JP2003502350A

JP2003502350A - 傷癒合促進用促進傷被覆材

Info

Publication number: JP2003502350A
Application number: JP2001504328A
Authority: JP
Inventors: エヌ．ハーンダン，デビット; ペレ−ポロ，ジョージ，アール．; イー．バロウ，ロバート
Original assignee: Research Development Foundation
Current assignee: Research Development Foundation
Priority date: 1999-06-22
Filing date: 2000-06-22
Publication date: 2003-01-21
Also published as: AU771904B2; EP1210046A1; US6576618B1; BR0012528A; CN1137723C; WO2000078259A1; US20020128222A1; RU2245722C2; MXPA02000128A; ZA200110240B; CA2377371A1; IL147127A0; EP1210046A4; AU5758500A; CN1372450A

Abstract

(57)【要約】本発明はリポソーム遺伝子構築物を傷修復改善の傷に直接、あるいは傷被覆及び／又は閉鎖物質に組み込んでその材料の機能性を促進することに関する。本発明はさらに、全厚傷修復における傷被覆材料としてリポソーム遺伝子治療によって促進したヒト胎児膜（例えば羊膜）を使用することについても開示するものである。促進された胎児膜あるいは促進された死体皮膚はリポソーム遺伝子構築物を有していない現在使われている材料より優れた利点を有しており、火傷による損傷を有している患者での臨床結果を改善するための効率的で安全な方法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は一般的には外傷薬及び傷の分野に関するものである。より具体的には
本発明は傷癒合促進方法と促進傷被覆材料に関するものである。

【０００２】関連技術の説明火傷は最も重大な外傷形態の１つを示している。火傷の傷が大きければ大きい
ほど、その結果はより重大で、望ましくない結果が広がったり死亡したりする可
能性が高い。毎年２００万人以上の火傷患者が発生し、治療のためのコストは年
間１０億ドルを上回る。火事及び火傷による外傷は１歳から１８歳までの子供に
おける外傷及び死亡の三番目に大きな原因となっている。火傷による死者の数は
この十年間減少傾向を示しており、それは主に早期のそして十分な液体蘇生法、
早期の積極的栄養補給、改良された感染調節、改良された傷ケア／傷被覆、及び
ホルモン調節などが理由となっている。

【０００３】傷癒合は火傷患者の回復において大きな重要性を有しており、従って、その臨
床的な結果にも重要な意味を持っている。早期の傷切除及び組織移植が火傷によ
る外傷後の高代謝反応と生残率を改良してくれることが示されている。切除され
た傷に移植するために同原の皮膚を用いることもできるが（ドナー・サイト）、
これは特に大きな火傷を受けた患者の場合は有効な処理ではない。これらの場合
は、合成皮膚あるいは死体の皮膚が用いられている。

【０００４】傷被覆は傷閉鎖と区別するべきである。傷閉鎖材料は傷床によって生物学的に
受け入れられ、癒合しつつある傷に永続的に組み込まれる。一方、傷被覆材料は
傷凝固への組み込みと接着のための凝固組織の成長に基づくものであり、この現
象は多くの傷被覆材料の特徴である。傷被覆材料は一般的には生分解せず、従っ
て、表皮の一時的な大体物として用いることができるだけである。傷被覆材料は
従って上皮再形成あるいは皮膚移植のいずれかで患者の皮膚によって置換されね
ばならない。一時的な被覆の場合、傷にバクテリアが繁殖してはならず、３週間
以内には完全な癒合が期待できるように十分に表面的なものでなければならない
。上皮付加物からの上皮細胞は増殖して破壊された上皮にとって換わり、通常、
傷被覆材料は剥離される。従って、表皮の第２度火傷における傷被覆材料の主要
な目的は傷床への微生物の侵入を制限し（微生物バリア）、それによって感染を
防ぎ、同時に、空気の接触を制限してそれによって痛みをできるだけ少なくする
ことである。

【０００５】傷被覆材料は重大な火傷外傷を有する患者で自分の皮膚で最終的な傷閉鎖を行
う前の深度２度あるいは３度外傷のためにも用いられている。最適な傷被覆材料
についての研究が必要である。しかしながら、傷閉鎖材料の必要条件は通常の皮
膚芽細胞及び表皮細胞の機能と同様の機能を果たすことである。具体的には、表
皮傷閉鎖材料の必要条件は：ａ）無毒性、防腐性、非炎症性、そしてバクテリア
及びその他の微生物に対する非抗原性バリアを提供すること；ｂ）通常の熱及び
水伝導性を提供すること；ｃ）傷床に対する迅速、均一、そして緊密な接着を提
供すること；ｄ）通常の局所ホスト防御及び傷修復メカニズムを支援すること；
ｅ）弾力性と長期耐久性を維持すること；ｆ）増殖の可能性を妨げないこと；そ
してｇ）分割した厚い自己移植とほぼ同様の傷拘縮特性を有する長期機能性及び
美容性機能を提供することである。

【０００６】インテグラ（ＩＮＴＥＧＲＡ^TM）、アロダーム（ＡＬＬＯＤＥＲＭ^TM）あるい
はバイオブレン（ＢＩＯＢＲＡＮＥ^TM）は非常に優れた生体適合性及び癒合特性
を示す。しかしながら、これらの素材は非常に高価であり、その広範な利用を制
約している。また、死体の皮膚は傷被覆のための比較的効率的で安価なアプロー
チである。しかしながら、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＳＶ及び肝炎伝染の危険性が重大
な懸念であり、従って、死体の皮膚の適用を制限している。

【０００７】胎児膜は傷被覆材料としての利用を可能にする多数の優れた特性を有しており
、それには、ａ）低免疫原性；ｂ）無毒性、防腐性、及び非炎症性；ｃ）ＨＩＶ
、ＨＳＶ、あるいはＣＭＶ非感染性、ｄ）量的に制限がないこと（従って、胎児
膜組織を既存の皮膚代替物に対する安価な代替品とさせる可能性）；ｅ）長さ、
直径、及び厚みの変更可能性、そしてｆ）コラーゲン、ラミニン、及びフィブロ
ネクチンなど内在機構成分などを含んでおり通常の人間の皮膚機能と同様の物理
的安定性、増殖支援が保証されているなどの特徴が含まれる。

【０００８】生化学的に、熱による外傷は高心拍出量、酸素消費の増大、不十分な免疫反応
、及びタンパク質と脂質異化作用などによって特徴付けられるハイパーメタボリ
ック反応を伴う特に重大な形態の外傷である［３４］。火傷の傷はトロンボヘキ
サン及び炎症促進性サイトカインを生成、放出することでこうした脆弱なハイパ
ーメタボリック状態を促進させる［３５−３７］。傷癒合は従って火傷患者の生
残り及び増殖にとって重要である［２２、３８−３９］。増殖ホルモン及びイン
シュリン様成長因子−Ｉなどのアナボリック剤はハイパーメタボリック反応を減
衰させ、傷癒合を促進してくれることが示されている［３５、３９−４１］。

【０００９】サイズが約７．５ｋＤの小さなポリペプチドであるインシュリン様成長因子は
熱的損傷後の代謝［３５］、腸粘膜機能［４２］及びタンパク質ロス［４３］を
改良してくれることが示されている。ＩＧＦ−Ｉはやせた人の体重ロス、不十分
な免疫反応、急性位相反応を緩和し、そして、傷癒合を改善することによって増
殖ホルモンの作用を媒介する［３５、３８、４４−４７］。ＩＧＦ−Ｉによる措
置はコラーゲン形成と繊維芽細胞及びケラチン生成細胞の細胞分裂誘起性を刺激
することによって傷癒合を改善してくれる［４０、４１、４８］。低血糖症、心
理状態変化、浮腫、疲労、及び頭痛などの望ましくない副作用があり、それが火
傷の治療におけるＩＧＦ−Ｉの治療的利用を制約している［４９、５０］。これ
ら望ましくない副作用は生物学的有効性に求められる遊離ＩＧＦ−Ｉを超生理学
的用量の故に非常に発生しやすい［４９、５０］。

【００１０】遺伝子伝達の適切なビヒクルの選択は最優先事項である［１、２］。ウイルス
、及び特にアデノウイルスは、それらのトランスフェクション能力の故に、遺伝
子導入媒体として用いられている［１−３］。しかしながら、ウイルスはウイル
ス感染に関連した毒性、不十分な免疫毒性、変異原性あるいは発癌性作用を示す
場合があり、そのことがこの方法を潜在的に危険なものとしている［１］。導入
システムとしてリポソームとして使用することは、従ってそれらの非ウイルス性
組成、安定性、そして細胞膜と相互作用する能力の故に魅力的なモデルとなる［
４］。標準的なリポソーム構造に陽イオン特性を付加しコレステロールを組み込
み、遺伝子運搬のために用いられるｃＤＮＡ構築物内にサイトメガロウイルス（
ＣＭＶ）プロモータを組み込むと、アデノウイルス構築物によって達成されるの
と同等のトランスジェニック発現の有効性及びレベルを増大してくれる［４、５
］。

【００１１】先行技術は傷癒合を促進方法と促進された傷被覆材料において不十分である。
本発明はこの技術分野におけるこうした長年の必要性と願望を達成するものであ
る。

【００１２】発明の要約本発明は成長促進剤をコードするリポソーム運搬遺伝子を用いた促進された傷
癒合のための方法について述べるものである。本発明はさらに、傷癒合を促進す
るための成長促進剤を発現するリポソーム運搬遺伝子で含浸させた促進傷被覆材
料について述べるものである。本発明の目的は、ハイパーメタボリック反応を減
らし、従って治療結果を改善して外傷、特に熱的損傷後の生残性を増大させるこ
とである。

【００１３】本発明は傷修復を促進し、傷被覆材料の機能性を増強するための傷及び／又は
被覆材料へのリポソーム遺伝子構築物の直接の取り込みについて述べる。本発明
はさらに、十分な厚みの傷修復における一過性傷被覆材料としての成長促進剤を
発現するリポソーム遺伝子促進と組み合わせた改良型ヒト胎児羊膜の使用につい
て述べる。胎児膜はインテグラ（Ｉｎｔｅｇｒａ^TM）、バイオブレン（Ｂｉｏｂ
ｒａｎｅ^TM）、アロダーム（Ａｌｌｏｄｅｒｍ^TM）どの現在用いられている素材
に勝る利点を有しており、治療結果を改善するための効率的で安全な方法である
。

【００１４】本発明の１つの目的は傷癒合促進方法、傷被覆材料を改良するための方法、そ
して促進傷被覆材料を提供することである。

【００１５】本発明の１つの実施の形態で、傷にリポソームを注入するステップを含み、上
記リポソームが少なくとも１つの成長促進剤をコードする少なくとも１つの遺伝
子を含んでいる傷癒合促進方法が提供される。

【００１６】本発明の別の実施の形態で、傷を傷被覆材料で被覆するステップを含み、上記
傷被覆材料がリポソームで含浸されており、上記リポソームが成長促進剤をコー
ドする少なくとも１つの遺伝子を含んでいることを特徴とする傷癒合促進方法が
提供される。

【００１７】本発明のさらに別の実施の形態で、傷を傷閉鎖材料で被覆するステップを含み
、上記傷閉鎖材料がリポソームで含浸されており、上記リポソームが少なくとも
１つの成長促進剤をコードする遺伝子を含んでいることを特徴とする傷癒合を促
進する方法が提供される。

【００１８】本発明のさらに別の実施の形態で、傷被覆材料、及び、少なくとも１つの成長
促進剤をコードする遺伝子を含むリポソームを含む促進傷手当用品が提供される
。

【００１９】本発明のさらに別の実施の形態で、少なくとも１つの成長促進剤をコードする
遺伝子を含むリポソーム、及び、薬理的に受容できる担体を含む傷癒合促進用組
成物が提供される。

【００２０】本発明のその他の側面、特徴、及び利点は現在の時点で好ましい本発明の実施
の形態に関する説明から明らかになるであろう。これらの実施の形態は開示の目
的のために提供されるものである。

【００２１】［発明の詳細な説明］本発明はラットにおける外傷傷、特に熱による損傷に対して成長促進剤を発現
するリポソーム内に導入されたベクターを使用することの利点を示すものである
。本発明はさらにヨークシャー・ミニブタ（Yorkshire mini pig）における胎児
膜、ヒトの皮膚及びいくつかの市販されている合成素材など種々の傷被覆材料の
機能性についての比較も行う。

【００２２】より具体的に言えば、本発明は成長促進剤、例えばインシュリン様成長因子−
Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、あるいは表皮ケラチン細胞成長因子（ＫＧＦ）をコードする
リポソーム遺伝子構築物を傷床あるいは上記傷被覆素材中に直接導入すること、
及びその有効性とリポソームによって措置されない傷との比較について述べる。
このリポソーム遺伝子治療の有効性はその摂取量と癒合時間を測定し、傷の収縮
を組織学的に調べると同時に、組織学、被覆材料拒否の免疫マーカー、そしてハ
イパーメタボリック反応の程度を１週間間隔で全部で４ヶ月間にわたり調べるこ
とで評価する。

【００２３】ここに報告されている知見に基づけば、成長因子を発現する１つ以上の遺伝子
が直接傷か、あるいは後で傷にあてられる傷被覆材料に注入されるリポソーム媒
体を介して導入される遺伝子治療は熱による損傷、皮膚潰瘍に対して現在行われ
ている治療、及び皮膚移殖手順を改革、改善してくれる。

【００２４】本発明は傷癒合促進方法及び促進傷被覆材料に関するものである。

【００２５】本発明は傷にリポソームを注入するステップを含み、上記リポソームが成長促
進剤をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む方法をも対象とするものである
。

【００２６】本発明は傷を傷被覆材料で被覆するステップを含み、上記傷被覆材料がリポソ
ームに含浸されており、上記リポソームが成長促進剤をコードする少なくとも１
つの遺伝子を含むものである傷癒合促進方法にも関している。

【００２７】別の実施形態で、本発明は傷を傷閉鎖材料で被覆するステップを含み、上記傷
閉鎖材料にリポソームが含浸されており、上記リポソームが成長促進剤をコード
する少なくとも１つの遺伝子を含んでいることを特徴とする傷癒合を促進する方
法に関している。

【００２８】本発明のさらに別の実施形態で、本発明は傷被覆素材、及び、成長促進剤をコ
ードする少なくとも１つの遺伝子を含むリポソームを含む促進傷手当用品に関し
ている。通常、成長促進剤を含むリポソームは注射によって上記傷被覆材料に注
入され、その注入は上記傷に傷被覆材料をあてる前、あるいはそれに引き続き行
われてもよい。

【００２９】本発明のさらに別の実施形態で、本発明は成長因子をコードする少なくとも１
つの遺伝子を含むリポソームと、薬学的に受け入れ可能な担体を含む傷癒合促進
用組成物をも対象としている。この実施の形態の組成物はその組成物が注射器に
容易に充填できるようにパッケージ化されてもよいし、あるいは直接注射器内に
入れてもよい。

【００３０】これらの実施の形態で、本発明による組成物及び方法を用いて治療可能な代表
的な傷は熱外傷、化学的外傷、切除外傷、外科手術外傷、あるいはすり傷などで
ある。好ましいリポソームはコレステロール含有陽イオンリポソームである。一
般的に、成長促進作用因子は増殖ホルモン、インシュリン様成長因子−Ｉ、表皮
ケラチン細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子、上皮成長因子、血小板誘導成長因
子あるいは形質転換成長因子−βなどである。好ましくは、増殖促進作用因子が
インシュリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）であり、そしてそのリポソーム内で
のＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子の濃度はリポソーム１ｍｌあたり約２．２μｇ
である。

【００３１】代表的な傷被覆材料はヒト胎児羊膜、ヒト胎児絨毛膜、ヒトの死体皮膚、合成
皮膚、及びその他この技術分野の当業者に知られている素材などである。代表的
な傷閉鎖材料はヒト胎児羊膜、ヒト胎児絨毛膜、ヒトの同種同系皮膚、ヒト同種
異系皮膚、及びこの技術分野における当業者に知られているその他の素材である
。

【００３２】本発明によれば、この技術分野における従来の分子生物学、微生物学、及び組
み換えＤＮＡ技術を用いることができる。そうした技術は文献に充分に説明され
ている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, "Molecular Cloning: A Labo
ratory Manual (1982); "DNA CLoning: A Practical Approach", Ｉ及びＩＩ
巻（D. N. Glover編、１９８５）； "Oligonuoleotide Synthesis" (M. J. Ga
it編、１９８４)； "Nucleic Acid Hybridization" [B. D. Hames & S. J. Higg
ins編、（１９８５）]； "Transcription and Translation" [B. D. Hames & S
. J. Higgins編、（１９８４）]； "Animal Cell Culture" [R. I. Freshney編
、（１９８６）]； "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, （１９８６）]； B. Perbal,
"A Practice Guide To Molecular Cloning" （１９８４）参照。従って、本明
細書で使われている場合、以下の用語は以下に述べられるように定義されている
ものとする。

【００３３】『ＤＮＡ分子』とは１本鎖形態、あるいは２本鎖らせんのいずれかの高分子形
態のデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、あるいはシトシ
ン）を意味している。この用語はその分子の一次及び二次構造だけを意味し、い
ずれの三次形態にもそれを限定するものではない。従って、この用語はとりわけ
直線形ＤＮＡ分子（例えば制限フラグメント）に見られる２本鎖ＤＮＡ、ウイル
ス、プラスミド、そして染色体を含んでいる。以下の検討においては、構造は従
来の慣習に従ってＤＮＡの非転写ストランドに沿って５'−３'方向の配列（つま
りｍＲＮＡと相同の配列を有するストランド）だけを示す。

【００３４】『ベクター』はプラスミド、ファージ、あるいはコスミドなどのレプリコンで
、それに対して別のＤＮＡセグメントが結合したセグメントの複製物を発生させ
ることができる。『レプリコン』とはｉｎｖｉｖｏでＤＮＡ複製の自立単位と
して機能する、つまりそれ自体の調節下で複製を行うことができるいずれかの遺
伝子的要素（例えばプラスミド、染色体、ウイルス）である。『複製の開始点』
とはＤＮＡ合成に関与するＤＮＡ配列を意味している。『発現調節配列』とは別
のＤＮＡ配列の転写及び翻訳を調節、調節するＤＮＡ配列である。ＲＮＡポリメ
ラーゼがそのコード配列をｍＲＮＡ内に転写して、それがそのコード配列によっ
てコードされるタンパク質内に翻訳される場合に、コード配列は１つの細胞内で
『操作可能に結合され』、転写及び翻訳調節配列の『調節下』にある。

【００３５】一般的に、挿入されたＤＮＡフラグメントの効率的な転写及び翻訳を促進する
プロモータ配列を含む発現ベクターはホストとの関連で用いられる。発現ベクタ
ーは一般的には複製の開始点、プロモータ、ターミネータ、及び形質転換された
細胞において表現型選択を行うことができる特殊な遺伝子を含んでいる。形質転
換されたホストはこの技術分野で周知の手段によって発酵、培養させて、最適な
細胞増殖を達成させることができる。

【００３６】ＤＮＡ『コード配列』とは適切な調節配列の調節下に置かれた場合、ｉｎｖ
ｉｖｏでポリペプチド内に転写、翻訳される２本鎖ＤＮＡ配列である。コード配
列の境界は５'（アミノ）末端の開始コドンと３'（カルボキシル）末端の翻訳停
止コドンによって決められる。コード配列は原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡか
らのｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳動物）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、そ
して合成ＤＮＡ配列なども含む。ポリアデニル化信号と転写停止配列はコード配
列の３'末端に位置している。『ｃＤＮＡ』は複写ＤＮＡあるいは相補性ＤＮＡ
と定義されており、ｍＲＮＡトランスクリプトからの逆転写反応の生成物である
。『エクソン』とは遺伝子座から転写された発現配列であり、『イントロン』と
は遺伝子座からの非発現配列である。転写及び翻訳調節配列とはプロモータ、エ
ンハンサ、ポリアデニル化信号、ターミネータなどホスト細胞内でコード配列の
発現をもたらすＤＮＡ調節配列である。『ｃｉｓ要素』とは『コンセンサス配列
』あるいは『モチーフ』とも呼ばれるヌクレオチド配列で、特定の遺伝子座の発
現をアップレギュレートあるいはダウンレギュレートすることができる他のタン
パク質と相互作用する。『信号配列』もコード配列と共に含まれる場合もある。
この配列はホスト細胞と交信してポリペプチドを適切な細胞位置に向かわせる上
記ポリペプチド信号ペプチド、Ｎ末端から上記ポリペプチドをコードする。信号
配列は原核生物及び真核生物中に天然に存在している種々のタンパク質と結合し
た形態で見出される場合もある。

【００３７】『プロモータ配列』とは細胞内ＲＮＡポリメラーゼに結合できるＤＮＡ調節領
域で、下流（３'末端方向）コード配列の転写を開始させることができる。本発
明の限定する目的で、プロモータ配列はその３'末端の転写開始サイトを一方の
境界とし、上流（５'末端方向）に延びて背景との比較で検出可能なレベルで転
写を開始するのに必要な塩基対あるいは要素を含む。プロモータ配列内に転写開
始サイトと、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合領域（コンセ
ンサス配列）が見出される。真核生物プロモータは常にという訳ではないが、し
ばしば“ＴＡＴＡ”ボックス及び“ＣＡＴ”ボックスを含んでいる。原核生物プ
ロモータは−１０及び−３５コンセンサス配列に加えて、シャイン−ダルガーノ
配列を含んでいる。

【００３８】一般的に、『遺伝子』とはコード配列に操作可能に結合されたプロモータ及び
調節要素を含むことを意図して用いられている。これらのプロモータ配列と調節
要素はその遺伝子に天然に存在するプロモータ及び/又は調節要素であってもよ
いし、あるいは異種のものであってもよい。『異種』領域とは天然のより大型の
分子との結合状態では見られない大型ＤＮＡ分子のＤＮＡの識別可能なセグメン
トである。従って、この異種領域が哺乳動物の遺伝子をコードすると、その遺伝
子は通常そのソース生物のゲノムの哺乳動物ゲノムＤＮＡには側鎖しないＤＮＡ
によって側鎖される（（例えばプロモータ配列及び/又は調節要素）。別の例で
、コード配列はそのコード配列自体が自然では見られないような構成物である（
例えばゲノムコード配列がイントロンあるいは天然の遺伝子とは異なったコドン
を有する合成配列を有しているｃＤＮＡ）である。対立遺伝子の異化あるいは自
然発生的な突然変異事象はここで定義されているような異種領域は発生させない
。

【００３９】『組み換えＤＮＡ技術』とは、通常は異なった生物からのＤＮＡのｉｎｖｉｔ
ｒｏ結合の結果として２つの異種ＤＮＡ分子を統合させるための技術である。組
み換えＤＮＡ分子は一般的には遺伝子操作技術における実験によってつくりださ
れる。同義的な用語として『遺伝子スプライシング』、『分子クローニング』及
び『遺伝子工学』がある。これらの操作による生成物は『組み換え体』あるいは
『組み換え分子』となる。

【００４０】細胞が外来性あるいは異種ＤＮＡによって『形質転換』あるいは『トランスフ
ェクト』されるのは、そうしたＤＮＡがその細胞に導入された場合である。形質
転換ＤＮＡはその細胞のゲノムに一体化（共有結合によって結合）される場合も
あればされない場合もある。例えば、原核生物、イースト菌、及び哺乳動物細胞
においては、形質転換ＤＮＡはベクターやプラスミドなどのエピソーム性要素上
に保持される場合もある。真核生物細胞の場合、安定的に形質転換された細胞は
その形質転換ＤＮＡが染色体と一体化して、それが染色体複製を通じて娘細胞に
遺伝的に受け継がれる場合である。この安定性はその真核生物細胞のその形質転
換ＤＮＡを含む娘細胞の群によって構成される細胞株あるいはクローンを確立す
る能力によって示される。『クローン』とは１つの細胞あるいは祖先から細胞分
裂によって導かれた細胞の群を意味している。『細胞系』とはｉｎｖｉｔｏｒ
ｏで多くの世代にわたり安定な増殖をおこなうことができる一次細胞のクローン
である。外来性ＤＮＡによって形質転換された植物や動物などの生物は『形質転
換体』と呼ばれる。

【００４１】本明細書で用いられる場合、『羊膜』という用語は胚を取り囲み、外肺葉及び
中肺葉組織から誘導される胚体外薄膜を指している。

【００４２】本明細書で用いられる場合、『絨毛膜』とは最終的には胎盤の一部となり、呼
吸機能に加えて、栄養を供給し、廃棄物を除去する一番外側の胚体外膜を指して
いる。

【００４３】本明細書で用いられる場合、『リポソーム』はリン脂質から人工的につくられ
る二層脂質膜によって取り囲まれた小さな球体を指している。ＤＮＡ、タンパク
質、及びその他の物質をリポソーム内に取り込んで原形質膜と融合させることで
動物の細胞に導入することができる。本明細書で用いられる場合、『コレステロ
ール含有陽イオンリポソーム』とは特にコレステロール含有リポソームを指して
いる。

【００４４】本明細書で用いられる場合、『成長促進剤』とは増殖を促進させる化合物を指
す。

【００４５】本明細書で用いられる場合、『摂取量』とはホスト組織へのドナー組織の「健
康な摂取量」あるいは「受容量」を意味している。

【００４６】本発明で述べられているリポソームを用いて医薬品組成物を調製することが具
体的に構想されている。こうした場合、その医薬品組成物は成長因子をコードす
る遺伝子、本発明によるリポソーム、そして薬理的に受容できる担体を含むもの
である。この技術領域における当業者は本発明によるリポソームの適切な用量、
投与ルートについては過剰な実験を行わなくても容易に判断することができるで
あろう。治療で患者に対して用いられる場合、本発明に述べられているリポソー
ム媒体は治療的に有効な量、つまり、適切な量の増殖促進作用因子をコードする
ＤＮＡを患者あるいは動物に投与される。それは通常は傷あるいは傷被覆材料に
注入可能な形態で投与されるが、他の適切なルートも適切に用いることができる
。容量及び処方は傷の性状（組織損傷の程度）及びそのサイズ、患者の病歴、及
びその他の因子に依存する。投与されるリポソームの量は通常は傷の面積に応じ
て用いられ、リポソームの注入は約４ｃｍ間隔で行われる。こうした処方は処理
の悪影響とのバランスを取りながらその有効性を最大化するように継続される。
Remington's Pharmaceutical Science 17^th Ed. (1990) Mark Publishing Co.,
Easton, Penn.; 及びGoodman and Gildman's: The Pharmacological Basis of
Therapeutics 8^th Ed (1990) Pergamon Press参照。これらの試料は引用により
本明細書に組み込まれる。局所的投与の場合、リポソームは最も一般的には薬理
的に受容できる担体と共に単位用量注入可能形状（溶液、懸濁液、エマルジョン
）で製剤される。そうした担体は好ましくは非毒性で、治療効果は持っていない
。そうした担体の実例は水、生理的食塩水、液、デキストロース液、及び５％ヒ
ト血清アルブミンである。固定オイル及びエチル・オレエートなどの非水性担体
も用いることができる。担体は等張性及び化学的安定性、例えば緩衝液及び保存
剤などの添加物を少量含んでいてもよい。リポソームは通常そうした担体内で約
１μｇから１０μｇの濃度で作成される。

【００４７】以下の実施の形態は本発明の種々の実施の形態を説明する目的で開示されるも
のであって、いかなる意味でも本発明の限定は意図していない。

【００４８】実施例１実験動物−ラット成体雄のスプラーグ−ドウリー・ラット（Sprague-Dawley rat）（３５０−３
７５ｇ）を金網底の檻に入れて、明間と暗間が１２時間づつ繰り返される温度制
御室に収容した。これらの動物を７日間その環境に順化させた後、ブラインド・
テストを開始した。すべてのラットに対して液体食餌サスタカル（Sustacal） (
Mead Johnson Nutritionals. Evansville, Indiana, USA)及び水が調査全期間を
通じて与えられた。各ラットには体表面積の６０％にわたって熱湯による全厚火
傷が与えられた。熱的に損傷を受けたラットはその後ランダムに（ａ）コレステロール含有陽イオンリポソーム（１８０μｌ生理的食塩水に２０
μｌリポソームを溶解したもの、ｎ＝２８）、あるいは生理的食塩水の注入を受
ける２グループ（コントロール、２００μｌ、ｎ＝２８）と、（ｂ）２．２μｇのＩＧＦ−ＩｃＤＮＡ構築物及び０．２μｇのＣＭＶプロモ
ーター操作、レポータ遺伝子β−ガラクトシダーゼ、ＬａｃＺｃＤＮＡ構築
物を含むリポソーム（１８０μｌ生理的食塩水中１０μｌリポソーム）を週に１
回、火傷傷の周辺上の１つの注射箇所に皮下注射するか（ｎ＝１２）（図１）、
あるいは２．２μｇのサイトメガロウイルス操作ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡ構築物と
０．２μｇのβ−ガラクトシダーゼに対するレポータ遺伝子、ＬａｃＺｃＤ
ＮＡ構築物を含むリポソーム（１８０μｌ生理的食塩水中１０μｌリポソーム）
を火傷傷の周辺上の２つの注射箇所に週に１回注射される（ｎ＝１２）（図１）
２つのグループ、あるいは（ｃ）週に１度、生理的食塩水（２００μｌの通常の生理的食塩水；ｎ＝１０）
の皮下注射を受けるか、０．２μｇのβ−ガラクトシダーゼに対するレポータ遺
伝子を含むリポソーム（１８０μｌ生理的食塩水中１０μｌリポソーム）を皮下
注射されるか（ｎ＝１０）、あるいは週に１度、２．２μｇのＩＧＦ−ＩｃＤ
ＮＡ構築物及び０．２μｇのレポータ遺伝子β−ガラクトシダーゼＬａｃＺ
ｃＤＮＡ構築物を含むリポソーム（１８０μｌ生理的食塩水中１０μｌリポソー
ム）を皮下注射される３つのグループ（ｎ＝１０）に分けた。

【００４９】実施例２0 実験動物−ブタヨークシャー・ミニブタにおける傷修復メカニズムはヒトにおける同様のメカ
ニズムと非常に類似している。従って、ヨークシャー・ミニブタは従来にもよく
説明されたモデルであり、いくつかの実験的外傷研究で用いられている。１０頭
のヨークシャー・ブタのそれぞれに対して麻酔、鎮痛状態で４つの全厚傷（標準
モデル）を与えた。各傷箇所は正方形あるいは長方形の形状をしており、寸法は
約８ｘ８ｃｍで、それぞれの傷の間には約５ｃｍの間隔が設けられ、場所はわき
腹上部及び背中に限定された。これらの傷は動物が拘束ハンモックから開放され
た後横向きで快適に寝られるように特別の位置に設ける必要がある。

【００５０】傷を与えた直後に、その傷をヒト胎児絨毛膜／羊膜、インテグラ（ＩＮＴＥＧ
ＲＡ^TM）（Life Science）、アロダーム（ＡＬＬＯＤＥＲＭ^TM）（Life-Cell）
あるいはバイオブレン（ＢＩＯＢＲＡＮＥ^TM）（Dow-Hichhan）で被覆した。こ
の被覆を火傷以外の傷に固定し、三重抗生物質油剤含浸ガーゼと大量の加圧包帯
によって覆った。必要に応じてステープルを用いるか、あるいは閉鎖した。

【００５１】手術後、調査対象の動物をハンモックで拘束し、移植箇所が傷を受けたり被覆
が外れないように麻酔から回復させた。動物を２４時間、こうしたハンモック拘
束状態に放置した。

【００５２】実施例３使用されたリポソームは、コレステロール膜ろ過水とＤＭＲＩＥ試薬（１，２
−ジミリスシロキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシ・エチル・アンモニウム
・ブロマイド）（Life Technologies, Rockville, MD）で作成されたコレステロ
ール含有陽イオンリポソームであった。ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡ構築物（図２）は
UTMB Sealy Center for Molecular Science Recombinant DNA Core Facilityで
つくられたサイトメガロウイルス駆動ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡプラスミドで構成されていた（ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡはG. Rotweing, NIH, Bethesda, MDから
寄贈されたもの）。用いられた用量は１０％リポソーム（ＤＮＡの可溶性に悪影
響を及ぼさず、遺伝子導入パラダイムと両立するＤＮＡ導入実験で用いられる最
高の濃度）であった。リポソームの効果を経時的に調べるために、リポソームを
グループ（ａ）のラットの尾の血管に熱的損傷を受けてから０．５時間後に静脈
注射して、７日間にわたって変化を調べた。心臓停止などの望ましくない副作用
を伴わないでラットの尾の血管に投与できる量は体積で２００μｌである。熱に
よる損傷の直後に、グループ（ｂ）あるいは（ｃ）の各ラットに傷の周囲から１
ｃｍ離れた１つの箇所、あるいは相互に対角線上反対側の２箇所のいずれかに０
．２ｍｌの溶液が注入された（図１）。この手順を１週間に１度、全部で４週間
繰り返した。注入を行う前に毎週脂質片を新たにつくった。

【００５３】実施例４手順測定を行った各日に、同じ時間に体重を測定した。全体的な体重の変化率は最
初の２日間に全体として増加傾向を示し、続いて、火傷２日間体重は減少した。
リポソームの投与を受けたラットは食塩で措置したコントロールと比べて、体重
を良好に維持した、ｐ＜０．０５（図３）。ラットを（グループ（ａ）のラット
の場合）火傷から１、２、５または７日後に致死させ、あるいはグループ（ｂ）
及び（ｃ）のラットの場合最後の注射（火傷を受けてから３３日目）を行ってか
ら５日目に致死させた。血清及び血漿分離装置に血液を回収して、１０００ｇで
１５分間回転させて静止沈降させてから、取り出して、−７３℃で冷凍した。肝
臓及び腓腹筋を取り出し、重量測定し、分解して、サンプルをそれぞれ６０℃で
乾燥して一定の重量にした。乾燥／湿潤重量比率を用いてタンパク質含有量を求
めた。バイオプシーＩ、ＩＩ及びＩＩＩと定義された３つの背部皮膚サンプルを
取り出して液体窒素内でスナップ例とし、−７３℃の温度で分析用に保存した（
図１）。腓腹筋と肝臓に関してはリポソーム処理した動物とコントロール動物と
の間に乾／湿重量比率に差はなかった。

【００５４】血清コレステロール、遊離脂肪酸、血清急性期タンパク質（ヘプトグロビン及
びα_２−マクログロブリン）、構成肝臓タンパク質（総タンパク質、トランスフ
ェリン、及びアルブミン）、そしてグルコースをベーリング比濁計（Behring, D
earfield, IL）で測定した。血清α_１−酸糖タンパク質をＥＬＩＳＡ（Wako Che
micals Inc., Richmond, VA）で判定した。ラットα_１−酸糖タンパク質濃度の
標準曲線は対数ベースで０−１５００ｐｇ／ｍｌの範囲では直線形であった。血
漿ＴＮＦ−αはＥＬＩＳＡ（Endogen, Woburn, MA.）で測定した。ラットＴＮＦ
−αの定量に対して用いられた標準曲線は０−８３３ｐｇ／ｍｌの範囲で対数ベ
ースで直線形であった。血清ＩＬ−１βレベルはＥＬＩＳＡ（Biosource int.,
Camarillo, CA.）で判定し、ラットＩＬ−１βの定量に用いられた標準曲線は０
−１５００ｐｇ／ｍｌの範囲で直線形であった。血清ＩＬ−６は血清濃度を増大
させて処理したログ相Ｂ９細胞（マウス・ハイブリドーマ系）を用いるバイオア
ッセイで判定した。追加的な血清に対応した細胞増殖を定量的ＭＴＳ還元法によ
って分光測定的に測定した。

【００５５】実施例５トランスフェクショントランスフェクションはβ−ガラクトシダーゼの存在を測定することによって
判定された。β−ガラクトシダーゼタンパク質は３つの皮膚バイオプシーでＢｌ
ｕｏ−ｇａｌによる生化学染色を行うことで検出した。皮膚標本をｐＨ７．６で
ＨＥＰＥＳ緩衝ハンクス溶液に４％パラフォルムアルデヒドを溶かしたもので構
成される固定剤内で４℃の温度で一昼夜固定した。緩衝液及びリン酸緩衝液（Ｐ
ＢＳ）ないで洗浄してから、標本をｐＨ７．６に緩衝されたＢｌｕｏ−Ｇａｌ担
体の０．１％溶液（ハロゲン化インドリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）(LIFE
Technologies, Gaithersburg, MD, USA)内で３７℃の温度で培養した。充分に洗
浄した後、組織をパラフィンに埋め込んで、組織切片をつくり、ヘマトキシレン
とエオシン、あるいはエオシンだけで染色した。

【００５６】 β−ガラクトシダーゼタンパク質の存在は皮膚内での化学レポータ遺伝子アッ
セイ（GALACTO-LIGHT PLUS^TM, Tropix inc. Bedford, MA, USA）によっても検出
された。サンプルは以下のように作成された［５５］：１００ｍｇの組織を２０
０μｌのリシス緩衝液（４０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、１
５０ｍＭＮａＣｌ）内で約３０秒間かけてホモゲナイズさせた。サンプルを３
分間遠心分離にかけた（１２，０００ｘｇ）。上澄み液を取り除いてから、体積
を測定し、氷上に保存した。残留ペレットを２００μｌリシス緩衝液で洗浄して
、微小遠心分離にかけた。アッセイは９６ウェル・プレートで、メーカーの指示
に従って行われた。

【００５７】 β−ガラクトシダーゼ反応の微粒子状青緑色反応生成物はスピンドル様筋線維
芽細胞、マクロファージ、傷の下の増殖中の小血管で構成される肉芽組織内に主
に存在していた。β−ガラクトシダーゼを一貫して染色している細胞は筋線維芽
細胞、内皮細胞、そして炎症領域のマクロファージであり、複数核巨大細胞を含
んでおり、このことはより高い増殖率での細胞の優先的トランスフェクションを
示している（図４Ａ）。β−ガラクトシダーゼに対するほとんどの染色は細胞質
内で行われたが、いくつかの反応生成物が細胞境界外でも観察され、このことは
恐らく死亡した細胞によって放出された酵素か反応生成物の単純な拡散によるも
のであろう。少量の反応生成物が注入箇所近くの毛嚢でも観察された。食塩で処
理した動物ではβ−ガラクトシダーゼは観察されなかった（図４Ｂ）。

【００５８】 β−ガラクトシダーゼタンパク質発現は生理的食塩水で措置したラットと比
較して、リポソーム・カプセル化ＬａｃＺｃＤＮＡ＋ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡ構
築物を受けたラットの傷周辺で増大した（ｐ＜０．０５；表Ｉ）。血液細胞、肝
臓、脾臓、あるいは腎臓におけるβ−ガラクトシダーゼ濃度のグループ間での差
は認められなかった。この知見は皮下ｃＤＮＡ注射後に体細胞はトランスフェク
トされないという結論と一致している（表２）。

【００５９】

【表１】

【００６０】

【表２】

【００６１】実施例６ＩＧＦ−ＩＩＧＦ−ＩｃＤＮＡ構築物を受けたラットでは、トランスフェクション箇所
に近い皮膚でＩＧＦ−ＩｍＲＮＡの証拠が認められたが、コントロール及び食
塩水で処理した組織では認められなかった（図５）。

【００６２】ＩＧＦ−Ｉタンパク質濃度を３つの皮膚バイオプシーでＲＩＡで測定した（図
１）。タンパク質を液体窒素の存在下で４０ｍｇの組織を粉砕して取り出し、抽
出緩衝液（ＰＢＳ；０．２５ｍｌＰＭＳＦ、５０ｍｇロイペプチン、１００ｍ
ｇアプロチニン、及び５０ｍｇアンチパイン）を体積で１：７（７ｍｌ緩衝液／
グラム組織）を付加して、その混合物をホモゲナイズさせた。タンパク質を回収
できるように、サンプルを−８０℃で一昼夜凍結した。解凍後、５０μｌの均一
化物を１５０μｌの抽出物溶液に加えて１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離に
かけた。上澄み液１００μｌを４００μｌの中性化液に加えて、手引書（Diagno
stic System Laboratories, Webstar, TX, USA）に述べられている手順に従って
ＲＩＡを行った。

【００６３】取られたすべての皮膚バイオプシーで、ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡ構築物で措置され
た動物はリポソームだけ、あるいは生理的食塩水で処理された動物から得たバイ
オプシーと比較して傷周囲でより高いＩＧＦ−Ｉタンパク質濃度を示した（ｐ＜
０．０５；表３）。血清、肝臓、脾臓、あるいは腎臓でのＩＧＦ−Ｉタンパク質
濃度においてはグループ間での差は認められなかった（表４）。

【００６４】

【表３】

【００６５】

【表４】

【００６６】実施例７構成的肝臓タンパク質、急性期タンパク質及びサイトカイン血清総タンパク質濃度は火傷による損傷後低下した。リポソームの注射を受け
たラットは火傷から５日後に血清総タンパク質の上昇を示した（リポソーム：５
．６＋０．１ｇ／ｄｌ）、ｐ＜０．０５。血清トランスフェリンは火傷による損
傷後、正常値より３０％近く低下した。リポソームで措置されたラットはコント
ロールと比較して、火傷から２日目及び５日目に血清トランスフェリンの増大を
示した（ｐ＜０．０５；図６）。措置されたグループとコントロールグループの
間で血清アルブミンにおいては有意な差は認められなかった。さらに、実験の全
期間中、血清コレステロール、遊離脂質及びグルコースに関して措置されたグル
ープとコントロールグループとの間に有意な差はなかった。

【００６７】タイプＩ急性期タンパク質、血清ハプトグロビン、及びα_１−酸糖タンパク質
は熱による損傷後上昇した。リポソームは火傷から１及び５日目にα_１−酸糖タ
ンパク質を減少させた（ｐ＜０．０５；図７）。リポソームで措置したグループ
とコントロールグループとの間で、血清ハプトグロビンにおいては有意な差は認
められなかった。タイプＩＩ急性期タンパク質は火傷後約５０％増大した。血清
α_２−マグログロブリンはリポソームで措置された動物とコントロール動物間で
差は認められなかった。

【００６８】熱による損傷後、測定されたすべてのサイトカインは増大した。リポソームの
注入を受けたラットでは、コントロールと比較して、血清ＩＬ−１βは火傷を受
けた最初の日に減少し、血清ＴＮＦ−αは火傷１及び２日目に減少した（ｐ＜０
．０５；図８Ａ、Ｂ）。リポソームで措置したラットでは、コントロールと比べ
て血清ＩＬ−６での変化は認められなかった。

【００６９】実施例８生物学的有効性すべてのラットは６０％ＴＢＳＡ熱湯火傷を受けても生き残こり、薬の注射に
対する望ましくない副作用は認められなかった。傷癒合は以下のように判定され
た；傷の瘡蓋を最初の２８日間はそのままにしておいて、その後癒合した傷の縁
を破壊しないように静かに引っ張って取り除いた。瘡蓋を取り除いた後、動物を
標準的な面上に置いて、はっきりした再上皮化した部分と火傷を受けなかった部
分との境界線及び新しい上皮の先端部分に沿ってアセテート・シート上でトレー
スした。これらとレースした面積をコンピュータによる平面計測（Sigma Scan及
びSigma Plotソフトウエア）で計算した。さらに、皮膚バイオプシーを火傷から
３３日目に傷周辺から取り出して、確立されている手法で光学顕微鏡分析を行っ
た。直線形皮膚再上皮化に関する組織学的測定にはＨＥ染色技術を用いた。

【００７０】熱による損傷から２８日及び３３日後に、ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡ構築物の注射
を受けたラットはリポソームだけ、あるいは生理的食塩水を受けたものと比較し
て再上皮化において有意な増大を見せた（ｐ＜０．０５；図１０）。傷癒合にお
けるその改善は、リポソームだけ、あるいは生理的食塩水で措置されたものと比
較してＩＧＦ−ＩｃＤＮＡ構築物で措置されたラットでは細胞分裂活性の増大
が見られたので、ＩＧＦ−Ｉの表皮ケラチン細胞及び繊維芽細胞に対する細胞分
裂誘発性刺激によるものである可能性が最も高い。ＩＧＩ−ＩｃＤＮＡ構築物
を受けたラットはリポソームあるいは生理的食塩水で処理したラットと比較して
総血清タンパク質レベル及び総肝臓タンパク質レベルがより高かった（ｐ＜０．
０５；表５）。

【００７１】

【表５】

【００７２】実施例９事情を知らせ、病歴について聞き、癌、感染症、薬の乱用、及び性的行為など
危険な因子に対するスクリーニングを行った後、ドナー予定者について（ＳＢＩ
皮膚バンクによって日常的に行われ、ＡＡＴＢで規定されているように）Ｂ及び
Ｃ型肝炎、ＲＰＲ、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２に関するテストを行った。このテストは
薬投与の時点と、導入後６０−９０日間の外来患者の予定に沿った予約に基づい
て行われた。導入直後、胎児膜付きの胎盤を適切なドナーから（ＡＡＴＢによる
ガイドラインに従って）入手した。投薬室でリンゲル液で予備的に洗浄した後、
胎盤を抗菌及び抗黴剤を含有する組織培養培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０）
に移し、４℃の温度下で処理箇所に移し変えた。

【００７３】調達手順は生成物のバクテリア及び黴汚染が起きないように殺菌技術を用いて
行われた。汚染を監視するために、各処理段階で微生物テストを実施した。ウイ
ルスによる感染（例えば、ＨＩＶ−１あるいは−２）を排除するために組織サン
プルに対して追加的なＰＣＲ技術を実施することも可能。

【００７４】処理箇所（ＳＢＩ組織バンク施設）で、リンゲル液を用いて追加的な洗浄とフ
ラッシングを臍嚢を用いて実施した。羊膜及び絨毛膜を相互に胎盤から物理的に
切り離して、表面を覆っている細胞性物質をトリプシンで酵素消化を行い（Boeh
ringer Mannheim, Indianapolis, IN）（蒸留水とロリプシンの１：１希釈液、
２０℃で２時間）、その後、リン酸緩衝液で（ＷＯ９３／１０７２２に従って）
繰り返しリンスした。一貫性を保つために、調製された羊膜を標準的な調節率凍
結技術を用いて保存した。異なった組織属性及び特性を得るために、胎児膜構造
を１．５％グルタルアルデヒド溶液（Sigma, St. Louis, MO）を用いて２０分間
、２０℃で架橋させて、その後、１．５％グリシン（Sigma, St. Louis, MO）で
ユーロ皮膚バンク（６１）による皮膚保存に対して述べられているように１５分
間３回洗浄した。

【００７５】限定的保管のための準備手順としては、水分含有量が６％以下となる二重冷凍
乾燥手順に従って棚冷凍乾燥システムを用いた凍結乾燥を行うか、あるいは胎児
膜を８５％グリセロル内で２０℃の温度下で３時間ずつ、２回振動させることに
よって行った。後者の場合、残留水分含有量が１５％となり、ＨＩＶ及びその他
のウイルスが確実に非活性化される（６２）。後者の手順による措置を行った場
合増殖可能な細胞が残らず、抗原性が減って免疫反応が低下する（６３、６４）
。グリセロル保存組織はグリセロル内で４℃の温度下で保管される。両方の手順
とも組織をフォイル・バッグに移し、ガンマ線照射あるいはエチレン・ガスによ
ってさらに殺菌できるようにすることによって完了する。使用する前に、組織を
生理的食塩水／リンゲル液内に浸して再構成する。タイプＩ及びＩＩコラーゲン
及びヒトの皮膚を含む合成繊維などの追加的な傷被覆材料を比較目的のためにつ
くった（米国特許第５，００２，０７１号．Walther et al., 1998）。

【００７６】実施例１０外傷の遺伝子治療のための導入システムとしてのコレステロール含有陽イオンリ
ポソームは熱的な損傷を受けたラットで急性期反応を緩和する熱的損傷に伴うハイパーメタボリックに関与する１つの重要な因子は急性期タ
ンパク質とサイトカインの増大である［９、１０、１１］。本発明では、コレス
テロール含有陽イオンリポソームが生理的食塩水で措置した場合と比較して、火
傷後の体重の増加と構成的肝臓タンパク質トランスフェリン及び総タンパク質の
発現を改善することが示された。さらに、リポソームは血清タイプＩ急性期タン
パク質及びタイプＩ急性期タンパク質応答性炎症促進性サイトカイン血清ＴＮＦ
−α及びＩＬ−１βを減少させることも示された。ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αの
現象はこれら急性期タンパク質の減少につながる可能性がある。

【００７７】リポソームに関連した有利な効果がもたらされる理由は、損傷した細胞膜への
リポソーム脂質構成部分の直接的な影響、あるいは細胞外栄養物の摂取の増大及
び急性期タンパク質とサイトカインによって開始される高代謝反応の一部とし局
所的につくりだされる内発性成長因子及びサイトカインのｉｎｓｉｔｕでのカ
プセル化及び保護によるものである可能性が最も高い。炎症促進性サイトカイン
、特にＴＮＦ−αはタンパク質合成を抑止し、体重減少を誘発する［１６−１８
］。熱的損傷を受けた後、敗血症の場合と同様、ＴＮＦ−α血清レベルは敗血症によ
って誘発される筋タンパク質分解と共に増大する［１９−２１］。ＴＮＦ−α血
清レベルの低下は熱的に損傷を受けた小児患者における総タンパク質バランスの
改善及び体重減少の減少を伴う［２２、２３］。従って、ここで示されているよ
うに、ＴＮＦ−α血清レベルの減少は体重を保持し、血清トランスフェリン・レ
ベルの増大をもたらす可能性がある。

【００７８】ｉｎｖｉｔｒｏでのサイトカイン発現に対して陽イオンリポソームが発揮す
る抑止効果のメカニズムを調べるためのいくつかの研究が行われているが、正確
なメカニズムは現段階ではまだはっきりしていない［２５−３０］。核ファクタ
ー・カッパーＢ（ＮＦ−ｋβ）が重要な役割を果たしている可能性があるらしい
［２７］。ＮＦ−ｋβは転写信号であり、細胞免疫及び炎症反応の発展に決定的
な役割を果たしている［２７］。細胞と陽イオンリポソームとの間の静電反応に
よって、リポソームは酸化低密度脂質タンパク質（ＯｘＬＤＬ）に対するレセプ
タに結合する［２８．２９］。Sambrand等はこの競合的結合とその後に起きるＯ
ｘＬＤＬレセプタの活性化がＮＦ−ｋβのその同系ＤＮＡサイトの活性化及び／
又はそれへの結合を間接的に抑止することを示した［２８］。さらに、Aramaki
等は陽イオンリポソームがＭＡＰキナーゼ転写因子系のタンパク質であるｐ４１
のチロシン・ホスホリル化を抑止し、それが結果としてＮＦ−ｋβの下方調節に
つながることを示した［２５−２７］。ｐ４１及びＮＦ−ｋβの抑止は誘発可能
な窒素酸化物シンセターゼ（ｉＮＯＳ）の誘発を抑止し、それがその後の窒素酸
化物（ＮＯ）発現を減少させる［２５，２６］。信号経路におけるこれらの変化
が転写後レベルでのＴＮＦ−α発現の選択的抑止に関与していると想定されてい
る［２５、２６、３１］。ＮＯ及びｉＮＯＳがＩＬ−１β発現を促進すると仮定
すると、陽イオンリポソームを介してのＮＯあるいはｉＮＯＳ活性の抑止がＩＬ
−１β発現の低下につながるらしい［３２、３３］。従って、陽イオンリポソー
ム投与は、一部には炎症促進性サイトカイン放出の抑制によって、炎症促進性疾
病の措置における有効性を示すように思われる［３１、３４］。

【００７９】コレステロール含有陽イオンリポソームの投与はサイトカイン発現に影響を及
ぼすことで高代謝反応を調節するが、上記抑制の効果は５日間以上は持続しない
ようである。火傷から７日後のリポソームで措置した動物とコントロール動物と
の間での血清サイトカインとタンパク質との間に差は認められなかった。さらに
、血清トランスフェリンはリポソームの投与を受けたラットでは火傷から５−７
日目に減少したが、コントロールの動物は火傷から５−７日目に血清トランスフ
ェリンの増大を示した。さらに、血清ハプトグロビンはリポソームで措置したグ
ループで火傷から５−７日目に増大したが、コントロールの動物では血清ハプト
グロビンは同じ期間に減少した。従って、コレステロール含有リポソームは構成
的肝臓タンパク質を増大させ、タイプＩ急性期タンパク質を減少させ、それと同
時にＩＬ−１βとＴＮＦ−αレベルは減少した。従って、コレステロール陽イオ
ンリポソームは、リポソームが外傷によって誘発される高代謝反応を好適に調節
し、通常他の陽イオンリポソームのｉｎｖｉｖｏでの使用に関連した細胞毒性
を示さないので、外傷における遺伝子治療用の導入システムとして適しているよ
うである［４、７］。

【００８０】実施例１１熱的損傷後にＩＧＦ−Ｉ遺伝子構築物を複数回注射することの臨床的影響各グループ内のすべてのラットは６０％ＴＢＳＡ熱湯火傷と薬剤注入を生き延
び、望ましくない副作用の証拠は認められなかった。総体重はＩＧＦ−ＩｃＤ
ＮＡ遺伝子構成物を１回あるいは複数回注射してトランスフェクトさせた動物に
おいて、火傷後の最初の４週間に１週間あたり約２％の割合で増大し、２つのグ
ループの間に差は認められなかった。ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡ遺伝子構築物の注射
を複数回受けたラットは１回だけ注射を受けたラットと比較して、より高い血清
タンパク質レベル（１回の注射の場合５．２＋０．０５ｇ／ｄｌであるのに対し
て、複数回注射を行った場合は５．５＋０．０６ｇ／ｄｌ）及びより高い総肝臓
タンパク質（１回の注射の場合０．６４＋０．００２ｍｇ／ｍｌであるのに対し
て、複数回注射を行った場合は０．７１＋０．００３ｍｇ／ｄｌ）を示した。瘡
蓋を取り除いた後、再上皮化した火傷傷の面積割合は１回の投与を受けたラット
と比較してＩＧＦ−ＩｃＤＮＡを２回注射されたラットにおいて火傷から３３
日後にかなり大きかった（それぞれ３８＋２％対３１＋２；ｐ＜０．０５）。こ
れらの結果は直線形再上皮化を組織学的に測定することで確認された。ＩＧＦ−
ＩｃＤＮＡを２回注射されたラットは１回の注射を受けたラットと比較して再
上皮化の割合がかなり高かった（ｐ＜０．０５；図ＩＩ）。

【００８１】 β−ガラクトシダーゼを検出するための化学蛍光レポータ遺伝子アッセイによ
って判定されたトランスフェクションはリポソーム・カプセル化ＬａｃＺｃＤ
ＮＡ及びＩＧＦ−ＩｃＤＮＡ構築物を複数回注射された動物の傷周辺で、１回
の注射を受けたラットと比較して増大した（ｐ＜０．０５；図１２Ａ、Ｂ）。Ｉ
ＧＦ−Ｉタンパク質の皮膚濃度はＩＧＦ−ＩｃＤＮＡを一回注射されたラット
において、その傷周辺で皮膚バイオプシーＩから皮膚バイオプシーＩＩＩに向け
て減少した（図１３Ａ）。ｃＤＮＡ構成物を２回注射された動物は、傷周辺部全
体にそって一貫してＩＧＦ−Ｉタンパク質濃度の上昇を示した（図１３Ｂ）。さ
らに、トランスフェクションはＬａｃＺ遺伝子の皮下注射からわずか１日目に検
出することができた。トランスフェクションの割合は増大傾向を示し、注入から
５日目にピークに達した。投与から７日後にトランスフェクションが検出されな
かったｉｎｖｉｔｒｏでの実験と対照的に、ｉｎｖｉｖｏでの注入後７−１
４日目にも検出可能であった。

【００８２】ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡ及びレポータＬａｃＺ構築物の皮下注射後、トランスフ
ェクトされた皮膚細胞、筋繊維芽細胞、内皮細胞、及びマクロファージが確認さ
れ、増殖することが知られている多重核巨大細胞も含まれていた。ＩＧＦ−Ｉに
対するｍＲＮＡレベルはＩＧＦ−Ｉ構成物でトランスフェクトさせたラットの皮
膚で増大した。ｍＲＮＡがタンパク質内に翻訳されたということは観察されてい
るＩＧＦ−Ｉタンパク質濃度の増大との一貫性を示している。こうしたＩＧＦ−
Ｉタンパク質の局所発現の一時的増大はＩＧＦＢＰ−３の同時並行的刺激及び生
物学的に活性のあるＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３複合体のレベルを局所的に増大
させることができ、遊離ＩＧＦ−Ｉタンパク質の循環レベルにおける超生理学的
増大は伴わず、従って望ましくない副作用は無かった［４９、５０］。リポソー
ム・トランスフェクション後に発現される少量のＩＧＦ−Ｉタンパク質は全身投
与で必要とされるより大きな用量の悪い副作用を伴わず、パラクリン方式で有効
である。

【００８３】皮膚におけるＩＧＦ−Ｉ濃度の上昇は再上皮化及び皮膚細胞回復及び皮膚細胞
分裂という面で傷癒合を改良した。ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡを受けたラットも総体
重と血清及び肝臓における総タンパク質濃度の増大を示した。血液、肝臓、脾臓
あるいは腎臓でトランスフェクションもＩＧＦ−Ｉ発現の増大も観察されなかっ
たので、有利な効果（例えば体重の維持、結成及び肝臓タンパク質濃度の増大）
は傷癒合の改善及び損傷後の皮膚細胞の回復の改善によるものであり、全身トラ
ンスフェクションからもたらされるＩＧＦ−Ｉタンパク質の循環レベルの変化と
は反対に、ＩＧＦ−Ｉタンパク質の局所的に高いレベルに関連したパラクリン効
果によるものである。ＩＧＦ−Ｉはコラーゲン合成の刺激により表皮ケラチン細
胞及び繊維芽細胞に対して細胞分裂誘発的効果を及ぼし、火傷後の細胞回復を促
進して、傷癒合の促進をもたらす［４０、４１、４８］。

【００８４】いくつかの臨床研究［３６、３７］で示された早期の傷閉鎖の利点は高代謝性
火傷反応の減少、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、及びＴＮＦ−αなどの炎症媒
介因子の減少［３６、３７］などである。さらに、ＩＧＦ−Ｉタンパク質は熱的
損傷後の炎症促進性サイトカインＩＬ−１β及びＴＮＦ−α発現を減少させる［
５７］。従って、ＩＧＦ−Ｉは再上皮化の促進及び／又は火傷後のサイトカイン
合成及び放出の主要な源泉の１つである皮膚における炎症促進性反応の減少を通
じてその全身的好影響を及ぼす［５８、５９］。

【００８５】本発明ではトランスフェクションが注射箇所の小さな周囲内の皮膚に限定され
ているおとが実証されている。ＩＧＦ−Ｉの発現の性質は陽イオンリポソーム上
の正表面電荷と負に荷電された外側細胞膜との間のリポソーム移動を制限する相
互作用である可能性が最も高い［５４］。しかしながら、トランスフェクション
とＩＧＦ−Ｉ発現は一回の注射箇所と比較して、複数の注射箇所を用いた場合、
かなり増大した。ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡを複数回注射するとＩＧＦ−Ｉタンパク
質発現が一貫して上昇し、傷癒合が促進されたのに対して、１回の注射では傷周
辺でのＩＧＦ−Ｉタンパク質の量が少なかった。この知見は遺伝子をカプセル化
するリポソームはトランスフェクション及びタンパク質発現を最適にするために
外傷からよく定義された距離で適用されるべきであるから、臨床的に適切である
。

【００８６】ここに述べれられている実験はリポソーム・カプセル化ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡ
構築物の皮下投与が皮膚細胞にうまくトランスフェクトしたことを示している。
ｃＤＮＡがｍＲＮＡ内に転写され、ＩＧＩ−１タンパク質内に翻訳されたことも
示されている。ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡを複数回注射するとトランスフェクトされ
た細胞の数とタンパク質発現が増大し、それによって１回の注射の場合と比較し
て傷被覆が改善された。全身的なトランスフェクションや全身的なＩＧＦ−Ｉタ
ンパク質発現の増大は観察されなかったので、トランスフェクション、転写、及
び翻訳のプロセスは皮膚に限定されていた。増大した皮膚ＩＧＦ−Ｉに対する生
物学的反応は傷癒合の促進と、その後に続くハイパーメタボリック反応の全身的
改善である。

【００８７】実施例１２リポソーム・カプセル化ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡ遺伝子導入は皮膚細胞内でＩＧＦ
−Ｉタンパク質を増大させ、傷癒合を促進する外傷を受けた後に一過性の遺伝子治療を用いることは臨床的な結果の改善及び
死亡率低下に対する新しいアプローチである。大きな重要性を持っているのは遺
伝子導入のための適切なベクターの選択である［１、２］。非ウイルス性組成物
、非毒性の増大した感染性、そして抗炎症性活性はコレステロール含有陽イオン
リポソームを火傷で誘発された高代謝反応を緩和するための有望な方式にしてい
る［４、５１−５３］。コレステロール含有陽イオンリポソームが熱的損傷後の
有効な導入システムであることも示された。さらに、ＤＮＡトランスフェクショ
ンとその後に誘発される遺伝子発現が熱的損傷反応を変化させることメカニズム
と熱的損傷のモデルにおけるＩＧＦ−Ｉ遺伝子導入の効果について報告されてい
る。リポソーム・カプセル化ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡ構築物の皮下注射が皮膚細胞
をうまくトランスフェクトし、ｃＤＮＡがｍＲＮＡ内に転写されてＩＧＦ−Ｉタ
ンパク質内に翻訳されることが示された。トランスフェクション、転写、及び翻
訳のプロセスは皮膚に限定されていた。増大した皮膚ＩＧＦ−Ｉに対する生物学
的反応は傷癒合の促進と、その後に続くハイパーメタボリック反応の全身的改善
であった。これらの知見から、６０％ＴＢＳＡ熱的損傷を有するラットに与えた
場合に、ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡに対する発現プラスミド・ベクターをカプセル化
するコレステロール含有陽イオンリポソームがＩＧＦ−Ｉ皮膚タンパク質濃度の
増大に有効であり、それによって傷被覆を促進すると結論付けることができる。

【００８８】実施例１３被覆材料としての膜の比較異なった被覆材料の生物学的有効性を判定するために、４ヶ月の期間にわたっ
て毎週結果を測定し、その測定内容はａ）傷被覆時間；ｂ）コンピュータ化プラ
ミニメータ、組織学的／電子顕微鏡による再上皮化測定、ｃ）摂取量と拒絶の組
織学及び免疫的兆候の結びつき、そしてｄ）弾性及び収縮などであった。これら
のデータに基づいて、種々の被覆材料の有効性を評価し、最も適切なものを判定
する。

【００８９】さらに、遺伝子導入をａ）トランスフェクションのスクリーンとしてのレポー
タ遺伝子（β−ガラクトシダーゼ）発現の組織学的、化学蛍光アッセイ、ｂ）転
写マーカーとしての皮膚内のＩＧＦ−ＩｍＲＮＡに対するノーザン・ブロット
分析；そしてｃ）皮膚内におけるＩＧＦ−Ｉタンパク質を検出するための放射免
疫アッセイによって測定した。

【００９０】さらに、急性期反応をａ）体重、栄養摂取、窒素バランスおよび筋と肝臓にお
けるタンパク質濃度、ｂ）ネフェロメータによって判定された構成的肝臓タンパ
ク質生産（アルブミン、トランスフェリン、プレ−アルブミン及びレチノール結
合タンパク質）、ｃ）酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及びネフェロメータによる急性期タン
パク質（ヘパトグロビン、α_１−酸糖タンパク質、α_２−マクログロビン及びフ
ィブリノゲン）測定、そしてｅ）ＥＬＩＳＡによるサイトカイン（インターロイ
キン−１β、インターロイキン−４、インターロイキン−６、インターロイキン
−８、インターロイキン−１０、腫瘍壊死因子−α及びインターフェロン−γに
よって判定した。

【００９１】実施例１４火傷外相の傷被覆臨床的治療をより正確にシミュレートするために、１５頭のヨークシャー・ブ
タのそれぞれに麻酔、鎮痛常態下で体表面全体の３５％（ＴＢＳＡ）に全厚炎症
性火傷（標準モデル）を与えた。それらの動物をハンモックで２４時間拘束して
、充分な蘇生及び鎮痛措置を含む集中ケアした。臨床的状況を模倣するために、
火傷を受けてから２４時間後に、動物に対して切除及び移植を行った。これはヒ
トの患者が火傷後に切除、移植を受けるのとほぼ同じ時間的枠組みであった。一
般的な麻酔及び鎮痛措置下では、火傷傷全体が切除され、ヒト羊膜あるいはリポ
ソーム遺伝子複合体を含浸させたヒト羊膜で被覆される。同じ動物の背部では種
々の傷被覆素材が用いられたのに対して、１つの動物にはただ１つのタイプだけ
の被覆材料を用いた。その被覆は火傷していない箇所にステープルするか、ある
いは三重の抗生油剤を含むガーゼ及び大きな圧力包帯で被覆する。必要に応じて
ステープル及び／又は縫合糸を用いた。手術後、調査対象の動物を、上に述べた
ような麻酔状態から回復させてハンモック拘束状態にした。

【００９２】これらの実験で、リポソーム発現ベクターを有する、あるいは有しない種々の
被覆素材の肝臓急性期反応に対する影響を判定してその影響と傷癒合との関連性
が調べられた。従って、火傷、手術の直後、及び術後２、４、６、８、１０、１
２、１４及び１６日目に、動物から静脈血を抜き取って、構成的肝臓タンパク質
、急性期タンパク質及びサイトカインに関して調査を行った。ヒト羊膜又はイン
テグラ（ＩＮＴＥＧＲＡ^TM）はリポソーム遺伝子構築物の貯蔵器である。細胞／
傷表面間の静電反応のせいで、リポソームは含浸された被覆材料から外に移動し
て、皮膚と傷ついた細胞をトランスフェクトし、それによって局所的なＩＧＦ−
Ｉ濃度を増大させる。ＩＧＦ−Ｉ濃度の増大はその結果として傷癒合を改善する
。

【００９３】実施例１５ＩＧＦ−１関連成長因子リポソーム遺伝子構築物を含浸させた胎児膜あるいはヒト死体皮膚は火傷後の
移植片摂取、機能性、傷癒合、そしてハイパーメタボリック反応を改善してくれ
る。リポソーム遺伝子構築物はインシュリン様成長因子―Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、表
皮ケラチン細胞成長因子（ＫＧＦ）、成長ホルモン（ＧＨ）、繊維芽細胞成長因
子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β
）、あるいは上に述べた因子のいずれかの組み合わせをコードする場合もある。

【００９４】結論ＩＧＦ−ＩをコードするｃＤＮＡを含有するリポソームは６０％ＴＢＳＡ創傷
後に体重を維持し、筋タンパク質喪失を防ぎ、そして皮膚内でのＩＧＦ−Ｉタン
パク質濃度を増大させることが示された。さらに、細胞トランスフェクション及
びその後のＩＧＦ−Ｉ遺伝子発現は注射箇所に限定された局所的な事象である。
血清ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦＢＰ−３の間には有意さはないので、リポソーム遺伝
子導入の好適な影響はＩＧＦ−Ｉ循環における全身的な変化ではなく、局所化さ
れた傷癒合が理由である。

【００９５】本発明は成長促進剤をコードするｃＤＮＡが好適に熱による損傷後の高代謝反
応を調節し、そして、リポソーム構築物が遺伝子トランスフェクションのための
導入システムとして有効に使えることを示している。リポソーム遺伝子トランス
フェクションの治療上の利点は傷周辺の注射箇所の数を増やすか、あるいは『傷
手当用品』によってさらに強化され、トランスフェクトされた細胞の数とそれに
並行する遺伝子発現のレベルの上昇をもたらした。従って、胎児膜あるいはＩＧ
Ｆ−Ｉ遺伝子構築物を含むリポソームを含浸させたその他の傷被覆材料は傷癒合
を改善し、火傷傷措置としては最適である。リポソーム遺伝子治療のこうした適
用はヒト死体皮膚、羊膜あるいはその他のタイプの傷被覆及び／又は閉鎖素材に
含浸させるために用いられ、柔軟で再構成的な外傷及び火傷手術を革新し、それ
らの患者の臨床結果を改善してくれる可能性がある。

【００９６】本明細書中には以下の引例が引用された。 1. Firedmann T. Scientific American, 1997. 6: 96-101. 2. Felgner PL. Scientific American. 1997. 6: 102-106. 3. Feigner, P.L., et al. Annals of the New York Academy of Sciences. 19
95. 772; 126-139. 4. FeIgner, P.L. Human Gene Therapy. 1996, 7: 1791-1793. 5. Wheeler, C,J., et al. Proc Natl Acad Sciec 1996. 93 (21): 11454-11459. 6. Sharata, et al. Intern J Dermatalogy. 1996. 35(1 1):761-769. 7. Fey G, & Gauldie J. The acute phase response of the liver in inflamm
ation. In Popper, H., Schaffner, F. (Eds.). Progress in Liver Disease. P
hiladelphia: W.B. Saunders, 1990. 89-116. 8. Rotheschild MA, et al. Hepatology. 1988. 8:385-401. 9. Moshage H. J Pathol. 1997. 181: 257-266. 10. Selzman CH, et al, Shock 1998; 10: 309-318. 11. Gilpin DA, et al. Surgery. 1996. 119 (6): 664-673. 12. Jarrar D, et al, Arch. Surg 1997. 132: 1171-1176. 1 3. Xia ZF, et al. Surgery. 1996. 119: 664-673. 15. Herndon DN, et al J. Surg. Res. 1978. 25: 394-403. 16. Beutler B, & Cerami A. Adv Immunol. 1988. 42: 213-231. 17. Moldawer LL, et al. Ann Rev Nutr. 1988. 8:585-609. 18. Frost RA, et al. Endo. 1997. 138 (10): 4153-4159. 19. Marano M, et al. Am Burn Assoc Ann Proc. 1988. 20: 18. 20. Yamada Y, et al. Burns. 1996. 22 (8): 587-593. 21. Balteskard L, et al. Scand J Infect Dis. 1997. 29: 393-399. 22. Gore DC, et al. Arch Surg. 1991. 126: 38-43. 23. Chrysopoulo MT, et al. Arch Surg. 1998. (in press). 24. Pennanen N, et al, Pharm Res. 1995. 12: 916-922. 25. Aramaki Y, et al. Biochem Biophys Res Corn. 1996. 220: 16. 26. Aramaki Y, et al. Biochem Biophys Res Corn. 1997. 23 1:827-830. 27. Mulsch A, et a]. Biochem Biophys Res Corn. 1993. 191:1301-1308. 28. Sambrand et al. Proc Nat Acad Sci USA. 1995. 92: 1396-1400. 29. Shackelford RE, et al. J Biol Chem. 1995. 270: 3745-3478. 30. Mulsch A, et al. FEBS Lett. 1993. 321: 215-218. 31. Brisseau GF, et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy.1994. 38:
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【００９７】本発明に述べられているずべての特許及び刊行物は本発明が関係する技術分野
の当業者のレベルを示している。さらに、これらの特許及び刊行物は本明細書で
引用されたことで、個々の刊行物が具体的、個別的に引用によって組み込まれる
のと同様に、全体として組み込まれている。

【００９８】当業者であれば、本発明はここで述べられている課題を実行し、目的と利点、
及びそれらに本質的に付随した課題、目的、利点を達成するのによく適合してい
ることは容易に理解できるであろう。これらの実施例は本明細書中で述べられて
いる方法、手順、措置、分子、及び具体的な化合物と共に現段階での好ましい実
施の形態を示すもので、本発明の範囲の限定は意図していない。添付請求項に定
義されている本発明の精神の範囲内に含まれる変更やその他の使用法は当業者に
は自明であろう。

【００９９】添付図面は上に述べた本発明の特徴、利点、及び目的が明確になり、詳細に理
解できるようにここに含まれている。これらの図面は明細書の一部を形成してい
る。しかしながら、添付図面は本発明の好ましい実施の形態を示すものであり、
本発明の範囲の限定を意図するものではない。

【図面の簡単な説明】

【図１】注入箇所を図式的に示す図である。１つの注入箇所を有する動物は注入箇所Ｉ
だけで注入を受けたのに対して、２つの注入箇所を有する動物は注入箇所Ｉ及び
ＩＩで注入を受けた。火傷から３３日後に皮膚バイオプシーＩ，ＩＩ，ＩＩＩを
取り出して分析した。

【図２】ＣＭＶにより駆動されるプロモータを有するＩＧＦ−Ｉプラスミド（ｐｃＤＮ
Ａ３ｃＤＮＡを示しす図である。β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ遺伝子）に
対する構造的に類似したプラスミドも同じプラスミドに組み込んだ。

【図３】７日間の調査で示された体重変化率を示す図である。＊グループ間の有意差は
ｐ＜０．０５。データは平均値＋標準偏差で示されている。

【図４】 β−ガラクトシダーゼ活性に関する組織化学的反応を行い、エオシンで対比染
色した後の皮膚の組織学的断面を図である。図４Ａでは、火傷傷の基底の肉芽組
織内の多くの筋線維芽細胞及び組織球細胞内に微粒子上の青緑色反応生成物が存
在している。倍率は３８０倍である。４Ｂでは、火傷傷近くの損傷を受けていな
い皮膚の下側の食塩水注入（コントロール）上皮組織は反応生成物を示さなかっ
た。倍率は３８０倍である。

【図５】ＩＧＦ−ＩをコードするｃＤＮＡを含むリポプレクシーでトランスフェクトし
た後の皮膚におけるＩＧＦ−ＩｍＲＮＡの存在を示す図である。リポソームだ
けあるいは生理的食塩水だけでトランスフェクトしたラット（レーンＡ及びＢ）
からの皮膚バイオプシーからはＩＧＦ−ＩｍＲＮＡは検出できなかった。ＩＧ
Ｆ−ＩｃＤＮＡでトランスフェクトしたラット（レーンＣ）からの皮膚バイオ
プシーには有意な量のＩＧＦ−ＩｍＲＮＡが存在した。代表的なサンプルを示
している。

【図６】７日間の調査期間中の血清トランスフェリン濃度を示す図である。血清トラン
スフェリンは火傷による損傷後減少した。リポソームは火傷後２及び５日後にそ
の降下を減衰させた。＊グループ間有意差、ｐ＜０．０５。データは平均値＋標
準偏差で示す。（通常の血清トランスフェリン、＞７２ｍｇ／ｄｌ）。

【図７】図７は熱的損傷から１−７日後の血清α_１−酸糖タンパク質を示す図である。
＊食塩水とリポソーム間の有意差、ｐ＜０．０５。データは平均値＋ＳＥＭで示
す。（通常の血清α_１−酸糖タンパク質、５５−７０ｐｇ／ｍｌ）。

【図８】熱的損傷から１−７日後の血清ＴＮＦ−αを示す図である。＊食塩水とリポソ
ーム間の有意差、ｐ＜０．０５。データは平均値＋標準偏差で示す。（通常の血
清ＴＮＦ−α、１−１０ｐｇ／ｍｌ）。

【図９】熱的損傷から１−７日後の血清ＩＬ−１βを示す図である。＊食塩水とリポソ
ーム間の有意差、ｐ＜０．０５。データは平均値＋標準偏差で示す。（通常の血
清ＩＬ−１β、４−２０ｐｇ／ｍｌ）。

【図１０】プラニメータで測定した傷再上皮化の面積を示す図である。カプセル化したＩ
ＧＦ−１ｃＤＮＡ構成物を受けたラットはリポソームあるいは食塩水グループ
と比較して、調査期間全体を通じて再上皮化の割合が最も高かった。＊リポソー
ムｃＤＮＡ対リポソーム及び食塩水（ｐ＜０．０５）。データは平均値＋標準偏
差で示す。

【図１１】プラニメータで測定した傷再上皮化した面積を示す図である。カプセル化した
ＩＧＦ−１ｃＤＮＡ構成物を複数回注入されたラットは１回の注入を受けたラ
ットと比較して、調査期間全体を通じて再上皮化の割合が最も高かった。＊ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡ複数回注入対１回注入、ｐ＜０．０５。データは平均値＋標準偏差で示す。

【図１２】 β−ガラクトシダーゼタンパク質の存在が皮膚バイオプシーＩ、ＩＩ及びＩＩ
Ｉ内で化学蛍光レポータ遺伝子アッセイによって検出されたことを示す図である
（１２Ａ）。ｃＤＮＡ構築物の注入を１回受けたラットでは傷端部に沿ってβ−
ガラクトシダーゼ発現がかなり低下した。＊皮膚バイオプシーＩとＩＩＩとの間
の有意差，ｐ＜０．０５（１２Ｂ）。複数回の注入を受けたラットではβ−ガラ
クトシダーゼ発現が一貫してかなり上昇したレベルを示した。皮膚バイオプシー
Ｉ、ＩＩあるいはＩＩＩ間には差がなかった。データは平均値＋ＳＥＭで示す。

【図１３】ＲＩＡで測定された皮膚バイオプシーＩ、ＩＩ、及びＩＩＩ内でのＩＧＦ−Ｉ
タンパク質濃度を示す図である。（１３Ａ）１回の注入を受けたラットはバイオ
プシーＩ−ＩＩＩのＩＧＦ−Ｉ濃度の低下を示した。皮膚バイオプシーＩとＩＩ
Ｉ間の有意差、ｐ＜０．０５。（１３Ｂ）複数回の注入を受けた動物は一貫して
高いレベルのＩＧＦ−Ｉを示した。データは平均値＋標準偏差で示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 38/22 Ａ６１Ｐ 17/02 38/28 41/00 47/28 43/00 １０７Ａ６１Ｌ 15/44 Ａ６１Ｋ 37/24 Ａ６１Ｐ 17/02 37/26 41/00 Ａ６１Ｌ 15/03 43/00 １０７Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ペレ−ポロ，ジョージ，アール．アメリカ合衆国 77551 テキサス，ガルベストン，トミニク 2934 (72)発明者バロウ，ロバートイー．アメリカ合衆国 77554 テキサス，ガルベストン，オステマイアロード 11806 Ｆターム(参考） 4C076 AA19 AA71 BB11 BB31 CC26 CC30 CC50 DD70F FF16 4C081 AA02 AA12 BA16 CD26 CD27 CD34 DA02 4C084 AA02 AA13 BA44 DB01 DB52 DB58 MA05 MA24 MA63 MA66 NA10 NA11 NA12 NA14

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】傷に少なくとも１つの成長促進剤をコードする遺伝子を含む
リポソームを注入するステップを含む治療を必要とする個人における傷癒合の促
進方法。
【請求項２】傷が熱外傷、化学的外傷、切除外傷、手術外傷、及び、すり
傷で構成される群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】リポソームがコレステロール含有陽イオンリポソームである
請求項１記載の方法。
【請求項４】成長促進剤が増殖ホルモン、インシュリン様成長因子−Ｉ、
表皮ケラチン細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子、上皮成長因子、血小板由来成
長因子、及び形質転換成長因子−βで構成される群から選択されることを特徴と
する請求項１記載の方法。
【請求項５】上記増殖改良因子がインシュリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）
であり、リポソームのＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子の濃度が約２．２μ／ｍｌ
リポソームである請求項４記載の方法。
【請求項６】傷被覆材料にリポソームを含浸させるステップを含み、上記
リポソームが成長促進剤をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む傷癒合の促
進方法。
【請求項７】傷被覆材料の含浸が傷を被覆する前、又は、傷の被覆に続い
て行われる請求項６記載の方法。
【請求項８】傷が熱外傷、化学的外傷、切除外傷、手術外傷、及び、すり
傷で構成される群から選択される請求項６記載の方法。
【請求項９】傷被覆材料がヒト胎児羊膜、ヒト胎児絨毛膜、ヒトの死体の
皮膚、および合成皮膚から成る群より選択される請求項６記載の方法。
【請求項１０】リポソームがコレステロール含有陽イオンリポソームであ
る請求項６記載の方法。
【請求項１１】成長促進剤が増殖ホルモン、インシュリン様成長因子−Ｉ
、表皮ケラチン細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子、上皮成長因子、血小板由来
成長因子及び形質転換成長因子−βで構成される群から選択される請求項６記載
の方法。
【請求項１２】成長促進剤がインシュリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）であ
り、リポソームのＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子の濃度が、約２．２μ／ｍｌ
リポソームである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】傷を傷閉鎖材料で被覆し、上記傷の閉鎖材料にリポソーム
を含浸させるステップを含み、上記リポソームが成長促進剤をコードする少なく
とも１つの遺伝子を含む傷癒合促進方法。
【請求項１４】傷閉鎖材料の含浸が傷を被覆する前、又は、傷の被覆に続
いて行われる請求項１３記載の方法。
【請求項１５】傷が熱外傷、化学的外傷、切除外傷、手術外傷、及び、す
り傷で構成される群から選択される請求項１３記載の方法。
【請求項１６】傷の閉鎖材料がヒト胎児羊膜、ヒト胎児絨毛膜、ヒトの同
種同系皮膚、およびヒトの同種異系皮膚で構成される群から選択される請求項１
３記載の方法。
【請求項１７】リポソームがコレステロール含有陽イオンリポソームであ
る請求項１７記載の方法。
【請求項１８】成長促進剤が増殖ホルモン、インシュリン様成長因子−Ｉ
、表皮ケラチン細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子、上皮成長因子、血小板由来
成長因子及び形質転換成長因子−βで構成される群から選択される請求項１３記
載の方法。
【請求項１９】成長促進剤がインシュリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）であ
り、リポソームのＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子の濃度が約２．２μ／ｍｌリポ
ソームであることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】傷被覆材料、及び、成長促進剤をコードする少なくとも１
つの遺伝子を含むリポソームを含む促進傷手当用品。
【請求項２１】傷被覆材料がヒト胎児羊膜、ヒト胎児絨毛膜、ヒトの死体
の皮膚、及び、合成皮膚で構成される群から選択される請求項２０記載の促進傷
手当用品。
【請求項２２】リポソームがコレステロール含有陽イオンリポソームであ
る請求項２０記載の促進傷手当用品。
【請求項２３】成長促進剤が増殖ホルモン、インシュリン様成長因子−Ｉ
、表皮ケラチン細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子、上皮成長因子、血小板由来
成長因子及び形質転換成長因子−βで構成される群から選択される請求項２０記
載の促進傷手当用品。
【請求項２４】成長促進剤がインシュリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）であ
り、リポソームのＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子の濃度が約２．２μ／ｍｌリポ
ソームである請求項２３記載の促進傷手当用品。
【請求項２５】成長促進剤をコードする少なくとも１つの遺伝子を含むリ
ポソーム、及び、薬理的に受容できる担体を含む傷癒合促進用組成物。
【請求項２６】傷が熱外傷、化学的外傷、切除外傷、手術外傷、及びすり
傷で構成される群から選択される請求項２５記載の組成物。
【請求項２７】リポソームがコレステロールを含有する陽イオンリポソー
ムである請求項２５記載の組成物。
【請求項２８】成長促進剤が増殖ホルモン、インシュリン様成長因子−Ｉ
、表皮ケラチン細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子、上皮成長因子、血小板由来
成長因子及び形質転換成長因子−βで構成される群から選択される請求項２５記
載の組成物。
【請求項２９】成長促進剤がインシュリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）であ
り、リポソームの上記遺伝子をコードするＩＧＦ−Ｉの濃度が、約２．２μ／ｍ
ｌのリポソームであることを特徴とする請求項２８記載の組成物。
【請求項３０】注射器内に充填できるようにパッケージ化された請求項２
５記載の組成物。
【請求項３１】注射器内に入れられた請求項２５記載の組成物。