JP2003199565A

JP2003199565A - 炎症過程の検査法

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Publication number: JP2003199565A
Application number: JP2002358608A
Authority: JP
Inventors: Stefan Meuer; ミュアーステファン; Thomas Giese; ギーセトーマス
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2001-12-11
Filing date: 2002-12-10
Publication date: 2003-07-15
Also published as: EP1319717A1; US20040023246A1

Abstract

(57)【要約】【課題】より信頼性の高い、診断上有用な、炎症過程
の検査のための非侵襲性の方法を提供する。【解決手段】 (a)末梢血単核細胞からRNAを含む試料を
分離すること、および(b)前記試料における4〜6個の選
択された遺伝子の発現レベルを、健康な個体の末梢血単
核細胞由来のRNAを含む試料中の前記遺伝子の発現レベ
ルと比較してモニターすること、を含んでなり、前記の
選択された遺伝子のうち少なくとも50%の発現に50%の差
異があれば炎症過程を示し、その際、前記の選択された
遺伝子の少なくとも１つの発現が低下していることを特
徴とする、炎症過程の検査方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、炎症過程の診断の
分野に関する。より詳細には、本発明は、サイトカイン
の発現解析により炎症過程を診断する分野に関する。

【０００２】

【従来の技術】炎症過程は、白血球（顆粒球、リンパ
球、および単球）の関与を特徴とする、局所に限定され
た事象である。上記の細胞の一部は血流中に放出される
ため、こうした起源からこれらの細胞を容易に分離し
て、診断法に供することができる。たとえば、末梢血単
核細胞における遺伝子発現を、RT-PCRのような高感度な
方法によって、優先的にモニターすることができる。

【０００３】種々の遺伝子がコードする様々なタイプの
タンパク質が炎症過程に関与するが、これらはサイトカ
インであり、特にケモカインである。これらのタンパク
質は数多くの機能および疾病との関連性のために、その
発現が生化学研究において重要な焦点となっている。エ
ンザイムイムノアッセイ、免疫組織化学、またはフロー
サイトメトリーによる、こうしたタンパク質性メディエ
ーターの直接評価は、特異的抗体を必要とし、アッセイ
感度は変動しやすい。サイトカイン遺伝子発現（mRNA）
は、通常、生成されるタンパク質のレベルと量的に相関
関係があるので、RT-PCRはサイトカインプロファイルを
描くための代替法として広く用いられている。mRNAの定
量は、測定可能な量のタンパク質を集める必要がなく、
したがって遺伝子発現の、より感度の高い、動的なモニ
ターである。

【０００４】ケモカイン以外に、他のタンパク質の発現
が炎症中に影響を受ける。たとえば、転写因子をコード
する遺伝子の発現は、炎症過程において変化することが
明らかになっている。

【０００５】高感度ではあるが、従来型のRT-PCRは煩雑
で、定量化に使用することが難しかった。外部標準およ
び競合物質を使用する多くの半定量的RT-PCR法が利用可
能である。しかしながら、いずれも相当な時間と労力を
要する。通常、増幅後に、手動のゲル分析を行い、バン
ド強度を視認によって、またはデンシトメトリーによっ
て比較する。

【０００６】従来型の半定量的RT-PCRの困難の多くは、
最近利用可能となったライトサイクラー(LightCycler)
システムによって克服される。各サイクルで蓄積するPC
R産物を連続して検出することによって、迅速かつ信頼
性の高い遺伝子発現の定量が可能となる。

【０００７】同種移植の拒絶反応の発生が重篤な炎症過
程と関連することが相当以前から判明している（6, 7,
13, 19）。同種移植の拒絶反応の診断は、従来は、たと
えば、同種心臓移植の場合には心内膜心筋生検といっ
た、生検の組織病理学検査に依っている。別の方法とし
て、同種移植の拒絶反応発生の予測診断は、炎症過程に
おいて過剰発現される遺伝子の、定量的な遺伝子発現解
析に基づいて行うことができる（1, 17, 18, 21, 2
4）。

【０００８】しかしながら、生検の試料採取は侵襲性の
手法であるため、患者には苦痛という一定のリスクを課
しており、故意に繰り返すことはできず、また、相当の
コストがかかる。臨床医学診療において日常的に使用さ
れてはいるが、円形細胞の浸潤に基づく組織病理学的な
拒絶反応の等級づけは、いくつかの限界を抱えている。
第一に、円形細胞浸潤の度合いが部位によって異なり、
小さな生検試料に反映されない可能性があるため、限ら
れた数の生検には問題がある。さらに、組織病理学診断
の質は操作を行う技師に依存し、その上、観察者の間で
異なる変動しやすさを示すことがある。最終的に、形態
的な所見に基づいて機能性の現象を予測することは、相
当な不正確さを伴う。

【０００９】近年、生検による分析を末梢血単核細胞の
分析に置き換えることが提唱されている。これに関連し
て、いくつかの刊行物が、末梢血単核細胞における単一
または少数の遺伝子またはサイトカインの発現が移植時
に発生するような明確な炎症過程と相関する可能性につ
いて検討している。しかしながら、想定される臨床応用
に関して、少数の遺伝子だけを分析した試行はいずれ
も、選択された標的遺伝子とは無関係に、高いパーセン
テージの偽陰性および擬陽性の結果をもたらした（5, 1
2, 22）。

【００１０】特に同種腎臓移植拒絶反応に関連した炎症
過程を、任意に選択された多数の遺伝子をモニターする
方法に基づいて診断することも提案されている（1）
が、利用可能なデータは、測定された発現の差異と炎症
過程の重症度との間に、ごくわずかから中程度までの相
関性しか示さなかった。

【００１１】さらに、C型肝炎ウイルス（HCV）の感染
は、世界的に肝不全の主な原因の一つとなっている。進
行性HCV肝疾患の発生機序は、炎症と線維症の双方を伴
っており、可能な限り早期の診断が求められる。

【００１２】当技術分野で知られているすべての方法を
まとめると、それらは、単に定性的な組織病理学検査と
相まって侵襲性の試料調製法の難点を示すか、あるいは
また発現解析に基づく場合には、単一の遺伝子もしくは
いくつかの任意に選択された遺伝子の信頼性があまりな
いという難点を示すか、のいずれかである。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、より信頼性の高い診断上有用な、炎症過程の検
査のための改良法を提供することである。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明は、末梢血単核細
胞における4〜6個の選択された遺伝子の発現レベルを、
健康な個体の末梢血単核細胞中の上記遺伝子の発現レベ
ルと比較してモニターすることを含んでなる、炎症過程
を検査する方法を提供するが、その特徴は、上記の選択
された遺伝子のうち少なくとも50%の発現に50%の差異が
あれば炎症過程を示す点にある。ここにおいて、上記の
選択された遺伝子の少なくとも１つの発現は炎症過程の
間に抑制される。

【００１５】同様に、本発明はまた、末梢血単核細胞に
おける4〜6個の選択された遺伝子の発現レベルを、健康
な個体の末梢血単核細胞中の上記遺伝子の発現レベルと
比較してモニターすることを含んでなる、炎症過程を検
査する方法を提供するが、その特徴は、上記の選択され
た遺伝子のそれぞれについて、正常細胞と比較した発現
の差異の程度に対応するスコアリング値を決定する点に
あり、さらに決定されたすべてのスコアリング値の合計
として算出された全体値が炎症過程の可能性を示す点に
ある。ただし、炎症遺伝子のなかで通常十分に発現され
ない少なくとも１つの遺伝子をモニターすることを条件
とする。

【００１６】優先的に、第１および第２に選択されるサ
イトカインは、MRP-14および／またはインターロイキン
-6および／またはインターロイキン-8である。また、選
択されるさらなる遺伝子がインターフェロンγおよび／
またはパーフォリンであっても有利である。

【００１７】もっとも好都合なのは、RT-PCR、たとえば
ライトサイクラー装置（Roche Molecular Biochemicals
社）を用いたリアルタイムRT-PCRによって、選択された
遺伝子の発現レベルを測定することである。

【００１８】本発明の方法は、同種移植拒絶反応を含む
様々な炎症過程の診断に使用することができる。

【００１９】さらに、本発明の方法は、たとえば、HCV
関連肝不全の診断のような、感染に関連した臓器不全の
診断に使用することもできる。

【００２０】本発明のさらに別の態様は、MRP-14、イン
ターロイキン-6、インターフェロンγおよびパーフォリ
ンの配列を増幅するための試薬を含んでなる、4〜6個の
遺伝子の発現をモニターするキットに関する。

【００２１】

【発明の実施の形態】本発明は、末梢血単核細胞（PBM
C）における、ある特定のサイトカインおよび他の遺伝
子の高度な発現差が、別の遺伝子またはサイトカインに
関する場合よりも高い確率で炎症過程と関連していると
いう驚くべき知見に基づくものである。

【００２２】様々な異なるサイトカインおよびケモカイ
ンパラメーターが、炎症過程の間にアップレギュレート
されることがこれまでに明らかにされてきた。しかしな
がら、診断目的での単一パラメーターの発現解析は、本
発明者らが最大限知る限りでは、現在までのところ失敗
に終わっている。対照的に、多数の異なる臨床検体のス
クリーニングを通じて、複数の単一パラメーターの発現
レベルを相互に関連づけることは十分でないことが判明
した。その理由は、局所的な疾病事象によって引き起こ
された炎症過程が存在するにもかかわらず、特定の遺伝
子のアップレギュレーションが観察されない多くのケー
スが確認されたためである。

【００２３】その代わりに、すべてのサイトカインおよ
びケモカインの全般的な発現パターンの有意な増加が、
炎症過程とよりよく相関すると考えられた。しかしなが
ら、意外なことに、炎症過程の開始時またはその間に、
発現が合理的な統計学的発生率でダウンレギュレートさ
れると考えられるいくつかの遺伝子が存在すること、お
よびさらに、ダウンレギュレーションの定量的なモニタ
リングによって炎症過程を診断するための信頼性のある
方法を導くことができること、が本発明者らによって立
証され、本発明において開示される。

【００２４】上記遺伝子の大半は、サイトカインもしく
は転写因子のいずれかである。

【００２５】さらに意外なことに、診断目的では単一パ
ラメーターの発現が炎症過程の存在と有意に相関する可
能性はないが、パラメーターを注意深く選択するなら
ば、ごく少数のパラメーターを分析することは差し支え
ないことが本発明者らによって立証された。言い換えれ
ば、いくつかの特別に選択されたパラメーターのセット
の過半数が過剰発現または抑制されることは、炎症過程
の診断にとって重要であるが、いくつかの任意に選択さ
れたパラメーターのセットの過半数が過剰発現または抑
制されることは重要ではない。

【００２６】結果として、まず第１の態様において、本
発明は、末梢血単核細胞において4〜6個の選択された遺
伝子の発現レベルを、健康な個体の末梢血単核細胞にお
ける上記の選択された遺伝子の発現レベルと比較してモ
ニターすることを含んでなる、炎症過程の早期診断のた
めの方法を提供する。その特徴は、上記の選択された遺
伝子のうち少なくとも50%の発現に50%の差異があれば炎
症過程を示す点にある。このような状況において、発現
における50%の差異とは、健康な個体の末梢血単核細胞
における平均発現レベルと比較して、２倍の過剰発現あ
るいは50%の抑制のいずれかであると定義される。

【００２７】より高レベルの診断特異性を達成し、した
がって本発明の方法の診断鋭敏度を低下させるために、
上記の選択されたパラメーターのうち60%より多く、ま
たはより望ましくは75%より多くが、２倍に過剰発現さ
れるか、あるいは50％より低い残存レベルにまで抑制さ
れるかのいずれかであることが好ましい。

【００２８】同様に、本発明はやはり、末梢血単核細胞
において4〜6個の選択された遺伝子の発現レベルを、健
康な個体の末梢血単核細胞における上記の選択された遺
伝子の発現レベルと比較してモニターすることを含んで
なる、炎症過程の検査のための方法を提供するが、その
特徴は、上記の選択された遺伝子のそれぞれについて、
発現の差異の程度に対応するスコアリング値を決定する
ことであり、さらに決定されたすべてのスコアリング値
の合計として算出された全体値が炎症過程の可能性を示
す点にある。この場合、発現の差異が増加であるか減少
であるかにかかわらず、絶対的な発現の差異に対応して
正の数値が与えられるようにスコアリングを行う。

【００２９】選択された上記のパラメーターの中にMRP-
14が含まれるならば、このパラメーターは最も高い特異
性で炎症過程の場合に過剰発現されるので、非常に好ま
しい。

【００３０】MRP-14（Calgranulin B）はS100ファミリ
ーに属するカルシウム結合タンパク質である。このタン
パク質は、骨髄分化の際に発現され、顆粒球および単球
に豊富に存在し、Ca²⁺依存的にMRP-8と共にヘテロダイ
マー複合体を形成する。MRP8およびMRP14を発現する食
細胞は、早期浸潤細胞に属し、急性炎症性損傷を支配す
る（10）。

【００３１】インターロイキン-6（IL-6）は多面的なサ
イトカインであって、多種多様なタイプの細胞に作用す
る。それは免疫系において重要な調節機能を有し、急性
期反応のメディエーターであり、さらに標的細胞の分
化、増殖および生存の調節に関与する（8）。

【００３２】IFNγは主として、抗原、マイトジェンま
たはアロ抗原によって活性化されたT細胞およびナチュ
ラルキラー細胞によって産生される。IFNγは、抗ウイ
ルス活性および抗寄生虫活性があり、また、多くの正常
細胞およびトランスフォームした細胞の増殖を阻害す
る。IFNγの主要な生物活性は、主として抗ウイルス性
である他のインターフェロンとは異なり、免疫調節作用
であると思われる（9）。

【００３３】パーフォリンは、カルシウムの存在下で重
合し、膜貫通チャネルを形成することによって、膜を透
過性にする細胞溶解性タンパク質である。パーフォリン
は、リンパ球の細胞傷害活性の原因となる主要な因子の
１つである（23）。

【００３４】本発明の方法は、同種移植拒絶反応を含む
種々の炎症過程の診断に使用することができる。

【００３５】ある実施形態において、本発明の方法は、
同種移植拒絶反応事象の早期検出に使用することができ
る。たとえば、本発明を限定するわけではないが、この
新規方法は同種腎臓移植拒絶反応（実施例3参照）、同
種心臓移植拒絶反応または同種肝臓移植拒絶反応事象を
検出することができるが、こうした事象はいずれも炎症
過程に基づくことが知られている。この点から、移植拒
絶反応は局所免疫反応に相当するが、同種反応性の活性
化エフェクター細胞が、血流中に低い頻度ではあるが、
存在することが明らかになったことに注目することは重
要である。

【００３６】本発明によるPBMCにおける多重遺伝子発現
解析は、遺伝子が本発明に従って適切に選択されるなら
ば、組織病理学とは対照的に、エフェクター細胞の機能
の状態に関するデータを生み出す。したがって、臨床に
関連した拒絶反応の発生を検出することに加えて、この
新規発明は、免疫抑制治療をそれぞれの個体の要求に適
合させるためにも役立つ。

【００３７】別の態様において、本発明は、遺伝子が適
切に選択されるならば、PBMCにおける多重遺伝子発現を
モニターすることによって、HCVに感染した患者の免疫
病理学的過程を高感度で検出する可能性を提供する。し
たがって、PBMC中の選択された遺伝子の発現と、観察さ
れる組織病理学的変化と、の間に高度の相関関係がある
ために、この新規方法は、重篤な肝不全を含めて、HCV
の引き起こす全身性疾患の過程を検出する可能性を与え
る。このような全身性疾患過程の重篤度は、感染した患
者のウイルス負荷と相関関係がないため、このことは特
に有益なことである。

【００３８】遺伝子の発現は、多くの様々な方法によっ
てモニターすることができる。たとえば、サイトカイン
およびケモカインタンパク質の発現は、当業界で公知の
方法、たとえばゲル電気泳動またはタンパク質アレイ技
法によって半定量的に測定することができる。定量結果
は、それぞれELISAアッセイを用いて得ることが望まし
い。

【００３９】サイトカインおよび他の遺伝子の発現は、
特に、RNAレベルでモニターされるが、たとえば、ノー
ザンブロット分析、RNアーゼプロテクション法もしくは
核酸アレイ技法のような従来の技術が適用される。

【００４０】もっとも好都合であるのは、選択された遺
伝子の発現レベルをRT-PCR、たとえばリアルタイムRT-P
CR、によって測定することであるが、それはこの技法が
より感度が高く、再現性が高いためである。定量的な結
果をもたらすその驚くべき可能性ゆえに、たとえば米国
特許第6,174,670号に開示されるように、リアルタイムR
T-PCRを行うことがもっとも好適である。

【００４１】高品質のRNAを分離することが遺伝子発現
を定量するための重要な第一段階であるため、試料調製
は、PBMCの定量的PCRに関する最も重要な側面のひとつ
である。この段階は、簡単、迅速、かつ確実であるべき
である。高い試料処理能力のために、マイクロフォーマ
ットが望ましい。

【００４２】試料調製のために自動化システムを利用す
ることが有利であることもわかっている。たとえば、マ
グナピュア(MagnaPure)核酸試料調製システム（Roche M
olecular Biochemicals社）を用いて、信頼性のある結
果を得ることができる。

【００４３】細胞由来の全RNAは分析に差し支えない
が、DNAの混入は最小にすべきである。増幅されるRNA配
列は、細胞由来の全RNAのみならず当業界において公知
の精製法によって精製されたmRNAに由来することも可能
である。

【００４４】これは、グアニジニウムおよびフェノール
を用いた精製プロトコル（3）またはHigh Pureスピンカ
ラム（Roche Molecular Biochemicals社）のような高速
クロマトグラフ法を包含するが、それに限定されない。

【００４５】RNAはまず第１鎖cDNAに転写されなければ
ならない。cDNAの合成は、種々の手順に従って行うこと
ができるが、ここにおいて、第１鎖および第２鎖の合成
は、両方のステップに対して二つの異なる酵素を用いる
か、または同一の酵素を用いるか、のいずれかによって
行われる。第１鎖の合成に関しては、あらゆるタイプの
RNA依存性DNAポリメラーゼ（逆転写酵素）、たとえば、
AMV逆転写酵素、MMLV逆転写酵素もしくはその変異体、
またはC. thermもしくはTth（Roche MolecularBiochemi
cals社）のような耐熱性DNAポリメラーゼを使用するこ
とができる。つぎに、このRNA/cDNAハイブリッドを熱変
性に供し、あるいはこのハイブリッド内のRNA鋳型をRN
アーゼHによって分解する。さらに第２鎖の合成は、あ
らゆるタイプのDNA依存性DNAポリメラーゼ、たとえばク
レノウDNAポリメラーゼ、またはTaqDNAポリメラーゼ、
を用いて行うことができる。

【００４６】第１鎖および第２鎖の合成を１つの酵素に
よって行う方法には、Thermus thermophilusまたはC. T
herm（Roche Diagnostics社）が使用される。ワンステ
ップまたはワンチューブRT-PCRを利用すると、手間と時
間はかからないが、検討するパラメーター、および試料
濃度を標準化するために使用されるハウスキーピング遺
伝子の、それぞれについて別々のRT反応が必要である。

【００４７】２段階システムにおいては、第１鎖の合成
は、すべてのパラメーターについて個別の反応で同時に
行われ、つぎにパラメーター特異的なPCR分析をおこな
う。通常1μgの全RNAから得られるcDNAは、50のパラメ
ーターを分析するのに十分である。したがって、本発明
の方法を実施することに関しては、２段階システムが非
常に好ましい。とりわけ、全RNA分離およびAMVによる第
１鎖cDNA合成を用いた２段階システムによって、良好で
信頼性の高い結果が得られる。

【００４８】PCRに基づく方法には通常必要でないが、
一部の例では、すくなくとも場合によっては、二本鎖cD
NAを増幅前に精製しておくことは有効であると考えられ
る。精製は、従来からの沈殿法、フェノール／クロロホ
ルム抽出、Sephadexスピンカラム、HighPureスピンカラ
ム（Roche Molecular Biochemicals社）の使用、または
当業界に公知の他のあらゆる方法によって行うことがで
きる。

【００４９】二本鎖cDNAの増幅は、熱安定性DNAポリメ
ラーゼおよび２つの増幅プライマーを用いたPCRによっ
て行うことが望ましい。ここで、これらのプライマー
は、完全に、または少なくとも大体は、それぞれ第１お
よび第２のオリゴヌクレオチドによって導入されたプラ
イマー結合部位に相補的である。PCRに関する一般知識
によって、当業者であれば、日常的な開発手順により効
果的で収率の高い増幅に適したPCR条件を確立すること
ができる。さらに、たとえばNASBA(11)のような他の増
幅法を適用することもできる。

【００５０】次に核酸アレイで発現を検討するために、
当業界で周知の方法(15)によって、追加のステップにお
いて、増幅されたcDNAをin vitroで転写することができ
る。転写を可能にするために、第１の伸長可能なプライ
マーは、in vitro転写のためのプロモーターを包含す
る。プロモーターは、核酸増幅プライマーのためのプラ
イマー結合部位として単独で機能することができるセグ
メントの下流に位置することが必須である。さらに、プ
ロモーターは増幅されるべきプール中のほぼすべてのRN
Aとハイブリダイズすることができるセグメントの上流
に位置することが必要である。言い換えると、プロモー
ターは上記の前者のセグメントと後者のセグメントの間
に位置することが望ましい。

【００５１】しかしながら、発現をリアルタイムRT-PCR
によってモニターすることがとりわけ好ましい。リアル
タイムPCRおよび特にリアルタイムRT-PCRは、種々の異
なる選択可能な検出フォーマットにより実施されるが、
それらの中で、もっとも確立されたものは下記の通りで
ある。

【００５２】a) FRETハイブリダイゼーションプローブこの検査フォーマットには、２つの一本鎖ハイブリダイ
ゼーションプローブが同時に使用される。これらのプロ
ーブは増幅すべき標的核酸の同一鎖の隣接した部位に対
して相補的である。２つのプローブはいずれも異なる蛍
光成分によって標識される。適当な波長の光で励起した
とき、第１の成分は、蛍光共鳴エネルギー転移の原理に
従って、吸収したエネルギーを第２の成分に転移するた
め、両方のハイブリダイゼーションプローブが検出すべ
き標的分子の隣接した位置に結合したとき、第２の成分
の蛍光発光を測定することができる。

【００５３】本発明の範囲に含まれると考えられるすべ
ての検出フォーマットのうち、この「FRETハイブリダイ
ゼーションプローブ」は、感度が高く、正確で、信頼性
が高いことが判明した。

【００５４】また、蛍光標識プライマーおよび単一の標
識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用することも
できる（2）。

【００５５】b) TaqManハイブリダイゼーションプロー
ブ一本鎖ハイブリダイゼーションプローブは、２つの成分
で標識される。第１の成分は適当な波長の光で励起さ
れ、吸収されたエネルギーは、蛍光共鳴エネルギー転移
の原理に従って、第２の成分、いわゆる消光剤、に転移
される。PCR反応のアニーリングステップの間、ハイブ
リダイゼーションプローブは標的DNAと結合し、それに
続く伸長期にTaqポリメラーゼの5’-3’エキソヌクレア
ーゼ活性によって分解される。結果として、励起された
蛍光成分および消光剤が、互いに空間的に分離され、そ
れによって第１の成分の蛍光発光を測定することができ
る（米国特許第5,210,015号）。

【００５６】c) 分子ビーコン（Molecular Beacon）これらのハイブリダイゼーションプローブも、第１成分
および消光剤で標識されており、その標識はプローブの
両端にあることが望ましい。プローブの２次構造の結果
として、２つの成分はいずれも溶液中で空間的に近傍に
ある。標的核酸とハイブリダイゼーションした後、両成
分は互いに分離されるため、適当な波長の光で励起した
後、第１の成分の蛍光発光を測定することができる（米
国特許第5,118,801号）。

【００５７】d) SybrGreenフォーマット二本鎖核酸結合部分を用いて増幅産物を検出する場合
に、本発明の添加物の存在下でリアルタイムPCRを実施
することも、本発明の範囲に包含される。たとえば、そ
れぞれの増幅産物を本発明に従ってDNA結合性蛍光染料
によって検出することも可能である。ここでこの蛍光染
料は、適当な波長の光で励起した後、二本鎖核酸との相
互作用の際に、対応する蛍光シグナルを発する。SybrGr
eenおよびSybrGold染料（Molecular Probes社）がこう
した応用に特に適していることが判明した。挿入染料(i
ntercalating dye)を代わりに使用してもよい。しかし
ながら、このフォーマットでは、異なる増幅産物を識別
するために、それぞれの融解曲線分析を実施することが
必要である（米国特許第6,174,670号）。

【００５８】本発明のアッセイの実施に関するもう１つ
の重要な特徴は、すぐれた増幅プライマーの設計であ
る。アンプリコン（単位複製配列）は600bpより小さく
（250から350bpの間が最適）、ゲノム配列は全く増幅さ
れるべきでない。これは「RTなし」のPCR対照（逆転写
酵素なしでのcDNA反応）および／またはゲノムDNAを含
むPCRによって検証される。1500bpより大きいゲノム産
物は、標準的な迅速サイクリングプロトコールを用いた
ライトサイクラー(LightCycler)においては、通常増幅
されない。

【００５９】SybrGreenIフォーマットの場合は、ただ１
つの特異的産物だけが増幅されることが重要である。増
幅プライマーは、誤ったプライミングに対する閾値が高
くあるべきである。選択されたプライマーの配列を用い
て別のデータベースを検索することは非常に有用である
と考えられる。増幅の厳密性を増加させること（たとえ
ばタッチダウンPCR）は、また、標的の特異的増幅を強
めることができる。厳密性の高い結合特性を有するプラ
イマー配列のコンピューター支援検索が推奨される。た
とえば、オリゴプライマー分析ソフトウェアを用いてプ
ライマーを選択することができる。

【００６０】選択されたRT-PCRを実施する実際の方法に
かかわらず、遺伝子発現を比較定量する方法を使用する
ことは、非常に有利である。したがって、炎症性の遺伝
子発現の程度を標準化するために、内部ハウスキーピン
グ遺伝子レベルをモニターすることは、本発明の範囲に
含まれる。

【００６１】要約すると、この新しい方法は、局所性疾
病事象に関連した炎症過程を分析するための非侵襲性の
診断ツールを提供し、その方法は、多くの異なる態様に
おいて、生検材料の分析に基づく従来法に取って代わる
ことができることが強調されるべきである。

【００６２】

【実施例】下記の実施例、参考文献、配列表および図面
は、本発明の理解を助けるために提供されるが、本発明
の正確な範囲は特許請求の範囲に述べる。本発明の精神
から逸脱することなしに発表された手順に修飾を加える
ことができることが理解されるであろう。

【００６３】実施例１：自動化された試料調製および逆
転写末梢血をCPT-真空採血管(Becton Dickinson社)内に採取
した。このCPT試験管を遠心分離した結果、内容物は明
確な4層に分かれた（図３）：・試験管の底部に、濃縮赤血球、顆粒球および「濃厚
溶液」・末梢血単核細胞（PBMC）から赤血球を分離する不活
性プラグ・ PBMCを含有するフィコール（「濃厚溶液」）層・血漿 PBMC層を注意深く15mlファルコンチューブに移し、細胞
培養培地で3回洗浄した。2×10⁶個のPBMCを10% FCSを含
有する1ml RPMI1640中で37℃で3時間培養し、基礎的な
転写レベルを回復した。300μl MagnaPure溶解バッファ
ー中で溶解した後、試料を−70℃で凍結した。解凍後、
溶解物をよく混合し、MagnaPure試料カートリッジに入
れ、細胞用のmRNA標準プロトコールを用いてMagnaPure-
LC装置で、mRNAを単離した。溶出量は、50μlにセット
した。8.2μlに分割されたRNAの２アリコートは、AMV-R
Tおよびプライマーとしてオリゴ-(dT)を用いて、メーカ
ーの使用説明書に従ってサーモサイクラーで、独立に、
逆転写を行った（First Strand cDNA 合成キット、Roch
e社）。ｃDNA合成を終了した後、反応混合物を最終容量
500μlに希釈し、PCR分析まで−20℃で保存した。

【００６４】実施例２：手動の試料調製および逆転写 Leuco Sepチューブ（Greiner Labortechnik Frickenhau
sen、ドイツ）を用いてHistopaque 1077密度勾配によっ
て単核細胞（MNC）を単離し、2×10⁶細胞を10% FCSを含
有するRPMI 1640に再懸濁した。37℃、7% CO₂において
様々な時点で、10ng/ml PMAおよび0.5μg/mlイオノマイ
シンで培養物を刺激した。細胞を集め、200μl PBSに再
懸濁し、400μlのHigh-Pure溶解溶液を添加した。得ら
れた溶解物を−70℃に保存した。37℃で10分間解凍した
後、RNAを抽出し（RNA単離キット）、50μlの容量でス
ピンカラムから溶出した。8.2μlに分割されたRNAの１
アリコートを、AMV-RTおよびプライマーとしてオリゴ-
(dT)を使用して逆転写した（cDNA合成キット）。

【００６５】実施例３：SybrGreen検出法を用いた定量
的リアルタイムホットスタートPCR 標的配列は、市販のライトサイクラープライマーセット
（Search-LC、ハイデルベルク）をLightCycler FastSta
rt DNA SybrGreen I Kit（Roche Diagnostics社）とと
もに用いて、添付の使用説明書に従って増幅した。手短
に言うと、2μlのFastStart DNA SybrGreen Iマスター
ミックス、2μlのプライマーセットおよび6μlのPCRグ
レードの水からなる反応混合物を予め混合し、10μlの
希釈されたcDNA試料とともにライトサイクラーキャピラ
リーに添加する。短時間遠心した後、そのキャピラリー
をライトサイクラーのサーマルチャンバーに入れ、10分
間95℃でポリメラーゼを活性化した。変性は、10秒間95
℃に設定された。アニーリングはタッチダウン法で行っ
た：開始温度68℃； 20サイクルにわたり10秒間でサイ
クル当たり0.5℃低下、さらに伸長は72℃で16秒間行っ
た。PCRは35サイクル行った。

【００６６】コピー数は、プラスミドの既知の投入濃度
を、検出される蛍光強度が一定値に達するPCRサイクル
数に対してプロットすることによって得られた事実上の
標準曲線から算出された。

【００６７】RNA投入量は健康な提供者の２つのハウス
キーピング遺伝子、β-アクチンおよびシクロフィリンB
の平均発現によって標準化された。このファクターは不
変であったため、すべての試料が相互に比較可能であ
る。

【００６８】各試料およびパラメーターに関する2回の
独立した分析データを平均し、cDNA1μl当たりの調整し
た転写物として表した。これらの値に3000を乗じると、
試料当たりの転写物数となる。

【００６９】実施例４：サイトカインおよび遺伝子の発
現解析同種移植拒絶反応を起こしている6人の同種腎臓移植患
者由来のPBMCにおける36の異なるサイトカインおよび遺
伝子の発現をモニターし、実施例３に従って定量した。
プライマーは「オリゴプライマー分析」ソフトウェア
（MBI）を用いて設計した。

【００７０】結果を図１に示す。より正確には、このプ
ロットは、同種移植拒絶反応事象のない健康な4個体の
集団と比較した、同種移植拒絶反応を示す6個体からな
る患者集団における36の選択されたパラメーターの平均
発現率のlog2を表す。

【００７１】図から理解されるように、同種移植拒絶反
応患者由来のWBCにおいて大きく過剰発現するMRP-14の
ような一定の遺伝子が存在する一方で、たとえばIP-10
のような他の遺伝子の発現は、強く抑制されている。し
かしながら、これに関しては、IL-6およびMCP-3といっ
た一部のパラメーターについて得られた値は、高い標準
偏差の値を示し、したがって統計学上の観点からは、関
連性が低いと考えられることに注目することが重要であ
る。

【００７２】実施例５：同種腎臓移植拒絶反応患者およ
び拒絶反応のない同種腎臓移植患者の多重遺伝子発現ス
コアリング実施例３で得られた結果に基づいて、多重遺伝子発現ス
コアを確認した。スコアのランク付けは下記のように行
った： MRP-14 0 = 3倍以下 1 = 5倍以下 2 = 10倍以下 3 = 10倍を超える増加 IL-8 0 = 1.5倍以下 1 = 3倍以下 2 = 10倍以下 3 = 10倍を超える増加 IFNγ、パーフォリン、C-II-TA、CD154 0 = 30%以下 1 = 70%以下 2 = 90%以下 3 = 90%を超える減少

【００７３】このスコアリングシステムに基づいて、選
択された遺伝子の発現を、6人の同種腎臓移植拒絶反応
を示す腎臓移植患者および4人の同種移植拒絶反応のな
い同種腎臓移植患者について、プロットした。

【００７４】上記の特別な例における発現を実施例２に
従ってモニターし、下記の標的を増幅した：

【表１】

【００７５】結果を図２に示す。図から明らかなよう
に、6人の同種腎臓移植拒絶反応のうち5人についてスコ
アリング値に有意な差が得られた。より正確には、上記
5患者について得られたスコアリング値は、対照群のス
コアリング値について得られた標準偏差の２倍よりもか
なり高かった。したがって、このようなスコアリング法
はやがて起こる同種移植拒絶反応事象を示唆する炎症過
程の早期診断に適用することができる。

【００７６】上記の実施例、参考文献および図面は、本
発明の理解を助けるために提供されるのであって、本発
明の正確な範囲は、特許請求の範囲に示される。本発明
の精神から逸脱することなく、公表された手順に修飾を
加えることができることを理解すべきである。

【００７７】参考文献一覧 1) Akalin, E.ら、Transplantation 72 (2001) 948-53 2) Bernard, P. S.ら、Anal Biochem 255 (1998) 101-7 3) Chomczynski, P.およびSacchi, N., Anal Biochem 1
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lant 20 (2001) 503-10 5) Dugre F. J.ら、Transplantation 70 (2000) 1074-8
0 6) Hayry, P., Transplant Proc 28 (1996) 7-10 7) Hayry, P.ら、Immunol Rev 77 (1984) 85-142 8) Horn, F.ら、Immunobiology 202 (2000) 151-67 9) Ijzermans, J. N.およびMarquet, R. L., Ommunobio
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1 15) Milligan, J. F.ら、Nucleic Acids Res 15 (1987)
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7) 695-700 25) Strom, T. B.およびSuthanthiran, M., Semin Neph
rol 20 (2000) 103-7 26) Suthanthiran, M., Am J Med Sci 313 (1997) 264-
7 27) van Emmerik, N.ら、Transpl Int 7 (1994) S623-6 28) 米国特許第5,118,801号 29) 米国特許第5,210,015号 30) 米国特許第6,174,670号

【図面の簡単な説明】

【図１】６人の同種腎臓移植拒絶反応患者由来の末梢血
単核細胞における36の異なる遺伝子の平均発現を4人の
拒絶反応のない同種腎臓移植患者の発現と比較して示し
た図である。

【図２】本発明に従って選択された一定の遺伝子の発現
に基づく、4人の拒絶反応のない同種腎臓移植患者の発
現と比較した6人の同種腎臓移植拒絶反応患者の多重遺
伝子発現スコアを示した図である。詳細は実施例におい
て明らかにする。

【図３】実施例１による密度勾配遠心分離を示した図で
ある。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１４年１２月１０日（２００２．１２．
１０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者トーマスギーセドイツ連邦共和国 69198 シュリーズハイム，ブルーテンヴェグ７Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA04 CA09 CA12 CA20 HA11 HA13 HA14 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ08 QQ53 QR08 QR32 QR35 QR40 QR42 QR56 QR62 QS25 QS34 QS39 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】炎症過程を検査するための方法であっ
て、(a)末梢血単核細胞からRNAを含む試料を分離するこ
と、および(b)前記試料における4〜6個の選択された遺
伝子の発現レベルを、健康な個体の末梢血単核細胞由来
のRNAを含む試料中の前記遺伝子の発現レベルと比較し
てモニターすること、を含んでなり、前記の選択された遺伝子のうち少なくとも50%の発現に5
0%の差異があれば炎症過程を示し、その際、前記の選択
された遺伝子の少なくとも１つの発現が低下しているこ
とを特徴とする前記方法。
【請求項２】炎症過程を検査するための方法であっ
て、(a)末梢血単核細胞からRNAを含む試料を分離するこ
と、および(b)前記試料における4〜6個の選択された遺
伝子の発現レベルを、健康な個体の末梢血単核細胞由来
のRNAを含む試料中の前記遺伝子の発現レベルと比較し
てモニターすること、を含んでなり、前記の選択された遺伝子のそれぞれについて、前記遺伝
子の発現の差異の程度に対応するスコアリング値を決定
し、さらに、すべての決定されたスコアリング値の合計
として算出された全体値が炎症過程の可能性を示し、そ
の際、前記の選択された遺伝子の少なくとも１つの発現
が低下していることを特徴とする前記方法。
【請求項３】前記の選択された遺伝子の少なくとも１
つがMRP-14またはインターロイキン-6のいずれかであ
る、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】前記の選択された遺伝子の少なくとも１
つがインターフェロンγまたはパーフォリンのいずれか
である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】前記発現レベルがRT-PCRによって、さら
に優先的にはリアルタイムRT-PCRによって測定される、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】同種移植拒絶反応の検査のための、請求
項１〜５のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項７】同種移植が同種腎臓移植である、請求項
６に記載の使用。
【請求項８】感染に関連した臓器の機能不全、特にHC
Vに関連した肝不全の検査のための、請求項１〜５のい
ずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項９】 MRP-14、インターロイキン-6、インター
フェロンγ、およびパーフォリンの配列を増幅するため
の試薬を含んでなる、4〜6個の遺伝子の発現をモニター
するためのキット。