JP2003267979A - シガトキシンｃｔｘ３ｃを検出するサンドイッチ測定キット類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】シガトキシンを構成する環の一部であるＡ−Ｅ
環部、およびＩ−Ｍ環部を含む合成ハプテンを用いて得
られた２種のモノクローナル抗体を組み合わせたサンド
イッチ法の提供 【解決手段】 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７５０のハ
イブリドーマ３Ｄ１１により産生されるシガトキシンＣ
ＴＸ３Ｃと特異的に反応するモノクローナル抗体および
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７４９のハイブリドーマ１
０Ｃ９により産生されるシガトキシンＣＴＸ３Ｃと特異
的に反応するモノクローナル抗体を組み合わせた、特に
いずれか一方を標識化合物と結合して標識モノクローナ
ル抗体とし、前記標識化された標識モノクローナル抗体
と標識化されない前記いずれかのモノクローナル抗体と
の組み合わせからなるシガトキシン類検出サンドイッチ
測定キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、被検出非タンパク
高分子化合物を構成する分子内の部分構造から誘導され
る複数の合成ハプテンを利用して得られる前記被検出非
タンパク高分子化合物に特異的に結合する複数のモノク
ローナル抗体、特にシガトキシン類と特異的に反応する
モノクローナル抗体、に標識化合物、例えば酵素標識化
合物を結合した標識モノクローナル抗体とシガトキシン
類と特異的に反応する前記モノクローナル抗体とは別の
モノクローナル抗体である非標識モノクローナル抗体と
を組み合わせたシガトキシン類、特にシガトキシンＣＴ
Ｘ３Ｃの検出に有用なサンドイッチ測定キットに関す
る。また、前記標識モノクローナル抗体を得るモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマ、該ハイブリドー
マを作製するのに用いられる合成ハプテンおよび当該合
成ハプテンとキャリヤータンパク質とから得られた当該
ハイブリドーマを作製するのに用いられる免疫用化合物
に関する。

【０００２】

【従来の技術】免疫的手法を用いて、海毒、特にシガト
キシン類（ＣＴＸ）を調査する研究は、ラジオイムノア
ッセイの発展に伴って１９７７年頃から始まった。シガ
テラ毒は、天然からごく微量しか採集されず（８５０
匹、４ｔの毒ウツボから毒本体のシガトキシンは僅か
０．３５ｍｇ）、培養による生産も困難なことが抗体調
製の障害となっている。ハワイ大学ホカマらは、貴重な
毒本体シガトキシン（１μｇ）をヒト血清アルブミンに
カルボジイミド法で連結したコンジュゲートを作製、こ
れを抗原としてマウスに免疫、モノクローナル抗体を調
製した（Ｔｏｘｉｃｏｎ 第１５巻、(1977 年)、第317
頁）。この抗体は、シガトキシンに結合するが、オカダ
酸とも強い交差活性を示し、その親和性の差は５倍程度
しかない（Journal of Clinical Laboratory Analysis
第6巻、(1992 年)、第54頁）。また、ブレベトキシン、
マイトトキシン、パリトキシン等にも交差活性を示すこ
とが分かっているが（Journal of AOAC International
第81巻、(1998 年)、第727頁）、詳しいデータは発表さ
れていない。このホカマらの抗体を用いて、シガトキシ
ン類に汚染された魚類を免疫的手法により検出するため
試薬、キット(Cigua Check TM)などが開発されている。

【０００３】本発明者らは、初期にはシガトキシンの左
側ＡＢＣ環部を化学合成し、これを合成ハプテンとした
タンパクコンジュゲートを用いて、三種のモノクローナ
ル抗体を調製しているが、これらはいずれもシガトキシ
ンに非常に弱いアフィニティーしか示さなかった（Synt
hesis (1999年)、第1431頁） 。また、他のグループ
も、合成ハプテン（ＪＫＬＭ環部）のコンジュゲートの
免疫を試みているが、モノクローナル抗体の調製には至
っていないようである〔Toxicon第38巻(2000年)第６６
９頁〕。このような状況の中で、本発明者らは、更に、
シガトキシン類の右末端の部分構造であるＩＪＫＬＭ環
部を含む合成ハプテンを設計、合成し、この合成ハプテ
ンのタンパクコンジュゲートでマウスを免疫する工程を
含む方法により前記受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７５０
のハイブリドーマを作りだし、当該ハイブリドーマを用
いてシガトキシン類に特異性の高いモノクローナル抗体
を調製することに成功した。そして、該モノクローナル
抗体を３Ｄ１１（独立行政法人産業技術総合研究所 特
許性物寄託センターの受託日、平成１４年３月５日）と
命名した。該モノクローナル抗体のシガトキシンＣＴＸ
３Ｃに対しての結合解離定数(Ｋｄ)は、１２２ｎＭであ
った。また、シガトキシンに構造の類似した海産ポリエ
ーテル系毒素と前記抗体の交差活性を測定したところ、
赤潮毒ブレベトキシン類と交差活性が確認されたが、こ
の交差活性は、シガトキシン類との結合と比べると３５
０分の１以下の非常に弱いものであることを見出した。

【０００４】また、シガトキシン類のモノクローナル抗
体を得ることを目的とする合成ハプテンとして、シガト
キシンのＡＢＣ環部のＣ₁₆位にカルボン酸リンカーを導
入した誘導体とキャリヤープロテインであるＢＳＡまた
はＫＬＨとからコンジュゲート化合物を合成し、これを
ＲＩＢＩアジュパント中に乳化し、５匹のＢａｌｂ／ｃ
マウスに３週間間隔で４回注射して免疫し、該マウスか
ら脾臓を取り出し、該脾臓細胞をミエローマ細胞（Ｐ３
Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）と融合し、前記抗体を得、前
記抗体の前記合成ハプテンに対する反応特異性を評価し
ている〔Synthesis 1999,No.SI.1431-1436 ISSN 0039-7
881,〕。すなわち、シガトキシン類、特にシガトキシン
ＣＴＸ３Ｃの部分構造を用いて、免疫化学的な手法でシ
ガトキシン類（ＣＴＸ）を調査するのに有用なモノクロ
ーナル抗体を製造するのに有用な合成シガトキシン類の
環部の一部を用いた合成ハプテンの検討がなされてい
る。

【０００５】本発明者らは、前記検討に対し更にシガト
キシン類に対しての親和性を更に向上させたモノクロー
ナル抗体を得ることができる合成ハプテンを設計してシ
ガトキシンＣＴＸ３Ｃの左末端の部分構造であるＡＢＣ
ＤＥ環部を含む化合物をハプテンとして設計、合成し、
この合成ハプテンのタンパクコンジュゲートでマウスを
免疫する工程を含む方法により前記受託番号ＦＥＲＭ
Ｐ−１８７４９のハイブリドーマ１０Ｃ９（独立行政法
人産業技術総合研究所 特許性物寄託センターの受託
日、平成１４年３月５日）を作りだし、当該ハイブリド
ーマを用いてシガトキシン類に特異性の高いモノクロー
ナル抗体を調製することに成功した。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、基本
的には、前記本発明者らが開発した前記２つのモノクロ
ーナル抗体を組み合わせて、検出特性をより改善したサ
ンドイッチ法によりシガトキシン類を検出するキットを
提供することである。また、前記キットを得るためのモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、該ハイブ
リドーマを得るために有用な合成ハプテン、該合成ハプ
テンとキャリヤータンパクとを結合させた前記モノクロ
ーナル抗体を産生させるハイブリドーマを得るのに有用
な合成ハプテン−タンパクコンジュゲートを提供するこ
とである。特に、前記２つのモノクローナル抗体の一方
にサンドイッチ法に有用な標識体を結合して有用なサン
ドイッチ法キットを得るべく検討し、シガトキシンＣＴ
Ｘ３Ｃを構成するＩＪＫＬＭ環を持つ合成ハプテンを用
いて得られたモノクローナル抗体に酵素標識体を結合す
ることによりサンドイッチ法に有用なキットが得られる
ことを発見し、前記課題を解決することができた。更
に、前記検討の中で、被検出化合物を、該被検出化合物
構成する分子内の部分構造から誘導される複数の合成ハ
プテンを利用して得られる前記被検出非タンパク化合物
に特異的に結合する複数のモノクローナル抗体を組み合
わせたサンドイッチ測定キットとすることにより、擬陽
性を顕著に減少できることを確認し、前記サンドイッチ
測定キットの技術思想を確立するに至った。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の第１は、被検出
非タンパク化合物を構成する分子内の部分構造から誘導
される複数の合成ハプテンを利用して得られる前記被検
出非タンパク化合物に特異的に結合する複数のモノクロ
ーナル抗体を組み合わせた前記被検出非タンパク化合物
検出サンドイッチ測定キットである。本発明の第２は、
被検出非タンパク化合物がシガトキシン類であり、前記
分子内の部分構造から誘導される合成ハプテンがシガト
キシン類を構成する分子両端の２種部分構造であること
を特徴とするシガトキシン類検出サンドイッチ測定キッ
トである。好ましくは、前記式１の合成ハプテンを用い
て得られた受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７５０のハイブ
リドーマ３Ｄ１１により産生されるモノクローナル抗体
と式２の合成ハプテンを用いて得られた受託番号ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１８７４９のハイブリドーマ１０Ｃ９により産
生されるモノクローナル抗体とを組み合わせたものから
なることを特徴とする前記シガトキシン類検出サンドイ
ッチ測定キットであり、より好ましくは、前記組み合わ
せるモノクローナル抗体の一方のモノクローナル抗体が
標識化したものであることを特徴とするシガトキシン類
検出サンドイッチ測定キットであり、更に好ましくは、
標識化合物が酵素標識体であることを特徴とする前記サ
ンドイッチ測定キットである。また、非標識モノクロー
ナル抗体がプレートに吸着されていることを特徴とする
前記サンドイッチ測定キットである。

【０００８】本発明の第３は、前記式１で表される新規
化合物であり、本発明の第４は、前記式１で表される新
規化合物のシガトキシン類を認識するモノクローナル抗
体を産生させるハイブリドーマを得るための合成ハプテ
ンとしての使用である。

【０００９】本発明の第６は、前記式３の合成ハプテン
とキャリヤータンパクとの反応生成物で免疫して得られ
るシガトキシン類と特異的に反応するモノクローナル抗
体であり、好ましくは、前記合成ハプテンとキャリヤー
タンパクとの反応生成物におけるキャリヤータンパクが
牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリムペットヘ
モシアニン（keyhole limpet hemocyanine,ＫＬＭ）ま
たはオボアルブミン（egg albumin、ＯＶＡ）であるこ
とを特徴とする前記モノクローナル抗体である。

【００１０】本発明の第７は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１８７５０として受託されたシガトキシン類と特異的に
反応する前記各モノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマである。

【００１１】

【本発明の実施の態様】本発明をより詳細に説明する。 Ａ．環境、食物などに微量に存在化合物の検出、特に精
度の良い検出手法の確立は安全な社会生活に強く要求さ
れている。本発明の被検出非タンパク化合物を構成する
分子内の部分構造から誘導される複数の合成ハプテンを
利用して得られる前記被検出非タンパク化合物に特異的
に結合する複数のモノクローナル抗体を組み合わせて前
記被検出非タンパク化合物検出するサンドイッチ測定方
法の確立は、高精度の検出を提供するものである点で革
新的な技術である。 Ｂ．本発明の式１の合成ハプテンに含まれる化合物３は
下記の反応式１によって得られる。反応式１の出発化合
物１は公知である〔文献；Chem.Comm. 2001, 381-38
2.〕。化合物２は、２０ｍＬナス型フラスコに化合物１
(7.8 mg,11μmol),酢酸エチル（EtOAc） (100μＬ),メ
タノール(300μＬ),Ｐｄ（ＯＨ）₂(２０％、カーボン
上: 1.1 mg, 11 μmol) を加えた。水素雰囲気下（肉厚
風船を使用）、室温で ３時間攪拌した。酢酸エチルで
希釈してから、セライトで濾過した。濾液を濃縮し、化
合物２(6.2 mg, 13 μmol) を定量的に得た。

【００１２】化合物３および３‘の混合物は、２０ｍＬ
ナス型フラスコに化合物２(4.2 mg,9.0 μmol),ＣＨ₂Ｃ
ｌ₂(300 μＬ), （ＭｅＯ）₂ＣＨＣＨ₂ＣＯ₂Ｍｅ(25 μ
Ｌ,180 μmol), ＴｓＯＨ・Ｈ₂Ｏ(0.5 mg, 3 μmol) を
加えた。室温で１．５時間攪拌した後、トルエン(1 ｍ
Ｌ) を加えて、ロータリーエバポレーターで減圧（120
mbar/hPa）し、1時間後に大気圧に戻した。酢酸エチル
で希釈してから、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶
液、水、飽和食塩水で洗い、無水硫酸マグネシウムで乾
燥、ろ過、濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフ
ィーで精製して、アセタール位に関してのジアステレオ
マー混合物 (３：３’＝３：１) を(4.7mg, 8.5 μmol,
94%)得た。化合物３および３’混合物の物性を表１に
示す。

【００１３】

【表１】

【００１４】

【化４】

【００１５】Ｃ、タンパク質コンジュゲートの調製まで
を反応式２に示す。 化合物３，３’〜化合物４，４’の合成；２０ｍＬナス
型フラスコに化合物３，３’(4.7 mg, 8.5 μmol)、ｔ
−ＢｕＯＨ(0.5 mL)、水 (125μL)、ＬｉＯＨ・Ｈ₂Ｏ
(2.8 mg, 68 μmol) を加えて、室温で1時間撹拌した。
ＫＨＳＯ₄(18.6 mg, 136 μmol) を加え、溶液のｐＨ
（3-４程度）を確認した後、酢酸エチル (10 mL) で希
釈した。無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、濃縮し、
粗化合物４，４’を得た。これにＤＭＦ(200 μL)、Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミド (9.7 mg, 85μmol)、 Ｅ
ＤＣ・ＨＣｌ(8.1 mg, 43μmol) を加えて、室温で１２
時間攪拌した。反応溶液を酢酸エチル(10 ml)で希釈
し、有機層を水で３回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾
燥、濃縮し、活性化エステルである化合物６，６’を得
た。これにＤＭＦ(100 μL) を加えた溶液を作製し、コ
ンジュゲートの調製に使用した。

【００１６】ＫＬＨコンジュゲートの調製 ＫＬＨ(7.0 mg)のPBS buffer 溶液 (2.0 ml)に活性化
エステルである化合物６，６’(約4.2 μmol) のＤＭＦ
溶液(50 μL) を加えて１０分間撹拌した。一日静置し
た後、４℃で透析した。この後、１４、１９時間後にＰ
ＢＳバッファー(700 mL) を交換し、２８時間後に透析
膜からエッペンドルフチューブに移し換えて、−７８℃
で保存した。

【００１７】ＢＳＡコンジュゲートの調製 ＢＳＡ (7.0 mg) のＰＢＳバッファー溶液 (2.0 mL) に
活性化エステルである化合物６，６’(約4.2 μmol) の
ＤＭＦ溶液(50 μL)を加えて１０分間撹拌した。一日静
置した後、４℃で透析した。この後、１４、１９時間後
にＰＢＳバッファー(700 mL) を交換し、２８時間後に
透析膜からエッペンドルフチューブに移し換えて、−７
８℃で保存した。

【００１８】

【化５】

【００１９】（Ｐｒはキャリヤータンパク。ｎは１以上
の整数）

【００２０】ハプテン価の解析 透析して得た ＢＳＡコンジュゲートを、ＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦ−ＭＳで質量分析した。ＢＳＡコンジュゲートの
平均分子量は約７１８００であった（ＢＳＡの分子量約
６６４００）。ハプテンの分子量が (５４０) であるの
で、ＢＳＡコンジュゲートには平均１０個（化合物６．
６’においてｎの平均値）のハプテンが連結されている
ことが分かった。

【００２１】Ｄ、モノクローナル抗体調製；前項で得た
ＩＪＫＬＭ−ＫＬＨ（100μg）にＲＩＢＩアジュバンド
（ＲＩＢＩＩｍｍｕｎｏｌ．Res. Inst.社製）を加え、
良く攪拌してエマルジョンとしたのち、これをＢａｌｂ
／ｃマウス（５匹）に二週間毎に三回、腹腔内投与し
た。初回免疫から３５日目にマウスの血清を採取し、Ｉ
ＪＫＬＭ−ＢＳＡ（式４）を用い、ＥＬＩＳＡ法で血清
の抗体価を滴定した。

【００２２】

【化６】

【００２３】E、ＥＬＩＳＡ法による抗体価の測定；９
６ウエルＥＬＩＳＡ用プレート（ファルコン社製、391
0）の各ウエルに50 μＬの ＩＪＫＬＭ−ＢＳＡ溶液を
入れ、室温で２時間放置後、４℃で一晩放置して、プレ
ートにコンジュゲートを吸着させた。プレートをＰＢＳ
−Ｔｗｅｅｎ〔PBS バッファー に５％ Ｔｗｅｅｎ ２
０(和光純薬製 ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン
モノラウレート（Sorbitan Monolaurate）、ICI社、商
標Tween 20 相当品 No. 167-11515、を含むもの〕で３
回洗浄後、ＭＩＬＬＩ−Ｑ水で一度洗浄し、吸着しなか
ったコンジュゲートを除去した。ハイブリドーマ培養上
清（もしくは抗血清、精製抗体溶液）を加え、室温で１
時間放置後、PBS-Tweenと、ＭＩＬＬＩ−Ｑ水で順次洗
浄した。50μＬの 酵素標識二次抗体（ヤギ抗マウスIgG
−西洋わさびペルオキシダーゼ：ＨＲＰ）（ＺＹＭＥＤ
社製、62-6520 1000倍希釈）を各ウエルに入れ、室温
で１時間放置後、PBS-Tweenと、ＭＩＬＬＩ−Ｑ水で順
次洗浄した。100μＬの基質溶液〔基質溶液の組成:
１，２−フェニレンジアミン（1,2-phenylenediamine）
4.0 mg、過酸化水素水 10 μＬ、0.1Ｍ クエン酸バッフ
ァー (pH 5.0) 10 ml〕を加え、５分間呈色反応を進行
させた後、２規定 硫酸（50 μＬ）で反応を停止した。
マイクロプレート吸光度測定装置（ＢＩＯ−ＲＡＤ, Be
nchmark 170-6850）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測
定し、陽性のクローンを判別した。

【００２４】血清中の抗体価の測定；ＩＪＫＬＭ−ＢＳ
Ａ溶液を吸着した９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレートの最
上段に、５０μＬのＰＢＳバッファーを入れた。２００
倍に希釈したマウスの抗血清(50 μＬ) を最上段のウエ
ル(Ａ１)に加え、この溶液を順次２倍希釈した（縦列Ａ
１−Ａ８に４００倍から５１，２００倍の希釈系列を作
製）。プレートを室温で１時間放置後、上述の方法で４
５０ｎｍの吸光度を測定した。血清希釈率の対数（横
軸）と吸光度をプロット（ＯＤ、縦軸）すると、シグモ
イド状の滴定曲線となり、血清濃度依存的に、血清中の
抗体がＩＪＫＬＭ−ＢＳＡコンジュゲートと結合するこ
とが分かった。また、ＡＢＣ−ＢＳＡとはほとんど結合
しないことを確認した。

【００２５】５匹の中で、最も高い抗体価を示したマウ
スに、腹腔内にＩＪＫＬＭ−ＫＬＨ（100 μg）を追加
免疫し、３日後に脾臓を摘出した。脾臓に付着している
組織や臓器の断片をピンセットで取り除いた後、基本培
地〔RPMI Medium 1640 (GIBCO 社製、一袋)、炭酸水素
ナトリウム2 g, ペニシリン-ストレプトマイシン（GIBC
O 社製）20 mg, 200 mM-グルタミン２０mLを蒸留水に溶
かして１０００mＬとしてｐＨを７．２に調製したも
の〕入りのシャーレに移し、ピンセットで脾臓内の細胞
を浮遊させた。脾細胞浮遊液を濾過後、５０mL遠心管に
移した。さらに、基本培地１５ｍＬを加え、良くピペッ
ティングして濾過し、全量を３０ｍＬとした。８００回
転／分で５分間、室温で遠心分離し、上清を除去、タッ
ピングした。ＨＴ・ＢＣ培地［牛胎児血清（ＦＣＳ）20
0 ｍＬ, ＨＴ（コスモバイオ社製ＨＴ液（５０倍濃縮）
２０ｍＬ,ＢＣ（Bioresearch island社製 BriClone）５
０ｍＬ, 基本培地７３０ ｍＬを混合したもの）を３０
ｍＬ加え、細胞を浮遊させた。

【００２６】ハイブリドーマの調製；冷凍庫から（−１
３０℃）からミエローマ細胞〔Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．５
６３（大日本製薬社製）〕の凍結したチューブを取り出
し、３７℃恒温槽中で速やかに解凍した。チューブをア
ルコール綿でよく消毒したのち、チューブ内の細胞浮遊
液を基本培地３０ｍＬに移した。８００回転／分で５分
間、室温で遠心分離し、上清を除去した。タッピング
後、１０ＦＣＳ培地(基本培地に１０％のＦＣＳを添加)
を１０ｍＬ加え、細胞を浮遊させ、５０ｍＬ培養フラス
コに移した。フラスコの栓をゆるめ、炭酸ガス培養装置
にいれた。１?２日毎に継代し、２５０ｍＬフラスコ２
本分（９０-１００ｍＬ）にした。

【００２７】マウスから取り出した脾細胞（２ｘ１０⁸
個）とミエローマ細胞（5ｘ１０⁷個）を混合し、遠心
（８００回転／分、５分間、室温）し、上清を除去、タ
ッピングした。この後、ＥＣＦバッファー〔マンニトー
ル 45.5 g, 10 mＭ 塩化カルシウム（10 mＬ）, 10 mＭ
塩化マグネシウム（10 mL）, 20 mＭ トリスバッファ
ー〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〕 ｐＨ
７．２を蒸留水で溶かして、1000 mlにしたもの〕 を３
０ｍＬを加え、遠心（８００回転／分、５分間、室
温）、上清除去、タッピングする操作を２回繰り返した
後、ＥＣＦバッファー(4.8 mＬ) を加えた。これを６ウ
エルプレート（ＳＵＭＩＲＯＮ製）に、１．２ｍＬずつ
分注し、島津社製 ＳＳＨ−１０細胞融合装置を用い、
以下の条件で細胞融合した〔電極間距離:1.0 mm; 交流
周波数: 1 MHz; 交流初期印加電圧: 80 V; 交流初期印
加時間: 10 s; パルス幅: 40 μｓ; パルス電圧: 920
V; パルス電界強度: 2.30 kV/cm; 交流２次印加電圧: 8
0 V; パルス印加間隔: 1.0 s; 印加パルス数: 1; パル
ス電圧変化: +0 V; 交流最終印加時間: 10 s; 交流電圧
減衰率: 0%; 接触強化: off〕。

【００２８】前記調製したハイブリドーマ細胞を、各ウ
エルにＨＡＴ培地（選択培地）〔基本培地110 ml, FCS
30 ml, BC 7.5 ml, HAT（コスモバイオ社製 HAT液（50
倍濃縮）を混合したもの）100μＬを加えた９６ウエル
プレート１０枚に移した。２週間後、ハプテンとしたＩ
ＪＫＬＭ環部に結合する抗体を産生するハイブリドーマ
をＩＪＫＬＭ−ＢＳＡを用い、ＥＬＩＳＡ法でスクリー
ニングした。陽性のウエルを選択し、２回クローニング
後に、再度ＥＬＩＳＡ陽性となった抗体を産生するクロ
ーンを順次培養し、それぞれ約２００ mＬまで増殖させ
た。この結果、ＩＪＫＬＭ−ＫＬＭを免疫原として、３
種のモノクローナル抗体、すなわち、IＭ（ＩからＭの
環を持つことを意味する）−３Ｄ１１（受託番号ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１８７５０として独立行政法人産業技術総合研
究所 特許生物寄託センターに受託されたハイブリドー
マにより産生された抗体。抗体名を前記受託ハイブリド
ーマを識別する表示と同一にした。）、ＩＭ−２Ｃ７お
よびＩＭ−８Ｂ１２を調製することができた。得られた
モノクローナル抗体の結合試験をＥＬＩＳＡ法で検討し
た。抗原として、シガトキシン類の部分構造、すなわち
ＡＢＣ、ＡＢＣＤ、Ａ＊ＢＣ(Ａ環部がシガトキシン型
のものを意味する)、およびＩＪＫＬＭ環構造を連結し
たＢＳＡコンジュゲートを用いた。その結果、ＩＪＫＬ
Ｍ 環部親和性の高い抗体として、ＩｇＧ抗体ＩＭ−３
Ｄ１１を選別した。ＩＪＫＬＭに対する解離定数Ｋｄは
８．６ｎＭであった（測定法については後述する。）。

【００２９】抗体の精製及びサブクラスの決定 上清を抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭアフィニティーカラム
（ＮＧＦ Industries, Ltd.社製）で精製した（結合用
リン酸バッファー（pH 7.0）、溶出用バッファー（0.2
M Glycine-HCl, pH 2.5）。精製した抗体をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミド
ゲル電気泳動）で分析し、＞９５％の純度であることを
確認した。ＰＩＥＲＣＥ社製タイピングキット（3750
1）を用いて、それそれの抗体のサブクラスを決定し
た。

【００３０】抗体の親和性解析（競争阻害実験） 次に、前記選別した３種のモノクローナル抗体を精製
し、ハプテンとの解離定数(Ｋｄ)を求めた。ＥＬＩＳＡ
用プレート（Ａ１からＡ１２ウエル）に順次２倍希釈し
た競合阻害剤（ＰＢＳ溶液 各30 μＬ）の溶液を調製し
た。これに抗体溶液(30 μＬ)を加え、室温で２時間放
置した。抗体と阻害剤の混合溶液５０μＬを、ハプテン
−ＢＳＡ溶液を吸着した９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレー
ト（抗体の親和性解析参照）に加え、室温で２０分間放
置した。プレートを洗浄後、吸光度を測定し、滴定曲線
を得た。Ｆｒｉｇｕｅｔらの方法［Journal of Immunol
ogicalMethod, 第77巻（1985年）, 第305 頁］を参考
に、Ｋｌｏｔｚプロットして得られた直線の傾きから阻
害剤のＫｄ値を求めた。この結果、IＭ−３Ｄ１１はＩ
ＪＫＬＭ 環部（ＩＭ）（式５）にかなり高い親和性
（Ｋｄ＝ 8.6 nM）を示すことが分かった。

【００３１】

【化７】

【００３２】この結果をふまえ、上述の競争阻害の実験
系を利用して毒本体ＣＴＸ３Ｃとの結合試験を検討し
た。ＩＭ−３Ｄ１１はＣＴＸ３Ｃに強く結合した（Ｋｄ
＝１２２ｎＭ）。さらに、ＩＭ−３Ｄ１１については、
構造の類似した海産ポリエーテル毒素との結合試験を検
討したところ、オカダ酸や、マイトトキシンとはほとん
ど結合しなかった。赤潮毒ブレベトキシン類とは交差活
性を検出したが、ＣＴＸ３Ｃとの親和性と比べると、３
５０分の１程度（ＢＴＸＡ:Ｋｄ＝４３μＭ）の非常に
弱いものであることが分かった。

【００３３】３Ｄ１１抗体の酵素標識法〔3D11-ＨＲＰ
（西洋わさびペルオキシダーゼ）；の合成〕（サンドイ
ッチ法用） ３Ｄ１１抗体のＨＲＰ標識はPierce社のEZ-Link（商標
名）Plus Activated Peroxidase and Kitを用い、Pierc
e社説明書に従って行った。３Ｄ１１抗体(1mg) のcarbo
nate-bicarbonate buffer溶液 (1 mL)に1mgのEZ-Link P
lus Activated Peroxidaseの水溶液(100 μL)を加え、
室温で1時間反応させた。10 μLのReductantsolution
（ＮａＢＨ₃ＣＮが主成分）を反応混合液へ加え、１５
分間室温で反応させた。２０ mLのクエンチバッファー
（Quench Buffer）を加え、得られた溶液を室温で１５
分間静置した。反応液は１ＬＰＢＳで３回透析後、１ｍ
Ｌのグリセロールを加え、−２０℃で保存した。標識体
としては、周知のものを使用できる。

【００３４】シガトキシンのＡ〜Ｅ（ＡＥと略称する場
合もある）の環構造をもつ前記標識モノクローナル抗体
と組み合わせるモノクローナル抗体の調製（この技術
は、本出願と同日付けにて特許出願した）の説明； １．合成ハプテンとなる前記式２（請求項３）のジアス
テレオマー混合物の合成。 下記の工程１により得られる。

【００３５】

【化８】

【００３６】化合物７のＯＨをベンジル基（Ｂｎ）保護
基で保護した化合物の合成方法は、M.Maruyama et al,H
eterocycles,2001,54,93-99,に記載されている。化合物
１は前記文献２に記載の化合物のＢｎをＤＤＱ（2,3-ジ
クロロ-5,6-ジシアノ-1,4-ベンゾキノン）を用いて脱保
護することにより得られる。化合物１のアルコール(4.0
mg,6.0 μmol)をＴＨＦ（テトラヒドロフラン）(2 ｍ
Ｌ)に溶かし、室温でテトラブチルアンモニウムフルオ
リド (ＴＢＡＦ,１Ｍ ＴＨＦ溶液：１８μL,１８μmol)
を加えた。３０分後、反応溶液を濃縮して、シリカゲル
クロマトグラフィーで精製し、化合物８(2.5 mg, 5.9
μmol,９８％)を得た。

【００３７】２０ｍＬナス型フラスコに化合物８(2.8 m
g, 6.6 μmol),ＣＨ₂Ｃｌ₂(300 μL), （ＭｅＯ）₂ＣＨ
ＣＨ₂ＣＯＯＭｅ(１０μl,７０ μmol), ＴｓＯＨ・Ｈ₂
Ｏ(0.5 mg, 3 μmol) を加えた。室温で１．５時間攪拌
した後、トルエン(1 ｍＬ)を加えて、ロータリーエバポ
レーターで減圧（120 mbar/hPa）し、１時間後に大気圧
に戻した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製
して、アセタール位に関してのジアステレオマー混合物
(式２の上の化合物：下の化合物＝２：１)を(1.9 mg,
3.8 μmol, 57%) 得た。式２の化合物の物性を表２に示
す。

【００３８】

【表２】

【００３９】式１及び式２のＲをＨにした化合物９は、
式２の化合物をＬｉＯＨで処理して得られる。工程にお
いてＬがスクシンイミドの化合物４は工程２で得られ
る。

【００４０】

【化９】

【００４１】２０mLナシ型フラスコに式１及び式２の化
合物(2.5 mg, 4.9 μmol)、ｔ−ＢｕＯＨ(0.5 mL)、水
(125 μL)、ＬｉＯＨ・Ｈ₂Ｏ(2.8 mg, 68 μmol) を加
えて、室温で１時間撹拌した。ＫＨＳＯ₄(18.6 mg, 136
μmol) を加え、溶液のｐＨ（3-４程度）を確認した
後、酢酸エチル (40 mL) で希釈した。無水硫酸マグネ
シウムで乾燥、ろ過、濃縮し、粗化合物８を得た。これ
にＤＭＦ(ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、２
００μL)、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド (5.6mg, 49
μmol)、ＥＤＣ−ＨＣｌ (ＥＤＣ＝1-(3-ジメチルアミ
ノプロピル)-3-エチルカルボジイミド、4.8 mg, 25 μm
ol) を加えて、室温で１２時間攪拌した。反応溶液を酢
酸エチル(40 mL)で希釈し、有機層を水で３回洗浄し、
無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮し、活性化エステルで
ある化合物９を得た。これにＤＭＦ(100 μL) を加えた
溶液を作製し、コンジュゲートの調製に使用した。

【００４２】２．タンパクコンジュケートの製造。 ＫＬＨコンジュゲートの調製；ＫＬＨ(5.0 mg)のＰＢ
Ｓバッファー溶液 (1.0 mL)に活性化エステルである化
合物９(約2.4 μmol) の ＤＭＦ溶液(50 μL) を加えて
１０分間撹拌した。一日静置した後、４℃で透析した。
この後、５．９時間後にＰＢＳバッファー(700 mL)を交
換し、１２時間後に透析膜からエッペンドルフチューブ
に移し換えて、−７８℃で保存した。

【００４３】ＢＳＡコンジュゲートの調製；ＢＳＡ(7.0
ｍｇ) のＰＢＳバッファー溶液 (2.0 ｍＬ) に活性化
エステルである化合物９(約2.4 μmol) のＤＭＦ溶液
(50 μL) を加えて１０分間撹拌した。一日静置した
後、４℃で透析した。この後、５．９時間後にＰＢＳバ
ッファー (700 ｍＬ) を交換し、１２時間後に透析膜か
らエッペンドルフチューブに移し換えて、−７８℃で保
存した。

【００４４】３．ハプテン価の解析 透析して得た ＢＳＡコンジュゲートを、ＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦ−ＭＳで質量分析した。ＢＳＡコンジュゲートの
平均分子量は約７０２００であった（ＢＳＡの分子量約
66400）。ハプテン部分の分子量が（４７６）であるの
で、ＢＳＡコンジュゲートには平均８個のハプテンが連
結されていることが分かった。

【００４５】４．モノクローナル抗体（非標識抗体とし
て用いる）の作製；前項で得たＡＢＣＤＥ−ＫＬＨ(100
μg）にＲＩＢＩアジュバンド（RIBI Immunol. Res. In
st.社製）を加え、良く攪拌してエマルジョンとしたの
ち、これをＢａｌｂ／ｃマウス（５匹）に二週間毎に３
回、腹腔内投与した。初回免疫から３９日目にマウスの
血清を採取し、ＡＢＣＤＥ−ＢＳＡを用い、ＥＬＩＳＡ
法で血清の抗体価を滴定した。

【００４６】ＥＬＩＳＡ法；９６ウエルＥＬＩＳＡ用プ
レート（ファルコン社製、3910）の各ウエルに５０μＬ
の ABCDE−ＢＳＡ溶液を入れ、室温で２時間放置後、４
℃で一晩放置して、プレートにコンジュゲートを吸着さ
せた。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ〔ＰＢＳバッファ
ーに５％Ｔｗｅｅｎ ２０〔和光純薬製 ポリオキシエチ
レン（polyoxyethylene） (２０) ソルビタン モノラウ
レート（Sorbitan Monolaurate）ＩＣＩ社 商標Ｔｗｅ
ｅｎ−２０ 相当品 No. 167-11515〕〕を含むもの〕で
３回洗浄後、ＭＩＬＬＩ-Ｑ水（Millipore 社製の複数
段階の樹脂やフィルターを用いて、精製水を脱イオン化
もの）で一度洗浄し、吸着しなかったコンジュゲートを
除去した。ハイブリドーマ培養上清（もしくは抗血清、
精製抗体溶液）を加え、室温で１時間放置後、ＰＢＳ−
Ｔｗｅｅｎと、ＭＩＬＬＩ-Ｑ水で順次洗浄した。５０
μＬの 酵素標識二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ−西洋
わさびペルオキシダーゼ）（ＺＹＭＥＤ社製、62-6520
1000倍希釈）を各ウエルに入れ、室温で１時間放置
後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎと、ＭＩＬＬＩ-Ｑ水で順次洗
浄した。１００μＬの基質溶液 〔基質溶液の組成: 1,2
-phenylenediamine 4.0 mg、過酸化水素水 10 μＬ、
０．１Ｍ クエン酸 バッファー(pH 5.0) 10 ml〕を加
え、５分間呈色反応を進行させた後、２規定 硫酸（50
μl）で反応を停止した。マイクロプレート吸光度測定
装置（ＢＩＯ−ＲＡＤ,Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ 170-6850）
を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定し、陽性のクロー
ンを判別した。

【００４７】血清中の抗体価の測定 ハプテン（ＡＢＣＤＥあるいはＩＪＫＬＭ）−ＢＳＡ溶
液を吸着した９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレートの最上段
に、５０μＬのＰＢＳバッファーを入れた。２００倍に
希釈したマウスの抗血清(５０μl) を最上段のウエル
(Ａ１)に加え、この溶液を順次２倍希釈した（縦列Ａ１
−Ａ８に４００倍から５１，０００倍の希釈系列を作
製）。プレートを室温で１時間放置後、上述の方法で４
５０ｎｍの吸光度を測定した（図２参照）。血清希釈率
の対数と吸光度をプロットすると、血清濃度依存的に、
血清中の抗体が ＡＢＣＤＥ−ＢＳＡコンジュゲートと
結合することが分かった。

【００４８】５．抗体価の高いマウスからの脾臓の摘
出、培養 ５匹の中で、最も高い抗体価を示したマウスに、腹腔内
にＡＢＣＤＥ−ＫＬＨ（100 μg）を追加免疫し、３日
後に脾臓を摘出した。脾臓に付着している組織や臓器の
断片をピンセットで取り除いた後、基本培地〔ＲＰＭＩ
Ｍｅｄｉｕｍ 1640 (GIBCO 社製、一袋、炭酸水素ナト
リウム２g, ペニシリン-ストレプトマイシン（GIBCO 社
製）20 mg, 200 mM-グルタミン２０ｍＬを蒸留水に溶か
して1000ｍＬとしてｐＨを7.2に調製したもの〕入りの
シャーレに移し、ピンセットで脾臓内の細胞を浮遊させ
た。脾細胞浮遊液を濾過後、５０ｍＬ遠心管に移した。
さらに、基本培地１５ｍＬを加え、良くピペッティング
して濾過し、全量を３０ｍＬとした。８００回転／分で
５分間、室温で遠心分離し、上清を除去、タッピングし
た。ＨＴ・ＢＣ培地〔牛胎児血清（FCS）200 ml,ＨＴコ
スモバイオ社製ＨＴ液（５０倍濃縮）２０ｍＬ、ＢＣ
（Bioresearch island社製 BriClone）５０ｍＬ,基本培
地 ７３０ｍＬを混合したもの〕を３０mＬ加え、細胞を
浮遊させた。

【００４９】冷凍庫から（−１３０℃）からミエローマ
細胞Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（大日本製薬社製）を
凍結したチューブを取り出し、３７℃恒温槽中で速やか
に解凍した。チューブをアルコール綿でよく消毒したの
ち、チューブ内の細胞浮遊液を基本培地３０ｍＬに移し
た。８００ｒｐｍ（回転／分）で５分間、室温で遠心分
離し、上清を除去した。タッピング後、１０％ＦＣＳ
(基本培地に１０％のFCSを添加)を１０ｍＬ加え、細胞
を浮遊させ、５０ｍＬ培養フラスコに移した。フラスコ
の栓をゆるめ、炭酸ガス培養装置にいれた。１−２日毎
に継代し、２５０ｍＬフラスコ２本分（９０−１００ｍ
Ｌ）にした。

【００５０】マウスから取り出した脾細胞（２ｘ１０⁸
個）とミエローマ細胞（5ｘ１０⁷個）を混合し、遠心
（８００回転／分、５分間、室温）し、上清を除去、タ
ッピングした。この後、ＥＣＦバッファー〔マンニトー
ル 45.5 g, 10 mM 塩化カルシウム（10 ｍＬ）、１０ｍ
Ｍ塩化マグネシウム（１０ｍＬ）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
バッファーｐＨ7.2を蒸留水で溶かして、1000ｍＬにし
たもの〕 を３０ｍＬを加え、遠心（８００回転／分、
５分間、室温）、上清除去、タッピングする操作を２回
繰り返した後、ＥＣＦバッファー(4.8ｍＬ) を加えた。
これを６ウエルプレート（ＳＵＭＩＲＯＮ製）に、１．
２ｍＬずつ分注し、島津社製ＳＳＨ−１０細胞融合装置
を用い、以下の条件で細胞融合した〔［電極間距離:
１．０ｍｍ; 交流周波数: 1 ＭＨｚ; 交流初期印加電
圧: ８０Ｖ; 交流初期印加時間:１０秒（s）; パルス
幅:４０（マイクロ秒（μｓ）; パルス電圧:９２０Ｖ;
パルス電界強度:２．３０ｋＶ／ｃｍ; 交流２次印加電
圧:８０Ｖ; パルス印加間隔:１．０秒;印加パルス数:
１; パルス電圧変化:＋０Ｖ; 交流最終印加時間:１０
秒; 交流電圧減衰率:０％; 接触強化:ｏｆｆ〕。

【００５１】調製したハイブリドーマ細胞を、各ウエル
にＨＡＴ培地 [HAT-RPMI 1640, 20%FCS, 5% Briclone
(BioResearch Ireland社製)含有] １００μＬを加えた
９６ウエルプレート１０枚に移した。２週間後、ハプテ
ンとしたＡＢＣＤＥ環部に結合する抗体を産生するハイ
ブリドーマ１０Ｃ９（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７４
９とて独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託
センターに受託された。受託日平成１４年３月５日）を
ＡＢＣＤＥ−ＢＳＡを用い、ＥＬＩＳＡ法でスクリーニ
ングした。陽性のウエルを選択し、２ 回クローニング
後に、再度ＥＬＩＳＡ陽性となった抗体を産生するモノ
クローンを順次培養し、それぞれ約２００ｍＬまで増殖
させた。この結果、６種のモノクローナル抗体を調製す
ることができた。得られたモノクローナル抗体の結合試
験をＥＬＩＳＡ法で検討した。抗原として、シガトキシ
ン類の部分構造を連結したＢＳＡコンジュゲートを用い
た。その結果（表３）、ＡＢＣＤＥ−ＫＬＨ環部を免疫
して得られたＩｇＧ抗体は、ＡＢＣＤＥ−ＢＳＡ（化学
式ＡＥ−ＢＳＡ）へ強く結合し、IＪＫＬＭ−ＢＳＡ
（化合物１０）とは結合しないことがわかった。

【００５２】

【化１０】

【００５３】

【表３】

【００５４】

【化１１】

【００５５】サンドイッチ検定法 Ｃｏａｓｔｅｒ社ＥＬＩＳＡ Ｐｌａｔｅ（83590）に１
０Ｃ９のＰＢＳ溶液 (4.3 μg/mL)を５０μＬ/ウエル入
れ、４℃で一晩静置した。溶液を捨て、１％スキム ミ
ルク入りＰＢＳを加えて(400 μL/ウエル)室温で１時間
静置した。溶液を廃棄後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗
浄した後(200 μL/ウエル) 、ＣＴＸ３Ｃの希釈溶液を
入れ(50 μL/ウエル)１時間静置した。溶液を廃棄後、
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した(200 μL/ウエル)。
３Ｄ１１−ＨＲＰのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液( 1 μg/m
L, 50 μL/ウエル)を加え、室温で１時間静置した。溶
液を廃棄して、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した(200
μL/ウエル)後、ＯＰＤ溶液(100 μL/ウエル、Sigma社
FAST（商標名）ｏ−PHENYLENE DIAMINE DIHYDROCHLORID
E TABLET SETSを使用)を加えて、室温にて５−１０分発
色させた。２規定硫酸水溶液(50μL/ウエル)を加えて反
応を停止させ、吸光度(450ｎｍ)をBio-Rad社製Micropla
te Reader Benchmarkにて測定した。測定結果を図１に
示す。

【００５６】

【発明の効果】以上述べたように、本発明において設計
した合成ハプテン(ＩＪＫＬＭ環部)、および合成ハプテ
ン(ＡＢＣＤＥ環部)を用いて得られたモノクローナル抗
体の組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いるこ
とにより、シガトキシンを高感度で検定できることを見
出した。従来の、１種の抗体のサンプルへの結合を指標
とするシガテラ毒検定キットにおいては、しばしば、陽
性となっても夾雑物に結合し陽性となった擬陽性のケー
スを避けることができなかった。従来技術ではそのこと
の判別も不可能であったので、本発明の測定キットの提
供は、社会生活の向上に資すること顕著である。被検出
非タンパク化合物に対する２つの抗体を組み合わせたサ
ンドイッチ式検定法は、本発明により初めて確立したも
のであり、特に、シガトキシンＣＴＸ３Ｃの特異性の高
い検出方法を確立した点において優れた効果をもたらし
たものである。

【００５７】本明細書で使用の一部の略号表 BSA: bovine serum albumin CTX: ciguatoxin ELISA: enzyme linked immunosorbent assay HRP: Horseradish Peroxidase (西洋わさびペルオキシ
ダーゼ) O.D.: Optical Density OPD: o-Phenylene Diamine PBS: Phosphate Buffered Saline Bn: benzyl DDQ: 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone EDC；1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide
hydrochloride FCS: fetal calf serum Ig: Immunoglobulin KLH: keyhole limpet hemocyanine TBAF: tetra-n-butylammonium fluoride Ts: p-tolenesulfonyl THF: tetrahydrofuran OVA: ovalbumin

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のサンドイッチ法によるＣＴＸ３Ｃの
検出特性

【図２】 １−５はシガトキシンのＡ〜Ｅ環部を含むＢ
ＳＡとのコンジュゲートＡＥ−ＢＳＡに対する抗体価、
（１）−（５）はシガトキシンのＩ〜Ｍ環部を含むＢＳ
ＡとのコンジュゲートＩＭ−ＢＳＡに対する抗体価

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１５年２月１７日（２００３．２．１
７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項３

【補正方法】変更

【補正内容】

【化１】

【化２】 ＲはＨまたメチル基である。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１０

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００３

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００３】本発明者らは、初期にはシガトキシンの左
側ＡＢＣ環部を化学合成し、これを合成ハプテンとした
タンパクコンジュゲートを用いて、三種のモノクローナ
ル抗体を調製しているが、これらはいずれもシガトキシ
ンに非常に弱いアフィニティーしか示さなかった（Synt
hesis (1999年)、第1431頁） 。また、他のグループ
も、合成ハプテン（ＪＫＬＭ環部）のコンジュゲートの
免疫を試みているが、モノクローナル抗体の調製には至
っていないようである〔Toxicon第38巻(2000年)第６６
９頁〕。このような状況の中で、本発明者らは、更に、
シガトキシン類の右末端の部分構造であるＩＪＫＬＭ環
部を含む合成ハプテンを設計、合成し、この合成ハプテ
ンのタンパクコンジュゲートでマウスを免疫する工程を
含む方法により前記受託番号ＦＥＲＭ ＰＢ−８２９３
のハイブリドーマを作りだし、当該ハイブリドーマを用
いてシガトキシン類に特異性の高いモノクローナル抗体
を調製することに成功した。そして、該モノクローナル
抗体を３Ｄ１１（独立行政法人産業技術総合研究所 特
許生物寄託センターの受託日、平成１４年３月５日、受
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７５０。平成１５年２月１３
日に前記原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託への移
管申請により受託番号ＦＥＲＭ ＰＢ−８２９３として
受託された。）と命名した。該モノクローナル抗体のシ
ガトキシンＣＴＸ３Ｃに対しての結合解離定数(Ｋｄ)
は、１２２ｎＭであった。また、シガトキシンに構造の
類似した海産ポリエーテル系毒素と前記抗体の交差活性
を測定したところ、赤潮毒ブレベトキシン類と交差活性
が確認されたが、この交差活性は、シガトキシン類との
結合と比べると３５０分の１以下の非常に弱いものであ
ることを見出した。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００５

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００５】本発明者らは、前記検討に対し更にシガト
キシン類に対しての親和性を更に向上させたモノクロー
ナル抗体を得ることができる合成ハプテンを設計してシ
ガトキシンＣＴＸ３Ｃの左末端の部分構造であるＡＢＣ
ＤＥ環部を含む化合物をハプテンとして設計、合成し、
この合成ハプテンのタンパクコンジュゲートでマウスを
免疫する工程を含む方法により前記受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−８２９２のハイブリドーマ１０Ｃ９（独立行政法
人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターの受託
日、平成１４年３月５日、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８
７４９。平成１５年２月１３日に前記原寄託よりブタペ
スト条約に基づく寄託への移管申請により受託番号ＦＥ
ＲＭ ＰＢ−８２９２として受託された。）を作りだ
し、当該ハイブリドーマを用いてシガトキシン類に特異
性の高いモノクローナル抗体を調製することに成功し
た。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００７

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の第１は、被検出
非タンパク化合物を構成する分子内の部分構造から誘導
される複数の合成ハプテンを利用して得られる前記被検
出非タンパク化合物に特異的に結合する複数のモノクロ
ーナル抗体を組み合わせた前記被検出非タンパク化合物
検出サンドイッチ測定キットである。本発明の第２は、
被検出非タンパク化合物がシガトキシン類であり、前記
分子内の部分構造から誘導される合成ハプテンがシガト
キシン類を構成する分子両端の２種部分構造であること
を特徴とするシガトキシン類検出サンドイッチ測定キッ
トである。好ましくは、前記式１の合成ハプテンを用い
て得られた受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９３のハイブ
リドーマ３Ｄ１１により産生されるモノクローナル抗体
と式２の合成ハプテンを用いて得られた受託番号ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−８２９２のハイブリドーマ１０Ｃ９により産
生されるモノクローナル抗体とを組み合わせたものから
なることを特徴とする前記シガトキシン類検出サンドイ
ッチ測定キットであり、より好ましくは、前記組み合わ
せるモノクローナル抗体の一方のモノクローナル抗体が
標識化したものであることを特徴とするシガトキシン類
検出サンドイッチ測定キットであり、更に好ましくは、
標識化合物が酵素標識体であることを特徴とする前記サ
ンドイッチ測定キットである。また、非標識モノクロー
ナル抗体がプレートに吸着されていることを特徴とする
前記サンドイッチ測定キットである。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１０】本発明の第７は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ
−８２９３として受託されたシガトキシン類と特異的に
反応する前記各モノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマである。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２８】前記調製したハイブリドーマ細胞を、各ウ
エルにＨＡＴ培地（選択培地）〔基本培地110 ml, FCS
30 ml, BC 7.5 ml, HAT（コスモバイオ社製 HAT液（50
倍濃縮）を混合したもの）100μＬを加えた９６ウエル
プレート１０枚に移した。２週間後、ハプテンとしたＩ
ＪＫＬＭ環部に結合する抗体を産生するハイブリドーマ
をＩＪＫＬＭ−ＢＳＡを用い、ＥＬＩＳＡ法でスクリー
ニングした。陽性のウエルを選択し、２回クローニング
後に、再度ＥＬＩＳＡ陽性となった抗体を産生するクロ
ーンを順次培養し、それぞれ約２００ mＬまで増殖させ
た。この結果、ＩＪＫＬＭ−ＫＬＭを免疫原として、３
種のモノクローナル抗体、すなわち、IＭ（ＩからＭの
環を持つことを意味する）−３Ｄ１１（受託番号ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１８７５０として独立行政法人産業技術総合研
究所 特許生物寄託センターに受託され、平成１５年２
月１３日に前記原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託
への移管申請により受託番号ＦＥＲＭ ＰＢ−８２９３
として受託されたハイブリドーマにより産生された抗
体。抗体名を前記受託ハイブリドーマを識別する表示と
同一にした。）、ＩＭ−２Ｃ７およびＩＭ−８Ｂ１２を
調製することができた。得られたモノクローナル抗体の
結合試験をＥＬＩＳＡ法で検討した。抗原として、シガ
トキシン類の部分構造、すなわちＡＢＣ、ＡＢＣＤ、Ａ
＊ＢＣ(Ａ環部がシガトキシン型のものを意味する)、お
よびＩＪＫＬＭ環構造を連結したＢＳＡコンジュゲート
を用いた。その結果、ＩＪＫＬＭ 環部親和性の高い抗
体として、ＩｇＧ抗体ＩＭ−３Ｄ１１を選別した。ＩＪ
ＫＬＭに対する解離定数Ｋｄは８．６ｎＭであった（測
定法については後述する。）。

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５１】調製したハイブリドーマ細胞を、各ウエル
にＨＡＴ培地 [HAT-RPMI 1640, 20%FCS, 5% Briclone
(BioResearch Ireland社製)含有] １００μＬを加えた
９６ウエルプレート１０枚に移した。２週間後、ハプテ
ンとしたＡＢＣＤＥ環部に結合する抗体を産生するハイ
ブリドーマ１０Ｃ９（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７４
９とて独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託
センターに受託された。受託日平成１４年３月５日。平
成１５年２月１３日に前記原寄託よりブタペスト条約に
基づく寄託への移管申請により受託番号ＦＥＲＭ ＰＢ
−８２９２として受託された。）をＡＢＣＤＥ−ＢＳＡ
を用い、ＥＬＩＳＡ法でスクリーニングした。陽性のウ
エルを選択し、２ 回クローニング後に、再度ＥＬＩＳ
Ａ陽性となった抗体を産生するモノクローンを順次培養
し、それぞれ約２００ｍＬまで増殖させた。この結果、
６種のモノクローナル抗体を調製することができた。得
られたモノクローナル抗体の結合試験をＥＬＩＳＡ法で
検討した。抗原として、シガトキシン類の部分構造を連
結したＢＳＡコンジュゲートを用いた。その結果（表
３）、ＡＢＣＤＥ−ＫＬＨ環部を免疫して得られたＩｇ
Ｇ抗体は、ＡＢＣＤＥ−ＢＳＡ（化学式ＡＥ−ＢＳＡ）
へ強く結合し、IＪＫＬＭ−ＢＳＡ（化合物１０）とは

【書類名】 受託番号変更届

【提出日】 平成１５年２月１７日

【旧寄託機関の名称】 独立行政法人産業技術総合研
究所 特許性物寄託セン ター

【旧受託番号】 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８
７４９

【旧受託番号】 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８
７５０

【新寄託機関の名称】 独立行政法人産業技術総合研
究所 特許性物寄託セン ター

【新受託番号】 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８２
９２

【新受託番号】 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８２
９３

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/543 ５５５ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ (72)発明者 藤井 郁雄 大阪府吹田市五月が丘東10−８−201 (72)発明者 円谷 健 大阪府千里山西６−14−３−Ｄ203 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA53 GA03 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4B065 AA92X AB05 AC14 BA08 CA25 CA46 4C071 AA04 BB03 CC15 EE05 FF16 GG03 HH05 LL01 4H045 AA11 BA42 BA72 CA40 DA76 EA50 FA72

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被検出非タンパク化合物を構成する分子
   内の部分構造から誘導される複数の合成ハプテンを利用
   して得られる前記被検出非タンパク化合物に特異的に結
   合する複数のモノクローナル抗体を組み合わせた前記被
   検出非タンパク化合物検出サンドイッチ測定キット。
2. 【請求項２】 被検出非タンパク化合物がシガトキシン
   類であり、前記分子内の部分構造から誘導される合成ハ
   プテンがシガトキシン類分子両端の部分構造を含むもの
   であることを特徴とするシガトキシン類検出サンドイッ
   チ測定キット。
3. 【請求項３】 式１の合成ハプテンを用いて得られた受
   託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７５０のハイブリドーマ３Ｄ
   １１により産生されるモノクローナル抗体と式２の合成
   ハプテンを用いて得られた受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８
   ７４９のハイブリドーマ１０Ｃ９により産生されるモノ
   クローナル抗体とを組み合わせたものからなることを特
   徴とする請求項２に記載のシガトキシン類検出サンドイ
   ッチ測定キット。 【化１】 【化２】 ＲはＨまたメチル基である。
4. 【請求項４】 組み合わせるモノクローナル抗体の一方
   のモノクローナル抗体が標識化したものであることを特
   徴とする請求項３に記載のシガトキシン類検出サンドイ
   ッチ測定キット。
5. 【請求項５】 標識化合物が酵素標識体であることを特
   徴とする請求項４に記載のサンドイッチ測定キット。
6. 【請求項６】 前記式１で表される新規化合物。
7. 【請求項７】 前記式１で表される新規化合物のシガト
   キシン類を認識するモノクローナル抗体を産生させるハ
   イブリドーマを得るための合成ハプテンとしての使用。
8. 【請求項８】 式３で表される合成ハプテンとキャリヤ
   ータンパクとの反応生成物で免疫して得られるシガトキ
   シン類と特異的に反応するモノクローナル抗体。 【化３】 式３中、ｎは１以上の整数である
9. 【請求項９】 合成ハプテンとキャリヤータンパクとの
   反応生成物におけるキャリヤータンパクが牛血清アルブ
   ミン（ＢＳＡ）、キーホールリムペットヘモシアニン
   （keyhole limpet hemocyanine,ＫＬＭ）またはオボア
   ルブミン（egg albumin、ＯＶＡ）であることを特徴と
   する請求項６のモノクローナル抗体。
10. 【請求項１０】 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７５０と
    して受託されたシガトキシン類と特異的に反応するモノ
    クローナル抗体を産生するハイブリドーマ３Ｄ１１。