JP2003189848A

JP2003189848A - 動物細胞培養用ビーズ

Info

Publication number: JP2003189848A
Application number: JP2002298832A
Authority: JP
Inventors: Tatsuya Osumi; 辰也大隅
Original assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Current assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Priority date: 2001-10-19
Filing date: 2002-10-11
Publication date: 2003-07-08

Abstract

(57)【要約】【課題】動物細胞の接着性及び増殖性が高く、特に無
血清培地でも効率的に培養できる動物細胞培養用ビーズ
を提供すること。【解決手段】微粒子（Ｂ）の表面に、細胞接着シグナ
ルを現す最小アミノ酸配列を１分子中に少なくとも１個
有するポリペプチド（Ｐ）を配してなり、（Ｐ）の含有
量が（Ｂ）の表面積１ｃｍ²当り０．１〜１００μｇで
あることを特徴とする動物細胞培養用ビーズを用いる。
なお、（Ｂ）の体積平均粒子径は５０〜２５０μｍが好
ましい。また、（Ｂ）の真比重は１．０１〜１．０５ｇ
／ｃｍ ³が好ましい。また、（Ｂ）は少なくともスチレ
ン及び多官能性モノマーを構成単位としてなることが好
ましい。また、ポリペプチド（Ｐ）の細胞接着シグナル
を現す最小アミノ酸配列の数は、（Ｐ）１分子中に３〜
５０個が好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、動物細胞培養用ビ
ーズに関する。さらに詳しくは、細胞の接着・増殖性が
高く、特に、無血清培地を用いても、血清含有培地と同
等以上の接着・増殖性を与える動物細胞培養用ビーズに
関するものである。

【０００２】

【従来の技術】アミノ酸３文字表記で現されるArg Gly
Asp配列を有する遺伝子組換えペプチドであるプロネク
チンＦ（以下、ＰｎＦと略する。）やポリ−Ｌ−リジン
をコートした樹脂ビーズに対する細胞接着性を、０．５
％の血清を含有した培地を使用して研究発表されている
（非特許文献１）。

【０００３】

【非特許文献1】バラニ（J.Varani），インマン（D.R.I
nman），フリギール（S.E.G.Fligiel），ヒリガス（W.
J.Hillegas）、サイトテクノロジー（Cytotechnology）
13,1993年、89-98頁

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】この研究発表におい
て、ＰｎＦを０.００５μｇ／ｃｍ²あるいは０．０２５
μｇ／ｃｍ²コートした場合、コートしない場合のそれ
ぞれ３倍又は５倍の細胞接着性を示すが、接着・増殖性
がさらに高いものが強く要望されている。一方、同研究
発表で、ポリ−Ｌ−リジンを０.５μｇ／ｃｍ²コートし
た場合に、コートしない場合の約４１倍の細胞接着性を
示すが、この場合、細胞の伸展が遅いという問題と、ポ
リ−Ｌ−リジンには毒性があるという問題がある。す
なわち、本発明の目的は、動物細胞の接着性及び増殖性
が高く、特に無血清培地でも効率的に培養できる動物細
胞培養用ビーズを提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、鋭意研究を
重ね、特定のポリペプチドを０．１μｇ／ｃｍ²以上で
コートした樹脂ビーズを用いることにより劇的に細胞接
着性及び増殖性が高くなることを見いだし本発明に到達
した。すなわち、本発明の動物細胞培養用ビーズの特徴
は、微粒子（Ｂ）の表面に、細胞接着シグナルを現す最
小アミノ酸配列を１分子中に少なくとも１個有するポリ
ペプチド（Ｐ）を配してなり、（Ｐ）の含有量が（Ｂ）
の表面積１ｃｍ²当り０．１〜１００μｇである点にあ
る。

【０００６】

【発明の実施の形態】まず、微粒子（Ｂ）について説明
する。微粒子（Ｂ）は、水不溶性であればいかなる材質
も使用可能であるが、成型性や細胞毒性が低いという点
で好ましいものを列記すると、ビニル樹脂｛ポリスチレ
ン、ポリアクリルアミド架橋体（アクリルアミドとエチ
レングリコールジアクリレートとの共重合体等）、ポリ
メチル（メタ）アクリレート及びポリ（メタ）アクリロ
ニトリル等｝、ポリエステル、ポリウレタン、エポキシ
樹脂、ナイロン及びポリカーボネート等の合成高分子を
主成分とするもの、セルロース、セルロース誘導体（セ
ルロースジアセテート及びセルローストリアセテート
等）、架橋コラーゲン、架橋ゼラチン、架橋キチン及び
デキストラン等の天然高分子を主成分とするもの、並び
に酸化アルミニウム、ハイドロキシアパタイト、酸化チ
タン、シリカ及びガラス等の無機物を主成分とするもの
等が挙げられる。なお、水不溶性とは、３７℃の水（電
気伝導度１ジーメンス未満のイオン交換水）に対する溶
解度が１ｇ／１００ｇ未満のものをいう。イオン交換水
に対する溶解度は、次のようにして求められる。１００
ｇのイオン交換水（電気伝導度１ジーメンス未満）に、
過剰の（Ｂ）を加え、３７℃で２４時間攪拌し完全に飽
和させる。次に孔径１０μｍのメンブランフィルターで
ろ過して得られるろ液を１００℃で蒸発させてその残渣
を測定することにより求められる。

【０００７】これらの中で、細胞との親和性が良いとい
う点で、合成高分子を主成分とするもの、天然高分子を
主成分とするもの及びハイドロキシアパタイトが好まし
く、さらに好ましくは合成高分子を主成分とするもの及
び天然高分子を主成分とするもの、特に好ましくは合成
高分子を主成分とするもの、最も好ましくはビニル樹脂
を主成分とするものである。ビニル樹脂としては、スチ
レン及び多官能性モノマーを構成単位としてなるポリス
チレン、メチル（メタ）アクリレート及び多官能性モノ
マーを構成単位としてなるポリメチル（メタ）アクリレ
ート、並びに（メタ）アクリルアミド及び多官能性モノ
マーを構成単位としてなるポリ（メタ）アクリルアミド
等が挙げられ、これらの中で、スチレン及び多官能性モ
ノマーを構成単位としてなるポリスチレンが望ましい。
多官能性モノマーとしては、細胞毒性が低くスチレンと
共重合しうるモノマーであれば制限なく使用でき、２〜
４官能のビニル化合物及び（メタ）アクリロイル化合物
等が用いられ、例えば、ジビニルベンゼン、エチレング
リコールジ（メタ）アクリレート、トリビニルベンゼン
及びトリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート
等が挙げられる。

【０００８】ビニル樹脂を主成分とする場合、ビニル樹
脂（ポリスチレンが好ましい）中のビニルモノマー｛ス
チレン、メチル（メタ）アクリレート及び（メタ）アク
リルアミド等｝単位の含有量は、微粒子（Ｂ）の重量に
基づいて、６０〜９９．９重量％が好ましく、さらに好
ましくは８０〜９９．５重量％、特に好ましくは９０〜
９９重量％である。すなわち、この場合、ビニル樹脂中
のビニルモノマー単位の含有量（重量％）は、微粒子
（Ｂ）の重量に基づいて、６０以上が好ましく、さらに
好ましくは８０以上、特に好ましくは９０以上であり、
また９９．９以下が好ましく、さらに好ましくは９９．
５以下、特に好ましくは９９以下である。ビニル樹脂
（ポリスチレンが好ましい）中の多官能性モノマー単位
の含有量は、微粒子（Ｂ）の重量に基づいて、０．１〜
４０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．５〜２０
重量％、特に好ましくは１〜１０重量％である。すなわ
ち、多官能モノマー単位の含有量（重量％）は、微粒子
（Ｂ）の重量に基づいて、０．１以上が好ましく、さら
に好ましくは０．５以上、特に好ましくは１以上であ
り、また４０以下が好ましく、さらに好ましくは２０以
下、特に好ましくは１０以下である。

【０００９】微粒子（Ｂ）の形態には中実型と多孔質型
があるが、本発明においては特に制限はなく、中実型で
も多孔質型でも使用できる。これらのうち、通常の培養
方法でも細胞に対する栄養や酸素の供給が効率よく行
え、細胞の回収率が高くできるという点において、中実
型が好ましい。また、微粒子（Ｂ）の形状としては、細
胞が接着できる表面積が大きくなるという点で、針状、
板状又は直方体状等は好ましくなく、すなわち球状が好
ましく、特に真球状に近い方が好ましい。

【００１０】微粒子（Ｂ）の形態が中実型の場合、
（Ｂ）の体積平均粒子径は、２０〜１０００μｍが好ま
しく、さらに好ましくは４０〜５００μｍ、特に好まし
くは５０〜２５０μｍである。すなわち、この場合、
（Ｂ）の体積平均粒子径（μｍ）は、２０以上が好まし
く、さらに好ましくは４０以上、特に好ましくは５０以
上であり、また１０００以下が好ましく、さらに好まし
くは５００以下、特に好ましくは２５０以下である。体
積平均粒子径がこの範囲内であると、細胞の接着のしや
すさと単位体積当りの有効表面積のバランスが取れてお
り、特に５０〜２５０μｍの範囲であると、その傾向が
顕著である。また、粒子径（μｍ）は、１５〜１５００
が好ましく、さらに好ましくは３０〜６００、特に好ま
しくは４０〜３００である。すなわち、粒子径（μｍ）
は、１５以上が好ましく、さらに好ましくは３０以上、
特に好ましくは４０以上であり、また１５００μｍ以下
が好ましく、さらに好ましくは６００μｍ以下、特に好
ましくは３００μｍ以下である。微粒子（Ｂ）の形態が
多孔質型の場合、体積平均粒子径は、５０〜２００００
μｍが好ましく、さらに好ましくは１００〜１００００
μｍ、特に好ましくは２００〜５０００μｍである。す
なわち、この場合、体積平均粒子径（μｍ）は、５０以
上が好ましく、さらに好ましくは１００以上、特に好ま
しくは２００以上であり、また２００００以下が好まし
く、さらに好ましくは１００００以下、特に好ましくは
５０００以下である。また、粒子径（μｍ）は、３０〜
２５０００が好ましく、さらに好ましくは５０〜１２０
００、特に好ましくは７５〜６０００である。すなわ
ち、粒子径（μｍ）は、３０以上が好ましく、さらに好
ましくは５０以上、特に好ましくは７５以上であり、ま
た２５０００以下が好ましく、さらに好ましくは１２０
００以下、特に好ましくは６０００以下である。

【００１１】形態が多孔質型の場合、気孔径は５〜５０
０μｍが好ましく、さらに好ましくは７〜１００μｍ、
特に好ましくは１０〜５０μｍである。すなわち、この
場合、気孔径（μｍ）は５以上が好ましく、さらに好ま
しくは７以上、特に好ましくは１０以上であり、また５
００以下が好ましく、さらに好ましくは１００以下、特
に好ましくは５０以下である。なお、体積平均粒径は、
レーザー式粒度分布測定装置（例えば、商品名ＬＡ−９
２０：堀場製作所製、商品名マルチタイザーIII：コー
ルター社製等）で、水等を分散媒として用いて測定でき
る。また、気孔径は、電子顕微鏡で観察することで測定
できる。

【００１２】微粒子（Ｂ）の真比重は特に制限はない
が、本発明のビーズの使用方法によって好ましい範囲が
異なる。すなわち、ビーズを培地とともに撹拌しながら
細胞培養するいわゆる懸濁培養法等においては、撹拌中
はビーズは浮遊し、撹拌を止めると沈降することが好ま
しく、微粒子（Ｂ）の真比重としては１.００〜１.１０
ｇ／ｃｍ³が好ましく、さらに好ましくは１.０１〜１.
０８ｇ／ｃｍ³、特に好ましくは１．０１〜１．０５ｇ
／ｃｍ³である。すなわち、微粒子（Ｂ）の真比重（ｇ
／ｃｍ²）としては、１.００以上が好ましく、さらに好
ましくは１.０１以上であり、また１.１０以下が好まし
く、さらに好ましくは１.０８以下、特に好ましくは
１．０５以下である。

【００１３】また、ビーズを流動層型バイオリアクター
等の中に流動層として固定して培地を循環しながら細胞
培養するいわゆる灌流培養等においては、ビーズが液流
によって舞い上がらないことが好ましく、微粒子（Ｂ）
の真比重としては１.１〜１０.０ｇ／ｃｍ³が好まし
く、さらに好ましくは１.３〜８.０ｇ／ｃｍ³、特に好
ましくは１．５〜３．０ｇ／ｃｍ³である。すなわち、
微粒子（Ｂ）の真比重（ｇ／ｃｍ²）としては１.１以上
が好ましく、さらに好ましくは１.３以上、特に好まし
くは１．５以上であり、また１０.０以下が好ましく、
さらに好ましくは８.０以下、特に好ましくは３．０以
下である。なお、灌流培養においても、ビーズをホロー
ファイバー等に充填された状態で固定して培地を循環し
ながら培養する場合には、微粒子（Ｂ）の真比重は特に
規定されない。

【００１４】微粒子（Ｂ）の製造方法については特に制
限はなく、従来から公知の方法等が適用できる。合成高
分子を主成分とする場合、微粒子（Ｂ）の水性分散液
を、例えば、懸濁重合法又は乳化重合法で直接得る
か、バルク重合又は溶液重合後に転相乳化法又は貧溶
媒添加法で得るかした後、（Ｂ）の水性分散液を遠心分
離又はろ過により（Ｂ）を製造する方法や、バルク重
合又は溶液重合で得られた重合体(溶液)をスプレードラ
イすることによって（Ｂ）を製造する方法（大津隆行，
木下雅悦著「高分子化学合成の実験法」化学同人，１９
７２年）等が挙げられる。なお、溶液重合品をスプレー
ドライすることによって、多孔質型のビーズが得られ
る。

【００１５】ビニル樹脂を主成分とする場合はいずれの
方法も適用できるが、特にポリスチレンを効率良く合成
できるという点で懸濁重合による方法が好ましい。例え
ば、ビニル樹脂であるスチレンと多官能モノマーからな
るビーズは、ポリビニルアルコール［例えば、（株）ク
ラレ製、商品名：ＰＶＡ３５Ｐ］を分散剤として用い
（例えばモノマー全量に対して０．４重量％）、例えば
スチレンとジビニルベンゼンの混合モノマー（例えばス
チレン／ジビニルベンゼン＝９８／２重量比）を、例え
ばモノマー３０重量部に対して７０重量部の水に分散さ
せ、重合開始剤［例えば、日本化薬（株）製ベンゾイル
パーオキシド）を例えばモノマー全量に対して３重量％
加えた後、窒素雰囲気下で撹拌しながら８０℃で７時間
反応後、ろ過，乾燥（例えば８０℃で１０時間），篩い
分け｛例えば、目開き１０６μｍ金属製網篩（ＪＩＳ
Ｚ８８０１−１９８７）を通り、目開き７５μｍ金属製
網篩（ＪＩＳＺ８８０１−１９８７）に残るもの選
別｝することによって、得られる。

【００１６】ポリエステル、ポリウレタン、エポキシ樹
脂、ナイロン及びポリカーボネートを主成分とする場合
は、乳化重合による方法以外の方法が適用できるが、懸
濁重合による方法および転相乳化による方法が好まし
い。天然高分子を主成分とするものは、その溶液を用
いて転相乳化法又は貧溶媒添加法で水性分散体を得た
後、これを遠心分離又はろ過により微粒子（Ｂ）を製造
する方法や、その溶液をスプレードライすることによ
って製造することができる。なお、スプレードライする
ことによって多孔質型のビーズが得られる。

【００１７】無機化合物を主成分とするものは、市販品
をそのまま又は篩い分けを行った後に使用できる。市販
品としては、例えば、酸化アルミナとして昭和電工(株)
製又は住友化学(株)製の活性アルミナ、ハイドロキシア
パタイトとして富山製薬(株)製又は京セラ(株)製のハイ
ドロキシアパタイト粉末、酸化チタンとして石原産業
(株)製又はチタン工業(株)製の酸化チタン粉末、シリカ
として東海化学(株)製のシリカ粉末、及びガラスとして
日本板硝子(株)製のガラス粉末がそれぞれ挙げられる。

【００１８】また、細胞培養用ビーズとして市販されて
いるビーズも使用可能である。市販品としては、例え
ば、ポリスチレン製として、ナルジェヌンク社製の商品
名バイオシロン（Biosilon）、ソロヒル社製の商品名プ
ラスチックビーズ（Plastic beads）及びラックス社製
の商品名サイトスフェア(Cytosphere)；ポリアクリルア
ミド製としてバイオラッド(株)製の商品名バイオキャリ
ア(Biocarrier)；ポリウレタン製としてイノアック(株)
製の商品名ＰＵＦ；セルロース製としてバイオマテリア
ル(株)製の商品名セルスノウ(Cellsnow)；コラーゲン製
としてべラックス社製の商品名べラックス（Verax）；
ゼラチン製として東洋紡績(株)製の商品名カルチスフェ
アー（Cultispher）；デキストラン製としてアムシャム
ファルマシア社製の商品名サイトデックス（Cytode
x）；並びにガラス製としてスコット社製の商品名シラ
ン（SIRAN）等が挙げられる。

【００１９】細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配
列を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド
（Ｐ）について説明する。細胞接着シグナルを現わす最
小アミノ酸配列としては、接着シグナルとして働くもの
であればいずれも使用でき、例えば、株式会社永井出版
発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０）５
２７頁に記載されているもの等が使用できる。

【００２０】これらのうち、接着する細胞の種類が多い
という点で、Arg Gly Asp配列、LeuAsp Val配列、Arg G
lu Asp Val配列（１）、Tyr Ile Gly Ser Arg配列
（２）、Pro Asp Ser Gly Arg配列（３）、Arg Tyr Val
Val Leu Pro Arg配列（４）、Leu Gly Thr Ile Pro Gl
y配列（５）、Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp I
le配列（６）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）、Leu A
rg Glu配列、Asp Gly GluAla配列（８）及びHis Ala Va
l配列からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列が
好ましく、さらに好ましくはArg Gly Asp配列、Ile Lys
Val Ala Val配列（７）及びHis Ala Val配列からなる
群から選ばれる少なくとも１種の配列である。なお、ア
ミノ酸配列はアミノ酸３文字表記で現わし、（）内に
アミノ酸配列表に対応する配列番号を付記した。

【００２１】ポリペプチド（Ｐ）中には前記最小アミノ
酸配列が１分子中に少なくとも１個含有される必要があ
る。前記最小アミノ酸配列があると、細胞接着活性が高
まり、本来の機能を維持した状態で動物細胞の増殖を促
進することが可能となる。一方、前記最小アミノ酸配列
が含有されない場合、細胞接着性が低下する結果、特に
無血清培地を用いる場合に細胞の増殖が不十分になる。

【００２２】この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接
着・増殖性の観点から、１分子中３〜５０個が好まし
く、さらに好ましくは５〜４０個、特に好ましくは１０
〜３０個である。含有量がこの範囲であると、細胞接着
活性がさらに高まり、本来の機能を維持した状態で動物
細胞の増殖を促進することが容易となりやすい傾向にあ
る。

【００２３】ポリペプチド（Ｐ）の数平均分子量（Ｍ
ｎ）は、細胞に対する毒性が低く、接着性能が高いとい
う点で、５，０００〜５，０００，０００が好ましく、
さらに好ましくは１０，０００〜１，０００，０００、
特に好ましくは５０，０００〜５００，０００である。
なお、ポリペプチド（Ｐ）の数平均分子量（Ｍｎ）は、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（Ｎａドデシルスルフェイト−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法）で、（Ｐ）を水中で展
開し、泳動距離を標準物質と比較することによって求め
られる。

【００２４】ポリペプチド（Ｐ）は、細胞接着シグナル
を現わす最小アミノ酸配列以外に、（Ｐ）の熱安定性が
高まるアミノ酸配列、例えばシルクフィブロイン由来の
GlyAla Gly Ala Gly Ser配列（９）を少なくとも２個有
することが好ましく、このアミノ酸配列を３個以上有す
ることがさらに好ましく、５〜３０個有することが特に
好ましい。

【００２５】ポリペプチド（Ｐ）としては、例えば、
（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）₉配列（１０）とArg Gly
Asp配列とを有するポリペプチド、（Gly Ala Gly Ala G
ly Ser）₉配列（１０）とTyr Ile Gly Ser Arg配列
（２）とを有するポリペプチド、（Gly Ala Pro (Gly P
ro Pro)₄）₂配列（１１）とArg Gly Asp配列とを有する
ポリペプチド、（Gly Ala Pro (Gly Pro Pro)₄）₂配列
（１１）とTyr Ile Gly Ser Arg配列（２）とを有する
ポリペプチド、及び（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）₉配列
（１０）とIle Lys Val Ala Val配列（７）とを有する
ポリペプチド（特表平３−５０２９３５号公報）等が挙
げられる。

【００２６】ポリペプチド（Ｐ）として市場から入手で
きるものとしては、例えば、三洋化成工業（株）製プロ
ネクチンＦ（遺伝子組替大腸菌により製造され、１分子
中にArg Gly Asp配列と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）₉
配列（１０）とを各々約１３個有する数平均分子量約１
１万のポリペプチド）、同プロネクチンＦプラス（プロ
ネクチンＦをジメチルアミノエチルクロライドと反応さ
せて水溶性にしたもの）、同プロネクチンＬ（遺伝子組
替大腸菌により製造され、１分子中にIle LysVal Ala V
al配列（７）と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）₉配列（１
０）とを各々約７個有する数平均分子量約９万のポリペ
プチド）等が挙げられる。

【００２７】また、宝酒造（株）製ＲｅｔｒｏＮｅｃｔ
ｉｎ（リコンビナントヒトフィブロネクチンＣＨ−２９
６）｛ヒトフィブロネクチン細胞接着シグナルであるＣ
Ｓ１シグナルと細胞接着ドメインＴｙｐｅＩＩＩ及びヘ
パリン結合ドメインＩＩを１つずつ有する数平均分子量
約6万のポリペプチド｝（Leu Asp Val配列を約１個含
有）、同ＲＧＤＳ−ＰｒｏｔｅｉｎＡ｛Arg Gly Asp
配列をＰｒｏｔｅｉｎＡ（ＩｇＧ結合ドメイン）に挿
入した数平均分子量約３万のポリペプチド｝（ArgGly A
sp配列を約１個含有）もポリペプチド（Ｐ）として使用
可能である。

【００２８】ポリペプチド（Ｐ）の製造方法は特に制限
されず、ペプチドを合成する従来既知の方法と同様にし
て製造することができ、例えば、有機合成法（固相合成
法、液相合成法等）及び生化学的合成法［遺伝子組換微
生物（酵母、細菌、大腸菌等）］等によって合成するこ
とができる。有機合成法に関しては、例えば、日本生化
学学会編「続生化学実験講座２、タンパク質の化学
（下）」第６４１〜６９４頁（昭和６２年５月２０日；
株式会社東京化学同人発行）に記載されている方法等が
用いられる。

【００２９】生化学的合成法に関しては、例えば、特表
平３−５０２９３５号公報に記載されている方法等が用
いられる。高分子量の（Ｐ）を容易に合成できる点で、
遺伝子組換微生物による生化学的合成法が好ましく、特
に好ましくは遺伝子組換大腸菌を用いて合成する方法で
ある。

【００３０】本発明のビーズは、細胞接着シグナルを現
す最小アミノ酸配列を１分子中に少なくとも１個有する
ポリペプチド（Ｐ）を、微粒子（Ｂ）の表面に、（Ｂ）
の平均表面積１ｃｍ²当り、０．1〜１００μｇ含有して
おり、好ましくは０．２〜５０μｇ、さらに好ましくは
０．３〜１０μｇの範囲で含有している。すなわち、ポ
リペプチド（Ｐ）の含有量（μｇ）は、微粒子（Ｂ）の
平均表面積１ｃｍ²当り、０．1以上であり、好ましくは
０．２以上、さらに好ましくは０．３以上であり、ま
た、１００以下であり、好ましくは５０以下、さらに好
ましくは１０以下である。ポリペプチド（Ｐ）の含有量
が、０．１μｇ／ｃｍ²未満である場合、（Ｐ）を含ま
ない場合よりも細胞の接着・増殖性は高くなるものの、
その効果は不十分であり、（Ｐ）の含有量が１００μｇ
／ｃｍ²を超える場合、効果は低下しないものの非経済
的である。なお、（Ｐ）の含有量は、通常のタンパク量
測定試薬（例えば、ピアスケミカル社製ＢＣＡ蛋白試薬
等）で測定することができる。微粒子（Ｂ）の平均表面
積は、次のようにして求める。レーザー式粒度分布測定
装置（例えば、商品名：ＬＡ−９２０（堀場製作所製）
及びマルチタイザーＩＩＩ（コールター社製）等）で、
水を分散媒として（Ｂ）の体積平均粒子径［φ（μ
ｍ）］を測定する。一方、比重の異なる液体（食塩水
等）に、それぞれ微粒子（Ｂ）を加えて、（Ｂ）の浮遊
する液を見いだすことにより、その液体の比重を（Ｂ）
の比重（ｄ）とする。そして、微粒子（Ｂ）の平均表面
積は、（Ｂ）を真球状と擬制することにより、これらの
体積平均粒子径（φ）及び比重（ｄ）から、式｛表面積
（ｃｍ²／ｇ）＝［４×π×（φ／２／１００００）²］
／［４／３×π×（φ／２／１００００）³×ｄ］｝か
ら算出される。なお、鱗片状、棒状、直方体及び板状等
の球状でないもの、表面に凹凸を有するもの（例えば凹
凸の差が０．１ｍｍを超えるもの）及び多孔質のもの
（上記の方法ででは計算できないもの）は、比表面積計
（例えば、ＱＵＡＮＴＡＳＯＲＢ（ユアサアイオニクス
製）を用いて測定（測定ガス；Ｈｅ／Ｋｒ＝９９．９／
０．１体積比、検出ガス；窒素）することができる。な
お、以上のすべての測定温度は２５℃である。

【００３１】本発明のビーズを得る方法としては、例え
ば、ポリペプチド（Ｐ）を溶媒に溶かした溶液を予め作
製し、その中に微粒子（Ｂ）を加え、所定のコーティン
グ時間必要に応じて攪拌した後に余分の溶液を捨て乾燥
させるか、余分の溶液を捨てずに乾燥させる方法等が挙
げられる。

【００３２】ポリペプチド（Ｐ）の溶液を作製するため
に用いられる溶媒としては特に制限はないが、無機塩、
有機酸塩、アミノ酸、ビタミン、アルコール、脂質・
糖、酸及び／又は塩基を０．１〜５０重量％（好ましく
は１〜３０重量％）含有する水溶液及び水等が使用でき
る。無機塩としては、ハロゲン化金属塩、硫酸金属塩、
リン酸金属塩、硝酸金属塩、炭酸金属塩及び過ハロゲン
酸金属等が使用でき、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナ
トリウム、リン酸ナトリウム、塩化カルシウム、硝酸
鉄、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸ナトリウ
ム、リン酸水素ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水
素カリウム、硫酸銅、硫酸鉄、塩化リチウム、臭化ナト
リウム、臭化リチウム過塩素酸ナトリウム及び過塩素酸
リチウム等が挙げられる。

【００３３】有機酸塩としては、例えば、蟻酸ナトリウ
ム、酢酸ナトリウム、酢酸リチウム及び酒石酸ナトリウ
ム等が挙げられる。アミノ酸としては、例えば、アルギ
ニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニ
ン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、
チロシン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラ
ギン酸、グルタミン酸、プロリン、セリン及びグリシン
等が挙げられる。ビタミンとしては、例えば、コリン、
イノシトール、ニコチンアミド、グルタミン、ビタミン
Ａ及びビタミンＢ₁₂等が挙げられる。アルコールとして
は、炭素数１〜４のアルコール等が使用でき、例えば、
メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール及び
ブタノール等が挙げられる。

【００３４】脂質・糖としては、例えば、脂質、単糖、
２糖、オリゴ糖、アミノ糖及び酸性糖等が挙げられる。
酸としては、無機酸及び炭素数１〜６の有機酸等が使用
でき、例えば、塩酸、硝酸、塩酸、硫酸、燐酸、酢酸、
蟻酸、酒石酸、リンゴ酸、フェノール及びカテコール等
が挙げられる。塩基としては、無機塩基及び炭素数２〜
６の有機塩基等が使用でき、例えば、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、アンモニア、モノエタノールアミ
ン、トリエタノールアミン及びトリエチルアミン等が挙
げられる。水としては、蒸留水、イオン交換水、水道水
及びイオン交換蒸留水等が挙げられる。これらの溶媒の
中で、無機塩、酸及び／又は塩基を含有する水溶液及び
水が好ましく、さらに好ましくは無機塩を含有する水溶
液及び水、特に好ましくは無機塩を含有する水溶液であ
る。無機塩のうち、ｐＨ緩衝効果のある無機塩（炭酸ナ
トリウム、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、
リン酸カリウム及びリン酸水素カリウム等）を含有する
ものが最も好ましい。

【００３５】なお、好ましいｐＨ範囲は、２〜１１．５
であり、さらに好ましくは４〜９．５、特に好ましくは
６〜８．５、最も好ましくは７〜７．５である。すなわ
ち、ｐＨは、２以上が好ましく、さらに好ましくは４以
上、特に好ましくは６以上、最も好ましくは７以上であ
り、また１１．５以下が好ましく、さらに好ましくは
９．５以下、特に好ましくは８．５以下、最も好ましく
は７．５以下である。好ましい無機塩水溶液としては、
ｐＨ７．２に調整されたリン酸水素ナトリウムとリン酸
水素カリウムとの生理食塩水溶液［ＰＢＳ（−）］等が
挙げられる。ポリペプチド（Ｐ）がシルクフィブロイン
由来のGly Ala Gly Ala Gly Ser配列（９）を含有する
場合、その溶媒溶液の好ましい作成方法としては、該ポ
リペプチドを過塩素酸リチウムあるいは臭化リチウムに
例えば１ｍｇ／ｍＬの濃度にまず溶解し、ＰＢＳ（−）
で２０〜２００倍に希釈する方法等が挙げられる。

【００３６】ポリペプチド（Ｐ）の溶液の濃度は、溶媒
１ｍｌ当り、０．０１μｇ〜１００ｍｇが好ましく、さ
らに好ましくは０．１μｇ〜１０ｍｇ、特に好ましくは
１μｇ〜１ｍｇである。すなわち、ポリペプチド（Ｐ）
の溶液の濃度は、溶媒１ｍｌ当り、０．０１μｇ以上が
好ましく、さらに好ましくは０．１μｇ以上、特に好ま
しくは１μｇ以上であり、また１００ｍｇ以下が好まし
く、さらに好ましくは１０ｍｇ以下、特に好ましくは１
ｍｇ以下である。コーティング時間としては、用いる培
養基材によっても異なるが、通常３０秒〜４８時間、好
ましくは１分〜２４時間、されに好ましくは３分〜１２
時間である。必要に応じて行われる乾燥の条件について
も特に制限はなく、通常の方法が適用でき、例えば、必
要に応じて順風乾燥機や減圧乾燥機などを用いて、０〜
２００℃、０．００１Ｐa〜大気圧の圧力下で、１〜１
００時間乾燥することで行える。

【００３７】また、必要に応じて行われる乾燥の前又は
後で、無機塩を含有する水溶液又は水で通常の方法で洗
浄することもできる。また、コーティングの後で、必要
に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限
は無く、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス
滅菌、オートクレーブ滅菌及び乾熱滅菌等が挙げられ
る。

【００３８】本発明のビーズを用いて、培養される動物
細胞の種類としては特に制限がなく、ヒト、サル、マウ
ス、ハムスター、ラット及び昆虫等の初代培養細胞や株
化細胞、並びに細胞培養実験、医薬品又はワクチン生産
等に用いられる公知の細胞等が使用できる。具体的には
例えば、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル腎）細胞、ＣＨ
Ｏ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＷＩ３８（ヒ
ト胎児肺）細胞、ヒト由来の幹細胞、内皮細胞、上皮細
胞、実質細胞、線維芽細胞及び角質細胞等が挙げられ
る。これら細胞の中では、無血清培養のニーズが高く、
本発明のビーズの特長が最大限活用される医薬品やワク
チン生産用に用いられる細胞（Ｖｅｒｏ細胞及びＣＨＯ
細胞等）に最適である。

【００３９】本発明のビーズを用いて動物細胞を培養す
る方法としては特に制限はなく、通常の方法、例えば、
ビーズを培地とともに撹拌しながら細胞培養するいわゆ
る懸濁培養法、ビーズを流動層型バイオリアクター等の
中に流動層として固定するかあるいはホローファイバー
等の中に固定層として固定して培地を循環しながら細胞
培養するいわゆる灌流培養灌流培養法等を用いることが
できる。本発明のビーズの使用量は、細胞の種類等によ
って異なるが、通常、培地１Ｌ当り、０．５〜１０００
ｇ、好ましくは１〜１００ｇ、さらに好ましくは５〜５
０ｇである。すなわち、本発明のビーズの使用量（ｇ）
は、培地１Ｌ当り、通常０．５以上、好ましくは１以
上、さらに好ましくは５以上であり、また１０００以
下、好ましくは１００以下、さらに好ましくは５０以下
である。

【００４０】培地としては、用いる動物細胞の種類に応
じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ
培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆ
ｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地及びＲＰＭＩ培
地等、朝倉書店発行「日本組織培養学会編組織培養の
技術第三版」５８１頁に記載の基礎培地、これらの培地
に血清成分（ウシ胎児血清等）等を添加したもの、並び
に市販の無血清培地［味の素（株）製無血清培地ＡＳＦ
１０３，同ＡＳＦ１０４，同ＡＳＦ３０１、ギブコ社製
無血清培地ＣＨＯ−ＳＦＭ，同ＶＰ−ＳＦＭ等］等が用
いられる。

【００４１】血清培地を使用した場合、血清中に成分未
知の蛋白質等が含まれ再現性が得られにくいこと、細胞
を用いる医薬品生産の場合には精製工程が複雑となりコ
ストがかかること、さらにウィルス感染の危険性がある
こと等の理由から、血清を含まないいわゆる無血清培地
が好ましく、特に、本発明のビーズは、無血清培地でも
細胞の接着・増殖性に優れているため、本発明のビーズ
とともに用いる培地としては無血清培地が特に好まし
い。

【００４２】さらに必要に応じて、細胞増殖因子（Ｓ）
を培地中に含有させることにより、動物細胞の増殖速度
をさらに高めたり、細胞活性を高めたり、細胞が本来有
する機能を発現させたりすることができる。細胞増殖因
子（Ｓ）は細胞を増殖させる活性のある物質であり、例
えば、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、
ＩＧＦ及びＢＭＰ等が挙げられ、この他に、例えば財団
法人名古屋大学出版会発行「上田実編ティッシュエンジ
ニアリング（１９９９年）」４３〜５１頁及び同文献に
付記されている参考文献に記載されているもの等も用い
られる。細胞増殖因子（Ｓ）を含有させる場合、この使
用量（ｍｇ）としては、培地１Ｌ当たり、０．００００
１〜１００が好ましく、さらに好ましくは０．０００１
〜１０、特に好ましくは０．００１〜１である。すなわ
ち、この場合、（Ｓ）の使用量（ｍｇ）は、培地１Ｌ当
たり、０．００００１以上が好ましく、さらに好ましく
は０．０００１以上、特に好ましくは０．００１以上で
あり、また、１００以下が好ましく、さらに好ましくは
１０以下、特に好ましくは１以下である。

【００４３】培養条件としては、特に制限はなく、二酸
化炭素（ＣＯ₂）濃度１〜２０体積％、５〜４５℃で１
時間〜１００日間、必要に応じて１〜７日毎に培地交換
しなら培養すること等が挙げられる。特に好ましい例と
しては、例えば、ＣＯ₂濃度５体積％、３７℃の条件
で、２〜４日毎に培地交換しながら１〜３６日間培養す
ることである。

【００４４】本発明のビーズは、動物細胞を効率的に接
着・増殖させることができ、無血清培地を好適に使用で
きるため、細胞を用いる医薬品やワクチンの生産用に特
に好適に使用できる。

【００４５】

【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。＜実施例１＞スチレン９９重量％、ジビニルベンゼン1
重量％を懸濁重合して得られたポリスチレンビーズを金
属製網篩（ＪＩＳＺ８８０１−１９８７）で篩い分
け、７５〜１０６μｍの間の粒子径を有するビーズを得
た。レーザー式粒度分布測定装置ＬＡ−９２０（堀場製
作所製）で測定した体積平均粒径は９６μｍ、比重は
１．０５であった。このビーズの平均表面積は、上記の
計算式によって５９５ｃｍ ²／ｇと計算された。

【００４６】特表平３−５０２９３５号公報中の実施例
記載の方法に準じて、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）₉配
列（１０）とArg Gly Asp配列とを１２個含むＭｎ約１
１万の遺伝子組換え大腸菌の産生蛋白質"ＳＬＰＦ"を作
製した。次いで、ＳＬＰＦの４．５規定の過塩素酸リチ
ウム水溶液（ＳＬＰＦの濃度；１ｍｇ／ｍｌ）をリン酸
バッファー液（ＰＢＳ）でＳＬＰＦの濃度が１５μｇ／
ｍｌとなるように希釈し、ＳＬＰＦ溶液１を作製した。

【００４７】ＳＬＰＦ溶液１の２５ｍｌに上記で得られ
たビーズを５ｇ加え、ポリフッ化エチレン樹脂（テフロ
ン（登録商標））製撹拌子で１２時間撹拌した。得られ
たビーズスラリーを振盪器上にセットしたステンレス製
バットに移し、１００℃の熱風を吹きつけながら、２４
時間振盪乾燥した。得られた乾燥ビーズをＰＢＳ５０ｍ
ｌで２回洗浄し、ＰＢＳ中で１２１℃で２０分間オート
クレーブ滅菌後、ＵＶ照射下に乾燥することで、本発明
のビーズ１を得た。ビーズ１のＳＬＰＦ含有量を、ビー
ズ１を４．５規定の過塩素酸リチウム溶液５０ｍＬ中で
２４時間撹拌後、過塩素酸リチウム溶液上清中に溶出し
たＳＬＰＦの含有量をピアスケミカル社製ＢＣＡ蛋白試
薬で測定することによって求めた結果、０．１μｇ／ｃ
ｍ²であった。

【００４８】＜実施例２＞ＳＬＰＦ溶液１の代わりに、
ＳＬＰＦの濃度が４５μｇ／ｍｌのＳＬＰＦ溶液２を用
いる以外は実施例１と同様にして、本発明のビーズ２を
得た。ビーズ２のＳＬＰＦ含有量は０．３μｇ／ｃｍ²
であった。

【００４９】＜実施例３＞ＳＬＰＦ溶液１の代わりに、
ＳＬＰＦの濃度が９０μｇ／ｍｌのＳＬＰＦ溶液３を用
いる以外は実施例１と同様にして、本発明のビーズ３を
得た。ビーズ３のＳＬＰＦ含有量は０．７μｇ／ｃｍ²
であった。

【００５０】＜比較例１＞ＳＬＰＦ溶液での処理を行わ
ず、ポリスチレンビーズをそのまま用いて、比較用のビ
ーズ４を得た。

【００５１】＜比較例２＞ＳＬＰＦ溶液１の代わりに、
ＳＬＰＦの濃度が５．０μｇ／ｍｌのＳＬＰＦ溶液４を
用いる以外は実施例１と同様にして、比較用のビーズ５
を得た。ビーズ５のＳＬＰＦ含有量は０．０３μｇ／ｃ
ｍ²であった。

【００５２】＜比較例３＞ＳＬＰＦ溶液１の代わりに、
ＳＬＰＦの濃度が１０．０μｇ／ｍｌのＳＬＰＦ溶液５
を用いる以外は実施例１と同様にして、比較用のビーズ
６を得た。ビーズ６のＳＬＰＦ含有量は０．０６μｇ／
ｃｍ²であった。

【００５３】＜細胞培養＞得られたビーズ１〜６を用い
て無血清細胞培養実験を行った。６個の１Ｌスピナーフ
ラスコに、６ｇのビーズ１〜６をそれぞれ加え、２５０
ｍｌの味の素（株）製無血清培地ＡＳＦ１０４を加え、
３７℃で２０分間撹拌下温調後、Ｖｅｒｏ細胞［大日本
製薬（株）から購入］を細胞濃度：５．０×１０ ⁶個／
ｍＬに分散したもの５ｍｌを加え、２５ｒｐｍで撹拌し
ながら、二酸化炭素と空気の混合物（二酸化炭素／空気
＝５／９５体積比）中、３７℃で３日間培養を行なっ
た。撹拌下ビーズ懸濁液をサンプリングし、細胞核数を
ウィーゼル（Wezel）によるクリスタルバイオレットを
用いた細胞核計数法（nuclei-counting method）で計数
することで、細胞数を測定した。結果を表１に示す。

【００５４】

【表１】なお、ビーズ１を用いて同様に、味の素（株）製無血清
培地ＡＳＦ１０４の代わりに、血清培地（ＦＢＳ５％含
有ＤＭＥＭ）を用いた場合の細胞数は、７０×１０⁶個
であった。

【００５５】この結果をＳＬＰＦの含有量を横軸にグラ
フ化すると、図１のようになる。図１から、ＳＬＰＦ含
有量が０．１μｇ／ｃｍ²以上で、得られる細胞数が明
らかに激増し、血清培地を用いた場合と同等以上の細胞
数が得られることが判る。以上の実施例及び比較例か
ら、本発明のビーズを用いた場合、無血清培養において
も血清培地を使用した場合と同様に、細胞の増殖が促進
されることが判る。

【００５６】

【発明の効果】本発明のビーズを用いると、無血清でも
細胞を効率的に培養が可能であり、動物細胞を用いる医
薬品やワクチンの生産の完全無血清化が実現できるもの
である。

【００５７】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＳＬＰＦ量と細胞数との関係を表したグラフで
ある。

【００５８】

【配列表】 <110>三洋化成工業株式会社；SANYO CHEMICAL INDUSTRIES,LTD. <120>動物細胞培養用ビーズ <150>特願2001-322356 <151>2001-10-19 <160>11 <210>1 <211>4 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>1 Arg Glu Asp Val 1 <210>2 <211>5 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>2 Tyr Ile Gly Ser Arg 1 5 <210>3 <211>5 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>3 Pro Asp Ser Gly Arg 1 5 <210>4 <211>7 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>4 Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg 1 5 <210>5 <211>6 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>5 Leu Gly Thr Ile Pro Gly 1 5 <210>6 <211>10 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>6 Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile 1 5 10 <210>7 <211>5 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>7 Ile Lys Val Ala Val 1 5 <210>8 <211>4 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>8 Asp Gly Glu Ala 1 <210>9 <211>6 <212>PRT <213>Bombyx mori <400>9 Gly Ala Gly Ala Gly Ser 1 5 <210>10 <211>54 <212>PRT <213>Bombyx mori <400>10 Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala 20 25 30 Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser 35 40 45 Gly Ala Gly Ala Gly Ser 50 <210>11 <211>30 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>11 Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 1 5 10 15 Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro 20 25 30

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】微粒子（Ｂ）の表面に、細胞接着シグナ
ルを現す最小アミノ酸配列を１分子中に少なくとも１個
有するポリペプチド（Ｐ）を配してなり、（Ｐ）の含有
量が（Ｂ）の表面積１ｃｍ²当り０．１〜１００μｇで
あることを特徴とする動物細胞培養用ビーズ。
【請求項２】体積平均粒子径が５０〜２５０μｍであ
る請求項１記載のビーズ。
【請求項３】真比重が１．０１〜１．０５ｇ／ｃｍ³
である請求項１又は２記載のビーズ。
【請求項４】微粒子（Ｂ）が少なくともスチレン及び
多官能性モノマーを構成単位としてなる請求項１〜３の
いずれか記載のビーズ。
【請求項５】ポリペプチド（Ｐ）の細胞接着シグナル
を現す最小アミノ酸配列の数が、（Ｐ）１分子中に３〜
５０個である請求項１〜４のいずれか記載のビーズ。
【請求項６】ポリペプチド（Ｐ）の細胞接着シグナル
を現す最小アミノ酸配列が、アミノ酸３文字表記で現わ
される、Arg Gly Asp配列、Leu Asp Val配列、Arg Glu
Asp Val配列（１）、Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）、
Pro Asp SerGly Arg配列（３）、Arg Tyr Val Val Leu
Pro Arg配列（４）、Leu Gly Thr Ile Pro Gly配列
（５）、Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile配
列（６）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）、Leu Arg G
lu配列、Asp Gly Glu Ala配列（８）及びHis Ala Val配
列からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列である
請求項１〜５のいずれか記載のビーズ。
【請求項７】ポリペプチド（Ｐ）が、さらにアミノ酸
３文字表記で現されるGly Ala Gly Ala Gly Ser配列
（９）を少なくとも２個有してなる請求項１〜６のいず
れか記載のビーズ。
【請求項８】無血清培地を用いて、請求項１〜７のい
ずれか記載のビーズ上で動物細胞を培養することを特徴
とする動物細胞の生産方法。