形態において、宿主細胞は、変化したアミノペプチダーゼ遺伝子を
含む、トランスジェニック動物を産生するのに使用できる、受精卵または胚幹細
胞であり得る。別に、宿主細胞は、特定の細胞のサブセットを生じる幹細胞また
は他の初期組織前駆体であり得、これを動物でのトランスジェニック組織の産生
に使用できる。また、相同的組換えベクターの記載についてはＴｈｏｍａｓら、
Ｃｅｌｌ ５１：５０３（１９８７）参照。ベクターを、胚幹細胞系（例えば電
気穿孔法により）に導入し、導入遺伝子が、内因性アミノペプチダーゼ遺伝子と
相同的に組換えられている細胞を選択する（例えば、Ｌｉ，Ｅら（１９９２）Ｃ
ｅｌｌ ６９：９１５参照）。次いで、選択細胞を、動物（例えばマウス）の胚
盤胞に注入し、凝集キメラを形成する（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ、悪性奇形
腫および胚幹細胞：実践的なアプローチ、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲ
Ｌ、オックスフォード、１９８７）１１３〜１５２項参照）。次いで、キメラ胚
を、適切な偽妊娠雌育成動物に移植し、胚を成熟させる。その胚細胞に相同的組
換えＤＮＡを有する子孫を使用して、動物を繁殖することができ、ここで、動物
の全ての細胞が、導入遺伝子の生殖系列伝達により、相同的組換えＤＮＡを含む
。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物を作成する方法はさらに、Ｂｒ
ａｄｌｅｙ，Ａ（１９９１）生物工学の現在の見解 ２：８２３〜８２９および
ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０およびＷＯ９
３／０４１６９に記載されている。

【０２９７】 遺伝子工学した宿主細胞を使用して、非ヒトトランスジェニック動物を産生で
きる。トランスジェニック動物は、好ましくは、哺乳動物、例えばげっ歯類、例
えばラットまたはマウスであり、ここでは、動物の細胞の１つ以上が、導入遺伝
子を含む。導入遺伝子は、細胞のゲノムに取り込まれた外来性ＤＮＡであり、こ
れからトランスジェニック動物が発生し、トランスジェニック動物の１つ以上の
細胞型または組織中の成熟動物のゲノム中に残存している。これらの動物は、ア
ミノペプチダーゼタンパク質の機能を研究し、アミノペプチダーゼタンパク質活
性の調節因子を同定および評価するのに有用である。

【０２９８】 トランスジェニック動物の他の例は、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ
、ヤギ、ニワトリ、および両生類を含む。

【０２９９】 １つの実施形態において、宿主細胞は、アミノペプチダーゼポリヌクレオチド
配列が導入されている、受精卵または胚幹細胞である。

【０３００】 トランスジェニック動物は、核酸を、例えばマイクロインジェクション、レト
ロウイルス感染により、受精卵の雄前核に導入し、卵細胞を偽妊娠雌育成動物で
発生することにより産生できる。アミノペプチダーゼヌクレオチド配列のいずれ
かを、導入遺伝子として、ヒト以外の動物、例えばマウスのゲノムに導入できる
。

【０３０１】 発現ベクターに有用な調節または他の配列のいずれかが、トランスジェニック
配列の一部を形成できる。これは、既に含まれていない場合には、イントロン配
列およびポリアデニル化シグナルを含む。組織特異的調節配列（群）を、導入遺
伝子に作動可能に連結して、特定の細胞へのアミノペプチダーゼの発現を指令で
きる。

【０３０２】 胚操作およびマイクロインジェクションによりトランスジェニック動物、特に
マウスなどの動物を作成する方法は、当分野で慣用的になっており、米国特許第
４，７３６，８６６号および第４，８７０，００９号（両方共Ｌｅｄｅｒらによ
る）、Ｗａｇｎｅｒらによる米国特許第４，８７３，１９１号、およびＨｏｇａ
ｎ，Ｂ、マウス胚の操作（コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コ
ールドスプリングハーバー、Ｎ．Ｙ．、１９８６）に記載されている。類似の方
法が、トランスジェニック動物の産生に使用されている。トランスジェニック育
成動物は、ゲノム中の導入遺伝子の存在および／または動物の組織または細胞中
のトランスジェニックｍＲＮＡの発現に基づいて同定できる。次いで、トランス
ジェニック育成動物を使用して、導入遺伝子を有する追加の動物を交配した。さ
らに、導入遺伝子を有するトランスジェニック動物はさらに、他の導入遺伝子を
有する他のトランスジェニック動物に交配した。トランスジェニック動物はまた
、全動物または動物中の組織を、本明細書に記載の相同的組換えした宿主細胞を
使用して産生した、動物を含む。

【０３０３】 別の実施形態において、導入遺伝子の調節発現の可能である、選択系を含む、
トランスジェニック非ヒト動物を産生できる。かかる系の一例は、バクテリオフ
ァージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコ
ンビナーゼ系の記載について、例えば、Ｌａｋｓｏら（１９９２）ＰＮＡＳ ８
９：６２３２〜６２３６参照。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら（１９９１）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１〜１３５５参照。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナ
ーゼ系を使用して、導入遺伝子の発現を調節する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼお
よび選択タンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要である。か
かる動物は、例えば、２匹のトランスジェニック動物（一方は、選択タンパク質
をコードする導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子
を含む）を接合することにより、「二重」トランスジェニック動物の作成により
作成できる。

【０３０４】 本明細書に記載のヒト以外のトランスジェニック動物のクローンも、Ｗｉｌｍ
ｕｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０〜８１３およびＰＣＴ国際公
開公報ＷＯ９７／０７６６８およびＷＯ９７／０７６６９に記載の方法に従って
産生できる。簡潔には、トランスジェニック動物からの細胞、例えば体細胞を単
離し、誘導して、増殖周期から出てＧ₀期に入ることができる。次いで、静止状
態の細胞を、例えば、電気パルスの使用により、静止状態の細胞を単離したのと
同じ種の動物由来の除核卵母細胞に融合できる。次いで、再構成した卵母細胞を
、桑実胚または胚盤胞に発達するように培養し、次いで、偽妊娠雌育成動物に移
す。この雌育成動物の子孫の子供は、細胞、例えば体細胞を単離した動物のクロ
ーンである。

【０３０５】 本明細書に記載のポリペプチドを発現する組換え細胞を含むトランスジェニッ
ク動物は、インビボで本明細書に記載のアッセイを実施するのに有用である。従
って、インビボで存在し、結合または活性化に影響を及ぼし得る様々な生理学的
因子が、インビトロの細胞非含有または細胞をベースとしたアッセイから明らか
とならないであろう。従って、ペプチド相互作用、アミノペプチダーゼ機能およ
びペプチド相互作用に対する特定の変異アミノペプチダーゼの効果、およびキメ
ラアミノペプチダーゼの効果を含む、インビボのアミノペプチダーゼ機能をアッ
セイするための、ヒト以外のトランスジェニック動物を提供することが有用であ
る。また、１つ以上のアミノペプチダーゼ機能を実質的にまたは完全に消失する
変異である、ヌル変異の効果を評価することが可能である。

【０３０６】 医薬組成物 アミノペプチダーゼ核酸分子、タンパク質、タンパク質の調節因子、および抗
体（本明細書では「活性化合物」とも称する）は、対象、例えばヒトに投与する
のに適切な医薬組成物に取込むことができる。かかる組成物は、典型的には、核
酸分子、タンパク質、調節因子、または抗体および医薬的に許容される担体を含
む。

【０３０７】 用語「投与」は、最も広い意味で使用され、本発明の組成物を対象に導入する
任意の方法を含む。これは、対象に外から導入しておいた、ポリヌクレオチドの
インビボでの転写または翻訳による、インビボでポリペプチドまたはポリヌクレ
オチドを産生することを含む。従って、外来性組成物から対象で産生されたポリ
ペプチドまたは核酸は、用語「投与」に包含される。

【０３０８】 本明細書に使用したような「医薬的に許容される担体」なる語は、医薬投与に
適合性である、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および
抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤当を含むものとする。医薬的に活性な物質へ
のかかる媒体および物質の使用は、当分野で公知である。任意の慣用的な媒体ま
たは物質が活性化合物と適合性である限り、かかる媒体を、本発明の組成物に使
用できる。補助活性化合物も、組成物に取込むことができる。本発明の医薬組成
物は、その目的の投与経路に適合性であるように製剤化する。経口投与の例は、
非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘
膜、および直腸投与を含む。非経口、皮内、または皮下適用に使用する溶液また
は懸濁液は、以下の成分を含むことができる：注射用水、食塩水溶液、不揮発性
油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合
成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗細
菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミ
ンテトラ酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝
剤および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張力調整剤。ｐＨは、塩酸
または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整できる。非経口調製物を、ガ
ラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回投与バイ
アルに封入できる。

【０３０９】 注射使用に適切な医薬組成物は、無菌水溶液（水溶性の場合）または懸濁液、
および、無菌注射溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末を含む。静脈内投与
用の適切な担体は、生理的食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標
）（ＮＪ州パーシッパニー所在ＢＡＳＦ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を
含む。全ての場合、組成物は無菌でなければならず、容易にシリンジが使用でき
る程度に流動性であるべきである。製造および保存の条件下で安定でなければな
らず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して防御されていなければな
らない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール
、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールと）を含む溶媒ま
たは分散媒体、および適切なその混合物であり得る。適切な流動性は、例えば、
レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズ
の維持により、および、界面活性剤の使用により維持できる。微生物の作用の防
御は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、
フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成できる。多くの場合、
等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩
化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。注射可能な組成物の吸収延長は
、組成物に、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収
を遅延する物質を含めることによりもたらすことができる。

【０３１０】 無菌注射溶液は、活性化合物（例えば、アミノペプチダーゼタンパク質または
抗アミノペプチダーゼ抗体）を、必要な量、適切な溶媒に、必要であれば、上記
に列挙した成分の１つまたは組合せと共に取込み、次いで滅菌ろ過することによ
り調製できる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本分散媒体および上記に列
挙したものからの必要な他の成分を含む無菌ベヒクルに取込むことにより調製す
る。無菌注射溶液の調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製法は、真空乾燥およ
び凍結乾燥であり、これにより、以前に滅菌ろ過した溶液から、活性成分の粉末
と任意の追加の所望の成分が得られる。

【０３１１】 経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらは、ゼラ
チンカプセルに封入できるか、または圧縮して錠剤にできる。経口投与用に、物
質を、胃を切り抜けるように腸溶形で含め得るか、またはさらにコーティングま
たは混合して、既知の方法により消化管の特定の領域で放出されるようにできる
。経口治療投与の目的で、活性化合物を、添加剤と共に取込むことができ、錠剤
、トローチ剤、またはカプセル剤の形で使用できる。経口組成物はまた、うがい
薬として使用するために液体担体を使用して調製でき、ここでの液体担体中の化
合物は経口適用され、ヒューっと音を立て、吐くまたは飲み込む。医薬的に適合
性の結合剤および／または補助物質を組成物の一部として含めることができる。
錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤等は、以下の成分のいずれか、または性質
の類似した化合物を含むことができる：微結晶セルロース、トラガカントゴム、
またはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの添加剤；アルギ
ン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マ
グネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの
滑沢剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリ
チル酸メチル、またはオレンジ芳香などの芳香剤。

【０３１２】 吸入により投与するために、化合物は、適切な噴射剤、例えば二酸化炭素など
の気体を含む加圧容器または施薬器、または噴霧器からエアゾール形で送達する
。

【０３１３】 全身投与はまた、経粘膜または経皮手段により得る。経粘膜または経皮投与の
ために、透過する障壁に適切な透過剤を製剤に使用する。かかる透過剤は、一般
に、当分野で既知であり、例えば、経粘膜投与用に、洗浄剤、胆汁酸塩、および
フシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐剤の使用により
実施できる。経皮投与では、活性化合物を、一般に当分野で既知のような、軟膏
、ロウ膏、ゲル、またはクリームに製剤化する。

【０３１４】 化合物はまた、坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの慣用
的な坐剤基剤を用いて）または直腸送達用の保持浣腸の形で調製できる。

【０３１５】 １つの実施形態において、インプラントおよびマイクロカプセル化した送達系
を含む、放出制御製剤などのように、活性化合物は、生体からの急速な消失から
化合物を保護する担体を用いて調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリアンヒドリ
ド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸など
の、生物分解性で生物適合性ポリマーを使用できる。かかる製剤の調製法は、当
業者には明らかである。物質はまた、Ａｌｚａ社およびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａ
ｃｅｕｔｉｃａｌｓ者から市販で得ることができる。リポソーム懸濁液（ウイル
ス抗原に対するモノクローナル抗体と共に、感染細胞に標的化したリポソームを
含む）も、医薬的に許容される担体として使用できる。これらは、例えば、米国
特許第４，５２２，８１１号に記載のように、当業者に既知の方法に従って調製
できる。

【０３１６】 投与し易くし投与形を均一にするために、投与単位形で経口または非経口組成
物を製剤化することが特に利点がある。本明細書に使用したような「投与単位形
」は、治療する被検者の単位投与量として適した物理的に別個の単位を意味し；
各単位は、必要や医薬担体と共に、所望の治療効果をもたらすと計算された予め
決定した量の活性化合物を含む。本発明の投与単位形の明細は、活性化合物の独
特な特徴および達成したい具体的な治療効果により示され、直接的にそれに依存
し、限界は、個体の治療用の活性化合物などの配合の技術に存する。

【０３１７】 本発明の核酸分子をベクターに挿入し、遺伝子療法ベクターとして使用できる
。遺伝子療法ベクターは、対象に、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第
５，３２８，４７０号）または定位注射により送達できる（例えば、Ｃｈｅｎら
（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：３０５４〜３０５７参照）。遺伝子療法ベクター
の医薬調製物は、許容される希釈剤に遺伝子療法ベクターを含むことができるか
、または、遺伝子送達ベヒクルを包埋する遅延放出マトリックスを含むことがで
きる。別に、完全な遺伝子送達ベクターを、組換え細胞、例えばレトロウイルス
ベクターから無傷で産生できる場合、医薬調製物は、遺伝子送達系を産生する１
つ以上の細胞を含むことができる。

【０３１８】 医薬組成物は、容器、パック、または施薬器に、投与説明書と共に含めること
ができる。

【０３１９】 本発明は、多くの異なる形で包埋し得、本明細書に示した実施形態に限定され
ると捉えるべきではなく；むしろ、これらの実施形態は、この開示が本発明を当
業者に完全に伝えるように提供される。本発明の多くの修飾および他の実施形態
が、前記に提示した教義の利点を有する、本発明が属する分野の専門家には思い
浮かぶだろう。専門用語を使用するが、それらは特記しない限り当分野と同じよ
うに使用される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、アミノペプチダーゼヌクレオチド配列（配列番号２）および推定アミ
ノ酸配列（配列番号１）を示す。

【図２】 図２は、アミノペプチダーゼアミノ酸配列；αβターンおよびコイル領域；親
水性；両親媒性領域；可動領域；抗原性係数；および表面確率プロットの解析を
示す。

【図３】 図３は、アミノペプチダーゼ（配列番号１）の疎水性プロットを示す。

【図４】 図４は、特定の機能的部位（配列番号１）に対応するアミノ酸のアミノペプチ
ダーゼオープンリーディングフレームの解析を示す。タンパク質はまた、中性亜
鉛メタロペプチダーゼに見出される亜鉛結合領域サインを含む。

【図５】 図５は、正常ヒト組織および癌でのアミノペプチダーゼのＲＮＡ発現を示す。

【図６】 図６は、ヒト組織および細胞でのアミノペプチダーゼのＲＮＡ発現を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 15/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ ４Ｃ０８４ 35/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 ４Ｈ０４５ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｎ 5/10 1/68 Ａ 9/64 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/37 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/00 Ｂ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 AA12 BA14 BA41 BA58 BA61 CA02 CA04 CA09 CA12 DA02 DA03 DA05 DA06 DA08 DA12 EA02 EA04 HA12 HA15 4B050 CC01 CC03 CC07 DD11 EE10 LL01 LL03 4B063 QA01 QA07 QA17 QA19 QQ02 QQ03 QQ05 QQ08 QQ36 QQ44 QQ48 QQ58 QQ79 QR08 QR14 QR20 QR31 QR33 QR36 QR38 QR41 QR50 QR55 QR56 QR58 QR59 QR62 QR66 QR72 QR77 QS03 QS05 QS10 QS11 QS25 QS33 QS34 QX02 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93X AA93Y AA95X AB01 AB04 BA02 CA23 CA24 CA25 CA33 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA22 BA23 BA35 CA49 CA53 CA56 CA59 DC50 NA14 ZA592 ZA662 ZA812 ZB262 ZC202 ZC352 4H045 AA10 AA11 AA30 BA09 BA54 CA40 DA75 DA89 EA20 EA28 EA51 FA72 FA73 FA74

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）配列番号２のヌクレオチド配列または特許寄託番号ＰＴ
   Ａ−１６４２としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのいずれかのｃＤＮＡ挿入
   断片またはその相補物に少なくとも４５％同一であるヌクレオチド配列を含む核
   酸分子と、 ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列または特許寄託番号ＰＴＡ−１６４２とし
   てＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのいずれかのｃＤＮＡ挿入断片またはその相
   補物の少なくとも１５個のヌクレオチド断片を含む核酸分子と、 ｃ）配列番号１のアミノ酸配列または特許寄託番号ＰＴＡ−１６４２としてＡ
   ＴＣＣに寄託されたプラスミドのいずれかのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされ
   るアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子と、 ｄ）配列番号１のアミノ酸配列または特許寄託番号ＰＴＡ−１６４２としてＡ
   ＴＣＣに寄託されたプラスミドのいずれかのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされ
   るアミノ酸配列を含むポリペプチド断片であって、配列番号１または特許寄託番
   号ＰＴＡ−１６４２としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのいずれかのｃＤＮ
   Ａ挿入断片によりコードされるアミノ酸配列の少なくとも１２個の連続アミノ酸
   を含むポリペプチド断片をコードする核酸分子と、 ｅ）配列番号１のアミノ酸配列または特許寄託番号ＰＴＡ−１６４２としてＡ
   ＴＣＣに寄託されたプラスミドのいずれかのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされ
   るアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然対立遺伝子変異体をコードする核酸分
   子であって、配列番号２またはその相補物を含む核酸分子にストリンジェントな
   条件下でハイブリダイズする核酸分子と からなる群から選択される単離核酸分子。
2. 【請求項２】 ａ）配列番号２のヌクレオチド配列、特許寄託番号ＰＴＡ−
   １６４２としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのいずれかのｃＤＮＡ挿入断片
   またはその相補物を含む核酸分子と、 ｂ）配列番号１のアミノ酸配列または特許寄託番号ＰＴＡ−１６４２としてＡ
   ＴＣＣに寄託されたプラスミドのいずれかのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされ
   るアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子と からなる群から選択される請求項１に記載の単離核酸分子。
3. 【請求項３】 ベクター核酸配列をさらに含む請求項１に記載の核酸分子。
4. 【請求項４】 異種ポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む請求項
   １に記載の核酸分子。
5. 【請求項５】 請求項１に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
6. 【請求項６】 哺乳動物宿主細胞である請求項５に記載の宿主細胞。
7. 【請求項７】 請求項１に記載の核酸分子を含む非ヒト哺乳動物宿主細胞。
8. 【請求項８】 ａ）配列番号１のアミノ酸配列または特許寄託番号ＰＴＡ−
   １６４２としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのいずれかのｃＤＮＡ挿入断片
   によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片であって、配列番号１
   または特許寄託番号ＰＴＡ−１６４２としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドの
   いずれかのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるアミノ酸配列の少なくとも１５
   個の連続アミノ酸を含むポリペプチド断片と、 ｂ）配列番号１のアミノ酸配列または特許寄託番号ＰＴＡ−１６４２としてＡ
   ＴＣＣに寄託されたプラスミドのいずれかのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされ
   るアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号２またはその相補物を含
   む核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド分子
   によりコードされるポリペプチドの天然対立遺伝子変異体と、 ｃ）配列番号２のヌクレオチド配列またはその相補物を含む核酸に少なくとも
   ４５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるポリペプ
   チドと からなる群から選択される単離ポリペプチド。
9. 【請求項９】 配列番号１のアミノ酸配列または特許寄託番号ＰＴＡ−１６
   ４２としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのいずれかのｃＤＮＡ挿入断片によ
   りコードされるアミノ酸配列を含む請求項８に記載の単離ポリペプチド。
10. 【請求項１０】 異種アミノ酸配列をさらに含む請求項８に記載のポリペプ
    チド。
11. 【請求項１１】 請求項８に記載のポリペプチドに選択的に結合する抗体。
12. 【請求項１２】 ａ）配列番号１のアミノ酸配列または特許寄託番号ＰＴＡ
    −１６４２としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのいずれかのｃＤＮＡ挿入断
    片によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、 ｂ）配列番号１のアミノ酸配列または特許寄託番号ＰＴＡ−１６４２としてＡ
    ＴＣＣに寄託されたプラスミドのいずれかのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされ
    るアミノ酸配列の断片であって、配列番号１または特許寄託番号ＰＴＡ−１６４
    ２としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのいずれかのｃＤＮＡ挿入断片により
    コードされるアミノ酸配列の少なくとも１２個の連続アミノ酸を含む断片を含む
    ポリペプチドと、 ｃ）配列番号１のアミノ酸配列または特許寄託番号ＰＴＡ−１６４２としてＡ
    ＴＣＣに寄託されたプラスミドのいずれかのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされ
    るアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号２またはその相補物を含
    む核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリペプチドの天
    然対立遺伝子変異体と からなる群から選択されたポリペプチドを製造する方法であって、請求項５に記
    載の宿主細胞を、核酸分子が発現される条件下で培養することを含む方法。
13. 【請求項１３】 前記ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む請
    求項１０に記載の方法。
14. 【請求項１４】 ａ）試料を、請求項８に記載のポリペプチドに選択的に結
    合する化合物と接触させるステップと、 ｂ）化合物が試料中のポリペプチドに結合するかどうかを決定するステップと
    を含む、試料中の請求項８に記載のポリペプチドの存在を検出する方法。
15. 【請求項１５】 ポリペプチドに結合する化合物は抗体である請求項１４に
    記載の方法。
16. 【請求項１６】 請求項８に記載のポリペプチドに選択的に結合する化合物
    および使用説明書を含むキット。
17. 【請求項１７】 ａ）核酸分子に選択的にハイブリダイズする核酸プローブ
    またはプライマーと試料を接触させるステップと、 ｂ）核酸プローブまたはプライマーが試料中の核酸分子に結合するかどうかを
    決定するステップと を含む試料中の請求項１に記載の核酸分子の存在を検出する方法。
18. 【請求項１８】 試料はｍＲＮＡ分子を含み、核酸プローブと接触させる請
    求項１７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 請求項１に記載の核酸分子に選択的にハイブリダイズする
    化合物および使用説明書を含むキット。
20. 【請求項２０】 ａ）請求項８に記載のポリペプチドまたは請求項８に記載
    のポリペプチドを発現する細胞を、試験化合物と接触させるステップと、 ｂ）ポリペプチドが試験化合物に結合するかどうかを決定するステップと を含む請求項８に記載のポリペプチドに結合する化合物を同定する方法。
21. 【請求項２１】 ａ）試験化合物とポリペプチドとの結合を直接検出するこ
    とによる結合の検出と、 ｂ）競合結合アッセイを使用した結合の検出と、 ｃ）ＧＰＣＲ様媒介シグナル伝達のアッセイを使用した結合の検出と からなる群から選択された方法によって試験化合物のポリペプチドへの結合を検
    出する請求項２０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 請求項８に記載のポリペプチドまたは請求項８に記載のポ
    リペプチドを発現する細胞を、ポリペプチドの活性を調節するのに十分な濃度で
    ポリペプチドに結合する化合物と接触させることを含む、請求項８に記載のポリ
    ペプチドの活性を調節する方法。
23. 【請求項２３】 ａ）請求項８に記載のポリペプチドを、試験化合物と接触
    させるステップと、 ｂ）試験化合物の、ポリペプチドの活性に対する効果を決定し、よってポリペ
    プチドの活性を調節する化合物を同定するステップと を含む請求項８に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法。
24. 【請求項２４】 細胞における請求項１に記載の核酸分子の発現レベルを調
    節する物質を同定する方法であって、前記核酸分子の前記発現レベルを前記物質
    により前記細胞で調節できるように、前記物質を前記核酸分子を発現する細胞と
    接触させるステップと、前記核酸分子の前記発現レベルを測定するステップとを
    含む方法。
25. 【請求項２５】 請求項１に記載の核酸分子の発現レベルを調節する方法で
    あって、前記物質が核酸分子の発現レベルを調節することのできる条件下で、前
    記核酸分子を物質と接触させることを含む方法。
26. 【請求項２６】 医薬的に許容される担体に請求項８に記載のポリペプチド
    のいずれかを含む医薬組成物。