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JP2003501098A - 基質捕捉性プロテインチロシンホスファターゼ - Google Patents

基質捕捉性プロテインチロシンホスファターゼ

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Publication number
JP2003501098A
JP2003501098A JP2001502601A JP2001502601A JP2003501098A JP 2003501098 A JP2003501098 A JP 2003501098A JP 2001502601 A JP2001502601 A JP 2001502601A JP 2001502601 A JP2001502601 A JP 2001502601A JP 2003501098 A JP2003501098 A JP 2003501098A
Authority
JP
Japan
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substrate
ptp
protein
tyrosine
tyrosine phosphatase
Prior art date
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Pending
Application number
JP2001502601A
Other languages
English (en)
Inventor
トンクス，ニコラス，ケイ．
チャン，シャオ−フイ
Original Assignee
コールド スプリング ハーバー ラボラトリー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by コールド スプリング ハーバー ラボラトリー filed Critical コールド スプリング ハーバー ラボラトリー
Publication of JP2003501098A publication Critical patent/JP2003501098A/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

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  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 触媒機能を有さないが、ホスホチロシン含有タンパク質基質と結合する能力を保持し、かつ少なくとも１つのチロシン残基とリン酸化され得ないアミノ酸との置換によりさらに改変される、新規な基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）に関する組成物および方法が提供される。ＰＴＰ基質の同定のためのかかるＰＴＰの使用、ＰＴＰ−基質相互作用を変える薬剤の使用が開示され、ＰＴＰ活性を変更する方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連出願の相互参照 本出願は、１９９６年７月２５日に提出された米国特許出願第０８／６８５，
９９２号の分割出願である、１９９８年９月１日提出の米国特許出願番号第０９
／１４４，９２５号の一部継続出願である。本出願はまた、１９９９年６月３日
提出の米国特許仮出願第６０／１３７，３１９号（代理人名簿番号ＣＳＨＬ９９
−０６Ｐ）の特典を主張する。これらの出願の教示は、その全体が参照によりこ
こに組み込まれる。
【０００２】 米国政府の権利の言明 ここで述べる研究は、米国立衛生研究所によって授与された研究補助金ＣＡ
５３８４０の下で政府の資金援助を受けた。米国政府はこの発明の権利の一部を
所有しうる。
【０００３】 発明の分野 本発明は一般に、細胞増殖、細胞分化及び／又は細胞の生存を制御するものの
ような、細胞の生化学的経路の欠陥に関連する状態を治療するために有用な組成
物と方法に関する。本発明は、より特定すると、プロテインチロシンホスファタ
ーゼポリペプチドの基質捕捉性変異体、及びそのバリアントに関する。本発明は
また、生物学的シグナル伝達及び細胞の生化学的経路を変化させる、小分子を含
めた抗体及び他の薬剤を同定するためのそのようなポリペプチドの使用に関する
。
【０００４】 発明の背景 ポリペプチドにおいて一部のチロシン残基をリン酸化するプロテインチロシン
キナーゼ（ＰＴＫ）、及び一部のホスホチロシン残基を脱リン酸化するプロテイ
ンチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）の作用によって同調(coordinate)される可
逆的な蛋白質チロシンのリン酸化は、多くの細胞活動を調節する上での鍵となる
機序である。ＰＴＰとＰＴＫの多様性と複雑さは同等であり、ＰＴＰは、細胞機
構が適切に機能するために正と負の両方のシグナルを送達するのに等しく重要で
あることが明らかになりつつある。チロシンリン酸化の調節は、細胞の分裂、増
殖及び分化に関連するものを含む、生物学的シグナル伝達の特異的経路に寄与す
る。これらの経路の欠陥及び／又は機能不全は、例えば悪性疾患、自己免疫疾患
、糖尿病、肥満及び感染を含む、介入処置のための有効な手段があいまいなまま
である一部の疾患状態の原因となりうる。
【０００５】 プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ファミリーの酵素は、共通して
高度に保存された２５０アミノ酸のＰＴＰ触媒ドメインを持つが、その非触媒セ
グメントにおいてはかなりの変動性を示す、５００以上の構造的に異なる蛋白質
から成る（ＣｈａｒｂｏｎｎｅａｕとＴｏｎｋｓ，１９９２ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ
．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：４６３−４９３；Ｔｏｎｋｓ，１９９３ Ｓｅｍｉ
ｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４：３７３−４５３）。この構造的多様性は、ある場
合には、増殖、発生及び分化において特異的機能を持つことが明らかにされてい
るＰＴＰファミリーの個々の成員の生理的役割の多様性をおそらく反映している
。（Ｄｅｓａｉら、１９９６ Ｃｅｌｌ ８４：５９９−６０９；Ｋｉｓｈｉｈ
ａｒａら、１９９３ Ｃｅｌｌ ７４：１４３−１５６；Ｐｅｒｋｉｎｓら、１
９９２ Ｃｅｌｌ ７０：２２５−２３６；ＰｉｎｇｅｌとＴｈｏｍａｓ，１９
８９ Ｃｅｌｌ ５８：１０５５−１０６５；Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９９３ Ｃ
ｅｌｌ ７３：１４４５−１４５４）。
【０００６】 最近の研究ではまた、ＰＴＰの構造、発現及び調節に関してかなりの情報が得
られているが、ＰＴＰがその作用を及ぼすためのチロシンリン酸化基質の性質は
解明されないままである。合成リンペプチド基質についての限られた数の研究は
、種々のＰＴＰの基質選択性におけるある程度の相違を明らかにした（Ｃｈｏら
、１９９３ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２：９７７−９８４；Ｄｅｃｈｅｒｔら
、１９９５ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３１：６７３−６８１）。ＰＴＰ
が仲介するＰＴＰ基質の脱リン酸化の分析は、リン酸化チロシン残基に対して基
質ポリペプチドの特定位置にある種のアミノ酸残基が存在することにより、触媒
活性に好都合でありうることを示唆している（Ｒｕｚｚｅｎｅら、１９９３ Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１１：２８９−２９５；Ｚｈａｎｇら、１９９４
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：２２８５−２２９０）。それ故、これらの
研究において使用された基質の生理学的関連性は不明であるが、ＰＴＰはｉｎ
ｖｉｔｒｏである程度のレベルの基質選択性を示す。
【０００７】 ＰＴＰファミリーの酵素は、共通する、ＰＴＰ触媒ドメインとして知られる約
２５０個のアミノ酸の進化的に保存されたセグメントを含む。この保存されたド
メイン内に、すべてのＰＴＰにおいて不変である特有のシグナチャー(signature
) 配列モチーフ、 ［Ｉ／Ｖ］ＨＣＸＡＧＸＸＲ［Ｓ／Ｔ］Ｇ 配列番号：３６ が存在する。このモチーフ内のシステイン残基は該ファミリーの成員において不
変であり、ホスホチロシンの脱リン酸化反応の触媒作用にとって不可欠であるこ
とが知られている。かかる残基は、入ってきた基質のホスホチロシン残基上に存
在するホスフェート部分を攻撃する求核試薬として機能する。システイン残基を
部位特異的突然変異誘発によってセリン（例えばシステインからセリンへの変異
体又は「ＣＳ」変異体において）又はアラニン（例えばシステインからアラニン
への変異体又は「ＣＡ」変異体）に置き換えると、生じたＰＴＰは、触媒作用は
減衰しているが、少なくともｉｎ ｖｉｔｒｏではその基質と複合体を形成する
又は結合する能力を保持している。そのような変異体は、例えばＰＴＰファミリ
ーの成員であるＭＫＰ−１（Ｓｕｎら、１９９３ Ｃｅｌｌ ７５：４８７−４
９３）、並びに他のＰＴＰを用いて作製することができる。しかし、これらのＣ
Ｓ変異体は一般にｉｎ ｖｉｔｒｏでホスホチロシル基質と有効に結合して、安
定な酵素−基質複合体を形成することができるが、多くの場合そのような複合体
は、例えば変異体ＰＴＰとホスホチロシル蛋白質基質の両方が１個の細胞内に一
緒に存在するときには、ｉｎ ｖｉｖｏで単離することができる。それ故、ＣＳ
変異体は有用性が限られており、すべての組合せのＰＴＰと基質を単離するため
には使用することができない。
【０００８】 現在、ＰＴＰが仲介する細胞事象を支配する分子機序を明らかにするための望
ましいゴールは、特に、ＰＴＰが相互作用する分子、基質及び結合パートナーの
決定、及びＰＴＰ活性を調節する薬剤の同定を含む。ある種の状況では、しかし
ながら、現在のアプローチは、ＰＴＰによるチロシンリン酸化の調節の一部の局
面についての理解を導きうるが、細胞内での特異的チロシンリン酸化及び／又は
脱リン酸化事象を制御するための戦略を提供することはできないであろう。
【０００９】 従って当該技術においては、ＰＴＰの調節を含むホスホチロシンのシグナル伝
達を調節する改善された能力が求められている。ＰＴＰの調節に関する理解を高
めることは、ホスホチロシンシグナル伝達経路に関与する蛋白質の活性を調節し
、そのような経路に関連する状態を治療するための方法の開発を促進すると考え
られる。本発明はこれらの必要を満たし、さらに他の関連する利益を提供する。
【００１０】 発明の概要 本発明はＰＴＰの基質１つ以上と結合（捕捉）する、基質捕捉性ＰＴＰ（ＳＴ
−ＰＴＰ）とも称される、哺乳類ＰＴＰの新規な基質捕捉性の変異体または改変
型を提供する。ＳＴ−ＰＴＰとＰＴＰ基質との結合により、容易に観察でき、そ
して所望により単離して同定することのできる複合体が形成される。これらのＰ
ＴＰの変異体は野生型のＰＴＰと比較した場合、減衰された触媒活性（触媒活性
を欠くか低下した触媒活性を有する）を有するが、野生型ＰＴＰのチロシンリン
酸化基質に結合する能力を保持している。ＳＴ−ＰＴＰは例えばＰＴＰ１つ以上
の微妙な(fine)基質特異性を測定するために有用である。
【００１１】 本発明の１つの局面は野生型プロテインチロシンホスファターゼ触媒ドメイン
の不変アスパラギン酸残基が、酵素のＫｍは顕著な変化をもたらさないが１分あ
たり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸で置換され；かつ、少なく
とも１つの野生型チロシン残基がリン酸化されることのできないアミノ酸で置換
されている、基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼを提供する。
特定の実施態様においては、少なくとも１つの野生型チロシン残基がアラニン、
システイン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、
グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパ
ラギン、プロリン、アルギニン、バリンまたはトリプトファンであるアミノ酸で
置換されている。特定の別の実施態様においては、置換されているチロシン残基
の少なくとも１個はプロテインチロシンホスファターゼ触媒ドメインに位置する
。特定の実施態様においては、置換されているチロシン残基の少なくとも１個が
プロテインチロシンホスファターゼ活性部位に位置し、さらに特定の実施態様に
おいてはチロシン残基の少なくとも１個がフェニルアラニンで置換されている。
特定の別の実施態様においては、置換されているチロシン残基の少なくとも１個
がプロテインチロシンホスファターゼ保存残基であり、特定のさらなる実施態様
においては、保存された残基がヒトＰＴＰＨ１のアミノ酸部位６７６位における
チロシンに相当する。特定の実施態様においては、チロシン残基の少なくとも１
個がプロテインチロシンホスファターゼおよび基質分子少なくとも１個を含有す
る複合体を安定化させるアミノ酸で置換されている。特定の実施態様においては
、基質捕捉性変異体は変異体ＰＴＰＨ１を有しており、特定の実施態様において
は、基質捕捉性変異体はＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰ−ＰＥＳＴ、ＰＴＰγ、ＭＫＰ−１
、ＤＥＰ−１、ＰＴＰμ、ＰＴＰＸ１、ＰＴＰＸ１０、ＳＨＰ２、ＰＴＰ−ＰＥ
Ｚ、ＰＴＰ−ＭＥＧ１、ＬＣ−ＰＴＰ、ＴＣ−ＰＴＰ、ＣＤ４５、ＬＡＲまたは
ＰＴＰＨ１である変異体プロテインチロシンホスファターゼを包含する。特定の
実施態様においては、基質捕捉性変異体は２３１位のアミノ酸がセリン残基で置
換されている変異体ＰＴＰ−ＰＥＳＴホスファターゼを包含する。
【００１２】 本発明の別の局面は、（ｉ）野生型プロテインチロシンホスファターゼ触媒ド
メインの不変アスパラギン酸残基が、酵素のＫｍは顕著な変化をもたらさないが
１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸で置換され；かつ
（ｉｉ）少なくとも１つの野生型チロシン残基がチロシンリン酸化タンパク質と
基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼとの間の複合体の形成を可
能にするのに十分な条件下およびそのような時間にリン酸化されることのできな
いアミノ酸で置換されている基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファター
ゼ少なくとも１個を、チロシンリン酸化タンパク質少なくとも１個を含む試料と
合わせる工程；および、チロシンリン酸化タンパク質および基質捕捉性変異体プ
ロテインチロシンホスファターゼを有する複合体の存在または非存在を測定する
工程、ここで、複合体の存在がチロシンリン酸化タンパク質がその複合体形成相
手であるプロテインチロシンホスファターゼの基質であることを示す、を含む、
プロテインチロシンホスファターゼの基質であるチロシンリン酸化タンパク質を
同定するための方法を提供する。特定の実施態様において、基質捕捉性変異体は
ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰ−ＰＥＳＴ、ＰＴＰγ、ＭＫＰ−１、ＤＥＰ−１、ＰＴＰμ
、ＰＴＰＸ１、ＰＴＰＸ１０、ＳＨＰ２、ＰＴＰ−ＰＥＺ、ＰＴＰ−ＭＥＧ１、
ＬＣ−ＰＴＰ、ＴＣ−ＰＴＰ、ＣＤ４５、ＬＡＲまたはＰＴＰＨ１である変異体
プロテインチロシンホスファターゼを包含する。特定の実施態様において、試料
はチロシンリン酸化タンパク質を発現する細胞を含有し、そして別の特定のさら
なる実施態様において、該細胞は該基質をコードする核酸分子少なくとも１個で
トランスフェクションされている。他の特定の実施態様において少なくとも１個
の基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼは細胞により発現され、
そして別の更なる特定の実施態様においては細胞は該基質捕捉性変異体プロテイ
ンチロシンホスファターゼをコードする核酸分子少なくとも１つでトランスフェ
クションされている。特定の別の実施態様において、試料は（ｉ）プロテインチ
ロシンホスファターゼの基質であるチロシンリン酸化タンパク質および（ｉｉ）
少なくとも1 個の基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼを発現す
る細胞を含有する。特定の別の実施態様において、細胞は（ｉ）該基質をコード
する核酸少なくとも１個および（ｉｉ）基質捕捉性変異体プロテインチロシンホ
スファターゼをコードする核酸少なくとも１個でトランスフェクションされてい
る。特定の別の実施態様において、試料はチロシンリン酸化タンパク質を少なく
とも１個含有する細胞溶解物を含有し、そして特定の更なる実施態様において、
細胞溶解物はチロシンリン酸化タンパク質をコードする核酸少なくとも１個でト
ランスフェクションされた細胞から誘導される。特定の更に別の実施態様におい
て細胞溶解物はプロテインチロシンキナーゼをコードする核酸少なくとも１個で
トランスフェクションされた細胞から誘導される。さらに別の特定の実施態様に
おいて、基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼの少なくとも１個
が細胞溶解物内に存在し、そして特定の更なる実施態様において、細胞溶解物は
基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼをコードする核酸少なくと
も１個でトランスフェクションされた細胞から誘導される。別の実施態様におい
て、チロシンリン酸化タンパク質はＶＣＰ、ｐ１３０cas ，ＥＧＦ受容体、ｐ２
１０ ｂｃｒ：ａｂｌ，ＭＡＰキナーゼ、Ｓｈｃ（Ｔｉｇａｎｉｓら、１９９８
Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ. Ｂｉｏｌ．１８：１６２２−１６３）またはインスリ
ン受容体である。
【００１３】 別の局面において、本発明は、薬剤候補の非存在下および存在下、プロテイン
チロシンホスファターゼ、およびプロテインチロシンホスファターゼの基質であ
るチロシンリン酸化タンパク質を、基質の検出可能な脱リン酸化が起こるのに十
分な条件下およびそのような時間、接触させること（ここで、プロテインチロシ
ンホスファターゼの基質であるチロシンリン酸化タンパク質は、（１）（ｉ）野
生型プロテインチロシンホスファターゼ触媒ドメインの不変アスパラギン酸残基
が、酵素のＫｍは顕著な変化をもたらさないが１分あたり１未満までのＫｃａｔ
の減少をもたらすアミノ酸で置換され；かつ（ｉｉ）少なくとも１つの野生型チ
ロシン残基が、チロシンリン酸化タンパク質と基質捕捉性変異体プロテインチロ
シンホスファターゼとの間の複合体の形成を可能にするのに十分な条件下および
そのような時間にリン酸化されることのできないアミノ酸で置換されている基質
捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼ少なくとも１個を、チロシンリ
ン酸化タンパク質を少なくとも１個含む試料と合わせること；および（２）チロ
シンリン酸化タンパク質および基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファタ
ーゼを有する複合体の存在または非存在を測定すること、ここで、複合体の存在
はチロシンリン酸化タンパク質がその複合体形成相手であるプロテインチロシン
ホスファターゼの基質であることを示す、により同定される）；および薬剤の非
存在下の基質の脱リン酸化のレベルと薬剤の存在下の基質の脱リン酸化の程度を
比較すること（ここで、基質脱リン酸化のレベルの差は薬剤がプロテインチロシ
ンホスファターゼと基質との間の相互作用を変化させることを示す）を含む、プ
ロテインチロシンホスファターゼと、プロテインチロシンホスファターゼの基質
であるチロシンリン酸化タンパク質との間の相互作用を変化させる薬剤の同定方
法を提供する。
【００１４】 別の局面において本発明は、（ｉ）野生型プロテインチロシンホスファターゼ
触媒ドメインの不変アスパラギン酸残基が、酵素のＫｍは顕著な変化をもたらさ
ないが１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸で置換され；
かつ（ｉｉ）少なくとも１つの野生型チロシン残基が、リン酸化されることので
きないアミノ酸で置換されている突然変異されたプロテインチロシンホスファタ
ーゼを基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼが含む、候補薬剤の
非存在下および存在下、プロテインチロシンホスファターゼおよびプロテインチ
ロシンホスファターゼの基質であるチロシンリン酸化タンパク質を、チロシンリ
ン酸化タンパク質と基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼとの間
の複合体の形成を可能にするのに十分な条件下およびそのような時間接触させる
こと；および、薬剤の非存在下の複合体形成のレベルと薬剤の存在下の複合体形
成のレベルを比較すること（ここで、複合体形成のレベルの差は薬剤がプロテイ
ンチロシンホスファターゼと基質との間の相互作用を変化させることを示す）を
含む、プロテインチロシンホスファターゼとプロテインチロシンホスファターゼ
の基質であるチロシンリン酸化タンパク質との間の相互作用を変化させる薬剤の
同定方法を提供する。
【００１５】 別の局面において、本発明は（ｉ）野生型プロテインチロシンホスファターゼ
触媒ドメインの不変アスパラギン酸残基が、酵素のＫｍは顕著な変化をもたらさ
ないが１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸で置換され；
かつ（ｉｉ）少なくとも１つの野生型チロシン残基が、リン酸化されることので
きないアミノ酸で置換されている、プロテインチロシンホスファターゼの基質捕
捉性変異体を被験体に投与し、それにより基質捕捉性変異体プロテインチロシン
ホスファターゼのチロシンリン酸化タンパク質との相互作用がチロシンリン酸化
タンパク質の活性を低下させる、チロシンリン酸化タンパク質の活性を低下させ
る方法を提供する。特定の実施態様において、チロシンリン酸化タンパク質はＶ
ＣＰ、ｐ１３０cas ， ＥＧＦ受容体、ｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌ， ＭＡＰキ
ナーゼ、Ｓｈｃ（Ｔｉｇａｎｉｓら、１９９８ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ. Ｂｉｏ
ｌ．１８：１６２２−１６３４）またはインスリン受容体である。特定の別の実
施態様において、プロテインチロシンホスファターゼはＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰ−Ｐ
ＥＳＴ、ＰＴＰγ、ＭＫＰ−１、ＤＥＰ−１、ＰＴＰμ、ＰＴＰＸ１、ＰＴＰＸ
１０、ＳＨＰ２、ＰＴＰ−ＰＥＺ、ＰＴＰ−ＭＥＧ１、ＬＣ−ＰＴＰ、ＴＣ−Ｐ
ＴＰ、ＣＤ４５、ＬＡＲまたはＰＴＰＨ１である。
【００１６】 本発明の更に別の局面において、本発明は、（ｉ）野生型プロテインチロシン
ホスファターゼ触媒ドメインの不変アスパラギン酸残基が、酵素のＫｍは顕著な
変化をもたらさないが１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ
酸で置換され；かつ（ｉｉ）少なくとも１つの野生型チロシン残基がリン酸化さ
れることのできないアミノ酸で置換されているＰＴＰ−ＰＥＳＴの基質捕捉性変
異体を、ｐ１３０cas を発現することのできる哺乳類に投与し、それにより基質
捕捉性変異体がｐ１３０cas と相互作用を起こしてｐ１３０cas リン酸化に関わ
る癌遺伝子少なくとも１個の形質転換作用を低減することを含む、ｐ１３０cas リン酸化に関わる癌遺伝子少なくとも１個の形質転換作用を低減する方法を提供
する。特定の実施態様においては癌遺伝子はｖ−ｃｒｋ， ｖ−ｓｒｃまたはｃ
−Ｈａ−ｒａｓである。
【００１７】 別の局面において、本発明は、（ｉ）野生型プロテインチロシンホスファター
ゼ触媒ドメインの不変アスパラギン酸残基が、酵素のＫｍは顕著な変化をもたら
さないが１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸で置換され
；かつ（ｉｉ）少なくとも１つの野生型チロシン残基が、リン酸化されることの
できないアミノ酸で置換されているＰＴＰ−ＰＥＳＴの基質捕捉性変異体を、ｐ
１３０cas 発現可能な哺乳類に投与し、それにより基質捕捉性変異体がｐ１３０ cas と相互作用を起こしてｐ１３０cas に関わるシグナル伝達複合体の形成を低
減させることを含む、ｐ１３０cas に関わるシグナル伝達複合体の形成を低減す
る方法を提供する。
【００１８】 本発明は別の局面において、（ｉ）野生型プロテインチロシンホスファターゼ
触媒ドメインの不変アスパラギン酸残基が、酵素のＫｍは顕著な変化をもたらさ
ないが１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸で置換され；
かつ（ｉｉ）少なくとも１つの野生型チロシン残基がリン酸化されることのでき
ないアミノ酸で置換されているプロテインチロシンホスファターゼの基質捕捉性
変異体を哺乳類に投与することを含む、プロテインチロシンホスファターゼの投
与または過剰発現に関わる細胞毒性作用を低減する方法を提供する。
【００１９】 本発明の別の局面において、野生型プロテインチロシンホスファターゼ触媒ド
メインの不変アスパラギン酸残基が、酵素のＫｍは顕著な変化をもたらさないが
１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸で置換され；かつ、
少なくとも１つの野生型チロシン残基がリン酸化されることのできないアミノ酸
で置換されている基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼをコード
する単離された核酸分子を提供する。特定の実施態様において、本発明は上記し
た基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼをコードする核酸分子に
相補的な少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含有するアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを提供する。
【００２０】 本発明の別の局面は、野生型プロテインチロシンホスファターゼ触媒ドメイン
の不変アスパラギン酸残基が、酵素のＫｍは顕著な変化をもたらさないが１分あ
たり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸で置換され；かつ、少なく
とも１つの野生型チロシン残基がリン酸化されることのできないアミノ酸で置換
されている基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼに融合したポリ
ペプチド配列を含有する融合タンパク質を提供することである。特定の実施態様
において、該ポリペプチドは酵素またはその変種またはフラグメントである。一
部の実施態様において、基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼに
融合するポリペプチド配列はプロテアーゼにより開裂可能である。特定の別の実
施態様において、ポリペプチド配列はリガンドに対する親和性を有するアフィニ
ティータグポリペプチドである。
【００２１】 更に別の局面において、本発明は野生型プロテインチロシンホスファターゼ触
媒ドメインの不変アスパラギン酸残基が、酵素のＫｍは顕著な変化をもたらさな
いが１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸で置換され；か
つ、少なくとも１つの野生型チロシン残基がリン酸化されることのできないアミ
ノ酸で置換されている基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼをコ
ードする核酸に作動可能に連結したプロモーター少なくとも１個を含有する組み
換え発現構築物を提供する。特定の実施態様において、該プロモーターは調節プ
ロモーターであり、そして特定のさらなる実施態様においては基質捕捉性変異体
プロテインチロシンホスファターゼは第２の核酸配列のポリペプチド産物との融
合タンパク質として発現される。特定のさらなる実施態様において、第２の核酸
配列のポリペプチド産物は酵素である。特定の別の実施態様において、発現構築
物は組み換えウィルス発現構築物である。特定の別の実施態様において本発明は
上記した組み換え発現構築物を含有する宿主細胞を提供する。特定の実施態様に
おいて該宿主細胞は原核細胞であり、そして、特定の実施態様においては該宿主
細胞は真核細胞である。
【００２２】 本発明は別の局面において、野生型プロテインチロシンホスファターゼ触媒ド
メインの不変アスパラギン酸残基が、酵素のＫｍは顕著な変化をもたらさないが
１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸で置換され；かつ、
少なくとも１つの野生型チロシン残基がリン酸化されることのできないアミノ酸
で置換されている基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼをコード
する核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター少なくとも１個を含有する組
み換え発現構築物を含有する宿主細胞を培養することを含む、組み換え基質捕捉
性変異体プロテインチロシンホスファターゼを生成する方法を提供する。特定の
実施態様においてプロモーターは調節プロモーターである。特定の別の実施態様
において、本発明は組み換え基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファター
ゼを生成する方法を提供し、該方法は上記した組み換えウィルス発現構築物に感
染した宿主細胞を培養することを含む。
【００２３】 本発明は別の局面において、製薬上許容しうる担体または希釈剤と共に、野生
型プロテインチロシンホスファターゼ触媒ドメインの不変アスパラギン酸残基が
、酵素のＫｍは顕著な変化をもたらさないが１分あたり１未満までのＫｃａｔの
減少をもたらすアミノ酸で置換され；かつ、少なくとも１つの野生型チロシン残
基がリン酸化されることのできないアミノ酸で置換されている基質捕捉性変異体
プロテインチロシンホスファターゼを含有する医薬組成物を提供する。
【００２４】 更に別の局面において、本発明は製薬上許容しうる担体または希釈剤と共に、
野生型プロテインチロシンホスファターゼ触媒ドメインの不変アスパラギン酸残
基が、酵素のＫｍは顕著な変化をもたらさないが１分あたり１未満までのＫｃａ
ｔの減少をもたらすアミノ酸で置換され；かつ、少なくとも１つの野生型チロシ
ン残基がリン酸化されることのできないアミノ酸で置換されている基質捕捉性変
異体プロテインチロシンホスファターゼと相互作用を示す薬剤を含有する医薬組
成物を提供する。特定の別の実施態様において、本発明は（ｉ）野生型プロテイ
ンチロシンホスファターゼ触媒ドメインの不変アスパラギン酸残基が、酵素のＫ
ｍは顕著な変化をもたらさないが１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少をもた
らすアミノ酸で置換され；かつ（ｉｉ）少なくとも１つの野生型チロシン残基が
リン酸化されることのできないアミノ酸で置換されている基質捕捉性変異体プロ
テインチロシンホスファターゼ少なくとも１個；および、プロテインチロシンホ
スファターゼとチロシンリン酸化タンパク質との複合体の存在または非存在を検
出する際に用いるのに適する補助試薬を含む、プロテインチロシンホスファター
ゼのチロシンリン酸化タンパク質基質を同定するためのキットを提供する。
【００２５】 本発明のこれらおよび他の局面は以下の詳細な説明および添付する図面を参照
することにより明らかになる。本明細書に開示する全ての参考文献（ウェブサイ
トを含む）は、参照により、各々が個々に組み込まれたかのようにそのまま組み
込まれる。
【００２６】 発明の詳細な説明 本発明は、ＰＴＰ触媒ドメインの不変のアスパラギン酸残基が、酵素のミカエ
リス−メンテン定数（Ｋｍ）の顕著な変化をもたらさないが、触媒速度定数（Ｋ
ｃａｔ）の低下をもたらすアミノ酸で置換されるように突然変異させ、さらに少
なくとも１個のチロシン残基を、リン酸化され得ないアミノ酸で置換することに
よって突然変異させたＰＴＰから誘導される新規基質捕捉性変異体プロテインチ
ロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）を対象とする。本発明は、一部、ある種のｉｎ
ｖｉｖｏ条件下でＰＴＰ酵素自体が、ＰＴＰと、ＰＴＰ基質を含めた他の分子
間での相互作用を変化させうるような様式でチロシンリン酸化を被ることがある
という予想外の所見に基づく。本明細書で定義するように、ホスファターゼは、
［Ｉ／Ｖ］ＨＣＸＡＧＸＸＲ［Ｓ／Ｔ］Ｇ（配列番号：３６）のシグナチャーモ
チーフを含む場合、ＰＴＰファミリーの成員である。二元(dual)特異性ＰＴＰ、
すなわちリン酸化チロシンとリン酸化セリン又はトレオニンの両方を脱リン酸化
するＰＴＰも、本発明における使用に適する。適切なＰＴＰは、ＰＴＰ１Ｂ、Ｐ
ＴＰ−ＰＥＳＴ、ＰＴＰγ、ＭＫＰ−１、ＤＥＰ−１、ＰＴＰμ、ＰＴＰＸ１、
ＰＴＰＸ１０、ＳＨＰ２、ＰＴＰ−ＰＥＺ、ＰＴＰ−ＭＥＧ１、ＬＣ−ＰＴＰ、
ＴＣ−ＰＴＰ、ＣＤ４５、ＬＡＲ及びＰＴＰＨ１を含むが、これらに限定されな
い。
【００２７】 上述したように、基質捕捉性変異体ＰＴＰは、野生型プロテインチロシンホス
ファターゼの触媒ドメインの不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な
変化をもたらさないが、１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミ
ノ酸で置換し、さらに少なくとも１個の野生型チロシン残基が、リン酸化され得
ないアミノ酸で置換されるように突然変異させた野生型ＰＴＰから誘導される。
これに関して、既知のＰＴＰのアミノ酸配列解析は、ＰＴＰファミリーの成員に
おいて不変である触媒ドメインのアスパラギン酸残基を含めて、ＰＴＰ一次構造
内に２７個の不変残基が存在することを明らかにしている（Ｂａｒｆｏｒｄら、
１９９４ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：１３９７−１４０４；Ｊｉａら、１９９５
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７５４−１７５８）。多数のＰＴＰファミリーの
成員のアミノ酸配列を整列したとき（例えば図１Ａ−Ｅ参照；また例えばＢａｒ
ｆｏｒｄら、１９９５ Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：１０４３
参照）、この不変のアスパラギン酸残基は、すべてのＰＴＰ間で不変である、Ｐ
ＴＰシグナチャー配列モチーフ、［Ｉ／Ｖ］ＨＣＸＡＧＸＸＲ［Ｓ／Ｔ］Ｇ（配
列番号：３６）に対して対応する位置に、各々のＰＴＰ配列の触媒ドメイン領域
において容易に同定できる（例えば、ＷＯ９８／０４７１２号；Ｆｌｉｎｔら、
１９９７ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１６８０及びその中で
引用されている参考文献参照）。しかし、触媒ドメインの不変のアスパラギン酸
残基の正確なアミノ酸配列位置番号は、様々なＰＴＰ配列の整列を最大化するこ
とを課すと考えられる配列シフトにより、ＰＴＰごとに異なると考えられる（種
々のＰＴＰ配列の整列については、例えばＢａｒｆｏｒｄら、１９９５ Ｎａｔ
ｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：１０４３参照）。
【００２８】 特に、２個のＰＴＰポリペプチド配列の部分は、アミノ酸の位置番号に従って
１個のＰＴＰ配列を番号付けし、次いで比較する配列を適合するアミノ酸又は保
存された残基であるアミノ酸、例えば各々の位置で極性（例えばＤ、Ｅ、Ｋ、Ｒ
、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）、疎水性（例えばＡ、Ｐ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
）又は中性（例えばＣ、Ｇ）の残基のままであるアミノ酸の数を最大にするよう
に整列するという慣例に基づき、「対応する」アミノ酸配列、領域、断片等とみ
なされる。同様に、本明細書で提供するように突然変異を起こさせる候補ＰＴＰ
をコードするＤＮＡ配列、又は部分、領域、断片等は、既知の野生型ＰＴＰのＤ
ＮＡ配列において核酸配列の位置を番号付けるための慣例に従って、既知の野生
型ＰＴＰをコードするＤＮＡ配列に対応させることができ、それによって、配列
の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドの所与の配列において少なくとも７
０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％のヌクレ
オチドが同一であるように候補ＰＴＰのＤＮＡ配列を既知のＰＴＰ ＤＮＡと整
列する。特定の好ましい実施態様では、候補ＰＴＰのＤＮＡ配列は、対応する既
知のＰＴＰ ＤＮＡ配列と９５％以上(greater than) 同一である。特定の特に
好ましい実施態様では、候補ＰＴＰのＤＮＡ配列の部分、領域又は断片は、対応
する既知のＰＴＰ ＤＮＡ配列と同一である。当該技術において周知であるよう
に、そのＤＮＡが、所与の形質の原因となる特定遺伝子において不規則性（例え
ば共通形態又は支配的形態）を含まない個人は、その遺伝子に関して野生型の遺
伝的相補体（遺伝子型）を有すると言われることがあるが、該遺伝子のＤＮＡに
おける突然変異として知られる不規則性、例えば１個又はそれ以上のヌクレオチ
ドの置換、挿入又は欠失の存在は、突然変異を起こした又は変異体の遺伝子型を
示す。
【００２９】 上述したように、本発明の一部の実施態様では、触媒ドメインの不変アスパラ
ギン酸及び少なくとも１個のチロシン残基が本明細書で提供するように置換され
ている基質捕捉性変異体ＰＴＰが提供される。Ｂａｒｆｏｒｄら（１９９５）の
中で開示されているもの以外のＰＴＰ配列における触媒ドメイン不変のアスパラ
ギン酸残基の同定は、ＧＥＮＥＷＯＲＫＳ、Ａｌｉｇｎ又はＮＣＢＩウエブサイ
ト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉ
ｎ／ＢＬＡＳＴ）で入手できる、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ．
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５，１９９１：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ
とＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：
１０９１５−１０９１９，１９９２）のような当業者に周知のコンピュータアル
ゴリズムを用いて配列を比較することによって実施しうる。
【００３０】 本発明の特定実施態様は、一部、不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの
顕著な変化をもたらさないが、１分あたり１未満（１min -1未満）までのＫｃａ
ｔの減少をもたらすアミノ酸で置換されている新規ＰＴＰに関する。これらのＰ
ＴＰは、それらのチロシンリン酸化基質と複合体を形成する又はチロシンリン酸
化基質に結合する能力を保持しているが、触媒作用は減衰している（すなわち、
基質捕捉性変異体ＰＴＰは対応する野生型ＰＴＰと同様のＫｍを保持するが、１
分あたり１未満のＫｃａｔと比較した野生型酵素の活性に依存して、野生型酵素
に対して少なくとも１０2 −１０5 倍低下したＶｍａｘを有している）。この減
衰は、野生型ＰＴＰに比べて低下した又は消失した触媒活性を包含する。例えば
、不変のアスパラギン酸残基を、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、
プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、グリシン、セリン
、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、リシン、ア
ルギニン又はヒスチジンに変化させる又は突然変異させることができる。
【００３１】 不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化をもたらさないが、１
分あたり１未満（１min -1未満）までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸で置
換され、かつ少なくとも１個のチロシン残基が、リン酸化され得ないアミノ酸で
置換されている、本明細書で述べる好ましい基質捕捉性変異体ＰＴＰは、さらに
他の突然変異を含みうる。特に好ましい実施態様では、そのような付加的な突然
変異は、ＰＴＰ／基質複合体を安定化するのを助ける置換、挿入又は欠失（最も
好ましくは置換）に関するものである。例えば、シグナチャーモチーフ内のセリ
ン／トレオニン残基のアラニン残基への突然変異（Ｓ／Ｔ→Ａ変異体）は、ＰＴ
Ｐが仲介する基質脱リン酸化反応の律速段階を変化させうる。未修飾ＰＴＰの場
合には、遷移状態の形成が律速となりうるが、Ｓ／Ｔ→Ａ変異体の場合には、遷
移状態の崩壊が律速となり、それによってＰＴＰ／基質複合体を安定化させるこ
とができる。そのような突然変異を、本明細書で提供するような、ＰＴＰ触媒ド
メインの不変のアスパラギン酸残基の置換及びＰＴＰチロシンの置換と、例えば
ＰＴＰ−基質複合体を安定化し、その単離を容易にするために有益に組み合わせ
ることができる。もう１つの例として、本明細書で提供するようにリン酸化する
ことができる、野生型ＰＴＰに存在する任意の１個又はそれ以上の他のアミノ酸
（例えばセリン、トレオニン、チロシン）を、リン酸化され得ないアミノ酸で置
換することは、ＰＴＰ−基質複合体の安定性の見地から望ましいと考えられる。
【００３２】 上述したように、本発明は、触媒ドメインの不変アスパラギン酸及び少なくと
も１個のチロシン残基が置換されており、かかるチロシンが、リン酸化すること
のできないアミノ酸で置換されている、基質捕捉性変異体ＰＴＰを提供する。リ
ン酸化され得ないアミノ酸は、好ましい実施態様では、アラニン、システイン、
アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒ
スチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロ
リン、アルギニン、バリン又はトリプトファンでありうる。チロシンの置換が望
ましいことは、ｉｎ ｖｉｖｏでの特定条件下で、ＰＴＰ酵素自体が、ＰＴＰと
、ＰＴＰ基質を含めた他の分子間の相互作用を変化させうるようにチロシンリン
酸化を被るという意外な所見から導かれる。ＰＴＰ基質は、本明細書で提供され
るようなＰＴＰに特異的に結合しうる及び／又はＰＴＰによって脱リン酸化され
うる、どのような天然又は非天然のチロシンがリン酸化されたペプチド、ポリペ
プチド又は蛋白質も包含する。従って、特定のＰＴＰの野生型アミノ酸配列にお
いて認められるチロシン残基を、本明細書で提供されるような別のアミノ酸で置
換すると、存在する複合体の量及び／又は基質に対する変異体ＰＴＰの親和性が
増大すると、チロシン残基が置換されていないＰＴＰを使用した複合体形成と比
べて、本発明の基質捕捉性変異体ＰＴＰとＰＴＰ基質によって形成される複合体
が安定化される。
【００３３】 上述したように、本発明は、野生型ＰＴＰの基質であるチロシンリン酸化蛋白
質を同定する方法を提供するために、本明細書で述べる基質捕捉性変異体ＰＴＰ
を利用する。本発明のこの局面に従えば、少なくとも１個のチロシンリン酸化蛋
白質を含むサンプルを、本明細書で提供されるような少なくとも１個の基質捕捉
性変異体ＰＴＰと組み合わせて、基質と変異体ＰＴＰを含む複合体の有無を調べ
る。ＰＴＰとＰＴＰ基質間での結合相互作用は複合体の形成をもたらし、これは
ＰＴＰとＰＴＰ基質間の親和相互作用を指す。複合体はシグナル伝達複合体を含
みうるが、これは、その形成、安定な結合及び／又は解離によって直接又は間接
的に生物学的シグナルを与えるあらゆる複合体を指す。そのようなシグナルは、
例えば、限定ではなく例示として、分子結合、分子構造の共有結合性又は非共有
結合性修飾、遺伝子発現、遺伝子組換え、遺伝子組込み、核酸合成又は非細胞粒
子構築を導く細胞内及び／又は細胞間事象を含み、またエンドサイトーシス、食
作用、核溶解、蛋白分解、脂肪分解、加水分解、触媒、又は他の調節事象を含み
うる。
【００３４】 ＰＴＰとＰＴＰ基質間での安定な複合体の存在の測定は、本開示に従ってＰＴ
ＰとＰＴＰ基質間での分子間相互作用を明らかにするための、当該技術において
既知の何らかの方法論の使用を指す。そのような方法論は、限定ではなく例示と
して、共精製、共沈、共免疫沈降、放射又は蛍光アッセイ、ウエスタン免疫ブロ
ット分析、固相リガンド−カウンターリガンドソルベント(solid-phase ligand-
counterligand sorbent)手法、アフィニティークロマトグラフィー及び表面アフ
ィニティープラスモン共鳴のようなアフィニティー手法を含む親和捕捉等を含み
うる。これらやその他の有用なアフィニティー手法に関して、アフィニティー手
法を含めた、複合体を単離し、特性付けるための手法の詳細については、例えば
、その全体が参照によりここに組み込まれる、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．，「蛋白
精製：原理と実際（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉ
ｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、１９８７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅ
ｒｌａｇ，ＮＹ；Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．「実験的免疫学ハンドブック（Ｈａｎｄｂ
ｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、１９８
６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ；及びＨｅｒｍ
ａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．ら、「固定化アフィニティーリガンド手法（Ｉｍｍｏｂｉ
ｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、１
９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ参照
。ＰＴＰが、約１０4 Ｍ-1に等しいか又はそれ以上の、好ましくは約１０5 Ｍ-1 に等しいか又はそれ以上の、より好まし約１０6 Ｍ-1に等しいか又はそれ以上の
、さらに一層好ましくは約１０7 Ｍ-1〜１０9 Ｍ-1に等しいか又はそれ以上のＫ
ａを有する基質と結合する場合、ＰＴＰは特異的結合を介してＰＴＰ基質と相互
作用しうる。ＰＴＰとＰＴＰ基質のような結合パートナーの親和性は、従来の手
法、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：
６６０（１９４９）が述べたような手法を用いて容易に測定できる。
【００３５】 理論に縛られるのは望むところではないが、ＰＴＰ分子自体の一部であるリン
酸化チロシン残基は、ＰＴＰ分子と、ＰＴＰが結合及び／又は脱リン酸化しうる
チロシンリン酸化蛋白質を含むＰＴＰ基質分子間の相互作用に影響を及ぼしうる
と考えられる。この非制限的な理論に従えば、ＰＴＰの一次構造中に存在する保
存されたチロシン残基は、ＰＴＰ触媒ドメインの活性部位に位置するシグナチャ
ーモチーフ（上述したような）において認められる不変システイン残基と、ＰＴ
Ｐ基質リン酸化蛋白上にホスホチロシンの形態で存在するリン酸基の間で形成さ
れうる高度に反応性のチオリン酸中間体からリン酸基を転移するためのレセプタ
であると考えられる。従って、ＰＴＰ活性部位の保存されたチロシン残基は、基
質ホスホチロシンとの疎水性相互作用を与えることにより、その基質に対するＰ
ＴＰの分子間配向を促進し、さらにリン酸アクセプタとして働くと考えられるが
、本発明はそのように限定されない。
【００３６】 上述したように、本発明は、少なくとも１個のチロシン残基が、リン酸化され
得ないアミノ酸で置換された変異体ＰＴＰを提供する。好ましくはチロシン残基
はＰＴＰ触媒ドメインに位置し、かかるドメインは、先に述べたように種々のＰ
ＴＰ間で高度に保存された約２５０アミノ酸の領域を指す（例えばＢａｒｆｏｒ
ｄ，１９９８ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ
．２７：１３３；Ｊｉａ，１９９７ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７
５：１７；Ｖａｎ Ｖｅｃｔｏｒら、１９９８ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅ
ｔ．Ｄｅｖｅｌ．８：１１２も参照のこと）。より好ましくは、チロシン残基は
ＰＴＰ活性部位に位置し、かかる部位は、ＰＴＰシグナチャーモチーフを含み、
且つ基質結合と脱リン酸化のためのＰＴＰ結合部位ポケット又は「クレイドル
（揺り篭）」を形成するアミノ酸を含み、さらに不変アスパラギン酸含有ループ
（存在する場合）及び基質の認識と触媒作用に寄与する隣接のペプチドバックボ
ーン配列（例えばＪｉａ，１９９７参照）を含む、ＰＴＰ触媒ドメイン内の領域
を指す。最も好ましい実施態様では、チロシン残基はフェニルアラニンで置換さ
れており、別の最も好ましい実施態様では、チロシン残基は、ヒトＰＴＰＨ１の
アミノ酸配列の６７６位に位置するチロシンに対応し、同時に図１に示すＰＴＰ
−１Ｂ配列の４６位のアミノ酸残基に対応する保存された残基である。他の好ま
しい実施態様では、チロシン残基は、シグナチャーモチーフの位置に対して２個
又はそれ以上のＰＴＰアミノ酸配列内の対応する位置に存在するチロシン残基を
含む、ＰＴＰ保存残基である。他の好ましい実施態様では、チロシン残基は、本
明細書で提供するような、ＰＴＰと少なくとも１個の基質分子によって形成され
る複合体を安定化するアミノ酸で置換されている。
【００３７】 上述したように、本発明に従って有用と考えられるＰＴＰは、触媒ドメイン内
の対応する位置の不変のアスパラギン酸残基と１個のチロシン残基を有するあら
ゆるＰＴＰを含む。限定ではなく例示として、本発明の一部の好ましい実施態様
では、基質捕捉性変異体ＰＴＰは、フェニルアラニンで置換された対応する野生
型配列内に認められる少なくとも１個のチロシン残基を持つ。一部の特に好まし
い実施態様では、ＰＴＰは、アラニンで置換された不変アスパラギン酸とフェニ
ルアラニンで置換された６７６位のチロシンを持つＰＴＰＨ１、ＰＴＰＨ１（Ｙ
６７６Ｆ／Ｄ８１１Ａ）である。一部の他の実施態様では、ＰＴＰは、対応する
野生型配列内で認められるシステインがセリンで置換され、少なくとも１個の野
生型チロシン残基が、リン酸化できないアミノ酸で置換されている、変異体ＰＴ
Ｐ−ＰＥＳＴホスファターゼである。しかし、本明細書で特定して述べるもの以
外の変異体ＰＴＰも、ＰＴＰ触媒ドメインのアミノ酸配列を、本明細書で述べる
ＰＴＰのアミノ酸配列（引用する参考文献で提供されるものを含む）と共に整列
し、触媒ドメインの不変のアスパラギン酸残基と少なくとも１個のチロシン残基
を同定して、さらにこれらの残基を、例えばＰＴＰをコードするＤＮＡの部位指
定突然変異誘発によって変化させることにより、容易に作製できることを認識し
ておかねばならない。
【００３８】 ＤＮＡの修飾は、ＰＴＰをコードするＤＮＡの部位特異的又は部位指定突然変
異誘発及びオーバーラップ伸長によるＰＣＲスプライシング（ＳＯＥ）のような
、ＤＮＡ鋳型に改変を導入し、増幅するプライマーを使用するＤＮＡ増幅法を含
めて、様々な方法によって実施しうる。部位指定突然変異誘発は、典型的には、
周知であり、市販のものが入手できるＭ１３ファージベクターのような、一本鎖
及び二本鎖形態を持つファージベクターを使用して実施される。一本鎖ファージ
の複製起点を含む他の適当なベクターも使用しうる（例えばＶｅｉｒａら、Ｍｅ
ｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５：３，１９８７参照）。一般に部位指定突然変異誘
発は、対象とする蛋白質（例えばＰＴＰファミリーの成員）をコードする一本鎖
ベクターを調製することによって実施される。一本鎖ベクター中のＤＮＡに相同
な領域内に所望する突然変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーをベクターに
アニーリングして、次に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノ
ー断片）のようなＤＮＡポリメラーゼを付加する。かかるＤＮＡポリメラーゼは
、二本鎖領域を、１本の鎖が改変された配列をコードし、他の鎖がもとの配列を
コードするヘテロ二本鎖を作製するためのプライマーとして使用する。部位指定
突然変異誘発に関するさらなる開示は、例えばＫｕｎｋｅｌら（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７，１９８７）；及び米国特許第４，５
１８，５８４号及び同第４，７３７，４６２号において認められる。ヘテロ二本
鎖を適切な細菌細胞に導入し、所望する突然変異を含むクローンを選択する。生
じた改変ＤＮＡ分子は、組換え手法により適切な宿主細胞において、修飾された
蛋白質を産生するように発現されうる。
【００３９】 部位指定突然変異の導入を通しての個々のアミノ酸の特異的置換は周知であり
、当業者が精通する方法論に従って実施しうる。生じる変異体ＰＴＰの触媒活性
への作用は、本明細書で提供されたように、またこれまでに開示されているよう
に（例えばＷＯ９８／０４７１２号；Ｆｌｉｎｔら、１９９７ Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１６８０）、単に生じた修飾蛋白質をＫｍの保存
とＫｃａｔの１分あたり１未満への減少に関して試験することにより、経験的に
決定することができる。生じた変異体ＰＴＰ分子をチロシンリン酸化する能力へ
の作用も、やはり本明細書で提供するように、例えばＰＴＫアクセプタとして働
きうるｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ条件に変異体を曝露させたあと、単
にそのような変異体をホスホチロシンの存在に関して試験することにより、経験
的に決定することができる。
【００４０】 下記に述べるＰＴＰ変異体の特定例は、ＤＡ（アスパラギン酸からアラニンへ
）変異体、ＹＦ（チロシンからフェニルアラニンへ）変異体、ＣＳ変異体及びそ
れらの組合せであるが、本発明の基質捕捉性変異体ＰＴＰがこれらのアミノ酸置
換に限定されないことは明白であろう。不変のアスパラギン酸残基は、例えば部
位指定突然変異誘発によって、酵素のＫｍの顕著な変化をもたらさないが、１分
あたり１未満（１min -1未満）までのＫｃａｔの減少をもたらすどのようなアミ
ノ酸にも変化させることができる。例えば、不変のアスパラギン酸残基を、アラ
ニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプ
トファン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン
、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン又はヒスチジン、あるいは誘
導体、変異体等を含めて当該技術において既知の他の天然又は非天然アミノ酸に
変化させる又は突然変異させることができる。同様に、少なくとも１個のチロシ
ン残基の置換は、リン酸化され得ない（すなわち、リン酸基によるアミノ酸側鎖
のヒドロキシルの安定な共有結合性修飾）任意のアミノ酸、例えばアラニン、シ
ステイン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グ
リシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラ
ギン、プロリン、アルギニン、バリン又はトリプトファン、あるいは誘導体、変
異体等を含めて当該技術において既知の他の天然又は非天然アミノ酸によって実
施しうる。
【００４１】 本発明の核酸はＲＮＡの形態又はＤＮＡの形態をとりうるが、かかるＤＮＡは
ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは二本鎖又は一本鎖で
ありうるが、一本鎖である場合には、コード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖
でありうる。野生型プロテインチロシンホスファターゼ触媒ドメインの不変のア
スパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化をもたらさないが、１分あたり１
未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸で置換されており、さらに少なく
とも１個の野生型チロシン残基が、リン酸化され得ないアミノ酸で置換されてい
る、基質捕捉性変異体ＰＴＰをコードする核酸分子は、上述したように任意の所
与のＰＴＰについての当該技術で既知のコード配列と同一であるか、若しくは、
同じＰＴＰをコードするが、遺伝コードの重複又は縮重の結果として異なるコー
ド配列でありうる。
【００４２】 本発明はさらに、基質捕捉性変異体ＰＴＰのような突然変異を生じたＰＴＰを
含めて、ＰＴＰポリペプチドの断片、類似体及び誘導体をコードする、本明細書
で述べる核酸の変異体に関する。ＰＴＰをコードする核酸の変異体は、核酸の天
然に生じる対立遺伝子変異体又は非天然に生じる変異体でありうる。当該技術に
おいて既知であるように、対立遺伝子変異体は、そのいずれもがコードされるＰ
ＴＰポリペプチドの機能を顕著に変化させない、１個又はそれ以上のヌクレオチ
ドの置換、欠失又は付加のうちの少なくとも１つを有しうる、核酸配列の代替的
形態である。
【００４３】 アミノ酸残基又は配列の様々な付加又は置換、あるいは生物学的活性に必要でな
い末端又は内部残基又は配列の欠失をコードする均等のＤＮＡ構築物も、本発明
に包含される。例えば、生物学的活性に必須でないＣｙｓ残基をコードする配列
を、Ｃｙｓ残基を欠失させる又は他のアミノ酸で置換して、再生の際に誤った分
子内ジスルフィド架橋が形成されるのを防ぐように改変させることができる。他
の均等物は、隣接する二塩基性アミノ酸残基を、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存
在する酵母系での発現を増強するように修飾することによって調製できる。ＥＰ
２１２，９１４号は、蛋白質中のＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を不活
性化するために部位特異的突然変異誘発を使用することを開示している。ＫＥＸ
２プロテアーゼプロセシング部位は、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、及びＬ
ｙｓ−Ａｒｇの対を、これらの隣接塩基性残基の発生を排除するように改変する
ために残基を欠失、付加又は置換することによって不活性化される。Ｌｙｓ−Ｌ
ｙｓの対合はかなりＫＥＸ２の切断を受けにくく、Ａｒｇ−Ｌｙｓ又はＬｙｓ−
ＡｒｇからＬｙｓ−Ｌｙｓへの変換が、ＫＥＸ２部位を不活性化するための伝統
的で好ましいアプローチである。
【００４４】 本発明はさらに、基質捕捉性変異体ＰＴＰを含めたＰＴＰポリペプチド、特に
ＰＴＰ発現構築物を含む宿主細胞を培養することによって組換えＰＴＰポリペプ
チドを生成するための方法、及び単離された組換えＰＴＰポリペプチドに関する
。本発明のポリペプチドと核酸は、好ましくは単離された形態で提供され、一部
の好ましい実施態様では、均一に精製される。基質捕捉性変異体ＰＴＰを含めて
、ＰＴＰポリペプチド又は融合蛋白質に言及するとき、「断片」、「誘導体」及
び「類似体」の語は、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能又は
活性を保持する任意のＰＴＰポリペプチド又は融合蛋白質を指す。従って、類似
体は、プロ蛋白部分の切断によって活性ＰＴＰポリペプチドを産生するように活
性化されうるプロ蛋白を含む。本発明のポリペプチドは組換えポリペプチド又は
合成ポリペプチドでありうるが、好ましくは組換えポリペプチドである。
【００４５】 基質捕捉性変異体ＰＴＰを含めて、ＰＴＰポリペプチド又は融合蛋白質の断片
、誘導体又は類似体は、（ｉ）１個又はそれ以上のアミノ酸残基が、保存された
又は保存されないアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）で置換さ
れており、そのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによってコードされるもの
であるか又はそうではないもの、あるいは（ｉｉ）１個又はそれ以上のアミノ酸
残基が置換基を含むもの、あるいは（ｉｉｉ）ＰＴＰポリペプチドが、当該ポリ
ペプチドの半減期を延長させる化合物（例えばポリエチレングリコール）のよう
な、別の化合物と融合しているもの、あるいは（ｉｖ）ＰＴＰポリペプチド又は
プロ蛋白配列の精製のために用いるアミノ酸を含めて、付加的なアミノ酸がＰＴ
Ｐポリペプチドに融合されているものでありうる。そのような断片、誘導体及び
類似体は、本文中の教示から当業者の技術範囲内であるとみなされる。
【００４６】 本発明のポリペプチドは、当該技術分野において既知のＰＴＰ配列と同一であ
るか又は類似するアミノ酸配列を持つＰＴＰポリペプチドおよび融合蛋白質を含
む。例えば、限定ではなく例示として、実施例において下記に言及するヒトＰＴ
Ｐポリペプチド（基質捕捉性変異体ＰＴＰを含めて）は、本明細書で引用する参
考文献及び実施例の中で述べるポリペプチド及びそのようなポリペプチドの部分
（ＰＴＰポリペプチドのそのような部分が一般に少なくとも３０個のアミノ酸、
より好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含む）と少なくとも７０％の類似
性（好ましくは７０％の同一性）、より好ましくは９０％の類似性（より好まし
くは９０％の同一性）、そしてさらに一層好ましくは９５％の類似性（さらに一
層好ましくは９５％の同一性）を持ち、本発明に従った使用のために考慮される
。
【００４７】 当該技術分野において既知であるように、２個のポリペプチド間の「類似性」
は、当該ポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換基を第二
のポリペプチドの配列と比較することによって（例えば上述したようなＧＥＮＥ
ＷＯＲＫＳ、Ａｌｉｇｎ又はＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて）決定される。本
発明のポリペプチドの断片又は部分は、ペプチド合成によって対応する完全長ポ
リペプチドを生成するために使用しうる：それ故、かかる断片は完全長ポリペプ
チドを生成するための中間体として使用できる。本発明の核酸の断片又は部分は
、本発明の完全長核酸を合成するために使用しうる。
【００４８】 「単離された」の語は、物質がそのもとの環境（例えば物質が天然に生じる場
合には自然環境）から取り出されることを意味する。例えば、生体動物中に存在
する天然に生じる核酸又はポリペプチドは単離されていないが、自然系において
共存する一部又は全部の物質から切り離された同じ核酸又はポリペプチドは単離
されている。そのような核酸はベクターの一部でありうる及び／又はそのような
核酸又はポリペプチドは組成物の一部でありうるが、そのようなベクター又は組
成物は核酸又はポリペプチドにとっての自然環境の一部ではないので、やはり単
離されている。「遺伝子」の語は、ポリペプチド鎖の生成に関わるＤＮＡのセグ
メントを意味する；これは、コード領域の前後の「リーダー及びトレーラー」領
域並びに個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を
含む。
【００４９】 本明細書で述べるように、本発明は、野生型プロテインチロシンホスファター
ゼ触媒ドメインの不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化をもた
らさないが、１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸で置換
されており、さらに少なくとも１個の野生型プロテインチロシンホスファターゼ
チロシン残基が、リン酸化され得ないアミノ酸で置換されている、基質捕捉性変
異体ＰＴＰに融合されたポリペプチドを含む融合蛋白質を提供する。そのような
ＰＴＰ融合蛋白質は、例えば、限定ではなく例示として、ＰＴＰ融合蛋白質の検
出、分離及び／又は精製を可能にする付加的な機能的又は非機能的ポリペプチド
配列に融合されたＰＴＰポリペプチド配列の発現を提供するために、フレーム内
で付加的コード配列に融合された基質捕捉性変異体ＰＴＰコード配列を有する核
酸によってコードされる。そのようなＰＴＰ融合蛋白質は、蛋白−蛋白親和性、
金属親和性又は電荷親和性に基づくポリペプチド精製によって、あるいはＰＴＰ
ポリペプチドが融合蛋白質から分離されうるようにプロテアーゼによって切断さ
れうる融合配列を含む融合蛋白質の特異的プロテアーゼ切断によって、ＰＴＰ融
合蛋白質の検出、単離及び／又は精製を可能にしうる。
【００５０】 それ故、ＰＴＰ融合蛋白質は親和性標識ポリペプチド配列を含むことができ、
これは、リガンドとの特異的親和相互作用を通してのＰＴＰの検出と単離を容易
にするためにＰＴＰに付加するポリペプチド又はペプチドを指す。リガンドは、
親和性標識が本明細書で提供するような特異的結合相互作用を通して相互作用し
うる任意の分子、レセプタ、カウンターレセプタ、抗体等でありうる。そのよう
なペプチドは、例えば、米国特許第５，０１１，９１２号及びＨｏｐｐら（１９
８８ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４）に述べられているポリ−
Ｈｉｓ又は抗原同定ペプチド、あるいはＸＰＲＥＳＳTMエピトープ標識（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む。親和性配列は、例えば、細
菌宿主の場合にはマーカに融合した成熟ポリペプチドの精製を行うための、ｐＢ
ＡＤ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はｐＱＥ−９ベクターによって供給さ
れるようなヘキサヒスチジン標識であるか、又は例えば、親和性配列は、哺乳類
宿主、例えばＣＯＳ−７細胞を使用するときには赤血球凝集素（ＨＡ）標識であ
りうる。ＨＡ標識は、インフルエンザ赤血球凝集素蛋白質から誘導される抗体決
定(defined) エピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８４ Ｃｅｌｌ ３
７：７６７）。
【００５１】 ＰＴＰ融合蛋白質はさらに、ＰＴＰの検出、単離及び／又は定位を容易にする
ためにＰＴＰに付加される免疫グロブリン定常領域のポリペプチドを含みうる。
免疫グロブリン定常領域ポリペプチドは、好ましくはＰＴＰポリペプチドのＣ末
端に融合している。抗体由来のポリペプチドの様々な部分（Fcドメインを含む）
に融合した異種ポリペプチドを含む融合蛋白質の一般的な調製は、例えばＡｓｈ
ｋｅｎａｚｉら（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０５３５，１９９１）及びＢｙｒ
ｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７，１９９０）によって記述されている。Ｐ
ＴＰ：Ｆｃ融合蛋白質をコードする遺伝子融合物は適切な発現ベクターに挿入さ
れる。本発明の特定実施態様では、ＰＴＰ：Ｆｃ融合蛋白質は抗体分子のように
集合することができ、その際Ｆｃポリペプチドの間で鎖間ジスルフィド結合が形
成され、ダイマーＰＴＰ融合蛋白質が生じる。
【００５２】 ＰＴＰをコードする配列にフレーム内で連結されたＤＮＡ配列によってコード
される免疫グロブリンＶ領域ドメインを含む融合ポリペプチドによって、あらか
じめ選択された抗原に対して特異的結合親和性を持つＰＴＰ融合蛋白質も、本明
細書で提供されるようなその変種及び断片を含めて、本発明の範囲内である。免
疫グロブリンＶ領域融合ポリペプチドを有する融合蛋白質の構築のための一般的
戦略は、例えばＥＰ ０３１８５５４号；Ｕ．Ｓ．５，１３２，４０５号；Ｕ．
Ｓ．５，０９１，５１３号及びＵ．Ｓ．５，４７６，７８６号に開示されている
。
【００５３】 本発明の核酸はまた、望ましい親和特性を持つ他のポリペプチド、例えばグル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのような酵素に融合されたＰＴＰポリペプチ
ドを含む融合蛋白質をコードしうる。別の例として、ＰＴＰ融合蛋白質はまた、
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のプロテイン
Ａポリペプチドに融合したＰＴＰポリペプチドを含みうる；プロテインＡをコー
ドする核酸及び免疫グロブリン定常領域に対して親和性を持つ融合蛋白質を構築
する上でのそれらの使用は、一般に、例えば米国特許第５，１００，７８８号に
開示されている。ＰＴＰ融合蛋白質の構築のための他の有用な親和性ポリペプチ
ドは、例えばＷＯ ８９／０３４２２号；Ｕ．Ｓ．５，４８９，５２８号；Ｕ．
Ｓ．５，６７２，６９１号；ＷＯ ９３／２４６３１号；Ｕ．Ｓ．５，１６８，
０４９号；Ｕ．Ｓ．５，２７２，２５４号及びその他で開示されているようなス
トレプトアビジン融合蛋白質、及びアビジン融合蛋白質（例えばＥＰ ５１１，
７４７号参照）を含みうる。本文中及び引用する参考文献において提供されるよ
うに、基質捕捉性変異体ＰＴＰを含めて、ＰＴＰポリペプチド配列は、完全長融
合ポリペプチドであるか、その代わりにその変種又は断片でありうる融合ポリペ
プチド配列に融合されうる。
【００５４】 本発明はまた、融合蛋白質を、細胞核に、小胞体（ＥＲ）の内腔に存するよう
に、古典的なＥＲ−ゴルジ分泌経路を通して細胞から分泌されるように（例えば
ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．１１５：１９５−２
０１，１９９０）、形質膜に組み込まれるように、膜貫通細胞表面レセプタの細
胞質ドメインを含む特異的細胞質成分と結合するように、又は当業者が精通する
様々な既知の細胞内蛋白ソーティング機序のいずれかによって特定の非細胞位置
に方向付けるように（例えばＲｏｔｈｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３７２：５５−６
３，１９９４；Ａｄｒａｎｉら、１９９８ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：
１０３１７、及び本明細書で引用する参考文献参照）指令するポリペプチド配列
を含むＰＴＰ融合蛋白質を考慮する。従って、これら及び関連する実施態様は、
対象とするポリペプチドをあらかじめ定められた細胞内の膜又は細胞外の位置に
ターゲティングすることを対象とした本発明の組成物及び方法に包含される。
【００５５】 本発明はまた、本発明の核酸を含むベクター及び構築物、特に上記に提供され
るような本発明に従ったＰＴＰポリペプチドをコードする任意の核酸を含む「組
換え発現構築物」、本発明のベクター及び／又は構築物で遺伝的に操作される宿
主細胞、及び組換え技術による本発明のＰＴＰポリペプチド及び融合蛋白質、又
はその断片又は変種の産生に関する。ＰＴＰ蛋白質は、適切なプロモーターの制
御下で哺乳類細胞、酵母、細菌、又は他の細胞において発現されうる。本発明の
ＤＮＡ構築物から誘導されるＲＮＡを使用してそのような蛋白質を産生するため
に、無細胞翻訳系も使用できる。原核及び真核宿主とともに使用するための適切
なクローニング及び発現ベクターは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、「分子クロー
ニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）によって記述されている。
【００５６】 一般に、組換え発現ベクターは、複製の起点、宿主細胞の形質転換を可能にす
る選択マーカ、例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子やビール酵母菌（Ｓ．ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＴＲＰ１遺伝子、及び下流の構造配列の転写を指令する
高度発現遺伝子から誘導されるプロモーターを含む。そのようなプロモーターは
、数ある中でも特に３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、α因子、酸性
ホスファターゼ、又は熱ショック蛋白質のような解糖酵素をコードするオペロン
から誘導できる。異種構造配列を適当な段階で翻訳開始及び終結配列と共に構築
する。任意に異種配列は、所望する特性、例えば発現される組換え産物の安定化
又は簡単な精製をもたらすＮ末端同定ペプチドを含む融合蛋白質をコードしうる
。
【００５７】 細菌での使用のための有用な発現構築物は、作動可能な読み枠(phase) に機能
的プロモーターと共に、所望する蛋白質を適当な翻訳開始及び終了シグナルと共
にコードする構造ＤＮＡ配列を、発現ベクターに挿入することによって構築され
る。構築物は、１つ又はそれ以上の表現型選択マーカ及びベクター構築物の維持
を確保し、所望する場合には宿主内での増幅を与える複製起点を含みうる。形質
転換のための適当な原核生物宿主は、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉ
ｕｍ）及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ）の中の様々な種を含むが、その他も選択肢として使用しうる。任意の他のプ
ラスミド又はベクターも、それらが宿主において複製可能であり、生存可能であ
るかぎり使用できる。
【００５８】 代表的であるが非制限的な例として、細菌での使用のための有用な発現ベクタ
ーは、選択マーカ及び周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３
７０１７）の遺伝的要素を含む市販のプラスミドから誘導される細菌の複製起点
を含みうる。そのような市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン
）及びＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，マジソン，ウィスコンシン州
，ＵＳＡ）を含む。これらのｐＢＲ３２２の「バックボーン」部分を適切なプロ
モーター及び発現する構造配列と組み合わせる。
【００５９】 適当な宿主菌株を形質転換し、宿主菌株が適当な細胞密度に増殖したあと、選
択したプロモーターを、それが本明細書で提供されるような調節されたプロモー
ターである場合には、適当な手段（例えば温度シフト又は化学誘導）によって誘
導し、さらなる期間細胞を培養する。細胞を典型的には遠心分離によって採集し
、物理的又は化学的手段によって破壊して、生じた粗抽出物をさらなる精製のた
めに保持する。蛋白質の発現において使用する微生物細胞は、凍結−解凍サイク
ル、音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用を含む、任意の従来の方法に
よって破壊することができる：そのような方法は当業者には周知である。
【００６０】 それ故、例えば、本明細書で提供されるような本発明の核酸は、ＰＴＰポリペ
プチドを発現するための組換え発現構築物としての様々な発現ベクター構築物の
いずれか１つに包含されうる。そのようなベクター及び構築物は、染色体、非染
色体及び合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージ
ＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組
合せから誘導されるベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス及び
仮性狂犬病のようなウイルスＤＮＡを含む。しかし、他のいかなるベクターも、
それが宿主において複製可能であり、生存可能であるかぎり組換え発現構築物の
調製のために使用しうる。
【００６１】 様々な手順によって適当なＤＮＡ配列をベクターに挿入しうる。一般に、当該
技術分野において既知の手法によってＤＮＡ配列を適当な制限エンドヌクレアー
ゼ部位に挿入する。クローニング、ＤＮＡの単離、増幅及び精製、ＤＮＡリガー
ゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ等が関与する酵素的反応のた
めの標準的技術、及び様々な分離技術は、当業者に既知であり、一般的に使用さ
れているものである。いくつかの標準的技術が、例えばＡｕｓｕｂｅｌら（１９
９３、「分子生物学における現行プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕ
ｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．＆ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ
．Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、「分子クローニング
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）；Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら（１９８２、「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，
Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）及びその他で記述されている。
【００６２】 発現ベクター中のＤＮＡ配列を、ｍＲＮＡ合成を指令するために少なくとも１
つの適切な発現制御配列（例えばプロモーター又は調節プロモーター）に作動可
能に連結する。そのような発現制御配列の代表的な例は、ＬＴＲ又はＳＶ４０プ
ロモーター、大腸菌ｌａｃ又はｔｒｐ、ファージλＰL プロモーター、及び原核
又は真核細胞又はそれらのウイルスにおいて遺伝子の発現を制御することが知ら
れている他のプロモーターを含む。プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェ
ニコールトランスフェラーゼ）ベクター又は選択マーカを持つ他のベクターを用
いて任意の所望する遺伝子から選択することができる。２つの適切なベクターは
ｐＫＫ２３２−８とｐＣＭ７である。特に命名されている細菌プロモーターは、
ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰR 、ＰL 及びｔｒｐを含む。真
核生物プロモーターは、ＣＭＶ即時初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期及び後
期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ及びマウスメタロチオネイン−Ｉを含
む。適切なベクターとプロモーターの選択は充分当該技術分野における通常技術
レベル内であり、ＰＴＰポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結された
少なくとも１個のプロモーター又は調節プロモーターを含む一部の特に好ましい
組換え発現構築物の調製を本明細書で述べる。
【００６３】 上述したように、一部の実施態様では、ベクターはレトロウイルスベクターの
ようなウイルスベクターでありうる。例えば、レトロウイルスプラスミドベクタ
ーを誘導しうるレトロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウ
イルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ(Harvey)肉腫ウイルス、鳥類白血症ウイ
ルス、テナガザル(gibbon ape)白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノ
ウイルス、骨髄増殖性(Myeloproliferative)肉腫ウイルス、及び乳腺癌ウイルス
を含むが、これらに限定されない。
【００６４】 ウイルスベクターは１以上のプロモーターを含む。用いてもよい適切なプロモ
ーターとしては、限定されないが、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモータ
ー、およびＭｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０
（１９８９）に記述されているヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ
ー、または他のいかなるプロモーター（例えば、限定されないが、ヒストン、po
l III 、β−アクチンプロモーターなどを含む、真核細胞プロモーターなどの細
胞プロモーター）が挙げられる。用いてもよい他のウイルスプロモーターとして
は、限定されないが、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）
プロモーター、Ｂ１９パルボウイルスプロモーターが挙げられる。適切なプロモ
ーターの選択は、本明細書に含まれる教示から当業者とって明らかであり、前述
の調節プロモーターまたは上記プロモーターのいずれかから行ないうる。
【００６５】 レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株に形質導入して
生産細胞株を形成するために使用される。トランスフェクションしてもよいパッ
ケージング細胞の例としては、限定されないが、その全体が参照により本明細書
に組み込まれるＭｉｌｌｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１：
５−１４に記載されるような、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ψ−２、Ψ−ＡＭ、Ｐ
Ａ−１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、
ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞系統が挙げられる。
前記ベクターは、当該技術分野において公知のいかなる手段によっても、パッケ
ージング細胞に形質導入してもよい。かかる手段としては、限定されないが、エ
レクトロポレーション、リポソームの使用、およびリン酸カルシウム沈殿法が挙
げられる。１つの選択肢として、レトロウイルスプラスミドベクターをリポソー
ム内に被包するか、または脂質に結合させて、その後、宿主に投与してもよい。
【００６６】 生産細胞株は、ＰＴＰポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸配
列を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。ついで、かかるレトロ
ウイルスベクター粒子を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで真核
細胞に形質導入してもよい。形質導入した真核細胞は、ＰＴＰポリペプチドまた
は融合タンパク質をコードする核酸を発現する。形質導入してもよい真核細胞は
、限定されないが、胚性幹細胞、胚性腫瘍細胞、並びに造血幹細胞、肝細胞、線
維芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、気管支上皮細胞および様々な他の培養適
合性細胞株が挙げられる。
【００６７】 ウイルスベクターを使用して組換ＰＴＰ発現構築物を調製する本発明の態様の
別の例として、１つの好ましい態様において、ＰＴＰポリペプチドまたは融合タ
ンパク質の発現を仕向ける組換ウイルス構築物により形質導入された宿主細胞は
、ウイルス出芽の際にウイルス粒子によって取り込まれる宿主細胞膜の部分から
得られる発現ＰＴＰポリペプチドまたは融合タンパク質を含むウイルス粒子を産
生することができるであろう。別の好ましい態様において、ＰＴＰをコードする
核酸配列をバキュロウイルスシャトルベクターにクローニングし、次にそれをバ
キュロウイルスと組換て、例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３９，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｄ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏ
ｎ編集、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９５；Ｐｉｗｎｉ
ｃａ−Ｗｏｒｍｓ，「バキュロウイルスベクターを使用した、昆虫細胞における
タンパク質の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｉ
ｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ
ｓ）」、第１６章§ＩＩ、「分子生物学におけるショートプロトコール（Ｓｈｏ
ｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」第
２版より、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐ．１６−３２から１６−４８に
記載のようにＳｆ９宿主細胞を感染させるために使用する組換バキュロウイルス
発現構築物を生成する。
【００６８】 もう１つの局面では、本発明は、前記組換ＰＴＰ発現構築物を含む宿主細胞に
関する。宿主細胞は、例えば、クローニングベクター、シャトルベクターまたは
発現構築物でありうる、本発明のベクターおよび／または発現構築物で遺伝子工
学的に作製（形質導入、形質転換またはトランスフェクト）される。ベクターま
たは構築物は、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形態であって
もよい。遺伝子工学的に作製された宿主細胞は、プロモーターを活性化すること
、形質転換株を選択することまたはＰＴＰポリペプチドもしくはＰＴＰ融合タン
パク質をコードする遺伝子などの特定の遺伝子を増幅することに適するように改
変された慣用の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨ等の発現のために
選択された特定の宿主細胞の培養条件は、当業者には容易に明らかであろう。
【００６９】 宿主細胞は、哺乳動物細胞などの高等真核細胞、または酵母細胞などの下等真
核細胞であり得、あるいは宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞でありうる。本
発明に従った適切な宿主細胞の代表例としては、限定される必要はないが、大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ネズ
ミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などの細菌細胞
；酵母などの真菌細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２細胞、
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９などの昆虫細胞；ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞または
２９３細胞などの動物細胞；アデノウイルス、植物細胞、またはｉｎ ｖｉｔｒ
ｏでの増殖に既に適合されているかまたは新たにそのように確立されたいかなる
適切な細胞をも挙げられる。適切な宿主の選択は、本明細書における教示から当
業者の技術範囲内であるとみなされるであろう。
【００７０】 種々の哺乳動物細胞培養系も、組換タンパク質を発現するために使用されうる
。したがって、本発明は、野生型プロテインチロシンホスファターゼ触媒ドメイ
ンの不変アスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの有意の変化をもたらさないが、Ｋ
ｃａｔを１分当り１未満への低下をもたらすアミノ酸と置換され、かつ少なくと
も１つの野生型プロテインチロシンホスファターゼのチロシン残基が、リン酸化
され得ないアミノ酸で置換されているものである基質捕捉性変異体プロテインチ
ロシンホスファターゼをコードする核酸配列に作動可能に連結された少なくとも
１つのプロモーターを含有した組換発現構築物を含有した宿主細胞を培養するこ
とによる、組換基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼの製造方法
を一部となす。ある態様において、前記プロモーターは、本明細書において与え
られるような調節プロモーター、例えば、テトラサイクリン抑制性プロモーター
であってもよい。ある態様において、組換発現構築物は、本明細書で与えられる
ような組換ウイルス発現構築物である。哺乳動物発現系の例としては、Ｇｌｕｚ
ｍａｎ，Ｃｅｌｌ ２３：１７５（１９８１）により述べられているサル腎線維
芽細胞のＣＯＳ−７株、およびコンパチブルベクターを発現しうる他の細胞株、
例えば、Ｃ１２７細胞株、３Ｔ３細胞株、ＣＨＯ細胞株、ＨｅＬａ細胞株および
ＢＨＫ細胞系統などが挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始起点、適
切なプロモーターとエンハンサーを含有しており、また、例えば、ＰＴＰ発現構
築物の調製に関して、本明細書で記載されるいかなる必要なリボソーム結合部位
、ポリアデニル化部位、スプライシングドナー、スプライシングアクセプター部
位、転写終止配列および５’隣接非転写配列をも含有する。ＳＶ４０スプライシ
ングに由来するＤＮＡ配列とポリアデニル化部位とは、必要な非転写遺伝子エレ
メントを提供するために用いられるであろう。宿主細胞への構築物の導入は、限
定されないが、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デ
キストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションなどを含
む当業者が精通する種々の方法によって実施されうる（Ｄａｖｉｓら、１９８６
、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）
。
【００７１】 ＰＴＰ（基質捕捉性変異体ＰＴＰなど）をコードする核酸配列もしくはそのバ
リアントまたは断片に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイ
ムを含む、アンチセンス作用物質(antisense agents)として使用するための核酸
分子の同定、並びに遺伝子治療における標的送達のためのＰＴＰ遺伝子（基質捕
捉性変異体ＰＴＰなど）をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドの同定は、当該
技術において周知の方法を含む。例えば、かかるオリゴヌクレオチドの望ましい
特性、長さおよび他の特徴は周知である。ある好ましい態様では、かかるアンチ
センスオリゴヌクレオチドは、本明細書で提供されるような基質捕捉性変異体Ｐ
ＴＰをコードする単離された核酸分子に相補的な少なくとも１５個の連続するヌ
クレオチドを含有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、ホス
ホロチオエート、メチルホスホネート、スルホン、スルフェート、ケチル、ホス
ホロジチオエート、ホスホルアミデート、リン酸エステル、および他のかかる結
合（例えば、Ａｇｒｗａｌら、Ｔｅｔｒｅｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２８：３５
３９−３５４２（１９８７）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．
９３：６６５７−６６６５（１９７１）；Ｓｔｅｃら、Ｔｅｔｒｅｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔ．２６：２１９１−２１９４（１９８５）；Ｍｏｏｄｙら、Ｎｕｃｌ
．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：４７６９−４７８２（１９８９）；Ｕｚｎａｎｓ
ｋｉら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８９）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら
、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４０：１３７−１４３（１９８４）；Ｅｃｋｓｔｅ
ｉｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：３６７−４０２（１９８５）
；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１４：９７−１００
（１９８９）；Ｓｔｅｉｎ、「オリゴデオキシヌクレオチド、遺伝子発現のアン
チセンス阻害因子（Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ａｎｔｉｓ
ｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」
より、Ｃｏｈｅｎ編集、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ．
９７−１１７（１９８９）；Ｊａｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：
７２３７−７２４６（１９８８）参照）などの結合を使用することによって内因
性のヌクレオ分解（nucleolytic ）酵素による分解に耐えるように設計される。
【００７２】 アンチセンスヌクレオチドは、ｍＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸に配列特異的
な様式で結合するオリゴヌクレオチドである。相補的配列を有するｍＲＮＡに結
合した場合、アンチセンスは、ｍＲＮＡの翻訳を妨げる（例えば、Ａｌｔｍａｎ
ら、米国特許第５，１６８，０５３号明細書；Ｉｎｏｕｙｅ、米国特許第５，１
９０，９３１号明細書；Ｂｕｒｃｈ、米国特許第５，１３５，９１７号明細書；
Ｓｍｉｔｈ、米国特許第５，０８７，６１７号明細書、およびダンベルアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドを記載するＣｌｕｓｅｌら、（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：３４０５−３４１１などを参照のこと）。三重鎖分子
は、二重鎖ＤＮＡに結合して共直線(collinear) 三重鎖分子を形成し、それによ
り、転写を妨げる1 つのＤＮＡ鎖(single DNA strands)を指す（例えば、二重鎖
ＤＮＡ上の標的部位に結合する合成オリゴヌクレオチドを作製するための方法を
記載したＨｏｇａｎら、米国特許第５，１７６，９９６号明細書などを参照のこ
と）。
【００７３】 本発明のこの態様によれば、特に有用なアンチセンスヌクレオチドおよび三重
鎖分子は、ＰＴＰポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳の阻害が行われるよ
うに、ＰＴＰポリペプチド（基質捕捉性変異体ＰＴＰなど）をコードするＤＮＡ
またはｍＲＮＡのセンス鎖に相補的である分子またはセンス鎖に結合する分子で
ある。
【００７４】 リボザイムは、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ基質を特異的に切断して、細胞遺伝子発
現の特異的阻害または干渉をもたらすＲＮＡ分子である。ＲＮＡ鎖の切断および
／またはＲＮＡ鎖のライゲーションに関与する少なくとも５つの既知のクラスの
リボザイムが存在する。リボザイムはどのようなＲＮＡ転写産物にも標的するこ
とができ、かかる転写産物を触媒的に切断する（例えば、米国特許第５，２７２
，２６２号明細書；米国特許第５，１４４，０１９号明細書；およびＣｅｃｈら
への米国特許第５，１６８，０５３号明細書、米国特許第５，１８０，８１８号
明細書、米国特許第５，１１６，７４２号明細書および米国特許第５，０９３，
２４６号明細書などを参照のこと）。本発明のある態様によれば、このようない
かなるＰＴＰ（基質捕捉性変異体ＰＴＰなど）ｍＲＮＡ特異的リボザイム、また
はかかるリボザイムをコードする核酸をも宿主細胞に送達し、ＰＴＰ遺伝子発現
の阻害をもたらすことができるであろう。したがって、リボザイム等は、核に導
入されたときリボザイムが直接転写されるように、真核ウイルスプロモーターな
どの真核生物プロモーターに連結されたリボザイムをコードするＤＮＡによって
宿主細胞に送達されうる。
【００７５】 発現された組換ＰＴＰポリペプチドまたは融合タンパク質（基質捕捉性変異体
ＰＴＰなどを含む）は、インタクト宿主細胞において；細胞膜、細胞内小胞また
は他の細胞小器官などのインタクト細胞小器官において；または細胞ホモジネー
トまたは溶解物、ミクロソーム、単層膜および多重膜小胞または他の調製物を含
むがこれらに限定されない破砕された細胞調製物において、有用であろう。一方
、発現された組換ＰＴＰポリペプチドまたは融合タンパク質は、硫酸アンモニウ
ム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグ
ラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマト
グラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーなどの方法によって、組換細胞培
養物から回収し、精製することができる。成熟タンパク質の立体配置を完成する
際に、必要に応じてタンパク質のリフォールディングステップを使用することが
できる。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が最終精製段階のた
めに使用されうる。
【００７６】 本発明の別の局面に注目すると、ＰＴＰの基質であるチロシンリン酸化タンパ
ク質[ チロシンがリン酸化されたタンパク質（tyrosine phosphorylated protei
n ）] の同定方法が提供される。本明細書中で用いられる「試料」は、少なくと
も１つのチロシンリン酸化タンパク質を含有する生物学的試料をいい、被験体ま
たは生物学的供給源に由来する血液試料、生検標本、組織外植片、器官培養物ま
たは任意の他の組織もしくは細胞調製物を得ることによって提供され得る。さら
に、試料は、形態学的完全性または物理状態が、例えば、被験体または生物学的
供給源に由来する試料を処理するための切離、解離、可溶化、分画化、ホモジネ
ーション、生化学的もしくは化学的な抽出、粉砕化、凍結乾燥、超音波処理また
は任意の他の手段によって破砕されている組織調製物または細胞調製物を称する
であろう。いくつかの好ましい態様において、試料は、細胞溶解物であり、ある
特に好ましい態様において、溶解物は、不溶性成分が標準的な細胞生物学技術に
従って除かれている界面活性剤可溶化細胞溶解物である。被験体または生物学的
供給源は、ヒトまたは非ヒト動物、初代細胞培養物または限定されないが、染色
体に組み込まれた核酸配列またはエピソーム組換核酸配列を含有し得る遺伝子工
学的に作製された細胞株などの培養適合細胞株（これには、）、不死化細胞株ま
たは不死化可能な細胞株、体細胞ハイブリッド細胞株、分化した細胞株または分
化し得る細胞株、形質転換された細胞株などであってもよい。必要に応じて、特
定の状況では、チロシンリン酸化タンパク質に関して試料を濃縮するために、生
物学的試料内の細胞を、本明細書中に記載されているように過バナジウム酸塩で
処理することは望ましいことであろう。また、他の手段も試料中に存在するチロ
シンリン酸化タンパク質の割合を増大させるために用いることができ、プロテイ
ンチロシンキナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子で形質転換されている
細胞株である被験体または生物学的供給源の使用が含まれる。加えてまたは別に
、タンパク質のチロシンリン酸化は、当該技術分野で周知の様々な方法および当
該技術分野においてプロテインチロシンキナーゼ活性を刺激することが公知の組
成物の任意の１以上を使用して被験体または生物学的供給源の細胞において刺激
されてもよい。これらの刺激としては、限定されないが、細胞へのサイトカイン
、増殖因子、ホルモン、ペプチド、小分子媒介因子またはＰＴＫ媒介されたタン
パク質チロシンリン酸化を誘導する他の薬剤の曝露が挙げられるであろう。かか
る薬剤としては、例えば、インターロイキン、インターフェロン、ヒト成長ホル
モン、インスリンおよび繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ならびに当業者が熟知
している他の薬剤が挙げられる。
【００７７】 本発明によれば、少なくとも１つのチロシンリン酸化タンパク質を含有した試
料は、チロシンリン酸化タンパク質と基質捕捉性変異体ＰＴＰとの間の複合体の
形成を可能にするに十分な条件かつ時間で、本明細書中に与えられる少なくとも
１つの基質捕捉性変異体ＰＴＰと混合される。かかる複合体の形成に好適な条件
は、複合体の存在を検出するための溶液条件および方法を含む、当該技術分野で
公知の本明細書中に与えられた教示に基づいて、容易に決定することができる。
次に、チロシンリン酸化タンパク質と基質捕捉性変異体ＰＴＰとを含有した複合
体の有無が決定され、ここで、複合体の存在は、チロシンリン酸化タンパク質が
、それと複合体を形成するＰＴＰの基質であることを示す。
【００７８】 チロシンリン酸化タンパク質基質との複合体において会合している基質捕捉性
変異体ＰＴＰは、上記のように、ＰＴＰとＰＴＰ基質との分子間相互作用を明ら
かにするために当該技術分野で知られている様々な技術のいずれかによって、例
えば、共精製；共沈殿；共免疫沈殿；放射測定アッセイまたは蛍光測定アッセイ
；ウエスタン免疫ブロット分析；固相リガンド−対応リガンド吸着技術、アフィ
ニティークロマトグラフィーおよび表面親和性プラズモン共鳴などのアフィニテ
ィー技術などのアフィニティー捕捉などによって同定され得る（例えば、米国特
許第５，３５２，６６０号明細書を参照のこと）。ＰＴＰ／基質複合体の存在の
決定は、ＰＴＰまたはチロシンリン酸化タンパク質基質に特異的に結合するモノ
クローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体および単鎖抗体などの種々の
抗体を用いてもよい。標識ＰＴＰおよび／または標識チロシンリン酸化基質もま
た、複合体の存在を検出するために使用することができる。ＰＴＰまたはリン酸
化タンパク質は、好適なレポーター分子または成分(moiety)、例えば、任意の種
々の酵素、蛍光物質、発光性物質、放射性物質などを共有結合的または非共有結
合的に結合させることによって標識されうる。好適な酵素の例としては、限定さ
れないが、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ビオチン、アルカリホスファ
ターゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼなどが挙げられる
。好適な蛍光物質の例としては、限定されないが、例えば、ウンベリフェロン、
フルオレセイン、フルオレセインイソチアシナート、ローダミン、ジクロロトリ
アジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、フィコエリトリンなどが挙
げられる。適切な発光性物質としては、ルミノールが挙げられ、好適な放射性物
質としては、放射性のリン［32Ｐ］、ヨウ素［125 Ｉまたは131 Ｉ］あるいはト
リチウム［3 Ｈ］が挙げられる。
【００７９】 かかる方法を使用して、ＰＴＰ１Ｂとｐ２１０ｂｃｒ：ａｂｌとの複合体、Ｐ
ＴＰ−ＰＥＳＴとｐ１３０cas との複合体、ＴＣ−ＰＴＰとＳｈｃとの複合体（
例えば、Ｔｉｇａｎｉｓ他、１９９８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１
６２２〜１６３４）およびＰＴＰＨ１とｐｐ９７／ＶＣＰとの複合体のそれぞれ
を、下記に記載されているようなウエスタン免疫ブロット分析によって容易に同
定することができる。これらの会合は、例えば、いくつかの細胞株から得られた
溶解物およびトランスフェクト細胞において観察され、ｐ２１０ｂｃｒ：ａｂｌ
、ｐ１３０cas 、ＳｈｃおよびＶＣＰが、それぞれ、ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰ−ＰＥ
ＳＴ、ＴＣ−ＰＴＰおよびＰＴＰＨ１に対する主要な生理学的に関連する基質を
表すことを示すであろう。ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰ−ＰＥＳＴおよびＰＴＰＨ１に対
して特異的なチロシンリン酸化基質を同定するために、本明細書中に例示されて
いるように使用され得る本発明の組成物および方法は、限定されないが、一般に
、ＴＣ−ＰＴＰ、ＰＴＰγ、ＭＫＰ−１、ＤＥＰ−１、ＰＴＰμ、ＳＨＰ２、Ｐ
ＴＰ−ＰＥＺ、ＰＴＰ−ＭＥＧ１、ＬＣ−ＰＴＰ、ＣＤ４５、ＬＡＲおよびＰＸ
ＰＸ１０を含むＰＴＰファミリーの任意のメンバーに適用することができる。
【００８０】 本発明のこの局面のある態様において、試料は、ＰＴＰの基質であるチロシン
リン酸化タンパク質を本来発現する細胞を含有してもよく、一方、いくつかの他
の態様において、該試料は、基質タンパク質をコードする１以上の核酸分子でト
ランスフェクトされている細胞を含有してもよい。例えば、試料は、基質タンパ
ク質をコードする少なくとも１つの核酸分子を含むｃＤＮＡライブラリーなどの
核酸ライブラリーでトランスフェクトされている細胞または細胞集団を含有して
もよい。いかなるチロシンリン酸化タンパク質も、本発明における潜在的な基質
として好適である。チロシンリン酸化タンパク質は、当該技術分野ではよく知ら
れている。適切な基質の具体的な例としては、限定されないが、ｐ１３０cas 、
ｐｐ９７／ＶＣＰ、ＥＧＦ受容体、ｐ２１０ｂｃr ：ａｂｌ、ＭＡＰキナーゼ、
Ｓｈｃ、インスリン受容体が挙げられる。特に注目されるものは、哺乳動物の疾
患または異常に関係しているチロシンリン酸化タンパク質である。
【００８１】 本発明によれば、基質としては、全長のチロシンリン酸化タンパク質ならびに
チロシン残基がリン酸化され得るポリペプチドおよびそのフラグメント（例えば
、一部分）、誘導体またはアナログが挙げられるであろう。かかるフラグメント
、誘導体およびアナログとしては、例えば、ＰＴＰとの複合体を形成することに
よって、本明細書中に与えられるようなＰＴＰと相互作用する生物学的機能を少
なくとも保持する任意のＰＴＰ基質ポリペプチドが挙げられる。融合タンパク質
である基質などを含むＰＴＰ基質ポリペプチドのフラグメント、誘導体またはア
ナログは、（ｉ）１以上のアミノ酸残基が、保存アミノ酸残基または非保存アミ
ノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残基）で置換され、かつかかる置換アミノ
酸残基は、遺伝コードによりコードされるアミノ酸残基であってもよく、または
かかるアミノ酸残基でなくてもよいものであるフラグメント、誘導体またはアナ
ログ、あるいは（ｉｉ）１以上のアミノ酸残基が置換基を含むものであるフラグ
メント、誘導体またはアナログ、あるいは（ｉｉｉ）基質ポリペプチドが、ポリ
ペプチドの半減期を増大させる化合物（例えば、ポリエチレングリコールなど）
またはレポーター分子などの検出可能な部分(moiety)などの別の分子と融合して
いるものであるフラグメント、誘導体またはアナログ、あるいは（ｉｖ）追加の
アミノ酸が、基質ポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製のために用いら
れるアミノ酸などを含む基質ポリペプチドに融合しているフラグメント、誘導体
またはアナログであってもよい。かかるフラグメント、誘導体およびアナログは
、当業者の範囲内であると考えられる。
【００８２】 また、本発明は、（試料と混合される）基質捕捉性変異体ＰＴＰが、細胞によ
り発現される変異体ＰＴＰであるいくつかの態様が考えられ、細胞が、変異体Ｐ
ＴＰをコードする１以上の核酸分子によってトランスフェクトされている態様が
含まれる。したがって、ＰＴＰの基質であるチロシンリン酸化タンパク質の同定
方法は、いくつかの態様において、チロシンリン酸化タンパク質を含有する試料
と変異体ＰＴＰとを混合することを含み、該試料は、チロシンリン酸化タンパク
質および変異体ＰＴＰのいずれかまたは両方を発現する細胞を含有する。任意に
、前記細胞は、チロシンリン酸化タンパク質および変異体ＰＴＰのいずれかまた
は両方をコードする核酸でトランスフェクトされていてもよい。
【００８３】 別の局面において、本発明は、ＰＴＰと、ＰＴＰの基質であるチロシンリン酸
化タンパク質との間の相互作用を変化させる薬剤を、かかる相互作用を変化（す
なわち、増大または低下）させる候補薬剤の能力を検出するスクリーニングアッ
セイの使用によって同定する方法を提供する。ＰＴＰとその基質との間の相互作
用は、例えば、触媒的な基質脱リン酸化を検出することにより、酵素的に決定さ
れるであろう。他方、ＰＴＰ（基質捕捉性変異体ＰＴＰを含む）とその基質との
間の相互作用は、結合相互作用として決定されるであろうし、好ましい態様にお
いて、かかる相互作用は、本明細書中に記載されている基準により、ＰＴＰ−基
質結合により形成される複合体を検出することとして明らかにされる。これらの
方法により同定された薬剤は、ＰＴＰ活性のアゴニスト（例えば、野生型ＰＴＰ
の活性を増強または増大させる薬剤）またはアンタゴニスト（例えば、野生型Ｐ
ＴＰの活性を阻害または低下させる薬剤）であってもよい。薬剤は、以下に記載
されているように、合成小分子を含む天然に存在化合物または非天然化合物のな
かから同定されるであろう。
【００８４】 スクリーニングアッセイがＰＴＰの触媒活性に対して行われるいくつかの態様
において、ＰＴＰの基質であるチロシンリン酸化タンパク質は、前記のように同
定され得、かかる方法は、本明細書中に開示されているような新規な基質捕捉性
変異体ＰＴＰの使用を特徴とする。したがって、ＰＴＰとチロシンリン酸化基質
とを、候補薬剤の非存在下および存在下で混合され、ここで、該基質は、基質捕
捉性変異体ＰＴＰを用いて、前記のように、まず同定されている。ＰＴＰおよび
基質は、検出可能な基質脱リン酸化が生じることを可能にし得る条件のもとで混
合される。
【００８５】 いかなる好適な方法も、リンタンパク質の脱リン酸化を検出するために使用す
ることができる。かかる方法としては、限定されないが、当該技術分野ではよく
知られており、例えば、放射測定、蛍光測定、デンシトメトリー、分光測光、ク
ロマトグラフィー、電気泳動、比色測定または生物分析によるアッセイの１以上
によって基質の触媒作用を検出することなどが挙げられる。薬剤の非存在下にお
ける基質の脱リン酸化のレベルを、薬剤の存在下における基質の脱リン酸化のレ
ベルと比較し、その結果、基質の脱リン酸化レベルにおける差異（例えば、統計
学的に有意な増大または低下）が、プロテインチロシンホスファターゼと基質と
の間の相互作用を変化させる薬剤が示される。
【００８６】 例えば、野生型ＰＴＰが用いられる酵素活性アッセイを候補薬剤の非存在下お
よび存在下で行なうことができる。当該技術分野で知られている酵素活性アッセ
イとしては、例えば、Ｆｌｉｎｔら（１９９３、ＥＭＢＯ Ｊ．１２：１９３７
- １９４６）に記載されるような、チロシンがリン酸化された32Ｐ標識基質を用
いるＰＴＰ活性アッセイなどが挙げられる。候補薬剤の存在下におけるＰＴＰ酵
素活性の低下は、その薬剤がＰＴＰとその基質との間の相互作用を阻害すること
を示す。逆に、候補薬剤の存在下におけるＰＴＰ酵素活性の増大は、その薬剤が
ＰＴＰとその基質との間の相互作用を増強することを示す。
【００８７】 スクリーニングアッセイが、基質捕捉性変異体ＰＴＰ−基質の結合相互作用を
変化させ得る薬剤を同定することに対して行われるいくつかの他の態様において
、（本明細書中に記載されるような）基質捕捉性変異体ＰＴＰと、チロシンリン
酸化基質(tyrosine phosphorylated substrate) とが、チロシンリン酸タンパク
質と基質捕捉性変異体ＰＴＰとの間の複合体の形成を可能にし、それによって結
合体(combination) を生成するのに十分な条件、かつ時間で混合される。ついで
、結合体(combination) におけるチロシンリン酸化タンパク質と基質捕捉性変異
体のタンパク質チロシンホスファターゼとを含有する複合体の形成が（本明細書
中にも与えられるように）決定され、ここで、薬剤の非存在下および存在下にお
ける複合体形成レベルの差（例えば、統計学的に有意な差）により、その薬剤が
タンパク質チロシンホスファターゼと基質との相互作用を変化（すなわち、増大
または低下）させることを示す。他方、競合的結合アッセイを、基質捕捉性変異
体ＰＴＰを候補薬剤の非存在下および存在下で用いて行うことができる。当該技
術分野で知られている競合的結合アッセイとしては、例えば、本発明のこれらの
態様の使用に適した方法を記載する米国特許第５，３５２，６６０号明細書など
が挙げられる。試験対象の薬剤の存在下におけるＰＴＰ−基質結合の程度におけ
る低下は、その薬剤がＰＴＰとその基質との間の相互作用を阻害することを示す
。逆に、試験対象の薬剤の存在下におけるＰＴＰ−基質結合の程度における増大
は、その薬剤がＰＴＰとその基質との間の相互作用を増強することを示す。
【００８８】 ＰＴＰとそのチロシンリン酸化タンパク質基質との間の相互作用を変化させる
薬剤をスクリーニングする本発明の方法における使用のための候補薬剤は、化合
物、組成物または分子の「ライブラリー」またはコレクションとして提供される
であろう。１以上のＰＴＰと相互作用し得る候補薬剤（本明細書中に与えられる
ような基質捕捉性変異体ＰＴＰと相互作用する薬剤を含む）としては、ＰＴＰに
結合する、Ｓｏｎｇｙａｎｇら（１９９５、Ｎａｔｕｒｅ、３７５：５３６〜５
３９；１９９３、Ｃｅｌｌ、７２：７６７〜７７８）に記載されているようなホ
スホチロシルペプチドライブラリーのメンバーなどが挙げられるであろう。かか
るペプチドライブラリーから同定されたペプチドは、ついで、これらのペプチド
を含有するチロシンリン酸化ペプチドが、本質的に存在するかどうかを明らかに
するために評価され得る。他方、スクリーニングされる候補分子のライブラリー
には、「小分子」として当該技術分野では公知の化合物で、分子量が１０5 ダル
トン未満（好ましくは１０4 ダルトン未満、さらにより好ましくは１０3 ダルト
ン未満）である化合物などが典型的に挙げられるであろう。例えば、試験化合物
のライブラリーのメンバーは、それぞれが、少なくとも１つの基質捕捉性変異体
ＰＴＰと、本明細書中に与えられるようなＰＴＰの基質である少なくとも１つの
チロシンリン酸化タンパク質とを含む多数の試料に与えられ(administered)、つ
いで、基質への変異体ＰＴＰの結合を増強または阻害するそれらの能力について
アッセイされ得る。ＰＴＰ−基質相互作用（例えば、結合および／または基質ホ
スホチロシン脱リン酸化）を変化させ得るとしてそのように同定された化合物は
、該化合物が、ＰＴＰ活性に関連する疾患の処置および／または検出を可能にす
るので、治療目的および／または診断目的に有用である。また、かかる化合物は
、ＰＴＰに関連する分子シグナル伝達機構に対する研究およびより大きな特異性
を示す将来の化合物の発見および開発における精密化に対する研究において有用
である。
【００８９】 さらに、候補化合物は、多数の反応容器において行なわれた多数のあらかじめ
決められた化学反応に従って調製された合成薬剤を含むことが好ましいコンビナ
トリアルライブラリーのメンバーとして提供されるであろう。例えば、種々の出
発化合物を、所定の成分が反応条件の多数の順列および／または組合せを追跡で
きるように経ることを可能にする固相合成、記録されたランダムミックス方法論
および記録された反応分割技術の１以上を用いて調製されるであろう。得られる
生成物は、ペプチドの合成コンビナトリアルライブラリー（例えば、ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ９１／０８６９４、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４６６６を参照のこと、これらはこ
れによりその全体が参照として組み込まれる）、または本明細書中に提供される
ような小分子を含んでもよい他の組成物（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０８５４
２、ＥＰ０７７４４６４、米国特許第５，７９８，０３５号明細書、米国特許第
５，７８９，１７２号明細書、米国特許第５，７５１，６２９号明細書を参照の
こと、これらはこれによりその全体が参照として組み込まれる）などのスクリー
ニングされ、その後、選抜および合成の手順が繰り返され得るライブラリーを含
有する。当業者は、かかるライブラリーの多様な取合わせは、確立された手順を
用いて調製され、そして本発明の開示に従って基質捕捉性変異体ＰＴＰを使用し
て試験され得ることを理解している。
【００９０】 また、本発明は、（ｉ）野生型ＰＴＰ触媒ドメインの不変のアスパラギン酸残
基が、酵素のＫｍの顕著な変化をもたらさないが、１分あたり１未満（１ｍｉｎ -1 未満）までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸（例えば、アラニン残基）と
置換され、かつ（ｉｉ）少なくとも１つの野生型チロシン残基がリン酸化され得
ないアミノ酸と置換されるものである、基質捕捉性変異体ＰＴＰを被験体に投与
する工程を含み、それにより、基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファタ
ーゼとチロシンリン酸化タンパク質との間の相互作用が、チロシンリン酸化タン
パク質の活性を低減する、チロシンリン酸化タンパク質の活性を低減させる方法
に関する。いくつかの好ましい態様において、チロシンリン酸化タンパク質は、
ＶＣＰ、ｐ１３０cas 、ＥＧＦ受容体、ｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌ、ＭＡＰキナ
ーゼ、Ｓｈｃまたはインスリン受容体である。いくつかの他の好ましい態様にお
いて、チロシンリン酸化タンパク質は、ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰ−ＰＥＳＴ、ＰＴＰ
γ、ＭＫＰ−１、ＤＥＰ−１、ＰＴＰμ、ＰＴＰＸ１、ＰＴＰＸ１０、ＳＨＰ２
、ＰＴＰ−ＰＥＺ、ＰＴＰ−ＭＥＧ１、ＬＣ−ＰＴＰ、ＴＣ−ＰＴＰ、ＣＤ４５
、ＬＡＲまたはＰＴＰＨ１である。
【００９１】 理論によりとらわれることを望まないが、かかる変異体ＰＴＰは、対応する野
生型ＰＴＰの活性を、野生型ＰＴＰとチロシンリン酸化タンパク質基質との複合
体を形成し、それにより、野生型酵素による触媒的脱リン酸化に利用できない基
質を与えることによって低減させる。したがって、基質捕捉性変異体ＰＴＰは、
脱リン酸化することなく（または非常に低下した速度で脱リン酸化を触媒する）
リンタンパク質基質に結合し、それにより、脱リン酸化されたタンパク質基質の
活性を妨害し、その下流の影響を低減させる。本明細書中で用いられるように、
「低減」は、リン酸化タンパク質基質の１以上の活性または機能の阻害または完
全な無効化の両方が含まれる。
【００９２】 チロシンリン酸化タンパク質の活性の低減方法の１つの局面において、ＰＴＰ
−ＰＥＳＴの基質であるｐ１３０cas のリン酸化に関連する少なくとも１つのガ
ン遺伝子の悪性転換効果を低減する方法が提供される。一般的には、前記方法は
、野生型ＰＴＰの触媒ドメインの不変のアスパラギン酸残基がアラニン残基と置
換され、かつ少なくとも１つの野生型チロシン残基がリン酸化され得ないアミノ
酸と置換されたものである基質捕捉性変異体ＰＴＰ−ＰＥＳＴを被験体に投与す
る工程を含む。野生型ＰＴＰ−ＰＥＳＴは、基質ｐ１３０cas に結合して、脱リ
ン酸化し、それにより、この基質の下流の生物学的作用を負に調節するのに対し
て、本発明の基質捕捉性ＰＴＰ−ＰＥＳＴ変異体は、ｐ１３０cas に結合するが
、ｐ１３０cas を脱リン酸化することができない（または非常に低速度で脱リン
酸化する）。前記に開示された限定されない理論により、基質は、ついで、基質
捕捉性ＰＴＰ−ＰＥＳＴとの複合体の中に隔離され、その下流の作用を発揮する
ことができない。本方法のいくつかの態様において、ガン遺伝子は、ｖ−ｃｒｋ
、ｖ−ｓｒｃまたはｃ−Ｈａ−ｒａｓのいずれかであってもよい。
【００９３】 同様に、本発明は、上記に規定されるような基質捕捉性変異体ＰＴＰ−ＰＥＳ
Ｔを哺乳動物に投与する工程を含む、ｐ１３０cas に関連するシグナル伝達複合
体(signaling complexes associated with p130 cas ) 、特に、分裂促進経路を
誘導するこれらのシグナル伝達複合体）の形成を低減する方法に関する。ＰＴＰ
は、ｐ１３０cas に結合および／または該ｐ１３０cas を脱リン酸化し、それに
より、ｐ１３０cas の下流の作用を負に調節し、ｐ１３０cas に関連するシグナ
ル変換複合体(signaling complexes associated with p130 cas ) の形成を低減
する。別の例として、いくつかの態様において、本発明は、ＰＴＰＨ１の基質で
あるｐｐ９７／ＶＣＰによる細胞周期の調節に関し、ここで、本明細書中に規定
されるような基質捕捉性変異体ＰＴＰＨ１（すなわち、触媒活性が弱められ、か
つ野生型チロシンが置換されたものである二重変異体）は、ＰＴＰＨ１１とＶＣ
Ｐとの間の相互作用を変化しうる。
【００９４】 本明細書中に規定されるように、本発明の基質捕捉性変異体ＰＴＰs は、ＰＴ
Ｐ調節されるシグナル伝達を含む生物学的な調節が、例えば、対応する野生型Ｐ
ＴＰの代わりに、あるいは対応する野生型ＰＴＰに加えて関与する事実上いかな
る状況においても有用であろう。本発明のかかる有用性の長所は、例えば、野生
型ＰＴＰが投与および／または過剰発現したときに広く認められる有害な細胞傷
害性作用を誘導することなく、野生型ＰＴＰにより媒介される脱リン酸化の後に
続くチロシンリン酸化基質の生物学的なシグナル伝達活性を弱めるために、基質
捕捉性性変異体ＰＴＰがその対応する野生型酵素の機能を模倣する能力にある。
したがって、本発明は、野生型ＰＴＰの投与または過剰発現に関連する細胞傷害
性効果を低減する方法にも関する。例えば、ＭＫＰ−１のＣＳ変異体は、潜在的
に有害な副作用を誘導することなく、野生型ＭＫＰ−１と同じ機能的作用を有す
ることが示されている。したがって、野生型ＰＴＰの触媒作用ドメインの不変の
アスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化をもたらさないが、１分あたり
１未満（１ｍｉｎ-1未満）までのＫｃａｔの変化をもたらすアミノ酸（例えば、
アラニン残基）と置換され、かつ少なくとも１つの野生型チロシン残基がリン酸
化され得ないアミノ酸と置換されるものである本明細書中に記載されたＰＴＰは
、対応物(counterpart) の野生型酵素の代わりに、かかる対応物(counterpart)
の野生型酵素が変異体ＰＴＰと同じ基質と特異的に相互作用し得る多くの状況で
使用することができる。
【００９５】 また、本明細書中に記載の基質捕捉性変異体ＰＴＰは、そのチロシンリン酸化
基質に結合する能力を保持する基質捕捉性変異体ＰＴＰ（またはその機能的部分
）をコードする核酸、例えば、上記に記載されているような組換発現構築物を被
験体に導入し、そして発現する遺伝子治療法などによって、チロシンリン酸化タ
ンパク質の活性を変える（すなわち、増大または低下）ために治療的に使用して
もよい。前記変異体ＰＴＰは、部分的または全体的に、被験体において正常に産
生される対応する宿主ＰＴＰ酵素の代わりになるか、あるいは基質に結合するこ
とに関して宿主のＰＴＰと競合してもよい。例えば、特定のチロシンリン酸化タ
ンパク質基質が、特定の疾患または異常に関係するであろう場合、疑わしい基質
を脱リン酸化し得る少なくとも１つのＰＴＰを同定できるであろう。対応する基
質捕捉性変異体ＰＴＰは、本明細書中に記載の組成物と方法とを使用して、直接
的に、あるいは遺伝子治療によって投与されうる。かかる変異体ＰＴＰは、チロ
シンリン酸化基質を隠蔽し、それにより、疾患プロセスにおける基質の役割を阻
害または低下させることができるであろう。好ましい態様において、本開示の基
質捕捉性変異体ＰＴＰは、野生型酵素の過剰発現に関連する細胞傷害性効果を低
減させるために、対応する野生型酵素の代わりに投与される。遺伝子治療の手法
が、当該技術分野で公知であり（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号明細
書を参照のこと）、本発明の基質捕捉性変異体ＰＴＰを発現させるために知られ
ている公知の方法によって改変することができる。
【００９６】 本発明の方法は、ホスファターゼＰＴＰＨ１、ＰＴＰ１ＢおよびＰＴＰ−ＰＥ
ＳＴに関して本明細書中に具体的に例示されている；しかしながら、本発明は、
これらの特定のＰＴＰに限定されないが、ＰＴＰファミリーのすべてのメンバー
に対して適用できることが理解される。ＰＴＰＨ１、ＰＴＰ１ＢおよびＰＴＰ−
ＰＥＳＴの潜在的な基質を同定するために、触媒作用が弱められているが、基質
結合能を保持している変異体（すなわち、変化または基質捕捉性）形態のＰＴＰ
Ｈ１、ＰＴＰ１ＢおよびＰＴＰ−ＰＥＳＴが、本明細書中に記載のように作製さ
れる。
【００９７】 ある態様では、本発明は、部分的に、野生型ＰＴＰ１Ｂの１８１位のアスパル
ギン酸残基がアラニンで置換され、かつさらに、ＰＴＰチロシン残基が任意にリ
ン酸化され得ない残基により置換される可能性があるＰＴＰ１Ｂ（Ｄ１８１Ａ）
に関する。その他のある態様では、本発明は、ホスファターゼＰＴＰ−ＰＥＳＴ
（Ｄ１９９Ａ）に関し、またその他のある態様では、本発明は、どちらのケース
でもリン酸化され得ない残基により任意に置換されるＰＴＰチロシン残基をさら
に有するＰＴＰ−ＰＥＳＴ（Ｃ２３１Ｓ）に関する。特に好適な態様では、本発
明は、ＰＴＰＨ１（Ｙ６７６Ｆ／Ｄ８１１Ａ）に関する。
【００９８】 上記のように、ある態様では、本発明は、基質捕捉性変異体ＰＴＰ−ＰＥＳＴ
に関する。ＰＴＰ−ＰＥＳＴは、哺乳動物の組織のいたるところで発現しており
（Yiら、1991, Blood 78: 2222-2228 ）、人工のチロシンリン酸化基質を使用し
てｉｎｖｉｔｒｏにて測定すると高い特異的活性を示す（GartonとTonks, 1994,
EMBO J. 13:3763-3771 ）、８６ｋＤａ細胞質ゾルＰＴＰである（Charest ら、
1995, Biochem. J. 308:425-432; den Hertog ら、1992, Biochem. Biophys. Re
s. Commun. 184: 1241-1249; Takekawa ら、1992, Biochem. Biophys. Res. Com
mun. 189: 1223-1230: Yang ら、1993, J. Biol. Chem. 268:6622-6628; Yangら
、1992, J. Biol. Chem. 268: 17650 ）。ＰＴＰ−ＰＥＳＴは、in vitroおよび
in vivo にてＳｅｒ３９のリン酸化による制御を必要とする。この改変物は、プ
ロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）とプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）との両方によ
り触媒され、このＰＴＰにより触媒される脱リン酸反応におけるＫｍの増加によ
りＰＴＰ−ＰＥＳＴ酵素活性の減少をもたらす（GartonとTonks 、1994, EMBO J
. 13:3763-3771）。付加的な細胞内制御メカニズムには、チロシンキナーゼの１
以上の細胞質ゾル基質のＰＴＰ−ＰＥＳＴ媒介脱リン酸化が含まれてもよい。
【００９９】 本明細書に開示され、実施例に説明されるように、ＰＴＰ１ＢおよびＰＴＰＨ
１の基質特異性は、ＰＴＰ触媒および／または基質との結合相互作用、例えば、
脱リン酸化およびin vitroとin vivo における基質捕捉に関する諸方法により特
徴付けることができる。ＰＴＰ１Ｂ（例えば、Barford ら、1994, Science 263:
1397; Jia ら、1995, Science 268:1754を参照）とＰＴＰ１Ｈ（例えば、米国特
許第5,595,911 号明細書および米国特許第第5,863,781 号明細書を参照）は、当
業者には周知のものである。本明細書に提示されている基質捕捉方法は、一般的
に不変ＰＴＰ触媒ドメインアスパラギン酸残基およびＰＴＰアミノ酸配列におけ
るチロシンの頻度により、いかなるＰＴＰにも適用可能であり、したがって、そ
の他のＰＴＰファミリーメンバーの基質優先度を図示する際に有用であることを
証明すべきである。特に、潜在的な能力を有する基質を捕捉し、それにより分離
する、触媒作用が損なわれた変異体ＰＴＰの使用により、個々のＰＴＰの生理学
的に重要な基質の同定が可能になり、細胞プロセスの制御におけるこうした酵素
の役割についての理解を改善することにつながる。さらに、リン酸化され得ない
アミノ酸によるＰＴＰチロシン残基の置換は、チロシンリン酸化タンパク質基質
に相互作用するそれらの能力について損なわれない基質捕捉性変異体ＰＴＰを提
供する。
【０１００】 また、本発明は、（ｉ）野生型ＰＴＰ触媒ドメインの不変のアスパラギン酸残
基が、酵素のＫｍの顕著な変化をもたらさないが、１分あたり１未満（１分-1未
満）までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸（例えば、アラニン残基）と置換
され、かつ（ｉｉ）少なくとも１つの野生型チロシン残基がリン酸化され得ない
アミノ酸（例えば、セリンまたはスレオニンあるいは他の任意の天然またはリン
酸化されるであろう非天然アミノ酸ではない）により置換されるものである基質
捕捉性変異体ＰＴＰを含有した医薬組成物に関する。したがって、本発明のＰＴ
Ｐは、例えば、医薬組成物を調製するための製薬上許容され得る単体または希釈
剤などの製薬上許容され得る基材により処方することが可能である。
【０１０１】 患者への投与に関しては、１以上のポリペプチド（基質捕捉性変異体ＰＴＰを
含む）、核酸分子（基質捕捉性変異体ＰＴＰをコードする組換発現構築物を含む
）および／または調節薬剤（ＰＴＰおよび／または基質捕捉性変異体ＰＴＰと相
互作用する薬剤を含む）が、一般的には、医薬組成物として処方される。医薬組
成物は、付加的に生理学的に許容され得る担体（例えば、活性成分の活性を阻害
しない非毒性材料）を含有した無菌水性あるいは非水性溶液、懸濁液あるいは乳
化剤であってもよい。かかる組成物は、固体、液体または気体（エアゾール）の
形態であってもよい。他方、本発明の組成物は、凍結乾燥剤として処方してもよ
く、あるいは該組成物を周知の技術を使用してリポソーム内にカプセル化しても
よい。また、本発明の範囲内にある医薬組成物には、生物学的に活性あるいは不
活性であり得る他の成分をも含んでもよい。こうした成分としては、限定されな
いが、緩衝液（例えば、中性緩衝生理食塩水あるいはリン酸緩衝化食塩水）、炭
水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースあるいはデキストラン）
、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたは、グリシンなどのアミノ酸、
抗酸化剤、ＥＤＴＡなどのキレート化剤、あるいはグルタチオン、安定剤、染料
、香味料および懸濁剤および／または保存剤などが挙げられる。
【０１０２】 当業者に公知のいかなる適切な担体をも本発明の医薬組成物に用いてもよい。
治療用途の担体は周知のものであり、また、例えば、Remingtons Pharmaceutica
l Sciences. Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro編、1985年刊) に記載されて
いる。一般的には、担体のタイプは、投与形態に基づいて選択される。医薬組成
物は、例えば、局所、経口、経鼻、眼内、くも膜下腔内、直腸内、膣内、舌下ま
たは皮下、静脈内、筋内、胸骨内、尿道管内ないしは尿道内注射あるいは輸液な
どの非経口投与を含むいかなる投与の適当な方法のためにも処方してもよい。非
経口投与に関しては、担体は、好適には、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、
ワックスあるいは緩衝液を含有する。経口投与に関しては、前記担体のいずれか
、またはマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サ
ッカリンナトリウム、タルク、セルロース、カオリン、グリセリン、スターチデ
キストリン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシルメチルセルロース、エチルセ
ルロース、グルコース、スクロースおよび／または炭酸マグネシウムなどの固体
担体を用いることができるであろう。
【０１０３】 医薬組成物（例えば、経口投与または注射による送達）は、液体（例えば、エ
リキシル剤、シロップ、溶液、乳化剤または懸濁剤）の形態であってもよい。液
体医薬組成物としては、例えば、１以上の下記：注射用水、生理食塩水溶液など
の無菌賦形剤、好適には、生理学的生理食塩水、リンゲル溶液、等張性塩化ナト
リウム、溶媒あるいは懸濁液として働く合成モノグリセリドあるいはジグリセリ
ドなどの固定油ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールあ
るいはその他の溶媒、ベンジルアルコールあるいはメチルパラベンなどの抗菌剤
、アスコルビン酸あるいは重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミ
ン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート化剤、酢酸塩、クエン酸塩あるいはリン酸
塩などの緩衝液および塩化ナトリウムあるいはデキストロースなどの緊張度調節
のための薬剤などが挙げられる。非経口製剤は、ガラスあるいはプラスチック製
のアンプル、ディスポーザルシリンジ、または複数投与バイアルの中に封入され
うる。生理学的生理食塩水の使用が好ましく、また、注射可能な医薬組成物は、
好ましくは無菌である。
【０１０４】 本明細書に記載の組成物は、持効性（すなわち、投与後化合物のゆっくりとし
た放出を行なうカプセルまたはスポンジ）に処方されてもよい。かかる組成物は
、一般的には、周知の技術を使用して調製され、例えば、経口、直腸内または皮
下移植により、あるいは望ましい標的部位への移植により投与されてもよい。持
効性製剤には、担体マトリックス内に分散した薬剤および／または速度制御膜に
囲まれたリザーバー内に含まれる薬剤が含まれてもよい。こうした製剤内に使用
される担体は生体適合性のものであり、また、生体分解性のものであってもよい
。好適には、製剤は、活性成分放出の比較的一定したレベルを提供する。持効性
製剤内に含有される活性成分量は移植部位、放出の速度と予想持続時間および治
療されるあるいは予防される状態の性質による。
【０１０５】 基質捕捉性変異体ＰＴＰポリペプチドをコードする核酸分子（ポリペプチドが
生体内で生成されるような）から成る医薬組成物に関しては、その核酸分子は、
核酸、細菌、ウイルスおよび、例えば、本出願に提示されている組換発現構築物
などの哺乳動物発現システムを含めた、当業者には公知のさまざまなデリバリー
システムのいずれかの内に存在し得る。こうした発現システムの中にＤＮＡを組
み込むための技術は当業者には周知のものである。そのＤＮＡは、例えば、Ulme
r ら、Science 259:1745-1749 、1993およびCohen による総括されているScienc
e259:1691-1692, 1993に説明されているように「裸の」ものである。裸のＤＮＡ
の摂取は、効率的に細胞の中に輸送される生体分解性ビーズ上のそのＤＮＡを被
膜することにより増加させ得る。
【０１０６】 医薬組成物内で、基質捕捉性変異体ＰＴＰポリペプチド、核酸分子をコードす
る基質捕捉性変異体ＰＴＰあるいは調節剤が、さまざまな化合物のいずれかとリ
ンクされ得る。例えば、こうしたポリペプチド、核酸分子あるいは薬剤は、その
標的部位へのその薬剤のデリバリーを容易なものにする標的部分（例えば、モノ
クローナル抗体あるいはポリクローナル抗体、タンパク質あるいはリポソーム）
にリンクされ得る。本出願で使用されるとき、「標的部分」という用語は、薬剤
にリンクされるときに、標的細胞あるいは組織に対するその薬剤の輸送を促進し
、それによってその薬剤の局所濃度を増加させるいずれかの物質（化合物あるい
は細胞など）であり得る。標的部分にはその抗体あるいは断片、受容体、リガン
ドおよびその標的組織の細胞にあるいはその標的組織の近傍に結合するその他の
分子が含まれる。抗体標的薬剤は、完全な分子（全体）、その断片、あるいは機
能的に等価なものであり得る。抗体断片の実施例は、通常の諸方法により、ある
いは遺伝子工学あるいはタンパク質工学により産生され得るＦ（ａｂ’）２、−
Ｆａｂ’、ＦａｂおよびＦ［ｖ］断片である。結合は一般的には共有的なもので
あり、また、例えば、直接濃縮あるいはその他の反応、あるいは二官能性あるい
は多官能リンカーにより達成され得るものである。標的部分は、薬剤が治療的恩
恵を奏すると予想される細胞（複数）あるいは組織（複数）に基づいて選択され
得る。
【０１０７】 医薬組成物は、治療対象（あるいは予防対象）疾患に対して適当な方法で投与
され得る。適当な投与量と、適当な持続時間と、投与の頻度はその患者の状態、
その患者の疾患のタイプと重篤度、活性成分の特定の形態および投与方法といっ
たそうした要素により決定されることであろう。一般的には、適当な投与量と治
療処方箋は、治療的および／または予防的恩恵をもたらすのに十分な量で薬剤
（複数）を供給する（例えば、さらに頻繁で完全なあるいは部分的な寛解あるい
は長い期間にわたる疾患からの解放、および／または全生存などの改善された臨
床上のアウトカム）。予防的な用途に関しては、投与は予防するのに十分なもの
であり、細胞シグナル伝達における欠陥、例えば、異常細胞サイクル制御、増殖
、活性化、分化、老化、アポトーシス、接着、代謝活性、遺伝子発現などにつな
がる欠陥に関連している疾患の発症を遅らせ、あるいは疾患の重篤度を軽減させ
るのに十分であるべきものである。
【０１０８】 至適投与量は一般的には、実験的なモデルおよび／または臨床治験を用いて決
定され得る。一般的には、１回の投与に存在するポリペプチドの量、あるいは１
回の投与に存在する、ＤＮＡによる生体内で産生されるペリペプチドの量は、約
０．０１μｇ〜約１００μｇ／宿主のｋｇ体重の範囲であり、また典型的には、
約０．１μｇ〜約１０μｇである。効果的な治療を提供するのに十分な最少投与
量の使用が通常は好ましいものとされる。患者は一般的には、当業者には馴染み
のある、治療あるいは予防される状態に対して適当なアッセイを使用して治療あ
るいは予防上の効果に関してモニターされ得る。適当な投与量は、その患者のサ
イズによりさまざまであるが、典型的には、１０〜６０ｋｇ対象に対して約１ｍ
Ｌ〜約５００ｍＬの範囲である。
【０１０９】 以下の実施例は、本発明を説明する目的で提供され、本発明の範囲を限定する
ように解釈されるべきものではない。本出願に引用されているすべての参考文献
の教示は全体として本出願に組み込まれている。
【０１１０】 実施例 実施例１ 変異体ＰＴＰタンパク質の生成、発現、精製 プラスミド単離；コンピテント細胞の生産；クローニングのための形質転換お
よび関連操作；増幅；組換プラスミド、挿入物、ベクターの構築；塩基配列決定
などは、公表された手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ，ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ
、1989；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９３ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ
．＆ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ．Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）により実
施された。ヒトＰＴＰ−ＰＥＳＴ（Ｇａｒｔｏｎら、１９９４ＥＭＢＯＪ．１３
：３７６３；Ｇａｒｔｏｎら、１９９６Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：６
４０８）およびヒトＰＴＰ−１Ｂ（Ｂｒｏｗｎ−Ｓｈｉｍｅｒら、１９９０Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：５１４８）をコードする組換核
酸発現構築物を、記載のように調製した。
【０１１１】 ＰＴＰの触媒ドメイン内の点変異は、標準的手法、例えば、ＰＴＰ−ＰＥＳＴ
のアミノ酸１９９位の不変アスパラギン酸（Ｄ）を置換変異によってアラニン
（Ａ）に変化させること（Ｄ１９９Ａ）などを用いて導入された。したがって、
ＰＴＰ−ＰＥＳＴ（Ｄ１９９Ａ）、ＰＴＰ−ＰＥＳＴ（Ｃ２３１Ｓ）、ＰＴＰ１
Ｂ（Ｄ１８１Ａ）、ＰＴＰ１Ｂ（Ｃ２１５Ｓ）を生成する変異が、Ｍｕｔａ−Ｇ
ｅｎｅ（商標）ｉｎｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を用い、製造者の指示に従って、部位特異的変異
導入法によって導入された。ついで、この特定の点変異を含む領域を、適切な発
現ベクター内の対応する野生型塩基配列と交換させ、その置換された変異体領域
全体の塩基配列を決定し、追加の変異がないことを証明した。
【０１１２】 全長ＰＴＰ−ＰＥＳＴタンパク質（野生型および変異体タンパク質、Ａｓｐ１
９９からＡｌａへの変異またはＣｙｓ２３１からＳｅｒへの変異のいずれかを含
む）および野生型ＰＴＰ−ＰＥＳＴ触媒ドメイン（アミノ酸１〜３０５）を、組
換バキュロウイルス（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商標）、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、
ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いてＳｆ９細胞に発現させ、Ｇａｒｔｏｎおよび
Ｔｏｎｋｓ（ＥＭＢＯＪ．１３：３７６３−３７７１、１９９４）の記載のよう
に精製した。ＰＴＰ−ＰＥＳＴのアミノ酸残基１〜３０５を含有した野生型およ
び変異体ＰＴＰ−ＰＥＳＴタンパク質の切形型が、ｐＧＥＸベクター（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ．，Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）中におけ
るＧＳＴのＰＴＰ−ＰＥＳＴＤＮＡインフレーム下流のサブクローニング後にＧ
ＳＴ融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現された。適切なベクターで
形質変換された２５ｍｌのＥ．ｃｏｌｉを対数増殖期まで増殖させた （ＯＤ60 0 は約０．５）。ついで、０．２ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシドの添加によって融合タンパク質発現を誘導し、細胞を３０℃で２
〜４時間増殖させた。遠心分離により細胞を回収し、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．４と５ｍＭのＥＤＴＡと１ｍＭのＰＭＳＦと１ｍＭのベンザミジン
と５ｍｇ／ｍｌのロイペプチンと５ｍｇ／ｍｌのアプロチニンと０．１％のＴｒ
ｉｔｏｎＸ−１００と１５０ｍＭのＮａＣｌとを含む３ｍｌの緩衝液中５０μｇ
／ｍｌのリゾチームと共にインキュベートし、超音波処理（３×１０秒）によっ
て溶解させた。遠心分離（３００，０００×ｇで２０分間）によって不溶物質を
除去後、１００ｍｌのグルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ビーズ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ．，Ｕｐｐｓａｌａ、スエーデン）と４℃
で３０分間インキュベーションによって融合タンパク質を分離し、つぎにこれら
のビーズを遠心分離によって集め、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのベンザミジン、１ｍｇ／ｍｌのロイペプ
チン、１ｍｇ／ｍｌのアプロチニン、１０％のグリセロール、１％のＴｒｉｔｏ
ｎＸ−１００および１００ｍＭのＮａＣｌ）で３回洗浄した。この手法によって
本質的に均一な融合タンパク質が、１ｍｇタンパク質／ｍｌグルタチオン−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅビーズの濃度で得られた。アミノ酸１〜３２１を含有したＰＴＰ
１Ｂタンパク質（野生型および変異型）をＥ．ｃｏｌｉに発現させ、均一になる
までＢａｒｆｏｒｄら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３９：７２６−７３０（１９
９４））に記載のように精製した。
【０１１３】 実施例２ ｐ２１０ＢＣＲ：ＡＢＬによるＰＴＰ１Ｂ発現レベルの調節 慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は、第９染色体上のｃ−Ａｂｌプロトオンコジー
ンが第２２染色体上のｂｃｒ遺伝子に結合しているフィラデルフィア染色体（Ｐ
ｈ）により特徴づけられる造血幹細胞のクローン性疾患であるプロテインチロシ
ンキナーゼ（ＰＴＫ）をコードする。これは、ｂｃｒ：ａｂｌ融合タンパク質ｐ
２１０ｂｃｒ：ａｂｌの生成をもたらし、ＰＴＫ活性がｃ−Ａｂｌと比べて増大
される。本実施例は、リン酸化受容性ｐ２１０ｂｃｒ：ａｂｌタンパク質が特異
的にＰＴＰ１Ｂ発現を誘導することを示す。
【０１１４】 温度感受性変異型のｐ２１０ｂｃｒ：ａｂｌを発現するＢａＦ３細胞（Ｊａｉ
ｎら、１９９６Ｂｌｏｏｄ８８：１５４２）を、ＰＴＫ活性を有するｐ２１０の
発現可能な温度までシフトさせた場合、ＰＴＰ１ＢｍＲＮＡおよびタンパク質発
現レベルは、１２〜２４時間以内に増加が観察されたが、これはＰＴＫの活性型
の発生と一致した（例えば、国際公開第９８／０４７１２号明細書；ＬａＭｏｎ
ｔａｇｎｅら、１９９８Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：２９６５などを参
照のこと）。また、ＰＴＰ１Ｂの発現の増加は、ＣＭＬ患者由来のフィラデルフ
ィア染色体−陽性（Ｐｈ＋）Ｂリンパ系細胞でも、同一患者のＰｈ−細胞と対比
して、観察された。酵素タンパク質レベルの変化と同一基準であるＰＴＰ１Ｂ活
性の変化も観察された。これらの変化はＰＴＰ１Ｂに特異的であり、密接な関連
するホモログＴＣ−ＰＴＰ（ＰＴＰ１Ｂと６５％のアミノ酸配列同一性を有する
）またはＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２、ＰＴＰ−ＰＥＳＴなど検討したその他のＰＴ
Ｐ類において見られなかった。ｐ２１０ｂｃｒ：ａｂｌＰＴＫ活性によるＰＴＰ
１Ｂ誘導の特異性は、キナーゼ欠損Ｒａｔ１細胞を用いて確認された（Ｐｅｎｄ
ｅｒｇａｓｔら、１９９３Ｃｅｌｌ７５：１７５）。これらの細胞は、アミノ酸
１１７２位にリジン残基の代わりにアルギニン慙愧を含み、ＰＴＫ活性を欠く不
活性型のｐ２１０ｂｃｒ：ａｂｌを発現する。このｐ２１０変異体のＲａｔ１細
胞における発現は、ＰＴＰ１Ｂ発現レベルを変化させることはできなかった。
【０１１５】 実施例３ ｐ２１０ＢＣＲ：ＡＢＬ結合基質の基質捕捉性ＰＴＰ変異体との相互作用 本実施例は、ＰＴＰ基質を同定するために、基質捕捉性変異体ＰＴＰの基質相
互作用特性の検索について述べるものである。基質捕捉性ＰＴＰポリペプチドお
よび融合タンパク質を実施例１に記載の通り調製した。
【０１１６】 基質捕捉性変異体ＰＴＰポリペプチドまたは融合タンパク質を、様々な細胞系
由来の溶解物と接触させた。簡単に述べれば、細胞溶解物の出発材料としてＨｅ
ＬａおよびＣＯＳ細胞を、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＤｕｌｂｅｃ
ｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。Ｒａｔ１、Ｗｉ３８、
Ｃ２Ｃ１２、およびＭｖＬｕ細胞は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で増殖させた
。２９３細胞は１０％子ウシ血清含有ＤＭＥＭ中で増殖させた。ＭＣＦ１０Ａ細
胞は、５％ウマ血清、２０ｎｇ／ｍｌの表皮成長因子、１０ｍｇ／ｍｌのインシ
ュリン、０．５ｍｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、および０．２５ｍｇ／ｍｌのフ
ァンギゾン(fungizone) を含有する５０％ＤＭＥＭ５０％ＨａｍのＦ−１２中で
増殖させた。ＢａＦ３細胞は既述のようにして維持した（Ｊａｉｎら、１９９６
Ｂｌｏｏｄ８８：１５４２）。どの培地にもペニシリンおよびストレプトマイシ
ンがそれぞれ１００Ｕ／ｍｌおよび１００ｍｇ／ｍｌの濃度で含まれており、ど
の細胞も３７℃で培養した。リン酸カルシウム仲介トランスフェクションを用い
て野生型および変異体ＰＴＰ−ＰＥＳＴタンパク質をコード化するｃＤＮＡをＣ
ＯＳ細胞内に導入した。これらのタンパク質は、プラスミドｐＭＴ２（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）
にサブクローニングされたＰＴＰ−ＰＥＳＴ ｃＤＮＡ（Ｇａｒｔｏｎら、１９
９６Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：６４０８）によってコード化され、こ
のプラスミドｐＭＴ２からの発現はアデノウイルスの主要後期プロモータ(major
late promoter) によって推進された。各細胞プレート１０ｃｍのトランスフェ
クションに２０μｇのＤＮＡを使用した。ＰＴＰ−ＰＥＳＴ構築物の発現のレベ
ルはどの場合も同程度であった。
【０１１７】 細胞溶解の前に、７０〜９０％の融合性細胞培養液を、０．１ｍＭの酸化バナ
ジン酸塩（過バナジン酸塩(pervanadate) ）を含有する培地（１０ｍｌの培地に
添加した５０ｍＭのメタバナジン酸ナトリウム（ＮａＶＯ3 ）および５０ｍＭの
Ｈ2 Ｏ2 を含有する新鮮な溶液２０μｌ）中３０分間処理した。Ｈ2 Ｏ2 および
バナジン酸塩による細胞の処理によって、ホスホチロシン濃度が、おそらく細胞
内ＰＴＰ類がバナジン酸塩によって阻害されるために、相乗作用的に増加する（
Ｈｅｆｆｅｔｚら、１９９０Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２８９６−２９
０２）。過バナジン酸塩処理によって少なくとも５０個の顕著なホスホチロシン
タンパク質バンドがすべての細胞型に出現したが、未処理細胞は実質的に検出で
きない程度のホスホチロシン濃度を含んでいた。
【０１１８】 細胞は、５ｍＭのヨード酢酸含有の緩衝液Ａ（実施例１参照）中で溶解させた
。４℃３０分間のインキュベーション後、ＤＴＴを添加して終濃度１０ｍＭとし
た。つぎに３００，０００×ｇで２０分間の遠心分離により不溶物質を除去した
。その結果得られる溶解物は、−７０℃での長期（数ヶ月）保存中、および４℃
での長時間（少なくとも２０時間）インキュベーション中、外因性の添加ＰＴＰ
の非存在下において、そのホスホチロシン含量に関して安定であった。
【０１１９】 過バナジン酸塩処理ＨｅＬａ細胞溶解物を、ＭｏｎｏＱＦＰＬＣカラム （Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）を用いる陰イオン交換クロマトグラフィーによって分画した
。カラムにかける前に試料（緩衝液Ａ中３ｍｇ／ｍｌ濃度でタンパク質総量５０
ｍｇ）を３倍容の緩衝液Ｂ（２０ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ
のＥＤＴＡ、１ｍＭのベンザミジン、１ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍｇ／ｍ
ｌのアプロチニン、および０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で希釈した。タ
ンパク質は、緩衝液Ｂ中０〜０．５ＭのＮａＣｌのリニアグラジェントで、１ｍ
ｌ／分の流速で２０画分（画分容積は１ｍｌ）にわたって溶出した後、緩衝液Ｂ
中０．５〜１．０ＭのＮａＣｌの第二グラジェントで５画分にわたって溶出した
。ホスホチロシン含有タンパク質は、抗−ホスホチロシン・イムノブロッティン
グによると、画分７〜２１内に検出された。ＰＴＰ１Ｂについても同一方法をお
こなったが、ただし細胞は過バナジン酸塩処理を行わなかった。
【０１２０】 脱リン酸化反応には、チロシンリン酸化タンパク質を含有する過バナジン酸塩
処理したＨｅＬａ細胞の溶解物（タンパク質１〜２ｍｇ／ｍｌ）を、氷上で２ｎ
Ｍの濃度の精製活性ＰＴＰの非存在下または存在下でインキュベートした。脱リ
ン酸化は一定量ずつ（３０μｇタンパク質）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中に
除去することによって終了させ、脱リン酸化の程度を、下記のように生成させた
ホスホチロシン特異的モノクローナル抗体Ｇ１０４を用いるイムノブロッティン
グによって測定した。基質としてチロシンリン酸化32Ｐ標識の、還元され、カル
ボキシアミドメチル化され、マレイル化されたリゾチーム（ＲＣＭ−リゾチーム
）を用いるＰＴＰ活性のアッセイを、Ｆｌｉｎｔら（１９９３、ＥＭＢＯＪ．１
２：１９３７〜１９４６）の記載通りに実施した。
【０１２１】 抗体およびイムノブロッティング：ＰＴＰ−ＰＥＳＴ特異的モノクローナル抗
体ＡＧ２５を、バキュロウイルスが発現した精製全長ＰＴＰ−ＰＥＳＴに対して
産生させた。抗−ホスホチロシンモノクローナル抗体Ｇ１０４は、抗原としてホ
スホチロシン、アラニン、およびグリシンを１：１：１の比率で１−エチル−３
−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドとともにスカシガイのヘモ
シアニンの存在下で重合させたものを用いて産生させたが、これはＫａｍｐｓお
よびＳｅｆｔｏｎが最初に記載された方法である（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２：３０５
−３１５（１９８８））。ｐ１３０cas モノクローナル抗体はＴｒａｎｓｄｕｃ
ｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、Ｋｙ）から入手し
た。ＰＴＰ１Ｂに対するモノクローナル抗体ＦＧ６はＤａｖｉｄＨｉｌｌ博士（
Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から提供された。イムノブロッティングによる
タンパク質の可視化は、ＨＲＰ結合二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｉｌ）および
ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）ＣＬ−ＨＲＰ基質系（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏ
ｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌ）を用いて増強化学ルミネッセンス（ＥＣＬ）によって達成
された。
【０１２２】 免疫沈降および基質捕捉：トランスフェクションしたＣＯＳ細胞からのＰＴＰ
−ＰＥＳＴの免疫沈降は、化学的交差結合剤ピメリミジン酸ジメチル（Ｓｃｈｎ
ｅｉｄｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１０７６６−１０７６９（１
９８２））を用いてプロテインＡ−セファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
ＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ．，Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）にモノクローナル抗
体ＡＧ２５を共有結合させた後に行った。抗体はまずプロテインＡ−セファロー
スに１ｍｇ／ｍｌビーズ容積の濃度で結合させた後、未結合物質を０．２Ｍのホ
ウ酸ナトリウム、ｐＨ９で３回洗浄して除去した。共有結合は、０．２Ｍホウ酸
ナトリウム、ｐＨ９中２０ｍＭのピメリミジン酸ジメチル存在下室温３０分間の
インキュベーションによって達成された。つぎにこれらのビーズを過剰の０．２
Ｍエタノールアミン、ｐＨ８とともに１時間インキュベートして未反応クロスリ
ンキング剤をブロックし、ＰＢＳで３回洗浄後、４℃で保存した。１０μｌのＡ
Ｇ２５ビーズを用いて、約０．３７５ｍｇのタンパク質を含有する溶解物からト
ランスフェクションしたＰＴＰ−ＰＥＳＴを沈降させた。
【０１２３】 基質捕捉は、様々なＰＴＰアフィニティマトリックスを用いて実施した。全長
ＰＴＰ−ＰＥＳＴマトリックスは、精製バキュロウイルス発現ＰＴＰ−ＰＥＳＴ
タンパク質を結合させた共有結合ＡＧ２５−プロテインＡ−セファロースビーズ
を利用した。一定量ずつ（１０μｌ）のＡＧ２５ビーズを、５μｇの精製ＰＴＰ
−ＰＥＳＴ（野生型または変異型）存在下で１００μｌの緩衝液Ａ中４℃で２時
間インキュベートした。つぎに１ｍｌの緩衝液Ａで３回洗浄することによって未
結合ＰＴＰ−ＰＥＳＴを除去した。その結果得られたＰＴＰ−ＰＥＳＴ−ＡＧ２
５プロテインＡ−セファロースビーズは、１０ｍｌについて約２ｍｇのＰＴＰ−
ＰＥＳＴを含有した。基質捕捉は、ＰＴＰ−ＰＥＳＴの触媒ドメインを含有する
細菌発現ＧＳＴ融合タンパク質に結合させたグルタチオン−セファロースビーズ
を用いても行った。
【０１２４】 ＰＴＰ１Ｂも基質捕捉実験に使用した。この場合、モノクローナル抗体ＦＧ６
を、クロスリンキング剤なしでプロテインＡ−セファロースにあらかじめ結合さ
せ（２μｇ抗体／１０μｌビーズ）、つぎに精製ＰＴＰ１Ｂタンパク質を過剰に
添加し、４℃で２時間インキュベートした。未結合ＰＴＰ１Ｂの除去後、１０μ
ｌのビーズは約２μｇのＰＴＰ１Ｂを含有した。
【０１２５】 過バナジン酸塩処理細胞溶解物、またはカラム画分を、基質捕捉実験のために
ホスホチロシン含有タンパク質の起源として使用した。一般に、０．５ｍｌの緩
衝液Ａ（５ｍＭのヨード酢酸、１０ｍＭのＤＴＴを含む）中０．２５〜０．５ｍ
ｇのタンパク質を含有する溶解物を、約２μｇの適切なＰＴＰタンパク質を含有
する１０μｌのアフィニティマトリックス中４℃で２時間インキュベートした。
つぎに未結合タンパク質を１ｍｌの緩衝液Ａで３回洗浄することによって試料か
ら除去し、結合物質は５０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液の添加によって採
取した後、９５℃５分間加熱した。つぎにビーズに結合したタンパク質を、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ後、イムノブロッティングにより分析した。
【０１２６】 ＣＯＳ細胞における一時的同時トランスフェクション実験では、ＰＴＰ１Ｂは
ｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌを脱リン酸化するが、ｖ−ａｂｌの脱リン酸化は行わ
ない。ＰＴＰ１Ｂ（Ｄ１８１Ａ）変異体をＧＳＴ融合タンパク質として発現させ
、精製し、Ｍｏ７−ｐ２１０細胞（ｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌを過剰発現する）
の溶解物とインキュベートしたとき、変異体ＰＴＰとｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌ
の複合体が分離された。これに対して、チロシンリン酸化ｃ−ａｂｌも上記溶解
物中に存在するが、これは変異体ＰＴＰに結合しなかった。ＰＴＰ１Ｂ（Ｄ１８
１Ａ）とｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌとの相互作用はバナジン酸塩でブロックされ
たが、これはこの相互作用にはＰＴＰの活性部位が関与していることを示唆する
所見である。
【０１２７】 ＣＯＳ細胞における一過性共発現後、ＰＴＰ１Ｂ（Ｄ１８１Ａ）はｐ２１０
ｂｃｒ：ａｂｌと複合体を形成した。ｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌのＹ１７７Ｆ変
異体はＰＴＰ１Ｂ（Ｄ１８１Ａ）と相互作用を行わなかったが、これはこのチロ
シン残基がＰＴＫにおける結合部位の一成分であることを示唆している。ｐ２１
０ｂｃｒ：ａｂｌ中のこのチロシン残基はインビボでリン酸化され、ＧＲＢ２に
対するドッキング部位として働くことが証明された（Ｐｅｎｄｅｒｇａｓｔら、
１９９３Ｃｅｌｌ７５：１７５）。ｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌ中のｐＴｙｒとＧ
ＲＢ２のＳＨ２ドメインとの直接相互作用は、ＰＴＫの形質転換活性にとって必
須である。ＰＴＰ１Ｂ（Ｄ１８１Ａ）とｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌとの相互作用
はＰＴＫのＧＲＢ２との会合を妨害する。以上をすべてを考慮に入れれば、これ
らのデータは、ｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌがＰＴＰ１Ｂの生理学的基質であるこ
と、ＰＴＰ１Ｂはインビボで癌タンパク質ＰＴＫの拮抗剤として機能することを
示唆している。ＲＣＭＬに対する３７ｋＤａのＰＴＰ１Ｂ変異体のＶｍａｘ、Ｋ
ｍ、Ｋｃａｔを図２に示す。
【０１２８】 ＰＴＰ１ＢおよびＥＧＦ受容体：ＣＯＳ細胞においてＰＴＰ１Ｂ（Ｄ１８１Ａ
）が発現されると、１８０ｋＤａタンパク質中ならびに１２０および７０ｋＤａ
のタンパク質中のチロシル残基のリン酸化が増強する。ＧＳＴ−ＰＴＰ１Ｂ（Ｄ
１８１Ａ）融合タンパク質をＣＯＳ細胞で発現させグルタチオン−セファロース
（登録商標）上に沈降させる場合は、この１８０ｋＤａおよびこれより少量のｐ
１２０およびｐ７０は同時沈降した。ｐ１８０タンパク質はイムノブロッティン
グによって表皮成長因子（ＥＧＦ）受容体であると同定された。しかしｐ１２０
およびｐ７０タンパク質の実体は不明であり、後者はｓｒｃ，ｐ６０でもパキシ
リン(paxillin)でもない。
【０１２９】 ＣＯＳ細胞中ＰＴＰ１Ｂ（Ｄ１８１Ａ）の発現によって、そのリガンドである
ＥＧＦの不在下でＥＧＦ受容体のチロシンのリン酸化が誘導されるが、これは、
変異体ＰＴＰが未変化細胞ではその作用を行うが、溶解後には行わないことを示
している。１９９位の該当するアスパラギン酸をアラニンで置換した等量のＰＴ
Ｐ−ＰＥＳＴ（Ｄ１９９Ａ）変異体はＥＧＦ受容体とは相互作用をせず、この所
見はこの基質相互作用の特異性を表している。
【０１３０】 ＥＧＦ受容体の自己リン酸化がＰＴＰ１Ｂ（Ｄ１８１Ａ）との相互作用には必
要である。キナーゼが作動しないか、または自動リン酸化部位が欠失してしまっ
ているような受容体変異体は、ＰＴＰ１Ｂ（Ｄ１８１Ａ）と相互作用を行わない
。ｖ−ｓｒｃ発現細胞では、チロシンリン酸化タンパク質が過剰に観察されたが
、ＥＧＦ受容体のリン酸化は検出されなかった。このような条件下では、ＰＴＰ
１Ｂ Ｄ１８１Ａは圧倒的に７０ｋＤａのチロシンリン酸化タンパク質に結合し
、したがってＰＴＰ１ＢはＥＧＦ誘導シグナル伝達経路を調節することができる
ようである。
【０１３１】 実施例４ ＰＴＰ−ＰＥＳＴは１３０ｋＤａホスホチロシン含有タンパク質を優先的に脱リ
ン酸化する ＰＴＰ−ＰＥＳＴのインビトロでの基質特異性を検索するために、一定量の過
バナジン酸塩処理ＨｅＬａ細胞溶解物を氷上でインキュベートしたところ、モノ
クローナル抗−ホスホチロシン抗体Ｇ１０４を用いた細胞溶解物のイムノブロッ
ティングによる判定によれば、５０〜１００のはっきり見分けられるホスホチロ
シン含有タンパクが生成した。つぎに、精製全長ＰＴＰ−ＰＥＳＴ（組換えバキ
ュロウイルスを用いてＳｆ９細胞に発現させたもの）、ＰＴＰ−ＰＥＳＴ触媒ド
メイン、またはＰＴＰ１Ｂ触媒ドメイン（３７ｋＤａ型）のいずれかを上記溶解
物に添加し、一定量ずつを様々な時点で取出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析後
、抗−ホスホチロシンイムノブロッティングを行った。
【０１３２】 意外にも、顕著な１３０ｋＤａホスホチロシンバンド（ｐ１３０）は１０分以
内にＰＴＰ−ＰＥＳＴによって選択的に脱リン酸化されたが、その他の全バンド
の強度は６０分間のＰＴＰ−ＰＥＳＴとのインキュベーション後も実質上不変で
あった。これより高い濃度のＰＴＰ−ＰＥＳＴ（１００倍以上）との長時間イン
キュベーションの結果、すべてのホスホチロシンバンドは溶解物から完全に除か
れた。しかし、検索したすべての条件下で、ｐ１３０はその他のすべての存在バ
ンドよりも迅速に脱リン酸化されることが判明した。
【０１３３】 ＰＴＰ−ＰＥＳＴによるｐ１３０の選択的脱リン酸化は、実質上該酵素の触媒
ドメインのみを含有する短縮型のホスファターゼ（アミノ酸残基１〜３０５）を
用いた場合にも観察された。この結果は、今回の分析でＰＴＰ−ＰＥＳＴによっ
て示された顕著な基質選択性はホスファターゼ触媒ドメインの固有の性質であり
、一方、Ｃ−末端の５００個のアミノ酸残基は該酵素の基質特異性に対して検出
できるような影響をほとんど持たないことを示唆している。
【０１３４】 ＰＴＰ−ＰＥＳＴとｐ１３０との相互作用の特異性を、脱リン酸化反応におけ
るＰＴＰ１Ｂの触媒ドメイン（アミノ酸残基１〜３２１）を用いて検索した。Ｐ
ＴＰ−ＰＥＳＴで使用したものと同様なモル濃度で添加した場合、ＰＴＰ１Ｂは
過バナジン酸塩処理ＨｅＬａ溶解物中に存在するホスホチロシン含有タンパク質
のほとんどを完全にかつ迅速に（１５分以内）脱リン酸化することが認められた
。さらに、ｐ１３０の脱リン酸化の経時的変化は、ＰＴＰ１Ｂによって脱リン酸
化された他のホスホチロシンバンドの脱リン酸化よりも有意に迅速であるという
ことはなかった。したがって、任意の基質の利用性が異なり、単離されたＰＴＰ
触媒サブユニットの特性が明らかになっている場合は、インビトロとインビボに
おけるＰＴＰ１Ｂ基質特異性の範囲は異なることがありうる。
【０１３５】 実施例５ 基質捕捉によるＰＴＰ−ＰＥＳＴの１３０ｋＤａ基質の同定 本実施例は、ある細胞溶解物中のＰＴＰ基質を同定するために、アフィニティ
マトリックスにおける基質捕捉性変異体ＰＴＰの使用について述べる。基質捕捉
性ＰＴＰアフィニティマトリックスの調製のために、ＰＴＰ−ＰＥＳＴの変異型
（Ｄ１９９Ａ）を、部位特異的変異導入法によって生成させ、この変異体酵素を
、組換えバキュロウイルスを用いて発現後精製した。チロシンリン酸化ＲＣＭ−
リゾチームを基質として使用して分析すると、この精製変異体酵素は、野生型酵
素の約１０，０００分の１の特異的活性を示した。この精製タンパク質を、プロ
テインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズに共有結合させた抗−ＰＴＰ−ＰＥＳＴモ
ノクローナル抗体（ＡＧ２５）からなるアフィニティマトリックスに結合させ、
つぎに実施例３に述べたようにしてＨｅＬａ細胞溶解物から調製したＭｏｎｏＱ
画分のそれぞれとインキュベートした。
【０１３６】 過バナジン酸塩処理ＨｅＬａ細胞溶解物を陰イオン交換クロマトグラフィによ
って分画し（実施例３）、一定量ずつの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後抗−ホスホチ
ロシンまたは抗−ｐ１３０cas 抗体を用いるイムノブロッティングによって分析
した。つぎに、分析したすべての試料の一定量ずつについて、Ａｓｐ１９９がア
ラニンに変化している全長ＰＴＰ−ＰＥＳＴ（Ｄ１９９Ａ）を、共有結合させた
プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ／抗体（ＡＧ２５）ビーズに結合させたもの
から成る基質捕捉性ＰＴＰ−ＰＥＳＴ変異体を含有するアフィニティマトリック
スとともにインキュベートした。４５分間インキュベーション後、変異体ＰＴＰ
−ＰＥＳＴと会合するタンパク質を遠心により採取し、ビーズを洗浄し、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ試料緩衝液を添加した。つぎに、会合したタンパク質をモノクローナ
ル抗−ホスホチロシン抗体Ｇ１０４を用いるイムノブロッティングによって分析
した。ＰＴＰ−ＰＥＳＴと会合したタンパク質をつぎにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
、ついで抗−ホスホチロシンまたは抗−ｐ１３０cas 抗体を用いるイムノブロッ
ティングによって分析した。
【０１３７】 これらのカラム画分の抗−ホスホチロシンイムノブロッティングによると、ｐ
１３０ホスホチロシンバンドは画分１１〜１４（約０．３ＭのＮａＣｌ）に単一
ピークとして溶出することが示された。ＨｅＬａ溶解物中にチロシンがリン酸化
したｐ１３０が多量にあることを考えれば、ｐ１３０は以前に同定されたホスホ
チロシンを含有する１３０ｋＤａタンパク質であろうと思われる。いくつかの可
能性のある候補物質が文献中に見られ、フォーカルアドヒージョンキナーゼｐ１
２５FAK 、ｒａｓ−ＧＡＰ、ｇｐ１３０、ｐ１３０cas などがある。これらの候
補物質のうち、ｐ１３０cas が、多種多様な系の特に顕著なホスホチロシンバン
ドであると同定されており、たとえばｖ−ｃｒｋ（ＭａｙｅｒおよびＨａｎａｆ
ｕｓａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２６３８−２６
４２（１９９０）；Ｍａｙｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ３３２：２７２−２７５（１９
８８）およびｓｒｃ（Ｋａｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ８７：３３２８−３３３２（１９９０）；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、Ｍｏｌ
．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：３９５１−３９５８（１９８９））形質転換線維芽
細胞、インテグリン仲介細胞接着（Ｎｏｊｉｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７０：１５３９８−１５４０２（１９９５）；Ｐｅｔｃｈら、Ｊ．ＣｅｌｌＳ
ｃｉｅｎｃｅ１０８：１３７１−１３７９（１９９５）；ＶｕｏｒｉおよびＲｕ
ｏｓｌａｈｔｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２２２５９−２２２６２（
１９９５））およびＰＤＧＦ刺激３Ｔ３細胞（ＲａｎｋｉｎおよびＲｏｚｅｎｇ
ｕｒｔ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：７０４−７１０（１９９４））など
が挙げられる。
【０１３８】 したがって、ｐ１３０ホスホチロシンバンドがｐ１３０cas に該当するという
可能性を、ｐ１３０cas に対する抗体を用いてＭｏｎｏＱ画分のイムノブロッテ
ィングによって検討した。ｐ１３０cas に該当する１３０ｋＤａバンドはｐ１３
０チロシンリン酸化バンドと同じ画分に溶出し、みかけの分子量はほぼ同じであ
ったため、これらは同一のタンパク質であると考えられる。さらに、これらの画
分から免疫沈降させたｐ１３０cas はチロシル残基にリン酸化されていることが
判明した。
【０１３９】 変異体ＰＴＰ−ＰＥＳＴタンパク質は、分子量（１３０ｋＤａ）とＭｏｎｏ
Ｑ溶出位置（画分１１〜１４）がｐ１３０cas と一致する単一のホスホチロシン
含有タンパク質と会合することが判明した。ｐ１３０cas 抗体を用いたこのＰＴ
Ｐ−ＰＥＳＴ会合タンパク質のイムノブロッティングにより、変異体ＰＴＰ−Ｐ
ＥＳＴによって捕捉された１３０ｋＤａのチロシンリン酸化タンパク質は実際に
ｐ１３０cas であることが証明された。したがってｐ１３０cas はＰＴＰ−ＰＥ
ＳＴにとって生理学的に関連する基質であると思われる。
【０１４０】 チロシンリン酸化ｐ１３０cas との特異的相互作用におけるＰＴＰ−ＰＥＳＴ の構造的特徴 ：Ｐ１３０cas とＰＴＰ−ＰＥＳＴとの相互作用を、過バナジン酸
塩処理ＨｅＬａ溶解物からタンパク質を沈降させるために様々な精製変異型ＰＴ
Ｐ−ＰＥＳＴを用いる基質捕捉実験においてさらに検索した。いくつかのアフィ
ニティマトリックスを過バナジン酸塩処理ＨｅＬａ細胞溶解物とインキュベート
し、ビーズと会合させたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、抗−ホスホチロシ
ンまたは抗−ｐ１３０cas 抗体を用いるイムノブロッティングによって分析した
。
【０１４１】 野生型全長ホスファターゼはチロシンリン酸化ｐ１３０cas と安定な会合はで
きないことが判明したが、ＰＴＰ−ＰＥＳＴ（Ｄ１９１Ａ）変異体タンパク質も
、活性部位システイン残基のない変異体（Ｃ２３１Ｓ）も、溶解物からｐ１３０ cas を特異的に沈降させた。野生型ホスファターゼが、チロシンリン酸化ｐ１３
０cas を沈降できないのは、おそらく、ＰＴＰ−ＰＥＳＴとチロシンリン酸化ｐ
１３０cas との正常な相互作用が一時的なものであることを反映していると思わ
れ、この相互作用はｐ１３０cas がＰＴＰ−ＰＥＳＴによって脱リン酸化される
と直ちに終結すると思われる。
【０１４２】 ＰＴＰ−ＰＥＳＴのＣ末端の５００のアミノ酸は、ｓｒｃ相同性−３（ＳＨ３
）ドメイン結合配列に類似するいくつかのプロリンに富む領域を含有するため、
ＰＴＰ−ＰＥＳＴとｐ１３０cas との相互作用の特異性は、これらのセグメント
の、ｐ１３０cas のＳＨ３ドメインとの会合にある程度依存性のようであった。
したがって、ＰＴＰ−ＰＥＳＴのＣ末端セグメントが、観察されたｐ１３０cas とのＰＴＰ−ＰＥＳＴの特異的相互作用に関与している可能性について、野生型
および変異体（Ｄ１９９Ａ）型両者のＰＴＰ−ＰＥＳＴの触媒ドメインのみを含
むＧＳＴ融合タンパク質を用いる基質捕捉実験をさらに行って、検索した。ＧＳ
Ｔに融合させたＰＴＰ−ＰＥＳＴ変異体触媒ドメインは、ｐ１３０cas ホスホチ
ロシンバンドを特異的に沈降させることが判明したが、野生型融合タンパク質も
ＧＳＴ単独もｐ１３０cas を沈降させることはできなかった。したがって、これ
らの実験で観察されたＰＴＰ−ＰＥＳＴとｐ１３０cas との特異的相互作用は、
ＰＴＰ−ＰＥＳＴの触媒ドメインの固有の性質であると思われ、ｐ１３０cas の
インビトロ脱リン酸化に活性なＰＴＰ−ＰＥＳＴ触媒ドメインの観察された選択
性に匹敵する。
【０１４３】 変異体ＰＴＰ−ＰＥＳＴとチロシンリン酸化ｐ１３０cas との相互作用の特異 性 ：過バナジン酸塩処理ＨｅＬａ細胞溶解物中にチロシンリン酸化ｐ１３０cas が比較的豊富にあることから考えて、観察されたＰＴＰ−ＰＥＳＴ不活性変異体
タンパク質のｐ１３０cas への選択的結合が、酵素指向性（ＰＴＰ−ＰＥＳＴの
真の基質選択性を反映する）というよりも、基質指向性（上記溶解物中に存在す
る他のホスホチロシン含有タンパク質に比べてこの潜在的基質が豊富にあること
を反映する）である可能性が考えられた。この可能性について２通りの方法で検
討した。まず、ＰＴＰ１Ｂの触媒ドメインの不活性変異型を用いて、この酵素の
基質となると思われる物質を過バナジン酸塩処理ＨｅＬａ溶解物から捕捉した。
やはり、野生型ホスファターゼはどのホスホチロシン含有タンパク質とも安定な
相互作用を行うことができないことが判明し、一方、ＰＴＰ１Ｂホスファターゼ
ドメインの変異体バリアント（ＰＴＰ−ＰＥＳＴについて上記のものと類似した
ＣｙｓまたはＡｓｐ突然変異を含有する）は多くのチロシンリン酸化タンパク質
と会合した。これはとくにＰＴＰ１Ｂのアスパラギン酸変異体（Ｄ１８１Ａ）に
ついて明確であり、これは実質上すべてのホスホチロシン含有タンパク質を、ほ
ぼ同じ程度の有効性で、溶解物から沈降させるようであった。これらのデータは
、ＰＴＰ−ＰＥＳＴとｐ１３０cas との相互作用の特異性を強調しており、これ
はすべてのＰＴＰ触媒ドメインが共有している特徴というよりも、ＰＴＰ−ＰＥ
ＳＴ触媒ドメインに特有の性質のようである。
【０１４４】 ＰＴＰ−ＰＥＳＴとｐ１３０cas との相互作用の特異性について、それぞれチ
ロシンリン酸化タンパク質の異なる配列を有するいくつかの異なる細胞系（Ｗ１
３８、２９３、ＣＯＳ、ＭＣＦ１０Ａ、Ｃ２Ｃ１２、ＭｖＬｕ）の過バナジン酸
塩処理後さらに検討した。得られた溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、抗−ホスホ
チロシンイムノブロッティングによって分析した。一定量ずつをＰＴＰ−ＰＥＳ
Ｔ（Ｄ１９９Ａ）アフィニティマトリックスまたは対照マトリックスとインキュ
ベートし、ＰＴＰ−ＰＥＳＴと会合しているチロシンリン酸化タンパク質を、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥと、抗−ホスホチロシンまたは抗−ｐ１３０cas 抗体を用いるイ
ムノブロッティングによって上記のように分析した。
【０１４５】 いずれの場合も、Ｄ１９９Ａ変異体ＰＴＰ−ＰＥＳＴタンパク質は様々な細胞
系において１２０〜１５０ｋＤａのみかけの分子量を持った単一の広いホスホチ
ロシンバンドを沈降させたが、アフィニティマトリックス単独ではホスホチロシ
ン含有タンパク質を沈降させることはできなかった。この沈降物のｐ１３０cas 抗体によるイムノブロッティングを行ったところ、すべての細胞溶解物から沈降
したタンパク質はｐ１３０cas に該当することが判明した。細胞系によって分子
量が異なることが観察されたが、これはおそらく、ｐ１３０cas の分子量が種に
よって異なること、または択一的スプライシングを受けた様々な型が発現される
ことを反映しているのであろう（Ｓａｋａｉら、ＥＭＢＯＪ．１３：３７４８−
３７５６（１９９４））。
【０１４６】 ＰＴＰ−ＰＥＳＴ沈降物中のチロシンリン酸化ｐ１３０cas の相対的含量は、
溶解物中のｐ１３０cas タンパク質の含量にほぼ相関関係を示すようであった（
データは掲載せず）。意外にも、溶解物中のチロシンリン酸化ｐ１３０cas の含
量に関係なく、ｐ１３０cas タンパク質をほとんど含まないが他のチロシンが豊
富にリン酸化された多種多様なタンパク質を示す２９３細胞溶解物においても、
ｐ１３０cas が常に沈降物中の唯一のホスホチロシン含有タンパク質であった。
同様に、過バナジン酸塩処理２９３細胞の溶解物（溶解物の抗−ホスホチロシン
イムノブロッティングでも検出できない量で、チロシンリン酸化ｐ１３０cas を
含む）を活性なＰＴＰ−ＰＥＳＴとインキュベートしたとき、どのホスホチロシ
ンバンドでも認められるほどの脱リン酸化は起こらなかった（Ｇａｒｔｏｎおよ
びＴｏｎｋｓ、未発表データ）。これらの結果は、ＰＴＰ−ＰＥＳＴのｐ１３０ cas に対する親和力は、存在する他のどのような基質に対するよりもかなり大き
いことを示し、ＰＴＰ−ＰＥＳＴのｐ１３０cas に対する顕著な基質選択性をい
っそう強調するものである。
【０１４７】 チロシンリン酸化ｐ１３０cas と変異体ＰＴＰ−ＰＥＳＴとの会合のバナジン 酸塩による阻害 ：不活性な変異体ＰＴＰ−ＰＥＳＴとは対照的に、野生型酵素は
チロシンリン酸化ｐ１３０cas と安定な複合体として会合することはできないと
いうことが一貫して観察され、これは、観察された会合は活性部位指向性である
ことを示唆している。この可能性を検討するために、過バナジン酸塩処理ＨｅＬ
ａ細胞溶解物に添加する前に、変異体ＰＴＰ−ＰＥＳＴ（Ｄ１９９Ａ）を様々な
濃度でＰＴＰ阻害剤バナジン酸塩とインキュベートした（Ｄｅｎｕら、１９９６
Ｐｒｏｃ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：２４９３−２４９８
）。つぎに、ｐ１３０cas のＰＴＰ−ＰＥＳＴとの会合の程度を分析した。共有
結合させたプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ／抗体（ＡＧ２５）ビーズに全長
ＰＴＰ−ＰＥＳＴ（Ｄ１９９Ａ）を結合させたものから成るＰＴＰ−ＰＥＳＴア
フィニティマトリックスを、様々な濃度のオルトバナジン酸ナトリウム存在下、
氷上で１０分間インキュベートした。つぎに試料を一定量の過バナジン酸塩処理
ＨｅＬａ細胞溶解物とインキュベートした。会合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥおよび抗−ホスホチロシンまたは抗−ｐ１３０cas 抗体を用いるイムノブロ
ッティングで分析した。野生型ＰＴＰ−ＰＥＳＴの活性も、同一条件下で、チロ
シンリン酸化32Ｐ標識ＲＣＭ−リゾチームを基質として用いて測定した。
【０１４８】 会合は、バナジン酸塩によって強力に破壊され、この破壊は野生型ＰＴＰ−Ｐ
ＥＳＴのバナジン酸塩阻害と同様の濃度依存性を示し、完全な破壊は１０ｍＭの
バナジン酸塩で観察されることが判明した。
【０１４９】 実施例６ ＣＯＳ細胞における内因性ｐ１３０CAS とトランスフェクトされた変異体ＰＴＰ
−ＰＥＳＴの会合 上記の実験は、ｐ１３０cas がPTP-PESTの生理条件下での基質を代表するもの
であることを強く示唆している。完全な細胞の中でPTP-PESTがｐ１３０cas と相
互作用するか否かを測定するため、PTP-PESTの野生型または基質捕捉性変異体
（D199A またはC231S ）をコードするプラスミドでCOS 細胞を形質転換した。こ
の細胞を溶解する前に過バナジン酸で30分間処理した。PTP-PESTタンパク質を免
疫沈降し、得られた沈殿物を抗−ホスホチロシン免疫ブロッティングして、会合
しているチロシンリン酸化タンパク質を解析した。また、細胞溶解物を共有結合
したプロテインＡ−セファロース／抗PTP-PEST（AG25）ビーズとインキュベート
して、会合したタンパク質をSDS-PAGE、および抗−ホスホチロシン抗体による免
疫ブロッティングによって解析した。
【０１５０】 これらの条件下で、再び、C231S PTP-PESTタンパク質と結合することができた
のは、ｐ１３０cas に相当するホスホチロシンを含むバンドだけであったため、
基質となりうるものが別に多数あるときに細胞内において、PTP-PESTが基質とし
てｐ１３０cas を特異的に選択できることが示された。過バナジン酸処理したCO
S 細胞においては、PTP-PESTの野生型もD199A 型も、チロシンリン酸化ｐ１３０ cas と安定に相互作用することができなかった。
【０１５１】 これらの条件下では、PTP-PESTの活性部位であるシステイン残基に結合された
過バナジン酸が存在しているため、ｐ１３０cas のホスホチロシン残基の結合が
効率よく排除されてしまい、PTP-PESTの野生型およびD199A 型とも、チロシンリ
ン酸化ｐ１３０cas への結合が阻害されるという可能性がもっとも高い（Denuら
、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2493-2498 (1996) ）。C231S 変異体PTP-PE
STが、過バナジン酸存在下でｐ１３０cas と結合して安定した複合体になりうる
ことは、この変異体タンパク質が過バナジン酸による影響をほとんど受けないこ
とを示唆しており、通常の形態である、バナジン酸イオンによるPTP の阻害とい
うのは、バナジン酸と、PTP の活性部位であるシステイン残基のチオールアニオ
ンとの間の直接的な相互作用に決定的に依存していることを示している。したが
って、これらの観察結果から、PTP-PESTとｐ１３０cas の間に、専らPTP-PESTの
活性部位に関係すると思われる排他的な相互作用が存在することがさらに裏付け
られ、それによって、PTP-PESTのｐ１３０cas に対する生理学的に非常に限定的
な基質選択性が結果に反映されている。
【０１５２】 実施例７ 基質捕捉性PTP 変異体の調製 基質と相互作用して安定した複合体となりうる変異型PTP の作製は、実質的に
、（Flint ら、1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1680; Garton ら、1996
, Mol. Cell. Biol. 16:6408; Tiganis ら、1997 J. Biol. Chem. 272: 21548;
PCT US97/13016も参照のこと）に記載されている。プラスミド単離、コンピテン
トセルの製造、形質転換、およびM13 の操作は、公開された方法に従った（Samb
rookら、Molecular Cloning, a Laboratory Manual、ニューヨーク州コールドス
プリングハーバーにあるコールドスプリングハーバー研究所出版（Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ）1989年）。DNA 断片の精
製は、QIAGEN社（カリフォルニア州チャッツワース（Chatsworth））から購入し
たQIAEX （登録商標）キットを用いて行なった。さまざまな構築物の配列決定は
、製造業者の説明に従って、Sequenase （登録商標）キット（ニュージャージー
州ピスカタウエイ（Piscataway, NJ）のアマーシャム−ファルマシア社（Amersh
am-Pharmacia））を用いて行なった。制限酵素と修飾酵素は、ロシュモレキュラ
ーバイオケミカルズ社（Roche Molecular Biochemicals）（インディアナ州イン
ディアナポリス（Inndianapolis, IN ））およびニューイングランドバイオラブ
ズ社（New England Biolabs ）（マサチューセッツ州ビバリー（Beverly, MA ）
）から購入した。
【０１５３】 簡単に説明すると、pBlueScript プラスミド（カリフォルニア州ラホヤ（LaJo
lla, CA ）のストラタジーン社（Stratagene））にライゲーションされたヒトPT
PH1 のcDNA（米国特許第5,595,911 号明細書）を、部位特異的変異導入法により
、製造業者の説明に従って、Muta-Gene （登録商標）（カリフォルニア州ハーキ
ュリー（Hercules, CA）のバイオラド社（Bio-Rad Inc.））を使用して変異させ
た。842 位のシステインをセリンにインビトロで変異させるために使用したオリ
ゴヌクレオチドは、 CCT AGT TCA CTC CAG TGC TGG AAT AG 配列番号：３７ であり、PTPH1 の2537〜2562に相当している。811 位のアスパラギン酸をアラニ
ンに変異させるためのオリゴヌクレオチドは、 GCA TGG CCT GCC CAC GGT GTG C 配列番号：３８ であり、PTPH1 のヌクレオチド2445〜2466に相当している。変異した複製型DNA
を大腸菌（E. coli ）の菌株DH10B （カリフォルニア州ラホヤ（LaJolla, CA ）
のストラタジーン社（Stratagene））に形質転換し、変異を確認するため、コロ
ニーを拾い、製造業者の説明に従って、Sequenase （登録商標）キット（ニュー
ジャージー州ピスカタウエイ（Piscataway, NJ）のアマーシャム−ファルマシア
社 （Amersham-Pharmacia））を用いてジデオキシ法による配列決定を行なった
。PTP 触媒ドメイン（634 〜913 のアミノ酸残基）をコードする野生型と変異型
のPTPH1 遺伝子部位をインフレームで、発現ベクターpGEX（ニュージャージー州
ピスカタウエイ（Piscataway, NJ）のアマーシャム−ファルマシア社（Amersham
-Pharmacia））に連結して、３種類のグルタチオン- Ｓ- トランスフェラーゼ（
GST ）融合タンパク質をコードする配列：GST-PTPH1 （野生型）、GST-PTPH1 （
D811A ）およびGST-PTPH1 （C842S ）を作製した。GST-PTPH1 融合タンパク質を
大腸菌で発現させ、製造業者のプロトコルに従って、Sepharose （登録商標）ビ
ーズ（ニュージャージー州ピスカタウエイ（Piscataway, NJ）のファルマシア社
（Pharmacia ））上に固定されたグルタチオンへのアフィニティー結合によっ
て精製を行なった。
【０１５４】 あるいは、哺乳動物細胞のトランスフェクションに使用される上記のような野
生型と変異型のPTPH1 構築物を、HAエピトープをコードする核酸配列によってＣ
末端側をコードする配列によるタグを付けた。このHAタグは、インフルエンザの
血球凝集素タンパク質に由来する、抗体規定エピトープ： SYPYDVPDYAS 配列番号：３９ に対応している（Wilsonら、1984、Cell 37: 767）。
【０１５５】 DNA 配列決定によって確認した後、これらの構築物をベクターpCDNA3（カリフ
ォルニア州カールズバッド（Carlsbad, CA）のインビトロジェン社（インビトロ
gen ））およびレトロウイルスベクターpBSTR1（マサチューセッツ州ボストンの
マサチューセッツ総合病院(Massachusetts General Hospital, Boston, MA)のS.
Reeves ）中にクロニーングした。
【０１５６】 上記したような部位特異的変異導入法により、PTPH1 のヌクレオチド2034〜20
70に相当するオリゴヌクレオチド： TTG GAC AAA AAC CGA TTT AAA GAT GTG CTG CCT TAT G 配列番号：４０ を用いて、GST-PTPH1 （D811A ）変異体構築物をさらに改変し、保存されたPTP
触媒部位である676 位のチロシン残基をフェニルアラニンに置換した二重変異体
（Y676F/D811A ）を作製した。
【０１５７】 実施例８ トランスフェクト細胞における、PTPH1 発現の細胞増殖に対する影響 本実施例では、トランスフェクトされたPTPH1 遺伝子を培養細胞で過剰発現さ
せると、細胞増殖が著しく阻害されるが、トランスフェクトされた変異型基質捕
捉性PTPH1 遺伝子を過剰発現させた場合には阻害が起こらないことを示すもので
ある。
【０１５８】 レトロウイルス遺伝子送達系を用いて、テトラサイクリン抑制型プロモーター
の調節下で野生型または基質捕捉性変異体PTPH1 GST 融合タンパク質（実施例７
参照）を発現する、安定したNIH3T3細胞株を構築した（Paulusら、1996、J. Vir
ol. 70:62; Wang ら、1998、Genes Develop. 12:1769）。簡単に説明すると、直
径10 cm の組織培養皿でコンフルエントになったウイルスパッケージング細胞株
LinX（ニューヨーク州コールドスプリングハーバーにあるコールドスプリングハ
ーバー研究所（Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY ）の
G. Hannon ）をリン酸カルシウム沈殿法で、15μg の野生型またはD811A 変異型
のPTPH1 レトロウイルス構築物によりトランスフェクトした。PTPH1 遺伝子の発
現抑制状態を維持するために、2 μg/mlのテトラサイクリン（カリフォルニア州
パロアルト（Palo Alto, CA ）のクロンテック社（Clontech））存在下で、安定
した細胞株を樹立維持するための以下の工程を行なった。レトロウイルスは、ト
ランスフェクトしたLinX細胞を30℃で48時間培養し、その後、パッケージング細
胞を除去するためにウイルスを含む培養液を0.45μm のフィルター（マサチュー
セッツ州ベドフォード(Bedford, MA) のミリポア社（Millipore ））を用いて濾
過して作製した。ウイルス上清に４μg/mlのポリブレン（ミズーリ州セントルイ
ス （St. Louis, MO ）のシグマ社（Sigma ））を添加し、10% ウシ胎児血清（
FBS 、ニューヨーク州グランドアイランド（Grand Island, NY）のギブコ- ビー
アールエル社（GIBCO-BRL ））を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、
ギブコ- ビーアールエル社（GIBCO-BRL ））の中で維持されていたNIH3T3細胞（
コールドスプリングハーバー研究所（Cold Spring Harbor Laboratory ）の保存
株、最初は、メリーランド州ロックビル（Rockville, MD ）のアメリカンタイプ
カルチャーコレクション（American Type Culture Collection）から入手したも
の）に感染させるために使用した。30℃に一晩置いて感染させた後、培地を新し
いものと交換して、培養物を37℃でインキュベートした。２日後、ピューロマイ
シンを最終濃度が２μg/mlになるように加え、選抜条件下に置いた。各コロニー
を単離して、テトラサイクリンおよびピューロマイシン存在下で維持した。PTPH
1 発現を誘導するために、細胞を洗浄して、ピューロマイシンは含むが、テトラ
サイクリンを含まない新しい培養皿に再び播種した。
【０１５９】 培養培地からテトラサイクリンを除去して野生型PTPH1 の触媒ドメインの発現
を誘導すると、細胞増殖は著しく阻害された（蓄積される細胞数で約７倍減少し
た）（図３および４）。野生型PTPH1 の発現を誘導しているうちに、約10％の細
胞が次第に培養皿から剥離したため、トリパンブルーを排除する能力の喪失で測
定したところ、これらの細胞は生きていなかった。これに対して、触媒機能が損
なわれているPTPH1-D811A 変異体（「DA」）は、細胞の増殖や生存力に影響を与
えなかった。各PTPH1 構築物について、別個に単離されたコロニーから作製され
た３種類の別の細胞株で同様の結果が得られていることから、クローン集団の違
いでは、野生型と変異型（D811A ）のPTPH1 によって形質転換された細胞間に見
られる表現形質の違いを説明できないことが示されている。DNA 断片化アッセイ
法（Wyllie、1980、Nature 284:555; Arendsら、1990、Am. J. Pathol. 136:593
）を用いて、PTPH1 発現を誘導された細胞はアポトーシスを起こさないことが測
定された。
【０１６０】 ヨウ化プロピジウムを用いるＤＮＡのフローサイトメトリー測定（Rabinovitc
h 、1994、Meths. Cell Biol. 41:263-296）による細胞周期分析を、野生型また
は変異型（D811A ）のPTPH1 の発現を誘導されたトランスフェクト細胞集団に対
して行なった。対照用の細胞と比べて、さまざまな細胞周期段階における細胞分
布は変化することなく、PTPH1 誘導性の増殖停止は、特定の細胞周期段階に作用
するものではないことが示された。
【０１６１】 また、培養中の細胞を同調させて、PTPH1 発現が、G1/S停止から回復して細胞
周期を再始動することに与える影響を測定した。PTPH1 （野生型または変異型D8
11A ）発現を誘導してから24時間後に1 mMのヒドロキシ尿素（カリフォルニア州
サンディエゴ（San Diego, CA ）のカルバイオケム社（Calbiochem））を加えて
18時間培養することによって、細胞を同調させた。この薬剤は、細胞周期のG1/S
の境界で細胞を停止させる（KrekとDeCaprio、1995、Meths. Enzymol. 254:114
）。ヒドロキシ尿素による阻害は、細胞を新鮮な培地で３回洗浄すれば失われる
。細胞周期阻害を除去した後さまざまな時点で、サイクリン特異的抗体を用いた
免疫ブロット解析を行うために、NP40バッファー（1 ％ NP40 、10 mM リン酸ナ
トリウム、pH 7.0、150 mM NaCl 、2 mM EDTA 、50 mM NaF 、1 mM Na3VO4 、5
μg/mlのロイペプチン、5 μg/mlのアプロチニン、1 mMベンズアミジン、1 mMPM
SF）の中で細胞を溶解した。簡単に説明すると、直径10 cm の組織培養皿でコン
フルエントになった細胞を0.5 mlのNP40バッファーの中で10分間4 ℃で溶解し、
溶解物を4 ℃で10分間、10,000 x gで遠心分離して清澄にした。各溶解液のアリ
コートをタンパク質濃度について標準化し（BCA アッセイ法、イリノイ州ロック
フォード（Rockford, IL）のピアスケミカルズ社（Pierce Chemicals））、ドデ
シル硫酸ナトリウム（SDS ）サンプルバッファー（Laemmli 、1970、Nature 227
:680）に希釈して、8 ％アクリルアミドゲルを用いたSDS ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動とイモビロン（Immobilon ）-P PVDF 膜（マサチューセッツ州ベドフ
ォード (Bedford, MA)のミリポア社（Millipore ））上に移したブロットによっ
て解析した。製造業者の推奨するところに従って、免疫ブロット用バッファー（
5 ％（w/v ）脱脂乳、150 mM NaCl および0.05％トゥイーン（Tween ）20を含む
20 mM トリス、pH 7.5）に希釈したポリクローナルウサギ抗- サイクリンD1抗体
（カリフォルニア州サンタクルス（Santa Cruz, CA）のサンタクルスバイオテク
ノロジー社（Santa Cruz Biotechnology））を用いて、室温で1 時間ブロットを
プロービングした。このブロットを同じバッファーで３回洗浄し、既述されたよ
うに（Zhang ら、1995、J. Biol. Chem. 270:20067）、製造業者の説明に従って
、エンハンスドケミルミネッセンス（ECL ）試薬と西洋ワサビペルオキシダーゼ
（HRP ）結合二次抗体 （どちらも、ニュージャージー州ピスカタウエイ（Pisc
ataway, New Jersey））のアマーシャム−ファルマシアバイオテック社（Amersh
am-Pharmacia Biotech））を用いて発色させた。
【０１６２】 図５に示したように、野生型PTPH1 導入遺伝子の発現を許容しない条件下で、
トランスフェクトした細胞をヒドロキシ尿素による細胞周期阻害から解放したと
ころ、細胞が細胞周期を再入し、進行して行くにつれて、サイクリンD 発現が次
第に増加した。しかし、PTPH1 発現を許容する条件下で、細胞周期阻害から細胞
を解放したときには、検出可能なサイクリンD 発現はすべて消失した。これは、
PTPH1 が細胞周期の進行を乱すことによって細胞増殖を抑制することを示唆して
いる。変異型導入遺伝子によってトランスフェクトした細胞における変異型PTPH
1 （D811A ）の発現は、細胞周期に対して影響を与えなかった。
【０１６３】 実施例９ インビトロにおける、PTPH1 基質捕捉性変異体を用いた、PTPH1 の基質としての
VCP の同定 本実施例では、不変PTP 触媒部位であるアスパラギン酸残基がアラニンに置換
された（D811A ）基質捕捉性PTPH1 変異体を用いて、細胞溶解物中のPTPH1 の基
質を同定することについて説明する。上記実施例３に記載したようにして細胞溶
解物を調製し、野生型または変異型のPTPH1 の触媒ドメインに接触させて、PTP-
基質結合相互作用を測定した。
【０１６４】 不変PTP 触媒部位であるアスパラギン酸残基がアラニンに置換されている変異
型PTP を用いた基質捕捉法は、上記実施例８に記載したように、変異型PTP がPT
PH1 （D811A ）になっている以外は既述した通りである（Flint ら、1997, Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1680; Garton ら、1996, Mol. Cell Biol. 16:640
8; Tiganisら、1997 J. Biol. Chem. 272: 21548; PCT US97/13016も参照のこと
）。
【０１６５】 過バナジン酸で処理した細胞溶解物を、Sepharose （登録商標）ビーズ上に固
定化したGST-PTPH1 触媒ドメイン融合タンパク質とともにインキュベートした。
簡単に説明すると、サブコンフルエントな哺乳動物培養細胞を50μM の過バナジ
ン酸（DMEM中100 mMバナジウム酸ナトリウムと100 mM H2O2 の１：１の混合液か
ら希釈したもの）で30分間処理し、PBS で洗浄してから、実施例８に記載したよ
うに、基質捕捉バッファー（1 ％ Triton X-100 、50 mM HEPES 、pH 7.5、5 mM
EDTA 、150 mM NaCl 、10 mM リン酸ナトリウム、50 mM NaF 、5 mMヨード酢酸
、5 μg/mlロイペプチン、5 μg/mlアプロチニン、1 mMベンズアミジンおよび1
mM PMSF ）の中で細胞溶解させた。溶解物に10 mM DTT を加えてから、10,000 x
gで10分間遠心分離して清澄にした。供給業者が推奨する条件下でグルタチオン
- セファロースビーズ（ニュージャージー州ピスカタウエイ（Piscataway, NJ）
のアマーシャム−ファルマシアバイオテック社（Amersham-Pharmacia Biotech.
））に結合している精製GST-PTPH1 融合タンパク質、またはGST のみを、1 ％ T
riton X-100 （ミズーリ州セントルイス（St. Louis, MO ）のシグマ社（Sigma
））、2 mMジチオスレイトール（DTT 、シグマ社（Sigma ））、5 μg/mlロイペ
プチン、5 μg/mlアプロチニン、1 mMベンズアミジンおよび1mM PMSFを含むリン
酸緩衝食塩水（PBS ）で充分に洗った。細胞溶解物を、ビーズに固定化したGST
またはGST-PTPH1 触媒ドメイン融合タンパク質とともに４℃で２時間インキュベ
ートし、ビーズを基質捕捉バッファーで４回洗浄した。ビーズに結合している物
質をSDS-PAGEで分離し、Immobilon-P （登録商標）（マサチューセッツ州ベドフ
ォード (Bedford, MA)のミリポア社（Millipore ））膜にブロットしてから、供
給業者が推奨する濃度のホスホチロシン特異的モノクローナル抗体（G98 、Tiga
nis ら、1997 J. Biol. Chem. 272: 21548；4G10、ニューヨーク州レイクプラシ
ッド（Lake Placid, NY ）のアプステート・バイオテクノロジー社（Upstate Bi
otechnology ）；PY20、ケンタッキー州レキシントン（Lexington, KY ）のトラ
ンスダクション・ラボラトリーズ社（Transduction Laboratories ））によって
プロービングし、上記実施例７に記載した通り、ECL 試薬（アマーシャム−ファ
ルマシアバイオテック社（Amersham-Pharmacia Biotech. Piscataway, NJ ））
を使用して現像した。
【０１６６】 顕著に現れた97 kDa（pp97）のチロシンリン酸化タンパク質が293 細胞の溶解
物からPTPH1 （D811A ）変異体によって特異的に単離されたが、野生型PTPH1 ま
たはPTPH1 （C842S ）変異体では単離されなかった（図６）。さらに、pp97は、
A431、COS-7 、HepG2 、MDCK、REF-52、Saos-2およびVero細胞など、調査したそ
の他の哺乳動物細胞株からも主要なチロシンリン酸化タンパク質として、PTPH1
（D811A ）変異体によって一貫して回収された。PTPH1 基質捕捉性変異体は、細
胞溶解物中に存在する数百種類のチロシンリン酸化タンパク質の一つであって、
基質捕捉の出発材料として使用した細胞溶解物のいずれにおいても主要なタンパ
ク質成分ではないpp97に特異的かつ選択的に結合した。さまざまな細胞株に由来
するPTPH1 関連材料では、さまざまな量の他の微量なチロシンリン酸化タンパク
質も検出された。
【０１６７】 固定化PTPH1 （D811A ）上における、108 個の293 細胞に相当する細胞溶解物
からのpp97精製をスケールアップして、Κ- エンドペプチダーゼによって分解さ
れたペプチドのエドマン分解によって部分配列を決定するのに十分な量のタンパ
ク質を得た（Russo ら、1992、J. Biol. Chem. 267:20317）。そのすべてがATPa
se活性を有し、ｐ97またはVCP として知られる膜結合タンパク質に存在するアミ
ノ酸配列に一致することが分かっている７種類のペプチドそれぞれの配列を決定
した（図７）（Egerton ら、1992、EMBO J. 11:3533 ）。下線を施した配列（図
７）は、NCBIデータベース（http://www/ncbi.nlm.nih.gov/、アクセッション番
号Z14044）（配列番号：４２）から検索されたマウスVCP の配列と一致した。CD
C48 として知られている、酵母におけるVCP の相同分子種は、細胞周期調節タン
パク質として充分に確認されたものである （Patel ら、1998、Trends Cell Bi
ol. 8:65）。マウスVCP （Egerton ら、1992）のＣ末端側15残基に相当する合成
ペプチドを調製し（ニューヨーク州コールドスプリングハーバーにあるコールド
スプリングハーバー研究所コアペプチド施設 （Cold Spring Harbor Laborator
y Core Peptide Facility, Cold Spring Harbor, NY ））、常法（HarlowとLane
、Antibodies, a Laboratory Manual 、コールドスプリングハーバー研究所（Co
ld Spring Harbor Laboratory ）1988；Weir, D.M.、Handbook of Experimental
Immunology 、1986、ボストン（Boston）のブラックウエルサイエンティフィッ
ク社（Blacwell Scientific ））にしたがって、ポリクローナル・ウサギ抗血清
CS531 を作製するための免疫原として用いるため、製造業者の推奨するところに
したがって、SPDP（N-サクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオン
酸、イリノイ州ロックフォード（Rockford, IL）のピアスケミカルズ社（Pierce
Chemicals））を用いてキーホールリンペットヘモシアニン（KLH 、ピアスケミ
カルズ社（Pierce Chemicals）に結合させた。VCP ペプチド免疫原は、配列： GGSVYTEDNDDDLYG 配列番号：４１ を持っていた。
【０１６８】 実施例１０ 置換された活性部位チロシンをもつ基質捕捉性PTPH1 二重変異体を用いた、PTPH
1 の基質としてのVCP の同定 本実施例では、PTP 二重変異体を用いて、完全な細胞におけるPTP とその基質
と位の間の相互作用を同定することについて説明する。より具体的には、本実施
例では、不変PTP 触媒部位であるアスパラギン酸残基がアラニンに置換され（D8
11A ）、また、保存されたPTP 触媒部位である676 位のチロシンがフェニルアラ
ニンに置換されているPTPH1 二重変異体を用いる。
【０１６９】 培養293 細胞を、実施例８記載のHAタグ付きPTPH1 構築物を用いてトランスフ
ェクトし、発現したHAエピトープタグ付きタンパク質を、既述（Zhang ら、1997
、J. Biol. Chem. 272: 27281 ）されているような固定化ブドウ球菌由来（Stap
hylococcal）のプロテインＡに結合したHA特異的モノクローナル抗体12CA5 によ
る免疫沈降を行なって回収した。上記実施例３の記載に従って作製した細胞溶解
物から、常法にしたがって免疫沈降物を調製した。上記のとおりのウエスタン免
疫ブロット法によって、免疫沈降物を、ホスホチロシンを含むタンパク質につい
て解析を行なった。驚いたことに、293 細胞で発現したPTPH1 （D811A ）変異体
は、有意かつ容易に検出できる量のホスホチロシンを含んでいて（図８Ａ）、大
腸菌で発現したGST-PTPH1 （D811A ）融合タンパク質には、検出可能量のホスホ
チロシンが含まれていなかったこととは対照的である（図６）。これらの結果か
ら、PTPH1 の一次構造におけるリン酸化チロシンの位置を決定することはできな
かった。さらに、293 細胞で発現したPTPH1 （D811A ）変異体は、検出可能なpp
97／VCP を共沈させなかった（図８）。このように、PTPH1 （D811A ）は、PTPH
1 （D811A ）がインビトロで示したインビトロのpp97／VCP 捕捉( 実施例９) と
同じような様式では、インビボで検出可能なpp97／VCP を充分量捕捉することは
できなかった。
【０１７０】 PTPH1 の触媒ドメインのアミノ酸配列を解析した結果、PTP 活性部位にある67
6 位に保存されたチロシン残基があることが明らかになった（Barford ら、1995
、Nat. Struct. Biol. 2: 1043）。実施例８の記載に従い、HAタグ付きPTPH1 二
重変異体を構築したが、ここでは、PTPH1 （D811A ）の676 位のチロシンがフェ
ニルアラニンに置き換えられて、PTPH1 （Y676F/D811A ）となった。PTPH1 （Y6
76/D811A）二重変異体をコードする構築物によって形質転換された293 細胞から
の細胞溶解物を溶解し、モノクローナル抗-HA 抗体により免疫沈降し、ホスホチ
ロシンが存在するかについて、上記のウエスタン免疫ブロット法によって解析し
た。また、抗血清CS531 （実施例９）を用いてpp97／VCP の存在について、また
、モノクローナル抗体12CA5 を用いてHAエピトープの存在について免疫沈降した
物質を解析した（Zhang ら、1997、J. Biol. Chem. 272: 27281 ）。
【０１７１】 単一変異体PTPH1 （D811A ）によって形質転換された293 細胞とは異なり、二
重変異体PTPH1 （Y676F/D811A ）で形質転換された293 細胞は、抗血清CS531 を
用いた免疫沈降物の免疫ブロット解析によって明らかになったように、特異的に
pp97／VCP を捕捉する能力を獲得していた（図８）。ホスホチロシン含有量につ
いて解析したところ、形質転換された293 細胞から免疫沈降した二重変異体PTPH
1 （Y676F/D811A ）は、単一変異体PTPH1 （D811A ）と比較すると、ホスホチロ
シンが劇的に減少していた（図８Ｂ）。
【０１７２】 実施例１１ 基質捕捉性PTPH1 二重変異体を用いた、インビボにおけるPTPH1 基質上のチロシ
ンリン酸化部位の同定 本実施例では、基質捕捉性PTPH1 二重変異体を、pp97／VCP 上のチロシンリン
酸化部位を機能的に特徴づけるために使用する。VCP のＣ末側にあるチロシン（
Y796とY805）は、これまで特徴が解っていない分子的経路による細胞周期制御に
おいてVCP の役割を担いうる主要なリン酸化部位である（Egerton ら、1994、J.
Biol. Chem. 269: 11435 ；Madeo ら、1998、Mol. Biol. Cell 9: 131）。
【０１７３】 （i ）実施例８〜１０記載のHA- タグ付きPTPH1 構築物（野生型、D811A 、ま
たはY676F/D811A ）のいずれか、および（ii）野生型VCP 構築物（VCPmyc）また
は２箇所のＣ末側チロシンリン酸化部位がフェニルアラニンに置換されている二
重変異体（Y676F/D811A ）のVCP 構築物（VCPmyc-FF 、メリーランド州ベセスダ
（Bethesda, Maryland）の米国国立衛生研究所（National Institure of Health
）のL. Samelson ）のいずれかによって、ヒト293 細胞を同時トランスフェクト
した。VCP の野生型および変異型の構築物に、モノクローナル抗体9E10（メリー
ランド州ロックビル（Rockville, MD ）のアメリカンタイプカルチャーコレクシ
ョン（American Type Culture Collection））によって認識されるMyc エピトー
プでタグを付けた。同時トランスフェクトされた細胞を、実施例３の記載にした
がって溶解し、（Zhang ら、1997、J. Biol. Chem. 272: 27281 ）の記載にした
がって抗体12CA5 （抗-HA ）で免疫沈降した。
【０１７４】 電気泳動によって分離し、ブロットした成分を、抗-myc抗体9E10でプロービン
グして、PTPH1 タンパク質と共沈した（すなわち、「捕捉された」）VCP タンパ
ク質を同定し、あるいは、抗-HA でプロービングして、免疫沈降物質の中にPTPH
1 タンパク質が含まれていることを確認した。野生型および変異型のPTPH1 タン
パク質は、VCP の２つの形態に匹敵するレベルで発現した。PTPH1 （Y676F/D811
A ）二重変異体は、野生型のVCP を効率よく捕捉したが、Ｃ末側チロシンリン酸
化部位をもたない二重変異VCP は捕捉しなかった（図９）。また、野生型PTPH1
と単一変異体PTPH1 （D811A ）のいずれも、効果的にVCP を捕捉することはなか
った（図９）。
【０１７５】 実施例１２ PTPH1 によるVCP の選択的脱リン酸化 本実施例では、VCP のリン酸化状態に対するPTPH1 の影響について調査した。
テトラサイクリン抑制型プロモーターの調節下で、テトラサイクリンの存在下ま
たは不在下で完全長の野生型PTPH1 を発現する、形質転換された安定したNIH3T3
細胞株を、細胞溶解する前に１時間1 mMバナジウム酸で予備処理してから、ウサ
ギCS531 抗血清を用いてVCP を免疫沈降させた。細胞をNP40バッファーではなく
RIPAバッファー（NP40バッファーに1 ％デオキシコール酸ナトリウムと0.1 ％SD
S を添加したもの）の中で溶解した点を除いては、実施例３に記載した常法にし
たがって細胞溶解物と免疫沈降物を調製した。PTPH1 発現（＋）を許容する条件
下では、PTPH1 の発現を抑制したとき（−）に比べて、VCP のホスホチロシン量
が３倍から５倍減少することが観察された（図１０Ａ）。
【０１７６】 NIH3T3形質転換細胞株の溶解物を、抗−ホスホチロシン抗体PT66（ミズーリ州
セントルイス（St. Louis, MO ）のシグマ社（Sigma ））でも免疫沈降させて、
PTPH1 発現の存在下（＋）または不在下（−）で培養した細胞からチロシンリン
酸化タンパク質の代表的なサンプルを得た（図１０Ｂ）。これらの免疫沈降物を
VCP に特異的な抗体により免疫ブロット解析したところ、誘導されなかった対照
（−）と比較して、PTPH1 発現が誘導された細胞から免疫沈降したチロシンリン
酸化タンパク質のうち、VCP の量が劇的に減少することが明らかになった（図１
０Ｂ）。これらの細胞において、PTP Ｈ1 によってVCP が一見して選択的に脱リ
ン酸化されることは、別のチロシンリン酸化タンパク質であるキナーゼFAK のチ
ロシンリン酸化の程度に対するPTPH1 による誘導の効果を評価することによって
も示された。PTPH1 発現の誘導は、抗−ホスホチロシン抗体によって免疫沈降し
たFAK の量を同じように減少させることはなかった（図１０Ｂ）。
【０１７７】 また、全チロシンリン酸化タンパク質プールに対する、誘導されたPTPH1 発現
の効果は、正常な条件下（「未処理」）において、0.5 ％FBS を含むDMEM中で16
時間培養することによって血清枯渇にして（「枯渇」）、または、枯渇の細胞を
10μg/mlのインシュリン（ロシュモレキュラーバイオケミカルズ社（Roche Mole
cular Biochemicals）（インディアナ州インディアナポリス（Inndianapolis, I
N ））によって10分間インシュリン刺激した後に増殖させた、PTPH1 により形質
転換されたNIH3T3細胞において比較した。全細胞溶解物のアリコートを電気泳動
によって分離し、Immobilon-P （登録商標）にブロットをトランスフェクトし、
供給業者の推奨にしたがって希釈した２種類のHRP 結合抗−ホスホチロシン抗体
、PY20（ケンタッキー州レキシントン（Lexington, KY ）のトランスダクション
・ラボラトリーズ社（Transduction Laboratories ））および4G10、（ニューヨ
ーク州レイクプラシッド（Lake Placid, NY ）のアプステート・バイオテクノロ
ジー社（Upstate Biotechnology ）を混合してプローブとし、ECL 検出（オハイ
オ州クリーブランド（Cleveland, OH ）のアマーシャム社（Amersham）を行なっ
た。PTPH1 の過剰発現を誘導したところ、ランダムに増殖している（「未処理」
）細胞、枯渇の細胞、またはインシュリン刺激を受けた細胞において、タンパク
質チロシンリン酸化の全体的なパターンを変えることはできなかった（図１１）
。
【０１７８】 当業者は、過度の実験を行なうことなく、ここに記載した発明の具体的態様に
等しい態様を数多く認めるか、確認することができるであろう。かかる均等物も
、以下の請求の範囲に含まれるであろう。また、発明の具体的な態様は、例示の
ためにここに記載されているが、本発明の主旨と範囲を逸脱することなく、さま
ざまな改変を加えることができると考えられよう。したがって、本発明は、添付
の請求の範囲による制限以外には制限されない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ〜１Ｅは種々のＰＴＰの触媒ドメインの複数のアミノ酸配列のアライン
メントを示すものである。基質と相互作用を示すＰＴＰ１Ｂのアミノ酸残基の位
置は小型の矢印で示してあり、アラインメントの下部の残基の数字はＰＴＰ１Ｂ
のものに相当する。図１Ａ〜１ＥはＰＴＰの触媒ドメインの複数の配列アライン
メントを示している（配列番号：１〜３５）。サイトゾルの真核細胞ＰＴＰおよ
びＲＰＴＰのドメイン１を組み合わせて１つのグループとし；ＲＰＴＰのドメイ
ン２は第２のグループとし、そしてイエルシニア（Yersinia）のＰＴＰは第３の
ものとした。３グループ全てに共有されている不変残基を小文字で示す。グルー
プ内の不変残基および高度に保存された残基はそれぞれイタリックと太字で示す
。イエルシニアのＰＴＰ配列内で、サイトゾルおよびＲＰＴＰドメインの配列の
間の不変残基または高度に保存された残基はそれぞれイタリックおよび太字で示
す。
【図２】 図２はＲＣＭＬ（還元され、カルボキシアミドメチル化され、マレイル化され
たリゾチーム）に対する種々のＰＴＰ１Ｂ変異体のＶｍａｘ、ＫｃａｔおよびＫ
ｍを示す。
【図３】 図３はＰＴＰＨ１を過剰発現する安定なＮＩＨ３Ｔ３細胞株の成長の抑制を示
す位相差顕微鏡写真である（＋、誘導； −、非誘導）。
【図４】 図４はＰＴＰＨ１を過剰発現する安定なＮＩＨ３Ｔ３細胞株の成長の抑制を示
す成長曲線（３連平板培養による平均値）である。
【図５】 図５はＨＡエピトープタグ（ＰＴＰＨ１）またはサイクリンに特異的な抗体を
用いたイムノブロット解析によるヒドロキシ尿素ブロックからの放出後の所定時
間における、ＰＴＰＨ１過剰発現による細胞周期の進行の抑制を示している（＋
、誘導； −、非誘導）。
【図６】 図６は基質捕捉性変異体ＰＴＰＨ１（Ｄ８１１Ａ）により捕捉された２９３細
胞溶解物タンパク質の抗ホスホチロシンイムノブロット解析によるｉｎ ｖｉｔ
ｒｏでのＰＴＰＨ１基質としてのｐｐ９７／ＶＣＰの同定を示す。
【図７】 図７はｐｐ９７／ＶＣＰのアミノ酸配列を示す（ｎｃｂｉデータベースアクセ
ッション番号Ｚ１４０４４）［配列番号：４２］。
【図８】 図８は基質捕捉性変異体ＰＴＰＨ１（Ｙ６７６Ｆ／Ｄ８１１Ａ）により捕捉さ
れ、これと共免疫沈降された２９３細胞タンパク質のイムノブロット解析による
ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＴＰＨ１基質としてのｐｐ９７／ＶＣＰの同定を示す。
【図９】 図９はＰＴＰＨ１により認識されるＶＣＰチロシン残基のＶＣＰのＣ末端領域
への局在化を示す。
【図１０】 図１０は野生型ＰＴＰＨ１を発現する安定なＮＩＨ３Ｔ３細胞株におけるＶＣ
Ｐの脱リン酸化を示す。
【図１１】 図１１は野生型ＰＴＰＨ１を発現する安定なＮＩＨ３Ｔ３細胞株におけるチロ
シンリン酸化タンパク質の全体的プロフィルを示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年７月２７日（２００１．７．２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｃ０８４ 1/19 9/16 Ｂ ４Ｈ０４５ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/42 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 9/16 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/42 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/52 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 チャン，シャオ−フイ アメリカ合衆国 カリフォルニア 92129 サン ディエゴ，ババリアン ドライブ 13415 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB20 DA20 DA36 DA78 FB01 FB03 4B024 AA01 AA11 AA12 BA11 CA06 CA07 DA02 DA05 DA12 EA02 EA04 FA02 GA11 HA11 4B050 CC04 CC05 DD07 LL01 LL03 4B063 QA19 QA20 QQ08 QQ13 QR13 QS02 QS33 QX02 4B065 AA01X AA57X AA72X AA90X AA93Y AB01 BA02 CA31 CA44 CA46 4C084 AA01 AA07 BA03 BA22 BA44 DC25 NA14 ZB212 ZB262 4H045 AA10 AA30 BA41 CA11 CA40 DA89 EA22 EA50 FA74

Claims (54)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ａ）野生型プロテインチロシンホスファターゼ触媒ドメイン
    の不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化をもたらさないが、１
    分あたり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸と置換され；かつ ｂ）少なくとも１つの野生型チロシン残基がリン酸化され得ないアミノ酸と置換
    されるものである、 基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼ。
  2. 【請求項２】 少なくとも１つの野生型チロシン残基が、アラニン、システ
    イン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシ
    ン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン
    、プロリン、アルギニン、バリンおよびトリプトファンからなる群より選ばれた
    アミノ酸と置換される、請求項１記載の基質捕捉性変異体。
  3. 【請求項３】 置換される少なくとも１つのチロシン残基が、プロテインチ
    ロシンホスファターゼ触媒ドメインに位置する、請求項１記載の基質捕捉性変異
    体。
  4. 【請求項４】 置換される少なくとも１つのチロシン残基が、プロテインチ
    ロシンホスファターゼ活性部位に位置する、請求項１記載の基質捕捉性変異体。
  5. 【請求項５】 少なくとも１つのチロシン残基が、フェニルアラニンと置換
    される、請求項１記載の基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼ。
  6. 【請求項６】 置換される少なくとも１つのチロシン残基が、プロテインチ
    ロシンホスファターゼ保存残基である、請求項１記載の基質捕捉性変異体プロテ
    インチロシンホスファターゼ。
  7. 【請求項７】 保存残基が、ヒトＰＴＰＨ１の６７６位のアミノ酸であるチ
    ロシンに対応する、請求項６記載の基質捕捉性変異体。
  8. 【請求項８】 少なくとも１つのチロシン残基が、プロテインチロシンホス
    ファターゼと少なくとも１つの基質分子とを含有してなる複合体を安定化させる
    アミノ酸と置換される、請求項６記載の基質捕捉性変異体。
  9. 【請求項９】 変異ＰＴＰＨ１を含有してなる、請求項１記載の基質捕捉性
    変異体。
  10. 【請求項１０】 ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰ−ＰＥＳＴ、ＰＴＰγ、ＭＫＰ−１、
    ＤＥＰ−１、ＰＴＰμ、ＰＴＰＸ１、ＰＴＰＸ１０、ＳＨＰ２、ＰＴＰ−ＰＥＺ
    、ＰＴＰ−ＭＥＧ１、ＬＣ−ＰＴＰ、ＴＣ−ＰＴＰ、ＣＤ４５、ＬＡＲおよびＰ
    ＴＰＨ１からなる群より選ばれた変異プロテインチロシンホスファターゼを含有
    してなる、請求項１記載の基質捕捉性変異体。
  11. 【請求項１１】 ２３１位のアミノ酸がセリン残基と置換される変異された
    ＰＴＰ−ＰＥＳＴホスファターゼを含有してなる、請求項１記載の基質捕捉性変
    異体。
  12. 【請求項１２】 ａ）チロシンリン酸化タンパク質と基質捕捉性変異体プロ
    テインチロシンホスファターゼとの間の複合体の形成を可能にするのに十分な条
    件かつ時間で、少なくとも１つのチロシンリン酸化タンパク質を含有する試料と
    （ｉ）野生型プロテインチロシンホスファターゼ触媒ドメインの不変のアスパラ
    ギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化をもたらさないが、１分あたり１未満ま
    でのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸と置換され、かつ（ii）少なくとも１つ
    の野生型チロシン残基がリン酸化され得ないアミノ酸と置換されるものである、
    少なくとも１つの基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼとを組み
    合わせる工程、ならびに ｂ）チロシンリン酸化タンパク質と基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスフ
    ァターゼとを含有してなる複合体の有無を測定する工程、ここで、複合体の存在
    がチロシンリン酸化タンパク質がそれと複合体を形成するプロテインチロシンホ
    スファターゼの基質であることを示す、 を含む、プロテインチロシンホスファターゼの基質であるチロシンリン酸化タン
    パク質を同定する方法。
  13. 【請求項１３】 基質捕捉性変異体が、ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰ−ＰＥＳＴ、Ｐ
    ＴＰγ、ＭＫＰ−１、ＤＥＰ−１、ＰＴＰμ、ＰＴＰＸ１、ＰＴＰＸ１０、ＳＨ
    Ｐ２、ＰＴＰ−ＰＥＺ、ＰＴＰ−ＭＥＧ１、ＬＣ−ＰＴＰ、ＴＣ−ＰＴＰ、ＣＤ
    ４５、ＬＡＲおよびＰＴＰＨ１からなる群より選ばれた変異体プロテインチロシ
    ンホスファターゼを含有する、請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 試料が、チロシンリン酸化タンパク質を発現する細胞を含
    有する、請求項１２記載の方法。
  15. 【請求項１５】 細胞が、基質をコードする少なくとも１つの核酸分子とト
    ランスフェクトされている、請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 少なくとも１つの基質捕捉性変異体プロテインチロシンホ
    スファターゼが、細胞により発現される、請求項１２記載の方法。
  17. 【請求項１７】 細胞が、基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファタ
    ーゼをコードする少なくとも１つの核酸分子によりトランスフェクトされている
    、請求項１６記載の方法。
  18. 【請求項１８】 試料が、（ｉ）プロテインチロシンホスファターゼの基質
    であるチロシンリン酸化タンパク質と（ii）基質捕捉性変異体プロテインチロシ
    ンホスファターゼとを発現する細胞を含有する、請求項１２記載の方法。
  19. 【請求項１９】 細胞が、（ｉ）基質をコードする少なくとも１つの核酸と
    （ii）基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼをコードする少なく
    とも１つの核酸とによりトランスフェクトされている、請求項１８記載の方法。
  20. 【請求項２０】 試料が、少なくとも１つのチロシンリン酸化タンパク質を
    含む細胞溶解物を含有する、請求項１２記載の方法。
  21. 【請求項２１】 細胞溶解物が、チロシンリン酸化タンパク質をコードする
    少なくとも１つの核酸によりトランスフェクトされた細胞由来である、請求項２
    ０記載の方法。
  22. 【請求項２２】 細胞溶解物が、プロテインチロシンキナーゼをコードする
    少なくとも１つの核酸によりトランスフェクトされた細胞由来である、請求項２
    ０記載の方法。
  23. 【請求項２３】 少なくとも１つの基質捕捉性変異体プロテインチロシンホ
    スファターゼが、細胞溶解物内に存在する、請求項１２記載の方法。
  24. 【請求項２４】 細胞溶解物が、基質捕捉性変異体プロテインチロシンホス
    ファターゼをコードする少なくとも１つの核酸によりトランスフェクトされた細
    胞由来である、請求項２３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 チロシンリン酸化タンパク質が、ＶＣＰ、ｐ１３０cas 、
    ＥＧＰレセプター、ｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌ、ＭＡＰキナーゼ、Ｓｈｃおよび
    インスリンレセプターからなる群より選ばれたものである、請求項１２記載の方
    法。
  26. 【請求項２６】 （ａ）候補薬剤の非存在下および存在下に、基質の検出可
    能な脱リン酸化が発生するのに十分な条件かつ時間で、プロテインチロシンホス
    ファターゼと該プロテインチロシンホスファターゼの基質であるチロシンリン酸
    化タンパク質とを接触させる工程、ここでプロテインチロシンホスファターゼの
    基質であるチロシンリン酸化タンパク質が、（１）チロシンリン酸化タンパク質
    と基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼとの間の複合体の形成を
    可能にするのに十分な条件かつ時間で、少なくとも１つのチロシンリン酸化タン
    パク質を含有する試料と（ｉ）野生型プロテインチロシンホスファターゼ触媒ド
    メインの不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化をもたらさない
    が、１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸と置換され、か
    つ（ii）少なくとも１つの野生型チロシン残基がリン酸化され得ないアミノ酸と
    置換されるものである、少なくとも１つの基質捕捉性変異体プロテインチロシン
    ホスファターゼとを組み合わせる工程；ならびに（２）チロシンリン酸化タンパ
    ク質と基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼとを含有してなる複
    合体の有無を測定し、ここで、複合体の存在が、チロシンリン酸化タンパク質が
    それと複合体を形成するプロテインチロシンホスファターゼの基質であることを
    示すものである工程、により同定される；ならびに （ｂ）薬剤の非存在下での基質の脱リン酸化のレベルを、薬剤の存在下での基質
    の脱リン酸化のレベルと比較する工程、ここで、基質の脱リン酸化のレベルにお
    ける差異が、該薬剤がプロテインチロシンホスファターゼと基質との間の相互作
    用を変えることを示す、 を含む、プロテインチロシンホスファターゼと、該プロテインチロシンホスファ
    ターゼの基質であるチロシンリン酸化タンパク質との間の相互作用を変える薬剤
    を同定する方法。
  27. 【請求項２７】 （ａ）候補薬剤の非存在下および存在下に、チロシンリン
    酸化タンパク質と基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼとの間の
    複合体の形成を可能にするのに十分な条件かつ時間で、プロテインチロシンホス
    ファターゼと該プロテインチロシンホスファターゼの基質であるチロシンリン酸
    化タンパク質とを接触させる工程、ここで基質捕捉性変異体プロテインチロシン
    ホスファターゼが、（ｉ）野生型プロテインチロシンホスファターゼ触媒ドメイ
    ンの不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化をもたらさないが、
    １分あたり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸と置換される、かつ
    （ii）少なくとも１つの野生型チロシン残基がリン酸化され得ないアミノ酸と置
    換されるものである、プロテインチロシンホスファターゼを含有する；ならびに
    、 （ｂ）薬剤の非存在下での複合体形成のレベルを、薬剤の存在下での複合体形成
    のレベルと比較する工程、ここで、複合体形成のレベルにおける差異が、薬剤が
    プロテインチロシンホスファターゼと基質との間の相互作用を変えることを示す
    、 を含む、プロテインチロシンホスファターゼと、該プロテインチロシンホスファ
    ターゼの基質であるチロシンリン酸化タンパク質との間の相互作用を変更する薬
    剤を同定する方法。
  28. 【請求項２８】 （ｉ）野生型プロテインチロシンホスファターゼ触媒ドメ
    インの不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化をもたらさないが
    、１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸と置換される、か
    つ（ii）少なくとも１つの野生型チロシン残基がリン酸化され得ないアミノ酸と
    置換されるものである、プロテインチロシンホスファターゼの基質捕捉性変異体
    を被験体に投与する工程を含み、それにより基質捕捉性変異体プロテインチロシ
    ンホスファターゼとチロシンリン酸化タンパク質との相互作用が該チロシンリン
    酸化タンパク質の活性を低減する、チロシンリン酸化タンパク質の活性を低減す
    る方法。
  29. 【請求項２９】 チロシンリン酸化タンパク質が、ＶＣＰ、ｐ１３０cas 、
    ＥＧＦレセプター、ｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌ、ＭＡＰキナーゼ、Ｓｈｃおよび
    インスリンレセプターからなる群より選ばれたものである、請求項２８記載の方
    法。
  30. 【請求項３０】 プロテインチロシンホスファターゼが、ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴ
    Ｐ−ＰＥＳＴ、ＰＴＰγ、ＭＫＰ−１、ＤＥＰ−１、ＰＴＰμ、ＰＴＰＸ１、Ｐ
    ＴＰＸ１０、ＳＨＰ２、ＰＴＰ−ＰＥＺ、ＰＴＰ−ＭＥＧ１、ＬＣ−ＰＴＰ、Ｔ
    Ｃ−ＰＴＰ、ＣＤ４５、ＬＡＲおよびＰＴＰＨ１からなる群より選ばれたもので
    ある、請求項２８記載の方法。
  31. 【請求項３１】 （ｉ）野生型プロテインチロシンホスファターゼ触媒ドメ
    インの不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化をもたらさないが
    、１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸と置換され、かつ
    （ii）少なくとも１つの野生型チロシン残基がリン酸化され得ないアミノ酸と置
    換されるものである、基質捕捉性ＰＴＰ−ＰＥＳＴの変異体を、ｐ１３０cas を
    発現しうる哺乳動物に投与する工程を含み、 それにより該基質捕捉性変異体がｐ１３０cas と相互作用し、ｐ１３０cas のリ
    ン酸化に関連する少なくとも１つのガン遺伝子の悪性転換効果を低減する、 ｐ１３０cas のリン酸化に関連する少なくとも１つのガン遺伝子の悪性転換効果
    を低減する方法。
  32. 【請求項３２】 ガン遺伝子が、ｖ−ｃｒｋ、ｖ−ｓｒｃおよびｃ−Ｈａ−
    ｒａｓからなる群より選ばれたものである、請求項３１記載の方法。
  33. 【請求項３３】 （ｉ）野生型プロテインチロシンホスファターゼ触媒ドメ
    インの不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化をもたらさないが
    、１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸と置換され、かつ
    （ii）少なくとも１つの野生型チロシン残基がリン酸化され得ないアミノ酸と置
    換されるものである、基質捕捉性ＰＴＰ−ＰＥＳＴの変異体を、ｐ１３０cas を
    発現しうる哺乳動物に投与する工程を含み、 それにより該基質捕捉性変異体がｐ１３０cas と相互作用し、ｐ１３０cas に関
    連するシグナル伝達複合体の形成を低減する、 ｐ１３０cas に関連するシグナル伝達複合体の形成を低減する方法。
  34. 【請求項３４】 （ｉ）野生型プロテインチロシンホスファターゼ触媒ドメ
    インの不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化をもたらさないが
    、１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸と置換され、かつ
    （ii）少なくとも１つの野生型チロシン残基がリン酸化され得ないアミノ酸と置
    換されるものである、プロテインチロシンホスファターゼの基質捕捉性変異体を
    哺乳動物に投与する工程を含む、プロテインチロシンホスファターゼの投与また
    は過剰発現に関連する細胞傷害性効果を低減する方法。
  35. 【請求項３５】 ａ）野生型プロテインチロシンホスファターゼ触媒ドメイ
    ンの不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化をもたらさないが、
    １分あたり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸と置換される；なら
    びに ｂ）少なくとも１つの野生型チロシン残基がリン酸化され得ないアミノ酸と置換
    される、 基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼをコードする単離された核
    酸分子。
  36. 【請求項３６】 請求項３５記載の核酸分子に相補的な少なくとも１５個の
    連続的なヌクレオチドを含有してなるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  37. 【請求項３７】 ａ）野生型プロテインチロシンホスファターゼ触媒ドメイ
    ンの不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化をもたらさないが、
    １分あたり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸と置換され、かつ ｂ）少なくとも１つの野生型チロシン残基がリン酸化され得ないアミノ酸と置換
    されるものである、 基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼに融合されたポリペプチド
    配列を含有してなる融合タンパク質。
  38. 【請求項３８】 ポリペプチドが、酵素またはそのバリアントもしくはフラ
    グメントである、請求項３７記載の融合タンパク質。
  39. 【請求項３９】 基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼに融
    合されたポリペプチド配列が、プロテアーゼにより切断されうる、請求項３７記
    載の融合タンパク質。
  40. 【請求項４０】 ポリペプチド配列が、リガンドに対するアフィニティーを
    有するアフィニティータグポリペプチドである、請求項３７記載の融合タンパク
    質。
  41. 【請求項４１】 ａ）野生型プロテインチロシンホスファターゼ触媒ドメイ
    ンの不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化をもたらさないが、
    １分あたり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸と置換され、かつ ｂ）少なくとも１つの野生型チロシン残基がリン酸化され得ないアミノ酸と置換
    されるものである、 基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼをコードする核酸に使用可
    能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含有してなる組換え発現構築物
    。
  42. 【請求項４２】 プロモーターが調節プロモーターである、請求項４１記載
    の発現構築物。
  43. 【請求項４３】 基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼが、
    第２核酸配列のポリペプチド産物との融合タンパク質として発現される、請求項
    ４１記載の発現構築物。
  44. 【請求項４４】 第２核酸配列のポリペプチド産物が、酵素である、請求項
    ４３記載の発現構築物。
  45. 【請求項４５】 発現構築物が、組換えウイルス発現構築物である、請求項
    ４１記載の組換え発現構築物。
  46. 【請求項４６】 請求項４１〜４５いずれか１つに記載の組換え発現構築物
    を含有してなる宿主細胞。
  47. 【請求項４７】 宿主細胞が、原核細胞である、請求項４６記載の宿主細胞
    。
  48. 【請求項４８】 宿主細胞が、真核細胞である、請求項４６記載の宿主細胞
    。
  49. 【請求項４９】 ａ）野生型プロテインチロシンホスファターゼ触媒ドメイ
    ンの不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化をもたらさないが、
    １分あたり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸と置換され、かつ ｂ）少なくとも１つの野生型チロシン残基がリン酸化され得ないアミノ酸と置換
    されるものである、 基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼをコードする核酸配列に使
    用可能に連結される少なくとも１つのプロモーターを含有してなる組換え発現構
    築物を含有してなる宿主細胞を培養する工程、 を含む、組換え基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼを産生する
    方法。
  50. 【請求項５０】 プロモーターが、調節プロモーターである、請求項４８記
    載の方法。
  51. 【請求項５１】 請求項４５記載の組換えウイルス発現構築物で感染された
    宿主細胞を培養する工程、 を含む、組換え基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼを産生する
    方法。
  52. 【請求項５２】 製薬上許容されうる担体または希釈剤と組み合わせて、 ａ）野生型プロテインチロシンホスファターゼ触媒ドメインの不変のアスパラギ
    ン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化をもたらさないが、１分あたり１未満まで
    のＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸と置換され、かつ ｂ）少なくとも１つの野生型チロシン残基がリン酸化され得ないアミノ酸と置換
    されるものである、 基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼ、 を含有してなる医薬組成物。
  53. 【請求項５３】 製薬上許容されうる担体または希釈剤と組み合わせて、 ａ）野生型プロテインチロシンホスファターゼ触媒ドメインの不変のアスパラギ
    ン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化をもたらさないが、１分あたり１未満まで
    のＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸と置換され、かつ ｂ）少なくとも１つの野生型チロシン残基がリン酸化され得ないアミノ酸と置換
    されるものである、 基質捕捉性変異体プロテインチロシンホスファターゼと相互作用する薬剤を含有
    してなる医薬組成物。
  54. 【請求項５４】 ａ）（ｉ）野生型プロテインチロシンホスファターゼ触媒
    ドメインの不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化をもたらさな
    いが、１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少をもたらすアミノ酸と置換され、
    かつ（ii）少なくとも１つの野生型チロシン残基がリン酸化され得ないアミノ酸
    と置換されるものである、少なくとも１つの基質捕捉性変異体プロテインチロシ
    ンホスファターゼ；ならびに ｂ）プロテインチロシンホスファターゼとチロシンリン酸化タンパク質との間の
    複合体の有無の検出における使用に適切な補助薬剤、 を含有してなる、プロテインチロシンホスファターゼのチロシンリン酸化タンパ
    ク質基質を同定するためのキット。
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