JP2003265190A

JP2003265190A - 核酸の定量方法及び核酸定量キット

Info

Publication number: JP2003265190A
Application number: JP2002380549A
Authority: JP
Inventors: Makoto Kobayashi; 真小林; Toshimitsu Arai; 俊光荒井; Ayuka Matsumura; 歩佳松村
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2001-12-28
Filing date: 2002-12-27
Publication date: 2003-09-24

Abstract

(57)【要約】【課題】核酸の定量方法及び核酸定量キット【解決手段】試料中の特定の標的核酸を定量するため
に用いられる検量線を作成するために用いられる標準品
であって、化学合成によって得られる合成ポリヌクレオ
チドからなる標準品、これを用いる定量方法および定量
キット、特定疾患の診断方法などを提供する。【効果】本発明の標準品は、化学合成によって得られ
る合成ポリヌクレオチドであり、従来の生合成によって
得られるポリヌクレオチドからなる標準品と比較して、
簡便な方法で目的とする配列のものを正確に得ることが
できるという利点がある。また、本発明の標準品は、生
物学的コンタミネーションがないので、環境に対して安
全であり、また高精度の定量を阻害する要因を少なくで
きるという利点がある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【従来の技術】本発明は、試料中の特定の標的核酸を定
量するために用いられる検量線を作成するために用いら
れる標準品、それを用いた核酸の定量方法及び定量キッ
トなどに関する。また、本発明は、その核酸の定量方法
または定量キットを用いた特定疾患の診断方法、及びそ
の特定された遺伝子ＤＮＡまたはその遺伝子産物を含む
医薬品にも関する。

【０００２】ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法
は、微量の標的核酸を指数的に増幅した後に検出するこ
とができるので、遺伝子の発現解析、疾患の診断、遺伝
子組換え食品の検査、自然食品における組換え遺伝子の
混入の判定などの分野において幅広く用いられている。
ＰＣＲ法については、例えば、米国特許第４，６８３，
１９５号、同第４，６８３，２０２号及び同第４，９６
５，１８８号などに詳しく記載されている。一般的なＰ
ＣＲ法では、標的核酸を含み得る試料と、標的核酸に対
応する一対のオリゴヌクレオチドプライマー、反応基質
（デオキシヌクレオチド三リン酸）、ＤＮＡポリメラー
ゼなどを含む増幅試薬とを反応させ、標的核酸を指数的
に増幅させることにより、微量に含まれる標的核酸の検
出を容易にする。また、ＰＣＲ法において特定のｍＲＮ
Ａを精度よく定量する方法として、蛍光プローブを用い
るＴａｑＭａｎ法等が知られている。例えば、特許公開
第２００１−２０４４８３号公報には、ｈＴＥＲＴｍ
ＲＮＡを定量するＴａｑＭａｎ法が開示されている。

【０００３】一方、微量に含まれる標的核酸の定量の精
度をあげるために、内部標準を用いた技術が開発されて
おり、例えば、特開平１１−１２３０９５号公報に開示
されている。この公報には、内部標準となるＤＮＡ配列
を含有するプラスミドを、増幅試薬中に存在させ、この
プラスミドが産生するｃＲＮＡを内部標準として用いる
標的核酸の定量方法が記載されている。

【特許文献１】米国特許第４，６８３，１９５号

【特許文献２】米国特許第４，６８３，２０２号

【特許文献３】米国特許第４，９６５，１８８号

【特許文献４】特許公開第２００１−２０４４８３号公
報

【特許文献５】特開平１１−１２３０９５号公報

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記方法によれば、内
部標準を用いない方法と比較してより正確に標的核酸を
定量することができる。しかしながら、この方法では、
内部標準となるＲＮＡがプラスミドから反応容器内で得
られるので、試薬の保存状態、反応条件、その他の要因
によっては、必ずしも一定量のＲＮＡが産生されるとは
限らない。また従来の酵素あるいは生物により合成され
た標準品はその調製が煩雑でありしばしば困難である場
合が存在する。従来の方法で標準品を調製するには、配
列情報を基にして目的とする生物種の細胞、臓器、ウイ
ルスなどからゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡもしくはｍＲ
ＮＡを抽出しそこから目的とする遺伝子の断片もしくは
その情報を有するＤＮＡもしくはＲＮＡを酵素的もしく
は生物的に合成する必要がある。また、材料となる生物
種には入手困難なものや強い病原性を持つものなども含
まれる。さらに、標準品の調製が生物から抽出された酵
素類もしくは生物そのものを用いるため標準品に高精度
の定量を阻害する生物学的コンタミネーションがおこる
ことも考えられる。したがって、上記のような不都合が
なく、簡便な方法で得られ、生物学的コンタミネーショ
ンのない標準品、及びそれを用いて標的核酸を高精度に
定量できる方法があれば、疾患遺伝子の特定、特定疾患
の診断、その疾患の治療等の分野で有用である。

【０００５】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、以下
に示す、標準品、核酸の定量方法、核酸の定量キット、
特定疾患の診断方法などを提供する。（１）化学合成によって得られる合成ポリヌクレオチド
を含む、試料中の特定の標的核酸を定量または検出する
際に用いられる標準品、（２）前記合成ポリヌクレオチ
ドがＲＮＡ、ＤＮＡ又はそれらの修飾物である前記
（１）記載の標準品、（３）前記合成ポリヌクレオチド
がＲＮＡまたはＤＮＡである前記（１）記載の標準品、
（４）前記合成ポリヌクレオチドがＲＮＡのときにセン
ス鎖、あるいはＤＮＡのときにアンチセンス鎖である前
記（３）記載の標準品、（５）前記合成ポリヌクレオチ
ドが標的核酸の一部を合成したものであって、ヌクレオ
チドの数が６０〜２００個である上記（１）記載の標準
品、（６）前記（１）〜（５）のいずれかに記載の標準
品を含む核酸定量キット、（７）前記（１）〜（５）の
いずれかに記載の標準品と少なくとも１対のプライマー
対を含む核酸定量キット、（８）さらに蛍光プローブま
たはリン酸化プローブを含んでなる前記（７）記載のキ
ット、（９）さらにＤＮＡポリメラーゼを含んでなる前
記（８）記載のキット、（１０）さらに逆転写酵素を含
む前記（９）記載のキット、（１１）複数の標的核酸を
定量するための核酸定量キットであって、複数の反応場
所を有する反応器具の各反応場所に、標的核酸に対応す
るプライマー対を含む増幅試薬を充填し、その標的核酸
に対応するプライマー対を充填していない反応場所に前
記（１）〜（５）のいずれかに記載の標準品とその標準
品に対応するプライマー対を含む増幅試薬を充填してな
る核酸定量キット、（１２）前記複数の標的核酸が特定
疾患に関与するＤＮＡまたはｍＲＮＡであり、その特定
疾患を診断するために用いられる前記（１１）記載の核
酸定量キット、（１３）前記複数の標的核酸が遺伝子組
換え食品に含有される組換えＤＮＡであり、食品中の組
換えＤＮＡを検知するために用いられる前記（１１）記
載の核酸定量キット、（１４）試料中の特定の標的核酸
を定量する方法であって、試料に標的核酸に対応する少
なくとも一対のプライマー対をそれぞれ含む増幅試薬を
加え、標準品としての化学合成ポリヌクレオチドにその
合成ポリヌクレオチドに対応するプライマー対を含む増
幅試薬を加えて、それぞれ増幅反応を行い、増幅された
標準品の量と増幅された標的核酸の量を測定し、これら
の情報に基づいて増幅前の標的核酸の量を計算する核酸
の定量方法、（１５）前記合成ポリヌクレオチドがＲＮ
Ａ、ＤＮＡ又はそれらの修飾物である前記（１４）記載
の方法、（１６）前記合成ポリヌクレオチドがＲＮＡで
ある前記（１４）記載の方法、（１７）前記合成ポリヌ
クレオチドがセンス鎖である前記（１６）記載の方法、
（１８）前記合成ポリヌクレオチドが標的核酸の一部を
合成したものであって、ヌクレオチドの数が６０〜２０
０個である前記（１４）〜（１７）記載の方法、（１
９）前記試料がヒトまたはその他の動物由来のｍＲＮＡ
試料である前記（１４）〜（１８）記載の方法、（２
０）前記増幅試薬がさらに蛍光プローブまたはリン酸化
プローブを含んでなる前記（１９）記載の方法、（２
１）前記増幅試薬がさらにＤＮＡポリメラーゼを含んで
なる前記（２０）記載の方法、（２２）前記増幅試薬が
さらに逆転写酵素を含む前記（２１）記載の方法、（２
３）（１）標的核酸に対応する少なくとも一対のプライ
マー対をそれぞれ含む増幅試薬に含まれる蛍光プローブ
またはリン酸化プローブのプローブ部分が、標的核酸の
うち該プライマー対に挟まれる領域の核酸からなるプロ
ーブであり、（２）合成ポリヌクレオチドに対応するプ
ライマー対を含む増幅試薬に含まれる蛍光プローブまた
はリン酸化プローブのプローブ部分が、合成ポリヌクレ
オチドのうち該プライマー対に挟まれる領域の核酸から
なるプローブである前記（２０）〜（２２）記載の方
法、（２４）ＤＮＡポリメラーゼによって蛍光プローブ
またはリン酸化プローブから遊離される蛍光物質の蛍光
強度またはリン酸基の量を指標として、増幅された標準
品の量と増幅された標的核酸の量を測定する前記（２
３）記載の方法、（２５）前記（１１）記載のキット又
は前記（１４）の方法を用いてＳＮＰの解析を行う方
法、（２６）前記（１２）記載のキット又は前記（１
４）の方法を用いて特定疾患を診断する方法、（２７）
前記（１３）記載のキット又は前記（１４）の方法を用
いて食品中に遺伝子組換えＤＮＡが含まれているか否か
を判定する方法、および（２８）前記（１２）記載のキ
ット又は前記（２６）記載の方法によって特定される、
ある細胞や組織において特徴的に発現が亢進または減少
している遺伝子ＤＮＡもしくはその遺伝子産物、又はそ
の遺伝子産物に対するアゴニスト、アンタゴニストもし
くは抗体を含んでなる医薬。

【０００６】以下、本発明について詳細に説明する。

【発明の実施の形態】（標準品）まず、本発明の標準品
は、試料中の特定の標的核酸を定量又は検出する際に用
いられる標準品であって、化学合成によって得られる合
成ポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。ここで、
「標準品」とは、標的核酸を増幅し、得られた増幅生成
物の量から、増幅前の標的核酸の量を計算する際に用い
られる検量線を作成するため、あるいはＳＮＰなどの特
定の核酸配列を検出する際に用いられる標準品のことを
いう。検量線の作成、増幅前の標的核酸の計算方法など
については後述する。

【０００７】本発明で用いる標準品は、合成ポリヌクレ
オチドであり、好ましくは、化学合成によって得られた
１本鎖もしくは２本鎖ＲＮＡ、１本鎖もしくは２本鎖Ｄ
ＮＡ又はそれらの修飾物である。ここで、「修飾物」と
は、一部が化学修飾されたものをいい、例えば、（１）
プリン環および／またはピリミジン環が化学修飾された
もの（例えば、メチル化されたプリンおよびピリミジン
環、アシル化されたプリンおよびピリミジン環などを有
するもの）、あるいはその他の複素環を含むもの、
（２）糖部分が化学修飾されたもの（例えば、１個以上
の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されてい
たり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換さ
れているもの）、（３）ビオチン化されたもの、（４）
ＦＩＴＣ化されたもの、（５）ジゴキシゲニンで修飾さ
れたもの、（６）リン酸化されたもの、（７）ペルオキ
シダーゼで修飾されたもの、（８）アルカリホスファタ
ーゼで修飾されたもの、（９）ルシフェラーゼで修飾さ
れたものなどが挙げられる。化学合成によれば、単一の
化学構造を有する目的ポリヌクレオチドを必要な量だけ
確実に得ることができるので、本発明では化学合成ポリ
ヌクレオチドが使用される。本発明の標準品は、好まし
くは、化学合成によって得られた１本鎖ＲＮＡであり、
より好ましくは化学合成によって得られたセンス鎖であ
る。また、化学合成による一本鎖ＤＮＡを用いる際は好
ましくはアンチセンス鎖を用いるのがよい。２本鎖よ
り、１本鎖のほうが、被定量物に近い状態のものを標準
とすることができるので、定量の精度が向上するからで
ある。

【０００８】本発明の合成ポリヌクレオチドとしては、
標的核酸またはその一部の塩基配列と同一の塩基配列を
有する合成ポリヌクレオチドであり、従来の生合成によ
って得られる標準品と同様の配列を有するものを用いる
ことができる。このような標準品としては、18Ｓリボソ
ームＲＮＡ（18S Ribosomal RNA）、酸性リボソームタ
ンパク質（Acidic Ribosomal Protein）、ベータアクチ
ン（β-actin）、サイクロフィリン（Cyclophilin）、
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Gl
yceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、ホスフォ
グリセロキナーゼ（Phosphoglycerokinase）、ベータ２
−ミクログロブリン（β2-Microglobulin）、ベータ−
グルクロニダーゼ（β-Glucuronidase）、ヒボキサンチ
ンリボシルトランスフェラーゼ（Hypoxanthine Ribosyl
Transferase）、転写因子ＩＩＤ（Transcription Fact
or IID）／ＴＡＴＡ結合因子（TATA Binding Facto
r）、トランスフェリンレセプター（Transferrin Recep
tor）等が挙げられる。当業者であれば、公知の配列に
基づき、化学合成によって本発明の標準品であるポリヌ
クレオチドを合成することは容易である。公知のポリヌ
クレオチドの合成方法として、例えば、ホスホアミダイ
ド法、Ｈ−ホスフェート法等が知られている。ホスホア
ミダイド法については、例えば、Wu,T.,Ogilvie,K.K.,
and Pon,R.T.(1989). Prevention of chain cleavage i
n the chemical synthesis of 2'-O-silylated oligori
bonucleotides.Nucl. Acids Res. 17, 3501-3517； St
awinski,J.,Stromberg,R.,Thelin,M., and Westman,E..
(1988)； Studies on the t-butyldimethyl-silyl gro
up as 2'-O-protection in oligoribonucleotide synth
esis via the H-phosphonate approach.Nucl. Acids Re
s. 16, 9285-9288； Scaringe,SA.A.,Franklyn,C., an
d Usman,N. (1990). Chemical synthesis of biologica
lly active oligoribinucleotides using b-cyanoethyl
protected ribonucleoside phosphoramidites.Nucl. A
cids Res. 18, 5433-5441； Chaix,C.,Molko,D. and T
eoule,R. (1989). The use of labile base protecting
groups in oligoribonucleotide synthesis.Tetrahedr
on Lett. 30, 71-74； Gasparutto,D.,Livache,T.,Bazi
n,H.,Duplaa,A.M.,Guy,A.,Khorlin,A.,Molko,D.,Roget,
A.,and Teoule,R. (1992)；Chemical synthesis of a b
iologically active natural tRNA with its minor bas
es. Nucleic Acids Res. 20, 5159-5166； Vinayak,R.,
Anderson,P.McCollum,C., and Hampel,A. (1992). Chem
ical synthesis ofRNA using fast oligonucleotide de
protection chemistry.Tetrahedron Lett.31, 7269-727
2などの文献に記載されている。また、Ｈ-ホスフェート
法については、例えば、Garegg,P.J., Regberg,T., Sta
winski,J. and Stromberg,R. (1985). Formation of in
ternucleotidic bonds via phosphonate intermediate
s. Chem. Scripta 25, 280-282； Garegg,P.J., Regber
g,T., Stawinski,J. and Stromberg,R. (1986). Nucleo
side hydrogenphosphonates in oligonucleotide synth
esis. Chem. Scripta 26, 59-62； Garegg,P.J., Lidh,
I.,Regberg,T., Stawinski,J. and Stromberg,R. (198
6)； Nucleoside H-phosphonates.III.Chemicalsynthes
is of oligodeoxyribonucleotides by the hydrogenpho
sphonateapproach. Tetrahedron Lett. 27, 4051-405
4； Froehler,B.C., Ng,P.G., andMatteucci,M.D. (198
6). Synthesis of DNA via deoxynucleoside H-phospho
nate intermediates. Nucleic Acids Res. 14, 5399-54
07； Froehler,B.C., and Matteucci,M.D. (1986). Nuc
leoside H-phosphonates : Valuable intermediatesin
the synthesis of oligonucleotides. Tetrahedron Let
t. 27, 469-472などに記載されている。なお、本発明で
用いる合成ポリヌクレオチドは、増幅効率を考慮すると
短いもののほうが好ましく、例えば、６０〜１５０me
r、より好ましくは、６０〜１００merのサイズを有す
る。本発明で用いる合成ポリヌクレオチドのヌクレオチ
ドの数は特に限定されないが、通常６０〜２００個、好
ましくは６０〜１００個である。

【０００９】（核酸定量キット）本発明において用いら
れる核酸定量キットは、上記標準品としての合成ポリヌ
クレオチドを含むものであり、さらには標的核酸に対応
する少なくとも一対のプライマー対、標的核酸に対応す
るプローブ、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液等を含んでい
てもよい。これらのキットは、必要に応じて、例えば、
プライマー伸長生成物の合成を触媒する薬剤、基質のヌ
クレオシド三リン酸塩、標識に使用する手段（例えば、
標識がビオチンならば、アビジン−酵素抱合体及び酵素
の基質及び色素原）、ＰＣＲ又はハイブリダイゼーショ
ン反応に適した緩衝液などを含むことができる。

【００１０】ここで、本発明において用いられる「標的
核酸に対応するプライマー対」とは、標的遺伝子の配列
（又は標的ｍＲＮＡをコードする遺伝子配列）のエクソ
ン領域の一方の鎖に相補的又は実質的に相補的である第
１のプライマーおよび該標的遺伝子配列のエクソン領域
の他方の鎖に相補的又は実質的に相補的である第２のプ
ライマーから成るプライマーの一対をいう。この第１の
プライマーと第２のプライマーに挟まれるエクソン部分
が増幅される。

【００１１】本発明においては、これらのプライマー対
を少なくとも１対以上使って、標的核酸の増幅を行う。

【００１２】標的核酸を増幅させるためのプライマー対
または標準品を増幅させるためのプライマー対は、その
標的核酸の配列に基づいて当業者であれば容易に設計す
ることができる（例えば、Genome Res. 1996 Oct;6(1
0):986-94参照）。

【００１３】例えば、標的核酸として、ｈＭＯＲ１ｃ
ＤＮＡが選択される場合は、ｈＭＯＲ１ｃＤＮＡ（配
列番号１）の１１２９〜１２１０位の相補配列のものを
化学合成して標準品とすることができる。この場合は、
上流プライマーとして5′-CCTTGGTTACAATCCCAGAAACTAC-
3′（配列番号：２）を、下流プライマーとして5′-AGG
CAGCTGTTTGTGTAACCTAGA-3′（配列番号：３）を用いる
ことができる。

【００１４】本発明において用いられる標的核酸に対応
するプローブまたは標準品である合成ポリヌクレオチド
に対応するプローブは、標的配列に応じて当業者に容易
に設計できる（例えば、Genome Res. 1996 Oct;6(10):9
86-94参照）。例えば、標的核酸に対応するプローブ
は、標的核酸のうち第１プライマーと第２プライマーに
挟まれる領域の核酸からなるプローブである。合成ポリ
ヌクレオチドに対応するプライマーは、合成ポリヌクレ
オチドのうち第１プライマーと第２プライマーに挟まれ
る領域の核酸からなるプローブである。本発明において
用いられる適当なオリゴヌクレオチドプローブは、好ま
しくは約１５〜約５０ヌクレオチドの長さを有し、より
好ましくは約２５〜約３５ヌクレオチドの長さを有す
る。オリゴヌクレオチドプローブは、生化学的、免疫化
学的、又は化学的な手段によって検出可能な化学物質等
を組込むことによって標識することができる。有用な標
識としては、³²Ｐ等の放射性同位元素、フルオレスカミ
ン、フルオレッセンイソチオシアネート等の蛍光物質、
ルミノール、ルシフェリン等の発光物質、β−ガラクト
シダーゼ、パーオキシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ等の酵素、ビオチン、および抗体等があげられる。な
かでも、蛍光物質で標識された蛍光プローブ、³²Ｐで標
識されたリン酸化プローブなどが好ましく用いられる。

【００１５】本発明において用いられるＤＮＡポリメラ
ーゼとしては、逆転写活性および５'→３'エキソヌクレ
アーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、例え
ば、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。

【００１６】本発明においては、公知のあるいは市販さ
れている緩衝液が用いられる（例えば、PEBiosystems社
製緩衝液；Genome Res. 1996 Oct;6(10):986-94参
照）。

【００１７】なお、定量キットに含まれる各種試薬など
の量は、試料の量、標的核酸の種類などに応じて適宜決
定される。

【００１８】本発明のより好ましい態様によれば、複数
の標的核酸を定量するための核酸定量キットであって、
複数の各反応場所、好ましくは複数の反応場所を有する
反応器具の各反応場所に、標的核酸に対応するプライマ
ー対をそれぞれ含む各増幅試薬を充填し、その標的核酸
に対応するプライマー対を充填していない反応場所に前
記請求項１〜４のいずれかに記載の標準品とその標準品
に対応するプライマー対を含む増幅試薬を充填してなる
核酸定量キットが提供される。この定量キットを用いる
ことにより、一度の操作で、試料中の複数の標的核酸の
有無およびその量を検出することができる。複数の反応
場所とは、２つ以上の反応場所であれば特に限定されば
いが、通常２〜数万個、好ましくは２〜１０００個、よ
り好ましくは１０〜８００個、さらに好ましくは１０〜
３００個の反応場所である。

【００１９】この態様では、複数の反応場所を有する反
応器具が用いられ、標的核酸を含み得る試料および一連
の既知濃度に設定された合成ヌクレオチドからなる標準
品と各増幅試薬とのそれぞれの反応は、各反応場所で行
われる。標準品の濃度はいずれでもよいが10¹コピーか
ら10⁷コピー程度が各容器に入っていることが好まし
い。各増幅試薬は、標的核酸またはその合成ポリヌクレ
オチドを増幅することができるプライマー対をそれぞれ
含む。ここで用いられる反応器具は、試料と各増幅試薬
とを一度に反応させることができるように、２つ以上の
反応場所を有している限り、反応器具の構成及び構造は
限定されない。好ましくは、本発明において用いられる
反応器具として、例えば、複数の穴を有するプレート、
複数のスライドグラスを備えてなる反応器具、複数の試
験管を備えてなる反応器具などが挙げられる。実験スペ
ース、操作性等を考慮した場合は、複数の穴を有するプ
レートを好ましく用いることができる。これらのプレー
トは、使用する増幅試薬の数によって決められるが、市
販されている９６穴または３８４穴プレートが好ましく
用いられる。しかし、増幅試薬の数に応じて所望の数の
反応場所を設けた反応器具を使うことができる。

【００２０】増幅試薬の数は、標的核酸の数に応じて調
整されるので、特に限定されないが、例えば、１０〜８
００種類の増幅試薬および標的に応じた合成オリゴヌク
レオチドからなる標準品を含んでなる定量キットが提供
される。本発明の他の態様によれば、１０〜３００種類
の増幅試薬および標的に応じた合成オリゴヌクレオチド
からなる標準品を含んでなる定量キットが提供される。
増幅試薬の数が多い場合は、異なるセットの増幅試薬を
複数枚のプレート（例えば、２〜１０枚のプレート）に
分けてセットしておき、定量反応を複数回に分けて行う
こともできる。

【００２１】（核酸の定量方法）次に、本発明の核酸定
量方法について説明する。本発明の核酸を定量する方法
においては、試料に標的核酸に対応する一対のプライマ
ー対とをそれぞれ含む増幅試薬を加え、標準品としての
化学合成ポリヌクレオチドにその合成ポリヌクレオチド
に対応する一対のプライマー対を含む増幅試薬を加え
て、それぞれ増幅反応を行い、増幅された標準品の量と
増幅された標的核酸の量を測定し、これらの情報に基づ
いて増幅前の標的核酸の量を計算する。

【００２２】[試料及び標的核酸]まず、本発明において
対象となる試料は、標的となる核酸を含み得る試料であ
ればよく、特に限定されない。本発明の対象となる試料
は、例えば、ヒトまたはその他の哺乳動物（例えば、ラ
ット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イ
ヌ、サルなど）の組織あるいはその培養細胞株から採取
したｍＲＮＡ試料である。このような組織として、例え
ば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、
海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小
脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒
質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、
甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管
（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下
腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎
盤、子宮、骨、関節、骨格筋などが挙げられる。このよ
うなｍＲＮＡ試料を用いて、その試料中に含まれる標的
ｍＲＮＡを定量することによって、ｍＲＮＡ試料を採取
した部位における標的遺伝子の発現レベルを解析するこ
とができる。

【００２３】また、ある特定の疾患を罹患している患者
由来のｍＲＮＡ試料を用いれば、その疾患に関与してい
る遺伝子（例えば、ＧＰＣＲ遺伝子）の特定が容易とな
る。特に、複数の遺伝子が関与しているといわれる癌な
どの多遺伝子関与疾患に関与するＧタンパク質共役型レ
セプター、チロシンリン酸化酵素型レセプター、イオン
チャンネル遺伝子を特定する場合は、本発明によれば、
各遺伝子の発現レベルを一度の定量操作で調べることが
できるので、関与遺伝子・タンパク質の特定が容易とな
る。

【００２４】本発明においては、上述したとおり、本発
明の合成ポリヌクレオチドを試料中の特定の標的核酸の
定量・検出用標準品として用いることにより、（１）複
数の遺伝子個々の発現量をまとめて定量解析することに
より、ある細胞または組織においてその発現が特徴的に
亢進または減少している遺伝子を同定したり、（２）特
定の遺伝子ファミリーに属する複数の遺伝子の発現解析
をまとめて行うことにより、その遺伝子ファミリーの中
で、ある細胞または組織においてその発現が特徴的に亢
進または減少している遺伝子を、その発現量の絶対値を
算出することで同定することができる。複数の遺伝子と
は、２個以上の遺伝子を意味し、上限は実施可能な限
り、特に限定されないが、通常２〜数万個、好ましくは
２〜１０００個、より好ましくは１０〜８００個、さら
に好ましくは１０〜３００個の遺伝子である。ここで、
「遺伝子の発現が特徴的に亢進または減少している」と
は、正常細胞または組織における遺伝子の発現と比較し
て、生理学的有意さがみられる程度に大量にまたは少量
に発現していることをいう。本発明において標的とする
遺伝子ファミリーは、特に限定されないが、例えば、Ｇ
タンパク質共役型レセプター遺伝子ファミリー、チロシ
ンリン酸化酵素型レセプター遺伝子ファミリー、イオン
チャネル遺伝子ファミリー、または転写因子、トランス
ポーター、プロテインキナーゼ、プロテインフォスファ
ターゼ、プロテアーゼ、ヒートショックプロテイン、Ａ
ＴＰａｓｅもしくはＤＮＡ結合プロテインのいずれかに
関連する遺伝子ファミリーなどから選択される。遺伝子
発現量の定量または遺伝子発現量の絶対値の算出は、後
述する標的ｍＲＮＡの定量法に従って行うことが出来
る。

【００２５】また、本発明によれば、遺伝子組換え食品
に含有されるＤＮＡを標的核酸とすることによって、遺
伝子組換え食品の検査、または遺伝子組換え技術を使用
せずに得られた自然食品に、組換え遺伝子が混入してい
るか否かの判定を行うことができる。なお、公知の遺伝
子組換え食品としては、大豆、ジャガイモ、トウモロコ
シ、トマト、パパイヤなどが知られている。そして、そ
の組換え遺伝子、これを検出するためのプライマー対、
一般的定量方法なども公知であり、例えば、「ＪＡＳ分
析試験ハンドブック遺伝子組換え食品検査・分析マニ
ュアル定量的ＰＣＲ編」、平成１３年４月、東京農林
水産消費技術センター発行などに記載されている。例え
ば、トウモロコシＣＢ３５１検出用として、５'―CCT T
CG CAA GAC CCT TCC TCT ATA―３'（配列番号：５）と
５'―GTA GCT GTC GGT GTA GTC CTC GT―３'（配列番
号：６）からなるプライマー対が知られている。また、
パパイヤ５５−１検出用として、５'−TTA CGG CGA GTT
CTG TTA GG−３'（配列番号：７）と５'−CAT GTG CCT
GAG AAA TAG GC―３'（配列番号：８）からなるプライ
マー対が知られている。また、ジャガイモNew Leaf Y検
出用として、５'−AAA AGA GCTGTC CTG ACA GC−３'
（配列番号：９）と５'−TCC TCC TGC ATC AAT TGT GT
−３'（配列番号：１０）からなるプライマー対が知ら
れている。

【００２６】本発明のほかの態様によれば、標的核酸
は、Ｇタンパク質共役型レセプター、チロシンリン酸化
酵素型レセプター、イオンチャネルなどをコードする遺
伝子ＤＮＡ又はそのｍＲＮＡである。この場合、標的Ｇ
タンパク質共役型レセプター、チロシンリン酸化酵素型
レセプター、イオンチャンネルなどのファミリーに属す
る遺伝子のｍＲＮＡに対応するプライマー対を含んでな
る各増幅試薬とｍＲＮＡ試料とを、反応器具の各反応場
所において接触させることにより、増幅反応させ、ｍＲ
ＮＡ増幅生成物を定量することによって、そのｍＲＮＡ
試料中に含まれていたＧタンパク質共役型レセプター、
チロシンリン酸化酵素型レセプター、イオンチャンネル
などのファミリーに属する遺伝子の発現量を測定するこ
とができる。

【００２７】本発明の他の態様によれば、全ての公知の
Ｇタンパク質共役型レセプター、チロシンリン酸化酵素
型レセプター、イオンチャンネルなどのファミリーに属
する遺伝子のｍＲＮＡに対応するプライマー対を全て準
備し、そのプライマー対をそれぞれ含む増幅試薬を各反
応場所にセットしておけば、一度の定量作業で、ｍＲＮ
Ａ試料中において、どのＧタンパク質共役型レセプタ
ー、チロシンリン酸化酵素型レセプター、イオンチャン
ネルなどのファミリーに属する遺伝子のｍＲＮＡがどの
程度産生していたかを知ることができる。勿論、必要に
応じて、異なるセットの増幅試薬を複数枚のプレートに
分けてセットしておき、定量反応を複数回に分けて行う
こともできる。

【００２８】本発明の他の態様によれば、ある一群のＧ
タンパク質共役型レセプター、チロシンリン酸化酵素型
レセプター、またはイオンチャネルのファミリーに属す
る遺伝子のｍＲＮＡに対応する一群のプライマー対を用
いることにより、一度の定量操作で、その一群のＧタン
パク質共役型レセプター、チロシンリン酸化酵素型レセ
プター、またはイオンチャネルなどのファミリーに属す
る遺伝子のなかで高発現しているＧタンパク質共役型レ
セプター、チロシンリン酸化酵素型レセプター、または
イオンチャネルなどのファミリーに属する遺伝子を特定
することができる。なお、現在、Ｇタンパク質共役型レ
セプター（または遺伝子）として次のものが公知であ
る。（１）アセチルコリンレセプター： M₁; M₂; M₃; M₄;
M₅ （２）アデノシンレセプター： A₁; A_2A; A_2B; A₃ （３）アドレノセプター（Adrenoceptors）： α1A;
α1B; α1D; α2A; α2B;α2C; β1; β2; β3 （４）アンギオテンシンレセプター： AT1; AT2 （５）ボンベシン（Bombesin）レセプター： BB1; BB
2; bb3 （６）ブラジキニンレセプター： B₁; B₂ （７）カルシトニン・アイニリン・ＣＧＲＰ及びアドレ
ノメヅリン（adrenomedullin）レセプター：（８）カンナビノイドレセプター： CB1;CB2 （９）ケモカインレセプター： CCR1; CCR2; CCR3; CC
R4; CCR5; CCR6; CCR7;CCR8; CCR9; CCR10; CXCR1; CXC
R2; CXCR3; CXCR4; CXCR5; CX₃CR1; XCR1; （１０）ケニオタクチックペプチド（Cheniotactic）レ
セプター： C3a; C5a; fMLP （１１）コレシストキニン及びガストリン（Cholecysto
kinin and gastrin）レセプター： CCK₁; CCK₂ （１２）コーチコトロピン放出因子（Corticotropin-re
leasing factor）レセプター： CRF₁; CRF₂ （１３）ドーパミンレセプター： D1; D2; D3; D4; D5 （１４）エンドセリンレセプター： ET_A; ET_B （１５）ガラニンレセプター（Galanin receptors）：
GAL1; GAL2; GAL3 （１６）グルタメートレセプター： mglu₁; mglu₂; mg
lu₃; mglu₄; mglu₅; mglu₆; mglu₇; mglu₈ （１７）グリコプロテインホルモン（Glycoprotein hor
mone）レセプター： FSH; LSH; TSH （１８）ヒスタミンレセプター： H₁; H₂; H₃; H₄ （１９）５−ＨＴレセプター： 5-HT_1A; 5-HT_1B; 5-HT
_1D; 5-ht_1B; 5-ht_1F;5-HT_2A; 5-HT_2F; 5-HT_2C; 5-HT₃;
5-HT₄; 5-ht_5A; 5-ht_5B; 5-HT₆; 5-HT₇ （２０）ロイコトリエンレセプター： BLT; CysLT₁; C
ysLT₂ （２１）リソフォスフォリピッド（Lysophospholipid）
レセプター： edg1; edg2; edg3; edg4 （２２）メラノコーリン（Melanocorlin）レセプター：
MC₁; MC₂; MC₃; MC₄; MC ₅ （２３）メラトニンレセプター： MT₁; MT₂; MT₃ （２４）ニューロペプチドYレセプター： Y₁; Y₂; Y₄;
Y₅; Y₆ （２５）ニューロテンション（Neurotension）レセプタ
ー： NTS1; NTS2 （２６）オピオイド： DOP; KOP; MOP; NOP （２７）P2Y レセプター： P2Y₁; P2Y₂; P2Y₄; P2Y₆;
P2Y₁₁; P2Y₁₂ （２８）パーオキシソームプロリフェレータ（Peroxiso
me proliferator）活性化レセプター： PPAR-α; PPAR
-β; PPAR-γ （２９）プロスタノイド（Prostanoid）レセプター：
DP; FP; IP; TP; EP₁; EP₂; EP₃; EP₄ （３０）プロテアーゼ活性化（Protease-activated）レ
セプター： PAR1; PAR2; PAR3; PAR4 （３１）ソマトスタチン（Somatotatin）レセプター：
sst₁; sst₂; sst₃; sst ₄; sst₅ （３２）タチキニン（Tachykinin）レセプター： NK₁;
NK₂; NK₃ （３３）チロトロピン放出ホルモン（Thyrotropin-rele
asing hormone）レセプター： TRH₁; TRH₂ （３４）ウロテンシン-II（Urotensin-II）レセプタ
ー：（３５）バソアクティブインテスティナルペプチド（Va
soactive intestinal peptide）及びピチュイタリアデ
ニレートサイクラーゼ活性ペプチド（pituitary adenyl
ate cyclase activating peptide）レセプター： VPAC
₁; VPAC₂; PAC₁ （３６）バソプレシン（Vasopressin）及びオキシトシ
ン（oxytocin）レセプター： V_1a; V_1b; V₂; OT また、現在、チロシンリン酸化酵素型レセプター、イオ
ンチャンネル遺伝子などのファミリーに属する遺伝子と
して、次のものが公知である。（３７）イオンチャネル： Na⁺チャネル（タイプI; タ
イプII/タイプIIA; タイプIII; SCL11/NaG; PN1; NaCh
6; NaDRG; SkM1/μ1, SkM2）、K⁺チャネル（Kv; EAG; K
QT; IRK; ROMK; GIRK; K_ATP等）、Ca²⁺チャネル（α1G;
α1E; α1S: α1C; α1D; α1B; α1A; IP3; リアノジ
ンレセプターなど）、Cl^-チャネル（GABA_A;GABA_C; グリ
シンレセプター；C1C0; C1C1; CFTRなど）、非選択性カ
チオンチャネル（nAChR; 5-HT₃; NMDA; AMPA; P_2XATP;
CNGなど）など（３８）チロシンリン酸化酵素レセプター：インスリン
レセプター；EGFレセプターなど

【００２９】本発明において用いられる核酸の定量方法
は、ヒトＧＰＣＲの機能解析、ＳＮＰ解析、遺伝子組換
え食品の判定以外にも種々の用途に用いることができ
る。例えば、判明している疾患遺伝子が産生するｍＲＮ
Ａを検出するプライマー対を含んでなる複数の増幅試薬
のセットを用いることにより、特定疾患の診断をするこ
とができる。本発明によれば、各遺伝子の発現レベルを
正確に測定することができるので、公知の方法と比較し
て、より正確な診断ができるという利点がある。

【００３０】[核酸の増幅]本発明の定量方法において、
試料中に含まれ得る標的核酸は、その標的核酸を増幅さ
せるためのプライマー対を含む増幅試薬を用いて増幅さ
れる。本発明の好ましい態様によれば、標的核酸の増幅
は公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行わ
れる（米国特許第４，６８３，１９５号；第４，６８
３，２０２号；第４，９６５，１８８号など参照）。ｍ
ＲＮＡを標的とする場合、その標的ｍＲＮＡの増幅は、
最初に、例えばウィルスの逆転写酵素を用いて、標的ｍ
ＲＮＡを逆転写し、生じたｃＤＮＡを増幅することによ
って行うことができる。さらに好ましい態様において、
ｍＲＮＡの増幅は、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ）を用いて行われる（米国特許第５，３１
０，６５２号；第５，３２２，７７０号；第５，５６
１，０５８号；第５，６４１，８６４号；５，６９３，
５１７号等参照）。

【００３１】なお、本発明においては、前記ポリメラー
ゼ連鎖反応以外にも種々のｍＲＮＡ増幅法が用いられ
る。そのような増幅法として、例えば、鎖置換アッセイ
法（米国特許第５，４５５，１６６号など参照）、転写
に基づく増幅法（ＴＡＳ）（米国特許第５，４３７，９
９０号；第５，４０９，８１８号；第５，３９９，４９
１号等参照）、自立配列複製法（３ＳＲ）(ＷＯ９２／
０８８００等参照)などが挙げられる。これらの増幅反
応の反応条件は、使用する試薬の種類等に応じて、当業
者によって容易に設定することができる。

【００３２】[標的核酸の定量]次に、本発明の定量方法
においては、核酸増幅生成物の生成量を定量する。増幅
生成物の定量は、好ましくはプローブを使用する方法に
よって行われる。好ましい態様によれば、蛍光物質によ
り標識したプローブを用いた方法によって行われる。

【００３３】本発明のより好ましい態様によれば、標的
ｍＲＮＡの定量は「ＴａｑＭａｎ法」又は「５’ヌクレ
アーゼアッセイ法」を用いて行われる（Proc. Natl. Ac
ad.Sci. USA、第88巻、第7276-7280頁（1991年）; 米国
特許第５，２１０，０１５号；第５，４８７，９７２
号；第５，８０４，３７５号など参照）。しかし、必要
に応じて、ＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎ法、ハイブリダイゼ
ーション法などを用いることもできる。ＴａｑＭａｎア
ッセイ法において、５’末端を標識したプローブが用い
られる。また、このプローブは、プローブがＤＮＡ合成
のためのプライマーとして働くことを防ぐために３’末
端が修飾される。この修飾として、リン酸基、蛍光物質
等の末端への付加があげられる。標的ｍＲＮＡの増幅
は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ
ポリメラーゼ、例えばＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを用
いて行われる。前記プライマーの下流の標的ｍＲＮＡに
ハイブリダイズするプローブは、増幅反応の間、ＤＮＡ
ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によ
って分解される。新規に標的領域が増幅されるたびに、
プローブが分解され、プローブに修飾されていた標識物
質（例、リン酸基、蛍光物質）が遊離される。この遊離
される標識物質を定量することにより、標的ｍＲＮＡ量
が間接的に測定される。

【００３４】遊離される標識物質を定量的に検出するた
めには公知の方法が用いられる。好ましい方法におい
て、前記プローブは、２つの蛍光物質で５’および３’
末端が標識され、このうちの一方が、他方の物質の蛍光
を消光することができる。このプローブは鋳型ＤＮＡに
ハイブリダイズしている間は２つの蛍光物質の相互作用
により蛍光が消光されているが、ＤＮＡポリメラーゼが
有する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により分解さ
れることにより蛍光を発するようになる。増幅反応の進
行に伴い蛍光が増大し、この蛍光の増大がモニターされ
る。

【００３５】［検量線の作成及び増幅前の標的核酸量の
計算］本発明では、予め知られている量の標準品である
合成ポリヌクレオチドを提供するので、これを増幅させ
て作成した「検量線」に基づいて標的核酸を含む試料の
定量を行う。

【００３６】検量線の作成については、例えば、特開平
１１−１２３０９５号公報に記載されている。すなわ
ち、検量線は、ポリメラーゼ連鎖反応において作られる
標準品としてのポリオリゴヌクレオチドの量を、増幅前
に存在する種々の既知量のＲＮＡに対してプロットする
ことによって作成される。高い精度を確保するために、
増幅反応混合物の希釈度を段階的に変えた希釈系列を用
いて増幅反応を行って検量線を作成する。この検量線は
所定の増幅サイクル数に対して増幅される内部標準品及
び標的核酸の量をプロットすることによって作成され
る。増幅前の標的核酸の量は、増幅される標的核酸の量
を上記検量線と比較することによって求められる。つま
り、標準品と標的核酸の一連の希釈系列を別の反応場所
において同様の条件で増幅せしめ、そしてこの反応を増
幅の指数期において停止させ、増幅前にこの試料中に存
在している標的核酸の量を、標準品を用いて作成される
検量線に対して外挿せしめることによって決定する。

【００３７】（疾患の診断方法およびその疾患を治療す
る医薬）次に、本発明の上記（２３）による方法によれ
ば、患者から採取したｍＲＮＡ試料を用いて遺伝子発現
解析を行い、特定疾患関連遺伝子の特徴的発現を検知す
ることによってその患者が罹患している疾患を診断する
ことができる。本発明によれば、特定疾患関連遺伝子フ
ァミリー（特に、特定疾患関連ＧＰＣＲ遺伝子ファミリ
ー）に属する遺伝子の発現をまとめて解析することによ
り、複数の特定疾患関連遺伝子のなかで、どの遺伝子の
発現が特徴的であるかを一度の操作で特定することがで
きる。したがって、このようにして特定された遺伝子の
遺伝子産物に対するアゴニスト、アンタゴニストもしく
は抗体、またはその遺伝子産物をコードするＤＮＡを含
む医薬は、その診断対象の患者に対して特に有効であ
る。本発明においては、複数の異常発現遺伝子を特定す
ることができ、かつその遺伝子の発現レベルまでをも正
確に定量することができる。したがって、その患者に適
当な処方として、複数のアゴニスト、アンタゴニストま
たは抗体を選択し、その処方量についても、疾患関連遺
伝子の発現レベルに応じて調製することができる。すな
わち、本発明によれば、その患者のみに処方される、い
わゆるテーラーメード医薬の調製が可能となる。

【００３８】より詳細に述べると、例えば、生体内にお
いてあるレセプタータンパク質が減少しているためにリ
ガンドの生理作用が期待できない（該レセプタータンパ
ク質の欠乏症）患者がいる場合に、そのレセプタータ
ンパク質を該患者に投与し該レセプタータンパク質の量
を補充したり、（イ）本発明のレセプタータンパク質
をコードするＤＮＡを該患者に投与し発現させることに
よって、あるいは（ロ）対象となる細胞に本発明のレセ
プタータンパク質をコードするＤＮＡを挿入し発現させ
た後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、
患者の体内におけるレセプタータンパク質の量を増加さ
せ、リガンドの作用を充分に発揮させることができる。

【００３９】本発明の医薬は、特定された遺伝子が関与
する疾患の予防または治療に有効であり、例えば、中枢
疾患(例えば、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害な
ど)、内分泌疾患(例えば、高血圧症、性腺機能異常、甲
状腺機能異常、下垂体機能異常など)、代謝疾患(例え
ば、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症など)、癌（例え
ば、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、
乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌等）などの予防また
は治療に有用である。本発明で特定された遺伝子の遺伝
子産物（例えば、レセプタータンパク質）、それに対す
るアゴニスト、アンタゴニストもしくはその抗体、また
はその遺伝子をコードするＤＮＡを上記予防または治療
剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化する
ことができる。

【００４０】一方、ＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略
記する場合がある）を上記予防・治療剤として使用する
場合は、そのＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベク
ター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシ
エーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿
入した後、常套手段に従って実施することができる。そ
のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補
助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのよ
うなカテーテルによって投与できる。

【００４１】例えば、本発明で用いられる医薬は、必
要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル
剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは
水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性
溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使
用できる。例えば、本発明の医薬を、生理学的に認め
られる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐
剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤
実施に要求される単位用量形態で混和することによって
製造することができる。これら製剤における有効成分量
は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするも
のである。

【００４２】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアル
コール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート
８０^TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液
としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶
解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。

【００４３】また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝
剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。このようにして得られる製剤は
安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳
動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与するこ
とができる。

【００４４】本発明の医薬の投与量は、投与対象、対象
臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投
与の場合、一般的に例えば、癌患者（６０ｋｇとして）
においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好
ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０
〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１
回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などに
よっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例え
ば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき
約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０
ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静
脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場
合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することがで
きる。本発明のＤＮＡの投与量は、投与対象、対象臓
器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与
の場合、一般的に例えば、癌患者（６０ｋｇとして）に
おいては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ま
しくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜
２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回
投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによ
っても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、
癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約
０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍ
ｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈
注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合
も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができ
る。

【００４５】（略号の表示）本明細書において、塩基、
アミノ酸、化合物等を略号で表示する場合、IUPAC-IUB
Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づき表示を行い、
その例を以下に記載する。またアミノ酸が光学異性体を
取りうる場合、特に明示しなければＬ体を表す。ＤＮＡ：デオキシリボ核酸ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸ａまたはＡ：アデニンｔまたはＴ：チミンｇまたはＧ：グアニンｃまたはＣ：シトシンｕまたはＵ：ウラシルＲＮＡ：リボ核酸ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸ＡＴＰ：アデノシン三リン酸Ｇｌｙ：グリシンＡｌａ：アラニンＶａｌ：バリンＬｅｕ：ロイシンＩｌｅ：イソロイシンＳｅｒ：セリンＴｈｒ：スレオニンＣｙｓ：システインＭｅｔ：メチオニンＧｌｕ：グルタミン酸Ａｓｐ：アスパラギン酸Ｌｙｓ：リジンＡｒｇ：アルギニンＨｉｓ：ヒスチジンＰｈｅ：フェニルアラニンＴｙｒ：チロシンＴｒｐ：トリプトファンＰｒｏ：プロリンＡｓｎ：アスパラギンＧｌｎ：グルタミンｐＧｌｕ：ピログルタミン酸

【００４６】本明細書の配列表記載の配列は以下のとお
りである。［配列番号：１］ｈＭＯＲ１の塩基配列を表す。［配列番号：２］実施例１で用いた上流プライマーＮ−
９１７Ｆの塩基配列を表す。［配列番号：３］実施例１で用いた下流プライマーＮ−
９９８Ｒの塩基配列を表す。［配列番号：４］実施例１で用いたプローブＮ−９４５
Ｔの塩基配列を表す。［配列番号：５］トウモロコシＣＢ３５１検出用プライ
マーの塩基配列を表す。［配列番号：６］トウモロコシＣＢ３５１検出用プライ
マーの塩基配列を表す。［配列番号：７］パパイヤ５５−１検出用プライマーの
塩基配列を表す。［配列番号：８］パパイヤ５５−１検出用プライマーの
塩基配列を表す。［配列番号：９］ジャガイモNew Leaf Y検出用プライマ
ーの塩基配列を表す。［配列番号：１０］ジャガイモNew Leaf Y検出用プライ
マーの塩基配列を表す。

【００４７】

【実施例】以下に実施例を示して、本発明をより詳細に
説明するが、これは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１（１）ｈＭＯＲ１部分配列の化学合成ＤＮＡによる検量
線の作成この例は、ＴａｑＭａｎ法における、ｈＭＯＲ１ｃＤ
ＮＡ（配列番号１：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号
Ｌ２５１１９）部分配列の化学合成ＤＮＡを用いた検
量線の作成を記載する。

【００４８】（２）試料増幅は、ｈＭＯＲ１ｃＤＮＡ部分配列の化学合成ＤＮ
Ａ（ｈＭＯＲ１Ｔ／Ｍ）の連続希釈溶液を用いて行っ
た。本件のｈＭＯＲ１ＣＯＭの配列は、ｈＭＯＲ１ｃ
ＤＮＡ（配列番号１）内１１２９−１２１０位の相補配
列に相当し、β−シアノエチルホスホアミダイド固相合
成法（化学合成法）にて合成後、アンモニアクリーベー
ジ処理を行い、ポリアクリルアミド変性ゲル電気泳動に
よる精製を行った。

【００４９】（３）増幅プライマー及び検出プローブｈＭＯＲ１ｃＤＮＡ部分配列の領域の増幅は、5′-CCT
TGGTTACAATCCCAGAAACTAC-3′（配列番号：２）の配列を
有する上流プライマーＮ−９１７Ｆを、5′-AGGCAGCTGT
TTGTGTAACCTAGA-3′（配列番号：３）の配列を有する下
流プライマーＮ−９９８Ｒとを一対のプライマー対とし
て用いて行った。前記の上流プライマー、Ｎ−９１７Ｆ
は、ｈＭＯＲ１ｃＤＮＡ（配列番号：１）内の１１２
９−１１５３位の相補配列にハイブリダイズする。前記
の下流プライマー、Ｎ−９９８Ｒは、ｈＭＯＲ１ｃＤ
ＮＡ（配列番号：１）内の１１８７−１２１０位の配列
にハイブリダイズする。これらのプライマーは一緒に、
完全長のｈＭＯＲ１ｃＤＮＡ配列の一部を含む、８２
塩基対の生成物の増幅を触媒する。

【００５０】検出は、5′-CCAGACTGTTTCTTGGCACTTCTGCA
TTG-3′（配列番号：４）を有するＮ−９４５Ｔをプロ
ーブとして用いて行った。このプローブは、ｈＭＯＲ１
ｃＤＮＡ（配列番号：１）内の１１５７−１１８５位
の相補配列にハイブリダイズする。前記のＴａｑＭａｎ
形式での検出を可能にするために、前記プローブは、
５’端にフルオレセイン型の蛍光色素（ＦＡＭ：リポー
ター）３’端にローダミン型の蛍光色素（ＴＡＭＲＡ：
クェンチャー）を標識した。標識したプローブは、ハイ
ブリダイズしない状態の場合には、蛍光共鳴エネルギー
の移動現象により、リポーターの蛍光は抑制される。Ｄ
ＮＡポリメラーゼによる前記プローブの伸長を、増幅の
間防ぐために、前記プローブの３’末端はリン酸ブロッ
クで合成した。

【００５１】（４）増幅各々のＰＣＲ増幅は、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｕｎｉｖｅ
ｒｓａｌＰＣＲＭａｓｔｅｒＭＩＸ（アプライド
バイオシステムズジャパン株式会社）を用いて、２０μ
ｌの合計反応液量で行った。最終試薬濃度を以下の様に
した：試料遺伝子、１× ＴａｑＭａｎ（商標）Ｕｎｉ
ｖｅｒｓａｌＰＣＲＭａｓｔｅｒＭＩＸ（Ａｍｐｌ
ｉＴａｑＧｏｌｄ（商標）ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ、ＡｍｐＥｒａｓｅ（商標）Ｕｒａｃｉｌ−Ｎ−ｇ
ｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）、ＲＯＸなどを含
む。）、９００ｎＭ各プライマー、２００ｎＭプロー
ブ。

【００５２】増幅反応は、ＡＢＩＰＲＩＺＭ（商標）
７９００ＨＴ配列検出システム（アプライドバイオシス
テムズジャパン株式会社）で行い、使用した温度周期の
プロファイルを以下に示す。サーマルサイクリングの時
間及び温度ＡｍｐＥｒａｓｅＵＮＧ反応のインキュベ
ーション：５０℃で２分間、ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏ
ｌｄＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅの活性化：９５℃
で１０分間、変性・アニール／伸長：４０サイクル：
９５℃で１５秒間、６０℃で１分間。

【００５３】（５）定量的ＴａｑＭａｎ解析ＴａｑＭａｎ反応において、増幅の間に、前記ＤＮＡポ
リメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によ
り、前記標的配列にハイブリダイズするプローブは５’
末端から加水分解される。その結果、リポーター蛍光色
素は遊離し、蛍光強度が増加する。増幅生成物の蓄積
は、反応液の、リポーター蛍光色素の蛍光強度の増加を
測定することによって、測定した。また、同時に、反応
液の、実験誤差補正用の蛍光リファレンス（蛍光色素：
ＲＯＸ）の蛍光強度も測定した。各々の増幅サイクルの
間、前記リポーター蛍光色素、及びリファレンス蛍光色
素は、その最大の励起に近い波長の光で励起し、そして
前記リポーター蛍光色素、及びリファレンス蛍光色の発
光は、その発光の最大付近で測定される。これらの周波
数は、ＡＢＩＰＲＩＺＭ（商標）７９００ＨＴ配列検出
システムであらかじめ決定され、別の検出機器を使用し
たならば、適当な周波数を選択すべきである。

【００５４】蛍光測定値は、７９００ＨＴＳＤＳソフ
トウェア（アプライドバイオシステムズジャパン株式会
社）により解析した。まず、リポーター蛍光色素の蛍光
強度をリファレンス蛍光色素の蛍光強度で標準化し、標
準化リポーターシグナル（Ｒｎ）を算出した。更に、Ｒ
ｎから、ＰＣＲ初期サイクルのサイクルの間で比較的一
定なＲｎの平均値（ベースライン）を差し引いた値をΔ
Rnとした。サイクル数に対してΔＲｎをプロットした増
幅曲線上で、増幅産物の指数関数的増幅に相当する蛍光
シグナル（ΔＲｎ）の増加を解析アルゴリズムが初めて
検出したサイクル数をＴｈｒｅｓｈｏｌｄＣｙｃｌｅ
（Ｃ_T）とした。具体的には、このＣ_Tを決定するため
に、増幅産物の指数関数的増幅に至っていないと考えら
れるＰＣＲ初期サイクル（３−１５サイクル）をベース
ラインとして、このサイクル内の平均ΔＲｎの標準偏差
を計算した。次にこの標準偏差を１０倍した値をＴｈｒ
ｅｓｈｏｌｄと定義し、各増幅曲線上でこのＴｈｒｅｓ
ｈｏｌｄの値に相当するサイクル数をＣ_Tとした。前記
の増幅産物の指数関数的増幅期の間、Ｃ_Tは、最初の標
的コピー数の対数に比例する。後期のサイクルにおける
増幅生成物の蓄積は、反応を阻害し、そしてついには反
応のプラトーをもたらす。

【００５５】（６）結果各試料で得たＣ_T値を、以下に示す。各Ｃ_T値は、４回の
反応から得た平均値を表わす。試料Ｃ_T 値１０⁷ コピーのｈＭＯＲ１Ｔ／Ｍ１６．３１０⁶ コピーのｈＭＯＲ１Ｔ／Ｍ１９．２１０⁵ コピーのｈＭＯＲ１Ｔ／Ｍ２２．５１０⁴ コピーのｈＭＯＲ１Ｔ／Ｍ２６．０１０³ コピーのｈＭＯＲ１Ｔ／Ｍ２９．２１０²コピーのｈＭＯＲ１Ｔ／Ｍ３２．９０コピーのｈＭＯＲ１Ｔ／Ｍ４０．０以上

【００５６】検量線は、既知量のｈＭＯＲ１ＣＯＭの鋳
型（標準サンプル）の増幅から得た、Ｃ_T値から導い
た。具体的には標準サンプルの初期既知量（対数値）に
対してＣ_Tをプロットし、検量線を作成した。近似曲線
にはＣ_T＝（Ｌｏｇ［ＤＮＡ］_T−Ｌｏｇ［ＤＮＡ］₀）
／Ｌｏｇ（１＋ｅ）（ここで、［ＤＮＡ］₀は標的テン
プレートの初期濃度であり、［ＤＮＡ］_Tは、Ｃ_Tサイク
ル時の増幅産物の濃度であり、ｅは、平均増幅効率であ
り、そしてＬｏｇ（Ｘ）は、Ｘが１０の底を表す対数で
ある）の一次方程式を用い、７９００ＨＴＳＤＳソフ
トウェアにより、パラメーターを定めた。前記の試料か
ら得たＣ_T値から、以下の検量線を得た：Ｃ_T＝３９．３４−３．３３１×Ｌｏｇ［ＤＮＡ］₀ 相関係数Ｒ２＝０．９９９平均増幅効率ｅ＝９９．６％

【００５７】実施例２（１）ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡ合成前立腺癌細胞ＬＮＣａＰ−ＦＧＣ細胞をプレコンフルエ
ントになるまで培養した。細胞を０．２５％トリプシン
−１ｍＭＥＤＴＡ（Invitrogen社）ではがし細胞数を
測定した後、RNeasy mini KIT（QIAGEN社）のマニュア
ルに従って全ＲＮＡを抽出精製した。抽出したＲＮＡは
SuperScript II（Invitrogen社）のマニュアルに従って
first strand cDNAを合成し、エタノール沈殿後下記の
ように溶解して用いた。合成したｃＤＮＡは１０ｍｇ／
ｍｌＲＮＡ相当になるようにＴＥに溶解した後、５０
μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡを含むＴＥに５ｎｇ／μｌに
なるように希釈した。希釈したｃＤＮＡ溶液５μｌ（２
５ｎｇのＲＮＡに相当）を１種類のＧＰＣＲのｍＲＮＡ
の定量の測定用試料とした。

【００５８】（２）化学合成標準品を用いたＧＰＣＲ
ｍＲＮＡの定量既知のＧＰＣＲ１６０種類の配列を基に、ソフトウエ
アPrimer Express（商標）（アプライドバイオシステム
ズジャパン株式会社）を用いてプライマーおよびプロー
ブを設計した。また、プライマーにはさまれた塩基配列
を持つ（−）鎖のＤＮＡを化学合成した。化学合成した
ＤＮＡを５０μｇ／ｍｌのyeast tRNAを含むＴＥに１０
⁶コピー／５μｌになるように希釈した後、１０倍づつ
１０²コピー／５μｌになるまで希釈系列を作成した。
１種類のＧＰＣＲのｍＲＮＡの測定は、これらの化学合
成品による希釈系列５種と前述した測定サンプル１種の
５μｌずつを各２点分注して行った。増幅反応試薬は、
TaqMan(商標) Universal PCRMaster Mix（アプライドバ
イオシステムズジャパン株式会社）および、前述のよう
に設計したTaqMan(商標) Probe Kit（アプライドバイオ
システムズジャパン株式会社）を用い、１５μｌの液量
に調製したのち、前述の標準品および測定試料の入った
各ウェルに加えた。各プライマー、プローブの最終濃度
はマニュアルに従った。TaqMan(商標) PCRは、ABI PRIS
M(商標)7900HT配列検出システム（アプライドバイオシ
ステムズジャパン株式会社）で行い、使用した温度周期
はTaqMan(商標) Universal PCR Master Mix（アプライ
ドバイオシステムズジャパン株式会社）のマニュアルに
従った。増幅生成物の定量的TaqMan解析は、7900HT SDS
ソフトウェア（アプライドバイオシステムズジャパン株
式会社）を用いて行った。上記の条件を用いて３８４ウ
ェルプレート１枚で３２種類のＧＰＣＲの定量的測定を
行い、５枚の３８４ウェルプレートを用いることにより
前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ−ＦＧＣ細胞の発現する前述
した１６０種類全てのＧＰＣＲの正確な定量が可能であ
った。

【００５９】

【発明の効果】本発明の標準品は、化学合成によって得
られる合成ポリヌクレオチドであり、従来の生合成によ
って得られるポリヌクレオチドからなる標準品と比較し
て、簡便な方法で目的とする配列のものを正確に得るこ
とができるという利点がある。また、本発明の標準品
は、生物学的コンタミネーションがないので、環境に対
して安全であり、また高精度の定量を阻害する要因を少
なくできるという利点がある。また、本発明の定量方法
及び定量キットによれば、標準品として１本鎖のポリヌ
クレオチドを用いた場合は、被定量物に近い状態のもの
を標準とすることができるので、より高精度の定量が可
能となる。

【００６０】また、本発明の他の態様に係る定量方法及
び定量キットによれば、多種類の標的核酸を含み得る試
料について、多種類の標的核酸の有無及びその量を一度
の処理で高感度で検出することができる。したがって、
本発明によれば、標的遺伝子の発現解析を高感度で迅速
に行うことができるシステムを提供することができる。
さらに、本発明の定量方法および定量キットを用いるこ
とによって、特定疾患の診断、遺伝子組換え食品の検査
または自然食品中の遺伝子組換えＤＮＡの混入の判定な
どを高精度で行うことができる。

【００６１】

【配列表】 [Sequence Listing] <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Quantification Method and Quantification Kit of Nucleic Acids <130> P02-0156 <150> JP 2001-400280 <151> 2001-12-28 <160> 10 <210> 1 <211> 2162 <212> DNA <213> Human <220> <221> <223> (2063), (2091) <224> <400> 1 ggaattccgg ctataggcag aggagaatgt cagatgctca gctcggtccc ctccgcctga 60 cgctcctctc tgtctcagcc aggactggtt tctgtaagaa acagcaggag ctgtggcagc 120 ggcgaaagga agcggctgag gcgcttggaa cccgaaaagt ctcggtgctc ctggctacct 180 cgcacagcgg tgcccgcccg gccgtcagta ccatggacag cagcgctgcc cccacgaacg 240 ccagcaattg cactgatgcc ttggcgtact caagttgctc cccagcaccc agccccggtt 300 cctgggtcaa cttgtcccac ttagatggca acctgtccga cccatgcggt ccgaaccgca 360 ccaacctggg cgggagagac agcctgtgcc ctccgaccgg cagtccctcc atgatcacgg 420 ccatcacgat catggccctc tactccatcg tgtgcgtggt ggggctcttc ggaaacttcc 480 tggtcatgta tgtgattgtc agatacacca agatgaagac tgccaccaac atctacattt 540 tcaaccttgc tctggcagat gccttagcca ccagtaccct gcccttccag agtgtgaatt 600 acctaatggg aacatggcca tttggaacca tcctttgcaa gatagtgatc tccatagatt 660 actataacat gttcaccagc atattcaccc tctgcaccat gagtgttgat cgatacattg 720 cagtctgcca ccctgtcaag gccttagatt tccgtactcc ccgaaatgcc aaaattatca 780 atgtctgcaa ctggatcctc tcttcagcca ttggtcttcc tgtaatgttc atggctacaa 840 caaaatacag gcaaggttcc atagattgta cactaacatt ctctcatcca acctggtact 900 gggaaaacct cgtgaagatc tgtgttttca tcttcgcctt cattatgcca gtgctcatca 960 ttaccgtgtg ctatggactg atgatcttgc gcctcaagag tgtccgcatg ctctctggct 1020 ccaaagaaaa ggacaggaat cttcgaagga tcaccaggat ggtgctggtg gtggtggctg 1080 tgttcatcgt ctgctggact cccattcaca tttacgtcat cattaaagcc ttggttacaa 1140 tcccagaaac tacgttccag actgtttctt ggcacttctg cattgctcta ggttacacaa 1200 acagctgcct caacccagtc ctttatgcat ttctggatga aaacttcaaa cgatgcttca 1260 gagagttctg tatcccaacc tcttccaaca ttgagcaaca aaactccact cgaattcgtc 1320 agaacactag agaccacccc tccacggcca atacagtgga tagaactaat catcagctag 1380 aaaatctgga agcagaaact gctccgttgc cctaacaggg tctcatgcca ttccgacctt 1440 caccaagctt agaagccacc atgtatgtgg aagcaggttg cttcaagaat gtgtaggagg 1500 ctctaattct ctaggaaagt gcctactttt aggtcatcca acctctttcc tctctggcca 1560 ctctgctctg cacattagag ggacagccaa aagtaagtgg agcatttgga aggaaaggaa 1620 tataccacac cgaggagtcc agtttgtgca agacacccag tggaaccaaa acccatcgtg 1680 gtatgtgaat tgaagtcatc ataaaaggtg acccttctgt ctgtaagatt ttattttcaa 1740 gcaaatattt atgacctcaa caaagaagaa ccatcttttg ttaagttcac cgtagtaaca 1800 cataaagtaa atgctacctc tgatcaaagc accttgaatg gaaggtccga gtctttttag 1860 tgtttttgca agggaatgaa tccattattc tattttagac ttttaacttc aacttaaaat 1920 tagcatctgg ctaaggcatc attttcacct ccatttcttg gttttgtatt gtttaaaaaa 1980 aataacatct ctttcatcta gctccataat tgcaagggaa gagattagca tgaaaggtaa 2040 tctgaaacac agtcatgtgt canctgtaga aaggttgatt ctcatgcact ncaaatactt 2100 ccaaagagtc atcatggggg atttttcatt cttaggcttt cagtggtttg ttcctggaat 2160 tc 2162 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N917F <400> 2 ccttggttac aatcccagaa actac 25 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N-998R <400> 3 aggcagctgt ttgtgtaacc taga 24 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_binding <223> Probe N-945T, labeled 5'-terminal with FAM and 3'-terminal with TA MRA <400> 4 ccagactgtt tcttggcact tctgcattg 29 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 ccttcgcaag acccttcctc tata 24 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 gtagctgtcg gtgtagtcct cgt 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 ttacggcgag ttctgttagg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 catgtgcctg agaaataggc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 aaaagagctg tcctgacagc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 tcctcctgca tcaattgtgt 20

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 2G045 AA20 AA25 AA40 BA11 CB17 CB20 CB30 DA12 DA13 DA14 DA77 FB02 FB07 4B024 AA01 AA11 CA09 CA12 HA20 4B063 QA01 QA12 QA18 QQ42 QQ53 QR08 QR32 QR35 QR56 QR62 QS25 QS36 QX01 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】化学合成によって得られる合成ポリヌク
レオチドを含む、試料中の特定の標的核酸を定量または
検出する際に用いられる標準品。
【請求項２】前記合成ポリヌクレオチドがＲＮＡ、Ｄ
ＮＡ又はそれらの修飾物である請求項１記載の標準品。
【請求項３】前記合成ポリヌクレオチドがＲＮＡまた
はＤＮＡである請求項１記載の標準品。
【請求項４】前記合成ポリヌクレオチドがＲＮＡのと
きにセンス鎖、あるいはＤＮＡのときにアンチセンス鎖
である請求項３記載の標準品。
【請求項５】前記合成ポリヌクレオチドが標的核酸の
一部を合成したものであって、ヌクレオチドの数が６０
〜２００個である請求項１記載の標準品。
【請求項６】前記請求項１〜５のいずれかに記載の標
準品を含む核酸定量キット。
【請求項７】前記請求項１〜５のいずれかに記載の標
準品と少なくとも１対のプライマー対を含む核酸定量キ
ット。
【請求項８】さらに蛍光プローブまたはリン酸化プロ
ーブを含んでなる請求項７記載のキット。
【請求項９】さらにＤＮＡポリメラーゼを含んでなる
請求項８記載のキット。
【請求項１０】さらに逆転写酵素を含む請求項９記載
のキット。
【請求項１１】複数の標的核酸を定量するための核酸
定量キットであって、複数の反応場所を有する反応器具
の各反応場所に、標的核酸に対応するプライマー対を含
む増幅試薬を充填し、その標的核酸に対応するプライマ
ー対を充填していない反応場所に前記請求項１〜５のい
ずれかに記載の標準品とその標準品に対応するプライマ
ー対を含む増幅試薬を充填してなる核酸定量キット。
【請求項１２】前記複数の標的核酸が特定疾患に関与
するＤＮＡまたはｍＲＮＡであり、その特定疾患を診断
するために用いられる請求項１１記載の核酸定量キッ
ト。
【請求項１３】前記複数の標的核酸が遺伝子組換え食
品に含有される組換えＤＮＡであり、食品中の組換えＤ
ＮＡを検知するために用いられる請求項１１記載の核酸
定量キット。
【請求項１４】試料中の特定の標的核酸を定量する方
法であって、試料に標的核酸に対応する少なくとも一対
のプライマー対をそれぞれ含む増幅試薬を加え、標準品
としての化学合成ポリヌクレオチドにその合成ポリヌク
レオチドに対応するプライマー対を含む増幅試薬を加え
て、それぞれ増幅反応を行い、増幅された標準品の量と
増幅された標的核酸の量を測定し、これらの情報に基づ
いて増幅前の標的核酸の量を計算する核酸の定量方法。
【請求項１５】前記合成ポリヌクレオチドがＲＮＡ、
ＤＮＡ又はそれらの修飾物である請求項１４記載の方
法。
【請求項１６】前記合成ポリヌクレオチドがＲＮＡで
ある請求項１４記載の方法。
【請求項１７】前記合成ポリヌクレオチドがセンス鎖
である請求項１６記載の方法。
【請求項１８】前記合成ポリヌクレオチドが標的核酸
の一部を合成したものであって、ヌクレオチドの数が６
０〜２００個である請求項１４〜１７記載の方法。
【請求項１９】前記試料がヒトまたはその他の動物由
来のｍＲＮＡ試料である請求項１４〜１８記載の方法。
【請求項２０】前記増幅試薬がさらに蛍光プローブま
たはリン酸化プローブを含んでなる請求項１９記載の方
法。
【請求項２１】前記増幅試薬がさらにＤＮＡポリメラ
ーゼを含んでなる請求項２０記載の方法。
【請求項２２】前記増幅試薬がさらに逆転写酵素を含
む請求項２１記載の方法。
【請求項２３】（１）標的核酸に対応する少なくとも
一対のプライマー対をそれぞれ含む増幅試薬に含まれる
蛍光プローブまたはリン酸化プローブのプローブ部分
が、標的核酸のうち該プライマー対に挟まれる領域の核
酸からなるプローブであり、（２）合成ポリヌクレオチ
ドに対応するプライマー対を含む増幅試薬に含まれる蛍
光プローブまたはリン酸化プローブのプローブ部分が、
合成ポリヌクレオチドのうち該プライマー対に挟まれる
領域の核酸からなるプローブである請求項２０〜２２記
載の方法。
【請求項２４】ＤＮＡポリメラーゼによって蛍光プロ
ーブまたはリン酸化プローブから遊離される蛍光物質の
蛍光強度またはリン酸基の量を指標として、増幅された
標準品の量と増幅された標的核酸の量を測定する請求項
２３記載の方法。
【請求項２５】前記請求項１１記載のキット又は前記
請求項１４の方法を用いてＳＮＰの解析を行う方法。
【請求項２６】前記請求項１２記載のキット又は前記
請求項１４の方法を用いて特定疾患を診断する方法。
【請求項２７】前記請求項１３記載のキット又は前記
請求項１４の方法を用いて食品中に遺伝子組換えＤＮＡ
が含まれているか否かを判定する方法。
【請求項２８】前記請求項１２記載のキット又は前記
請求項２６記載の方法によって特定される、ある細胞や
組織において特徴的に発現が亢進または減少している遺
伝子ＤＮＡもしくはその遺伝子産物、又はその遺伝子産
物に対するアゴニスト、アンタゴニストもしくは抗体を
含んでなる医薬。