JP2003501064A

JP2003501064A - シャペロンポリペプチドのフラグメントを含む融合タンパク質

Info

Publication number: JP2003501064A
Application number: JP2001501628A
Authority: JP
Inventors: ファーシュト，アラン
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1999-06-09
Filing date: 2000-05-23
Publication date: 2003-01-14
Also published as: CA2376062A1; WO2000075346A1; EP1181378A1; AU5086800A; GB9913437D0

Abstract

(57)【要約】本発明は、ａ）シャペロンポリペプチドのフラグメントを含む第一の領域と、ｂ）関心あるポリペプチド配列を含む第二の領域であって、第一の領域とは本来関連のない第二の領域とを含む融合タンパク質とに関し、またこの様な融合タンパク質をコードする核酸配列およびこの様な核酸配列に基づくポリペプチドの発現方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、その他のタンパク質のフォールディングと構造の完全性の維持に有
効なシャペロンポリペプチド、および発現系においてポリペプチドの発現を助け
る融合パートナーとしてのその使用に関する。本発明は、記述されているシャペ
ロンポリペプチドと融合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含むベク
ター、および核酸またはベクターにより融合タンパク質を発現する様に改変され
た宿主細胞にも関する。

【０００２】シャペロンは、種々の細胞コンパートメントにおけるポリペプチド鎖のフォー
ルディングの媒介に欠かせない大きなマルチサブユニットのタンパク質の集合で
あることが一般に知られている。シャペロンのファミリーが同定されており、例
えば、シャペロニンｈｓｐ６０ファミリー、あるいはタンパク質のｃｐｎ６０ク
ラスとして知られるものが構成的に発現され、また細菌細胞質体（ＧｒｏＥＬ）
、内部共生的に得られるミトコンドリア（ｈｓｐ６０）、葉緑体（リブロース−
１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ結合タンパク質）において例が認められる
。別のシャペロンファミリーは、ＴＦ５５／ＴＣＰ１と名付けられ、好光熱性古
細菌と進化的に結合された真核生物の細胞質ゾルに見いだされる。アミノ酸配列
データの比較により、原核生物、ミトコンドリア、葉緑体に認められるシャペロ
ンの間に少なくとも５０％の配列同一性が存在することが明らかにされた（Ｅｌ
ｌｉｓＲＪａｎｄＶａｎｄｅｒＶｉｅｓＳＭ（１９９１）Ａ
ｎｎＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ６０：３２１−３４７）。

【０００３】典型的なシャペロニンは、熱ショックタンパク質のｈｓｐ６０ファミリーの一
員であるＧｒｏＥＬである。ＧｒｏＥＬは、十四量体で、各単量体サブユニット
（ｃｐｎ６０ｍ）の分子量は約５７ｋＤである。この十四量体は、多くのタンパ
ク質のｉｎｖｉｔｒｏでのフォールディングを促進し、さもなければ、タンパ
ク質は、ミスフォールディングするか、あるいは凝集、沈殿する。Ｂｒａｉｇ
Ｋｅｔａｌ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３７１：５７８−５８６により報告
されているように、大腸菌由来のＧｒｏＥＬの構造は、Ｘ線結晶学の研究により
確立されている。このホロタンパク質は円筒形で、ＥｌｌｉｓＲＪａｎｄ
ＨｒｔｌＦＵ（１９９６）ＦＡＳＥＢＪｏｕｒｎａｌ１０：２０−２
６によれば、活性に必須と一般に考えられている中心の大きな１つの空洞を形成
する２つの七員環から構成されている。いくつかの小さなタンパク質が、Ｇｒｏ
ＥＬに結合されると、変性状態からフォールディングされることが証明されてお
り（ＧｒａｙＴＥａｎｄＦｅｒｓｈｔＡＲ（１９９３）ＪＭｏ
ｌＢｉｏｌ２３２：１１９７−１２０７；ＨｕｎｔＪＦｅｔａｌ
（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ３７９：３７−４５；ＷｅｉｓｓｍａｎＪ
Ｓｅｔａｌ（１９９６）Ｃｅｌｌ８４：４８１−４９０；Ｍａｙｈｅ
ｗＭｅｔａｌ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ３７９：４２０−４２６；Ｃ
ｏｒｒａｌｅｓＦＪａｎｄＦｅｒｓｈｔＡＲ（１９９５）Ｐｒｏ
ｃＮａｔＡｃａｄＳｃｉ９２：５３２６−５３３０）、またケージ状の
構造が、部分的にフォールディングされた、あるいは組み立てられたタンパク質
を隔離するのに必要であると論じられている（ＥｌｌｉｓＲＪａｎｄＨ
ａｒｔｌＦＵ（１９９６）上記）。

【０００４】大腸菌ＧｒｏＥＬの全アミノ酸配列も知られており（ＢｒａｉｇＫｅｔ
ａｌ（１９９４）上記参照）、３つのドメインがホロシャペロニン（十四量体）
の各ｃｐｎ６０ｍに割り当てられている。３つのドメインとは中間（アミノ酸残
基１−５、１３４−１９０、３７７−４０８、５２４−５４８）、赤道位（残基
６−１３３、４０９−５２３）、先端（残基１９１−３７６）のドメインである
。

【０００５】ＧｒｏＥＬの単量体が尿素または圧力により誘導されたが、これらは不活性で
、ロダネーゼの再フォールディングを促進するために、再結合し、中心空洞を形
成しなければならない（ＭｅｎｄｏｚａＪＡｅｔａｌ（１９９４）Ｊ
ＢｉｏｌＣｈｅｍ２６９：２４４７−２４５１；ＹｂａｒｒａＪａ
ｎｄＨｏｒｏｗｉｔｚＰＭ（１９９５）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７
０：２２９６２−２２９６７）。

【０００６】ＧｒｏＥＬは、多くのタンパク質のフォールディングを以下の２つの機序によ
り促進する。（１）ＧｒｏＥＬが部分的にフォールディングされたタンパク質に
結合することにより凝集を阻害し（ＧｏｌｏｕｂｉｎｏｆｆＰｅｔａｌ（
１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４２：８８４−８８９；ＺａｈｎＲａｎｄ
ＰｌｕｃｋｔｈｕｎＡ（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３１：３２
４９−３２５５）、次にそれはＧｒｏＥＬにおいて自然のような状態に再フォー
ルディングする（ＺａｈｎＲａｎｄＰｌｕｃｋｔｈｕｎＡ（１９９２）
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３１：３２４９−３２５５）；ＧｒａｙＴＥ
ａｎｄＦｅｒｓｈｔＡＲ（１９９３）ＪＭｏｌＢｉｌｏ２３２
：１１９７−１２０７）。（２）ＧｒｏＥＬはミスフォールディングされたタン
パク質を、それらを展開して、そこから再フォールディングが再び開始できる状
態にすることにより、連続的にアニーリングする（ＺａｈｎＲｅｔａｌ（
１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７１：６４２−６４５）。先端ドメインの幾つ
かの突然変異が、ポリペプチド結合の減少を引き起こすことから（Ｆｅｎｔｏｎ
ＷＡｅｔａｌ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３７１：６１４−６１９
）、このドメインがポリペプチドの結合に関与していることが示唆される。電子
顕微鏡による検査により、変性タンパク質がＧｒｏＥＬ円柱の先端の内側に結合
することが示唆されている（ＣｈｅｎＳｅｔａｌ（１９９４）Ｎａｔｕ
ｒｅ３７１：２６１−２６４）。赤道ドメインは、ＡＴＰγＳに結合されたＧ
ｒｏＥＬの２．４Å結晶構造（ＢｏｉｓｖｅｒｔＤＣｅｔａｌ（１９９
６）ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔｕｒｅＢｉｏｌｏｇｙ３：１７０−１７
７）と突然変異の研究（ＦｅｎｔｏｎＷＡｅｔａｌ（１９９４）Ｎａ
ｔｕｒｅ３７１：６１４−６１９）から、ヌクレオチド結合部位を持つことが
明らかにされた。ＡＴＰの結合と加水分解は協同的で（Ｂｏｃｈｋａｒｅｖａ
ＥＳｅｔａｌ（１９９２）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６７：６７９６−
６８００；ＧｒａｙＴＥａｎｄＦｅｒｓｈｔＡＲ（１９９１）
ＦＥＢＳＬｅｔｔ２９２：２５４−２５８）、ポリペプチドに対する親和性
を低下させる（ＪａｃｋｓｏｎＧＳｅｔａｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ３２：２５５４−２５６３）。ＧｒｏＥＬのサブユニット間の
分子間接触の大部分は赤道ドメインの間で起こる。中間ドメインは他の２つのド
メインを結合し、アロステリック効果を伝達する（ＢｒａｉｇＫｅｔａｌ
（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３７１：５７８−５８６；ＢｒａｉｇＫｅｔ
ａｌ（１９９５）ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔＢｉｏｌ２：１０８３−１０
９４）。

【０００７】ＧｒｏＥＬの結晶構造は、赤道または中間ドメインよりも、先端ドメインに異
常に高いＢ因子を示し、またＢ因子はドメイン内で大きく異なる（Ｂｒａｉｇ
Ｋｅｔａｌ（１９９５）ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔＢｉｏｌ２：
１０８３−１０９４；ＢｏｉｓｖｅｒｔＤＣｅｔａｌ（１９９６）
ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔｕｒｅＢｉｏｌｏｇｙ３：１７０−１７７）。
総体的なＢ因子が高いのは、非対称単位の、恐らくＧｒｏＥＬの結晶全体内部の
静的無秩序（static disorder）により引き起こされた様に見え、中間ドメイン
のヒンジ様βシートにより引き起こされる剛体運動に起因するとされている。フ
レキシビリティの高い領域も、コシャペロニンＧｒｏＥＳの２．８Å構造におい
て観察されている（ＨｕｎｔＪＦｅｔａｌ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ
３７９：３７−４５）。可動ループが、先端ドメインとのＡＤＰ依存性結合に直
接関与していることが明らかにされている（ＬａｎｄｒｙＳＪｅｔａｌ
（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６４：２５５−２５８）。ＧｒｏＥＳの結合によ
り、ＧｒｏＥＬの配座の変化が引き起こされ、ＧｒｏＥＬの空洞の拡大が同時に
生じ（ＣｈｅｎＳｅｔａｌ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３７１：２６１
−２６４）、その空洞の中で、被包されたポリペプチド基質が、凝集の危険を伴
わずに自然様状態に再フォールディングされる（ＭａｒｔｉｎＪｅｔａｌ
（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６６：２２８−２３３；Ｗｅｉｓｓｍａｎ
ＪＳｅｔａｌ（１９９５）Ｃｅｌｌ８３：５７７−５８７）。

【０００８】ＧｒｏＥＬの単量体の形態は、特定部位の突然変異誘発により誘導され、発現
され、これらはロダネーゼに結合するが、そのリフォールディングには影響を及
ぼさない（ＷｈｉｔｅＺＷｅｔａｌ（１９９５）ＪＢｉｏｌＣｈ
ｅｍ２７０：２０４００４−２０４０９）。

【０００９】Ｙｏｓｈｉｄａｅｔａｌ（１９９３）ＦＥＢＳ３３６：３６３−３６
７は、１４９のＮＨ₂末端残基と〜９３のＣＯＯＨ末端残基とを欠失する大腸菌
腸菌ＧｒｏＥＬの３４ｋＤタンパク質分解フラグメント（ＧｒｏＥＬ１５０−
４５６）が、ＧｒｏＥＳとＡＴＰが存在しない状態で変性ロダネーゼのリフォー
ルディングを促進することを報告している。タンパク質分解フラグメントＧｒｏ
ＥＬ１５０−４５６はゲル透過中にタンパク質として溶出するが、なお先端ドメ
インと中間ドメインおよび赤道ドメインのかなりの部分を含んでおり、後者はＧ
ｒｏＥＬのサブユニット間の接触を決定し（ＢｒａｉｇＫｅｔａｌ（１９
９４）上記）、従って、中心空洞の一過性形成が可能となり、これによって観察
されるシャペロニン活性が説明される。

【００１０】いずれの事象においても、ＧｒｏＥＬによるロダネーゼのリフォールディング
の様式は、ホロタンパク質により生じるものとは大きく異なる。生じるリフォー
ルディング収率が低く、フォールディングは時間と共に速やかに飽和され、Ｇｒ
ｏＥＳとＡＴＰにより影響を受けない。効率的な遊離とフォールディングは、Ａ
ＴＰの加水分解を必要とする（ＬａｎｄｒｙＳｅｔａｌ（１９９２）Ｎａ
ｔｕｒｅ３５５：４５５−４５７；ＧｒａｙＴＥａｎｄＦｅｒｓｈｔ
ＡＲ（１９９２）ＦＥＢＳＬｅｔｔ２８２：２５４−２５８；Ｊａｃｋｓｏ
ｎＧＳｅｔａｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３２：２５５
４−２５６３；ＴｏｄｄＭｅｔａｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ３２：８５６０−８５６７）。

【００１１】ＥＰ−Ａ−０６５０９７５（ＮＩＰＰＯＮＯＩＬＣＯＬＴＤ）により
、シャペロニン分子と、Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから得られ
るＧｒｏＥＬシャペロニン６０単量体（ｃｐｎ６０ｍ）とを用いる変性タンパク
質のリフォールディング方法が開示されている。Ｔａｇｕｃｈｉｅｔａｌ（
１９９１）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６６：２２４１１−２２４１８の方法に
より、細菌源から、ホロシャペロニンがまず抽出され、次に精製された。次に、
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によりホロシャペロニンを処理し、次に得られた変
性タンパク質を逆相（ｒｐ）ＨＰＬＣにかけることにより、ｃｐｎ６０ｍが産生
された。約５７ｋＤのｃｐｎ６０ｍを含むピーク分画が得られた。不活化ロダネ
ーゼの活性の回復を監視することにより、ｃｐｎ６０ｍのリフォールディング活
性が、溶液中で分析され、比活性の見地から、不活性化前のロダネーゼの比活性
の約２５％にしか達しなかった。バックグラウンドの自然のロダネーゼのリフォ
ールディングをさし引くと、リフォールディング活性は約２０％しかない。

【００１２】ｃｐｎ６０ｍと同様に、ＥＰ−Ａ−０６５０９７５は、７９位のＴｈｒ残基
まで（但しこれは含まれない）のＮ末端アミノ酸残基がタンパク質の加水分解に
より除去されている、約５０ｋＤのｃｐｎ６０ｍのＮ末端欠失フラグメントの使
用も開示されている。この５０ｋＤのフラグメントは、溶液中で約３５％（バッ
クグラウンドを引くと約３０％）のロダネーゼリフォールディング活性を示した
。

【００１３】ＴａｇｕｃｈｉＨｅｔａｌ（１９９４）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６
９：８５２９−８５３４は、ＥＰ−Ａ−０６５０９７５の発明の基礎となる科
学論文である。シャペロニン単量体が溶液中に存在する時に、一過性に形成され
るＧｒｏＥＬ十四量体（ホロシャペロニン）は存在することが認められた。従っ
て、これらの試料のリフォールディング活性は、単量体ではなく、ホロシャペロ
ニンの存在により引き起こされると考えられる。これを検討するために、Ｔａｇ
ｕｃｈｉｅｔａｌは、ｃｐｎ６０ｍをクロマトグラフ樹脂に固定し、ホロシ
ャペロニン形成の可能性を除外した。固定されると、従って、厳密に単量体の形
態におかれると、ｃｐｎ６０ｍは約１０％のロダネーゼリフォールディング活性
しか示さなかった。

【００１４】ロダネーゼのリフォールディングは、シャペロニン活性を測定する一般的で便
利な分析法であった。しかし、分析法に重大な問題が存在することが認められて
おり、これによって、この分析に基づいて断定されたリフォールディング活性は
かなり疑わしいものとなっている。分子シャペロニンが存在しない状態で自然に
リフォールディングし、リフォールディングされたロダネーゼの収率は、ロダネ
ーゼ濃度が減少するにつれ、徐々に増加するのが事実である（Ｔａｇｕｃｈｉ
ｅｔａｌ（１９９４）上記参照）。従って、固定化された（厳密に単量体の）
ｃｐｎ６０ｍに関してＥＰ−Ａ−０６５０９７５に報告された１０％のロダネ
ーゼリフォールディング活性は、ｃｐｍ６０ｍとロダネーゼの場合はいうまでも
なく、単量体のシャペロニンがタンパク質へのリフォールディング活性を持つと
一般的に証明するには、ロダネーゼによる自然活性回復に近似し過ぎている。

【００１５】ＡｌｃｏｎａｄａＡａｎｄＣｕｅｚｖａＪＭ（１９９３）ＴＩＢＳ１８：８１
−８２は、大腸菌の修飾ｍＲＮＡ安定性（ａｍｓ）遺伝子産物（Ａｍｓ）とＧｒ
ｏＥＬの中心部分のアミノ酸配列の類似性に基づき、ＧｒｏＥＬの「内部フラグ
メント」がシャペロン活性を有する可能性があることを示唆した。ａｍｓ遺伝子
座は、大腸菌染色体の２３ｍｉｎに位置し、ｍＲＮＡの半減期を延長する温度感
受性突然変異である。ａｍｓ遺伝子はクローニングされ、発現され、ａｍｓ突然
変異を補足することが明らかにされた。この遺伝子産物は、見かけの分子量が１
７ｋＤの１４９のアミノ酸タンパク質（Ａｍｓ）である。

【００１６】ＣｈａｎｄａＰＫｅｔａｌ（１９８５）ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ１
６１：４４６−４４９は、ＧｒｏＥオペロンのＬ遺伝子の一部に対応する１７ｋ
Ｄタンパク質フラグメントが、大腸菌ａｍｓの突然変異体において発現されると
、野生型表現型を回復することを発見した。この１７ｋＤフラグメントは、分離
された機能性シャペロニンタンパク質の基本単位であることが示唆された。３つ
のシャペロニン（大腸菌ＧｒｏＥＬ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ由来
のリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ（ＲＵＢＰＣ）サブユニット結合タン
パク質、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓａｅミトコンドリ
アｈｓｐ６０）のアミノ酸配列が、Ａｍｓの配列と比較された。３０７−４２３
残基が、ＡｍｓとＧｒｏＥＬの間で実質的に対応していることが発見された。こ
れらの残基は、ＧｒｏＥＬの中間および先端ドメインの両者のほぼ同等部分から
成る。

【００１７】上記のシャペロニンと共にＡｍｓタンパク質の配列は、Ａｍｓのアミノ酸末端
の５分の４と大腸菌ＧｒｏＥＬシャペロニンの中心部（約５分の１）に著しい類
似性（９８％）を示している。Ａｍｓアミノ酸末端領域と２つのその他のシャペ
ロニンの間の５０％の配列類似性は、シャペロニンファミリーにおいて報告され
た同一性と矛盾しない。Ａｍｓタンパク質のカルボキシル末端部分は、シャペロ
ニンと類似性を示さなかった（相同性は１０％未満）。

【００１８】その内容全体を引用する事により本明細書の一部をなすものとする国際特許出
願ＷＯ９８／１３４９６は、ミニシャペロンと名付けられたシャペロン分子のフ
ラグメントについて説明しており、これらは展開され、あるいはミスフォールデ
ィングされたポリペプチドのフォールディングの促進に有効である。フラグメン
トは溶液中で単量体である。

【００１９】組み換えＤＮＡ技術により、産業上、商業的に重要な多くのタンパク質を生産
することが可能となった。タンパク質は、例えば、細菌、酵母、昆虫、植物、哺
乳動物細胞に基づく多種多様な発現系において生産される。組み換え技術による
タンパク質の生産に伴う問題の１つは、宿主細胞が、タンパク質分解酵素を含ん
でいる点で、そのような酵素の存在により小さなポリペプチドの生産に特に困難
である。更に、組み換えＤＮＡ技術により生産されるポリペプチドは、しばしば
少なくとも一部は不適切にフォールディングされ、その結果、生物学的活性を有
する分子の収率は、発現系の正しいフォールディングを促進する能力によって変
動する。更に、これは、構造的な均一性が高度に関連する化学および物理分析を
目的としたポリペプチドの生産において問題となる可能性がある。

【００２０】この様な問題を克服する一つの方法は、目的の組み換えタンパク質を融合タン
パク質の形態で発現する事である。関心あるタンパク質をコードするＤＮＡは、
融合パートナータンパク質にフレーム内で融合し、その結果生じた融合物が発現
される。しばしば、融合物の２つの部分の間にあるタンパク質分解酵素切断部位
をコードするリンカー配列が含まれ、宿主細胞から回収された後、融合物を切断
することが可能となる。

【００２１】しばしば、融合パートナータンパク質は、幾つかの形態の高度に特異的な親和
性精製手段により回収され、精製される。このようなタンパク質の具体例は、本
技術において知られており、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、
マルトース結合タンパク質およびβラクタマーゼが挙げられる。

【００２２】しかし、これらの融合パートナータンパク質は比較的大きく、そのために多く
の欠点を有する。例えば、独立性を保ちながら関心あるタンパク質を機能させる
には融合パートナータンパク質は大きすぎるため、関心あるタンパク質について
有意義な処理を施す前に必ず除去しなくてはならない。従って、多くの小さなポ
リペプチドは、今なお化学合成によって産生されている。

【００２３】［発明の概要］本発明は、生物発現系において正しくフォールディングされたポリペプチドを
高効率で発現させるために、融合パートナーとしてシャペロンフラグメントを組
み込んだ融合タンパク質を提供する。タンパク質が、シャペロンフラグメントと
の融合物として発現されれば、組み換えにより発現されるより高収率のポリペプ
チドが一貫して得られることが観察された。

【００２４】従って、本発明の第一の形態によれば、ａ）シャペロンポリペプチドのフラグ
メントを含む第一の領域と、ｂ）関心あるポリペプチド配列を含む第二の領域で
あって、第一の領域とは本来関連のない第二の領域とを含む融合タンパク質が提
供される。

【００２５】「融合タンパク質」という用語は、本発明の技術分野におけるその通常の意味
に従って使用され、異なる供給源から得られる２つ以上の領域を含む１つのタン
パク質を意味する。典型的には、融合タンパク質は、それぞれの核酸コーディン
グ配列のフレーム内での融合により融合される２つのタンパク質である。

【００２６】本明細書に使用されている「シャペロンフラグメント」という用語は、ポリペ
プチドのフォールディングをｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏで促進する
能力を持つ分子シャペロンの任意のフラグメントをいう。好ましいフラグメント
は、引用する事により本明細書の一部をなすものとする国際特許出願ＷＯ９８／
１３４９６に説明されている。特に好ましいのは、ＧｒｏＥＬのフラグメント１
９１−３７５、１９１−３４５、１９３−３３５である。有利には、下記に更に
説明されている様に、ＧｒｏＥＬは大腸菌ＧｒｏＥＬである。

【００２７】本発明の融合タンパク質は、シャペロンフラグメントの他に所望のポリペプチ
ドを含む。所望のポリペプチドは、典型的には、組み換えＤＮＡ技術により発現
することが望ましいポリペプチドであって、本発明により、正しくフォールディ
ングされた産物の収率を上げるために、シャペロンフラグメントとの融合物とし
て発現される。多くのポリペプチドが、本発明の融合タンパク質として発現され
うる。しかし、約２５０個のアミノ酸長までのより小さなポリペプチドの発現が
好ましい。好ましくは、ポリペプチドの長さは、約５から１００個のアミノ酸長
である。

【００２８】有利には、ポリペプチドは、哺乳動物ポリペプチドの様な真核生物ポリペプチ
ドである。

【００２９】好ましくは、本発明の融合タンパク質は、その第一の領域と第二の領域との間
に切断可能なリンカーを含む。リンカーは、典型的には、タンパク質分解酵素に
より、あるいはポリペプチド切断に適したその他の手段により切断可能なポリペ
プチド鎖であって、所望のポリペプチドの回収を促進するために、融合タンパク
質の生産後に切断可能である。

【００３０】更に、融合タンパク質が、シャペロンフラグメントと所望のポリペプチドとを
別の鎖として含み、それらがペプチド結合以外の手段で結合されている場合には
、切断可能なリンカーはジスルフィド結合の様な別の切断可能部位を含むことが
できる。好ましくは、シャペロンフラグメントは、融合タンパク質の所望のポリ
ペプチドのＮ末端に配置される。有利には、シャペロンフラグメントそのものは
、融合タンパク質のＮ末端を形成するが、例えば、シャペロンフラグメントを変
性から保護するために、別のＮ末端を含めることも予想される。

【００３１】本発明の文脈において、タンパク質とポリペプチドとの両者が使われているが
、これらの用語は実質的に交換可能である。例外として、「タンパク質」という
用語は特に１つ以上のポリペプチド鎖から成る多重鎖分子を含む。これらの複数
のポリペプチド鎖は、非共有的な結合または共有結合により結合できるが、この
様な共有結合はペプチド結合を含まない。例えば、鎖はジスルフィド結合により
結合される。

【００３２】本発明は更に、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含み、好ましくは
、核酸は、プロモーターに作動可能に結合された核酸を含む発現ベクターの一部
を形成する。

【００３３】核酸、ベクター、プロモーターは以下に更に詳細に説明されている。

【００３４】本発明は更に、本発明の発現ベクターを有する宿主細胞を含み、（ｉ）該宿主
細胞内部において発現ベクターから融合タンパク質を発現させる条件下で宿主細
胞を培養するステップと、（ｉｉ）細胞から融合タンパク質を回収するステップ
とを含む本発明の融合タンパク質の調製方法も含む。

【００３５】融合タンパク質が、第一の領域と第二の領域との間にタンパク質分解酵素によ
る切断が可能なリンカー領域を更に含む場合には、本発明の方法は更に、任意選
択的にタンパク質分解酵素による切断が可能なリンカーでタンパク質を切断し、
第二の領域を回収するステップを更に含む。

【００３６】［発明の詳細な説明］［Ａ：第一の領域］本発明の融合タンパク質の第一の領域は、天然または合成のシャペロンフラグ
メントを含むことができる。

【００３７】本発明の使用に適したシャペロンフラグメントは、例えば、引用することによ
り本明細書の一部をなすものとする国際特許出願ＷＯ／１３４９６に説明されて
いる。

【００３８】実質的に配列番号１に示されるように、ＧｒｏＥＬ配列の少なくともアミノ酸
残基２３０−２７１であるが、残基１５０−４５５または１５１−４５６以上で
はないものから選択されるアミノ酸配列を有するシャペロンポリペプチド、また
は実質的に相同のシャペロンポリペプチドに相当する配列、またはシャペロン活
性を有するその修飾、突然変異または変異型である。

【００３９】ＧｒｏＥＬの配列は上記の様に本発明の技術分野において利用可能であり、学
問的データベースから入手可能であるが、データベース配列に適合するＧｒｏＥ
Ｌフラグメントは実施不可能である。特に、データベースは２６２位と２６７位
がそれぞれアラニンとイソロイシンである配列を含んでいる。これらの残基の１
つまたは両者を組み込むフラグメントは機能せず、ポリペプチドのフォールディ
ングを促進することはできない。その代わりに、本発明は２６２位と２６７位が
それぞれロイシンとメチオニンであるＧｒｏＥＬポリペプチドに関する。

【００４０】アミノ酸配列は、好ましくは、少なくともアミノ酸残基１９３−３３５、好ま
しくは、１９３−３３７、より好ましくは、１９１−３４５、更により好ましく
は、１９１−３７６であるが、１５１−４５５を越えないものから選択される。
従って、本発明は、ＧｒｏＥＬアミノ酸残基２３０−２７１、２３０−２７２…
以下参照…２３０−４５５、同様に残基２３０−２７１、２２９−２７１…以下
…１５１−２７１。また、残基２３０−２７１、２２９−２７２…以下…１５１
−３５１、１５１−３５２…以下…１５１−４５５。例えば、１７１−４２３ま
たは１６６−４０６の様な、少なくとも隣接する残基２３０−２７１を含むが、
１５１−４５５を越えない４２個以上の残基のアミノ酸配列は全て本発明のこの
点に関して範囲内にある。

【００４１】極めて好ましい側面において、本発明は残基１９１−３７５、１９１−３４５
、１９３−３５５から成る群から選択されるフラグメントを提供する。

【００４２】分子シャペロンとしてのタンパク質を特徴づける４つの重要な特性が存在する
。（１）タンパク質フォールディング中の凝集の抑制、（２）タンパク質展開時
の凝集の抑制、（３）フォールディングの収率と速度論に及ぼす影響、（４）化
学量論的レベル付近で発揮される効果である。これらの活性を有するフラグメン
トは、本発明において使用することに適している。

【００４３】シャペロン活性は、実際的にはシクロフィリンＡのリフォールディング能によ
り決定できるが、グルコサミン−６−リン酸デアミナーゼまたはインドールグリ
セロールホスフェートシンターゼ（ＩＧＰＳ）の突然変異型（アミノ酸残基４９
−２５２）の様なその他の適切なタンパク質も使用できる。ロダネーゼリフォー
ルディング分析も使用できる。適切なリフォールディング分析の詳細は、下文に
提供されている特定の実施例に更に詳細に説明されている。

【００４４】好ましくは、シャペロン活性は、シクロフィリンＡのリフォールディングによ
り決定される。より好ましくは、８Ｍの尿素で変性したシクロフィリンＡ（１０
０μＭ）を最終濃度が１μＭとなる様に１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐ
Ｈ７．０、１０ｍＭのＤＴＴの中に希釈し、次に少なくとも１μＭの前記ポリペ
プチドと２５℃で少なくとも５分間接触させ、得られたシクロフィリンＡ活性を
、ＦｉｓｃｈｅｒＧｅｔａｌ（１９８４）ＢｉｏｍｅｄＢｉｏｃｈｉｍ
Ａｃｔａ４３：１１０１−１１１１の方法により分析する。

【００４５】ポリペプチドは、好ましくは、ｈｓｐ６０ポリペプチドであり、好ましくは、
ＧｒｏＥＬポリペプチドである。

【００４６】好ましいポリペプチドは、ＧｒｏＥＬのアミノ酸配列１９１−３４５または１
９１−３７６、より好ましくは、１９３−３３５または１９１−３３７、あるい
は実質的に相同なシャペロニンの相当する残基、またはその修飾されたもの、突
然変異、または変異型配列を有する。

【００４７】ポリペプチドの分子量は、好ましくは３４ｋＤａである。

【００４８】「修飾」には、例えば、化学的に修飾されたポリペプチドが含まれる。「変異
型」には、例えば、ｈｓｐ６０シャペロニンを有する生体／細胞に見いだされる
種類の天然変異型および天然の多型または突然変異が含まれる。「突然変異」は
、本技術に精通する者にとって既知の突然変異誘発の方法により人工的に導入す
ることもできる。

【００４９】「実質的に相同な」場合、ペプチドは特定のＧｒｏＥＬアミノ酸配列と少なく
とも５０％のアミノ酸配列相同性を有し、好ましくは少なくとも６０％の相同性
、より好ましくは７５％の相同性を有する。勿論、相同性はポリペプチドのヌク
レオチド配列にも存在し、特定のＧｒｏＥＬアミノ酸残基をコードするヌクレオ
チド配列と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％の相同性、より好
ましくは、７５％の相同性を有する。

【００５０】保存的置換が行われる場合は、以下の表を参考に実施できる。第二列目の同じ
枠内で、好ましくは、第三列目の同じ行のアミノ酸は互いに置換できる。

【００５１】

【表１】

【００５２】自然発生のシャペロンタンパク質の合成変異型は、標準組み換えＤＮＡ技術に
より作製できる。例えば、特定部位の突然変異誘発を利用して、自然発生コイル
ドコイル（coiled coil）タンパク質をコードするＤＮＡのコーディング領域に
変化を導入できる。挿入が行われる予定の場所に、挿入部位両側の自然発生配列
に対応する５’および３’フランキング領域と共に挿入をコードする合成ＤＮＡ
。フランキング領域は自然発生配列の部位に対応する好都合な制限部位を含むた
め、自然発生配列は適切な酵素により切断でき、その切断部分に合成ＤＮＡを結
合できる。次にＤＮＡを本発明に従って、発現させ、コードされたタンパク質を
作る。これらの方法は、ＤＮＡ配列の操作に関する本技術において公知の多くの
標準技術の例に過ぎず、その他の既知の方法に使用できる。

【００５３】シャペロニンタンパク質のｈｓｐ６０クラスは構造において相同であり、従っ
て、クラスのメンバー間で保存的なアミノ酸配列または実質的に相同なアミノ酸
配列が存在する。ＧｒｏＥＬは、ｈｓｐ６０シャペロニンタンパク質の単なる一
例であり、相同な先端ドメインを持つ適切なその他のタンパク質が続く。

【００５４】本発明の融合タンパク質は、実現可能な程度に小さなシャペロンフラグメント
を含む。これは、ＮＭＲによるタンパク質の構造決定において、１５Ｎまたは１
３Ｃによる同位体標識がしばしば必要となる場合、特に重要となり得る。これは
高価で、長い融合パートナーの場合、担体タンパク質（例えば、多くの場合ＧＳ
Ｔ）が切断されると、多くの取り込まれた放射能が除去される。

【００５５】［Ｂ：第二の領域］本発明の融合タンパク質の第二の領域は、天然には第一の領域と関連のないあ
らゆる関心あるポリペプチドを含むことができる。通常、これは、目的の配列が
、第一の領域をコードする遺伝子と異なる遺伝子によりコードされて自然に見い
だされることを意味する。これは、公に利用可能な配列データバンクと対照して
第一および第二の領域を検査することにより簡単に決定できる。第二の領域は、
第一の領域と同じ種由来でも、異なる種由来でもよい。第一の領域と第二の領域
は同じタンパク質の一部から得ることも可能であるが、本発明の融合タンパク質
は、本来のタンパク質配列とは異なる様式で存在する。

【００５６】本発明の融合タンパク質は、どんな大きさでも可能であるが、一般に本発明は
、目的の配列が、例えば、２から１００個のアミノ酸長、好ましくは、２から５
０個のアミノ酸長、または２から３０個のアミノ酸長、または５から１０個のア
ミノ酸長の様に、アミノ酸長が短い場合に特に有用である。しかし、１５０、２
００、４００または１０００個のアミノ酸長の様に目的のポリペプチドがより大
きい場合をも意図するものである。本発明は、組み換え技術による製造が現在で
は困難な小さなポリペプチドの調製にも特に有利である。このようなポリペプチ
ドの例として、シャペロンタンパク質のフラグメント、代謝酵素、ＤＮＡおよび
ＲＮＡ結合タンパク質、抗体、ウイルスタンパク質、内因性膜タンパク質（ミト
コンドリアの輸送タンパク質、セブンへリックスレセプター分子、Ｔ細胞レセプ
ター等）、および細胞骨格複合体、抗体結合ペプチド、ペプチドホルモン（リボ
ソーム合成により作られるその他の生物活性ペプチド）、呼吸酵素、ＡＴＰシン
ターゼの様なマルチサブユニット生物学的構造由来の小さなサブユニットが挙げ
られる。一般に、本発明は、あらゆる大きさのペプチドを用いた使用にも適して
いるが、その有利な特性は、小さなポリペプチド、例えば、２から５０アミノ酸
長、特に２から２０アミノ酸長、好ましくは、５から１０アミノ酸長に最も活用
される。

【００５７】本発明の特定の利点は、従来は、非常に短いためにオリゴペプチド合成技術に
より作製されていたペプチドを組み換えＤＮＡ技術により生産できる点である。
従って、例えば、生物活性ペプチドの様なペプチドのライブラリを生産すること
が可能で、これらを、組み換え発現系、特に細菌発現系において安価かつ効率的
にスクリーニングまたは分析することができる。

【００５８】［Ｃ：切断可能なリンカー領域］第一の領域と第二の領域が、切断可能なリンカーにより結合されている場合、
これはこの目的に適ったあらゆる領域が可能である。好ましくは、切断可能なリ
ンカー領域は、タンパク質分解酵素により切断可能なリンカーであるが、例えば
、小さな分子により切断可能なその他のリンカーも使用できる。これらには、臭
化シアンにより切断可能なＭｅｔ−Ｘ部位、ヒドロキシルアミンにより切断可能
なＡｓｎ−Ｇｌｙ、弱酸により切断可能なＡｓｐ−Ｐｒｏ、特にＮＢＳスカトー
ルにより切断可能なＴｒｐ−Ｘが含まれる。タンパク質分解酵素の切断部位は、
例えば、第Ｘａ因子、トロンビン、コラゲナーゼにおいて必要とされ、認められ
る穏やかな切断条件のため好ましい。これらの全てを使用できる。正確な配列は
、本技術において利用可能であり、本技術に精通する者にとって、適切な切断部
位の選択は難しくない。例として、第Ｘａ因子が標的とするタンパク質分解酵素
の切断領域はＩＥＧＲである。エンテロキナーゼが標的とするタンパク質分解酵
素の切断領域は、ＤＤＤＤＫである。トロンビンが標的とするタンパク質分解酵
素の切断領域は、ＬＶＰＲＧである。

【００５９】［Ｄ．核酸］本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸も提供する。これらは、
標準組み換えＤＮＡ技術を用いて作製できる。核酸は、ＲＮＡでもＤＮＡでもよ
いが、ＤＮＡが好ましい。ＲＮＡの場合には、操作はｃＤＮＡ中間体を介して実
施できる。一般に、第一の領域をコードする核酸配列が作製され、適切な制限部
位が５’末端および／または３’末端に供給される。好都合には、この配列は、
ｐＢＲ３２２またはｐＵＣ１９に基づくプラスミドベクターの様な標準実験ベク
ターにおいて操作される（下記参照）。適切な技術の正確な詳細は、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇｂｙＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，１９８９）または同様の標準参考書を参照でき
る。

【００６０】第二の領域をコードする核酸は、同様なベクター系において同様に提供される
。核酸供給源は、発表されている文献またはＧｅｎｂａｎｋの様なデータバンク
を参照することにより確認できる。

【００６１】所望の第一または第二の領域をコードする核酸は、材料を進んで提供する学術
的または商業的な供給源から得ることができ、あるいは配列データだけが入手可
能な場合、適切な配列を合成またはクローニングすることにより得ることができ
る。一般に、問題の遺伝子のクローニングを説明している文献を参照することに
より、これを行うことができる。

【００６２】あるいは、限られた配列データが利用可能な場合、あるいは既知の核酸と相同
の、さもなければ関係している核酸を発現することが望まれる場合には、具体例
としての核酸は、本技術において公知の核酸とハイブリッド形成するヌクレオチ
ド配列であることが特徴である。

【００６３】ハイブリッド形成のストリンジェンシーとは、ポリ核酸ハイブリッドが安定で
ある条件を意味する。本技術に精通する者にとって公知な様に、ハイブリッドの
安定性は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）を反映しており、配列相同性が１％
減少する毎に約１から１．５℃低下する。一般に、ハイブリッドの安定性は、ナ
トリウムイオン濃度と温度の関数である。典型的には、ハイブリッド形成反応は
、より高いストリンジェンシーで実施され、続いて、種々のストリンジェンシー
で洗浄する。

【００６４】本明細書に使用されている高いストリンジェンシーとは、６５−６８℃で１Ｍ
のＮａ＋において安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリッド形
成を可能にする条件を意味する。高いストリンジェンシーの条件は、例えば、６
ｘＳＳＣ、５ｘデンハート溶液、１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０
．１ピロリン酸Ｎａ＋、非特異的競合物質としてサケ精子ＤＮＡを含む水溶液に
おけるハイブリッド形成により提供できる。ハイブリッド形成後、高いストリン
ジェンシーの洗浄が数段階で行われ、最終洗浄（約３０分間）は０．２−０．１
ｘＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにおいてハイブリッド形成温度で行われる。

【００６５】中程度の高いストリンジェンシーとは、約６０−６２℃で行われる以外上記に
説明されている溶液中のハイブリッド形成と同じ条件を意味する。この場合、最
終洗浄は、１ｘＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにおいてハイブリッド形成温度で実施
される。

【００６６】低いストリンジェンシーとは、約５０−５２℃で上記に説明されている溶液中
のハイブリッド形成と同じ条件を意味する。この場合、最終洗浄は、２ｘＳＳＣ
、０．１％のＳＤＳにおいてハイブリッド形成温度で実施される。

【００６７】本明細書に手引きを提供するとすれば、本発明の融合タンパク質の第一または
第二の領域を形成するのに適した核酸は、本技術において既知の方法により入手
可能である。例えば、本発明のＤＮＡは、化学合成により、またはポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、またはゲノムライブラリ、あるいは所望の核酸を
有し、検出可能なレベルでそれを発現すると考えられている供給源から作製され
る適切なｃＤＮＡをスクリーニングすることにより入手可能である。

【００６８】目的の核酸を合成するための化学的方法は本技術において知られており、トリ
エステル、亜リン酸、ホスホルアミダイトおよびＨホスホン酸法、ＰＣＲおよび
その他のオートプライマー法、および固体支持体におけるオリゴヌクレオチド合
成が含まれる。これらの方法は、その核酸の核酸配列全体が知られている場合、
あるいは、コーディング鎖と相補的な核酸配列が利用可能な場合に利用できる。
あるいは、標的アミノ酸配列が知られている場合、各アミノ酸残基に対する公知
の好ましいコーディング残基を利用して、可能性のある核酸配列を推定すること
ができる。

【００６９】融合タンパク質の所望の領域をコードする遺伝子を分離する別の方法は、例え
ば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９の第１４章に説明されているＰ
ＣＲ技術を用いる方法である。この方法は、所望の核酸にハイブリッド形成する
オリゴヌクレオチドプローブを使用する必要がある。オリゴヌクレオチドの選択
方法を下記に示す。

【００７０】ライブラリは、目的の遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質を識別
する様にデザインされたプローブまたは分析手段を用いてスクリーニングされる
。ｃＤＮＡ発現ライブラリに関しては、適切な手段として、所望のタンパク質、
つまり、同じまたは異なる種由来の所望のタンパク質をコードする既知のｃＤＮ
Ａまたは推定ｃＤＮＡをコードする約２０から８０個の塩基長のオリゴヌクレオ
チドおよび／または同物質またはハイブリッド形成ＤＮＡをコードする相補的ま
たは相同のｃＤＮＡまたはそのフラグメントを認識し、特異的に結合するモノク
ローナル抗体またはポリクローナル抗体が含まれる。ゲノムＤＮＡライブラリを
スクリーニングする適切なプローブには、同物質またはハイブリッド形成ＤＮＡ
；および／または相同ゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントをコードするオリゴ
ヌクレオチド、ｃＤＮＡまたはそのフラグメントが含まれるが、それらの限定さ
れない。

【００７１】所望のタンパク質をコードする核酸は、適切なプローブとのハイブリッド形成
条件において、適切なｃＤＮＡまたはゲノムライブラリをスクリーニングするこ
とにより分離できる。

【００７２】本明細書に使用されている様に、プローブは、例えば、公知または所望の配列
と同数、またはそれより多い隣接する塩基と同じ（または相補的な）１０から５
０個、好ましくは１５から３０個、最も好ましくは、少なくとも約２０個の隣接
する塩基を含む一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡである。プローブとして選択される核
酸配列は、擬陽性結果を最小限にとどめるために、十分な長さを有し、十分明確
であるべきである。ヌクレオチド配列は、通常、保存的なヌクレオチド配列また
は高度に相同なヌクレオチド配列、または所望のタンパク質の領域に基づく。プ
ローブとして使用される核酸は、１つ以上の位置で縮重していてよい。縮重オリ
ゴヌクレオチドの使用は、その種における優先的コドン使用が判明していない種
からライブラリをスクリーニングする場合には特に重要である。

【００７３】そこからプローブを作製するために好ましい領域は、リガンド結合部位をコー
ドすると予測される５’および／または３’コーディング配列を含む。例えば、
本明細書において配列番号１として開示されている全長ｃＤＮＡクローンまたは
そのフラグメントはプローブとして、特に第一の領域をコードする遺伝子を分離
するために利用できる。好ましくは、本発明の核酸プローブは、ハイブリッド形
成時にいつでも検出できるように適切な標識手段で標識される例えば、適切な標
識手段は放射性標識である。好ましいＤＮＡフラグメントの標識方法は、本技術
において既知である、ランダムプライマー法においてＤＮＡポリメラーゼのクレ
ノウフラグメントと共にα³²ＰｄＡＴＰを組み込むことによる。オリゴヌクレオ
チドは、通常γ³²Ｐで標識したＡＴＰとポリヌクレオチドキナーゼにより末端標
識される。しかし、例えば、適切な蛍光体またはビオチン化による酵素標識、蛍
光標識の様に、その他の方法（例えば、非放射性）もフラグメントまたはオリゴ
ヌクレオチドの標識に利用できる。

【００７４】実質的に所望の配列全体を含むＤＮＡの一部または前記ＤＮＡの一部に基づく
適切なオリゴヌクレオチドを用いるライブラリのスクリーニング後、ハイブリッ
ド形成シグナルを検出することにより陽性クローンが同定され、同定されたクロ
ーンは、制限酵素マッピングおよび／またはＤＮＡ配列分析により特徴づけられ
、次にそれらが完全なポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでいるかどうか（
すなわち、それらが翻訳開始および終結コドンを含むかどうか）を確認するため
に検査される。選択されたクローンが不完全ならば、複数の重複したクローンを
得るために同じまたは異なるライブラリを再スクリーニングするためにそれらを
使用できる。もしもライブラリがゲノムならば、重複したクローンはエクソンま
たはイントロンを含むことができる。もしもライブラリがｃＤＮＡのライブラリ
ならば、重複したクローンはオープンリーディングフレームを含む。いずれの場
合も、本明細書に提供されているＤＮＡと推定されたアミノ酸配列と比較するこ
とにより、完全なクローンを識別することができる。

【００７５】本発明の核酸は、ヌクレオチドの置換、ヌクレオチドの削除、ヌクレオチドの
挿入またはヌクレオチド伸長の逆位、およびそれらの組み合わせ全てにより容易
に修飾され得ると考えられる。この様な突然変異体は、自然界に見られる配列と
異なるアミノ酸配列を持つ突然変異体を産生するために使用できる。突然変異誘
発は、あらかじめ決定される（部位特異的）または無作為である。サイレント突
然変異ではない突然変異は、配列をリーディングフレームの外側に配置してはな
らない。好ましくは、ハイブリッド形成して、ループまたはヘアピンの様な二次
ｍＲＮＡ構造を生産する可能性がある相補的領域を作り出さない。

【００７６】前記の方法は、勿論、本発明の融合タンパク質の全ての部分において有用な配
列の同定および修飾または産生に応用できる。特に、配列番号１として本明細書
に記載されているＩＦ₁ポリペプチドのコイルドコイルの配列、または上記に論
じられているその適切なフラグメントを、更なる適切な配列を同定するためのプ
ローブとして使用できる。

【００７７】第一または第二の領域も、適切な制限酵素部位を介して、第一の領域をコード
する核酸に結合される末端に適切な制限酵素部位を導入する様に操作することが
できる。望ましくは、その部位は同一か、少なくとも適合する付着末端を有する
。勿論、第一および第二の領域は、別の手段によっても結合できる。例えば、第
一の領域は、第二の領域を分離または複製するために使用されるプライマーの中
に組み込むことができる。

【００７８】タンパク質分解酵素により切断可能なリンカー領域が必要な場合、これは、結
合された第一および第二の領域の中に（例えば、この２つを結合する制限部位に
）導入するか、あるいはそれらを結合する前にどちらか一方に導入することがで
きる。

【００７９】［Ｅ．発現ベクターと宿主細胞］本発明の融合タンパク質をコードする核酸、またはその構成成分は、更なる操
作のためにベクターに組み込むことができる。本明細書に使用されているベクタ
ー（またはプラスミド）とは、異種ＤＮＡをその発現または複製のために細胞内
に導入するために使用される独立した要素を意味する。この様な媒体の選択およ
び使用は、本発明の技術の範囲内である。多くのベクターが利用可能で、適切な
ベクターの選択は、ベクターの使用目的、すなわち、ＤＮＡ増幅に使用されるか
またはＤＮＡ発現に使用されるのかに応じて、ベクターに挿入されるＤＮＡの大
きさに応じて、またベクターにより形質転換される宿主細胞に応じて変わる。各
ベクターは、その機能（ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）とベクターが適合す
る宿主に基づき、種々の構成成分を含む。ベクター構成成分は一般に、以下の成
分、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー成分、プロモーター、
転写終結配列、シグナル配列のうちの１つ以上を含むが、それらに限定されない
。

【００８０】一般に、発現ベクターもクローニングベクターも、１つ以上の選択された宿主
細胞においてベクターの発現を可能にする核酸配列を含む。典型的には、クロー
ニングベクターにおいて、これらの配列により、宿主染色体ＤＮＡと独立してベ
クターを複製することが可能となり、これらの配列は複製起点または自律複製配
列を含む。この様な配列は種々の細菌、酵母、ウイルスに関して知られている。
プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、殆どのグラム陰性菌に適しており、
２μプラスミド由来のものは酵母人工染色体に適しており、種々のウイルス由来
のものは哺乳動物細胞（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス）におけるベク
ターのクローニングに有用である。一般に、ＣＯＳ細胞のような高度のＤＮＡ複
製能を持つ哺乳動物細胞に使用されない限り、複製起点成分は哺乳動物の発現ベ
クターには不要である。

【００８１】殆どの発現ベクターがシャトルベクターである。すなわち、生物体の少なくと
も１クラスにおいて複製できるが、発現のために別の生物体に形質移入できる。
例えば、あるベクターは、宿主細胞の染色体と独立して複製できないが、大腸菌
内でクローニングされ、次に同じベクターが酵母または哺乳動物細胞の中に形質
移入される。宿主ゲノムの中に挿入することによりＤＮＡを複製することも可能
である。しかし、本発明の融合タンパク質をコードするゲノムＤＮＡの回収は、
ＤＮＡを切り取るために制限酵素による消化が必要なため、他の生物体で複製さ
れたベクターよりも複雑である。ＤＮＡは、ＰＣＲにより増幅でき、複製成分無
しで宿主細胞内に直接移入できる。

【００８２】有利には、発現ベクターとクローニングベクターは、選択可能遺伝子とも呼ば
れる選択遺伝子を含むことができる。この遺伝子は、選択的な培地で成長する形
質転換宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子
を含むベクターにより形質転換されない宿主細胞は、培地で生存しない。典型的
な選択遺伝子は、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラ
サイクリンの様な抗生物質およびその他の毒素に対する耐性を付与するタンパク
質をコードし、栄養要求性欠乏を補足し、あるいは複合培地から利用できない重
要な栄養素を供給する。

【００８３】酵母に適切な選択遺伝子マーカーに関して、マーカー遺伝子の表現型発現によ
る形質転換体の選択を容易にする任意のマーカー遺伝子が利用できる。酵母に適
切なマーカーは、例えば、抗生物質Ｇ４１８、ヒグロマイシンまたはブレオマイ
シンに対する耐性を付与するものであり、あるいは栄養要求性酵母突然変異株に
原栄養性を供給し、例えば、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２，ＬＹＳ２、ＴＲＰ１またはＨ
ＩＳ３遺伝子が挙げられる。

【００８４】ベクターの複製は、好都合には大腸菌において行われ、有利には大腸菌遺伝子
マーカーと大腸菌複製起点が含まれる。これらは、ｐＢＲ３２２、Ｂｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ（商品名）ベクターまたはｐＵＣプラスミド、例えば、ｐＵＣ１８また
はｐＵＣ１９の様な大腸菌プラスミドから得られ、大腸菌複製起点と、アンピシ
リンの様な抗生物質に耐性を付与する大腸菌遺伝子マーカーとの両者を含む。

【００８５】哺乳動物細胞に適切な選択マーカーは、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ
、メトトレキセート耐性）、チミジンキナーゼ、またはＧ４１８またはヒグロマ
イシンに対する耐性を付与する遺伝子の様な、ベクター核酸を取り込む能力を有
する細胞の識別を可能にするものである。哺乳動物細胞形質転換体は、そのマー
カーを取り込み、発現している形質転換体だけが適応して生存できる選択圧下に
置かれる。

【００８６】ＤＨＦＲまたはグルタミンシンターゼ（ＧＳ）マーカーの場合、圧力が徐々に
高くなる条件において形質転換体を培養することにより、選択圧をかけることが
でき、これによって選択遺伝子と、融合タンパク質をコードする結合されたＤＮ
Ａの両者の増幅（その染色体組み込み部位において）を引き起こすことができる
。増幅は、成長に重要なタンパク質の生産に対する要求がより大きい遺伝子が、
所望のタンパク質をコードできる近接して結合された遺伝子と共に、組み換え細
胞の染色体内で縦列に反復される過程である。増量された所望のタンパク質は、
通常この様に増幅されたＤＮＡから合成される。

【００８７】発現ベクターとクローニングベクターは、通常、宿主生物体により認識される
プロモーターを含み、核酸をコードする融合タンパク質に作動可能に結合されて
いる。この様なプロモーターは、制限酵素消化により供給源のＤＮＡからプロモ
ーターを除去し、分離されたプロモーター配列をベクターに挿入することにより
、融合タンパク質をコードするＤＮＡに作動可能に結合される。融合タンパク質
の構成成分の１つである本来のプロモーター配列も、多くの異種プロモーターも
共に、ＤＮＡの増幅および／または発現を命令するために利用できる。「作動可
能に結合された」という用語は、説明されている成分が、その意図する様式で機
能できる様な関係にある近位を意味する。「作動可能に」コーディング配列に結
合されている調節配列は、コーディング配列の発現が、調節配列と適合する条件
で達成される様に結合されている。

【００８８】原核生物宿主と共に使用するのに適したプロモーターには、例えば、βラクト
マーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトフ
ァン（ｔｒｐ）プロモーター系、およびｔａｃプロモーターの様なハイブリッド
プロモーターが含まれる。それらのヌクレオチド配列は公開されており、それに
よって本技術に精通する者は、必要なあらゆる制限部位を供給するために、リン
カーまたはアダプターを使用して、融合タンパク質をコードするＤＮＡにそれら
を機能できる様に結合することができる。一般に、細菌系に使用するためのプロ
モーターは、融合タンパク質をコードするＤＮＡに作動可能に結合されたシャイ
ン・ダルガーノ配列も含む。

【００８９】好ましい発現ベクターは、細菌発現ベクターで、これは細菌において機能でき
るファージｘまたはＴ７の様なバクテリオファージのプロモーターを含む。最も
広く使用されている発現系の１つにおいて、融合タンパク質をコードする核酸は
、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによりベクターから転写できる（Ｓｔｕｄｉｅｒｅ
ｔａｌ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．１８５；６０−８９，１
９９０）。ｐＥＴベクターと組み合わせて使用される大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）
宿主株において、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは宿主細菌においてλ溶原ＤＥ３から
生産され、その発現は、ＩＰＴＧ誘導性ｌａｃＵＶ５プロモーターの調節下にあ
る。この系は、多くの球状タンパク質の過剰生産に使用され、成功しているが、
多くのその他の例においては、過剰生産の毒性のために、過剰生産は達成できな
い（Ｓｔｕｄｉｅｒｅｔａｌ．，１９９０；Ｇｅｒｏｇｅｅｔａｌ，
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５；４２４４−４３５，１９９４）。あるい
は、ポリメラーゼ遺伝子は、ラムダファージにおいて、市販の（Ｎｏｖａｇａｎ
社製，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）ＣＥ６ファージの様なｉｎｔファージによる
感染により導入できる。その他のベクターには、ＰＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ社製，ＮＬ）の様なラムダＰＬプロモーターを含むベクター、ｐＴｒｃＨｉｓ
ＸｐｒｅｓｓＴｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）またはｐＴｒｃ９９（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製，ＳＥ）の様なｔｒｃプロモーターを含むベク
ター、またはｐＫＫ２２３−３（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）ま
たはＰＭＡＬ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製，ＭＡ，ＵＳＡ）
の様なｔａｃプロモーターを含むベクターが挙げられる。

【００９０】更に、本発明の融合タンパク質は、細菌宿主からのポリペプチドの分泌を促進
するために、分泌配列を含むことが可能である。その結果、ポリペプチドは封入
体内ではなく、可溶性天然ペプチドとして生産される。ペプチドは、ペリプラス
ム間隙から、あるいは培地から適切に回収できる。

【００９１】酵母宿主と共に使用するための適切な促進配列は、調節的でも構成的でもよく
、好ましくは、高度に発現される酵母遺伝子、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子から得られる。従って、ＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＨ
ＩまたはＡＤＨＩＩ遺伝子、酸性ホスファターゼ（ＰＨ０５）遺伝子のプロモー
ター、ａ因子またはα因子をコードする酵母接合フェロモン遺伝子類由来のプロ
モーター、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（Ｇ
ＡＰ）、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルビ
ン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イ
ソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオー
スリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼまたはグルコキナーゼ遺
伝子等のプロモーターの様な糖分解酵素をコードする遺伝子、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓａｅＧａｌ４遺伝子、Ｓ．ｐｏｍｂｅｎｍｔ１遺伝子から得られる
プロモーター、またはＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＴ）遺伝子のプロモーター
が利用できる。更に、ある酵母遺伝子の上流活性化配列（ＵＡＳ）と別の酵母遺
伝子の機能性ＴＡＴＡボックスを含む下流プロモーター成分から成るハイブリッ
ドプロモーターを利用することもでき、例えば、酵母ＰＨ０５遺伝子のＵＡＳ（
ｓ）と酵母ＧＡＰ遺伝子の機能性ＴＡＴＡボックスを含む下流プロモーター成分
を含むハイブリッドプロモーターがある（ＰＨ０５−ＧＡＰハイブリッドプロモ
ーター）。適切な構成性ＰＨ０５プロモーターは、例えば、ＰＨ０５遺伝子のヌ
クレオチド−１７３から始まり、ヌクレオチド−９で終わるＰＨ０５（−１７３
）プロモーター成分の様な、上流域調節成分（ＵＡＳ）を欠いた短縮された酸性
ホスファターゼＰＨ０５プロモーターである。

【００９２】哺乳動物宿主におけるベクターからの融合タンパク質遺伝子の転写は、ポリオ
ーマウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫
ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、シミアンウイル
ス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから得られるプロモーター、アクチン
プロモーターまたはリボソームタンパク質プロモーターの様な非常に強力なプロ
モーター等の異種哺乳動物プロモーター、融合タンパク質の成分をコードする遺
伝子と通常結合しているプロモーターにより調節される。

【００９３】高等真核生物による融合タンパク質をコードするＤＮＡの転写は、ベクターに
エンハンサー配列を挿入することにより増大することができる。エンハンサーは
比較的方向性と位置に無関係である。多くのエンハンサー配列が、哺乳動物遺伝
子由来のもので公知である（例えば、エラスターゼおよびグロビン）。しかし、
典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例として、複製
起点（塩基対１００−２７０）の後期側にＳＶ４０エンハンサーとＣＭＶ早期プ
ロモーターエンハンサーを含む。エンハンサーは、コーディング配列の５’また
は３’の位置でベクター内にスプライシングできるが、好ましくは、プロモータ
ーの５’側に配置される。

【００９４】有利には、融合タンパク質をコードする真核発現ベクターは、遺伝子座調節領
域（ＬＣＲ）を含む。ＬＣＲは、宿主細胞クロマチンに組み込まれた導入遺伝子
の発現とは無関係に、高レベルの組み込み部位を命令することができ、これは遺
伝子治療用に設計されたベクターにおいて、または形質転換された動物において
、ベクターの染色体組み込みが行われた永久トランスフェクションされた真核細
胞系に関連して、融合タンパク質遺伝子が発現される場合に、特に重要である。

【００９５】発現ベクターには、ＤＮＡを発現できるプロモーター領域の様な調節配列と作
動可能に結合される核酸を発現できる全てのベクターが含まれる。従って、発現
ベクターとは、適切な宿主細胞に導入されると、クローン化されたＤＮＡの発現
を引き起こす、プラスミド、ファージ、組み換えウイルスまたはその他のベクタ
ーの様な組み換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を意味する。適切な発現ベクターは
、本技術において通常の技術を有する者にとって知られており、真核および／ま
たは原核細胞において複製可能なもの、およびエピソームのままでいるもの、あ
るいは宿主細胞ゲノムに組み込まれるものが含まれる。例えば、本発明の融合タ
ンパク質をコードするＤＮＡは、ｐＥＶＲＦ（Ｍａｔｔｈｉａｓ，ｅｔａｌ．
，（１９８９）ＮＡＲ１７，６４１８）等のＣＭＶエンハンサーに基づくベク
ターの様に、哺乳動物細胞におけるｃＤＮＡの発現に適したベクターに組み込ま
れる。

【００９６】哺乳動物細胞において融合タンパク質をコードするＤＮＡの一過性発現をする
発現ベクターが本発明の実施に特に有用である。一過性発現とは、通常、宿主細
胞における効率的な複製が可能な発現ベクターの利用が含まれ、その結果宿主細
胞は発現ベクターの多くのコピーを蓄積でき、次に高濃度の融合タンパク質を合
成することができる。本発明の目的のために、一過性発現系は、例えば、融合タ
ンパク質の突然変異体を識別するために、リン酸化の可能性のある部位を同定す
るために、あるいはタンパク質の機能性ドメインの特徴を明らかにするために有
用である。

【００９７】本発明のベクターの作製には、通常の結合技術を用いる。分離されたプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントを切断し、調整し、必要なプラスミドを産生するた
めに望ましい形態に再結合する。所望により、作製されたプラスミドにおける適
正な配列を確認するための分析を既知の方法で実施する。発現ベクターの構築、
転写物のｉｎｖｉｔｒｏ作製、宿主細胞内へのＤＮＡの導入、発現と機能の分
析に関する適切な方法は、本技術において公知である。遺伝子の存在、増幅およ
び／または発現は、例えば、ｍＲＮＡの転写を定量には従来のサザンブロッティ
ング、ノーザンブロッティング分析により、ドットブロッティング（ＤＮＡまた
はＲＮＡ分析）、または本明細書に記載されている配列に基づく適切に標識され
たプローブを用いるｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、試料中で直
接測定できる。本技術に精通する者は、所望により、これらの方法を改変できる
ことは容易に予想できるであろう。

【００９８】更に、本発明は、宿主細胞において第一の核酸配列を発現できるプロモーター
に作動可能に結合されたコイルドコイル構造を形成できるポリペプチドをコード
する第一の核酸配列と、前記核酸配列に結合され、該第一の核酸配列と融合して
発現できる様に第二の核酸配列の挿入を可能にするクローニング部位を含む発現
ベクターとを提供する。この様なベクターは、本発明の融合タンパク質の形態で
所望のあらゆるポリペプチドをコードする核酸を発現するための有用な手段であ
る。

【００９９】本発明の更なる実施例は、本発明のポリヌクレオチドの複製と発現を行うため
のベクターにより形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を提供す
る。細胞は、ベクターに適合するように選択され、例えば、細菌、酵母、昆虫ま
たは哺乳動物細胞が可能である。

【０１００】原核、酵母、高等真核細胞の様な宿主細胞が、ＤＮＡの複製および融合タンパ
ク質の生産に利用できる。適切な原核生物には、真正細菌、大腸菌Ｋ−１２株、
ＤＨ５αおよびＨＢ１０１などの大腸菌、バチルス属の様なグラム陰性菌および
グラム陽性菌等が含まれる。融合タンパク質をコードするベクターに適した更な
る宿主には、糸状菌またＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓａｅ等の
酵母の様な真核微生物が含まれる。高等真核細胞には昆虫および脊椎動物細胞、
特に哺乳動物細胞が含まれる。近年、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の
増殖が通常の手法になった。有用な哺乳動物宿主細胞系の例として、チャイニー
ズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、または２
９３Ｔ細胞などの上皮または繊維芽細胞が挙げられる。本明細書に言及されてい
る宿主細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏの細胞と宿主動物内にある細胞を含む。

【０１０１】ＤＮＡは、本技術において既知の方法を用いて、細胞内に安定して組み込む事
も、一過性に発現させることもできる。安定してトランスフェクションされた哺
乳動物細胞は、選択マーカーを持つ発現ベクターにより細胞をトランスフェクシ
ョンし、トランスフェクションされた細胞をマーカー遺伝子を発現する細胞を選
択する条件で成長させることにより作製できる。一過性トランスフェクタントを
作製するために、トランスフェクション効率を監視するために、哺乳動物細胞を
リポーター遺伝子によりトランスフェクションする。

【０１０２】この様な安定して、または一過性にトランスフェクションされた細胞を作製す
るために、細胞は、融合タンパク質を形成するために、十分量の融合タンパク質
をコードする核酸によりトランスフェクションされる。融合タンパク質をコード
するＤＮＡの正確な量は、経験的に決定でき、特定の細胞と分析に関して最適化
される。

【０１０３】宿主細胞は、上記に説明された本発明の発現ベクターまたはクローニングベク
ターによりトランスフェクションされ、あるいは、好ましくは形質転換され、プ
ロモーターの誘導、形質転換体の選択、所望の配列をコードする遺伝子の増幅に
適するように適当に改変された通常の栄養培地において培養される。異種ＤＮＡ
は、リン酸カルシウム共沈法またはエレクトロポレーションによる異種ＤＮＡを
コードするベクターによるトランスフェクションを用いるトランスフェクション
の様な、本技術において既知のいずれの方法によっても宿主細胞に導入できる。
多くのトランスフェクション法が本技術に精通する者にとって公知である。トラ
ンスフェクションの成功は一般に、宿主細胞におけるこのベクターの作用の何ら
か徴候が現れた時に認識される。形質転換は、使用する特定の宿主細胞に適切な
通常の技術を用いて達成される。

【０１０４】クローン化ＤＮＡの適切な発現ベクターへの取り込み、プラスミドベクターま
たはそれぞれが１つ以上の異なる遺伝子をコードするプラスミドベクターの組み
合わせ、または線状ＤＮＡを用いる真核細胞のトランスフェクションは、本技術
において既知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（１９８９）Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓを参照。）。

【０１０５】トランスフェクションまたは形質転換された細胞は、本技術において既知の培
地と培養方法を用いて、好ましくは、ＤＮＡによりコードされた融合タンパク質
が発現される条件で培養される。適切な培地の組成は本技術において知られてお
り、従って、容易に調製できる。適切な培地は市販のものも利用できる。

【０１０６】本発明の方法において使用できる好ましい細菌宿主は、ＢＬ２１の様な大腸菌
のＢ株またはＪＭ１０９の様なＫ株が挙げられる。Ｂ株は、ｌｏｎプロテアーゼ
を欠失しており、この遺伝子型を持つその他の株も利用できる。好ましくは、菌
株は組み換え遺伝子を欠失していない。

【０１０７】Ｓｔｕｄｉｅｒｅｔａｌ．（１９９０）に明らかにされているように、菌
株はＢＬ２１（ＤＥ３）が最も好ましい。異種ポリペプチドの発現が改善された
ものを選択することによって得られる細菌であって、任意選択的に元のベクター
が除去された細菌も本発明において宿主細胞として使用できる。特定の細菌には
、大腸菌Ｃ４３（ＤＥ３）（ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆ
ＣｅｌｌＣｕｏｔｕｒｅｓ（ＥＣＣＣ），Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓ
ｈｉｒｅ，ＵＫにＢ９６０７０４４５として１９９６年７月４日に供託された）
、大腸菌Ｃ０２１４（ＤＥ３）（ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ
ｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅｒｉａにＮＣ
ＩＭＢ４０８８４として１９９７年６月２５日に供託された）、大腸菌ＤＫ８
（ＤＥ３）Ｓ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓｏｆＩｎｄｕｓ
ｔｒｉａｌａｎｄＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅｒｉａにＮＣＩＭＢ４０８８
５として１９９７年６月２５日に供託された）、または、大腸菌Ｃ４１（ＤＥ３
）（ＥＣＣＣにＢ９６０７０４４４として１９９６年７月４日に供託された）が
含まれる。この様な細菌は除去がされると、宿主において本発明の融合タンパク
質を発現し、その発現が細菌に対して毒性を有する場合、融合タンパク質の発現
に特に適している。

【０１０８】［Ｆ．融合タンパク質の生産とそれらの処理］本発明の宿主細胞は、融合タンパク質の発現が起こる条件において培養される
。融合タンパク質は、例えば、アフィニティークロマトグラフィーまたはＨＰＬ
Ｃの様な適切な手段のいずれによっても回収できる。小さな融合タンパク質が関
係している場合、ＨＰＬＣが特に適している。

【０１０９】融合タンパク質は、例えば、適切なタンパク質分解酵素を用いて切断され、目
的のポリペプチドが提供される。この配列は、融合タンパク質の第一および第二
の領域の得られた混合物から回収できる。

【０１１０】あるいは、融合タンパク質は、コイルドコイルが凝集体を形成する場合、例え
ば、免疫原としての応用が可能である。これによって、小さなタンパク質および
ペプチドを別の化学反応によりキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）の
様な担体タンパク質に結合させることにより、これらの小さなタンパク質および
ペプチドから免疫原性物質を作製する必要性が無くなる。

【０１１１】［Ｈ．ＮＭＲによる研究］本発明の融合タンパク質は、非常に小さな融合パートナーを含んでいる。その
一つの利点は、得られたスペクトルに融合パートナーが干渉することなく、融合
タンパク質をＮＭＲによる研究に直接使用できる点である。

【０１１２】ＮＭＲ分析は、例えば、引用する事により本明細書の一部をなすものとするＫ
．Ｗｕｒｔｒｉｃｈ，“ＮＭＲｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓａｎｄＮｕｃｌ
ｅｉＡｃｉｄｓ“，Ｗｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８６に説明さ
れている様に、本技術において既知の技術と方法により実施できる。

【０１１３】本発明は、以下の実施例を参考に説明される。

【０１１４】［実施例１］［ＧｒｏＥＬ融合ベクターの作製］ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、Ｎ末端ヒスチジン標識、ＧｒｏＥ
Ｌの１９１−３４５フラグメント、トロンビン切断部位および複数のクローニン
グ部位を含むＤＮＡフラグメントを作製する。５’−フランキングＰＣＲプライ
マーは、５’−ＡＧＡＣＧＧＡＣＴＧＣＣＡＴＡＴＧＣＡＴＣＡ
ＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＡＡＧＧＴＡＴＧＣＡＧＴＴ
ＣＧＡＣＣ−３’である。３’−フランキングプライマーは、５’−ＡＴＴ
ＧＡＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＴＡＣ
ＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＡ
ＣＧＣＧＧＡＡＣＣＡＧＡＣＣＡＣＧＧＣＣＣＴＧＧＡＴＴ
ＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＡＣＣＣ−３’である。ＰＣＲ増幅の鋳型は、
Ｚａｈｎｅｔａｌ．，（１９９６）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９３：１５０２４
−１５０２６に説明されている通りである。得られたフラグメントは、ＮｄｅＩ
およびＨｉｎｄＩＩＩにより消化されたＰＲＥＳＥＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
）の中にクローニングされ、ｐＨＧｒｏが作製される（図１参照。）。

【０１１５】ヒトのテネイシン（tenascin）とヒトＦＫＢＰのフィブロネクチンＩＩＩ型ド
メインを、ＢａｍＨおよびＥｃｏＲ１を用いてｐＨＧｒｏの中にサブクローニン
グする。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅリボヌクレアーゼＨＩの残基２−６２を、Ｐ
ＣＲによりゲノムでから増幅し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を介して
、やはり、ＧｒｏＥＬシャペロンタンパク質のフラグメントとヒスチジン標識を
含むｐＲＳＥＴａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のなかにサブクローニング
する。ＰＣＲ増幅に使用されるプライマーの配列は以下の通りである。

【０１１６】５’ＧＣＡＣＣＴＡＧＧＣＧＴＴＣＣＧＴＴＣＣＣＴＴＧＡＡＧＡＴＧＣＧＣ（
順方向）５’−ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＡＣＴＴＣＣＡＴＡＧＴＴＡＧＡＴＧＴＡＧＴ
ＡＴＴＴＧＧ（逆方向）

【０１１７】ベクターは、２ｘＴＹ培地において発現テストに使用される大腸菌株ＢＬ２１
（ＤＥ３）Ｃ４１（Ｎｏｖａｇａｎ：ＭｉｒｏｕｘＢ．，およびＷａｌｋｅｒ
，Ｊ．Ｅ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０，２８９−２９８）を形
質転換するために使用される。形質転換体は、ポリエチレングリコール法を用い
て得られる（Ｃｈｕｎｇ，ｅｔａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６，２１７２−２１７５）。

【０１１８】［実施例２］［融合タンパク質の発現と精製］０．２５Ｌの２ＸＴＹ培地と１ｍＬあたり２０μｇのアンピシリンを含む２Ｌ
の振とうフラスコにｐＨＧｒｏ融合ベクターを含む４Ｃ４１コロニーを接種す
る。培養を、２００ｒｐｍでオービタルシェーカーの中で、２８℃で成長させる
。０．３のＡｂ６００値で、最終濃度を５０μＭとして、イソプロピルＢ−Ｄチ
オガラクトシド（ＩＰＴＧ）により発現を誘導する。誘導の２０時間後、遠心分
離により細胞を収集し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２と１５
０ｍＭのＮａＣｌと１０ｍＭのβメルカプトエタノールとＰＭＳＦ（最終濃度０
．５ｍＭ）を含む２００ｍＬの溶液に再懸濁する。懸濁液を、Ｍｉｓｏｎｉｘ
Ｉｎｃ．ＭｏｄｅｌＮｏ．ＸＬ２０２０超音波発生装置の出力レベルを８として
、１秒間のパルス処理と３秒間の氷上冷却処理を合計１２分間行い、１５ｋｒｐ
ｍで３０分間遠心分離にかける。不溶分画を１００ｍＬの超音波処理緩衝液に再
懸濁し、再超音波処理と再遠心分離を行う。

【０１１９】バッチ方式で精製を行う。遠心分離されたタンパク質溶液を合わせ、１０ｍＬ
のＮｉ²⁺で荷電されたイミノ二酢酸樹脂（Ｓｉｇｍａ社製）を加える。溶液を４
℃で３時間攪拌し、樹脂を５０ｍＬ超音波処理緩衝液で３回洗浄し、続いて５０
ｍＬの５０ｍＭトリズマ塩基／トリズマ塩酸（Ｓｉｇｍａ社製）緩衝液、ｐＨ８
．４＋１０ｍＭメルカプトエタノールにより２回洗浄する。１分間洗浄しては、
遠心分離により樹脂を分離する。ｐＨＧｒｏの融合毎にこの工程を繰り返す。２
５０ｍＬのイミダゾールを含む５０ｍＬの緩衝液を用いて、樹脂から融合タンパ
ク質を溶出する。５０ｍＬのトリス緩衝液、ｐＨ８．４と１０ｍＭのＢ−メルカ
プトエタノールをヒトＦＫＰＢ１２に使用し、テネイシンとリボヌクレアーゼＨ
ＩにｐＨ７．４のものを使用する。リボヌクレアーゼＨＩドメインの溶出中に１
５０ｍＭの塩化ナトリウムを含める必要がある。６００単位のトロンビン（Ｓｉ
ｇｍａ社製）をＦＫＢＰ１２に加え、５０ユニットを他の２つに加える。室温で
約２０時間後、生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓｈａｇｇｅｒ，Ｈ．，ａｎｄＪ
ａｇｏｗ，Ｇ．（１９８７）ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ１６６，３６８−３７９）により分析する。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆ
ｏｒｄ社の色素結合法に基づくＢｉｏ−Ｒａｄ社のタンパク質分析溶液を用いて
評価する。牛血清アルブミンを使用して、検量曲線を作成する。

【０１２０】試験するタンパク質は、培地１Ｌあたり平均４００ｍｇまで生産される。これ
は総可溶性タンパク質の約３０％である。３つの融合タンパク質は全て、金属ア
フィニティークロマトグラフィーにかけている間、典型的な様式で行動し、トロ
ンビンはＧｒｏＥＬフラグメントを全てのケースにおいてうまく除去する（図２
参照）。テネイシンとリボヌクレアーゼＨＩは、ＧｒｏＥＬの完全除去に少量の
トロンビンしか必要としない。ＦＫＢＰ１２の場合には、トロンビン処理後、少
量の融合タンパク質が残る。これは、トロンビンを使用した場合、他のＦＫＢＰ
融合タンパク質でも経験されたことで、予想された事である。

【０１２１】Ｎ末端ヒスチジン標識をつけたＧｒｏＥＬの１９１−３４５先端フラグメント
は、良好な融合タンパク質の基準を満足する。これは、大腸菌において可溶性融
合タンパク質として高濃度まで過剰発現が可能で、小さく、またニッケルアフィ
ニティークロマトグラフィーを用いて簡単に精製できる。単量体なので、この発
現系は、二量体融合タンパク質による多量体タンパク質の発現に伴う問題が生じ
ることはない。

【０１２２】［実施例３］［ＮＭＲ標本の調製］ ¹⁵Ｎまたは¹⁵Ｎと¹³Ｃによるタンパク質の均質な標識は、それぞれ窒素および
炭素源として、¹⁵ＮＨ₄Ｃｌまたは¹³Ｃ６グルコースを含む最小培地で細胞を成
長させることにより達成される。１０％の¹³Ｃ標識タンパク質は、１０％の¹³Ｃ ₆ グルコースと９０％の未標識グルコースを成長培地に混合することにより作製
される。０．５Ｌの培養を２５０ｒｐｍで振とうし、２８℃で、６００ｎｍで吸
光度０．２ＡＵまで成長させる。タンパク質発現を、０．２ｍＭのイソプロピル
−Ｄ−チオガラクトシドを用いて１６時間誘導し、収集した細胞を１６ｍＭのＮ
ａ₂ＨＰＯ４、４ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１０
ｍＭのβメルカプトエタノールの中に再懸濁する。細胞に対し、超音波処理を２
回行い、細胞溶解産物を１７，０００ｒ．ｐ．ｍで３０分間遠心分離する。上清
をニッケルアフィニティークロマトグラフィー（Ｓｉｇｍａ社製）にかけ、融合
タンパク質を、５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１
０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、２５０ｍＭのイミダゾールにより溶出する
。タンパク質１ｍＬあたり５Ｕのトロンビンを用いて、融合タンパク質のトロン
ビン消化により、ＧｒｏＥＬ標識フラグメントからリボヌクレアーゼＨＩフラグ
メントを解離させる。これは、室温で２時間実施される。リボヌクレアーゼＩＩ
は、５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．４および１０ｍＭのβ−メルカプトエタノ
ールにおいて、１ＭのＮａＣｌの勾配（０−１００％）でヘパリンハイパーＤカ
ラム（Ｓｉｇｍａ社製）を用いてＧｒｏＥＬフラグメントから精製される。リボ
ヌクレアーゼＨＩを含む分画を５０ｍＭの酢酸緩衝液、ｐＨ３．６と５ｍＭのＤ
ＴＴに対して一晩透析し、アミコン濃縮器で濃縮する。

【０１２３】ＮＭＲ試料は、１０％のＤ₂Ｏを含むＨ₂Ｏ、または１００％のＤ₂Ｏのどちら
かにおいて、５０ｍＭの酢酸緩衝液、ｐＨ３．６と５ｍＭのＤＴＴの中に約２ｍ
Ｍのタンパク質を含んでいた。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｎ末端ヒスチジン標識、ＧｒｏＥＬの１９１−３４５フラグメント、トロンビ
ン切断部位、複数のクローニング部位から成るプラスミドｐＨＧｒｏを示す図で
ある。

【図２】ｐＨＧｒｏ発現および精製系のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。１４，０００−
７０，０００ダルトンの範囲の分子量標準をレーン５、１０、１５にローディン
グする（Ｓｉｇｍａ社製＃ＳＤＳ−７ＤａｌｔｏｎＭａｒｋＶＩＩ−Ｌ ^TM ）。超音波処理抽出物の分析は、テネイシン（レーン１）、リボヌクレアーゼ
ＨＩ（レーン６）、ＦＫＢＰ１２（レーン１１）融合タンパク質は全て高濃度に
過剰発現されることを示している。ニッケル親和性樹脂による３時間のインキュ
ベーション後、融合タンパク質の視認可能なトレース全てが、テネイシン（レー
ン２）、リボヌクレアーゼＨ１（レーン７）、ＦＫＢＰ（レーン１２）超音波処
理抽出物から除去される。テネイシン、リボヌクレアーゼＨ１、ＦＫＢＰ１２融
合タンパク質は、溶出緩衝液の中に解離される（それぞれレーン３、８、１３）
。トロンビンは、テネイシン（レーン４）、リボヌクレアーゼＨ１（レーン９）
、ＦＫＢＰ（レーン１４）からＧｒｏＥＬフラグメントをうまく除去する。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年７月９日（２００１．７．９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 24/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 24/08 ５１０ＰＣ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA04 CA07 CA10 DA06 EA03 EA04 GA11 HA01 HA12 4B064 AG01 CA02 CA19 CA21 CC24 CE12 4B065 AA26X AA26Y AB01 AC14 BA02 BD01 BD14 BD45 CA24 4H045 AA10 AA20 AA30 BA41 CA11 EA50 FA74 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）シャペロンポリペプチドのフラグメントを含む第一の領
域と、ｂ）第一の領域とは本来関連のない第二の領域であって、関心あるポリペプチド
配列を含む第二の領域とを含む融合タンパク質。
【請求項２】前記第一の領域と前記第二の領域との間に切断可能なリンカ
ー領域を更に含む請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】前記第一の領域が、タンパク質のＮ末端またはその近位にあ
る請求項１または２記載の融合タンパク質。
【請求項４】前記関心あるポリペプチド配列が２から２５０個のアミノ酸
長である請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項５】前記関心あるポリペプチド配列が真核生物由来である請求項
１〜４のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項６】前記第一の領域が、大腸菌ＧｒｏＥＬの残基１９１−３７５
、１９１−３４５および１９３−３３５から成る群から選択されるポリペプチド
を含む請求項１〜５のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項７】請求項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質をコードす
る核酸。
【請求項８】プロモーターに作動可能に結合された請求項７に記載の核酸
を含む発現ベクター。
【請求項９】宿主細胞において第一の核酸配列を発現できるプロモーター
に作動可能に結合されたシャペロンポリペプチドのフラグメントをコードする第
一の核酸配列と、前記核酸配列に結合され、該第一の核酸配列と融合して発現さ
れるように第二の核酸配列の挿入を可能にするクローニング部位とを含む発現ベ
クター。
【請求項１０】請求項８または９に記載の発現ベクターにより形質転換さ
れる宿主細胞。
【請求項１１】（ｉ）宿主細胞内において前記発現ベクターから前記融合
タンパク質を発現させる条件下で該宿主細胞を培養するステップを含む方法であ
って、請求項１０に記載の宿主細胞を形質転換するステップと、（ｉｉ）該融合タンパク質を回収するステップとを含む融合タンパク質の調製方法。
【請求項１２】前記宿主細胞が大腸菌である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】前記発現ベクターがバクテリオファージＴ７を含む請求項
１２記載の方法。
【請求項１４】前記融合タンパク質が、前記第一の領域と第二の領域との
間にタンパク質分解酵素による切断が可能なリンカー領域を更に含む方法であっ
て、該方法が該タンパク質分解酵素による切断が可能なリンカー部位で該タンパ
ク質を切断し、該第二の領域を回収するステップを含む請求項１１〜１３のいず
れかに記載の方法。
【請求項１５】請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法により調製され
たポリペプチド。
【請求項１６】融合タンパク質の構築において、融合パートナーとしてコ
イルドコイル構造を形成できるポリペプチドの使用。
【請求項１７】前記融合タンパク質が、請求項１〜７のいずれかに記載の
融合タンパク質である請求項１６記載の使用。
【請求項１８】ＮＭＲによる研究における請求項１〜６のいずれかに記載
の融合タンパク質の使用。