JP2003265193A

JP2003265193A - 組換えｐ５３アデノウイルス

Info

Publication number: JP2003265193A
Application number: JP2003041578A
Authority: JP
Inventors: Wei-Wei Zhang; ツァン，ウェイ−ウェイ; Jack A Roth; ロス，ジャック・エイ
Original assignee: University of Texas System; University of Texas at Austin
Current assignee: University of Texas System; University of Texas at Austin
Priority date: 1993-10-29
Filing date: 2003-02-19
Publication date: 2003-09-24
Also published as: US6740320B1; BR9408179A; AU8094994A; CA2174556A1; KR960705930A; SK50996A3; NO961696L; US20030021767A1; CN1079833C; CZ288790B6; PL314311A1; CA2174556C; NZ275356A; AU698437B2; PL186151B1; US20030012770A1; EP0725791B1; US20070190040A1; WO1995012660A3; WO1995012660A2

Abstract

(57)【要約】【課題】ｐ５３アデノウイルスなどの組換えアデノウ
イルスの能率的な製造方法、及び、異常ｐ５３を持つ細
胞がｐ５３の機能を回復できる効果的な手段を提供す
る。【解決手段】リポソームを介する同時トランスフェク
ション、及び、トランスフェクションされた細胞中で細
胞変性効果（ＣＰＥ）を直接観察することにより、組換
えアデノウイルスを製造する簡単で効率的な方法を開示
した。さらにまた、新規のｐ５３アデノウイルス構成物
についての組成物及び方法、ならびに変異ｐ５３を持つ
細胞と動物がｐ５３の機能と腫瘍抑制力を回復する方法
も開示した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】発明の背景１．発明の分野本発明は一般には、組換え技術の分野に関する。本発明
の一部の態様においては、組換えアデノウイルスを産生
させる簡単で能率的な方法に関する。他の態様において
は、異常なｐ５３を持つ細胞が正常なｐ５３機能と増殖
の抑制力を回復する方法を含む、ｐ５３アデノウイルス
構成物（construct）に関する新規な組成物と方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】２．関連技術の説明放射線療法、外科手術、及び化学療法を始めとする現在
の癌治療方法では、効果に限度があることが知られてい
る。アメリカ合衆国では、肺癌のみをとってみても死亡
数は年間１４０，０００人以上に達している。最近の年
齢別統計では、肺癌の死亡率は、女性の乳癌死亡率を超
えている。禁煙運動が行われるようになって喫煙の慣習
は減ってきたが、肺癌死亡率は高いまま２１世紀を迎え
ることになろう。肺癌の新しい治療方法の合理的な開発
は、肺癌の分子レベルの生物学の理解しだいである。

【０００３】現在の確立された理論では、各種癌の病因
の少なくとも一部は、遺伝子に異常が生じて一以上の遺
伝子が過剰発現するか、あるいは、異常又は変異遺伝子
が発現することにあるとされている。例えば、多くの症
例においてガン遺伝子が発現したことが原因となって癌
が発病したことが知られている。「ガン遺伝子」とは、
遺伝的に変質した遺伝子で、発現産物が突然変異してい
るために正常細胞の機能や制御を何らかの理由で破壊す
るのである（Spandidos et al.，1989）。

【０００４】今日まで研究されたほとんどのガン遺伝子
は、正常細胞遺伝子のコード領域、つまり、「原ガン遺
伝子」が、突然変異、それも多くは点突然変異をおこす
ことによって、「活性化され」、発現したタンパク質産
物のアミノ酸を置換することがわかっている。この変質
した発現産物は、新生物形成過程に参加する異常な生物
機能を示すようになる（Travali et al.，1990）。この
ような基礎となる突然変異は、化学的突然変異形成や電
離放射線など各種手段により発生する。現在では、ｒａ
ｓ，ｍｙｃ，ｎｅｕ，ｒａｆ，ｅｒｂ，ｓｒｃ，ｆｏ
ｓ，ｊｕｎやａｂｌを始めとして、多くのガン遺伝子や
ガン遺伝子群が同定されて、遺伝子によって差はあるも
のの、特徴付けもなされている（Travali et al.，199
0; Bishop，1987）。

【０００５】正常細胞が増殖している間は、増殖を促進
する原ガン遺伝子と、増殖を制御するガン抑制遺伝子と
が均衡を保っていると考えられている。いくつかの要因
により、これら二つの力の均衡が崩れ、新生物形成状態
になる。この要因の一つが、ガン抑制遺伝子の突然変異
である（Weinberg，1991）。

【０００６】重要なガン抑制遺伝子は、細胞タンパク質
をコードしている遺伝子であるｐ５３である。ｐ５３は
細胞の増殖を制御していてる５３ｋＤの核リンタンパク
質である。ｐ５３遺伝子が突然変異していて、さらに、
この遺伝子が存在している染色体１７ｐから対立遺伝子
が排除されていることが、ヒトの悪性腫瘍で最も頻繁に
見いだされる変化である。ｐ５３タンパク質は進化を通
して保存度が高く、ほとんどの正常組織で発現されてい
る。野生型ｐ５３は、細胞周期の制御（Mercer，199
2）、転写の調節（Fields et al.，1990，and Miez et
al.，1992）、ＤＮＡの複製（Wilcock and Lane，199
1，and Bargonetti et al.，1991）、及びアポトーシス
の誘発（Yonish-Rouach et al.，1991，and Shaw et a
l.，1992）に関与していることが立証されている。

【０００７】各種の突然変異ｐ５３対立遺伝子は、１個
の塩基が置換されただけで、全く異なる成長調節特性を
もつタンパク質が合成されるようになって、最後には悪
性腫瘍をもたらすことが知られている（Hollstein et a
l.，1991）。事実、ｐ５３遺伝子は、ごく普通に見られ
るヒトの癌で、突然変異している頻度が最も高い遺伝子
であって（Hollstein et al.，1991; Weinberg，199
1）、特に喫煙に起因する癌に関与することが認められ
ている（Hollstein et al.，1991; Zakut-Houri eta
l.，1985）。乳癌中のｐ５３の過剰発現も報告されてい
る（Casey et al.，1991）。

【０００８】癌の遺伝子療法で最も挑戦的な態様の一つ
は、ｐ５３のようなガン抑制遺伝子を利用することであ
る。野生型ｐ５３をある種の乳癌細胞や肺癌細胞にトラ
ンスフェクションすると、これらの細胞系が増殖を抑制
する制御能力を回復することが報告されている（Casey
et al.，1991; Takahasi et al.，1992）。ＤＮＡのト
ランスフェクションは、患者の細胞内にＤＮＡを導入す
る実行可能な手段ではない。しかしながら、これらの実
験結果は、ｐ５３遺伝子の改良デリバリー手段さえ開発
されれば、ｐ５３遺伝子が突然変異している癌細胞に野
生型ｐ５３を供給して、効果的な治療方法とすることが
できることを示している。

【０００９】遺伝子による腫瘍抑制療法に適用しようと
して、遺伝子デリバリーシステムが研究開発されてい
る。実際の生細胞を感染させる、つまり、ウイルスが自
らの遺伝材料を伝達する過程の効率が良いので、ウイル
ス系遺伝子伝達媒体が特に興味深い。これまでにこの分
野で、例えば、各種の遺伝子をデリバリーするように操
作したレトロウイルスベクターの産生に、ある程度の進
歩が見られた。しかしながら、遺伝子療法としてレトロ
ウイルスベクターを使用するには、レトロウイルスは標
的細胞にレトロウイルス受容体が存在しないと感染する
ことができない点、濃縮及び精製が難しい点、複製して
いる細胞にしか効率的に組み込むことができない点など
の重大な欠陥がある。

【００１０】アデノウイルスベクターシステムは、ある
種の遺伝子伝達プロトコルに使用することを目的として
最近提案されたものであるが、現在の組換えアデノウイ
ルス製造方法にいくつかの問題がある。現在の製法は、
発現ベクターとアデノウイルスプラスミドとをリン酸カ
ルシウムを介して宿主細胞にトランスフェクションした
後、このトランスフェクションした細胞をプラーク解析
する。この種のトランスフェクション工程と解析方法
は、非能率的であり、しかも、低濃度のウイルスしか増
殖できないという典型的な結果となる。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】したがって、増殖に対
する抑制力を回復する手段として、ｐ５３などのガン抑
制遺伝子を細胞に導入する新しい方法を開発すること
が、明かに必要である。また、組換えアデノウイルスの
製造方法としては、リン酸カルシウムを介したトランス
フェクション工程と、アガロースで表面処理してプラー
ク解析する試験方法を用いない方法が有利である。

【００１２】

【課題を解決するための手段】発明の要旨本発明は上記その他の問題を解決するためになされたも
ので、ｐ５３アデノウイルスなどの組換えアデノウイル
スの能率的な製造方法、及び、異常ｐ５３を持つ細胞が
ｐ５３の機能を回復できる効果的な手段を提供する。さ
らに、癌細胞のような異常なｐ５３機能を持つ細胞中で
野生型ｐ５３の発現を促進する組成物を使用する方法に
用いる組換えアデノウイルスベクターとビリオンを開示
する。さらにまた、リポソームを仲介としてＤＮＡをト
ランスフェクションした後、細胞変性効果（cytopathic
effect）（ＣＰＥ）を観察し、好ましくはポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）解析を行って、組換えアデノウイ
ルスを増殖する簡単なプロトコルも開示する。

【００１３】また、組換えアデノウイルスを産生増殖す
るこの新規方法を用いて、上記以外の遺伝子をビリオン
ゲノムに取り込むことも考えられる。これらの遺伝子と
しては、網膜芽腫（ｒｂ）遺伝子などのガン抑制遺伝
子、抗ｃ−ｍｙｃや抗ｋ−ｒａｓなどのアンチセンスガ
ン遺伝子、及び癌遺伝子療法に用いる増殖制御関連遺伝
子などを挙げることができる。

【００１４】本発明者らは、本発明によって転移性増殖
の制御に著しい効果を挙げることができることを立証し
た。Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３組換えアデノウイルスが、形
質転換した細胞の成長速度を顕著に低減できることが証
明されている。このウイルスは、また、ウイルスに感染
したＨ３５８細胞の腫瘍形成を抑制した。さらに、同所
性肺癌も、先ず、Ｈ２２６Ｂｒ細胞を気管支内に接種し
た後、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３組換えアデノウイルスを気
管支内滴注することにより増殖を防止することができ
た。このように腫瘍形成が抑制されたことは、高濃度の
ｐ５３タンパク質が一時的に発現しただけでも、殺腫瘍
効果を誘発するに充分であることが示唆されている。

【００１５】特異的な一実施態様において、本発明は突
然変異又は異常ｐ５３遺伝子を持つと推定される標的細
胞など、悪性腫瘍細胞タイプを含む標的細胞中に野生型
ｐ５３遺伝子を組み入れるベクター構成物に関する。こ
れらの態様では、ｐ５３遺伝子がプロモーターによって
制御されている遺伝子発現単位又は転写単位を調製し、
この単位を組換えアデノウイルス内のアデノウイルスベ
クターに組み入れる。

【００１６】いくつかの理由からこの発明は全体とし
て、驚異的に有利な発明である。第一の理由は、ｐ５３
ウイルスは毒性があるため、アデノウイルスをつくる際
に用いられるような、パッケージング細胞中に産生させ
ることはできないと従来から考えられてきた点にある。
第二の理由は、アデノウイルスのＥ１ＢはＰ５３と結合
するため、ｐ５３の機能に干渉する点にある。第三に、
一旦ｐ５３を産生すると、ｐ５３アデノウイルスは各種
癌細胞の成長抑制に予期せざるほど効果的であることが
見いだされている点にある。最後に、コントロールウイ
ルスでは抑制されず、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３を用いる治
療を通じて肺癌細胞の腫瘍形成が抑制されるが、この新
規なｐ５３タンパク質デリバリー方法とその製剤は驚く
べき治療効果があることを示している点にある。

【００１７】したがって本発明は、ｐ５３などのガン抑
制遺伝子、アンチセンスガン遺伝子、その他の関連遺伝
子をアデノウイルスに担持させてヒトの癌治療に使用す
る、アデノウイルスベクター構成物に関する。これは、
一実施態様においては、組換えアデノウイルスビリオン
又は粒子は、野生型ｐ５３をコードする発現領域を含む
組換え挿入断片を含むベクター及びその製剤処方が組み
入れられていて、ベクターがヒトの転移細胞中でｐ５３
を発現することができるものとなっている。ベクターの
ｐ５３発現領域は、ゲノム配列を含んでもよいが、ｐ５
３のｃＤＮＡ配列の方が当業者からの入手が容易であ
り、操作も簡単であるので、ｐ５３のｃＤＮＡ配列を用
いて簡単化することを考慮している。ベクターの組換え
挿入断片は、一般に、ＳＶ４０又はプロタミン遺伝子の
ポリアデニル化シグナルなどのプロモーター領域及びポ
リアデニル化シグナルを含む。

【００１８】好ましい実施態様においては、ＣＭＶプロ
モーター、ウイルスＬＴＲ、ＲＳＶ又はＳＶ４０プロモ
ーターなどの強力な構成的プロモーター、あるいは伸長
因子−１やアクチンプロモーターなどのような、哺乳動
物の細胞において高濃度で発現する遺伝子と結合してい
るプロモーターに、ｐ５３発現領域を制御させることを
考慮している。現在のところ、最も好ましいプロモータ
ーはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーター
である。

【００１９】本発明では、ｐ５３のコード配列をＥ１Ｂ
を欠いているウイルスゲノムに挿入あるいは添加するこ
とにより、ｐ５３遺伝子又はｃＤＮＡを組換えアデノウ
イルスに導入する。しかしながら、好ましいアデノウイ
ルスは、アデノウイルスベクター構成物から複製及び／
又はパッケージングに必須なウイルス遺伝子を欠失させ
ておき、その位置にｐ５３発現領域を導入することがで
きる、増殖欠損性ウイルス（replication defective vi
ruses）である。Ｅ１Ｂの他にも、複製に必須の遺伝子
（例えば、Ｅ１Ａ，Ｅ２やＥ４）や、非必須の遺伝子
（例えば、Ｅ３）を欠失させておいて、ｐ５３で置換し
てもよい。

【００２０】図１のゲノム構成で例示しているように、
アデノウイルスベクターからＥ１ＡとＥ１Ｂを欠失させ
ておいて、その位置にｐ５３発現領域を導入しているベ
クターとビリオンが特に好ましい。

【００２１】増殖欠損性アデノウイルスを製造する技術
は当業者によく知られていて、Ghosh-Choudhury and Gr
ahama(1987)、McGrory et al.，(1988)、及びGluzmann
et al.,（1982）に例示されている。これらの文献各々
は、引用することにより本発明の一部とする。各種細胞
系に既に複製欠失があるとしても、欠失を相補できさえ
すれば、これらの細胞系を用いて組換えアデノウイルス
を増殖できることもよく知られている。好ましい細胞系
はヒト２９３細胞系であるが、複製を許容できる、即
ち、好ましい場合Ｅ１ＡとＥ１Ｂを発現できる他の細胞
系も使用することができる。さらに、細胞をプラスチッ
ク皿や懸濁培地で増殖して、ウイルス株を得ることがで
きる。

【００２２】本発明は、Ｅ１を欠いているウイルスとＥ
１を発現する細胞の組合せだけに限らない。本発明で
は、ｐ５３ベクターがＥ１Ｂを持たない限り、上記以外
でもお互いに相補しているウイルスと宿主細胞との組合
せを実際に使用することができる。機能的なＥ２を欠い
ているウイルスとＥ２を発現する細胞との組合せでもよ
いし、機能的なＥ４を欠いているウイルスとＥ４を発現
する細胞との組合せなどでもよい。例えばＥ３のような
複製に必須ではない遺伝子が欠失し、これが置換されて
いる場合、この欠失を宿主細胞が特異的に相補する必要
はない。

【００２３】アデノウイルスのベクターやビリオンの固
有の性質は、Ｅ１Ｂを持っていてはいけないという条件
以外、本発明の実施に重要であるとは考えられていな
い。アデノウイルスは、これまでに異なる４２の血清型
とサブグループＡ〜Ｆが知られているが、このうち、ど
のアデノウイルスでもよい。本発明の方法に使用する増
殖欠損性アデノウイルスベクターの出発原料としては、
サブグループＣのタイプ５アデノウイルスが好ましい。
タイプ５のアデノウイルスは、大量の生化学及び遺伝学
情報が蓄積されていて、歴史的にアデノウイルスをベク
ターとして用いるほとんどの構成物に使用されてきたヒ
トアデノウイルスだからである。

【００２４】上記に関連する態様において、本発明は、
新規なｐ５３ＤＮＡセグメント、又は発現ベクター、及
び本発明により製造するアデノウイルスｐ５３ベクター
を取り入れる組換え宿主細胞に関する。本発明のＤＮＡ
セグメントは、一般に、転写の５’−３’方向に、サイ
トメガロウイルスＩＥプロモーター、野生型ヒトｐ５３
の構造遺伝子、及びＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナ
ルを含有している。組換えアデノウイルスを含有する宿
主細胞は、一般に、真核細胞及び２９３細胞などの哺乳
類細胞である。あるいは本発明のアデノウイルスに感染
しているｐ５３遺伝子欠失細胞でもよい。

【００２５】他の実施態様において、本発明は、野生型
ｐ５３をコードする組換えアデノウイルスを含み、薬理
的に許容できる溶液又は緩衝液に分散させた製薬組成物
に関する。好ましい薬理的に許容できる溶液としては、
リン酸塩、乳酸塩、トリスなどで緩衝した中性塩類溶液
が挙げられる。言うまでもなく、アデノウイルスは精製
して、妨害する欠陥アデノウイルス粒子や、内毒素その
他のパイロジェンなどの好ましからざる汚染物を実質的
に皆無とし、ベクター構成物を服用する動物や患者に副
作用が起きないようにすることが望ましい。ベクター精
製の好ましい手段としては、塩化セシウム密度勾配遠心
法などの浮遊密度勾配法の使用が挙げられる。

【００２６】さらに他の実施態様において、本発明は、
野生型ｐ５３欠損細胞にｐ５３機能を与える方法、ある
いはこの細胞が野生型ｐ５３タンパク質の機能を回復す
る方法に関する。これを達成する手段として、ｐ５３突
然変異を持つ細胞を、野生型ｐ５３がこの細胞内で発現
するのに充分な有効量の組換えアデノウイルスに接触さ
せる。これは、例えば癌細胞などの、欠陥ｐ５３を含む
細胞を持つ動物又はヒト患者に、生理的有効量のアデノ
ウイルス含有製薬組成物を投与することにより達成する
ことができる。したがって、本発明の範囲には、乳癌や
肺癌などのヒト悪性腫瘍を有効に治療する方法も含まれ
るものとする。

【００２７】さらに他の実施態様において、本発明はｐ
５３発現アデノウイルスを用いて、悪性増殖、さらには
転移性増殖をも防止することに関する。一実施態様にお
いては、ｐ５３遺伝子が突然変異している細胞の制御で
きない増殖を抑制するために、組換えｐ５３を発現して
いるアデノウイルスが使われる。より好ましい実施態様
においては、このｐ５３を発現しているアデノウイルス
によって、Ｈ３５８細胞の腫瘍形成と増殖を抑制する
が、ｐ５３機能の存在を示すことができる他の細胞を使
用してもよい。

【００２８】さらに他の実施態様においては、ｐ５３を
発現しているウイルスを気管支内に滴注することによ
り、同所性肺腫瘍の増殖を防止する。これについては、
ヌードマウスにＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ウイルスを用いる
実験を行って、好成績をおさめた。Ｈ３５８細胞は通常
では顕著な腫瘍塊をつくる細胞であるが、Ａｄ５ＣＭＶ
−ｐ５３ウイルスを感染させることにより腫瘍形成を抑
制することができた。さらに、Ｈ２２６Ｂｒ細胞を気管
内に接種した後、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ウイルスを気管
内に滴注することにより、同所性肺癌の増殖を防止し
て、肺癌細胞に対するＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３のin vitro
での効果を確認した。肺癌細胞の腫瘍形成がコントロー
ルウイルスのＡｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２ではなく、Ａｄ５
ＣＭＶ−ｐ５３による治療によって抑制されたことは、
ｐ５３タンパク質が治療効果を持っていることを示して
いる。当業者は他のウイルスデリバリー方法も本発明の
範囲に含まれていることを理解している。

【００２９】本発明の実施態様のある一面は、正常な細
胞機能の回復や、癌の治療を目的とするｐ５３構成物の
使用を例示する。反面、組換えアデノウイルスによって
標的細胞内、あるいは宿主細胞内で高濃度のガン抑制タ
ンパク質を発現するために、本発明を一般的に適用する
ことを提案する。例えば、癌治療薬様相の一環として、
発明者により考案されたｐ５３の置換に加え、特に例を
あげると、網膜芽腫遺伝子（ｒｂ）、アンチセンスガン
遺伝子（ｃ−ｍｙｃやｃ−ｒａｓ）、その他関連遺伝子
を導入してヒト癌の療法とすることが考えられている。

【００３０】本発明で用いるアデノウイルスベクターは
複製欠損性であるので、ガン細胞などのような、最終的
に感染しなければならない細胞中で複製することができ
ないことを指摘しなければならない。したがって、治療
を開始した時のように、患者の治療を継続する必要があ
ると判断される場合には、一定期間後、例えば６ケ月後
あるいは一年後ウイルスを再導入する必要が出でくる可
能性がある。

【００３１】本発明のアデノウイルスベクターは、遺伝
子療法とは直接関係がない実施態様においても有用性が
ある。このような、これまでと述べてきたところとは異
なる用法としては、各種ｐ５３遺伝子のin vitro解析や
突然変異誘発研究、さらに例えば抗体産生や他の態様で
用いるタンパク質の組換え生産が挙げられる。新しく見
いだされるｐ５３の分子活性に関するすべての実施態様
を含むヒトの治療とは関係がない実施態様においても同
じことが言える。即ち、細胞へｐ５３をデリバリーする
のに、他の関連ウイルスを使用することである。これに
はヘルペス属ウイルス、例えば単純疱疹ウイルス（ＨＳ
Ｖ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイト
メガロウイルス（ＣＭＶ）、及び仮性狂犬病ウイルス
（ＰＲＶ）が好適である。

【００３２】これまで述べてきたところとは異なる一実
施態様において、本発明は非能率的なリン酸カルシウム
によるトランスフェクションと単調なプラーク検定法に
よらないで、あらゆる種類の組換えアデノウイルスを簡
単に生産する製法に関する。

【００３３】本発明の組換えアデノウイルス製法は、一
般的にリポソームを介したトランスフェクションにより
アデノウイルスプラスミトと発現ベクターを好適な宿主
細胞に導入し、その後、相同組換えとウイルス産生が行
われていることを示す細胞変性効果（ＣＰＥ）が培養し
た宿主細胞中に存在するかどうかを解析する。第一工程
のトランスフェクションの効率が上がれば、第二工程の
ＣＰＥが有利となる。

【００３４】リポソームを介したトランスフェクション
に使用する好ましい組成物は、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−
（２，３−ジデオイロキシ［dideoyloxy］）プロピル］
−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルサルフ
ェート）で、これは市販で入手可能である。ＣＰＥは直
接観察が可能な現象で、位相差顕微鏡で評価することが
できる。ＣＰＥは、初めに溶菌感染した細胞が収縮し、
最後には溶菌プラークが形成されるアデノウイルスの細
菌毒性の形態的特徴を示したものである。この方法固有
の利点としては、インキュベートを開始して１０日〜１
４日後に、ウイルスの増殖が容易に測定できることであ
る。これは、リン酸カルシウムを介したトランスフェク
ションと、その後のプラーク検定との組合せでは、少な
くとも１４日、普通は最低２１日、時として数週間経た
ないと結果を評価できないのと比較すると著しい改善で
ある。

【００３５】ある実施態様では、Ｅ１が欠けているプラ
スミドと２９３細胞の組合せで例示されているように、
本発明の方法を、複製欠損性アデノウイルスプラスミド
とこの欠陥を相補する宿主細胞の組合せに使用してい
る。機能的Ｅ１ＡとＥ１Ｂが欠けているアデノウイルス
プラスミドに、ｐ５３発現領域を組み込んで、本発明の
実用実施例として使用することができるが、この同じ方
法によってどのような発現領域でも組換えアデノウイル
スに取り入れることもできる。正確な方法の実施態様は
所望によって異なるが、ある場合では最小必須培地を使
用することが好ましい。

【００３６】これらの新しい方法をＰＣＲ解析と併用し
て、正しく組換えられたウイルスが存在しているか、否
かを確認することできる。ＰＣＲは当業者に公知であっ
て、アメリカ合衆国特許第4,683,195号に開示されてい
る。この特許は引用することにより本発明の一部とす
る。ＰＣＲを本発明と併用する場合、細菌変性効果を示
す細胞の上澄み液からＤＮＡを採取し、１組は発現ベク
ターに特異性を持ち、他の１組はアデノウイルスゲノム
に特異性を持つ２組のプライマーを用いてＰＣＲにより
このＤＮＡを解析する。ベクター、又は挿入断片に特異
性を有するＤＮＡは、例えばｐ５３ＤＮＡの発現によっ
てｍＲＮＡやタンパク質の産生を示すように、最終的に
発現させたいポリペプチド又はＲＮＡをコードするＤＮ
Ａの一部をなす遺伝子セグメントであると定義すること
ができる。また、アデノウイルスゲノムに特異性を有す
るＤＮＡは、増殖がモニターされている段階の間に発現
されるどの部分のゲノムでもよい。

【００３７】

【発明の実施の形態】最良の実施態様の詳細な説明Ａ．肺癌発生の分子事象本発明者らは実験を行い、癌が発生及び進行する重要な
分子事象を同定した。

【００３８】この結果、本発明者らは、in vivoで特定
の正常なタンパク質機能を回復することにより、悪性表
現型を抑制する新しい方法を開発することができた。

【００３９】最も発生頻度が高い肺癌組織（８０％）
を、非小細胞肺癌（non-small-celllung cancer）（Ｎ
ＳＣＬＣ）の名称で分類し、これに鱗状癌（squqmou
s）、腺癌（adenocarcinoma）、及び大細胞未分化癌（l
arge-cell undifferentiated）を含めた。現在のとこ
ろ、肺癌の分子生物学のデータの多くは、発生頻度が低
い小細胞肺癌（small-cell lung cancer）（ＳＣＬＣ）
の研究から得られたものである。ＳＣＬＣとＮＳＣＬＣ
とは、細胞の神経分泌の特徴によって区別することがで
きる。ＳＣＬＣは化学療法によく反応するが、治療後速
やかに再発する。ＮＳＣＬＣは、上記以外の発癌物質が
誘発する上皮癌のモデルとしても用いることができる。
この実験で開発されたアプローチや観察は、この他のタ
イプの上皮癌にも適用することもできる。

【００４０】悪性形質転換の過程には、遺伝的パラダイ
ムが介在していることを示す数多くの証拠が集められて
いる。癌細胞で検出される主な障害は、優性ガン遺伝子
や、優性ガン抑制遺伝子に存在している。優性ガン遺伝
子は、原ガン遺伝子と呼ぶクラスの遺伝子が変化したも
ので、シグナルトランスダクションや転写を含む重要な
正常細胞機能に関与している。形質転換を起こす能力を
与える優性ガン遺伝子の一次的修飾は、点突然変異、転
座、転位、及び増幅を含む。ガン抑制遺伝子では、突然
変異や欠失あるいはこれらの併合によって、機能をホモ
接合で喪失すると、形質転換が起こると思われる。ガン
抑制遺伝子の一部は転写の調整によって、増殖を制御す
る役割を果たしているように思われる。優性ガン遺伝子
やガン抑制遺伝子の発現が変化すると、細胞の一部の特
性に影響が出てきて、悪性表現型の誘因となる可能性も
ある。

【００４１】これまで、ガン遺伝子が仲介する形質転換
のメカニズムがより良く知られるようになって来ている
にも拘らず、ガン遺伝子とその産物を特異的に標的とす
る療法の開発はほとんど進歩しなかった。当初、この分
野の研究では、先ず優性ガン遺伝子の特徴付けがなされ
たこともあって、焦点がこの優性ガン遺伝子に充てられ
ていた。ＤＮＡを介する遺伝子の伝達が研究されるよう
になって、先ずヒト悪性腫瘍からＤＮＡが転移し、その
後で正常細胞が悪性表現型を獲得することが立証され
た。

【００４２】Ｂｐ５３と、癌におけるｐ５３の突然変
異現在、ｐ５３はガン抑制遺伝子であると認識されている
（Montenarch，1992）。化学物質による発癌、紫外線照
射、及びＳＶ４０を含むいくつかのウイルスにより形質
転換した多くの細胞に、高濃度のｐ５３が見いだされて
いる。ｐ５３遺伝子は、広範囲に亘る各種ヒト腫瘍にお
いて、突然変異によって失活している場合が多く、発生
頻度が高いヒトの癌で突然変異することが最も多い遺伝
子であると既に報告されている（Mercer，1992）。ｐ５
３遺伝子はヒトＮＳＣＬＣの５０％以上（Hollestein e
t al.，1991）、及びこれ以外の広範囲の腫瘍において
突然変異している。

【００４３】ｐ５３遺伝子は、ラージＴ抗原やＥ１Ｂな
どの宿主タンパク質と複合物を形成することができる３
７５個のアミノ酸からなるリンタンパク質をコードして
いる。このタンパク質は正常組織や正常細胞で見いださ
れるが、形質転換した細胞や、腫瘍組織と比較すると僅
かな濃度でしかない。興味深いことに、野生型ｐ５３は
細胞の成長や細胞分裂を調整する上で重要であると思わ
れることである。ある症例では、野生型ｐ５３の過剰発
現に、ヒト腫瘍細胞系において抗増殖効果があったこと
が示されている。したがって、ｐ５３は細胞の増殖に対
してネガティブレギュレーターとして作用することがで
きるし（Weinberg，1991）、制御できない細胞の増殖を
直接的に抑制したり、あるいは制御できない増殖を抑制
できる遺伝子を間接的に活性化することもできる。した
がって、野生型ｐ５３が存在していなかったり不活性化
していると、形質転換を起こす一因となる可能性もあ
る。

【００４４】しかしながら、ある研究では、突然変異ｐ
５３遺伝子の形質転換する潜在性能が完全に発現するた
めには、突然変異ｐ５３が存在することが必要であると
報告している。

【００４５】野生型ｐ５３が多くの細胞系において中枢
的に重要な増殖調整遺伝子であると認識されているが、
この遺伝子の遺伝的特性や、生化学的特性にも役割があ
るように思われる。ミスセンス突然変異は、ｐ５３遺伝
子によく起こるが、ガン遺伝子の形質転換能にとっても
必須な突然変異である。点突然変異に誘発された単独の
遺伝的変化は、ｐ５３ガン遺伝子を生じうる。しかしな
がら、他のガン遺伝子とは異なり、ｐ５３の点突然変異
は少なくとも３０個のそれぞれ異なるコドンで存在する
ことで知られている。これらの点突然変異は、ホモ接合
を減らすことなく、細胞の表現型を転換させる優性対立
遺伝子を作り出すことが多い。さらに、これらドミナン
トネガティブな対立遺伝子の多くは生物中では寛容さ
れ、生殖細胞系中に受け継がれる。各種対立遺伝子は、
最小限の機能不全をもつ負の対立遺伝子から、強い浸透
度のドミナントネガティブな遺伝子まで、広い範囲に亘
っている（Weinberg，1991）。

【００４６】Caseyらは、野生型ｐ５３をコードしてい
るＤＮＡを、二つのヒト乳癌細胞系にトランスフェクシ
ョンすると、これらの細胞が増殖を抑制する制御を回復
すると報告している（Casey et al.，1991）。また、突
然変異ｐ５３ではなく、野生型ｐ５３をヒト肺癌細胞系
にトランスフェクションしても同様な効果が得られたこ
とが報告されている（Takahasi et al.，1992）。ｐ５
３は、変異遺伝子よりも優性で、変異遺伝子と細胞中に
同時トランスフェクションすると、増殖に拮抗する選択
がなされる。トランスフェクションされたｐ５３が正常
に発現しても、内因性ｐ５３を持つ細胞の増殖には影響
しない。したがって、正常細胞が上記のような構成物を
取り込んでも、副作用はない。

【００４７】したがって、ｐ５３に起因する癌を野生型
ｐ５３で治療して、悪性腫瘍細胞数を減らすことは可能
である。しかしながら、ＤＮＡトランスフェクションに
よって患者の体内の癌細胞にＤＮＡを導入することは不
可能であるので、上記の研究がその目的を達成するまで
には、まだまだ長い距離を行かなくてはならない。

【００４８】Ｃ．遺伝子療法の技術遺伝子療法について今日までいくつかのの実験アプロー
チが提案されているが、それぞれ特有の欠点がある（Mu
lligan，1993）。上記したようにトランスフェクション
法は、ＤＮＡに実験対象の遺伝子を含有させて、生物的
にではなく、例えば物理的又は化学的に細胞膜を浸透す
ることにより細胞内に導入することが基本となってい
る。このことからこのアプローチは、一時的に体外に取
り出すことができ、治療由来の細胞毒性を寛容できる細
胞、すなわちリンパ球に限られてしまう。また、ある脂
質や両親媒性ペプチドからリポソーム又はタンパク質結
合体をつくって、トランスフェクションに使うことはで
きるが、遺伝子組込みの効率が低く、細胞１,０００〜
１００,０００個当り組込み成功例１件程度でしかな
い。そればかりでなく、トランスフェクションされた遺
伝子の発現持続時間は、増殖性細胞で数日間、非増殖性
細胞で数週間に過ぎないことが多い。したがって、ＤＮ
Ａトランスフェクションは明かに癌治療方法として適当
ではない。

【００４９】第二のアプローチは、それぞれのウイルス
が独自の遺伝子材料を持参して、細胞に入って行くこと
ができるウイルスの天然の性能を利用する方法である。
独自の遺伝子を宿主ゲノムに取り込ませ、多量の外来遺
伝材料を伝達し、広範囲の種と細胞型に感染でき、その
上特別の細胞系でパッケージングされることができる性
能を持つレトロウイルスは、遺伝子デリバリーベクター
として有望ではある。

【００５０】しかしながら、三つの重要な問題があっ
て、レトロウイルスベクターの実用を阻んでいる。第一
に、レトロウイルスの感染力は、標的表面のレトロウイ
ルス受容体の存在量しだいであるということである。第
二に、レトロウイルスが効率的に取り込まれるのは、複
製している細胞だけである。最後は、レトロウイルスは
濃縮及び精製が難しいことである。

【００５１】Ｄ．遺伝子療法に用いるアデノウイルス
構成物ヒトアデノウイルスは、二本鎖ＤＮＡ腫瘍ウイルスで、
ゲノムの大きさは約３６ｋｂである（Tooza，1981）。
アデノウイルスはこれまでに、真核細胞遺伝子発現のモ
デルシステムとして広く研究され、特徴もよく調べられ
て、遺伝子伝達システムとして開発するのに魅力的な系
である。この群のウイルスは、in vitro、in vivoとも
に、増殖と操作が容易で、宿主域が広い。溶菌感染細胞
では、アデノウイルスは宿主のタンパク質合成を停止
し、宿主のメカニズムに多量のウイルスタンパク質を合
成させて、おびただしいウイルスを産生する。

【００５２】ゲノムのＥ１領域にはＥ１ＡとＥ１Ｂがあ
って、ウイルスのゲノム及びいくつかの細胞遺伝子の転
写調節を行うタンパク質をコードしている。Ｅ２発現遺
伝子にはＥ２ＡとＥ２Ｂとがあって、ウイルスの複製機
能、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡポリメラー
ゼ、及び複製の準備をする末端タンパク質の合成を可能
にしている。Ｅ３遺伝子産物は、細胞障害性Ｔ細胞や腫
瘍壊死因子による細胞分解を防止するので、ウイルスの
増殖に重要であると考えられる。Ｅ４タンパク質に関連
する機能には、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、及び、宿
主細胞の閉止（host cell shutoff）がある。後期遺伝
子産物にはビリオンキャプシドタンパク質のほんどんと
が含まれていて、主要後期プロモーターからつくられる
１個の一次転写産物のプロセッシングの大部分が起こっ
た後に初めて、これらの後期遺伝子産物が発現する。主
要後期プロモーター（ＭＬＰ）は、感染後期の段階で高
い効率を発揮する（Stratford-Perricaudet and Perric
audet，1991a）。

【００５３】ウイルスのゲノムは、in cisでは少量しか
必要とされないので（Tooza，1981）、アデノウイルス
由来のベクターと２９３細胞などの細胞系とを同時使用
すると、このベクターが大きなＤＮＡフラグメントを置
換する優れた性能が生まれる。また、Ａｄ５で形質転換
したヒト胚腎臓細胞系（Graham，et al.，1977）は、in
transに必須のウイルスタンパク質を供給するように開
発されてきた。したがって、本発明者らは、このような
特性からin vivoで癌細胞を標的とするには、アデノウ
イルスを使うのがよいと判断した（Grunhaus & Horwit
z，1992）。

【００５４】細胞に外来タンパク質をデリバリーするア
デノウイルスシステムの特筆すべき利点としては、
（ｉ）外来ＤＮＡによって比較的大きなウイルスＤＮＡ
を置換することができる、（ii）組換えアデノウイルス
の構造が安定している、（iii）ヒトにアデノウイルス
を投与しても安全である、及び（iv）アデノウイルスに
よる感染と癌又は悪性腫瘍との間で、知られている関連
性がない、（ｖ）高力価の組換えウイルスを得ることが
できる、（vi）アデノウイルスの感染度が高いことが挙
げられる。

【００５５】この他、レトロウイルスに勝るアデノウイ
ルスベクターの利点として、高濃度の遺伝子発現を挙げ
ることができる。さらに、アデノウイルスの複製は、レ
トロウイルスの配列とは異なり、宿主の遺伝子複製に依
存しない。Ｅ１領域におけるアデノウイルスの形質転換
遺伝子は、容易に欠失でき、効率的な発現ベクターとな
るので、アデノウイルスベクターに起因するガン遺伝子
の危険は無視できる程小さいと考えられる（Grunhaus &
Horwitz，1992）。

【００５６】一般に、アデノウイルス遺伝子伝達システ
ムは、Ｅ１などゲノムの一部を欠失させて複製欠損性
（replication-incompetent）とするが、感染適格性は
保持するように操作した、組換えアデノウイルスを基本
としている。アデノウイルスゲノムから別の部分をさら
に欠失させると、相対的に大きな外来タンパク質を発現
することができる。例えば、Ｅ１とＥ３両方の領域を欠
失しているアデノウイルスは、１０ｋｂまでの外来ＤＮ
Ａを担持して、２９３細胞内で高力価になることができ
る（Stratford-Perricaudet and Perricaudet，1991
a）。驚くべきことに、アデノウイルスによる感染後、
導入した遺伝子（トランスジーン）が発現を続けていた
ことが報告されている。

【００５７】最近では、真核細胞や動物全体に遺伝子を
伝達する仲介手段として、アデノウイルスを介する遺伝
子の伝達が研究されるようになった。例えば、まれな劣
性遺伝疾患であるオルニチントランスカルバミラーゼ
（ＯＴＣ）欠乏症を罹患しているマウスの治療におい
て、アデノウイルス構成物を用いて正常なＯＴＣ酵素を
供給できることが見いだされた。残念ながら、１７症例
のうち正常濃度のＯＴＣを発現できるまで回復したもの
は４例に過ぎなかった（Stratford-Perricaudet eta
l.，1991b）。したがって、この実験のマウスの大部分
は、欠陥が部分的に矯正されただけで、生理的にも、表
現型でも変わるところはなかった。このような結果で
は、癌療法にアデノウイルスベクターの使用が促進され
る筈がない。

【００５８】コットンラットの嚢胞性線維症の膜内外伝
導調整遺伝子（cystic fibrosis transmembrane conduc
tanve regulator、ＣＦＴＲ）の遺伝子を、アデノウイ
ルスによって肺上皮に伝達する実験が行われた。この実
験は部分的には成功したが、実験動物の上皮に伝達され
た遺伝子の生物活性を評価することはできなかった（Ro
senfeld et al.，1992）。この実験でも、遺伝子が伝達
されたこと、肺気道細胞でＣＦＴＲタンパク質が発現し
たことは証明されたが、生理的効果は証明されなかっ
た。１９９１年のScience 誌の論文において、Rosenfel
dらは、α１−抗トリプシンタンパク質を肺で発現させ
ることに成功したが、生理的効果を証明することができ
なかったことを報告している。事実、彼らは観察された
発現の濃度は、ヒトの肺の保護に必要な濃度の約２％、
つまり、生理的効果に必要な濃度を大幅に下回ると見積
ったのであった。

【００５９】正常ラットの肝臓にヒトα1−抗トリプシ
ン遺伝子を肝門内注射により導入する実験が行われた。
その結果、遺伝子は肝臓で発現し、導入されたヒトタン
パク質がラットの血漿に分泌された（Jaffe et al.，19
92）。しかし、残念ながら、得られた濃度は治療価値に
達する程高くはなかった。

【００６０】これらの実験結果では、アデノウイルスが
組換え細胞中で充分なタンパク質を発現させて、生理的
に妥当な効果を挙げることを証明できなかったし、ま
た、アデノウイルスシステムが癌療法に使用できる有用
性を持つことも証明できなかった。さらにまた、本発明
以前では、ｐ５３には毒性があるので、アデノウイルス
を製造する場合に用いられるような、パッケージング細
胞にｐ５３を取り入れることはできないと思われてい
た。また、アデノウイルスのＥ１Ｂは、ｐ５３と結合す
るので、この点からもアデノウイルスの技術と、ｐ５３
の技術とを結び付けることはできないと考えられていた
のである。

【００６１】Ｅ．ｐ５３−アデノウイルス構成物と腫
瘍の抑制本発明は、癌の遺伝子療法に、新しく効果的なガン抑制
ベクターを提供するものである。この組換えウイルス
は、高力価である、標的範囲が広い、効率的に形質導入
ができる、標的細胞に組み込まれることがないなどの、
アデノウイルスベクターとしての長所を活用しようとす
るものである。本発明の一実施態様においては、増殖欠
損性であり、ヘルパーに依存性がない、アデノウイルス
をつくり、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターの制
御下で野生型ｐ５３（Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３）を発現し
ている。

【００６２】発現ベクターの制御機能は、補乳動物の細
胞中で発現しようとする場合には、ウイルスから与えら
れることが多い。例えば、広く使用されているプロモー
ターはポリオーマ、アデノウイルス２、及びサルウイル
ス４０（ＳＶ４０）から派生されるものである。ＳＶ４
０ウイルスの初期及び後期のプロモーターは、両方とも
ＳＶ４０ウイルスの複製開始点を含有するフラグメント
として容易にウイルスから得ることができて、特に有用
である。ＳＶ４０のフラグメントは、ウイルス複製開始
点に位置するＨｉｎｄIII部位からＢｇ１Ｉ部位の方向
に伸びている約２５０ｂｐの配列を含んでいさえすれ
ば、小さくとも、大きくとも、どちらでも使用するのに
差し支えはない。さらに、プロモーター配列や制御配列
は、制御配列が宿主細胞のシステムと適合すれば、通常
は、含まれている遺伝子配列と結合したままで使用する
ことができるし、また、その方が望ましい。

【００６３】複製開始点は、ＳＶ４０あるいは他のウイ
ルス（例えば、ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）
から派生されるような外因性の開始点を含むベクターを
構成して得ることができるし、また宿主細胞の染色体複
製メカニズムから得ることもできる。ベクターが宿主細
胞の染色体に組み込まれている場合には、それで充分で
ある場合が多い。

【００６４】好ましいｐ５３アデノウイルスの増殖デザ
インは図１の図表にしてある。これについて、組換えア
デノウイルスの増殖及び同定の改良プロトコルが開発さ
れている（以下で説明する）。同定後、図２に示すよう
なＰＣＲ解析によりｐ５３組換えアデノウイルスの構造
を確認した。この構造を単離して確認した後、このｐ５
３アデノウイルスを使って、ホモ接合ｐ５３遺伝子を欠
失させたヒト肺癌細胞系Ｈ３５８に感染させた。ウェス
タンブロット法により、この外因性ｐ５３タンパク質が
高濃度で発現し（図４及び図５）、感染３日後でピーク
に達したこと（図６）が認められた。

【００６５】さらにまた、ｐ５３が点突然変異している
細胞系Ｈ３２２において、変異しているｐ５３が外因性
ｐ５３の発現によって負の調節を受けていることが示さ
れた。実験コントロールとしては、構造がＡｄ５ＣＭＶ
−ｐ５３と似ているビリオン（Ａｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ
２）を使用した。このビリオンは、ラウス肉腫ＬＴＲプ
ロモーターによって制御されたルシフェラーゼｃＤＮＡ
をビリオンの発現カセット中で含有していた。ビリオン
Ａｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２に感染させた細胞中では、ｐ５
３が発現したことも検出されなかったし、アクチンの発
現が変化したことも検出されなかった。Ａｄ５ＣＭＶ−
ｐ５３に感染させたＨ３５８細胞の増殖は、非感染細胞
又はコントロールビリオンに感染させた細胞とは対照的
に、大幅に阻害された（図７Ａ）。ｐ５３ビリオンによ
り、Ｈ３２２細胞の増殖もまた大幅に阻害されたが（図
７Ｂ）、野生型ｐ５３を含有するヒト肺癌Ｈ４６０細胞
では影響が少なかった（図７Ｃ）。

【００６６】in vitroにおいて、肺癌細胞の増殖に対し
て、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３の仲介による強力な抑制効果
が認められた。ＭＯＩが１ＰＦＵ／細胞以下のＡｄ５Ｃ
ＭＶ−ｐ５３で細胞を感染させた場合、増殖抑制はそれ
ほど明らがではなかった。ところが、ＭＯＩが１００Ｐ
ＦＵ／細胞以上であると、コントロールウイルスである
Ａｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２おいてさえ細胞毒性が認められ
た。本発明者らの研究において、成長速度実験で用いた
至適用量は、１０〜５０ＰＦＵ／細胞であった。この用
量範囲ならば、細胞増殖の抑制はｐ５３タンパク質の発
現によるものであるとすることができた。

【００６７】ヌードマウスを用いる実験において、Ｈ３
５８細胞をＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３で処理することによっ
て、腫瘍形成を大幅に抑制したことが認められた。ヒト
の同所性肺癌のマウスモデルにおいて、ウイルス処理の
３日前に、ｐ５３が点突然変異している腫瘍形成性Ｈ２
２６Ｂｒ細胞を気管支内に接種した。このモデルシステ
ムにＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３を気管支内滴注することによ
り腫瘍形成を防止した。このことから、修飾されたアデ
ノウイルスは、ヒトの癌細胞内でガン抑制遺伝子の伝達
及び発現を仲介する効率的なベクターであり、Ａｄ５Ｃ
ＭＶ−ｐ５３ウイルスは、今後さらに癌遺伝子療法で使
用する治療剤に開発できることが示唆されている。

【００６８】ヒト肺癌細胞内でＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３の
仲介により、高濃度のｐ５３遺伝子が発現したことがウ
ェスタンブロット法解析で証明されている。外因性ｐ５
３タンパク質の検出量は、Ｈ４６０細胞の場合では内因
性野生型ｐ５３の約１４倍、Ｈ３５８細胞の場合ではイ
ンターナルコントロールであるβアクチンの約２〜４倍
であった。高濃度で発現された理由は、（１）遺伝子の
伝達が非常に効率的であった、（２）強力なＣＭＶプロ
モーターがｐ５３ｃのＤＮＡを発現させた（３）アデノ
ウイルスＥ１エンハンサーがｐ５３のｃＤＮＡの転写を
増強したことが挙げられる。感染後のｐ５３発現の持続
時間は、Ｈ３５８細胞の場合１５日以上であった。しか
しながら、感染５日後以降では発現が急速に減衰した。
感染Ｈ３５８細胞からＤＮＡサンプルを採取してＰＣＲ
解析を行ったところ、タンパク質濃度が低下するにつれ
て、ウイルスＤＮＡの濃度も低下することが認められ、
invitroでは癌細胞が増殖を続けている間中、ウイルス
のＤＮＡが失われていくことを示していた。

【００６９】従前から宿主細胞が仲介してＣＭＶプロモ
ーターが閉止する（CMV promoter shutoff）現象が報告
されていたことから、ｐ５３の発現を制御しているＣＭ
Ｖプロモーターが細胞内で減衰するのでｐ５３の発現も
低下して行くとも考えられる（Dai et al.，1992）。ア
デノウイルスベクターは、宿主遺伝子に組み込まれない
遺伝子伝達ベクターである。したがって、遺伝子発現の
持続時間は、宿主細胞、伝達される遺伝子、及び関連す
るプロモーターを始めとする多数の要因に依存してい
る。Crystalらは感染６週間後においてすら、コットン
ラットの上皮細胞における嚢胞性腺維症の膜内外伝導調
整遺伝子が低濃度の発現をしているのを証明した（Rose
nfeld et al.，1992）。また、Perricaudetの研究所で
は、ｍｄｘマウスの筋肉のミニジストロフィンが感染後
３ケ月以上も最低限度の発現を続けていたことを証明し
た。本実験で観察されたように、野生型ｐ５３タンパク
質が高濃度で短時間発現することにより、Ａｄ５ＣＭＶ
−ｐ５３によってin vivo処理した後では、副作用が少
ないという利益効果が生まれる。

【００７０】本明細書で開示した実験では、ｐ５３組換
えアデノウイルスは、腫瘍細胞がｐ５３タンパク質の機
能を回復するためと考えられる腫瘍抑制特性を持つこと
を示している。これらの実験結果は、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ
５３ビリオンを癌治療の治療剤として使用することを支
持している。

【００７１】Ｆ．組換えアデノウイルス増殖同定の改
良プロトコル新しい遺伝子伝達システムとしての組換えアデノウイル
スには、遺伝子療法やワクチンの開発の多くの面で適用
される可能性がある。このような分子生物学の分野で
は、組換えアデノウイルスの増殖が重要な用具である。
組換えアデノウイルスの現在の増殖方法は、リン酸カル
シウム沈澱を仲介として２９３細胞内にトランスフェク
ションした後、トランスフェクションした細胞をプラー
ク検定することからなる。この方法のトランスフェクシ
ョンの効率には改良する余地があり、また、操作手続き
もより簡単化する必要がある。

【００７２】本発明以前では、組換えアデノウイルスの
増殖は、常套的にリン酸カルシウムを介してトランスフ
ェクションを行うことにより実施されてきた。この方法
は細胞を、リン酸カルシウム中でベクター又はプラスミ
ドＤＮＡに数時間さらした後、例えば、１５％グリセロ
ールに１分間つけるなど、短時間のショック処理を行う
ことからなる。この方法は細胞に取り入れられるＤＮＡ
の濃度が低い、つまり極めて効率の悪いトランスフェク
ション手段であるという著しい欠点がある。ウイルスが
増殖したことは、ウイルスの増殖に起因する細胞溶解を
示す、溶解した細胞の周囲に、清澄な丸い区域となって
いるプラークが見えることで判断することができる。

【００７３】本発明者らは、トランスフェクション効率
を著しく向上し、選択も簡単化にできる新規なアデノウ
イルス製造方法を開発した。本発明者らは、ＤＯＴＡＰ
を介するトランスフェクションなどの、リポソームを介
するトランスフェクションと、細胞変性効果（ＣＰＥ）
の観察とを組み合わせると、効率は向上し、検出も迅速
で簡単化できることを見いだした。新方法では、リポソ
ームＤＯＴＡＰを介して遺伝子を伝達して、発現ベクタ
ーと組換えプラスミドを２９３細胞中に形質導入する。
このようにしてトランスフェクションされた細胞は、
０．５％アガロースで表面処理してプラーク検定するの
ではなく、そのまま最小必須培地に維持しておいて細胞
変性効果（ＣＰＥ）を観察する。

【００７４】新方法を用いて、２４ウェルプレートのう
ちウェル２個、及び６０ｍｍ皿５枚のうち３枚に、同時
トランスフェクションして、それぞれ第１０日目と第１
２日目にＣＰＥを発生させる二つの実験を行った。対照
として、リン酸カルシウム沈澱法を用いて、１回当り６
０ｍｍ皿２０枚に同時トランスフェクションさせて、こ
れを３回繰り返したが組換えウイルスを得ることはでき
なかった。ＨｅｐＧ２細胞系とＨｅＬａ細胞系にＤＯＴ
ＡＰが仲介するトランスフェクションを行い、ＣＡＴ
（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）
解析を実施したところ、ＣＡＴ活性はリン酸カルシウム
トランスフェクションの場合の５倍以上高かった。

【００７５】同時トランスフェクション後、アガロース
による表面処理をしないことで操作手続きが簡単になっ
た。インキュベート１０〜１４日後では、普通は濁って
測定が難しくなるプラークを同定するのではなく、直接
ＣＰＥを観察するだけであるので、この実験の終了点、
つまりウイルスの増殖は、培養後１０〜１４日後に判断
が不明瞭で困難であるプラークを確認するかわりに、Ｃ
ＰＥを直接観察することによってより簡単になった。図
３はＣＰＥによる細胞培養と、ＣＰＥによらない細胞培
養を比較したものである。

【００７６】本発明者らはさらに、ＰＣＲを用いてアデ
ノウイルスの力価を迅速に測定する技術を開発した。こ
の方法はＣＰＥを示す細胞培養物の上澄み液からＤＮＡ
サンプルを採取して、直接ＰＣＲ解析を行うものであ
る。この方法では、便宜上、挿入断片に特異性を持つ配
列を増幅するプライマーと、ウイルスゲノムに特異性を
持つ配列を増幅するプライマーの２組のプライマーを使
用する。本発明者らは、アデノウイルスを細胞培地中に
放出しても、僅か約５０μｌの上澄み液でＤＮＡテンプ
レートを作って、ＰＣＲにより検出できることを証明し
た。

【００７７】ＰＣＲ増幅を行った挿入断片に特異性を持
つ配列と、ウイルスゲノムに特異性と持つ配列は、例え
ば、アガロースゲル上でＰＣＲ増幅産物を解析すること
により同定する。挿入断片に特異性を持つＤＮＡに対応
するバンド、ウイルスゲノムに特異性と持つＤＮＡに対
応するバンド、及びプライマーに対応するバンドを適当
な標準マーカーと比較して同定する。

【００７８】ＰＣＲにより、挿入断片に特異性を持つ遺
伝子産物と、ウイルスゲノムに特異性を持つ遺伝子産物
を増幅する場合には、増幅すべき配列に特異的なプライ
マーを作成する。挿入断片に特異的な産物の定まった部
分を増幅するプライマーと、ウイルスゲノムに特異的な
産物のセグメントを定めるプライマーの２組のプライマ
ーを用いれば効果的かつ選択的に増幅を達成することが
できる。例として、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭ
Ｖ）プロモーターとＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナ
ルから、ｐ５３発現カセットを構成した。１組のプライ
マーは、ヒトＣＭＶ主要ＩＥ遺伝子プロモーターの第一
イントロンの下流に位置し、もう１組のプライマーは、
ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに位置している。
理想的には、これらのプライマーは両方とも、ｃＤＮＡ
挿入断片、つまりこの実施例ではｐ５３から１５〜２０
ｂｐ離れていることが望ましい。

【００７９】定められたＰＣＲ産物、例えば１．４０ｋ
ｂのｐ５３ｃＤＮＡを選択する。また、例えば、第２組
のプライマーはＡｄ５ゲノムから１１Ｍ.Ｕ.及び１３．
４Ｍ.Ｕ.に位置して、０．８６ｋｂのウイルスゲノムに
特異的なＰＣＲ産物を定めている。

【００８０】プライマーの選択は当業者にとり周知であ
る。塩基対配列が分かっているＤＮＡ配列の部分を選択
して、これを増幅するためのプライマーを構成してもよ
い。

【００８１】プライマーは、ＤＮＡとハイブリッドを形
成して、遺伝子の一部分の合成開始部位となる。

【００８２】ヌクレオチドプライマーは、対合する二本
鎖のそれぞれの部位と結合するように設計され、その間
に入る配列を増幅すべき部分として定めるようにしても
よい。プライマーとして用いるヌクレオチド分子は、一
般に増幅することを所望するＤＮＡセグメントと相補的
な、少なくとも１０ｂｐの配列を含んでいる。１０ｂｐ
の大きさは、一般的な最低限度で、大きさが１０ｂｐよ
り小さいと、ハイブリッド形成が効果的に行えなくな
り、安定性に問題が生じる。好ましくは、１５〜２０ｂ
ｐの大きさを使用する。本発明の最良の実施態様では、
図１に示すプライマーセットを使用しているが、これは
１９ｂｐ又は２０ｂｐの大きさである。

【００８３】Ｇ．患者と治療プロトコル切除不能な閉塞性気管支内癌などのｐ５３に起因する肺
癌患者の細胞に、アデノウイルス−ｐ５３遺伝子構成物
を局所的にデリバリーすることにより、治療有効遺伝子
をデリバリーして臨床疾患を和らげる極めて効果的な方
法となる。このアプローチは、最後の癌細胞まで殺す
か、除くことを意図している現在の癌療法の顕著な改善
である。腫瘍細胞が休眠する現象は立証されており、こ
の減少のために、効果的な殺細胞などあり得るはずがな
い。

【００８４】ＮＳＣＬＣ細胞がアデノウイルス構成物を
取り込むと、この細胞の増殖率が低下する。こうなると
患部の肺が広がったまま（expanded）になっている時間
が長くなり、気管支内の腫瘍の再増殖を防止することが
でき、患者が長く生存できるようになる。

【００８５】切除不能の、気管支内腫瘍が再発し、気道
の一部又は全部を閉塞している患者で、体外からの放射
線治療に効果がなかったか、放射線治療を受けられない
場合には、このプロトコルを考慮する。現在の治療法で
は、このような病状に対しては一時的な抑えができるだ
けである。ほとんどの患者では、体外から放射線治療を
受けていても、癌は再発する。近接照射カテーテル（br
achytherapy catheter）を挿入して、照射療法を追加す
ることもできる。しかしながら、この療法の受診患者の
平均寿命は、６ケ月である。近接照射療法で効果がなか
った患者は、遺伝子療法に適格である。この場合、先ず
レーザー鉗子又は生検鉗子で気道から腫瘍を取り除く。
これをアデノウイルス構成物の注射と併用すると、注射
量を減量することができる。ウイルス構成物の投与をし
ている場合でも、進行性腫瘍の場合は、他の緩和療法を
平行実施してもよい。

【００８６】次の各種実施例は本発明の最良の実施態様
を説明するために記載したものである。当業者は、これ
らの実施例で開示する技術は、本発明者らが本発明の実
施によく機能する技術として発明したもので、したがっ
て、最良の実施態様を構成するものと考えられているこ
とを理解しなくてはならない。しかしながら、当業者
は、本開示に鑑み、本明細書で開示された特定の実施態
様を数多く変更して、同様の結果を得たとしても、これ
らの変更は本発明の精神及び範囲内であることを理解し
なければならない。

【００８７】例１ｐ５３発現ベクターの構成本実施例ではｐ５３発現ベクターの構成を説明する。こ
のベクターは次の通りに構成して、アデノウイルス株Ａ
ｄ５ゲノムのＥ１領域（１．３〜９．２ｍ.ｕ.）を置換
するのに用い、さらにまた例２で説明するアデノウイル
スビリオンの構成にも使用する。

【００８８】図１に示す、ヒトサイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）プロモーター（Boshart etal.，1985）、ｐ
５３ｃＤＮＡ、及び、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグ
ナルを含有するｐ５３発現カセットを、ｐｘＣＪＬ１
（Dr．Frank L．Graham，McMaster University，Canada
から恵贈）のＸｂａＩ部位とＣｌａＩ部位との間に挿入
した。

【００８９】ゲノムの大きさは、約３５．４ｋｂで、こ
れは図単位に換算すると、１００ｍｕ.（１ｍ.ｕ.＝
０．３５ｋｂ）となる。ｐ５３発現体カセットはＡｄ５
ゲノムのＥ１領域（１．３〜９．２ｍ.ｕ.）を置換し
た。

【００９０】プライマー１の配列は、５’−ＧＧＣＣＣ
ＡＣＣＣＣＣＴＴＧＧＣＴＴＣ−３’（配列番号１）で
あって、ヒトＣＭＶ主要ＩＥ遺伝子プロモーター（Bosh
art，et al.，1985）の第１イントロンの下流に位置し
ている。プライマー２の配列は、５’−ＴＴＧＴＡＡＣ
ＣＡＴＴＡＴＡＡＧＣＴＧＣ−３’（配列番号２）であ
って、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに位置して
いる。これらのプライマーはいずれも、その両端がｐ５
３ｃＤＮＡ挿入断片から１５〜２０ｂｐだけ離れてい
て、１．４０ｋｂのＰＣＲ産物を定めている。プライマ
ー３の配列は、５’−ＴＣＧＴＴＴＣＴＣＡＧＣＡＧＣ
ＴＧＴＴＧ−３’（配列番号３）、プライマー４の配列
は、５’−ＣＡＴＣＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＣＧＴＧＧ
−３’（配列番号４）であって、Ａｄ５ゲノムの各々１
１ｍ.ｕ.及び１３．４ｍ.ｕ.に位置し、０．８６ｋｂの
ウイルスゲノムに特異的なＰＣＲ産物を定めている。

【００９１】例２組換えｐ５３アデノウイルスの産生
及び増殖本実施例では、ｐ５３を発現する、ヘルパー依存性がな
い組換えアデノウイルスを産生する好適な方法を説明す
る。この方法は、アデノウイルスのパッケージングには
限りがあるため、ｐＪＭ１７は、自らウイルスを形成で
きない事実を基本にして、組換えアデノウイルス産生の
分子戦略を組み立てている。したがって、トランスフェ
クションされた細胞内でｐ５３発現ベクタープラスミド
と、ｐＪＭ１７とを相同組換えして、必要なアデノウイ
ルスタンパク質を発現する細胞だけに、パッケージング
されることができる生ウイルスをつくることができる。

【００９２】本実施例の方法は、宿主細胞として２９３
細胞を使って、異種ＤＮＡ発現カセットがＥ１領域又は
Ｅ３領域を置換しているウイルスを増殖するものであ
る。この工程では、ＤＮＡを２９３細胞内に同時トラン
スフェクションする必要がある。ウイルス増殖の効率
は、主としてこのトランスフェクションで決められる。
本発明以前では、ＤＮＡを２９３細胞にトランスフェク
ションする方法は、通常、リン酸カルシウム／ＤＮＡ共
沈澱法であった（Graham and van der Eb，1973）。し
かしながら、この方法とプラーク検定法を併用すること
は比較的に難しいし、また、ウイルス増殖の効率が低い
のが通例である。本実施例で説明するように、リポソー
ムを介したトランスフェククションを行い、トランスフ
ェクションされた細胞を細胞変性効果（ＣＰＥ）で同定
することにより、トランスフェクションとその後のトラ
ンスフェクションされた細胞の同定を著しく改良させる
ことができる。

【００９３】２９３細胞系は、加熱により失活させたウ
マ血清１０％を加えたダルベッコ改良最小必須培地中に
維持された。相同組換えするｐ５３発現ベクターと、プ
ラスミドｐＪＭ１７（Mcgrory，et al.，1988）とは、
メーカーのプロトコル（Boehringer Mannheim Biochemi
cals，1992）に従って、ＤＯＴＡＰを介したトランスフ
ェクションににより、２９３細胞中に同時トランスフェ
クションした。この概略図を図１に示す。

【００９４】２９３細胞（継代３５、６０％集密的）
は、トランスフェクションの２４時間前に６０ｍｍ皿
か、２４ウェルプレートのいずれかに接種した。ウェル
各々の細胞は、ＤＯＴＡＰを３０μｌ、ｐ５３発現ベク
ターを２μｇ、及びプラスミドｐＪＭ１７を３μｇをそ
れぞれ添加して、トランスフェクションした。トランス
フェクション後からＣＰＥの開始まで、２〜３日毎に最
小必須培地を細胞に供給した。

【００９５】例３組換えアデノウイルスの同定本実施例では、適当な細胞系で同時トランスフェクショ
ンを実施した後、組換えビリオンを同定を確認する新し
いポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）検定を説明する。

【００９６】実験プレートから細胞培養物の上澄み液の
アリコート（５０〜３７０μｌ）を採取し、プロテイナ
ーゼＫ（０．５％のＳＤＳと２０ｍＭのＥＤＴＡを含有
する５０μｇ／ｍｌ）により５６℃で１時間処理して、
フェノール−クロロホルムで抽出し、核酸をエタノール
沈澱させた。ＤＮＡペレットは２０μｌのｄＨ2Ｏ中に
再懸濁して、ＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用し
た。各種ＰＣＲプライマーの相対的位置とその配列を図
１に掲げる。これらの配列はそれぞれ、配列番号１、
２、３及び４である。ｃＤＮＡ挿入断片に特異的なプラ
イマーは、１．４ｋｂのＰＣＲ産物を定め、ウイルスゲ
ノムに特異的なプライマーは、０．８６ｋｂのＰＣＲ産
物を定めている。ＰＣＲ反応は、ＭｇＣｌ2を４ｍＭ、
ＫＣｌを５０ｍＭ、トリトンＸ−１００を０．１％、ｄ
ＮＴＰｓそれぞれ２００μＭづつ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ９．０）を１０ｍＭ、プライマーそれぞれ２μＭ
づつ、及びＴａｑポリメラーゼ（Promega）を１．０単
位含有する５０μｌ容量内で実施した。反応は、９４℃
で０．５分、５６℃で０．５分、及び７２℃で１分、３
０サイクル行った。

【００９７】新しく増殖した組換えウイルスの同定方法
を簡単化するため、細胞培養物の上澄み液から採取した
ＤＮＡサンプルを直接ＰＣＲ検定する検定法を開発し
た。ＣＰＥを起こしている細胞の培地から上澄み液のア
リコート（５０又は３７０μｌ）を取り、プロテイナー
ゼＫで処理し、フェノール／クロロホルムで抽出した。

【００９８】エタノール沈澱の後、２組のプライマーを
使ってＰＣＲ解析を行い、挿入断片に特異的な配列と、
ウイルスゲノムに特異的な配列を増幅した。ＰＣＲプラ
イマーの標的とその配列を図１に示す。プライマー１、
２、３、及び、４は、それぞれ配列番号１、２、３、及
び、４で表される。

【００９９】その結果、１．４ｋｂのｃＤＮＡ挿入断片
と０．８６ｋｂのウイルスゲノムフラグメントは、発現
ベクター（ポジティブコントロール）と陽性の細胞培養
物のＤＮＡサンプルから増幅された（図２ＢＮそれぞれ
レーン１及び４）。０．８６ｋｂのフラグメントだけ
が、Ａｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２ウイルス（ネガティブコン
トロール、レーン２）のＤＮＡサンプルから増幅した。
未処理の陽性の細胞培地の上澄み液を取って、ＰＣＲ反
応を行ったが、いずれの場合も増幅されたバンドは現れ
なかった（レーン３）。

【０１００】これらの実験結果は、細胞培地の上澄み液
を僅か５０μｌ使ってＤＮＡテンプレートをつくること
により、細胞培地に放出されたアデノウイルスが検出可
能であることを示している。また、これらの実験結果か
ら、アデノウイルスの力価を、これまで行われてきたプ
ラーク検定にかわり、この技術によって測定する定量法
を開発することができることがわかる。

【０１０１】Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ウイルスＤＮＡをＣ
ｓＣｌ勾配法により精製して、ジデオキシＤＮＡ配列決
定法により、これが野生型配列のｐ５３ｃＤＮＡである
ことを確認した。同様にして、コントロールウイルスで
あるＡｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２を産生したが、発現カセッ
ト中でラウス肉腫ウイルスプロモーターとルシフェラー
ゼｃＤＮＡが使われている以外は、構造がＡｄ５ＣＭＶ
−ｐ５３に類似している。大腸菌β−ガラクトシダーゼ
遺伝子（ＬａｃＺ）を担持する組換えアデノウイルスで
あるＡｄ５ＣＭＶ−ＬａｃＺも、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３
に類似する構造である。このＡｄ５ＣＭＶ−ＬａｃＺ
は、Dr．Frank L．Grahamから恵贈された。

【０１０２】ウイルス株、力価及び感染。Graham and P
revecの方法（1991）によりプラーク精製をおこなっ
て、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３、Ａｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２、
及び、Ａｄ５ＣＭＶ−ＬａｃＺそれぞれのクローンをつ
くった。１個のウイルスクローンを２９３細胞で増殖さ
せた。完全な細胞変性効果を示している２９３細胞の培
地を集めて、１０００Ｘｇで１０分間遠心分離した。上
澄み液をプールして、等分し、ウイルス株として−２０
℃で保存した。ウイルスの力価はプラーク測定法（Grah
am and Prevec，1991）により測定した。単層に蒔いた
細胞にウイルス溶液（６０ｍｍ皿毎に０．５ｍｌ）を添
加して、５分毎に短時間攪伴しながら室温で３０分間イ
ンキュベートして細胞系を感染させた。その後、培地を
添加して、感染細胞を３７℃のインキュベーター中に入
れた。

【０１０３】Ｈ２２６Ｂｒ、Ｈ３２２、Ｈ４６０、Ｈｅ
ｌａ、ＨｅｐＧ２、ＬＭ２や、Ｖｅｒｏなどの各種細
胞系にＡｄ５ＣＭＶ−ＬａｃＺを用いて、組換えアデノ
ウイルスによる遺伝子伝達の効率を評価した。ＭＯＩが
３０ＰＦＵ／細胞でＡｄ５ＣＭＶ−ＬａｃＺに細胞系を
感染した後、Ｘ−ｇａｌで染色したところ、すべての細
胞系の９７〜１００％がブルーに染まっていたのが認め
られた。

【０１０４】例４ヒト肺癌細胞においてＡｄ５ＣＭＶ
−ｐ５３が誘導するｐ５３遺伝子の発現本実施例では、ホモ接合でｐ５３遺伝子が欠失している
ヒト肺癌細胞に、組換えｐ５３アデノウイルスを感染さ
せることを説明する。この実験結果では、これら細胞の
増殖と変異株ｐ５３の発現が抑制され、Ａｄ５ＣＭＶ−
ｐ５３ビリオンが転移細胞の制御に有用な薬剤であるこ
とを示していた。

【０１０５】単層にした感染細胞を３．８％ホルマリン
で固定し、３％Ｈ₂Ｏ₂を含むメタノールで５分間処理し
たものについて、免疫組織化学解析を行った。この免疫
組織化学解析は、Vectastain Elite kit（Vector，Burl
ingame，CA）を用いて実施した。この解析に用いた一次
抗体は、抗ｐ５３抗体ＰＡｂ１８０１（Oncogene Scie
nce，Manhasset，NY）であった。また、ネガティブコン
トロールとしてＭＯＰＣ−２１（Organonn Teknika Cor
p.，West Chester，PA）を使用した。二次抗体はアビジ
ンで標識した抗マウスＩｇＧ（Vector）であった。ま
た、ビオチン化したホースラディッシュペルオキシダー
ゼＡＢＣ複合試薬を用いて、抗原抗体複合物を検出し
た。最後に、細胞をHarrisヘマトキシリン（Sigma）で
対比染色して、Cytoseal 60（Stephens Scientific，Ri
verdale，NJ）でマウントした。

【０１０６】感染細胞系の免疫組織化学解析を行うこと
により、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ウイルスのＣＭＶプロモ
ーターに制御されるｐ５３発現のin situにおける発現
を検討した。ホモ接合でｐ５３が欠失しているＨ３５８
細胞系では、３０〜５０プラーク形成単位（ＰＦＵ）／
細胞の多重感染度で、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３に感染させ
たとき、免疫組織化学解析で検出したように、ｐ５３遺
伝子が効率９７〜１００％で伝達されているのが認めら
れた（図４）。

【０１０７】ヒトＣＭＶＩＥプロモーターによって転写
されたＬａｃＺ遺伝子を担持しているウイルスであるＡ
ｄ５ＣＭＶ−ＬａｃＺで確認した時にも、組換えアデノ
ウイルスによる高い伝達効率が認められた。３０〜５０
ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでは、Ｈｅｌａ、ＨｅｐＧ２、
ＬＭ２、及び、ヒトＮＳＣＬＣ癌細胞系を含む、試験さ
れたすべての細胞系の９７〜１００％において、Ｘ−ｇ
ａｌ染色法によるβ−ガラクトシダーゼ活性が陽性であ
った。アデノウイルスベクターは、遺伝子をヒト癌細胞
に伝達する効率的な伝達媒体であることを、これらの実
験結果は示している。

【０１０８】単層にした細胞をリン酸緩衝塩類液（ＰＢ
Ｓ）で洗った後、この細胞を皿に入れて、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥサンプル緩衝液（６０ｍｍ皿１枚当り０．５ｍｌ）
で細胞を分解して、全細胞溶解液をつくり、この全細胞
溶解液でウェスタンブロット法解析を行った。ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ解析では、レーンに細胞５×１０⁴個に等しい
細胞溶解液（１０〜１５ｍｌ）をロードした。ゲル中の
タンパク質はＨｙｂｏｎｄ^TM−ＥＣＬ膜に移動させた。
これらの膜は、０．５％のドライミルクを含むＰＢＳで
ブロッキングして、一次抗体として、マウスの抗ヒトｐ
５３モノクローナル抗体Ｐ１８０１、マウスの抗ヒトβ
アクチンモノクローナル抗体（Amersham）でプローブ
し、洗った後、二次抗体としてホースラディッシュペル
オキシダーゼと結合したウサギの抗マウスＩｇＧ（Pier
ce Chemical Co.，Rockford，IL）でプローブした。こ
れらの膜は、Amershamの増強化学ルミネセンスプロトコ
ルにしたがって発色させた。発現した外因性ｐ５３の相
対量はデンシトメーター（Molecular Dynamics Inc，Su
nnyvale，CA）により測定した。

【０１０９】ウェスタンブロット法では、外因性ｐ５３
タンパク質が高濃度で発現したことを示していた（図５
Ａレーン２、３及び５、６）。タンパク質は感染３日
後でピークに達した（図６、挿入断片、０．５日〜３
日）。コントロールとして、例１の組換えＡｄ５ＣＭＶ
−ｐ５３と似た構造を持つビリオンを構成した。このビ
リオンの発現カセットには、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ
プロモーターにより制御されるルシフェラーゼｃＤＮＡ
を含有させた。ビリオンＡｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２に感染
した細胞では、ｐ５３の発現も検出されなかったし、ア
クチンの発現の変化も検出されなかった。

【０１１０】組換えｐ５３アデノウイルスを、次の３つ
のヒト肺癌ＮＳＣＬＣ細胞系に感染させた。ホモ接合で
ｐ５３遺伝子が欠失しているＨ３５８細胞系、コドン２
４８でｐ５３遺伝子が点突然変異（ＧからＴ）している
Ｈ３２２細胞系、及び野生型ｐ５３遺伝子を持っている
Ｈ４６０細胞系である。ウイルス感染２４時間前、６０
ｍｍ培養皿にＨ３２２及びＨ４６０（１×１０⁵）又は
Ｈ３５８（２×１０⁵を接種した後、これらのヒトＮＳ
ＣＬＣ細胞の成長速度を測定した。細胞は、１０ＰＦＵ
／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。さらに、
培地を用いて偽感染コントロール（mock infection con
trol）をつくった。このように、異なった処理条件をお
こなった３組の各細胞系を培養して、感染後１〜６日間
細胞数を毎日計数した。

【０１１１】Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３に感染したＨ３５８
は、非感染細胞やコントロールビリオン感染細胞とは対
照的に、増殖が大幅に抑制された（図７Ａ）。Ｈ３２２
細胞の増殖もｐ５３ビリオンによって大幅に抑制された
が（図７Ｂ）、野生型ｐ５３を含有するヒト肺癌Ｈ４６
０細胞に対する影響は小さかった（図７Ｃ）。Ａｄ５Ｃ
ＭＶ−ｐ５３ウイルスに感染したＨ３５８細胞の７９％
は、増殖が抑制されたが、非感染細胞とコントロールウ
イルス感染細胞の増殖は、抑制されなかった。

【０１１２】ｐ５３が点突然変異をしているＨ３２２細
胞系の７２％は、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３によって増殖が
抑制されたが、このウイルスの野生型ｐ５３を含有する
Ｈ４６０細胞系の増殖に対する影響は小さかった（２８
％が抑制された）。

【０１１３】これらの結果は、ｐ５３組換えアデノウイ
ルスは、腫瘍細胞にｐ５３タンパク質の機能を回復させ
ることにより、腫瘍を抑制できることを示している。

【０１１４】例５ｐ５３欠損細胞のＡｄ５ＣＭＶ−
ｐ５３による治療本実施例では、組換えｐ５３アデノウイルスによりin v
ivoで腫瘍細胞に増殖抑制力を回復させて、細胞の悪性
増殖又は転移増殖を治療することに関する。本発明の目
的であるアデノウイルスを介する遺伝子療法によって、
癌を治療する方法を説明する。

【０１１５】１０ＰＦＵ／細胞のＭＯＩで、Ａｄ５ＣＭ
Ｖ−ｐ５３及びＡｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２にＨ３５８細胞
を感染させた。偽感染（mock infection）として、等量
の細胞を培地で処理した。感染２４時間後、処理した細
胞を採取して、ＰＢＳで２回洗った。このように処理し
た細胞は、それぞれ、１匹当り０．１ｍｌ容量に細胞３
百万（３×１０⁶）個加えたものをヌードマウス（Harla
n Co.，Houston，TX）に皮下注射した。ウイルスは、そ
れぞれを、マウス５匹ずつに投与した。マウスには、注
射前に照射（３００ｃＧｙ、60Ｃｏ）を行い、注射後は
毎週検査を行った。腫瘍形成の評価は、６週間の末日に
行った。腫瘍の体積は、断面の直径の積の平方根を求
め、この平方根を平均直径とする球体を腫瘍の体積と想
定して計算した。

【０１１６】Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３を介した、腫瘍形成
に対する抑制効果を測定するため、ヌードマウスにＨ３
５８細胞（ヒトＮＳＣＬＣ型細胞）を皮下注射して、新
生物形成増殖を誘発した。１０ＰＦＵ／細胞でＡｄ５Ｃ
ＭＶ−ｐ５３又はＡｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２に２４時間感
染させた細胞を、マウスそれぞれに１回注射した。培地
のみで処理したＨ３５８細胞は、偽感染コントロールと
して使用した。偽感染細胞、及びコントトールウイルス
感染細胞の場合には、表１に示すように感染１４日後
で、腫瘍が触知できるようになった。

【０１１７】

【表１】

【０１１８】表１に示す通り、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３で
処理した細胞を投与されたマウスには、腫瘍は形成され
なかった。６週間の末日において、腫瘍は直径４〜１０
ｍｍであった。この実験は１群マウス５匹で開始した
が、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３群、及びＡｄ５／ＲＳＶ／Ｇ
Ｌ２群の各々１匹のマウスは、恐らく院内感染のため実
験終了前に死亡した。

【０１１９】例６肺癌治療とＡｄ５ＣＭＶ−Ｐ５３本実施例では、組換えｐ５３アデノウイルスを用いてin
vivoで腫瘍細胞に増殖抑制力を回復させて、動物の癌
を治療することに関する。本発明の目的であるアデノウ
イルスを介した遺伝子療法によって、癌を治療する方法
を説明する。

【０１２０】同所性ヒト肺癌のマウスモデルにより、Ａ
ｄ５ＣＭＶ−ｐ５３の腫瘍形成を抑制する効能をさらに
評価した。Ｈ３５９細胞とＨ３２２細胞はこのモデルで
腫瘍を形成しなかったので、Ｈ２２６Ｂｒ細胞系を使用
した。この細胞系の由来は肺鱗状癌（squamous lung ca
ncer）で、肺から脳へ転移したものである。また、この
Ｈ２２６Ｂｒは、ｐ５３遺伝子のエクソン７、コドン２
５４で点突然変異（ＡＴＣからＧＴＣ）していて、マウ
スにおいて腫瘍形成性である。

【０１２１】同所性ヒト肺癌のマウスモデルの試験方法
は、前報により報告されていた（Georges，et al.，199
3）。簡単に言うと、ヌードマウスを放射線処理（３０
０ｃＧｙ、⁶⁰Ｃｏ）して、Ｈ２２６Ｂｒ細胞を気管支内
滴注により接種した。滴注量はマウス１匹当り、０．１
ｍｌ容量のＰＢＳに細胞２×１０⁶個を添加したものを
投与した。接種３日後、１群当り１０匹のマウスにウイ
ルス又はビヒクル（ＰＢＳ）０．１ｍｌを１日１回、２
日間気管支内滴注した。この時のウイルス投与量は、マ
ウス１匹当り５×１０⁷個のＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３又は
Ａｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２であった。マウスは６週間の末
日に殺した。肺組織及び中隔膜組織を切除して、腫瘍の
大きさを測定することにより腫瘍形成を評価した。腫瘍
塊の切片を組織学的に解析して、腫瘍であることを確認
した。

【０１２２】ヌードマウスを照射した後、Ｈ２２６Ｂｒ
細胞をマウス１匹当り２×１０⁶個、気管支内滴注によ
り接種した。接種３日後、マウスそれぞれに（１群当り
８〜１０匹）Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３又はＡｄ５／ＲＳＶ
／ＧＬ２又はビヒクル（ＰＢＳ）のいずれか０．１ｍｌ
を１日１回、２日間気管支内滴注した。ウイルス投与量
は、マウス１匹当り５×１０⁷ＰＦＵであった。６週間
の末日に、肺組織と中隔膜組織を切除して、腫瘍の大き
さを測定することにより、腫瘍形成を評価した。この試
験方法のフローチャートを図８に示し、切除した代表的
なサンプルを図９に掲げる。検出した腫瘍は、組織学的
な解析により確認した。腫瘍の寸法データを表２に示
す。

【０１２３】

【表２】

【０１２４】Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３で治療したマウスの
うち、腫瘍を形成したものは２５％に過ぎなかったが、
ビヒクルコントロール又はＡｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２コン
トロールで治療したマウスのうち、７０〜８０％が腫瘍
を形成した。Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３群の腫瘍の大きさ
は、コントロール群より著しく小さかった。これらの結
果は、同所性ヒト肺癌のマウスモデルにおいて、Ａｄ５
ＣＭＶ−ｐ５３がＨ２２６Ｂｒによる腫瘍形成を防止で
きることを示している。

【０１２５】例７Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３と臨床治療言うまでもなく、例５及び例６で説明したような動物モ
デルは、前臨床実験の一部として実施されるものであ
る。臨床段階に入ると、患者毎にアデノウイルスを介し
た遺伝子伝達療法の適用を決定し、体内にアデノウイル
スに特異的な抗体が存在するか、否かの試験を行う。抗
体が存在しているか、あるいは過去に薬剤又は天然物質
に対するアレルギーの病歴がある場合には、綿密な臨床
観察下で１０³〜１０⁶程度の投与量で組換えアデノウイ
ルスの試験的投与を行うのがよい。

【０１２６】Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３による癌治療では、
ＣＭＶプロモーターなどの好適なプロモーター／エンハ
ンサー要素の制御により、組換えアデノウイルスがｐ５
３を発現する。したがって、ＦＤＡ（Food and Drug Ad
ministration）が人体への投与を許容する方法により、
Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３を製造し、精製しなければならな
い。このような方法としては、先ず、塩化セシウム密度
勾配遠心法を行い、これに続いて効果及び純度試験を行
うことを含むが、これのみに限らない。

【０１２７】ｐ５３アデノウイルス治療方法には、直接
投与又は局所投与と、より全身型の投与との、二つの好
適な基本的方法がある。これらの方法によって、ｐ５３
の変異に起因することで知られている各種の異なる癌を
好適に治療することができる。全身投与としては、アデ
ノウイルスを簡単に静脈内注射して、注射部位から遠い
組織部位をウイルスに感染させることができ（Stratfor
d-Perricaudet et al.，1991）、したがって、ｐ５３に
起因するすべての悪性腫瘍の治療に好適である。ウイル
スの静脈内注射用剤形としては、薬理的に許容できる溶
液でもよいし、また、時間をかけて投与する注入剤でも
よい。一般的に言って、機能を持つウイルス粒子を投与
する場合、効果がある粒子数は１×１０¹⁰〜５×１０¹²
であると信じられている。

【０１２８】特に、肺癌の場合、もし所望なら、組換え
アデノウイルスを物理的に直接に標的とすることができ
るが、このような場合、嚢胞性線維症の膜内外伝導調整
遺伝子の気管支内投与と同様にして目的を達することが
できる（Rosenfeld et al.，1992）。この場合、組換え
ｐ５３アデノウイルスは標的細胞の部位近くにデリバリ
ーされる。

【０１２９】より詳しく言えば、次の方針にしたがって
好ましい治療プロトコルを作成する。患者は先ず、気管
支鏡検査を受けて、狭窄の程度を見積る。内視鏡的に腫
瘍を可能な限り大きく切除する。気管支鏡検査法受診の
際は、局所又は全身麻酔を施術することが望ましい。St
ifcor^TMトランス気管支鏡吸引針（Stifcor^TMtransbronc
hial aspiration needle）（２１ｇ）を気管支鏡の生検
チャンネルに通すことができる。こうした後、約１０ｍ
ｌ以下程度の少量のｐ５３アデノウイルスを残存腫瘍部
位に注射する。

【０１３０】使用するアデノウイルスは、複製を行うこ
とができないので、ウイルスそのものが患者の健康に有
害な影響を与えることはない。しかしながら、患者は治
療中少なくとも４８時間は入院して、急性副作用や、遅
延性副作用をモニターする。

【０１３１】過去において増殖欠損性アデノウイルスを
ヒトの遺伝子伝達媒体として使用する安全性について、
懸念が表明されたこともあったが（Rosenfeld et al.，
1992）、アデノウイルスの投与量を適当にモニターし
て、好ましからざる副作用の機会をさらに減ずる。

【０１３２】反応の必要性が存在しているか、否か、あ
るいは、毒性が存在しているか、否かを判断する規準に
はいろいろとある。毒性の存在の判断規準の一助とし
て、治療開始前に、腫瘍床（tumor bed）の写真をとっ
ておき、長径と垂線を測っておく。大きさは直径の積と
して記録する。腫瘍が再び成長を始めたら、これらのデ
ータから再生速度を計算することができる。

【０１３３】疾患が進行性に転ずる時期も、最初の観察
値から腫瘍の体積の減少値を引く計算を繰り返して、進
行性疾患の徴候を得ることによって判定する。進行性疾
患とは、病巣を測定して、直径の積の値が≧２５％増加
していることを言う。進行性疾患であると判定する前
に、患者に少なくとも２コースの治療を実施する。患者
の生存日数はプロトコル開始の日から計算する。

【０１３４】追跡検査には、癌治療で日常的に行われて
いる検査をすべて含める。これには、例えば臨床徴候の
モニター、及び、各種ｐ５３遺伝子の発現パターンを検
討する標準解析、分子生物解析のための生検材料の採取
を含む。これらの解析では、さらに、伝達された遺伝子
を取り込んだ細胞数、in vivoにおけるプロモーターの
相対強度などについての情報を提供できるようにしても
よい。このようにして得たデータに基づいて、治療方法
の調整を行うことが望ましい。治療方法の調整は、異な
るプロモーターをもつアデノウイルス構成物、感染した
ほとんど腫瘍細胞、又はすべての腫瘍細胞が組換え遺伝
子の非生理的な過剰発現を起こさないように、注射する
ＰＦＵを変えることなどを含む。

【０１３５】in vivoにおいて、アデノウイルスが伝達
した外因性遺伝子の発現は、長期間持続することができ
ると考えられる。ウイルスが伝達した外因性遺伝子の発
現が長期間持続し、しかも、治療上の有効性を維持する
ためには、場合に応じて管理しなくてはならない。遺伝
障害の改良に要求される発現レベルは、他の疾患を完治
するのに要求されるレベルとかなり異なるために、マー
カー遺伝子は、遺伝子の発現の治療持続性を見積もるの
には、有効性において限りがある。

【０１３６】最良の実施態様に関連して、本発明の組成
物と方法を説明したが、説明した組成物、方法、及び方
法からなる工程又は一連の工程を変更することはできる
が、これらの変更も本発明の概念、精神及び範囲内であ
ることは、当業者にとって明白である。より詳しく言え
ば、本発明で説明した薬剤を、化学的及び生理的関連が
ある特定の薬剤で置換して、同一又は類似の結果を得る
ことができることは明白である。当業者にとって明白で
ある、このような類似する置換及び変更は、以下に述べ
る請求の範囲で定義されている本発明の精神、範囲及び
概念内であるものと見なす。請求されている事項及び方
法は、過度の実験を行うことなく、製造及び実施するこ
とができる。

【０１３７】

【表３】

【表３（つづき）】

【０１３８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Board of Regents, The University of Texas System <120> Recombinant p53 adenovirus <130> 8-145div <150> US 08/145,826 <151> 1993-10-29 <160> 4 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 1 ggcccacccc cttggcttc 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 2 ttgtaaccat tataagctgc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 3 tcgtttctca gcagctgttg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 4 catctgaact caaagcgtgg 20

【図面の簡単な説明】

次に掲げる図面は本明細書を構成する一部であって、本
発明の特定の実施態様をさらによく説明するために掲載
したものである。以下に開示する特定の実施態様の詳細
な説明と、これら図面のうち一以上を併せて参照すれ
ば、本発明をよく理解することができる。

【図１】図１は、組換えｐ５３アデノウイルスの産生の
ための図である。ｐ５３発現カセットをｐＸＣＪＬ．１
のＸｂａＩ部位とＣｌａＩ部位の間に挿入した。ｐ５３
発現ベクター（ｐＥＣ５３）と組換えプラスミドｐＪＭ
１７を、２９３細胞中に同時トランスフェクションし
た。トランスフェクションした細胞は、細胞変性効果が
開始されるまで培地に維持された。新しく産生されたｐ
５３組換えアデノウイルス（Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３）
は、ＣＰＥ上澄み液をプロテイナーゼＫで処理し、フェ
ノールで抽出して作成したＤＮＡテンプレートを用い、
ＤＮＡをＰＣＲで解析することにより同定した。

【図２Ａ】図２Ａは、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ＤＮＡの構
造解析に使用した地図を示している。これは、ｐ５３発
現カセットの位置、ＰＣＲプライマー及び制限部位を示
す、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ゲノムＤＮＡの地図である。
ゲノムの大きさは約３５．４ｋｂで、１００地図単位
（maps unit）（１ｍ.ｕ.＝０．３５ｋｂ）に目盛りを
付けることができる。ｐ５３発現カセットは、Ａｄ５ゲ
ノムのＥ１領域（１．３〜９．２ｍ.ｕ.）を置換した。
プライマー１は、ヒトＣＭＶ主要ＩＥ遺伝子プロモータ
ーの第一イントロンの下流に位置している。プライマー
２は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル中に位置し
ている。両プライマーとも両端は、ｐ３５ｃＤＮＡ挿入
断片から１５〜２０ｂｐ離れて、１．４０ｋｂのＰＣＲ
産物の周囲を定めている。プライマー３と４とは、Ａｄ
５ゲノムから各々１１ｍ.ｕと１３．４ｍ.ｕ.に位置
し、０．８６ｋｂのウイルスゲノム特異的ＰＣＲ産物の
周囲を定めている。

【図２Ｂ】図２Ｂは、ＰＣＲ産物のアガロースゲル解析
を示している。各々の反応では、１．４ｋｂ（ｐ５３）
と０．８６ｋｂの（Ａｄ５）ＤＮＡフラグメントを定め
ている２組のプライマーを使用した。各々の反応に使用
したＤＮＡテンプレートは、ｐＥＣ５３プラスミド（レ
ーン１）、Ａｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２ＤＮＡ（レーン
２）、ＤＮＡなし（レーン３）及びＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５
３ＤＮＡ（レーン４）であった。レーン（Ｍ）は分子量
マーカーに対応している。

【図２Ｃ】図２ＣはＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ＤＮＡの制限
地図を示している。ＣｓＣｌ勾配で精製したＡｄ５ＣＭ
Ｖ−ｐ５３ＤＮＡのサンプルを、各々、酵素なし
（Ｕ）、Ｈｉｎｄ III（Ｈ）、ＢａｍＨＩ（Ｂ）、Ｅｃ
ｏＲＩ（Ｅ）、及びＣｌａＩで消化して、１％アガロー
スゲルで解析した。レーン（Ｍ）は分子量マーカーであ
る。

【図３Ａ】図３Ａは、２９３における組換えアデノウイ
ルスによる細胞変性効果の観察結果を示している。ま
た、図３Ａは、２９３細胞の一連の位相差画像（×４０
０）である。図３Ａはトランスフェクション前である。

【図３Ｂ】図３Ｂは、２９３における組換えアデノウイ
ルスによる細胞変性効果の観察結果を示している。ま
た、図３Ｂは、２９３細胞の一連の位相差画像（×４０
０）である。図３Ｂはトランスフェクション後１２日の
ネガティブコントロールである。

【図３Ｃ】図３Ｃは、２９３における組換えアデノウイ
ルスによる細胞変性効果の観察結果を示している。ま
た、図３Ｃは、２９３細胞の一連の位相差画像（×４０
０）である。図３Ｃはトランスフェクション後１２日の
ＣＰＥを開始したものである。

【図３Ｄ】図３Ｄは、２９３における組換えアデノウイ
ルスによる細胞変性効果の観察結果を示している。ま
た、図３Ｄは、２９３細胞の一連の位相差画像（×４０
０）である。図３Ｄはトランスフェクション後１４日の
ＣＰＥを完了したものである。

【図４Ａ】図４Ａは、組換えアデノウイルスに感染した
細胞の免疫組織化学像を示している。図４Ａは、Ｈ３５
８細胞の一連の免疫組織画像である。また、図４Ａは、
Ｈ３５８細胞に対するＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３の感染力を
示したものである。Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３又はＡｄ５／
ＲＳＶ／ＧＬ２をＨ３５８細胞に、５０ＰＦＵ／細胞で
２４時間感染させた。また、培地のみを使用したものを
偽感染（mock infection）として使用した。感染させた
細胞は、免疫染色により解析した。図４Ａは、偽感染を
抗ｐ５３抗体でプローブした結果を示している。使用し
た抗ｐ５３抗体は、Ｐａｂ１８０１であり、染色にはア
ビジン−ビオチン法を用いた。

【図４Ｂ】図４Ｂは、組換えアデノウイルスに感染した
細胞の免疫組織化学像を示している。図４Ｂは、Ｈ３５
８細胞の一連の免疫組織画像である。また、図４Ｂは、
Ｈ３５８細胞に対するＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３の感染力を
示したものである。Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３又はＡｄ５／
ＲＳＶ／ＧＬ２をＨ３５８細胞に、５０ＰＦＵ／細胞で
２４時間感染させた。また、培地のみを使用したものを
偽感染（mock infection）として使用した。感染させた
細胞は、免疫染色により解析した。図４Ｂは、細胞をＡ
ｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２コントロールに感染させて、抗ｐ
５３抗体でプローブした結果を示している。使用した抗
ｐ５３抗体は、Ｐａｂ１８０１であり、染色にはアビジ
ン−ビオチン法を用いた。

【図４Ｃ】図４Ｃは、組換えアデノウイルスに感染した
細胞の免疫組織化学像を示している。図４Ｃは、Ｈ３５
８細胞の一連の免疫組織画像である。また、図４Ｃは、
Ｈ３５８細胞に対するＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３の感染力を
示したものである。Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３又はＡｄ５／
ＲＳＶ／ＧＬ２をＨ３５８細胞に、５０ＰＦＵ／細胞で
２４時間感染させた。また、培地のみを使用したものを
偽感染（mock infection）として使用した。感染させた
細胞は、免疫染色により解析した。図４Ｃは、Ａｄ５Ｃ
ＭＶ−ｐ５３に感染させた細胞を、無関係の抗体（ＭＯ
ＰＣ−２１）でプローブした結果を示している。染色に
はアビジン−ビオチン法を用いた。

【図４Ｄ】図４Ｄは、組換えアデノウイルスに感染した
細胞の免疫組織化学像を示している。図４Ｄは、Ｈ３５
８細胞の一連の免疫組織画像である。また、図４Ｄは、
Ｈ３５８細胞に対するＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３の感染力を
示したものである。Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３又はＡｄ５／
ＲＳＶ／ＧＬ２をＨ３５８細胞に、５０ＰＦＵ／細胞で
２４時間感染させた。また、培地のみを使用したものを
偽感染（mock infection）として使用した。感染させた
細胞は、免疫染色により解析した図４Ｄは、Ａｄ５ＣＭ
Ｖ−ｐ５３に感染させた細胞を、抗ｐ５３抗体でプロー
ブした結果を示している。使用した抗ｐ５３抗体は、Ｐ
ａｂ１８０１であり、染色にはアビジン−ビオチン法を
用いた。

【図５】図５Ａでは、クーマシーブルーで染色したＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより、Ｈ３５８細胞中で発現した外因性
ｐ５３の相対濃度を比較したものである。Ｈ３５８細胞
のサンプルは、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３又はＡｄ５／ＲＳ
Ｖ／ＧＬ２に３０ＰＦＵ／細胞で感染させて、感染２４
時間後及び７２時間後でサンプルとして調製した。ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ解析のクーマシーブルー染色によると、ロ
ードされたタンパク質サンプルの相対量を示すことがで
きる。レーン１と４は、Ａｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２に感染
させた細胞のサンプルである。レーン２と３は、異なる
２つのＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３株それぞれに感染させた細
胞から、感染２４時間後採取したサンプルである。レー
ン５と６は、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３に感染させた細胞か
ら、感染７２時間後採取したサンプルである。レーン７
は、感染７２時間後で採取した偽感染Ｈ３５８のサンプ
ルである。レーンＭは、予め染色したｋＤａ単位の分子
量マーカー（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）である。図５Ｂは、
レーン配置を図５ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥの場合と同様に
して、ウェスタンブロット法で解析した結果を示してい
る。抗ｐ５３抗体を用いてウェスタンブロット法でｐ５
３発現の相対濃度を解析した。使用した一次抗体は、ｐ
５３タンパク質（PAb 1801，Oncogene Science Inc.）
とβアクチン（Amersham，Inc.）に対するモノクローナ
ル抗体であった。ホースラディッシュペルオキシダーゼ
と結合した２次抗体とＥＣＬ発色剤は、ウェスタンブロ
ット法でウイルス感染させたＨ３５８細胞をAmersham I
nc．から入手した。５Ｂのウェスタンブロット法の構成
と規模は５Ａと同一である。

【図６Ａ】図６は、ウェスタンブロット法で測定したｐ
５３発現の時間経過を示している。Ｈ３５８細胞を多数
の皿に入れ、ＩＯＰＦＵ/細胞でＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３
に感染させた。感染後の指定時点で細胞ライセートを調
製した。ウェスタンブロットを抗ｐ５３抗体と抗アクチ
ン抗体とで同時にプローブした。レーン“Ｃ”はネガテ
ィブコントロールを示している。棒グラフはデンシトメ
ーターで測定したｐ５３の相対量を示している。

【図６Ｂ】図６は、ウェスタンブロット法で測定したｐ
５３発現の時間経過を示している。Ｈ３５８細胞を多数
の皿に入れ、ＩＯＰＦＵ/細胞でＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３
に感染させた。感染後の指定時点で細胞ライセートを調
製した。ウェスタンブロットを抗ｐ５３抗体と抗アクチ
ン抗体とで同時にプローブした。レーン“Ｃ”はネガテ
ィブコントロールを示している。棒グラフはデンシトメ
ーターで測定したｐ５３の相対量を示している。

【図７Ａ】図７Ａは、細胞系Ｈ３５８のウイルス感染ヒ
ト肺癌細胞の成長曲線である。細胞は、皿一枚（６０ｍ
ｍ）あたり細胞数１０5個、１細胞系あたり６皿の割合
で接種した。２４時間後、１０ＭＯＩ（multiplicity o
f infection、多重感染度、即ちＰＦＵ／細胞）のＡｄ
５ＣＭＶ−ｐ５３又はＡｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２に感染さ
せた。感染後６日間、毎日細胞数を数えた。これらの成
長曲線は、実験を４回繰り返して得たデータから作成し
た。

【図７Ｂ】図７Ｂは細胞系Ｈ３２２由来の、ウイルス感
染ヒト肺癌細胞の成長曲線である。細胞は、皿一枚（６
０ｍｍ）あたり細胞数１０5個、１細胞系あたり６皿の
割合で接種した。２４時間後、１０ＭＯＩ（多重感染
度、即ちＰＦＵ／細胞）のＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３又はＡ
ｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２に感染させた。感染後６日間、毎
日細胞数を数えた。これらの成長曲線は、実験を４回繰
り返して得たデータから作成した。

【図７Ｃ】図７Ｃは細胞系Ｈ４６０由来の、ウイルス感
染ヒト肺癌細胞の成長曲線である。細胞は、皿一枚（６
０ｍｍ）あたり細胞数１０5個、一細胞系あたり６皿の
割合で接種した。２４時間後、１０ＭＯＩ（多重感染
度、即ちＰＦＵ／細胞）のＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３又はＡ
ｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２に感染させた。感染後６日間、毎
日細胞数を数えた。これらの成長曲線は、実験を４回繰
り返して得たデータから作成した。

【図８】図８は同所性肺癌モデルによるＡｄ５ＣＭＶ−
ｐ５３実験のフローチャートを示している。これはＨ２
２６Ｂｒ細胞とウイルスを接種したヌードマウスを治療
する実験で、投与量と治療計画の概略をフローチャート
として示したものである。

【図９】図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、及び９Ｄは、治療マウス
とコントロールマウス各々から切除した、肺と中隔膜の
サンプルである。図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、及び９Ｄは、一
頁の画像を４パネルに分けたものである。治療後６週間
が経過した最終日において、マウスを殺した。肺と中隔
膜の組織を切除して、腫瘍形成を評価した。図９Ａは、
正常ヌードマウスの中隔膜ブロックのサンプルである。
図９Ｂは、ビヒクル（ＰＢＳ）で治療したマウスの中隔
膜ブロックのサンプルである。図９Ｃは、Ａｄ５ＣＭＶ
−ｐ５３で治療したマウスの中隔膜ブロックのサンプル
である。図９Ｄは、Ａｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２で治療した
マウスの中隔膜ブロックのサンプルである。矢印は腫瘍
塊を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/04 Ｃ１２Ｎ 7/00 43/00 １０５ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ 7/00 Ａ６１Ｋ 37/24 (72)発明者ロス，ジャック・エイアメリカ合衆国、77004 テキサス、ヒューストン、ボルソーヴァー 2324 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 EA02 FA01 FA02 FA06 GA11 HA17 4B065 AA90X AA95X AA95Y AB01 AC14 BA02 CA28 CA44 4C084 AA02 AA13 BA44 CA18 CA53 DA27 DB61 DB70 MA56 MA65 MA66 NA05 NA14 ZB21 ZB26 ZC02 ZC03 4C087 AA01 AA02 AA03 BB65 BC83 CA12 MA56 MA65 MA66 NA05 NA14 ZB21 ZB26 ZC02 ZC03

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】機能的なＥ１Ｂは発現しないが、野生型
ｐ５３をコードするＤＮＡ配列を含有しそれを発現する
組換えアデノウイルスであって、癌細胞において細胞の
増殖を阻害して癌の退縮をおこすのに充分な野生型ｐ５
３が発現することを特徴とする、機能的なｐ５３の欠損
した細胞からなるヒトの癌細胞における細胞増殖を抑制
するための組換えアデノウイルス。
【請求項２】サイトメガロウイルスＩＥプロモーター
が野生型ｐ５３に作動可能に連結し、前記ｐ５３の発現
が前記サイトメガロウイルスＩＥプロモーターにより制
御される請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項３】アデノウイルスが、ｐ５３の発現領域、
サイトメガロウイルスＩＥプロモーター及びＳＶ４０初
期ポリアデニル化シグナルを含んでなる請求項１に記載
のアデノウイルス。
【請求項４】アデノウイルスのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ領域
が欠失し、ｐ５３発現領域がその場所に導入されている
請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項５】製薬的に許容可能な製剤中に分散してい
る請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項６】請求項１に記載のアデノウイルスを感染
させた組換え宿主細胞。
【請求項７】癌の治療用の医薬品の製造のための、ヒ
トの癌細胞における細胞の増殖を阻害するための請求項
１〜７のいずれか１項に記載の組換えアデノウイルスの
使用であって、ベクターが野生型ｐ５３をコードする発
現領域を含み、ウイルスが機能的なＥ１Ｂを発現しない
ことを特徴とする使用。
【請求項８】癌の治療用の医薬品の製造のための、ア
デノウイルスＩＴＲおよびｐ５３コード領域を含むＤＮ
Ａセグメントの使用であって、前記コード領域は、サイ
トメガロウイルスプロモーターの制御下に位置すること
を特徴とする使用。
【請求項９】ＤＮＡセグメントがｐ５３コード領域の
３’側にポリアデニル化シグナルをさらに含む請求項８
に記載の使用。
【請求項１０】ＤＮＡセグメントが機能的なアデノウ
イルスＥ１コード領域を含有しない請求項８に記載の使
用。
【請求項１１】アデノウイルスＩＴＲ領域が左側末端
のＩＴＲである請求項８に記載の使用。
【請求項１２】ＤＮＡセグメントがＥ１エンハンサー
をさらに含む請求項８に記載の使用。
【請求項１３】ＤＮＡセグメントが、アデノウイルス
ゲノムの１．３地図単位から９．２地図単位を除いた、
アデノウイルスゲノムの０地図単位から１６地図単位を
さらに含む請求項８に記載の使用。
【請求項１４】ＤＮＡセグメントが発現ベクターであ
る請求項８に記載の使用。
【請求項１５】ポリアデニル化シグナルがＳＶ４０ポ
リアデニル化シグナルである請求項９に記載の使用。
【請求項１６】ＤＮＡセグメントがＥ２アデノウイル
ス遺伝子をさらに含む請求項１１に記載の使用。
【請求項１７】ＤＮＡセグメントがＥ４アデノウイル
ス遺伝子をさらに含む請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】ＤＮＡセグメントが、アデノウイルス
ゲノムの１．３地図単位から９．２地図単位を除いた、
アデノウイルスゲノムの０地図単位から１００地図単位
をさらに含む請求項１３に記載の使用。
【請求項１９】発現ベクターが、アデノウイルス発現
ベクターである請求項１４に記載の使用。
【請求項２０】ＤＮＡがアデノウイルスにパッケージ
ングされる請求項８〜１９のいずれか１項に記載の使
用。
【請求項２１】医薬品が局所的にまたは全身に投与さ
れ、局所的には特に腫瘍部位への直接注入または気管内
投与により、より特定には気管内投与により、全身的に
は特に静脈注射または静脈内注入により投与されること
を特徴とする請求項７〜２０のいずれか１項に記載の使
用。
【請求項２２】ベクターまたはＤＮＡセグメントが、
薬理学的に許容可能な製剤中に分散されており、特に製
剤が腫瘍への注入により投与されるのに適しているか、
長期の注入に適していることを特徴とする請求項７〜２
０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】転移性の増殖を制御するため、ヒトの
悪性腫瘍を抑制するためおよび／または腫瘍形成を抑制
するための医薬品の製造のための請求項７〜２０のいず
れか１項に記載の使用。
【請求項２４】上皮癌、特に、肺癌、より特定には同
所性肺癌または気管支内腫瘍、もっとも特定には非小細
胞癌に対する、または乳癌に対する、または切除不能な
癌に対する医薬品の製造のための請求項７〜２０のいず
れか１項に記載の使用。
【請求項２５】医薬品が十分長い期間投与される請求
項７〜２０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】医薬品が少なくとも二度投与され、特
に二度目に異なる感染多重度で投与される請求項７〜２
０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】医薬品が腫瘍切除の後に残留した腫瘍
への注入により投与される請求項７〜２０のいずれか１
項に記載の使用。
【請求項２８】医薬品が１０¹⁰〜５×１０¹²個の組換
えアデノウイルス量で投与される請求項７〜２０のいず
れか１項に記載の使用。