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JP2003284574A - 核酸分子、ポリペプチド、ならびにアルツハイマー病の診断および処置を含むそれらの使用 - Google Patents

核酸分子、ポリペプチド、ならびにアルツハイマー病の診断および処置を含むそれらの使用

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JP2003284574A
JP2003284574A JP2002291568A JP2002291568A JP2003284574A JP 2003284574 A JP2003284574 A JP 2003284574A JP 2002291568 A JP2002291568 A JP 2002291568A JP 2002291568 A JP2002291568 A JP 2002291568A JP 2003284574 A JP2003284574 A JP 2003284574A
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api
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alzheimer
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antibody
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JP2002291568A
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キャスリン ダラム エル．
David L Friedman
エル． フリードマン デイビッド
Herath Mudiyanselage A C Herath
マディヤンセラジ アスラ チャンドラシリ ヘラス ヘラス
Lida H Kimmel
エイチ． キメル リダ
Rajesh Bhikhu Parekh
ビクフ パレク ラジェシュ
David M Potter
エム． ポッター デイビッド
Christian Rohlff
ロールフ クリスチャン
B Michael Silber
マイケル シルバー ビー．
Peter Jeffrey Snyder
ジェフリー スナイダー ピーター
Holly Daria Soares
ダリア ソアレス ホリー
Thomas R Stiger
アール． スティガー トーマス
P Trey Sunderland
トレイ サンダーランド ピー．
Robert Reid Townsend
レイド タウンゼンド ロバート
W Frost White
フロスト ホワイト ダブリュー．
Stephen A Williams
エイ． ウィリアムズ スティーブン
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Oxford Glycosciences UK Ltd
Pfizer Products Inc
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Oxford Glycosciences UK Ltd
Pfizer Products Inc
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、アルツハイマー病のスクリーニング、診断ま
たは予後のため、アルツハイマー病の処置の有効性をモ
ニターするため、ならびに薬物開発のための方法および
組成物を提供する。脳脊髄液、血清または血漿の二次元
電気泳動によって検出可能なアルツハイマー病関連特徴
（ＡＦ）が、記載される。本発明はさらに、脳脊髄液、
血清または血漿において検出可能なアルツハイマー病関
連タンパク質アイソフォーム（ＡＰＩ）、単離されたＡ
ＰＩを含む調製物、ＡＰＩに対して免疫特異的な抗体、
薬学的組成物、診断および治療方法、ならびにこれらを
含むかまたはこれらに基づくキットをさらに提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】（発明の詳細な説明） （発明の分野）本発明は、アルツハイマー病に対する素
因ならびにその発症および進行に関連するタンパク質お
よびタンパク質アイソフォームの同定、ならびにそれを
コードする遺伝子および核酸分子の同定、および、例え
ば、臨床スクリーニング、診断、処置ならびに薬物スク
リーニングおよび薬物開発のためのそれらの使用に関す
る。
【０００２】（発明の背景）アルツハイマー病（ＡＤ）
は、神経変性のますます一般的となっている形態であ
り、６５歳を超える人々の間の痴呆の全症例の約５０〜
６０％を占める。これは、現在、世界中で推定１，５０
０万人の人々を冒し、そしてその集団中の高齢の人々の
相対的な増加に起因して、その罹患率は、今後２０〜３
０年にわたって増加するであろう。アルツハイマー病
は、進行性の障害であり、臨床的症状の発症から死亡ま
で約８．５年の平均持続期間を有する。高等な精神機能
に関連する脳領域における錐体ニューロンの死およびニ
ューロンシナプスの損失は、その代表的な症候を生じ、
これは、認知機能の全体的かつ進行的な障害によって特
徴付けられる（Ｆｒａｎｃｉｓら、１９９９、Ｊ．Ｎｅ
ｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ
６６：１３７−４７）。現在、アルツハイマー病の診
断は、以下を必要とする：注意深い医学的な病歴および
身体の試験；詳細な神経学的および精神医学的試験；Ａ
Ｄを装う、根底にある代謝疾病および医学的疾病を排除
するための実験室血液研究；精神状態の評価および正式
の認知試験；ならびに脳のＣＴスキャンまたは磁気共鳴
画像法（Ｇｒｏｗｄｏｎ，ＪＨ．，１９９５，Ａｄｖａ
ｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ
Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．：Ｉｑｂａ
ｌ，Ｋ．，Ｍｏｒｔｉｍｅｒ，ＪＡ．，Ｗｉｎｂｌａ
ｄ，Ｂ．，Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ，ＨＭ編、Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅ
ｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄ
ｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．１９９５：１３９−１
５３）。これらの試験の時間消費的性質、それらの費
用、およびそれらの患者に対する不便性に起因して、ア
ルツハイマー病の陽性診断を導くかまたは鑑別診断から
のＡＤの排除を補助する、身体のサンプル（例えば、脳
脊髄液（ＣＳＦ）、血液または尿のサンプル）中の物質
の測定が非常に望ましい。ＣＳＦは脳を浴するので、そ
のタンパク質組成における変化は、この疾患に原因的ま
たは診断的に関連する脳タンパク質発現パターンにおけ
る変更を、最も正確に示し得る。
【０００３】アルツハイマー病についての現在の候補生
物マーカーとしては、以下が挙げられる：（１）プレセ
ニリン１（ＰＳ１）遺伝子、プレセニリン２（ＰＳ２）
遺伝子およびアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺
伝子における変異；（２）アポリポタンパク質Ｅ（Ａｐ
ｏＥ）の対立遺伝子の検出；ならびに（３）ＣＳＦ中の
アミロイドβ−ペプチド（Ａβ）、τタンパク質、およ
びニューロンスレッド（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｔｈｒｅａ
ｄ）タンパク質（ＮＴＰ）の濃度の変化。例えば、総説
については、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｉ
ｎｇ １９：１０９−１１６（１９９８）を参照のこ
と。ＰＳ１遺伝子、ＰＳ２遺伝子およびＡＰＰ遺伝子に
おける変異は、早期発症の家族性アルツハイマー病を示
す。しかし、早期発症の家族性アルツハイマー病は、比
較的まれであり；現在、世界中でわずか１２０の家族し
か、決定的変異を保持することが知られていない（Ｎｅ
ｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ １９：１０
９−１１６（１９９８））。ＡｐｏＥのｅ４対立遺伝子
の検出は、後期発症および散発性形態のアルツハイマー
病に相関することが示されている。しかし、ｅ４単独
は、アルツハイマー病の生物マーカーとして使用され得
ない。なぜなら、ｅ４は、アルツハイマー病に罹患して
いない多くの個体中に検出されており、そしてｅ４の非
存在は、アルツハイマー病を排除しないからである（Ｎ
ｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ １９：１
０９−１１６（１９９８））。
【０００４】アルツハイマー病のＣＳＦ中のＡβペプチ
ドＡβ４２の減少およびτタンパク質の増加は、アルツ
ハイマー病の存在と相関することが示されている（Ｎｅ
ｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ １９：１０
９−１１６（１９９８））。しかし、アルツハイマー病
の生物マーカーとしてのＡβ４２およびτタンパク質の
特異性および感度は、中程度である。例えば、診断的に
情報を与えるＣＳＦτタンパク質のカットオフレベルを
決定することは困難であった。また、死後の被験体のＣ
ＳＦ中のＮＴＰレベルの上昇が、アルツハイマー病の存
在と相関することが示されている（Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ １９：１０９−１１６（１
９９８））。従って、生存している被験体におけるアル
ツハイマー病の診断のための、高感度かつ特異的な生物
マーカーを同定する必要性が存在する。
【０００５】（発明の要旨） １．哺乳動物におけるアルツハイマー病のスクリーニン
グ、診断または予後のための方法、アルツハイマー病を
発症する危険のある哺乳動物を同定するための方法、お
よび／あるいはアルツハイマー病を有する哺乳動物に施
した治療の効果をモニターするための方法であって、上
記方法は、以下：上記哺乳動物由来の体液の試験サンプ
ルを、二次元電気泳動によって分析して、特徴の二次元
アレイを作製する工程であって、上記アレイは、少なく
とも１つの選択された特徴を含み、上記特徴の相対存在
比は、アルツハイマー病の存在、非存在、段階または重
症度に関連するか、あるいはアルツハイマー病の発症ま
たは経過を予測する、工程；および上記試験サンプル中
の選択された各特徴の存在比を、アルツハイマー病を有
さない１人以上の身体由来の体液中の選択された特徴の
存在比、あるいはアルツハイマー病を有さない被験体に
おける特徴についての予め決定された参照範囲、あるい
は上記試験サンプルにおける少なくとも１つの発現参照
特徴（ＥＲＦ）での存在比と比較する工程、を包含す
る、方法。
【０００６】２．前記体液が、脳脊髄液（ＣＳＦ）であ
る、項１に記載の方法。
【０００７】３．前記方法が、アルツハイマー病のスク
リーニングまたは診断のための方法であり、そして選択
された少なくとも１つの特徴の前記相対存在比が、アル
ツハイマー病の存在または非存在に関連する、項１また
は２に記載の方法。
【０００８】４．前記方法が、アルツハイマー病を有す
る被験体に施した治療の効果をモニターするための方法
であって、そして選択された少なくとも１つの特徴の前
記相対存在比が、アルツハイマー病の重症度に関連す
る、項１または２に記載の方法。
【０００９】５．前記工程（ｂ）が、前記サンプルにお
ける選択された各特徴の存在比を、アルツハイマー病を
有さない１つ以上の哺乳動物由来のＣＳＦにおいて選択
された特徴の存在比、またはアルツハイマー病を有さな
い哺乳動物における選択された特徴についての予め決定
された参照範囲と比較することを含む、項２に記載の方
法。
【００１０】６．前記工程（ａ）が、以下：
【００１１】
【化１０】 のアルツハイマー病関連特徴（ＡＦ）の１つ以上を定量
的に検出することを含む、項１または２に記載の方法。
【００１２】７．前記工程（ａ）が、ドデシル硫酸ナト
リウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）の後に、等電点電気泳動を含む、項１、２または
５に記載の方法。
【００１３】８．哺乳動物におけるアルツハイマー病の
スクリーニング、診断または予後のための方法、アルツ
ハイマー病を発症する危険のある哺乳動物を同定するた
めの方法、あるいはアルツハイマー病を有する哺乳動物
に施した治療の効果をモニターするための方法であっ
て、上記方法は、以下： （ａ）上記哺乳動由来の脳脊髄液のサンプル中の、以
下：
【００１４】
【化１１】 のアルツハイマー病関連タンパク質アイソフォーム（Ａ
ＰＩ）の少なくとも１つを定量的に検出する工程；およ
び（ｂ）上記アイソフォームまたは工程（ａ）において
検出したアイソフォームのレベルまたは量を、コントロ
ールと比較する工程、を包含する、方法。
【００１５】９．項８に記載の方法であって、ここで、
前記定量的に検出する工程が、前記サンプルの少なくと
も１つのアリコートを試験することを含み、上記試験す
ることが、以下： （ａ）上記アリコートを、予め選択されたＡＰＩに対し
て免疫特異的な抗体と接触させる工程； （ｂ）上記抗体と上記アリコート中の少なくとも１つの
種との間に生じる任意の結合を定量的に測定する工程；
および （ｃ）工程（ｂ）の結果を、コントロールと比較する工
程、を包含する、方法。
【００１６】１０．前記抗体がモノクローナル抗体であ
る、項９に記載の方法。
【００１７】１１．前記抗体がキメラである、項９に記
載の方法。
【００１８】１２．前記定量的に検出する工程が、複数
の抗体を有する複数のアリコートを、複数の予め選択さ
れたＡＰＩの定量的検出について試験することを含む、
項９に記載の方法。
【００１９】１３．前記抗体がモノクローナル抗体であ
る、項１２に記載の方法。
【００２０】１４．前記抗体がキメラである、項１２に
記載の方法。
【００２１】１５．調製物であって、以下：
【００２２】
【化１２】 から選択される単離されたアルツハイマー病関連タンパ
ク質アイソフォーム（ＡＰＩ）のうち少なくとも１つを
含む、調製物。
【００２３】１６．項１５に記載の調製物、他の試薬、
および使用のための指示書を含む、キット。
【００２４】１７．複数の前記調製物を含む、項１６に
記載のキット。
【００２５】１８．抗体であって、以下：
【００２６】
【化１３】 のアルツハイマー病関連タンパク質アイソフォーム（Ａ
ＰＩ）のうち１つに免疫特異的に結合し得る、抗体。
【００２７】１９．モノクローナル抗体である、項１８
に記載の抗体。
【００２８】２０．キメラ抗体である、項１８に記載の
抗体。
【００２９】２１．前記ＡＰＩの別のアイソフォームよ
りも高い親和性で上記ＡＰＩに結合する、項１８、１９
または２０に記載の抗体。
【００３０】２２．前記ＡＰＩの任意の他のアイソフォ
ームよりも高い親和性で上記ＡＰＩに結合する、項１８
に記載の抗体。
【００３１】２３．項１８に記載の抗体、他の試薬、お
よび使用のための指示書を含む、キット。
【００３２】２４．複数の前記抗体を含む、項２３に記
載のキット。
【００３３】２５．治療有効量の項１８に記載の抗体お
よび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成
物。
【００３４】２６．薬学的組成物であって、以下：項１
８に記載の抗体の治療有効量のフラグメントまたは誘導
体であって、上記フラグメントまたは誘導体は、上記抗
体の結合ドメインを含む、フラグメントまたは誘導体；
および薬学的に受容可能なキャリア、を含む、薬学的組
成物。
【００３５】２７．アルツハイマー病を処置する方法で
あって、このような処置を必要とする被験体に、以下：
【００３６】
【化１４】 のアルツハイマー病関連タンパク質アイソフォーム（Ａ
ＰＩ）の１つをコードする、治療有効量の核酸を投与す
る工程を包含する、方法。
【００３７】２８．アルツハイマー病を処置する方法で
あって、このような処置または予防を必要とする被験体
に、以下：
【００３８】
【化１５】 のアルツハイマー病関連タンパク質アイソフォーム（Ａ
ＰＩ）の１つ以上の機能を阻害する、治療有効量の核酸
または抗体を投与する工程を包含する、方法。
【００３９】２９．前記核酸が、ＡＰＩアンチセンス核
酸またはリボザイムである、項２７または２８に記載の
方法。
【００４０】３０．ＡＰＩ、ＡＰＩフラグメント、また
はＡＰＩ関連ポリペプチドと相互作用する因子をスクリ
ーニングする方法であって、上記方法は、以下： （ａ）ＡＰＩ、ＡＰＩの生物学的に活性な部分、または
ＡＰＩ関連ポリペプチドを、上記因子と接触させる工
程；および（ｂ）上記因子が、上記ＡＰＩ、上記ＡＰＩ
フラグメント、または上記ＡＰＩ関連ポリペプチドと相
互作用するか否かを決定する工程、を包含する、方法。
【００４１】３１．前記ＡＰＩ、前記ＡＰＩフラグメン
ト、または前記ＡＰＩ関連ポリペプチドが、細胞によっ
て発現される、項３０に記載の方法。
【００４２】３２．前記細胞が、組換えＡＰＩ、組換え
ＡＰＩフラグメント、または組換えＡＰＩ関連ポリペプ
チドを発現する、項３１に記載の方法。
【００４３】３３．ＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポリペプチ
ドの発現または活性を調節する因子についてスクリーニ
ングする方法であって、上記方法は、以下： （ａ） ＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポリペプチドを発現す
る細胞の第１の集団を、候補因子と接触させる工程； （ｂ）上記ＡＰＩまたは上記ＡＰＩ関連ポリペプチドを
発現する細胞の第２の集団を、コントロール因子と接触
させる工程；および （ｃ）上記第１および第２の細胞集団における、上記Ａ
ＰＩもしくは上記ＡＰＩ関連ポリペプチドまたは上記Ａ
ＰＩもしくは上記ＡＰＩ関連ポリペプチドをコードする
ｍＲＮＡのレベルを比較する工程、あるいは上記第１お
よび第２の細胞集団における、細胞のセカンドメッセン
ジャーの誘導のレベルを比較する工程、を包含する、方
法。
【００４４】３４．前記ＡＰＩまたは前記ＡＰＩ関連ポ
リペプチド、上記ＡＰＩまたは上記ＡＰＩ関連ポリペプ
チドをコードするｍＲＮＡ、あるいは前記細胞のセカン
ドメッセンジャーの前記レベルが、前記第２の細胞集団
よりも前記第１の細胞集団において大きい、項３３に記
載の方法。
【００４５】３５．前記ＡＰＩまたは前記ＡＰＩ関連ポ
リペプチド、上記ＡＰＩまたは上記ＡＰＩ関連ポリペプ
チドをコードするｍＲＮＡ、あるいは前記細胞のセカン
ドメッセンジャーの前記レベルが、前記第２の細胞集団
よりも前記第１の細胞集団において小さい、項３３に記
載の方法。
【００４６】３６．ＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポリペプチ
ドの発現または活性を調節する因子をスクリーニングま
たは同定する方法であって、上記方法は、以下： （ａ）スクリーニングすべき因子を、第１の哺乳動物ま
たは哺乳動物のグループに投与する工程； （ｂ）コントロール因子を、第２の哺乳動物または哺乳
動物のグループに投与する工程；ならびに （ｃ）上記第１および第２のグループにおける、上記Ａ
ＰＩもしくは上記ＡＰＩ関連ポリペプチド、または上記
ＡＰＩもしくは上記ＡＰＩ関連をコードするｍＲＮＡの
発現レベルを比較する工程、あるいは上記第１および第
２のグループにおける、細胞のセカンドメッセンジャー
の誘導のレベルを比較する工程、を包含する、方法。
【００４７】３７．前記哺乳動物が、アルツハイマー病
またはダウン症候群のための動物モデルである、項３６
に記載の方法。
【００４８】３８．前記ＡＰＩまたは前記ＡＰＩ関連ポ
リペプチド、上記ＡＰＩまたは上記ＡＰＩ関連ポリペプ
チドをコードするｍＲＮＡ、あるいは前記細胞のセカン
ドメッセンジャーの前記発現レベルが、前記第２のグル
ープよりも前記第１のグループにおいて大きい、項３６
または３７に記載の方法。
【００４９】３９．前記ＡＰＩまたは前記ＡＰＩ関連ポ
リペプチド、上記ＡＰＩまたは上記ＡＰＩ関連ポリペプ
チドをコードするｍＲＮＡ、あるいは前記細胞のセカン
ドメッセンジャーの前記発現レベルが、前記第２のグル
ープよりも前記第１のグループにおいて小さい、項３６
または３７に記載の方法。
【００５０】４０．前記第１および第２のグループにお
ける、前記ＡＰＩまたは前記ＡＰＩ関連ポリペプチド、
上記ＡＰＩまたは上記ＡＰＩ関連ポリペプチドをコード
するｍＲＮＡ、あるいは前記細胞のセカンドメッセンジ
ャーの前記レベルが、正常なコントロール哺乳動物にお
ける、上記ＡＰＩまたは上記ＡＰＩ関連ポリペプチド、
あるいは上記ＡＰＩまたは上記ＡＰＩ関連ポリペプチド
をコードする上記ｍＲＮＡのレベルとさらに比較され
る、項３９に記載の方法。
【００５１】４１．スクリーニングすべき前記因子の投
与が、前記第１のグループにおける上記ＡＰＩまたは前
記ＡＰＩ関連ポリペプチド、あるいは上記ＡＰＩまたは
前記ＡＰＩ関連ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮ
Ａ、あるいは前記細胞のセカンドメッセンジャーのレベ
ルを、前記第２のグループにおける上記ＡＰＩまたは上
記ＡＰＩ関連ポリペプチドあるいは上記ｍＲＮＡあるい
は上記細胞のセカンドメッセンジャーのレベルへと調節
する、項３９に記載の方法。
【００５２】４２．前記哺乳動物が、アルツハイマー病
を有するヒト被験体である、項３６に記載の方法。
【００５３】４３．ＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポリペプチ
ドと相互作用する因子をスクリーニングまたは同定する
方法であって、上記方法は、以下： （ａ）スクリーニングすべき因子を、上記ＡＰＩまたは
上記ＡＰＩ関連ポリペプチドと接触させる工程、および
（ｂ）存在する場合、上記因子と上記ＡＰＩまたは上記
ＡＰＩ関連ポリペプチドとの間の結合を定量的に検出す
る工程、を包含する、方法。
【００５４】４４．ＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポリペプチ
ドの活性を調節する因子をスクリーニングまたは同定す
る方法であって、上記方法は、以下： （ａ）第１のアリコートにおいて、スクリーニングすべ
き因子を、上記ＡＰＩまたは上記ＡＰＩ関連ポリペプチ
ドと接触させる工程、および（ｂ）上記第１のアリコー
トにおける上記ＡＰＩまたは上記ＡＰＩ関連ポリペプチ
ドの活性を、上記候補因子の添加後に、コントロールア
リコートにおける上記ＡＰＩまたは上記ＡＰＩ関連ポリ
ペプチドの活性、あるいは予め決定した参照範囲と比較
する工程、を包含する、方法。
【００５５】４５．前記ＡＰＩまたは前記ＡＰＩ関連ポ
リペプチドが、組換えタンパク質である、項４３または
４４に記載の方法。
【００５６】４６．前記ＡＰＩまたは前記ＡＰＩ関連ポ
リペプチドが、固体支持体上に固定されている、項４３
または４４に記載の方法。
【００５７】４７．被験体におけるアルツハイマー病の
スクリーニング、診断または予後のための方法、あるい
は被験体に投与した抗アルツハイマー病剤または治療の
効果をモニターするための方法であって、上記方法は、
以下： （ａ）以下：
【００５８】
【化１６】 から選択されるＡＰＩをコードするヌクレオチド配列に
相補的な１０個以上連続したヌクレオチドを含む、少な
くとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを、上記被験
体由来の生物学的サンプルから得たＲＮＡ、または上記
ＲＮＡからコピーしたｃＤＮＡと接触させる工程であっ
て、ここで、上記接触させる工程が、存在する場合、上
記プローブの上記ヌクレオチド配列へのハイブリダイズ
を可能にする条件下で起こる、工程； （ｂ）存在する場合、上記プローブと上記ヌクレオチド
配列との間のハイブリダイゼーションを検出する工程；
および （ｃ）存在する場合、工程（ｂ）において検出した上記
ハイブリダイゼーションを、コントロールサンプルにお
いて検出した上記ハイブリダイゼーション、または予め
決定した参照範囲と比較する工程、を包含する、方法。
【００５９】４８．前記工程（ａ）が、以下：
【００６０】
【化１７】 から選択されるＡＰＩをコードするヌクレオチド配列に
相補的な１０個以上連続したヌクレオチドを含む複数の
オリゴヌクレオチドプローブを、上記被験体由来の生物
学的サンプルから得られるＲＮＡ、または上記ＲＮＡか
らコピーされたｃＤＮＡと接触させることを含み、ここ
で、上記接触が、存在する場合、上記プローブの上記ヌ
クレオチド配列へのハイブリダイゼーションを可能にす
る条件下で起こる、項４７に記載の方法。
【００６１】４９．前記工程（ａ）が、前記ヌクレオチ
ド配列をＤＮＡアレイにハイブリダイズする工程を包含
し、ここで、上記アレイの１つ以上のメンバーが、異な
るＡＰＩをコードする複数のヌクレオチド配列に相補的
な前記プローブである、項４７に記載の方法。
【００６２】５０．リボザイムまたはアンチセンス核酸
であって、上記リボザイムまたはアンチセンス核酸は、
以下：
【００６３】
【化１８】 のアルツハイマー病関連タンパク質アイソフォーム（Ａ
ＰＩ）のうちの１つをコードする核酸を含む、リボザイ
ムまたはアンチセンス核酸。
【００６４】本発明は、アルツハイマー病のスクリーニ
ング、診断および処置のため、ならびにアルツハイマー
病の処置のための薬物のスクリーニングおよび開発のた
めの、方法および組成物を提供する。
【００６５】本発明の第１の局面は、アルツハイマー病
を同定するための方法を提供し、この方法は、２次元電
気泳動によってＣＳＦのサンプルを分析して、少なくと
も１つのアルツハイマー病に関連する特徴（Ａｌｚｈｅ
ｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
Ｆｅａｔｕｒｅ）（ＡＦ）（例えば、本明細書中に開
示される１以上のＡＦ）の存在またはレベルあるいはそ
れらの任意の組み合わせを検出する工程を包含する。こ
れらの方法はまた、臨床的スクリーニング、診断、治療
結果のモニタリング、特定の治療的処置に対して応答す
る可能性が最も高い患者の同定、薬物のスクリーニング
および開発、ならびに薬物処置のための新しい標的の同
定に適切である。
【００６６】本発明の第２の局面は、アルツハイマー病
の診断のための方法を提供し、この方法は、ＣＳＦのサ
ンプルにおいて、少なくとも１つのアルツハイマー病関
連タンパク質アイソフォーム（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ
ｄｉｓｅａｓｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｉｓｏｆｏｒｍ）（ＡＰＩ）（例えば、本明細書
中に開示される１以上のＡＰＩ）の存在またはレベルあ
るいはそれらの任意の組み合わせを検出する工程を包含
する。
【００６７】本発明の第３の局面は、ＡＰＩ（例えば、
本明細書中に開示されるＡＰＩ）に免疫特異的に結合し
得る抗体（例えば、モノクローナル抗体およびポリクロ
ーナル抗体、ならびにキメラ（二重特異性（ｂｉｓｐｅ
ｃｉｆｉｃ）抗体）を提供する。
【００６８】本発明の第４の局面は、単離されたＡＰＩ
（すなわち、ＡＰＩとは有意に異なる等電点または有意
に異なる見掛けの分子量を有するタンパク質またはタン
パク質アイソフォームを実質的に含まないＡＰＩ）を含
む調製物を提供する。
【００６９】本発明の第５の局面は、上記で列挙された
方法において使用され得、そして単一または複数の調製
物あるいは抗体を、他の試薬、標識、基質（必要な場
合）および使用の指示書と一緒に含み得る、キットを提
供する。このキットは、疾患の診断のために使用され得
るか、あるいは新規の診断剤および／または治療剤を同
定するためのアッセイであり得る。
【００７０】本発明の第６の局面は、アルツハイマー病
を処置する方法を提供し、この方法は、アルツハイマー
病を有する被験体においてＡＰＩの発現または活性（例
えば、酵素活性または結合活性）あるいは両方を調節
（例えば、上方調節または下方調節）する治療的有効量
の薬剤を、被験体に投与する工程を包含する。
【００７１】本発明の第７の局面は、ＡＰＩ、ＡＰＩア
ナログまたはＡＰＩ関連ポリペプチドの特徴（例えば、
発現あるいは酵素活性または結合活性）を調節（例え
ば、上方調節または下方調節）する薬剤についてスクリ
ーニングする方法を提供する。
【００７２】他の目的および利点は、以下の例示的な図
面と合わせて以下の詳細な説明の検討から明らかとな
る。
【００７３】（発明の詳細な説明）以下に詳細に記載さ
れる本発明は、例えば、哺乳動物被験体におけるアルツ
ハイマー病のスクリーニング、診断および処置に有用
な、ならびに薬物スクリーニングおよび薬物開発に有用
な、方法、組成物およびキットを提供する。本発明はま
た、アルツハイマー病を処置または予防するための、哺
乳動物被験体への治療組成物の投与を包含する。哺乳動
物被験体は、非ヒト哺乳動物であり得るが、好ましく
は、ヒト、より好ましくは、ヒト成体（すなわち、少な
くとも２１歳（より詳細には、少なくとも３５歳、少な
くとも５０歳、少なくとも６０歳、少なくとも７０歳、
または少なくとも８０歳）のヒト被験体）であり得る。
開示の明瞭化のためであり、かつ限定目的でないが、本
発明は、ＣＳＦサンプルの分析に関して記載される。し
かし、当業者が本発明の説明に基づいて理解するよう
に、以下に記載のアッセイおよび技術は、他の型のサン
プル（体液（例えば、血液、血清、血漿または唾液）、
アルツハイマー病を有するかまたは発症する危険性のあ
る被験体由来の組織サンプル（例えば、脳生検のような
生検）あるいはそれらのホモジネートを含む）に適用さ
れ得る。本発明の方法および組成物は、例えば、生存し
ている被験体のスクリーニング、診断および処置に有用
であるが、例えば、同疾患を発症する危険性のある被験
体の家族メンバーを同定するために、被験体の死後診断
にもまた使用され得る。
【００７４】以下の定義は、本開示の検討を補助するた
めに提供される。
【００７５】（５．１．定義）「特徴」とは、２Ｄゲル
中に検出されるスポットをいい、そして用語「アルツハ
イマー病に関連する特徴」（ＡＦ）とは、アルツハイマ
ー病を有さない被験体由来のサンプルと比較して、アル
ツハイマー病を有する被験体由来のサンプル中に差示的
に存在する特徴をいう。２Ｄゲルにおいて検出される特
徴またはスポットは、２Ｄゲル電気泳動、特に本明細書
に記載される好ましい技術（Ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用することによって決定される
ような、その等電点（ｐＩ）および分子量（ＭＷ）によ
って特徴付けられる。本明細書中で使用される場合、特
徴は、その特徴を検出するための方法（例えば、２Ｄ電
気泳動）が、第１のサンプルと第２のサンプルに適用さ
れた場合に異なるシグナルを与える場合に、第２のサン
プルに対して第１のサンプル中に「差示的に存在す
る」。ＡＦ（またはタンパク質アイソフォーム、すなわ
ち、前出の定義のようなＡＰＩ）は、その検出の方法
が、ＡＦまたはＡＰＩが第２のサンプルよりも第１のサ
ンプル中で多いことを示す場合か、あるいはＡＦまたは
ＡＰＩが、第１のサンプル中で検出可能でありかつ第２
のサンプル中で実質的に検出不可能である場合、第２の
サンプルに対して第１のサンプルにおいて「増加してい
る」。反対に、ＡＦまたはＡＰＩは、その検出の方法
が、ＡＦまたはＡＰＩが第２のサンプルよりも第１のサ
ンプル中で少ないことを示す場合か、あるいはＡＦまた
はＡＰＩが、第１のサンプル中で検出不可能でありかつ
第２のサンプル中で検出可能である場合、第２のサンプ
ルに対して第１のサンプルにおいて「減少している」。
【００７６】特に、２つのサンプル中の特徴の相対量
は、２つの工程において、その正規化されたシグナルを
参照して決定される。第１に、サンプル中の特徴の検出
の際に得られるシグナルは、以下の適切なバックグラウ
ンドパラメーターを参照して正規化される：例えば、
（ａ）分析されるサンプル中の総タンパク質（例えば、
ゲル上にロードされた総タンパク質）；（ｂ）試験され
る被験体の集団中の、好ましい技術の変動性の制限内の
発現参照特徴（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｒｅｆｅｒｅｎ
ｃｅ Ｆｅａｔｕｒｅ）（ＥＲＦ）（すなわち、その量
が実質的に不変である特徴）（例えば、以下に開示され
るＥＲＦ）、または、（ｃ）より好ましくはサンプル中
の全てのタンパク質の各々の合計として検出される総シ
グナル。
【００７７】第２に、１つのサンプルまたはサンプルセ
ットにおける特徴についての正規化されたシグナルを、
第２のサンプル（またはサンプルセット）に対して第１
のサンプル（またはサンプルセット）において「差示的
に存在する」特徴を同定するために、別のサンプルまた
はサンプルセットにおける同じ特徴についての正規化さ
れたシグナルと比較する。
【００７８】「〜倍の変化」は、「〜倍の増加」および
「〜倍の減少」を含み、そして第２のサンプル（または
サンプルセット）と比較した、第１のサンプルまたはサ
ンプルセットにおけるＡＦの量の相対的な増加または減
少、あるいはポリペプチド（例えば、前出で定義したよ
うなＡＰＩ）の発現または活性の相対的な増加または減
少をいう。ＡＦまたはポリペプチドの〜倍の変化は、観
察される増加または減少が、使用される技術に依存して
変化するにもかかわらず、当業者に公知の任意の技術に
よって測定され得る。好ましくは、〜倍の変化は、本明
細書中以下の実施例に記載にされるように決定される。
【００７９】「アイソフォーム」および「タンパク質ア
イソフォーム」とは、ポリペプチドをいい、そして、比
較された１以上のポリペプチド配列によって、ならびに
２Ｄゲル電気泳動、特に本明細書中に記載のような好ま
しい技術によって決定されるようなｐＩおよびＭＷをさ
らに参照することによって、本明細書中で特徴付けられ
る。しかし、本明細書中で使用される場合、用語「アイ
ソフォーム」は、以下に規定されるような改変体、およ
びより一般的には、本明細書中で同定される特定の特徴
に相関し得るポリペプチド配列をいう改変体の両方を含
み、その結果、両方の推定／野生型ポリペプチドおよび
その任意の改変体の両方が、本発明の文脈におけるこの
用語の使用によって意図される。
【００８０】図２は、特徴の特徴付け、および特徴とタ
ンパク質アイソフォームとの関係を示すフローチャート
である。特徴は、そのｐＩおよびＭＷに関連する特定の
ペプチド配列を有するタンパク質アイソフォームとして
か、またはそのｐＩおよびＭＷに関連する特定のペプチ
ド配列を有するタンパク質アイソフォームによって、さ
らに特徴付けられ得る。本明細書中に示すように、特徴
は、好ましい技術を使用して識別可能なｐＩおよびＭＷ
を有するが、別個のペプチド配列を含む１以上のタンパ
ク質アイソフォームを含み得る。このタンパク質アイソ
フォームのペプチド配列は、このようなペプチド配列を
含む以前に同定されたタンパク質について、データベー
スを検索するために使用され得る。以前に同定されたタ
ンパク質について、この以前に同定されたタンパク質お
よび／またはそのタンパク質ファミリーのメンバーを認
識し得る市販の抗体が存在するか否かを確認し得る。
【００８１】本明細書中で使用される場合、「改変体」
とは、単一の遺伝子または関連の遺伝子のファミリー内
の遺伝子配列由来の遺伝子によってコードされるポリペ
プチドファミリーのメンバーであり、かつｐＩまたはＭ
Ｖあるいは両方において異なるポリペプチドをいう。こ
のような改変体は、それらのアミノ酸組成において異な
り得（例えば、選択的ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡプロ
セシング（例えば、選択的スプライシングまたは限定さ
れたタンパク質分解）の結果として）、そしてさらに、
または代替的に、差示的な翻訳後修飾（例えば、グリコ
シル化、アシル化、リン酸化）から生じ得る。
【００８２】「アルツハイマー病関連タンパク質アイソ
フォーム」（ＡＰＩ）とは、アルツハイマー病を有さな
い被験体由来のサンプルと比較して、アルツハイマー病
を有する被験体由来のサンプル中に差示的に存在するタ
ンパク質アイソフォーム、またはアルツハイマー病を有
さない被験体由来のサンプルと比較して、アルツハイマ
ー病を有する被験体由来のサンプル中に差示的に存在す
るタンパク質アイソフォームをいう。本明細書中で使用
される場合、上記の特徴を検出するための方法（例え
ば、２Ｄ電気泳動またはイムノアッセイ）が、第１のサ
ンプルと第２のサンプルに適用された場合に異なるシグ
ナルを与える場合に、ＡＰＩが、第２のサンプルに対し
て第１のサンプル中に「差示的に存在する」（ＡＦの定
義を参照のこと）。代表的に、ＡＰＩは、ＡＦのアミノ
酸配列決定によって同定または特徴付けられる（図
２）。
【００８３】ＡＦ、ＡＰＩ、またはＡＰＩ関連ポリペプ
チドの発現または活性に関して「調節する」とは、Ａ
Ｆ、ＡＰＩ、またはＡＰＩ関連ポリペプチドの発現また
は活性の任意の変化（例えば、上方調節または下方調
節、増大または減少）をいう。本開示に基づいて、当業
者は、このような調節が当業者に公知のアッセイによっ
て決定され得ることを理解する。
【００８４】「ＡＰＩアナログ」とは、ＡＰＩと類似ま
たは同一の機能を保持するが、ＡＰＩのアミノ酸配列と
類似または同一のアミノ酸配列を必ずしも含む必要はな
いか、またはＡＰＩの構造と類似または同一の構造を保
持する、ポリペプチドをいう。本明細書中で使用される
場合、ポリペプチドのアミノ酸配列は、それが、以下の
基準の少なくとも１つを満足する場合に、ＡＰＩのポリ
ペプチドに「類似」する：（ａ）そのポリペプチドが、
ＡＰＩのアミノ酸配列に少なくとも３０％（より好まし
くは、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくと
も４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少な
くとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、
少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５
％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少な
くとも９９％）同一であるアミノ酸配列を有する；
（ｂ）そのポリペプチドが、ＡＰＩの少なくとも５アミ
ノ酸残基（より好ましくは、少なくとも１０アミノ酸残
基、少なくとも１５アミノ酸残基、少なくとも２０アミ
ノ酸残基、少なくとも２５アミノ酸残基、少なくとも４
０アミノ酸残基、少なくとも５０アミノ酸残基、少なく
とも６０アミノ酸残基、少なくとも７０アミノ酸残基、
少なくとも８０アミノ酸残基、少なくとも９０アミノ酸
残基、少なくとも１００アミノ酸残基、少なくとも１２
５アミノ酸残基、または少なくとも１５０アミノ酸残
基）をコードするヌクレオチド配列にストリンジェント
条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によって
コードされる；または（ｃ）そのポリペプチドが、ＡＰ
Ｉをコードするヌクレオチド配列に少なくとも３０％
（より好ましくは、少なくとも３５％、少なくとも４０
％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも
５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なく
とも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少
なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５
％、または少なくとも９９％）同一であるヌクレオチド
配列によってコードされる。本明細書中で使用される場
合、ＡＰＩの構造に「類似の構造」を有するポリペプチ
ドとは、ＡＰＩの二次構造、三次構造または四次構造に
類似の二次構造、三次構造または四次構造を有するポリ
ペプチドをいう。ポリペプチドの構造は、当業者に公知
の方法（Ｘ線結晶学、核磁気共鳴、および結晶学的電子
顕微鏡を含むが、これらに限定されない）によって決定
され得る。
【００８５】「ＡＰＩ融合タンパク質」とは、（ｉ）Ａ
ＰＩ、ＡＰＩフラグメント、ＡＰＩ関連ポリペプチドま
たはＡＰＩ関連ポリペプチドのフラグメントのアミノ酸
配列、および（ｉｉ）異種ポリペプチド（すなわち、非
ＡＰＩ、非ＡＰＩフラグメントまたは非ＡＰＩ関連ポリ
ペプチド）のアミノ酸配列を含むポリペプチドをいう。
【００８６】「ＡＰＩホモログ」とは、ＡＰＩのアミノ
酸配列に類似のアミノ酸配列を含むが、ＡＰＩと類似ま
たは同一の機能を必ずしも保持しないポリペプチドをい
う。
【００８７】「ＡＰＩオルソログ」とは、（ｉ）ＡＰＩ
のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を含み、そして
（ｉｉ）ＡＰＩの機能と類似または同一の機能を保持す
る、非ヒトポリペプチドをいう。
【００８８】「ＡＰＩ関連ポリペプチド」とは、ＡＰＩ
ホモログ、ＡＰＩアナログ、ＡＰＩの改変体、ＡＰＩオ
ルソログ、またはそれらの任意の組み合わせをいう。
【００８９】「キメラ抗体」とは、異なる部分が異なる
動物種由来の分子（例えば、ヒト免疫グロブリン定常領
域およびマウスｍＡｂ由来の可変領域を有する分子）を
いう（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１
６，５６７号；およびＢｏｓｓら、米国特許第４，８１
６，３９７号（これらは、その全体が参考として本明細
書中に援用される）を参照のこと）。
【００９０】「誘導体」とは、アミノ酸残基の置換、欠
失または付加の導入によって変更された第２のポリペプ
チドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをいう。誘導体
ポリペプチドは、その第２のポリペプチドと類似または
同一の機能を保持する。
【００９１】「フラグメント」とは、第２のポリペプチ
ドのアミノ酸配列の少なくとも５アミノ酸残基（好まし
くは、少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも１５ア
ミノ酸残基、少なくとも２０アミノ酸残基、少なくとも
２５アミノ酸残基、少なくとも４０アミノ酸残基、少な
くとも５０アミノ酸残基、少なくとも６０アミノ酸残
基、少なくとも７０アミノ酸残基、少なくとも８０アミ
ノ酸残基、少なくとも９０アミノ酸残基、少なくとも１
００アミノ酸残基、少なくとも１２５アミノ酸残基、少
なくとも１５０アミノ酸残基、少なくとも１７５アミノ
酸残基、少なくとも２００アミノ酸残基、または少なく
とも２５０アミノ酸残基）のアミノ酸配列を含む、ペプ
チドまたはポリペプチドをいう。ＡＰＩのフラグメント
は、第２のポリペプチドの機能的活性を保持してもよ
く、保持しなくてもよい。
【００９２】２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列
の「同一性パーセント」は、最適な比較の目的のために
配列を整列し（例えば、他の配列との最良なアラインメ
ントのためにいずれかの配列にギャップが導入され得
る）そして対応する位置でアミノ酸残基またはヌクレオ
チドを比較することによって決定され得るかまたは一般
的に決定される。「最良なアライメント」は、最も高い
同一性パーセントを生じる２つの配列のアライメントで
ある。同一性パーセントは、比較される配列における同
一のアミノ酸残基またはヌクレオチドの数によって決定
される（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の
総数×１００）。
【００９３】２つの配列間の同一性パーセントの決定
は、当業者に公知の数学的アルゴリズムを使用して達成
され得る。２つの配列を比較するための数学的アルゴリ
ズムの例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１
９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８７：２２６７−２２６８のアルゴリズムであり、
これは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９
３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９０：５８７３−５８７７に記載のように改変されてい
る。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴプログラ
ムおよびＸＢＬＡＳＴプログラムは、このようなアルゴ
リズムを組み込んでいる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索
を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード
長＝１２を用いて実行し、本発明の核酸分子に相同なヌ
クレオチド配列を獲得し得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検
索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード
長＝３を用いて実行し、本発明のタンパク質分子に相同
なアミノ酸配列を獲得し得る。比較目的のためにギャッ
プが導入されたアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅ
ｄ ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−
３４０２に記載されるように利用し得る。あるいは、Ｐ
ＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いて、分子間の距離関係を検出す
る繰り返しの検索を実行し得る（同書）。ＢＬＡＳＴ、
Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプ
ログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例え
ば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパ
ラメーターを使用し得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃ
ｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。
【００９４】配列を比較するために利用される数学的ア
ルゴリズム別の例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，
ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。ＧＣ
Ｇ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であ
るＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）は、この
ようなアルゴリズムを組み込んでいる。当該分野で公知
の配列分析のための他のアルゴリズムとしては、Ｔｏｒ
ｅｌｌｉｓおよびＲｏｂｏｔｔｉ（１９９４）Ｃｏｍｐ
ｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，１０：３−５；に記
載のようなＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ；ならびにＰ
ｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４−８
に記載のＦＡＳＴＡが挙げられる。ＦＡＳＴＡにおいて
は、ｋｔｕｐが、検索の感度および速度を設定する制御
オプションである。
【００９５】「診断」とは、診断、予後、モニタリン
グ、特徴付け、患者（臨床試験の参加者を含む）の選
択、および特定の障害を有する危険性のある患者の同
定、または特定の治療的処置に対する患者の応答を評価
もしくはモニタリングするための、特定の治療的処置に
応答する可能性が最も高い患者の同定をいう。
【００９６】「処置」とは、治療、予防（ｐｒｅｖｅｎ
ｔｉｏｎ）および予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）をい
い、特に、患者が罹患している場合は、虚弱または病気
の予防（予防）または治療のいずれかのための、患者に
関する医薬の投与または医学的手順の実施をいう。
【００９７】「薬剤」とは、全て本発明に従って、薬学
的組成物および診断組成物を調製するために使用され得
る全ての材料、または化合物、核酸、ポリペプチド、フ
ラグメント、アイソフォーム、改変体、またはこのよう
な目的のために独立して使用され得る他の材料であり得
る全ての材料をいう。
【００９８】「脳脊髄液」（ＣＳＦ）とは、Ｐｈｙｓｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｐｒａｃｔｉｅ（Ｊ．Ｂ．Ｗｅｓｔ編、Ｗｉｌｌｉａ
ｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ
１９８５）に記載のような、中枢神経系の大半を取り
囲む液体をいう。ＣＳＦには、脳室ＣＳＦおよび腰椎Ｃ
ＳＦが含まれる。
【００９９】（５．２．アルツハイマー病関連の特徴
（ＡＦ））本発明の１つの局面において、アルツハイマ
ー病のスクリーニング、処置または診断のために１以上
のアルツハイマー病関連の特徴（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’
ｓＤｉｓｅａｓｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｆｅａｔｕ
ｒｅｓ）（ＡＦ）の発現を検出または定量するために、
２次元電気泳動を使用して、被験体（好ましくは、生存
している被験体）由来のＣＳＦを分析する。
【０１００】限定のためではなく例示のために、好まし
い技術を使用して、アルツハイマー病を有する被験体由
来の多くのサンプルおよびアルツハイマー病を有さない
被験体由来の多くのサンプルを、２次元電気泳動によっ
て分離し、そして得られたゲルの蛍光デジタル画像を、
選択された代表的な一次マスターゲルの画像に一致させ
る。このプロセスによって、そのｐＩおよびＭＷによっ
て特徴付けられる任意のゲルの特徴が同定され、そして
研究の任意のゲルで試験されることが可能になる。特
に、所定の特徴に存在するタンパク質の量を、各ゲルに
おいて測定し得る：この特徴の豊富さは、類似のサンプ
ルからのゲル（例えば、アルツハイマー病を有する被験
体由来のサンプルからのゲル）中で平均され得る。最後
に、統計的分析を、２つ以上のサンプルセットを相互に
比較するために、このように作製されたサンプルセット
で実施し得る。
【０１０１】本明細書中で使用される場合、「２次元電
気泳動」（２Ｄ−電気泳動）は、等電点電気泳動、その
後の変性電気泳動を含む技術を意味し；これは、複数の
分離されたタンパク質を含む２次元（２Ｄ−ゲル）を生
じる。好ましくは、変性電気泳動の工程は、ドデシル硫
酸ナトリウムの存在下でのポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用する。国際出願番号９
７ＧＢ３３０７（ＷＯ９８／２３９５０として公開され
ている）および米国特許第６，０６４，６５４号（両方
とも１９９７年１２月１日に出願され、これらの各々
は、特に２３〜３５頁のプロトコルに関連して、その全
体が参考として本明細書中に援用される）に記載のよう
な、非常に正確で、かつ自動化可能な方法および装置
（「好ましい技術（ｔｈｅ Ｐｒｅｆｅｒｅｄ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ）」）が、特に好ましい。手短に言う
と、好ましい技術は、生物学的サンプル中の生体分子
（例えば、タンパク質（糖タンパク質を含む））の同
定、選択および特徴付けのための、効率的なコンピュー
タ支援方法および装置を提供する。２次元アレイは、そ
れらの電気泳動移動度および等電点に従って、２次元ゲ
ル上で生体分子を分離することによって生成される。ア
レイのコンピュータ作成デジタルプロフィールが作成さ
れ、これは、この２次元アレイ中に検出された複数の生
体分子の同定、見かけの分子量、等電点、および相対量
を示し、これによって、複数の生物学的サンプル由来の
プロフィールのコンピュータ媒介比較、および目的の分
離されたタンパク質のコンピュータ援用切り出しが可能
になる。
【０１０２】蛍光標識したタンパク質を検出するための
特定のスキャナは、ＷＯ９６／３６８８２およびＤａｖ
ｉｄ Ａ．Ｂａｓｉｊｉの博士論文（表題「Ｄｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐ
ｕｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｃａｎｎｅｒ Ｅ
ｍｐｌｏｙｉｎｇ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｅｆｌｅｃｔ
ｉｏｎ Ｏｐｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｓｅ−ｓｅｎｓ
ｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（Ｔｏｔａｌ Ｉｎｔ
ｅｒｎａｌ Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐ
ｈｏｒｅｓｉｓ）」、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗ
ａｓｈｉｎｇｔｏｎ（１９９７）、Ｄｉｓｓｅｒｔａｔ
ｉｏｎ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌの第５８巻／１２−Ｂ、６６８６頁）（それらの各
々の内容は、参考として本明細書中に援用される）に記
載される。これらの文献は、高速での自動化された一体
型の操作のために特別に設計された画像スキャナを記載
する。このスキャナは、蛍光色素または銀染色で染色さ
れたゲルを画像化し得、そして蛍光体スクリーンを保存
し得る。Ｂａｓｉｊｉの論文は、レーザー散乱または均
一な蛍光に起因するベースラインノイズから変調された
蛍光を識別するための、位相感応検出システムを提供す
るが、このスキャナはまた、非位相感応モードで操作さ
れ得る。この位相感応検出能力は、従来の蛍光画像化シ
ステムと比較して、装置の感度を１オーダー以上上昇す
る。この上昇された感度は、上流の装置にロードするサ
ンプル調製物を減少し、一方、増強された画像の質によ
って、そのプロセスの下流の画像分析が単純化される。
【０１０３】より非常に好ましいスキャナは、Ａｐｏｌ
ｌｏ ２スキャナ（ＯｘｆｏｒｄＧｌｙｃｏｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）であり、これは、上記の
スキャナの改変されたバージョンである。Ａｐｏｌｌｏ
２スキャナにおいて、ゲルは、スキャナを通して、正
確な親ねじ（ｌｅａｄ−ｓｃｒｅｗ）駆動システム上に
輸送される。これは、Ｂａｓｉｊｉの論文に記載される
ベルト駆動システム上にガラスプレートを重ねることよ
りも好ましい。なぜなら、これは、画像化光学を通して
ゲルを正確に輸送する再現可能な手段を提供するからで
ある。
【０１０４】Ａｐｏｌｌｏ ２スキャナにおいて、ゲル
は、既知の位置にガラスプレートを堅く保持する３つの
アライメントストップに対して固定される。これを上記
の正確な輸送システムと組み合わせて行うことによっ
て、ゲルの絶対位置が、予測および記録され得る。これ
は、ゲル上の各特徴の座標が、より正確に決定され、そ
して所望の場合に、その特徴を切り出すための切断ロボ
ットに連結されることを保証する。Ａｐｏｌｌｏ ２ス
キャナにおいて、ゲルを保持するキャリアは、画像位置
を補正するために使用される、４つの内蔵蛍光マーカー
を有する。これらのマーカーは、スキャニングが正確に
実行されたことを確かめる、精度管理特徴である。
【０１０５】Ｂａｓｉｊｉの論文に記載されるスキャナ
と比較して、Ａｐｏｌｌｏ ２スキャナの光学成分は反
転される。Ａｐｏｌｌｏ ２スキャナにおいて、レーザ
ー、ミラー、導波管および他の光学成分は、スキャンさ
れるガラスプレートの上にある。Ｂａｓｉｊｉの論文に
記載されるスキャナは、下部にこれらの成分を有する。
Ａｐｏｌｌｏ ２スキャナにおいて、ガラスプレート
は、スキャナゲルのサイド下方にマウントされ、それ
故、光路長は、ガラスプレートを通ったままである。こ
れを行うことによって、ガラスプレートから離れ得るゲ
ルの任意の粒子は、光学内よりもむしろ装置の基部に落
下する。これは、このシステムの機能性に影響を及ぼさ
ずに、その信頼性を増加する。
【０１０６】Ａｐｏｌｌｏ ３スキャナは、さらにより
好ましい。ここでは、シグナル出力は、いかなるピーク
飽和もシグナルの平方根符号化も伴わずに、完全１６ビ
ットデータにデジタル化される。補償アルゴリズムもま
た、スキャニングビームの路に沿って検出感度における
任意の変動を補正するために適用されている。この変動
は、光学における異常および導波管にわたる補正効率に
おける差異に起因する。較正は、全体の均一蛍光を用い
てパースペクスプレートを使用して行われる。このプレ
ートのスキャンから受けるデータを使用して、各ピクセ
ルレベルから標的レベルまでシグナルを増加するために
必要とされる増倍因子を決定する。次いで、これらの因
子を、ゲルの引き続くスキャンにおいて使用し、任意の
内部光学変動を除去する。
【０１０７】上記のように、「特徴」とは、２Ｄゲル中
に検出されるスポットをいい、そして用語「アルツハイ
マー病関連の特徴」（ＡＦ）とは、アルツハイマー病を
有さない被験体由来のサンプル（例えば、ＣＳＦのサン
プル）と比較して、アルツハイマー病を有する被験体由
来のサンプル（例えば、ＣＳＦのサンプル）中に差示的
に存在する特徴をいう。
【０１０８】本発明の局面に従って、本明細書中に開示
されるＡＦは、アルツハイマー病を有さない被験体由来
のＣＳＦサンプルに対して、アルツハイマー病を有する
被験体由来のＣＳＦサンプルを比較することによって同
定された。アルツハイマー病を有さない被験体には、既
知の疾患または状態を有さない被験体（正常な被験体）
およびアルツハイマー病以外の疾患（神経学的疾患およ
び神経変性疾患を含む）を有する被験体が含まれる。
【０１０９】ＡＦの２つのグループは、好ましい技術の
方法および装置によって同定された。第１のグループ
は、アルツハイマー病を有さない被験体のＣＳＦと比較
した場合に、アルツハイマー病を有する被験体のＣＳＦ
中で減少されるＡＦからなる。これらのＡＦは、表Ｉに
提供されるような、見かけの分子量（ＭＷ）および等電
点（ｐＩ）によって記載される。
【０１１０】（表Ｉ．アルツハイマー病を有する被験体
のＣＳＦにおいて減少されたＡＦ） （ａ）マスターグループ分析から同定されたＡＦ）
【０１１１】
【表１ａ】 ＊所定のｐ値を算定するために使用した統計技術は、各
ｐ値についての脚注によって示される。このグループ分
析に使用した統計技術は、ＡＤを有する患者とＡＤを有
さないコントロール患者との間の比較であった。分析
は、（１）年齢および性別を制御する線形モデル；
（２）段階的な多価線形弁別分析；（３）最隣接ならび
に（４）縦方向の分析。
【０１１２】（（ｂ）表Ｉ（ａ）および表ＩＩ（ａ）の
タンパク質と組み合わせて使用され得るマスターグルー
プ分析によって同定されたＡＦ）
【０１１３】
【表１ｂ】 ＊所定のｐ値を算定するために使用した統計技術は、各
ｐ値についての脚注によって示される。このグループ分
析に使用された統計技術は、以下であった、（１）年齢
および性別を制御する線形モデル；（２）分類ツリー；
（３）ロジスティク回帰分析ならびに（４）縦方向の分
析。＃ ここに報告される〜倍の変化は、年齢および性別につ
いての調整の前に算定した変化である。
【０１１４】（（ｃ）表Ｉ（ａ）および表ＩＩ（ａ）の
タンパク質と組み合わせて使用し得るプールされたゲル
の分析によって同定されたＡＦ）
【０１１５】
【表１ｃ】 ＃これらの特徴は、アルツハイマーのＣＳＦと正常ＳＣ
Ｆとの間で、平均強度の少なくとも２倍の差異を有する
ことを基準にして有意である（すなわち、少なくとも２
倍の変化の閾値）、示唆的な存在を有するとして同定さ
れた。
【０１１６】第２群は、アルツハイマー病に罹患してい
ない被験体のＣＳＦと比較して、アルツハイマー病に罹
患する被験体のＣＳＦにおいて増加したＡＦからなる。
これらのＡＦは、表ＩＩに提供されるように見かけの分
子量（ＭＷ）および等電点（ｐＩ）によって記載され得
る。
【０１１７】
【表２】 任意の所定のＡＦについて、アルツハイマー病に罹患し
ていない被験体由来のＣＳＦの分析で得られるシグナル
と比較してアルツハイマー病に罹患する被験体由来のＣ
ＳＦの分析で得られるシグナルは、使用される特定の分
析プロトコルおよび検出技術に依存する。従って、当業
者は、本記載に基づいて、任意の研究室が、使用する分
析プロトコルおよび検出技術に従ってアルツハイマー病
に罹患していない被験体における任意のＡＦに対する適
切な参照範囲を達成し得ることを理解する。特に、アル
ツハイマー病に罹患していることが既知の被験体由来の
少なくとも１つの陽性コントロールＣＳＦサンプルまた
はアルツハイマー病に罹患していないことが既知の被験
体由来の少なくとも１つの陰性コントロールＣＳＦサン
プル（そして、より好ましくは陽性コントロールサンプ
ルと陰性コントロールサンプルとの両方）は、分析され
る試験サンプルの各バッチに含まれる。１つの実施形態
において、特性の発現レベルは、バックグランド値と比
較して決定され、イメージの近位領域から得られるシグ
ナルのレベルとして規定され、このイメージは、（ａ）
問題の特定の特性に対して等しい領域であり；そして
（ｂ）実質的に認識可能なタンパク質特性を含まない。
【０１１８】好ましい実施形態において、被験体（例え
ば、アルツハイマー病に罹患すると推測されるか、また
は罹患していることが既知である被験体）のＣＳＦにお
いてＡＦに関連するシグナルは、同じ２Ｄゲルにおいて
検出される１つ以上の発現参考特性（Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｆｅａｔｕｒｅｓ）（ＥＲ
Ｆ）に関して正規化される。当業者にとって明らかなよ
うに、このようなＥＲＦは、技術およびプロトコル（例
えば、好ましい技術）を使用して異なるサンプルを比較
することによってたやすく決定され得る。適切なＥＲＦ
は、以下の表に記載されるものを含む（しかし、これら
に限定されない）。
【０１１９】
【表３】 当業者がたやすく理解するように、所定の特性またはタ
ンパク質アイソフォームの測定されたＭＷおよびｐＩ
は、２Ｄ電気泳動の各工程およびランドマークマッチン
グに使用される正確なプロトコルに依存してある程度変
化する。本明細書で使用される場合、用語「ＭＷ」およ
び「ｐＩ」は、それぞれ、以下の第６節に確認される参
考プロトコルに注意深く従って測定される特性またはタ
ンパク質アイソフォームの見かけの分子量（ダルトン）
および見かけの等電点を意味すると定義される。参考プ
ロトコルに従い、そしてサンプルが２重またはより多数
の複製で作動される場合、ＡＦまたはＡＰＩの測定され
た平均ｐＩにおける変化は、典型的に３％未満であり、
そしてＡＦまたはＡＰＩの測定された平均ＭＷにおける
変化は、典型的に５％未満である。当業者が参考プロト
コルとは異なることを所望する場合、較正実験が、
（ａ）参考プロトコルによって、および（ｂ）発散によ
って検出されるような各ＡＦまたはタンパク質アイソフ
ォームのＭＷおよびｐＩを比較するために実施されるべ
きである。
【０１２０】本発明のＡＦは、例えば、検出、処置、診
断、または薬物開発または薬学的産物に使用され得る。
本発明の１つの実施形態において、被験体（例えば、ア
ルツハイマー病に罹患していると推測される被験体）由
来のＣＳＦは、以下：
【０１２１】
【化１９】 の任意の適切な組合せにおいて１つ以上のＡＦの定量的
検出について２Ｄ電気泳動によって分析され、このよう
なＡＦは、本明細書中の表Ｉ（ａ）、Ｉ（ｂ）およびＩ
（ｃ）に示される。本発明の特定の実施形態において、
被験体（例えば、アルツハイマー病に罹患していると推
測される被験体）由来のＣＳＦは、以下：
【０１２２】
【化２０】 の任意の適切な組合せにおいて１つ以上のＡＦの定量的
検出について２Ｄ電気泳動によって分析され、このよう
なＡＦは、本明細書中の表Ｉ（ａ）に示される。アルツ
ハイマー病に罹患していない被験体（例えば、コントロ
ールサンプルまたは予め決定された参考範囲）由来のＣ
ＳＦと比較して、被験体由来のＣＳＦにおける１つ以上
のこのようなＡＦの任意の適切な組合せにおいて減少し
た数度は、アルツハイマー病の存在を示す。
【０１２３】本発明の別の実施形態において、被験体由
来のＣＳＦは、１つ以上の次のＡＦ：
【０１２４】
【化２１】 の定量的検出について２Ｄ電気泳動によって分析され、
このようなＡＦは、本明細書中の表ＩＩ（ａ）、ＩＩ
（ｂ）またはＩＩ（ｃ）に示される。アルツハイマー病
に罹患していない被験体（例えば、コントロールサンプ
ルまたは予め決定された参考範囲）由来のＣＳＦと比較
して、被験体由来のＣＳＦにおける１つ以上のこのよう
なＡＦの任意の適切な組合せにおいて増加した数度は、
アルツハイマー病の存在を示す。本発明の特定の実施形
態において、被験体由来のＣＳＦは、１つ以上の次のＡ
Ｆ：
【０１２５】
【化２２】 の定量的検出について２Ｄ電気泳動によって分析され、
このようなＡＦは、本明細書中の表ＩＩ（ａ）に示され
る。アルツハイマー病に罹患していない被験体（例え
ば、コントロールサンプルまたは予め決定された参考範
囲）由来のＣＳＦと比較して、被験体由来のＣＳＦにお
ける１つ以上のこのようなＡＦの任意の適切な組合せに
おいて増加した数度は、アルツハイマー病の存在を示
す。なお別の実施形態において、被験体由来のＣＳＦ
は、（ａ）その減少した数度がアルツハイマー病の存在
を示す１つ以上のＡＦまたはそれらの任意の適切な組合
せ（すなわち、表Ｉ（ａ）、Ｉ（ｂ）またはＩ（ｃ）に
示されるようなＡＦが好ましく、表Ｉ（ａ）に示される
ようなＡＦがより好ましい）；ならびに（ｂ）その増加
した数度がアルツハイマー病の存在を示す１つ以上のＡ
Ｆまたはそれらの任意の適切な組合せ（すなわち、表Ｉ
Ｉ（ａ）、ＩＩ（ｂ）またはＩＩ（ｃ）に示されるよう
なＡＦが好ましく、表ＩＩ（ａ）に示されるようなＡＦ
がより好ましい）の定量的検出について２Ｄ電気泳動に
よって分析される。
【０１２６】本発明のなお別の実施形態において、被験
体由来のＣＳＦは、表Ｉ（ａ）、Ｉ（ｂ）、Ｉ（ｃ）、
ＩＩ（ａ）、ＩＩ（ｂ）またはＩＩ（ｃ）に示される１
つ以上のＡＦの定量的検出について２Ｄ電気泳動によっ
て分析され、ここで、発現参考特性（ＥＲＦ）に対する
１つ以上のＡＦの比は、アルツハイマー病が存在するこ
とを示す。特定の実施形態において、コントロールサン
プルまたは参考範囲におけるＡＦ／ＥＲＦ比と比較し
た、試験されるサンプルにおける１つ以上のＡＦ／ＥＲ
Ｆ比における減少は、アルツハイマー病の存在を示す；
表Ｉ（ａ）、Ｉ（ｂ）、またはＩ（ｃ）に示されるＡＦ
は、本目的に適切なＡＦであり、より好ましくは、表Ｉ
（ａ）に示されるＡＦが、本目的に適切である。別の特
定の実施形態において、アルツハイマー病の存在を検出
する方法として、試験サンプルにおける１つ以上のＡＦ
を測定し得、そしてそれらをＥＲＦと比較する。従っ
て、コントロールサンプルまたは参考範囲中のＡＦ／Ｅ
ＲＦ比と比較して、試験サンプル中の１つ以上のＡＦ／
ＥＲＦ比における増加は、アルツハイマー病の存在を示
す；表ＩＩ（ａ）、ＩＩ（ｂ）、またはＩＩ（ｃ）に示
されるＡＦは、本目的に適切なＡＦである。より好まし
くは、表ＩＩ（ａ）に示されるＡＦが、本目的に適切で
ある。
【０１２７】本発明のさらなる実施形態において、被験
体由来のＣＳＦは、（ａ）コントロールサンプル中のＡ
Ｆ／ＥＲＦ比と比較して、試験サンプル中の減少したＡ
Ｆ／ＥＲＦ比がアルツハイマー病の存在を示す、１つ以
上のＡＦ、またはそれらの任意の適切な組合せ（すなわ
ち、表Ｉ（ａ）、Ｉ（ｂ）、またはＩ（ｃ）に示される
ＡＦが好ましく、表Ｉ（ａ）に示されるＡＦが、より好
ましい）；（ｂ）コントロールサンプル中のＡＦ／ＥＲ
Ｆ比と比較して、試験サンプル中の増加したＡＦ／ＥＲ
Ｆ比がアルツハイマー病の存在を示す１つ以上のＡＦ、
またはそれらの任意の適切な組合せ（すなわち、表ＩＩ
（ａ）、ＩＩ（ｂ）、またはＩＩ（ｃ）に示されるＡＦ
が好ましく、表ＩＩ（ａ）に示されるＡＦが、より好ま
しい）の定量的検出について２Ｄ電気泳動によって分析
される。
【０１２８】好ましい実施形態において、被験体由来の
ＣＳＦは、多数のＡＦの定量的検出について分析され
る。
【０１２９】（５．３ アルツハイマー病関連タンパク
質アイソフォーム（ＡＰＩ））本発明の別の局面におい
て、被験体由来のＣＳＦは、１つ以上のアルツハイマー
病関連タンパク質アイソフォーム（ＡＰＩ）の定量的検
出について分析される（例えば、アルツハイマー病のス
クリーニング、処置もしくは診断のためまたは薬学的産
物の開発のため）。当該分野で周知のように、所定のタ
ンパク質は、アミノ酸組成の異なる（例えば、変更ｍＲ
ＮＡまたはプレｍＲＮＡプロセシング（例えば、選択的
スプライシングまたは限定されたタンパク質分解）の結
果としてか、あるいは異なる翻訳後修飾（例えば、グリ
コシル化、リン酸化、アシル化）の結果として、あるい
はその両方の結果として）１つ以上の改変体形態（アイ
ソフォーム）として発現され得、その結果、同一アミノ
酸配列のタンパク質はそのｐＩ、ＭＷ、またはその両方
が異なり得る。「アルツハイマー病関連タンパク質アイ
ソフォーム」とは、アルツハイマー病に罹患していない
被験体由来のＣＳＦと比較してアルツハイマー病に罹患
する被験体由来のＣＳＦに特異的に存在するタンパク質
アイソフォームをいう。
【０１３０】ＡＰＩの２つの群は、図２に示され、そし
て上記のＡＦのアミノ酸配列決定によって本明細書中に
記載される。ＡＰＩは、単離され、タンパク質分解に供
され、そしてこの場合、好ましい技術の方法および装置
を使用して質量分析法によって分析された（好ましい技
術は代表として示されるが本発明の制限ではないことが
理解される）。当業者は、質量分析法および／またはタ
ンデム質量分析法によって種々のスペクトル解析法およ
びデータベース探索ツールを使用して解析されたタンパ
ク質由来の配列情報を同定し得る。これらの方法および
ツールのいくつかの例は、Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓウェブサイ
ト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／）お
よびＥｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙウェブサイト（ｗｗｗ．
ｍａｎｎ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／Ｓ
ｅｒｖｉｃｅｓ／ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈ／）で見
出され得る。ＡＰＩの同定は、ＳＥＱＵＥＳＴ探索プロ
グラム（Ｅｎｇら、１９９４，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａ
ｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．５：９７６−９８９）および
ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０１／０４０３４（その全
体が参考として本明細書中に援用される）に記載される
方法を使用して実行された。
【０１３１】第１群は、アルツハイマー病に罹患してい
ない被験体のＣＳＦと比較して、アルツハイマー病に罹
患している被験体のＣＳＦにおいて減少したＡＰＩから
なる。トリプシンを使用するタンパク質分解によってこ
れらのＡＰＩから生成され、そしてタンデム質量分析法
およびＳＥＱＵＥＳＴプログラムを使用するデータベー
ス探索によって同定されるペプチドのアミノ酸配列は、
対応するｐＩおよびＭＷに加えて表ＩＶに列挙される。
１つのＡＰＩについて、タンデム質量分析法由来の部分
的配列情報は、いずれの公知の公開データベースにも記
載されていないことがわかった。このＡＰＩは、表ＩＶ
中に「新規」として列挙され、そして以下の実施例に記
載されるようにこのＡＰＩのトリプシンペプチドのＭＳ
／ＭＳスペクトルを手動で解釈することから誘導される
部分的アミノ酸配列情報は、表ＩＸに提供される。
【０１３２】
【表４】 第２群は、アルツハイマー病に罹患していない被験体の
ＣＳＦと比較して、アルツハイマー病に罹患している被
験体のＣＳＦにおいて増加したＡＰＩを含む。トリプシ
ンを使用するタンパク質分解によってこれらのＡＰＩか
ら生成され、そしてタンデム質量分析法およびＳＥＱＵ
ＥＳＴプログラムを使用するデータベース探索によって
同定されるペプチドのアミノ酸配列は、対応するｐＩお
よびＭＷに加えて表Ｖに列挙される。
【０１３３】（表Ｖ．ＡＰＩは、アルツハイマー病を有
する被験体のＣＳＦにおいて増加する） （ａ）ＡＰＩは、アルツハイマー病を有する被験体のＣ
ＳＦにおいて増加する
【０１３４】
【表５ａ】 （ｂ）表ＩＶ（ａ）および表Ｖ（ａ）のＡＰＩと組合せ
て使用され得るＡＰＩ
【０１３５】
【表５ｂ】 当業者は、本発明の記載に基づいて、所定のＡＰＩは、
表ＩＶまたはＶの中のＡＰＩについて提供されたデータ
に基づいて記載され得ることを理解する。このＡＰＩ
は、そのＡＰＩについて記載されるペプチド配列を含む
タンパク質（好ましくは、そのＡＰＩについて記載され
るペプチド配列の複数を、より好ましくはペプチド配列
の全てを含む）であり、そしてそのＡＰＩについて記載
されたほぼその値のｐＩ（好ましくは、記載された値の
約１０％以内、より好ましくは約５％以内、なおより好
ましくは約１％以内）であり、そしてそのＡＰＩについ
て記載されたほぼその値のＭＷを有する（好ましくは、
記載された値の約１０％以内、より好ましくは約５％以
内、なおより好ましくは約１％以内）。
【０１３６】１つの実施形態において、被験体からのＣ
ＳＦが、以下のＡＰＩの１つ以上の定量的な検出につい
て分析される：
【０１３７】
【化２３】 またはそれらの任意の適切な組み合せ。このようなＡＰ
Ｉは、表ＩＶ（ａ）または表ＩＶ（ｂ）に記載される。
より好ましくは、被験体からのＣＳＦが、以下のＡＰＩ
の１つ以上の定量的な検出について分析される：
【０１３８】
【化２４】 またはそれらの任意の適切な組み合せ。このようなＡＰ
Ｉは、表ＩＶ（ａ）に記載され、ここで、アルツハイマ
ー病を罹患していない被験体からのＣＳＦ（例えば、コ
ントロールサンプルまたは先に決定された参照範囲）に
比較して、被験体からのＣＳＦにおけるＡＰＩ（または
それらの任意の適切な組み合せ）の減少した量は、アル
ツハイマー病の存在を示す。
【０１３９】本発明の別の実施形態において、被験体か
らのＣＳＦが、以下のＡＰＩの１つ以上の定量的な検出
について分析される：
【０１４０】
【化２５】 またはそれらの任意の適切な組み合せ。このようなＡＰ
Ｉは、表Ｖ（ａ）または表Ｖ（ｂ）に記載される。より
好ましくは、被験体からのＣＳＦが、以下のＡＰＩの１
つ以上の定量的な検出について分析される：
【０１４１】
【化２６】 またはそれらの任意の適切な組み合せ。このようなＡＰ
Ｉは、表Ｖ（ａ）に記載され、ここで、アルツハイマー
病を罹患していない被験体からのＣＳＦ（例えば、コン
トロールサンプルまたは先に決定された参照範囲）に比
較して、被験体からのＣＳＦにおけるＡＰＩ（またはそ
れらの任意の適切な組み合せ）の増加した量は、アルツ
ハイマー病の存在を示す。
【０１４２】さらなる実施形態において、被験体由来の
ＣＳＦは、（ａ）１つ以上のＡＰＩまたはこれらの任意
の組み合せ（これらの減少した量は、アルツハイマー病
の存在を示す）、すなわち、表ＩＶ（ａ）またはＩＶ
（ｂ）に記載されるＡＰＩ、より好ましくは、表ＩＶ
（ａ）に記載されるＡＰＩ：ならびに（ｂ）１つ以上の
ＡＰＩまたはこれらの任意の組み合せ（これらの増加し
た量は、アルツハイマー病を示す）、すなわち、表Ｖ
（ａ）またはＶ（ｂ）に記載されるＡＰＩ、より好まし
くは、表Ｖ（ａ）に記載されるＡＰＩの定量的な検出に
ついて、分析される。
【０１４３】なおさらなる実施形態において、被験体か
らのＣＳＦが、１つ以上のＡＰＩおよび１つ以上の以前
に公知のアルツハイマー病のバイオマーカー（例えば、
ｔａｕ、ＮＴＰ、Ａβ２）の定量的検出について分析さ
れる。この実施形態に従って、コントロールまたは参照
範囲に対する各ＡＰＩおよび公知のバイオマーカーの量
は、被験体がアルツハイマー病を有するか否かを示す。
【０１４４】好ましくは、ＡＰＩの量は、発現参照タン
パク質アイソフォーム（ＥＲＰＩ）に対して規格化され
る。ＥＲＰＩは、ＥＲＦの部分的な配列アミノ酸配列の
特徴付けによって同定され得、これらは上に記載され、
そしてこのことは、例えば、好ましい技術の方法および
装置を使用して達成され得る。ＥＲＰＩの部分的アミノ
酸配列が、表ＶＩに提供される。
【０１４５】（表ＶＩ 発現参照タンパク質アイソフォ
ーム）
【０１４６】
【表６】 上に示されるように、本明細書中に記載されるＡＰＩ
は、以前に未知のタンパク質、ならびに、既知のタンパ
ク質のアイソフォームを含み、ここで、これらのアイソ
フォームは、以前には、アルツハイマー病と関連してい
るとは、知られていなかった。それぞれのＡＰＩについ
て、本発明は、さらに以下を提供する：（ａ）単離され
たＡＰＩを含む、調製物；（ｂ）ＡＰＩの１つ以上のフ
ラグメントを含む調製物；および（ｃ）これらのＡＰ
Ｉ、これらのフラグメント、またはこれらのＡＰＩおよ
びフラグメントの両方に結合する抗体。本明細書中で使
用される場合、ＡＰＩは、それが実質的に他のタンパク
質が存在しない調製物、すなわち、存在する全タンパク
質の１０％未満（特に５％未満、より特に１％未満）
が、タンパク質を混入している調製物中に存在する場
合、「単離されている」。別のタンパク質は、２Ｄ電気
泳動によって決定されるように、単離されたＡＰＩのｐ
ＩまたはＭＷとは有意に異なるｐＩまたはＭＷを有する
タンパク質またはタンパク質アイソフォームである。本
明細書中で使用される場合、「有意に異なる」ｐＩまた
はＭＷは、他のタンパク質が、参照プロトコルに従って
実施される、２Ｄ電気泳動でのＡＰＩから分離されるこ
とを可能にするものをいう。
【０１４７】１つの実施形態において、ＡＰＩについて
の表ＩＶまたはＶに同定されるアミノ酸配列を有するペ
プチドを含む単離されたタンパク質が提供され、このタ
ンパク質は、そのＡＰＩについて表ＩＶまたはＶに同定
される値の１０％以内（特に５％以内、より特に１％以
内）のｐＩおよびＭＷを有する。
【０１４８】本発明のＡＰＩは、当業者に公知の任意の
方法によって、定性的にまたは定量的に検出され得、こ
の方法には、本明細書中に記載される好ましい技術、キ
ナーゼアッセイ、酵素アッセイ、結合アッセイおよび他
の機能的アッセイ、イムノアッセイ、ならびにウエスタ
ンブロットが挙げられるがこれらに限定されない。１つ
の実施形態において、ＡＰＩは、それらのＭＷおよびｐ
Ｉによって２Ｄゲルで分離され、そしてこのゲルを染色
することによって、可視化される。１つの実施形態にお
いて、ＡＰＩは、蛍光色素を用いて染色され、そして蛍
光スキャナを用いて画像化される。Ｓｙｐｒｏ Ｒｅｄ
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ，Ｅｕｇ
ｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）は、この目的のために適切な色
素である。好ましい蛍光色素は、ピリジニウム、４−
［２−［４−（ジペンチルアミノ）−２−トリフルオロ
メチルフェニル］エテニル−１−（スルホブチル）−内
部塩である。米国特許出願番号０９／４１２，１６８
（１９９９年１０月５日出願）（これは、その全体が、
本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０１４９】あるいは、ＡＰＩは、イムノアッセイにお
いて検出され得る。１つ実施形態において、イムノアッ
セイは、ＡＰＩが存在する場合に免疫特異的結合が生じ
得る条件下で、サンプルを抗ＡＰＩ抗体に接触し、そし
てこの抗体による任意の免疫特的結合の量を検出または
測定することによって、実施される。抗ＡＰＩ抗体は、
本明細書中に記載される方法および技術によって生成さ
れ得る。当該分野で公知のこのような抗体の例が、表Ｖ
ＩＩに記載される。表ＶＩＩに示されるこれらの抗体
は、ＡＰＩ自体がファミリーメンバーであるタンパク質
に結合することが既に知られている。特に、抗ＡＰＩ抗
体は、同じタンパク質の他のアイソフォームよりも、む
しろＡＰＩに優先的に結合する。特定の実施形態におい
て、抗ＡＰＩ抗体は、このＡＰＩに、同じタンパク質の
他のアイソフォームと比較して、少なくとも２倍大きい
親和性、より特定的には少なくとも５倍大きい親和性、
なおより好ましくは少なくとも１０倍大きい親和性で結
合する。表ＶＩＩに示される抗体が、標的ＡＰＩに対し
て必要とされる優先的な選択性を提示しない場合、当業
者は、このような抗体を生成するためにＡＰＩ自体を使
用することによってさらなる抗体を生成し得る。
【０１５０】ＡＰＩは、ゲルから適切な膜（例えば、Ｐ
ＶＤＦ膜）に移動され、そして続いて適切なアッセイに
おいて、プローブされる。この適切なアッセイとして
は、競合アッセイ系および非競合アッセイ系（ウエスタ
ンブロットのような技術を使用する）ならびに本明細書
中に記載されるような抗ＡＰＩ抗体（例えば、表ＶＩＩ
に同定される抗体、または本発明の記載に基づいて当業
者に理解されるような目的のＡＰＩに対して惹起された
抗ＡＰＩ抗体）を使用する「サンドイッチ」イムノアッ
セイが挙げられるがこれらに限定されない。これらの免
疫ブロットは、同じ遺伝子によってコードされる他のア
イソフォーム由来のＡＰＩを免疫特異的に分化させるた
めに必要とされる選択性を提示するこれらの抗ＡＰＩ抗
体を同定するために使用され得る。
【０１５１】（表ＶＩＩ．ＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポリ
ペプチドを認識する公知の抗体）
【０１５２】
【表７】 １つの実施形態において、組織切片（ｓｅｃｔｉｏｎ）
における抗体の結合を使用して、ＡＰＩ局在または１以
上のＡＰＩのレベルを検出し得る。特定の実施形態にお
いて、ＡＰＩに対する抗体を使用して、被験体からの組
織サンプル（例えば、脳生検）をＡＰＩのレベルについ
てアッセイし得る。ここで、ＡＰＩの実質的に変化した
レベルは、アルツハイマー病を示す。本明細書中で使用
される場合、「実質的に変化したレベル」は、アルツハ
イマー病のない被験体におけるレベルまたは参照レベル
と比較して、増加したかまたは減少したレベルを意味す
る。所望される場合、この比較は、アルツハイマー病に
罹患されていない身体の一部から得られた、同一の被験
体からの一致したサンプルで実施され得る。
【０１５３】任意の適切な免疫アッセイを使用して、Ａ
ＰＩを検出し得る。これは、以下の技術を使用する競合
アッセイ系および非競合アッセイ系を限定せずに含む：
例えば、ウエスタンブロット、放射免疫アッセイ、ＥＬ
ＩＳＡ（酵素免疫測定法）、「サンドイッチ」免疫アッ
セイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降アッ
セイ、免疫拡散アッセイ、凝集（ａｇｇｌｕｔｉｎａｔ
ｉｏｎ）アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射分析ア
ッセイ、蛍光免疫アッセイおよびプロテインＡ免疫アッ
セイ。
【０１５４】例えば、ＡＰＩは、２工程サンドイッチア
ッセイによって、流体サンプル（例えば、ＣＳＦ、血
液、尿または組織ホモジネート）中に検出され得る。第
１の工程において、捕獲試薬（例えば、抗ＡＰＩ抗体）
を使用して、ＡＰＩを捕獲する。当該分野において公知
のこのような抗体の例は、表ＶＩＩに示される。捕獲試
薬は、必要に応じて固相上に固定化される。第２の工程
において、直接的にかまたは間接的に標識した検出試薬
を使用して、捕獲されたＡＰＩを検出する。１つの実施
形態において、検出試薬はレクチンである。レクチン
は、ＡＰＩと同一のコアタンパク質を有する他のアイソ
フォームに対してか、または抗体によって認識される抗
原性決定基を共有する他のタンパク質に対してよりも、
ＡＰＩに対して優先的に結合するというこの目的のため
に使用され得る。好ましい実施形態において、選択され
たレクチンは、ＡＰＩと同一のコアタンパク質を有する
他のアイソフォームに対してか、または抗体によって認
識される抗原性決定基を共有する他のタンパク質に対し
てよりも、少なくとも２倍より高い親和性、より特定に
は、少なくとも５倍より高い親和性、なおさらに好まし
くは、少なくとも１０倍より高い親和性でＡＰＩに結合
する。本明細書の記載に基づいて、所定のＡＰＩを検出
するために適切なレクチンは、例えば、Ｇａｂｉｕｓ
Ｈ−Ｊ＆Ｇａｂｉｕｓ Ｓ（編）１９９３、Ｌｅｃｔｉ
ｎｓ ａｎｄ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（１５８〜１
７４頁）（これは、その全体が参考として本明細書中に
援用される）中のＳｕｍａｒら、Ｌｅｃｔｉｎｓ ａｓ
Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ−Ａｓ
ｓｏｃｉａｔｅｄ Ｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓの１５８〜１
５９ページの表Ｉに列挙されるレクチンの１以上を試験
する際の、当該分野において周知の方法を使用して当業
者によって容易に同定され得る。所望のオリゴ糖特異性
を有するレクチンは、例えば、２Ｄゲルにおいて、ニト
ロセルロース膜のような適切な固体基質に転写した後の
２Ｄゲルのレプリカにおいて、または抗体による捕獲に
続く２工程アッセイにおいて、ＡＰＩを検出するための
それらの能力によって同定され得る。代替の実施形態に
おいて、検出試薬は、抗体（例えば、他の翻訳後修飾を
免疫特異的に検出する抗体（例えば、リン酸化したアミ
ノ酸に免疫特異的に結合する抗体））である。このよう
な抗体の例としては、ホスホチロシンに結合するもの
（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ，カタログ番号Ｐ１１２３０−０５０／Ｐ１１
２３０−１５０；Ｐ１１１２０；Ｐ３８８２０；Ｐ３９
０２０）、ホスホセリンに結合するもの（ＺｙｍｅｄＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａ
ｎ Ｆｒａｎｓｃｉｓｃｏ，ＣＡ、カタログ番号 ６１
−８１００）、およびホスホスレオニンに結合するもの
（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，
ＳｏｕｔｈＳａｎ Ｆｒａｎｓｃｉｓｃｏ，ＣＡ、カタ
ログ番号 ７１−８２００、１３−９２００）が挙げら
れる。
【０１５５】所望される場合、ＡＰＩをコードする遺伝
子、関連遺伝子（例えば、配列相同性を有する遺伝
子）、または関連核酸配列もしくはサブ配列（相補性配
列を含む）はまた、ハイブリダイゼーションアッセイに
おいて使用され得る。ＡＰＩをコードするヌクレオチ
ド、または少なくとも８ヌクレオチド、好ましくは少な
くとも１２ヌクレオチド、および最も好ましくは少なく
とも１５ヌクレオチドを含むそのサブ配列は、ハイブリ
ダイゼーションプローブとして使用され得る。ハイブリ
ダイゼーションアッセイは、ＡＰＩをコードする遺伝子
の異常な発現に関連する、状態、障害、または疾患状態
の検出、処置、診断、またはモニタリングのために、あ
るいは、アルツハイマー病を示唆する兆候または症状を
有する被験体の差示的診断のために使用され得る。特
に、このようなハイブリダイゼーションアッセイは、ハ
イブリダイゼーションが生じ得るような条件下で、核酸
を含む被験体サンプルを、ＡＰＩをコードするＤＮＡま
たはＲＮＡにハイブリダイズし得る核酸プローブに接触
させる工程、および生じた任意のハイブリダイゼーショ
ンを検出または測定する工程を包含する方法によって実
施され得る。ヌクレオチドは、以下に記載されるような
アルツハイマー病を有する被験体の治療のために使用さ
れ得る。
【０１５６】本発明はまた、抗ＡＰＩ抗体を含む診断キ
ットを提供する。さらに、このようなキットは、必要に
応じて以下の１以上を含み得る：（１）診断、予後、治
療的モニタリングまたはこれらの適用の適切な任意の組
み合わせのために抗ＡＰＩ抗体を使用するための指導
書；（２）抗体に対する、標識された結合パートナー；
（３）その上に抗ＡＰＩ抗体が固定化される固相（例え
ば、試薬ストリップ）；ならびに（４）診断的使用、予
後的使用もしくは治療的使用、あるいはこれらの適切な
任意の組み合わせに対する、規制当局の認可を示す標識
または挿入物。抗体に対する、標識された結合パートナ
ーが提供されない場合、抗ＡＰＩ抗体自体は、検出可能
なマーカー（例えば、化学発光部分、酵素部分、蛍光部
分または放射活性部分）で標識され得る。
【０１５７】本発明はまた、ＡＰＩをコードするＲＮＡ
にハイブリダイズし得る核酸プローブを含むキットを提
供する。特定の実施形態において、キットは、１以上の
容器中に、適切な反応条件下で（例えば、ポリメラーゼ
連鎖反応（例えば、Ｉｎｎｉｓら、１９９０、ＰＣＲ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，
Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照のこと）、
Ｑβレプリカーゼを使用するリガーゼ連鎖反応（欧州特
許番号３２０，３０８号を参照のこと）、環状プローブ
反応、または当該分野において公知の他の方法によっ
て）、ＡＰＩをコードする核酸の少なくとも一部の増幅
をプライムし得る１対のプライマー（例えば、各々６〜
３０ヌクレオチドの範囲のサイズ、より好ましくは１０
〜３０ヌクレオチド、およびさらにより好ましくは１０
〜２０ヌクレオチド）を含む。
【０１５８】複数のＡＰＩ、またはＡＰＩ各々をコード
する複数の核酸を検出し得るキットがまた、提供され
る。キットは、予め決定された量の単離されたＡＰＩタ
ンパク質もしくはＡＰＩをコードする核酸（例えば、標
準またはコントロールとして使用するための）を、必要
に応じてさらに含み得る。
【０１５９】（５．４ ＡＰＩおよびＡＰＩクラスタを
同定するための統計的技術）単一変量（ｕｎｉ−ｖａｒ
ｉａｔｅ）差示的分析道具（例えば、倍数変化（ｆｏｌ
ｄ ｃｈａｎｇｅ）、ウィルコクソン順位和（ｓｕｍ）
検定およびｔ検定）は、アルツハイマー病に診断的に関
連する個々のＡＦまたはＡＰＩを同定する際に、または
疾患プロセスを調節する個々のＡＰＩを同定する際に有
用である。しかし、この疾患プロセスが、単離物におけ
る個々のＡＦおよびＡＰＩよりもむしろ、ＡＦまたはＡ
ＰＩの適切な組み合わせに関連する（およびＡＰＩの適
切な組み合わせによって調節されるべき）ことは、当業
者には明白である。このようなＡＦおよびＡＰＩの適切
な組み合わせを発見するための戦略は、個々のＡＦおよ
びＡＰＩを発見するためのものとは異なる。このような
場合において、個々のＡＦおよびＡＰＩの各々が、ある
変数と認識され得、そして疾患は、これらの変数の相互
作用によって生じる、連結した（ｊｏｉｎｔ）多変量
（ｍｕｌｔｉ−ｖａｒｉａｔｅ）効果として認識され得
る。
【０１６０】以下の工程は、好ましい技術（Ｐｒｅｆｅ
ｒｒｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって生成される
データからマーカーを同定するために使用され得る。
【０１６１】第１工程は、アルツハイマー病との顕著な
関連を個々に示すＡＦおよびＡＰＩの収集を同定するこ
とである。同定された個々のＡＦまたは個々のＡＰＩと
アルツハイマー病との間の関連は、個々のＡＦおよびＡ
ＰＩが診断的に使用される場合に所望されるように、Ａ
ＦおよびＡＰＩの収集が高度に顕著である必要はない。
上記の試験（倍数変化、ウィルコクソン順位和（ｓｕ
ｍ）検定など）のいずれもが、この段階で使用され得
る。一旦、ＡＦまたはＡＰＩの適切な収集が同定された
ら、クラスタを同定し得る高性能な多変量分析を使用し
て、アルツハイマー病と関連する顕著な多変量を見積も
り得る。
【０１６２】線形判別分析（ＬＤＡ）は、このような手
順の１つである。これは、変数（すなわち、ＡＦまたは
ＡＰＩ）のクラスタとアルツハイマー病との間の有意な
関連を検出するために使用され得る。ＬＤＡを実施する
際に、重みのセットは、各変数（すなわち、ＡＦまたは
ＡＰＩ）に関連する。その結果、重みと変数の測定され
た値との線形組み合わせは、アルツハイマー病を有する
被験体とアルツハイマー病のない被験体との間を判別す
ることによって疾患状態を同定し得る。ＬＤＡに対する
増大は、モデルの判別力を最適化するために変数の逐次
封入（ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）（また
は除去）を可能にする。従って、ＬＤＡの結果は、ＡＦ
およびＡＰＩのクラスタであり、これは、薬学的生成物
の診断、処置または発達について使用され得る。ＬＤＡ
の他の増強された変化（例えば、Ｆｌｅｘｉｂｌｅ Ｄ
ｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）は、疾患
のない状態から疾患状態を判別するために、変数の非線
形組み合わせの使用を可能にする。判別分析の結果は、
ホック後試験（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ｔｅｓｔ）によっ
て、そして分類ツリーのような代替的技術を使用する分
析を反復することによって立証され得る。
【０１６３】ＡＦまたはＡＰＩのさらなるカテゴリー
は、ある群のサンプル（例えば、病気の被験体からのサ
ンプル）におけるＡＦおよびＡＰＩの特徴存在パーセン
ト（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｆｅａｔｕｒｅ ｐｒｅｓ
ｅｎｃｅ）を、別の群のサンプル（例えば、コントロー
ル被験体からのサンプル）におけるＡＦおよびＡＰＩの
特徴存在パーセントと比較することによる定性的測定に
よって同定され得る。ＡＦおよびＡＰＩの「特徴存在パ
ーセント」は、サンプル群におけるサンプルのパーセン
テージであり、ここで、ＡＦまたはＡＰＩは、選択され
た検出方法によって検出可能である。例えば、ＡＦが病
気の被験体からのサンプルの９５％において検出可能な
場合、そのサンプル群におけるそのＡＦの特徴存在パー
セントは、９５％である。病気でない被験体からのサン
プルの５％のみが同一のＡＦの検出可能なレベルを有す
る場合、被験体のサンプルにおけるそのＡＦの検出は、
その被験体がアルツハイマー病のようであることを示唆
する。
【０１６４】同様に、「最近接分析（ｎｅａｒｅｓｔ
ｎｅｉｇｈｂｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）」の使用は、Ａ
ＦまたはＡＰＩの特定の群またはクラスタの視覚的な検
査、ならびに特定のこのような特徴またはアイソフォー
ムの、それらの物理的な密接さおよび同様に外見に基づ
く、他の特徴またはアイソフォーム（これらは、疾患状
態の被験体から取られたサンプル中の有意な存在を実証
することが見出されている）とのその結果としての関連
を含む。
【０１６５】（５．５ 臨床研究における使用）本発明
の診断法および組成物は、例えば、アルツハイマー病に
対する治療を評価するための臨床研究をモニタリングす
る工程を援助し得る。１つの実施形態において、化合物
は、アルツハイマー病を有する被験体におけるＡＦまた
はＡＰＩのレベルをアルツハイマー病のない被験体にお
いて見出されるレベルにまで回復させる人の能力、また
は処置された被験体（例えば、コリンエステラーゼイン
ヒビターで処置された後）においてアルツハイマー病の
ない被験体において見られるレベルでかまたは近いレベ
ルでＡＦまたはＡＰＩのレベルを維持するためのその能
力について試験される。１以上のＡＦまたはＡＰＩのレ
ベルが、アッセイされ得る。
【０１６６】別の実施形態において、本発明の方法およ
び組成物を使用して、アルツハイマー病を有する個体を
同定するための臨床研究にエントリーするために個体を
スクリーニングし得；次いで、すでにアルツハイマー病
を有する個体は、研究から排除され得るかまたは処置ま
たは分析のための別々の一団に置かれ得る。所望される
場合、候補を同時にスクリーニングして、レーヴィ小体
症および／もしくは老人性痴呆または他の公知の標準的
なアルツハイマー病を有する個体を同定し得；これらの
スクリーニングのための手順は、当該分野において周知
である（ＨａｒｄｉｎｇおよびＨａｌｌｉｄａｙ，１９
９８，Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｎｅｕｒｏ
ｂｉｏｌ．２４：１９５−２０１）。
【０１６７】（５．６ ＡＰＩの精製）特定の局面にお
いて、本発明は、単離された哺乳動物ＡＰＩ、好ましく
はヒトＡＰＩ、および抗原性決定基を含む（すなわち、
抗体によって認識され得る）かまたはさもなくば機能的
に活性であるそのフラグメント、ならびに、前述のもの
をコードする核酸配列を提供する。本明細書中で使用さ
れる場合、「機能的に活性」は、全長（野生型）ＡＰＩ
に関連する機能的な活性（例えば、ＡＰＩ基質またはＡ
ＰＩ結合パートナーに結合すること、抗原性（抗ＡＰＩ
抗体に結合すること）、免疫原性、酵素活性など）の１
以上を示す物質をいう。
【０１６８】特定の実施形態において、本発明は、少な
くとも５アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくと
も５０アミノ酸、または少なくとも７５アミノ酸を含
む、ＡＰＩのフラグメントを提供する。ＡＰＩの領域の
いくらかまたは全てを欠くフラグメントはまた、このよ
うなフラグメントを含むタンパク質（例えば、融合タン
パク質）同様に提供される。前述のものをコードする核
酸が、提供される。
【０１６９】一旦、ＡＰＩ、ＡＰＩの一部、またはＡＰ
Ｉの前駆体をコードする組換え核酸が確認されると、そ
の遺伝子産物は、分析され得る。これは、所定の産物の
物理的特性または機能的特性に基づくアッセイ（例え
ば、産物の放射活性標識、続くゲル電気泳動による分
析、免疫アッセイなど）によって達成され得る。
【０１７０】本明細書中で同定されるＡＰＩは、クロマ
トグラフィー（例えば、イオン交換カラムクロマトグラ
フィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、お
よびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分
離、差示的可溶性を含む標準的方法によって、またはタ
ンパク質の精製について標準的な他の任意の方法によっ
て単離かつ精製され得る。
【０１７１】あるいは、一旦、ＡＰＩをコードする組換
え核酸が同定されると、ＡＰＩの全アミノ酸配列は、組
換え核酸に含まれる遺伝子コード領域のヌクレオチド配
列から推定され得る。結果として、タンパク質は、当該
分野において公知の標準的な化学法によって合成され得
る（例えば、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、１９８４、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３１０：１０５−１１１を参照のこと）。
【０１７２】別の代替的な実施形態において、ネイティ
ブなＡＰＩは、上記のような標準法（例えば、イムノア
フィニティー精製）によって天然の供給源より精製され
得る。
【０１７３】好ましい実施形態において、ＡＰＩは、上
記の好ましい技術によって単離される。予備規模での実
行について、Ｗｅｓｔｅｒｍｅｉｅｒ，１９９３，Ｅｌ
ｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ
（ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１９
７〜２０９頁（その全体が本明細書中に参考として援用
される）に記載される方法に従う、２以下のｐＨ単位の
ｐＨ範囲を有する狭い範囲の「ズームゲル」は、等電的
工程に好ましい；この改変は、大量の標的タンパク質を
ゲル上にロードさせ得、これによりゲルから回収され得
る単離されたＡＰＩの量を増加させ得る。予備規模での
実行に対してこの方法で使用される場合、好ましい技術
は、典型的には、単一の実行における単離されたＡＰＩ
の１００ｎｇまでを提供し、そして１０００ｎｇまでを
提供し得る。ゲル等電的集束を利用する分離戦略のいず
れにおいてもズームゲルが使用され得ることは、当業者
には明白である。
【０１７４】従って、本発明は、単離されたＡＰＩ、単
離されたＡＰＩ関連ポリペプチド、およびＡＰＩまたは
ＡＰＩ関連ポリペプチドの単離された誘導体またはフラ
グメントを提供し；前述のもののいずれもが、組換えＤ
ＮＡ技術または化学合成法によって生成され得る。
【０１７５】（５．７ ＡＰＩをコードするＤＮＡの単
離）ＡＰＩをコードする遺伝子のクローニングについて
の特定の実施形態は、実施例によって以下に示される
が、限定ではない。
【０１７６】本発明のヌクレオチド配列（ＤＮＡおよび
ＲＮＡを含み、ＡＰＩもしくはそのフラグメントをコー
ドする配列を含む）、またはＡＰＩ関連ポリペプチド
は、当該分野において公知の方法（例えば、慣用的化学
的手法またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅）を
使用して合成され得る。本発明のヌクレオチド配列はま
た、例えば、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリ
ーまたは発現ライブラリーのスクリーニングによって、
ＡＰＩホモログまたはＡＰＩオルソログをコードする遺
伝子の同定およびクローニングを可能にする。
【０１７７】例えば、ＰＣＲ技術によってＡＰＩをコー
ドする遺伝子をクローニングするために、アンカーされ
た縮重オリゴヌクレオチド（または、たいがいのオリゴ
ヌクレオチドのセット）は、同一のタンパク質の一部と
して同定される全てのＡＰＩペプチドフラグメントにつ
いて設計され得る。種々の条件下でのＰＣＲ反応は、関
連するｃＤＮＡおよび１以上の種からのゲノムＤＮＡ
（例えば、脳組織由来かまたは免疫系の細胞由来）を用
いて実施され得る。ベクタレット（ｖｅｃｔｏｒｅｔｔ
ｅ）反応はまた、上記のオリゴヌクレオチド（好ましく
は、ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）である）を使用して任
意の利用可能なｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡに対して実
施され得る。ベクタレットＰＣＲは、１つのみのプライ
マーの配列が公知であるような状況での、特定のＤＮＡ
フラグメントの増幅を可能にする方法である。従って、
配列情報が一端でのみ利用可能である場合に、ＰＣＲの
適用をＤＮＡのストレッチまで拡張する。（Ａｒｎｏｌ
ｄ Ｃ，１９９１，ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．
１（１）：３９−４２；Ｄｙｅｒ ＫＤ，Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ，１９９５，１９（４）：５５０−
２）。ベクタレットＰＣＲは、ゲノムライブラリーのプ
ールまたはｃＤＮＡライブラリーのプールをテンプレー
トとして使用して、例えば、ＡＰＩペプチドフラグメン
トをコードする、アンカーされた縮重オリゴヌクレオチ
ド（および、たいがいのオリゴヌクレオチド）であるプ
ローブを用いて実施され得る。
【０１７８】アンカーされた縮重オリゴヌクレオチド
（または、たいがいのオリゴヌクレオチド）は、全ての
ＡＰＩペプチドフラグメントについて設計され得る。こ
れらのオリゴヌクレオチドは、標識され得、そしてｃＤ
ＮＡライブラリーおよびゲノムＤＮＡライブラリーを含
むフィルター上にハイブリダイズされ得る。同一のタン
パク質からの異なるペプチドに対するオリゴヌクレオチ
ドは、同一のメンバーのライブラリーをしばしば同定す
る。ｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムＤＮＡライブラ
リーは、任意の適切または所望の哺乳動物種（例えば、
ヒト）から得られ得る。
【０１７９】本発明のＡＰＩまたはＡＰＩフラグメント
をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列
は、例えば、他のタンパク質をコードする遺伝子の相補
性ストレッチと選択的にハイブリダイズするその能力に
ついて有用である。適用に依存して、種々のハイブリダ
イゼーション条件は、ＡＰＩをコードするヌクレオチド
の配列に、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５
％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５
％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％
同一、または１００％同一であるヌクレオチド配列を得
るために使用され得る。
【０１８０】高度な選択性について、比較的ストリンジ
ェントな条件（例えば、低塩条件または高温条件）は、
二重鎖を形成するために使用され得る。本明細書中で使
用される場合、「高度にストリンジェントな条件」は、
６５℃にて０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４、７％ ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中でのフィ
ルター結合ＤＮＡに対するハイブリダイゼーション、お
よび６８℃にて０．１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中で
の洗浄を意味する（Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら編、１
９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｇｒｅ
ｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，
Ｉｎｃ．，ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，
Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの２．１０．３頁；その全
体が本明細書中に参考として援用される）。いくつかの
適用について、二重鎖形成のための弱いストリンジェン
トな条件が必要とされる。本明細書中で使用される場
合、「中程度にストリンジェントな条件」は、４２℃に
て０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄を意味す
る（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９、前出）。ハイブリダ
イゼーション条件はまた、漸増量のホルムアミドの添加
によってよりストリンジェントにして、ハイブリッド二
重鎖を不安定にし得る。従って、特定のハイブリダイゼ
ーション条件は、容易に操作され得、そして一般に所望
の結果に依存して選択される。一般には、５０％ホルム
アミド存在下での便利なハイブリダイゼーション温度
は：ＡＰＩをコードする遺伝子のフラグメントに９５〜
１００％同一であるプローブについては４２℃、９０〜
９５％同一性については３７℃、そして７０〜９０％同
一性については３２℃である。
【０１８１】ゲノムライブラリーの調製において、ＤＮ
Ａフラグメントが作製され、その中のいくつかは、ＡＰ
Ｉの一部または全体をコードする。ＤＮＡフラグメント
を調製するための任意の適切な方法が、本発明において
用いられ得る。例えば、ＤＮＡは種々の制限酵素を用い
て特定の部位で切断され得る。あるいは、ＤＮＡをフラ
グメント化するために、マンガネーゼの存在下でＤＮＡ
ｓｅが用いられ得るか、またはＤＮＡは、例えば、超音
波破砕により物理的に剪断され得る。次いで、ＤＮＡフ
ラグメントは、標準的技術（アガロースおよびポリアク
リルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィーな
らびにスクロース勾配遠心分離が挙げられるがこれらに
限定されない）により、大きさに従って分離され得る。
次いで、ＤＮＡフラグメントは、適切なベクター（プラ
スミド、コスミド、バクテリオファージλまたはＴ４、
および酵母人工染色体（ＹＡＣ）が挙げられるがこれら
に限定されない）に挿入され得る（例えば、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（ｅｄ），１９８５，ＤＮ
Ａ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐ
ｒｏａｃｈ，ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒ
ｄ，Ｕ．Ｋ．ＶｏｌＩ，ＩＩ；Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．
Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ，Ｖｏｌ Ｉ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，およびＪｏｈｎ Ｗ
ｉｌｅｙ ＆ ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
を参照のこと）。ゲノムライブラリーは、標識されたプ
ローブへの核酸ハイブリダイゼーションによりスクリー
ニングされ得る（ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓ，１９
７７，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０；Ｇｒｕｎｓｔ
ｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓ，１９７５，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７２：３９６
１）。
【０１８２】本明細書に基づき、ゲノムライブラリー
は、当該分野で周知の最適なアプローチを用いて、ＡＰ
Ｉの任意のペプチドのアミノ酸配列に対応する標識され
た縮重オリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニ
ングされ得る。用いられる任意のプローブは、少なくと
も１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少
なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチ
ド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌク
レオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも６
０ヌクレオチド、少なくとも７０ヌクレオチド、少なく
とも８０ヌクレオチド、または少なくとも１００ヌクレ
オチドである。好ましくは、プローブは、１０ヌクレオ
チド以上、より好ましくは１５ヌクレオチド以上であ
る。
【０１８３】上記の表ＩＶおよびＶにおいて、本明細書
中で開示されるいくつかのＡＰＩは、配列が公的に公知
である遺伝子によりコードされる以前に同定されたタン
パク質のアイソフォームに対応する。このような遺伝子
をスクリーニングするために、この遺伝子またはその相
補体に相補的な任意のプローブが用いられ得；好ましく
は、このプローブは、１０ヌクレオチド以上、より好ま
しくは１５ヌクレオチド以上である。ＳＷＩＳＳ−ＰＲ
ＯＴおよびｔｒＥＭＢＬデータベース（Ｓｗｉｓｓ Ｉ
ｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ
ｓ（ＳＩＢ）およびＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏ
ｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）により
維持されており、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓ
ｙ．ｃｈ／において利用可能である）およびＧｅｎＢａ
ｎｋデータベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）により維持されて
おり、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉ
ｌ．ｇｏｖ／において利用可能である）は、表ＩＶおよ
びＶにおいて以下の登録番号の下でＡＰＩについて列挙
されたアミノ酸配列を含むタンパク質配列を提供し、そ
して各配列は、本明細書中で参考として援用される。
【０１８４】（表ＶＩＩＩ．ＡＰＩ、ＡＰＩ関連タンパ
ク質、またはＥＲＰＩをコードするヌクレオチド配列）
【０１８５】
【表８】 所定のＡＰＩのアミノ酸配列を含むタンパク質をコード
するヌクレオチド配列が既知でない場合、縮重プローブ
が、スクリーニングのために用いられ得る。表ＩＸにお
いて、縮重セットのプローブがＡＰＩ−１１１およびＡ
ＰＩ−１１２のために提供される。表ＩＸに列挙される
部分的なアミノ酸配列は、ＡＰＩのトリプシン消化ペプ
チドのタンデム質量分析の手動での解析により獲得され
た。本発明においてペプチドを配列決定するために用い
られたタンデム質量分析法において、以下の対のアミノ
酸配列は、お互いに区別され得ない：ロイシンおよびイ
ロロイシン；および特定の環境下で、フェニルアラニン
および酸化したメチオニン。本明細書中で用いられる場
合、「質量分析により決定された」アミノ酸配列は、示
された位置で、示された対のアミノ酸の一方かまたは他
のメンバーを含むアミノ酸配列のセットをいう。例え
ば、アミノ酸配列Ｐ［Ｌ／Ｉ］Ａは、アミノ酸配列ＰＬ
ＡおよびＰＩＡを示す。当業者に明らかであるように、
ｎ個の示された対を含む配列は、２ｎ個のアミノ酸配列
を示す。表ＩＸにおいて、各々の可能性のあるアミノ酸
配列は、質量分析により決定された各配列について列挙
され、そして各々の可能性のあるアミノ酸配列に対して
好ましく、そして完全な縮重セットのプローブが提供さ
れる。
【０１８６】（表ＩＸ．ＡＰＩのアミノ酸配列およびプ
ローブ）
【０１８７】
【表９】 ＊質量分析により決定された質量は、１００パーツパー
ミリオン（ｐｐｍ）以下の質量測定の誤差を有する。ｚ
ｐｐｍの質量測定の誤差を有する所定の測定された質
量Ｍについて、質量測定の誤差は、（Ｍ×ｚ÷１０００
０００）として算出され得る。
【０１８８】本明細書中で用いられる場合、「一価のプ
ロトン化されたペプチドの質量」は、質量分析により測
定された一価のプロトン化されたトリプシン消化ペプチ
ドの質量であり（およそ１００ｐｐｍ以下の測定の誤差
を有する）、水分子（Ｈ２Ｏ）および一価プロトン（Ｈ
＋）が付加されたペプチドの構成アミノ酸残基の総質量
に対応する。本明細書中で用いられる場合、「アミノ酸
残基」は、一般的な構造：―ＮＨ―ＣＨＲ―ＣＯ−なら
びに以下の記号、元素組成および単一同位体質量を有す
るアミノ酸残基をいう。
【０１８９】（アミノ酸残基の元素組成および単一同位
体質量）
【０１９０】
【化２７】 １全てのシステインは、本発明者らの生産プロセスの
間、カルボキシアミン誘導体に修飾されている。
【０１９１】本明細書中で用いられる場合、「トリプシ
ン消化ペプチド」は、酵素トリプシンを用いたタンパク
質の処理を通して生成されたペプチドである。トリプシ
ンは、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）残基の
カルボキシル側を特異的に切断し、その結果、生成する
トリプシン消化ペプチドは、ペプチドフラグメントがタ
ンパク質のＣ末端から獲得されない限り、Ｃ末端アミノ
酸としてＬｙｓまたはＡｒｇを有するはずである。同様
に、トリプシン消化ペプチドのＮ末端アミノ酸の直前に
あるアミノ酸もまた、ペプチドがタンパク質のＮ末端か
ら獲得されない限り、ＬｙｓまたはＡｒｇであるはずで
ある。トリプシン消化ペプチドの質量は、水分子（Ｈ２
Ｏ）の付加されたペプチドの構成アミノ酸残基の総質量
に対応する。本明細書中で用いられる場合、「部分配
列」は、ペプチドのタンデム質量分析の解析から決定さ
れたトリプシン消化ペプチド中のアミノ酸配列である。
本明細書中で用いられる場合、「Ｎ末端質量」は、ペプ
チドの部分配列の開始からＮ末端に延びるトリプシン消
化ペプチドの部分の質量分析（およそ１００ｐｐｍ以下
の測定の誤差を有する）により測定された質量である。
これは、ペプチドの部分配列からＮ末端に延びる構成ア
ミノ酸残基の総質量に対応する中間質量（ｎｅｕｔｒａ
ｌ ｍａｓｓ）である。本明細書中で用いられる場合、
「Ｃ末端質量」は、ペプチドの部分配列の終了からＣ末
端に延びるトリプシン消化ペプチドの部分の質量分析
（およそ１００ｐｐｍ以下の測定の誤差を有する）によ
り測定された質量である。この質量は、水分子（Ｈ
２Ｏ）および一価プロトン（Ｈ＋）が付加されたペプチ
ドの部分配列の終了からＣ末端に延びる構成アミノ酸残
基の総質量に対応する。前出の表ＩＸにおいて、好まし
い縮重セットのプローブは、ＧＣＧ Ｓｅｑ Ｗｅｂ
ＴＭ配列分析ソフトウェア（ＳｅｑＷｅｂＴＭバージョ
ン１．１、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅ
ｒｓｉｏｎ １０の一部、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐ
ｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）において用いられる
ようなＧＣＧヌクレオチド多義性暗号（Ｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅ Ａｍｂｉｇｕｉｔｙ Ｃｏｄｅ）を用いて記載
される。これらのヌクレオチド多義性暗号は以下の意味
を有する。
【０１９２】
【化２８】 ＧＣＧは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢにより提案されたアミノ
酸暗号およびヌクレオチド多義性暗号に対する文字暗号
を使用する。これらの暗号は、ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎ
ｋ、およびＰＩＲデータベースにより用いられる暗号と
互換性がある。ＩＵＰＡＣ，Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏ
ｎ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆＯｒｇａｎｉｃ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ＩＵＰＡ
Ｃ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ
Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎ
ｓ １９９３），Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３を参照の
こと。
【０１９３】ライブラリーがスクリーニングされる場
合、目的のＡＰＩをコードするインサートＤＮＡまたは
そのフラグメントを有するクローンは、対応するセット
の縮重オリゴヌクレオチドプローブ（またはそれらの相
補体）の１つ以上のメンバーとハイブリダイズする。こ
のようなオリゴヌクレオチドプローブとゲノムライブラ
リーとのハイブリダイゼーションは、当該分野で公知の
方法を用いて実施される。例えば、上記の縮重セットの
オリゴヌクレオチドプローブまたはそれらの相補体の１
つとの（あるいは、このようなセットまたはその相補体
の任意のメンバーとの）ハイブリダイゼーションは、上
述のような高度にストリンジェントな条件または中程度
にストリンジェントな条件下で実施され得るか、または
２×ＳＳＣ、１．０％ＳＤＳ中で５０℃にて実施され
得、そして前述の高度にストリンジェントなハイブリダ
イゼーションまたは中程度にストリンジェントなハイブ
リダイゼーションのための洗浄条件を用いて洗浄され得
る。
【０１９４】本発明のなお別の局面において、ＡＰＩ全
体、ＡＰＩのフラグメント、ＡＰＩ関連ポリペプチド、
またはＡＰＩ関連ポリペプチドのフラグメント、もしく
は前述のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む
クローンもまた、発現ライブラリーをスクリーニングす
ることにより獲得され得る。例えば、関連する供給源由
来のＤＮＡは単離され、そして無作為のフラグメントが
作製され、そして発現ベクター（例えば、バクテリオフ
ァージ、プラスミド、ファージミド、またはコスミド）
中に連結され、その結果、ベクター中に挿入された配列
は、ベクターが導入された宿主細胞により発現され得
る。次いで、種々のスクリーニングアッセイが用いら
れ、発現されたＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポリペプチドに
ついて選択され得る。１つの実施形態において、種々の
本発明の抗ＡＰＩ抗体が用いられ、当該分野で公知の方
法を用いて所望のクローンが同定され得る。例えば、Ｈ
ａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ，ＮＹ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ ＩＶを参照のこと。
ライブラリー由来のコロニーまたはプラークは抗体と接
触させられて、抗体と結合するこれらのクローンが同定
される。
【０１９５】１つの実施形態において、ＡＰＩ、ＡＰＩ
のフラグメント、ＡＰＩ関連ポリペプチド、またはＡＰ
Ｉ関連ポリペプチドのフラグメントをコードするＤＮＡ
を含むコロニーまたはプラークは、Ｏｌｓｖｉｃｋ ｅ
ｔ ａｌ．，２９ｔｈ ＩＣＡＡＣ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，
Ｔｅｘ．１９８９（本明細書中で参考として援用され
る）に従い、ＤＹＮＡ Ｂｅａｄｓを用いて検出され得
る。抗ＡＰＩ抗体は、トシル化ＤＹＮＡ Ｂｅａｄｓ
Ｍ２８０に架橋され、次いでこれらの抗体含有ビーズ
は、組換えポリペプチドを発現するコロニーまたはプラ
ークと接触させられる。ＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポリペ
プチドを発現するコロニーまたはプラークは、ビーズに
結合するコロニーまたはプラークのいずれかとして同定
される。
【０１９６】あるいは、抗ＡＰＩ抗体は、安定な支持体
（例えば、シリカまたはＣｅｌｉｔｅ（登録商標）樹
脂）に非特異的に固定され得る。次いでこの材料は、本
明細書中に記載されるようなＡＰＩタンパク質またはＡ
ＰＩ関連ポリペプチドを発現する細菌コロニーに吸着さ
せるために用いられ得る。
【０１９７】別の局面において、ＰＣＲ増幅が用いら
れ、ゲノムＤＮＡからＡＰＩの全体またはその一部をコ
ードする実質的に純粋なＤＮＡ（すなわち、混入する核
酸を実質的に含まないＤＮＡ）が単離され得る。好まし
くは、このようなＤＮＡは、少なくとも９５％純粋、よ
り好ましくは少なくとも９９％純粋である。本明細書中
に開示されるＡＰＩのペプチド配列に対応するオリゴヌ
クレオチド配列、縮重配列またはその他の配列が、プロ
ーブとして用いられ得る。
【０１９８】ＰＣＲは、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍ
ｅｒ ＣｅｔｕｓサーマルサイクラーおよびＴａｑポリ
メラーゼ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ（登録商標）またはＡｍｐ
ｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）を用いて実施され得
る。ＰＣＲ反応における使用のためにいくつかの異なる
縮重プライマーを合成することが選択され得る。ＰＣＲ
反応を開始する際に用いられるハイブリダイゼーション
条件のストリンジェンシーを変更し、縮重プライマーと
ＤＮＡにおける対応する配列との間の、より大きな程度
かまたはより小さい程度のヌクレオチド配列の類似性を
可能にすることもまた可能である。ＡＰＩをコードする
配列のセグメントの好適な増幅の後、このセグメント
は、分子的にクローニングされ、配列決定され、そして
プローブとして用いられて完全なゲノムクローンを単離
し得る。前述のように、これは、順に、遺伝子の完全な
ヌクレオチド配列の決定、その発現の分析、および機能
分析のためのそのタンパク質産物の生成を可能にする。
【０１９９】ＡＰＩをコードするこれらの遺伝子はま
た、核酸ハイブリダイゼーション、続くインビトロでの
翻訳によるｍＲＮＡの選択により同定され得る。この手
順において、フラグメントは、ハイブリダイゼーション
により相補的なｍＲＮＡを単離するために用いられる。
このようなＤＮＡフラグメントは、利用可能な、別の種
（例えば、マウス、ヒト）のＡＰＩをコードする精製さ
れたＤＮＡを示し得る。単離されたｍＲＮＡの単離され
た生成物のインビトロでの翻訳産物の免疫沈降分析また
は機能性アッセイ（例えば、インビトロでの凝集能；レ
セプターへの結合）は、そのｍＲＮＡを同定し、それに
より、所望の配列を含む相補的なＤＮＡフラグメントを
同定する。さらに、特定のｍＲＮＡは、細胞から単離さ
れたポリゾームの、ＡＰＩを特異的に認識する固定され
た抗体への吸着により選択され得る。ＡＰＩをコードす
る放射標識されたｃＤＮＡは、テンプレートとして（吸
着されたポリゾームから）選択されたｍＲＮＡを用いて
合成され得る。次いで、放射標識されたｍＲＮＡまたは
ｃＤＮＡはプローブとして用いられ、他のゲノムＤＮＡ
フラグメント間からＡＰＩをコードするＤＮＡフラグメ
ントを同定し得る。
【０２００】ＡＰＩをコードするゲノムＤＮＡの単離の
代替として、既知の配列からの遺伝子配列自体の化学的
な合成、またはＡＰＩをコードするｍＲＮＡに対するｃ
ＤＮＡの作製が挙げられるがこれらに限定されない。例
えば、ＡＰＩをコードする遺伝子のｃＤＮＡクローニン
グのためのＲＮＡは、ＡＰＩを発現する細胞から単離さ
れ得る。本明細書から、当業者は、他の方法が用いられ
得、そしてこれらは本発明の範囲内に含まれることを理
解する。
【０２０１】任意の適切な真核生物細胞は、ＡＰＩをコ
ードする遺伝子の分子クローニングのための核酸供給源
として有用であり得る。ＡＰＩをコードする核酸配列
は、脊椎動物、哺乳動物、霊長類、ヒト、ブタ、ウシ、
ネコ、サル、ウマ、イヌ、またはマウス供給源から単離
され得る。ＤＮＡは、クローン化されたＤＮＡ（例え
ば、ＤＮＡ「ライブラリー」）から当該分野において公
知の標準的な手順によるか、化学合成によるか、ｃＤＮ
Ａクローニングによるか、所望の細胞から精製されたゲ
ノムＤＮＡまたはそのフラグメントのクローニングによ
り獲得され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ
Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｇｌｏｖｅ
ｒ，Ｄ．Ｍ．（ｅｄ），１９８５，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ
ＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．
Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩを参照のこと）。ゲノムＤＮＡから得
られたクローンは、コード領域に加えて調節領域および
イントロンＤＮＡ領域を含み得：ｃＤＮＡから得られた
クローンは、エキソン配列のみを含む。
【０２０２】同定および単離された遺伝子またはｃＤＮ
Ａは、次いで、任意の適切なクローニングベクターに挿
入され得る。当該分野で公知の多くのベクター−宿主系
が用いられ得る。当業者は、選択されるベクター系が、
用いられる宿主細胞に適合するべきであることを理解す
る。このようなベクターとしては、λ誘導体のようなバ
クテリオファージ、ＰＢＲ３２２またはｐＵＣプラスミ
ド誘導体もしくはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ）のようなプラスミド、あるいはアデ
ノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはレトロウイル
スのような改変されたウイルスが挙げられるがこれらに
限定されない。クローニングベクターへの挿入は、例え
ば、相補的な粘着末端を有するクローニングベクターへ
ＤＮＡフラグメントを連結することにより達成され得
る。しかし、ＤＮＡをフラグメント化するために用いら
れた相補的な制限部位が、クローニングベクターに存在
しない場合、ＤＮＡ分子の末端は、酵素的に改変され得
る。あるいは、所望の任意の部位は、ＤＮＡ末端にヌク
レオチド配列（リンカー）を連結することにより生成さ
れ得；これらの連結されたリンカーは、制限エンドヌク
レアーゼ認識配列をコードする特定の化学的に合成され
たオリゴヌクレオチドを含み得る。代替の方法におい
て、切断されたベクターおよびＡＰＩをコードする遺伝
子は、ホモポリマーテイリングにより改変され得る。組
換え分子は、形質転換、トランスフェクション、感染、
エレクトロポレーションなどにより宿主細胞に導入され
得、その結果、遺伝子配列の多くのコピーが作製され得
る。
【０２０３】特定の実施形態において、ＡＰＩをコード
する単離された遺伝子を組み込んだ組換えＤＮＡ分子、
ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ配列を用いた宿主細胞の形
質転換は、複数のコピーの遺伝子の生成を可能にする。
従って、この遺伝子は、形質転換体を増殖させ、その形
質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離することにより
（必要な場合、単離された組換えＤＮＡから挿入された
遺伝子を回収することにより）、多量に獲得され得る。
【０２０４】本発明のヌクレオチド配列は、ネイティブ
のＡＰＩと実質的に同一のアミノ酸配列を有するアミノ
酸配列をコードするヌクレオチド配列、機能的に等価な
アミノ酸を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチ
ド配列、ＡＰＩ、ＡＰＩのフラグメント、ＡＰＩ関連ポ
リペプチド、またはＡＰＩ関連ポリペプチドのフラグメ
ントをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２０５】特定の実施形態において、ＡＰＩ関連ポリ
ペプチドをコードする単離された核酸分子は、１つ以上
のヌクレオチド置換、付加、または欠失をＡＰＩのヌク
レオチド配列に導入することにより作製され、その結
果、１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失がコー
ドされるタンパク質に導入され得る。当業者に公知の標
準的な技術が用いられて、変異（例えば、部位特異的変
異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発が挙げられる）を導入
され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１つ以
上の予想される非必須アミノ酸残基で成される。「保存
的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の電荷を有
する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換で
ある。類似の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基の
ファミリーは、当該分野で規定されている。これらのフ
ァミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例え
ば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有
するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン
酸）、非電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリ
シン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニ
ン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミ
ノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイ
シン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリ
プトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、
スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側
鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラ
ニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。あ
るいは、変異は、コード配列の全てかまたは一部に沿っ
て無作為に導入され得（例えば、飽和変異誘発（ｓａｔ
ｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によっ
て）、そして得られる変異体は、生物学的活性について
スクリーニングされて、活性を保持する変異体が同定さ
れ得る。変異誘発の後、コードされるタンパク質が発現
され得、そしてタンパク質の活性が決定され得る。
【０２０６】（５．８ ＡＰＩをコードするＤＮＡの発
現）ＡＰＩ、ＡＰＩアナログ、ＡＰＩ関連ペプチド、ま
たは前述のいずれかのフラグメントもしくは他の誘導体
をコードするヌクレオチド配列は、適切な発現ベクター
（すなわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写お
よび翻訳のために必要なエレメントを含むベクター）に
挿入され得る。必要な転写および翻訳シグナルはまた、
ＡＰＩをコードするネイティブの遺伝子またはその隣接
領域、あるいはＡＰＩ関連ポリペプチドをコードするネ
イティブの遺伝子またはその隣接領域により供給され得
る。種々の宿主ベクター系が、本発明において、タンパ
ク質コード配列を発現させるために用いられ得る。これ
らとしては、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、
アデノウイルスなど）で感染させた哺乳動物細胞系；ウ
イルス（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫
細胞系；酵母ベクターを含む酵母のような微生物；また
はバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ま
たはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌が挙げられる
がこれらに限定されない。ベクターの発現エレメント
は、その長さおよび特異性において変化する。用いられ
る宿主−ベクター系に依存して、多くの適切な転写およ
び翻訳エレメントのいずれか１つが用いられ得る。特定
の実施形態において、ヒト遺伝子をコードするヌクレオ
チド配列（またはヒトＡＰＩの機能的に活性な部分をコ
ードするヌクレオチド配列）が発現される。なお別の実
施形態において、ＡＰＩのドメインを含むＡＰＩのフラ
グメントが発現される。
【０２０７】ベクターへのＤＮＡフラグメントの挿入に
ついて以前に記載された任意の方法が用いられ、適切な
転写および翻訳制御シグナルならびにタンパク質コード
領域からなるキメラ遺伝子を含む発現ベクターが構築さ
れ得る。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮ
Ａおよび合成技術ならびにインビボ組換え（遺伝子組換
え）が挙げられ得る。ＡＰＩまたはそのフラグメントを
コードする核酸配列の発現は、第２の核酸配列により調
節され得、その結果、ＡＰＩまたはフラグメントは組換
えＤＮＡ分子で形質転換された宿主において発現され
る。例えば、ＡＰＩの発現は、当該分野で公知の任意の
プロモーターまたはエンハンサーエレメントにより制御
され得る。ＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポリペプチドをコー
ドする遺伝子の発現を制御するために用いられるプロモ
ーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅ
ｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔ
ｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイル
スの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａ
ｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：
７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモー
ター（Ｗａｇｎｅｒｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：
１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節
配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｎ
ａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）、テトラサイクリン
（Ｔｅｔ）プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１）；β−ラクタ
マーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ
ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）
またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ，ｅｔ ａ
ｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５；「Ｕｓｅｆｕｌ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｂａｃｔｅｒｉａ」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ，１９８０，２４２：７４−９４もまた参照
のこと）のような原核生物発現ベクター；ノパリンシン
ターゼプロモーター領域（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅ
ｌｌａ ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０３：２０９−
２１３）またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ
ＲＮＡプロモーター（Ｇａｒｄｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，
１９８１，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：２８７
１）を含む植物発現ベクター、および光合成酵素リブロ
ース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター（Ｈｅｒ
ｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，１９８
４，Ｎａｔｕｒｅ ３１０：１１５−１２０）；Ｇａｌ
４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒロドゲナー
ゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナー
ゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモータ
ーのような酵母または他の真菌類由来のプロモーターエ
レメント、および組織特異性を示し、そしてトランスジ
ェニック動物において用いられる以下の動物転写制御領
域：膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子
制御領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅ
ｌｌ ３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−
４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏ
ｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞において
活性なインシュリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，
１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−１２２）、
リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御
領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，１９８
４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓ
ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３
３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔａｌ．，１９８
７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４
４４）、精巣、乳房、リンパ節、および肥胖細胞におい
て活性なマウス乳腺癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５−４
９５）、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域
（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ
ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）、肝臓に
おいて活性なαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒ
ｕｍｌａｕｆｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：
５３−５８）；肝臓において活性なα１−抗トリプシン
遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙｅｔ ａｌ．，１９８
７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１
７１）、骨髄性細胞において活性なβグロビン遺伝子制
御領域（Ｍｏｇｒａｍｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３１５；３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９
４）；脳におけるオリゴ樹状細胞において活性なミエリ
ン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ
ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３−
７１２）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖２遺伝子
制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１
４：２８３−２８６）；神経細胞において活性なニュー
ロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）（Ｍｏｒｅｌｌｉ ｅ
ｔ ａｌ，１９９９，Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：５７
１−８３）；神経細胞において活性な脳由来神経栄養性
因子（ＢＤＮＦ）遺伝子制御領域（Ｔａｂｕｃｈｉ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙ
ｓｉｃ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２５３：８１８−８２３）；
星状細胞において活性な神経膠原繊維酸性タンパク質
（ＧＦＡＰ）プロモーター（Ｇｏｍｅｓ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９９，Ｂｒａｚ Ｊ Ｍｅｄ ＢｉｏｌＲｅ
ｓ ３２（５）：６１９−６３１；Ｍｏｒｅｌｌｉ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９９，Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：５
７１−８３）および視床下部において活性な性腺刺激放
出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−
１３７８）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２０８】特定の実施形態において、ＡＰＩコード核
酸、１つ以上の複製起点、および必要に応じて１つ以上
の選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）に作動
可能に連結されたプロモーターを含むベクターが用いら
れる。
【０２０９】特定の実施形態において、発現構築物は、
３つのｐＧＥＸベクター（グルタチオン−Ｓ-トランス
フェラーゼ発現ベクター；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓ
ｏｎ，１９８８，Ｇｅｎｅ ７：３１−４０）の各々の
ＥｃｏＲＩ制限部位へのＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポリペ
プチドコード配列のサブクローニングにより作製され
る。これは、正確なリーディングフレーム中のサブクロ
ーンからのＡＰＩ産物またはＡＰＩ関連ポリペプチドの
発現を可能にする。
【０２１０】哺乳動物宿主細胞において、多くのウイル
スベースの発現系が利用され得る。発現ベクターとして
アデノウイルスが用いられる場合、ＡＰＩコード配列ま
たはＡＰＩ関連ポリペプチドコード配列は、アデノウイ
ルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーター
および三部リーダー配列（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｌｅ
ａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に連結され得る。次い
で、このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボ組
換えによりアデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイ
ルスゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１またはＥ３領
域）における挿入は、生存能を有し、そして感染宿主に
おいて抗体分子を発現し得る組換えウイルスを生じる
（例えば、Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ，１９８４，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：
３５５−３５９を参照のこと）。特定の開始シグナルは
また、挿入された抗体コード配列の効果的な翻訳に必要
とされ得る。これらのシグナルとして、ＡＴＧ開始コド
ンおよび隣接配列が挙げられる。さらに、開始コドン
は、インサート全体の翻訳を保証するために所望のコー
ド配列のリーディングフレームと同調していなければな
らない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コ
ドンは、天然および合成性の両方の、種々の起源のシグ
ナルおよびコドンであり得る。発現の有効性は、適切な
転写エンハンサーエレメント、転写終結因子などの包含
により増強され得る（Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔａｌ．，１
９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５
３：５１−５４４を参照のこと）。
【０２１１】ＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポリペプチドをコ
ードする遺伝子のインサートを含む発現ベクターは、例
えば、３つの遺伝的アプローチ：（ａ）核酸ハイブリダ
イゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在ま
たは非存在、および（ｃ）挿入された配列の発現、によ
り同定され得る。第１のアプローチにおいて、発現ベク
ターに挿入されたＡＰＩをコードする遺伝子の存在は、
ＡＰＩをコードする挿入遺伝子に相同な配列を含むプロ
ーブを用いる核酸ハイブリダイゼーションにより検出さ
れ得る。第２のアプローチにおいて、組換えベクター／
宿主系は、ベクター中でＡＰＩをコードする遺伝子の挿
入により引き起こされる特定の「マーカー」遺伝子機能
（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する活
性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける閉塞体
（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）形成など）の存在ま
たは非存在に依存して同定および選択され得る。例え
ば、ＡＰＩをコードする遺伝子は、ベクターのマーカー
遺伝子配列内に挿入される。ＡＰＩインサートをコード
する遺伝子を含む組換え体はマーカー遺伝子機能の非存
在により同定され得る。第３のアプローチにおいて、組
換え体発現ベクターは、組換え体により発現される遺伝
子産物（すなわち、ＡＰＩ）をアッセイすることにより
同定され得る。このようなアッセイは、例えば、インビ
トロアッセイ系におけるＡＰＩの物理的または機能的特
性（例えば、抗ＡＰＩ抗体との結合）に基づき得る。
【０２１２】さらに、宿主細胞株が選択され得、これは
挿入された配列の発現を調節するか、または所望される
特定の様式での遺伝子産物を改変およびプロセシングす
る。特定のプロモーターからの発現は、特定のインデュ
ーサーの存在下で上昇し得る；従って、遺伝子操作され
たＡＰＩまたはＡＰＩ関連のポリペプチドの発現が制御
され得る。さらに、異なる宿主細胞は、翻訳および翻訳
後プロセシングおよび改変（例えば、タンパク質のグリ
コシル化、リン酸化）についての特徴的なかつ特異的な
メカニズムを有する。適切な細胞株または宿主系が選択
されて発現される外来タンパク質の所望の改変およびプ
ロセシングを確実にする。例えば、細菌系における発現
は、グリコシル化されていない産物を産生し、そして酵
母における発現は、グリコシル化された産物を産生す
る。遺伝子産物の一次転写、グリコシル化、およびリン
酸化の適切なプロセシングのための細胞機構を有する真
核生物宿主細胞が使用され得る。このような哺乳動物宿
主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｈｅｌ
ａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そ
して特に、例えば、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＦＩ、
ＳＫ−Ｎ−ＤＺヒト神経芽細胞腫（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ
ら、１９８４、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓ
ｔ．７３：５１−５７）、ＳＫ−Ｎ−ＳＨヒト神経芽細
胞腫（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１
９８２、７０４：４５０−４６０）、Ｄａｏｙヒト小脳
髄芽細胞腫（Ｈｅら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．５２：１１４４−１１４８）、ＤＢＴＲＧ０５ＭＧ
神経膠芽腫細胞（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌ
ｓ）（Ｋｒｕｓｅら、１９９２、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃ
ｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２８Ａ：６０９−６１
４）、ＩＭＲ−３２ヒト神経芽細胞腫（Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．、１９７０、３０：２１１０−２１１８）、１
３２１Ｎ１ヒト星状細胞腫（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９７７、７４：４８１６）、
ＭＯＧ−Ｇ−ＣＣＭヒト星状細胞腫（Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒ、１９８４、４９：２６９）、Ｕ８７ＭＧヒト神
経膠芽腫−星状細胞腫（Ａｃｔａ Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．第二版、１９６８、７４：４６５−４
８６）、Ａ１７２ヒト神経膠芽腫（Ｏｌｏｐａｄｅら、
１９９２、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：２５２３−２
５２９）、Ｃ６ラット神経膠腫細胞（ｇｌｉｏｍａ ｃ
ｅｌｌｓ）（Ｂｅｎｄａら、１９６８、Ｓｃｉｅｎｃｅ
１６１：３７０−３７１）、Ｎｅｕｒｏ−２ａマウス
神経芽細胞腫（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、１９７０、６５：１２９−１３６）、ＮＢ
４１Ａ３マウス神経芽細胞腫（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９６２、４８：１１８４−
１１９０）、ＳＣＰヒツジ脈絡叢（Ｂｏｌｉｎら、１９
９４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４８：２１１
−２２１）、Ｇ３５５−５、ＰＧ−４ネコ正常星状細胞
（Ｈａａｐａｌａら、１９８５、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５
３：８２７−８３３）、Ｍｐｆケナガイタチ脳（Ｔｒｏ
ｗｂｒｉｄｇｅら、１９８２、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ １
８：９５２−９６０）のような神経細胞株、ならびに、
例えば、ＣＴＸ ＴＮＡ２ラット正常皮質脳（Ｒａｄａ
ｎｙら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８９：６４６７−６４７１）（例えば、
ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔなど）のような
正常細胞株が挙げられるがこれらに限定されない。さら
に、異なるベクター／宿主発現系が、プロセシング反応
を異なる程度まで生じ得る。
【０２１３】長期にわたる高収率の組換えタンパク質産
生のために安定な発現が好ましい。例えば、差動的に発
現される遺伝子タンパク質、または経路（ｐａｔｈｗａ
ｙ）の遺伝子タンパク質を安定に発現する細胞株が操作
され得る。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使
用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント
（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写タ
ーミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択マ
ーカーによって制御されたＤＮＡで形質転換され得る。
外来ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、富化培
地中で１〜２日間増殖させられ得、次いで選択培地に置
き換えられる。組換えプラスミド中の選択マーカーは、
選択に対する耐性を与え、細胞がプラスミドをその細胞
の染色体に安定に組込み、そして病巣（これは、次にク
ローン化され得、そして細胞株にまで拡大され得る）を
形成するまで増殖することを可能にする。この方法は、
差動的に発現される遺伝子タンパク質、または経路の遺
伝子タンパク質を発現する細胞株を操作するために有利
に利用され得る。このように操作された細胞株は、差動
的に発現される遺伝子タンパク質、または経路の遺伝子
タンパク質の内因性の活性に影響する化合物のスクリー
ニングおよび評価において特に有用であり得る。
【０２１４】多数の選択系が使用され得、これらとし
て、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌ
ｅｒら、１９７７、Ｃｅｌｌ １１：２２３）、ヒポキ
サンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、１９
６２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
４８：２０２６）、およびアデニンホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、１９８０、Ｃｅｌｌ ２
２：８１７）の遺伝子が挙げられるが、これらには限定
されず、これらはそれぞれｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細
胞またはａｐｒｔ−細胞において使用され得る。また、
代謝拮抗物質耐性が、ｄｈｆｒ遺伝子（これは、メトト
レキサートに対する耐性を与える）（Ｗｉｇｌｅｒら、
１９８０、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７
７：３５６７；Ｏ’Ｈａｒｅら、１９８１、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２
７）；ｇｐｔ遺伝子（これは、ミコフェノール酸に対す
る耐性を与える）（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ、
１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ７８：２０７２）；ｎｅｏ遺伝子（これは、アミ
ノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与える）（Ｃｏ
ｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、１９８１、Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１）；ならびにｈｙｇｒｏ遺伝
子（これは、ヒグロマイシンに対する耐性を与える）
（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、１９８４、Ｇｅｎｅ３０：１４
７）について選択の基礎として使用され得る。
【０２１５】他の実施形態において、ＡＰＩ、フラグメ
ント、アナログ、または誘導体は、融合タンパク質産物
もしくはキメラタンパク質産物（ペプチド結合を介して
異種タンパク質配列に連結したタンパク質、フラグメン
ト、アナログ、または誘導体を含む）として発現され得
る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン
の定常ドメイン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）、
またはそれらの部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、もしく
はそれらの任意の組合せおよびそれらの部分）と融合さ
れ得、キメラポリペプチドを生じる。このような融合タ
ンパク質は、精製を容易にし、インビボでの半減期を増
加し、免疫系に対する上皮バリアを横切る抗原の送達を
増強する。インビボでの半減期の増加および精製を容易
にすることが、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つの
ドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽
鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク
質について示されている。例えば、ＥＰ ３９４，８２
７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３１：
８４−８６（１９８８）を参照のこと。免疫系に対する
上皮バリアを横切る抗原の増強された送達は、ＩｇＧフ
ラグメントまたはＦｃフラグメントのようなＦｃＲｎ結
合パートナーに結合体化された抗原（例えば、インシュ
リン）について実証されている（例えば、ＰＣＴ公開Ｗ
Ｏ ９６／２２０２４および同ＷＯ ９９／０４８１３
を参照のこと）。
【０２１６】ＡＰＩ、ＡＰＩのフラグメント、ＡＰＩに
関連するポリペプチド、またはＡＰＩに関連するポリペ
プチドのフラグメントをコードする核酸は、エピトープ
タグ（例えば、血球凝集素タグ（「ＨＡ」）またはフラ
ッグタグ（ｆｌａｇ ｔａｇ））に融合されて発現され
たポリペプチドの検出および精製を補助し得る。例え
ば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載された系は、ヒ
ト細胞株で発現された変性していない融合タンパク質の
容易な精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、１９
９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８８：８９７２−８９７）。
【０２１７】ＡＰＩ融合タンパク質は、当該分野で公知
の方法によって、所望のアミノ酸配列をコードする適切
な核酸配列を、適切なコードフレームにおいてお互いに
連結すること（ｌｉｇａｔｉｎｇ）、および当該分野で
一般的に知られている方法によってキメラ産物を発現す
ることによって作製され得る。あるいは、ＡＰＩ融合タ
ンパク質は、タンパク質合成技術によって（例えば、ペ
プチド合成機の使用によって）作製され得る。
【０２１８】ｃＤＮＡおよびゲノム配列の両方が、クロ
ーン化され、そして発現され得る。
【０２１９】（５．９ ＡＰＩのドメイン構造）本発明
によって提供されるいくつかのＡＰＩのドメインは、当
該分野で公知であり、そして科学文献に記載されてい
る。さらに、ＡＰＩのドメインは、当業者に公知の技術
を使用して同定され得る。例えば、ＡＰＩの１以上のド
メインは、１以上の次のプログラムを使用することによ
って同定され得る：ＰｒｏＤｏｍ、ＴＭｐｒｅｄ、およ
びＳＡＰＳ。ＰｒｏＤｏｍは、ポリペプチドのアミノ酸
配列と収集されたドメインのデータベースを比較する
（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｏｕｌｏｕｓｅ．
ｉｎｒａ．ｆｒ／ｐｒｏｄｏｍ．ｈｔｍｌ；Ｃｏｒｐｅ
ｔ Ｆ．、Ｇｏｕｚｙ Ｊ．＆ Ｋａｈｎ Ｄ．、１９
９９、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２７：２
６３−２６７を参照のこと）。ＴＭｐｒｅｄは、ポリペ
プチドの膜貫通領域およびその方向を予測する。このプ
ログラムは、ＴＭｂａｓｅ（天然に存在する膜貫通タン
パク質のデータベース）（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗ
ｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／
ＴＭＰＲＥＤ ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ；Ｈｏｆｍａｎｎ
＆ Ｓｔｏｆｆｅｌ．（１９９３）「ＴＭｂａｓｅ−Ａ
ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｐａ
ｎｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｅｇｍｅｎｔｓ」Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ３４
７、１６６を参照のこと）の統計学的解析に基づくアル
ゴリズムを使用する。ＳＡＰＳプログラムは、電荷−ク
ラスタ（ｃｈａｒｇｅ−ｃｌｕｓｔｅｒ）、繰り返し、
親水性領域、組成ドメイン（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａ
ｌ ｄｏｍａｉｎ）のような統計学的に有意な特徴につ
いてポリペプチドを解析する（例えば、Ｂｒｅｎｄｅｌ
ら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８９：２００２−２００６を参照のこ
と）。従って、当業者は、本明細書に基づいて、酵素的
活性または結合活性を有するＡＰＩのドメインを同定し
得、そしてさらに、このようなドメインをコードするヌ
クレオチド配列を同定し得る。次いで、これらのヌクレ
オチド配列は、ＡＰＩの酵素的活性または結合活性を保
持するＡＰＩフラグメントの組換え発現のために使用さ
れ得る。
【０２２０】当業者は、本明細書に基づいて、酵素的活
性または結合活性を有するＡＰＩのドメインを同定し
得、そしてさらにこのようなドメインをコードするヌク
レオチド配列を同定し得る。次いで、これらのヌクレオ
チド配列は、ＡＰＩの酵素的活性または結合活性を保持
するＡＰＩフラグメントの組換え発現のために使用され
得る。
【０２２１】１つの実施形態において、ＡＰＩは、同定
された既知のポリペプチドのドメインに十分に類似のア
ミノ酸配列を有する。本明細書中で使用される場合、用
語「機能的に類似」は、第一のアミノ酸配列または第一
のヌクレオチド配列が、一般的な構造ドメインもしくは
一般的な機能的活性あるいはその両方を有するか、また
はコードするように、第二のアミノ酸配列または第二の
ヌクレオチド配列に同一かもしくは等価な（例えば、類
似の側鎖を有する）アミノ酸残基もしくはヌクレオチド
を十分な数含む第一のアミノ酸配列または第一のヌクレ
オチド配列を言う。
【０２２２】ＡＰＩドメインは、当業者に周知の技術を
使用してその機能について評価され得る。例えば、ドメ
インは、そのキナーゼ活性またはＤＮＡに結合するその
能力について、当業者に周知の技術を使用して評価され
得る。キナーゼ活性は、例えば、基質をリン酸化するポ
リペプチドの能力を測定することによって評価され得
る。ＤＮＡ結合活性は、例えば、電気泳動度シフトアッ
セイ（ｅｌｅｃｔｒｏｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ
ａｓｓａｙ）において、ＤＮＡ結合エレメントに結合す
るポリペプチドの能力を測定することによって評価され
得る。好ましい実施形態において、ＡＰＩのドメインの
機能は、表ＩＸに同定される参照文献（補遺）の１以上
に記載されたアッセイを使用して決定される。
【０２２３】（５．１０ ＡＰＩに対する抗体の生成）
本発明によると、ＡＰＩ、ＡＰＩアナログ、ＡＰＩ関連
のタンパク質もしくはフラグメントまたは前記の任意の
誘導体が、免疫原として使用されて、このような免疫原
に免疫特異的に結合する抗体を生成し得る。このような
免疫原は、上記方法を含む任意の簡便な手段によって単
離され得る。本発明の抗体として、ポリクローナル抗
体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体
もしくはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメントお
よびＦ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリ
ーによって生成されたフラグメント、抗イディオタイプ
（抗−Ｉｄ）抗体、ならびに上記のいずれかのエピトー
プ結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定され
ない。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、
免疫グロブリン分子および免疫学的に活性な免疫グロブ
リン分子の部分、すなわち、抗原に特異的に結合する抗
原結合部位を含む分子を言う。本発明の免疫グロブリン
分子は、任意のクラスのもの（例えば、ＩｇＧ、Ｉｇ
Ｅ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ）または免疫グロブリ
ン分子のサブクラスのものであり得る。
【０２２４】１つの実施形態において、ＡＰＩをコード
する遺伝子の遺伝子産物を認識する抗体が調製され得
る。例えば、これらのＡＰＩおよび／またはアイソフォ
ームを認識する抗体として、以下を認識する抗体が挙げ
られる：ＡＰＩ−１、ＡＰＩ−３、ＡＰＩ−４、ＡＰＩ
−６、ＡＰＩ−７、ＡＰＩ−１０、ＡＰＩ−１５、ＡＰ
Ｉ−１６、ＡＰＩ−２２、ＡＰＩ−２８、ＡＰＩ−３
０、ＡＰＩ−３３、ＡＰＩ−３４、ＡＰＩ−３７、ＡＰ
Ｉ−３８、ＡＰＩ−３９、ＡＰＩ−４０、ＡＰＩ−４
２、ＡＰＩ−４３、ＡＰＩ−４４、ＡＰＩ−４５、ＡＰ
Ｉ−４６、ＡＰＩ−４７、ＡＰＩ−５０、ＡＰＩ−５
２、ＡＰＩ−５３、ＡＰＩ−５５、ＡＰＩ−５８、ＡＰ
Ｉ−６０、ＡＰＩ−６２、ＡＰＩ−６４、ＡＰＩ−６
６、ＡＰＩ−６７、ＡＰＩ−６９、ＡＰＩ−７２、ＡＰ
Ｉ−７４、ＡＰＩ−７５、ＡＰＩ−７６、ＡＰＩ−７
７、ＡＰＩ−７８、ＡＰＩ−７９、ＡＰＩ−８０、ＡＰ
Ｉ−８１、ＡＰＩ−８２、ＡＰＩ−８４、ＡＰＩ−９
０、ＡＰＩ−９２、ＡＰＩ−９３、ＡＰＩ−９５、ＡＰ
Ｉ−９７、ＡＰＩ−９８、ＡＰＩ−１０１、ＡＰＩ−１
０２、ＡＰＩ−１０３、ＡＰＩ−１０４、ＡＰＩ−１１
３、ＡＰＩ−１１８、ＡＰＩ−１１９、ＡＰＩ−１２
３、ＡＰＩ−１２４、ＡＰＩ−１２６、ＡＰＩ−１３
０、ＡＰＩ−１３１、ＡＰＩ−１３２、ＡＰＩ−１３
４、ＡＰＩ−１３６、ＡＰＩ−１３７、ＡＰＩ−１３
８、ＡＰＩ−１４０、ＡＰＩ−１４２、ＡＰＩ−１４
３、ＡＰＩ−１４５、ＡＰＩ−１４９、ＡＰＩ−１５
０、ＡＰＩ−１６１、ＡＰＩ−１６５、ＡＰＩ−１６
７、ＡＰＩ−１６８、ＡＰＩ−１６９、ＡＰＩ−１７
０、ＡＰＩ−１７１、ＡＰＩ−１７２、ＡＰＩ−１７
３、ＡＰＩ−１７４、ＡＰＩ−１７５、ＡＰＩ−１７
６、ＡＰＩ−１７８、ＡＰＩ−１７９、ＡＰＩ−１８
１、ＡＰＩ−１８２、ＡＰＩ−１８６、ＡＰＩ−１８
８、ＡＰＩ−１８９、ＡＰＩ−１９１、ＡＰＩ−１９
４、ＡＰＩ−１９６、ＡＰＩ−２０１、ＡＰＩ−２１
５、ＡＰＩ−２２０、ＡＰＩ−２２１、ＡＰＩ−２２
３、ＡＰＩ−２２５、ＡＰＩ−２３３、ＡＰＩ−２３
４、ＡＰＩ−２３７、ＡＰＩ−２３８、ＡＰＩ−２３
９、ＡＰＩ−２４０、ＡＰＩ−２４１、ＡＰＩ−２４
２、ＡＰＩ−２４３、ＡＰＩ−２４４、ＡＰＩ−２４
５、ＡＰＩ−２４６、ＡＰＩ−２４７、ＡＰＩ−２４
８、ＡＰＩ−３００、ＡＰＩ−３０１、ＡＰＩ−３０
２、ＡＰＩ−３０３、ＡＰＩ−３０４、ＡＰＩ−３０
５、ＡＰＩ−３０６、ＡＰＩ−３０７、ＡＰＩ−３０
８、ＡＰＩ−３０９、ＡＰＩ−３１０、ＡＰＩ−３１
１、ＡＰＩ−３１２、ＡＰＩ−３１３、ＡＰＩ−３１
４、ＡＰＩ−３１５、ＡＰＩ−３１６、ＡＰＩ−３１
７、ＡＰＩ−３１８、ＡＰＩ−３１９、ＡＰＩ−３２
０、ＡＰＩ−３２１、ＡＰＩ−３２２、ＡＰＩ−３２
３、ＡＰＩ−３２４、ＡＰＩ−３２５、ＡＰＩ−３２
６、ＡＰＩ−３２７、ＡＰＩ−３２８、ＡＰＩ−３２
９、ＡＰＩ−３３０、ＡＰＩ−３３１、ＡＰＩ−３３
２、ＡＰＩ−３３３、ＡＰＩ−３３４、ＡＰＩ−３３
５、ＡＰＩ−３３６、ＡＰＩ−３３７、ＡＰＩ−３３
８、ＡＰＩ−３３９、ＡＰＩ−３４０、ＡＰＩ−３４
１、ＡＰＩ−３４２、ＡＰＩ−３４３、ＡＰＩ−３４
４、ＡＰＩ−３４５、ＡＰＩ−３４６、ＡＰＩ−３４
７、ＡＰＩ−３４８、ＡＰＩ−３４９、ＡＰＩ−３５
０、ＡＰＩ−３５１、ＡＰＩ−３５２、ＡＰＩ−３５
３、ＡＰＩ−３５４、ＡＰＩ−３５５、ＡＰＩ−３５
６、ＡＰＩ−３５７、ＡＰＩ−３５８、ＡＰＩ−３５
９、ＡＰＩ−３６０、ＡＰＩ−３６１、ＡＰＩ−３６
２、ＡＰＩ−３６３、ＡＰＩ−３６４、ＡＰＩ−３６
５、ＡＰＩ−３６６、ＡＰＩ−３６７もしくはＡＰＩ−
３６８。特定の抗体がすでに公知であり、そして上の表
ＶＩＩに示されるような市販の供給源から購入し得る。
別の実施形態において、当業者に公知の方法を使用し
て、ＡＰＩ、ＡＰＩアナログ、ＡＰＩ関連ポリペプチド
または上記いずれかの誘導体もしくはフラグメントを認
識する抗体を生成し得る。
【０２２５】本発明の１つの実施形態において、ＡＰＩ
の特異的ドメインに対する抗体が生成され得る。特定の
実施形態において、ＡＰＩの親水性フラグメントが、抗
体生成のための免疫原として使用される。
【０２２６】抗体の生成において、所望の抗体について
のスクリーニングは、当該分野で公知の技術（例えば、
ＥＬＩＺＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ））によって達
成され得る。例えば、ＡＰＩの特異的なドメインを認識
する抗体を選択するために、このようなドメインを含む
ＡＰＩフラグメントに結合する生成物について生じたハ
イブリドーマをアッセイし得る。第一のＡＰＩホモログ
には特異的に結合するが、第二のＡＰＩホモログには特
異的に結合しない（または、より弱く（ｌｅｓｓ ａｖ
ｉｄｌｙ）結合する）抗体を選択するために、第一のＡ
ＰＩホモログにポジティブに結合し、第二のＡＰＩホモ
ログに結合しない（または結合が減少している）ことに
基づいて選択し得る。同様に、ＡＰＩに特異的に結合す
るが、同じタンパク質の異なるアイソフォーム（例え
ば、ＡＰＩと同一のコアペプチドを有する異なる糖形態
（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ））には特異的に結合しない（ま
たはより弱く結合する）抗体を選択するために、ＡＰＩ
にポジティブに結合し、異なるアイソフォーム（例え
ば、異なる糖形態）には結合しない（または結合が減少
している）ことに基づいて選択し得る。従って、本発明
は、ＡＰＩの異なるアイソフォーム（単数または複数）
（例えば、糖形態）よりも、ＡＰＩに対してより高い親
和性（詳細には少なくとも２倍、より詳細には少なくと
も５倍、なおより詳細には少なくとも１０倍高い親和
性）で結合する抗体（特に、モノクローナル抗体）を提
供する。
【０２２７】本発明の方法において使用され得るポリク
ローナル抗体は、免疫された動物の血清由来の抗体分子
の異種集団である。画分されていない免疫血清がまた使
用され得る。当該分野で公知の種々の手順が、ＡＰＩ、
ＡＰＩのフラグメント、ＡＰＩ関連ポリペプチド、また
はＡＰＩ関連ポリペプチドのフラグメントに対するポリ
クローナル抗体の生成のために使用され得る。特定の実
施形態において、ＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポリペプチド
のエピトープに対するウサギポリクローナル抗体が、得
られ得る。例えば、ポリクローナル抗体またはモノクロ
ーナル抗体の生成のために、種々の宿主動物（ウサギ、
マウス、ラットなどが挙げられるが、これらに限定され
ない）が、ネイティブなまたは合成（すなわち、組換
え）バージョンのＡＰＩ、ＡＰＩのフラグメント、ＡＰ
Ｉ関連ポリペプチド、またはＡＰＩ関連ポリペプチドの
フラグメントを注射することによって免疫され得る。こ
のような免疫化に適切な単離されたＡＰＩは、発見技術
（例えば、本明細書中に記載の好ましい技術）の使用に
よって得られ得る。ＡＰＩがゲル電気泳動によって精製
される場合、ＡＰＩはポリアクリルアミドゲルからの事
前の抽出ありかまたは抽出なしで免疫化のために使用さ
れ得る。宿主の種に依存して、種々のアジュバンドが、
免疫学的応答を増強するために使用され得る。このよう
なアジュバンドとして、完全フロイントアジュバンドも
しくは不完全フロイントアジュバンド、ミネラルゲル
（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例え
ば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニ
オン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペ
ットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびアジュ
バンド（例えば、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅ
ｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）またはｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が挙げられるが、これらに限
定されない。さらなるアジュバンドがまた、当該分野で
周知である。
【０２２８】ＡＰＩ、ＡＰＩのフラグメント、ＡＰＩ関
連ポリペプチド、またはＡＰＩ関連ポリペプチドのフラ
グメントに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の調製
のために、培養における連続的な細胞株による抗体分子
の生成を提供する任意の技術が使用され得る。例えば、
ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって最初に開
発されたハイブリドーマ技術（１９７５， Ｎａｔｕｒ
ｅ ２５６：４９５−４９７）、ならびにトリオーマ
（ｔｒｉｏｍａ）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術
（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
Ｔｏｄａｙ ４：７２）、およびヒトモノクローナル抗
体を生成するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌ
ｅら、１９８５、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌ
ａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、７７−９６頁）。この
ような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、Ｉｇ
Ｄを含む任意の免疫グロブリンのクラスおよびその任意
のサブクラスのものであり得る。本発明のｍＡｂを生成
するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培
養され得る。本発明のさらなる実施形態において、モノ
クローナル抗体は、公知の技術（ＰＣＴ／ＵＳ９０／０
２５４５、本明細書中で参考として援用される）を使用
する無菌動物で生成され得る。
【０２２９】モノクローナル抗体として、ヒトモノクロ
ーナル抗体およびキメラモノクローナル抗体（例えば、
ヒト−マウスキメラ）が挙げられるが、これらに限定さ
れない。ヒト化抗体は、１以上の非ヒト種由来の相補性
決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来
のフレームワーク領域を有するヒトではない種由来の抗
体分子である(例えば、Ｑｕｅｅｎ、米国特許第５，５
８５，０８９号（これは、その全体が参考として本明細
書中に援用される）を参照のこと)。
【０２３０】キメラモノクローナル抗体およびヒト化モ
ノクローナル抗体は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技
術（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ８７／０２６７１；
欧州特許出願第１８４，１８７号；欧州特許出願１７
１，４９６号；欧州特許出願１７３，４９４号；ＰＣＴ
公開番号ＷＯ ８６／０１５３３；米国特許第４，８１
６，５６７号；欧州特許出願第１２５，０２３号；Ｂｅ
ｔｔｅｒら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０
４１−１０４３；Ｌｉｕら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９−３
４４３；Ｌｉｕら、１９８７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら、１９８７、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２
１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、１９８７、Ｃａ
ｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら、
１９８５、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９；お
よび、Ｓｈａｗら、１９８８、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９；Ｍｏｒｒ
ｉｓｏｎ、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０
２−１２０７；Ｏｉら、１９８６、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ ４：２１４；米国特許第５，２２５，５３
９号；Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ３２１：
５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒ
ら、１９８８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３
−４０６０に記載の方法を使用して）によって生成され
得る。
【０２３１】完全ヒト抗体（ヒト抗原材料からのみ誘導
される抗体）は、ヒト被験体の治療的処置に特に所望さ
れる。このような抗体は、トランスジェニックマウス
（これは、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子および軽鎖
遺伝子を発現し得ないが、ヒト重鎖遺伝子および軽鎖遺
伝子を発現し得る）を使用して生成され得る。このトラ
ンスジェニックマウスは、通常の様式で選択された抗原
（例えば、本発明のＡＰＩの全てまたは一部）を使用し
て免疫される。この抗原に対するモノクローナル抗体
は、従来のハイブリドーマ技術を使用して得られ得る。
トランスジェニックマウスによって保有されるヒト免疫
グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再配列し、
そして続いてクラススイッチング（ｃｌａｓｓ ｓｗｉ
ｃｈｉｎｇ）および体細胞変異を受ける。従って、この
ような技術を使用して、治療的に有用なＩｇＧ、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を生成し得る。ヒト抗体を
生成するためのこの技術の概要について、Ｌｏｎｂｅｒ
ｇおよびＨｕｓｚａｒ（１９９５、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３）を参照のこと。ヒト
抗体およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのこ
の技術ならびにこのような抗体を生成するためのプロト
コルの詳細な議論について、例えば、米国特許第５，６
２５，１２６；米国特許第５，６３３，４２５号；米国
特許第５，５６９，８２５号；米国特許第５，６６１，
０１６号；および米国特許第５，５４５，８０６号を参
照のこと。さらに、企業（例えば、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉ
ｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａ
ｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ））は、上記に類似の技
術を使用して選択された抗原に対するヒト抗体を生成す
るために従事し得る。
【０２３２】選択されたエピトープを認識する完全ヒト
抗体は、「誘導（された）選択（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌ
ｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる技術を使用して生成され得
る。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノク
ローナル抗体（例えば、マウス抗体）を使用して、同一
のエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導（ｇ
ｕｉｄｅ）し得る。（Ｊｅｓｐｅｒｓら（１９９４）Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３）。
【０２３３】本発明の抗体はまた、当該分野で公知の種
々のファージディスプレイ法を使用して生成され得る。
ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメイン
は、これらをコードするポリヌクレオチド配列を保有す
るファージ粒子の表面上に示される。詳細には、このよ
うなファージを使用してレパートリー抗体ライブラリー
またはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒ
トまたはマウス）から発現される抗体結合ドメインを示
し得る。目的の抗原を結合する抗原結合ドメインを発現
するファージは、抗原を用いて（例えば、標識された抗
原または固体表面またはビーズに結合もしくは捕捉され
た抗原を使用して）選択または同定され得る。これらの
方法において使用されるファージは、代表的には線維状
ファージであり、これは、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはジスル
フィドで安定化されたＦｖ抗体ドメイン（ファージ遺伝
子ＩＩＩまたはファージ遺伝子ＶＩＩＩのタンパク質の
いずれかに組換え融合されている）を有するファージか
ら発現されたｆｄ結合ドメインおよびＭ１３結合ドメイ
ンを含む。本発明の抗体を作製するために使用され得る
ファージディスプレイ方法として、以下に開示される方
法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９
５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌ
ｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２
４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇ
ｅｎｅ１８７ ９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ
ら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号Ｐ
ＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ ９０／
０２８０９；同ＷＯ ９１／１０７３７；同ＷＯ ９２
／０１０４７；同ＷＯ ９２／１８６１９；同ＷＯ９３
／１１２３６；同ＷＯ ９５／１５９８２；同ＷＯ ９
５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２
６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４
８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，
９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２
１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４
２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，
７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第
５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８
号；これらのそれぞれは、その全体が参考として本明細
書中で援用される。
【０２３４】上の参考文献において記載されるように、
ファージを選択した後、このファージ由来の抗体コード
領域は、単離され得、そして全抗体（ヒト抗体または任
意の他の所望される抗原結合フラグメントを含む）を生
成するために使用され、そして任意の所望される宿主
（例えば、以下に詳細に記載されるような哺乳動物細
胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む）に
おいて発現される。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ
（ａｂ’）２フラグメントを組換え生成するための技術
はまた、以下に開示されるような当該分野で公知の方法
を使用して利用され得る：ＰＣＴ公開ＷＯ ９２／２２
３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およ
びＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ ３４：２６−３４（１９９
５）；ならびにＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
０：１０４１−１０４３（１９８８）（これらの参照文
献は、その全体が参考として援用される）。
【０２３５】本発明の単鎖ＦｖｓおよびＡＰＩに対する
抗体を生成するために使用され得る適切な技術の例とし
て、以下に記載される技術が挙げられる：米国特許第
４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８
号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈ
ｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９
３）；ならびにＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
０：１０３８−１０４０（１９８８）。
【０２３６】本発明はさらに、二重特異性抗体の使用を
提供し、この二重特異性抗体は、当該分野で公知の方法
によって作製され得る。全長二重特異性抗体の従来の生
成は、２つの鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロ
ブリンの重鎖−軽鎖対の同時発現に基づく（Ｍｉｌｓｔ
ｅｉｎら、１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７−
５３９）。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の無作為な
組合せのために、これらのハイブリドーマ（クアドロー
マ（ｑｕａｄｒｏｍａ））は、１つのみが正確な二重特
異性構造を有する１０の異なる抗体分子の潜在的混合物
を生成する。正確な分子の精製（これは、通常アフィニ
ティークロマトグラフィー工程により行われる）は、か
なり取り扱いにくく、生成物の収率は低い。同様の手順
が、ＷＯ９３／０８８２９（１９９３年５月１３日公
開）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１，ＥＭＢ
Ｏ Ｊ．１０：３６５５−３６５９に開示されている。
【０２３７】異なる、より好ましいアプローチに従っ
て、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体
−抗原結合部位）が、免疫グロブリン定常ドメイン配列
に融合される。この融合は、好ましくは、ヒンジ領域、
ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む
免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖
結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）
が、融合物の少なくとも１つに存在することが好まし
い。免疫グロブリン重鎖融合物をコードするＤＮＡ、お
よび所望である場合には、免疫グロブリン軽鎖が、別個
の発現ベクターに挿入され、そしてこれらは適切な宿主
生物に同時にトランスフェクトされる。これは、この構
築で使用される不等比の３つのポリペプチド鎖が、最適
収率を提供する実施形態において、この３つのポリペプ
チドフラグメントの相互割合の調整に大きな柔軟性を提
供する。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖が同
じ比で発現されることが、高収率を生じるか、またはこ
の比が特に重要でない場合に、２つまたは３つ全てのポ
リペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入
することが可能である。
【０２３８】本アプローチの好ましい実施形態におい
て、二重特異性抗体は、一方の腕のハイブリッド免疫グ
ロブリン重鎖（第一の結合特異性を有する）、および他
方の腕にハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第
二の結合特異性を提供する）から構成される。二重特異
性分子の１／２のみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在
が容易な分離方法を提供するので、この非対称構造が、
所望されない免疫グロブリン鎖の組み合わせから所望の
二重特異性化合物を分離することを容易にすることが見
出された。このアプローチは、１９９４年３月３日に公
開されたＷＯ ９４／０４６９０に開示されている。二
重特異性抗体を生成するためのさらなる詳細について
は、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８６、１２１：２１０を参
照のこと。
【０２３９】本発明は、抗ＡＰＩ免疫グロブリン分子の
機能的に活性なフラグメント、誘導体またはアナログを
提供する。機能的に活性なとは、このフラグメント、誘
導体またはアナログが、抗−抗イディオタイプ抗体（す
なわち、三次抗体）（これは、このフラグメント、誘導
体、またはアナログが誘導される抗体によって認識され
るのと同じ抗原を認識する）を惹起し得ることを意味す
る。特に好ましい実施形態において、免疫グロブリン分
子のイディオタイプの抗原性は、フレームワークおよび
抗原を特異的に認識するＣＤＲ配列に対してＣ末端に存
在するＣＤＲ配列の欠失によって増強され得る。どのＣ
ＤＲ配列が抗原に結合するかを決定するために、ＣＤＲ
配列を含む合成ペプチドが、当該分野で公知の適切な任
意の結合アッセイによる抗原を用いる結合アッセイにお
いて使用され得る。
【０２４０】本発明は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントお
よびＦａｂフラグメントのような抗体フラグメントを提
供するが、これらに限定されない。特異的なエピトープ
を認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって生
成され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領
域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインからな
り、そしてこれらは、抗体分子のペプシン消化によって
生成される。Ｆａｂフラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２フ
ラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって
生成される。本発明はまた、本発明の抗体の重鎖および
軽鎖二量体、もしくはそれらの任意の最小フラグメント
（例えば、Ｆｖｓもしくは単鎖抗体（ＳＣＡ）） (例え
ば、米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ、１９
８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２；Ｈｕｓ
ｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３；およびＷ
ａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４−
５４に記載されるような)、または本発明の抗体と同一
の特異性を有する任意の他の分子を提供する。単鎖抗体
は、アミノ酸架橋を介するＦｖ領域の重鎖フラグメント
と軽鎖フラグメントとの連結によって形成され、単鎖ポ
リペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉ中に機能的なＦｖフ
ラグメントを組み立てるための技術が使用され得る（Ｓ
ｋｅｒｒａら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１
０３８−１０４１）。
【０２４１】他の実施形態において、本発明は、本発明
の免疫グロブリンの融合タンパク質（または、その機能
的に活性なフラグメント）を提供し、ここで例えば、免
疫グロブリンは、この免疫グロブリンではない別のタン
パク質（またはその部分、好ましくは、そのタンパク質
の少なくとも１０、２０または５０のアミノ酸の部分）
のアミノ酸配列に対してＮ末端もしくはＣ末端のいずれ
かで、共有結合（例えば、ペプチド結合）を介して融合
される。好ましくは、この免疫グロブリンまたはそのフ
ラグメントは、定常ドメインのＮ末端で他のタンパク質
に共有結合される。上記のように、このような融合タン
パク質は、精製を容易にし得、インビボでの半減期を増
加し得、そして免疫系に対する内皮バリアを横切る抗原
の送達を高め得る。
【０２４２】本発明の免疫グロブリンは、アナログおよ
び誘導体を含み、これらはいずれも改変されている（す
なわち、任意の分子型の共有結合によって（このような
共有結合が免疫特異的結合を害さない限り））。例え
ば、限定ではないが、免疫グロブリンの誘導体およびア
ナログとして、例えば、グリコシル化、アセチル化、ぺ
グ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化、アミド化、
公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質
分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への
結合などによってさらに改変された誘導体およびアナロ
グが挙げられる。多数の化学的な改変のいずれかが、公
知の技術（特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化
などが挙げられるが、これらに限定されない）によって
行われ得る。さらに、アナログまたは誘導体は、１以上
の非古典的なアミノ酸または非天然のアミノ酸を含み得
る。
【０２４３】上記抗体は、本発明のＡＰＩの局在化およ
び活性に関連する当該分野で公知の方法において、例え
ば、これらのタンパク質を画像化するため、適切な生理
学的サンプル中のこれらのレベルを測定するため、診断
的方法などにおいて使用され得る。
【０２４４】（５．１１ 抗体の発現）本発明の抗体
は、抗体の合成のための当該分野で公知の任意の適切な
方法、詳細には、化学的合成、または組換え発現によっ
て生成され得、好ましくは、組換え発現技術によって生
成される。
【０２４５】抗体、またはそのフラグメント、誘導体も
しくはアナログの組換え発現は、この抗体をコードする
核酸の構築を必要とする。抗体のヌクレオチド配列が既
知である場合には、抗体をコードする核酸が、化学的に
合成されたオリゴヌクレオチドから構築され得る（例え
ば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、１９９４、ＢｉｏＴｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ １７：２４２に記載のように）。これは、
簡単には、抗体をコードする配列の部分を含むオーバー
ラッピングオリゴヌクレオチドを合成する工程、これら
のオリゴヌクレオチドをアニーリングおよび連結する工
程、そして次いで、連結されたオリゴヌクレオチドをＰ
ＣＲによって増幅する工程を包含する。
【０２４６】あるいは、抗体をコードする核酸が、抗体
をクローニングすることによって得られ得る。特定の抗
体をコードする核酸を含むクローンが利用可能ではない
が、抗体分子の配列が既知である場合、この抗体をコー
ドする核酸が、適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡラ
イブラリー、またはこの抗体を発現している任意の組織
または細胞から生成されたｃＤＮＡライブラリー）か
ら、配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可
能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によってか、
または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチド
プローブを使用するクローニングによって、得られ得
る。
【０２４７】特定の抗原を特異的に認識する抗体分子
（またはこのような抗体をコードする核酸をクローニン
グするためのｃＤＮＡライブラリーのための供給源）が
利用可能でない場合、特定の抗原に特異的な抗体が、当
該分野で公知の任意の方法（例えば、ウサギのような動
物を免疫して、ポリクローナル抗体、またはより好まし
くはモノクローナル抗体を生成すること）によって生成
され得る。あるいは、少なくとも抗体のＦａｂ部分をコ
ードするクローンは、Ｆａｂ発現ライブラリー（例え
ば、Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：
１２７５−１２８１に記載のような）を特定の抗原に結
合するＦａｂフラグメントのクローンについてスクリー
ニングすることによってか、または抗体ライブラリーを
スクリーニングすることによって得られ得る（例えば、
Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３５
２：６２４；Ｈａｎｅら、１９９７ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４９３７を参照
のこと）。
【０２４８】一旦、少なくとも抗体分子の可変ドメイン
をコードする核酸が得られると、この核酸は、抗体分子
の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むベクタ
ーに導入され得る（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ８６／０
５８０７；ＰＣＴ公開ＷＯ８９／０１０３６；および米
国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）。完全な
抗体分子の発現を可能にする核酸を用いて同時に発現す
るための完全な軽鎖または重鎖を含むベクターもまた利
用可能である。次いで、抗体をコードする核酸を使用し
て、スルフヒドリル基を含まないアミノ酸残基との鎖内
ジスルフィド結合に関与する可変領域の１以上のシステ
イン残基を置換（または欠失）するために必要なヌクレ
オチドの置換、または欠失を導入し得る。このような改
変は、ヌクレオチド配列に特定の変異または欠失を導入
するための当該分野で公知の任意の方法（例えば、化学
的変異誘発、インビトロでの部位特異的変異誘発（Ｈｕ
ｔｃｈｉｎｓｏｎら、１９７８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２５３：６５５１）、ＰＣＴに基づく方法などが挙
げられるが、これらに限定されない）によって行われ得
る。
【０２４９】さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分
子由来の遺伝子と共に適切な抗原特異性のマウス抗体分
子由来の遺伝子をスプライシングすることによる、「キ
メラ抗体」の産生のために発展した技術が使用され得る
（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５；Ｎｅｕ
ｂｅｒｇｅｒら、１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６
０４−６０８；Ｔａｋｅｄａら、１９８５，Ｎａｔｕｒ
ｅ ３１４：４５２−４５４）。上記のように、キメラ
抗体は、異なる部分が異なる動物種由来である分子（例
えば、マウスｍＡｂ由来の可変領域およびヒト抗体定常
領域を有する分子（例えば、ヒト化抗体））である。
【０２５０】一旦、本発明の抗体分子をコードする核酸
が得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当
該分野で周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって
産生される。従って、抗体分子配列を含む核酸の発現に
よって本発明のタンパク質を調製するための方法が、本
明細書中に記載される。当業者に周知の方法を使用し
て、抗体分子コード配列ならびに適切な転写および翻訳
の制御シグナルを含む発現ベクターを構築し得る。これ
らの方法としては、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技
術、合成技術およびインビボ遺伝子組換えが挙げられ
る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９９０、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）およびＡｕｓｕｂｅｌら
（編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ）に記載される技術
を参照のこと。
【０２５１】発現ベクターは、従来の技術によって宿主
細胞に転移され、次いでこのトランスフェクトされた細
胞は、本発明の抗体を産生するための従来の技術によっ
て培養される。
【０２５２】本発明の組換え抗体を発現するために使用
される宿主細胞は特に、全組換え抗体分子発現のため
に、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）または好ましくは、真核生物細胞のいずれかであ
り得る。特に、ベクター（例えば、ヒトサイトメガロウ
イルス由来の主要な中間初期遺伝子プロモーターエレメ
ント）と共に、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハ
ムスター卵巣細胞（ＣＨＯ））は、抗体のための有効な
発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、１９８６，Ｇｅｎ
ｅ ４５：１０１；Ｃｏｃｋｅｔｔら、１９９０，Ｂｉ
ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２）。
【０２５３】種々の宿主−発現ベクター系は、本発明の
抗体分子を発現するのに利用され得る。このような宿主
−発現系は、ビヒクルを提供し、このビヒクルによっ
て、目的のコード配列が産生され得、引き続いて精製さ
れ得るだけでなく、適切なヌクレオチドコード配列で形
質転換するかまたはトランスフェクトする場合、インサ
イチュで本発明の抗体分子を発現し得る細胞もまた提供
する。これらとしては、以下が挙げられるがこれらに限
定されない：抗体コード配列を含む組換えバクテリオフ
ァージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベク
ターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した
細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
のような微生物；抗体コード配列を含む組換え酵母発現
ベクターで形質転換した酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体コード配列を含む
組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイル
ス）で感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベク
ター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭ
Ｖ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染させた
か、または抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現
ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した、
植物細胞系；あるいは、哺乳動物細胞のゲノム由来のプ
ロモーター（例えば、メタロチオネンプロモーター）ま
たは哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、ア
デノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス
７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を含む
哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２
９３、３Ｔ３細胞）。
【０２５４】細菌系において、多数の発現ベクターが、
発現される抗体分子について意図される用途に依存して
有利に選択され得る。例えば、このような多量のタンパ
ク質が産生される場合、抗体分子を含有する薬学的組成
物の生成のために、容易に精製された高レベルの融合タ
ンパク質産物の発現を指向するベクターが望ましくあり
得る。このようなベクターとしては以下が挙げられるが
これらに限定されない：Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵ
Ｒ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、１９８３，ＥＭＢＯ Ｊ．
２：１７９１）（ここで、抗体コード配列が、ｌａｃ
Ｚコード領域とインフレームでベクターに個々に結合さ
れ得、その結果、融合タンパク質が産生される）；ｐＩ
Ｎベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ，１９８
５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１
０１−３１０９；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓ
ｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５
５０３−５５０９）など。ｐＧＥＸベクターを使用し
て、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を
用いて、融合タンパク質として外来性ポリペプチドもま
た発現させ得る。一般的に、このような融合タンパク質
は、可溶性であり、そしてマトリクスグルタチオン−ア
ガロースビーズへの吸着および結合、引き続く遊離グル
タチオンの存在下での溶離によって、溶解細胞から容易
に精製され得る。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまた
はＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計さ
れ、その結果、クローン化標的遺伝子産物がＧＴＳ部分
から放出され得る。
【０２５５】昆虫系において、サインカリフォルニア核
多面性ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏ
ｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉ
ｓｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）が、外来性遺伝子を発現
するためのベクターとして使用される。このウイルス
は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞
中で増殖する。抗体コード配列は、ウイルスの非本質的
な領域（例えば、多面性遺伝子）内に個々にクローン化
されて、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、多面性プロ
モーター）の制御下で配置され得る。哺乳動物宿主細胞
において、多数のウイルスベースの発現系（例えば、ア
デノウイルス発現系）が利用され得る。
【０２５６】上記のように、挿入した配列の発現を調節
するか、または所望な特定の様式で遺伝子産物を改変お
よびプロセシングする宿主細胞株は、本記載に基づいて
選択され得る。タンパク質産物のこのような改変（例え
ば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切
断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。
【０２５７】組換え抗体の長期間の高収率産生のため
に、安定な発現が好ましい。例えば、目的の抗体を安定
に発現する細胞株は、細胞を発現ベクターでトランスフ
ェクトすることによって産生され得る。この発現ベクタ
ーは、抗体のヌクレオチド配列および選択マーカー（例
えば、ネオマイシンまたはハイグロマイシン）のヌクレ
オチド配列を含み、かつこの選択マーカーの発現につい
て選択される。このような操作される細胞株は、直接的
または間接的に抗体分子と相互作用する化合物のスクリ
ーニングおよび評価の際に特に有用であり得る。
【０２５８】抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅に
よって増加され得る（総説については、Ｂｅｂｂｉｎｇ
ｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏ
ｆｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍ
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍ
ａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏ
ｎｉｎｇ，第３巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照のこと）。抗体を発
現するベクター系におけるマーカーが増幅可能な場合、
宿主細胞の培養物に存在するインヒビターのレベルの増
加は、マーカー遺伝子のコピーの数を増加させる。増幅
した領域が抗体遺伝子と関連しているため、抗体の産生
もまた増加される（Ｃｒｏｕｓｅら、１９８３，Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７）。
【０２５９】宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター
（重鎖由来のポリペプチドをコードする第一のベクター
および軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベク
ター）で同時トランスフェクトされ得る。これら２つの
ベクターは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチド
の等しい発現を可能にする同一の選択マーカーを含み得
る。あるいは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチ
ドの両方をコードする単一ベクターが、使用され得る。
このような状況下において、軽鎖は、過剰な毒性遊離重
鎖を回避するように重鎖の前に配置されなければならな
い（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｄ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３
２２：５２；Ｋｏｈｌｅｒ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７）。
重鎖および軽鎖についてのコード配列は、ｃＤＮＡまた
はゲノムＤＮＡを含み得る。
【０２６０】一旦、本発明の抗体分子が、組換え的に発
現されると、それは抗体分子の精製のための当該分野で
公知の任意の方法（例えば、クロマトグラフィー（例え
ば、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡまた
は特定の抗原を用いるアフィニティークロマトグラフィ
ー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠
心分離、差次的な溶解性、またはタンパク質の精製につ
いての他の任意の標準的な方法）によって精製され得
る。
【０２６１】あるいは、任意の融合タンパク質が発現さ
れる融合タンパク質に特異的な抗体を用いて容易に精製
され得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載
される系は、ヒト細胞株において発現される非変性融合
タンパク質をただちに精製することを可能にする（Ｊａ
ｎｋｎｅｃｈｔら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８９７２−８９７）。
この系において、目的の遺伝子は、ワクシニア組換えプ
ラスミドにサブクローン化され、その結果、遺伝子のオ
ープンリーディングフレームは、６つのヒスチジン残基
からなるアミノ末端タグに翻訳的に融合される。このタ
グは、融合タンパク質についてのマトリクス結合ドメイ
ンとして作用する。組換えワクシニアウイルスで感染さ
せた細胞からの抽出物は、Ｎｉ２＋ニトリロ酢酸アガロ
ースカラムに充填され、そしてヒスチジンタグ化タンパ
ク質は、イミダゾール含有緩衝液で選択的に溶出され
る。
【０２６２】（５．１２ 結合体化抗体）好ましい実施
形態において、抗ＡＰＩ抗体またはそのフラグメント
は、診断分子または治療分子に結合体化される。例え
ば、この抗体を、診断に、または所定の処理レジメンの
効力を決定するために使用し得る。検出は、抗体を検出
可能な物質に結合することによって容易にされ得る。検
出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子団、
蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射活性核種、
（陽子放出断層撮影法における使用のための）ポジトロ
ン放出金属、および非放射活性常磁性金属イオンが挙げ
られる。一般的に、本発明に従って診断剤としての使用
のために抗体に結合され得る金属イオンについての米国
特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵素
としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホス
ファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコ
リンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子団の例と
しては、ストレプトアビジン、アビジンおよびビオチン
が挙げられ；適切な蛍光物質としては、ウンベリフェロ
ン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネー
ト、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレ
セイン、ダンシルクロリドおよびフィコエリトリンが挙
げられ；適切な発光物質としては、ルミノールが挙げら
れ；適切な生物発光物質としては、ルシフェラーゼ、ル
シフェリンおよびエクオリンが挙げられ；ならびに、適
切な放射活性核種としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１
１Ｉｎおよび９９Ｔｃが挙げられる。
【０２６３】抗ＡＰＩ抗体またはそのフラグメントは、
治療剤または医薬品に結合されて、所定の生物学的応答
を改変し得る。治療剤または薬物部分は、古典的な化学
的治療剤に限定されると解釈されない。例えば、薬物部
分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポ
リぺプチドであり得る。このようなタンパク質として
は、例えば、毒素（例えばアブリン、リシンＡ、シュー
ドモナス外毒素、またはジフテリア毒素）；タンパク質
（例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−
インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因
子、組織プラスミノゲンアクチベーター、血栓症薬もし
くは抗脈管形成薬（例えば、アンジオスタチンもしくは
エンドスタチン）；または生物学的応答改変剤（例えば
リンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、イ
ンターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−
６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因
子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−Ｃ
ＳＦ）、神経発育因子（ＮＧＦ）、または他の増殖因
子）が挙げられ得る。
【０２６４】このような治療部分を抗体に結合する技術
は、周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕ
ｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈ
ｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６
頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈ
ｅｌｌｓｔｒｏｍら、「ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＦｏｒ
Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ
ＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ（第二版）、Ｒｏｂｉｎｓ
ｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋ
ｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔ
ｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘ
ｉｃ Ａｇｅｎｔｓ ＩｎＣａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎ
ｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐ
ｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１９８
５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ
ＦｕｔｕｒｅＰｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＵｓｅＯｆ Ｒａｄｉｏｌａ
ｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ
Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏ
ｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら
（編）、３０３−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ １９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ Ｐ
ｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ
Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏ
ｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒ
ｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。
これらの参考文献は、その全体が本明細書中で援用され
る。
【０２６５】あるいは、抗体は、Ｓｅｇａｌにより米国
特許第４，６７６，９８０号に記載されるように、二次
抗体に結合され、抗体ヘテロ結合体を形成し得る。
【０２６６】単独または細胞毒因子および／もしくはサ
イトカインと組合せて投与される抗体（その抗体に結合
する治療部分を有するまたは有さない）は、治療剤とし
て使用され得る。
【０２６７】（５．１３ アルツハイマー病の診断）本
発明に従って、アルツハイマー病を患うと疑われるか、
またはアルツハイマー病を患うことが知られている被験
体から得られた適切な試験サンプル（例えば、脳脊髄液
（ＣＳＦ）、血清、血漿または尿）が、診断のために使
用され得る。１つの実施形態において、（アルツハイマ
ー病でない被験体由来の）コントロールサンプルまたは
以前に決定された参照範囲と比較して、試験サンプル中
の１つ以上のＡＦもしくはＡＰＩ（またはそれらの任意
の組み合わせ）の減少した量は、アルツハイマー病の存
在を示す；この目的に適切なＡＦおよびＡＰＩは、上で
詳細に記載されるように、表ＩおよびＩＶにおいてそれ
ぞれ同定される。本発明の別の実施形態において、コン
トロールサンプルまたは以前に決定された参照範囲と比
較して、試験サンプル中の１つ以上のＡＦもしくはＡＰ
Ｉ（またはそれらの任意の組み合わせ）の増加した量
は、アルツハイマー病の存在を示す；この目的に適切な
ＡＦおよびＡＰＩは、上で詳細に記載されるように、表
ＩＩおよびＶにおいてそれぞれ同定される。別の実施形
態において、コントロールサンプルまたは以前に決定さ
れた参照範囲と比較して、試験サンプル中の１つ以上の
ＡＦもしくはＡＰＩ（またはそれらの任意の組み合わ
せ）の相対的な量は、アルツハイマー病（例えば、家族
性または散発性のアルツハイマー病）のサブタイプを示
す。なお別の実施形態において、コントロールサンプル
または以前に決定された参照範囲と比較して、試験サン
プル中の１つ以上のＡＦもしくはＡＰＩ（またはそれら
の任意の組み合わせ）の相対的な量は、アルツハイマー
病の程度または重篤度を示す。前述の方法のいずれかに
おいて、本明細書中で記載される１つ以上のＡＰＩの検
出は、アルツハイマー病についての１つ以上のさらなる
生物マーカー（アポプリポプロテインＥ（ａｐｏｐｌｉ
ｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡｐｏＥ）、アミロイドβ−ペ
プチド（Ａβ）、τおよび中性のスレッドタンパク質
（ＮＴＰ）が挙げられるが、これらに限定されない）の
検出と必要に応じて組み合わされる。当該分野において
適切な任意の方法は、ＡＦおよびＡＰＩのレベルを測定
するために用いられ得、この方法としては、以下が挙げ
られるがこれらに限定されない：本明細書中で記載され
る好ましい技術、キナーゼアッセイ、ＡＰＩを検出およ
び／または可視化するための免疫アッセイ（例えば、ウ
エスタンブロットの免疫沈降、続くドデシル硫酸ナトリ
ウムポリアシルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学な
ど）。ＡＰＩが公知の機能を有する場合において、その
機能についてのアッセイを使用してＡＰＩ発現を測定し
得る。さらなる実施形態において、コントロールサンプ
ルまたは以前に決定された参照範囲と比較して、表ＩＶ
において同定される試験サンプル中の１つ以上のＡＰＩ
（またはそれらの任意の組み合わせ）をコードするｍＲ
ＮＡの減少した量は、アルツハイマー病の存在を示す。
なおさらなる実施形態において、コントロールサンプル
または明らかに決定された参照範囲と比較して、表Ｖに
おいて同定される試験サンプル中の１つ以上のＡＰＩ
（またはそれらの任意の組み合わせ）をコードするｍＲ
ＮＡの増加した量は、アルツハイマー病の存在を示す。
任意の適切なハイブリダイゼーションアッセイを使用し
て、ＡＰＩをコードするｍＲＮＡを検出および／または
可視化することによって（例えば、ノーザンアッセイ、
ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーション
など）、ＡＰＩ発現を検出し得る。
【０２６８】本発明の別の実施形態において、ＡＰＩに
特異的に結合する標識化抗体、それらの誘導体およびア
ナログを、診断目的のために（例えば、アルツハイマー
病を検出、診断またはモニタリングするために）使用し
得る。好ましくは、アルツハイマー病は、動物におい
て、より好ましくは、哺乳動物において、最も好ましく
は、ヒトにおいて検出される。
【０２６９】（５．１４ スクリーニングアッセイ）本
発明は、ＡＰＩに結合するか、あるいはＡＰＩの発現ま
たはＡＰＩの活性に対して刺激効果または阻害効果を有
する因子（例えば、化学化合物、タンパク質またはペプ
チド）を同定するための方法を提供する。本発明はま
た、ＡＰＩ関連ポリペプチドまたはＡＰＩ融合タンパク
質に結合するか、あるいはＡＰＩ関連ポリペプチドまた
はＡＰＩ融合タンパク質の発現または活性に対して刺激
効果または阻害効果を有する、因子、候補化合物または
試験化合物を同定する方法を提供する。これらの因子、
候補化合物または試験化合物の例としては、核酸（例え
ば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、糖質、脂質、タンパク質、
ペプチド、ペプチド模倣物、低分子および他の薬物が挙
げられるがこれらに限定されない。因子は、当該分野に
おいて公知のコンビナトリアルライブラリー法における
多数の適切なアプローチのいずれかを使用して得られ
得、これらのライブラリーには、以下が挙げられる：生
物学的ライブラリー；空間的にアクセス可能な平行固相
もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳を要する合成ライ
ブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；お
よびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する
合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチ
はペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのア
プローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化
合物の低分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ，
１９９７，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．
１２：１４５；米国特許第５，７３８，９９６号；およ
び同第５，８０７，６８３号（これらの各々が、その全
体が本明細書中で参考として援用される））。
【０２７０】分子ライブラリーの合成のための方法の例
は、当該分野において、例えば以下に見出され得る：Ｄ
ｅＷｉｔｔら、１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６９０９；Ｅｒｂら、１９
９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、１９９
４，Ｊ，Ｍｅｄ，Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏ
ら、１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃ
ａｒｒｅｌｌら、１９９４，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉ
ｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ
ら、１９９４，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．
Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら、１
９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３（これ
らの各々が、その全体が本明細書中で参考として援用さ
れる）。
【０２７１】化合物のライブラリーは、例えば、溶液中
で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、１９９２，Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２〜４２１）、あるい
はビーズ上（Ｌａｍ、１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５
４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ、１９９３，
Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５〜５５６）、細菌（米国
特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，
５７１，６９８号；同第５，４０３，４８４号；および
同第５，２３３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ
ら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５〜１８６９）またはファー
ジ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、１９９０，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ、１
９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４〜４０６；Ｃ
ｗｉｒｌａら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６３７８〜６３８２；およ
びＦｅｌｉｃｉ、１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２
２２：３０１〜３１０（これらの各々が、その全体が本
明細書中で参考として援用される））において示され得
る。
【０２７２】１つの実施形態において、ＡＰＩ、ＡＰＩ
フラグメント（例えば、機能的に活性なフラグメン
ト）、ＡＰＩ関連ポリペプチド、ＡＰＩ関連ポリペプチ
ドのフラグメント、またはＡＰＩ融合タンパク質と相互
作用する（すなわち、結合する）因子は、細胞ベースア
ッセイ系において同定される。この実施例に従って、Ａ
ＰＩ、ＡＰＩのフラグメント、ＡＰＩ関連ポリペプチ
ド、ＡＰＩ関連ポリペプチドのフラグメント、またはＡ
ＰＩ融合タンパク質を発現する細胞は、候補化合物また
はコントロール化合物と接触され、そして候補化合物が
ＡＰＩと相互作用する能力が決定される。所望ならば、
このアッセイを使用して、複数の候補化合物（例えば、
ライブラリー）をスクリーニングし得る。例えば、細胞
は、原核生物起源（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核
生物起源（例えば、酵母または哺乳動物）の細胞であり
得る。さらに、これらの細胞は、ＡＰＩ、ＡＰＩのフラ
グメント、ＡＰＩ関連ポリペプチド、ＡＰＩ関連ポリペ
プチドのフラグメント、またはＡＰＩ融合タンパク質を
発現するために内因的または遺伝学的に操作される、Ａ
ＰＩ、ＡＰＩのフラグメント、ＡＰＩ関連ポリペプチ
ド、ＡＰＩ関連ポリペプチドのフラグメント、またはＡ
ＰＩ融合タンパク質を発現し得る。いくつかの実施形態
において、ＡＰＩ、ＡＰＩのフラグメント、ＡＰＩ関連
ポリペプチド、ＡＰＩ関連ポリペプチドのフラグメン
ト、またはＡＰＩ融合タンパク質もしくは候補化合物
は、例えば、（３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉのような）放
射活性標識または（フルオロセインイソチオシアネー
ト、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、
アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉ
ｎ）、ｏ−フタルアルデヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌｄｅｈ
ｙｄｅ）またはフルオレサミンのような）蛍光標識を用
いて、ＡＰＩと候補化合物との間の相互作用の検出を可
能にするように標識される。候補化合物が直接的または
間接的にＡＰＩ、ＡＰＩのフラグメント、ＡＰＩ関連ポ
リペプチド、ＡＰＩ関連ポリペプチドのフラグメント、
またはＡＰＩ融合タンパク質と相互作用する能力は、当
業者に公知の方法によって決定され得る。例えば、候補
化合物とＡＰＩ、ＡＰＩのフラグメント、ＡＰＩ関連ポ
リペプチド、ＡＰＩ関連ポリペプチドのフラグメント、
またはＡＰＩ融合タンパク質との間の相互作用は、フロ
ーサイトメトリー、シンチレーションアッセイ、免疫沈
降またはウエスタンブロット分析によって決定され得
る。
【０２７３】別の実施形態において、ＡＰＩ、ＡＰＩフ
ラグメント（例えば、機能的に活性なフラグメント）、
ＡＰＩ関連ポリペプチド、ＡＰＩ関連ポリペプチドのフ
ラグメント、またはＡＰＩ融合タンパク質と相互作用す
る（すなわち、結合する）因子は、無細胞アッセイ系に
おいて同定される。この実施例に従って、ネイティブも
しくは組換えのＡＰＩもしくはそのフラグメント、また
はネイティブもしくは組換えのＡＰＩ関連ポリペプチド
もしくはそのフラグメント、またはＡＰＩ融合タンパク
質もしくはそのフラグメントは、候補化合物またはコン
トロール化合物と接触され、そして候補化合物がＡＰＩ
もしくはＡＰＩ関連ポリペプチド、またはＡＰＩ融合タ
ンパク質と相互作用する能力が決定される。所望なら
ば、このアッセイを使用して、複数の候補化合物（例え
ば、ライブラリー）をスクリーニングし得る。好ましく
は、ＡＰＩ、ＡＰＩのフラグメント、ＡＰＩ関連ポリペ
プチド、ＡＰＩ関連ポリペプチドのフラグメント、また
はＡＰＩ融合タンパク質は、例えば、ＡＰＩ、ＡＰＩの
フラグメント、ＡＰＩ関連ポリペプチド、ＡＰＩ関連ポ
リペプチドのフラグメント、またはＡＰＩ融合タンパク
質を、それを特異的に認識しかつそれと結合する固定化
抗体と接触させることによって、またはＡＰＩ、ＡＰＩ
のフラグメント、ＡＰＩ関連ポリペプチド、ＡＰＩ関連
ポリペプチドのフラグメント、またはＡＰＩ融合タンパ
ク質の精製された調製物を、タンパク質に結合するよう
に設計された表面と接触させることによって、初めに固
定化される。ＡＰＩ、ＡＰＩのフラグメント、ＡＰＩ関
連ポリペプチド、ＡＰＩ関連ポリペプチドのフラグメン
ト、またはＡＰＩ融合タンパク質は、部分的または完全
に精製され得るか（例えば、部分的または完全に他のポ
リペプチドがない）、あるいは細胞溶解物の一部であり
得る。さらに、ＡＰＩ、ＡＰＩのフラグメント、ＡＰＩ
関連ポリペプチド、ＡＰＩ関連ポリペプチドのフラグメ
ントは、ＡＰＩもしくはその生物学的に活性な部分、ま
たはＡＰＩ関連ポリペプチドおよびドメイン（例えば、
グルタチオネン−Ｓ−トランスフェラーゼ）を含む融合
タンパク質であり得る。あるいは、ＡＰＩ、ＡＰＩのフ
ラグメント、ＡＰＩ関連ポリペプチド、ＡＰＩ関連ポリ
ペプチドのフラグメント、またはＡＰＩ融合タンパク質
は、当該分野で周知の技術（例えば、ビオチン化キッ
ト、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｒｏｃｋｆｏ
ｒｄ，ＩＬ）を使用してビオチン化され得る。候補化合
物がＡＰＩ、ＡＰＩのフラグメント、ＡＰＩ関連ポリペ
プチド、ＡＰＩ関連ポリペプチドのフラグメント、また
はＡＰＩ融合タンパク質と相互作用する能力は、当業者
に公知の方法によって決定され得る。
【０２７４】別の実施形態において、細胞ベースのアッ
セイ系を使用して、タンパク質（例えば、酵素またはそ
の生物学的に活性な部分）に結合するかまたはその活性
を改変する因子を同定する。このタンパク質は、ＡＰＩ
の産生または分解を担うか、またはＡＰＩの翻訳後改変
を担う。一次スクリーニングにおいて、複数の化合物
（例えば、ライブラリー）は、（ｉ）ＡＰＩ、ＡＰＩの
アイソフォーム、ＡＰＩ相同体、ＡＰＩ関連ポリペプチ
ド、ＡＰＩ融合タンパク質、または前述のいずれかの生
物学的に活性なフラグメント；および（ｉｉ）ＡＰＩ、
ＡＰＩアイソフォーム、ＡＰＩ相同体、ＡＰＩ関連ポリ
ペプチド、ＡＰＩ融合タンパク質、またはフラグメント
の産生、分解、または翻訳後改変を調節する化合物を同
定するための、ＡＰＩ、ＡＰＩアイソフォーム、ＡＰＩ
相同体、ＡＰＩ関連ポリペプチド、ＡＰＩ融合タンパク
質、またはフラグメントのプロセシングを担うタンパク
質、を天然にまたは組換え的に発現する細胞と接触され
る。所望の場合、一次スクリーニングにおいて同定され
る化合物は、次いで、目的の特定のＡＰＩを天然にまた
は組換え的に発現する細胞に対する二次スクリーニング
においてアッセイされ得る。候補化合物がＡＰＩ、アイ
ソフォーム、相同体、ＡＰＩ関連ポリペプチド、または
ＡＰＩ融合タンパク質の産生、分解、または翻訳後改変
を調節する能力は、当業者に公知の方法（フローサイト
メトリー、シンチレーションアッセイ、免疫沈降および
ウエスタンブロット分析が挙げられるがこれらに限定さ
れない）によって決定され得る。
【０２７５】別の実施形態において、ＡＰＩ、ＡＰＩフ
ラグメント、ＡＰＩ関連ポリペプチド、ＡＰＩ関連ポリ
ペプチドのフラグメント、またはＡＰＩ融合タンパク質
と競合的に相互作用する（すなわち、結合する）因子
は、競合的結合アッセイにおいて同定される。この実施
形態に従って、ＡＰＩ、ＡＰＩフラグメント、ＡＰＩ関
連ポリペプチド、ＡＰＩ関連ポリペプチドのフラグメン
ト、またはＡＰＩ融合タンパク質を発現する細胞は、候
補化合物、ならびにＡＰＩ、ＡＰＩフラグメント、ＡＰ
Ｉ関連ポリペプチド、ＡＰＩ関連ポリペプチドのフラグ
メント、またはＡＰＩ融合タンパク質と相互作用するこ
とが公知の化合物と接触される；次いで、候補化合物が
ＡＰＩ、ＡＰＩフラグメント、ＡＰＩ関連ポリペプチ
ド、ＡＰＩ関連ポリペプチドのフラグメント、またはＡ
ＰＩ融合タンパク質と競合的に相互作用する能力が決定
される。あるいは、ＡＰＩ、ＡＰＩフラグメント、ＡＰ
Ｉ関連ポリペプチド、またはＡＰＩ関連ポリペプチドの
フラグメントと競合的に相互作用する（すなわち、結合
する）因子は、ＡＰＩ、ＡＰＩフラグメント、ＡＰＩ関
連ポリペプチド、ＡＰＩ関連ポリペプチドのフラグメン
ト、またはＡＰＩ融合タンパク質を、候補化合物、なら
びにＡＰＩ、ＡＰＩ関連ポリペプチドもしくはＡＰＩ融
合タンパク質と相互作用することが公知の化合物と接触
させることによる無細胞アッセイ系において同定され
る。上述のように、候補化合物がＡＰＩ、ＡＰＩのフラ
グメント、ＡＰＩ関連ポリペプチド、ＡＰＩ関連ポリペ
プチドのフラグメント、またはＡＰＩ融合タンパク質と
相互作用する能力は、当業者に公知の方法によって決定
され得る。これらの細胞ベースまたは無細胞のアッセイ
を使用して、複数の候補化合物（例えば、ライブラリ
ー）をスクリーニングし得る。
【０２７６】別の実施形態において、ＡＰＩまたはＡＰ
Ｉ関連ポリペプチドの発現を改変する（すなわち、アッ
プレギュレートまたはダウンレギュレートする）因子
は、ＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポリペプチドを発現する細
胞（例えば、原核生物起源または真核生物起源の細胞）
を候補化合物またはコントロール化合物（例えば、リン
酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ））と接触させ、ＡＰＩ、
ＡＰＩ関連ポリペプチドまたはＡＰＩ融合タンパク質、
ＡＰＩをコードするｍＲＮＡまたはＡＰＩ関連ポリペプ
チドをコードするｍＲＮＡの発現を決定することによっ
て、同定される。候補化合物の存在下で、選択されたＡ
ＰＩ、ＡＰＩ関連ポリペプチド、ＡＰＩをコードするｍ
ＲＮＡまたはＡＰＩ関連ポリペプチドをコードするｍＲ
ＮＡの発現レベルは、候補化合物の非存在下（例えば、
コントロール化合物の存在下）で、ＡＰＩ、ＡＰＩ関連
ポリペプチド、ＡＰＩをコードするｍＲＮＡまたはＡＰ
Ｉ関連ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現レベル
と比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づ
いてＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポリペプチドの発現の調節
因子として同定され得る。例えば、ＡＰＩまたはｍＲＮ
Ａの発現が、候補化合物の非存在下よりも候補化合物の
存在下におけるほうが有意に高い場合、候補化合物は、
ＡＰＩまたはｍＲＮＡの発現の刺激因子として同定され
る。あるいは、ＡＰＩまたはｍＲＮＡの発現が、候補化
合物の非存在下よりも候補化合物の存在下におけるほう
が有意に低い場合、候補化合物は、ＡＰＩまたはｍＲＮ
Ａの発現の阻害因子として同定される。ＡＰＩまたはそ
れをコードするｍＲＮＡの発現レベルは、本記述に基づ
いて当業者に公知の方法によって決定され得る。例え
ば、ｍＲＮＡ発現は、ノーザンブロット分析またはＲＴ
−ＰＣＲによって評価され得、そしてタンパク質レベル
は、ウエスタンブロット分析によって評価され得る。
【０２７７】別の実施形態において、ＡＰＩまたはＡＰ
Ｉ関連ポリペプチドの活性を改変する因子は、ＡＰＩま
たはＡＰＩ関連ポリペプチドを含む調製物、またはＡＰ
ＩまたはＡＰＩ関連ポリペプチドを発現する細胞（例え
ば、原核生物細胞または真核生物細胞）を含有する調製
物を試験 化合物またはコントロール化合物と接触さ
せ、試験化合物がＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポリペプチド
の活性を改変する（例えば、刺激するまたは阻害する）
能力を決定することによって、同定される。ＡＰＩまた
はＡＰＩ関連ポリペプチドの活性は、ＡＰＩまたはＡＰ
Ｉ関連ポリペプチド（例えば、細胞内Ｃａ２＋、ジアシ
ルグリセロール、ＩＰ３など）の細胞シグナル伝達経路
の誘導を検出するか、適切な基質上の標的の触媒活性ま
たは酵素活性を検出するか、レポーター遺伝子（例え
ば、ＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポリペプチドに応答性であ
る調節エレメント、および検出可能なマーカー（例え
ば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動可能に連
結される調節エレメント）の誘導を検出するか、あるい
は、本記載に基づいて、当業者に公知の技術がこれらの
活性を測定するために使用される場合（米国特許第５，
４０１，６３９号（これは、その全体が参考として援用
される）を参照のこと）、細胞応答（例えば、細胞分化
または細胞増殖）を検出することによって、評価され得
る。次いで、候補因子は、コントロール化合物と候補化
合物の効果を比較することによって、ＡＰＩまたはＡＰ
Ｉ関連ポリペプチドの活性の調節因子として同定され得
る。適切なコントロール化合物としては、リン酸緩衝液
生理食塩水（ＰＢＳ）および通常の食塩水（ＮＳ）が挙
げられる。
【０２７８】別の実施形態において、ＡＰＩまたはＡＰ
Ｉ関連ポリペプチドの発現、活性または発現と活性との
両方を改変する（すなわち、アップレギュレートまたは
ダウンレギュレートする）因子が、動物モデルにおいて
同定される。適切な動物の例としては、マウス、ラッ
ト、ウサギ、サル、モルモット、イヌおよびネコが挙げ
られるが、これらに限定されない。好ましくは、使用さ
れる動物（例えば、ヒト家族性アルツハイマー病（ＦＡ
Ｄ）β−アミロイド前駆体（ＡＰＰ）を発現する動物、
ヒト野生型ＡＰＰを過剰発現する動物、β−アミロイド
１−４２（βＡ）を過剰発現する動物、ＦＡＤプレセニ
リン−１（ＰＳ−１）を発現する動物）は、アルツハイ
マー病のモデルを表す。例えば、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｌ
Ｓ，１９９９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
Ｔｏｄａｙ ５：２７４−２７６を参照のこと。本実
施例に従って、試験化合物またはコントロール化合物
は、適切な動物に（例えば、経口的、直腸的または非経
口的に（例えば、腹腔内にまたは静脈内に））投与さ
れ、そしてＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポリペプチドの発
現、活性または発現と活性との両方に対する効果が決定
される。ＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポリペプチドの発現の
変化は、本記載に基づいて、上記の任意の適切な方法に
よって評価され得る。
【０２７９】なお別の実施形態において、ＡＰＩまたは
ＡＰＩ関連ポリペプチドを、ツーハイブリッドアッセイ
またはスリーハイブリッドアッセイにおいて「ベイトタ
ンパク質」として使用して、ＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポ
リペプチドに結合するかまたはこれらと相互作用する他
のタンパク質を同定する（例えば、米国特許第５，２８
３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ
７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら、（１９９３）
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０
５４；Ｂａｒｔｅｌら、（１９９３）Ｂｉｏ／ｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ１４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉ
ら、（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ８：１６９３−１６
９６；およびＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１０３００を参照
のこと）。当業者が理解するように、このような結合タ
ンパク質はまた、本発明のＡＰＩによるシグナル（例え
ば、本発明のＡＰＩを含むシグナル伝達経路の上流また
は下流エレメントとして）の伝達に関与するようであ
る。
【０２８０】当業者が理解するように、表Ｘは、ＡＰ
Ｉ、ＡＰＩアナログ、ＡＰＩ関連ポリペプチドまたは前
述のいずれかのフラグメントの酵素活性または結合活性
の検出または定量化についての適切なアッセイを記載す
る科学刊行物を列挙する。このような参考文献の各々
は、本明細書中でその全体が援用される。好ましい実施
形態において、表Ｘに参照されるアッセイを、本明細書
中で記載されるスクリーニングおよびアッセイに使用し
て、例えば、ＡＰＩ、ＡＰＩアナログもしくはＡＰＩ関
連ポリペプチド、前述のいずれかのフラグメント、また
はＡＰＩ融合タンパク質の活性を改変する（またはそれ
らの発現と活性との両方を改変する）因子をスクリーニ
ングするかまたはそれらを同定する。
【０２８１】
【表１０】 本発明は、上述のスクリーニングアッセイによって同定
される新規薬剤および明細書中に記述されるような処置
のためのその使用をさらに提供する。
【０２８２】（５．１５ ＡＰＩの治療的使用）本発明
は治療的薬剤の投与による種々の疾患および障害の処置
または予防を提供する。このような薬剤としては以下が
挙げられるがこれらに限定されない：ＡＰＩ、ＡＰＩア
ナログＡＰＩ関連ポリペプチドおよびそれらの誘導体
（フラグメントを含む）；前述のものに対する抗体；Ａ
ＰＩ、ＡＰＩアナログＡＰＩ関連ポリペプチドおよびそ
れらのフラグメントをコードする核酸；ＡＰＩまたはＡ
ＰＩ関連ポリペプチドをコードする遺伝子に対するアン
チセンス核酸；ならびにＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポリペ
プチドをコードする遺伝子のモジュレーター（例えば、
アゴニストおよびアンタゴニスト）。本発明の重要な特
徴は、アルツハイマー病に関与するＡＰＩをコードする
遺伝子の同定である。アルツハイマー病は、アルツハイ
マー病を有する被験体のＣＳＦにおいて低下する１以上
のＡＰＩの機能もしくは発現を促進する治療用化合物の
投与によって、またはアルツハイマー病を有する被験体
のＣＳＦにおいて上昇する１以上のＡＰＩの機能もしく
は発現を減少させ治療用化合物の投与によって、処置さ
れ得るか（例えば、症状を改善するためにまたは発症も
しくは進行を遅らせるために）、または予防され得る。
【０２８３】１つの実施形態において、ＡＰＩに各々特
異的に結合する１以上の抗体が、単独でまたは１以上の
さらなる治療用化合物もしくは処置と組み合わせて投与
される。このような治療用化合物または処置の例とし
て、タクリン、ドンペジル（ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ）、α
−トコフェロール、セレギリン（ｓｅｌｅｇｅｌｉｎ
ｅ）、ＮＳＡＩＤ、エストロゲン補充療法、フィゾスチ
グミン、リバスチグミン（ｒｉｖａｓｔｉｇｍｉｎ
ｅ）、ヘパスチグミン（ｈｅｐａｓｔｉｇｍｉｎｅ）、
メトリホナート、ＥＮＡ−７１３、イチョウ抽出物（ｇ
ｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ ｅｘｔｒａｃｔ）、フィゾ
スチグミン、アムリジン（ａｍｒｉｄｉｎ）、タルサク
リジン（ｔａｌｓａｃｌｉｄｉｎｅ）、ジフロシロン
（ｚｉｆｒｏｓｉｌｏｎｅ）、エプタスチグミン、メタ
ンスルホニルクロライド、ネフィルアセタム（ｎｅｆｉ
ｒａｃｅｔａｍ）、ＡＬＣＡＲ、タルサチジン（ｔａｌ
ｓａｃｈｉｄｉｎｅ）、キサノメリン（ｘａｎｏｍｅｌ
ｉｎｅ）、ガランタミン、およびプロペントフィリン
（ｐｒｏｐｅｎｔｏｆｙｌｌｉｎｅ）が挙げられるが、
これらに限定されない。
【０２８４】好ましくは、抗体のような生物学的製品は
投与される被験体に同種異系である。好ましい実施形態
では、ヒトＡＰＩまたはヒトＡＰＩ関連ポリペプチド、
ヒトＡＰＩまたはヒトＡＰＩ関連ポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列、あるいはヒトＡＰＩまたはヒト
ＡＰＩ関連ポリペプチドに対する抗体は、治療（例え
ば、症状を改善するためにまたは発症もしくは進行を遅
らせるために）または予防のためにヒト被験体に投与さ
れる。
【０２８５】（５．１５．１ アルツハイマー病の処置
および予防）アルツハイマー病は、アルツハイマー病を
有する疑いのある被験体もしくは有することが知られて
いる被験体またはアルツハイマー病が発症するおそれの
ある被験体への、アルツハイマー病を有さない被験体の
ＣＳＦと比較してアルツハイマー病を有する被験体のＣ
ＳＦ中に差次的に存在する、１以上のＡＰＩのレベルも
しくは活性（すなわち、機能）または１以上のＡＦのレ
ベルを調節する（すなわち、上昇させるまたは低下させ
る）薬剤の投与後の投与によって、処置または予防され
得る。１つの実施形態において、アルツハイマー病は、
アルツハイマー病を有する疑いのある被験体もしくは有
することが知られている被験体またはアルツハイマー病
を発症するおそれのある被験体への、アルツハイマー病
を有する被験体のＣＳＦにおいて低下している、１以上
のＡＰＩのレベルもしくは活性（すなわち、機能）また
は１以上のＡＦのレベルをアップレギュレートする（す
なわち、上昇させる）薬剤の投与によって、処置され
る。別の実施形態において、アルツハイマー病を有する
被験体のＣＳＦにおいて上昇する、１以上のＡＰＩのレ
ベルもしくは活性（すなわち、機能）または１以上のＡ
Ｆのレベルをダウンレギュレートする薬剤が投与され
る。このような化合物の例として、ＡＰＩ、ＡＰＩフラ
グメントおよびＡＰＩ関連ポリペプチド；ＡＰＩ、ＡＰ
ＩフラグメントおよびＡＰＩ関連ポリペプチドをコード
する核酸（例えば、遺伝子治療に使用するための）；お
よび酵素活性を有するこれらのＡＰＩもしくはＡＰＩ関
連ポリペプチドに対する、その酵素活性を調節すること
が公知の化合物または分子が挙げられるが、これらに限
定されない。使用し得る他の化合物（例えば、ＡＰＩア
ゴニスト）は、上述もしくは以前に定義または記載され
たように、インビトロアッセイを用いて同定され得る。
【０２８６】アルツハイマー病はまた、アルツハイマー
病を有する疑いのある被験体もしくは有することが知ら
れている被験体またはアルツハイマー病が発症するおそ
れのある被験体への、アルツハイマー病を有する被験体
のＣＳＦにおいて上昇している、１以上のＡＰＩのレベ
ルもしくは活性または１以上のＡＦのレベルをダウンレ
ギュレートする化合物の投与によって、処置または予防
される。別の実施形態において、アルツハイマー病を有
する被験体のＣＳＦにおいて低下する、１以上のＡＰＩ
のレベルもしくは活性または１以上のＡＦのレベルをア
ップレギュレートする化合物が投与される。このような
化合物の例としては、ＡＰＩアンチセンスオリゴヌクレ
オチド、リボザイム、ＡＰＩに対する抗体、およびＡＰ
Ｉの酵素活性を阻害する化合物が挙げられるが、これら
に限定されない。他の有用な化合物（例えば、ＡＰＩア
ンタゴニストおよび低分子ＡＰＩアンタゴニスト）はイ
ンビトロアッセイを用いて同定され得る。
【０２８７】好ましい実施形態において、個々の被験体
の必要に応じて、治療または予防を調整する。従って、
特定の実施形態において、１以上のＡＰＩのレベルもし
くは機能または１以上のＡＦのレベルを促進する化合物
が、アルツハイマー病を有する疑いのある被験体もしく
は有することが知られている被験体（この被験体におい
て、前述の１以上のＡＰＩのレベルもしくは機能または
前述の１以上のＡＦのレベルが存在しないかもしくは低
下しているコントロールもしくは正常な参照範囲と比較
して）に治療的または予防的に投与される。さらなる実
施形態において、１以上のＡＰＩのレベルもしくは機能
または１以上のＡＦのレベルを促進する化合物が、アル
ツハイマー病を有する疑いのある被験体もしくは有する
ことが知られている被験体（この被験体において、前述
の１以上のＡＰＩのレベルもしくは機能または前述の１
以上のＡＦのレベルがコントロールもしくは参照範囲と
比較して上昇している）に治療的または予防的に投与さ
れる。さらなる実施形態において、１以上のＡＰＩのレ
ベルもしくは機能または１以上のＡＦのレベルを低下さ
せる化合物が、アルツハイマー病を有する疑いのある被
験体もしくは有することが知られている被験体（この被
験体において、前述の１以上のＡＰＩのレベルもしくは
機能または前述の１以上のＡＦのレベルがコントロール
もしくは参照範囲と比較して上昇している）に治療的ま
たは予防的に投与される。さらなる実施形態において、
１以上のＡＰＩのレベルもしくは機能または１以上のＡ
Ｆのレベルを低下せる化合物が、アルツハイマー病を有
する疑いのある被験体もしくは有することが知られてい
る被験体（この被験体において、前述の１以上のＡＰＩ
のレベルもしくは機能または前述の１以上のＡＦのレベ
ルがコントロールもしくは参照範囲と比較して低下して
いる）に治療的または予防的に投与される。このような
化合物の投与に起因するＡＰＩの機能もしくはレベル、
またはＡＦレベルにおける変化は、例えば、サンプル
（例えば、ＣＳＦ、血液もしくは尿のサンプルまたは生
検組織のような組織サンプル）を得て、そして前述のＡ
Ｆのレベルまたは前述のＡＰＩのレベルもしくは活性、
または前述のＡＰＩをコードするｍＲＮＡのレベルある
いは前述の任意の組み合わせをインビトロでアッセイす
ることによって容易に検出され得る。このようなアッセ
イは、本明細書中で記載されるように化合物の投与前お
よび投与後に実施され得る。
【０２８８】本発明の化合物としては、アルツハイマー
病のＡＰＩもしくはＡＦプロフィールを正常に向かって
回復させる任意の化合物（例えば、有機低分子、タンパ
ク質、ペプチド、抗体、核酸など）（ただし、このよう
な化合物は、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）
インヒビター（例えば、タクリン、ドンペジル（ｄｏｎ
ｅｐｅｚｉｌ）、リバスチグミン（ｒｉｖａｓｔｉｇｍ
ｉｎｅ）、ヘパスチグミン（ｈｅｐａｓｔｉｇｍｉｎ
ｅ）、メトリホナート（Ｍｅｔｒｉｇｏｎａｔｅ）、フ
ィゾスチグミン、アムリジン（Ａｍｒｉｄｉｎ）、タル
サクリジン（Ｔａｌｓａｃｌｉｄｉｎｅ）、ＫＡ−６７
２、フペルジン（Ｈｕｐｅｒｚｉｎｅ）、Ｐ−１１０１
２、Ｐ−１１１４９、ジフロシロン（Ｚｉｆｒｏｓｉｌ
ｏｎｅ）、エプタスチグミン、メタンスルホニルクロラ
イド、およびＳ−９９７７）、アセチルコリンレセプタ
ーアゴニスト（例えば、ネフィルアセタム（Ｎｅｆｉｒ
ａｃｅｔａｍ）、ＬＵ−２５１０９、およびＮＳ２３３
０）、ムスカリン性レセプターアゴニスト（例えば、Ｓ
Ｂ−２０２０６、タルサチジン（Ｔａｌｓａｃｈｉｄｉ
ｎｅ）、ＡＦ−１０２５Ｂ、およびＳＲ−４６５５９
Ａ）、ニコチン性（ｎｉｃｏｔｏｎｉｃ）コリン作用性
レセプターアゴニスト（例えば、ＡＢＴ−４１８）、ア
セチルコリンモジュレーター（例えば、ＦＫＳ−５０８
およびガランタミン（Ｇａｌａｎｔａｍｉｎｅ））また
はプロペントフィリン（ｐｒｏｐｅｎｔｏｆｙｌｌｉｎ
ｅ）のいずれでもない）が挙げられるが、これらに限定
されない。
【０２８９】（５．１５．２ 遺伝子治療）別の実施形
態において、ＡＰＩ、ＡＰＩフラグメント、ＡＰＩ関連
ポリペプチドまたはＡＰＩ関連ポリペプチドのフラグメ
ントをコードする配列を含む核酸が、遺伝子治療によっ
てＡＰＩ機能を促進するために投与される。遺伝子治療
は、被験体への発現される核酸または発現可能な核酸の
投与を表す。この実施形態において、核酸はそのコード
されたポリペプチドを産生し、そしてそのポリペプチド
はＡＰＩ機能を促進することによって治療効果を媒介す
る。
【０２９０】当該分野で入手可能な遺伝子治療に関する
任意の適切な方法を本発明に従って、使用し得る。
【０２９１】遺伝子治療の方法の一般的な総説として
は、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，１９９３，Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５；Ｗｕお
よびＷｕ，１９９１，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７
−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒ
ｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５
７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２６０：９２６−９３２；ならびにＭｏｒｇａ
ｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７；１９９３
年５月，ＴＩＢＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５
を参照のこと。本発明において使用され得る組換えＤＮ
Ａ技術の分野で一般的に公知の方法が、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（編），１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊ
ｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ；およびＫｒｉｅ
ｇｌｅｒ，１９９０，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａ
ｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ
Ｙに記載されている。
【０２９２】特定の局面において、この化合物はＡＰＩ
またはそのフラグメントもしくはキメラタンパク質をコ
ードする核酸を含み、この核酸は、ＡＰＩまたはそのフ
ラグメントもしくはキメラタンパク質を適切な宿主中で
発現する発現ベクターの一部である。特に、このような
核酸はＡＰＩコード領域に対して作動可能に連結したプ
ロモーターを有し、このプロモーターは、誘導的または
構成的（そして、必要に応じて、組織特異的）である。
別の特定の実施形態において、ＡＰＩコード配列および
任意の他の所望の配列が、ゲノム中の所望の部位での相
同組換えを促進する領域に隣接し、このようにしてＡＰ
Ｉ核酸の染色体内発現を提供する核酸分子が使用される
（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，１９８９，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：
８９３２−８９３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，１９８９，
Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８）。
【０２９３】核酸の被験体への送達は、直接的であり
得、この場合、被験体は核酸または核酸保有ベクターに
直接暴露される；このアプローチはインビボ遺伝子治療
として公知である。あるいは、核酸の被験体への送達は
間接的であり得、この場合、細胞は最初に核酸によって
インビトロで形質転換され、次いで被験体に移植され
る、これは「エキソビボ遺伝子治療」として公知であ
る。
【０２９４】別の実施形態において、核酸はインビボで
直接投与され、そこで、この核酸は発現されて、コード
された産物を産生する。これは当該分野で公知の多くの
方法のうち任意の方法によって（例えば、適切な核酸発
現ベクターの一部としてこの核酸を構築し、そして細胞
内になるように（例えば、欠損または弱毒化レトロウイ
ルスベクターあるいは他のウイルスベクターを使用する
感染によって（米国特許第４，９８０，２８６号を参照
のこと））投与することによって；裸のＤＮＡの直接注
射によって；微粒子衝撃（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌ
ｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によって；脂質、細
胞表面レセプターもしくはトランスフェクト剤でコート
することによって；リポソーム、微粒子もしくはマイク
ロカプセル中にカプセル化することによって；核に入る
ことが公知のペプチドに連結してそれを投与することに
よって；またはレセプター媒介エンドサイトーシスを受
けるリガンドに連結して、それを投与することによっ
て）（例えば、ＷｕおよびＷｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照のこ
と）達成され得、これらはレセプターを特異的に発現す
る細胞型を標的とするために使用され得る。別の実施形
態において、リガンドがエンドソームを破壊するための
フソゲニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ウイルスペプチド
を含む核酸−リガンド複合体が形成され得、核酸がリソ
ソーム分解を回避することを可能にする。さらに別の実
施形態において、核酸は細胞特異的な取り込みおよび発
現について、特異的レセプターを標的化することによっ
てインビボで標的にされ得る（例えば、ＰＣＴ公報 Ｗ
Ｏ９２／０６１８０、１９９２年４月１６日付（Ｗｕ
ら）；ＷＯ ９２／２２６３５、１９９２年１２月２３
日付（Ｗｉｌｓｏｎら）；ＷＯ９２／２０３１６、１９
９２年１１月２６日付（Ｆｉｎｄｅｉｓら）；ＷＯ９３
／１４１８８、１９９３年７月２２日付（Ｃｌａｒｋｅ
ら），ＷＯ ９３／２０２２１、１９９３年１０月１４
日付（Ｙｏｕｎｇ）を参照のこと）。あるいは、核酸
は、細胞内に導入され、相同組換えによって発現のため
に宿主細胞ＤＮＡ内に組込まれ得る（Ｋｏｌｌｅｒおよ
びＳｍｉｔｈｉｅｓ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３
５；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３
４２：４３５−４３８）。
【０２９５】さらなる実施形態において、ＡＰＩをコー
ドする核酸を含むウイルスベクターが使用される。例え
ば、レトロウイルスベクターが使用され得る（Ｍｉｌｌ
ｅｒら，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１
７：５８１−５９９を参照のこと）。これらのレトロウ
イルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージングお
よび宿主細胞ＤＮＡへの組込みのために必要でないレト
ロウイルス配列を欠失するように改変された。遺伝子治
療において使用されるべきＡＰＩをコードする核酸はベ
クター内へクローン化され、被験体への遺伝子の送達を
促進する。レトロウイルスベクターについてのさらなる
詳細はＢｏｅｓｅｎら，１９９４，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐ
ｙ ６：２９１−３０２に見い出され得、これは、化学
療法に対してさらに耐性の幹細胞を作製するために、造
血幹細胞へｍｄｒ１遺伝子を送達するためのレトロウイ
ルスベクターの使用を記載している。遺伝子治療におけ
るレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文
献は以下である：Ｃｌｏｗｅｓら，１９９４，Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１；Ｋｉｅｍ
ら，１９９４，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７
３；ＳａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，１９９
３，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２
９−１４１；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌｓ
ｏｎ，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４。
【０２９６】アデノウイルスは、遺伝子治療に使用され
得る他のウイルスベクターである。アデノウイルスは遺
伝子を気道上皮に送達するために特に魅力的なビヒクル
である。アデノウイルスは、気道上皮に自然に感染し、
ここで軽い疾患を引き起こす。アデノウイルスに基づく
送達系に対する他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細
胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞
に感染可能であるという利点を有する。Ｋｏｚａｒｓｋ
ｙおよびＷｉｌｓｏｎ，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏ
ｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９９−５０３は、アデノウ
イルスに基づく遺伝子治療の総説を示している。Ｂｏｕ
ｔら，１９９４，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ５：３−１０は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を
移入するためのアデノウイルスベクターの使用を示して
いる。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の
例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２５２：４３１−４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，
１９９２，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５；Ｍａｓｔ
ｒａｎｇｅｌｉら，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅ
ｓｔ．９１：２２５−２３４；ＰＣＴ公報ＷＯ９４／１
２６４９号；およびＷａｎｇら，１９９５，Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３に見い出され得
る。
【０２９７】アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺
伝子治療における使用について提唱されている（Ｗａｌ
ｓｈら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００；米国特許第５，
４３６，１４６号）。
【０２９８】遺伝子治療に対する別の適切なアプローチ
は、電気穿孔法、リポフェクション、リン酸カルシウム
媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のよう
な方法によって、組織培養中の細胞に遺伝子を移すこと
を含む。通常、移入の方法は、細胞への選択マーカーの
移入を含む。次いで、細胞は、これらの移された遺伝子
を取り込み、かつこの遺伝子を発現している細胞を単離
するために選択下に置かれる。次いで、これらの細胞は
被験体に送達される。
【０２９９】この実施形態において、核酸は、得られた
組換え細胞のインビボでの投与の前に細胞へ導入され
る。このような導入は、以下に挙げられるような、しか
しこれらに限定されない当該分野で公知の任意の方法に
よって実施され得る：トランスフェクション、電気穿孔
法、微量注入、核酸配列を含むウイルスベクターもしく
はバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、
染色体媒介の遺伝子移入、マイクロセル媒介の遺伝子移
入、スフェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への
導入のための多くの技術が、当該分野で公知であり（例
えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ，１９９３，Ｍ
ｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８；Ｃ
ｏｈｅｎら，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２
１７：６１８−６４４；Ｃｌｉｎｅ，１９８５，Ｐｈａ
ｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２を参照のこ
と）、そして、本発明に従って（ただし、レシピエント
細胞の必要な発達機能および生理学的機能が破壊されな
い限り）使用され得る。核酸が細胞によって発現可能で
あり、好ましくはその細胞の子孫によって遺伝性でかつ
発現可能であるように、核酸を細胞へと安定に移入する
ための技術が提供されるべきである。
【０３００】得られた組換え細胞は、当該分野で公知の
種々の方法によって被験体に送達され得る。好ましい実
施形態において、上皮細胞が例えば皮下に注射される。
別の実施形態において、組換え皮膚細胞は、被験体への
上の皮膚移植片として適用され得る。組換え血球（例え
ば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好ましくは静
脈内に投与される。使用が想定される細胞の量は、所望
の効果、被験体の状態などに依存し、そして当業者によ
って決定され得る。
【０３０１】核酸が遺伝子治療の目的のために導入され
得る細胞は、任意の所望な、入手可能な細胞型を含み、
この細胞型の例としては、ニューロン細胞、グリア細胞
（例えば、稀突起膠細胞または星状細胞）、上皮細胞、
内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細
胞；血球（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マ
クロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球）；種
々の幹細胞または前駆細胞、特に造血幹細胞または造血
前駆細胞（例えば、骨髄、臍帯血、末梢血または胎児肝
臓から得られるような）が挙げられるが、これらに限定
されない。
【０３０２】好ましい実施形態において、遺伝子治療に
使用される細胞は、処置される被験体に対して自系であ
る。
【０３０３】組換え細胞が遺伝子治療に使用される実施
形態において、ＡＰＩをコードする核酸は、細胞または
それらの子孫によって発現可能であるように細胞へ導入
され、次いで組換え細胞は治療効果のためにインビボで
投与される。特定の実施形態において、幹細胞または前
駆細胞が使用される。単離され、かつインビトロで維持
され得る任意の幹細胞または前駆細胞は、本発明のこの
実施形態に従って使用され得る（例えば、ＰＣＴ公報
ＷＯ９４／０８５９８号、１９９４年４月２８日付；Ｓ
ｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９９２，Ｃｅ
ｌｌ ７１：９７３−９８５；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，１
９８０，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１Ａ：２２
９；ならびにＰｉｔｔｅｌｋｏｗおよびＳｃｏｔｔ，１
９８６，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１：７
７１を参照のこと）。
【０３０４】別の実施形態において、遺伝子治療の目的
で導入される核酸は、コード領域に作動可能に連結され
た誘導性プロモーターを含み得、その結果、転写の適切
な誘導物質の有無を制御することによって核酸の発現を
制御することが可能である。
【０３０５】ＡＰＩをコードするＤＮＡの直接注入はま
た、例えば、米国特許第５，５８９，４６６号に記述さ
れる技術に従って実施され得る。これらの技術は「裸の
ＤＮＡ」（すなわち、適切なキャリア以外はリポソーム
も、細胞も、あらゆる他の物質も存在しない、単離され
たＤＮＡ分子）の注入を含む。タンパク質をコードしか
つ適切なプロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡの
注入によって、注入部位の近くの細胞におけるタンパク
質の産生および注入されたＤＮＡによってコードされた
タンパク質に対する被験体の免疫応答の誘発が生じる。
好ましい実施形態において、（ａ）ＡＰＩをコードする
ＤＮＡおよび（ｂ）プロモーターを含む裸のＤＮＡは、
ＡＰＩに対する免疫応答を誘発するために被験体に注入
される。
【０３０６】（５．１５．３ アルツハイマー病を処置
するためのＡＰＩの阻害）本発明の１つの実施形態にお
いて、アルツハイマー病は、アルツハイマー病を有さな
い被験体のＣＳＦと比較してアルツハイマー病を有する
被験体のＣＳＦにおいて上昇する１以上のＡＰＩのレベ
ルおよび／または機能を拮抗する（阻害する）化合物の
投与によって処置または予防される。この目的に有用な
化合物として抗ＡＰＩ抗体（ならびにそれらの結合領域
を含むフラグメントおよび誘導体）、ＡＰＩのアンチセ
ンスまたはリボザイムの核酸、ならびに相同組換えによ
って内因性のＡＰＩ機能を「ノックアウトする」ために
使用される機能障害性のＡＰＩをコードする核酸が挙げ
られるが、これらに限定されない（例えば、Ｃａｐｅｃ
ｃｈｉ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８
−１２９２を参照のこと）。ＡＰＩ機能を阻害する他の
化合物は、公知のインビトロアッセイ（例えば、試験化
合物が、ＡＰＩの別のタンパク質もしくは結合パートナ
ーに対する結合を阻害する能力または公知のＡＰＩ機能
を阻害する能力についてのアッセイ）の使用によって同
定され得る。好ましくは、このような阻害はインビトロ
でまたは細胞培養内でアッセイされるが、遺伝的アッセ
イも使用され得る。「好ましい技術」もまた、化合物の
投与前または投与後に、ＡＰＩのレベルを検出するのに
使用され得る。好ましくは、適切なインビトロアッセイ
またはインビボアッセイは、以下により詳細に記述され
るように、特定の化合物の効果およびその投与が罹患組
織の処置のために指示されるかどうかを決定するために
利用される。
【０３０７】特定の実施形態において、ＡＰＩ機能を阻
害する化合物は、アルツハイマー病を有さない被験体の
ＣＳＦまたは所定の基準範囲のＣＳＦと比較して上昇し
たＣＳＦレベルまたはＡＰＩの機能的活性（例えば、正
常レベルまたは所望のレベルを超える）が検出された被
験体に治療的にまたは予防的に投与される。上に概略が
説明されるように、ＡＰＩのレベルまたは機能における
上昇を測定するために当該分野における標準的な方法が
使用され得る。好ましいＡＰＩインヒビター組成物は低
分子（例えば、１０００ダルトン以下の分子）を含む。
このような低分子は、本明細書中に記載されるスクリー
ニング法によって同定され得る。
【０３０８】（５．１５．４ ＡＰＩのアンチセンス調
節）さらなる実施形態において、ＡＰＩ発現はＡＰＩア
ンチセンス核酸の使用によって阻害される。本発明は、
ＡＰＩまたはその一部をコードする遺伝子またはｃＤＮ
Ａに対してアンチセンスである少なくとも６ヌクレオチ
ドを含む核酸の治療的または予防的な使用を提供する。
本明細書中で使用される場合、ＡＰＩ「アンチセンス」
核酸とは、ＡＰＩをコードするＲＮＡ（好ましくはｍＲ
ＮＡ）の一部分に対する何らかの配列相補性によってハ
イブリダイズ可能な核酸を表す。アンチセンス核酸は、
ＡＰＩをコードするｍＲＮＡのコード領域および／また
は非コード領域に対して相補性であり得る。このような
アンチセンス核酸は、ＡＰＩ発現を阻害する化合物とし
ての有用性を有し、アルツハイマー病の処置または予防
に使用され得る。
【０３０９】本発明のアンチセンス核酸は、二本鎖もし
くは一本鎖のオリゴヌクレオチド、ＲＮＡもしくはＤＮ
Ａ、またはそれらの改変体もしくは誘導体であり、そし
て細胞に対して直接投与され得るか、または外因性の導
入された配列の転写によって細胞内で産生され得る。
【０３１０】本発明は、治療有効量のＡＰＩアンチセン
ス核酸、および薬学的に受容可能なキャリア、ビヒクル
または希釈剤を含む薬学的組成をさらに提供する。
【０３１１】別の実施形態において、本発明は、本発明
のＡＰＩアンチセンス核酸を含む有効量の組成物を原核
生物の細胞または真核生物の細胞に提供することを含
む、原核生物の細胞または真核生物の細胞内のＡＰＩ核
酸配列の発現を阻害するための方法を提供する。
【０３１２】ＡＰＩアンチセンス核酸およびそれらの使
用を、以下に詳細に記載する。
【０３１３】（５．１５．５ ＡＰＩアンチセンス核
酸）ＡＰＩアンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオ
チドのものであり、好ましくは６〜約５０オリゴヌクレ
オチドの範囲にあるオリゴヌクレオチドである。特定の
局面において、そのオリゴヌクレオチドは、少なくとも
１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少な
くとも１００ヌクレオチド、または少なくとも２００ヌ
クレオチドである。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡもし
くはＲＮＡまたはそれらのキメラ混合物もしくは誘導体
もしくは改変体であり得、そして一本鎖または二本鎖で
あり得る。オリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、
またはリン酸骨格で修飾され得る。オリゴヌクレオチド
は、ペプチドのような他の付加された基；細胞膜（例え
ば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６５５３−６
５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８４：６４８−６５２；
ＰＣＴ公開番号ＷＯ ８８／０９８１０（１９８８年１
２月１５日に公開）を参照のこと）または血液脳関門
（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ８９／１０１３４（１
９８８年４月２５日に公開）を参照のこと）を横切った
輸送を促進する薬剤；ハイブリダイゼーション誘発切断
剤（例えば、Ｋｒｏｌら，１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６を参照のこと）または
インターカレート剤（例えば、Ｚｏｎ，１９８８，Ｐｈ
ａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照のこと）を
含み得る。
【０３１４】本発明の特定の局面において、好ましくは
一本鎖ＤＮＡのＡＰＩアンチセンスオリゴヌクレオチド
が提供される。オリゴヌクレオチドは、当該分野で一般
的に公知の置換基を用いて、その構造上の任意の位置で
修飾され得る。
【０３１５】ＡＰＩアンチセンスオリゴヌクレオチド
は、以下の修飾された塩基部分のうち、任意の適切なも
のを含み得る：例えば、５−フルオロウラシル、５−ブ
ロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシ
ル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシ
ン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、
５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジ
ン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒ
ドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン（ｂ
ｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎ
ｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−
メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチ
ルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニ
ン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−
アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチ
ルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラ
シル、β−Ｄ−マンノシルキュェオシン（ｂｅｔａ−Ｄ
−ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５−メトキシ
カルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２
−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシ
ル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂ
ｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル（ｐｓｅｕｄ
ｏｕｒａｃｉｌ）、キュェオシン（ｑｕｅｏｓｉｎ
ｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシ
ル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチル
ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、
ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チ
オウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキ
シプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ，２，６−ジア
ミノプリン、および他の塩基アナログ。
【０３１６】別の実施形態において、オリゴヌクレオチ
ドは、少なくとも１個の修飾された糖部分を含む（例え
ば、以下の糖部分の１つ：アラビノース、２−フルオロ
アラビノース、キシルロース、およびヘキソース）。
【０３１７】さらに別の実施形態において、オリゴヌク
レオチドは、以下の修飾されたリン酸骨格の少なくとも
１つを含む：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエー
ト、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート
（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホルジアミ
デート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｄｉａｍｉｄａｔｅ）、メチ
ルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、ホルム
アセタール、またはホルムアセタールのアナログ。
【０３１８】さらに別の実施形態において、オリゴヌク
レオチドはα−アノマーオリゴヌクレオチドである。α
−アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のβ−ユニット
とは対照的に、鎖が互いに平行に走っている特異的な二
本鎖ハイブリッドを相補的なＲＮＡと形成する（Ｇａｕ
ｔｉｅｒら，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１５：６６２５−６６４１）。
【０３１９】オリゴヌクレオチドは別の分子（例えば、
ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送
剤、またはハイブリダイゼーション誘発切断剤）に結合
し得る。
【０３２０】本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野
で公知の標準的な方法によって（例えば、自動ＤＮＡ合
成機（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販される）の使用によ
って）合成され得る。例としては、ホスホロチオエート
オリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎらの方法（１９８
８，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９）
によって合成され得、メチルホスホネートオリゴヌクレ
オチドは、制御された細孔ガラスポリマー支持体の使用
によって調製され得る（Ｓａｒｉｎら，１９８８，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：７
４４８−７４５１）。
【０３２１】別の実施形態において、本発明のＡＰＩア
ンチセンス核酸は外因性配列からの転写によって細胞内
に産生される。例えば、ベクターは細胞によって取り込
まれるようにインビボで導入され得、この細胞内でベク
ターまたはその一部は転写され、本発明のアンチセンス
核酸（ＲＮＡ）を産生する。このようなベクターは、Ａ
ＰＩアンチセンス核酸をコードする配列を含む。このよ
うなベクターは、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡ
を産生し得る限り、エピソーム性のままであり得、また
は染色体に組込まれ得る。このようなベクターは、当該
分野で標準的な組換えＤＮＡ技術によって構築され得
る。ベクターは、哺乳動物の細胞内での複製および発現
に使用される、プラスミド、ウイルス、または当該分野
で公知の他のものであり得る。ＡＰＩアンチセンスＲＮ
Ａをコードする配列の発現は、哺乳動物の細胞（好まし
くはヒトの細胞）で作用する、当該分野で公知の任意の
プロモーターによって発現され得る。このようなプロモ
ーターは、誘導的または構成的であり得る。このような
プロモーターの例は上に概略が説明されている。
【０３２２】本発明のアンチセンス核酸は、ＡＰＩをコ
ードする遺伝子（好ましくはＡＰＩをコードするヒト遺
伝子）のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に対して相補性
の配列を含む。しかし、完全な相補性が好ましいけれど
も、必要とはされない。本明細書中で示す「ＲＮＡの少
なくとも一部に対して相補性の」配列とは、ストリンジ
ェントな条件（例えば、７％ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、６５℃でハイブリダ
イゼーションして、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中
６８℃で洗浄することを含む非常にストリンジェントな
条件、または０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中４２
℃で洗浄することを含む中程度にストリンジェントな条
件）下で、ＲＮＡとハイブリダイズして安定な二重鎖を
形成し得る十分な相補性を有する配列を意味する；二本
鎖ＡＰＩアンチセンス核酸の場合には、二重鎖ＤＮＡの
一本鎖がこのように試験され得るか、または三重鎖形成
がアッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は、相補
性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存す
る。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、そ
れを含み得てかつ安定な二重鎖（または場合によっては
三重鎖）を依然として形成するＡＰＩをコードするＲＮ
Ａとの塩基ミスマッチが多くなる。当業者は、ハイブリ
ダイズした複合体の融点を決定するための標準的な手順
の使用によって、ミスマッチの許容範囲を確認し得る。
【０３２３】（５．１５．６ ＡＰＩアンチセンス核酸
の治療的使用）アルツハイマー病を有する疑いのある被
験体またはアルツハイマー病に苦しむ被験体のＣＳＦに
おいて標的ＡＰＩが過剰に発現する場合、ＡＰＩアンチ
センス核酸はアルツハイマー病を処置または予防するた
めに使用され得る。好ましい実施形態において、一本鎖
ＤＮＡアンチセンスＡＰＩオリゴヌクレオチドが使用さ
れる。
【０３２４】ＡＰＩをコードするＲＮＡを発現または過
剰発現する細胞型は、当該分野で公知の種々の方法によ
って同定され得る。このような細胞型として、白血球
（例えば、好中球、マクロファージ、単球）および常在
細胞（例えば、星状細胞、グリア細胞、ニューロン細
胞、および上衣細胞）が挙げられるが、これらに限定さ
れない。このような方法として、ＡＰＩ特異的核酸との
ハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンハイブリダ
イゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーショ
ン、インサイチュハイブリダイゼーションによる）、イ
ンビトロでこの細胞型由来のＲＮＡがＡＰＩへと翻訳さ
れる能力の観察、免疫アッセイなどが挙げられるが、こ
れらに限定されない。好ましい局面において、被験者由
来の一次組織は、処置の前にＡＰＩ発現について、例え
ば、免疫細胞化学によってまたはインサイチュハイブリ
ダイゼーションによってアッセイされ得る。
【０３２５】薬学的に受容可能なキャリア、ビヒクルま
たは希釈剤中にＡＰＩアンチセンス核酸を有効量含む本
発明の薬学的組成物は、アルツハイマー病を有する被験
体に投与され得る。
【０３２６】アルツハイマー病の処置において有効なＡ
ＰＩアンチセンス核酸の量は、標準的な臨床技術によっ
て決定され得る。
【０３２７】特定の実施形態において、１以上のＡＰＩ
アンチセンス核酸を含む薬学的組成物は、リポソーム、
微粒子、またはマイクロカプセルを介して投与される。
本発明の種々の実施形態において、このような組成物
は、ＡＰＩアンチセンス核酸の持続放出を達成するため
に使用され得る。
【０３２８】（５．１５．７ 阻害性リボザイムおよび
三重らせんアプローチ）別の実施形態において、アルツ
ハイマー病の症状は、周知の遺伝子「ノックアウト」
法、リボザイム法または三重らせん法と併用してＡＰＩ
をコードする遺伝子配列を使用してＡＰＩの遺伝子発現
を減少させることによって、ＡＰＩまたはＡＰＩ活性の
レベルを減少させることにより改善され得る。このアプ
ローチにおいて、リボザイム分子または三重らせん分子
は、ＡＰＩをコードする遺伝子の活性、発現または合成
を調節するために使用され、従ってアルツハイマー病の
症状を改善するために使用される。このような分子は、
変異体もしくは非変異体の標的遺伝子の発現を減少させ
るまたは阻害するために設計され得る。このような分子
の産生および使用のための技術は、当業者に周知であ
る。
【０３２９】ＡＰＩをコードする遺伝子ｍＲＮＡ転写物
を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子
は、標的遺伝子ｍＲＮＡの翻訳を阻止し、それゆえ遺伝
子産生物の発現を阻止するために使用され得る（例え
ば、ＰＣＴ国際公開 ＷＯ９０／１１３６４、１９９０
年１０月４日公開；Ｓａｒｖｅｒら，１９９０， Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２４７：１２２２−１２２５を参照のこ
と）。
【０３３０】リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒
することが可能な酵素的なＲＮＡ分子である（総説につ
いては、Ｒｏｓｓｉ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ４，４６９−４７１を参照のこと）。リボ
ザイムの作用機構は、相補的な標的ＲＮＡに対するリボ
ザイム分子の配列特異的なハイブリダイゼーション、続
いてヌクレオチド鎖内切断性（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌ
ｙｔｉｃ）の切断事象を含む。リボザイム分子の構成
は、標的遺伝子ｍＲＮＡに対して相補的な１以上の配列
を含まなければならず、かつｍＲＮＡ切断の原因となる
周知の触媒的配列を含まなければならない。この配列に
ついては、例えば、本明細書中で参考としてその全体が
援用される、米国特許第５，０９３，２４６号を参照の
こと。
【０３３１】ＡＰＩをコードするｍＲＮＡを破壊するの
に、部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイ
ムが使用され得るが、ハンマーヘッド型リボザイムの使
用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍ
ＲＮＡと相補的な塩基対を形成する隣接領域によって指
示された位置で、ｍＲＮＡを切断する。標的ｍＲＮＡ
が、以下の２塩基配列（５’−ＵＧ−３’）を有するこ
とが唯一の必要条件である。ハンマーヘッド型リボザイ
ムの構築および産生は、当該分野で周知であり、各々本
明細書中で参考としてその全体が援用される、Ｍｙｅｒ
ｓ，１９９５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＡＣｏｍｐｒｅ
ｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣ
Ｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（特に８
３３頁の図４を参照のこと）ならびにＨａｓｅｌｏｆｆ
およびＧｅｒｌａｃｈ，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３
４，５８５−５９１にさらに完全に記載されている。
【０３３２】好ましくは、リボザイムは、切断認識部位
が、ＡＰＩをコードするｍＲＮＡの５’末端の近くに位
置するように（すなわち、効率を向上させ、機能的でな
いｍＲＮＡ転写物が分子内に蓄積するのを最小限にする
ために）操作される。
【０３３３】本発明のリボザイムとしてはまた、ＲＮＡ
エンドリボヌクレアーゼ（本明細書、以下では「Ｃｅｃ
ｈ型リボザイム」）（例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ中で天然に発生するもの（Ｉ
ＶＳまたはＬ−１９ ＩＶＳＲＮＡとして公知）ならび
にＴｈｏｍａｓ Ｃｅｃｈおよび共同研究者によって広
範に記載されているもの（Ｚａｕｇら，１９８４，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２２４，５７４−５７８；Ｚａｕｇおよび
Ｃｅｃｈ，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３１，４７０
−４７５；Ｚａｕｇら，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２
４，４２９−４３３；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｔｅ
ｎｔｓ Ｉｎｃ．による、公開された国際特許出願番号
ＷＯ８８／０４３００；ＢｅｅｎおよびＣｅｃｈ，１
９８６，Ｃｅｌｌ，４７，２０７−２１６）が挙げられ
る。Ｃｅｃｈ型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列にハイブ
リダイズしてその後に標的ＲＮＡの切断が起こる８塩基
対の活性部位を有する。本発明は、ＡＰＩをコードする
遺伝子中に存在する８塩基対の活性部位配列を標的とす
るＣｅｃｈ型リボザイムを含む。
【０３３４】アンチセンスアプローチにおけるように、
このリボザイムは改変されたオリゴヌクレオチド（例え
ば、改良された安定性、標的化など）から構成され得、
そしてインビボでＡＰＩを発現する細胞に送達されるべ
きである。送達の好ましい方法としては、強力な構成的
ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターまたはｐｏｌ ＩＩプロモ
ーターの制御下で、このリボザイムを「コードする」Ｄ
ＮＡ構築物を使用する工程を包含し、従ってトランスフ
ェクト細胞は、十分な量のリボザイムを産生し、このＡ
ＰＩをコードする内因性ｍＲＮＡを破壊し、そして翻訳
を阻害する。アンチセンス分子と違いリボザイムは触媒
的であるので、より低い細胞内濃度が、有効性のために
必要とされる。
【０３３５】内因性ＡＰＩ発現はまた、標的化された相
同組換えを使用してＡＰＩをコードする遺伝子もしくは
このような遺伝子のプロモーターを不活化することによ
ってか、または「ノックアウト」することによって、減
少され得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、１９８５、
Ｎａｔｕｒｅ ３１７：２３０〜２３４；Ｔｈｏｍａｓ
およびＣａｐｅｃｃｈｉ、１９８７、Ｃｅｌｌ ５１：
５０３〜５１２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９８９、Ｃｅ
ｌｌ ５：３１３〜３２１；ならびにＺｉｊｌｓｔｒａ
ら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５〜４３８
（これらのそれぞれはその全体が本明細書中で参考とし
て援用される）を参照のこと）。例えば、内因性遺伝子
（ＡＰＩをコードする遺伝子のコード領域またはＡＰＩ
をコードする遺伝子の調節領域のいずれか）に相同であ
るＤＮＡに隣接する非機能的ＡＰＩ（または完全に関係
のないＤＮＡ配列）をコードする変異遺伝子が、選択マ
ーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーを用いて
かまたは用いられずに使用され、インビボでこの標的遺
伝子を発現する細胞をトランスフェクトし得る。標的化
された相同組換えを介するＤＮＡ構築物の挿入は、この
標的遺伝子の不活化を生じる。このようなアプローチ
は、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）に対する改変を使用して不
活化した標的遺伝子を有する動物子孫を産生し得る農業
の分野において特に適切である（例えば、Ｔｈｏｍａｓ
およびＣａｐｅｃｃｈｉ、１９８７、ならびにＴｈｏｍ
ｐｓｏｎ、１９８９、上述を参照のこと）。しかし、こ
のアプローチは、適切なウイルスベクターを使用してイ
ンビボで必要な部位に、組換えＤＮＡ構築物が直接的に
投与されるかまたは標的化される場合、ヒトにおける使
用において適用され得る。
【０３３６】あるいは、ＡＰＩをコードする遺伝子の内
因性発現は、この遺伝子の調節領域（すなわち、遺伝子
プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的な
デオキシリボヌクレオチド配列を標的化し、身体中での
標的化細胞においてＡＰＩをコードする遺伝子の転写を
阻害する三重らせん構造を形成し得るすることによって
減少され得る（一般に、Ｈｅｌｅｎｅ、１９９１、Ａｎ
ｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．６（６）、５６
９〜５８４；Ｈｅｌｅｎｅら、１９９２、Ａｎｎ．Ｎ．
Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、６６０、２７〜３６；および
Ｍａｈｅｒ、１９９２、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４（１
２）、８０７〜８１５を参照のこと）。
【０３３７】本発明において転写の阻害のための三重ら
せん形成において使用される核酸分子は、一本鎖であ
り、そしてデオキシヌクレオチドから構成されるべきで
ある。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、Ｈｏ
ｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成規定を介して三重らせん形成
を促進するように設計されなければならず、これは一般
に、二重鎖の一方の鎖上に存在するプリンまたはピリミ
ジンのいずれかの大きなストレッチを必要とする。ヌク
レオチド配列は、ピリミジンベースであり得、これは生
じる三重らせんの３つの関連する鎖を横切ってＴＡＴお
よびＣＧＣ＋三重鎖を生じる。このピリミジンリッチな
分子は、この鎖に平行する方向で二重鎖の一本鎖のプリ
ンリッチな領域に相補的な塩基を提供する。さらに、例
えばＧ残基の伸長を含むピリミジンリッチである核酸が
選択され得る。これらの分子は、ＧＣ対がリッチである
ＤＮＡ二重鎖と三重らせんを形成し、ここでこのプリン
残基の多くは、この標的二重鎖の一本鎖上に位置し、三
重鎖における３本の鎖を通してＧＧＣ三重鎖を生じる。
【０３３８】あるいは、三重らせん形成のために標的化
され得る潜在的な配列は、いわゆる「スイッチバック」
核酸分子を作製することによって増加され得る。スイッ
チバック分子は、交互の５’−３’、３’−５’様式に
おいて合成され、その結果、これらは二重鎖の第１の１
つの鎖と塩基対を形成し次いでもう一方と形成し、二重
鎖の１つの鎖上に存在するプリンまたはピリミジンのい
ずれかの大きなストレッチについての必要性を排除す
る。
【０３３９】１つの実施形態において、本明細書中に記
載されるアンチセンス分子、リボザイム分子または三重
らせん分子が、変異体遺伝子発現の阻害に利用される場
合、この技術は、ＡＰＩの正常な遺伝子対立遺伝子によ
って生成されるｍＲＮＡの転写（三重らせん）もしくは
翻訳（アンチセンス、リボザイム）を効率的に減少また
は抑制し得るので、存在するＡＰＩの濃度が正常な表現
型に必要とされるよりも低くあり得るという状況が生じ
得る、ということが可能である。このような場合におい
て、ＡＰＩをコードする遺伝子の活性の実質的な正常レ
ベルを維持することを確実にするために、遺伝子治療を
使用して、正常な遺伝子活性を示しそしてアンチセン
ス、リボザイムまたは三重らせん処置が利用されるか否
かに影響を受けやすい配列を含まないＡＰＩをコードし
そして発現する核酸分子を、細胞中に導入し得る。ある
いは、この遺伝子が細胞外タンパク質をコードする例に
おいて、正常ＡＰＩは、ＡＰＩ活性の必要レベルを維持
するために共に投与され得る。
【０３４０】本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮ
Ａ、リボザイム、ならびに三重らせん分子は、上記のよ
うなＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の合成について当該分
野で公知の任意の方法によって調製され得る。これらに
は、当該分野で周知のオリゴデオキシリ−ボヌクレオチ
ドおよびオリゴリボヌクレオチドの化学合成技術（例え
ば、固相ホスホルアミダイト化学合成など）が挙げられ
る。あるいは、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子
をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボで
の転写によって生成され得る。このようなＤＮＡ配列
は、適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、
Ｔ７ポリメラーゼプロモーターまたはＳＰ６ポリメラー
ゼプロモーターなど）を取り込む種々広範なベクター中
に取り込まれ得る。あるいは、使用されるプロモーター
に依存してアンチセンスＲＮＡを構成的または誘導的に
合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物が、細胞株中に安
定に導入され得る。
【０３４１】（５．１６ 治療的または予防的化合物に
ついてのアッセイ）本発明はまた、アルツハイマー病の
処置または予防のための化合物の効果を同定するかまた
は証明するために、薬学的生成物の発見において使用す
るためのアッセイを提供する。薬剤は、アルツハイマー
病を有さない患者において見出されるレベルに対してア
ルツハイマー病を有する被験体におけるＡＦもしくはＡ
ＰＩレベルを回復する能力か、またはアルツハイマー病
の実験動物モデルにおいて同様の変化を生成する能力に
ついてアッセイされ得る。アルツハイマー病を有さない
患者において見出されるレベルに対してアルツハイマー
病を有する被験体におけるＡＦもしくはＡＰＩレベルを
回復し得るか、またはアルツハイマー病の実験動物モデ
ルにおいて同様の変化を生成し得る化合物は、さらなる
薬物発見のためのリード化合物としてか、あるいは治療
的に使用され得る。ＡＦ発現およびＡＰＩ発現は、好ま
しい技術、免疫アッセイ、ゲル電気泳動および続く視覚
化、ＡＰＩ活性の検出、または本明細書中で教示される
かもしくは当業者に公知の任意の他の方法によってアッ
セイされ得る。このようなアッセイを使用して、ＡＦま
たはＡＰＩの存在量が臨床的疾患の代理マーカーとして
役立ち得る場合、臨床的モニタリングまたは薬物開発に
おいて候補薬物をスクリーニングし得る。
【０３４２】種々の実施形態において、インビトロアッ
セイが、被験体の障害に関与する代表的な細胞型の細胞
を用いて実行され、化合物がこのような細胞型に対して
所望の効果を有するか否かを決定し得る。
【０３４３】治療において使用される化合物は、ヒトに
おいて試験する前に、適切な動物モデル系（ラット、マ
ウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなどが挙げられる
がこれらに限定されない）において試験され得る。イン
ビボ試験について、ヒトに投与する前に、当該分野で公
知の任意の動物モデル系が使用され得る。アルツハイマ
ー病の動物モデルの例としては、ヒト家族性アルツハイ
マー病（ＦＡＤ）β−アミロイド前駆体（ＡＰＰ）を発
現する動物、ヒト野生型ＡＰＰを過剰発現する動物、β
−アミロイド１−４２（βＡ）を過剰発現する動物、Ｆ
ＡＤプレセニリン−１（ＰＳ−１）を発現する動物が挙
げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｈｉｇｇ
ｉｎｓ，ＬＳ，１９９９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ ５：２７４〜２７６を参照の
こと）。さらに、ダウン症候群についての動物モデル
（例えば、ＴｇＳＯＤ１、ＴｇＰＦＫＬ、ＴｇＳ１００
β、ＴｇＡＰＰ、ＴｇＥｔｓ２、ＴｇＨＭＧ１４、Ｔｇ
ＭＮＢ、Ｔｓ６５ＤｎおよびＴｓ１Ｃｊｅ（例えば、Ｋ
ｏｌａら、１９９９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃ
ｉｎｅ Ｔｏｄａｙ ５：２７６〜２７７を参照のこ
と））が利用されてＡＦレベルまたはＡＰＩレベルを調
節する化合物を試験し得る。なぜなら、ダウン症候群を
有する個体によって示される神経病状は、アルツハイマ
ー病の神経病状と同様だからである。本開示に基づい
て、トランスジェニック動物が、１つ以上のＡＰＩをコ
ードする遺伝子の「ノックアウト」変異を用いて生成さ
れ得ることがまた、当業者に明らかである。遺伝子の
「ノックアウト」変異は、発現されないか、または異常
な形態もしくは低レベルで発現する変異遺伝子を引き起
こす変異であり、それによりこの遺伝子産物に関連する
活性はほとんどまたは完全に存在しない。好ましくは、
このトランスジェニック動物は哺乳動物であり、より好
ましくはこのトランスジェニック動物はマウスである。
【０３４４】１つの実施形態において、ＡＰＩの発現を
調節する試験化合物は、ＡＰＩを発現する、非ヒト動物
（例えば、マウス、ラット、サル、ウサギおよびモルモ
ット）、好ましくは、アルツハイマー病またはダウン症
候群の非ヒト動物モデルにおいて同定される。この実施
形態に従って、試験化合物またはコントロール化合物が
動物に投与され、そして１以上のＡＰＩの発現に対する
試験化合物の効果が決定される。ＡＰＩ（または複数の
ＡＰＩ）の発現を変化させる試験化合物は、試験化合物
で処置した動物または動物群における選択されたＡＰＩ
（またはＡＰＩをコードするｍＲＮＡ）のレベルと、コ
ントロール化合物で処置した動物または動物群における
このＡＰＩまたはｍＲＮＡのレベルとを比較することに
より同定され得る。当業者に公知の技術を用いて、ｍＲ
ＮＡおよびタンパク質レベルを決定し得る（例えば、イ
ンサイチュハイブリダイゼーション）。この動物は、試
験化合物の効果をアッセイするために屠殺されてもよい
し、屠殺されなくてもよい。
【０３４５】別の実施形態において、ＡＰＩまたはその
生物学的に活性な部分の活性を調節する試験化合物は、
ＡＰＩを発現する、非ヒト動物（例えば、マウス、ラッ
ト、サル、ウサギおよびモルモット）、好ましくは、ア
ルツハイマー病またはダウン症候群の非ヒト動物モデル
において同定される。この実施形態に従って、試験化合
物またはコントロール化合物が動物に投与され、そして
ＡＰＩの活性に対する試験化合物の効果が決定される。
ＡＰＩ（または複数のＡＰＩ）の発現を変化させる試験
化合物は、コントロール化合物で処置した動物および試
験化合物で処置した動物をアッセイすることにより同定
され得る。ＡＰＩの活性は、ＡＰＩの細胞性第２メッセ
ンジャー（例えば、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロ
ール、ＩＰ３など）の誘導を検出するか、ＡＰＩまたは
その結合パートナーの触媒活性または酵素活性を検出す
るか、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼまた
は緑色蛍光タンパク質のような検出可能なマーカーをコ
ードする核酸に作動可能に連結された本発明のＡＰＩに
応答する調節エレメント）の誘導を検出するか、または
細胞応答（例えば、細胞分化または細胞増殖）を検出す
ることによりアッセイされ得る。当業者に公知の技術を
利用して、ＡＰＩの活性における変化を検出し得る（例
えば、その全体が本明細書中に参考として援用される、
米国特許第５，４０１，６３９号を参照のこと）。
【０３４６】なお別の実施形態において、ＡＰＩ（また
は複数のＡＰＩ）のレベルまたは発現を調節する試験化
合物は、アルツハイマー病またはダウン症候群を有する
ヒト被験体、好ましくは、軽度から重度までのアルツハ
イマー病を有するヒト被験体、最も好ましくは、軽度の
アルツハイマー病を有するヒト被験体において同定され
る。この実施形態に従って、試験化合物またはコントロ
ール化合物は、ヒト被験体に投与され、そしてＡＰＩ発
現に対する試験化合物の効果が、生物学的サンプル（例
えば、ＣＳＦ、血清、血漿または尿）においてＡＰＩま
たはＡＰＩをコードするｍＲＮＡの発現を分析すること
により決定される。ＡＰＩの発現を変化させる試験化合
物は、コントロール化合物で処置した被験体または被験
体群におけるＡＰＩまたはＡＰＩをコードするｍＲＮＡ
のレベルと、試験化合物で処置した被験体または被験体
群におけるＡＰＩまたはＡＰＩをコードするｍＲＮＡの
レベルとを比較することにより同定され得る。あるい
は、ＡＰＩの発現の変化は、試験化合物の投与前および
投与後の被験体または被験体群におけるＡＰＩまたはＡ
ＰＩをコードするｍＲＮＡのレベルを比較することによ
り同定され得る。当業者に公知の任意の適切な技術を用
いて、生物学的サンプルを得て、そしてｍＲＮＡまたは
タンパク質発現を分析し得る。例えば、本明細書中に記
載の好ましい技術が、ＡＰＩのレベルにおける変化を評
価するために用いられ得る。
【０３４７】別の実施形態において、ＡＰＩ（または複
数のＡＰＩ）の活性を調節する試験化合物は、アルツハ
イマー病またはダウン症候群を有するヒト被験体、好ま
しくは、軽度から重度までのアルツハイマー病を有する
ヒト被験体、最も好ましくは、軽度のアルツハイマー病
を有するヒト被験体において同定される。この実施形態
において、試験化合物またはコントロール化合物がヒト
被験体に投与され、そしてＡＰＩの活性に対する試験化
合物の効果が決定される。ＡＰＩの活性を変化させる試
験化合物は、コントロール化合物で処置した被験体由来
の生物学的サンプルと、試験化合物で処置した被験体由
来のサンプルとを比較することにより同定され得る。あ
るいは、ＡＰＩの活性の変化は、試験化合物の投与前お
よび投与後の被験体または被験体群におけるＡＰＩの活
性を比較することにより同定され得る。ＡＰＩの活性
は、生物学的サンプル（例えば、ＣＳＦ、血清、血漿ま
たは尿）においてＡＰＩの細胞シグナル伝達経路（例え
ば、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３な
ど）の誘導を検出するか、ＡＰＩまたはその結合パート
ナーの触媒活性または酵素活性を検出するか、または細
胞応答（例えば、細胞分化または細胞増殖）を検出する
ことにより評価され得る。当業者に公知の技術を用い
て、ＡＰＩの第２メッセンジャーの誘導における変化ま
たは細胞応答の変化を検出し得る。例えば、ＲＴ−ＰＣ
Ｒを用いて、細胞性第２メッセンジャーの誘導における
変化を検出し得る。
【０３４８】特定の実施形態において、コントロール被
験体（例えば、アルツハイマー病を有さないヒト）にお
いて検出されたレベルに対してＡＰＩのレベルまたは発
現を変化させる薬剤は、さらなる試験用途または治療用
途のために選択される。別の好ましい実施形態におい
て、コントロール被験体（例えば、アルツハイマー病を
有さないヒト）において見出された活性に対してＡＰＩ
の活性を変化させる試験化合物は、さらなる試験用途ま
たは治療用途のために選択される。
【０３４９】別の実施形態において、アルツハイマー病
と関連する１以上の症状の重篤度を低減する試験化合物
は、アルツハイマー病またはダウン症候群を有するヒト
被験体、好ましくは、軽度から重度までのアルツハイマ
ー病を有するヒト被験体、最も好ましくは、軽度のアル
ツハイマー病を有するヒト被験体において同定される。
この実施形態に従って、試験化合物またはコントロール
化合物は、被験体に投与され、そしてアルツハイマー病
の１以上の症状に対する試験化合物の効果が決定され
る。１以上の症状を低減する試験化合物は、コントロー
ル化合物で処置された被験体と、試験化合物で処置され
た被験体とを比較することにより同定され得る。アルツ
ハイマー病に精通した医師に公知の技術を用いて、試験
化合物が、アルツハイマー病と関連する１以上の症状を
低減するか否かを決定し得る。例えば、アルツハイマー
病を有する被験体における記憶を高めるか、または混乱
を低減する試験化合物は、アルツハイマー病を有する被
験体を処置するために有益である。
【０３５０】好ましい実施形態において、アルツハイマ
ー病を有するヒトにおいてアルツハイマー病に関連する
１以上の症状の重篤度を低減する薬剤が、さらなる試験
用途または治療用途のために選択される。
【０３５１】（５．１７ 治療組成物および予防組成物
ならびにそれらの使用）本発明は、有効量の本発明の薬
剤を被験体に投与する工程を包含する処置の方法を提供
する。好ましい局面において、化合物は、実質的に精製
される（例えば、化合物の効果を制限するか、または所
望でない副作用を生じる物質を実質的に含まない）。こ
の被験体は、好ましくは、動物（ウシ、ブタ、ウマ、ニ
ワトリ、ネコ、イヌなどのような動物が挙げられるが、
これらに限定されない）であり、そして好ましくは、哺
乳動物であり、そして最も好ましくは、ヒトである。特
定の実施形態において、非ヒト哺乳動物が被験体であ
る。
【０３５２】化合物が核酸を含む場合に用いられ得る処
方物および投与方法は、上記のとおりである；さらなる
適切な処方物および投与経路は、以下に記載される。
【０３５３】種々の送達系が公知であり、そして本発明
の化合物を投与するために用いられ得る（例えば、リポ
ソーム、微粒子、マイクロカプセルにおけるカプセル
化、この化合物を発現し得る組換え細胞、レセプター媒
介性エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ １
９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−
４４３２を参照のこと）、レトロウイルスベクターまた
は他のベクターの一部としての核酸の構築など）。導入
方法は、経腸的または非経口的であり得、そして皮内、
筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、およ
び経口の経路が挙げられるが、これらに限定されない。
この化合物は、任意の従来の投与により、例えば、注入
またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚内層
（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を介
した吸収により投与され得、そして他の生物学的に活性
な薬剤とともに投与され得る。投与は、全身または局所
的であり得る。さらに、本発明の薬学的組成物を任意の
適切な経路（脳室内および硬膜下腔内注射を含む）によ
り中枢神経系に導入することは望ましくあり得る；脳室
内注射は、例えば、リザーバ（例えば、Ｏｍｍａｙａリ
ザーバ）に付属された、脳室内カテーテルにより容易に
され得る。肺投与もまた、例えば、吸入器またはネブラ
イザの使用、およびエアロゾル化薬剤を有する処方物に
より、用いられ得る。
【０３５４】特定の実施形態において、本発明の薬学的
組成物を処置の必要な領域に局所的に投与することは望
ましくあり得る；このことは、例えば（制限によら
ず）、外科手術の間の局所的注入、局所的適用（例え
ば、注射による）、カテーテルにより、またはインプラ
ントにより達成され得る。このインプラントは、多孔
性、非多孔性、またはゼラチン様物質である（シナラス
ティック膜のような膜または繊維を含む）。１つの実施
形態において、投与は、ＣＳＦへ、または神経変性の部
位（もしくはより前の部位）に、またはＣＮＳ組織への
直接注射によってであり得る。
【０３５５】別の実施形態において、この化合物は、小
胞（特にリポソーム）において送達され得る（Ｌａｎｇ
ｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−
１５３３；Ｔｒｅａｔら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ
ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ
Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ
−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（編），
Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，３５３−３６５頁（１９
８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書，３１
７−３２７頁を参照のこと；一般的には、同書を参照の
こと）。
【０３５６】なお別の実施形態において、この化合物
は、徐放系において送達され得る。1つの実施形態にお
いて、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅｒ，前出；Ｓ
ｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂ
ｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄ
ら，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７；Ｓａｕ
ｄｅｋら，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２
１：５７４を参照のこと）。別の実施形態において、ポ
リマー材料が用いられ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅ
ｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲ
Ｃ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄ
ａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂ
ｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕ
ｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃ
ｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，
ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅ
ｐｐａｓ，Ｊ．，１９８３，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃ
ｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１
を参照のこと；Ｌｅｖｙら，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇら，１９８９，Ａｎ
ｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄら，１
９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５もまた
参照のこと)。なお別の実施形態において、徐放系は、
治療標的（すなわち、脳）の近位に配置され得、従っ
て、全身用量のうちの特定の割合のみを要する（例え
ば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓ
ｅ，前出、第２巻、１１５−１３８頁（１９８４）を参
照のこと）。
【０３５７】他の適切な徐放系は、Ｌａｎｇｅｒ（１９
９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３）
による総説において議論される。
【０３５８】別の実施形態において、本発明の化合物が
タンパク質をコードする核酸である場合、この核酸は、
適切な核酸発現ベクターの一部として構築され、そして
これが細胞内にあるように投与することにより（例え
ば、レトロウイルスベクターの使用（米国特許第４，９
８０，２８６号を参照のこと）により、または直接注射
により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝
子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によ
り、脂質もしくは細胞表面レセプターもしくはトランス
フェクト薬剤でのコーティングにより、または核に入る
ことが公知のホメオボックス様ペプチドに連結して投与
することにより（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら，１９９１，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
８：１８６４−１８６８を参照のこと）により、な
ど）、そのコードされたタンパク質の発現を促進するよ
うにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細胞
内に導入され得、そして相同組換えによる発現のために
宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る。
【０３５９】本発明はまた、薬学的組成物を提供する。
このような組成物は、治療有効量の薬剤、および薬学的
に受容可能なキャリアを含む。好ましい実施形態におい
て、用語「薬学的に受容可能な」は、合衆国政府または
州政府の監督官庁により認可を受けているか、あるいは
動物における使用のための、より具体的にはヒトにおけ
る使用のための米国薬局方または他の一般に認識される
薬局方において列挙されていることを意味する。用語
「キャリア」とは、希釈剤、アジュバント、賦形剤、ま
たはビヒクル（これらとともに、治療剤が投与される）
をいう。このような薬学的なキャリアは、例えば、水お
よび油のような滅菌液体（石油、動物、植物または合成
起源の油（例えば、落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油
など）を含む）であり得る。薬学的組成物が静脈内に投
与される場合は、水が好ましいキャリアである。生理食
塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール
溶液はまた、液体キャリアとして、特に注射溶液のため
に用いられ得る。適切な薬学的賦形剤としては、デンプ
ン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、
麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリ
ン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タル
ク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロー
ル、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙
げられる。所望であれば、この組成物はまた、微量の湿
潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これ
らの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸
剤、カプセル剤、散剤、徐放処方物などの形態をとり得
る。この組成物は、伝統的な結合剤およびトリグリセリ
ドなどのキャリアとともに坐剤として処方され得る。経
口処方物は、標準的なキャリア（例えば、薬学等級のマ
ンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグ
ネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マ
グネシウムなど）を含み得る。適切な薬学的キャリアの
例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏ
ｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ」に記載される。このような組成物は、被験体への
適切な投与のための形態を提供するように、適切な量の
キャリアとともに、治療有効量の化合物（好ましくは、
精製された形態において）を含む。この処方物は、投与
様式に適しているべきである。
【０３６０】好ましい実施形態において、この組成物
は、ヒトへの静脈内投与に適合した薬学的組成物として
慣用的手順に従って処方される。代表的には、静脈内投
与のための組成物は、滅菌等張性水性緩衝液の溶液であ
る。必要な場合、この組成物はまた、注射部位における
疼痛を和らげるために、可溶化剤および局所麻酔剤（例
えば、リドカイン）を含み得る。一般に、成分は、例え
ば密閉容器中の乾燥した凍結乾燥粉末または無水濃縮物
として（例えば、活性薬剤の量を示すアンプルもしくは
小袋（ｓａｃｈｅｔｔｅ）として）単位投薬形態で別々
か、または一緒に混合してかのいずれかで供給される。
組成物が注入により投与される場合、これは滅菌の製薬
等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルで分散され
得る。組成物が注射により投与される場合、注入用滅菌
水または生理食塩水のアンプルは、この成分が投与前に
混合され得るように提供され得る。
【０３６１】本発明の化合物は、中性または塩形態とし
て処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、遊離
アミノ基（例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒
石酸などに由来するもの）で形成される塩、およびナト
リウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化
第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−
エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど
に由来するもののような遊離カルボキシル基で形成され
る塩が挙げられる。
【０３６２】アルツハイマー病の処置において有効な本
発明の化合物の量は、本記載に基づく標準的な臨床技術
により決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、
必要に応じて、最適投薬範囲の同定を補助するために用
いられ得る。処方物に用いられる正確な用量はまた、投
与経路、および疾患または障害の重篤度に依存し、そし
て医師の判定および各被験体の環境に従って決定される
べきである。しかし、静脈内投与の適切な投薬範囲は、
一般に、体重１ｋｇあたり約２０〜５００μｇの活性化
合物である。鼻腔内投与のための適切な投薬範囲は、一
般に、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重で
ある。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系
から誘導される用量応答曲線から推定され得る。
【０３６３】坐剤は、一般に、０．５重量％〜１０重量
％の範囲の活性成分を含む；経口処方物は、好ましく
は、１０％〜９５％の活性成分を含む。
【０３６４】本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１
以上の成分が充填された１以上の容器を含む薬学的パッ
クまたはキットを提供する。医薬または生物製剤の製
造、使用または販売を規制する政府当局により定められ
た形式の通知が、必要に応じてこのような容器に付随し
得る。この通知は、（ａ）ヒト投与のための製造、使用
または販売の、機関による認可、（ｂ）使用のための指
示、またはその両方を反映する。
【０３６５】（６．実施例：アルツハイマー病における
ＣＳＦにおいて差次的に発現されるタンパク質の同定）
以下の例示的かつ非限定的な手順を用いて、（ａ）アル
ツハイマー病を有する１４８の被験体、（ｂ）これらの
アルツハイマー病の被験体の６０家族の構成員、および
（ｃ）３２の無関連コントロールに由来するＣＳＦサン
プルにおけるタンパク質を、等電点電気泳動、続いてＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そして分析した。同じ被
験体から、連続サンプルを経時的に得た。以下に記載の
手順のパート６．１．１から６．１．９（６．１．９を
含む）を「参考プロトコル」としてここで示す。
【０３６６】（６．１．材料および方法） （６．１．１．サンプル調製）タンパク質アッセイ（Ｐ
ｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｃａｔ＃２３２２５）を、受け取
り時の各ＣＳＦサンプルに対して行った。タンパク質分
離の前に、タンパク質分離を高めかつ簡単にし、そして
目的のタンパク質を妨害し得るかまたは目的のタンパク
質の分析を制限し得るタンパク質を除去することにより
分析を容易にするために、各サンプルを特定のタンパク
質の選択的枯渇のために処理した。１９９９年６月１日
出願の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１７４２
（その全体が本明細書中に参考として援用される）、特
に３頁および６頁を参照のこと。
【０３６７】ＣＳＦからのアルブミン、ハプトグロビ
ン、トランスフェリンおよび免疫グロブリンＧ（Ｉｇ
Ｇ）の除去（「ＣＳＦ枯渇」）を、アフィニティークロ
マトグラフィー精製工程により達成し、ここでサンプル
を、アルブミン、ハプトグロビンおよびトランスフェリ
ンの選択的除去のための固定化抗体、ならびに免疫グロ
ブリンＧの選択的除去のためのプロテインＧを含む一連
の「Ｈｉ−Ｔｒａｐ」カラムに通した。直列アセンブリ
で２つのアフィニティーカラムを、Ｈｉ−Ｔｒａｐカラ
ムに含まれるプロテインＧ−セファロース（プロテイン
ＧセファロースＨｉ−Ｔｒａｐカラム（１ｍｌ）Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−０４０４−０１）
に抗体をカップリングすることにより調製した。このこ
とは、以下の溶液をカラムを通して順番に循環させるこ
とにより行った：（１）ダルベッコのリン酸緩衝化生理
食塩水（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｃａｔ．Ｎｏ．１４１９
０−０９４）；（２）濃縮抗体溶液；（３）２００ｍＭ
炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３５）；（４）架橋
溶液（２００ｍＭ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３
５）、２０ｍＭ ジメチルピメリミデート）；および
（５）５００ｍＭ エタノールアミン、５００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ。ついで、第３の（非誘導化）プロテインＧＨｉ
−Ｔｒａｐカラムを、直列カラムアセンブリの下端に接
続した。
【０３６８】クロマトグラフィー手順を、Ａｋｔａ Ｆ
ａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａ
ｔｏｇｒａｐｈｙ（ＦＰＬＣ）システムを用いて自動化
し、その結果、一連の７回までの作動を連続的に行うこ
とができた。サンプルを、一連の３つのＨｉ−Ｔｒａｐ
カラムに通過させ、ここで、アフィニティークロマトグ
ラフィー媒体が、上記のタンパク質を選択的に結合し、
それにより、サンプルから上記のタンパク質を除去す
る。画分（代表的には１チューブあたり３ｍｌ）を、カ
ラムローディングおよび洗浄段階の間にカラムから溶出
した非結合物質について回収し（「フロースルー画
分」）、そして結合タンパク質をＩｍｍｕｎｏｐｕｒｅ
Ｇｅｎｔｌｅ Ａｇ／Ａｂ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆ
ｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．２１０１３）を
用いた段階溶出により溶出した（「結合／溶出画
分」）。非結合物質を含む溶出液をプールした画分にお
いて回収し、遠心限外濾過により脱塩／濃縮し、そして
２Ｄ ＰＡＧＥによるさらなる分析を待つために保存し
た。
【０３６９】約３００μｇの総タンパク質を含む枯渇Ｃ
ＳＦの容量をアリコートにわけ、そして等量の１０％
（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（Ｆｌｕｋａ ７１７２９）、２．３
％（ｗ／ｖ）ジチオスレイトール（ＢＤＨ ４４３８５
２Ａ）を添加した。サンプルを９５℃で５分間加熱し、
次いで、２０℃に冷却した。次いで、１２５μｌの以下
の緩衝液をサンプルに添加した： ８Ｍ 尿素（ＢＤＨ ４５２０４３ｗ） ４％ ＣＨＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃ３０２３） ６５ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ） ２％（ｖ／ｖ）Ｒｅｓｏｌｙｔｅｓ ３．５−１０（Ｂ
ＤＨ ４４３３８ ２×）。
【０３７０】この混合物をボルテックスし、そして１３
０００ｒｐｍで５分間、１５℃で遠心分離し、そして上
清を等電点電気泳動により分析した。
【０３７１】（６．１．２．等電点電気泳動）等電点電
気泳動（ＩＥＦ）を製造業者の説明書に記載される手順
に従って、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ（登録商標）ＤｒｙＳ
ｔｒｉｐ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢｉｏＴｅｃ
ｈ）を用いて行った。Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ（登録商
標）ＤｒｙＳｔｒｉｐ Ｋｉｔ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，
＃１８−１０３８−６３，Ｅｄｉｔｉｏｎ ＡＢ（その
全体が本明細書中に参考として援用される）の説明書を
参照のこと。Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｐＨ Ｇｒａｄ
ｉｅｎｔ（ＩＰＧ）ストリップ（１８ｃｍ，ｐＨ３〜１
０の非線形ストリップ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃａｔ．
＃１７−１２３５−０１）を、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ
ＤｒｙＳｔｒｉｐＵｓｅｒｓ Ｍａｎｕａｌに記載のよ
うに、８Ｍ 尿素、２％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、１０ｍ
Ｍ ＤＴＴ、２％（ｖ／ｖ）Ｒｅｓｏｌｙｔｅｓ ３．
５〜１０の溶液中、２０℃で一晩再水和した。ＩＥＦに
ついては、５０μｌの上清（上記のように調製した）を
ストリップにロードし、カップローディングユニットを
ストリップの塩基性末端に配置した。次いで、ロードし
たゲルを鉱油（Ｐｈａｒｍａｃｉａ １７−３３３５−
０１）で覆い、そして以下のプロフィールに従って、Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ ＥＰＳ３５００ＸＬ電源装置（Ｃａ
ｔ １９−３５００−０１）を用いてストリップに直ぐ
に印加した： 初期電圧＝３００Ｖ、２時間 ３時間かけて３００Ｖから３５００Ｖの線形傾斜 ３５００Ｖで１９時間維持。
【０３７２】処理の全ての段階について、電流限界を１
２のゲルについて１０ｍＡに設定し、そしてワット限界
を５Ｗに設定した。温度を作動の間中、２０℃に維持し
た。
【０３７３】（６．１．３．ゲル平衡化およびＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）最後の１９時間の工程の後、ストリップを直
ぐに外し、そして以下の組成物の第１の溶液に２０℃で
１０分間浸漬した：６Ｍ 尿素；２％（ｗ／ｖ）ＤＴ
Ｔ；２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ；３０％（ｖ／ｖ）グリセロ
ール（Ｆｌｕｋａ ４９７６７）；０．０５Ｍ Ｔｒｉ
ｓ／ＨＣｌ，ｐＨ６．８（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ Ｔ−１
５０３）。このストリップを、第１の溶液から取り出
し、そして以下の組成の第２の溶液に２０℃で１０分間
浸漬した：６Ｍ 尿素；２％（ｗ／ｖ）ヨードアセトア
ミド（Ｓｉｇｍａ Ｉ−６１２５）；２％（ｗ／ｖ）Ｓ
ＤＳ；３０％（ｖ／ｖ）グリセロール；０．０５Ｍ Ｔ
ｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ６．８。第２の溶液から取り出し
た後、このストリップを、以下に特定される改変を伴っ
て、Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒら，１９８８，Ａｎａｌ
ｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７３：４
１２−４２３（その全体が本明細書中に参考として援用
される）に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの支持されたゲル
上にロードした。
【０３７４】（６．１．４．支持されたゲルの調製）ゲ
ルを、以下の寸法の２つのガラスプレートの間に入れ
た：２３ｃｍ幅×２４ｃｍ長（後ろ側プレート）；２３
ｃｍ幅×２４ｃｍ長（中心部１９ｃｍにおいて２ｃｍの
深さのノッチ）（前側プレート）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルの共有結合を促進するために、後ろ側プレートを、エ
タノール中のγ−メタクリル−オキシプロピルトリメト
キシシランの０．４％溶液（ＢｉｎｄＳｉｌａｎ
ｅＴＭ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃａｔ．＃１７−１３３
０−０１）で処理した。前側プレートを、ＲｅｐｅｌＳ
ｉｌａｎｅＴＭ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃａｔ．＃１７
−１３３２−０１で処理して、ゲルの接着を減少させ
た。過剰な試薬を水で洗浄することにより除去し、そし
てこれらのプレートを乾燥させた。この段階でゲルの識
別およびプレートのコーティングされた面を識別するた
めのマーカーの両方として、接着バーコードをゲルマト
リックスと接触させないように、適切な位置に後ろ側プ
レートに接着した。
【０３７５】乾燥したプレートを、１３のゲルサンドイ
ッチを収容する能力を有するキャスティングボックスに
組み立てた。各サンドイッチの頂部プレートおよび底部
プレートを、１ｍｍ厚さのスペーサー、２．５ｃｍ幅に
より間隔を空けた。サンドイッチをアセテートシートで
挟み込んで、ゲルの重合後のサンドイッチの分離を容易
にした。次いで、キャスティングを、Ｈｏｃｈｓｔｒａ
ｓｓｅｒら（前出）に従って行った。
【０３７６】９〜１６％の線形ポリアクリルアミド勾配
をキャストし、Ａｎｇｅｌｉｑｕｅｇｒａｄｉｅｎｔ
ｃａｓｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌ
ｅＢｉｏｌｏｇｙ）を用いて、前側プレートにおけるノ
ッチのレベルの２ｃｍ下の点まで広げた。ストック溶液
は以下のとおりであった。アクリルアミド（水中４０
％）は、Ｓｅｒｖａ（Ｃａｔ．＃１０６７７）製であっ
た。架橋剤は、総開始モノマー含有量の２．６％（ｗ／
ｗ）の濃度のＰＤＡ（ＢｉｏＲａｄ １６１−０２０
２）であった。ゲル緩衝液は、０．３７５Ｍ Ｔｒｉｓ
／ＨＣｌ，ｐＨ８．８であった。重合触媒は、０．０５
％（ｖ／ｖ）ＴＥＭＥＤ（ＢｉｏＲａｄ１６１−０８０
１）であり、開始剤は、０．１％（ｗ／ｖ）ＡＰＳ（Ｂ
ｉｏＲａｄ １６１−０７００）であった。ＳＤＳは、
ゲル中に含めず、濃縮ゲルも用いなかった。キャストゲ
ルを２０℃で一晩重合させ、次いで、密封ポリエチレン
バッグ中で６ｍｌのゲル緩衝液とともに４℃で保存し、
４週間以内に用いた。
【０３７７】（６．１．５ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）０．５
％（ｗ／ｖ）アガロース（Ｆｌｕｋａ Ｃａｔ ０５０
７５）溶液をラニング緩衝液（微量のブロモフェノール
ブルーを補充した、０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１９
８Ｍグリシン（Ｆｌｕｋａ ５００５０）、１％（ｗ／
ｖ）ＳＤＳ）中で調製した。このアガロース懸濁液を、
このアガロースが溶解するまで攪拌しながら、７０℃ま
で加熱した。この支持された２次元ゲルの上層を、この
アガロース溶液で満たし、そして平衡化したストリップ
をこのアガロース中に配置し、そして、このゲルがこの
２次元ゲルと密に接触するまで、パレットナイフを用い
て穏やかに軽く叩いた。このゲルを、Ａｍｅｓｓら、１
９９５、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １６：１２
５５〜１２６７（これは本明細書中でその全体が参考と
して援用される）に記載されるように、２次元ラニング
タンク中に配置した。このタンクを、緩衝液のレベルを
２次元ゲルの領域の上層より僅かに高くなるまでラニン
グ緩衝液（上述のように）で満たした。この２次元ゲル
は、ポリアクリルアミドを含み、活性ゲル領域を効果的
に冷却することを達成する。ラニング緩衝液を、このゲ
ルで形成された上層の緩衝液区画に加え、次いで、電圧
を、Ｃｏｎｓｏｒｔ Ｅ−８３３電源を使用して速やか
にゲルに印加した。１時間、このゲルを２０ｍＡ／ゲル
で電気泳動させた。ワット数限界を、６つのゲルを含む
タンクに対して１５０Ｗに設定し、この電圧限界を６０
０Ｖに設定した。１時間後、次いで、このゲルを、この
ブロモフェノールブルーの線がゲルの底から０．５ｃｍ
となるまで、前と同じ電圧限界およびワット数限界を用
いて４０ｍＡ／ゲルで電気泳動させた。この緩衝液の温
度を、電気泳動の最中１６℃に維持した。ゲルは、２連
で電気泳動しなかった。
【０３７８】（６．１．６染色）電気泳動の実施の完了
の際に、このゲルを、固定のため、速やかにタンクから
取り出した。ゲルカッセトの上層プレートを、注意深く
除去し、このゲルを底のプレートに結合させたままにし
ておいた。次いで、この付着したゲルを伴った底のプレ
ートを、染色装置中に配置した。この染色装置は、１２
のゲルを収容し得る。このゲルを固定剤溶液中に完全に
浸した。この固定剤溶液は、４０％（ｖ／ｖ）エタノー
ル（ＢＤＨ ２８７１９），１０％（ｖ／ｖ）酢酸（Ｂ
ＤＨ １０００１６Ｘ），５０％（ｖ／ｖ）水（Ｍｉｌ
ｌｉＱ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）であり、ゲル上を連続的
に循環した。一晩のインキュベーション後、この固定剤
をタンクから排液し、そしてこのゲルを、７．５％（ｖ
／ｖ）酢酸、０．０５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，９２．５％
（ｖ／ｖ）水に、３０分間浸すことにより、プライムし
た。次いで、このプライム化溶液を、排液し、そしてこ
のゲルを、ピリジニウムの染色溶液（４−［２−［４−
（ジペンチルアミノ）−２−トリフルオロメチルフェニ
ル］エテニル］−１−（スルホブチル）−、内塩（ｉｎ
ｎｅｒ ｓａｌｔ））中に４時間完全に浸すことによっ
て染色した。この染色溶液は、この色素のストック溶液
（ＤＭＳＯ中の２ｍｇ／ｍｌ）を、７．５％（ｖ／ｖ）
酢酸水溶液で希釈して、最終濃度を１．２ ｍｇ／ｌと
して調製した；この染色溶液を、使用する前に、０．４
μｍフィルター（Ｄｕｒｏｐｏｒｅ）を通して吸引濾過
を行った。
【０３７９】（６．１．７ゲルの画像化）コンピュータ
読取り可能出力を、前出の５．１節に記載のように、蛍
光染色したゲルをＡｐｏｌｌｏ ２スキャナ（Ｏｘｆｏ
ｒｄ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ
Ｋ）を用いて画像化することによって作製した。このス
キャナは、４つの統合蛍光マーカー（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ
３、Ｍ４と表す）を備えたゲルキャリアを有する。これ
らのマーカーは、画像の形状を修正するために使用さ
れ、そしてスキャニングが正確に実施されたことを確認
する品質制御機能である。
【０３８０】スキャニングのために、このゲルを染色液
から取り除き、水でリンスし、短時間で空気乾燥し、そ
してＡｐｏｌｌｏ ２で画像化した。画像化後、このゲ
ルを微量ボリュームの染色溶液を含んだポリエチレン容
器中に密閉し、次いで４℃で保存した。
【０３８１】（６．１．８ データのデジタル解析）こ
のデータを、米国出願第０８／９８０，５７４号（ＷＯ
９８／２３９５０として公開）の第５．４節および第
５．５節（参考として本明細書中に援用される）に記載
されるように、より詳細には以下に記載されるように、
処理した。
【０３８２】スキャナからの出力を、初めにＭＥＬＡＮ
ＩＥ（登録商標）ＩＩ ２Ｄ ＰＡＧＥ解析プログラム
（リリース２．２、１９９７、ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒ
ｎｉａ，カタログ番号１７０〜７５６６）を使用して処
理し、レジストレーションポイント Ｍ１、Ｍ２、Ｍ
３、およびＭ４を自動検出し；画像を自動クロップ（す
なわち、ゲル境界（例えば、参照フレーム）の外側に位
置するスキャンされた画像の領域に由来するシグナルを
除去）し；ゴミに起因するアーティファクトを除外し；
特徴の検出および定量化を行い；そして画像ファイルを
ＧＩＦ形式で作製した。以下パラメータを用いて、特徴
を検出した： スムース（Ｓｍｏｏｔｈｓ）＝２ ラプラシアン閾値（Ｌａｐｌａｃｉａｎ ｔｈｒｅｓｈ
ｏｌｄ）５０ 部分閾値（Ｐａｒｔｉａｌｓ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）１ サチュレーション（Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）＝１００ ピーク性（Ｐｅａｋｅｄｎｅｓｓ）＝０ 最小周囲（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ）＝１
０。
【０３８３】（６．１．９ ｐＩ値およびＭＷ値の割り
当て）ランドマーク（Ｌａｎｄｍａｒｋ）同定を使用し
て、画像中で検出した特徴のｐＩおよびＭＷを決定す
る。１２個のランドマーク特徴（ＣＳＦ１〜ＣＳＦ１２
と名づける）を、プールしたサンプルから得た標準的な
ＣＳＦ画像中で同定した。これらのランドマーク特徴は
図１で確認され、そして、表ＸＩ中で確認される、ｐＩ
値および／またはＭＷ値を割り当てた。 （表Ｘ．本研究で使用したランドマーク特徴）
【０３８４】
【表１１】 これらのランドマークのうち可能な限り多くのものを、
データセットの各ゲル画像中で同定した。次いで、この
研究ゲル中の各特徴に、ｐＩ値を、最も近い２つのラン
ドマークに対する線形内挿または線形外挿によって割り
当て（ＭＥＬＡＮＩＥ（登録商標）−ＩＩソフトウェア
を使用した）、そしてＭＷ値を、最も近い２つのランド
マークに対する線形内挿または線形外挿によって割り当
てた（ＭＥＬＡＮＩＥ（登録商標）−ＩＩソフトウェア
を使用した）。
【０３８５】（６．１．１０ 第１のマスター画像との
一致）画像を編集して、ゴミのような大きなアーティフ
ァクトを除去し、大きな異常（例えば、タンパク質特徴
のスメアリング（ｓｍｅａｒｉｎｇ））を有するか、ま
たは大部分の強度特徴より多くの同定を可能にするには
低すぎる読込み（ｌｏａｄｉｎｇ）強度もしくは低すぎ
る画像全体の強度であるか、または特徴の正確な検出を
可能にするには乏しすぎる解像度である、画像を排除し
た。次いで、画像を、全サンプルセットからの、１つの
共通な画像と対にすることによって比較した。この共通
の画像、「第１のマスター画像」を、タンパク質のロー
ド（最大特徴検出と一貫した最大ロード）、十分に解像
されたミオグロビン領域（ミオグロビンを内部標準とし
て使用した）、および一般的に画像の質に基づいて選択
した。さらに、第１のマスター画像を、解析に含まれる
全画像のうちで一般に代表的であるような画像であるよ
うに選択した。（第１のマスターゲルを研究するゲルの
代表であると判別するプロセスは、以下に記載された方
法によって再度確認され、そして第１のマスターゲルが
代表的でないものと見出される場合、これは排除され、
そしてこのプロセスを、代表的な第１のマスターゲルを
見出すまで、繰り返した）。
【０３８６】共通のタンパク質特徴が、第１のマスター
画像と別個の以下に記載のような研究ゲル画像の各々と
の間で対にされるように、残りの研究ゲル画像の各々を
別個に、この第１のマスター画像に対して一致させた。
【０３８７】（６．１．１１ サンプル間の交差一致）
差示的に発現された特徴を同定する目的で、多数のサン
プルの統計的な解析を推し進めるために、各研究ゲルの
特徴を、このタンパク質特徴パターンと第１のマスター
のタンパク質特徴パターンとの間の最大アライメントに
対して、以下のように調節した。研究ゲル画像の各々
を、複数解像度ワープ化（ｍｕｌｔｉ−ｒｅｓｏｌｕｔ
ｉｏｎ ｗａｒｐｉｎｇ）手順を使用して第１のマスタ
ー画像の形状へと別個に変換した。この手順は、画像の
形状を、１つのサンプルから別のサンプルへの電気泳動
分離プロセスの物理パラメータの僅かな変化によっても
たらされた歪みに対して修正する。観測された変化は、
見出された歪みが単純な形状的歪みではなく、むしろ円
滑な流れであり、局所的なスケールおよび大域的なスケ
ールの両方の変位を伴う。
【０３８８】複数解像度モデリングにおける基礎的な原
理は、滑らかなシグナルを、「スケール空間」を通した
展開としてモデリングし得ることである。この「スケー
ル空間」の中では、連続的なより微細なスケールにおけ
る詳細を、より低い解像度近似に加え、より高い解像シ
グナルを得る。この型のモデルは、ベクトルの流動場
（ｆｌｏｗ ｆｉｅｌｄ）（参照画像上の各ピクセル位
置で定義される）に対して適用され、そして任意の滑ら
かさ（ｓｍｏｏｔｈｎｅｓｓ）の流れを比較的少ない自
由度を用いてモデリングすることを可能にする。各画像
を、初めに、初めの画像から誘導したスタック画像また
はピラミッド画像に変形する（ｒｅｄｕｃｅ）が、全て
のレベルにおける各方向において解像度において２倍だ
けスムース化または変形され（ガウスピラミッド）、そ
して対応する異なった画像をまた、各レベルで算出し、
スムース化された画像とその前駆物（ｐｒｏｇｅｎｉｔ
ｏｒ）との間の差異（ラプラスピラミッド）を表現す
る。従って、このラプラス画像（Ｌａｐｌａｃｉａｎ
ｉｍａｇｅｓ）は、異なるスケールにおける画像の詳細
を表現する。
【０３８９】任意の２つの所定の画像間の歪みを評価す
るために、このピラミッドにおけるレベル７（すなわ
ち、解像度における、７回の連続した変形の後に）で計
算を実施した。ラプラス画像を、両方向の隣接するグリ
ッド位置間で５０％の重なりを伴って１６×１６ピクセ
ルのグリッドへとセグメント化し、そして参照画像およ
び試験画像上にある対応するグリッド正方形の間の相互
相関を算出した。次いで、歪みの変位を、相関行列中の
最大値の位置により得た。特定のレベルで全ての変位を
計算した後、これらをピラミッドにおける次のレベルへ
組み込み、試験画像に対し適用し、次いで、変位に対す
るさらなる修正を次のスケールで算出した。
【０３９０】このワーププロセスによって、第１のマス
ター画像と他のサンプルに対する画像との間の共通の特
徴の良好なアライメントを生じた。ＭＥＬＡＮＩＥ（登
録商標）ＩＩ ２Ｄ ＰＡＧＥ解析プログラムを使用し
て、第１のマスター画像と他の画像のそれぞれとの間で
の、約５００〜７００の一致した特徴の対を計算し、そ
して記録する。このプログラムの精度を、上述の様式に
おける画像アライメントにより有意に増強した。精度を
尚さらに改善するために、全ての対形成を、ＭｅｌＶｉ
ｅｗ対話式エディティングプログラムを用いて最終的に
目視により調べ、そして残りの位認識可能な程度に不正
確な対を除去した。このような認識可能に不正確な対の
数は、（同じ生物学的サンプルの繰り返し解析によって
測定された）Ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙの全再現性を超えた場合、第１のマスターゲルである
として選択されたゲルを、第１のマスターゲルとして機
能するには不充分な研究ゲルの代表として判断した。こ
の場合、第１のマスターゲルとして選択されたゲルを拒
絶し、そして異なるゲルを第１のマスターゲルとして選
択し、そしてこのプロセスを繰り返した。
【０３９１】次いで、全ての画像を、複合マスター画像
（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｍａｓｔｅｒ ｉｍａｇｅ）を
作製するために一緒に加え、そして全ての構成成分画像
の、全てのゲル特徴の位置および形態を、上述の複合マ
スターに対して重ね合わせた。
【０３９２】一旦、全ての初期対を算出し、修正し、そ
して保存すると、第２のパスを実施し、これによって、
もとの（ワープされていない）画像を、第１のマスター
の形状に対して２回目に変換し、今回は対になったゲル
の特徴の重心によって規定された複数のタイポイントの
スムース補間によって算出された流動場を使用した。従
って、複合マスター画像を、その特徴記述子を用いて第
１のマスター画像を初期化することによって生成した。
各画像を第１のマスター形状中へ変換する場合、これ
は、複合マスター画像中へデジタル的にピクセル毎に加
算され、そして上記で概略した手順によって対となって
いない特徴を、流動場の修正を使用してマスター形状に
対して調整されたこれらの重心を用いて、同様に複合マ
スター画像記述へと加算した。
【０３９３】処理の最終段階を、この複合マスター画像
およびこの特徴記述子（ここで、共通の形状へ変換され
たこの研究中の全ての画像から全ての特徴を表す）に対
して適用した。これら特徴を、これらの間の重複の度合
いに従って、連結したセットまたは「クラスタ」へと一
緒にグループ化した。次いで、各クラスタに、固有の識
別指標である、分子クラスタ指標（ＭＣＩ）を与えた。
【０３９４】ＭＣＩは、異なる画像上の一致した特徴の
セットを同定する。従って、ＭＣＩは、異なるサンプル
での２Ｄ分離における等価な位置において抽出した、タ
ンパク質を示す。
【０３９５】（６．１．１２． プロフィールの構築）
最終複合マスター画像に対する、この研究における全て
の成分ゲルの一致の後、各特徴の強度を、測定して、そ
して記憶した。この解析の最後の結果は、デジタルプロ
フィールの生成である。このデジタルプロフィールは、
同定した各々の特徴に対して、以下を含む：１）複合マ
スター画像中の対応する特徴に関連した固有の同定コー
ド（ＭＣＩ）、２）ゲル中の特徴のｘ座標、ｙ座標、
３）ＡＦの等電点（ｐＩ）、４）ＡＦの見かけの分子量
（ＭＷ）、５）シグナル値、６）先行した測定の各々に
ついての、標準偏差、および７）各特徴のＭＣＩを、こ
の特徴が一致したマスターゲルに結びつける方法。Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍａｎａ
ｇｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩＭＳ）の効力によっ
て、このＭＣＩプロフィールは、これが生成されて実際
に貯蔵されたゲルに対して追跡可能であり、その結果、
ゲルのプロフィールデータベースのコンピュータ解析に
よって同定されたタンパク質を検索し得る。ＬＩＭＳは
また、このプロフィールから、もとのサンプルまた患者
にまでたどることを可能にする。
【０３９６】（６．１．１３． プロフィールの示差的
解析）各サンプルセット（アルツハイマーのＣＳＦおよ
び正常なＣＳＦ）中のプールされたゲルデータに対し
て、これらのプロフィールを解析して、これらのプロフ
ィール中に示差的に存在する特徴を同定し、そして選択
した。次いで、これらの選択した特徴を、アルツハイマ
ーのプールされたゲル特徴のセットの中へ整理した。次
いで、各特徴のセットの一致する特徴を、アルツハイマ
ーＣＳＦと正常なＣＳＦとの間の平均的な強度におい
て、少なくとも２倍の差異を示す特徴を同定するために
比較した。示差的に存在する特徴を、アルツハイマー病
関連特徴（ＡＦ）として同定した。
【０３９７】（６．１．１４．プロフィールの統計的解
析）ＭＣＩデータを、２つの形態の統計モデルで表現し
た：１）所定のゲルに対する総タンパク質ボリュームの
割合（ＰＣＴＶＯＬ）および２）絶対ボリューム、これ
はゲル上にロードした総ボリュームによってスケール化
した（ＶＯＬ）。ＭＣＩが特定のゲル上に現れなかった
場合、値０が、ＰＣＴＶＯＬとＶＯＬに入力される。殆
どの解析に対して、ＭＣＩを統計的モデルにおいて考慮
するために、（以下に記載のような）解析される診断グ
ループのうちの少なくとも１つにおける、少なくとも７
５％のゲルにおいて、ＭＣＩが、ＰＣＴＶＯＬおよびＶ
ＯＬについてゼロでない値を有する必要があった。
【０３９８】以下に特定される補足的な統計ストラテジ
ーを使用して、マスターグループにおけるＭＣＩから、
ＡＦを同定した。
【０３９９】（Ｉ）グループ解析 これらの解析の目的は、異なる臨床的診断を有する個体
からゲルの間での差異を特徴づけることであった。この
診断グループは、以下である： １）検死確認されたもの（ＡＤ） 対 これらの第１の
サンプル中の正常なコントロール（ＮＣＯ）、 ２）疾患発症３年以内の初期サンプルを伴った痴呆アル
ツハイマー型（ＤＡＴ）対 ＮＣＯ、および ３）痴呆の臨床的診断なしで、アルツハイマー型の痴呆
であると診断された個体の１親等の親戚の、最新のサン
プル（ＮＣＦ） 対 ＮＣＯ。
【０４００】以下の統計的技術を、グループ解析におい
て使用した： （１）線形モデル ＤＡＴグループ 対 ＮＣＯグループを、このボリュー
ムのランクに関して比較した、年齢および性別について
制御する線形モデル。
【０４０１】（２）分類樹 分類樹を、予測子としてのＭＣＩボリュームおよび応答
としての臨床診断と共に使用した。このアルゴリズム
は、応答変数に従ってデータを均質なセットへと分割す
る予測子における「分岐点」を探す。この樹の所定の節
に対して全ての可能な分岐を評価した後に、多項尤度モ
デル（ｍｕｌｔｉｎｏｍｉａｌ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ
ｍｏｄｅｌ）に従って、ずれにおける変化を最大化す
る分岐点を選択する。樹モデルを、もとのデータおよび
もとのデータのブートストラップサンプル（置換えを用
いたサンプリング）からのデータの両方に対して適合さ
せる。この統計検定は、所定のＭＣＩが、もとのデータ
の樹またはブートストラップサンプルの樹のいずれかに
おいて診断を決定するために重要な「分岐点」であると
判明するか否かに関与する。
【０４０２】（３）ロジスティック回帰モデル ロジスティック回帰モデルを使用して、ＡＤである確率
をモデル化した。種々のＭＣＩのボリュームを、説明的
変数（ｅｘｐｌａｎａｔｏｒｙ ｖａｒｉａｂｌｅｓ）
として使用した。逐次的手順を使用して、５つのＭＣＩ
を選択した。
【０４０３】グループ解析に基づく包含のための基準：
上述の解析の全てからの情報を使用して、以下のＭＣＩ
を選択した： １．所定の解析に対して最も小さいｐ値を有する５〜６
のＭＣＩ ２．２つ以上の解析に対する最も小さい１００のｐ値の
中に現れたＭＣＩ ３．分類樹中の重要な分岐点として現れたＭＣＩ ４．所望の分布特性を有するＭＣＩ。
【０４０４】（４）最隣接解析（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｎｅ
ｉｇｈｂｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ）上述した技術に加
え、このゲルを最隣接解析で調べた。この解析におい
て、このゲルを視覚的に調べ、そして疾患を示すボリュ
ームもしくは他の特徴を明示した他のＭＣＩに最も近い
ＭＣＩ、およびそれ自体で同様外観および強度を明示し
たＭＣＩに、留意し、そして同様の有意性を有してカテ
ゴリー化した。次いで、これらのＭＣＩを、この疾患に
おけるこれらの役割についてのさらなる調査および解析
のためにグループに含めた。
【０４０５】（ＩＩ）長期的解析 この長期的解析の目的は、ＭＭＳＥＭ（ＭＭＳＥ評価基
準、ＣＤＲ評価基準、およびＧＤＳ評価基準）の組み合
わせによって測定した場合の疾患状態における変化に関
連したＡＦを同定することであった。２つ以上のサンプ
ルを伴ったＤＡＴ被験体をこれらの解析において使用し
た。
【０４０６】長期的解析において用いられた、２つのモ
デルが存在した。第１のモデルでは、この目的は、ボリ
ュームにおける変化が、ＭＭＳＥＭにおける変化と有意
に相関するＡＦを同定することであった。各ＡＦに対し
て、ＭＭＳＥＭを、年齢および被験体について調節した
後のボリュームのランクに関して回帰させた。グループ
解析のいずれかの上位１００位において、０．０５未満
のｐ値を有し、かつアップレギュレーションまたはダウ
ンレギュレーションに関してグループ解析と一貫性があ
るＡＦを、含めた。
【０４０７】第２のモデルの目的は、ＡＦに対する、被
験体の第１のサンプルにおけるボリュームが、第１のサ
ンプルの時点後の期間の疾患進行速度の重要な予測子で
あるＡＦを同定することであった。はじめに、単純な線
形回帰モデルを使用して、各被験体に関するＭＭＳＥＭ
に基づいた進行速度を評価した。１２以上の初期ＭＭＳ
ＥＭを有し、かつ最初のサンプルと最後のサンプルとの
間が４ヶ月より長い被験体のみを使用した。さらに、最
初のサンプルの最初の３年以内のサンプルのみが、使用
された。次いで、回帰モデリングおよび分割サンプル確
証（ｓｐｌｉｔｓａｍｐｌｅ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）
を使用して、有意ななＡＦを同定した。より具体的に
は、被験体を、最初に無作為に２つのグループに分割し
た。各グループについて、各被験体の最初のサンプルか
らのボリュームのランクを使用した、段階的重み付け最
小２乗（ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｌｅａ
ｓｔ−ｓｑｕａｒｅｓ；ＷＬＳ）回帰を使用して、進行
速度を予測するための、最良の５つのＡＦを選択した。
ＡＦが１つのグループにおいて上位５位に入り、そして
他のグループにおいて含まれるときに同じ符号をともな
った傾きの推定値を生じた場合、これを包めた。さら
に、合せた両方のグループについての段階的ＷＬＳから
の上位５位のＡＦを、包含した。
【０４０８】（６．１．１５ 選択されたタンパク質の
回収および分析）ＡＦにおけるタンパク質を、ロボット
を利用して切り出し、そして処理してトリプシン消化ペ
プチド（ｔｒｙｐｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ ｐｅｐｔｉｄ
ｅｓ）を生成した。トリプシン消化ペプチドを、Ｐｅｒ
Ｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅ
ｒ−ＤＥＴＭ ＳＴＲ Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅ
ｄＬａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔ
ｉｏｎ Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ（ＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦ）質量分析計を使用した質量分析法によって分析
し、そして選択されたトリプシン消化ペプチドを、（ｎ
ａｎｏｆｌｏｗＴ Ｍエレクトロスプレイ Ｚ−スプレイ
供給源を備えたＭｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｄｒｕｐｏ
ｌｅ Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ（Ｑ−ＴＯＦ）質
量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ， Ａｌｔｒｉｎｃｈａ
ｍ，Ｕ．Ｋ．）を使用したタンデム質量分析法（ＭＳ／
ＭＳ）によって分析した。ＡＰＩの部分アミノ酸配列決
定および同定のために、トリプシン消化ペプチドの未解
釈のタンデム質量スペクトルを、ＳＥＱＵＥＳＴ検索プ
ログラム（Ｅｎｇら、１９９４，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍ
ａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．５：９７６−９８９）バー
ジョンｖ．Ｃ．１を用いて検索した。データベース同定
のための基準は、以下を含んでいた：トリプシンの切断
特異性；データベースから返答されたペプチド中のａイ
オン、ｂイオンおよびｙイオンの組の検出；ならびにカ
ルバミドメチル化（ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌａ
ｔｉｏｎ）を説明する、全てのＣｙｓ残基についての質
量増分。検索したデータベースは、Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）によって維持され
ている、非冗長データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．
ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／でアクセス可能で
ある）中にあるタンパク質エントリーから構築された、
データベースであった。ＳＥＱＵＥＳＴプログラムを使
用し、スペクトル−スペクトル相関を通して、タンパク
質の同定した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計で検出
された質量を、同定されたタンパク質の中のトリプシン
消化ペプチドに対して割り当てた。ＳＥＱＵＥＳＴプロ
グラムを使用し、トリプシン消化ペプチドの未解釈のＭ
Ｓ／ＭＳスペクトルの検索を通して、タンパク質が同定
できなかった場合、このペプチドのタンデム質量スペク
トルを、当該分野で公知の方法を使用して、手動で解釈
した。（ペプチドイオンの低エネルギー断片化質量スペ
クトルの解釈については、Ｇａｓｋｅｌｌら、１９９
２、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔ
ｒｏｍ．６：６５８−６６２を参照のこと。）ＰＣＴ出
願番号ＰＣＴ／ＧＢ０１／０４０３４においてに記載の
された方法（全体が参考として援用される）をまた、マ
ススペクトルを解釈するために使用した。
【０４０９】（６．２ 結果）これらの初期の実験によ
って、正常なＣＳＦと比較したとき、アルツハイマー病
のＣＳＦにおいて減少した１１１個の特徴、およびアル
ツハイマー病のＣＳＦにおいて増加した３０個の特徴を
同定した。これらのＡＦの詳細は、表Ｉおよび表ＩＩに
おいて提供される。各ＡＦは、正常ＣＳＦと比較した場
合、アルツハイマー病のＣＳＦに示差的に存在した。い
くつかの好ましいＡＦについて（ＡＦ−２００、ＡＦ−
２０１、ＡＦ−２０３、ＡＦ−２０４、ＡＦ−２０５、
ＡＦ−２０６、ＡＦ−２０７、ＡＦ−２０８、ＡＦ−２
０９、ＡＦ−２１０、ＡＦ−２１１、ＡＦ−２１２、Ａ
Ｆ−２１３、ＡＦ−２１４、ＡＦ−２１５、ＡＦ−２１
６、ＡＦ−２１７、ＡＦ−２１８、ＡＦ−２１９、ＡＦ
−２２０、ＡＦ−２２１、ＡＦ−２２２、ＡＦ−２２
３、ＡＦ−２２４、ＡＦ−２２５、ＡＦ−２２６、ＡＦ
−２２７、ＡＦ−２２７、ＡＦ−２２９、ＡＦ−２３
０、ＡＦ−２３１、ＡＦ−２３２、ＡＦ−２３３、ＡＦ
−２３４、ＡＦ−２３５、ＡＦ−２３６、ＡＦ−２３
７、ＡＦ−２３８、ＡＦ−２３９、ＡＦ−２４０、ＡＦ
−２４１、ＡＦ−２４２、ＡＦ−２４３、ＡＦ−２４
４、ＡＦ−２４５、ＡＦ−２４８、ＡＦ−２４９、ＡＦ
−２５１、ＡＦ−２５２、ＡＦ−２５３、ＡＦ−２５
８、ＡＦ−２６２、ＡＦ−２６３、ＡＦ−２７８、ＡＦ
−２８７、ＡＦ−３０３、ＡＦ−３１０、ＡＦ−３１
１、ＡＦ−３１３、ＡＦ−３１４、ＡＦ−３１６、ＡＦ
−３１７、ＡＦ−３１８、ＡＦ−３２５）、差は非常に
有意であり（ｐ＜０．０１）、そして特定の非常に好ま
しいＡＦ（ＡＦ−２００、ＡＦ−２０１、ＡＦ−２０
３、ＡＦ−２０４、ＡＦ−２０５、ＡＦ−２０６、ＡＦ
−２０７、ＡＦ−２０８、ＡＦ−２０９、ＡＦ−２１
０、ＡＦ−２１１、ＡＦ−２１２、ＡＦ−２１３、ＡＦ
−２１４、ＡＦ−２１６、ＡＦ−２１７、ＡＦ−２１
８、ＡＦ−２１９、ＡＦ−２２０、ＡＦ−２２１、ＡＦ
−２２２、ＡＦ−２２３、ＡＦ−２２４、ＡＦ−２２
５、ＡＦ−２２６、ＡＦ−２２７、ＡＦ−２２７、ＡＦ
−２２９、ＡＦ−２３１、ＡＦ−２３２、ＡＦ−２３
３、ＡＦ−２３４、ＡＦ−２３５、ＡＦ−２３６、ＡＦ
−２３７、ＡＦ−２３８、ＡＦ−２４０、ＡＦ−２４
１、ＡＦ−２４２、ＡＦ−２４３、ＡＦ−２４５、ＡＦ
−２５３、ＡＦ−２５８、ＡＦ−２６２、ＡＦ−２８
７、ＡＦ−３０３、ＡＦ−３１１、ＡＦ−３１６）につ
いて、この差はさらに尚、有意であった（ｐ＜０．００
１）。
【０４１０】部分アミノ酸配列を、これらのＡＦにおい
て示差的に存在するＡＰＩについて、決定した。これら
のＡＰＩの詳細を、表ＩＶおよびＶで提供する。公開さ
れたデータベースのコンピュータ検索によって、少なく
とも１つのＡＰＩを同定した。このＡＰＩに対して、こ
の部分アミノ酸配列およびこのようなペプチド配列をコ
ードする任意のオリゴヌクレオチドのいずれもが、調べ
たどの公開データベースにも記載されてなかった。
【０４１１】（７．実施例：アルツハイマー病の診断お
よび処置）以下の実施例によって、アルツハイマー病に
ついてのスクリーニング、処置、または診断のための、
本発明のＡＰＩの使用を例示する。以下の実施例はま
た、アルツハイマー病を処置または予防するための、本
発明のＡＰＩのモジュレーター（アゴニストまたはアン
タゴニスト）の使用を例示する。
【０４１２】色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）は、初期胚
形成発生において網膜色素上皮細胞によって合成され、
そして分泌される、神経栄養性タンパク質である。色素
上皮誘導因子（ＰＥＤＦ）は、ＲＰＥ細胞と神経網膜
（ｎｅｕｒａｌ ｒｅｔｉｎａ）との間の細胞外マトリ
ックスに存在することが示されている。これは、ニュー
ロン分化を誘導し、そして血清除去（ｓｅｒｕｍ ｗｉ
ｔｈｄｒａｗａｌ）またはグルタメート細胞傷害（ｇｌ
ｕｔａｍａｔｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）によって
引き起こされる変性からの、中枢神経系のニューロンの
生存を促進する。ＰＥＤＦは、未熟であり、成熟してい
ない小脳細胞をアポトーシス死から保護し、このような
細胞にとっての生存因子として作用し、ならびにこれら
をグルタミン細胞傷害および過酸化水素細胞傷害から保
護することが示されている。ＰＥＤＦは、グリコサミノ
グリカンに、ならびに網膜芽細胞腫および小脳顆粒細胞
の表面上に存在する８０ｋＤａレセプターに結合する。
８０ｋＤａレセプターに結合するＰＥＤＦの、ならびに
ＰＥＤＦ活性は、ＰＥＤＦを認識する抗体によって、お
よびＰＥＤＦの４４アミノ酸フラグメント（アミノ酸７
８〜１２１）によってブロックされ得る。
【０４１３】分子量３３，４０１ｋＤａであり、そして
ｐＩが６．７４である、ＰＥＤＦのアイソフォームの発
現は、本明細書中で、アルツハイマー病ではない被験体
のＣＳＦと比較した場合に、アルツハイマー病を有する
被験体の脳脊髄液（ＣＳＦ）において有意に増加したこ
とを示した。従って、ＣＳＦ中のＰＥＤＦの定量的な検
出を使用して、アルツハイマー病を診断し得、アルツハ
イマー病の進行を決定し得、または、アルツハイマー病
に対する治療有効性をモニターし得る。
【０４１４】本発明の１つの実施形態において、ＰＥＤ
Ｆの発現、ＰＥＤＦの活性、またはＰＥＤＦの発現およ
び活性の両方を調節（すなわち、アップレギュレートま
たはダウンレギュレート）する化合物を、アルツハイマ
ー病の処置を必要としているかまたはその予防のために
被験体に対して投与する。ＰＥＤＦの発現、ＰＥＤＦの
活性、またはＰＥＤＦの発現および活性の両方を調節す
る抗体は、この目的のため適切である。さらに、ＰＥＤ
Ｆの全部もしくは一部をコードする核酸、またはＰＥＤ
Ｆの全部もしくは一部に相補的な核酸を、投与し得る。
ＰＥＤＦ、またはＰＥＤＦポリペプチドのフラグメント
もまた、投与され得る。
【０４１５】本発明はまた、ＰＥＤＦの発現またはＰＥ
ＤＦの活性を調節するさらなる化合物を同定するための
スクリーニングアッセイを提供する。インビトロでＰＥ
ＤＦの発現を調節する化合物を、試験化合物で処理した
細胞内のＰＥＤＦの発現とコントロール化合物（例え
ば、生理食塩水）で処理した細胞内のＰＥＤＦの発現と
を比較することによって、同定し得る。ＰＥＤＦの発現
の検出方法は、当該分野で公知であり、そしてＰＥＤＦ
ＲＮＡのレベルを（例えば、ノーザンブロット分析ま
たはＲＴ−ＰＣＲによって）測定することおよびＰＥＤ
Ｆタンパク質を（例えば、イムノアッセイまたはウエス
タンブロット分析によって）測定することを包含する。
ＰＥＤＦの活性を調節する化合物を、試験化合物がＰＥ
ＤＦの機能をアゴナイズするか、またはアンタゴナイズ
する能力（例えば、これの神経栄養活性または８０ｋＤ
ａレセプターへの結合）と、コントロール化合物（例え
ば、生理食塩水）がＰＥＤＦの同じ機能を阻害する能力
とを比較することによって、同定し得る。ＰＥＤＦレセ
プターへのＰＥＤＦ結合またはＰＥＤＦ活性を調節し得
る化合物は、アルツハイマー病の処置にとして有用な化
合物のさらなる開発のために適切な化合物として同定さ
れる。
【０４１６】ＰＥＤＦとそのレセプターとの間の結合
は、例えば、ＰＥＤＦと、ＰＥＤＦレセプターを発現し
ていることが既知な細胞とを接触させ、そしてＰＥＤＦ
と細胞表面レセプターとの間の結合の度合いをアッセイ
することによって、または無細胞アッセイ（すなわち、
ＰＥＤＦおよびＰＥＤＦレセプターが単離されており、
好ましくは組換え的に作製された、アッセイ）において
ＰＥＤＦとそのレセプターを接触させ、そしてＰＥＤＦ
とそのレセプターとの間の結合の度合いをアッセイする
工程によって決定し得る。このようなアッセイの使用を
通して、候補化合物を、ＰＥＤＦの、そのレセプターへ
の結合をアゴナイズするか、またはアンタゴナイズする
能力に対して試験し得る。
【０４１７】ＰＥＤＦの発現またはＰＥＤＦ活性に影響
を与える、インビトロで同定される化合物を、アルツハ
イマー病およびダウン症候群の動物モデルにおいてか、
またはアルツハイマー病を有する被験体において、イン
ビボで試験し得、これらの治療的効力を決定し得る。
【０４１８】本発明は、本願書に記載の特定の実施形態
に関して、限定されるべきではなく、これらの実施形態
は本発明の個々の局面の単なる例示として意図される。
本発明の範囲内にある機能的に等価な方法および装置
は、本明細書中で列挙されたものに加えて先に述べた記
述および添付の図面から、当業者にとっては明らかであ
る。このような改変および変形は、特許請求の範囲内に
あることが意図される。各参考文献、特許および本明細
書中で引用された特許出願の内容は、本明細書中で全体
が参考として援用される。
【０４１９】本発明は、アルツハイマー病のスクリーニ
ング、診断または予後のため、アルツハイマー病の処置
の有効性をモニターするため、ならびに薬物開発のため
の方法および組成物を提供する。脳脊髄液、血清または
血漿の二次元電気泳動によって検出可能なアルツハイマ
ー病関連特徴（ＡＦ）が、記載される。本発明はさら
に、脳脊髄液、血清または血漿において検出可能なアル
ツハイマー病関連タンパク質アイソフォーム（ＡＰ
Ｉ）、単離されたＡＰＩを含む調製物、ＡＰＩに対して
免疫特異的な抗体、薬学的組成物、診断および治療方
法、ならびにこれらを含むかまたはこれらに基づくキッ
トをさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、正常なＣＳＦの２次元電気泳動から得
られた画像である。これには、ＣＳＦ１〜ＣＳＦ１２と
名付けた１２個の目印となる特徴を識別するために注釈
を付し、そしてこれは、本発明の１つの局面の１つの実
施形態を示す。
【図２】図２は、特徴および特徴とタンパク質アイソフ
ォームとの関係の特徴づけ示すフローチャートである。
特徴は、ｐＩおよびＭＷを伴う特定のペプチド配列を有
する、タンパク質アイソフォームとして、またはタンパ
ク質アイソフォームによってさらに説明され得る。本明
細書中で示されたように、特徴は、１つ以上のタンパク
質アイソフォームを含み、これらは、好ましい技術を使
用して見分けがつかないｐＩおよびＭＷを有するが、別
個のペプチド配列を有している。このタンパク質アイソ
フォームのペプチド配列を、このようなペプチド配列を
含む以前に同定したタンパク質に対してデータベースを
検索するために使用し得、いずれかの以前に同定された
タンパク質について、市販されている抗体（これは、以
前に同定されたタンパク質およびまたはこのタンパク質
ファミリーのメンバーを認識する）が存在するか否かを
確認し得る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/08 ４Ｃ０８５ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/02 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ａ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 27/447 33/50 Ｚ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｍ 33/53 33/577 Ｂ 37/00 １０２ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 37/00 １０２ Ｇ０１Ｎ 27/26 ３１５Ｈ ３１５Ｆ ３１５Ｇ ３２５Ａ ３０１Ａ ３０１Ｃ (72)発明者 エル． キャスリン ダラム アメリカ合衆国 コネチカット 06320, ニュー ロンドン， グレンウッド ア ベニュー 94 (72)発明者 デイビッド エル． フリードマン アメリカ合衆国 コネチカット 06433, マディソン， バートレット ドライブ 368 (72)発明者 ヘラス マディヤンセラジ アスラ チャ ンドラシリ ヘラス イギリス国 オーエックス14 １ワイダブ リュー， アビンドン， フォスター ロ ード 53 (72)発明者 リダ エイチ． キメル アメリカ合衆国 コネチカット 06412, チェスター， ボカム ロード 55 (72)発明者 ラジェシュ ビクフ パレク イギリス国 オーエックス６ オーエヌエ ス， ニア ウェンドルバリー， ラング フォード レーン， アルチェスター ハ ウス (72)発明者 デイビッド エム． ポッター アメリカ合衆国 コネチカット 06339, リダイアード， クリスウッド トレイ ス 33 (72)発明者 クリスチャン ロールフ イギリス国 オーエックス１ ２アールエ イ， オックスフォード， リューリー ロード 19 (72)発明者 ビー． マイケル シルバー アメリカ合衆国 コネチカット 06433, マディソン， ランディ ドライブ 104 (72)発明者 ピーター ジェフリー スナイダー アメリカ合衆国 コネチカット， ウエス ト ハートフォード (72)発明者 ホリー ダリア ソアレス アメリカ合衆国 コネチカット， グロト ン (72)発明者 トーマス アール． スティガー アメリカ合衆国 コネチカット 06379, ポーカタック， キャッスル ヒル ロ ード 93 (72)発明者 ピー． トレイ サンダーランド アメリカ合衆国 メリーランド 20815, シェビー チェイス， カンバーランド アベニュー 4718 (72)発明者 ロバート レイド タウンゼンド イギリス国 オーエックス２ ０イーユ ー， オックスフォード， オートランズ ロード ２ (72)発明者 ダブリュー． フロスト ホワイト アメリカ合衆国 コネチカット 06339, リダイアード， ホームステッド ロー ド 65 (72)発明者 スティーブン エイ． ウィリアムズ アメリカ合衆国 コネチカット 06340, グロトン， コロニー ロード 114 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 CB01 CB17 DA12 DA13 DA14 DA36 DA37 DA77 FB02 FB03 FB05 FB06 4B024 AA01 AA11 BA80 CA01 CA04 CA05 CA06 CA11 CA12 DA02 4B063 QA18 QA19 QQ03 QQ53 QQ79 QR77 QR80 QS32 4B064 AG27 CC24 DA01 DA13 4C084 AA13 NA14 ZA162 4C085 AA13 AA14 DD61 EE01 4H045 AA11 AA30 BA10 BA40 CA40 DA75 DA76 EA20 EA50

Claims (50)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 哺乳動物におけるアルツハイマー病のス
    クリーニング、診断または予後のための方法、アルツハ
    イマー病を発症する危険のある哺乳動物を同定するため
    の方法、および／あるいはアルツハイマー病を有する哺
    乳動物に施した治療の効果をモニターするための方法で
    あって、該方法は、以下：該哺乳動物由来の体液の試験
    サンプルを、二次元電気泳動によって分析して、特徴の
    二次元アレイを作製する工程であって、該アレイは、少
    なくとも１つの選択された特徴を含み、該特徴の相対存
    在比は、アルツハイマー病の存在、非存在、段階または
    重症度に関連するか、あるいはアルツハイマー病の発症
    または経過を予測する、工程；および該試験サンプル中
    の選択された各特徴の存在比を、アルツハイマー病を有
    さない１人以上の身体由来の体液中の選択された特徴の
    存在比、あるいはアルツハイマー病を有さない被験体に
    おける特徴についての予め決定された参照範囲、あるい
    は該試験サンプルにおける少なくとも１つの発現参照特
    徴（ＥＲＦ）での存在比と比較する工程、を包含する、
    方法。
  2. 【請求項２】 前記体液が、脳脊髄液（ＣＳＦ）であ
    る、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記方法が、アルツハイマー病のスクリ
    ーニングまたは診断のための方法であり、そして選択さ
    れた少なくとも１つの特徴の前記相対存在比が、アルツ
    ハイマー病の存在または非存在に関連する、請求項１ま
    たは２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記方法が、アルツハイマー病を有する
    被験体に施した治療の効果をモニターするための方法で
    あって、そして選択された少なくとも１つの特徴の前記
    相対存在比が、アルツハイマー病の重症度に関連する、
    請求項１または２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記工程（ｂ）が、前記サンプルにおけ
    る選択された各特徴の存在比を、アルツハイマー病を有
    さない１つ以上の哺乳動物由来のＣＳＦにおいて選択さ
    れた特徴の存在比、またはアルツハイマー病を有さない
    哺乳動物における選択された特徴についての予め決定さ
    れた参照範囲と比較することを含む、請求項２に記載の
    方法。
  6. 【請求項６】 前記工程（ａ）が、以下： 【化１】 のアルツハイマー病関連特徴（ＡＦ）の１つ以上を定量
    的に検出することを含む、請求項１または２に記載の方
    法。
  7. 【請求項７】 前記工程（ａ）が、ドデシル硫酸ナトリ
    ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
    Ｅ）の後に、等電点電気泳動を含む、請求項１、２また
    は５に記載の方法。
  8. 【請求項８】 哺乳動物におけるアルツハイマー病のス
    クリーニング、診断または予後のための方法、アルツハ
    イマー病を発症する危険のある哺乳動物を同定するため
    の方法、あるいはアルツハイマー病を有する哺乳動物に
    施した治療の効果をモニターするための方法であって、
    該方法は、以下： （ａ）該哺乳動由来の脳脊髄液のサンプル中の、以下： 【化２】 のアルツハイマー病関連タンパク質アイソフォーム（Ａ
    ＰＩ）の少なくとも１つを定量的に検出する工程；およ
    び（ｂ）該アイソフォームまたは工程（ａ）において検
    出したアイソフォームのレベルまたは量を、コントロー
    ルと比較する工程、を包含する、方法。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載の方法であって、ここ
    で、前記定量的に検出する工程が、前記サンプルの少な
    くとも１つのアリコートを試験することを含み、該試験
    することが、以下： （ａ）該アリコートを、予め選択されたＡＰＩに対して
    免疫特異的な抗体と接触させる工程； （ｂ）該抗体と該アリコート中の少なくとも１つの種と
    の間に生じる任意の結合を定量的に測定する工程；およ
    び （ｃ）工程（ｂ）の結果を、コントロールと比較する工
    程、を包含する、方法。
  10. 【請求項１０】 前記抗体がモノクローナル抗体であ
    る、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記抗体がキメラである、請求項９に
    記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記定量的に検出する工程が、複数の
    抗体を有する複数のアリコートを、複数の予め選択され
    たＡＰＩの定量的検出について試験することを含む、請
    求項９に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記抗体がモノクローナル抗体であ
    る、請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記抗体がキメラである、請求項１２
    に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 調製物であって、以下： 【化３】 から選択される単離されたアルツハイマー病関連タンパ
    ク質アイソフォーム（ＡＰＩ）のうち少なくとも１つを
    含む、調製物。
  16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の調製物、他の試
    薬、および使用のための指示書を含む、キット。
  17. 【請求項１７】 複数の前記調製物を含む、請求項１６
    に記載のキット。
  18. 【請求項１８】 抗体であって、以下： 【化４】 のアルツハイマー病関連タンパク質アイソフォーム（Ａ
    ＰＩ）のうち１つに免疫特異的に結合し得る、抗体。
  19. 【請求項１９】 モノクローナル抗体である、請求項１
    ８に記載の抗体。
  20. 【請求項２０】 キメラ抗体である、請求項１８に記載
    の抗体。
  21. 【請求項２１】 前記ＡＰＩの別のアイソフォームより
    も高い親和性で該ＡＰＩに結合する、請求項１８、１９
    または２０に記載の抗体。
  22. 【請求項２２】 前記ＡＰＩの任意の他のアイソフォー
    ムよりも高い親和性で該ＡＰＩに結合する、請求項１８
    に記載の抗体。
  23. 【請求項２３】 請求項１８に記載の抗体、他の試薬、
    および使用のための指示書を含む、キット。
  24. 【請求項２４】 複数の前記抗体を含む、請求項２３に
    記載のキット。
  25. 【請求項２５】 治療有効量の請求項１８に記載の抗体
    および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成
    物。
  26. 【請求項２６】 薬学的組成物であって、以下：請求項
    １８に記載の抗体の治療有効量のフラグメントまたは誘
    導体であって、該フラグメントまたは誘導体は、該抗体
    の結合ドメインを含む、フラグメントまたは誘導体；お
    よび薬学的に受容可能なキャリア、を含む、薬学的組成
    物。
  27. 【請求項２７】 アルツハイマー病を処置する方法であ
    って、このような処置を必要とする被験体に、以下： 【化５】 のアルツハイマー病関連タンパク質アイソフォーム（Ａ
    ＰＩ）の１つをコードする、治療有効量の核酸を投与す
    る工程を包含する、方法。
  28. 【請求項２８】 アルツハイマー病を処置する方法であ
    って、このような処置または予防を必要とする被験体
    に、以下： 【化６】 のアルツハイマー病関連タンパク質アイソフォーム（Ａ
    ＰＩ）の１つ以上の機能を阻害する、治療有効量の核酸
    または抗体を投与する工程を包含する、方法。
  29. 【請求項２９】 前記核酸が、ＡＰＩアンチセンス核酸
    またはリボザイムである、請求項２７または２８に記載
    の方法。
  30. 【請求項３０】 ＡＰＩ、ＡＰＩフラグメント、または
    ＡＰＩ関連ポリペプチドと相互作用する因子をスクリー
    ニングする方法であって、該方法は、以下： （ａ）ＡＰＩ、ＡＰＩの生物学的に活性な部分、または
    ＡＰＩ関連ポリペプチドを、該因子と接触させる工程；
    および（ｂ）該因子が、該ＡＰＩ、該ＡＰＩフラグメン
    ト、または該ＡＰＩ関連ポリペプチドと相互作用するか
    否かを決定する工程、を包含する、方法。
  31. 【請求項３１】 前記ＡＰＩ、前記ＡＰＩフラグメン
    ト、または前記ＡＰＩ関連ポリペプチドが、細胞によっ
    て発現される、請求項３０に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記細胞が、組換えＡＰＩ、組換えＡ
    ＰＩフラグメント、または組換えＡＰＩ関連ポリペプチ
    ドを発現する、請求項３１に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 ＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポリペプチド
    の発現または活性を調節する因子についてスクリーニン
    グする方法であって、該方法は、以下： （ａ） ＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポリペプチドを発現す
    る細胞の第１の集団を、候補因子と接触させる工程； （ｂ）該ＡＰＩまたは該ＡＰＩ関連ポリペプチドを発現
    する細胞の第２の集団を、コントロール因子と接触させ
    る工程；および （ｃ）該第１および第２の細胞集団における、該ＡＰＩ
    もしくは該ＡＰＩ関連ポリペプチドまたは該ＡＰＩもし
    くは該ＡＰＩ関連ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの
    レベルを比較する工程、あるいは該第１および第２の細
    胞集団における、細胞のセカンドメッセンジャーの誘導
    のレベルを比較する工程、を包含する、方法。
  34. 【請求項３４】 前記ＡＰＩまたは前記ＡＰＩ関連ポリ
    ペプチド、該ＡＰＩまたは該ＡＰＩ関連ポリペプチドを
    コードするｍＲＮＡ、あるいは前記細胞のセカンドメッ
    センジャーの前記レベルが、前記第２の細胞集団よりも
    前記第１の細胞集団において大きい、請求項３３に記載
    の方法。
  35. 【請求項３５】 前記ＡＰＩまたは前記ＡＰＩ関連ポリ
    ペプチド、該ＡＰＩまたは該ＡＰＩ関連ポリペプチドを
    コードするｍＲＮＡ、あるいは前記細胞のセカンドメッ
    センジャーの前記レベルが、前記第２の細胞集団よりも
    前記第１の細胞集団において小さい、請求項３３に記載
    の方法。
  36. 【請求項３６】 ＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポリペプチド
    の発現または活性を調節する因子をスクリーニングまた
    は同定する方法であって、該方法は、以下： （ａ）スクリーニングすべき因子を、第１の哺乳動物ま
    たは哺乳動物のグループに投与する工程； （ｂ）コントロール因子を、第２の哺乳動物または哺乳
    動物のグループに投与する工程；ならびに （ｃ）該第１および第２のグループにおける、該ＡＰＩ
    もしくは該ＡＰＩ関連ポリペプチド、または該ＡＰＩも
    しくは該ＡＰＩ関連をコードするｍＲＮＡの発現レベル
    を比較する工程、あるいは該第１および第２のグループ
    における、細胞のセカンドメッセンジャーの誘導のレベ
    ルを比較する工程、を包含する、方法。
  37. 【請求項３７】 前記哺乳動物が、アルツハイマー病ま
    たはダウン症候群のための動物モデルである、請求項３
    ６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記ＡＰＩまたは前記ＡＰＩ関連ポリ
    ペプチド、該ＡＰＩまたは該ＡＰＩ関連ポリペプチドを
    コードするｍＲＮＡ、あるいは前記細胞のセカンドメッ
    センジャーの前記発現レベルが、前記第２のグループよ
    りも前記第１のグループにおいて大きい、請求項３６ま
    たは３７に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記ＡＰＩまたは前記ＡＰＩ関連ポリ
    ペプチド、該ＡＰＩまたは該ＡＰＩ関連ポリペプチドを
    コードするｍＲＮＡ、あるいは前記細胞のセカンドメッ
    センジャーの前記発現レベルが、前記第２のグループよ
    りも前記第１のグループにおいて小さい、請求項３６ま
    たは３７に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記第１および第２のグループにおけ
    る、前記ＡＰＩまたは前記ＡＰＩ関連ポリペプチド、該
    ＡＰＩまたは該ＡＰＩ関連ポリペプチドをコードするｍ
    ＲＮＡ、あるいは前記細胞のセカンドメッセンジャーの
    前記レベルが、正常なコントロール哺乳動物における、
    該ＡＰＩまたは該ＡＰＩ関連ポリペプチド、あるいは該
    ＡＰＩまたは該ＡＰＩ関連ポリペプチドをコードする該
    ｍＲＮＡのレベルとさらに比較される、請求項３９に記
    載の方法。
  41. 【請求項４１】 スクリーニングすべき前記因子の投与
    が、前記第１のグループにおける該ＡＰＩまたは前記Ａ
    ＰＩ関連ポリペプチド、あるいは該ＡＰＩまたは前記Ａ
    ＰＩ関連ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡ、ある
    いは前記細胞のセカンドメッセンジャーのレベルを、前
    記第２のグループにおける該ＡＰＩまたは該ＡＰＩ関連
    ポリペプチドあるいは該ｍＲＮＡあるいは該細胞のセカ
    ンドメッセンジャーのレベルへと調節する、請求項３９
    に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記哺乳動物が、アルツハイマー病を
    有するヒト被験体である、請求項３６に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 ＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポリペプチド
    と相互作用する因子をスクリーニングまたは同定する方
    法であって、該方法は、以下： （ａ）スクリーニングすべき因子を、該ＡＰＩまたは該
    ＡＰＩ関連ポリペプチドと接触させる工程、および
    （ｂ）存在する場合、該因子と該ＡＰＩまたは該ＡＰＩ
    関連ポリペプチドとの間の結合を定量的に検出する工
    程、を包含する、方法。
  44. 【請求項４４】 ＡＰＩまたはＡＰＩ関連ポリペプチド
    の活性を調節する因子をスクリーニングまたは同定する
    方法であって、該方法は、以下： （ａ）第１のアリコートにおいて、スクリーニングすべ
    き因子を、該ＡＰＩまたは該ＡＰＩ関連ポリペプチドと
    接触させる工程、および（ｂ）該第１のアリコートにお
    ける該ＡＰＩまたは該ＡＰＩ関連ポリペプチドの活性
    を、該候補因子の添加後に、コントロールアリコートに
    おける該ＡＰＩまたは該ＡＰＩ関連ポリペプチドの活
    性、あるいは予め決定した参照範囲と比較する工程、を
    包含する、方法。
  45. 【請求項４５】 前記ＡＰＩまたは前記ＡＰＩ関連ポリ
    ペプチドが、組換えタンパク質である、請求項４３また
    は４４に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 前記ＡＰＩまたは前記ＡＰＩ関連ポリ
    ペプチドが、固体支持体上に固定されている、請求項４
    ３または４４に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 被験体におけるアルツハイマー病のス
    クリーニング、診断または予後のための方法、あるいは
    被験体に投与した抗アルツハイマー病剤または治療の効
    果をモニターするための方法であって、該方法は、以
    下： （ａ）以下 【化７】 から選択されるＡＰＩをコードするヌクレオチド配列に
    相補的な１０個以上連続したヌクレオチドを含む、少な
    くとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを、該被験体
    由来の生物学的サンプルから得たＲＮＡ、または該ＲＮ
    ＡからコピーしたｃＤＮＡと接触させる工程であって、
    ここで、該接触させる工程が、存在する場合、該プロー
    ブの該ヌクレオチド配列へのハイブリダイズを可能にす
    る条件下で起こる、工程； （ｂ）存在する場合、該プローブと該ヌクレオチド配列
    との間のハイブリダイゼーションを検出する工程；およ
    び （ｃ）存在する場合、工程（ｂ）において検出した該ハ
    イブリダイゼーションを、コントロールサンプルにおい
    て検出した該ハイブリダイゼーション、または予め決定
    した参照範囲と比較する工程、を包含する、方法。
  48. 【請求項４８】 前記工程（ａ）が、以下： 【化８】 から選択されるＡＰＩをコードするヌクレオチド配列に
    相補的な１０個以上連続したヌクレオチドを含む複数の
    オリゴヌクレオチドプローブを、該被験体由来の生物学
    的サンプルから得られるＲＮＡ、または該ＲＮＡからコ
    ピーされたｃＤＮＡと接触させることを含み、ここで、
    該接触が、存在する場合、該プローブの該ヌクレオチド
    配列へのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で
    起こる、請求項４７に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記工程（ａ）が、前記ヌクレオチド
    配列をＤＮＡアレイにハイブリダイズする工程を包含
    し、ここで、該アレイの１つ以上のメンバーが、異なる
    ＡＰＩをコードする複数のヌクレオチド配列に相補的な
    前記プローブである、請求項４７に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 リボザイムまたはアンチセンス核酸で
    あって、該リボザイムまたはアンチセンス核酸は、以
    下： 【化９】 のアルツハイマー病関連タンパク質アイソフォーム（Ａ
    ＰＩ）のうちの１つをコードする核酸を含む、リボザイ
    ムまたはアンチセンス核酸。
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