JP2003254967A

JP2003254967A - 標的核酸の検出方法

Info

Publication number: JP2003254967A
Application number: JP2002051896A
Authority: JP
Inventors: Keisaku Okada; 圭策岡田; Yasuyuki Tanaka; 康進田中; Riyouko Asai; 量子浅井
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 2002-02-27
Filing date: 2002-02-27
Publication date: 2003-09-10

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】操作性に優れ、迅速かつ簡便に標的核酸の存在
を検出できる標的核酸の検出方法、及び当該検出方法に
好適に使用される標的核酸の検出用キットの提供。【解決手段】標的核酸との結合性を有する検出プローブ
を用いる標的核酸の検出方法において、（ａ）固定化し
た被検試料、リガンド結合化合物を有するシグナルレポ
ーターを液体との接触により展開可能に保持させてなる
レポーター相とを有する吸水性基材上に、リガンドを有
する該検出プローブを導入する工程、（ｂ）ストリンジ
ェントな条件下、吸水性基材上で該検出プローブを展開
する工程、及び（ｃ）固定相において該シグナルレポー
ターからのシグナルを検出する工程を含み、固定相にお
いて該シグナルが検出される場合に被検試料中に標的核
酸が含まれると判定する、標的核酸の検出方法、並びに
上記レポーター相を有する吸水性基材と、リガンドを有
する検出プローブとを含んでなる標的核酸の検出用キッ
ト。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、標的核酸の検出方
法および標的核酸の検出用キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】近年問題となっているサルモネラ菌をは
じめとする病原性微生物などの、食品中や患者からの検
出には、多くの日数、煩雑な操作を要する場合が多い。
また、疾患によってはより迅速な診断が要求される場合
も多い。

【０００３】これらの検出や診断には、標識化免疫測定
法などの種々の免疫測定法（イムノアッセイ）が用いら
れ、最近では免疫クロマトグラフ方式による、迅速・簡
便な検査も広く行われている。このような測定法では、
検査対象となる微生物に対する抗体が必要不可欠であ
る。しかしながら、微生物によっては種レベルではな
く、属レベルでの検出が要求されるため、様々な血清型
を有する細菌が検出対象となりうる。このような場合に
は種々の抗原に対する抗体が必要となるため、抗体の確
保に多大な労力と費用が求められる。

【０００４】そこで近年では、ＤＮＡプローブなどを用
いたハイブリダイゼーション法が用いられるようになっ
てきた。たとえば、特定の微生物を検出するための方法
においては、細菌のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を標
的としてハイブリダイゼーションが行われる。細菌のｒ
ＲＮＡの塩基配列は細菌の系統進化を反映している観点
から、その有効性が広く世に知られている〔DeLong E.
F. ら、Science 243:1360-1363(1989)〕。従って、かか
る方法は、特定の微生物を検出する方法として優れたも
のである。しかしながら、通常のハイブリダイゼーショ
ン法にはブロッティング、ハイブリダイゼーション、洗
浄、発色などの手順が含まれており、任意の試料をブロ
ットしたメンブレンをプラスチック製のバッグに密封し
て加熱したり、洗浄を繰り返したりする必要があり、操
作性の点では優れているとは言いがたい。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来のハイ
ブリダイゼーション法に比べて非常に操作性に優れた、
迅速かつ簡便に被検試料中の標的核酸の存在を検出する
ことができる標的核酸の検出方法、ならびに当該検出方
法に好適に使用される標的核酸の検出用キットを提供す
ることを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、
〔１〕標的核酸との結合性を有する検出プローブを用
いる標的核酸の検出方法において、（ａ）被検試料を固
定化してなる固定相と、リガンド結合化合物を有するシ
グナルレポーターを液体との接触により展開可能に保持
させてなるレポーター相とを有する吸水性基材上に、リ
ガンドを有する該検出プローブを導入する工程、（ｂ）
ストリンジェントな条件下、吸水性基材上で該検出プロ
ーブを展開する工程、ならびに（ｃ）固定相において該
シグナルレポーターからのシグナルを検出する工程、を
含み、固定相において該シグナルが検出される場合に被
検試料中に標的核酸が含まれると判定する、標的核酸の
検出方法、〔２〕リガンドとリガンド結合化合物が、
ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、
ＦＩＴＣ−抗ＦＩＴＣ抗体およびジゴキシゲニン−抗ジ
ゴキシゲニン抗体からなる群より選択される少なくとも
１つの組み合わせからなるものである前記〔１〕記載の
検出方法、〔３〕シグナルレポーターが着色粒子、酵
素または蛍光色素である前記〔１〕または〔２〕記載の
検出方法、〔４〕標的核酸が一本鎖核酸である前記
〔１〕〜〔３〕いずれか記載の検出方法、〔５〕一本
鎖核酸がリボソームＲＮＡである前記〔４〕記載の検出
方法、〔６〕リボソームＲＮＡがサルモネラ菌または
リステリア菌由来のものである前記〔５〕記載の検出方
法、〔７〕リガンド結合化合物を有するシグナルレポ
ーターを液体との接触により展開可能に保持させてなる
レポーター相を有する吸水性基材と、リガンドを有する
検出プローブとを含んでなる標的核酸の検出用キット、
に関する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の標的核酸の検出方法（以
下、検出方法という）は、従来のハイブリダイゼーショ
ン法による被検試料中の標的核酸の検出をクロマトグラ
フ方式にて行うことを１つの大きな特徴とする。従っ
て、本発明によれば、従来のハイブリダイゼーション法
の煩雑な操作を行うことなく、本発明において使用する
吸水性基材上に試薬等を導入（たとえば、滴下）するだ
けで、迅速かつ簡便に被検試料中の標的核酸の存在を検
出することができる。

【０００８】すなわち、本発明は、クロマトグラフ方式
により標的核酸と検出プローブとをハイブリダイズさ
せ、標的核酸にハイブリダイズした検出プローブの存在
を、該検出プローブにリガンドとリガンド結合化合物の
結合を介して結合したシグナルレポーターからのシグナ
ルとして検出し、該シグナルが検出された場合に被検試
料中に標的核酸が含まれると判定する標的核酸の検出方
法である。

【０００９】具体的には、当該検出方法は、標的核酸と
の結合性を有する検出プローブを用いる標的核酸の検出
方法において、（ａ）被検試料を固定化してなる固定相
と、リガンド結合化合物を有するシグナルレポーター
（以下、単にシグナルレポーターという場合がある）を
液体との接触により展開可能に保持させてなるレポータ
ー相とを有する吸水性基材上に、リガンドを有する該検
出プローブ（以下、単に検出プローブという場合があ
る）を導入する工程、（ｂ）ストリンジェントな条件
下、吸水性基材上で該検出プローブを展開する工程、な
らびに（ｃ）固定相において該シグナルレポーターから
のシグナルを検出する工程、を含むものである。そし
て、固定相において該シグナルが検出される場合に被検
試料中に標的核酸が含まれると判定する。

【００１０】なお、本明細書においては「リガンドを有
する検出プローブ」および「リガンド結合化合物を有す
るシグナルレポーター」と記載するが、リガンドとリガ
ンド結合化合物は互いに逆であってもよい。本明細書に
おいては説明の簡略化の観点から、検出プローブがリガ
ンドを有し、かつシグナルレポーターがリガンド結合化
合物を有する場合を例に記載する。リガンド結合化合物
とはリガンドに結合しうる化合物をいう。また、本明細
書において「結合性を有する」とは、ストリンジェント
な条件下に互いにハイブリダイズ可能であることを意味
し、「結合性を有しない」とは、ストリンジェントな条
件下に互いにハイブリダイズしないことを意味する。ま
た、「核酸」にはＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲ
ＮＡ（リボ核酸）が含まれる。当該核酸としては、天然
由来の核酸、生物学的方法および／または化学的方法に
より作製された核酸、増幅核酸、組換え核酸等の任意の
核酸が含まれる。

【００１１】本発明においては、吸水性基材上に導入さ
れる、該基材上で展開させる成分（以下、展開対象成
分）を毛細管現象により自然展開させるため、当該展開
対象成分は水を媒体とする溶液や分散液等であるのが好
適である。たとえば、そのような形態で提供された検出
プローブを、本発明の吸水性基材上の一端に導入〔工程
（ａ）〕すると、当該検出プローブは直ちに吸水性基材
上で展開〔工程（ｂ）〕される。

【００１２】検出プローブの導入は本発明の所望の効果
が得られるように行われる。たとえば、導入は滴下等に
より適宜行えばよい。導入量は本発明の所望の効果が得
られれば特に限定されるものではないが、被検試料中の
予想される標的核酸の存在量以上の量であるのが好まし
い。導入位置は、吸水性基材上、固定相から見てレポー
ター相の存在する一方の側であり、かつレポーター相も
しくはレポーター相より末端側の位置であって、所望の
展開移動距離が確保できる位置であるのが望ましい。か
かる展開移動距離とは、該検出プローブの導入位置から
固定相までの距離をいう。当該展開移動距離としては、
好ましくは５〜３５ｍｍ、より好ましくは１０〜３０ｍ
ｍである。かかる範囲内であれば、シグナルの検出感度
が良好で、測定時間も適切である。

【００１３】検出プローブはレポーター相に、その導入
と同時に接触する、または展開に伴って達することにな
るが、当該レポーター相には、リガンド結合化合物を有
するシグナルレポーターが液体との接触により展開可能
に保持されているので、検出プローブの媒体（好ましく
は水）がレポーター相のシグナルレポーターに接触する
と、当該シグナルレポーターはレポーター相から溶出さ
れると同時に保持が外れて展開可能な状態となる。検出
プローブとシグナルレポーターとは、リガンドと対応す
るリガンド結合化合物との結合を介して結合し、検出プ
ローブとシグナルレポーターとを有する、いわゆる標識
複合体が形成される。

【００１４】該標識複合体は吸水性基材上でさらに展開
されて固定相に達する。該標識複合体に含まれる検出プ
ローブは標的核酸との結合性を有するため、該標識複合
体が固定相において固定化された被検試料と接触する
と、該試料中に標的核酸が含まれる場合、検出プローブ
と標的核酸とのハイブリダイゼーションを介して、該標
識複合体は該固定相に捕捉されることになる。

【００１５】次いで、固定相において該標識複合体のシ
グナルレポーター（詳しくは、リガンドとリガンド結合
化合物との結合を介してシグナルレポーターが結合した
検出プローブが固定相の標的核酸とハイブリダイズし、
その結果、該固定相に捕捉されるに至ったシグナルレポ
ーター）からのシグナルを検出〔工程（ｃ）〕する。

【００１６】被検試料に標的核酸が含まれると、前述の
ように固定相では標識複合体の捕捉が生ずることになる
が、かかる標識複合体の捕捉は、被検試料中に標的核酸
が存在する場合にのみ生ずる。それゆえ、被検試料を固
定化した固定相を有する吸水性基材上で検出プローブを
展開し、展開途中において形成される検出プローブとシ
グナルレポーターとを含む標識複合体の固定相における
存在を、それに含まれるシグナルレポーター由来のシグ
ナルの検出を通じて確認できれば、被検試料中に標的核
酸が含まれると判定することができる。

【００１７】本発明において被検試料としては、核酸が
含まれうるものであれば特に限定されるものではない。
被検試料としては、たとえば、食中毒の原因菌（細菌、
たとえば、サルモネラ菌、リステリア菌等）等の特定の
菌種に由来する溶菌液や、各種生物の血液、組織等の細
胞溶解液、ならびにそれらの希釈液等が挙げられる。菌
もしくは細胞の溶解や、得られた溶菌液等の希釈には、
特に限定されるものではないが、水、ホウ酸緩衝液、リ
ン酸緩衝液等の水系溶媒を使用するのが好適である。さ
らに、前記溶菌液等に含まれる核酸を鋳型としてポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得られた増幅産物をも
被検試料とすることができる。

【００１８】また、標的核酸としては、その配列が既知
のものであれば特に限定されるものではない。たとえ
ば、前記食中毒の原因菌のゲノム上もしくはプラスミド
上に、または各種生物のゲノム上にコードされた特定の
遺伝子領域や、前記原因菌等に含まれるＲＮＡ等を挙げ
ることができる。たとえば、標的核酸が特定の食中毒の
原因菌に固有の塩基配列を有する核酸である場合、本発
明の検出方法により任意の被検試料において当該標的核
酸の存在が確認されれば、当該被検試料の取得源（たと
えば、食品）における当該原因菌の存在が明らかとな
る。かかる標的核酸としては、特定の菌種の属や系統分
類学上の集団に固有の塩基配列が知られている細菌のｒ
ＲＮＡが好適である。また、標的核酸が、特定の疾患の
病因として知られる、もしくは特定の疾患の病状を表わ
すことが知られる、野性型の遺伝子や変異型の遺伝子で
ある場合、被検試料において当該遺伝子の存在が確認さ
れれば、当該被検試料の取得源である生物の疾患の病因
や病状が明らかとなる。さらには、生物の特定の遺伝子
について多型が存在する場合、たとえば、個々の遺伝子
に特徴的な塩基配列を有する遺伝子領域を標的核酸と
し、本発明の検出方法を用いて当該生物由来の被検試料
において当該標的核酸の存在を確認することにより、当
該生物の遺伝子型タイピングを行うことも可能である。

【００１９】本発明の標的核酸の形態としては一本鎖で
あっても二本鎖であってもよいが、一本鎖であるのが好
ましい。たとえば、本発明の標的核酸としては、ＲＮＡ
や公知の方法により任意に合成・増幅して得られた一本
鎖ＤＮＡ等の一本鎖核酸が好適である。かかる一本鎖核
酸としては、たとえば、食品の食中毒の原因菌による汚
染を判定する場合の有用性の観点から、前記細菌のｒＲ
ＮＡが好適であり、中でもサルモネラ菌またはリステリ
ア菌由来のｒＲＮＡがより好適である。被検試料に二本
鎖の核酸が含まれる場合には、本発明の検出方法に供す
る前に、公知のアルカリ処理法や加熱処理法等により、
二本鎖の核酸を予め一本鎖に解離させておくのが好まし
い。

【００２０】吸水性基材上の固定相は、かかる被検試料
を吸水性基材上に直接的にまたは間接的に固定化するこ
とにより形成する。

【００２１】固定相は、吸水性基材上の所望の位置に、
被検試料を、ディスペンサー等を用いてライン状に直接
塗布し、またピペット等を用いて円形状に直接スポット
し、固定化して形成してもよいが、展開対象成分の展開
方向に対し垂直となる方向の当該吸水性基材の幅と同様
の幅で形成されるのが好ましい。また、吸水性基材上の
固定相の占有面積は吸水性基材の面積に対し百分率で
０．５〜３％であるのが好ましい。

【００２２】吸水性基材上への被検試料の直接の固定化
は、後述する、本発明のリガンドを有する検出プローブ
等を調製するための方法に準じて適宜行うことができ
る。また、たとえば、簡便に、被検試料を吸水性基材上
に直接塗布し、たとえば、１２０℃で３０分間程度、オ
ーブン中に維持して加熱処理することにより固定化する
こともできる。

【００２３】被検試料を吸水性基材上に間接的に固定化
して固定相を形成する場合、たとえば、被検試料をガラ
ス繊維等からなるパッドに、被検試料を吸水性基材上に
直接固定化する場合と同様にして固定化し、得られたパ
ッドを吸水性基材上に、たとえば、接着することにより
貼り合わせ、固定相とするのが好適である。

【００２４】固定相としては、リガンドとリガンド結合
化合物との結合を介してシグナルレポーターと検出プロ
ーブとが結合してなる標識複合体を充分に捕捉し得、そ
れに含まれるシグナルレポーター由来のシグナルの検出
が容易に行われうる程度の量で標的核酸が固定化されう
るように、該標的核酸の存在が予想される被検試料を固
定化してなるものが好ましい。固定相における被検試料
の固定化量は、予想される標的核酸の存在量に応じて適
宜決定され得、一概には決定できないが、通常、被検試
料を好ましくは０．１〜１００ｎｇ／ｃｍ²の範囲で均
一に固定化して固定相を形成するのが好ましい。

【００２５】なお、固定相を形成した吸水性基材は、標
的核酸以外の核酸の当該基材上への非特異的な吸着の防
止、展開の容易性、ならびに固定化した被検試料の保存
安定性の観点から、公知の方法に従ってブロッキング
剤、界面活性剤および糖を含有する溶液（以下、処理液
という）に浸漬し、乾燥して用いるのが好ましい。ここ
で、使用するブロッキング剤としては、ウシ血清アルブ
ミン、カゼイン、ゼラチン、スキムミルク、ポリビニル
アルコール、ポリビニルピロリドン等の吸水性基材に対
し吸着性を有するタンパク質が挙げられる。界面活性剤
としては、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニ
ルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレ
ート、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテルリン
酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン
酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエー
テル等が挙げられる。糖としては、サッカロース、トレ
ハロース等が挙げられる。なお、前記処理液中のブロッ
キング剤の含有量は、好ましくは０．１〜１０重量％で
ある。前記処理液中の界面活性剤の含有量は、好ましく
は０．０１〜１重量％である。前記処理液中の糖の含有
量は、好ましくは０．１〜１０重量％である。また、上
記操作の実施は、吸水性基材に対し固定相を形成した後
であれば、本発明の所望の効果の発現が阻害されない限
り、本発明の検出方法における使用前において任意に行
うことができる。

【００２６】本発明の検出プローブは、標的核酸の塩基
配列に相補的な塩基配列を有しており、かつ標的核酸に
対して結合性を有する、すなわち、ストリンジェントな
条件下でハイブリダイズ可能な核酸プローブであれば特
に限定されない。ここで「相補的」とは、検出プローブ
の塩基配列が標的核酸の塩基配列の相補鎖を正確に反映
している必要はないが、ストリンジェントな条件下で標
的核酸にハイブリダイズできる程度には当該相補鎖に充
分に類似していることをいう。当該類似の程度として
は、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以
上、さらに好ましくは９５％以上である。

【００２７】当該検出プローブとしては、核酸、修飾核
酸、核酸アナログ等からなるものが挙げられる。検出プ
ローブは一本鎖または二本鎖の核酸でありうるが、一本
鎖の核酸であるのが好ましい。また、その塩基数として
は少なくとも５塩基長程度であり、好ましくは５〜１０
０塩基長、より好ましくは１５〜５０塩基長であるが、
数千塩基長であってもよい。

【００２８】前記修飾核酸としては、修飾された糖基、
リン酸基、または修飾塩基を含む核酸が挙げられる。た
とえば、修飾塩基を含む核酸の例としては、たとえば、
アセチル化された塩基（４−アセチルシチジン等）、カ
ルボキシル化された塩基（５−カルボキシメチルアミノ
メチルウリジン等）、またはメチル化された塩基（１−
メチルイノシン等）等を含む核酸が挙げられる。また、
デアザグアニンおよびウラシルを含む核酸をグアニンお
よびチミンを含む核酸の代わりに検出プローブとして用
いてもよい。かかる場合には、ハイブリダイズした際の
検出プローブの熱安定性が低下する。また、５−メチル
シトシンを含む核酸をシトシンを含む核酸の代わりに検
出プローブとして用いてもよい。かかる場合には、ハイ
ブリダイズした際の検出プローブの熱安定性が向上す
る。核酸のホスホジエステル骨格から負電荷を除去する
ような修飾も検出プローブの熱安定性の向上に寄与す
る。また、検出プローブとしてＲＮＡを用いる場合に
は、当該プローブのヌクレアーゼ感受性を低下させる観
点から、２’−Ｏ−メチル基の付加など、リボースの糖
基を修飾するのが好ましい。

【００２９】前記核酸アナログとしては、たとえば、標
準的な核酸塩基が、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン
単位の繰り返しからなるペプチド様骨格に結合している
ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる〔Nielsen, P. E.
ら、Science, 254:1497〜1500（1991）〕。ＰＮＡはヌ
クレアーゼによる分解に対して非常に抵抗性が強い点で
有用である。

【００３０】標的核酸の塩基配列の相補鎖との検出プロ
ーブの塩基配列の前記「類似の程度」は、該相補鎖と該
検出プローブの塩基配列との間の配列同一性を求めるこ
とにより評価することができる。かかる配列同一性とは
２つの配列間の塩基の配列類似性をいい、２つの適切に
アラインメントされた配列を比較することにより決定す
る。具体的には、両方の配列に存在する同一の塩基を決
定して適合部位の数を決定し、次いで比較対象の配列領
域内の塩基の総数で前記適合部位の数を割り、得られた
数値に１００を乗じて配列同一性（％）を算出する。か
かる配列同一性は、たとえば、ＢＬＡＳＴネットワーク
サービスを利用して適宜求めることが可能である。

【００３１】本明細書においてストリンジェントな条件
としては、非特異的なハイブリダイゼーション反応を有
意に低下させる条件であれば特に限定されない。核酸の
ハイブリダイゼーションを行うためのストリンジェント
な条件については、たとえば、成書（モレキュラーク
ローニング（Molecular Cloning）第３版、ザンブルー
ク（Sambrook）とラッセル（Russell）著、コールドス
プリングハーバー）等に記載されている。プローブの長
さ、塩基組成、ハイブリダイズする配列間の配列同一
性、温度、およびイオン強度等の要素が、核酸ハイブリ
ッドの安定性に影響する。たとえば、中ストリンジェン
シーまたは高ストリンジェンシー等のストリンジェント
な条件は、標的核酸と検出プローブの特性に応じて、経
験的に決定することができる。

【００３２】上記のような核酸、修飾核酸、核酸アナロ
グ等からなる検出プローブは、所望の性質を有するよう
に公知の方法（たとえば、前記成書参照）に従って適宜
作製することができる。また、任意の配列や修飾（標
識）を有する核酸を合成した市販品を購入することもで
きる。

【００３３】シグナルレポーターは当該レポーターに由
来するシグナルを検出可能なものであれば特に限定され
るものではない。好ましくは機器もしくは目視により、
より好ましくは目視により、当該レポーター由来のシグ
ナルを容易かつ簡便に検出可能であるものが好適であ
る。

【００３４】かかるシグナルレポーターとしては、たと
えば、着色粒子、酵素、蛍光色素や、³²Ｐ、³⁵Ｓ、³Ｈ
等のラジオアイソトープ等が挙げられる。中でも検出容
易性の観点から、着色粒子、酵素または蛍光色素が好ま
しい。

【００３５】本明細書において着色粒子とは着色された
粒子であって、シグナルを当該粒子から直接的に発せら
れる色として検出しうる粒子をいう。たとえば、当該粒
子としては、金コロイド粒子やセレニウムコロイド粒子
のような金属コロイド粒子や、着色された水分散型高分
子粒子などが挙げられる。水への分散性に優れ、また核
酸や酵素等の固定化容易性の観点から、水分散型高分子
粒子からなるものが好ましい。

【００３６】金属コロイド粒子は入手容易性および安定
性等の観点より、金コロイド粒子が好ましい。また、核
酸やリガンド等の固定化容易性および検出の容易性の観
点から、その粒径（平均粒径）は５〜８０ｎｍが好まし
く、１０〜５０ｎｍがより好ましい。当該粒径は、たと
えば、透過型電子顕微鏡観察下で各粒子の絶対粒径を測
定し、得られた測定値を平均することにより求められ
る。

【００３７】水分散型高分子粒子は、たとえば、公知の
方法に従い、不飽和二重結合を有する単量体の一又は二
以上を乳化重合することによって調製することができ
る。かかる単量体としては、たとえば、エチレン、プロ
ピレン等のオレフィン系単量体、酢酸ビニル、塩化ビニ
ル等のビニル系単量体、スチレン、メチルスチレン、ク
ロロスチレン等のスチレン系単量体、アクリル酸メチル
等の（メタ）アクリル酸エステル系単量体、ブタジエン
等のジエン系単量体等が好適に用いられる。

【００３８】また、本発明に用いられる水分散型高分子
粒子としては、上記単量体の単独重合体や共重合体から
なるものの他、その表面に核酸や酵素等を固定化するた
めのリガンドやスペーサーの導入を目的として、得られ
る粒子に官能基やイオン性基を付与したものでもよく、
また粒子の水性媒体中での分散安定性を高めるなどの目
的で、改質用単量体を共重合してなるものであってもよ
い。

【００３９】そのような官能基やイオン性基としては、
たとえば、カルボキシル基、水酸基、グリシジル基、ア
ミノ基、ホルミル基、カルバモイル基、イソチオシアナ
ート基、アジドカルボニル基、ヒドラジド基、酸無水物
基等を挙げることができ、中でもカルボキシル基が好ま
しい。これらの官能基等を有する水分散型高分子粒子を
調製するには、単量体成分として、たとえば、アクリル
酸、メタクリル酸のようなカルボキシル基を有する単量
体、たとえば、ヒドロキシアクリレート、２−ヒドロキ
シエチルアクリレートのような水酸基を有する単量体、
たとえば、グリシジルメタクリレートのようなグリシジ
ル基を有する単量体を、所望により他の共重合性単量体
と乳化重合させることによって、それぞれカルボキシル
基、水酸基およびグリシジル基を有する粒子として得る
ことができる。また所望の単量体成分を重合させた後、
得られた粒子に官能基を導入することもできる。

【００４０】また、前記改質用単量体としては、たとえ
ば、アクリル酸、メタクリル酸、２，２，２−トリフル
オロエチルメタクリレートなどのフッ素化メタクリル酸
エステル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ア
クリルアミド、スチレンスルホン酸ナトリウム、スルホ
プロピル（メタ）アクリレートナトリウム塩、Ｎ−ビニ
ル−２−ピロリドン、２−ヒドロキシエチルアクリレー
ト、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリシジル
メタクリレートなどが用いられる。

【００４１】水分散型高分子粒子の着色は、たとえば、
スダンブルーやスダンレッドＩＶ、スダンＩＩＩ、オイ
ルオレンジ、キニザリングリーンなどに代表される顔料
や染料、また種々の蛍光色素・顔料を、当該粒子製造時
に任意に添加することで行うことができる。着色された
水分散型高分子粒子をシグナルレポーターとして用いた
場合、それが直接的に発する色として、目視または機器
〔たとえば、クロマトスキャナー（スキャニングデンシ
トメータ）〕により迅速、簡便にシグナルを検出するこ
とができる。目視確認の容易性の観点からは、青色、赤
色、緑色またはオレンジ色等に着色された水分散型高分
子粒子が好ましく、分散安定性や被検物質の検出感度の
調整の容易性などの観点から、青色または赤色に着色さ
れたものがより好ましい。

【００４２】本発明においては、市販されている種々の
着色された水分散型高分子粒子も好適に使用することが
できる。市販されている水分散型高分子粒子としては、
たとえば、ｐ−クロロスチレンの単独重合体または共重
合体、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−アク
リロニトリル−ブタジエン共重合体などの、スチレンま
たはその誘導体を単量体成分として含んでなる単独重合
体または共重合体を挙げることができる。また、（メ
タ）アクリル酸の長鎖アルキルエステルまたはその誘導
体からなる単独重合体や、これらと（メタ）アクリル酸
メチルや（メタ）アクリル酸エチル、グリシジル（メ
タ）アクリレート等との共重合体も本発明において用い
られる。さらに、スチレンまたはその誘導体と、（メ
タ）アクリル酸エステルまたはその誘導体との共重合体
も用いられる。また、ゴム、ナイロン、ポリウレタン、
微結晶質セルロース等を用いてもよい。

【００４３】なお、本発明の水分散型高分子粒子として
は、前記するような単独重合体または共重合体の１種か
らなるものであっても、２種以上からなるものであって
もよい。

【００４４】水分散型高分子粒子は、その使用時や保存
時に融着や凝集を起こさないものが好ましい。従って、
当該粒子としては所望のガラス転移点を有するように選
択された単量体から構成されたものがよい。当該ガラス
転移点としては、好ましくは１０℃以上、より好ましく
は室温（１５℃）以上である。ガラス転移点は、たとえ
ば、示差走査熱量計で測定できる。

【００４５】このような水分散型高分子粒子の粒径（平
均粒径）は、分散性や吸水性基材内での展開性維持の観
点から、また核酸やリガンド等の固定化性の観点から、
好ましくは３μｍ以下、より好ましくは２μｍ以下であ
り、核酸やリガンド等を固定する際の精製の容易性の観
点から、好ましくは０．０１μｍ以上、より好ましくは
０．１μｍ以上である。すなわち、水分散型高分子粒子
の粒径としては、好ましくは０．０１〜３μｍ、より好
ましくは０．１〜２μｍである。なお、当該粒径は、金
属コロイド粒子と同様の方法により測定できる。

【００４６】シグナルレポーターとして酵素を用いる場
合、シグナルは、その基質に対する当該酵素の作用によ
り生ずる産物から発せられる。本発明に用いうる酵素と
して好適には、公知の酵素免疫測定法において標識とし
て常用される酵素を挙げることができる。たとえば、ペ
ルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラ
ーゼ、エステラーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ等が挙
げられる。中でも、より高感度で安定な検出を達成する
観点から、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファタ
ーゼが好ましい。

【００４７】また、当該酵素の基質としては、酵素反応
産物の検出が可能であれば特に限定されるものではない
が、迅速、簡便に当該産物の検出を行いうる観点から発
色性基質が好ましい。かかる発色性基質は、使用する酵
素に応じ、公知の酵素免疫測定法において用いられる発
色性基質から適宜選択することができる。

【００４８】発色性基質としては、たとえば、酵素がペ
ルオキシダーゼの場合、ペルオキシダーゼと過酸化水素
との組み合わせにより反応して発色しうる基質であれば
よく、たとえば、２，２’−アジノ−ビス（３−エチル
ベンズチアゾリン）−６−スルホン酸、ｏ−フェニレン
ジアミン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジ
ン（以下、ＴＭＢという) 、ｏ−ジアニジジン、３，
３’−ジアミノベンジジン、３−アミノ−９−エチルカ
ルバゾール、４−クロロ−１−ナフトール等が挙げら
れ、発色性および無毒性という観点からＴＭＢが好まし
い。

【００４９】本発明においては、基質は溶液状態で、た
とえば、酵素基質液として用いるのが好適である。酵素
基質液としては、前記発色性基質を、たとえば、水、ホ
ウ酸緩衝液、リン酸緩衝液等に溶解してなるものが好適
である。また、当該基質液には適切な酵素反応を行う上
で好適な、その他の成分（たとえば、過酸化水素等）を
所望により含有させてもよい。

【００５０】また、シグナルレポーターとして使用しう
る蛍光色素としては、フルオレセイン、テトラメチルロ
ーダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５等が挙げられる。

【００５１】リガンドを有する検出プローブとリガンド
結合化合物を有するシグナルレポーターは各々、検出プ
ローブもしくはシグナルレポーターとリガンドもしくは
リガンド結合化合物（以下、それらを結合対象物という
場合がある）とを直接的にまたは間接的に結合させるこ
とにより得られる。間接的に結合させる場合とは、たと
えば、結合対象物間の結合を任意の物質を介して行うよ
うな場合をいう。たとえば、結合対象物間の結合を、た
とえば、前記水分散型高分子粒子を介して行ってもよ
い。

【００５２】また、結合対照物は必ずしも１対１で結合
させる必要はなく、たとえば、１つの検出プローブに対
し複数のリガンドを直接的にまたは間接的に結合させて
もよい。リガンドを検出プローブに結合させる場合、リ
ガンドは検出プローブの５’末端、３’末端および配列
内部の少なくとも１つに直接的にまたは間接的に結合さ
せればよい。

【００５３】結合対象物間の結合は、任意の物質間の結
合方法として一般に公知である、共有結合、物理的吸着
もしくはイオン結合を利用する方法を用いて好適に行う
ことができる。結合安定性の観点から、共有結合を利用
する方法を採用するのが好ましい。

【００５４】たとえば、結合対象物に存在する官能基や
イオン性基を介して直接結合する、または水溶性カルボ
ジイミドや他の炭素数ｌ〜１２の炭素鎖基を有する二官
能性の有機化合物をスペーサーとして介在させて結合す
る。また、たとえば、リガンドと検出プローブとの結合
を、かかるリガンドとは別のリガンドとその対応するリ
ガンド結合化合物との結合を利用して行うことも可能で
ある。シグナルレポーターとして酵素を用いる場合に
は、なんらかのスペーサーを介在させることにより当該
酵素の自由度を高めることができ、酵素反応の効率を高
める観点から好ましい。

【００５５】本発明に用いうるリガンド−リガンド結合
化合物の組み合わせ例としては、ビオチン−アビジン、
ビオチン−ストレプトアビジン、ＦＩＴＣ−抗ＦＩＴＣ
抗体、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−抗ＤＩＧ抗体等が挙
げられる。本発明の検出方法においては、リガンドとリ
ガンド結合化合物が、特に、ビオチン−アビジン、ビオ
チン−ストレプトアビジン、ＦＩＴＣ−抗ＦＩＴＣ抗体
およびＤＩＧ−抗ＤＩＧ抗体からなる群より選択される
少なくとも１つの組み合わせからなるものが好ましい。
中でも、ビオチン−ストレプトアビジン、ＤＩＧ−抗Ｄ
ＩＧ抗体の組み合わせは、それらが結合して形成される
複合体の安定性が高く、より好ましい。

【００５６】また、たとえば、リガンドと検出プローブ
とを前記水分散型高分子粒子を介して間接的に結合させ
る場合、たとえば、（リガンド）−（水分散型高分子粒
子）−（検出プローブ）の形を有する検出プローブを得
る場合、リガンドと水分散型高分子粒子との間および水
分散型高分子粒子と検出プローブとの間を、前記するよ
うにして結合することにより調製することができる。

【００５７】本発明の検出方法に使用する検出プローブ
およびシグナルレポーターは、それらを構成する結合対
象物同士を結合させた後、たとえば、膜分離法や濾過、
遠心分離法等の慣用の分離法によって、たとえば、結合
を行った反応場である溶媒等から分離精製することによ
り得られる。そのようにして得られた本発明の検出プロ
ーブは、たとえば、水中に浸漬して、または凍結乾燥し
て保存すればよい。また、本発明の検出方法において使
用する場合には、たとえば、水、ホウ酸緩衝液、リン酸
緩衝液等に分散または溶解しておくのが好適である。一
方、シグナルレポーターは、使用時まで、たとえば、水
中に浸漬して、または凍結乾燥して保存することができ
る。

【００５８】レポーター相は、以下のようにして、得ら
れたシグナルレポーターを吸水性基材上に保持させるこ
とにより形成することができる。シグナルレポーター
は、吸水性基材上に直接的にまたは間接的に保持させる
ことができるが、操作の効率の観点から、直接的に保持
させるのが好ましい。

【００５９】吸水性基材上に直接的に保持させる場合、
たとえば、得られたシグナルレポーターを水、ホウ酸緩
衝液、リン酸緩衝液等に分散または溶解させたものを、
吸水性基材上の所望の位置に、たとえば、ディスペンサ
ー等を用いてライン状に塗布し、またはピペット等を用
いて円形状にスポットし、２０〜８０℃にて風乾するこ
とにより行うことができる。

【００６０】吸水性基材上に間接的に保持させる場合、
たとえば、得られたシグナルレポーターを水、ホウ酸緩
衝液、リン酸緩衝液等に分散または溶解させたものを、
たとえば、ポリエステル、レーヨン、ガラス繊維等から
なるパッドに含浸させ、前記同様にして風乾し、次いで
吸水性基材上の所望の位置に、たとえば、当該パッドを
接着により貼り合わせることにより行うことができる。

【００６１】なお、液体との接触によるシグナルレポー
ターの展開可能化を促進する観点から、シグナルレポー
ターを分散または溶解させる溶媒にサッカロースやトレ
ハロース等の糖などを含ませておいてもよい。

【００６２】レポーター相の形状は任意であるが、検出
プローブの展開方向に対し垂直となる方向の吸水性基材
の幅と同様の幅でライン状に形成されるのが好ましい。
また、レポーター相におけるシグナルレポーターの保持
量は特に限定されるものではないが、重量で、導入され
る検出プローブの量以上であるのが好ましい。

【００６３】レポーター相の吸水性基材上における形成
位置としては、本発明の所望の効果の発現を得る観点か
ら、検出プローブを導入する位置、または検出プローブ
を導入する位置と固定相との間であるのが好ましい。

【００６４】シグナルレポーターとして着色粒子や蛍光
色素を用いた場合は、固定相において、それらが発する
色や蛍光をシグナルとして、たとえば、目視により検出
する。ラジオアイソトープを用いた場合は、たとえば、
オートラジオグラフィにより固定相における放射能の存
在をシグナルとして検出する。

【００６５】シグナルレポーターに酵素を用いた場合
は、本発明の検出方法の工程（ａ）において、検出プロ
ーブを吸水性基材上に導入した後、さらに酵素基質液を
本発明の所望の効果の発現が得られるように導入する。
当該酵素基質液の導入位置は前記検出プローブの導入位
置と同一であっても、異なっていてもよい。

【００６６】酵素反応に要する時間は、酵素基質液の展
開時間を含め、酵素基質液を導入してから好ましくは１
〜２０分間程度である。ただし、当該時間は酵素、基
質、反応条件等に依存するため、特に限定されるもので
はない。たとえば、本発明の好適な態様において、発色
性基質を用いた場合、吸水性基材上の固定相においてシ
グナルとして検出される色は、固定相において捕捉され
た前記の標識複合体に含まれるシグナルレポーターの酵
素の作用により基質から生じた発色性産物に由来する。

【００６７】本発明の検出方法においては、展開対象成
分は、吸水性基材上でストリンジェントな条件下に展開
される。従って、展開対象成分は、当該条件に適合する
組成を有する、好ましくは水系の分散液または溶液とし
て吸水性基材上に導入する。「条件に適合する組成」と
は、被検試料中の標的核酸と検出プローブとがハイブリ
ダイズ可能な組成をいい、用いる核酸のＴｍ値や反応環
境の温度等に応じて適宜選択すればよい。かかる組成や
温度の条件については、前記成書等で詳述されている。

【００６８】たとえば、前記検出プローブの溶液や、酵
素基質液を、予め作製しておいた上記組成を有する緩衝
液（ハイブリダイゼーションバッファー）の濃縮液およ
び所望により水で希釈し、所望の組成に調整した後に吸
水性基材上に導入する。また、検出プローブの溶液等は
当初よりハイブリダイゼーションバッファーの組成を有
するように調製しておいてもよい。

【００６９】展開は、検出プローブを導入後、好ましく
は１〜１０分間程度行えばよい。また、該検出プローブ
の導入後、非特異的な核酸の吸着を洗い流す目的で洗浄
液を導入してもよい。当該洗浄液としては前記ハイブリ
ダイゼーションバッファーが好適である。

【００７０】本発明に用いられる吸水性基材としては、
水性の液体を吸収可能な性質を有する基材であれば特に
限定されるものではない。本発明においては、展開対象
成分が速やかに展開できるような適度な吸水性を有する
吸水性基材が好ましい。かかる吸水性基材の具体例とし
ては、例えば、不織布、濾紙、ガラス繊維布、ガラスフ
ィルター、ニトロセルロース、多孔質膜等が挙げられ
る。

【００７１】吸水性基材の吸水性の程度は、たとえば、
厚さ１ｍｍ×幅５ｍｍ×長さ１００ｍｍの吸水性基材の
片端部を水に１分間浸漬した場合に、水に浸漬された部
分と浸漬されない部分との境界位置からの吸水距離が
０．５〜５ｃｍであるのが好ましい。また、吸水性の程
度は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニ
ルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース等の親水性
重合体を、たとえば、吸水性基材の表面に被覆する、も
しくは吸水性基材に含浸させることにより適宜調整する
こともできる。

【００７２】吸水性基材の形状は、前記混合物等を展開
できる形状であれば特に限定されるものではなく、たと
えば、矩形のシート状（片状）やロッド状等の形状が好
ましい。

【００７３】さらに、吸水性基材には滴下パッド部（展
開対象成分を滴下するための部分)、および／または固
定相を挟んで展開対象成分を導入するための部分とは反
対側に、当該展開対象成分の吸水性基材上における展開
を、その水性液体の吸収力により促進させうる手段であ
る吸水パッド部等を設けてもよい。滴下パッド部は、た
とえば、ポリエステルやレーヨン製の不織布等を所望の
形状にて吸水性基材上の所望の位置に貼り合わせること
により適宜作製できる。また、吸水パッド部に使用する
吸水パッドとしては水性液体の吸収性に優れる材料が好
適であり、たとえば、ガラス繊維性不織布等を使用する
ことができる。

【００７４】なお、滴下パッド部は、吸水性基材上で、
前記するような所望の展開移動距離が確保できる位置に
設けられるのが望ましい。

【００７５】たとえば、本発明に使用する吸水性基材の
一例として、図１に示す吸水性基材を挙げることができ
る。吸水性基材の大きさは本発明の所望の効果の発現が
得られれば特に限定されるものではないが、たとえば、
３〜１０ｍｍ×４０〜８０ｍｍ程度の大きさを有する。

【００７６】図１に示す吸水性基材は、滴下パッド１、
吸水性基材２、吸水パッド３、固定相４およびレポータ
ー相５からなる。滴下パッド１と固定相４との間には、
前記好ましい範囲にある展開移動距離を確保しうる距離
が存在する。

【００７７】たとえば、当該吸水性基材を用いて本発明
の検出方法を実施する場合、検出プローブをピペット等
を用いて滴下パッド１に滴下する。滴下された検出プロ
ーブは、吸水性基材２上で図の右から左へ延びた矢印の
向きに展開され、レポーター相５に達する。レポーター
相５では、検出プローブの媒体である水とシグナルレポ
ーターとが接触し、レポーター相５からシグナルレポー
ターが溶出されて展開可能化される。シグナルレポータ
ーは、リガンドとリガンド結合化合物との結合を介して
検出プローブと結合し、いわゆる標識複合体を形成す
る。かかる標識複合体はさらに展開され、固定相４に達
する。固定相４では、被検試料中に標的核酸が存在する
場合、当該標的核酸に対し標識複合体に含まれる検出プ
ローブがハイブリダイズし、標的核酸の分布状態に応じ
て標識複合体が捕捉される（捕捉されなかった標識複合
体は吸水パッド３まで流れて行く）。さらに所望により
洗浄液を滴下パッド１に滴下して展開し、吸水性基材２
上を洗浄する。この時点で、シグナルレポーターが前述
の着色粒子の場合、固定相４に標識複合体が捕捉されて
おれば、捕捉が生じた位置が呈色し、色としてシグナル
が検出される。シグナルレポーターが酵素の場合は、た
とえば、該酵素の作用により発色の得られる発色性基質
を滴下パッド１からさらに展開すれば、固定相４が同様
に呈色し、色としてシグナルが検出される。いずれにし
ても固定相４において、使用したシグナルレポーターに
応じたシグナルが検出されれば、被検試料中に標的核酸
が存在すると判定する。なお、本発明の検出方法は、シ
グナルの検出を目視観察により行いうる条件で実施する
のが好適であるが、目視観察によっては困難である場
合、たとえば、シグナルが色であれば、前記クロマトス
キャナー等を用いてシグナルの検出を行うのが好適であ
る。

【００７８】さらに本発明の別の態様として、本発明の
検出方法において有用な標的核酸の検出用キットを提供
する。当該キットとしては、リガンド結合化合物を有す
るシグナルレポーターを液体との接触により展開可能に
保持させてなるレポーター相を有する吸水性基材と、リ
ガンドを有する検出プローブとを含んでなるものを挙げ
ることができる。それらの吸水性基材ならびに検出プロ
ーブは前記するようにして作製することができる。さら
に、当該キットには、任意にその他の構成物、たとえ
ば、被検試料を入手する手段や、酵素基質液、ハイブリ
ダイゼーションバッファー等の適当な試薬、本発明の検
出方法を実施するための説明書等を含めてもよい。本発
明のキットに含まれる吸水性基材への被検試料の固定化
（該吸水性基材上での固定相の形成）は、該キットの使
用時に所望の被検試料を用い、前記する固定相の形成方
法に従って行えばよい。

【００７９】本発明の検出方法によれば、検出プローブ
等を、本発明において使用する、任意の被検試料を固定
化した固定相とシグナルレポーターを保持させたレポー
ター相とを有する吸水性基材上に、たとえば、滴下する
だけで、たとえば、食中毒の原因菌による食品の汚染の
判定、疾患の病因または病状の診断、生物の遺伝子型タ
イピング等を迅速、簡便に行うことができる。

【００８０】

【実施例】以下、本発明を実施例を挙げて、さらに具体
的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定さ
れるものではない。

【００８１】製造例１：被検試料の調製表１に示したサルモネラ属細菌および非サルモネラ属細
菌を５ｍＬのニュートリエントブロス（Ｎｕｔｒｉｅ
ｎｔＢｒｏｔｈ）（商品名、日水製薬製の粉末培地を
用いて調製）中にて３７℃、一晩培養して得た培養液か
ら、ＩＳＯＧＥＮ（商品名、ニッポンジーン製）を用
い、添付のマニュアルに従って全ＲＮＡを抽出し、滅菌
脱イオン水に溶解して被検試料とした。得られたＲＮＡ
はＯ．Ｄ．２６０の値をもとに１μｇ／μＬとなるよう
適宜希釈した（１Ｏ．Ｄ．２６０＝０．０４μｇ／μＬ
換算）。

【００８２】

【表１】

【００８３】製造例２：ビオチン結合検出プローブとス
トレプトアビジン結合シグナルレポーターの調製下記の配列番号：１記載の塩基配列からなる検出プロー
ブの５’末端を公知の方法によりビオチン標識した。当
該検出プローブは標的核酸であるサルモネラ属細菌２３
ＳｒＲＮＡの塩基配列に相補的であり、該ｒＲＮＡに対
して結合性を有する配列である。配列番号：１５’−ＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＧＴＧＴＣＡＧＣ−３’

【００８４】シグナルレポーターとして使用する着色ラ
テックス粒子（平均粒径０．１８μｍ、日東電工製）の
水分散液に水溶性カルボジイミド（１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
１０ｍｇ／ｍＬ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ８．
２、同仁化学研究所製）０．５ｍＬ、ストレプトアビジ
ン（１ｍｇ／ｍＬ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ８．
２、ロシュ・ダイアグノスティックス製）２ｍＬを加え
て１０℃で３時間反応させた後、洗浄液として０．０１
Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ８．２を加え、遠心分離して洗浄
を行い、同緩衝液で固形分濃度５重量％に調整した。な
お、以下の記述ではストレプトアビジンをＳＡと略す。

【００８５】製造例３：サルモネラ属細菌ｒＲＮＡ検出
用クロマトグラフ型試験片の作製本製造例では、サルモネラ属細菌２３ＳｒＲＮＡを検出
するためのクロマトグラフ型試験片を以下に示す方法で
作製した。なお、本明細書において「上流」とは、後述
の滴下パッドが配置される、吸水性基材の末端側を意味
する。また、得られた試験片の構成は図１に示す吸水性
基材と同様である。

【００８６】吸水性基材の材料としてナイロン６６メン
ブレン（孔径５μｍ、６ｍｍ×４０ｍｍ、ＰＡＬＬ製）
を用いた。この上流端から２２．５ｍｍの箇所に製造例
１で調製した被検試料１．５μＬを、ピペットを用いて
ドット状にスポットした。風乾の後、１２０℃で３０分
間、加熱処理して、被検試料をメンブレンに固定化し、
固定相を形成した。固定化後、１重量％ウシ血清アルブ
ミン（オリエンタル酵母製）、１重量％サッカロース
（和光純薬製）、０．１重量％ポリオキシエチレンソル
ビタンモノラウレート（和光純薬製）にメンブレンを浸
漬してブロッキングし、室温で乾燥させた。なお、被検
試料中のＲＮＡの濃度条件は０、０．１、１μｇ／ｍＬ
の３種とした。

【００８７】また、製造例２に記載するようにして調製
したＳＡ結合シグナルレポーターを終濃度０．１重量％
となるように０．０１Ｍホウ酸−１％（w/v）サッ
カロースｐＨ８．２にて希釈し、その１．５μＬをポリ
エステル製不織布ハイボン４８８０Ｃ（厚さ２．５ｍ
ｍ、大きさ７ｍｍ×１２ｍｍ、シンワ製）の中央にピペ
ットを用いてドット状に塗布したのち風乾した。かかる
不織布を吸水性基材の上流端より３ｍｍのところから貼
り合わせ、レポーター相を兼ねた滴下パッドを設置し
た。

【００８８】さらに、吸水性基材の下流端より５〜１０
ｍｍのところから吸水パッドとしてガラス繊維製の吸水
材（１５ｍｍ×３０ｍｍ、厚さ１ｍｍ、Ｗｈａｔｍａｎ
製）を貼り合わせ、試験片を作製した。当該試験片を１
００個作製して、以降の検出に用いた。

【００８９】実施例１：クロマトグラフ方式によるサル
モネラ属細菌ｒＲＮＡの存在の特異的検出製造例２にて調製した検出プローブを用いて、以下の組
成の展開用組成液を調製した。

【００９０】〔展開用組成液の組成〕２×ＳＳＣ５０％（w/v）ホルムアミド１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ０．１％（w/v）ＳＤＳ５０ｐｍｏｌ／ｍＬ検出プローブ

【００９１】なお、２×ＳＳＣは３３．３ｍＭＮａＣ
ｌ、３３．３ｍＭクエン酸ナトリウムからなる。

【００９２】３７℃に保温した該展開用組成液を、製造
例３で作製した試験片の滴下パッドに１００μＬ滴下し
た。１０分間の展開後、固定相における発色の有無を目
視で観察した。その結果を表２に示す。なお、表２にお
ける判定基準は以下の通りである。

【００９３】〔判定基準〕＋：ラテックス由来の着色あり ±：ラテックス由来の薄い着色あり −：着色なし

【００９４】

【表２】

【００９５】表２に示すように、試験片に固定化した被
検試料にサルモネラ属細菌ＲＮＡが含まれない場合、ま
たサルモネラ属細菌以外の細菌のＲＮＡが含まれる場
合、検出プローブがハイブリダイズする対象が固定相に
存在せず、該検出プローブの固定相における捕捉が生じ
ず、ひいてはシグナルレポーターの捕捉が生じないもの
と思われ、固定相では、着色ラテックス粒子の色として
のシグナルは検出されなかった。一方、サルモネラ属細
菌のＲＮＡを１μｇ／ｍＬの濃度で固定化した場合、固
定相で当該シグナルが検出された。これは被検試料に含
まれるサルモネラ属細菌２３ＳｒＲＮＡと検出プローブ
とがハイブリダイズしたために固定相にシグナルレポー
ターが捕捉され、結果として着色ラテックス粒子由来の
色がシグナルとして検出されえたものと思われる。また
試験片に固定化したサルモネラ属細菌のＲＮＡの濃度を
０．１μｇ／ｍＬとした場合には、固定相にて弱いシグ
ナルが検出された。これは標的核酸の量が減少したため
に固定相で捕捉されるシグナルレポーターが減少し、検
出されるシグナルのレベルが低下したことによるものと
考えられる。いずれにしても、標的核酸であるサルモネ
ラ属細菌２３ＳｒＲＮＡが含まれるサルモネラ属細菌Ｒ
ＮＡを含む被検試料では固定相においてシグナルが検出
されたことから、本発明の検出方法により、被検試料中
の標的核酸の存在を検出できることが分かる。

【００９６】これらの反応は展開用組成液を滴下するだ
けの操作で進行し、約１０分間で結果を得ることができ
た。一般的なハイブリダイゼーション法が洗浄や発色等
の煩雑な操作と１〜２日間程度の時間を必要とするのに
対して、本発明の検出方法ではクロマトグラフ方式を採
用することにより、展開用組成液の滴下のみで操作を完
結させることができる。従って、本発明は、被検試料中
の標的核酸の迅速かつ簡便な検出方法として有効である
ことは明らかである。

【００９７】配列表フリーテキスト配列番号：１は、サルモネラ属細菌の２３ＳｒＲＮＡの
塩基配列に基づいてデザインしたプローブの配列であ
る。

【００９８】

【発明の効果】本発明により、従来のハイブリダイゼー
ション法に比べて非常に操作性に優れた、迅速かつ簡便
に被検試料中の標的核酸の存在を検出することができる
標的核酸の検出方法、ならびに当該検出方法に好適に使
用される標的核酸の検出用キットが提供される。本発明
の検出方法によれば、たとえば、食中毒の原因菌による
食品の汚染の判定、疾患の病因または病状の診断、生物
の遺伝子型タイピング等を迅速、簡便に行うことができ
る。

【００９９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> NITTO DENKO CORPORATION <120> Method of detecting target gene <130> ND-13-021 <160> 1

【０１００】 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed probe based on nucleotide sequence of Salmonella 23SrRNA. <400> 1 cttcacctac gtgtcagc 18

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明に使用する、被検試料を固定化
してなる固定相とシグナルレポーターを保持させてなる
レポーター相とを有する吸水性基材の一例を示す模式図
である。

【符号の説明】１滴下パッド２吸水性基材３吸水パッド４固定相５レポーター相

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｆ 33/569 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者浅井量子大阪府茨木市下穂積１−１−２日東電工株式会社内Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA02 CA09 CA10 CA11 GA19 HA14 4B029 AA07 AA23 BB02 BB20 CC03 CC08 CC10 FA01 FA15 4B063 QA01 QA18 QQ06 QQ42 QQ54 QR32 QR41 QR55 QR66 QR75 QR84 QS12 QS25 QS34 QS39 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】標的核酸との結合性を有する検出プロー
ブを用いる標的核酸の検出方法において、（ａ）被検試
料を固定化してなる固定相と、リガンド結合化合物を有
するシグナルレポーターを液体との接触により展開可能
に保持させてなるレポーター相とを有する吸水性基材上
に、リガンドを有する該検出プローブを導入する工程、
（ｂ）ストリンジェントな条件下、吸水性基材上で該検
出プローブを展開する工程、ならびに（ｃ）固定相にお
いて該シグナルレポーターからのシグナルを検出する工
程、を含み、固定相において該シグナルが検出される場
合に被検試料中に標的核酸が含まれると判定する、標的
核酸の検出方法。
【請求項２】リガンドとリガンド結合化合物が、ビオ
チン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、ＦＩ
ＴＣ−抗ＦＩＴＣ抗体およびジゴキシゲニン−抗ジゴキ
シゲニン抗体からなる群より選択される少なくとも１つ
の組み合わせからなるものである請求項１記載の検出方
法。
【請求項３】シグナルレポーターが着色粒子、酵素ま
たは蛍光色素である請求項１または２記載の検出方法。
【請求項４】標的核酸が一本鎖核酸である請求項１〜
３いずれか記載の検出方法。
【請求項５】一本鎖核酸がリボソームＲＮＡである請
求項４記載の検出方法。
【請求項６】リボソームＲＮＡがサルモネラ菌または
リステリア菌由来のものである請求項５記載の検出方
法。
【請求項７】リガンド結合化合物を有するシグナルレ
ポーターを液体との接触により展開可能に保持させてな
るレポーター相を有する吸水性基材と、リガンドを有す
る検出プローブとを含んでなる標的核酸の検出用キッ
ト。