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JP2003286195A - Ｐｄｅ１１ａの活性を調節する剤 - Google Patents

Ｐｄｅ１１ａの活性を調節する剤

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Publication number
JP2003286195A
JP2003286195A JP2003043929A JP2003043929A JP2003286195A JP 2003286195 A JP2003286195 A JP 2003286195A JP 2003043929 A JP2003043929 A JP 2003043929A JP 2003043929 A JP2003043929 A JP 2003043929A JP 2003286195 A JP2003286195 A JP 2003286195A
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JP
Japan
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pde11a
agent
vivo
gene
cells
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Pending
Application number
JP2003043929A
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English (en)
Inventor
Martyn Frank Burslem
フランク バースレム マーティン
Ian Dennis Harrow
デニス ハロウ イアン
Jeremy Lanfear
ランフィア ジェレミー
Stephen Charles Phillips
チャールズ フィリップス スティーブン
Christopher Peter Wayman
ピーター ウェイマン クリストファー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pfizer Corp Belgium
Pfizer Inc
Original Assignee
Pfizer Corp Belgium
Pfizer Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer Corp Belgium, Pfizer Inc filed Critical Pfizer Corp Belgium
Publication of JP2003286195A publication Critical patent/JP2003286195A/ja
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＰＤＥ１１Ａ活性を調節する剤を含む、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ又はｅｘｖｉｖｏの精子後受精能獲得を調
節するための医薬組成物の提供。 【解決手段】 本発明は男性の受精前能力、男性の避
妊、及び女性の性機能障害（ＦＳＤ）、特に女性の性的
覚醒障害（ＦＳＡＤ）、女性のオルガズム障害（ＦＯ
Ｄ）、性的欲求活動低下障害（ＨＳＤＤ）又は性的疼痛
障害に対するＰＤＥ１１Ａ調節の効果に関連する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの精子受
精能獲得に対するＰＤＥ１１Ａ調節（すなわち、ＰＤＥ
１１Ａ阻害又は刺激）及びｉｎ ｖｉｖｏの精子受精能
獲得に対するＰＤＥ１１Ａ刺激の効果に関する。本発明
は男性の受精前能力、男性の避妊、及び女性の性機能障
害（ＦＳＤ）、特に女性の性的覚醒障害（ＦＳＡＤ）、
女性のオルガズム障害（ＦＯＤ）、性的欲求活動低下障
害（ＨＳＤＤ）又は性的疼痛障害に対するＰＤＥ１１Ａ
調節の効果にも関する。
【０００２】発明の背景 環状ヌクレオチドフォスフォジエステラーゼ（ＰＤＥ
ｓ）は、セカンドメッセンジャーであるｃＡＭＰ（環状
アデノシン３’，５’−一リン酸）及びｃＧＭＰ（環状
グアニン３’，５’−一リン酸）の如き、環状ヌクレオ
チドの加水分解を触媒する。したがって、ＰＤＥｓは広
くさまざまなシグナル伝達経路において中枢の制御的役
割を果たす（Ｂｅａｖｏ， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅ
ｖ． ７５：７２５−４８， １９９５）。例えば、Ｐ
ＤＥｓは視覚（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ， ４： １３０−３４， １
９９３）、嗅覚（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：
９６７７−８１， １９９５）、血小板凝集（Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．
３２３： ３７１−７７， １９９７）、アルドステ
ロン合成（ＭａｃＦａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６： １３６−４
２， １９９１）、インスリン分泌（Ｚｈａｏ ｅｔ
ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０
２： ８６９−７３， １９９８）、Ｔ−細胞活性化
（Ｌｉ ｅｔａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３： ８
４８−５１， １９９９）、及び平滑筋弛緩（Ｂｏｏｌ
ｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｉｍｐｏ
ｔ．Ｒｅｓ． ８： ４７−５２，１９９６； Ｂａｌ
ｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｕｒｏｌ． １５９：
２１６４−７１， １９９８）に関与するプロセスを
仲介する。
【０００３】ＰＤＥｓは１１の主要なファミリーに分け
られる酵素スーパーファミリーを形成する（Ｂｅａｖ
ｏ， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７５： ７２５−
４８，１９９５； Ｂｅａｖｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏ
ｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６： ３９９−０５，
１９９４； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒ
ｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ
９５： ８９９１−９６， １９９８； Ｆｉｓｈｅｒ
ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２４６： ５７０−
７７， １９９８； Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，
Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃ
ｏｍｍｕｎ． ２５０： ７５１−５６， １９９８；
Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１５５５３−５８， １９
９８； Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３： １５５５９−６４， １
９９８； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒ
ｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ
９６： ７０７１−７６， １９９９；及びＦａｗｃｅ
ｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃ
ａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７： ３７０２−０７，
２０００）。
【０００４】それぞれのＰＤＥファミリーは独特な酵素
特性及び薬理学的特性により機能的に区別される。さら
に、それぞれのファミリーは明確な組織、細胞、及び細
胞内発現パターンを示す（Ｂｅａｖｏ ｅｔ ａｌ．，
Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４６： ３９９−
４０５， １９９４； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ ｅｔａ
ｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ９５：８９９１−９６， １９９８；Ｆ
ｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２４６：
５７０−７７，１９９８； Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅ
ｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２５０： ７５１−５６， １
９９８；Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３： １５５５３−５
８， １９９８； Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３： １５５５９−
６４， １９９８； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ９６： ７０７１−７６， １９９９；
Ｆａｗｃｅｔｔ ｅｔａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：３７０２
−０７， ２０００； Ｂｏｏｌｅｌｌ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｉｎｔ．Ｊ． Ｉｍｐｏｔ． Ｒｅｓ． ８：
４７−５２， １９９６； Ｂａｌｌａｒｄ ｅｔ
ａｌ．， Ｊ． Ｕｒｏｌ． １５９： ２１６４−７
１， １９９８； Ｈｏｕｓｌａｙ， Ｓｅｍｉｎ，
Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．９： １６１−６７，
１９９８；及びＴｏｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｕ
ｌｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． １２：
１３１−３５， １９９９）。それゆえ、ＰＤＥ酵素の
１のファミリー又はサブファミリーの活性を選択的に制
御する化合物を投与することにより、細胞−又は組織−
特異的様式でｃＡＭＰ及び／又はｃＧＭＰのシグナル伝
達経路を制御することが可能である。
【０００５】Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，
Ｖｏｌ． ４１３： ６０３−６０９， ２００１）は
（新たに発見された、精巣特異的、環状ヌクレオチド一
リン酸（ｃＮＭＰ）開閉カルシウムチャネル−精子陽イ
オンチャネル、ＣａｔＳｐｅｒを介する）精子における
ｃＡＭＰ上昇及びＣａ２＋流入の間の関連を提供し、そ
れは受精能を引き起こす受精能獲得及び下流の事件を誘
導する。上記チャネルのノックアウト（ＫＯ）（Ｃａｔ
Ｓｐｅｒ −／− マウス）は正常な外観の精巣及び精
子を導くが、上記雄マウスは精子を「活性化する」こと
の不能のために生殖不能である。
【０００６】ＰＤＥ１１はＰＤＥｓの最も最近示された
ファミリーの一つである；ＰＤＥ１１Ａはこれまでに同
定されたこのファミリーの唯一のメンバーである（Ｆａ
ｗｃｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７： ３７０２−
０７， ２０００、本明細書中後に「Ｆａｗｃｅｔｔ，
２０００」、Ｙｕａｓａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂ
ｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７５： ３１４６９−７９，
２０００、本明細書中後に「Ｙｕａｓａ，２００
０」）。ＰＤＥ１１Ａは例えば、精巣、骨格筋、腎臓、
肝臓、さまざまな腺組織（例えば、下垂体、唾液腺、副
腎、乳腺及び甲状腺）、膵臓、脊髄、及び気管において
発現されることが知られている（Ｆａｗｃｅｔｔ，２０
００）一方で、ＰＤＥ１１Ａの機能についてはほとんど
知られていない。
【０００７】ヒトＰＤＥ１１Ａは全ての他の哺乳類のＰ
ＤＥｓの触媒ドメインと＞５０％のアミノ酸相同性を示
し、ヒトＰＤＥ５と最も似ており、そして明確な生化学
的特性を有する；このファミリーは今般４のアイソフォ
ーム、すなわち、ＰＤＥ１１Ａ１〜４を含む（Ｈｅｔｍ
ａｎ ＪＭ， Ｒｏｂａｓ Ｎ， Ｂａｘｅｎｄａｌｅ
Ｒ， Ｆｉｄｏｃｋ Ｍ， Ｐｈｉｌｌｉｐｓ Ｓ
Ｃ， Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ ＳＨ， Ｂｅａｖｏ Ｊ
Ａ． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉ
ａｎｔｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓ
ｔｅｒａｓｅ １１Ａ．（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａ
ｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０００； ９７(２３)： １
２８９１−５)； Ｙｕａｓａ, ２０００）。組換え
ヒトＰＤＥ１１Ａはそれぞれ０．５２μＭ及び１．０４
μＭのＫｍ値及び同程度のＶｍａｘ値でｃＧＭＰ及びｃ
ＡＭＰの両方を加水分解する。それゆえ、ＰＤＥ１１Ａ
は生理学的条件下でｃＧＭＰ及びｃＡＭＰの両方を制御
する二重−基質ＰＤＥを代表する。
【０００８】特許出願ＣＡ ２，３６０，４８５（２０
０１年１０月３０日出願）、ＥＰ０１３０８９５９．４
（２００１年１０月２２日出願）、ＪＰ ２００１−３
３７０６１（２００１年１１月１日出願）及びＵＳ（シ
リアル番号は得られない−ＵＳＰＴＯによりまだ発行さ
れていない）はＰＤＥ１１Ａの機能を研究する生物学的
道具（例えば、機能的に破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子
を含む遺伝的に改変された非ヒト哺乳類及び遺伝的に改
変された動物細胞）及びこれらのＰＤＥ１１Ａ機能に関
連する疾患及び状態の予防又は治療における使用のため
のＰＤＥ１１Ａ活性を制御する剤を同定するための方法
（例えば、ＰＤＥ１１Ａを調節する剤をスクリーニング
する方法及びＰＤＥ１１Ａを発現する細胞内においてｃ
ＡＭＰ及びｃＧＭＰのシグナル伝達を調節する方法）を
開示する。
【０００９】特許出願ＣＡ ２，３６０，４８５（２０
０１年１０月３０日出願）、ＥＰ０１３０８９５９．４
（２００１年１０月２２日出願）、ＪＰ ２００１−３
３７０６１（２００１年１１月１日出願）及びＵＳ（シ
リアル番号は得られない−ＵＳＰＴＯによりまだ発行さ
れていない）は、ｉｎｔｅｒ ａｌｉａで精子形成に関
連する遺伝子を調査する、及び、野生型マウスと比較し
たとき、精子形成に関連する成分を分析するのに優秀な
機会を提供する、ＰＤＥ１１Ａノックアウトマウスの供
給を開示する。この型の分析の１の方法はマイクロアレ
イ技術である。ＤＮＡマイクロアレイ技術で、時間にわ
たるラージスケールの遺伝子発現をモニターすることが
可能になる。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（ＵＳＡ、
ＣＡ）により製造される、多数の特別に設計されたオリ
ゴヌクレオチドプローブの組み立て式の配列は、何千も
の遺伝子の同時のハイブリダイゼーションに基づいた分
析を可能にする。
【００１０】Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（上記を参照のこ
と）の発見は、ＰＤＥ１１Ａのノックアウト（ＫＯ）
（ＰＤＥ１１Ａ −／− マウス）が上昇したｃＡＭＰ
／ｃＧＭＰ値を生じ、それが今度は下流のシグナル（上
記チャネル−ＣａｔＳｐｅｒを介したＣａ２＋流入）
を、そしてそれゆえ成熟前受精能獲得／「活性化」を活
性化するという点で、本明細書中に示される発見とよく
関連する。
【００１１】発明の要約 本発明は以下の（番号を付された）局面を提供する：
【００１２】１．前記方法はＰＤＥ１１Ａ活性を調節す
る剤を投与することを含む、ｉｎｖｉｖｏ又はｅｘ ｖ
ｉｖｏで精子受精能獲得を調節する方法 上記用語「ｉｎ ｖｉｖｏの精子受精能獲得」は精巣内
での精子（すなわち射精されていない精子）の受精能獲
得をいう。受精能獲得は精子が「活発にされ」、そして
先体反応を経験し、そして最終的に卵母細胞と受精する
ことができることをもたらす。しかしながら、精子の上
記受精能獲得がｉｎ ｖｉｖｏで起こるとき、結果とし
て射精された精子は、ほとんどの部分が、卵母細胞及び
受精の部位までの道程を生き残ることができないようで
ある（本質的には上記精子は成熟前に受精能を獲得して
いる）。このことはｉｎ ｖｉｖｏでの精子の受精能獲
得が男性の避妊の型であることを導く。しかしながら、
ｉｎ ｖｉｖｏの精子受精能獲得の調節が受精能獲得に
おける減少を生ずるならば、男性の受精前能力が生じう
ることに留意するべきである。このことはほとんどの精
子が精巣内で成熟前に「活発にされ」ず、そしてそのた
め大部分の精子が先体反応を（後に）経験する及び（上
記卵母細胞及び受精の部位への道程を（よりよく）生き
残った後に）最終的に卵母細胞と受精することができる
であろうためである。
【００１３】上記用語「ｅｘ ｖｉｖｏの精子受精能獲
得」は男性の体の外（すなわち、射精された精子又は人
工的に体から取り出された精子）での、精子の受精能獲
得をいう。ｅｘ ｖｉｖｏは、この文脈では、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏと同義語である。ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖ
ｉｔｒｏの精子受精能獲得はｉｎ ｖｉｔｒｏの受精
（ＩＶＦ）手順（又は同様の受精前能力技術／治療）の
間に卵母細胞と受精するのに使用されうる大部分の精子
が「活発にされ」、そして先体反応を経験する、及び最
終的に卵母細胞と受精することができることを確実にす
るための主要な使用のものである。したがって、このこ
とはｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏの精子受精能
獲得が男性の受精前能力の機構であることを導く。しか
しながら、ｅｘ ｖｉｖｏの精子受精能獲得の調節が
（ｅｘ ｖｉｖｏで望ましくない）受精能獲得における
減少を生ずるなら、男性の避妊を生じうるということに
留意するべきである。このことはほとんどの精子がｉｎ
ｖｉｔｒｏの受精（ＩＶＦ）手順における使用の前に
「活発にされ」ず、そしてそのため大部分の精子が先体
反応を経験する、及び最終的に卵母細胞と受精すること
ができないであろうためである。
【００１４】２．前記剤はＰＤＥ１１Ａ活性を減少させ
る、及びｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘｖｉｖｏの精子受精能
獲得を増大させる、局面（１）に記載の方法
【００１５】３．前記剤は（ａ）ＰＤＥ１１Ａ阻害剤又
はアンタゴニスト又は（ｂ）ＰＤＥ１１Ａ遺伝子発現の
阻害剤である、局面（１）又は局面（２）に記載の方法
本明細書中で使用されるとき、上記用語ＰＤＥ１１Ａ阻
害剤又はＰＤＥ１１ＡアンタゴニストはＰＤＥ１１Ａの
活性を阻害する又は減少させる（又はＰＤＥ１１Ａの値
を減少させる）ことができる又はＰＤＥ１１Ａの遺伝子
発現の値を減少させることができる化合物又は剤をい
う。
【００１６】４．前記剤はＣｉａｌｉｓ（ＩＣ３５
１）、Ｅ４０２１又はＵＫ−２３５，１８７である、局
面（１）、（２）又は（３（ａ））のいずれか１に記載
の方法
【００１７】上記に挙げられた剤の詳細：Ｃｉａｌｉｓ （ＩＣ３５１；ＵＳＡ、Ｂｏｔｈｅｌｌの
ＩＣＯＳ） 特許出願：ＷＯ ９５／１９９７８（Ｇｌａｘｏ） ＣＡＳ番号：１７１４８８−０１−０ 名称：（６Ｒ，１２ａＲ）−６−（１，３−ベンゾジオ
キソール−５−イル）−２，３，６，７，１２，１２ａ
−ヘキサヒドロ−２−メチル−ピラジノ［１’，２’：
１，６］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジ
オン 化学構造：
【００１８】
【化１】
【００１９】Ｅ４０２１（日本、ＩｂａｒａｋｉのＥｉ
ｓａｉ） 特許出願：ＷＯ ９３／０７１２４（Ｅｉｓａｉ） ＣＡＳ番号：１５０４５２−２１−４ 名称：一塩酸１−［４−［（１，３−ベンゾジオキソー
ル−５−イルメチル）アミノ］−６−クロロ−２−キナ
ゾリニル］−４−ピペリジンカルボン酸 化学構造：
【００２０】
【化２】
【００２１】ＵＫ−２３５，１８７（日本、大阪のＯｎ
ｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより示されたシ
リーズからの代表的な化合物のＩｎｔｅｒｎａｌ Ｃｏ
ｍｐｏｕｎｄ Ｃｏｄｅ） 特許出願：ＥＰ ５７９４９６ ＣＡＳ番号：１５７８６３−３１−５ 名称：二塩酸６−クロロ−２−（１Ｈ−イミダゾール−
１−イル）−Ｎ−（フェニルメチル）−，４−キナゾリ
ンアミン 化学構造：
【００２２】
【化３】
【００２３】５．前記剤はＰＤＥ１１Ａ活性を増大させ
る及びｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの精子受精能
獲得を減少させる、局面（１）に記載の方法
【００２４】６．前記剤は（ａ）ＰＤＥ１１Ａ刺激剤、
活性化剤又はアゴニスト又は（ｂ）ＰＤＥ１１Ａ遺伝子
発現の刺激剤、エンハンサー又は活性化剤である、局面
（１）又は（５）に記載の方法
【００２５】本明細書中で使用されるとき、上記用語Ｐ
ＤＥ１１Ａ刺激剤、ＰＤＥ１１Ａ活性化剤、ＰＤＥ１１
Ａエンハンサー又はＰＤＥ１１ＡアゴニストはＰＤＥ１
１Ａの活性を最大にさせる又は増大させる（又はＰＤＥ
１１Ａの値を増大させる）ことのできる又はＰＤＥ１１
Ａの遺伝子発現の値を増大させることのできる化合物又
は剤をいう。
【００２６】７．ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで
の精子受精能獲得を調節する医薬の製造におけるＰＤＥ
１１Ａ活性を調節する剤の使用
【００２７】８．前記剤はＰＤＥ１１Ａ活性を減少させ
る及びｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの精子受精能
獲得を増大させる、局面（７）に記載の使用
【００２８】９．前記剤は（ａ）ＰＤＥ１１Ａ阻害剤又
はアンタゴニスト又は（ｂ）ＰＤＥ１１Ａ遺伝子発現の
阻害剤である、局面（７）又は局面（８）に記載の使
用。
【００２９】１０．前記剤はＣｉａｌｉｓ（ＩＣ３５
１）、Ｅ４０２１又はＵＫ−２３５，１８７である、局
面（７）、（８）又は（９（ａ））のいずれか１に記載
の使用。
【００３０】１１．ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ
の精子受精能獲得を減少させるための医薬の製造におけ
るＰＤＥ１１Ａ活性を増大させる剤の使用。
【００３１】１２．前記剤は（ａ）ＰＤＥ１１Ａ刺激
剤、活性化剤又はアゴニスト又は（ｂ）ＰＤＥ１１Ａ遺
伝子発現の刺激剤、エンハンサー又は活性化剤である、
局面（７）又は局面（１１）に記載の使用。
【００３２】１３．前記男性の受精前能力剤がｅｘ ｖ
ｉｖｏで使用される、男性の受精前能力剤としてのＰＤ
Ｅ１１Ａ活性を減少させる剤の使用。
【００３３】１４．前記男性の受精前能力剤は（ａ）Ｐ
ＤＥ１１Ａ阻害剤又はアンタゴニスト又は（ｂ）ＰＤＥ
１１Ａ遺伝子発現の阻害剤である、局面（１３）に記載
の使用。
【００３４】１５．ＰＤＥ１１Ａ活性を減少させる前記
剤はＣｉａｌｉｓ（ＩＣ３５１）、Ｅ４０２１又はＵＫ
−２３５，１８７である、局面（１３）又は局面（１４
（ａ））に記載の使用。
【００３５】１６．前記男性の受精前能力剤はｉｎ ｖ
ｉｖｏで使用される、男性の受精前能力剤としてのＰＤ
Ｅ１１Ａ活性を増大させる剤の使用。
【００３６】１７．前記男性の受精前能力剤は（ａ）Ｐ
ＤＥ１１Ａ刺激剤、活性化剤又はアゴニスト又は（ｂ）
ＰＤＥ１１Ａ遺伝子発現の刺激剤、エンハンサー又は活
性化剤である、局面（１６）に記載の使用。
【００３７】１８．前記男性の受精前能力剤はｅｘ ｖ
ｉｖｏで使用される、男性の受精前能力剤としての精子
受精能獲得を増大させる剤の使用。
【００３８】１９．前記男性の受精前能力剤は（ａ）Ｐ
ＤＥ１１Ａ阻害剤又はアンタゴニスト又は（ｂ）ＰＤＥ
１１Ａ遺伝子発現の阻害剤である、局面（１８）に記載
の使用。
【００３９】２０．精子受精能獲得を増大させる前記剤
はＣｉａｌｉｓ（ＩＣ３５１）、Ｅ４０２１又はＵＫ−
２３５，１８７である、局面（１８）又は局面（１９
（ａ））に記載の使用。
【００４０】２１．前記男性の受精前能力剤はｉｎ ｖ
ｉｖｏで使用される、男性の受精前能力剤としての精子
受精能獲得を減少させる剤の使用。
【００４１】２２．前記男性の受精前能力剤は（ａ）Ｐ
ＤＥ１１Ａ刺激剤、活性化剤又はアゴニスト又は（ｂ）
ＰＤＥ１１Ａ遺伝子発現の刺激剤、エンハンサー又は活
性化剤である、局面（２１）に記載の使用。
【００４２】２３．前記男性の避妊剤はｉｖ ｖｉｖｏ
で使用される、男性の避妊剤としてのＰＤＥ１１Ａ活性
を減少させる剤の使用。
【００４３】２４．前記男性の避妊剤は（ａ）ＰＤＥ１
１Ａ阻害剤又はアンタゴニスト又は（ｂ）ＰＤＥ１１Ａ
遺伝子発現の阻害剤である、局面（２３）に記載の使
用。
【００４４】２５．ＰＤＥ１１Ａ活性を減少させる前記
剤はＣｉａｌｉｓ（ＩＣ３５１）、Ｅ４０２１又はＵＫ
−２３５，１８７である、局面（２３）又は局面（２４
（ａ））に記載の使用。
【００４５】２６．前記男性の避妊剤はｅｘ ｖｉｖｏ
で使用される、男性の避妊剤としてのＰＤＥ１１Ａ活性
を増大させる剤の使用。
【００４６】２７．前記男性の避妊剤は（ａ）ＰＤＥ１
１Ａ刺激剤、活性化剤又はアゴニスト又は（ｂ）ＰＤＥ
１１Ａ遺伝子発現の刺激剤、エンハンサー又は活性化剤
である、局面（２６）に記載の使用。
【００４７】２８．前記男性の避妊剤はｉｎ ｖｉｖｏ
で使用される、男性の避妊剤としての精子受精能獲得を
増大させる剤の使用。
【００４８】２９．前記男性の避妊剤は（ａ）ＰＤＥ１
１Ａ阻害剤又はアンタゴニスト又は（ｂ）ＰＤＥ１１Ａ
遺伝子発現の阻害剤である、局面（２８）に記載の使
用。
【００４９】３０．精子受精能獲得を増大させる前記剤
はＣｉａｌｉｓ（ＩＣ３５１）、Ｅ４０２１又はＵＫ−
２３５，１８７である局面（２８）又は局面（２９
（ａ））に記載の使用。
【００５０】３１．前記男性の避妊剤はｅｘ ｖｉｖｏ
で使用される、男性の避妊剤としての精子受精能獲得を
減少させる剤の使用。
【００５１】３２．前記男性の避妊剤は（ａ）ＰＤＥ１
１Ａ刺激剤、活性化剤又はアゴニスト又は（ｂ）ＰＤＥ
１１Ａ遺伝子発現の刺激剤、エンハンサー又は活性化剤
である、局面（３１）に記載の使用。
【００５２】３３．女性の性機能障害（ＦＳＤ）を予防
する又は治療する方法であって、前記方法はＰＤＥ１１
Ａ活性を刺激する、活性化する、高める又は作用する剤
を女性の哺乳類に投与することを含む方法。
【００５３】３４．前記女性の性機能障害（ＦＳＤ）は
女性の性的覚醒障害（ＦＳＡＤ）、女性のオルガズム障
害（ＦＯＤ）又は性的疼痛障害である、局面（２３）に
記載の方法。好ましくは前記性的疼痛障害は性交疼痛症
又は膣痙である。
【００５４】３５．前記女性の哺乳類はヒト女性であ
る、局面（３３）又は局面（３４）に記載の方法。
【００５５】３６．女性の性機能障害（ＦＳＤ）の予防
又は治療のための医薬の製造のおけるＰＤＥ１１Ａ活性
を刺激する、活性化する、高める又は作用する剤の使
用。
【００５６】３７．前記女性の性機能障害（ＦＳＤ）は
女性の性的覚醒障害（ＦＳＡＤ）、女性のオルガズム障
害（ＦＯＤ）又は性的疼痛障害である、局面（３６）に
記載の使用。好ましくは前記性的疼痛障害は性交疼痛症
又は膣痙である。
【００５７】３８．前記女性の哺乳類はヒト女性であ
る、局面（３６）又は局面（３７）に記載の使用。
【００５８】３９．女性の性機能障害（ＦＳＤ）の予防
又は治療の方法であって、前記方法はＰＤＥ１１Ａ活性
を阻害する、減少させる、不活性化する又は拮抗する剤
を女性の哺乳類に投与することを含む方法。
【００５９】４０．前記女性の性機能障害（ＦＳＤ）は
性的欲求活動低下障害（ＨＳＤＤ）である、局面（３
９）に記載の方法。
【００６０】４１．前記女性の哺乳類はヒト女性であ
る、局面（３９）又は局面（４０）に記載の方法。
【００６１】４２．ＰＤＥ１１Ａ活性を阻害する、減少
させる、不活性化する又は拮抗する前記剤はＣｉａｌｉ
ｓ（ＩＣ３５１）、Ｅ４０２１又はＵＫ−２３５，１８
７である、局面（３９）〜（４１）のいずれか１に記載
の方法。
【００６２】４３．女性の性機能障害（ＦＳＤ）の予防
又は治療のための医薬の製造におけるＰＤＥ１１Ａ活性
を阻害する、減少させる、不活性化する又は拮抗する剤
の使用。
【００６３】４４．前記女性の性機能障害（ＦＳＤ）は
性的欲求活動低下障害（ＨＳＤＤ）である、局面（４
２）に記載の使用。
【００６４】４５．前記女性の哺乳類はヒト女性であ
る、局面（４２）又は局面（４３）に記載の使用。
【００６５】４６．ＰＤＥ１１Ａ活性を阻害する、減少
させる、不活性化させる又は拮抗する前記剤はＣｉａｌ
ｉｓ（ＩＣ３５１）、Ｅ４０２１又はＵＫ−２３５，１
８７である、局面（４３）〜（４５）のいずれか１に記
載の使用。
【００６６】ＰＤＥ１１Ａ活性の調節は例えば：コルチ
コステロイド結合グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ
１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（ガンマ３サ
ブユニット）、プロホルモン変換酵素５、ライディッヒ
インスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−ボックス
３、クロモグラニンＢ、クリプトジン１、ＰＰ２Ｂ、グ
ルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン、ＨＲ６
Ａ、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニレ
ートキナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１又はＫｒｏｘ−２４結
合タンパク質のようなある他のタンパク質を調節する効
果を有する。より特別には、ＰＤ１１Ａ活性における増
大は例えば、コルチコステロイド結合グロブリン、セン
トリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢ
Ａ−Ａ（ガンマ３サブユニット）、プロホルモン変換酵
素５、ライディッヒインスリン様ペプチド、カルパイン
３、Ｙ−ボックス３、クロモグラニンＢ、クリプトジン
１、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニド
ジェン及びＨＲ６Ａの値を増大させるが、例えば、プロ
タミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニレートキナ
ーゼ２、ＡＫＡＰ１２１及びＫｒｏｘ−２４結合タンパ
ク質の値を減少させる。逆に、ＰＤＥ１１Ａ活性におけ
る減少は、例えば、コルチコステロイド結合グロブリ
ン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３
３、ＧＡＢＡ−Ａ（ガンマ３サブユニット）、プロホル
モン変換酵素５、ライディッヒインスリン様ペプチド、
カルパイン３、Ｙ−ボックス３、クロモグラニンＢ、ク
リプトジン１、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガ
ーゼ、ニドジェン及びＨＲ６Ａの値を減少させるが、例
えば、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニ
レートキナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１及びＫｒｏｘ−２４
結合タンパク質の値を増大させる。
【００６７】したがって、例えば、コルチコステロイド
結合グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボ
ックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（ガンマ３サブユニッ
ト）、プロホルモン変換酵素５、ライディッヒインスリ
ン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−ボックス３、クロモ
グラニンＢ、クリプトジン１、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸
システインリガーゼ、ニドジェン、ＨＲ６Ａ、プロタミ
ン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニレートキナーゼ
２、ＡＫＡＰ１２１又はＫｒｏｘ−２４結合タンパク質
を調節することにより、精子受精能獲得、性的欲求（衝
動）、性的覚醒又はオルガズムを調節する又は作用する
ことができる。
【００６８】好ましくは、本発明に係る調節剤はコルチ
コステロイド結合グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ
１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（ガンマ３サ
ブユニット）、プロホルモン変換酵素５、ライディッヒ
インスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−ボックス
３、クロモグラニンＢ、クリプトジン１、ＰＰ２Ｂ、グ
ルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン又はＨＲ６
Ａの値を減少させ、それによりｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ
ｖｉｖｏでの精子受精能獲得を増大させる、性的欲求
（衝動）を増大させる、性的覚醒を減少させる又はオル
ガズムを減少させる。より好ましくは、前記剤は（ａ）
コルチコステロイド結合グロブリン、セントリン３、Ｘ
ＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（ガン
マ３サブユニット）、プロホルモン変換酵素５、ライデ
ィッヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−ボッ
クス３、クロモグラニンＢ、クリプトジン１、ＰＰ２
Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン又は
ＨＲ６Ａの阻害剤又はアンタゴニスト又は（ｂ）コルチ
コステロイド結合グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ
１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（ガンマ３サ
ブユニット）、プロホルモン変換酵素５、ライディッヒ
インスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−ボックス
３、クロモグラニンＢ、クリプトジン１、ＰＰ２Ｂ、グ
ルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン又はＨＲ６
Ａの遺伝子発現の阻害剤である。
【００６９】阻害剤又はアンタゴニストは上記タンパク
質のいずれかの活性（又は値）を阻害する又は減少させ
る又はそれらの発現の値を減少させることのできる化合
物又は剤をいう。より好ましくは、前記剤はＣｉａｌｉ
ｓ（ＩＣ３５１）、Ｅ４０２１又はＵＫ−２３５，１８
７である。
【００７０】あるいは、本発明に係る調節剤はコルチコ
ステロイド結合グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ
１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（ガンマ３サ
ブユニット）、プロホルモン変換酵素５、ライディッヒ
インスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−ボックス
３、クロモグラニンＢ、クリプトジン１、ＰＰ２Ｂ、グ
ルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン又はＨＲ６
Ａの値を増大させ、それによりｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ
ｖｉｖｏの精子受精能獲得を減少させる、性的欲求
（衝動）を減少させる、性的覚醒を増大させる又はオル
ガズムを増大させる。より好ましくは、前記剤は（ａ）
コルチコステロイド結合グロブリン、セントリン３、Ｘ
ＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（ガン
マ３サブユニット）、プロホルモン変換酵素５、ライデ
ィッヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−ボッ
クス３、クロモグラニンＢ、クリプトジン１、ＰＰ２
Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン又は
ＨＲ６Ａの刺激剤、活性化剤又はアゴニスト又は（ｂ）
コルチコステロイド結合グロブリン、セントリン３、Ｘ
ＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（ガン
マ３サブユニット）、プロホルモン変換酵素５、ライデ
ィッヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−ボッ
クス３、クロモグラニンＢ、クリプトジン１、ＰＰ２
Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン又は
ＨＲ６Ａの遺伝子発現の刺激剤、エンハンサー又は活性
化剤である。
【００７１】刺激剤、活性化剤、エンハンサー又はアゴ
ニストは上記タンパク質のいずれかの活性（又は値）を
最大にさせる又は増大させる又はそれらの発現の値を増
大させることのできる化合物又は剤をいう。
【００７２】本発明に係るさらなる態様においては、本
発明に係る調節剤はプロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ
４６、アデニレートキナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１又はＫ
ｒｏｘ−２４結合タンパク質の値を減少させ、それによ
りｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘｖｉｖｏでの精子受精能獲得
を減少させる、性的欲求（衝動）を減少させる、性的覚
醒を増大させる又はオルガズムを増大させる。好ましく
は、前記剤は（ａ）プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ
４６、アデニレートキナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１又はＫ
ｒｏｘ−２４結合タンパク質の阻害剤又はアンタゴニス
ト又は（ｂ）プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、
アデニレートキナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１又はＫｒｏｘ
−２４結合タンパク質の遺伝子発現の阻害剤である。阻
害剤又はアンタゴニストは上記タンパク質のいずれかの
活性（又は値）を阻害する又は減少させる又はそれらの
発現の値を減少させることのできる化合物又は剤をい
う。
【００７３】さらにさらなる代替の態様においては、本
発明に係る調節剤はプロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ
４６、アデニレートキナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１又はＫ
ｒｏｘ−２４結合タンパク質の値を増大させ、それによ
りｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘｖｉｖｏでの精子受精能獲得
を増大させる、性的欲求（衝動）を増大させる、性的覚
醒を減少させる又はオルガズムを減少させる。好ましく
は、前記剤は（ａ）プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ
４６、アデニレートキナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１又はＫ
ｒｏｘ−２４結合タンパク質の刺激剤、活性化剤又はア
ゴニスト又は（ｂ）プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ
４６、アデニレートキナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１又はＫ
ｒｏｘ−２４結合タンパク質の遺伝子発現の刺激剤、エ
ンハンサー又は活性化剤である。
【００７４】刺激剤、活性化剤、エンハンサー又はアゴ
ニストは上記タンパク質のいずれかの活性（又は値）を
最大にさせる又は増大させる又はそれらの発現の値を増
大させることのできる化合物又は剤をいう。
【００７５】より好ましくは、前記剤はＣｉａｌｉｓ
（ＩＣ３５１）、Ｅ４０２１又はＵＫ−２３５，１８７
である。
【００７６】疑問を避けるために、本発明はＰＤＥ１１
Ａ値／活性を減少させる剤はコルチコステロイド結合グ
ロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックス
Ｍ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（ガンマ３サブユニット）、プロ
ホルモン変換酵素５、ライディッヒインスリン様ペプチ
ド、カルパイン３、Ｙ−ボックス３、クロモグラニン
Ｂ、クリプトジン１、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システイ
ンリガーゼ、ニドジェン又はＨＲ６Ａの値／活性をも減
少させうるが、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４
６、アデニレートキナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１又はＫｒ
ｏｘ−２４結合タンパク質の値／活性を増大させうるこ
とを教示する。逆に、ＰＤＥ１１Ａ値／活性を増大させ
る剤はコルチコステロイド結合グロブリン、セントリン
３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ
（ガンマ３サブユニット）、プロホルモン変換酵素５、
ライディッヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ
−ボックス３、クロモグラニンＢ、クリプトジン１、Ｐ
Ｐ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン
又はＨＲ６Ａの値／活性をも増大させうるが、プロタミ
ン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニレートキナーゼ
２、ＡＫＡＰ１２１又はＫｒｏｘ−２４結合タンパク質
の値／活性を減少させうる。
【００７７】また、疑問を避けるために、本発明は、女
性の哺乳類、好ましくはヒト女性において性的欲求（衝
動）が増大する場合、性的欲求活動低下障害（ＨＳＤ
Ｄ）として知られる女性の性機能障害（ＦＳＤ）が治療
されうることを教示する。さらに、女性の哺乳類、好ま
しくはヒト女性において性的覚醒が増大する場合、女性
の性的覚醒障害（ＦＳＡＤ）として知られるＦＳＤが治
療されうる。またさらに、女性の哺乳類、好ましくはヒ
ト女性においてオルガズムが増大する場合、女性のオル
ガズム障害（ＦＯＤ）又は女性の性的オルガズム障害
（ＦＳＯＤ）として知られるＦＳＤが治療されうる。さ
らに、女性の哺乳類、好ましくはヒト女性が性的に覚醒
される場合、性的興奮の潤滑−膨張応答は性交疼痛症及
び膣痙の如き、性的疼痛障害として知られるＦＳＤ群を
治療するのに役立つであろう。
【００７８】本発明が、ＰＤＥ１１Ａ活性の調節はｉｎ
ｔｅｒ ａｌｉａで精子受精能獲得における増大を導
く、ＰＤＥ１１Ａ活性／値における減少又はｉｎｔｅｒ
ａｌｉａで精子受精能獲得における減少を導く、ＰＤ
Ｅ１１Ａ活性／値における増大でありうることを提供す
ることが理解されるであろう（Ｆｉｇ．７Ａ及びＦｉ
ｇ．７Ｂを参照のこと）。
【００７９】精子の受精能獲得における増大をもたらす
本発明に係る剤は男性のｉｎ ｖｉｖｏの避妊剤又は男
性のｅｘ ｖｉｖｏの受精前能力剤として分類されうる
（Ｆｉｇ．７Ａを参照のこと）。
【００８０】精子受精能獲得における減少をもたらす本
発明に係る剤は男性のｉｎ ｖｉｖｏの受精前能力剤又
は男性のｅｘ ｖｉｖｏの避妊剤として分類されうる
（Ｆｉｇ．７Ｂを参照のこと）。当業者は本発明を示す
ための本明細書の本説明及び添付の請求項において使用
される用語を完全に理解するであろう。それにもかかわ
らず、本明細書中に別段に提供されない限り、以下の用
語は以下に示されるとおりである。
【００８１】「阻害剤」又は「アンタゴニスト」によ
り、阻害剤又はアンタゴニストの標的物（例えば、ＰＤ
Ｅ１１Ａ酵素又はＰＤＥ１１Ａ遺伝子）の活性／産生値
における減少を誘発することのできる分子／化合物／剤
を意味する。
【００８２】「刺激剤」、「活性化剤」、「エンハンサ
ー」又は「アゴニスト」により、刺激剤、活性化剤、エ
ンハンサー又はアゴニストの標的物（例えば、ＰＤＥ１
１Ａ酵素又はＰＤＥ１１Ａ遺伝子）の活性／産生値にお
ける増大を誘発することのできる分子／化合物／剤を意
味する。
【００８３】「調節剤」により、「阻害剤」、「アンタ
ゴニスト」、「刺激剤」、「活性化剤」、「エンハンサ
ー」又は「アゴニスト」（すなわち、阻害剤、アンタゴ
ニスト、刺激剤、活性化剤、エンハンサー又はアゴニス
トの標的物（例えば、ＰＤＥ１１Ａ酵素又はＰＤＥ１１
Ａ遺伝子）の活性／産生値を調節する分子／化合物／
剤）を意味する。
【００８４】「コード配列」又は「コード領域」によ
り、上記配列が発現されるとき遺伝子を産生するのに必
要な配列情報を有する核酸分子を意味する。
【００８５】「アンチセンスオリゴヌクレオチド」によ
り、改変されていないＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は改変さ
れたＲＮＡ若しくはＤＮＡでありうる、典型的に約１０
〜５０ヌクレオチド長の小核酸分子を意味する；それは
それぞれの転写産物にハイブリダイズするように設計さ
れ、そしてそれにより、例えば、上記それぞれの転写産
物の翻訳を妨げることにより又はその速い分解を促進す
ることにより、そのタンパク質への翻訳を減少させる。
【００８６】「リボザイム」により、改変されていない
ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は改変されたＲＮＡ若しくはＤ
ＮＡでありうる、上記それぞれの転写産物にハイブリダ
イズし、そして切断するように設計される、核酸分子を
意味する。
【００８７】本明細書中で使用されるとき、用語「抗
体」は、組換え又はタンパク質分解の方法により作出さ
れた、抗体断片はもちろん、ポリクローナル及びモノク
ローナル抗体、単鎖、キメラの及びヒト化された抗体を
含む。上記用語は抗体由来発現ライブラリー、例えば、
単鎖Ｆｖ又はＦａｂ断片発現ライブラリーの産物を含む
とも意味される。
【００８８】「バイオマーカー／マーカー」により、プ
ロセス、例えば、精子形成の進行における状態、障害、
疾患又は現状又は疾患の進行の現状の表示である、分
子、例えば、遺伝子の転写産物又は翻訳産物を意味す
る。
【００８９】「遺伝的に改変された」非ヒト哺乳類又は
動物細胞は、遺伝工学により、非ヒト哺乳類又は動物細
胞に又は先祖非ヒト哺乳類又は動物細胞に導入された改
変についてヘテロ接合又はホモ接合である。上記改変を
導入するのに入手可能な遺伝工学の標準の方法は相同的
組換え、ウイルスベクター遺伝子トラッピング、照射、
化学変異誘発、及び単一の又は触媒性リボザイムを伴う
アンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列のト
ランスジェニック発現を含む。遺伝子改変に好ましい方
法は「外来性核酸配列」を上記遺伝子座に挿入すること
により、例えば、相同的組換え又はウイルスベクター遺
伝子トラッピングにより、内因性遺伝子を改変するもの
である。「外来性核酸配列」は上記遺伝子内に非天然に
起こる、外因性配列である。外来性ＤＮＡのこの挿入は
ＰＤＥ１１Ａ遺伝子のどの領域内、例えば、エンハンサ
ー、プロモーター、制御領域、非コード領域、コード領
域、イントロン又はエクソン内でも起こりうる。遺伝工
学の最も好ましい方法は、上記外来性核酸配列が単一で
又は内因性遺伝子配列の一部の欠損と共に標的を有する
様式で挿入される、相同的組換えである。
【００９０】「機能的に破壊された」ＰＤＥ１１Ａ遺伝
子により、破壊された遺伝子によりコードされたＰＤＥ
１１Ａポリペプチドの細胞内活性が通常は上記ＰＤＥ１
１Ａ遺伝子の野生型翻訳物を発現する細胞において減少
されるように、遺伝的に改変されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子
を意味する。上記遺伝子改変が細胞内で上記ＰＤＥ１１
Ａ遺伝子の全ての野生型コピーを有効に消滅させる（例
えば、上記遺伝的に改変された、非ヒト哺乳類又は動物
細胞がＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊についてホモ接合である
又はもともと存在するＰＤＥ１１Ａ遺伝子の野生型コピ
ーのみが今破壊される）とき、上記遺伝子改変は、野生
型ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を発現する好適な対照細胞と比較
して、ＰＤＥ１１Ａポリペプチド活性における減少をも
たらす。ＰＤＥ１１Ａポリペプチド活性におけるこの減
少は減少したＰＤＥ１１Ａ遺伝子発現（すなわち、ＰＤ
Ｅ１１Ａ ｍＲＮＡ値が有効に減少される、及びＰＤＥ
１１Ａポリペプチドの減少した値を作出する）に由来す
る及び／又は上記破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子は野生
型ＰＤＥ１１Ａポリペプチドと比較して減少した機能又
は安定性を有する変異を誘発したポリペプチドをコード
するためである。好ましくは、遺伝的に改変された、非
ヒト哺乳類又は動物細胞におけるＰＤＥ１１Ａポリペプ
チドの活性は野生型の値の５０％以下まで、より好まし
くは２５％以下まで、及びさらにより好ましくは野生型
の値の１０％以下まで減少される。最も好ましくは、上
記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊は検出できないＰＤＥ１１Ａ
活性をもたらす。
【００９１】機能的に破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を
含む「遺伝的に改変された、非ヒト哺乳類」により、例
えば、上記所望される遺伝的改変を有する胚盤胞又は胚
を作出し、そしてその後ｉｎ ｕｔｅｒｏの発達のため
に代理母内に上記胚盤胞又は胚を移植することにより、
もともと作出された非ヒト哺乳類を意味する。マウスの
場合、上記遺伝的に改変された胚盤胞又は胚は、遺伝的
に改変された胚幹（ＥＳ）細胞をマウス未分化胚芽細胞
に移植することにより又は四倍体の胚でＥＳ細胞を集め
ることにより、胚が作出されうる。あるいは、さまざま
な種の遺伝的に改変された胚は核移植により得られう
る。核移植の場合、上記提供者細胞は体細胞又は多能性
の幹細胞であり、そしてそれは上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子
を機能的に破壊する所望の遺伝的改変を含むように作り
変えられる。この細胞の核はその後徐核された、受精し
た又は単為発生の卵母細胞内に移植される；上記胚は再
構築される、及び胚盤胞内で発達される。上記方法のい
ずれかにより作出された遺伝的に改変された胚盤胞はそ
の後当業者に周知の標準の方法に従って代理母内に移植
される。「遺伝的に改変された、非ヒト哺乳類」は上記
に示された方法により作出される哺乳類の全ての子孫を
含み、上記子孫は上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を機能的に破
壊する遺伝的改変の少なくとも１のコピーを受け継ぐこ
とが提供される。上記遺伝的に改変された哺乳類の全て
の体細胞及び生殖細胞が上記改変を含むことが好まし
い。破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含むように遺伝的
に改変された好ましい非ヒト動物はマウス及びラットの
如きげっ歯類、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、ハム
スター、ヒツジ、ブタ及びフェレットを含む。
【００９２】機能的に破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を
含む「遺伝的に改変された動物細胞」により、上記破壊
されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を受け継ぐ娘細胞はもちろ
ん、機能的に破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含むよう
に遺伝工学により作出された、ヒト細胞を含む動物細胞
を意味する。これらの細胞は当業者に知られる標準の方
法に従って培養で遺伝的に改変されうる。培養で上記細
胞を遺伝的に改変する代替として、非ヒト哺乳類細胞は
ＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊を含む遺伝的に改変された、非
ヒト哺乳類から単離されうる。本発明に係る動物細胞は
培養に適合された、腫瘍形成の又は形質転換された細胞
系はもちろん、初代細胞又は組織調製物から得られう
る。これらの細胞及び細胞系は、例えば、内皮細胞、上
皮細胞、小島、神経単位及び他の神経組織由来細胞、中
皮細胞、骨細胞、リンパ球、軟骨細胞、造血細胞、免疫
細胞、主要な腺又は組織の細胞（例えば、精巣、肝臓、
肺、心臓、胃、膵臓、腎臓、及び皮膚）、（骨格筋、平
滑筋、及び心筋からの細胞を含む）筋肉細胞、外分泌性
又は内分泌性細胞、線維芽細胞、及び胚の及び他の全能
性又は多能性幹細胞（例えば、ＥＳ細胞、ＥＳ様細胞、
及び胚の生殖系（ＥＧ）細胞、及び先祖細胞及び組織由
来幹細胞の如き、他の幹細胞）に由来する。上記好まし
い遺伝的に改変された細胞はＥＳ細胞、より好ましく
は、マウス又はラットのＥＳ細胞、及び最も好ましく
は、ヒトＥＳ細胞である。
【００９３】「ＥＳ細胞」又は「ＥＳ様細胞」により、
全ての３の胚芽層の代表である細胞型への分化はもちろ
ん、無限の自己再生の能力がある、胚から、原始生殖細
胞から又は奇形癌から由来する多能性幹細胞を意味す
る。「ＰＤＥ１１Ａ遺伝子」により、ヒト対立形質変異
体及びＰＤＥ１１Ａ活性及びそれらの対立形質の変異体
を有するホモログをコードする哺乳類配列はもちろん、
Ｆａｗｃｅｔｔ， ２０００、（ヒトＰＤＥ１１Ａ１、
ＧｅｎＢａｎｋ 取得番号第ＡＪ２５１５０９）、ＷＯ
００／４０７３３（ヒトＰＤＥ１１Ａ１及びＰＤＥ１
１Ａ２）又はＹｕａｓａ， ２０００（ヒトＰＤＥ１１
Ａ３及びＰＥ１１Ａ４、ＧｅｎＢａｎｋ 取得番号第Ａ
Ｂ０３６７０４及びＡＢ０３８０４１）中で開示される
ポリペプチドをコードする核酸配列を意味する。「ＰＤ
Ｅ１１ポリペプチド」により、ヒト対立形質変異体及び
ＰＤＥ１１Ａ活性を有する哺乳類のホモログによりコー
ドされるポリペプチドはもちろん、Ｆａｗｃｅｔｔ，２
０００又はＹｕａｓａ， ２０００中で開示されるフォ
スフォジエステラーゼを意味する。本明細書中で使用さ
れるとき、上記用語「ホモログ」は異なる種（例えば、
ヒト及びマウスＰＤＥ１１Ａポリペプチド）における引
用タンパク質に進化的に関連する、及び実質的な構造の
及び機能の類似性を共有するタンパク質を意味する。
【００９４】「ＰＤＥ１１Ａポリペプチド活性」又は
「ＰＤＥ１１Ａポリペプチド様活性」又は「ＰＤＥ１１
Ａ活性」により、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子によりコードされ
るポリペプチドによるｃＡＭＰ又はｃＧＭＰの加水分解
を意味する。細胞内での上記活性はＰＤＥ１１Ａ発現の
値で（例えば、細胞内に有効に存在するポリペプチドの
量を変化させることにより）又はそれぞれのＰＤＥ１１
Ａポリペプチド分子の特定の機能特性を調節することに
より（例えば、上記変異を誘導されたポリペプチドの加
水分解のＫｍを変化させることにより）調節されうる。
「調節する」により、増大又は（完全な消滅を含む）減
少を意味する。
【００９５】ＰＤＥ１１Ａ活性を調節するのに「選択
的」である剤により、同じ濃度の剤で他のＰＤＥにはほ
とんど影響を与えない一方で、主にＰＤＥ１１Ａに影響
する剤を意味する。例えば、剤がＰＤＥ１１Ａを阻害す
るのに選択的である場合、ＰＤＥ１１Ａについての上記
剤の５０％阻害が起こる濃度（ＩＣ５０）は、ＰＤＥｓ
１〜１０の群からの１以上のＰＤＥｓについてのＩＣ５
０と比較して濃度が少なくとも２０倍、より好ましく
は、少なくとも３０倍、さらにより好ましくは、少なく
とも５０倍、及びさらにより好ましくは、少なくとも１
００倍低い。好ましくは、上記剤はＰＤＥ７〜１０に比
較して、及びより好ましくは、ＰＤＥｓ１〜１０の全
て、特にＰＤＥ３〜６に比較して、ＰＤＥ１１Ａに選択
的である。
【００９６】性機能障害 性機能障害（ＳＤ）は男性及び女性の両方に影響しうる
顕著な臨床的問題である。ＳＤの原因は心理的なものは
もちろん器官的なものでありうる。ＳＤの器官的な局面
は典型的に高血圧又は真性糖尿病に関連するものの如
き、基礎となる血管性疾患により、処方治療により及び
／又は憂うつの如き精神科疾患により引き起こされる。
生理学的な因子は、恐れ、行為不安及び対人関係の対立
を含む。ＳＤは性行為を損なう、自己尊重を減少させ
る、及び対人関係を破壊し、それにより個人の悩みを誘
発する。臨床においては、ＳＤ障害は女性の性機能障害
（ＦＳＤ）障害及び男性の性機能障害（ＭＳＤ）障害に
分けられている（Ｍｅｌｍａｎｅｔ ａｌ １９９
９）。ＦＳＤは性的表現において満足を見出すことの女
性の困難さ又は不能として最もよく定義される。男性の
性機能障害（ＭＳＤ）は一般的に男性の勃起機能障害
（ＭＥＤ）としても知られる勃起機能障害と関連する
（Ｂｅｎｅｔ ｅｔ ａｌ １９９４−Ｍａｌｅ Ｅｒ
ｅｃｔｉｌｅ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｓｓｅｓｓ
ｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｐｔｉｏｎ
ｓ． Ｃｏｍｐ． Ｔｈｅｒ． ２０：６６９−６７
３）。
【００９７】本発明に係る剤は女性の性機能障害（ＦＳ
Ｄ）、特に女性の性的覚醒障害（ＦＳＡＤ）、女性のオ
ルガズム障害（ＦＯＤ）又は性的欲求活動低下障害（Ｈ
ＳＤＤ）の予防及び／又は治療に特に有効である。
【００９８】女性の性機能障害（ＦＳＤ） 女性の性機能障害（ＦＳＤ）のカテゴリーはそれらを正
常な女性の性的応答：欲求、覚醒及びオルガズムの段階
と対比することにより最もよく定義される（ＳＲ Ｌｅ
ｉｂｌｕｍ， （１９９８）， Ｄｉｆｉｎｉｔｉｏｎ
ａｎｄ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅ
ｍａｌｅ Ｓｅｘｕａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ， Ｉｎ
ｔ． Ｊ． Ｉｍｐｏｔｅｎｃｅ Ｒｅｓ．， １０，
Ｓ１０４−Ｓ１０６を参照のこと）。欲求又は衝動は
性的表現の駆動力である。その表明はしばしば興味のあ
る相手と共にいるとき又は他の性欲をかきたてる刺激に
暴露されたときの性的考えを含む。覚醒は性的刺激に対
する血管応答を含み、その重要な成分は生殖器の充血及
び増大した膣の潤滑、膣の伸長及び増大した生殖器の感
覚／敏感さ並びに自覚的な興奮応答である。オルガズム
は覚醒の間に頂点に達した性的緊張の解放である。した
がって、ＦＳＤは女性が１以上のこれらの段階、通常欲
求、覚醒又はオルガズムにおいて欠落した、不十分な又
は不満足な応答を有するとき起こる。
【００９９】米国精神医学会は女性の性機能障害（ＦＳ
Ｄ）を４のクラスに分類する：ＦＳＡＤ、性的欲求活動
低下障害（ＨＳＤＤ）、女性のオルガズム障害（ＦＯ
Ｄ）、及び性的疼痛障害（例えば、性交疼痛症及び膣
痙）［ｔｈｅ ＡｍｅｒｉｃａｎＰｓｙｃｈｉａｔｒｉ
ｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ’ｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ
ｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ， ４ｔｈ
Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＤＳＭ−ＩＶ）を参照のこと］。
【０１００】ＤＳＭ−ＩＶは４のクラスを以下のように
定義する：ＨＳＤＤ−性的活動についての性的想像及び
欲求の持続的な又は再発性の不足（又は欠落）。不足又
は欠落の判断は、年齢及びその個人の生活の内容の如
き、機能に影響する因子を考慮して、臨床医によりなさ
れる。
【０１０１】ＦＳＡＤ−性的興奮の十分な潤滑−膨張応
答を得ること又は性的活動の完了まで維持することの持
続的な又は再発性の不能。
【０１０２】ＦＯＤ−正常な性的興奮段階に続くオルガ
ズムの持続的な又は再発性の遅延又は欠落。女性はオル
ガズムを引き起こす刺激の型又は強さにおいてさまざま
な変動性を示す。ＦＯＤの診断はその女性のオルガズム
能力が彼女の年齢、性的経験、及び彼女が受ける性的刺
激の十分さについて見合うよりも少ないという臨床医の
判断に基づくべきである。
【０１０３】性交疼痛症（性交に関連した再発性の又は
持続性の生殖器の痛み）及び膣痙（性交を妨げる膣の外
側第三の筋肉組織の再発性の又は持続性の不本意の痙
攣）の如き、性的疼痛障害。
【０１０４】性的欲求活動低下障害（ＨＳＤＤ） ＨＳＤＤは女性が性的であることの欲求を全く又はほと
んど持たない、及び性的考え又は想像を全く又はほとん
ど持たない場合に存在する。この型のＦＳＤは自然に起
こる閉経又は外科的な閉経のための低いテストステロン
値により引き起こされうる。閉経後の女性はもちろん、
閉経前の女性（すなわち、閉経前である、及び子宮摘出
を受けていない）における他の原因は、疾患、薬物療
法、疲労、憂うつ及び／又は不安を含む。対人関係の困
難さ又は宗教的な因子の如き可能性のある（自覚のある
又は潜在意識の）心理的影響を有する因子は女性におけ
るＨＳＤＤの存在／発展に関連しうる。
【０１０５】本明細書中に定義される顕著なＨＳＤＤ
は、女性患者にある程度の憂うつを引き起こす、ＨＳＤ
Ｄの値を意味する。好ましくは、顕著なＨＳＤＤはある
程度の憂うつを引き起こす及び計測できるＨＳＤＤの値
を意味する。より好ましくは、顕著なＨＳＤＤはある程
度の憂うつを引き起こす及び欲求ドメインに基づく１５
以下のスコア（ＳＦＱスケール）として計測できるＨＳ
ＤＤの値を意味する。
【０１０６】本明細書中に定義される併発のＨＳＤＤ
は、（その患者について）通常に又は（その患者につい
て）前の機能と比較したとき、欲求の欠落した又は顕著
に低い値の欲求を有する、又は性的考え又は想像を全く
又はほとんど有しない、ＦＳＡＤの女性患者を意味す
る。
【０１０７】ごく稀に上記患者は活動に対する彼女の欲
求におけるわずかな増加を経験しうるが、一般的及び全
体的には彼女の機能は彼女の以前の値（又は彼女の通常
の値）と比較して不十分であるような、ＨＳＤＤの症状
が場合により心理的因子により和らぐ、ＦＳＡＤ及びＨ
ＳＤＤの女性患者はＨＳＤＤを患っていると分類される
べきだと理解されるべきである。
【０１０８】本明細書中に定義される併発の顕著なＨＳ
ＤＤは状況に応じたＨＳＤＤの女性患者を含まないと理
解されるべきである。本明細書中に定義される状況に応
じたＨＳＤＤの女性患者は通常覚醒できる及び通常性的
欲求の満足な値を経験するが、（相手特異的なＨＳＤＤ
のように）場合により外的な因子への直接の又は間接の
応答として性的欲求の満足な値を経験することができな
い女性患者を含む。
【０１０９】女性の性的覚醒障害（ＦＳＡＤ） 米国精神医学会の診断及び統計マニュアル（ＤＳＭ）Ｉ
Ｖは女性の性的覚醒障害（ＦＳＡＤ）を以下のように定
義する：「・・・性的興奮の十分な潤滑−膨張応答を得
ること又は性的活動の完了まで維持することの持続性の
又は再発性の不能。上記妨害は顕著な憂うつ又は対人関
係の困難さを引き起こす・・・。」
【０１１０】上記覚醒応答は胎盤における血管充血、膣
の潤滑及び外側生殖器の伸長及び膨張から成る。上記妨
害は顕著な憂うつ及び／又は対人関係の困難さを引き起
こす。
【０１１１】ＦＳＡＤは閉経前、近辺及び後（±ホルモ
ン置換治療（ＨＲＴ））の女性に影響する高い有病率の
性的障害である。それは憂うつ、心血管疾患、糖尿病及
び泌尿生殖器系（ＵＧ）障害の如き付随する障害と関連
する。
【０１１２】ＦＳＡＤの初期の結果は充血／膨張の欠
落、潤滑の欠落及び満足な生殖器の感覚の欠落である。
ＦＳＡＤの第二の結果は減少した性的欲求、性交の間の
痛み及びオルガズムを達成することにおける困難さであ
る。ＦＳＡＤの症状を有する少なくとも一部の患者につ
いては血管の基礎があるという仮説が最近立てられてお
り（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ．
Ｊ． Ｉｍｐｏｔ． Ｒｅｓ．， １０， Ｓ８４−Ｓ
９０， １９９８）、この観点を支持する動物データも
ある（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ．Ｊ． Ｉｍ
ｐｏｔ． Ｒｅｓ．， ９， ２７−３７，１９９
７）。
【０１１３】有効性についての調査下にある、ＦＳＡＤ
を治療するための薬物候補は、はじめは男性の生殖器に
循環を促進する勃起機能障害の治療である。それらは２
の型の調剤、経口又は舌下の医薬（アポモルフィン、フ
ェントラミン、フォスフォジエステラーゼ５型（ＰＤＥ
５）阻害剤、例えば、シルデナフィル）、及び男性にお
いて経尿道的に及び女性において生殖器に局所的に注入
される又は投与されるプロスタグランジン（ＰＧＥ１）
から成る。
【０１１４】本発明に係るいくつかの剤は正常な性的覚
醒応答−つまり膣の、クリトリスの及び唇の充血を引き
起こす増大した生殖器の血流を回復させる方法を提供す
ることにより有用である。このことは血漿浸出を介する
増大した膣の潤滑、増大した膣の弾力性及び増大した生
殖器の敏感さをもたらすであろう。したがって、本発明
は正常な性的覚醒応答を回復させる又は高める方法を提
供する。
【０１１５】本明細書中で女性の生殖器により、私たち
は以下のことを意味する：「生殖組織は内側の及び外側
の群から成る。上記内側の器官は胎盤内に位置し、そし
て卵巣、卵管、子宮及び膣から成る。上記外側の器官は
泌尿生殖器系の隔膜の外面に及び胎盤弓の下にある。そ
れらは胎盤丘、唇大及び小外陰部、クリトリス、前庭、
前庭の弁、及び大前庭腺を含む」（Ｇｒａｙ’ｓ Ａｎ
ａｔｏｍｙ， Ｃ．Ｄ． Ｃｌｅｍｅｎｔｅ， １３
ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｅｄｉｔｉｏｎ）。
【０１１６】Ｒ．Ｊ． Ｌｅｖｉｎは「・・・男性及び
女性の生殖器は発生学的に共通の組織原基から発展し、
［そして］男性及び女性の生殖器構造は互いに相同であ
ることが議論される。したがって、クリトリスはペニス
のホモログ、及び唇は陰嚢包のホモログである。・・
・」ということを私たちに教える（Ｌｅｖｉｎ， Ｒ．
Ｊ． （１９９１）， Ｅｘｐ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌ．， ９８， ６１−６９）。
【０１１７】要約として、ＦＳＡＤは性的刺激に対する
不十分な生殖器の応答により特徴付けられる。上記生殖
器は正常な性的覚醒を特徴付ける充血を経験しない。上
記膣壁は不十分にしか潤滑しないので、性交は痛みを伴
う。オルガズムは妨げられうる。覚醒障害は糖尿病及び
アテローム性動脈硬化症の如き血管成分を伴う疾患によ
ることはもちろん、閉経中又は出産後及び授乳中の減少
したエストロゲンにより引き起こされうる。他の原因は
利尿薬、抗ヒスタミン薬、抗うつ薬、例えば、選択的セ
ロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩｓ）又は抗高血圧
剤での治療から生ずる。
【０１１８】女性の（性的）オルガズム障害（ＦＳＯＤ
又はＦＯＤ） ＦＯＤは、十分な性的刺激及び覚醒に続いてオルガズム
を得ることの持続性の又は再発性の困難さ、遅れ又は欠
落であり、個人的な憂うつを引き起こす。
【０１１９】性的疼痛障害 （性交疼痛症及び膣痙を含む）性的疼痛障害は挿入及び
性的活動から生ずる痛みにより特徴付けられ、そして潤
滑を減少させる投薬、子宮内膜症、胎盤炎症疾患、炎症
性腸疾患又は尿路の問題により引き起こされうる。
【０１２０】本発明の他の特性及び利点は以下の詳細な
説明から及び上記請求項から明らかであろう。本発明は
特定の態様に関連して示されている一方で、実施されう
る他の変化及び改変も本発明の一部であり、そして付属
の請求項の範囲内にあることが理解されるであろう。こ
の出願は以下の本発明の代替、変化、使用又は適用も覆
うものと意図され、一般的に、本発明の原理は、本分野
内の知られた又は慣用の実施内で起こる、及び過度の実
験なしに確かめることのできる、本開示からの発展を含
む。核酸及びポリペプチドを作出する及び使用する点に
ついての追加の手引きは分子生物学、タンパク質科学、
及び免疫学の標準の教本において見られる（例えば、Ｄ
ａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌ
ｓｅｖｉｒ ＳｃｉｅｎｃｅｓＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，
Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９８
６； Ｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ＩＬ Ｐｒ
ｅｓｓ， １９８５； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｄｓ． Ａｕｓｕｂｅｌ
ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏ
ｎｓ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｅｄｓ． Ｄｒａｃｏ
ｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａ
ｎｄ Ｓｏｎｓ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ， Ｅｄｓ．
Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ； 及びＣｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ， Ｅｄｓ． Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ
ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓ
ｏｎｓを参照のこと）。本明細書中に挙げられる全ての
文献はそれらを全体として援用される。
【０１２１】発明の詳細な説明 本明細書中では、通常ＰＤＥ１１Ａを発現する細胞及び
組織におけるＰＤＥ１１Ａ機能を同定するための分析は
もちろん、破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含む、遺伝
的に改変された動物細胞及び遺伝的に改変された非ヒト
哺乳類が示される。
【０１２２】ＰＤＥ１１Ａ破壊（ＰＤＥ１１Ａ −／
−）についてホモ接合である遺伝的に改変されたマウス
の研究に基づいて、私たちはＰＤＥ１１Ａは精子形成を
刺激すること、精子受精能獲得を阻害すること、性的覚
醒を増大させる／正常化すること（女性）及びオルガズ
ムを増大させる／正常化すること（女性）において役割
を果たすことを発見した。したがって、本発明は、それ
ぞれＰＤＥ１１Ａ活性を減少させる又は増大させる剤を
投与することにより、例えば、哺乳類において精子受精
能獲得を刺激する又は阻害することに打撃を与える又は
影響を与える方法を提供する。
【０１２３】１．遺伝的に改変された非ヒト哺乳類及び
動物細胞 本明細書中に示される、上記遺伝的に改変された非ヒト
哺乳類及びヒト細胞を含む、遺伝的に改変された動物細
胞はＰＤＥ１１Ａ遺伝子を機能的に破壊する改変につい
てヘテロ接合又はホモ接合である。上記動物細胞は培養
で細胞を遺伝的に作出することにより由来されることが
でき、又は、非ヒト哺乳類細胞の場合には、上記細胞は
遺伝的に改変された非ヒト哺乳類から単離されうる。
【０１２４】上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子座は、化学突然変
異誘発（Ｒｉｎｃｈｉｋ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ ７： １５−２１， １９９１， Ｒｕｓ
ｓｅｌｌ， Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ＆ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ２３（Ｓｕｐ
ｐｌ． ２４）２３−２９， １９９４）、照射（Ｒｕ
ｓｓｅｌｌ， ｓｕｐｒａ）、単一の又は触媒ＲＮＡリ
ボザイム配列を伴う、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子アンチセンス
ＲＮＡのトランスジェニック発現（Ｌｕｙｃｋｘ ｅｔ
ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓ
ｃｉ． ９６：１２１７４−７９， １９９９； Ｓｏ
ｋｏｌ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ ５： ３６３−７１， １９９６； Ｅ
ｆｒａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ９１： ２０５１−５
５， １９９４； Ｌａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：
２２４２−４８，１９９４）及び、さらに以下に議論
されるように、外来核酸配列をＰＤＥ１１Ａ遺伝子座に
挿入することによるＰＤＥ１１Ａ遺伝子の破壊を含む、
本分野において知られる遺伝的改変のためのいくつかの
方法の１により機能的に破壊される。好ましくは、上記
外来性配列は相同的組換えにより又はウイルスベクター
の挿入により挿入される。最も好ましくは、ＰＤＥ１１
Ａ遺伝子破壊の方法は相同的組換えであり、そして内因
性ＰＤＥ１１Ａ遺伝子配列の一部の欠損を含む。
【０１２５】外来性配列の統合は１以上の以下の機構を
とおしてＰＤＥ１１Ａ遺伝子を機能的に破壊する：ＰＤ
Ｅ１１Ａ遺伝子転写又は翻訳プロセスを妨害することに
より（例えば、プロモーター認識を妨害することにより
又は転写終結部位又は翻訳停止コドンを上記ＰＤＥ１１
Ａ遺伝子内に導入することにより）；又はそれがもはや
正常な機能を有するＰＤＥ１１Ａポリペプチドをコード
しないように上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子をコードする配列
をひずませることにより（例えば、外来性コード配列
を、上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子をコードする配列内に挿入
することにより、フレームシフト突然変異又はアミノ酸
置換を導入することにより又は二重交差事件の場合に
は、機能的なＰＤＥ１１Ａタンパク質の発現に必要とさ
れる上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子をコードする配列の一部を
欠損させることにより）。
【０１２６】外来性配列を細胞ゲノム内のＰＤＥ１１Ａ
遺伝子座に挿入するために、上記外来性ＤＮＡ配列は、
エレクトロポレーション、カルシウム−リン酸沈殿、レ
トロウイルス感染、マイクロインジェクション、ｂｉｏ
ｌｉｓｔｉｃｓ、リポソームトランスフェクション、Ｄ
ＥＡＥ−デキストラントランスフェクション又はトラン
スファー感染（例えば、Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａ
ｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．１：８４１−８４５， １９８
２； Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１： ７１
６１−６５， １９８４； Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５： １３１
１−２６， １９８７；Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｃａｐ
ｅｃｃｈｉ， Ｃｅｌｌ ５１： ５０３−１２， １
９８７； Ｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ １７： １０５８−６２， １９９４；
Ｂｉｅｗｅｎｇａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７１： ６７−７
５， １９９７； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５： ８６８−７２， １９
９３； Ｒａｙａｎｄ Ｇａｇｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ １３： ５９８−６０３，１９９２； Ｌ
ｏ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３： １８
０３−１４， １９９３； Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ ｅｔ
ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ， １０：９３
−１０１， １９９８； Ｌｉｎｎｅｙ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．（Ｏｒｌａｎｄｏ）２１
３： ２０７−１６， １９９９； Ｚｉｍｍｅｒ ａ
ｎｄ Ｇｒｕｓｓ， Ｎａｔｕｒｅ ３３８： １５０
−１５３， １９８９； 及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅ
ｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２３： ４４５−４
８， １９８６）の如き、本分野において周知の好適な
方法により導入される。外来性ＤＮＡを細胞に導入する
好ましい方法はエレクトロポレーションである。
【０１２７】Ａ．相同的組換え 相同的組換えの方法は、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を標的にす
るベクターをＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含む細胞に導入する
ことによる上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の破壊を目標とす
る。上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を標的にして破壊するベク
ターの能力は上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子に相同である上記
ベクター内のヌクレオチド配列を用いて起こる。この相
同的領域は上記ベクター及び上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の
内因性配列の間のハイブリダイゼーションを促進する。
ハイブリダイゼーションに際して、上記標的を有するベ
クター及びゲノム配列の間の交差事件の可能性は大きく
増大する。この交差事件は上記ベクター配列の上記ＰＤ
Ｅ１１Ａ遺伝子座への統合及び上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子
の機能的な破壊をもたらす。
【０１２８】当業者が理解するであろうように、標的化
に使用されるベクターの構築についての一般的な原理は
Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ．１０： ５３４， １９９２）において概説され
る。ベクターの２の異なる例示的な型：挿入ベクター又
は置き換えベクターが相同的組換えによりＤＮＡを挿入
するのに使用されうる。挿入ベクターは二重標準休止を
有するＰＤＥ１１Ａ遺伝子相同的領域を含む環状ＤＮＡ
である。上記相同的領域及び上記内因性ＰＤＥ１１Ａ遺
伝子の間のハイブリダイゼーションに続いて、上記二重
標準休止での単一の交差事件が交差の部位で上記ウイル
ス配列全体の上記内因性遺伝子への挿入をもたらす。
【０１２９】相同的組換えのための使用に、より好まし
いベクターは置き換えベクターであり、環状というより
はむしろ、共直鎖である。上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子への
置き換えベクター統合は二重交差事件、すなわち、上記
標的を有するベクター及び上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の間
のハイブリダイゼーションの２の部位で交差が起こるこ
とを必要とする。この二重交差事件は、上記ＰＤＥ１１
Ａ遺伝子への２の交差部位の間にはさまれるベクター配
列の統合、及びもともと２の交差部位の間に伸びていた
対応する内因性ＰＤＥ１１Ａ遺伝子配列の欠損をもたら
す（例えば、Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ
ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ５１：５０３−１２，
１９８７； Ｍａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ
ｕｒｅ３３６： ３４８−５２， １９８８； Ｍａｎ
ｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７： ７６８８−７６
９２， １９９０；及びＭａｎｓｏｕｒ， ＧＡＴＡ
７： ２１９−２２７， １９９０を参照のこと）。
【０１３０】標的を有するベクターにおける相同的領域
は一般的に少なくとも１００ヌクレオチドの長さであ
る。最も好ましくは、上記相同的領域は少なくとも１〜
５キロ塩基（Ｋｂ）の長さである。相同的領域に必要と
される最小の長さ又は最小の相関性の程度は示されてい
ない。しかしながら、当業者は、相同的組換えについて
の標的効率は一般的に上記標的を有するベクター及び上
記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子座の間の長さ及び相関性の程度に
一致するであろうということを認識するであろう。置き
換えベクターが使用される、及び上記内因性ＰＤＥ１１
Ａ遺伝子の一部が相同的組換えに際して欠損する場合に
は、追加の考慮は内因性ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の欠損した
部分の大きさである。上記内因性ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の
この一部が１Ｋｂの長さよりも大きい場合は、１Ｋｂよ
りも長い相同的領域を伴う標的を有するカセットが組換
えの効率を高めるのに推奨される。相同的組換えに有効
な配列の選択及び使用についてのさらなる案内は引用文
献において示される（例えば、Ｄｅｎｇ ａｎｄ Ｃａ
ｐｅｃｃｈｉ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．１
２： ３３６５−３３７１， １９９２； Ｂｏｌｌａ
ｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅ
ｔ． ２３： １９９−２２５， １９８９； 及びＷ
ａｌｄｍａｎ ａｎｄ Ｌｉｓｋａｙ， Ｍｏｌ． Ｃ
ｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８： ５３５０−５３５７，
１９８８を参照のこと）。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ関連
プラスミド（例えば、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋１
１）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐＢＳ、
ｐＤ１０、ファージスクリプト、ｐｈｉＸ１７４、ｐＢ
Ｋ Ｐｈａｇｅｍｉｄ、 ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、
ｐＮＨ１８Ｚ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ
２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、及びｐ
ＲＩＴ５ ＰＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＸＴ１、
ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ＰＢＰ
Ｖ、ＰＭＳＧ、及びｐＳＶＬ、ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ
３２２に基づくベクター、ｐＢＭ９、ｐＢＲ３２５、ｐ
ＫＨ４７、ｐＢＲ３２８、ｐＨＣ７９、ファージＣｈａ
ｒｏｎ２８、ｐＫＢ１１、ｐＫＳＶ−１０、ｐＫ１９関
連プラスミド、ｐＵＣプラスミド、及びプラスミドのｐ
ＧＥＭシリーズを含む、広くさまざまなクローニングベ
クターが本発明に係る上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を標的に
するベクターの構築におけるベクター骨格として使用さ
れうる。これらのベクターはさまざまな商業的な源から
入手可能である（例えば、ＩＮ、インディアナポリスの
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ；ＣＡ、バレンシアのＱｉａｇｅｎ；Ｃ
Ａ、ラ・ジョラのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ；ＷＩ、マディ
ソンのＰｒｏｍｅｇａ；及びＭＡ、ビバリーのＮｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。しかしながら、他
のベクター、例えば、プラスミド、ウイルス又はそれら
の部分はそれらが所望の宿主内で複製可能であり生存可
能であるかぎり増殖に使用されうる。上記ベクターはそ
のゲノムが改変されるべき宿主内でそれが複製できるよ
うにする配列をも含みうる。上記ベクターの使用は、標
的効率を増大させ、組換えが起こりうる相互作用期間を
延ばしうる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
ｅｄ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｕｎｉｔ
９．１６、図９．１６．１を参照のこと）。
【０１３１】本発明に係る標的を有するベクターを増殖
させるのに使用される特定の宿主は重要ではない。実施
例はＥ． ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＲ１（Ｂｏｌｉｖａｒ
ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ２： ９５， １９７
７）、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ１２ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ
第３３６９４号）、Ｅ． ｃｏｌｉ ＭＭ２１（ＡＴＣ
Ｃ 第３３６７８０号）、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ１（Ａ
ＴＣＣ 第３３８４９号）、Ｅ． ｃｏｌｉ 株ＤＨ５
α、及びＥ． ｃｏｌｉ ＳＴＢＬ２を含む。あるい
は、Ｃ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又はＢ． ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓの如き宿主が使用されうる。上記に挙げられた宿
主は商業的に入手可能である（例えば、ＣＡ、ラ・ジョ
ラのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ；及びＭＤ、ロックヴィルの
ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【０１３２】標的を有するベクターを作出するために、
ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を標的にする構築物が上記に示され
るベクター骨格に加えられる。本発明に係るＰＤＥ１１
Ａ遺伝子を標的にする構築物は少なくとも１のＰＤＥ１
１Ａ遺伝子相同的領域を有する。上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝
子相同的領域を作出するために、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子に
関連した配列がポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）プライマ
ーを作出するための基礎として使用される。これらのプ
ライマーは高忠実性ＰＣＲ増幅により上記ＰＤＥ１１Ａ
配列の所望の領域を増幅するのに使用される（Ｍａｔｔ
ｉｌａ ｅｔａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ． １９： ４９６７， １９９１； Ｅｃｋｅ
ｒｔ ａｎｄ Ｋｕｎｋｅｌ １： １７， １９９
１；及び米国特許第４，６８３，２０２号）。上記ゲノ
ム配列はゲノムクローンライブラリーから又はゲノムＤ
ＮＡの調製から、好ましくはＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊の
標的にされるべき動物種から得られる。ＰＤＥ１１Ａ遺
伝子に関連した配列は、例えば、Ｆａｗｃｅｔｔ， ２
０００、（ヒトＰＤＥ１１Ａ１、ＧｅｎＢａｎｋ取得番
号第ＡＪ２５１５０９）、ＷＯ ００／４０７３３（ヒ
トＰＤＥ１１Ａ１及びＰＤＥ１１Ａ２）、及びＹｕａｓ
ａ， ２０００（ヒトＰＤＥ１１Ａ３及びＰＥ１１Ａ
４、ＧｅｎＢａｎｋ取得番号第ＡＢ０３６７０４及びＡ
Ｂ０３８０４１）中で報告されている。
【０１３３】好ましくは、本明細書中に示される標的を
有する構築物は陽性マーカータンパク質をコードする外
因性ヌクレオチド配列をも含む。ベクター統合の後の陽
性マーカーの安定な発現は細胞の生存力に妥協すること
なく上記細胞に同定可能な特性を与える。それゆえ、置
き換えベクターの場合には、上記マーカー遺伝子は、そ
れが上記二重交差事件に続いて上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子
内へ統合されるように、２の両側に位置する相同的領域
の間に位置される。
【０１３４】上記陽性マーカータンパク質は選択可能な
タンパク質であることが好ましい；細胞内の上記タンパ
ク質の安定な発現は選択可能な表現型特性を与える、す
なわち、上記特性は、そうでなければ致命的な条件下で
の、上記細胞の生存率を高める。したがって、上記選択
可能な条件を課すことにより、生存力に基づいて、上記
陽性選択可能なマーカーを安定に発現する細胞を、上記
ベクター配列をうまく統合しなかった他の細胞から単離
することができる。陽性選択可能なマーカータンパク質
（及びそれらの選択剤）の例はＮｅｏ（Ｇ４１８又はカ
ナマイシン）、Ｈｙｇ（ハイグロマイシン）、ＨｉｓＤ
（ヒスチジノール）、Ｇｐｔ（キサンチン）、Ｂｌｅ
（ブレオマイシン）、及びＨｐｒｔ（ヒポキサンチン）
を含む（例えば、をＣａｐｅｃｃｈｉ ａｎｄ Ｔｈｏ
ｍａｓ， 米国特許番号第５，４６４，７６４号および
Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １２
８８−９２， １９８９を参照のこと）。選択可能なマ
ーカーの代替として使用されうる他の陽性マーカーはβ
−ガラクトシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ又は緑色蛍
光タンパク質の如きレポータータンパク質を含む（例え
ば、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｙｔ
ｏｍｅｔｒｙ， Ｕｎｉｔ ９．５、及びＣｕｒｒｅｎ
ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｕｎｉｔ ９．６， Ｊｏｈｎ Ｗ
ｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮｅｗＹｏｒｋ， ＮＹ，
２０００を参照のこと）。
【０１３５】上記に示した陽性選択スキームは、どこか
の染色体位置へのベクター配列のランダムな非相同的な
統合に対して、上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子座での標的にし
た相同的組換えにより上記ベクターを統合した細胞を区
別しない。それゆえ、相同的組換えのための置き換えベ
クターを用いるとき、陰性選択可能なマーカータンパク
質をコードするヌクレオチド配列を含むことも好まし
い。陰性選択可能なマーカーの発現はある剤に暴露され
たとき生存力を失うマーカーを発現する細胞をもたらす
（すなわち、上記マーカータンパク質はある選択可能な
条件下で上記細胞に致命的になる）。陰性選択可能なマ
ーカー（及びそれらの致命性の剤）の例は単純ヘルペス
ウイルスチミジンキナーゼ（ガンシクロヴィル又は１，
２−デオキシ−２−フルオロ−α−ｄ−アラビノフラン
シル−５−ヨードウラシル）、Ｈｐｒｔ（６−チオグア
ニン又は６−チオキサンチン）、及びジフテリア毒、リ
シン毒、及びシトシンデアミナーゼ（５−フルオロシト
シン）を含む。
【０１３６】上記陰性選択可能なマーカーをコードする
ヌクレオチド配列は上記置き換えベクターの２の相同的
領域の外側に位置される。この位置を与えられると、統
合がランダムな非相同的組換えにより起こる場合、細胞
は上記陰性選択可能なマーカーを統合する、及び安定に
発現するのみであろう；上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子及び標
的を有する構築物内の２の相同的領域の間の相同的組換
えは上記陰性選択可能なマーカーをコードする配列を統
合から除外する。したがって、上記陰性条件を課すこと
により、ランダムな非相同的組換えにより上記標的を有
するベクターを統合された細胞は生存力を失う。
【０１３７】陽性及び陰性選択段階の連続は相同的組換
えによるベクター統合を経験した、そして、それゆえ、
潜在的に破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を有するそれら
の細胞のみをより有効に選択するように計画されうるの
で、陽性及び陰性の選択可能なマーカーの組み合わせは
本発明に係る上記遺伝的に改変された非ヒト哺乳類及び
動物細胞を作出するための好ましい選択スキームであ
る。陽性−陰性選択スキーム、選択可能なマーカー、及
び標的を有する構築物のさらなる例は、例えば、米国特
許第５，４６４，７６４号、ＷＯ ９４／０６９０８、
及びＶａｌａｎｃｉｕｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，
Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１： １４０
２， １９９１中に示される。
【０１３８】マーカータンパク質をベクター統合におい
て安定に発現するために、上記標的を有するベクター
は、上記マーカーをコードする配列がベクター統合に際
して上記内因性のＰＤＥ１１Ａ遺伝子プロモーターに作
用可能であるように結合されるように、設計されうる。
上記マーカーの発現はその後通常ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を
発現する細胞内で上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子プロモーター
により駆動される。あるいは、上記ベクターの標的を有
する構築物内のそれぞれのマーカーは、上記ＰＤＥ１１
Ａ遺伝子プロモーターに独立の発現を駆動するそれ自身
のプロモーターを含みうる。この後者のスキームは典型
的に上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を発現しない細胞において
マーカーの発現をさせる利点を有する（Ｓｍｉｔｈ ａ
ｎｄ Ｂｅｒｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ． ４９：
１７１， １９８４； Ｓｅｄｉｖｙ ａｎｄ Ｓｈａ
ｒｐ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． （ＵＳＡ） ８６：２２７： １９８９； Ｔｈ
ｏｍａｓ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｃｅｌｌ５
１： ５０３， １９８７）。
【０１３９】マーカー遺伝子発現を駆動するのに使用さ
れうる外因性プロモーターは細胞特異的又は段階特異的
プロモーター、構成性プロモーター、及び誘導可能な又
は制御可能なプロモーターを含む。これらのプロモータ
ーの非制限的な例は単純ヘルペスチミジンキナーゼプロ
モーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ
ー／エンハンサー、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫプロ
モーター、ＰＭＣ１−ネオ、メタロチオネインプロモー
ター、アデノウイルス遅延プロモーター、ヴァクシニア
ウイルス７．５Ｋプロモーター、鳥類のベータグロビン
プロモーター、ヒストンプロモーター（例えば、マウス
ヒストンＨ３−６１４）、ベータアクチンプロモータ
ー、神経特異的エノラーゼ、筋肉アクチンプロモータ
ー、及びカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモー
ターを含む（一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｖｏ
ｌｓ．Ｉ−ＩＩＩ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９，
ａｎｄ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗ
ｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ
Ｙ， ２０００；ＣＡ、ラ・ジョラのＳｔｒａｔａｇｅ
ｎｅを参照のこと）。
【０１４０】細胞が上記ベクター配列を標的にされたＰ
ＤＥ１１Ａ遺伝子座内へ統合したかどうかを確認するた
めに、所望のベクター統合事件に特異的なプライマー又
はゲノムプローブが上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子座内への所
望のベクター統合の存在を同定するために、ＰＣＲ又は
サザンブロット分析と共に使用されうる（Ｅｒｌｉｃｈ
ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２： １６４
３−５１， １９９１； Ｚｉｍｍｅｒ ａｎｄ Ｇｒ
ｕｓｓ， Ｎａｔｕｒｅ ３３８： １５０，１９８
９； Ｍｏｕｅｌｌｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８７：
４７１２， １９９０；及びＳｈｅｓｅｌｙ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． （ＵＳＡ）８８： ４２９４， １９９１）。
【０１４１】Ｂ．遺伝子トラッピング 上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を機能的に破壊するために外来
性核酸配列を上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子座内へ挿入するの
に入手可能な他の方法は遺伝子トラッピングである。こ
の方法は、遺伝子トラップベクターコード配列をランダ
ムな様式で遺伝子内へ挿入するために、エクソンを切断
してｍＲＮＡにする全ての哺乳類細胞内に存在する上記
細胞装置を利用する。一度挿入されたら、上記遺伝子ト
ラップベクターは上記トラップされたＰＤＥ１１Ａ遺伝
子を機能的に破壊しうる突然変異を作出する。相同的組
換えと比較して、突然変異に関するこのシステムは大き
くランダムな突然変異を作出する。したがって、機能的
に破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含む遺伝的に改変さ
れた細胞を得るために、この特定の突然変異を含む細胞
はさまざまな遺伝子内にランダム突然変異を含む細胞集
団から同定され、そして選択されなければならない。
【０１４２】遺伝子トラッピングシステム及びベクター
はマウスの細胞及び他の細胞型の遺伝的改変における使
用について示されている（例えば、Ａｌｌｅｎ ｅｔ
ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３３： ８５２−５５，
１９８８； Ｂｅｌｌｅｎｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ
Ｄｅｖ． ３： １２８８−１３００， １９８９；
Ｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．
３： １２７３−１２８７， １９８９； Ｂｏｎｎｅ
ｒｏｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：
４９８２−９１， １９９２； Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ８６： ５５１７−２１， １９８９；
Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １
９３： ７３７−４７， １９９３； Ｆｒｉｅｄｒｉ
ｃｈ ａｎｄ Ｓｏｒｉａｎｏ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ． ２２５： ６８１−７０１， １９９
３； Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ ａｎｄ Ｓｏｒｉａｎｏ，
Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ５： １５１３−２３， １
９９１； Ｇｏｆｆ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ． １５２： ４６９−８１， １９８７； Ｇｏｓ
ｓｌｅｒ ｅｔａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：
４６３−６５， １９８９； Ｈｏｐｅ， Ｄｅｖｅｌ
ｏｐ， １１３： ３９９−４０８， １９９１； Ｋ
ｅｒｒｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂ． Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ２：
７６７−７７６， １９８９； Ｒｅｄｄｙ ｅｔａ
ｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６５： １５０７−１５
１５， １９９１；Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒ
ｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．
Ａ． ８９：６７２１−２５， １９９２； Ｓｋａｒ
ｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ６：
９０３−９１８， １９９２； ｖｏｎ Ｍｅｌｃｈｎ
ｅｒ ａｎｄ Ｒｕｌｅｙ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６
３：３２２７−３２３３， １９８９；ａｎｄ Ｙｏｓ
ｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎ． Ｒｅ
ｓ． ４： ２７７−８７， １９９５を参照のこ
と）。
【０１４３】プロモータートラップ（５’トラップ）ベ
クターは５’〜３’の順でスプライスアクセプター配
列、続いて、翻訳開始コドン及びオープンリーディング
フレーム及び／又は内部のリボソーム加入部位により典
型的に特徴付けられるエクソンを含む。一般的に、これ
らのプロモータートラップベクターはプロモーター又は
作用可能なように結合したスプライスドナー配列を含ま
ない。その結果、上記宿主細胞の細胞ゲノム内への統合
後、上記プロモータートラップベクター配列は上流遺伝
子の通常のスプライスを遮断する及び終結エクソンとし
て働く。上記ベクターをコードする配列の発現は、適切
なリーディングフレームで上記破壊された遺伝子のイン
トロンへ統合するベクターに因る。上記の場合には、上
記細胞のスプライシング装置は上記ベクターをコードす
る配列のトラップされた遺伝子上流からエクソンをスプ
ライスする（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，
ＷＯ９９／５０４２６）。
【０１４４】上記に示されたプロモータートラップベク
ターに似た効果を作出するための代替の方法は、上記プ
ロモータートラップベクターのスプライスアクセプター
及び翻訳開始コドン又はポリアデニル化配列の間の領域
内に存在する又は、そうでなければ、そのように作り出
された停止コドンの入れ子状に重なったセットを組み込
むベクターである。上記コード配列は、上記コード配列
が宿主細胞ゲノム内で統合の部位とは全く独立した様式
で発現されるであろうように、独立のリボソーム加入部
位（ＩＲＥＳ）を含むように作り出されうる。典型的
に、しかし、必須ではないが、ＩＲＥＳは停止コドンの
入れ子状に重なったセットと共に使用される。
【０１４５】他の型の遺伝子トラッピングスキームは
３’遺伝子トラップベクターを使用する。この型のベク
ターは、効力のある組み合わせで、隣接したコード配列
の発現を仲介するプロモーター領域、上記コード配列、
及び上記コード配列エクソンの３’末端を定義するスプ
ライスドナー配列を含む。宿主細胞ゲノム内への統合
後、上記ベクタープロモーターにより発現された転写産
物は統合された遺伝子トラップベクター配列の下流に位
置されるトラップされた遺伝子からスプライスアクセプ
ター配列までスプライスされる。したがって、上記ベク
ターの統合は、上記３’遺伝子トラップカセットのコー
ド配列及び上記終末エクソン及びそのポリアデニル化シ
グナルを含む下流の細胞のエクソンを含む融合転写物の
発現をもたらす。上記ベクターが遺伝子内へ統合される
とき、上記細胞のスプライシング装置は上記トラップさ
れた遺伝子の３’エクソンのベクターコード配列上流を
スプライスする。上記ベクターの１の利点は、３’遺伝
子トラップベクターの発現は上記遺伝子トラップカセッ
ト内のプロモーターにより駆動され、そして通常宿主細
胞内で発現される遺伝子内への統合を必要としないこと
である（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ
９９／５０４２６）。上記３’遺伝子トラップベクタ
ー内に組み込まれうる転写プロモーター及びエンハンサ
ーの例は標的を有するベクターに関して上記に議論され
るものを含む。
【０１４６】上記プロモーター又は３’遺伝子トラップ
ベクターのための構造成分として使用される上記ウイル
スベクター骨格は標的細胞のゲノム内へ挿入されうる広
い範囲のベクターから選ばれうる。好適な骨格ベクター
は、非限定的に、単純ヘルペスウイルスベクター、アデ
ノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レ
トロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、偽狂
犬病ウイルス、アルファヘルペスウイルスベクター等を
含む。ウイルスベクター、特に、非複製細胞を改変する
のに好適なウイルスベクターの概説及び上記ベクターを
外因性ポリヌクレオチド配列の発現に関連してどのよう
に使用するかは、Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｇｅ
ｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎ
ｃｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｅｄｓ． Ｃａｐ
ｌｉｔｔ ａｎｄ Ｌｏｅｗｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９５において
見られうる。
【０１４７】好ましくは、レトロウイルスベクターは遺
伝子トラッピングに使用される。これらのベクターは米
国特許第５，４４９，６１４号に示されるものの如き、
レトロウイルスをパッケージングする細胞系に関連して
使用されうる。非マウス哺乳類細胞が遺伝子改変のため
の標的細胞として使用される場合、両方向性の又は全方
向性のパッケージング細胞系が好適なベクターをパッケ
ージするのに使用されうる（Ｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｕ
ＳＡ ９３： １１４００−１１４０６， １９９
６）。今示した３’遺伝子とラップベクターを作出する
のに適合されうる代表的なレトロウイルスベクターは、
例えば、米国特許第５，５２１，０７６中に示される。
【０１４８】上記遺伝子トラッピングベクターは相同的
組換えに使用される標的を有するベクターについて上記
に議論された１以上の陽性マーカー遺伝子を含みうる。
標的を有するベクターにおけるそれらの使用と同様に、
これらの陽性マーカーは上記細胞ゲノム内に上記ベクタ
ーを統合した細胞を同定する及び選択するための遺伝子
トラッピングベクターにおいて使用される。上記マーカ
ー遺伝子は、上記マーカーが上記ベクターが上記標的細
胞ゲノム内に統合された位置に全く独立の様式で発現さ
れるであろうように、ＩＲＥＳを含むように作り出され
うる。
【０１４９】遺伝子トラップベクターが感染された宿主
細胞のゲノム内にかなりランダムな様式で統合されるで
あろうことから、破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を有す
る遺伝的に改変された細胞はランダムベクター統合を経
験した細胞集団から同定されなければならない。好まし
くは、上記細胞集団における遺伝的改変は、上記集団が
主に上記細胞ゲノム内において見られるそれぞれの遺伝
子内の突然変異を示すように、十分なランダムさ及び頻
度のものであり、破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を有す
る細胞が上記集団から同定されるであろうようにさせる
（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ ９９
／５０４２６； Ｓａｎｄｓ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ
９８／１４６１４を参照のこと）。
【０１５０】破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含む個々
の突然変異細胞系は、例えば、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子配列
における突然変異を同定するために逆転写及びＰＣＲを
用いて、突然変異を起こされた細胞集団において同定さ
れる。このプロセスはたまったクローンにより能率化さ
れうる。例えば、破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含む
個々のクローンを見つけるために、ＲＴ−ＰＣＲが、遺
伝子トラップベクター内にアンカーされた１のプライマ
ー及び上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子配列内に位置された他の
プライマーを用いて行われる。陽性ＲＴ−ＰＣＲの結果
は上記ベクター配列はＰＤＥ１１Ａ遺伝子転写産物内に
コードされていることを示し、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子は遺
伝子トラップ統合事件により破壊されたことを示す（例
えば、Ｓａｎｄｓ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ ９８／１４
６１４を参照のこと）。
【０１５１】Ｃ．一時的な、空間的な、及び誘導可能な
ＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊 本明細書中のある開示では、内因性ＰＤＥ１１Ａ遺伝子
の機能的な破壊は特定の発達又は細胞周期段階で（一時
的な破壊）又は特定の細胞型で（空間的な破壊）起こ
る。本明細書中の他の開示では、上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝
子破壊はいくつかの条件が存在するとき誘導可能であ
る。Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系の如き、リコンビナーゼ切除系が
特定の発達段階で、特定の組織又は細胞型で又は特定の
環境条件下で上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を活性化する又は
不活性化するのに使用されうる。一般的に、Ｃｒｅ−Ｌ
ｏｘ技術を利用する方法はＴｏｒｒｅｓ ａｎｄ Ｋｕ
ｈｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆ
ｏｒ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅ
ｔｉｎｇ， Ｏｘｆｏｒｄ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒ
ｅｓｓ， １９９７により示されるように行われる。上
記Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系について示されたものと同様の方法
はＦＬＰ−ＦＲＴ系を利用しても使用されうる。上記Ｆ
ＬＰ−ＦＲＴ系及び相同的組換え又はウイルス挿入によ
り遺伝子を条件的に破壊するリコンビナーゼ除去系の使
用についてのさらなる教示は、例えば、米国特許第５，
６２６，１５９号、米国特許第５，５２７，６９５号、
米国特許第５，４３４，０６６号、ＷＯ ９８／２９５
３３、Ｏｒｂａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａ
ｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： ６８
６１−６５， １９９２； Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ
ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１： １３５１−５
５， １９９１； Ｓａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７： １
４７−６１， １９８９； Ｂａｒｉｎａｇａ， Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２６５： ２６−２８， １９９４；及び
Ａｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ． ２５： １７６６−７３， １９９７
中に提供される。１以上のリコンビナーゼ系が非ヒト哺
乳類又は動物細胞を遺伝的に改変するのに使用されう
る。
【０１５２】上記Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系の如きリコンビナー
ゼ系を用いて、一時的な、空間的な又は誘導可能な様式
で上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を破壊するために相同的組換
えを用いるとき、上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子をコードする
領域の一部は、ｌｏｘＰ部位により両側を固められた、
上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子をコードする領域を含む、標的
を有する構築物により置き換えられる。この遺伝的改変
を有する非ヒト哺乳類及び動物細胞は機能的な、ｌｏｘ
Ｐで両側を固めたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含む。上記ＰＤ
Ｅ１１Ａ遺伝子破壊の一時的な、空間的な又は誘導可能
な局面は、それぞれ所望の空間的に制御された、一時的
に制御された又は誘導可能なプロモーターの制御の下で
非ヒト哺乳類又は動物細胞において発現される、追加の
遺伝子導入、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子導入の発現パ
ターンにより引き起こされる。Ｃｒｅリコンビナーゼは
ｌｏｘＰ部位を組換えの標的にする。それゆえ、Ｃｒｅ
発現が活性化されるとき、上記ｌｏｘＰ部位は、はさま
れたＰＤＥ１１Ａ遺伝子をコードする配列を削除する組
換えを経験し、上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の機能的な破壊
をもたらす（Ｒａｊｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．
Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９８： ６００−０
３， １９９６； Ｓｔ．−Ｏｎｇｅ ｅｔａｌ．，
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４： ３８
７５−７７，１９９６； Ａｇａｈ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．１００： １６９−
７９， １９９７； Ｂｒｏｃａｒｄ ｅｔ ａｌ．，
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ ９４： １４５５９−６３， １９９７； Ｆｅｉ
ｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３： １０８８７−９０，
１９９６； 及びＫｕｈｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２６９： １４２７−２９，１９９５）。
【０１５３】Ｃｒｅリコンビナーゼ導入遺伝子及びｌｏ
ｘＰで両側を固めたＰＤＥ１１Ａ遺伝子の両方を含む細
胞は標準のトランスジェニック技術をとおして、又は、
遺伝的に改変された非ヒト哺乳類の場合には、１の親が
ｌｏｘＰで両側を固めたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含む、及
びもう一方が所望のプロモーターの制御下のＣｒｅリコ
ンビナーゼ導入遺伝子を含む、遺伝的に改変された非ヒ
ト哺乳類をかけ合わせることにより作出されうる。リコ
ンビナーゼ系及び一時的な、空間的な又は条件的な上記
ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の破壊に有用な特定のプロモーター
についてのさらなる教示は、例えば、Ｓａｕｅｒ， Ｍ
ｅｔｈ， Ｅｎｚ．２２５： ８９０−９００， １９
９３， Ｇｕ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６
５： １０３−０６， １９９４， Ａｒａｋｉ ｅｔ
ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １２２： ９７
７−８２， １９９７， Ｄｙｍｅｃｋｉ， Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３： ６１
９１−９６， １９９６、及びＭｅｙｅｒｓ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８：１３
６−４１， １９９８中に見られる。
【０１５４】上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の誘導可能な破壊
はテトラサイクリン反応性二者択一系を用いることによ
っても達成されうる（Ｇｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｊａ
ｒｄ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ８９： ５５４７−５１， １９９
２）。この系は、Ｔｅｔプロモーターを上記内因性ＰＤ
Ｅ１１Ａ遺伝子制御エレメント内へ導入するために細胞
を遺伝的に改変すること及びテトラサイクリンで制御可
能なリプレッサー（ＴｅｔＲ）を発現する遺伝子導入を
含む。上記細胞においては、テトラサイクリンの投与は
ＴｅｔＲを活性化し、それが、今度は、ＰＤＥ１１Ａ遺
伝子発現を阻害し、そしてそれゆえ、上記ＰＤＥ１１Ａ
遺伝子を機能的に破壊する（Ｓｔ．−Ｏｎｇｅ ｅｔ
ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２
４： ３８７５−７７， １９９６，米国特許第５，９
２２，９２７号）。一時的な、空間的な、及び誘導可能
なＰＤＥ１１Ａ遺伝子の破壊についての上記に示した系
は、例えば、ＷＯ ９８／２９５３３中に示されるよう
な遺伝的改変の方法として、例えば遺伝子トラッピング
を用いるときも適合されうる。
【０１５５】Ｄ．遺伝的に改変された非ヒト哺乳類及び
動物細胞の作出 遺伝的改変のための上記に示された方法は動物に由来す
る実質上どんな型の体細胞又は幹細胞においてＰＤＥ１
１Ａ遺伝子を機能的に破壊するのにも使用されうる。本
明細書中に示される遺伝的に改変された動物細胞は、非
限定的に、ヒト細胞を含む哺乳類細胞、及び鳥類細胞を
含む。これらの細胞は培養に適合した、癌化した又は形
質転換された細胞系の如き、動物細胞系を遺伝的に作り
出すことに由来しうる、又はそれらは所望のＰＤＥ１１
Ａ遺伝的改変を有する遺伝的に改変された非ヒト哺乳類
から単離されうる。
【０１５６】上記細胞は上記破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺
伝子についてヘテロ接合又はホモ接合でありうる。上記
ＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊についてホモ接合である（ＰＤ
Ｅ１１Ａ −／−）細胞を得るために、両方の対立遺伝
子の直接の、連続の標的化が行われうる。このプロセス
は陽性選択可能なマーカーを再利用することにより促進
されうる。このスキームに従って、上記陽性選択可能な
マーカーをコードするヌクレオチド配列は上記Ｃｒｅ−
ｌｏｘＰ系を用いる１の対立遺伝子の破壊に続いて除去
される。したがって、上記同じベクターが上記第二のＰ
ＤＥ１１Ａ遺伝子対立遺伝子を破壊する次のターゲティ
ング期において使用されうる（Ａｂｕｉｎ ａｎｄ Ｂ
ｒａｄｌｅｙ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．
１６：１８５１−５６， １９９６； Ｓｅｄｉｖｙ
ｅｔ ａｌ．， Ｔ．Ｉ．Ｇ．１５： ８８−９０，
１９９０； Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ８８：
７１７０−７４，１９９１； Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ
ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． （ＵＳＡ）８８： ７０３６−４０， １９
９１；ｔｅ Ｒｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒ
ｅ （Ｌｏｎｄｏｎ） ３４８： ６４９−６５１，
１９９０）。
【０１５７】ＰＤＥ−／−であるＥＳ細胞を得るための
代替の策は上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊についてヘテロ
接合（ＰＤＥ１１Ａ＋／−）である細胞集団からの細胞
の同種化である。上記方法は選択可能な薬物耐性マーカ
ーを発現するＰＤＥ１１Ａ＋／−を標的にしたクローン
が非常に高い薬物濃度に対して選択されるスキームを使
用する；この選択は上記薬物耐性マーカーをコードする
配列の２のコピーを発現する、そして、それゆえ、上記
ＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊についてホモ接合である細胞を
好む（Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １２： ２３９１−９５，
１９９２）。さらに、遺伝的に改変された動物細胞は、
さらに以下に議論されるように、生殖細胞においてＰＤ
Ｅ１１Ａ＋／−である非ヒト哺乳類をかけ合わせること
により作出される遺伝的に改変されたＰＤＥ１１Ａ−／
−非ヒト哺乳類から得られうる。
【０１５８】所望の細胞又は細胞系の遺伝的改変に続い
て、上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子座は、本分野で知られる標
準のＰＣＲ又はサザンブロット法に従って、ＰＣＲ分析
により改変の部位として確認されうる（例えば、米国特
許第４，６８３，２０２号；及びＥｒｌｉｃｈ ｅｔ
ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２： １６４３，１９
９１を参照のこと）。ＰＤＥ１１Ａ遺伝子のメッセンジ
ャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）値及び／又はＰＤＥ１１Ａポリ
ペプチド値が通常上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を発現する細
胞において減少される場合、上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の
機能的な破壊のさらなる実証がなされうる。ＰＤＥ１１
Ａ遺伝子ｍＲＮＡ値の計測は逆転写酵素で仲介されるポ
リメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノザンブロット分
析又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いる
ことにより得られうる。上記細胞により産生されるＰＤ
Ｅ１１Ａポリペプチド値の定量は、例えば、本分野にお
いて知られる標準の免疫分析法によりなされうる。上記
免疫分析は、非限定的に、放射免疫分析、ＥＬＩＳＡ
（酵素に結合した免疫吸着剤分析）、「サンドウィッ
チ」免疫分析、免疫放射分析、ゲル拡散沈降素反応、免
疫核酸分析、（例えば、金コロイド、酵素的又は放射性
同位体のラベルを用いる）ｉｎ ｓｉｔｕ免疫分析、ウ
ェスタンブロット、２次元ゲル分析、沈殿反応、免疫蛍
光分析、タンパク質Ａ分析、及び免疫電気泳動分析の如
き、技術を用いる競合及び非競合分析系を含む。
【０１５９】好ましい遺伝的に改変された動物細胞はＥ
Ｓ細胞及びＥＳ様細胞である。これらの細胞はマウス
（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ １２
９： １５４−１５６， １９８１； Ｍａｒｔｉｎ，
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，
ＵＳＡ， ７８： ７６３４−７６３８， １９８
１）、ブタ及びヒツジ（Ｎｏｔａｎｉａｎｎｉ ｅｔ
ａｌ．， Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔ． Ｓｕｐ
ｐｌ．， ４３： ２５５−２６０， １９９１； Ｃ
ａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８
０： ６４−６８，１９９６）及びヒトを含む霊長類
（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第５，８
４３，７８０号；Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２８２： １１４５−１１４７， １９
９５；及びＴｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：
７８４４−７８４８， １９９５）の如き、さまざま
な種の着床前の胚及び胚盤胞に由来する。
【０１６０】これらの型の細胞は多能性である。つま
り、適切な条件下で、それらは全ての３の胚の胚葉；外
肺葉、中胚葉及び内胚葉に由来する広くさまざまな細胞
型に分化する。培養条件に因り、ＥＳ細胞のサンプル
は、１のサンプル内で広くさまざまな異なる細胞型に分
化させられ又はマクロファージ様細胞、神経細胞、心筋
細胞、脂肪細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、
ケラチノサイト、及び好酸球、マスト細胞、赤血球の先
祖細胞又は巨核球の如き、造血細胞の如き、特定の細胞
型に分化するように方向付けられ、幹細胞として無期限
に培養されうる。方向付けられた分化は、例えば、Ｋｅ
ｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ．
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７： ８６２−６９， １９９
５， Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．
８： ９７１， １９９８， Ｋｌｕｇ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９８：２
１６−２４， １９９６， Ｌｉｅｓｃｈｋｅ ｅｔ
ａｌ．， Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ． ２３： ３２８
−３４， １９９５， Ｙａｍａｎｅ ｅｔ ａｌ．，
Ｂｌｏｏｄ ９０： ３５１６−２３， １９９７、
及びＨｉｒａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ
９３： １２５３−６３， １９９９中にさらに示さ
れるように、培養条件中に特異的な成長因子又はマトリ
ックス成分を含むことにより達成される。
【０１６１】遺伝的改変に使用される特定の胚幹細胞系
は重要ではない；例示的なマウスＥＳ細胞系はＡＢ−１
（Ｍｃｍａｈｏｎ ａｎｄ Ｂｒａｄｌｅｙ， Ｃｅｌ
ｌ６２： １０７３−８５， １９９０）、Ｅ１４（Ｈ
ｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２６：
２９２−９５， １９８７）、Ｄ３（Ｄｏｅｔｓｃｈ
ｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｍｂｒｙｏｌ． Ｅ
ｘｐ． Ｍｏｒｐｈ． ８７： ２７−４５， １９８
５）、ＣＣＥ（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔａｌ．， Ｎ
ａｔｕｒｅ ３２３： ４４５−４８， １９９６）、
ＲＷ４（ＭＯ、セントルイスのＧｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ）、及びＤＢＡ／１ｌａｃＪ（Ｒｏａｃｈ ｅｔ
ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２２１：
５２０−２５， １９９５）を含む。遺伝的に改変さ
れたマウスＥＳ細胞は、公開された手順（Ｒｏｂｅｒｔ
ｓｏｎ， １９８７， Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍ
ａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌ
ｌｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，
Ｅｄ． Ｅ． Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｏｘｆｏ
ｒｄ： ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ． ７１−１１
２， １９８７； Ｚｊｉｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ ３４２； ４３５−４３８， １９８
９；及びＳｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６： ７９９−８０３， １９８
９）に従って、遺伝的に改変されたマウスを作出するた
めに使用されうる。
【０１６２】上記ＥＳ細胞が上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の
所望の機能的な破壊を含むことの確認に続いて、これら
のＥＳ細胞はその後本分野において知られる方法に従っ
てキメラマウスの作出のために好適な胚盤胞宿主内へ注
入される（Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎ
ｅｔ． ５： ７０， １９８９）。本明細書中で使用
される特定のマウス胚盤胞は重要ではない。上記胚盤胞
の例はＣ５７ＢＬ／６マウス、Ｃ５７ＢＬ／６アルビノ
マウス、Ｓｗｉｓｓ異系交配マウス、ＣＦＬＰマウス、
及びＭＦＩマウスに由来するものを含む。あるいは、Ｅ
Ｓ細胞は凝集ウェル内の四倍体胚の間ではさまれうる
（Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ８４２４−８
４２８，１９９３）。
【０１６３】遺伝的に改変されたＥＳ細胞を含む胚盤胞
又は胚はその後偽妊娠雌マウス内に移植され、そしてｉ
ｎ ｕｔｅｒｏで発達させられる（Ｈｏｇａｎ ｅｔ
ａｌ．， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕ
ｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ： ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８８；及び Ｔｅｒａｔ
ｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ
Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｅ． Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏ
ｎ， ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇ
ｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， １９８７）。代理母に生まれた
子孫は上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊についてキメラであ
るものを同定するためにふるいにかけられうる。一般的
に、上記子孫は起源の胚盤胞からの他の細胞に加えて、
上記遺伝的に改変されたドナーＥＳ細胞に由来するいく
つかの細胞を含む。上記事情においては、子孫ははじめ
に、上記ドナーＥＳ細胞に由来する細胞を胚盤胞の他の
細胞から見分けるために、皮色選択策が使用されるモザ
イク皮色でふるいにかけられうる。あるいは、子孫の尾
の組織からのＤＮＡが上記遺伝的に改変された細胞を含
むマウスを同定するのに使用される。
【０１６４】生殖細胞系に上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊
を含むキメラマウスの交配は全ての生殖細胞系及び体細
胞系に上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊を有する子孫を作出
する。上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊についてヘテロ接合
であるマウスはその後ホモ接合を作出するために交配さ
れうる（例えば、米国特許第５，５５７，０３２号、及
び米国特許第５，５３２，１５８号を参照のこと）。
【０１６５】細胞から動物全体に遺伝的改変を移す上記
に示されたＥＳ細胞技術の代替は核移植を使用すること
である。この方法は、マウスの他に、例えば、ヒツジ
（ＭｃＣｒｅａｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ
２９： １０６６−６９， ２０００； Ｃａｍｐｂｅ
ｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８９： ６４
−６６， １９９６；及びＳｃｈｎｉｅｋｅ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ２７８： ２１３０−３３，
１９９７）及びウシ（Ｃｉｂｅｌｌｉ ｅｔａｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０： １２５６−５８， １９９
８）のような他の遺伝的に改変された、非ヒト哺乳類を
作出するのに使用されうる。簡単に言えば、体細胞（例
えば、線維芽細胞）又は多能性幹細胞（例えば、ＥＳ様
細胞）は核ドナーとして選択され、そして上記ＰＤＥ１
１Ａ遺伝子の機能的な破壊を含むように遺伝的に改変さ
れる。上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子に突然変異を起こすため
にＤＮＡベクターを体細胞内に挿入するとき、上記ＰＤ
Ｅ１１Ａ遺伝子内へのベクター統合が上記ＰＤＥ１１Ａ
遺伝子プロモーターの制御下の上記マーカーの発現をも
たらすように、プロモーターのないマーカーが上記ベク
ター内で使用されることが好ましい（Ｓｅｄｉｖｙ ａ
ｎｄ Ｄｕｔｒｉａｕｘ， Ｔ．Ｉ．Ｇ．１５：８８−
９０， １９９９； ＭｃＣｒｅａｔｈ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２９： １０６６−６９， ２
０００）。適切なＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊を有するドナ
ー細胞からの核はその後除核された受精した又は単為生
殖の卵母細胞に移植される（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ
ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８０： ６４， １９９
６； Ｗｉｌｍｕｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ
３８５： ８１０， １９９７）。胚は再構築され、桑
実胚／胚盤胞段階に発達するよう培養され、そして満期
のｉｎ ｕｔｅｒｏでの発達のために代理母に移植され
る。
【０１６６】本明細書中の説明の範囲は上記遺伝的に改
変された、非ヒト哺乳類及び遺伝的に改変された動物細
胞の子孫をも含む。上記子孫は上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子
を機能的に破壊する上記遺伝的改変についてヘテロ接合
又はホモ接合である一方で、それらは今示した遺伝的改
変に加えて他の座で次の世代で起こりうる突然変異又は
環境の影響のために、親の非ヒト哺乳類及び動物細胞と
遺伝的に同一でないこともある。
【０１６７】Ｅ．「ヒト化した」非ヒト哺乳類及び動物
細胞 本明細書中に示される、及び破壊された内因性ＰＤＥ１
１Ａ遺伝子を含む、上記遺伝的に改変された非ヒト哺乳
類及び非ヒト動物細胞は上記ヒトＰＤＥ１１Ａ配列を発
現する（本明細書中で「ヒト化した」と言われる）よう
にさらに改変されうる。上記ヒトＰＤＥ１１Ａ配列は、
例えば、Ｆａｗｃｅｔｔ， ２０００、Ｐｈｉｌｌｉｐ
ｓ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ ００／４０７３３、及びＧ
ｅｎＢａｎｋ取得番号第ＡＪ２５１５０９号中に開示さ
れる。
【０１６８】細胞をヒト化する好ましい方法は相同的組
換えにより内因性ＰＤＥ１１Ａについて上記ヒトＰＤＥ
１１Ａ配列を置換することを含む。上記標的を有するベ
クターは、５’及び３’相同性アーム及び陽性／陰性選
択スキームについて、伝統的にノックアウトベクターと
して用いられたものと同様である。しかしながら、上記
ベクターは、組換え際して、上記ヒトＰＤＥ１１Ａをコ
ードする配列を内因性配列と引き換えに挿入する、又は
上記配列が上記内因性の野生型配列の代わりに上記ヒト
ＰＤＥ１１Ａをコードするように上記内因性配列を改変
する塩基対交換、コドン置換又はエクソン置換に影響す
る、配列をも含む。一度相同的組換え体が同定される
と、Ｃｒｅ又はＦｌｐで仲介された位置特異的組換えを
用いることにより挿入された選択に基づいた配列（例え
ば、ｎｅｏ）を削除することは可能である（Ｄｙｍｅｃ
ｋｉ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ．９３： ６１９１−９６， １９９６）。
【０１６９】上記ヒトＰＤＥ１１配列が上記内因性翻訳
開始部位の下流に直接位置されることが好ましい。この
位置は上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の内因性の一時的な及び
空間的な発現パターンを保存する。上記ヒト配列はゲノ
ムＰＤＥ１１Ａ配列全体又は適切なプロセッシングのた
めに３’末端に付けられたポリＡ尾部を有する全長ヒト
ｃＤＮＡ配列を含みうる（Ｓｈｉａｏ ｅｔ ａｌ．，
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． ８： ２９５−３
０２， １９９０）。細胞及び非ヒト哺乳類を内因性遺
伝子の発現をそのヒトの対応物で置き換えるように遺伝
的に改変するこの方法についてのさらなる教示は、例え
ば、Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： １７９７２−８０， １
９９７，Ｒｅａｕｍｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２３３８０−８８， １９
９６、及びＳｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第
５，７７７，１９４号中に見られる。上記「ヒト化し
た」有機体を作出する他の方法ははじめにＰＤＥ１１Ａ
−／−胚の作出、そして、第二に、上記ヒト配列をコー
ドする導入遺伝子の上記ＰＤＥ１１Ａ−／−胚への導入
を含む、多段階プロセスである。
【０１７０】Ｆ．実施例−ＰＤＥ１１Ａ＋／−及びＰＤ
Ｅ１１Ａ−／−マウスの作出 遺伝的に改変されたマウスＥＳ細胞（ＰＤＥ１１Ａ＋／
−）をＦｉｇ．１に示されるスキームを用いて作出した
（ＵＳＡ、ＣＡ、メンロパークのＤｅｌｔａＧｅｎ）。
上記ヒトＰＤＥ１１Ａ遺伝子（Ｆｉｇ．２Ａ；配列ＩＤ
番号：１及び２）の一部のｃＤＮＡ配列を以下に示され
るオリゴヌクレオチド鎖７７４４及び７７４５を設計す
るのに使用した。 オリゴヌクレオチド７７４４−５’ＴＴＴＣＴＧＴＡＣ
ＣＡＴＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＡＴＧ３’（配列ＩＤ番
号：３） オリゴヌクレオチド７７４５−５’ＡＡＧＧＣＡＧＣＣ
ＡＡＣＡＴＣＣＣＴＣＴＧＧＴＧＴ３’（配列ＩＤ番
号：４） 上記プライマーを用いるマウスゲノムＤＮＡのＰＣＲに
基づいた増幅はＦｉｇ．２Ｂに示されるマウスＰＤＥ１
１Ａ配列を示す産物を作出した（配列ＩＤ番号：５及び
６）。このゲノム配列に基づいて、配列ＩＤ番号：７及
び８の２の（それぞれ１０ヌクレオチドの長さの）相同
性アームを含んだ標的を有する構築物を作出し、そして
ＬａｃＺ−Ｎｅｏ配列をＦｉｇ．１に示されるように上
記アームの間に挿入した。上記標的を有する構築物を含
むＤＮＡをエレクトロポレーションにより上記ＥＳ細胞
内に挿入した。この構築物の、ＥＳ Ｒ１細胞内のマウ
スＰＤＥ１１Ａ遺伝子への統合（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．１８５： ４２−５４，
１９９７； Ｕｄｙ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ．Ｃｅ
ｌｌ Ｒｅｓ． ２３１： ２９６−３０１， １９９
７）は配列ＩＤ番号：５及び６の上記ヌクレオチド２７
〜４２の、上記ＬａｃＺ−Ｎｅｏ遺伝子との置き換えを
もたらす。ネオマイシン耐性であるＥＳ細胞をＰＤＥ１
１Ａ遺伝子の破壊を確認するためサザンブロットにより
分析した。これらの標的にされたＥＳ細胞をその後上記
細胞を胚盤胞に注入し、そして上記胚盤胞を偽妊娠雌マ
ウス内に移植することによりキメラマウスの作出のため
に使用した（Ｃａｐｅｃｃｈｉｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅ
ｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ５： ７０， １９８９，Ｈｏ
ｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ
ｔｈｅ ＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏ： Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８８；
ａｎｄ Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ
Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｐ
ｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｅ．Ｊ． Ｒ
ｏｂｅｒｔｓｏｎ， ｅｄ．， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，
Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．， １９８７）。キ
メラマウスをその後Ｃ５７ＢＬ／６（ＵＳＡ、ＭＥ、Ｂ
ａｒ ＨａｒｂｏｒのＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ）マウスと交配しＦ１ ＰＤＥ＋／−ヘテロ
接合体を作出し、それを、今度は、Ｆ２ ＰＤＥ−／−
ホモ接合マウスを作出するために交配した。ヘテロ接合
体及びホモ接合体における上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の機
能的な破壊はＰＣＲ及びサザンブロット分析により確認
した。
【０１７１】２．ＰＤＥ１１Ａ機能の特徴づけ及び治療
的関連性 ＰＤＥ１１Ａ活性又は発現を調節する乱れは、ＰＤＥ１
１Ａ改変が生理学的に関連性のある効果又は表現型を産
出するかどうかを決定するために、細胞、組織又は哺乳
類において誘導されうる。上記乱れを誘導する１の方法
は非ヒト哺乳類又は動物細胞を遺伝的に改変して上記Ｐ
ＤＥ１１Ａ遺伝子を破壊することである。あるいは、Ｐ
ＤＥ１１Ａ活性又は発現を調節する剤は細胞若しくは組
織調製への又は哺乳類へのその効果を決定するために投
与されうる。
【０１７２】Ａ． 組織発現 どの細胞、組織又は表現型をＰＤＥ１１Ａ機能に関して
研究するべきか決定するための教示はマウス及びヒトの
如き種における上記ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の発現パターン
において見られる。以前にＦａｗｃｅｔｔ， ２０００
においてヒトＰＤＥ１１Ａ発現について示されたものに
加えて（すなわち、精巣、骨格筋、腎臓、肝臓、さまざ
まな腺組織（例えば、下垂体、唾液腺、副腎、乳腺、及
び甲状腺）、膵臓、脊髄、及び気管）、私たちはＰＤＥ
１１Ａを発現する追加の組織を開示する、及び上記以前
に開示された組織における発現をさらに特徴付ける。
【０１７３】ＰＤＥ１１Ａ発現パターンを５μｍの幅に
切断したフォルマリンで固定した、パラフィンに埋め込
んだ正常ヒト組織（Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ Ｈｏｓ
ｐｉｔａｌ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ
Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ， Ｕ
Ｋ）、及び７μｍに切断したパラフォルムアルデヒドで
固定した、パラフィンに埋め込んだ正常マウス精巣サン
プル（カタログ番号６９５８４−３，ＵＳＡ、ＷＩ、マ
ディソンのＮｏｖａｇｅｎ）において決定した。固定化
された切片をキシレン（５分間）、無水アルコール（５
分間）、及びその後工業的なメチル化アルコール（５分
間）で洗浄することによりパラフィンを取り除いた。そ
の後上記スライドを流水中で５分間洗浄し、その後以下
の方法の１に従って抗原回復のために処理した：１）３
７℃で１５分間トリプシンで処理し（カタログ番号Ｔ７
１６８， Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ， １錠／水ｍｌ）、続
いて流水中でもう一度洗浄する；又は２）製造業者の教
示につき蒸気法を用いて標的回復溶液で処理し（カタロ
グ番号Ｓ１７００，ＵＳＡ、ＣＡのカーピンテリア、Ｄ
ＡＫＯ Ｃｏｒｐ．）、続いてトリスで緩衝した塩水
（ＴＢＳ）（カタログ番号Ｔ６６６４、ＵＳＡ、ＭＯの
セントルイス、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、１袋
／水Ｌ）中で何回か洗浄する。サンプルを新しいＴＢＳ
中に浸し、そして以下に示される２の代替の免疫組織化
学キットの１の成分で処理した。
【０１７４】サンプルを一次ウサギ抗ＰＤＥ１１Ａ抗体
（１：５００又は１：１０００希釈、ＴＢＳ／５％非脂
肪乳中で６０分間）でインキュベートした。一次抗体
は、ＳＡＩＦＤＲＮＲＫＤＥＬＰＲＬ（配列ＩＤ番号：
９）の上記ヒトＰＤＥ１１Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ取得番号
第ＡＪ２５１５０９号）の触媒ドメインペプチド配列に
対して作成された（ＵＫ、クリーブランドのＣａｍｂｒ
ｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）。上記抗体検出系は１）セイヨウワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ウサギ二次抗体及び３，３’−
ジアミノベンジディン（ＤＡＢ）クロモゲン溶液（カタ
ログ番号Ｋ４０１０， ＤＡＫＯ ＥｎＶｉｓｉｏｎ
（商標）＋Ｓｙｓｔｅｍ， ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐ．）；
又は２）アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）結合抗ウサ
ギ二次抗体（カタログ番号−ＡＫ５００１， ＡＢＣ−
ＡＰキット、ＵＳＡ、ＣＡ、ＢｕｒｌｉｎｇａｍｅのＶ
ｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びＡＰ基質
キット（カタログ番号ＳＫ−５１００、Ｖｅｃｔｏｒ
（商標） Ｒｅｄ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ）のいずれかを含む。上記免疫組織化学手順を製
造業者の推奨に従って行った。クロモジェンとのインキ
ュベーションに続いて、組織をヘモトキシリン（カタロ
グ番号Ｈ３４０１， Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）で対染色した。上記サンプルをその後水中で
すすぎ、そして酸すすぎ（２％ ｖ／ｖ氷酢酸）中に１
０回（１０×）、続いて水中に１０×、Ｓｃｏｔｔ’ｓ
ｔａｐ水（カタログ番号６７６９００２、ＵＫ、ラン
コーンのＳｈａｎｄｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に
２０×浸し、水中で３分間すすぎ、脱水し、ＤＰＸ（カ
タログ番号３６０２９４Ｈ、ＵＫプールのＢＤＨ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｕｐｐｌｉｅｓ）中にのせ、そし
てカバーガラスで密閉した。
【０１７５】強いＰＤＥ１１Ａ抗体染色が以下の細胞型
及び構造内で示された：心臓の全ての室中の心筋細胞；
心臓内に裏打ちする内皮細胞；心臓の（心外膜の及び心
筋内の）中央の平滑筋細胞及び細静脈、静脈、細動脈、
及び動脈中の（特により小さい直径の管内で）全身血管
系、血管内皮細胞；シュワン細胞及び神経周囲の細胞
（神経及び血管の染色はしばしば特定の組織、例えば、
膀胱、精巣、及び心臓において共に関連した）；精巣に
おいて、精母細胞及び精子細胞、間隙のライディッヒ細
胞及び精細管の基底膜の基礎となる細胞（線維芽細胞）
に加えて精原細胞の核内、及び血管平滑筋内；結腸及び
直腸腺内のアミン前駆体取り込み及び脱カルボキシル化
（ＡＰＵＤ）腸内分泌細胞；黒質、扁桃体、基底核、最
後野内、及び下垂体前葉の（特に外側野の辺縁内の）好
酸性細胞（ソマトトロピン産生細胞及びラクトトロピン
産生細胞）内の如き、脳全体の神経（強い染色に軽
く）；肺内の肺胞マクロファージ；膵臓内の島細胞；脾
臓の赤脾髄内のまばらな細胞；多数の脂肪細胞内；リン
パ球系組織内；及び癌の前立腺、過形成の前立腺、及び
悪性黒色腫を伴う皮膚からのサンプル中。
【０１７６】ＰＤＥ１１Ａについての弱い染色に軽く現
れた追加の細胞型及び組織は以下のものを含む：膀胱尿
路上皮、特に遷移性上皮層の基底（細胞質内、及び特
に、細胞の核内）；外分泌実質内の細胞；表皮の基底及
びとげの層内のケラチノサイト；皮質、外側毛根鞘、及
び毛包のコラーゲン性毛根鞘；外分泌腺；場合により小
脳内のプルキンエ細胞；上衣細胞、脳幹神経節及び線条
内の細胞；アウエルバッハ神経節及びマイスナー神経叢
内の神経節細胞；滑膜細胞；肝細胞；平滑筋；胸膜中
皮；膣粘膜内の鱗状細胞；胸内の小葉の及び管の上皮細
胞；脾性赤脾髄内の血管の及び洞様毛細血管の裏打ち細
胞；皮脂腺；腎臓内の渦巻状の管及び回収管；アテロー
ム性動脈硬化症における筋内膜の組織球を含む、組織
球；及びマスト細胞、血漿細胞、リンパ球、及び顆粒
球。
【０１７７】骨格筋における発現のさらなる浄化はいく
つかのサンプルにおける運動終板の強い染色を伴う、変
動しやすい染色を示した。脛骨前方筋細胞、ｔｈｅ ｅ
ｘｔｅｎｓｏｒ ｄｉｇｉｔｏｒｕｍ ｌｏｎｇｕｓ、
ひ腹筋、ひらめ筋内、及び外側広筋内で、染色は弱から
強へ変化した。ＰＤＥ１１Ａのマウス組織発現パターン
は精細管（精原細胞、精母細胞、精子細胞、ライディッ
ヒ細胞、及び血管平滑筋）の根源の上皮における精巣内
の弱い発現を示した。この発現は精母細胞において特に
発生する。
【０１７８】Ｂ． ＰＤＥ１１Ａアゴニスト及びアンタ
ゴニストの同定 ＰＤＥ１１Ａアゴニスト及びアンタゴニストを同定する
１のふるいいの型は組織から単離された天然の酵素を用
いて又はトランスフェクトされた宿主細胞、例えば、Ｓ
ｆ９昆虫細胞（Ｆａｗｃｅｔｔ， ２０００）、酵母細
胞（Ｌｏｕｇｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第
５，９３２，４６５号）又はＣＯＳ−７細胞（Ｙｕａｓ
ａ， ２０００）内で発現された組換え酵素を用いてｉ
ｎ ｖｉｔｒｏで行われる。好ましくは、上記ＰＤＥ１
１Ａ酵素はヒトのものである。ＰＤＥ１１Ａアゴニスト
又はアンタゴニストとして同定された剤は上記ＰＤＥ１
１ファミリーの他の構成員に同様の効果を出しやすいで
あろう。
【０１７９】ＰＤＥ１１Ａ活性は、例えば、適切な基
質、［３Ｈ］ｃＡＭＰ又は［３Ｈ］ｃＧＭＰの加水分解
の早さとして計測される。基質の加水分解を増大させる
又は減少させる剤はそれぞれ、ＰＤＥ１１Ａ選択的アゴ
ニスト（すなわち、エンハンサー）又はアンタゴニスト
（すなわち、阻害剤）として同定される。この活性は、
例えば、シンチレーション近接分析（ＳＰＡ）に基づい
た方法（Ｆａｗｃｅｔｔ， ２０００；Ｐｈｉｌｌｉｐ
ｓ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ ００／４０７３３、及びＴ
ｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１８： ５２２８， １９７９（製品コードＴＲＫＱ７
０９０／７１００、ＵＫ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉ
ｒｅのＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｌｔｄ．を用いて改変されるように））により計測さ
れる。簡単に言えば、上記ＰＤＥ１１Ａ酵素を含むサン
プルを、その一部（例えば、１／４〜１／２）が３Ｈ−
ラベルされた（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ｃＡＭＰ又はｃＧＭ
Ｐ基質（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）と接触させ
る。反応を、例えば、マイクロタイタープレート（例え
ば、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒ（商標）プレート、ＵＳＡ、
ＶＡ、ＣｈａｎｔｉｌｌｙのＤｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ）中で行い、過剰のラベルされていない環
状ヌクレオチドを含む珪酸塩イットリウムＳＰＡビーズ
（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の添加により停止する。上記ビー
ズを暗所内に設置した後、プレートをマイクロタイター
プレートリーダー（例えば、ＴｏｐＣｏｕｎｔ（商
標）、ＵＳＡ、ＣＴ、メリデンのＰａｃｋａｒｄ）によ
り読む。
【０１８０】ＰＤＥ活性は３２Ｐ−ｃＡＭＰ又は３２Ｐ
−ｃＧＭＰから放出された３２Ｐ−リン酸の検出によっ
ても（例えば、Ｌｏｕｇｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ７９６−８０
６， １９９６、及びＬｏｕｇｈｎｅｙ，米国特許第
５，９３２，４６５号中に示されるように）又は上記Ｐ
ＤＥ基質、ｃＧＭＰ又はｃＡＭＰ、及びそれらの加水分
解産物を見分ける抗体を用いても（例えば、Ｆｌａｓｈ
Ｐｌａｔｅ（商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＮＥＮ
（商標）、ＵＳＡ、ＭＡ、ボストンのＬｉｆｅ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓを用いて）分析されう
る。
【０１８１】ＰＤＥ１１Ａ触媒活性を評価する代替とし
て、剤は、それらが、例えば、翻訳後調節（例えば、リ
ン酸化）、アロステリックリガンド結合の調節（例え
ば、ＧＡＦドメインを介して（Ｆａｗｃｅｔｔ， ２０
００）を介して、又は触媒又はアロステリック制御部位
でＰＤＥ１１Ａ自身に結合することにより、間接的にＰ
ＤＥ１１Ａ触媒活性を調節する場合、ＰＤＥ１１Ａアゴ
ニスト又はアンタゴニストとして同定されうる。これら
の機構を介してＰＤＥ１１Ａ触媒活性を増大させる剤は
潜在的なアゴニストとして同定される；逆に、これらの
機構を介してＰＤＥ１１Ａ触媒活性を減少させる剤は潜
在的なアンタゴニストである。ＰＤＥ１１Ａリン酸化及
びアロステリックリガンド結合を決定する方法は引用文
献中に示される（例えば、ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ−Ｌｕ
ｃａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ． ２７０： ３０６７１−７９， １９９５、及び
Ｃｏｒｂｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ． ２６７： ２７６０−６７， ２０００
を参照のこと）。
【０１８２】ふるいにかけられる剤の例は、非限定的
に、核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）、炭水化物、脂
質、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティックス、
小分子及び他の化合物を含む。剤は試験のために個々に
又はライブラリーの一部として選択されうる。これらの
ライブラリーは本分野において知られるコンビナトリア
ルライブラリー法における多数のアプローチのいずれか
を用いて得られ、そして、生物学的ライブラリー；空間
的アドレス可能な平行固相または液相ライブラリー；デ
コンヴォルーションを必要とする合成ライブラリー法；
「１−ビーズ１−化合物」ライブラリー法；及びアフィ
ニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラ
リー法を含む。上記生物学的ライブラリーアプローチは
ペプチドライブラリーに限られ、その一方で他の４のア
プローチはペプチド、非ペプチド、オリゴマー又は化合
物の小分子ライブラリーに適用可能である（例えば、Ｌ
ａｍ， １９９７， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ
Ｄｅｓ． １２：１４５；米国特許第５，７３８，９
９６号；及び米国特許第５，８０７，６８３号）。
【０１８３】分子ライブラリーの合成法の例は、例え
ば、ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３， Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９
０：６９０９， Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．， １９９４，
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ ９１：１１４２２， Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎｅｔ
ａｌ．， １９９４， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．
３７：２６７８，Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．， １９９３，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３，Ｃａｒｒｅｌｌ
ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅ
ｍ．Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３：２０５９，
Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ａｎｇ
ｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．３
３：２０６１、及びＧａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．， １
９９４， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：１２３
３中のように本分野において見られうる。
【０１８４】個々の剤又は剤のライブラリーは溶液（例
えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ， １９９２， Ｂｉｏ／Ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）中に又はビ
ーズ（Ｌａｍ， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：
８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ， １９９３， Ｎ
ａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６）、バクテリア
（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（特許第
５，５７１，６９８号；第５，４０３，４８４号；及び
第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌｅｔ
ａｌ．， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １８６５−１８
６９）又はファージ（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄＳｍｉｔｈ，
１９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９： ３８６−３
９０；Ｄｅｖｌｉｎ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４９：４０４−４０６； Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａ
ｌ．， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：６３７８−６３８２；
及びＦｅｌｉｃｉ； １９９１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂ
ｉｏｌ． ２２２：３０１−３１０）上に存在しうる。
【０１８５】ＰＤＥ１１Ａ酵素速度論（例えば、Ｖｍａ
ｘ及びＫｍ）に対する試験剤の効果は、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで、例えば、固定化された濃度のＰＤＥ１１Ａ酵素、
ある範囲の基質濃度（例えば、０．１０〜１０μＭ）、
及び、例えば、５〜６０分間に及ぶ時間過程での加水分
解を計測することにより決定される。Ｖｍａｘを増大さ
せる又はＫｍを減少させる剤はアゴニストとして同定さ
れる。ＰＤＥ１１Ａ活性を阻害する剤はＶｍａｘを減少
させる又はＫｍを増大させる、そして、好ましくは、ナ
ノモーラーの範囲のＩＣ５０値を有する。上記ＩＣ５０
の決定はさまざまな阻害剤濃度及び低い基質濃度（例え
ば、０．１〜１０μＭ）の存在下で固定化された量の精
製組換え体の又は天然のＰＤＥ１１Ａを評価することを
含む。阻害剤に暴露されたサンプルの値は阻害されてい
ないコントロール（１００％）のパーセント活性に変換
され、そして５０％阻害が起こる（ＩＣ５０）濃度を見
つけるために阻害剤濃度に対してプロットされる。
【０１８６】好ましくは、上記ふるいわけはＰＤＥ１１
Ａ酵素に選択的なＰＤＥ１１Ａアゴニスト及びアンタゴ
ニストを同定する。例えば、好ましいアゴニスト又はア
ンタゴニストは、ＰＤＥｓ１〜１０の群からの１以上の
ＰＤＥｓと比較して少なくとも２０倍、より好ましく
は、少なくとも３０倍、さらにより好ましくは、少なく
とも５０倍、そして最も好ましくは、少なくとも１００
倍、ＰＤＥ１１Ａに選択的である。好ましいアゴニスト
及びアンタゴニストは１以上のＰＤＥ３、ＰＤＥ４、Ｐ
ＤＥ５及び／又はＰＤＥ６と比較してＰＤＥ１１Ａに選
択的である。
【０１８７】例えば、他のＰＤＥと比較したＰＤＥ１１
Ａについてのアンタゴニストの倍の選択性は他のＰＤＥ
についてのＩＣ５０値をＰＤＥ１１ＡについてのＩＣ５
０値により割ることにより決定される。倍の選択性の比
較はＰＤＥ１１Ａ値を他のＰＤＥｓについての以前に報
告した値と比較すること又は他のＰＤＥ酵素を同時に試
験することを含みうる。
【０１８８】ｉｎ ｖｉｔｒｏのふるいわけの代替とし
て、化合物は、ＰＤＥ１１Ａを内因的に又は遺伝工学技
術の結果として発現するサンプルを用いて、細胞に基づ
いた、組織に基づいた、又は動物全体に基づいた分析に
おけるＰＤＥ１１Ａを調節する効果についてふるいわけ
られうる。上記サンプルを上記剤の存在下及び非存在下
で比較することに加えて、上記分析のための追加の陰性
コントロールは好適に適合した、遺伝的に改変された、
ＰＤＥ１１Ａ−／−細胞又は組織調製又は非ヒト哺乳類
に対して上記剤を試験する。
【０１８９】実施例：ＰＤＥ１１Ａアンタゴニストの同
定 ＰＤＥ５を阻害することが知られる剤を、例えば、Ｆａ
ｗｃｅｔｔ， ２０００中及びＰｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ
ａｌ．， ＷＯ ００／４０７３３中に示される方法
に従って、それらがＰＤＥ１１Ａ活性をも調節するかど
うかを決定するために試験した。ＰＤＥ１１Ａの阻害に
ついての上記剤のＩＣ５０値をＰＤＥｓ５〜１０の阻害
についてのＩＣ５０値と比較した。ＰＤＥ５をヒト海綿
体から単離した；ＰＤＥ６をウシ網膜から単離した；及
び組換えヒトＰＤＥｓ７〜１１をＳｆ９細胞におけるバ
キュロウイルス発現により作出した（Ｆａｗｃｅｔｔ，
２０００、及びＢａｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．
Ｕｒｏｌ． １５９：２１６４−７１， １９９
８）。
【０１９０】試験される剤は以下のものを含む：Ｓｉｌ
ｄｅｎａｆｉｌ（５−［２−エトキシ−５−（４−メチ
ル−１−ピペラジニルスルフォニル）フェニル］−１−
メチル−３−ｎ−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−
ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン、これは
１−［［３−（６，７−ジヒドロ−１−メチル−７−オ
キソ−３−プロピル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピ
リミジン−５−イル）−４−エトキシフェニル］スルフ
ォニル］−４−メチルピペラジンとしても知られる（Ｅ
Ｐ−Ａ−０４６３７５６を参照のこと））；Ｃｉａｌｉ
ｓ（ＩＣ３５１；（６Ｒ，１２ａＲ）−６−（１，３−
ベンゾジオキソール−５−イル）−２，３，６，７，１
２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−メチル−ピラジノ
［１’，２’：１，６］ピリド［３，４−ｂ］インドー
ル−１，４−ジオン；ＣＡＳ番号：１７１４８８−０１
−０；ＷＯ ９５／１９９７８も参照のこと）、Ｅ４０
２１（一塩酸１−［４−［（１，３−ベンゾジオキソー
ル−５−イルメチル）アミノ］−６−クロロ−２−キナ
ゾリニル］−４−ピペリジンカルボン酸；ＣＡＳ番号：
１５０４５２−２１−４；ＷＯ ９３／０７１２４も参
照のこと）；及びＵＫ−２３５，１８７（二塩酸６−ク
ロロ−２−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−Ｎ−
（フェニルメチル）−４−キナゾリナミン；ＣＡＳ番
号： １５７８６３−３１−５；ＥＰ ５７９４９６も
参照のこと）。
【０１９１】化合物をＤＭＳＯ中に溶解し（４ｍＭ）、
そしてその後２５℃の緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ， ｐＨ７．４， ５ｍＭ ＭｇＣｌ２−六水化
物、２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））中に
４０μＭに希釈する（全ての成分はＭＯ、セントルイス
のＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手可能であ
る）。この４０μＭ溶液をその後連続して希釈し、少な
くとも５点にわたり半分ログ希釈を調製した。それぞれ
の範囲点のサンプル（２５μｌ）をマイクロタイタープ
レート（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒ（商標）プレート、Ｖ
Ａ、ＣｈａｎｔｉｌｌｙのＤｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ）中に二重に置いた。上記ＰＤＥ酵素を含む
サンプルをその後それぞれのウェルに添加した。精製し
た組換えの又は天然の酵素を緩衝液Ｂ中に１：５００に
希釈し、そして２５μｌのこの希釈液をそれぞれのウェ
ルに添加した。（この酵素量は時間及び濃度にわたり直
線反応を確認するのに十分であった。）上記酵素及び化
合物サンプルをその後室温で１５分間前インキュベート
した。
【０１９２】基質を５０μｌサンプル中のそれぞれのプ
レートに添加した。基質は、ＰＤＥ１１Ａ試験について
６９ｎＭの最終ｃＧＭＰ濃度のために、緩衝液Ａ（２０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ７．４， ５ｍＭ 六水
化物ＭｇＣｌ２）中の９０ｎＭの非ラベル化ｃＧＭＰ
（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、４８ｎＭ ３Ｈ
−ＧＭＰ（カタログ番号ＰＲＮＱ０１５０， Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ．）か
ら成った（試験された他のＰＤＥｓについての基質濃度
は１／３Ｋｍ以下に調節された）。十分な混合を確実に
するためのプレート振騰セット上での室温で５０分間の
インキュベーションに続いて、上記反応を過剰の（３ｍ
Ｍ）非ラベル化ｃＧＭＰを含む珪酸塩イットリウムＳＰ
Ａビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の添加により停止した。
上記プレートをその後一様の混合を確実にするために１
５分間振騰し、そしてその後ビーズを３０分間放置し
た。プレートをマイクロタイタープレートリーダー（Ｔ
ｏｐＣｏｕｎｔ（商標）プレートリーダー、ＴｏｐＣｏ
ｕｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ５０、ＣＴ、メリデンのＰ
ａｃｋａｒｄ）により読んだ。
【０１９３】ＰＤＥ１１Ａの阻害についての上記剤のＩ
Ｃ５０値をＰＤＥｓ５〜１０の阻害についてのそれらと
比較した。以下の表（１）に見られるように、ＰＤＥ５
阻害剤シアリス（ＩＣ３５１）、Ｅ４０２１、及びＵＫ
−２３５，１８７は、ＰＤＥｓ７〜１０に比較してＰＤ
Ｅ１１Ａの阻害について選択性を示した（シアリス（Ｉ
Ｃ３５１）はＰＤＥ６よりＰＤＥ１１Ａについて選択的
であった）。対照的に、上記ＰＤＥ５阻害剤シルデナフ
ィルはＰＤＥｓ５〜１０のいずれに比較してもＰＤＥ１
１Ａについて選択的ではなかった。
【０１９４】
【表１】
【０１９５】全ての結果は少なくとも３回の決定の幾何
平均である。
【０１９６】Ｃ． ＰＤＥ１１Ａ−／−及びＰＤＥ１１
Ａ＋／−マウスの表現型特徴づけ ＰＤＥ１１Ａポリペプチド活性を減少させた本明細書中
に示される遺伝的に改変されたＰＤＥ１１Ａ−／−及び
ＰＤＥ１１Ａ＋／−非ヒト哺乳類及び動物細胞は、例え
ば、減少した精子形成、増大した精子受精能獲得、ＮＯ
−仲介膀胱弛緩、及び血管拡張に関連して、いずれかの
異常な表現型の外観に基づいて新規ＰＤＥ１１Ａ仲介生
物学的機能を同定するのに使用されうる。減少したＰＤ
Ｅ１１Ａ活性に関連したいずれかの異常な表現型も、Ｐ
ＤＥ１１Ａ関連疾患又は状態の予防又は治療のためにＰ
ＤＥ１１Ａを標的にした治療を同定する及び開発する基
礎を確立する。
【０１９７】実施例−ＰＤＥ１１Ａ−／−マウスは減少
した精子形成を示す 上記ＰＤＥ遺伝子破壊についてのホモ接合のマウスを６
〜８週齢で異常な表現型を同定するために野生型マウス
と比較した。データを身体検査、死体解剖、組織学、臨
床化学、血液化学、体重、組織重量、及び骨髄の細胞学
的評価から集めた。これらの比較のために、６のＰＤＥ
−／−マウス（３雄及び３雌）、及び４のＰＤＥ１１＋
／＋野生型マウス（２雄及び２雌）が研究された。
【０１９８】組織学的研究は雄ＰＤＥ１１Ａ−／−マウ
スの精巣における変化を明らかにした。これらの変化は
減少した精子形成、精子形成上皮細胞の増大した脱落、
精子形成上皮の薄化、平均精細管直径における減少、上
記管を裏打ちする上皮細胞の退化、及び残りの体の増大
した脱落を含んだ。これらのＰＤＥ１１ＡＫＯマウスは
減少した副睾丸精子、増大した多核精子前駆体、及び細
胞破片及びタンパク質性の残骸の増大した出現をも示し
た。調べられた他の組織は組織学的に正常であった。こ
れらの他の組織は精嚢、唾液腺、胸腺、下垂体、甲状
腺、大動脈、心臓、肝臓、胆嚢、食道、盲腸、結腸、直
腸、骨、関節組織、脊髄、骨髄、気管、喉頭、骨格筋、
坐骨神経、舌、乳腺、卵巣、子宮、頸部、眼組織、及び
ハーデリアン腺を含んだ。血液化学分析、組織重量又は
体重の点では、上記ＰＤＥ１１Ａ−／−マウス及びコン
トロールマウスの間の一貫した又は顕著な相違は明らか
にならなかった。
【０１９９】ＰＤＥ１１Ａ−／−雄マウスにおいて観察
された異常な表現型はＰＤＥ１１Ａが通常は精子形成に
関与することを示す。したがって、雄哺乳類においてＰ
ＤＥ１１Ａ活性を阻害する又は高めることはそれぞれ精
子形成を減少させる又は増大させる。精子形成における
ＰＤＥ１１Ａの役割はさらに野生型マウスの精細管の根
源の上皮内、特に精母細胞内でのＰＤＥ１１Ａの発現に
より確認される。
【０２００】実施例−ＰＤＥ１１Ａ−／−マウスは精子
における増大した受精能獲得を示す 受精能獲得（ＣＰ）は精子が卵（卵母細胞）と受精する
前に、通常雌の管を通りｚｏｎａ ｐｅｌｌｕｃｉｄａ
に到達する、及び結合するそれらの過程の間に経験する
プロセスであり、受精の重要な決定物である。射精後の
精子において引き起こされる受精能獲得の生物化学的事
件は精子を「活発に」させる。これは精子が先体反応を
経験し、最終的に卵母細胞と受精することを可能にす
る。自発的な先体損失を介する受精能獲得の成熟前停止
もそうであるように、精子が受精能を獲得することに失
敗することは不妊の基礎にある原因でありうる。射精さ
れる前の精子は受精能を獲得しておらず、そして射精後
に受精能を獲得するようになる。精子の受精能獲得及び
このプロセスの全ての下流の結果を引き起こすことは精
液を構成し、そして射精時に精子と混合される生理活性
分子の環境の添加により促進される。この環境の成分の
多くが解明されるべきままである一方で、ＡＴＰは重要
な要素であることが知られている。精子生理学、特に受
精能獲得は精子内ｃＡＭＰの上昇により制御されること
がよく確立されている。精子のｃＡＭＰを加水分解する
フォスフォジエステラーゼのサブタイプは特徴付けられ
ていない。精子の成熟前受精能獲得はそれらの受精能に
負に影響しうることが示唆されている（Ｔｈｕｎｄａｔ
ｈｉｌ， Ｊ．， Ｇｉｌ， Ｊ．， Ｊａｎｕｓｋａ
ｕｓｋａｓ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． （１９９９）。
Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｐ
ｒｏｐｒｏｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｐａｃｉｔａｔｅｄ
ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｆｒ
ｏｚｅｎ−ｔｈａｗｅｄ ｂｕｌｌ ｓｅｍｅｎ ａｎ
ｄ ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ｗｉｔｈ ａｒｔｉｆｉｃｉ
ａｌ ｉｎｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ．（凍結融解した雄ウ
シの精液中に存在する受精能を獲得した精子の割合及び
人工授精での受精率の間の関係。）Ｉｎｔ． Ｊ． Ａ
ｎｄｒｏｌｏｇｙ， ２２， ３６６−３７３）。受精
能を獲得した精子は上昇した代謝速度、増大した膜の流
動性及び透過性を示し、そしてそれらが卵母細胞に到達
しない場合、それらは自発的な先体損失を経験する。そ
れゆえ、受精能を獲得した精子の寿命は制限される（Ｔ
ｈｕｎｄａｔｈｉｌｅｔ ａｌ．， １９９９）。した
がって、成熟前に受精能を獲得した精子は、それらが卵
母細胞及び受精部位に到達するまで生き残り難く、それ
ゆえ、減少した受精能又は不妊さえをも引き起こす。
【０２０１】方法 導入 組織切片は特異的抗ＰＤＥ１１抗体を用いて免疫組織化
学（ＩＨＣ）により調べられた。ＫＯマウスを標準の技
術を用いて作出し、ＰＤＥ１１の除去を逆転写酵素ポリ
メラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）及び精巣のＩＨＣ分析
に加えてサザンブロットにより確認した。新鮮な副睾丸
の精子を成体マウスから集め、そしてＣＰの誘発剤であ
るＡＴＰでの処理前及び後にクロロテトラサイクリン分
析を用いて受精能獲得（ＣＰ）について試験した。
【０２０２】免疫組織化学 フォルマリンで固定した、パラフィンに埋め込んだ、組
織切片をヒト及びマウスのＰＤＥ１１の触媒ドメインに
対して直接、特異的抗ペプチド抗体（ＥＰＨ３）を用い
て、免疫組織化学（ＩＨＣ；方法のために免疫組織化学
（ＩＨＣ）−材料及び方法及び免疫組織化学（ＩＨＣ）
法１と題された後の節を参照のこと）により調べた。
【０２０３】遺伝子ノックアウト（ＫＯ） ＰＤＥ１１ＫＯマウスを標準の技術を用いて作出し、そ
して特徴づけの前にＣ５７ＢＬ／６マウスと戻しかけ合
わせた；ＰＤＥ１１除去はＲＴ−ＰＣＲ及び精巣を含
む、関心ある組織のＩＨＣ分析に加えてサザンブロッテ
ィングにより確認した。
【０２０４】受精能獲得分析 受精能獲得分析には、新鮮な副睾丸の精子を成体（１６
週齢）マウスからＴｙｒｏｄｅｓ媒体中に集め、そして
精子の機能的な状態を決定するために、受精能獲得の誘
発剤であるＡＴＰで前処理した及びしていない（±）の
両方、クロロテトラサイクリン（ＣＴＣ）分析を用いて
三重で試験した（Ｆｒａｓｅｒ， Ｌ．Ｒ． ＆ Ｈｅ
ｒｏｄ， Ｊ． Ｅ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｈ
ａｎｇｅｓ ｉｎ ｃｈｌｏｒｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎ
ｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉ
ｎ ｍｏｕｓｅ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ ｒｅｑｕｉ
ｒｅｓ ａ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｇｌｙｃｏｌｙｓａｂ
ｌｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ．（マウスの精子におけるク
ロロテトラサイクリン蛍光パターンの受精能獲得依存的
変化の発現は好適な解糖可能な基質を必要とする。）
Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔ．， １９９０； ８
８（２）： ６１１−２１）。
【０２０５】精子懸濁液を３のＰＤＥ１１ノックアウト
（ＫＯ）及び３の野生型（ＷＴ）マウスからのマウス副
睾丸の内容物をＴｙｒｏｄｅｓ媒体中に放出することに
より調製した。受精能獲得の程度をクロロテトラサイク
リン（ＣＴＣ）、７５０μＭを用いて３７℃で１５分間
計測した。ＣＴＣ蛍光のパターンを顕微鏡下で観察した
（引用文献： Ｆｒａｓｅｒ ＬＲ ｅｔ ａｌ．，
１９９０， Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔ． −上
記を参照のこと）。パターンは精子の機能的状態、すな
わち、受精能を獲得した、受精能を獲得していない及び
先体損失を反映した。
【０２０６】結果 正常マウス（成体、ｎ＝５）及びヒト精巣（１７〜７０
歳、ｎ＝５）において、ＰＤＥ１１タンパク質は、ライ
ディッヒ及び血管平滑筋細胞に加えて、（精細管内で）
精原細胞、精母細胞及び精子細胞に位置づけられた（す
なわち、陽性染色）。セルトリ細胞及び結合組織要素は
陰性に染まった。ＰＤＥ１１ ＫＯマウスは生存能力が
あり（雄及び雌）、そして試験はＰＤＥ１１ ｍＲＮＡ
及びタンパク質発現を欠いていた（ｎ＝４；１６週
齢）。
【０２０７】上記精子の機能的状態は以下に要約され
る：
【０２０８】
【表２】
【０２０９】
【表３】
【０２１０】結論 射精前の精子の基礎の受精能獲得は野生型マウスと比較
してＰＤＥ１１ノックアウトマウスにおいては顕著に高
いことがわかった（Ｆｉｇ．６を参照のこと）。このデ
ータはＰＤＥ１１ノックアウトマウスから得られた精子
では顕著な割合の成熟前受精能獲得があることを示す。
この成熟前受精能獲得はこれらの精子の受精の可能性を
損ないうる。受精能獲得の最大の程度は野生型マウスと
比較してＰＤＥ１１ノックアウトマウスで同様であっ
た。両方のサンプルにおいて、ＡＴＰは１時間のインキ
ュベーション後受精能を獲得したマウス精子の数を顕著
に増大させた。
【０２１１】上記データは精子を活性化（例えば、射
精）前に受精能を獲得していない状態に維持することに
おけるＰＤＥ１１の役割を示唆する−このことはマウス
及びヒトにおけるＰＤＥ１１タンパク質の局在とも一致
する−おそらく上昇された環状ヌクレオチド一リン酸
（ｃＮＭＰ）経路（ｃＡＭＰ及び／又はｃＧＭＰシグナ
ル経路の増加）を介して。しかしながら、ＰＤＥ１１は
ＡＴＰでの活性化に際してＣＰのための潜在性において
役割を有しているように見えない。精液注入における受
精能を獲得していない精子の割合は卵挿入能と正に相関
することが知られているので（Ｔｈｕｎｄａｔｈｉｌ
Ｊ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｉｎｔ．Ｊ． Ａｎ
ｄｒｏｌ．）、ＰＤＥ１１活性／シグナルを高めること
はｉｎ ｖｉｖｏの男性の受精能を改善しうる。
【０２１２】Ｄ． ＰＤＥ１１Ａ−／−及びＰＤＥ１１
Ａ＋／−マウスの遺伝子型の特徴づけ ＰＤＥ１１Ａポリペプチド活性を減少させた、本明細書
中に示される上記遺伝的に改変されたＰＤＥ１１Ａ−／
−及びＰＤＥ１１Ａ＋／−非ヒト哺乳類及び動物細胞
は、例えば、精子形成、精子受精能獲得、ＮＯ仲介膀胱
弛緩、及び血管拡張に関連するような、ある遺伝子のア
ップ及び／又はダウンレギュレーションに基づいた新規
ＰＤＥ１１Ａ仲介生物学的機能を同定するのに使用され
うる。減少したＰＤＥ１１Ａ活性と関連したどんな異常
な遺伝子発現も、ＰＤＥ１１Ａ関連疾患又は状態を予防
する又は治療するためのＰＤＥ１１Ａを標的にした治療
を同定する及び開発するための基礎を確立する。
【０２１３】実施例−ＰＤＥ１１Ａ−／−マウスは野生
型マウスに比較して異常な遺伝子発現を示す ＲＮＡ抽出 （ＰＤＥ１１Ａ−／−ノックアウト（ＫＯ）マウス及び
野生型（ＷＴ）マウスの精巣からの）液体窒素中の凍結
組織を膜破壊装置（Ｂ． Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて粉砕し、そし
てＢｕｆｆｅｒＲＬＴ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）中に溶
解した。上記溶液をＱｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ（Ｑｉａｇ
ｅｎ）を用いてホモジナイズし、そして製造業者のプロ
トコールに従って上記ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ ｃｏｌｕ
ｍｎｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。
【０２１４】Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子発現分析 二重鎖ｃＤＮＡをＴ７−ポリＴプライマーと共にＳｕｐ
ｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ ｋｉｔ（ＵＫ、スコ
ットランドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ）Ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いて１０μｇ
のトータルＲＮＡから作出した。約１μｇのｃＤＮＡを
Ｂｉｏａｒｒａｙ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｔ
ｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＵＳ
ＡのＥｎｚｏ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によりビ
オチン化ｃＲＮＡを作出するのに使用した。１０μｇの
断片化されたｃＲＮＡを１００ｍＭ ＭＥＳ、１Ｍ Ｎ
ａ＋、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２
０、０．１ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、０．５ｍｇ／
ｍｌアセチル化ＢＳＡ及び５０ｐＭコントロールオリゴ
ヌクレオチド及びマウスゲノムＵ７４Ａ配列（ＭＧＵ７
４Ａ配列−カタログ番号： ９００３２１又は９００３
２２；ＵＳＡ、ＣＡのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に対する
真核生物ハイブリダイゼーションコントロール中で、４
５℃で１６時間ハイブリダイズさせた。配列を、２５℃
で非厳密な緩衝液（６× ＳＳＰＥ、０．０１％ Ｔｗ
ｅｅｎ２０、０．００５％抗泡立ち剤）中で、そして５
０℃で厳密な洗浄緩衝液（１００ｍＭ ＭＥＳ、０．１
Ｍ Ｎａ＋、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ）中でＡｆｆｙｍ
ｅｔｒｉｘプロトコールを用いて洗浄し、そして抗体増
幅段階を含むストレプトアビジンフィコエリスリン（１
０μｇ／ｍｌ）で染色した。配列を蛍光強度を得るため
に共焦点レーザースキャナーを用いて走査した。上記デ
ータをＭｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕ
ｉｔｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉ
ｘ）を用いて処理した。非機能的であるとしてＡｆｆｙ
ｍｅｔｒｉｘにより同定された約２，６００プローブセ
ットが上記分析から遮断された。上記データを３００の
標的強度に評価した。
【０２１５】上記ｎ＝４データセットのデータ分析 上記データを続いてＳｐｏｔｆｉｒｅ Ａｒｒａｙ Ｅ
ｘｐｌｏｒｅｒ ３．０ソフトウェアを用いて分析した
（例えば、米国特許第６，０１４，６６１号を参照のこ
と）。遺伝子ははじめに「ＷＴで高い／ＫＯで低い」
（すなわち、ＰＤＥ１１除去によりダウンレギュレート
された）又は「ＷＴで低い／ＫＯで高い」（すなわち、
ＰＤＥ１１除去によりアップレギュレートされた）とい
う、発現特性に基づいて選択された。そのようにして選
択された１０００遺伝子はその後発現値及び倍変化（少
なくともＷＴ及びＫＯ間で２倍）に基づいて選別格付け
された−これは大多数の遺伝子を除去した。発現された
配列タグ（ＥＳＴ）クラスター（現在のところ未知の機
能）もその後除去された。これは既知の機能を有するダ
ウン又はアップレギュレートされる１０８遺伝子を残し
た。これらの遺伝子のそれぞれはその後ｉｎｔｅｒ ａ
ｌｉａで精巣機能、ｃＡＭＰ及び／又はｃＧＭＰ仲介シ
グナル伝達への関連についてＭｅｄｌｉｎｅで調査され
た。ＫＯマウスにおける７２のダウンレギュレートされ
た遺伝子のうち、１５が精巣にある機知のつながりを有
する。３５のアップレギュレートされた遺伝子のうち、
６が精巣にある機知のつながりを有する。
【０２１６】ＰＤＥ１１ ＫＯの精巣においてダウンレ
ギュレートされる遺伝子のデータ分析の要約 ・ＷＴで高い／ＫＯで低い発現特性に相似性を示す、５
００遺伝子を同定した。 ・これらのうち、１９９遺伝子はＷＴ又はＫＯにおいて
結果に意味があるほど顕著な値で発現せず、無視した。 ・残った３０１遺伝子のうち、１７０遺伝子はＷＴ及び
ＫＯ間で２倍未満の差の発現しか示さなかった。統計的
にはこれらの遺伝子全ては少なくともＰ＝０．０５の顕
著性まで顕著に差異をもって発現したが、本分析の目的
のためにそれらは除かれた。 ・残りの１３１遺伝子のうち、５９遺伝子はマウスＥＳ
Ｔクラスターから由来し、現在のところ同定可能な機能
を有しない。 ・残りの７２遺伝子のうち、４３遺伝子は引用文献の調
査に基づいてｉｎｔｅｒ ａｌｉａで精巣機能における
識別可能な役割を有しなかった。 ・残りの２９遺伝子のうち、１２遺伝子は他の理由から
除かれた。 ・２のさらなる遺伝子は薬物代謝に関連することが知ら
れていた。 ・これは、精巣機能にさまざまなつながりを有し、ＰＤ
Ｅ１１ ＫＯの精巣において顕著にダウンレギュレート
される、１５遺伝子を残した（以下を参照のこと）。
【０２１７】ＰＤＥ１１ ＫＯの精巣においてアップレ
ギュレートされる遺伝子のデータ分析の要約 ・ＷＴで低い／ＫＯで高い発現特性に相似性を示す、５
００遺伝子を同定した。 ・これらのうち、２６９遺伝子はＷＴ又はＫＯにおいて
結果に意味があるほど顕著な値で発現せず、無視した。 ・残った２３１遺伝子のうち、１６１遺伝子はＷＴ及び
ＫＯ間で２倍未満の差の発現しか示さなかった。統計的
にはこれらの遺伝子全ては少なくともＰ＝０．０５の顕
著性まで顕著に差異をもって発現したが、本分析の目的
のためにそれらは除かれた。 ・残りの７０遺伝子のうち、３５遺伝子はマウスＥＳＴ
クラスターから由来し、現在のところ同定可能な機能を
有しない。 ・残りの３５遺伝子のうち、２８遺伝子は引用文献の調
査に基づいてｉｎｔｅｒ ａｌｉａで精巣機能における
識別可能な役割を有しなかった。 ・１の遺伝子は薬物代謝に関連することが知られてい
た。 ・これは、精巣機能にさまざまなつながりを有し、ＰＤ
Ｅ１１ ＫＯの精巣において顕著にアップレギュレート
される、６遺伝子を残した（以下を参照のこと）。
【０２１８】遺伝子発現 上記マイクロアレイのデータは野生型動物（ｎ＝４）に
比較してＰＤＥ１１ノックアウトマウス（ｎ＝４）の精
巣においてダウンレギュレートされた１５の遺伝子（Ｆ
ｉｇ．４を参照のこと）及び野生型動物（ｎ＝４）に比
較してＰＤＥ１１ノックアウトマウス（ｎ＝４）の精巣
においてアップレギュレートされた６の遺伝子（Ｆｉ
ｇ．５を参照のこと）を示した。
【０２１９】１５のダウンレギュレートされた遺伝子： １．コルチコステロイド結合グロブリンはステロイド
（例えば、テストステロン）の輸送に関与していること
が知られており、そしてそれはＳｅｒｐｉｎｓに関与す
る。初期の発現は肝臓内であるが、精巣においても発現
される（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ８４：５１５３）。この遺伝子のダウン
レギュレーションはライディッヒ細胞により分泌される
テストステロンの輸送に影響するであろう。それは精子
細胞の生存能力又は二次性徴に下流の影響を有しうる。 ２．セントリン３はセントロメア形成及び細胞周期進行
に関与する重要なタンパク質である。セントリンのダウ
ンレギュレーションは有志分裂ターンオーバーに影響
し、それゆえ、産出される精子細胞数を減少しうる。
【０２２０】３．ＸＲＣＣ１はＤＮＡ鎖−損傷修復、相
同的組換え、及び姉妹染色体交換に関与する。発現はマ
ウスにおいて時間にわたり変化しないことが知られる。
それゆえ、ＸＲＣＣ１のダウンレギュレーションは有志
分裂の間のＤＮＡの不正確な修復を引き起こしうる（Ｂ
ｒａｉｎ Ｒｅｓ． ８６９：１０５）。 ４．クロモボックスＭ３３は転写因子であり、そしてＰ
ｏｌｙｃｏｍｂに関連する。このタンパク質のダウンレ
ギュレーションはＫＯマウスにおいて見られる性逆転表
現型に似うる。 ５．ＧＡＢＡ−Ａ、ガンマ３サブユニットはＧＡＢＡ−
Ａ受容体の重要な構造成分である。ＧＡＢＡは先体反応
に必要とされることが知られる。このサブユニットのダ
ウンレギュレーションは先体反応を損ないうる、ＧＡＢ
Ａ−Ａ受容体を介する不十分なシグナル伝達を引き起こ
しうる。
【０２２１】６．プロホルモン変換酵素５はＭＩＳを活
性化すると考えられる。このタンパク質分解酵素のダウ
ンレギュレーションは不適切なミュラー管退縮に関連し
た発達異常を引き起こしうる。 ７．ライディッヒインスリン様ペプチドは導帯発達に関
与するリラクシン様因子である。この遺伝子のダウンレ
ギュレーションはＬｅｙ−Ｌ ＫＯマウスの局面、例え
ば、精巣のｃｒｙｐｔｏｃｈｏｒｄｉｓｍに似うる。 ８．カルパイン３は先体反応に関連する。他のカルパイ
ンはダウンレギュレートされない。カルパイン３のダウ
ンレギュレーションは上記先体反応に影響しうる。
【０２２２】９．Ｙ−ボックス３は転写に関連する。他
のＹ−ボックスタンパク質はダウンレギュレートされな
い。それは精巣における重要な転写因子であると推測さ
れているので、ダウンレギュレーションは精巣の生理学
に複数の影響を有しうる。 １０．クロモグラニンＢは内分泌組織からの分泌に関連
する。このタンパク質のダウンレギュレーションはライ
ディッヒ細胞の分泌経路を破壊し、それゆえ間質性微環
境における変化を引き起こしうる。 １１．クリプトジン１は感染性細菌に対する防御に重要
である。クリプトジンは精巣における細菌防御に関与す
ることが示されている。それゆえ、減少したクリプトジ
ン発現は精巣を感染させやすくしうる。 １２．ＰＰ２Ｂは、精子形成の鍵であるカルモジュリン
仲介カルシウムシグナル経路に関与することが知られる
フォスファターゼである。このタンパク質のダウンレギ
ュレーションはカルシウムシグナル伝達への妨害を引き
起こし、そして有効な精子形成に影響しうる。
【０２２３】１３．グルタミン酸システインリガーゼは
ガンマグルタミルサイクルに関与する。このサイクルは
精子形成に重要であることが知られるので、ダウンレギ
ュレーションはこのプロセスを阻害しうる。 １４．ニドジェンは管周辺細胞の細胞外マトリックスへ
の接着に関与する。この遺伝子のダウンレギュレーショ
ンは管周辺細胞における不安定性及び不適切なｓｐｅｒ
ｍｉａｔｉｏｎ及び移動を引き起こしうる。 １５．ＨＲ６Ａはユビキチン結合に関与する。このタン
パク質のダウンレギュレーションは上記ＫＯマウスにお
いて見られる表現型と一致する障害を生じた精子形成に
似うる。
【０２２４】６のアップレギュレートされた遺伝子： １．プロタミン１は精巣に特異的なヒストン様タンパク
質である。プロタミン１制御における変化は精子細胞の
核の不正確な凝集を引き起こすことが知られる。 ２．ｓｐ３２はプロアクロシン結合因子である。それは
受精効率に有害でありうるプロアクロシンの活性化を加
速する。 ３．ｍＣＤＣ４６はＤＮＡ複製に必須であるＤＮＡ複製
許可因子である。アップレギュレーションは精巣におけ
る有害な変化を反映しうる。 ４．アデニレートキナーゼ２はヌクレオチド制御に重要
である。アップレギュレーションは上昇したｃＡＭＰ値
に対する応答でありうる。
【０２２５】５．ＡＫＡＰ１２１はキナーゼアンカータ
ンパク質である。それはｃＡＭＰ及びホルモンにより制
御されることが知られる。アップレギュレーションは精
巣の微環境における有害な変化を反映しうる。 ６．Ｋｒｏｘ−２４結合タンパク質は、ＥＧＲを活性化
する亜鉛−フィンガー転写因子と結合する。増大された
発現はノックアウトマウスの不妊に寄与しうる。
【０２２６】Ｅ． ＰＤＥ１１Ａアゴニスト及びアンタ
ゴニストを用いたＰＤＥ１１Ａ機能の同定 ＰＤＥ１１Ａの調節剤として同定された化合物、より好
ましくは、選択的ＰＤＥ１１Ａ調節剤として同定された
化合物は、化合物投与に応答して起こる変化に基づいて
ＰＤＥ１１Ａ機能を同定するために、ＰＤＥ１１Ａを発
現する細胞又は組織調製物に又は動物全体に投与されう
る。例えば、膀胱尿路上皮におけるＰＤＥ１１Ａ発現を
考慮すれば、それは膀胱及び膀胱神経線維興奮性の一酸
化窒素（ＮＯ）仲介阻害の制御剤としての候補物質であ
る。このＮＯ仲介効果は、例えば、Ｏｚａｗａ ｅｔ
ａｌ．， Ｊ． Ｕｒｏｌ． １６２： ２２１１，
１９９９， Ｐａｎｄｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．
Ｕｒｏｌ． ５４５−５５０， ２０００、及びＢｕｒ
ｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ３：
５７１−７４， １９９７中に示される。膀胱収縮性
におけるＰＤＥ１１Ａの役割を特徴付けるために、ＰＤ
Ｅ１１Ａアンタゴニストの効果がオキシヘモグロビン誘
導（Ｐａｎｄｉｔａ， ｓｕｐｒａ）又はシクロフォス
ファミド誘導（Ｏｚａｗａ， ｓｕｐｒａ）膀胱活動亢
進のモデルにおいて研究されうる。実験動物（例えば、
ラット）に例えば、ＤＭＳＯ中に溶解された及び好適な
緩衝液により希釈されたＰＤＥ１１Ａアンタゴニストと
共に、オキシヘモグロビン（膀胱内に、Ｓｉｇｍａ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ）又はシクロフォスファミド（腹腔内
に）を投与する。上記ＰＤＥ１１Ａアンタゴニストは好
適な経路（例えば、膀胱内、腹腔内又は静脈内）により
投与される。
【０２２７】ＰＤＥ１１Ａアンタゴニストが、上記アン
タゴニストを投与されないコントロール動物と比較し
て、膀胱に分布する求心性神経での神経発火における減
少、膀胱収縮頻度における減少、排尿圧における減少、
及び／又は基礎圧減少を引き起こす場合、ＰＤＥ１１Ａ
は試験動物において膀胱及び膀胱神経線維興奮性のＮＯ
仲介阻害の制御において役割を果たすことが同定され
る。膀胱機能の計測は引用文献（例えば、Ｐａｎｄｉｔ
ａ（ｓｕｐｒａ）、及びＯｚａｗａ（ｓｕｐｒａ））中
に示される標準の方法に従ってなされる。上記観察され
た効果はＰＤＥ１１Ａを阻害することにより仲介された
ということを確実にするための追加のコントロールとし
て、破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子（好ましくは、ＰＤ
Ｅ１１Ａ−／−）を含む、好適に適合された、遺伝的に
改変された、非ヒト哺乳類が試験されうる。
【０２２８】ＰＤＥ１１Ａ活性又は発現を調節する剤の
効果を試験するとき、ヒト細胞系に又は初代ヒト組織調
製物に由来するものの如き、ヒトＰＤＥ１１Ａを発現す
る組織又は細胞サンプルを使用することが好ましい。あ
るいは、上記組織又は細胞サンプルはＰＤＥ１１Ａヒト
化非ヒト哺乳類又は動物細胞から得られうる。同様に、
ＰＤＥ１１Ａ機能研究に好ましい１の試験動物は遺伝的
に改変されたＰＤＥ１１Ａヒト化哺乳類である。
【０２２９】Ｆ． ＰＤＥ１１Ａ発現及びプロラクチン
及び／又は成長ホルモンの分泌の調節におけるその役割 免疫組織化学（ＩＨＣ） 材料及び方法 抗ヒトＰＤＥ１１Ａポリクローナル抗血清（ＥＰＨ−
３）は、ヒトＰＤＥ１１Ａ１の４１０〜４２４アミノ酸
残基に対応する、合成ペプチドＳＡＩＦＤＲＮＲＫＤＥ
ＬＰＲＬに対してウサギにおいて作出され、そして続い
て以前に示されたように（Ｆａｗｃｅｔｔ ｅｔ ａ
ｌ．， ２０００）アフィニティー精製された。
【０２３０】免疫組織化学（ＩＨＣ）法１：パラフィン
中に埋め込まれ、そしてＡＰＥＳ（３−アミノプロピル
トリエトキシシラン）で覆われたスライド上に固定化さ
れた５μｍのヒト組織切片をＰｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ
Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌ
ｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＵＫのＰｅｔｅｒｂｏｒｏ
ｕｇｈ）から購入した。全ての組織は手術により得られ
又は死後２４時間以内であり、そしてフォルマリンに固
定されていた。これらのサンプルの蝋を取り除き、そし
て水に取り、その後抗原を２００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ
７．７）及び４ｍＭ ＣａＣｌ２の緩衝液中で１ｍｇ／
ｍｌトリプシンで３７℃で１５分間再生させた。水中で
の簡単な洗浄に続いて、切片をその後基質クロモゲンと
しての３，３’−ジアミノベンジヂン（ＤＡＢ）と共に
ＤＡＫＯ Ｒａｂｂｉｔ ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）＋
システム（Ｃａｔ＃ Ｋ４０１０）を用いて免疫検出に
かけた。特異的なタンパク質検出のためには、切片は５
％（ｗ／ｖ）非脂肪乳粉末を含むトリスで緩衝した塩水
（ＴＢＳ）中に１：１０００に希釈したＥＰＨ−３抗体
でインキュベートし、そして室温で１時間インキュベー
トした。陰性コントロールが含まれた：免疫前血清及び
ブロッキングペプチドと混合した抗体の両方は同じ結果
を与えた。切片はヘマトキシリン中で対染色され、そし
てＤＰＸ中に永久固定した。
【０２３１】免疫組織化学（ＩＨＣ）法２：抗体ＥＰＨ
−３（１：５００又は１：１０００に希釈した）を一次
抗体として用い、そして上記原理的な検出系は、暗褐色
の赤色沈殿を作出するのに使用された、Ｖｅｃｔｏｒ
Ｒｅｄ基質キットを伴うＶｅｃｔｏｒ ＡＢＣ−ＡＰキ
ット（ＡＫ５００１、抗ウサギ二次抗体）から成った
（ＳＫ−５１００）。組織を上記組織抗原が保存され、
そして免疫組織化学分析に利用可能であったことを確認
するために陽性コントロール抗体（ＣＤ３１）でも染色
した。ＣＤ３１に陽性に染色された組織のみがこの研究
の残りのものに選ばれた。陰性コントロールは一次抗体
の非存在下で近隣の切片に上記免疫組織化学手順全体を
行うことから成った。
【０２３２】発現データ ヒトＰＤＥ１１Ａタンパク質の発現及び細胞局在は、ア
フィニティー精製した、抗ヒトＰＤＥ１１Ａポリクロー
ナル抗血清（ＥＰＨ−３）を用いて、免疫組織化学によ
りヒト組織切片において調べられた。上記結果はＦｉ
ｇ．８及びＦｉｇ．９中に見られる。
【０２３３】議論 ＰＤＥ１１は、陰性に現れる、下垂体後葉のものを含
む、ほとんどの他の細胞型と共に、下垂体前葉の好酸性
細胞、すなわち、ソマトトロピン産生細胞及びラクトト
ロピン産生細胞において発現される（Ｆｉｇ．８中で
「ＡＨ」（ＰＤＥ１１に陽性）を「ＮＨ」（ＰＤＥ１１
に陰性）と比較し、Ｆｉｇ．９中の「前葉」（ＰＤＥ１
１に陽性）及び「後葉」（ＰＤＥ１１に陰性）免疫染色
を比較せよ）。
【０２３４】好酸性細胞における存在は、それぞれ、ラ
クトトロピン産生細胞及びソマトトロピン産生細胞から
分泌される、プロラクチン及び／又は成長ホルモンの分
泌の調節における役割を示唆する。例えば、ＮＯはｃＧ
ＭＰの上昇を介してプロラクチン分泌を阻害することが
示されている（Ｄｕｖｉｌａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，
１９９５）。したがって、ＰＤＥ阻害を介するラクト
トロピン産生細胞におけるｃＧＭＰ値の上昇は、例え
ば、プロラクチンの減少した分泌をもたらしうる。プロ
ラクチンは、その乳汁分泌におけるよく確立された役割
に加えて、黄体機能、ステロイド合成、免疫制御、成
長、精巣発達及び精子形成への影響を含む、多様な範囲
の活性を有する（Ｂｏｌｅ−Ｆｅｙｓｏｔ ｅｔ ａ
ｌ．， １９９８）。プロラクチン受容体を欠くマウス
は不妊、欠落した正常な乳房発達及び抑圧された母性行
為（雌）、遅延した受精能（雄）、減少した骨形成及び
体重におけるわずかな減少を示し（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ
ａｌ．， ２００１）、そしてそれゆえ、これらの影響
は減少した又は除去されたプロラクチン分泌に応答して
明白でありうる。
【０２３５】成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）刺
激に応答した、ソマトトロピン産生細胞における環状Ａ
ＭＰ上昇は分泌顆粒からの成長ホルモン（ＧＨ）の放出
をもたらす（Ｍａｙｏ ｅｔ ａｌ．， １９９５）、
そしてそれゆえ、ＰＤＥ阻害はこれらの放出を高めう
る。ＧＨは成長刺激に重要であるが、骨格成長の中止後
の生涯を通して持続する、そしてそれゆえ、維持に重要
であると考えられる、すなわち、ＧＨはタンパク質及び
骨同化の、脂肪分解の及び抗ナトリウム排泄増加性の特
徴を有する（Ｍｕｒｒａｙ ＆ Ｓｈａｌｅｔ， ２０
００）。それゆえ、ＧＨは加齢、骨粗しょう症、疾患性
肥満、心不全、大きな熱性の傷害及びさまざまな急性及
び慢性異化作用状態に関連したもろさの治療において有
用性を有する。
【０２３６】結論としては、ＰＤＥ１１Ａはプロラクチ
ン及び／又は成長ホルモンの調節において果たす生理学
的な役割を、そしてそれゆえ、乳汁分泌、受精能、ステ
ロイド合成、免疫制御及び成長の如き、ある範囲の直接
の及び／又は間接の／内分泌の効果を有しうる。
【０２３７】ノックアウト（ＫＯ）マウスデータ ＰＤＥ１１に欠陥のあるマウスをＰＤＥ１１をコードす
る遺伝子を標的にした突然変異をとおして作出した（上
記を参照のこと）。ノックアウトマウス及びハイブリッ
ドＢ６：１２９系統上の血漿ホルモン分析に遺伝的に適
合した野生型コントロールをヘテロ接合の雄及び雌を陽
性圧絶縁体内で標準の環境及び食餌条件下でかけ合わせ
ることにより交配した。明／暗周期は人工的に制御され
た。動物を明期に入る標準時間で二酸化炭素で殺し、そ
して血液を腹の大静脈から即座に取り、血漿を得た。
【０２３８】プロラクチン分析 ｎ＝６雄ＷＴマウス及びｎ＝６雄ＫＯマウスからの血漿
において決定された。プロラクチンを製造業者の推奨に
従って、商業的な試験キット（Ｒａｔ Ｐｒｏｌａｃｔ
ｉｎ ＲＰＡ５５３、 ＵＫのＡｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉ
ｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０２３９】データ分析 データを、年齢を共変量として共分散分析（ＡＮＯＣＯ
ＶＡ）を用いて分析した。これは年齢及び応答の間の直
線関係を試験する。「親」は上記モデルにおいて因子と
して含まれた。これは、可能性のある年齢差が除去され
た後の親の間の差を同定するのに使用される（Ｎ．Ｂ．
年齢に寄与される検出される差は、実際に、年齢にお
ける差にたまたま対応する親のための差でありうる）。
上記２の遺伝子型の間の差を、年齢及び親のための可能
性のある差について許容した後に評価した。引用された
上記遺伝子型法はこれらの年齢及び親の差が除去された
後に評価される。
【０２４０】
【表４】
【０２４１】プロラクチン受容体を欠くマウスは不妊、
欠落した正常な乳房発達及び抑圧された母性行為
（雌）、遅延した受精能（雄）、減少した骨形成及び体
重におけるわずかな減少を示す。
【０２４２】結論 血漿ホルモン分析（ｎ＝６雄マウス）は年齢及びプロラ
クチン値の間に明確な関係、及びＰＤＥ１１ ＫＯマウ
スにおける減少したプロラクチンへの明らかな傾向を示
す（ｐ＝０．１２）。
【０２４３】Ｇ． 治療的適用 ＰＤＥ１１Ａ活性を調節すると同定された剤は治療的な
目的に使用されうる。好ましくは、上記剤は少なくとも
１の他のＰＤＥについてＰＤＥ１１Ａに選択的である
（例えば、Ｃｉａｌｉｓ（ＩＣ３５１）、Ｅ４０２１、
及びＵＫ−２３５，１８７はＰＤＥｓ７〜１０に比較し
て、ＰＤＥ１１Ａに選択的である）、より好ましくは、
上記剤はＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ５、及び／又はＰ
ＤＥ６のうちの少なくとも１についてＰＤＥ１１Ａに選
択的である（例えば、Ｃｉａｌｉｓ（ＩＣ３５１）はＰ
ＤＥ６に比較してＰＤＥ１１Ａに選択的である）。
【０２４４】精子受精能獲得の調節 本発明に係る剤の例示的な治療的適用は、（ＰＤＥ１１
Ａ活性を減少させ、精子受精能獲得を増大させることに
よる）男性のｉｎ ｖｉｖｏの避妊／男性のｅｘ ｖｉ
ｖｏの受精前能力剤としての使用のための精子受精能獲
得を調節する又は（ＰＤＥ１１Ａ活性を刺激し、精子受
精能獲得を減少させることにより）男性のｉｎ ｖｉｖ
ｏ受精能を増大させる剤を投与することであろう。ＰＤ
Ｅ１１Ａ活性を調節する剤は好適な経路により投与され
うる。例えば、投与は非経口の、静脈内の、動脈内の、
皮下の、筋内の、頭蓋内の、眼窩内の、眼の、脳室内
の、包内の、脊椎内の、槽内の、腹腔内の、鼻内の、エ
ーロゾル、又は坐剤により又は経口投与でありうる。
【０２４５】精子形成に加えて、ｃＡＭＰは成熟精子で
の運動性の維持における重要なメッセンジャーであるこ
とも報告されている（Ｃｈａｕｄｈｒｙ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｏｔｉｌ． Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔ
ｏｎ ３２： ６５−７９，１９９５）。さらに、それ
は精子における受精能獲得及び先体反応を引き起こすシ
グナル事件を導き出すことにおいて鍵の役割をも有する
（Ｄｕｎｃａｎ ＆Ｆｒａｓｅｒ， Ｊ． Ｒｅｐｒｏ
ｄ． Ｆｅｒｔｉｌ． ９７： ２８７−９９， １９
９３； Ａｉｔｋｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌ
ｌ Ｓｃｉ．１１１： ６４５−６５６， １９９８；
Ａｄｅｏｙａ−Ｏｓｉｇｕｗａ＆ Ｆｒａｓｅｒ，
Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ５７： ３８４
−９２， ２０００）；後者は精子の活性化及び受精能
に重要である。その結果として、ＰＤＥ１１Ａ阻害を介
する、精母細胞、精子細胞及び精子におけるｃＡＭＰ値
の乱れは、例えば、精子形成を抑制するが、射精の際の
精子の運動性及び／又は精子活性化を高めうる。
【０２４６】プロラクチン及び／又は成長ホルモン値の
調節 ＰＤＥ１１Ａは下垂体前葉の好酸性細胞、すなわち、ソ
マトトロピン産生細胞及びラクトトロピン産生細胞にお
いて発現される。好酸性細胞におけるＰＤＥ１１Ａの存
在はＰＤＥ１１Ａが、それぞれラクトトロピン産生細胞
及びソマトトロピン産生細胞から分泌される、プロラク
チン及び／又は成長ホルモンの分泌を調節することにお
いて役割を果たすことを示す。例えば、ＮＯはｃＧＭＰ
の上昇を介してプロラクチン分泌を阻害することが示さ
れている（Ｄｕｖｉｌａｎｓｋｉｅｔ ａｌ．， Ｐｒ
ｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ９
２： １７０−７４， １９９５）。それゆえ、ＰＤＥ
１１Ａ阻害を介して作出されたラクトトロピン産生細胞
におけるｃＧＭＰ値の上昇は、例えば、高プロラクチン
症に関連した障害を治療するためにプロラクチンの分泌
を減少させるのに使用されうる。プロラクチンは、その
乳汁分泌におけるよく確立された役割に加えて、黄体機
能、ステロイド合成、免疫制御、成長、精巣発達及び精
子形成への効果を含む、多様な範囲の活性を有する（Ｂ
ｏｌｅ−Ｆｅｙｓｏｔ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃ
ｒ． Ｒｅｖ． １９： ２２５−６８， １９９
８）。プロラクチン受容体を欠くマウスは不妊、欠落し
た正常な乳房発達及び抑圧された母性行為（雌）、遅延
した受精能（雄）、減少した骨形成及び体重におけるわ
ずかな減少を示す（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒ
ｏｎｔ． Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ２２；
１４０−４５， ２００１）。これらの効果は減少し
た又は除去されたプロラクチン分泌に応答して明白であ
りうる。したがって、ＰＤＥ１１Ａアゴニストは下垂体
前葉ラクトトロピン産生細胞においてｃＡＭＰ及びｃＧ
ＭＰの値を減少させること及びプロラクチン分泌を増加
させることのために使用されることができ、そして逆
に、ＰＤＥ１１Ａアンタゴニストはプロラクチン分泌を
減少させるのに使用されうる。
【０２４７】成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）刺
激に応答したソマトトロピン産生細胞における環状ＡＭ
Ｐ上昇は分泌顆粒からの成長ホルモン（ＧＨ）の放出を
もたらし（Ｍａｙｏ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｅｎｔ
Ｐｒｏｇ． Ｈｏｒｍ． Ｒｅｓ． ５０： ３５−７
３， １９９５）、そしてそれゆえ、下垂体前葉ソマト
トロピン産生細胞におけるＰＤＥ１１Ａ阻害は、例え
ば、この放出を高めうる。ＰＤＥ１１調節を介するプロ
ラクチン及び／又は成長ホルモン値の調節の例示的な治
療的適用は以下のものを含む：
【０２４８】（１）ＰＤＥ１１の阻害及びそれゆえの減
少したプロラクチン（ＰＲＬ）値： ・電解質バランス ＰＲＬは腎臓のＮａ＋及びＫ＋排出を減少させる、それ
ゆえ減少されたＰＲＬは排出を増大させる／正常化する
であろう。したがって、抗高血圧としてのＰＲＬ値を減
少させる剤の使用。
【０２４９】・成長及び発達 ＰＲＬは上皮及び平滑筋細胞の増殖を刺激し、それゆ
え、減少したＰＲＬは細胞増殖を減少させる／正常化す
るであろう。それゆえ、多くの細胞増殖障害、例えば、
再狭窄及び良性前立腺過形成（ＢＰＨ）の治療における
ＰＲＬ値を減少させる剤の使用。減少したＰＲＬはＰＲ
Ｌ感受性癌成長、例えば、結腸直腸癌及び乳癌を妨げる
／減少させることにおける使用をも有するであろう（Ｐ
ＲＬは胸の成長及び乳汁分泌を促進することが知られ
る）。寿命と関連した減少したＰＲＬ、それゆえ、加齢
においてＰＲＬ値を減少させる剤の使用。
【０２５０】・内分泌／代謝 減少したＰＲＬはリン脂質合成を減少させる及び炭水化
物代謝を増大させるであろう、そしてそのことは成長／
体重増加の減少においてＰＲＬ値を減少させる剤の使用
（抗肥満）の証拠を支持する。 ・脳及び行為 減少したＰＲＬは母性行為を減少させるであろう。
【０２５１】・生殖 減少したＰＲＬは乳腺の成長及び乳汁分泌を減少させる
であろう。減少したＰＲＬは受精能、例えば、排卵及び
着床を減少させるであろう。それゆえ、女性避妊薬とし
てのＰＲＬ値を減少させる剤の使用。減少したＰＲＬは
受精能、すなわち、精母細胞の精子細胞への変換を減少
させるであろう。それゆえ、（受精能獲得の効果に加え
て）男性避妊薬としてのＰＲＬ値を減少させる剤の使
用。 ・性行為 （例えば、ＰＤＥ１１阻害を介した）減少したＰＲＬ
は： ・性的欲求を増大させる（衝動を増大させる）； ・性的覚醒を減少させる；及び ・オルガズムを減少させる／正常化するであろう。（例
えば、女性にＰＤＥ１１阻害剤又はアンタゴニストを提
供することにより）ＰＤＥ１１活性を減少させることは
前記女性において性的欲求を増大させる（衝動を増大さ
せる）であろう。したがって、ＰＤＥ１１阻害は女性の
性機能障害（ＦＳＤ）、例えば、性的欲求活動低下障害
（ＨＳＤＤ）を予防する又は治療することにおける使用
を有する。
【０２５２】（２）ＰＤＥ１１経路の高め及びそれゆえ
の増大したプロラクチン分泌：（上記（１）の下に示さ
れたような）上記の反対及び： ・免疫調節 ＰＲＬは免疫応答を高めることが示されている。それゆ
え、免疫応答を高めるためのＰＲＬ値を増大させる剤の
使用。 ・性行為（例えば、ＰＤＥ１１刺激を介した）増大した
ＰＲＬは： ・性的欲求を減少させる（衝動を減少させる）； ・性的覚醒を増大させる；及び ・オルガズムを増大させる／正常化させる であろう。（例えば、女性にＰＤＥ１１刺激剤、活性化
剤、エンハンサー又はアゴニストを提供することによ
り）ＰＤＥ１１活性を増大させることは前記女性におい
て性的覚醒を増大させる及びオルガズムを増大させる／
正常化するであろう。したがって、ＰＤＥ１１刺激は女
性の性機能障害（ＦＳＤ）、例えば、女性の性的覚醒障
害（ＦＳＡＤ）、女性のオルガズム障害（ＦＯＤ）又は
性的疼痛障害を予防する又は治療することにおける使用
を有する。
【０２５３】（３）ＰＤＥ１１の阻害及びそれゆえの増
大した成長ホルモン（ＧＨ）値：ＰＤＥ１１阻害は成長
ホルモン（ＧＨ）放出を高めうる。ＧＨは成長刺激、特
に骨成長に重要であるが、骨格成長の停止後も生涯を通
して持続し、そしてそれゆえ、維持に重要であると考え
られる、すなわち、ＧＨはタンパク質及び骨同化の、脂
肪分解の及び抗ナトリウム排泄増加性特性を有する（Ｍ
ｕｒｒａｙ ＆Ｓｈａｌｅｔ， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉ
ｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ． １： ９７５−９
０， ２０００）。それゆえ、ＧＨ値を増大させる剤は
加齢、骨粗しょう症、病的な肥満、心不全、大きな熱性
の傷害及びさまざまな急性及び慢性異化状態に関連した
もろさの治療における使用を有しうる。ＰＤＥ１１Ａ活
性を調節する剤を含む治療用調剤を投与するとき、上記
調剤は液体溶液又は懸濁物の形態で、錠剤又はカプセル
の形態で又は粉末、鼻の水滴又はエーロゾルの形態であ
りうる。調剤を作出するための本分野で周知の方法は、
例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｅｄ． Ｇｅｎｎａｒ
ｏ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅ
ａｓｔｏｎ， ＰＡ， ＵＳＡ， １８ｔｈｅｄ．，
１９９０）中に見られる。
【０２５４】引用文献 １）Ｄｕｖｉｌａｎｓｋｉ ＢＨ， Ｚａｍｂｒｕｎｏ
Ｃ， Ｓｅｉｌｉｃｏｖｉｃｈ Ａ， Ｐｉｓｅｒａ
Ｄ， Ｌａｓａｇａ Ｍ， Ｄｉａｚ ＭＣ， Ｂｅ
ｌｏｖａ Ｎ， Ｒｅｔｔｏｎ Ｖ ＆ ＭｃＣａｎｎ
ＳＭ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ
ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｒｏｌａｃｔｉｎ
ｒｅｌｅａｓｅ ｂｙ ｔｈｅ ａｄｅｎｏｈｙｐｏｐ
ｈｙｓｉｓ．（腺性下垂体によるプロラクチン放出の制
御における一酸化窒素の役割。）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ （１９９５）；９２（１）：１７０−４． ２）Ｂｏｌｅ−Ｆｅｙｓｏｔ Ｃ， Ｇｏｆｆｉｎ
Ｖ， Ｅｄｅｒｙ Ｍ，Ｂｉｎａｒｔ Ｎ ＆ Ｋｅｌ
ｌｙ ＰＡ． Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ（ＰＲＬ）ａｎｄ
ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ａｃｔｉｏｎｓ， ｓｉｇ
ｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ
ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ
ｉｎ ＰＲＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｎｏｃｋｏｕｔ
ｍｉｃｅ．（ＰＲＬ受容体ノックアウトマウスにおける
プロラクチン（ＰＲＬ）及びその受容体、活動、シグナ
ル伝達経路及び表現型。） Ｅｎｄｏｃｒ． Ｒｅｖ．
（１９９８）；１９（３）：２２５−６８．
【０２５５】３）Ｋｅｌｌｙ ＰＡ， Ｂｉｎａｒｔ
Ｎ， Ｌｕｃａｓ Ｂ， Ｂｏｕｃｈａｒｄ Ｂ ＆
Ｇｏｆｆｉｎ Ｖ． Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ
ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｂｓｅ
ｒｖｅｄ ｉｎ ｐｒｏｌａｃｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏ
ｒ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ．（プロラクチン受容
体ノックアウトマウスにおいて観察される多表現型の示
唆。） Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌ． （２００１）；２２（２）：１４０−５． ４）Ｍａｙｏ ＫＥ， Ｇｏｄｆｒｅｙ ＰＡ， Ｓｕ
ｈｒ ＳＴ， Ｋｕｌｉｋ ＤＪ ＆ Ｒａｈａｌ Ｊ
Ｏ． Ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉ
ｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ： ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ
ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．（成長ホルモン放出ホルモン：
合成及びシグナリング。） Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇ．
Ｈｏｒｍ． Ｒｅｓ． （１９９５）；５０： ３５
−７３．５）Ｍｕｒｒａｙ ＲＤ ＆ Ｓｈａｌｅｔ
ＳＭ． Ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ： ｃｕｒｒｅ
ｎｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．（成長ホルモン：今般の及
び将来の治療適用。）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｐｈ
ａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．（２０００）； １（５）：９
７５−９０．
【０２５６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Limited (EP (GB) only), Pfizer Inc. (All other States) <120> Use of agents that modulate PDE11A activity <130> PC22067A <150> GB 0204227.3 <151> 2002-02-22 <160> 9 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 132 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 1 aaggcagcca acatccctct ggtgtcagaa cttgccatcg atgacattca ttttgatgac 60 ttttctctcg acgttgatgc catgatcaca gctgctctcc ggatgttcat ggagctgggg 120 atggtacaga aa 132 <210> 2 <211> 132 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 2 ttccgtcggt tgtagggaga ccacagtctt gaacggtagc tactgtaagt aaaactactg 60 aaaagagagc tgcaactacg gtactagtgt cgacgagagg cctacaagta cctcgacccc 120 taccatgtct tt 132 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 3 tttctgtacc atccccagct ccatg 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 4 aaggcagcca acatccctct ggtgt 25 <210> 5 <211> 83 <212> DNA <213> mus musculus <400> 5 tcggaactgg ccatcgatga catccatttc gatgactttt cccttgatgt tgatgccatg 60 atcacagccg ctctacggat gtt 83 <210> 6 <211> 83 <212> DNA <213> mus musculus <400> 6 agccttgacc ggtagctact gtaggtaaag ctactgaaaa gggaactaca actacggtac 60 tagtgtcggc gagatgccta caa 83 <210> 7 <211> 10 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 atgacattca 10 <210> 8 <211> 10 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 ctcgacgttg 10 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ser Ala Ile Phe Asp Arg Asn Arg Lys Asp Glu Leu Pro Arg Leu 1 5 10 15
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｆｉｇ．１は、例示的なＰＤＥ１１Ａ遺伝子を
標的とする又はノックアウト（ＫＯ）構築物を描く図を
示し、それはマウスＰＤＥ１１Ａ配列での相同的組換え
を受け、そしてＡＴＧ出発部位が５７の位置で始まるヒ
トｃＤＮＡ配列のヌクレオチド５６０〜５７５に相当す
る遺伝子配列を、それをＬａｃＺＮｅｏ配列で置き換え
て、欠損する。上記遺伝子の欠損した部分はＰＤＥ１１
Ａの触媒ドメインをコードする配列を含む。ＬａｃＺ／
Ｎｅｏ配列を側面に置く相同性アームの配列は配列ＩＤ
番号：７及び配列ＩＤ番号：８と名づけられる。ＳＳは
上記遺伝子内のイントロンスプライス部位をいう。ｐＡ
はポリアデニル化シグナルをいう。
【図２】Ｆｉｇ．２Ａは、ＰＣＲ増幅による相当するマ
ウス遺伝子配列の取得における使用のためのＰＣＲプラ
イマー（配列ＩＤ番号：３及び４）を作出するのに使用
される例示的なヒトＰＤＥ１１Ａ配列（配列ＩＤ番号：
１及び２）を示す。Ｆｉｇ．２ＢはＦｉｇ．２Ａで示さ
れるプライマーを用いて作出された、マウスＰＤＥ１１
Ａ遺伝子ＰＣＲ産物を示す。これらの配列は、Ｆｉｇ．
１に示されるように、ＰＤＥ１１Ａを標的とする構築物
の相同性アームを設計するのに使用されうるマウスＰＤ
Ｅ１１Ａ配列の例である。
【図３】Ｆｉｇ．３はＰＤＥ１１ノックアウト（ＫＯ）
マウスの精巣におけるＰＤＥ１１ ｍＲＮＡの除去を示
すエチヂウムブロマイド染色したアガロースゲルを示
す。４の野生型（ＷＴ；＝ＷＴ１、ＷＴ２、ＷＴ３及び
ＷＴ４）及び４のＰＤＥ１１ノックアウトマウス（Ｋ
Ｏ；＝ＫＯ１、ＫＯ２、ＫＯ３及びＫＯ４）から抽出さ
れた５μｇの精巣トータルＲＮＡを逆転写、続いてＰＣ
Ｒにかけた。（挿入の部位にわたり設計された）ＰＤＥ
１１特定的プライマーを用いて、上記４の野生型サンプ
ルはインタクトなＰＤＥ１１転写産物の存在を示す。こ
の転写産物はＰＤＥ１１ノックアウトサンプルにおいて
は検出されない。β−アクチンコントロールはｃＤＮＡ
が等しくロードされることを示す。
【図４】Ｆｉｇ．４は、野生型（ＷＴ）動物（ｎ＝４）
に比較したＰＤＥ１１ノックアウト（ＫＯ）マウス（ｎ
＝４）の精巣における発現のダウンレギュレーションを
示す、１５遺伝子（後を参照のこと）を示すヒストグラ
ムを示す。上記ヒストグラムの棒は平均値であり、そし
て誤差棒は＋／−１標準偏差である。
【図５】Ｆｉｇ．５は、野生型（ＷＴ）動物（ｎ＝４）
に比較したＰＤＥ１１ノックアウト（ＫＯ）マウス（ｎ
＝４）の精巣における発現のアップレギュレーションを
示す、６の遺伝子（後を参照のこと）を示すヒストグラ
ムを示す。上記ヒストグラムの棒は平均値であり、そし
て誤差棒は＋／−１標準偏差である。
【図６】Ｆｉｇ．６は、ＰＤＥ１１ノックアウト（Ｋ
Ｏ）及び野生型（ＷＴ）マウスから得られた射精前の副
睾丸精子懸濁物における受精能獲得の程度を示す。受精
能獲得の範囲はクロロテトラサイクリン（ＣＴＣ）を用
いて計測され、そして受精能獲得の程度はコントロール
及びアデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ）−処理した
サンプルにおいて見積もられた。全てのデータは平均＋
平均標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として表される、ｎ＝
３、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１、スチューデントｔテス
ト）。ＰＤＥ１１ＫＯ動物から得られたコントロールの
射精前の精子はＷＴマウスから得られた精子と比較して
顕著に高い受精能獲得の範囲を示した（白色棒、Ｐ＜
０．００１、スチューデントｔテスト）。ＡＴＰ（２．
５ｍＭ）は１時間のインキュベーション後全てのマウス
精子サンプルにおいて受精能を獲得した精子の数を顕著
に増大させた（灰色棒、Ｐ＜０．００１、スチューデン
トｔテスト）、その一方でＡＴＰ（１．０ｍＭ）のみは
ＰＤＥ１１ＫＯマウスから得られた精子において受精能
を獲得した精子の数を顕著に増大させた（黒色棒、Ｐ＜
０．００１、スチューデントｔテスト）。
【図７】Ｆｉｇ．７ＡとＦｉｇ．７ＢはＰＤＥ１１Ａ改
変及び精子受精能獲得（男性）、性的欲求／衝動、性的
覚醒及びオルガズムへのその影響の間の関係を図表で示
す図を示す。Ｆｉｇ．７Ａは（例えば、ＰＤＥ１１Ａ阻
害又は除去による）ＰＤＥ１１Ａ活性における減少
（↓）はプロラクチン（ＰＲＬ）値における減少、成長
ホルモン（ＧＨ）値における増大（↑）、精子受精能獲
得における増大、性的欲求（衝動）における増大、性的
覚醒における減少、及びオルガズムにおける減少をもた
らすことを示す。Ｆｉｇ．７ＢはＰＤＥ１１Ａ活性にお
ける増大は上記と反対の効果を有することを示す。
【図８】Ｆｉｇ．７Ｂを示す。
【図９】Ｆｉｇ．８はアフィニティー精製したポリクロ
ーナル抗血清ＥＰＨ−３（免疫組織化学（ＩＨＣ）法１
−実施例を参照のこと）を用いたＰＤＥ１１Ａに関する
ヒト下垂体の免疫染色を示す。陽性染色は対染色におけ
る灰色に対して黒色で表れる；ＡＨ＝腺下垂体（下垂体
前葉）、ＮＨ＝神経下垂体（下垂体後葉）。
【図１０】Ｆｉｇ．９はアフィニティー−精製したポリ
クローナル抗血清ＥＰＨ−３（免疫組織化学（ＩＨＣ）
法２−実施例を参照のこと）を用いたＰＤＥ１１Ａにつ
いてのヒト下垂体（８３歳の男性）の免疫染色を示す。
陽性染色は黒色の沈殿物として表れる；ＡＦ＝好酸球、
Ｂ＝好塩基球。
【図１１】Ｆｉｇ．１０は（ＰＤＥ１１ノックアウト
（◆）及び野生型（□）のマウスの）年齢の傾向及びプ
ロラクチン値を示す図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/517 Ａ６１Ｋ 31/517 Ｃ０７Ｄ 403/04 Ｃ０７Ｄ 403/04 405/14 405/14 487/14 487/14 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ０７Ｍ 7:00 Ｃ０７Ｍ 7:00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 イアン デニス ハロウ イギリス国，ケント シーティー13 ９エ ヌジェイ，サンドウィッチ，ラムズゲート ロード，ファイザー グローバル リサ ーチ アンド ディベロップメント (72)発明者 ジェレミー ランフィア イギリス国，ケント シーティー13 ９エ ヌジェイ，サンドウィッチ，ラムズゲート ロード，ファイザー グローバル リサ ーチ アンド ディベロップメント (72)発明者 スティーブン チャールズ フィリップス イギリス国，ケント シーティー13 ９エ ヌジェイ，サンドウィッチ，ラムズゲート ロード，ファイザー グローバル リサ ーチ アンド ディベロップメント (72)発明者 クリストファー ピーター ウェイマン イギリス国，ケント シーティー13 ９エ ヌジェイ，サンドウィッチ，ラムズゲート ロード，ファイザー グローバル リサ ーチ アンド ディベロップメント Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA05 CA11 DA02 GA14 HA11 HA17 4C050 AA01 AA07 BB04 CC08 DD02 EE03 FF01 FF05 GG03 HH02 4C063 AA01 AA03 BB09 CC31 CC81 DD25 DD31 EE01 4C084 AA02 AA17 BA44 CA59 NA14 ZA812 ZA862 4C086 AA01 AA02 BC46 CB09 GA02 GA07 GA16 MA01 MA04 NA14 ZA81 ZA86

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＰＤＥ１１Ａ活性を調節する剤を含む、
    ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの精子受精能獲得を
    調節するための医薬組成物。
  2. 【請求項２】 ＰＤＥ１１Ａ活性を減少させる及びｉｎ
    ｖｉｖｏ又はｅｘｖｉｖｏの精子受精能獲得を増大さ
    せる、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 【請求項３】 前記剤はＰＤＥ１１Ａ活性を増大させる
    及びｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの精子受精能獲
    得を減少させる、請求項１に記載の医薬組成物。
  4. 【請求項４】 ＰＤＥ１１Ａ活性を調節する剤を含む、
    ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの精子受精能獲得を
    調節する医薬組成物。
  5. 【請求項５】 前記剤はＰＤＥ１１Ａ活性を減少させる
    及びｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの精子受精能獲
    得を増大させる、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. 【請求項６】 ＰＤＥ１１Ａ活性を増大させる剤を含
    む、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの精子受精能獲
    得を減少させる医薬組成物。
  7. 【請求項７】 ｅｘ ｖｉｖｏで使用される、男性の受
    精前能力剤としてのＰＤＥ１１Ａ活性を減少させる剤。
  8. 【請求項８】 ｉｎ ｖｉｖｏで使用される、男性の受
    精前能力剤としてのＰＤＥ１１Ａ活性を増大させる剤。
  9. 【請求項９】 ｅｘ ｖｉｖｏで使用される、男性の受
    精前能力剤としての精子受精能獲得を増大させる剤。
  10. 【請求項１０】 ｉｎ ｖｉｖｏで使用される、男性の
    受精前能力剤としての精子受精能獲得を減少させる剤。
  11. 【請求項１１】 ｉｎ ｖｉｖｏで使用される、男性の
    避妊剤としてのＰＤＥ１１Ａ活性を減少させる剤。
  12. 【請求項１２】 ｅｘ ｖｉｖｏで使用される、男性の
    避妊剤としてのＰＤＥ１１Ａ活性を増大させる剤。
  13. 【請求項１３】 ｉｎ ｖｉｖｏで使用される、男性の
    避妊剤としての精子受精能獲得を増大させる剤。
  14. 【請求項１４】 ｅｘ ｖｉｖｏで使用される、男性の
    避妊剤としての精子受精能獲得を減少させる剤。
  15. 【請求項１５】 ＰＤＥ１１Ａ活性を刺激する、活性化
    する、高める又は作用する剤を含む、女性の性機能障害
    （ＦＳＤ）を予防する又は治療するための医薬組成物。
  16. 【請求項１６】 前記女性の性機能障害（ＦＳＤ）は女
    性の性的覚醒障害（ＦＳＡＤ）、女性のオルガズム障害
    （ＦＯＤ）又は性的疼痛障害である、請求項１５に記載
    の医薬組成物。
  17. 【請求項１７】 ＰＤＥ１１Ａ活性を刺激する、活性化
    する、高める又は作用する剤を含む、女性の性機能障害
    （ＦＳＤ）の予防又は治療のための医薬組成物。
  18. 【請求項１８】 前記女性の性機能障害（ＦＳＤ）は女
    性の性的覚醒障害（ＦＳＡＤ）、女性のオルガズム障害
    （ＦＯＤ）又は性的疼痛障害である、請求項１７に記載
    の医薬組成物。
  19. 【請求項１９】 ＰＤＥ１１Ａ活性を阻害する、減少さ
    せる、不活性化する又は拮抗する剤を含む、女性の性機
    能障害（ＦＳＤ）を予防する又は治療するための医薬組
    成物。
  20. 【請求項２０】 前記女性の性機能障害（ＦＳＤ）は性
    的欲求活動低下障害（ＨＳＤＤ）である、請求項１９に
    記載の医薬組成物。
  21. 【請求項２１】 ＰＤＥ１１Ａ活性を阻害する、減少さ
    せる、不活性化する又は拮抗する剤を含む、女性の性機
    能障害（ＦＳＤ）の予防又は治療のための医薬組成物。
  22. 【請求項２２】 前記女性の性機能障害（ＦＳＤ）は性
    的欲求活動低下障害（ＨＳＤＤ）である、請求項２１に
    記載の医薬組成物。
  23. 【請求項２３】 前記剤はＣｉａｌｉｓ（ＩＣ３５
    １）、Ｅ４０２１又はＵＫ−２３５，１８７である、請
    求項１、２、１９又は２０のいずれか１に記載の医薬組
    成物又は請求項４、５、７、９、１１、１３、２１又は
    ２２のいずれか１に記載の医薬組成物。
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