JP2003199580A

JP2003199580A - エストロゲンレセプター遺伝子およびその利用

Info

Publication number: JP2003199580A
Application number: JP2002004395A
Authority: JP
Inventors: Koichi Saito; 幸一斎藤
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 2002-01-11
Filing date: 2002-01-11
Publication date: 2003-07-15
Also published as: US20060141560A1; US7629138B2; US20090117564A1; US7393945B2

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】環境中の化学物質のエストロゲンレセプター
活性調節能を評価するための試験系開発に利用すること
のできる新たなエストロゲンレセプター遺伝子等を提供
すること。【解決手段】水生動物のモデル動物であるブルーギル
由来の、下記の(a)または(b)のいずれかのアミノ酸配列
を有するエストロゲンレセプターをコードする遺伝子
等。(a)特定のアミノ酸配列。(b)上記のアミノ酸配列に
対して８５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、エストロゲンレセ
プター遺伝子およびその利用に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】近
年、環境中の幾つかの化学物質がエストロゲン様活性を
示すことが報告され、例えばある種の化学物質による野
生の魚類等の雌性化の報告がなされている（T.Colborn,
D.Dumanoski and J.P.Myers著： Our Stolen Future,
1996, Dutton, New York発行）。かかる化学物質の活性
はヒトを含めた各種生物のホルモンバランスを崩し、異
常や疾患の原因となることが危惧されることから、化学
物質の安全性評価の一環として化学物質のエストロゲン
様活性を測定する試みがなされている。エストロゲン
が、エストロゲンの標的細胞に存在するエストロゲンレ
セプターに結合すると、該レセプターは活性化されて染
色体上のエストロゲン応答配列に結合し、そこへさら
に、エストロゲンとエストロゲンレセプターとの複合体
を認識する転写共役因子群が結合して、該応答配列の下
流に在する遺伝子の発現を促進する。そこで、化学物質
のエストロゲン様活性を測定するための方法として、化
学物質のエストロゲンレセプター活性調節能を評価する
ための試験系の開発が求められており、該試験系に利用
することのできるエストロゲンレセプター遺伝子が切望
されている。

【０００３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる状
況の下、鋭意検討した結果、水生動物のモデル動物であ
るブルーギルからエストロゲンレセプター遺伝子を単離
することに成功し、本発明に至った。すなわち、本発明
は、１）下記(a)または(b)のいずれかのアミノ酸配列を有す
るエストロゲンレセプターをコードする遺伝子（以下、
本発明遺伝子と記す。）、 (a)配列番号１で示されるアミノ酸配列。 (b)配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して８５％
以上の配列同一性を示すアミノ酸配列。２）配列番号2で示される塩基配列のうち塩基番号106〜
1767で表される塩基配列を有するエストロゲンレセプタ
ー遺伝子、３）本発明遺伝子を含有するベクター（以下、本発明ベ
クターと記す。）４）宿主細胞内で複製可能なベクターに本発明遺伝子を
組込むことを特徴とするベクターの製造方法、５）本発明遺伝子が宿主細胞に導入されてなる形質転換
体（以下、本発明形質転換体と記す。）、６）本発明遺伝子を宿主細胞に導入することを特徴とす
る形質転換体の製造方法、７）本発明形質転換体を培養してエストロゲンレセプタ
ーを産生させることを特徴とするエストロゲンレセプタ
ーの製造方法、８）本発明遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡ、９）部分塩基配列が、エストロゲンレセプターのリガン
ド結合領域をコードする塩基配列である前項８）記載の
ＤＮＡ、１０）下記の(a)または(b)のいずれかのアミノ酸配列を
有するエストロゲンレセプター、 (a)配列番号1で示されるアミノ酸配列。 (b)配列番号1で示されるアミノ酸配列に対して８５％以
上の配列同一性を示すアミノ酸配列。１１）エストロゲン応答配列を含む転写制御領域の下流
に連結されたレポーター遺伝子と本発明遺伝子とが宿主
細胞に導入されてなる形質転換体と、被験物とを接触さ
せ、該形質転換体における前記レポーター遺伝子の発現
量を測定する工程を含む被験物のエストロゲンレセプタ
ー活性調節能の評価方法、１２）リガンド依存的にエストロゲンレセプターに結合
可能な転写共役因子もしくは該転写共役因子のレセプタ
ー結合領域と、エストロゲンレセプターとがリガンド依
存的に複合体を形成することによりレポーター遺伝子の
転写が活性化されるツーハイブリッドシステムにおい
て、被験物のエストロゲンレセプター活性調節能を測定
するための本発明遺伝子の使用、１３）リガンド依存的にエストロゲンレセプターに結合
可能な転写共役因子もしくは該転写共役因子のレセプタ
ー結合領域と、エストロゲンレセプターのリガンド結合
領域とがリガンド依存的に複合体を形成することにより
レポーター遺伝子の転写が活性化されるツーハイブリッ
ドシステムにおいて、被験物のエストロゲンレセプター
活性調節能を測定するための本発明遺伝子の部分塩基配
列を有するＤＮＡの使用、１４）前項１０）記載のエストロゲンレセプターと被験
物とを接触させ保温する工程を含むレセプターバインデ
ィングアッセイを提供するものである。

【０００４】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明遺伝子としては、具体的には例えば、配列
番号1で示されるアミノ酸配列を有するエストロゲンレ
セプターをコードする遺伝子、配列番号１で示されるア
ミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を示すアミ
ノ酸配列を有するエストロゲンレセプターをコードする
遺伝子、配列番号２で示される塩基配列の塩基番号106
〜1767で表される塩基配列を有するエストロゲンレセプ
ター遺伝子等をあげることができる。ここで、「配列番
号1で示されるアミノ酸配列に対して８５％以上の配列
同一性を示すアミノ酸配列を有するエストロゲンレセプ
ター」としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ
酸配列と約８５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列
を有し、かつ、配列番号１で示されるアミノ酸配列から
なるエストロゲンレセプターと実質的に同等の特性のレ
セプター機能を有する蛋白質をあげることができる。レ
セプター機能は、例えば、後述のレポーターアッセイ、
ツーハイブリッドシステム、レセプターバインディング
アッセイ等に基づき評価することができる。また、かか
るエストロゲンレセプターのアミノ酸配列において認め
られる配列番号１で示されるアミノ酸配列とのアミノ酸
の相違とは、アミノ酸の欠失、置換、付加等である。こ
れらには、人為的に導入され得るアミノ酸変異に加え
て、動物の系統、個体、器官、組織等の違いに基づくア
ミノ酸配列の違いなどの天然に生ずる多型変異も含まれ
る。このような蛋白質をコードする遺伝子としては、天
然の遺伝子であってもよいし、例えば、部位特異的変異
導入法や突然変異処理等によって、天然の遺伝子に変異
を導入することにより作出された遺伝子であってもよ
い。

【０００５】本発明において「配列同一性」とは、２つ
のアミノ酸配列の配列の同一性及び相同性をいう。前記
「配列同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたっ
て、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比
較することにより決定される。ここで、比較対象の塩基
配列又はアミノ酸配列の最適なアラインメントにおい
て、付加又は欠失（例えばギャップ等）を許容してもよ
い。このような配列同一性は、例えば、FASTA［Pearson
& Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA，4, 2444-244
8(1988)］、BLAST［Altschulら、Journal of Molecular
Biology, 215, 403-410(1990)］、CLUSTAL W［Thompso
n,Higgins＆Gibson, Nucleic Acid Research, 22, 4673
-4680(1994a)］等のプログラムを用いて相同性解析を行
いアラインメントを作成することによって算出すること
ができる。上記のプログラムは、例えば、DNA Data Ban
k of Japan［国立遺伝学研究所生命情報・ＤＤＢＪ研
究センター (Center for Information Biology and DNA
Data Bank of Japan ;CIB/DDBJ)内で運営される国際Ｄ
ＮＡデータバンク］のホームページ（http://www.ddbj.
nig.ac.jp）等において、一般的に利用可能である。ま
た、配列同一性は、Vector NTI、GENETYX-WIN Ver.5
（ソフトウェア開発株式会社製）等の市販の配列解析ソ
フトウェアを用いて求めることもできる。本発明におけ
る配列同一性は、例えば、８５％以上であることが好ま
しい。

【０００６】本発明遺伝子は、例えば、魚類ブルーギル
（学名:Lepomis centrarchidae）などの魚類等の動物の
組織から、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレ
キュラークローニング第２版（Molecular Cloning 2nd
edition）、コールドスプリングハーバーラボラトリ
ー（Cold Spring Harbor Laboratory発行、1989年）等
に記載の遺伝子工学的方法に準じて取得することができ
る。具体的には、まず、ブルーギルなどの魚類等の動物
の組織由来の全RNAを調製する。例えば、ブルーギルの
肝臓等の組織を塩酸グアニジンやグアニジンチオシアネ
ート等の蛋白質変性剤を含む溶液中で粉砕し、さらに該
粉砕物にフェノール、クロロホルム等を加えることによ
り蛋白質を変性させる。変性蛋白質を遠心分離等により
除去した後、回収された上清画分から塩酸グアニジン／
フェノール法、SDS−フェノール法、グアニジンチオシ
アネート／CsCl法等の方法により全RNAを抽出する。な
お、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例
えばISOGEN（ニッポンジーン製）がある。得られた全RN
Aを鋳型としてオリゴdTプライマーをRNAのポリA配列に
アニールさせ、逆転写酵素により一本鎖cDNAを合成す
る。次いで、該一本鎖cDNAを鋳型とし、かつ大腸菌RNas
eHを用いてRNA鎖にニックとギャップを入れることによ
り得られるRNAをプライマーとして大腸菌のDNAポリメラ
ーゼＩを用いて二本鎖のcDNAを合成する。更に該二本鎖
cDNAの両末端をT4 DNAポリメラーゼにより平滑化する。
得られた二本鎖cDNAはフェノール−クロロホルム抽出、
エタノール沈殿等の通常の方法により精製、回収する。
なお、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、
例えばcDNA合成システムプラス（アマシャムファルマシ
アバイオテク社製）やTimeSaver cDNA合成キット（アマ
シャムファルマシアバイオテク社製）等があげられる。
次に、得られた二本鎖cDNAを例えば、プラスミドpUC118
やファージλgt10などのベクターとリガーゼを用いて連
結することによりcDNAライブラリーを作製する。このよ
うなcDNAライブラリーから、例えば、配列番号2で示さ
れる塩基配列の部分塩基配列を有するDNAをプローブと
して用いるハイブリダイゼーション法や、配列番号2で
示される塩基配列の部分塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして用いるポリメラーゼチェイン
反応（以下、PCRと記す。）により、本発明遺伝子を取
得することができる。ハイブリダイゼーション法に用い
られるプローブとしては、例えば、配列番号2で示され
る塩基配列の塩基番号166〜261または1654〜1800で表さ
れる塩基配列のいずれかを有するDNA等があげられる。
また、ハイブリダイゼーションの条件としては、例え
ば、6×SSC（0.9M NaCl、0.09Mクエン酸ナトリウム）、
5×デンハルト溶液（0.1%(w/v) フィコール400、0.1%(w
/v) ポリビニルピロリドン、0.1%(w/v)BSA）、0.5%(w/
v) SDSおよび100μg/ml変性サケ精子DNA存在下、または
100μg/ml変性サケ精子DNAを含むDIG EASY Hyb溶液（ベ
ーリンガーマンハイム社）中で、65℃で保温し、次いで
１×SSC（0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム）お
よび0.5%(w/v)SDS存在下に、室温で15分間の保温を2回
行い、さらに0.1×SSC（0.015M NaCl、0.0015Mクエン酸
ナトリウム）および0.5%(w/v)SDS存在下に、68℃で30分
間保温する条件等をあげることができる。PCRに用いら
れるプライマーとしては、例えば、約20bpから約40bp程
度の長さの塩基配列を、配列番号2で示される塩基配列
の5'末端非翻訳領域から選択した塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチドおよび3'非翻訳領域から選択した塩基配
列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合
成するとよい。具体的には、例えばフォワードプライマ
ーとしては配列番号４で示される塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチドがあげられ、リバースプライマーとして
は配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドがあげられる。また、フォワードプライマーとし
て配列番号２で示される塩基配列の塩基番号41〜68で表
される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、より具体
的には配列番号８で示される塩基配列からなるオリゴヌ
クレオチドをあげることもでき、リバースプライマーと
して配列番号２で示される塩基配列の塩基番号1874〜19
00で表される塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチド、より具体的には配列番号９で示される
塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをあげることもで
きる。PCRの条件としては、例えば、反応液50μl中に、
10 x Ex Taq緩衝液（宝酒造社製）5μl、2.5mMdNTP混合
液（各2.5mMのdATP, dGTP, dCTP, dTTPを含む。）4μl
（dATP, dGTP, dCTP,およびdTTP各々の終濃度が0.2m
M）、20μMプライマー各0.25〜1.25μl（終濃度が0.1
〜0.5μM）、鋳型cDNA 0.1〜0.5μg、Ex Taq polymeras
e（宝酒造社製）1.25 ユニットを含む組成の反応液にて、94
℃で1分間次いで55℃で2分間更に72℃で2.5分間の保温
を1サイクルとしてこれを全30サイクル行う等の条件が
挙げられる。このようにして得られた本発明遺伝子は、
例えば、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキ
ュラークローニング第２版（Molecular Cloning 2nd e
dition）、コールドスプリングハーバーラボラトリー
（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、1989年等に
記載の遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニン
グすることができる。具体的には例えば、TAクローニン
グキット（Invitrogen社）やpBluescriptII（Stratagen
e社）などの市販のプラスミドベクターを用いてクロー
ニングすることができる。尚、本発明遺伝子は、配列番
号2で示される塩基配列に基づいて、例えばホスファイ
ト・トリエステル法（Hunkapiller,M.et al., Nature,
310, 105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学
合成を行うことにより調製することもできる。得られた
本発明遺伝子の塩基配列は、Maxam Gilbert法 (例え
ば、Maxam,A.M &W.Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
74, 560, 1977 等に記載される)やSanger法（例えばSan
ger,F. & A.R.Coulson, J.Mol.Biol., 94, 441, 1975、
Sanger,F, & Nicklen and A.R.Coulson., Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA, 74, 5463, 1977等に記載される）等により
確認することができる。

【０００７】本発明遺伝子を、該遺伝子が導入される宿
主細胞において利用可能なベクター（以下、基本ベクタ
ーと記す。）、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情
報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主細胞
からの単離、精製が可能であり、検出可能なマーカーを
もつベクターに、通常の遺伝子工学的手法に準じて組み
込むことにより本発明ベクターを構築することができ
る。本発明ベクターの構築に用いることができる基本ベ
クターとしては、具体的には微生物である大腸菌を宿主
細胞とする場合、例えばプラスミドpUC119(宝酒造社製)
や、ファージミドpBluescriptII(Stratagene社製)等を
上げることができる。出芽酵母を宿主細胞とする場合
は、プラスミドpGBT9、pGAD424、pACT2(Clontech社製)
などをあげることができる。また、哺乳類動物細胞を宿
主細胞とする場合はpRc/RSV、pRc/CMV(Invitrogen社製)
等のプラスミド、ウシパピローマウイルスプラスミドpB
PV(アマシャムファルマシアバイオテク社製)もしくはEB
ウイルスプラスミドpCEP4(Invitrogen社製)等のウイル
ス由来の自律複製起点を含むベクター、ワクシニアウイ
ルス等のウイルスなどをあげることができ、昆虫類動物
細胞を宿主細胞とする場合には、バキュロウイルス等の
昆虫ウイルスをあげることができる。自律複製起点を含
むベクター、例えば、上記の酵母用プラスミドpACT2
や、ウシパピローマウイルスプラスミドpBPV、EBウイル
スプラスミドpCEP4などを用いて本発明ベクターを構築
すると、該ベクターは宿主細胞に導入された際にエピソ
ームとして細胞内に保持される。バキュロウイルスやワ
クシニアウイルス等のウイルスに本発明遺伝子を組み込
むには、使用しようとするウイルスのゲノムと相同な塩
基配列を含有するトランスファーベクターを用いること
ができる。このようなトランスファーベクターの具体的
例としては、Pharmingen社から市販されているpVL1392,
pVL1393(Smith,G.E.,Summers M.D.et al.:Mol.Cell.Bio
l.,3,2156-2165(1983))、pSFB5(Funahashi,S.et al.:J.
Virol.,65,5584-5588(1991))などのプラスミドをあげる
ことができる。本発明遺伝子を前記のようなトランスフ
ァーベクターに挿入し、該トランスファーベクターとウ
イルスのゲノムとを同時に宿主細胞に導入すると、トラ
ンスファーベクターとウイルスのゲノムとの間で相同組
換えが起こり、本発明遺伝子がゲノム上にくみこまれた
ウイルスを得ることができる。ウイルスのゲノムとして
は、Baculovirus,Adenovirus,Vacciniavirusなどのゲノ
ムを用いることができる。より具体的には、例えばバキ
ュロウイルスに本発明遺伝子を組み込む場合、トランス
ファーベクターpVL1393,pVL1392等のマルチクローニン
グ部位に本発明遺伝子を挿入した後、該トランスファー
ベクターのDNAとBaculovirus genome DNA(Baculogold;P
harmingen社製)とを昆虫細胞Sf21株（ATCCから入手可
能）にリン酸カルシウム法等により導入し、得られた細
胞を培養する。培養液から遠心分離等により、本発明遺
伝子が挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイルス
粒子を回収し、これをフェノール等で除蛋白処理するこ
とにより、本発明遺伝子を含有するウイルスのゲノムを
得ることができる。さらに、該ウイルスのゲノムを、昆
虫細胞Sf21株などのウイルス粒子形成能を有する宿主細
胞にリン酸カルシウム法等により導入し、得られる細胞
を培養することにより、本発明遺伝子を含有するウイル
ス粒子を増やすことができる。一方、マウス白血病レト
ロウイルスなどの比較的小さなゲノムへは、トランスフ
ァーベクターを利用せずに、本発明遺伝子を直接組み込
むこともできる。例えばウイルスベクタ-DC(X)（Eli Gi
lboa et al.,BioTechniques,4,504-512(1986)）など
は、該ベクター上のクローニング部位に本発明遺伝子を
組み込む。得られた本発明遺伝子の組込れたウイルスベ
クターを、例えばAmpli-GPE（J.Virol.,66,3755(199
2)）などのパッケージング細胞に導入することにより、
本発明遺伝子の挿入されたウイルスのゲノムを含有する
ウイルス粒子を得ることができる。

【０００８】本発明遺伝子の上流に、宿主細胞で機能可
能なプロモーターを機能可能な形で結合させ、これを上
述のような基本ベクターに組み込むことにより、本発明
遺伝子を宿主細胞で発現させることの可能な本発明ベク
ターを構築することができる。ここで、「機能可能な形
で結合させる」とは、本発明遺伝子が導入される宿主細
胞において、プロモーターの制御下に本発明遺伝子が発
現されるように、該プロモーターと本発明遺伝子とを結
合させることを意味する。宿主細胞で機能可能なプロモ
ーターとしては、導入される宿主細胞内でプロモーター
活性を示すＤＮＡをあげることができる。例えば、宿主
細胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペ
ロンのプロモーター（lacP）、トリプトファンオペロン
のプロモーター(trpP)、アルギニンオペロンのプロモー
ター(argP)、ガラクトースオペロンのプロモーター(gal
P)、tacプロモーター、T7プロモーター、T3プロモータ
ー、λファージのプロモーター(λ-pL、λ-pR)等をあげ
ることができ、宿主細胞が動物細胞や分裂酵母である場
合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモータ
ー、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、シミア
ンウイルス(SV40)の初期または後期プロモーター、マウ
ス乳頭腫ウイルス(MMTV)プロモーター等をあげることが
できる。宿主細胞が出芽酵母である場合にはADH1プロモ
ーターなどをあげることができる。また、宿主細胞にお
いて機能するプロモーターをあらかじめ保有する基本ベ
クターを使用する場合には、ベクター保有のプロモータ
ーと本発明遺伝子とが機能可能な形で結合するように、
該プロモーターの下流に本発明遺伝子を挿入すればよ
い。例えば、前述のプラスミドpRc/RSV、pRc/CMV等は、
動物細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニン
グ部位が設けられており、該クローニング部位に本発明
遺伝子を挿入し動物細胞へ導入することにより、本発明
遺伝子を発現させることができる。これらのプラスミド
にはあらかじめSV40の自律複製起点（ori）が組み込ま
れているため、oriを欠失したSV40ゲノムで形質転換さ
れた培養細胞、例えばCOS細胞等に該プラスミドを導入
すると、細胞内でプラスミドのコピー数が非常に増大
し、結果として該プラスミドに組み込まれた本発明遺伝
子を大量発現させることもできる。また前述の酵母用プ
ラスミドpACT2はADH1プロモーターを有しており、該プ
ラスミドまたはその誘導体のADH1プロモーターの下流に
本発明遺伝子を挿入すれば、本発明遺伝子を例えばCG19
45(Clontech社製)等の出芽酵母内で大量発現させること
が可能な本発明ベクターが構築できる。

【０００９】構築された本発明ベクターを宿主細胞に導
入することにより、本発明形質転換体を取得することが
できる。本発明ベクターを宿主細胞へ導入する方法とし
ては、宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用すること
ができる。例えば、微生物である大腸菌を宿主細胞とす
る場合は、「モレキュラー・クローニング」（J.Sambrook
ら、コールド・スプリング・ハーバー、1989年）等に記
載される塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法
等の通常の方法を用いることができる。また、哺乳類動
物細胞、魚類動物細胞または昆虫類動物細胞を宿主細胞
とする場合は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキ
ストラン法、エレクトロポレーション法、またはリポフ
ェクション法等の一般的な遺伝子導入法に準じて前記細
胞に導入することができる。酵母を宿主細胞とする場合
は、例えばリチウム法を基にしたYeast transformation
kit(Clontech社製)などを用いて導入することができ
る。尚、ウイルスをベクターに用いる場合には、上述の
ように一般的な遺伝子導入法によりウイルスのゲノムを
宿主細胞に導入できるほか、本発明遺伝子の挿入された
ウイルスのゲノムを含有するウイルス粒子を、宿主細胞
へ感染させることによっても、該ウイルスのゲノムを宿
主細胞に導入することができる。

【００１０】本発明形質転換体を選抜するには、例え
ば、本発明ベクターと同時にマーカー遺伝子を宿主細胞
へ導入し、マーカー遺伝子の性質に応じた方法で細胞を
培養すればよい。例えば、マーカー遺伝子が、宿主細胞
に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する
遺伝子である場合には、該薬剤を添加した培地を用い
て、本発明ベクターが導入された宿主細胞を培養すれば
良い。薬剤耐性付与遺伝子と選抜薬剤の組み合わせとし
ては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイ
シンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子
とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジン
Ｓ耐性付与遺伝子とブラストサイジンＳとの組み合わせ
などをあげることができる。また、マーカー遺伝子が宿
主細胞の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、
該栄養素を含まない最少培地を用いて、本発明ベクター
が導入された細胞を培養すればよい。また、本発明遺伝
子を宿主細胞で発現させることの可能な本発明ベクター
を導入した場合には、エストロゲン結合活性に基づく検
出方法を用いることもできる。本発明遺伝子が宿主細胞
の染色体に導入されてなる本発明形質転換体を取得する
には、例えば、本発明ベクターとマーカー遺伝子を有す
るベクターとを制限酵素等で消化することにより直鎖状
にした後、これらを前述の方法で宿主細胞へ導入して該
細胞を通常数週間培養し、導入されたマーカー遺伝子の
発現を指標にして目的とする形質転換体を選抜すればよ
い。また、例えば、上記のような選抜薬剤に対する耐性
付与遺伝子をマーカー遺伝子として有する本発明ベクタ
ーを前述の方法で宿主細胞に導入し、該細胞を選抜薬剤
が添加された培地で数週間以上該細胞を継代培養して、
コロニー状に生き残った選抜薬剤耐性クローンを純化培
養することにより、本発明遺伝子が宿主細胞の染色体に
導入されてなる本発明形質転換体を選抜することもでき
る。該形質転換体は、凍結保存が可能であり必要に応じ
て起眠して使用することができるので、実験毎の形質転
換体作製の手間を省くことができ、また、あらかじめ性
質や取扱い条件の確認された形質転換体を用いて試験を
実施することが可能となる。

【００１１】上述のようにして得られた本発明形質転換
体を培養することによりエストロゲンレセプターを産生
させることができる。例えば、本発明形質転換体が微生
物である場合、該形質転換体は、一般微生物における通
常の培養に使用される炭素源や窒素源、有機ないし無機
塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養することができ
る。培養は、一般微生物における通常の方法に準じて行
い、固体培養、液体培養（旋回式振とう培養、往復式振
とう培養、ジャーファーメンター（JarFermenter）培
養、タンク培養等）などが可能である。培養温度および
培地のｐＨは、微生物が生育する範囲から適宜選ぶこと
ができ、例えば、約15℃〜約40℃の培養温度にて、約6.
0〜約8.0の培地pHで培養するのが一般的である。培養時
間は、種々の培養条件によって異なるが、通常約１日間
〜約5日間である。温度シフト型やIPTG誘導型等の誘導
型のプロモーターを有する発現ベクターを用いた場合に
は誘導時間は1日以内が望ましく、通常数時間である。
また、上記形質転換体が哺乳類、魚類、昆虫類等の動物
細胞である場合、該形質転換体は一般の培養細胞におけ
る通常の培養に使用される培地を用いて培養することが
できる。選抜薬剤を利用して当該形質転換体を作製した
場合は、該選抜薬剤の存在下に培養するのが望ましい。
哺乳類動物細胞の場合、例えば終濃度が10%となるようF
BSを添加したDMEM培地（ニッスイ社製等）を用いて37
℃、5％CO₂存在下等の条件で数日ごとに新しい培養液に
交換しながら培養すればよい。細胞がコンフルエントに
なるまで増殖したら、例えば0.25%(w/v)程度となるよう
トリプシンが添加されたPBS溶液を加えて個々の細胞に
分散させ、数倍に希釈して新しいシャーレに播種し培養
を続ける。昆虫類動物細胞の場合も同様に、例えばGrac
e's medium +10%(v/v)FBS＋2%(w/v)Yeastlate等の昆虫
細胞用培養液を用いて培養温度25℃から35℃で培養すれ
ばよい。この際、Sf21細胞などのシャーレからはがれや
すい細胞の場合は、トリプシン液を用いずピペッテイン
グにより分散させ継代培養を行なうことができる。ま
た、バキュロウイルス等のウイルスベクターを含む形質
転換体の場合は、培養時間は細胞質効果が現れて細胞が
死滅する前、例えばウイルス感染後72時間までとするの
が好ましい。本発明形質転換体により産生されたエスト
ロゲンレセプターの回収は、適宜、通常の単離、精製の
方法を組み合わせて行えば良く、例えば、培養終了後、
形質転換体の細胞を遠心分離等で集め、集められた該細
胞を通常のバッファー、例えば20mM HEPES pH7,1mM EDT
A,1mM DTT,0.5mM PMSFからなるバッファーに懸濁した
後、ポリトロン、超音波処理、ダウンスホモジナイザー
等で破砕し、破砕液を数万xgで数十分間から1時間程度
超遠心分離し、上清画分を回収することにより、エスト
ロゲンレセプターを含む画分を得ることができる。さら
に、前記上清画分をイオン交換、疎水、ゲルろ過、アフ
ィニティ等の各種クロマトグラフィーに供することによ
り、より精製されたエストロゲンレセプターを回収する
こともできる。この際、エストロゲン応答配列すなわち
エストロゲンレセプターが結合する塩基配列を含む約15
bpから約200bp程度の長さのオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとしたDNA結合アッセイなどにより、本発明のエス
トロゲンレセプターを含む画分を見分けることもでき
る。このようにして製造された本発明のエストロゲンレ
セプターは、例えば、被験物のエストロゲンレセプター
に対する結合能・結合量を評価するためのレセプターバ
インディングアッセイ等に用いることができる。

【００１２】本発明遺伝子は、例えば、被験物のエスト
ロゲンレセプター活性調節能を評価するためのレポータ
ーアッセイに利用することができる。エストロゲンレセ
プター活性調節能としては、エストロゲンレセプターに
対するアゴニスト活性、アンタゴニスト活性等があげら
れる。本発明遺伝子を用いたレポーターアッセイにおい
て使用される「エストロゲン応答配列を含む転写制御領
域の下流に連結されたレポーター遺伝子」とは、具体的
には、例えばエストロゲン応答配列を含むアフリカツメ
ガエルのビテロジェニン遺伝子の転写制御領域等の下流
にレポーター遺伝子を結合させたキメラ遺伝子、または
エストロゲン応答配列の下流に転写開始に必要な塩基配
列とレポーター遺伝子を連結させたキメラ遺伝子などで
あり、宿主細胞内でのエストロゲンレセプターの転写調
節能をモニターするために用いることができる。このよ
うなキメラ遺伝子作製に用いられるレポーター遺伝子と
しては、ルシフェラーゼ遺伝子、分泌型アルカリフォス
ファターゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、クロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、成
長ホルモン遺伝子などを利用することができ、宿主細胞
における安定性が比較的高いレポーター蛋白質をコード
する遺伝子が好ましい。まず、本発明遺伝子と、エスト
ロゲン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結された
レポーター遺伝子とを、例えばエストロゲンレセプター
非内在性宿主細胞、具体的には例えばHeLa細胞、CV-1細
胞、Hepa1細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、COS1細胞、BF
-2細胞、CHH-1細胞等に導入し形質転換体を作製する。
ここで、本発明遺伝子は、例えば上述のように、宿主細
胞で機能可能なプロモーターと機能可能な形で結合され
基本ベクターに組み込まれた形で宿主細胞へ導入すると
よい。エストロゲン応答配列を含む転写制御領域の下流
に連結されたレポーター遺伝子も、基本ベクターに組み
込んで用いるとよい。また例えば、エストロゲン応答配
列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺
伝子が組み込まれたベクターと、宿主細胞で機能可能な
プロモーターと機能可能な形で結合された本発明遺伝子
を保有するベクターとを、マーカー遺伝子を有するベク
ターとともに宿主細胞に導入し、マーカー遺伝子の発現
を指標にして選抜することにより、エストロゲン応答配
列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺
伝子、および宿主細胞で機能可能なプロモーターと機能
可能な形で結合された本発明遺伝子が宿主細胞の染色体
に導入されてなる形質転換体を取得することができる。
該形質転換体は凍結保存が可能であり必要に応じて起眠
して使用することができるので、これをいったん取得す
ると、アッセイのたびにこれらの遺伝子を宿主細胞に導
入して新たな形質転換体を取得する必要がなく、また、
形質転換体の性能も一定に保つことができることから、
例えば自動化されたロボットによる大規模スクリーニン
グを実施する際にも有用である。上述のように作製され
た形質転換体を、例えば1日間から数日間培養する間
に、被験物を培地中に加えて前記形質転換体と接触さ
せ、該形質転換体における前記レポーター遺伝子の発現
量を測定する。該形質転換体が産生するエストロゲンレ
セプターが被験物中のエストロゲン様活性物質の結合に
より活性化された場合は、レポーター遺伝子の転写が促
進され、レポーター遺伝子にコードされた蛋白質が形質
転換体の細胞内などに蓄積されるかもしくは培地中に分
泌される。この蛋白質の量を測定することにより、該形
質転換体の細胞あたりのレポーター遺伝子の発現量を測
定する。具体的には、例えば、レポーター遺伝子として
ルシフェラーゼ遺伝子を用いた場合は、細胞粗抽出物に
ルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを加えると、
細胞抽出物中のルシフェラーゼ量に比例した強度で発光
する。従って、この発光強度をルミノメーターなどの測
定装置で測定することにより、ルシフェラーゼの量、ひ
いては、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現量を知
ることができる。同様にして、形質転換体に被験物を接
触させない条件下におけるレポーター遺伝子の発現量を
測定し、該発現量と、被験物を接触させた条件下におけ
るレポーター遺伝子発現量とを比較することにより、被
験物中のエストロゲン様活性物質のエストロゲンレセプ
ターに対するアゴニスト活性、すなわち、該レセプター
の活性化能を評価することができる。また、例えば、上
記の形質転換体に17β−エストラジオール（以下、E2と
記す。）等のエストロゲンを接触させた条件下、およ
び、該エストロゲンと被験物とを同時に接触させた条件
下にそれぞれ上記と同様の方法でレポーター遺伝子の発
現量を測定する。形質転換体にエストロゲンを接触させ
た条件下におけるレポーター遺伝子の発現量と比較し
て、エストロゲンと被験物とを接触させた条件下におけ
るレポーター遺伝子の発現量が低ければ、この被験物は
エストロゲンレセプターに対するアンタゴニスト活性、
すなわち、該レセプターの抗活性化能を有すると評価す
ることができる。

【００１３】また、本発明遺伝子または本発明遺伝子の
部分塩基配列を有するＤＮＡを、細胞内のレポーター遺
伝子の発現量を指標として、２種の融合蛋白質（two-hy
brid）の複合体形成能および形成された複合体の転写調
節能を検出することのできる試験系（ツーハイブリッド
システム； Nishikawa et al.,Toxicol. Appl. Pharmac
ol.,154,76-83(1999)）に利用することができる。具体
的には例えば、本発明遺伝子にコードされるエストロゲ
ンレセプターまたは該レセプターのリガンド結合領域
と、リガンド依存的に該レセプターに結合可能な転写共
役因子とが、リガンド依存的に複合体を形成することに
よりレポーター遺伝子の転写が活性化されるツーハイブ
リッドシステムにおいて、被験物の添加によるレポータ
ー遺伝子の発現量の増減を測定することにより、被験物
のエストロゲンレセプター活性調節能を評価することが
できる。エストロゲンレセプター活性調節能としては、
エストロゲンレセプターに対するアゴニスト活性、アン
タゴニスト活性等があげられる。かかるツーハイブリッ
ドシステムとしては、例えば、下記の（ｃ）〜（ｅ）記
載の遺伝子の各一が同一の宿主細胞に導入されてなる形
質転換体をあげることができる。（ｃ）宿主細胞内で機能可能なプロモーターの下流に接
続されており、宿主細胞内で機能可能な転写調節因子の
DNA結合領域と、本発明のエストロゲンレセプターまた
は該レセプターのリガンド結合領域との融合蛋白質をコ
ードする塩基配列からなるキメラ遺伝子。（ｄ）宿主細胞内で機能可能なプロモーターの下流に接
続されており、宿主細胞内で機能可能な転写調節因子の
転写活性化領域と、本発明のエストロゲンレセプターに
リガンド依存的に結合可能な転写共役因子または該転写
共役因子のレセプター結合領域との融合蛋白質をコード
する塩基配列からなるキメラ遺伝子。（ｅ）（ｃ）記載のＤＮＡ結合領域が結合可能な塩基配
列および（ｄ）記載の転写活性化領域により活性化され
得るプロモーターの下流に接続されてなるレポーター遺
伝子。宿主細胞としては、例えば、出芽酵母細胞や、HeLa細胞
などの哺乳類動物細胞等があげられる。本発明のエスト
ロゲンレセプターに対する被験物の活性調節能を精度よ
く測定するためには、エストロゲンレセプター非内在性
の細胞を使用することが好ましい。上記（ｃ）記載の
「宿主細胞内で機能可能な転写調節因子の転写活性化領
域」としては、例えば、宿主細胞として出芽酵母細胞を
使用する場合には、酵母由来の転写調節因子GAL4のDNA
結合領域、ハ゛クテリア由来のリフ゜レッサーLexA等をあげることが
できる。これらをコードするDNAと、本発明遺伝子のDNA
もしくは本発明遺伝子の部分塩基配列であってエストロ
ゲンレセプターのリガンド結合領域をコードする塩基配
列を有するDNAとを、その塩基配列の読み枠を合わせて
連結することにより、（ｃ）記載の「宿主細胞内で機能
可能な転写調節因子のDNA結合領域と、本発明のエスト
ロゲンレセプターまたは該レセプターのリガンド結合領
域との融合蛋白質をコードする塩基配列からなるキメラ
遺伝子」が得られる。前記の「本発明遺伝子の部分塩基
配列であってエストロゲンレセプターのリガンド結合領
域をコードする塩基配列を有するDNA」としては、例え
ば、本発明遺伝子の塩基配列のうちエストロゲンレセプ
ターのリガンド結合領域をコードする塩基配列を含みDN
A結合領域をコードする塩基配列を含まない塩基配列か
らなるDNA等をあげることができる。具体的には例え
ば、配列番号２で示される塩基配列のうち、少なくとも
塩基番号873〜1689で表される塩基配列を含み、塩基番
号1〜762で表される塩基配列を含まない塩基配列をあげ
ることができ、より具体的には、配列番号２で示される
塩基配列の塩基番号763〜1767で表される塩基配列を有
するDNA等をあげることができる。また、（ｄ）記載の
「宿主細胞内で機能可能な転写調節因子の転写活性化領
域」としては、例えば、GAL4の転写活性化領域、大腸菌
由来のB42酸性転写活性化領域等があげられる。「本発
明のエストロゲンレセプターにリガンド依存的に結合可
能な転写共役因子」とは、本発明のエストロゲンレセプ
ターとリガンドとの複合体を認識してこれに結合可能な
転写共役因子であって、具体的にはSRC1/NCoA1（Onate,
S.A.ら、Science,1995,270, 1354）、TIF2/GRIP1（Voeg
el,J.J.ら、EMBO,J.,1996,15, 3667）などがあげられ
る。前記のような転写活性化領域をコードするDNAと、
前記転写共役因子もしくは該因子のレセプター結合領域
をコードするDNAとを、その塩基配列の読み枠を合わせ
て連結することにより、（ｄ）記載の「宿主細胞内で機
能可能な転写調節因子の転写活性化領域と、本発明のエ
ストロゲンレセプターにリガンド依存的に結合可能な転
写共役因子または該転写共役因子のレセプター結合領域
との融合蛋白質をコードする塩基配列からなるキメラ遺
伝子」を得ることができる。尚、（ｃ）および（ｄ）記
載のキメラ遺伝子の構成を互いに入れ替えて、「宿主細
胞内で機能可能な転写調節因子のDNA結合領域と、本発
明のエストロゲンレセプターにリガンド依存的に結合可
能な転写共役因子または該転写共役因子のレセプター結
合領域との融合蛋白質をコードする塩基配列からなるキ
メラ遺伝子」および「宿主細胞内で機能可能な転写調節
因子の転写活性化領域と、本発明のエストロゲンレセプ
ターまたは該レセプターのリガンド結合領域との融合蛋
白質をコードする塩基配列からなるキメラ遺伝子」の組
合せとしてもよい。これらのキメラ遺伝子は、それぞれ
「宿主細胞内で機能可能なプロモーター」の下流に接続
されており、このようなプロモーターとしては、例え
ば、宿主細胞が出芽酵母細胞である場合には、GAL1プロ
モーターのような誘導型プロモーターや、ADHプロモー
ターのような恒常的に発現するプロモーター等を使用す
ることができる。（ｅ）記載のレポーター遺伝子として
は、ルシフェラーゼ遺伝子、分泌型アルカリフォスファ
ターゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、成長ホ
ルモン遺伝子などを利用することができ、宿主細胞にお
ける安定性が比較的高いレポーター蛋白質をコードする
遺伝子が好ましい。該レポーター遺伝子は、上記ＤＮＡ
結合領域が結合可能な塩基配列および上記転写活性化領
域により活性化され得るプロモーターの下流に接続され
る。例えば、GAL4のDNA結合領域が結合可能な塩基配列
としては、GAL1プロモーターのGAL4結合領域をあげるこ
とができ、LexAが結合可能な塩基配列としては、LexA結
合領域があげられる。また、GAL4の転写活性化領域によ
り活性化され得るプロモーターとしては、例えば、酵母
由来の最小TATAbox配列があげられる。上述のようなキ
メラ遺伝子およびレポーター遺伝子を、例えばそれぞれ
ベクターに挿入し、それらを同一の宿主細胞に導入して
形質転換体を取得する。尚、宿主細胞が、利用可能な内
在性のレポーター遺伝子を有する場合はそれを利用して
も良く、この場合はレポーター遺伝子の導入を省略する
ことができる。また、ツーハイブリッドシステムを調製
するための市販のキット、例えばMatchmaker Two-hybri
d System（Clontech社製）、CheckMate Mammalian Two-
Hybrid System（Promega）等を利用して形質転換体を調
製することもできる。本発明遺伝子にコードされるエス
トロゲンレセプターもしくは該レセプターのリガンド結
合領域と、リガンド依存的に該レセプターに結合可能な
転写共役因子とがリガンド依存的に複合体を形成するこ
とにより、レポーター遺伝子の転写が活性化されるツー
ハイブリッドシステムの構成の一例としては、例えば、
下記の（ｆ）および（ｇ）記載の遺伝子が、内在性のGA
L1 UAS（upstream activating sequence)および酵母由
来の最小TATA box配列の下流に接続されてなるLacZ遺伝
子（レポーター遺伝子）を有する出芽酵母Y190株(Clont
ech社製)に導入された形質転換体をあげることができ
る。（ｆ）ADH1プロモーターの下流に接続されており、GAL4
のDNA結合領域と、本発明のエストロゲンレセプターま
たは該レセプターのリガンド結合領域との融合蛋白質を
コードする塩基配列からなるキメラ遺伝子。（ｇ）ADH1プロモーターの下流に接続されており、GAL4
の転写活性化領域と本発明のエストロゲンレセプターに
リガンド依存的に結合可能な転写共役因子TIF2またはTI
F2のレセプター結合領域との融合蛋白質をコードする塩
基配列からなるキメラ遺伝子。上述のように作製された形質転換体を、例えば数時間か
ら数日間培養する間に、被験物を培地中に加えて前記形
質転換体と接触させ、エストロゲンレセプターもしくは
該レセプターのリガンド結合領域と、転写共役因子もし
くは該因子のレセプター結合領域との複合体形成を惹起
させ、その複合体の転写調節能を前記レポーター遺伝子
の発現量を指標にして測定する。具体的には、例えば、
レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いた
場合には、被験物を接触させた形質転換体から調製され
た細胞粗抽出物に、ルシフェラーゼの基質であるルシフ
ェリンを加えると、細胞粗抽出物中のルシフェラーゼ量
に比例した強度で発光する。従って、この発光強度をル
ミノメーターなどの測定装置で測定することにより、ル
シフェラーゼの量、ひいては、ルシフェラーゼレポータ
ー遺伝子の発現量を知ることができる。同様にして、形
質転換体に被験物を接触させない条件下におけるレポー
ター遺伝子の発現量を測定し、該発現量と、被験物を接
触させた条件下における発現量とを比較することによ
り、被験物中のエストロゲン様活性物質のエストロゲン
レセプターに対するアゴニスト活性、すなわち、該レセ
プターの活性化能を評価することができる。また、例え
ば、上記の形質転換体にE2等のエストロゲンを接触させ
た条件下、および、該エストロゲンと被験物とを同時に
接触させた条件下にそれぞれ上記と同様の方法でレポー
ター遺伝子の発現量を測定する。形質転換体にエストロ
ゲンを接触させた条件下におけるレポーター遺伝子の発
現量と比較して、エストロゲンと被験物とを接触させた
条件下におけるレポーター遺伝子の発現量が低ければ、
この被験物はエストロゲンレセプターに対するアンタゴ
ニスト活性、すなわち、該レセプターの抗活性化能を有
すると評価することができる。

【００１４】本発明のエストロゲンレセプターを用いた
レセプターバインディングアッセイは、該エストロゲン
レセプターに対する化学物質の結合能の測定や結合量の
定量のほか結合特異性、結合力の分析などが可能な試験
方法である。例えば、上述のようにして本発明形質転換
体から回収された本発明のエストロゲンレセプターに、
標識されたリガンド（以下、標識リガンドと記す。）が
結合しているところへ、被験物を共存させると、被験物
と標識リガンドとの競合から、両者のレセプターへの親
和性に応じて、標識リガンドがレセプターから遊離し、
レセプターに結合した標識リガンドの量が減少し、よっ
てレセプターに結合した標識量が減少する。従って、遊
離型の標識リガンドの標識量または結合型の標識リガン
ドの標識量をモニターすることにより、被験物のレセプ
ターへの結合能が間接的にわかる。標識リガンドとして
は、例えば、トリチウム標識されたE2等を用いることが
できる。標識リガンドの結合型／遊離型の分離はヒドロ
キシアパタイト法やグリセロール密度勾配超遠心法など
で行うことができる。反応系は大きく3群にわけられ
る。一つの系は、エストロゲンレセプターに標識リガン
ドが結合しているところへ溶媒のみが添加される群であ
り、被験物の濃度がゼロの系に相当し、この系から得ら
れる結合型の標識リガンドの標識量は、標識リガンドの
エストロゲンレセプターに対する総結合量を示す。もう
一つの系は、エストロゲンレセプターに標識リガンドが
結合しているところへ、例えば、標識されていないE2
が、レセプターを十分飽和し標識リガンドが結合できな
くなるだけの濃度（例えば10μＭ）となるよう添加され
た系であり、この系から得られる結合型の標識リガンド
の標識量は、標識リガンドのエストロゲンレセプターに
対する非特異的な結合量と判断される。したがって、エ
ストロゲンレセプターへの標識リガンドの特異的結合量
は、総結合量からこの非特異的結合量を引いた値とな
る。3番目の系は、エストロゲンレセプターに標識リガ
ンドが結合しているところへ、被験物が、例えば最終濃
度10μＭ（この濃度は目的により任意に変更する。）と
なるよう添加された系である。被験物がエストロゲンレ
セプターへの結合能を有する場合は、この系から得られ
る結合型の標識リガンドの標識量は、上記のようにして
求めた被験物濃度がゼロの時のエストロゲンレセプター
への標識リガンドの特異的結合量より小さくなる。この
ようにしてレセプターバインディングアッセイを行うこ
とにより、本発明のエストロゲンレセプターに対する被
験物の結合能を調べることができ、被験物が複数の物質
を含む場合にはその中にエストロゲンレセプターに親和
性を示す物質が存在するかどうかを調べることもでき
る。さらに、本発明のエストロゲンレセプターに対する
被験物の結合能をより詳細に評価するには、例えば前記
の3番目の系における被験物の添加濃度を変えて同様に
アッセイを行い結合型の標識リガンドの標識量を測定す
る。該測定値に基づき、各アッセイにおける結合型と遊
離型のリガンド量を算出して、例えばスキャッチャード
解析を行うことにより、被験物と本発明のエストロゲン
レセプターとの結合親和性、結合特異性、結合容量等を
評価することができる。本発明のレポーターアッセイ、
ツーハイブリッドシステムおよびレセプターバインディ
ングアッセイは、化学物質の安全性評価や、環境中のエ
ストロゲン様活性物質の検出等に利用することができ
る。

【００１５】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれら実施例によって限定されるもの
ではない。

【００１６】実施例１（本発明遺伝子の取得）ブルーギル肝臓組織より、フェノール−クロロホルム−
イソアミルアルコール法(Plant Cell Physiol. 36 (1):
pp85-93(1995))に準じて全RNAを調製した。全RNAの収量
は約2.8mgであった。全RNA約500μgより、Oligotex (d
T)₃₀-Super (宝酒造社製)を用いて、poly(A)⁺RNAを調製
した。poly(A)⁺RNAの収量は約10μgであった。次にGubl
er and Hoffman法に基づいて cDNAライブラリーを作製
した。まず2.4μgのpoly(A)⁺RNA、Oligo(dT)₁₈-リンカ
ープライマー（(GA)₁₀ACGCGTCGACTCGAGCGGCCGCGGACCG
(T)₁₈、XhoI認識配列を含む。）、RAV-2 RTase（宝酒造
製）およびSuperScriptII RTase（Gibco-BRL社製）を用
いて1本鎖cDNAを合成した。1本鎖cDNA合成時に5-methy1
dCTPを用いた。得られた1本鎖DNAから2本鎖DNAを合成
した後、その末端を平滑化し、EcoRI-NotI-BamHIアダプ
ター (宝酒造社製 code 4510)をライゲーションした。
該DNAを制限酵素XhoIで消化して、スピンカラムに供し
て低分子量DNAを除去した後、EcoRIおよびXhoIで消化し
たλZAPIIとライゲーションを行った。得られたDNAとin
vitro packaging kit (Stratagene社製)を用いて、in
vitro packagingを行い、ライブラリーを得た。該ライ
ブラリーについて、宿主に大腸菌XL1 Blue MRF'株（Str
atagene社製）を用いてタイトレーションを行ったとこ
ろ、青色コロニーと白色コロニーの出現率からインサー
ト含有率は約95%と推定された。次に、配列番号６で示
される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番
号７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを
合成した。該オリゴヌクレオチドをプライマーに用い
て、ブルーギルの肝臓から上記のように調製された２本
鎖cDNAを鋳型としてPCR（94℃1分間次いで55℃１分間さ
らに74℃2.5分間の保温を1サイクルとしてこれを30サイ
クル）を行った。増幅された約1kbpのDNA断片をpBluesc
riptIISK(+)ベクター(Stratagene社製)のEcoRV部位を用
いて作製されたTAクローニングベクターにサブクローニ
ングし、得られたクローンの保有するベクターに挿入さ
れたDNAの塩基配列を解析した。その結果から、配列番
号3で示される塩基配列を有するDNAを選択し、該DNA
を、これを保有するクローンから精製した。精製したDN
Aに、AlkPhos Direct system (アマシャムファルマシア
バイオテク社製)を用いて、耐熱性アルカリフォスファ
ターゼを直接標識することによりプローブを調製した。
一方、上記のようにして調製したライブラリーを大腸菌
XL1 Blue MRF'株に導入し、直径150mmのLBプレート（1%
Bacto-Triptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, 1.
5% agar）に約50,000クローンずつプレーティングして
プラークを形成させた。このプレートを合計6枚準備し
て、合計300,000クローンを以下のスクリーニングに供
した。各プレートから、Hybond N +メンブレン(アマシ
ャムファルマシアバイオテク社製)にファージDNAをうつ
しとり、該メンブレンを変性液(1.5M NaCl, 0.5N NaOH)
に5分間、次いで中和液(1.5M NaCl,0.5M Tris-HCl (pH
7.2), 1mM EDTA)に10分間浸した後、乾燥させた。この
メンブレンを80℃で2時間保温してDNAを固定した後、上
記のプローブを用いて、AlkPhos Direct systemのプロ
トコールにしたがってハイブリダイゼーションによるス
クリーニングを行った。すなわち、前記メンブレンをO.
5M NaClを含むハイブリダイゼーション溶液（アマシャ
ムファルマシアバイオテク社製、5ngフ゜ローフ゛/ml）に浸
し、55℃、16時間保温した。次いで、メンブレンを、一
次洗浄バッファー（２M尿素、0.1% SDS、150 mM NaCl、
１mM MgCl_2、0.2%ブロッキング試薬を含む50 mM ナトリ
ウムリン酸緩衝液、pH7.0）中にて60℃、10分間保温し
た後、再度、一次洗浄バッファー中にて65℃、10分間保
温した。さらに、二次洗浄バッファー（100 mM NaCl、2
mM MgCl₂を含む50 mMナトリウムリン酸緩衝液）中にて
室温、5分間の洗浄を2回行った。洗浄後のメンブレンに
ついて、AlkPhos Direct systemに含まれるCDP-Starを
基質として、アルカリフォスファターゼ酵素による化学
発光システムにより、シグナルの検出を行った。フィル
ムにはHyperfilm ECL（アマシャムファルマシアバイオ
テク社製）を用いた。シグナルの強い陽性クローンを選
択し、該陽性クローンは滅菌済チップを用いて採取し、
SMバッファー（50mM Tris-HCl (pH 7.5), 100mM NaCl,
MgSO4・H2O, 0.01%ゼラチン）中、4℃にて保存した。得
られた陽性クローンを培養して直径約90mmのLBプレート
に1,000〜1,500クローンずつプレーティングして（合計
10プレート）プラークを形成させ、前記と同様に、ハイ
ブリダイゼーションによるスクリーニング作業を行っ
た。その結果、1クローンについて陽性のシグナルが得
られたため該陽性クローンを採取した。該陽性クローン
を、λZAPIIベクターキット（ストラタジーン社製）添
付のプロトコールにしたがい、in vivo excision syste
mを用いて、pBluescript SK(-)を切り出しクローニング
を行った。クローニングされたDNAについて、Primer Wa
lking法により、全塩基配列の解析を行った。その結
果、該ＤＮＡは配列番号2で示される塩基配列の塩基番
号484〜2186で示される塩基配列を有していた。

【００１７】実施例２（5'-RACE法による完全長cDNAの
取得）実施例１で取得したpBluescript SK(-)のEcoRIおよびXh
oI部位にクローニングされたプラスミドの配列情報か
ら、完全長のcDNAを取得する必要があったため5'-RACEk
it（5'RACE System for Rapid Amplification of cDNA
Ends Version 2.0,Life Technologies社製）を用いて5'
末端配列を決定した。まずブルーギルの肝臓からTrizol
試薬（Life Technologies社製）を用いて製品マニュア
ルに従い全RNAを抽出した。この全RNA約5μgと配列番号
１６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを
用いて製品マニュアルに従い一本鎖cDNAを作製した。cD
NAをGlassMAXカラムを用いて精製後、terminal deoxynu
cleotidyl transferaseとｄCTPを用いて5'末端にoligdC
-tailを製品マニュアルに従い付加した。次にこのoligd
C-tailの付加した下ｃDNAおよび製品添付の5'RACEAbrid
ged Anchor Primerおよび配列番号１７で示される塩基
配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて製品マニュア
ルの条件に従いPCR（94℃1分間次いで55℃1分間さらに7
4℃2.0分間の保温を1サイクルとしてこれを30サイク
ル）を行った。次に該PCR産物1μlと製品添付のUnivers
al Amplification Primerおよび配列番号１８で示され
る塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて製品マ
ニュアルに従いPCR（94℃1分間次いで55℃1分間さらに7
4℃2.0分間の保温を1サイクルとしてこれを30サイク
ル）を行った。増幅されたPCR産物は１％アガロースゲ
ル（アガロースL、日本ジーン社製）電気泳動に供し、
バンドを切り出しフェノールを用いて精製後、Tベクタ
ー（ｐGEM-T、プロメガ製）を用いて製品マニュアルに
準じてクローニングを行いシークエンスを行った。その
結果、配列番号１９で示される塩基配列を有するPCR断
片が確認された。そこで、さらに配列番号１９で示され
る塩基配列をもとに、oligdC-tailの付加したｃDNAおよ
び製品添付の5'RACEAbridged Anchor Primerおよび配列
番号２０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチ
ドを用いて製品マニュアルの条件に従いPCR（94℃1分間
次いで55℃1分間さらに74℃2.0分間の保温を1サイクル
としてこれを30サイクル）を行った。該PCR産物1μlと
製品添付のUniversal Amplification Primerおよび配列
番号２１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチ
ドを用いて製品マニュアルに従いPCR（94℃1分間次いで
55℃1分間さらに74℃2.0分間の保温を1サイクルとして
これを30サイクル）を行った。増幅されたPCR産物は１
％アガロースゲル（アガロースL、日本ジーン社製）電
気泳動に供し、バンドを切り出しフェノールを用いて精
製後、Tベクター（ｐGEM-T、プロメガ製）を用いて製品
マニュアルに準じてサブクローニングを行い取得したク
ローンのシークエンスを確認した。その結果、該PCR産
物の配列は配列番号２２で示される塩基配列であった。
このPCR産物の5'末端配列を用いたオリゴヌクレオチド
（配列番号２３）と配列番号２４で示される塩基配列か
らなるオリゴヌクレオチドとを用いてLA-Taq（宝酒造
製）の製品マニュアルに従いPCR（94℃1分間次いで55℃
1分間さらに74℃2.0分間の保温を1サイクルとしてこれ
を30サイクル）を行い、１％アガロースゲル（アガロー
スL、日本ジーン社製）電気泳動に供し、約1.7kbpのPCR
産物のバンドを切り出し、フェノール抽出後、ダイレク
トシークエンス法により5'末端配列の確認を行った。こ
の結果、本発明遺伝子は配列番号２で示す塩基配列を持
つことがわかった。また、上記約1.7kbpのPCR断片をTベ
クター（ｐGEM-T、プロメガ製）を用いて製品マニュア
ルに準じて大腸菌DH5αにサブクローニングを行いシー
クエンスを確認したプラスミドクローンをpGEM-BGERβ
と名付けた。このプラスミドpGEM-BGERβは、通商産業
省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法
人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）に受託番
号ＦＥＲＭＢＰ−７１９９（原寄託日：平成１２年６
月２８日）としてブタペスト条約に基づき国際寄託され
ている。

【００１８】実施例３（動物細胞発現用の本発明ベクタ
ーの構築） RSVプロモーターを有する発現プラスミドpRc/RSV（Invi
trogen社）2μｇを、制限酵素Hind III (10U)およびXba
I（10U）で、37℃にて終夜消化した。これをアガロー
ス（アガロースＳ；ニッポンジーン社製）を用いたゲル
電気泳動に供し、5〜6kbpの長さを示すバンド部分から
ジーンクリーン（フナコシ社製）を用いてDNAを回収し
ベクターDNAとした。一方、ブルーギルの肝臓からTrizo
l試薬（Life Technologies社製）を用いて該試薬の製品
マニュアルに従い全RNAを調製し、THERMOSCRIPT RT-PCR
kit（Life Technologies社製）を用いてキット添付のラ
ンダムプライマーを使用してキット添付のマニュアルに
従いcDNAを作製した。該cDNAを鋳型として、配列番号２
５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよ
び配列番号２６で示される塩基配列からなるオリゴヌク
レオチドを用いてLA-Taq（宝酒造製）にてPCR（94℃1分
間次いで55℃1分間さらに74℃2.0分間の保温を1サイク
ルとしてこれを30サイクル）を行い本発明遺伝子のDNA
を増幅した。これをクロロホルム/フェノール処理の
後、エタノール沈殿し、70%エタノールにより遠心洗浄した後
乾燥させ、TEを加えて溶解させた後、 Tベクター（ｐGE
M-T、プロメガ製）を用いて製品マニュアルに準じてサ
ブクローニングを行い取得したクローンのシークエンス
を確認した。そのプラスミドクローンを制限酵素Hind I
IIおよびXbaIで37℃で5時間消化した。次いで、該消化
物を１％アガロースゲル電気泳動に供して分離し、約1.
7kbpのDNAを含むゲル部分を切り出し、これに含まれるD
NAをジーンクリーン（フナコシ社製）を用いて精製し
た。その約100nｇを上記のように調製したベクターDNA
約50ngと混合し、Ligation kit ver.2（宝酒造社製）に
より16℃にて終夜ライゲーションを行なった。この反応
液中のDNAを大腸菌 DH5α株コンピテントセル（TOYOBO
製）に添付説明書に記載の方法に従って導入し、アンピ
シリン耐性を示すコロニーからプラスミドDNAをアルカ
リ法で調製した。得られたプラスミドDNAの塩基配列を
解析し本発明遺伝子を発現する該プラスミドをｐRc/RSV
-BGERβと名付けた。

【００１９】実施例４（レポーター遺伝子アッセイ用の
レポータープラスミドの作製） Isogen試薬（ニッポンジーン社製）を用いて該試薬に添
付のプロトコールに記載の方法で、アフリカツメガエル
のゲノムDNAを精製した。該ゲノムDNAを鋳型として、Wa
lkerらの報告（Nucleic acid Res. (1984) 12, 8611-86
26）を参考にPCRを行なうことにより、アフリカツメガ
エルビテロゲニン遺伝子上流のTATAboxからエストロゲ
ンレセプター応答配列までを含むDNAを増幅した。増幅
されたDNAを回収し、その末端をBlunting kit（宝酒造
社製）を用いて平滑化した（以下、該DNAをERE DNAと記
す。）。マウスメタロチオネインI遺伝子のTATA box近
傍の塩基配列とリーダー配列（Genbank Accession No.J
00605）に由来する塩基配列(配列番号１０および配列番
号１１)からなる2本のオリゴヌクレオチドをアニーリン
グさせて2本鎖DNAとし、これにT4ポリヌクレオチドカイ
ネースを作用させてその両末端をリン酸化した（以下、
該DNAをTATA DNAと記す。）。一方、ホタルルシフェラ
ーゼ遺伝子を含むプラスミドpGL3（プロメガ社製）を制
限酵素Bgl IIおよびHind IIIで消化した後、これにBact
erial alkaline phosphatase(BAP)を加えて65℃で1時間
保温した。次いで、該保温液を低融点アガロース（Agar
oseL；ニッポンジーン社製）を用いた電気泳動に供し、
pGL3由来のルシフェラーゼ遺伝子を含むBgl II-Hind II
I断片のDNAを回収した。該DNA約100ngと、前記のTATA D
NA 1μｇとを混合し、T4リガーゼで結合させることによ
りプラスミドpGL3−TATAを作製した。次に、pGL3-TATA
を制限酵素Sma Iで消化した後、BAPを加えて65℃で1時
間保温した。該保温液を低融点アガロースゲル電気泳動
に供し、バンド部分のゲルからDNAを回収した。該DNA約
100ngと、上記 ERE DNA約1μｇとを混合してT4リガーゼ
を反応させた後、該反応液中のDNAをDH5αコンピテント
セル（TOYOBO社製）へ導入した。アンピシリン耐性を示
した大腸菌のコロニー数個からそれぞれの保有するプラ
スミドのDNAを調製し、これらを制限酵素Kpn IおよびXh
o Iで消化して該消化液をアガロースゲル電気泳動で分
析した。pGL3-TATAのSma I部位にERE DNAが１コピー導
入された構造を有するプラスミドをpGL3-TATA-EREと名
付け、また、前記Sma I部位にERE DNAが５コピー導入さ
れた構造を有するプラスミドをプラスミドpGL3-TATA-ER
Eｘ5とした。

【００２０】実施例５（一過性発現系によるレポーター
アッセイ） HeLa細胞を10 cmプレートに約2x10⁶細胞播種し、チャコ
ールデキストラン処理済みFBS（以下、FBSと記す。）が
10 %となるよう添加されたE-MEM培地で、5 %CO ₂条件下3
7 ℃にて1日培養を行った。培養後、細胞に、Lipofecta
mine（Life Technologies社製）を用いてそのプロトコ
ールに従い3.75 μgのpRc/RSV-BGERβおよび3.75 μgの
pGL3-TATA-EREｘ5を同時に導入した。37 ℃にて16時間
培養後、培地を交換しさらに3時間培養した。その後、
細胞を集めてFBSが10 %となるよう添加されたE-MEM培地
に懸濁して均一化し、予めDMSOで溶解した様々な濃度の
エストラジオール（和光純薬社製）、ジエチルスチルベ
ステロール（DES）（ナカライテスク社製）、p-ノニル
フェノール（関東化学社製）、ビスフェノールＡ（和光
純薬社製）、1 mMのダイゼイン（シグマ社製）、ゲニス
テイン（和光純薬社製）、（和光純薬社製）、クメステ
ロール（INDOFINE Chemical社製）またはo,p'-DDT（Lan
caster社製）を添加した96穴プレート（DMSO終濃度0.1
%）に播種した。また、抗エストロゲン作用を測定する
ために、同様に様々な濃度の4-ヒドロキシタモキシフェ
ン（住友化学で合成）と10 nMのエストラジオールとを
同時に添加した96穴プレート（DMSO終濃度0.1 %）に上
記細胞を播種した。細胞が播種された96穴プレートは37
℃にて約40時間培養した後、5倍に希釈した細胞溶解剤
PGC50（ニッポンジーン社製）を50 μｌ／wellずつ加え
て、時々軽くゆすりながら室温にて30分間放置して細胞
を溶解させた。このように調製された細胞溶解液を10μ
ｌずつ96穴白色サンプルプレート（ベルトールド社製）
に採取し、基質自動インジェクター付きのルミノメータ
ーLB96p（ベルトールド社製）で50μｌ/wellずつ酵素基
質液PGL100（ニッポンジーン社製）を添加しながら直ち
に発光量を5秒間測定した。結果を図１〜９に示す。上
記のように、本発明遺伝子を用いたルシフェラーゼレポ
ーターアッセイによって、被験物のエストロゲンレセプ
ター活性化能または活性化阻害能を測定することができ
た。さらに、他の被験物を同様に試験することにより、
エストロゲンレセプター活性化能を有する物質またはエ
ストロゲンレセプター活性化阻害能を有する物質を検出
することができる。

【００２１】実施例６（本発明遺伝子が染色体に導入さ
れたレポーターアッセイ用形質転換体の作製）プラスミドpUCSV-BSD（フナコシ社から購入）をBamHIで
消化し、ブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子発現カ
セットをコードするDNAを調製する。該DNAと、実施例３
記載のプラスミドpGL3−TATA-EREをBamHIで消化しBAP処
理して得られたDNAとを混合して、T4リガーゼを反応さ
せた後、該反応液中のDNAを大腸菌DH5αコンピテントセ
ル（TOYOBO製）に導入する。得られたアンピシリン耐性
の大腸菌クローンからプラスミドDNAを調製し、それぞ
れを制限酵素BamHIで消化して該消化液をアガロースゲ
ル電気泳動で分析する。ブラストサイジンＳデアミナー
ゼ遺伝子発現カセットがプラスミドpGL3-TATA-EREのBam
HI切断部位に挿入された構造を有するプラスミドを選択
し、プラスミドpGL3-TATA-ERE-BSDとする。次に、ヒト
由来のHeLa細胞に、上記のように作製されたプラスミド
pGL3-TATA-ERE-BSDのDNA、および、実施例３のようにし
て本発明遺伝子がpRc/RSVに組込まれた発現ベクターのD
NAを、それぞれ直鎖化して導入し、これらのDNAが宿主
細胞の染色体に導入されてなる形質転換体を取得する。
まず、プラスミドpGL3-TATA-ERE-BSDのDNA、および、本
発明遺伝子がpRc/RSVに組込まれた発現ベクターのDNAを
それぞれSal Iで消化する。HeLa細胞は、10%FBSを含むD
MEM培地（日水製薬社製）を用いて37℃にて5%CO₂存在下
に、直径約10cmのシャーレ（ファルコン社製）を用いて
培養する。約5ｘ10⁵の細胞を培養し、翌日、該細胞にリ
ポフェクチン（GIBCO社製）を用いたリポフェクション
法で、上記の直鎖化されたプラスミドのDNAを同時に導
入する。リポフェクション法の条件はリポフェクチンに
添付されたマニュアルの記載に従って、処理時間5時
間、直鎖化されたプラスミドDNAの総量7μｇ（各々3.5
μｇ）/シャーレ、リポフェクチン量は20μｌ/シャーレ
とする。リポフェクション後、10%FBSを含むDMEM培地中
でそのまま3日間培養する。次に、細胞をトリプシン処
理でシャーレから剥がし、1/10量ずつ新しい10枚のシャ
ーレに播種し、そのまま翌日まで培養する。次に、G418
（SIGMA社製）を最終濃度400μｇ/mlとなるように、お
よび、ブラストサイジンＳを最終濃度8μｇ/mlとなるよ
うに培養液に添加し、培養を継続する。一週間後、G418
およびブラストサイジンＳを前記と同じ濃度含む新しい
培地に交換し、更に培養を継続する。一週間後、同じ操
作を再度行う。さらに一週間後、倒立型顕微鏡でシャー
レを観察し、直径数mmのコロニー30個をそれぞれ、あら
かじめ培地を分注しておいた96穴ビュープレート(ベル
トールド製)の各ウェルに移し、さらに培養を続ける。
細胞をコンフルエントになる前にトリプシン処理により
剥がして回収し、3等分して3枚の新しい96穴ビュープレ
ートに播種する。1枚はそのまま継代と培養を続け、残
り2枚の内の一方には最終濃度50nMとなるようE2を加
え、もう一方には何も加えずに、それぞれを2日間培養
する。2日後、それぞれの培養上清を除き、200μｌ/wel
lのPBS(-)で細胞を2回洗浄した後、5倍に希釈したPGC50
（ニッポンジーン社製）を20μｌずつ加えて、室温に30
分間放置し細胞を溶解させる。このプレートを、酵素基
質自動インジェクター付きルミノメーターLB96p（ベル
トールド社製）にそれぞれセットし、50μｌの基質液PG
L1000（ニッポンジーン社製）を自動分注しながら、ル
シフェラーゼ活性を測定する。E2が添加された系の方
が、E2が添加されていない系に比べ、２倍以上高いルシ
フェラーゼ活性を示す形質転換体を選抜する。

【００２２】実施例７（本発明遺伝子が染色体に導入さ
れた形質転換体を用いるレポーターアッセイ）実施例６に記載のようにして作製されるHeLa細胞の形質
転換体を24穴プレートに約4x10⁴細胞/wellずつ播種し、
10%のチャコールデキストラン処理済みFBS、400μｇ/ml
のG418および8μｇ/mlのブラストサイジンSを含むE-MEM
培地（以下、FBSおよび抗生物質含有E-MEM培地と記
す。）で、5 ％CO₂条件下37℃にて1日間培養を行う。被
験物をDMSO（和光純薬社製）に溶解させ最終濃度が1nM
から50μMとなるよう添加したFBSおよび抗生物質含有E-
MEM培地、前記の被験物溶解液と同量のDMSOを添加したF
BSおよび抗生物質含有E-MEM培地、及びE2をDMSOに溶解
させ最終濃度1μＭとなるよう添加したFBSおよび抗生物
質含有E-MEM培地を調製し、これを前記の細胞の培養上
清と交換する。該細胞をCO₂インキュベーター中で培養
し、24時間後に培養上清を除き、ウェルに接着している
細胞を剥がさないように１ml/ウェルのPBS（−）でウェルを2
回洗浄し、5倍に希釈した細胞溶解剤PGC50（ニッポンジ
ーン社製）を50μｌ／wellずつ加えて、時々軽くゆすり
ながら室温にて30分間放置して細胞を溶解させる。この
ように調製された細胞溶解液を10μｌずつ96穴白色サン
プルプレート（ベルトールド社製）に採取し、基質自動
インジェクター付きのルミノメーターLB96p（ベルトー
ルド社製）で50μｌ/wellずつ酵素基質液PGL100（ニッ
ポンジーン社製）を添加しながら直ちに発光量を5秒間
測定する。このような本発明遺伝子が染色体に導入され
た形質転換体を用いたルシフェラーゼレポーターアッセ
イによって、エストロゲンレセプター活性化能を有する
物質を含む被験物を見出すことができる。

【００２３】実施例８（本発明のエストロゲンレセプタ
ーのリガンド結合領域と転写調節因子のDNA結合領域と
の融合蛋白質をコードするキメラ遺伝子を含有するベク
ターの作製）本発明遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡを含有する
プラスミドｐGEM-BGERβを鋳型として、配列番号１２で
示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番
号１３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
とをプライマーに用いてPCR（94℃1分間次いで55℃１分
間さらに74℃1.5分間の保温を1サイクルとしてこれを25
サイクル）を行うことにより、配列番号２で示される塩
基配列の塩基番号763〜1767で表される塩基配列を有し
本発明のエストロゲンレセプターのリガンド結合領域を
コードするDNAを増幅した。増幅されたDNAは、クロロホ
ルム/フェノール処理の後、エタノール沈殿し、70%エタノー
ルにより遠心洗浄した後乾燥させた。このDNAにTEを加え
て溶解させた後、制限酵素EcoRIとSalIとで37℃にて約5
時間消化した。消化物を１%アガロースゲル電気泳動に
供して分離し、約1000 bpのDNAを含むゲル部分を切り出
し、これに含まれるDNAをジーンクリーン（フナコシ社
製）を用いて回収した。一方、GAL4蛋白のDNA結合領域
とのキメラ蛋白作製用ベクターpGBT9（Clontech社製）
（約50ng）をEcoRIおよびSalIで消化した後、アガロー
スゲル電気泳動に供して、EcoRIおよびSalIで消化され
たベクターDNAをジーンクリーン（フナコシ社製）を用
いて回収した。該ベクターDNAと前記回収DNA約10ngとを
混合し、同容量のライゲーション液（宝酒造製ライゲー
ションキット）を加え、16℃で約5時間保温し、次いで
コンピテントセルDH5α（TOYOBO社製）に添付説明書に
記載の方法に従って導入し、アンピシリン耐性を示すコ
ロニーを単離して該コロニーからプラスミドDNAをアル
カリ法で調製した。得られたプラスミドは、塩基配列を
確認した後、pGBT9-BGERβLIDと名付けた。このプラス
ミドは、宿主細胞として出芽酵母細胞を用いたツーハイ
ブリッドアッセイに使用することができる。

【００２４】実施例９（転写共役因子のレセプター結合
領域と転写調節因子の転写活性化領域との融合蛋白質を
コードするキメラ遺伝子を含有するベクターの作製）ヒト脳由来mRNA（Clontech社製）とRT-PCRキット（宝酒
造製）を用いて製品添付のプロトコールに従いcDNAを作
製した。そして、該cDNAを鋳型として、配列番号１４で
示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配
列番号１５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チドをプライマーに用いてPCR（94℃で1分間次いで55℃
で1分間さらに72℃で2.5分間の保温を１サイクルとして
これを30サイクル）を行い、転写共役因子TIF2のアミノ
末端から624番目のアミノ酸から1287番目のアミノ酸ま
でをコードするDNAを増幅した。増幅されたDNAは、クロ
ロホルム/フェノール処理の後、エタノール沈殿し、70
%エタノールにより遠心洗浄した後乾燥させた。このDNAにTE
を加えて溶解させた後、制限酵素EcoRIとBglIIとで37
℃で5時間消化した。消化物を1%アガロースゲル電気泳
動に供して分離し、約2.0k bpのDNAを含むゲル部分を切
り出し、これに含まれるDNAをジーンクリーン（フナコ
シ社製）を用いて精製した。一方、GAL4蛋白の転写活性
化領域とのキメラ蛋白作製用ベクターpGAD424（Clontec
h社製）（約50 ng）をEcoRIおよびBamHIで消化した後、
アガロースゲル電気泳動に供して消化されたベクターDN
Aをジーンクリーン（フナコシ社製）を用いて回収し
た。該ベクターDNAと前記精製DNA約10ngとを混合し、同
容量のライゲーション液（宝酒造製ライゲーションキッ
ト）を加え、16 ℃で約１時間保温し、次いでコンピテ
ントセルDH5α（TOYOBO社製）に添付説明書に記載の方
法に従って導入し、アンピシリン耐性を示すコロニーを
単離して該コロニーからプラスミドDNAをアルカリ法で
調製した。得られたプラスミドは、塩基配列を確認した
後、pGAD424-TIF2RIDと名付けた。このプラスミドは、
それぞれ宿主細胞として出芽酵母細胞を用いたツーハイ
ブリッドアッセイに使用することができる。

【００２５】実施例１０（出芽酵母細胞を宿主細胞とす
るツーハイブリッドシステムの作製）酵母Y190（Clontech社製）をMatchmaker Two-Hybrid Sy
stem（Clontech社製）のマニュアルに従いYPD培地で30
℃にて終夜振盪培養した。該酵母を集菌後、その細胞内
に、実施例８記載のpGBT9-BGERβLIDと実施例９記載のp
GAD424-TIF2RIDとを、Yeastmaker yeast transformatio
n system（Clontech社製）を用いて導入した。前記プラ
スミドの導入された酵母細胞は、トリプトファンおよび
ロイシンを含まないSDプレート上に播き、30 ℃で約2日
間培養した。培養後、コロニーを選択し再びトリプトフ
ァンおよびロイシンを含まないSDプレート上に塗布し、
30℃で約2日間培養した。

【００２６】実施例１１（酵母ツーハイブリッドシステ
ムを用いた被験物のエストロゲンレセプター活性調節能
の測定）実施例１０で調製された酵母の一部をトリプトファンお
よびロイシンを含まないSD培地1 mlに植菌し、30 ℃で
終夜振盪培養し、得られた培養液をトリプトファンおよ
びロイシンを含まないSD培地で約80倍に希釈した。96穴
のディープウェルプレートの各ウェルにDMSOに溶解した
様々な濃度のエストラジオール（和光純薬社製）、エス
トリオール（和光純薬社製）、エストロン（和光純薬社
製）および1μMのジエチルスチルベステロール（DES）
（ナカライテスク社製）、1 mMのビスフェノールＡ（和
光純薬社製）、100 μMのp-ノニルフェノール（関東化
学社製）、100 μMのゲニステイン（和光純薬社製）、1
00 μMのクメステロール（INDOFINE Chemical社製）、1
mMのダイゼイン（シグマ社製）、1 mMのメトキシクロ
ル（和光純薬社製）、1 mMのo,p'-DDT（Lancaster社
製）2.5 μｌを加え（DMSO終濃度1 %とする）、ここへ
上記培養酵母希釈液を250 μｌを添加して、30℃で４時
間振盪培養した。培養後、各ウェルから酵母液100 μｌ
を回収しこれに100 μｌのβガラクトシダーゼ活性測定
用発光反応液（Gal-Screen、 Tropix社製）を加え、約
1.5時間室温で保温した後、ルミノメーターLB96p（ベル
トールド社製）で発光量を測定した。図１０にエストラ
ジオール（和光純薬社製）、エストリオール（和光純薬
社製）、エストロン（和光純薬社製）の濃度依存的な活
性誘導の結果を示す。また図１１に終濃度10 nMのジエ
チルスチルベステロール（DES）、10 μMのビスフェノ
ールＡ、1 μMのp-ノニルフェノール、1 μMのゲニステ
イン、1 μMのクメステロール、10 μMのダイゼイン、1
μMのメトキシクロルまたは10 μMのo,p'-DDTの活性誘
導結果を示す。

【００２７】実施例１３（本発明遺伝子を含有するウイ
ルスベクター及びウイルス粒子の作製）実施例３のようにして調製された本発明ベクターpRc/RS
V-BGERβのDNA2μｇを10Uの制限酵素SpeIおよびXbaIで3
7 ℃にて1時間消化した後、低融点アガロースゲル電気
泳動に供し約1.7 kbpのDNAを回収する。このDNAをblunt
ing kit（宝酒造製）を使用してマニュアルに従い平滑
化する。一方、2μｇのpVL1392ベクターDNAを10Uの制限
酵素SmaIで消化し、10Uのアルカリフォスファターゼで6
5 ℃にて1時間処理後、低融点アガロースゲル電気泳動
に供しＤＮＡを回収する。回収されたpVL1392ベクターD
NA100 ngに、上記のようにpRC/RSV−FMERαから調製し
た約1.8 bpのDNAを約100 ng加え、5UのT4 Ligaseを用い
て16 ℃にて3時間保温する。これをE.coli DH5α株のコ
ンピテントセル（TOYOBO社製）に添付説明書に記載の方
法に従って導入し、得られたコロニーからプラスミドDN
Aをアルカリ法で調製する。それぞれのプラスミドDNA約
１μｇを10Uの制限酵素XbaIで３７℃にて１時間消化し
た後アガロースＳ（ニッポンジーン社製）を用いたアガ
ロース電気泳動で分析し、約1.7kbpのバンドが検出され
るクローンを選択する。該クローンからプラスミドDNA
をアルカリ法にて調製し、組換えBaculo virus作製に用
いるトランスファーベクターpVL1392-BGERαとする。1
ｘ10⁶個のSf21細胞（ATCCから入手）を75cm²のＴ型フラ
スコ（ファルコン社製）中で10% FBSおよび2 % Yeastla
teを含むGrace's medium（以下、FBS含有Grace培地と記
す。）を用いて27 ℃にて一晩培養する。一方、上記の
ようにして作製されるトランスファーベクターpVL1392-
BGERαのDNA10μｇと、直鎖状に調製されたウイルスゲ
ノムDNA Baculo gold(Pharmingen社製)20ngとをGrace'
ｓ medium 100μｌに添加し、滅菌水で2倍に希釈したリ
ポフェクチン（GIBCO社製）10μｌを加え、室温にて30
分間放置する。一晩培養された前記のSf21細胞の培養上
清を除き、血清を含まないGrace's medium少量で細胞を
洗った後、同培地5mlを細胞に添加し、これに前記のリ
ポフェクチン−DNA混合液を全量加え、27℃にて3時間保
温する。次いで、FBS含有Grace培地で細胞を洗った後、
FBS含有Grace培地20mlを細胞に添加し、5日間27℃にて
培養する。5日目に培養上清を回収して50ml容の遠心チ
ューブに採り、5000xｇで15分間遠心分離することによ
り細胞の破片を沈殿させ、遠心上清を回収する。この上
清全量を100,000xgで24時間遠心分離し、ウイルス粒子
をペレットとして得る。このペレットを100μｌのTEに
懸濁し、当量のTE飽和フェノールを加え、穏やかに室温
にて24時間混合する。これを10,000xg、10分間遠心分離
した後、水層を回収し、これに当量のクロロホルムを加
え10分間穏やかに混合し、再度10,000xg、10分間の遠心
分離を行う。水層を回収し、該水層に終濃度0.2Mとなる
量のNaClと2.5倍量のエタノールを加え、本発明遺伝子
を保有するウイルスベクターのDNAを沈殿として回収す
る。

【００２８】実施例１４（本発明遺伝子を含有するウイ
ルスベクターがSf21細胞へ導入された形質転換体の作製
と本発明のエストロゲンレセプターの製造） Sf21細胞（ATCCから入手）を75cm²のＴ型フラスコ（フ
ァルコン社製）に1ｘ10 ⁶個ずつ計10枚播種し、27℃にて
FBS含有Grace培地で培養する。この細胞に、実施例１１
のように調製される組換えウイルス粒子を含む培養上清
を10μｌ／フラスコの割合で加え、そのまま4日間培養
する。この培養上清を採取し、前記と同様に75cm²のＴ
型フラスコ（ファルコン社製）10枚に培養した前Sf21細
胞へ、該培養上清をフラスコ一枚あたり1mlずつ加え、6
0時間培養する。60時間後、細胞をピペッテイングによ
り懸濁してフラスコより回収し、得られた細胞懸濁液を
5,000 xｇで15分間遠心分離しペレットとする。この細
胞のペレットを20mM HEPESpH7,1mM EDTA,1mM DTT,0.5mM
PMSFバッファーに懸濁した後、得られる細胞懸濁液を
ダウンス型ガラスホモジナイザーで上下に30回ホモジナ
イズし細胞を破砕する。この破砕液を30,000xｇで1時間
遠心分離して上清画分を回収することにより、本発明の
エストロゲンレセプターを含む画分を得る。

【００２９】実施例１５（レセプターバインディングア
ッセイ）結合反応バッファーは、最終組成が20mM HEPES-KOH pH
7.9, 10mMモリブデン酸ナトリウム, 1mM DTT, 0.5mM ED
TA, 0.5mM PMSF（いずれも和光純薬社製）となるように
調製する。反応系は総容量を100μｌとし、本発明のエ
ストロゲンレセプターを含む細胞抽出物を10μｇ蛋白質
添加し、トリチウム標識されたE2を1pMから100nM程度に
なるよう添加する。非特異的結合を調べるための試験区
には標識されていないE2を最終濃度10μMになるように
さらに加える。結合反応は、以下のように行う。反応液
を氷上で15時間保温した後、チャコールデキストラン液
[組成：10mM Tris-HCl、0.2%の酸洗活性炭（ナカライテ
スク社製NoritA）、0.005%ファルマシアDextran T70]を
100μｌ加え、10分間氷上に放置する。この反応液を低
速遠心機で1,000xgで10分間遠心分離して活性炭を沈殿
させ、上清を100μｌ分取し、その放射能量を液体シン
チレーションカウンターで測定する。この測定値を基
に、該上清画分中の標識E2量、すなわち、レセプターに
結合した標識E2量（結合型標識リガンド量）を求める。
標識E2のみが添加された試験区の結合型標識リガンド量
は、標識E2のレセプターに対する全結合量に相当する。
一方、標識E2に加え標識されていないE2が添加された試
験区の結合型標識リガンド量は、標識E2のレセプターに
対する非特異的結合量に相当する。各種濃度の標識E2が
添加された反応系それぞれについて、全結合量から非特
異的結合量を差し引いて、その反応系における標識リガ
ンドのレセプターに対する特異的結合量を求める。次い
で、Y軸に（特異的結合標識リガンド濃度/遊離標識リガ
ンド濃度）、X軸に特異的結合標識リガンド濃度をプロ
ットし、スキャッチャード解析することにより、本発明
のエストロゲンレセプターのE2に対するKd値を求める。
エストロゲンレセプターに対する被験物の親和性を測定
するには、上記と同様にして1nM程度のトリチウム標識E
2が入っているバインデイングアッセイ結合反応液へ被
験物を終濃度が1%程度となるよう添加する。なお被験物
が添加されない系には、被験物と同量の溶媒を系に加え
る。被験物添加によりレセプターに対する標識E2の結合
量が低下する場合は、その被験物にはエストロゲンレセ
プターに結合するような物質が含まれると判断される。

【００３０】

【発明の効果】本発明により、化学物質のエストロゲン
レセプター活性調節能を評価するための試験系に利用す
ることのできる新たなエストロゲンレセプター遺伝子等
が提供可能となる。

【００３１】[配列表フリーテキスト] 配列番号４ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー配列番号５ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー配列番号６ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー配列番号７ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー配列番号８ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー配列番号９ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー配列番号１０プロモーターDNAを作製するために設計されたオリゴヌ
クレオチド配列番号１１プロモーターDNAを作製するために設計されたオリゴヌ
クレオチド配列番号１２ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー配列番号１３ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー配列番号１４ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー配列番号１５ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー配列番号１６ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー配列番号１７ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー配列番号１８ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー配列番号２０ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー配列番号２１ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー配列番号２３ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー配列番号２４ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー配列番号２５ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー配列番号２６ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー

【００３２】

【配列表】 <110> Sumitomo Chemical Company Limited <120> Estrogen receptor gene and use thereof <130> P151719 <160> 26 <210> 1 <211> 554 <212> PRT <213> Blue gill <400> 1 Met Ala Cys Ser Pro Glu Lys Asp Gln Pro Leu Leu Gln Leu Gln Lys 1 5 10 15 Val Asp Ser Ser Arg Val Gly Ser Arg Val Val Ser Pro Ile Leu Asn 20 25 30 Ser Pro Leu Glu Arg Ser Gln Pro Ile Cys Ile Pro Ser Pro Tyr Thr 35 40 45 Asp Leu Ser His Asp Phe Thr Thr Ile Pro Phe Tyr Ser Pro Thr Phe 50 55 60 Phe Ser Tyr Ala Ser Pro Gly Ile Ser Asp Cys Pro Ser Val His Gln 65 70 75 80 Ser Leu Ser Pro Ser Leu Phe Trp Pro Ser His Gly His Val Gly Ser 85 90 95 Pro Ile Pro Leu His His Ser Gln Pro Arg Pro Gln His Arg Gln Pro 100 105 110 Ile Gln Ser Pro Trp Val Glu Leu Ser Pro Leu Glu Ser Thr Leu Thr 115 120 125 Thr Ser Lys Ser Val Arg Arg Arg Ser Gln Glu Ser Glu Asp Gly Val 130 135 140 Val Ser Ser Gly Gly Lys Ala Asp Ile His Tyr Cys Ala Val Cys His 145 150 155 160 Asp Tyr Ala Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Trp Ser Cys Glu Gly Cys 165 170 175 Lys Ala Phe Phe Lys Arg Ser Ile Gln Arg His Asn Asp Tyr Ile Cys 180 185 190 Pro Ala Thr Asn Gln Cys Thr Ile Asp Lys Asn Arg Arg Lys Ser Cys 195 200 205 Gln Ala Cys Arg Leu Arg Lys Cys Asn Glu Val Gly Met Thr Lys Cys 210 215 220 Gly Val Arg Lys Glu Arg Gly Asn Cys Arg Asn Pro Gln Met Arg Arg 225 230 235 240 Val Thr Arg Leu Ser Thr Gln Gly Arg Thr Asn Arg Thr Ala Val Leu 245 250 255 Thr Gly Pro Ala Val Gly Ser Leu Ile Ser Leu Asn Ser Pro Ala Leu 260 265 270 Thr Pro Glu Gln Leu Ile Glu Arg Ile Ile Asp Ala Glu Pro Pro Glu 275 280 285 Ile Tyr Leu Met Lys Asp Met Arg Arg Pro Leu Thr Glu Ala Asn Val 290 295 300 Met Met Ser Leu Thr Asn Leu Ala Asp Lys Glu Leu Val His Met Ile 305 310 315 320 Ser Trp Ala Lys Lys Ile Pro Gly Phe Val Glu Leu Ser Leu Leu Asp 325 330 335 Gln Val His Leu Leu Glu Cys Cys Trp Leu Glu Val Leu Met Val Gly 340 345 350 Leu Met Trp Arg Ser Val Asp His Pro Gly Lys Leu Ile Phe Ser Arg 355 360 365 Asp Leu Ser Leu Ser Arg Glu Glu Gly Ser Cys Val Gln Gly Phe Ala 370 375 380 Glu Ile Phe Asp Met Leu Ile Ala Ala Thr Ser Arg Val Arg Glu Leu 385 390 395 400 Lys Leu Gln Arg Glu Glu Tyr Val Cys Leu Lys Ala Met Ile Leu Leu 405 410 415 Asn Ser Asn Met Cys Leu Gly Ser Ser Glu Gly Ser Glu Glu Leu Gln 420 425 430 Ser Arg Ser Lys Leu Leu Cys Leu Leu Asp Ala Val Thr Asp Ala Leu 435 440 445 Val Trp Ala Ile Ala Lys Thr Gly Leu Thr Phe Arg Gln Gln Tyr Thr 450 455 460 Arg Leu Ala His Leu Leu Met Leu Leu Ser His Ile Arg His Val Ser 465 470 475 480 Asn Lys Gly Met Asp His Leu His Cys Met Lys Met Lys Asn Met Val 485 490 495 Pro Leu Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu Asp Ala His Ile Met His 500 505 510 Ser Ser Arg Leu Ser His Gln Pro Ile Gln Gln Asp Ala Gln Asp Gln 515 520 525 Arg Glu Ala Pro Ala Arg Pro His Ser Cys Gly Ser Gly Pro Leu Asn 530 535 540 Thr Trp Thr Pro Gly Gly Gly Glu Arg Gln 545 550 <210> 2 <211> 2186 <212> DNA <213> Blue gill <220> <221> CDS <222> (106)...(1770) <400> 2 cttacactga cactcggaga aaaagatgac taatgacatc ctaggcccat attctttgtc 60 gacgatgtgg tagatctagt gatactgaga cagtcagtag ttgca atg gcc tgc tct 117 Met Ala Cys Ser 1 cca gag aag gat cag ccc ctc ctc cag ctc cag aag gtg gac tcc agt 165 Pro Glu Lys Asp Gln Pro Leu Leu Gln Leu Gln Lys Val Asp Ser Ser 5 10 15 20 cga gtt ggc agt cgt gtc gtc tcc ccg atc ctc aac tcc ccg ttg gaa 213 Arg Val Gly Ser Arg Val Val Ser Pro Ile Leu Asn Ser Pro Leu Glu 25 30 35 aga agc cag ccc atc tgc atc ccc tcc cct tac acc gac ctc agc cac 261 Arg Ser Gln Pro Ile Cys Ile Pro Ser Pro Tyr Thr Asp Leu Ser His 40 45 50 gac ttc acc acc ata cct ttc tac agt cca act ttc ttt agt tat gcc 309 Asp Phe Thr Thr Ile Pro Phe Tyr Ser Pro Thr Phe Phe Ser Tyr Ala 55 60 65 agt cca ggc att tca gac tgc ccc tcc gtc cat cag tca cta agc ccc 357 Ser Pro Gly Ile Ser Asp Cys Pro Ser Val His Gln Ser Leu Ser Pro 70 75 80 tcc tta ttc tgg ccc agc cat ggc cat gtt ggg tcc ccc ata ccc ctg 405 Ser Leu Phe Trp Pro Ser His Gly His Val Gly Ser Pro Ile Pro Leu 85 90 95 100 cac cac tcc cag cct cga cct cag cac aga cag cca atc cag agt cca 453 His His Ser Gln Pro Arg Pro Gln His Arg Gln Pro Ile Gln Ser Pro 105 110 115 tgg gtg gag ttg tca cca ctg gag agc acc tta aca acc agt aag agt 501 Trp Val Glu Leu Ser Pro Leu Glu Ser Thr Leu Thr Thr Ser Lys Ser 120 125 130 gta agg agg cgt tct cag gag agc gag gat ggc gtg gtg tcg tcc ggc 549 Val Arg Arg Arg Ser Gln Glu Ser Glu Asp Gly Val Val Ser Ser Gly 135 140 145 ggg aag gcg gac atc cac tac tgc gct gtg tgt cac gac tac gcc tca 597 Gly Lys Ala Asp Ile His Tyr Cys Ala Val Cys His Asp Tyr Ala Ser 150 155 160 gga tac cac tac ggc gtc tgg tca tgt gag ggg tgt aag gcc ttc ttc 645 Gly Tyr His Tyr Gly Val Trp Ser Cys Glu Gly Cys Lys Ala Phe Phe 165 170 175 180 aag agg agc atc caa aga cac aat gac tac atc tgc cca gca acc aat 693 Lys Arg Ser Ile Gln Arg His Asn Asp Tyr Ile Cys Pro Ala Thr Asn 185 190 195 caa tgc act ata gac aag aac cgc cgt aag agc tgc cag gcg tgc cgc 741 Gln Cys Thr Ile Asp Lys Asn Arg Arg Lys Ser Cys Gln Ala Cys Arg 200 205 210 ctt cgc aaa tgc aat gaa gtt ggc atg acc aag tgt ggt gtg aga aag 789 Leu Arg Lys Cys Asn Glu Val Gly Met Thr Lys Cys Gly Val Arg Lys 215 220 225 gag cgt ggg aac tgc aga aac ccc cag atg agg cga gtg acc cga ctc 837 Glu Arg Gly Asn Cys Arg Asn Pro Gln Met Arg Arg Val Thr Arg Leu 230 235 240 tcc aca cag ggc aga act aac aga aca gct gtg tta act gga cca gcc 885 Ser Thr Gln Gly Arg Thr Asn Arg Thr Ala Val Leu Thr Gly Pro Ala 245 250 255 260 gtg ggt tca cta atc tcg ctc aac tct cct gca ctg acc cca gag cag 933 Val Gly Ser Leu Ile Ser Leu Asn Ser Pro Ala Leu Thr Pro Glu Gln 265 270 275 ctg att gaa cga ata att gat gct gag cca cca gag atc tac ctc atg 981 Leu Ile Glu Arg Ile Ile Asp Ala Glu Pro Pro Glu Ile Tyr Leu Met 280 285 290 aaa gac atg agg agg cct ctg act gaa gca aac gtc atg atg tcg ctc 1029 Lys Asp Met Arg Arg Pro Leu Thr Glu Ala Asn Val Met Met Ser Leu 295 300 305 aca aac ctt gct gat aag gag ctg gtt cac atg atc agc tgg gcc aag 1077 Thr Asn Leu Ala Asp Lys Glu Leu Val His Met Ile Ser Trp Ala Lys 310 315 320 aag att cca ggg ttt gta gag ctc agt ctc ttg gac cag gtg cac ctg 1125 Lys Ile Pro Gly Phe Val Glu Leu Ser Leu Leu Asp Gln Val His Leu 325 330 335 340 ttg gag tgc tgc tgg ctg gag gtg ctg atg gtt gga ctg atg tgg agg 1173 Leu Glu Cys Cys Trp Leu Glu Val Leu Met Val Gly Leu Met Trp Arg 345 350 355 tca gtg gac cat cct ggg aaa ctt atc ttc tcc cgg gac ctc agc ctg 1221 Ser Val Asp His Pro Gly Lys Leu Ile Phe Ser Arg Asp Leu Ser Leu 360 365 370 agc aga gaa gag ggg agc tgt gtc cag ggc ttc gca gag atc ttt gat 1269 Ser Arg Glu Glu Gly Ser Cys Val Gln Gly Phe Ala Glu Ile Phe Asp 375 380 385 atg ctg ata gct gcc acg tcc agg gtg aga gag ctc aag ctc cag agg 1317 Met Leu Ile Ala Ala Thr Ser Arg Val Arg Glu Leu Lys Leu Gln Arg 390 395 400 gag gag tac gtc tgc ctc aag gcc atg atc ctc ctt aac tcc aac atg 1365 Glu Glu Tyr Val Cys Leu Lys Ala Met Ile Leu Leu Asn Ser Asn Met 405 410 415 420 tgc ctc ggc tcc tca gag ggc agc gag gag ctg cag agt cgc tcc aag 1413 Cys Leu Gly Ser Ser Glu Gly Ser Glu Glu Leu Gln Ser Arg Ser Lys 425 430 435 ctg ctg tgt ctt ctg gac gct gta acg gac gct ctg gtg tgg gcc atc 1461 Leu Leu Cys Leu Leu Asp Ala Val Thr Asp Ala Leu Val Trp Ala Ile 440 445 450 gcc aaa act ggc ctc act ttc cgc caa cag tac acc cgc ctc gcc cac 1509 Ala Lys Thr Gly Leu Thr Phe Arg Gln Gln Tyr Thr Arg Leu Ala His 455 460 465 ctg ctt atg ctg ctc tca cac atc cgc cat gtc agt aac aaa ggc atg 1557 Leu Leu Met Leu Leu Ser His Ile Arg His Val Ser Asn Lys Gly Met 470 475 480 gac cac ctc cac tgc atg aaa atg aag aac atg gtg cct ttg tat gac 1605 Asp His Leu His Cys Met Lys Met Lys Asn Met Val Pro Leu Tyr Asp 485 490 495 500 ctg ctg ctg gag atg ttg gat gcc cac atc atg cac agc tcc cgt ctg 1653 Leu Leu Leu Glu Met Leu Asp Ala His Ile MET His Ser Ser Arg Leu 505 510 515 tct cac cag ccc ata cag caa gac gca cag gac cag agg gag gct cct 1701 Ser His Gln Pro Ile Gln Gln Asp Ala Gln Asp Gln Arg Glu Ala Pro 520 525 530 gct cgg cca cac agc tgt gga agc ggc cct tta aac acc tgg aca cca 1749 Ala Arg Pro His Ser Cys Gly Ser Gly Pro Leu Asn Thr Trp Thr Pro 535 540 545 ggt gga ggt gaa cgg cag tag tctgatggaa tgaattttca ccgctttgca caaa 1804 Gly Gly Gly Glu Arg Gln 550 actacttcac aaaactgatg agatgtttca cttgaacatt cttcagcacg ctaaattctg 1864 tgaaactcga gctttgacac actgtgcact acttatattg aacttttttg aatatctaaa 1924 gtttttcatt tgttattcat tgccttacca ccacatattg aaaagccagc aaacagatta 1984 agcagttgct gttataattg ggccagtagc acaattagtt gctcatatgt tcaggtaata 2044 tgttactgcc gtgaatctcc tgggtcgagc agctaatttc ctatcaaata acattgataa 2104 ataacattgt gtggtaagga gagacagtat ggtttcacct gtcacagtaa cacctgaggc 2164 agatcctgag atggtgttac ct 2186 <210> 3 <211> 963 <212> DNA <213> Blue gill <400> 3 aggagcatcc aaggtcacaa tgactacatc tgcccagcaa ccaatcaatg cactatagac 60 aagaaccgcc gtaagagctg ccaggcgtgc cgccttcgca aatgcaatga agttggcatg 120 accaagtgtg gtgtgagaaa ggagcgtggg aactgcagaa acccccagat gaggcgagtg 180 acccgactct ccacacaggg cagaactaac agaacagctg tgttaactgg accagccgtg 240 ggttcactaa tctcgctcaa ctctcctgca ctgaccccag agcagctgat tgaacgaata 300 attgatgctg agccaccaga gatctacctc atgaaagaca tgaggaggcc tctgactgaa 360 gcaaacgtca tgatgtcgct cacaaacctt gctgataagg agctggttca catgatcagc 420 tgggccaaga agattccagg gtttgtagag ctcagtctct tggaccaggt gcacctgttg 480 gagtgctgct ggctggaggt gctgatggtt ggactgatgt ggaggtcagt ggaccatcct 540 gggaaactta tcttctcccg ggacctcagc ctgagcagag aagaggggag ctgtgtccag 600 ggcttcgcag agatctttga tatgctgata gctgccacgt ccagggtgag agagctcaag 660 ctccagaggg aggagtacgt ctgcctcaag gccatgatcc tccttaactc caacatgtgc 720 ctcggctcct cagagggcag cgaggagctg cagagtcgct ccaagctgct gtgtcttctg 780 gacgctgtaa cggacgctct ggtgtgggcc atcgccaaaa ctggcctcac tttccgccaa 840 cagtacaccc gcctcgccca cctgcttatg ctgctctcac acatccgcca tgtcagtaac 900 aaaggcatgg accacctcca ctgcatgaaa atgaacaaga acaaagtgcc tctgtacgac 960 ctg 963 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 4 gatactgaga cagtcagtag ttgca 25 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 5 tgcaaagcgg tgaaaattca ttccat 26 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 6 aggagcatcc aaggtcacaa tgactac 27 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 7 caggtcgtac agaggcactt tgttcttg 28 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 8 ctaggcccat attctttgtc gacgatgt 28 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 9 ataagtagtg cacagtgtgt caaagct 27 <210> 10 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize promoter DNA <400> 10 gatctcgact ataaagaggg caggctgtcc tctaagcgtc accacgactt ca 52 <210> 11 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize promoter DNA <400> 11 agcttgaagt cgtggtgacg cttagaggac agcctgccct ctttatagtc ga 52 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 12 gccgaattcg gcatgaccaa gtgtggt 27 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 13 ccggtcgacc tactgccgtt cacctccacc 30 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 14 gccgaattcg agagagctga cgggcagagc aga 33 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 15 gccagatctg ctcatagttg ctggcatacc act 33 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 16 agagtcgggt cactcgcctc atctg 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 17 gtctatagtg cattgattgg ttgct 25 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 18 tgacacacag cgcagtagtg 20 <210> 19 <211> 494 <212> DNA <213> Blue gill <400> 19 gtcgacgatg tggtagatct agtgatactg agacagtcag tagttgcaat ggcctgctct 60 ccagagaagg atcagcccct cctccagctc cagaaggtgg actccagtcg agttggcagt 120 cgtgtcgtct ccccgatcct caactccccg ttggaagaag ccagcccatc tgcatcccct 180 ccccttacac cgacctcagc cacgacttca ccaccatacc tttctacagt ccaactttct 240 ttagttatgc cagtccaggc atttcagact gcccctccgt ccatcagtca ctaagcccct 300 ccttattctg gcccagccat ggccatgttg ggtcccccat acccctgcac cactcccagc 360 ctcgacctca gcacagacag ccaatccaga gtccatgggt ggagttgtca ccactggaga 420 gcaccttaac aaccagtaag agtgtaagga ggcgttctca ggagagcgag gatggcgtgg 480 tgtcgtccgg cggg 494 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 20 gtctgaaatg cctggactgg ca 22 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 21 actggagtcc accttctgga g 21 <210> 22 <211> 139 <212> DNA Blue gill <400> 22 cttacactga cactcggaga aaaagatgac taatgacatc ctaggcccat attctttgtc 60 gacgatgtgg tagatctagt gatactgaga cagtcagtag ttgcaatggc ctgctctcca 120 gagaaggatc agcccctcc 139 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 23 cttacactga cactcggaga 20 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 24 ctactgccgt tcacctccac c 21 <210> 25 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 25 cggaagcttc caccatggcc tgctctccag agaaggatc 39 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 26 cggtctagac tactgccgtt cacctccacc tgg 33

【図面の簡単な説明】

【図1】本発明遺伝子を用いたレポーターアッセイによ
り、エストラジオールのエストロゲンレセプター活性化
能を測定した結果を示す図である。横軸には、各試験区
におけるエストラジオールの濃度を付記した。左端の０
のカラムは、エストラジオールのDMSO溶液に換えてDMSO
を終濃度0.1%となるように添加した区（エストラジオー
ル無添加区）を示す。縦軸には、ルシフェラーゼ活性値
を、エストラジオール無添加区のルシフェラーゼ活性値
を１として示す。

【図2】本発明遺伝子を用いたレポーターアッセイによ
り、ジエチルスチルベステロール（ＤＥＳ）のエストロ
ゲンレセプター活性化能を測定した結果を示す図であ
る。横軸には、各試験区におけるＤＥＳの濃度を付記し
た。左端の０のカラムは、ＤＥＳのDMSO溶液に換えてDM
SOを終濃度0.1%となるように添加した区（ＤＥＳ無添加
区）を示す。縦軸には、ルシフェラーゼ活性値を、ＤＥ
Ｓ無添加区のルシフェラーゼ活性値を１として示す。

【図3】本発明遺伝子を用いたレポーターアッセイによ
り、p-ノニルフェノールのエストロゲンレセプター活性
化能を測定した結果を示す図である。横軸には、各試験
区におけるp-ノニルフェノールの濃度を付記した。左端
の０のカラムは、p-ノニルフェノールのDMSO溶液に換え
てDMSOを終濃度0.1%となるように添加した区（p-ノニル
フェノール無添加区）を示す。縦軸には、ルシフェラー
ゼ活性値を、p-ノニルフェノール無添加区のルシフェラ
ーゼ活性値を１として示す。

【図4】本発明遺伝子を用いたレポーターアッセイによ
り、ビスフェノールＡのエストロゲンレセプター活性化
能を測定した結果を示す図である。横軸には、各試験区
におけるビスフェノールＡの濃度を付記した。左端の０
のカラムは、ビスフェノールＡのDMSO溶液に換えてDMSO
を終濃度0.1%となるように添加した区（ビスフェノール
Ａ無添加区）を示す。縦軸には、ルシフェラーゼ活性値
を、ビスフェノールＡ無添加区のルシフェラーゼ活性値
を１として示す。

【図5】本発明遺伝子を用いたレポーターアッセイによ
り、ダイゼインのエストロゲンレセプター活性化能を測
定した結果を示す図である。横軸には、各試験区におけ
るダイゼインの濃度を付記した。左端の０のカラムは、
ダイゼインのDMSO溶液に換えてDMSOを終濃度0.1%となる
ように添加した区（ダイゼイン無添加区）を示す。縦軸
には、ルシフェラーゼ活性値を、ダイゼイン無添加区の
ルシフェラーゼ活性値を１として示す。

【図6】本発明遺伝子を用いたレポーターアッセイによ
り、ゲニステインのエストロゲンレセプター活性化能を
測定した結果を示す図である。横軸には、各試験区にお
けるゲニステインの濃度を付記した。左端の０のカラム
は、ゲニステインのDMSO溶液に換えてDMSOを終濃度0.1%
となるように添加した区（ゲニステイン無添加区）を示
す。縦軸には、ルシフェラーゼ活性値を、ゲニステイン
無添加区のルシフェラーゼ活性値を１として示す。

【図7】本発明遺伝子を用いたレポーターアッセイによ
り、クメステロールのエストロゲンレセプター活性化能
を測定した結果を示す図である。横軸には、各試験区に
おけるクメステロールの濃度を付記した。左端の０のカ
ラムは、クメステロールのDMSO溶液に換えてDMSOを終濃
度0.1%となるように添加した区（クメステロール無添加
区）を示す。縦軸には、ルシフェラーゼ活性値を、クメ
ステロール無添加区のルシフェラーゼ活性値を１として
示す。

【図8】本発明遺伝子を用いたレポーターアッセイによ
り、o,p'-DDTのエストロゲンレセプター活性化能を測定
した結果を示す図である。横軸には、各試験区における
ゲニステインの濃度を付記した。左端の０のカラムは、
o,p'-DDTのDMSO溶液に換えてDMSOを終濃度0.1%となるよ
うに添加した区（o,p'-DDT無添加区）を示す。縦軸に
は、ルシフェラーゼ活性値を、o,p'-DDT無添加区のルシ
フェラーゼ活性値を１として示す。

【図9】本発明遺伝子を用いたレポーターアッセイによ
り、４-ヒドロキシタモキシフェン（4-OH-HTM）のエス
トロゲンレセプター抗活性化能を測定した結果を示す図
である。横軸には、各試験区において10nMのエストラジ
オールと共存させた4-OH-HTMの濃度を付記した。左端の
０のカラムは、4-OH-HTMのDMSO溶液に換えてDMSOを終濃
度0.1%となるように添加した区（4-OH-HTM無添加区）を
示す。縦軸には、ルシフェラーゼ活性値を、4-OH-HTM無
添加区のルシフェラーゼ活性値を１として示す。

【図10】本発明遺伝子を用いたツーハイブリッドアッセ
イにより、エストラジオール、エストロン、エストリオ
ールのエストロゲンレセプター活性化能を測定した結果
を示す図である。横軸には、化合物の濃度を付記した。
縦軸には、βガラクトシダーゼ活性値を、化合物のDMSO
溶液に換えてDMSOを終濃度0.1%となるように添加した区
（化合物無添加区）のβガラクトシダーゼ活性値を１と
して示す。

【図11】本発明遺伝子を用いたツーハイブリッドアッセ
イにより、各種化合物のエストロゲンレセプター活性化
能を測定した結果を示す図である。縦軸には、化合物の
濃度を付記した。横軸には、βガラクトシダーゼ活性値
を、エストラジオールを1nMとなるよう添加した区のβ
ガラクトシダーゼ活性値を１として示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/02 5/00 ＢＦターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 CA11 DA02 EA02 HA11 HA17 4B063 QA01 QQ08 QQ79 QR48 QR77 QX02 4B064 AG20 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AA90Y AA93X AB01 BA01 CA24 CA44 CA46 CA54 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA52 DA50 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の(a)または(b)のいずれかのアミノ酸
配列を有するエストロゲンレセプターをコードする遺伝
子。 (a)配列番号１で示されるアミノ酸配列。 (b)配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して８５％
以上の配列同一性を示すアミノ酸配列。
【請求項２】配列番号２で示される塩基配列の塩基番号
106〜1767で表される塩基配列を有するエストロゲンレ
セプター遺伝子。
【請求項３】請求項１または２のいずれかに記載のエス
トロゲンレセプター遺伝子を含有するベクター。
【請求項４】エストロゲンレセプター遺伝子にプロモー
ターが機能可能な形で結合されてなる請求項３記載のベ
クター。
【請求項５】ベクターがウイルスである請求項３または
４のいずれかに記載のベクター。
【請求項６】請求項１または２のいずれかに記載のエス
トロゲンレセプター遺伝子を含有するウイルス粒子。
【請求項７】宿主細胞内で複製可能なベクターに請求項
１または２のいずれかに記載のエストロゲンレセプター
遺伝子を組込むことを特徴とするベクターの製造方法。
【請求項８】請求項１または２のいずれかに記載のエス
トロゲンレセプター遺伝子が宿主細胞に導入されてなる
形質転換体。
【請求項９】請求項３〜５のいずれかに記載のベクター
が宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
【請求項１０】エストロゲンレセプター遺伝子が宿主細
胞の染色体に導入されてなる請求項８または９のいずれ
かに記載の形質転換体。
【請求項１１】宿主細胞が動物細胞である請求項８〜１
０のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項１２】宿主細胞が哺乳類動物細胞である請求項
８〜１１のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項１３】宿主細胞が昆虫類動物細胞である請求項
８〜１１のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項１４】宿主細胞が酵母細胞である請求項８〜１
０のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項１５】請求項１または２のいずれかに記載のエ
ストロゲンレセプター遺伝子を宿主細胞に導入すること
を特徴とする形質転換体の製造方法。
【請求項１６】請求項８〜１４のいずれかに記載の形質
転換体を培養してエストロゲンレセプターを産生させる
ことを特徴とするエストロゲンレセプターの製造方法。
【請求項１７】請求項１または２のいずれかに記載のエ
ストロゲンレセプター遺伝子の部分塩基配列を有するＤ
ＮＡ。
【請求項１８】部分塩基配列が、エストロゲンレセプタ
ーのリガンド結合領域をコードする塩基配列である請求
項１７記載のＤＮＡ。
【請求項１９】下記の(a)または(b)のいずれかのアミノ
酸配列を有するエストロゲンレセプター。 (a)配列番号１で示されるアミノ酸配列。 (b)配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して８５％
以上の配列同一性を示すアミノ酸配列。
【請求項２０】エストロゲン応答配列を含む転写制御領
域の下流に連結されたレポーター遺伝子と請求項１また
は２のいずれかに記載のエストロゲンレセプター遺伝子
とが宿主細胞に導入されてなる形質転換体と、被験物と
を接触させ、該形質転換体における前記レポーター遺伝
子の発現量を測定する工程を含む被験物のエストロゲン
レセプター活性調節能の評価方法。
【請求項２１】リガンド依存的にエストロゲンレセプタ
ーに結合可能な転写共役因子もしくは該転写共役因子の
レセプター結合領域と、エストロゲンレセプターとがリ
ガンド依存的に複合体を形成することによりレポーター
遺伝子の転写が活性化されるツーハイブリッドシステム
において、被験物のエストロゲンレセプター活性調節能
を測定するための請求項１または２記載のいずれかに記
載のエストロゲンレセプター遺伝子の使用。
【請求項２２】リガンド依存的にエストロゲンレセプタ
ーに結合可能な転写共役因子もしくは該転写共役因子の
レセプター結合領域と、エストロゲンレセプターのリガ
ンド結合領域とがリガンド依存的に複合体を形成するこ
とによりレポーター遺伝子の転写が活性化されるツーハ
イブリッドシステムにおいて、被験物のエストロゲンレ
セプター活性調節能を測定するための請求項１７または
１８記載のいずれかに記載のＤＮＡの使用。
【請求項２３】請求項１９記載のエストロゲンレセプタ
ーと被験物とを接触させ保温する工程を含むレセプター
バインディングアッセイ。