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JP2003180354A - 新規シグナル配列 - Google Patents

新規シグナル配列

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Publication number
JP2003180354A
JP2003180354A JP2003002513A JP2003002513A JP2003180354A JP 2003180354 A JP2003180354 A JP 2003180354A JP 2003002513 A JP2003002513 A JP 2003002513A JP 2003002513 A JP2003002513 A JP 2003002513A JP 2003180354 A JP2003180354 A JP 2003180354A
Authority
JP
Japan
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dna
sequence
plant
gene
chitinase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2003002513A
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas Boller
ボーレル トーマス
Jean-Marc Neuhaus
ノイハウス イエンーマルク
John Ryals
ライアルズ ジョン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Syngenta Participations AG
Original Assignee
Syngenta Participations AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=4223728&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2003180354(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Syngenta Participations AG filed Critical Syngenta Participations AG
Publication of JP2003180354A publication Critical patent/JP2003180354A/ja
Pending legal-status Critical Current

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Abstract

(57)【要約】 【課題】構造遺伝子が植物細胞内でキチナーゼを発現す
る遺伝子である組換えＤＮＡ分子、そしてそのキチナー
ゼに連結されて特異的に植物液胞に方向づけられる遺伝
子産物を生じるＤＮＡ配列、及びそれらの突然変異体及
び変種の作成、及びその使用。 【解決手段】遺伝子工学手法を用いての植物細胞内でキ
チナーゼ発現ＤＮＡと操作可能に連結されたＤＮＡ配列
を含む組換えＤＮＡ分子、及びそれから誘導されたベク
ター、又該ベクターを含むトランスジェニック植物等の
宿主細胞及び／又は宿主有機体、及びその使用方法を包
含する。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は、新規なペプチド断片
（標的性シグナル）に関し、より詳しくは、植物液胞タ
ンパク質のＣ末端領域（Ｃ末端範囲）から得られ、かつ
あらゆる所望のタンパク質分子と操作可能に結合され
て、それらのペプチド断片と結合したタンパク質が特異
的に植物液胞に方向づけられることを確実にするペプチ
ド断片に関する。 【０００２】本発明はまた、上で詳細に特徴づけられた
ペプチド断片をコードし、そしてあらゆる所望の発現性
ＤＮＡと操作可能に連結されて、特異的に植物液胞に方
向づけられる遺伝子産物を生じるＤＮＡ配列、およびそ
れらの突然変異体および変種に関する。 【０００３】本発明はさらに、発現性ＤＮＡと操作可能
に連結された本発明に係るＤＮＡ配列を含む組換えＤＮ
Ａ分子、およびそれから誘導されたベクターに関する。
また、上記組換えＤＮＡまたはそれから誘導されたベク
ターを含むトランスジェニック植物などの宿主細胞およ
び／または宿主有機体をも包含する。 【０００４】本発明はまた、本発明に係るＤＮＡ配列な
らびに該ＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子およびベク
ターの製法、およびトランスジェニック植物作出のため
のそれらの使用にも関する。 【０００５】 【従来の技術】遺伝子工学において、結合した遺伝子産
物をその機能に従って特定の目的地に到達させ、その場
所で最適活性を示し得るか、または適当な方法で貯蔵さ
れ得る、いわゆるシグナル配列をコードするＤＮＡ配列
を同定することは、挿入された外来遺伝子の純粋な発現
以上に近年興味が高まってきている。概して植物に関
し、このことは、挿入された外来遺伝子の組織および／
または成長特異的発現を可能にするプロモーターの同定
または開発のための試みがなされていることを意味す
る。 【０００６】挿入された外来遺伝子またはそれらの発現
産物の標的または目的地指向配置は植物のレベルで適切
であるばかりでなく、特に形質転換の効果に関し細胞レ
ベルでも非常に重要である。 【０００７】例えば、植物ならびにその他の真核細胞に
おいて、大部分のタンパク質が細胞質リボソーム上で合
成されるけれども、非常に多くのタンパク質が全く異な
る細胞下区画において要求されることが知られている。
唯一の例外は、それらが使用される場所で製造されるミ
トコンドリアおよび葉緑素のいくつかのタンパク質によ
り形成される。他方、細胞質で製造されたタンパク質は
細胞を貫通する内膜系に沿って細胞の溶解区画（液胞、
リソソーム）および細胞外空間に運ばれるか、またはそ
れらの特定の区画（液胞、葉緑素、ペルオキシソーム）
により直接取り込まれる。 【０００８】細胞下レベルでこの区画化の維持のため
に、細胞質で製造されたタンパク質がそれらの機能に従
って分配されることを確実にする細胞内での特異的輸送
および選別系がなければならない。それ故に、これらの
タンパク質は、細胞の輸送および選別系がそれら自身の
特定の基質を認識し、そして該基質をそれらの特定の目
的地に方向づけることを可能にする情報の付加事項を一
つまたはそれ以上含んでいなければならない。従って、
例えば、ミトコンドリアおよび葉緑素タンパク質の非常
に多くの細胞質前駆体において、タンパク質がそれらの
特定の区画に取り込まれることを確実にするいわゆる輸
送ペプチドをＮ末端に検出することが可能であった。同
様に、核タンパク質は細胞−核特異的配列を有する。 【０００９】細胞内タンパク質輸送にとって特に重要な
のは細胞の内膜系である。細胞を貫通し、そして小胞体
およびゴルジ装置からなるこの膜系はタンパク質、特に
細胞質で製造されたタンパク質を溶解区画（液胞、リソ
ソーム）および細胞外空間に輸送するために実質的に機
能する。 【００１０】内膜系を介して輸送されたタンパク質は小
胞体をまず最初に通過する。この段階で必要な輸送シグ
ナルは分子のＮ末端にあるシグナル配列、いわゆるシグ
ナルペプチドにより示される。このシグナルペプチドは
その機能を果たすとすぐに、前駆体タンパク質からタン
パク質分解的に分離除去される。その特異的な機能のた
めに、このタイプのシグナルペプチド配列は、バクテリ
ア、酵母、菌類、動物または植物によらず全ての生存細
胞において進化の間に高度に保存されてきた。 【００１１】その他の選別段階は次いでゴルジ装置で起
こり、そこでは溶解区画（液胞、リソソーム）に意図さ
れたタンパク質および細胞外空間への分泌が意図された
タンパク質の分離が行われている。酵母および動物に関
する実験では、追加のシグナルを含まないタンパク質が
細胞外空間内に自動的に明らかに分泌され、一方、その
ような追加の選別シグナルを含むタンパク質は溶解区画
に送り出されることが見出されている。 【００１２】この選別シグナルの性質は非常に広範囲に
変化し得る。これまで研究された動物において、例え
ば、それは一般的に糖タンパク質のグリカン鎖、すなわ
ちマンノース６−ホスフェート基内での特異的修飾であ
る。この基は特異的なマンノース６−ホスフェートレセ
プターにより認識され、その結果特定の小胞中の相当す
るタンパク質がゴルジ装置から供給され、そしてリソソ
ームに輸送される。しかしながら、どのポリペプチド配
列がグリカン側鎖中のマンノース基のリン酸化に刺激を
与えるかを決定することはこれまで可能ではなかった。 【００１３】酵母において、溶解区画のための相当する
選別シグナルはグリカン鎖ではなくアミノ酸配列であ
り、シグナルペプチドの除去の後、タンパク質のＮ末端
を形成する。液胞のためのこのＮ末端標的性シグナルは
プロテイナーゼＡによりそれ自身液胞内で一般に分離除
去される。しばしば、液胞内に輸送されたタンパク質
は、標的性シグナルを分離除去してはじめて、酵素的に
活性な酵素になる。 【００１４】植物において、液胞が植物細胞の溶解区画
を示すだけでなく、貯蔵物質、解毒剤および防御物質の
ための最大の貯蔵区画を形成するから、タンパク質を液
胞に方向づけるのに関連する標的性シグナルの問題は特
に応用の観点から非常に興味深い〔６〕（なお、〔 〕
内の数字は参考文献一覧の番号に一致する）。 【００１５】それ故に、液胞が溶解物質のための植物細
胞中でとびぬけて大きな区画であるから、植物の栄養含
量における改良に関連したタンパク質を特異的に液胞に
方向づけ、そしてそれらをそこに貯蔵することが可能で
あることは非常に有利である。塊茎、球根、根および茎
の最も重要な貯蔵タンパク質は例えばこれらの器官を構
成する細胞の液胞中に局在している〔６〕。さらに、ほ
とんどの種子の貯蔵タンパク質はいわゆるタンパク体、
特殊化液胞に局在しており、この液胞には同様の標的性
シグナルが植物器官の液胞に対するように当てはまるも
のと思われる。 【００１６】同様の考えはまた、有害生物または疾病の
防除において使用され得る物質（それらの物質がそれ自
体植物に対して毒性であると証明されている場合に特
に）に対して当てはまる。それ故に、それらの物質を植
物液胞中に蓄積することも有利である。最終的に、ある
場合には、液胞は、例えば植物により合成された解毒剤
を貯蔵することによる解毒器官としても作用する
〔６〕。それ故に、解毒酵素を特異的に液胞に方向づけ
る試みがなされている。 【００１７】しかしながら、例えば、ある種の病原菌に
よる栽培植物の攻撃の場合に問題が明らかに生じる。こ
れらの病原菌は植物の細胞内空間を介して菌糸体を広げ
ることにより宿主植物を冒す。これらの病原体を防除す
るために使用され得るキチナーゼおよびグルカナーゼは
非常に多く液胞中に局在するから、細胞内空間での生体
利用性は元々非常に限定されている。それ故に、その場
合には、細胞内空間内におけるそれらの物質の生体利用
性を高め、そして病原菌の有効な防除を可能にするため
に、細胞外区画に特異的に上記タンパク質を送り出せる
ことが望ましい。 【００１８】細胞外空間への分泌はまた、特定の物質が
細胞培養体を用いて製造される場合に有利である。その
場合、方向づけられた外来タンパク質は細胞外空間に分
泌されるから、方向づけられた該タンパク質は非常に容
易に周囲の培地から単離され得る。細胞内産生の場合に
必要である細胞の破壊を不要とし得る。 【００１９】しかしながら、植物液胞のためのそのよう
な標的性シグナルを同定し、単独で分離させることは、
これまで可能ではなかった。 【００２０】酵母のＮ末端標的性シグナルに匹敵するシ
グナルが液胞にタンパク質を方向づけるのに植物におい
て関与し得ると仮定して、タグエおよびクリスピールズ
はエンドウからの植物性血球凝集素分子の種々の部分を
リポーター遺伝子と連結し、そしてそれらを酵母内で試
験した〔６８〕。酵母宿主において、植物性血球凝集素
の場合にも、分子のＮ末端部分が液胞のための標的性シ
グナルとして作用することが見出された。 【００２１】その他の液胞タンパク質、塩基性β−１，
３−グルカナーゼは分子が成熟する際に失われるＣ末端
範囲とともに合成される。同様のことがイネ、大麦およ
び小麦（小麦胚凝集素）からのレクチンにも当てはま
る。この範囲の機能はこれまで知られていなかった。 【００２２】液胞からの種々のタンパク質のＣ末端の比
較はこの領域で明らかな相同性をこれまで示さなかった
から、これまで支持されてきた仮説は、酵母の場合と同
様に、植物における決定的なシグナル活性はそれらの液
胞タンパク質のＮ末端に由来するというものだった。 【００２３】 【発明が解決しようとする課題】それ故に、本発明の範
囲内で解決されるべき主な課題の一つは、結合されたタ
ンパク質分子を植物細胞の液胞に特異的に方向づけるの
に関連するペプチド断片（標的性配列）および該ペプチ
ド断片をコードするＤＮＡ配列を同定し、そして単離す
ることである。 【００２４】 【課題を解決するための手段】驚くべきことに、本発明
の範囲内で、いくつかが公知である操作を用いることに
よりこの課題を解決できることが今可能となった。 【００２５】詳しくは、本発明は、あらゆる所望の結合
されたタンパク質分子を特異的に植物液胞内に方向づけ
る（標的として導く）のに関連する短いペプチド断片、
および該ペプチド断片をコードするＤＮＡ配列に関す
る。上記結合されたタンパク質分子は使用された標的性
配列に関して同種または異種起源のタンパク質であって
よい。 【００２６】液胞に本来存在するタンパク質分子のＣ末
端領域から得られ、かつあらゆる所望のタンパク質分子
と結合して、該分子が植物液胞内に標的指向様式で方向
づけられることを導く短いペプチド断片が好ましい。該
ペプチド断片をコードし、そして液胞に本来存在するタ
ンパク質分子をコードする相当遺伝子の３'末端領域か
ら対応して得られるＤＮＡもまた好ましい。 【００２７】液胞内に本来存在するキチナーゼ分子のＣ
末端領域から得られ、かつあらゆる所望のタンパク質分
子と結合して、該分子が植物液胞内に標的指向様式で方
向づけられることを導く短いペプチド断片、および該ペ
プチド断片をコードし、そして植物キチナーゼ遺伝子の
３'末端領域から対応して得られるＤＮＡが特に好まし
い。 【００２８】植物液胞のための標的性シグナルとして作
用し、かつ以下の配列番号：１および２： Arg Ser Phe Gly Asn Gly Leu Leu Val Asp Thr Met で示されるアミノ酸配列を有するペプチド断片、および
該ペプチド断片をコードしそして以下の配列番号：１： CGN/AGR TCN/AGW TTY GGN AAY GGN CTN/TTR TTR/CTN GTN GAY ACN ATG TAA （ただし、ＮはＡまたはＧまたはＣまたはＴであり、Ｒ
はＧまたはＡであり、ＷはＡまたはＴであり、そしてＹ
はＴまたはＣである）で示されるヌクレオチド配列を有
するＤＮＡ配列がとりわけ好ましい。 【００２９】大部分が植物により優先的に使用されるコ
ドンからなるＤＮＡ配列が好ましい。 【００３０】実質的に純粋な形態にあり、ニコチアナ・
タバカムの園芸品種ハバナ４２５(Nicotiana tabacum
L. c.v. Havana 425)植物の塩基性キチナーゼ遺伝子の
３'末端（Ｃ末端範囲）から得られ、そして以下の配列
番号：２： AGG TCT TTT GGA AAT GGA CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA で示されるＤＮＡ配列を実質的に有するＤＮＡ配列が特
に好ましい。 【００３１】実質的に純粋な形態にあり、ニコチアナ・
タバカムの園芸品種ハバナ４２５植物の塩基性グルカナ
ーゼ遺伝子の３'末端（Ｃ末端範囲）から得られ、そし
て以下の配列番号：１２： GTC TCT GGT GGA GTT TGG GAC AGT TCA GTT GAA ACT AAT GCT ACT GCT TCT CTC GTA AGT GAG ATG TGA で示されるＤＮＡ配列を実質的に有するＤＮＡ配列が特
に好ましい。 【００３２】上記ＤＮＡ配列によりコードされるペプチ
ド断片は、植物液胞のための標的性シグナルとして作用
し、かつ以下の配列番号：１２： Val Ser Gly Gly Val Trp Asp Ser Ser Val Glu Thr Asn Ala Thr Ala Ser Leu Val Ser Glu Met で示されるアミノ酸配列を有するが、該ペプチド断片も
また本発明に包含される。 【００３３】上記のＤＮＡ配列に実質的に相同であり、
そして本発明に必須の特性を依然有する、すなわち植物
液胞のための標的性シグナルとして作用するＣ末端ペプ
チドをコードするＤＮＡ配列の全ての誘導体もまた包含
される。 【００３４】本発明の範囲内で、あるＤＮＡ配列の活性
部分の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％
そして特に好ましくは少なくとも９０％が第２のＤＮＡ
配列と相同である場合に、それらは実質的に相同であ
る。 【００３５】本発明に係るＤＮＡ配列の上記誘導体は自
然に生じる変種もしくは突然変異体であっても、または
特にそれらは公知突然変異方法により特異的に製造され
得る変種もしくは突然変異体であってもよい。 【００３６】突然変異は本明細書において、１個または
それ以上の塩基の欠失または挿入、そして１個またはそ
れ以上の塩基の置換、またはこれらの組合せを意味する
ものと理解されるべきである。上記塩基置換がアミノ酸
置換を生じないサイレント突然変異により達成されるの
が特別な場合である。 【００３７】これもまた本発明に包含されるそのような
突然変異の例は、下のＤＮＡ配列にまとめられ、そして
配列番号：３ないし７で示されている。これらの突然変
異体は配列番号：１および２で示される親配列からオリ
ゴヌクレオチド仲介突然変異誘発により創成され得、そ
してこの親配列によりコードされた断片と同様の標的特
性を依然有するペプチド断片をコードする： （ａ） GGA AAA GAT CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA （ｂ） GGA AAT GGA CTT TTA GTC AAT ACT ATG TAA （ｃ） GGA AAT GGA CTT TTA GTC CGT ACT ATG TAA （ｄ） A GAT CTT TTG GGA AAT GGA CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA （ｅ） ATC GGT GAT CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA 配列（ａ）ないし（ｃ）中の空白のスペースは標的性配
列に比較して相違しない突然変異標的性配列の領域に関
する。 【００３８】上記のＤＮＡ配列によりコードされ、かつ
配列番号：１および２で示される親配列によりコードさ
れた天然に生じる未変性のペプチド断片と同様の標的特
性を依然有するペプチド断片もまた本発明に包含され
る。 【００３９】植物液胞のための標的性シグナルとして作
用し、そして配列番号：３ないし７で示されるアミノ酸
配列を有するペプチド断片が特に好ましい： （ａ） Gly Lys Asp Leu Leu Val Asp Thr Met End （ｂ） Gly Asn Gly Leu Leu Val Asn Thr Met End （ｃ） Gly Asn Gly Leu Leu Val Arg Thr Met End （ｄ） Asp Leu Leu Gly Asn Gly Leu Leu Val Asp Thr Met End （ｅ） Ile Gly Asp Leu Leu Val Asp Thr Met End 配列（ａ）ないし（ｃ）中の空白のスペースは出発配列
に比較して相違しない突然変異標的性配列の領域に関す
る。 【００４０】例として挙げたこのリストは何ら限定を意
図するものでなく、本発明に必須である配列の特性が失
われることなしに、上記配列の変種が当業者により非常
に容易に創成され得ることを単に示すものである。 【００４１】本発明はまた、上で詳細に記載されたＤＮ
Ａ配列から、またはそれらのＤＮＡ配列の誘導体から得
られ、かつ出発配列の特性を依然有する断片または部分
配列を包含する。 【００４２】本発明の範囲内で、配列番号：２の本発明
のＤＮＡ配列から得られ、そして以下の配列番号：８お
よび９で示されるヌクレオチド配列を実質的に有するＤ
ＮＡ断片が特に好ましい： 【００４３】上記のＤＮＡ配列は、植物液胞のための標
的性シグナルとして作用し、そして以下の配列番号：８
および９で示されるアミノ酸配列を有するペプチド断片
をコードする： それ故に、本発明は上記のペプチド断片にも関する。 【００４４】本発明はさらに、あらゆる所望の発現性Ｄ
ＮＡが本発明に係るＤＮＡ配列の一つ、ならびに植物細
胞内で活性な発現シグナルおよび場合により３'および
／または５'領域のその他のコード性配列および／また
は非コード性配列に操作可能に連結され、その結果植物
宿主内で形質転換して、発現産物が特異的に植物液胞内
に方向づけられるキメラ遺伝子構築物からなる組換えＤ
ＮＡ分子に関する。 【００４５】５'末端領域にある発現性ＤＮＡが、植物
細胞内で機能し得るＮ末端シグナルペプチドをコードす
る配列を含むか、またはそのような配列に連結されてい
ることが有利である。さらに、ＤＮＡ分子は、全体とし
て液胞中に入り込む能力の改善に寄与するペプチド断
片、例えばスポラミンのＮ末端範囲にマツオカおよびナ
カムラにより発見されたペプチド断片〔３５〕をコード
する配列のその他の部位を含んでいてもよい。 【００４６】本発明はまた、本発明に係る組換えＤＮＡ
分子を含むクローニング、形質転換および発現ベクタ
ー、該ベクターで形質転換された宿主有機体を包含す
る。 【００４７】本発明はさらに、本発明に係る組換えＤＮ
Ａ分子を含み、かつ大腸菌(E. coli) およびアグロバク
テリウム・チュメファシエンス(Agrobacterium tumefac
iens) の両方において安定に複製し得るいわゆるシャト
ルベクターまたは二元ベクターに関する。 【００４８】宿主有機体の中で、上記組換えＤＮＡで形
質転換された植物プロトプラスト、細胞、カルス、組
織、器官、接合子、胚、花粉および／または種子そして
特に全体の、好ましくは稔性の植物体からなる群から選
択される植物宿主が特に好ましい。全体の植物体は例え
ば本発明に係る組換えＤＮＡ分子で直接形質転換される
か、または予め形質転換されたプロトプラスト、細胞お
よび／または組織から再生により得られる。 【００４９】本発明に係る構築物の一つを含み、そして
発現された遺伝子産物が所望どおりに液胞に局在してい
るトランスジェニック植物、特に稔性のトランスジェニ
ック植物が非常に好ましい。 【００５０】本発明はまた、本発明に係る組換えＤＮＡ
分子の一つを用いる直接形質転換により形成されるか、
まかは予め形質転換されたプロトプラスト、細胞、カル
ス、組織、器官、接合子、胚、花粉および／または種子
（これらに限定されない）から再生により得られるトラ
ンスジェニック植物の全ての増殖材料を包含する。 【００５１】本発明の範囲内で、増殖材料は有性または
無性で、そして試験管内または生体内で増殖され得るあ
らゆる植物材料を意味するものと理解されるべきであ
り、好ましくは、本発明に係るトランスジェニックから
得られるプロトプラスト、細胞、カルス、組織、器官、
胚珠、接合子、胚、花粉および／または種子である。本
発明はまた、体細胞融合、遺伝的改変または突然変異選
択により得られた植物から得られるものを包含する、上
記植物の後代ならびにそれらの突然変異体および変種に
関する。 【００５２】本発明はさらに、 （ａ）本発明に係るＤＮＡ配列の一つの製造方法 （ｂ）あらゆる所望の発現性ＤＮＡ配列と操作可能に連
結した本発明に係る上記ＤＮＡ配列（好ましくはこのＤ
ＮＡ配列は植物発現シグナルの調節制御下にある）を含
む本発明に係る組換えＤＮＡの製造方法 （ｃ）本発明に係る上記組換えＤＮＡ分子を含むクロー
ニング、形質転換および／または発現ベクターの製造方
法 （ｄ）形質転換された宿主有機体、特に植物プロトプラ
スト、細胞、カルス、組織、器官、接合子、胚、花粉お
よび／または種子そして特に全体の、好ましくは稔性の
植物体からなる群から選択される植物宿主の製造方法 （ｅ）形質転換された植物材料から出発する増殖材料の
製造方法、特に有性および無性の後代の製造方法 に関する。 【００５３】本発明はまた、以下の工程： （ａ）まず最初に、液胞内に特異的に方向づけるのに関
連するＤＮＡ配列を公知方法により、適当な供給源から
単離するか、または合成し、（ｂ）該ＤＮＡ配列をあら
ゆる所望の発現性ＤＮＡ配列の３'末端に操作可能な様
式で挿入し、（ｃ）生成した構築物を植物発現ベクター
中に植物内で活性な発現シグナルの制御下にクローニン
グし、そして（ｄ）該発現ベクターを植物宿主内に形質
転換し、そしてその中で発現ベクターを発現させる、か
ら実質的になる植物液胞内に発現産物を標的にむけて方
向づける方法を包含する。 【００５４】５'末端領域にある発現性ＤＮＡが、植物
細胞内で機能し得るＮ末端シグナルペプチドをコードす
る配列を含むか、またはそのような配列に連結されてい
ることが有利である。さらに、ＤＮＡ分子は、全体とし
て液胞中に入り込む能力の改善に寄与するペプチド断
片、例えばスポラミンのＮ末端範囲にマツオカおよびナ
カムラにより発見されたペプチド断片〔３５〕をコード
する配列のその他の部位を含んでいてもよい。 【００５５】本発明の範囲内で行われた研究の間に、本
発明に係るシグナル配列を失う場合に、本発明に係る標
的性配列の一つを本来含み、かつそれ故に液胞内に通常
方向づけられるタンパク質が細胞外空間に分泌されるこ
とが見出された。 【００５６】それ故に、本発明はさらに、標的性配列を
本来含み、そしてそれ故に植物液胞内に通常方向づけら
れる植物タンパク質を細胞外空間に送り出す方法であっ
て、以下の工程： （ａ）上記タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離
し、（ｂ）特定の細胞区画への方向づけに関連するＣ末
端にある標的性配列を読み枠から除去し、（ｃ）上記の
変異させたＤＮＡ配列を適当な植物発現ベクター中にス
プライシングし、そして（ｄ）生成した構築物を植物宿
主内に形質転換する、から実質的になる上記方法に関す
る。 【００５７】定義 以下の記載において組換えＤＮＡ技術および植物遺伝学
において慣用である多くの用語が用いられている。発明
の詳細な説明および特許請求の範囲、およびこれらの用
語にあてられた範囲の明確な、そして首尾一貫した理解
を確実にするために、以下に定義を記載する。植物材料 ：培養液中でまたはそのままで生育可能な植物
の部分、例えばプロトプラスト、細胞、カルス、組織、
胚、植物器官、芽、種子等、および全体の植物。 植物細胞 ：プロトプラストおよび細胞壁からなる植物の
構造的および生理学的単位。プロトプラスト ：植物細胞または植物組織から分離さ
れ、そして細胞クローンまたは全体の植物に再生する能
力を有する細胞壁のない「裸の」植物細胞。植物組織 ：構造的および機能的単位の形態に組織化され
た植物細胞の群。植物器官 ：種々の組織、例えば根、茎、葉または胚から
構成される構造的および機能的単位。異種遺伝子またはＤＮＡ ：特定の生成物をコードする
か、または生物学的機能を遂行し、そして該遺伝子が挿
入される種以外の種に由来するＤＮＡ配列；該ＤＮＡ配
列は外来遺伝子または外来ＤＮＡとも記載される。相同遺伝子またはＤＮＡ ：特定の生成物をコードする
か、または生物学的機能を遂行し、そして該遺伝子が挿
入される種と同一種に由来するＤＮＡ配列。合成遺伝子またはＤＮＡ ：特定の生成物をコードする
か、または生物学的機能を遂行し、そして合成手段によ
り製造されるＤＮＡ配列。植物プロモーター ：植物内であらゆる所望の相同または
非相同ＤＮＡ遺伝子配列の転写を確実に行わせるＤＮＡ
発現の制御配列であるが、前記遺伝子配列はそのような
プロモーターと操作可能に結合されている。終結配列 ：転写工程の終了をシグナルで伝える転写単位
の末端のＤＮＡ配列。過産生植物プロモーター（ＯＰＰ） ：このＯＰＰで形質
転換されなかった宿主細胞において自然状態で観察され
るよりも明らかに高い程度まで（ＲＮＡの形態またはポ
リペプチドの量で測定される）、操作可能に結合された
機能遺伝子配列のトランスジェニック植物細胞内での発
現を引起し得る植物プロモーター。３'／５'非翻訳領域 ：ｍＲＮＡに転写されるけれどもポ
リペプチドに翻訳されないコード領域の上流／下流に位
置するＤＮＡ部分。この領域は、調節配列例えばリボソ
ーム結合部位（５'）またはポリアデニル化シグナル
（３'）を含む。ＤＮＡクローニングベクター：適当な
宿主細胞内に挿入されたＤＮＡのクローニングに必要な
全てのシグナル配列を含有するクローニングビヒクル、
例えばプラスミドまたはバクテリオファージ。ＤＮＡ発現ベクター ：適当な宿主細胞内に挿入されたＤ
ＮＡの発現に必要な全てのシグナル配列を含有するクロ
ーニングビヒクル、例えばプラスミドまたはバクテリオ
ファージ。ＤＮＡトランスファーベクター ：適当な宿主細胞内への
遺伝物質の挿入を可能にするトランスファービヒクル、
例えばＴｉプラスミドまたはウイルスファージ。 トランスジェニック植物の突然変異体、変種 ：自然に、
または公知方法例えば紫外線処理、突然変異誘発剤での
処理その他を用いて人工的に作製され、そして本発明に
必須である出発植物の特徴および特性を依然有するトラ
ンスジェニック植物の誘導体。実質的に純粋なＤＮＡ配列 ：天然または非天然源から実
質的に純粋な形態で単離されたＤＮＡ配列。そのような
配列は天然系、例えば細菌、ウイルスまたは植物もしく
は動物細胞中に存在していても、また合成ＤＮＡまたは
ｃＤＮＡの形態で利用されてもよい。実質的に純粋なＤ
ＮＡ配列は挿入物として上記ＤＮＡを含むベクターの形
態で一般に単離される。実質的に純粋とは、その他のＤ
ＮＡ配列がほんの無視できる量で存在し、そして５％未
満、好ましくは１％未満、そして特に好ましくは０．１
％未満含有されることを意味する。そのような配列およ
び該配列を含むベクターは一般に水溶液中に、すなわち
緩衝液または慣用の培養基の一つの中に存在する。 【００５８】本発明の範囲内で、あらゆる所望の結合さ
れた遺伝子産物を特異的に植物液胞内に方向づけるのに
関連する短いペプチド断片をコードする実際のＤＮＡ配
列を同定および単離することが今はじめて可能になっ
た。本発明に係る上記ＤＮＡ配列の単離のための出発材
料として、液胞に本来存在するタンパク質のｃＤＮＡお
よび／またはゲノムＤＮＡクローン、例えば植物キチナ
ーゼまたはグルカナーゼクローンが特に好ましい。 【００５９】それ故に、本発明は、液胞に本来存在する
タンパク質分子をコードする遺伝子の３'末端領域から
得られ、かつあらゆる所望の発現性ＤＮＡと操作可能と
連結して、特異的に植物液胞内に方向づけられる遺伝子
産物を生じる新規で実質的に純粋なＤＮＡ配列に特に関
する。 【００６０】本発明の範囲内で、植物キチナーゼ遺伝子
の３'末端領域から得られるＤＮＡ配列が好ましい。同
様に、植物グルカナーゼ遺伝子の３'末端領域から得ら
れるＤＮＡ配列も好ましい。 【００６１】適当な遺伝子、特にキチナーゼまたはグル
カナーゼ遺伝子の単離のために、当業者には十分に公知
の慣用の一般的方法により創生され得るゲノムまたはｃ
ＤＮＡ遺伝子ライブラリィを出発材料として使用するの
が好ましい。ゲノムまたはｃＤＮＡ遺伝子ライブラリィ
の基本的創生方法は、例えば、文献〔３４〕に詳細に記
載され、また植物系への導入およびそれらの方法の応用
は、例えば文献〔３９〕に記載されている。 【００６２】ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは種々の方法
で入手され得る。ゲノムＤＮＡは、例えば公知方法を用
いて適当な細胞から抽出され、そして精製され得る。 【００６３】本発明の特定の実施態様において、ｃＤＮ
Ａの作成のために、選択された細胞または組織から、し
かし特に高いキチナーゼまたはグルカナーゼ濃度を有す
ることが知られている細胞または組織から単離され得る
ｍＲＮＡが出発材料として一般的に使用される。単離さ
れたｍＲＮＡは次に相当するｃＤＮＡ作成のためのマト
リックスとして逆転写において使用され得る。 【００６４】ｃＤＮＡ作成のための出発材料として特に
好ましいのは、適当な手段により予め刺激され高レベル
でキチナーゼまたはグルカナーゼを産生する植物細胞も
しくは組織またはその他の適当な植物材料である。これ
は、例えば培養された細胞もしくは組織またはその他の
適当な植物材料を無ホルモン培地上に接種し、そして高
キチナーゼまたはグルカナーゼレベルの誘導に十分な期
間それらを培養することにより達成され得る。発明の範
囲内で、文献〔３３〕により提案された塩およびチアミ
ン−塩化水素濃度を含有する基本培地（ＬＳ培地）が特
に好ましい。 【００６５】ポリ（Ａ+ ）ＲＮＡを単離する方法および
ｃＤＮＡを作成する方法は当業者に公知であり、そして
実施例において以下に詳細に記載されている。 【００６６】抽出され、そして精製されたＤＮＡ調製物
は次に引き続くクローニングのための断片に切断され
る。クローン化されるべきゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ
は、機械的切断または好ましくは適当な制限酵素での切
断により、クローニングベクター内への挿入に適当な大
きさに断片化され得る。ゲノムおよび／またはｃＤＮＡ
遺伝子ライブラリィの創生のための一般的物質として既
に使用されている適当なクローニングベクターは例え
ば、ファージベクター例えばλシャロンファージ、また
は細菌ベクター例えば大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２を
包含する。その他の適当なクローニングベクターは当業
者に公知である。 【００６７】上記方法で創生された遺伝子ライブラリィ
から、キチナーゼまたはグルカナーゼ遺伝子またはそれ
らの部分を含む適当なクローンがスクリーニングプログ
ラム、例えば適当なオリゴヌクレオチドプローブ（プロ
ーブ分子）を用いて同定され、そして次に単離され得
る。種々の方法、例えば分別コロニーハイブリダイゼー
ションまたはプラークハイブリダイゼーションが適当な
クローンを同定するために利用可能である。特定の翻訳
産物の同定に基づいた免疫学的検出方法が使用されても
よい。 【００６８】プローブ分子として、例えば同一のキチナ
ーゼまたはグルカナーゼ遺伝子または構造的に関連する
キチナーゼまたはグルカナーゼ遺伝子から予め単離さ
れ、そして本発明に係るキチナーゼまたはグルカナーゼ
遺伝子内の配列の相当する部分とハイブリダイゼーショ
ンし得るＤＮＡ断片が使用され得る。 【００６９】単離されるべき遺伝子のアミノ酸配列また
は該配列の少なくとも一部が公知であれば、その配列情
報に基づいて相当するＤＮＡ配列は引き出され得る。遺
伝コードは縮重していることが知られているから、大部
分の場合、異なるコドンが一つおよび同じアミノ酸のた
めに使用され得る。結果として、いくつかの例外を別に
して、特定のアミノ酸配列が、互いに類似しているオリ
ゴヌクレオチドの全体の系により一般にコード化され得
る。しかしながら、オリゴヌクレオチドの系の一つだけ
が検索されている遺伝子内の相当する配列に実際に相当
することを確認することに注意が払われなければならな
い。可能性のあるオリゴヌクレオチドの数を始めから制
限するために、特定のコドンが真核細胞において実際に
使用されている頻度を考慮する文献〔３２〕に主張され
たコドンの使用に関する規則が例えば適用され得る。 【００７０】その情報に基づいて、プローブ分子をゲノ
ムＤＮＡまたはｃＤＮＡと上記方法の一つにおいてハイ
ブリダイゼーションさせることにより、適当なクローン
の同定および単離のためのプローブ分子として使用され
得るオリゴヌクレオチド分子を引き出すことも可能であ
る。 【００７１】所望の遺伝子、例えばキチナーゼまたはグ
ルカナーゼをコードする所望の遺伝子の検出を促進する
ために、上記のＤＮＡプローブ分子が適当な容易に検出
可能な群で標識され得る。本発明の範囲内で、検出可能
な群は特に容易に同定可能な物理的または化学的特性を
有するあらゆる物質として理解されるべきである。 【００７２】そのような物質は特にイムノアッセイの分
野で広く使用されており、そしてそれらの大部分は本発
明において使用され得る。酵素的に活性な群、例えば酵
素、酵素基質、補酵素および酵素阻害剤、および蛍光剤
および発色剤、発色団および放射性同位元素、例えば 3
Ｈ，35Ｓ，32Ｐ， 125Ｉおよび14Ｃがこの点で特別な記
載がなされ得る。これらの標識の容易な検出性は、一方
で固有の物理的特性（例えば蛍光標識、発色団、放射性
同位元素）、そして他方でそれらの反応および結合特性
（例えば酵素、基質、補酵素、阻害剤）に基づいてい
る。 【００７３】高いキチナーゼまたはグルカナーゼレベル
の産生のために誘導された組織または細胞から順に単離
されるポリ（Ａ+ ）ＲＮＡから誘導された一本鎖ｃＤＮ
Ａがプローブ分子として適当である。 【００７４】ハイブリダイゼーションに関する一般的方
法は、例えば文献〔３４〕および〔２２〕に記載されて
いる。 【００７５】プローブ分子とハイブリダイゼーションし
得、そして上記の検出方法の一つにより同定され得る上
記遺伝子ライブラリィ内のそれらのクローンは、キチナ
ーゼまたはグルカナーゼをコードする配列の範囲および
性質を詳細にさらに決定するために次に分析され得る。 【００７６】遺伝子、特にキチナーゼまたはグルカナー
ゼ遺伝子をクローニングする別の方法は発現ベクターか
らなる遺伝子ライブラリィの創生に基づいている。その
方法において、上記方法と同様に、ゲノムＤＮＡ、しか
し好ましくはｃＤＮＡがキチナーゼまたはグルカナーゼ
を発現し得る細胞または組織からまず分離され、そして
次に適当な発現ベクター内にスプライシングされる。そ
のようにして創生された遺伝子ライブラリィは次いで適
当な手段を用いて、好ましくは抗キチナーゼまたはグル
カナーゼ抗体を用いてスクリーニングされ、そして挿入
物として所望の遺伝子または少なくともその一部を含む
クローンが選択され得る。 【００７７】上記方法を用いて、あらゆる所望の構造遺
伝子と操作可能に連結して、遺伝子産物の形質転換され
た植物材料の液胞への特異的な方向づけを導くＤＮＡ配
列をＣ末端範囲に有する、液胞内に本来存在する遺伝子
産物をコードする遺伝子、例えば植物キチナーゼまたは
グルカナーゼ遺伝子、しかし特にタバコからの塩基性キ
チナーゼまたはグルカナーゼ遺伝子を単離することが可
能である。 【００７８】その他の特徴づけのために、上記のように
精製および単離されたＤＮＡ配列を配列分析に供する。
予め単離されたＤＮＡを最初に適当な制限酵素により断
片に切断し、そして次に適当なクローニングベクター、
例えばＭ１３ベクターｍｐ１８およびｍｐ１９内にクロ
ーン化する。配列決定は５'→３'方向に行われ、好まし
くはサンガーのジデオキシヌクレオチド鎖停止法〔５
５〕またはマキサムおよびギルバートの方法〔３６〕が
用いられる。配列決定におけるエラーを防止するため
に、同時に２本のＤＮＡ鎖の配列を決定することが有利
である。ヌクレオチド配列および相当するアミノ酸配列
の分析は適当な市販のコンピュータソフトウエア（例え
ばウイスコンシン大学のＧＣＧソフトウエア）を用いて
有利にコンピュータアシストされている。 【００７９】公知の方法を用いて、本発明に係るＤＮＡ
配列は次に、上記の方法で製造されたＤＮＡクローンか
ら、特にキチナーゼまたはグルカナーゼクローンから非
常に容易に単離され得る。 【００８０】本発明の範囲内で、実質的に純粋な形態に
あり、そして例えばニコチアナ・タバカムの園芸品種ハ
バナ４２５植物の塩基性キチナーゼ遺伝子の３'末端
（Ｃ末端範囲）から得られ、そして以下の配列番号：
２： AGG TCT TTT GGA AAT GGA CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA で示されるＤＮＡ配列を実質的に有するＤＮＡ配列が特
に好ましい。 【００８１】上に示されたＤＮＡ配列は、タンパク質分
子と操作可能に連結して、液胞のための標的性シグナル
として作用し、そして以下の配列番号：２： Arg Ser Phe Gly Asn Gly Leu Leu Val Asp Thr Met で示されるアミノ酸配列を有するペプチド断片をコード
する。本発明は上記ペプチド断片にも関する。 【００８２】実質的に純粋な形態にあり、そして例えば
ニコチアナ・タバカムの園芸品種ハバナ４２５植物の塩
基性グルカナーゼ遺伝子の３'末端（Ｃ末端範囲）から
得られ、そして以下の配列番号：１２： GTC TCT GGT GGA GTT TGG GAC AGT TCA GTT GAA ACT AAT GCT ACT GCT TCT CTC GTA AGT GAG ATG TGA で示されるＤＮＡ配列を実質的に有するＤＮＡ配列が特
に好ましい。 【００８３】上記ＤＮＡ配列によりコードされるペプチ
ド断片は、植物液胞のための標的性シグナルとして作用
し、かつ以下の配列番号：１２： Val Ser Gly Gly Val Trp Asp Ser Ser Val Glu Thr Asn Ala Thr Ala Ser Leu Val Ser Glu Met で示されるアミノ酸配列を有するが、該ペプチド断片も
また本発明に包含される。 【００８４】このＤＮＡ配列は公知の塩基配列であり、
適当なキチナーゼまたはグルカナーゼ遺伝子から各回新
たに単離される必要はなく、もちろんいつでも化学的操
作により非常に容易に合成され得る。短いＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドの合成に適当な方法、例えばホスホトリエ
ステル法またはホスフィット法は当業者には公知であ
る。今日、多くのオリゴヌクレオチド合成は機械化さ
れ、そして自動化されており、そのため短いＤＮＡ断片
は短時間で製造され得る。 【００８５】同様のことが相当する標的性ペプチドのア
ミノ酸配列にも当てはまり、該配列は塩基配列から直接
誘導され得る。 【００８６】それ故に、１個またはそれ以上の塩基対の
欠失、挿入または置換による、上で非常に詳細に記載さ
れたＤＮＡ配列の変種または突然変異体は容易に製造さ
れ得、そしてそれらの標的性配列としての適性が検査さ
れ得る。 【００８７】本発明の範囲内には、突然変異誘発により
自然に生じる出発配列から非常に容易に製造され得る非
常に多数の配列が開示されている。 【００８８】詳しくは、操作は、本発明に係るＤＮＡ配
列の一つを含む遺伝子を最初に同定および単離すること
であってよい。適当なクローニングベクター内にスプラ
イシングさせた後、上記遺伝子、特に３'末端の標的性
配列は次に公知工程手段により変性され得る。特定の突
然変異体を作成する特に適した方法はいわゆるオリゴヌ
クレオチド仲介突然変異誘発である。その方法におい
て、野生型配列に実質的に相同であるけれども、個々の
ヌクレオチドにおいて相違する短いオリゴヌクレオチド
断片が合成される。上記相違は１個またはそれ以上のヌ
クレオチドの挿入、欠失または置換であってよい。これ
らの突然変異された断片は次に一般的公知方法により野
生型遺伝子の相同対と置換される。最終構築物は次い
で、以下に詳細に記載されるように、適当な植物発現ベ
クターにクローン化され、そして植物内に形質転換され
得る。 【００８９】しかしながら、ある種のＤＮＡ断片の突然
変異はまた、好ましくはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）
を用いて行われ得る。この試験管内方法において、突然
変異させるべきＤＮＡ断片の周辺領域に一般的に由来
し、そして鎖特異的である化学的に合成されたオリゴヌ
クレオチドが使用される。適当な条件下で、オリゴヌク
レオチドと変性により作成されたＤＮＡ単鎖上の相補的
領域とのハイブリッド形成が起こる。この方法で作成さ
れた二本鎖領域は引き続くポリメラーゼ反応のためのプ
ライマーとして使用される。この方法において、大腸菌
からのＲＮＡポリメラーゼの他に、好熱菌例えばテルム
スサーマス・アクアティクス(Thermus aquatics)からの
熱安定性ポリメラーゼを使用してもよい。 【００９０】それ故に、本発明は上に非常に詳しく記載
した塩基配列に限定されず、１個またはそれ以上の塩基
の欠失または挿入により、１個またはそれ以上の塩基の
置換により作成され得、かつ出発配列の本発明に係る特
性を依然有する上記ＤＮＡ配列の全ての突然変異体およ
び／または変種を包含する。 【００９１】本発明の範囲内で、配列番号：１および２
で示される出発配列からオリゴヌクレオチド仲介突然変
異誘発により創成され得、そして該出発配列によりコー
ドされたペプチドと同様の標的特性を依然有するペプチ
ドをコードする以下の変種（配列番号：３ないし７）が
特に好ましい： （ａ） GGA AAA GAT CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA （ｂ） GGA AAT GGA CTT TTA GTC AAT ACT ATG TAA （ｃ） GGA AAT GGA CTT TTA GTC CGT ACT ATG TAA （ｄ） A GAT CTT TTG GGA AAT GGA CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA （ｅ） ATC GGT GAT CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA 配列（ａ）ないし（ｃ）中の空白のスペースは出発配列
に比較して相違しない突然変異標的性配列の領域に関す
る。 【００９２】上記の方法で単離または製造され得る本発
明に係るＤＮＡ配列は同様の機能を有する相同ＤＮＡ配
列を同定するために今使用され得る。例えば、これは最
初にゲノムまたはｃＤＮＡ遺伝子ライブラリーを作成
し、そしてプローブ分子として本発明に係るＤＮＡ配列
を用いて、前記プローブ分子とハイブリッド形成し得る
相同ＤＮＡ配列の存在を求めて前記ライブラリーを調べ
ることにより行われる。本発明はまた、このような同様
の機能を有する相同ＤＮＡ配列の位置決定方法に関す
る。 【００９３】上記のＤＮＡ配列によりコードされ、かつ
配列番号：１および２で示される親配列によりコードさ
れた天然に生じる未変性のペプチド断片と同様の標的特
性を依然有するペプチド断片もまた本発明に包含され
る。 【００９４】植物液胞のための標的性シグナルとして作
用し、そして配列番号：３ないし７で示されるアミノ酸
配列を有するペプチド断片が特に好ましい： （ａ） Gly Lys Asp Leu Leu Val Asp Thr Met End （ｂ） Gly Asn Gly Leu Leu Val Asn Thr Met End （ｃ） Gly Asn Gly Leu Leu Val Arg Thr Met End （ｄ） Asp Leu Leu Gly Asn Gly Leu Leu Val Asp Thr Met End （ｅ） Ile Gly Asp Leu Leu Val Asp Thr Met End 配列（ａ）ないし（ｃ）中の空白のスペースは出発配列
に比較して相違しない突然変異標的性配列の領域に関す
る。 【００９５】本発明はまた、上で詳細に記載されたＤＮ
Ａ配列から、またはそれらのＤＮＡ配列の誘導体から得
られ、かつ出発配列の特性を依然有する断片または部分
配列を包含する。 【００９６】本発明の範囲内で、本発明に係るＤＮＡ配
列から得られ、そして以下の配列番号：８および９で示
されるヌクレオチド配列を実質的に有するＤＮＡ断片が
特に好ましい： 【００９７】上記のＤＮＡ配列は、植物液胞のための標
的性シグナルとして作用し、そして以下の配列番号：８
および９で示されるアミノ酸配列を有するペプチド断片
をコードする： それ故に、本発明は上記のペプチド断片にも関する。 【００９８】本発明の範囲内で、それらに自然に結合さ
れた構造遺伝子を特異的に方向づけるのに関連する短い
Ｃ末端ペプチドをコードする本発明の上で詳細に特徴づ
けられたＤＮＡ配列は異種遺伝子に連結した場合でさえ
もそれらの標的性機能を果たし得ることを示すことが今
はじめて可能になった。 【００９９】本発明の特定の実施態様において、本発明
に係るＤＮＡ配列は、上記の方法により、相当する３'
末端配列を含まない異種遺伝子、好ましくは異種キチナ
ーゼ遺伝子に操作可能な様式で連結し、そして植物宿主
内に形質転換させる。植物液胞内に特異的に方向づけら
れる遺伝子産物は次に形質転換された植物宿主中に発現
される。 【０１００】詳しくは、最初にｃＤＮＡ遺伝子ライブラ
リィが適当な植物材料から作成され、そして３'末端範
囲を持たない適当なキチナーゼｃＤＮＡクローンが適当
なプローブ分子を用いて前記遺伝子ライブラリィから単
離される方法であってよい。ｃＤＮＡクローンを適当な
クローニングベクター内にスプライシングさせた後、前
記クローンは、本発明に係るＤＮＡ標的性配列が異種キ
チナーゼ遺伝子に操作可能な様式で連結され得るように
制限切断部位の挿入または欠失により変性され得る。最
終構築物は次に適当な植物発現ベクター内にクローン化
させ得、それにより植物内で活性な発現シグナルの調節
制御下におかれる。この点での例として、ＣａＭＶウイ
ルスの３５Ｓプロモーターおよびその終結配列を含む植
物発現ベクターｐＧＹ１を記載し得るが、これは本発明
の対象を制限するものではない。もちろん、あらゆるそ
の他の適当なベクターもまたこの点で使用され得る。 【０１０１】例えば、本発明に係る標的性配列との連結
により、Ｃ末端シグナルペプチドを持たず、それ故に細
胞外空間に通常分泌される、キュウリ由来の酸性キチナ
ーゼを植物液胞内に特異的に方向づけることが可能であ
る。 【０１０２】本発明はさらに、発現性ＤＮＡ、特に構造
遺伝子、好ましくは異種構造遺伝子を本発明に係るＤＮ
Ａ配列および植物細胞内で活性な発現シグナル例えばプ
ロモーターおよび終結配列、ならびに場合により３'お
よび／または５'領域のその他のコード配列および／ま
たは非コード配列と操作可能に連結して含むキメラ組換
えＤＮＡ分子の構築にも関する。 【０１０３】プロモーター配列と隣接するコード性ＤＮ
Ａ配列との間にリーダー配列を含むことはしばしば有利
であり、そのリーダー配列の長さはプロモーター配列と
本発明に係るＤＮＡ配列との距離が結合された構造遺伝
子の発現のために最適な距離であるように選択される。 【０１０４】挿入されるべきＤＮＡ分子が、植物細胞内
で機能し得るＮ末端シグナルペプチドをコードする配列
を含むか、またはそのような配列に５'末端領域におい
て連結されていることが有利である。さらに、ＤＮＡ分
子は、全体として液胞中に入り込む能力の改善に寄与す
るペプチド断片、例えばスポラミンのＮ末端範囲にマツ
オカおよびナカムラにより発見されたペプチド断片〔３
５〕をコードする配列のその他の部位を含んでいてもよ
い。 【０１０５】形質転換された植物細胞およびそれらから
発生する組織、そして特に植物に保護作用、例えば病原
体（例えば植物病原性菌類、バクテリア、ウイルスその
他）に対する増加した耐性；化学物質〔例えば除草剤
（例えばトリアジン、スルホニル尿素、イミダゾリノ
ン、トリアゾールピリミジン、ビアラホス、グリホセー
トその他）、殺虫剤もしくはその他の殺生物剤〕に対す
る耐性；不利な環境要因（例えば暑さ、寒さ、風、不利
な土壌条件、湿気、乾燥その他）に対する耐性を導く全
ての遺伝子が本発明の方法における使用に特に適してい
る。 【０１０６】本発明の範囲内で、植物病原体または寄生
虫の防除に関連した構造遺伝子が特に言及され得る。 【０１０７】昆虫耐性は、例えば昆虫および／またはそ
れらの幼虫に対して毒性であるポリペプチド、例えばバ
チラス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)の
結晶性タンパク質をコードしている遺伝子により付与さ
れ得る。 【０１０８】昆虫耐性を与える第二類のタンパク質はプ
ロテアーゼインヒビターである。プロテアーゼインヒビ
ターは植物貯蔵構造体の通常の構成要素である。ダイズ
から単離・精製されたボウマン−バーク(Bowman-Birk)
プロテアーゼインヒビターは、テネブリオ幼虫の内蔵プ
ロテアーゼを阻害することが示された〔３〕。ササゲト
リプシンインヒビターをコードしている遺伝子は、文献
〔２３〕に記載されている。 【０１０９】本発明の範囲内で、その起源に関係なくあ
らゆる所望のプロテアーゼインヒビター（例えば非植物
または純粋に合成起源のプロテアーゼインヒビター）を
植物細胞内で機能し得るＮ末端シグナルペプチドおよび
本発明に係るＣ末端標的性配列に操作可能に連結するこ
とにより、上記のあらゆるプロテアーゼインヒビターを
使用することが今では可能である。結果として、そのよ
うに変性されたプロテアーゼインヒビターは液胞内に特
異的に方向づけられ、その場所でそれらは最適な様式で
貯蔵され得る。 【０１１０】プロテアーゼインヒビターをコードしてい
る遺伝子は、植物プロモーター、例えばＣａＭＶ３５Ｓ
プロモーターのような構造的なプロモーターの制御下で
適当なベクター内に導かれていてもよい。遺伝子、例え
ばダイズボウマン−バークプロテアーゼインヒビターの
コード配列は、ｃＤＮＡクローニング方法を用いて得る
ことができる。１００個より少ないアミノ酸を有するプ
ロテアーゼインヒビター、例えばリママメトリプシンイ
ンヒビターを得る方法は、それを合成することである。
コード配列はアミノ酸配列のバックトランスレーション
により予測され得る。さらに、所望の特定のベクターに
対して適当な制限部位は両端部に包含される。合成遺伝
子は３０ないし６０塩基対の重複オリゴヌクレオチド断
片を合成し、それらの断片にリン酸転移し、次に互いを
連結し〔３４〕、そして最後に適当なベクター内にクロ
ーン化することにより製造される。その挿入が正確な配
向にあるクローンは、配列決定により同定され得る。プ
ロトプラスト内への挿入のために、単離されたプラスミ
ドＤＮＡが使用され得る。 【０１１１】これに関連して、植物病原体自体の細胞壁
の破壊を生じ得るか、またはその他の物質と一緒になっ
て相乗的に破壊を少なくとも補助する加水分解酵素が言
及されるべきである。 【０１１２】多くの昆虫は、ラメラ層中のキチンミセル
が基質内に埋め込まれているクチクラ骨格を有する。非
常に多くの植物病原性菌類は、菌糸および胞子構造の欠
くことのできない成分としてキチンを含有し、例えば担
子菌類（黒穂菌およびサビ菌）および子のう菌類および
不完全菌類〔アルテルナリア(Alternaria)およびビポラ
リス(Bipolaris) 、エクセロフィラム・タルシカム(Exe
rophilum turcicum)、コレトットリカム(Colletotricu
m) 、グレオセルコスポラ(Gleocercospora)およびセル
コスポラ(Cercospora)〕を包含する。キチナーゼは試験
管内である種の病原体の菌糸体の増殖を阻害し得る。構
造的に、または病原体侵入に応じてキチナーゼを発現す
る植物の器官または組織は、非常に多くの異なる菌類の
攻撃から保護される。 【０１１３】植物内に本来存在する内因性キチナーゼは
細胞外にあるか（酸性キチナーゼ）、または液胞内部に
局在しており（塩基性キチナーゼ）、２つの別の操作が
本発明の範囲内で考えられる。 【０１１４】一方で、液胞内に方向づけるのに関連する
Ｃ末端の配列を欠いている酸性キチナーゼ遺伝子は、遺
伝子産物が液胞を特異的に通過するように本発明に係る
ＤＮＡ配列を用いて変性され得、その場合それらは病原
体の侵入に対する活性を自然に生じる内因性塩基性キチ
ナーゼを補助することができる。 【０１１５】第２の変法において、液胞内に本来存在す
る塩基性キチナーゼ遺伝子のＣ末端範囲は遺伝子工学法
により読み枠から除去されるか、または例えばＣ末端範
囲の直前に停止コドンを挿入することにより少なくとも
不活性化される。結果として遺伝子産物は細胞内空間に
分泌され、そこで病原体侵入と直接関与するようにな
る。 【０１１６】それ故に、本発明のその他の面は、液胞内
に本来存在し、そして植物細胞内で活性な発現シグナル
と操作可能に連結している構造遺伝子であって、該遺伝
子に本来存在する３'末端の標的性配列を欠失させる
か、または不活性化させた構造遺伝子を含む組換えＤＮ
Ａ分子に関する。植物宿主で形質転換して、これらの構
造遺伝子は機能的Ｃ末端シグナル配列を含まず、それ故
に植物の細胞外空間に分泌される発現産物を生じる。 【０１１７】植物細胞内で活性な発現シグナルと操作可
能に連結している構造遺伝子であって、該遺伝子に本来
存在する３'末端の標的性配列が欠失されるか、または
不活性化された塩基性キチナーゼ遺伝子を含み、それ故
に、植物宿主で形質転換して、これらの構造遺伝子は機
能的Ｃ末端シグナル配列を含まず、そのため植物の細胞
外空間に分泌される発現産物を生じる組換えＤＮＡ分子
が特に好ましい。 【０１１８】病原体に対する植物の保護機構において中
心的な役割をおそらく演じるその他の酵素はβ−１，３
−グルカナーゼであり、それ故に、この酵素を本発明に
係るＤＮＡ配列と組合せて使用することは本発明の範囲
内で好ましい。 【０１１９】それ故に、植物細胞内で活性な発現シグナ
ルと操作可能に連結している構造遺伝子であって、該遺
伝子に本来存在する３'末端の標的性配列が欠失される
か、または不活性化された塩基性グルカナーゼ遺伝子を
含み、それ故に、植物宿主で形質転換して、これらの構
造遺伝子は機能的Ｃ末端シグナル配列を含まず、そのた
め植物の細胞外空間に分泌される発現産物を生じる組換
えＤＮＡ分子が好ましい。 【０１２０】本発明はさらに、本発明に係る標的性配列
のいわゆる溶菌ペプチドへの連結にも関する。これらは
病原体の細胞膜に侵入するか、該膜を溶解するか、また
はその別の様式で該膜に損傷を与え得る抗病原性を有す
る天然または合成ペプチドである。本発明の範囲内で使
用され得る上記溶菌ペプチドの代表例は動物起源（昆虫
を含む）または植物および微生物起源のものが知られて
おり、例えば動物のデフェンシン、セルコピン、チオニ
ンおよびメリチン、および昆虫のデフェンシン、マガイ
ニン、アタシン、ジプテリン、サペシン、カエルリンお
よびキセノプシン、およびそれらのハイブリッドであ
る。種々の溶菌ペプチドのアミノ酸配列は以下の刊行物
に記載されている：ＷＯ８９／１１２９１；ＷＯ８６／
０４３５６；ＷＯ８８／０５８２６；ＵＳ４８１０７７
７；ＷＯ８９／０４３７１および文献〔４〕、〔５８〕
および〔６９〕。 【０１２１】用語の最も広い意味での溶菌ペプチドは、
細胞膜に侵入するか、該膜を溶解するか、または該膜に
損傷を与える能力が酵素活性に基づいている化合物、例
えばリゾチームおよびホスホリパーゼであると理解され
るべきである。 【０１２２】本発明の範囲内で、加水分解性および溶菌
性ペプチドと、液胞内、適当である場合には細胞外空間
への引き続く標的指向方向づけとの組合せ発現に関す
る。さらに、発現適用と外因性適用の相互の使用が考え
られ、後者の目的には、この目的には慣用の助剤および
／または添加剤と組み合わせた溶菌ペプチドが特に適し
ている。 【０１２３】本発明に係るＤＮＡ配列はまた、植物細胞
自体またはより高度なオーガナイゼーション単位、例え
ば組織、カルス、器官、胚または全体の植物の一部に望
ましく有用な化合物の産生における可能な増加を生じさ
せるために理想的な様式で使用され得る。 【０１２４】本発明の範囲内で使用され得る遺伝子は、
例えば、葉、種子、塊茎、根、茎その他における保存物
質または貯蔵物質の増加した形成を導く遺伝子を包含す
る。トランスジェニック植物により産生され得る望まし
い物質は、例えばタンパク質、デンプン、糖、アミノ
酸、ビタミン、アルカロイド、フラビン、芳香剤および
色素、脂肪その他を包含する。 【０１２５】薬学的に活性な物質、例えばある種のアル
カロイド、ステロイド、ホルモン、免疫モジュレーター
およびその他の生理学的に活性な物質をコードする構造
遺伝子もまた、本発明に係る調節ＤＮＡ配列に結合され
得る。 【０１２６】それ故に、本発明範囲内で考慮され得る遺
伝子は公知遺伝子、例えば植物に特有の遺伝子、例えば
トウモロコシからのゼイン遺伝子、オート麦からのアベ
ニン遺伝子、イネからのグルテリン遺伝子等、哺乳類特
有の遺伝子、例えばインシュリン遺伝子、ソマトスタチ
ン遺伝子、インターロイキン遺伝子、ｔ−ＰＡ−遺伝子
等、または微生物起源の遺伝子、例えばＮＰＴII遺伝子
等ならびに合成遺伝子、例えばインシュリン遺伝子等を
包含するが、しかしこれに限定されない。 【０１２７】有用でそして望ましい特性をコードする天
然に生じる構造遺伝子を別にして、本発明の範囲内で、
化学的方法または遺伝子操作方法を用いる特定の方法で
予め変形した遺伝子を使用することも可能である。 【０１２８】さらに、本発明の広い概念はまた、化学合
成により全体が製造される遺伝子も包含する。それ故
に、本発明の範囲内で使用され得る遺伝子またはＤＮＡ
配列は、本発明の範囲内で与えられた定義に従う、相同
および異種遺伝子またはＤＮＡおよび合成遺伝子または
ＤＮＡである。インシュリン遺伝子がこの点で合成遺伝
子の例として記載され得る。 【０１２９】本発明の範囲内で使用され得るＤＮＡ配列
は、ゲノムＤＮＡから、ｃＤＮＡから、または合成ＤＮ
Ａから排他的に構築される得る。もう一つの可能性は、
ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡおよび／または合成ＤＮＡ
からなるハイブリッドＤＮＡ配列の構築である。 【０１３０】その場合、ｃＤＮＡはゲノムＤＮＡと同じ
遺伝子から生じてもよく、またｃＤＮＡとゲノムＤＮＡ
の両方が異なる遺伝子から生じてもよい。しかしなが
ら、あらゆる場合において、ゲノムＤＮＡおよび／また
はｃＤＮＡは同一遺伝子または異なる遺伝子から個々に
各々製造されてもよい。 【０１３１】ＤＮＡ配列が１以上の遺伝子の部分を含む
場合には、これらの遺伝子は１種そして同一個体に由来
しても、または同一属の同一種もしくは様々な種の種々
の株もしくは変種に属する種々の個体に由来しても、ま
た同一もしくは異なる分類学上の単位（門）の１以上の
属に属する個体に由来してもよい。 【０１３２】植物細胞中の上記構造遺伝子の発現を確実
にするために、コード遺伝子配列は植物細胞内で機能し
得る発現配列に操作可能な様式で最初に連結されること
が有利である。 【０１３３】従って、本発明の範囲内のハイブリッド遺
伝子構築物は、本発明に係るＤＮＡ配列に加えて、１種
またはそれ以上の構造遺伝子ならびにプロモーターおよ
びターミネーター配列の両方および３'および５'非翻訳
領域のその他の調節配列を包含する発現シグナルを含有
する。 【０１３４】コードＤＮＡ配列（構造遺伝子）の発現の
誘導を引き起こし得るあらゆるプロモーターおよびあら
ゆるターミネーターをハイブリッド遺伝子配列の成分と
して使用し得る。植物または植物ウイルスの遺伝子に由
来する発現シグナルは特に適当である。適当なプロモー
ターおよびターミネーターの例は、カリフラワーモザイ
クウイルス遺伝子（ＣａＭＶ）のもの、または記載した
発現シグナルの特徴的な特性を依然有する相同ＤＮＡ配
列である。細菌の発現シグナル、特にアグロバクテリウ
ム・チュメファシエンスのＴｉプラスミドからのノパリ
ンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）またはオクトピンシンタ
ーゼ遺伝子（ｏｃｓ）もまた適当である。 【０１３５】ＣａＭＶゲノムの３５Ｓおよび１９Ｓ発現
シグナルまたはそれらの相同物が本発明の範囲内で好ま
しく、例えば文献〔３４〕に記載されるような分子生物
学的方法を用いて前記ゲノムから単離され、そしてコー
ドＤＮＡ配列に結合され得る。 【０１３６】３５Ｓおよび１９Ｓ発現シグナルの相同物
は、本発明の範囲内で、わずかな配列の相違があっても
実質的に出発配列と実質的に相同であり、そしてそれら
の出発配列と同一の機能を依然有する配列を意味するも
のとして理解されるべきである。 【０１３７】本発明に従って、３５Ｓ転写制御配列に使
用される出発材料は、例えば遺伝子地図〔１５〕のヌク
レオチド６８０８−７６３２を包含するＣａＭＶ"Ｓ"株
の ScaＩ断片であってよい。 【０１３８】１９Ｓプロモーターおよび５'非翻訳領域
は、ＣａＭＶ遺伝子地図〔２５〕のPstI部位（５３８６
位）とHindIII 部位（５８５０位）との間のゲノム断片
上に位置する。相当するターミネーターおよび３'非翻
訳領域は、ＣａＭＶゲノムの７３４２位と７６４３位と
の間のEcoRV/ BglII断片上に位置する。 【０１３９】完全なヌクレオチド配列が文献〔１６〕に
記載されているＣａＭＶ ＣＭ１８４１株の発現シグナ
ルが本発明の範囲内で好ましい。 【０１４０】使用し得る効果的な植物プロモーターのも
う１つの例は、過産生植物プロモーターである。この種
のプロモーターは、所望の遺伝子産物をコードする遺伝
子配列に操作可能に連結されているならば、前記遺伝子
配列の発現を仲介可能であるべきでる。 【０１４１】本発明の範囲内で使用し得る過産生植物プ
ロモータは、ダイズからのリブロース−１，５−ビスホ
スフェートカルボキシラーゼの小サブユニットのプロモ
ーターおよびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロ
モーターを包含する。これらの２種のプロモーターは、
それらが真核植物細胞において光により誘導されるとい
う事実で知られている（例えば、文献〔９〕参照）。 【０１４２】それ故に、本発明は、本発明に係るＤＮＡ
配列が発現性ＤＮＡおよび植物細胞内で活性な発現シグ
ナルならびに場合により３'および／または５'領域のそ
の他のコード配列および／または非コード配列に操作可
能に連結され、その結果植物宿主内で形質転換して、発
現産物が特異的に植物液胞内に方向づけられるキメラ遺
伝子構築物からなる組換えＤＮＡ分子に関する。 【０１４３】本発明に係るＤＮＡ配列が形質転換された
植物細胞およびそれらから発生する組織、特に植物に、
病原体、化学物質および不利な環境要因に対する保護作
用を付与する構造遺伝子と操作可能に連結されているキ
メラ遺伝子構築物を含む組換えＤＮＡ分子が特に好まし
い。 【０１４４】本発明に係るＤＮＡが植物細胞内でキチナ
ーゼ、特に酸性キチナーゼまたはグルカナーゼ、特に酸
性グルカナーゼを発現する構造遺伝子と操作可能に結合
されているキメラ遺伝子構築物を含む組換えＤＮＡ分子
が本発明の範囲内でとりわけ好ましい。 【０１４５】本発明はまた、形質転換された植物細胞自
体または組織、器官、カルス、胚および全体の植物から
なる群から選択されるより高度なオーガナイゼーション
単位の部分において発現して、望ましく有用な化合物の
植物液胞内への方向づけを導く、構造遺伝子と本発明に
係るＤＮＡ配列が操作可能に結合されているキメラ遺伝
子構築物を含む組換えＤＮＡ分子を包含する。 【０１４６】液胞内に本来存在するタンパク質をコード
する遺伝子、特に塩基性キチナーゼ遺伝子、とりわけタ
バコまたはキュウリ植物体からの塩基性キチナーゼ遺伝
子が、該タンパク質分子が細胞外空間に分泌されるよう
に変性されたキメラ遺伝子構築物を含む組換えＤＮＡ分
子はさらに好ましい。詳細には、このことは、前記遺伝
子、特にキチナーゼ遺伝子に本来存在し、液胞内への方
向づけに関連するＤＮＡ配列を含むＣ末端範囲の除去ま
たは不活性化を、遺伝子工学法を用いて、例えばＣ末端
範囲の前に直接停止コドンを挿入することにより行われ
得る。 【０１４７】キメラ遺伝子の構築に使用され得るその他
の調節ＤＮＡ配列は、例えば誘導または抑制によって植
物組織内で結合ＤＮＡ配列の転写を制御し得る配列を包
含する。 【０１４８】種々の内部および外部要因、例えば植物ホ
ルモン、熱ショック、化学物質、病原体、酸素不足、
光、その他により誘導されることが知られている個々の
植物遺伝子が例として挙げられる。 【０１４９】植物ホルモンによる遺伝子調節の例とし
て、ワタの後胚期の間に生じる過剰のｍＲＮＡを誘導す
ることが知られているアブシジン酸（ＡＢＳ）が言及さ
れるべきである。その他の例は、ヒマの実におけるマレ
ートシンターゼ転写物および大麦の糊粉層におけるα−
アミラーゼのイソ酵素を誘導するジベレリン酸（ＧＡ
３）である。 【０１５０】マメの葉におけるグルカナーゼまたはグル
カナーゼおよびキチナーゼまたはグルカナーゼの活性は
ストレスホルモンエチレンとの処理により著しく高めら
れ得る。キチナーゼの場合、誘導作用はキチナーゼ遺伝
子のプロモーターを介して制御され、そしてマメ〔ファ
セオルス・ヴァルガリス(Phaseolus vulgalis)〕のキチ
ナーゼ遺伝子からのプロモーターを用いるリポーター遺
伝子試験により、これを示すことが可能だった。 【０１５１】ダイズの熱ショック感受性タンパク質遺伝
子の調節は詳細に研究されてきた。４０℃の温度で数時
間植物を処理すると、いわゆる熱ショックタンパク質の
新たな合成を生じる。これまで非常に多くの遺伝子が単
離され、そしてそれらの調節が詳細に分析された。それ
らの遺伝子の発現は転写段階で主として制御される。例
えば、ｈｓｐ７０遺伝子のプロモーターがネオマイシン
ホスホトランスフェラーゼII（ＮＰＴII）遺伝子と融合
される場合、その様にして形成されたキメラ遺伝子は熱
ショックにより誘導され得る〔６７〕。 【０１５２】植物内に誘導可能な遺伝子のもう一つのク
ラスは、光調節化遺伝子、特にリブロース１，５−ビス
ホスフェートカルボキシラーゼ（ＲＵＢＩＳＣＯ）の小
サブユニットの核コード化遺伝子からなる。文献〔４
１〕は、リポーター遺伝子がエンドウからのＲＵＢＩＳ
ＣＯ遺伝子の５'−フランキング配列にキメラの形態で
連結される場合に、該５'−フランキング配列がリポー
ター遺伝子に光誘導性を導入し得ることを示した。この
観察をその他の光誘導化遺伝子、例えばクロロフィルａ
／ｂ結合タンパク質に広げることも可能となった。 【０１５３】トウモロコシのアルコールデヒドロゲナー
ゼ遺伝子（ａｄｈ遺伝子）が鋭意研究の対象だった。ト
ウモロコシからａｄｈ１−ｓ遺伝子が単離され、そして
一時的に形質転換された組織が嫌気条件下に暴露された
とき５'−フランキングＤＮＡがキメラリポーター遺伝
子（例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ，ＣＡＴ）の発現を誘導し得ることが示された
〔２８〕。 【０１５４】制御可能なＤＮＡ配列のその他の群は化学
的に制御可能な配列であり、それは例えばタバコのＰＲ
（病原体関連）タンパク質遺伝子内に存在し、そして化
学調節剤により誘導され得る。 【０１５５】上に例示した調節性ＤＮＡ配列は、天然起
源または合成起源であってよく、また天然および合成Ｄ
ＮＡ配列の混合物からなっていてよい。 【０１５６】発現性ＤＮＡ、特に挿入されるべき構造遺
伝子が、植物細胞内で機能し得るＮ末端シグナルペプチ
ドをコードする配列を含むか、またはそのような配列に
５'末端領域で連結されていることは有利である。シグ
ナルペプチドは内膜系を介して輸送されるタンパク質の
Ｎ末端に見出される輸送シグナルである。このシグナル
配列は、上記タンパク質が最初に小胞体を通過し、そこ
でシグナルペプチドがその機能を果たすとすぐに前駆体
タンパク質からタンパク質分解的に分離されることを可
能にする。その特異的な機能のために、このタイプのシ
グナルペプチド配列は、バクテリア、酵母、菌類、動物
または植物によらず全ての生存細胞において進化の間に
高度に保存されてきた。 【０１５７】さらに、ＤＮＡ分子は、全体として液胞中
に入り込む能力の改善に寄与するペプチド断片、例えば
スポラミンのＮ末端範囲にマツオカおよびナカムラによ
り発見されたペプチド断片〔３５〕をコードする配列の
その他の部位を含んでいてもよい。 【０１５８】それ故に、本発明は、本発明に係る標的性
配列の他に、構造遺伝子またはあらゆるその他の発現性
遺伝子、例えば遺伝子発現の特異的に制御される誘導ま
たは抑圧を可能にするＤＮＡ配列のその他の制御部位を
操作可能に連結されて含むキメラ遺伝子構築物を包含す
る。 【０１５９】配列の種々の部位はそれ自体公知の方法に
より互いに連結されて、植物細胞内で発現可能な完全な
ＤＮＡ配列を形成する。適当な方法は、例えば相同部位
を有するＤＮＡ配列の生体内組換えおよび制限断片の試
験管内連結を包含する。 【０１６０】一般的に使用されるクローニングベクター
は宿主細胞に適合する種起源の、複製および制御配列を
有するプラスミドまたはウイルス（バクテリオファー
ジ）ベクターである。 【０１６１】クローニングベクターは一般的に、一つの
複製開始点、そしてさらに形質転換された宿主細胞内で
表現型の選択特性、特に抗生物質またはある種の除草剤
に対する耐性を導く特有の遺伝子を有する。宿主細胞内
で形質転換後、形質転換されたベクターはこれらの表現
型マーカーにより選択され得る。 【０１６２】本発明の範囲内で使用され得る選択可能な
表現型マーカーは、例えばこれが本発明の主題を限定す
ることなくアンピシリン、テトラサイクリン、ハイグロ
マイシン、カナマイシン、メトトレキサート、Ｇ４１８
およびネオマイシンに対する耐性を包含する。 【０１６３】本発明の範囲内の適当な宿主細胞は、原核
生物であり、細菌宿主、例えばアグロバクテリウム・チ
ュメファシエンス(A. tumefaciens)、大腸菌(E. coli)
、エス．・チフィムリウム(S. typhimurium)およびセ
ルラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens) およ
びシアノバクテリアを含む。真核生物宿主、例えば酵
母、菌糸体形成菌および植物細胞も本発明の範囲内で使
用できる。 【０１６４】本発明に係るハイブリッド遺伝子構築物の
適当なクローニングベクター内へのスプライシングは、
例えば文献〔３４〕に記載された標準法を用いて行われ
る。 【０１６５】一般的に、スプライシングされるべきベク
ターおよびＤＮＡ配列をまず最初に適当な制限酵素で切
断する。適当な制限酵素は、例えばブラント末端を有す
る断片を生じるもの、例えばSma Ｉ、Hpa ＩおよびEcoR
V 、または粘着端を形成する酵素、例えばEcoRI 、Sac
ＩおよびBamHI である。 【０１６６】ブラント末端を有する断片と互いに相補的
である粘着端を有する断片の両方を、適当なＤＮＡリガ
ーゼにより再び連結し、連続的で均一なＤＮＡ分子を形
成することができる。 【０１６７】突出する粘着端を有するＤＮＡ断片を大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片と処理して、相当
する相補的ヌクレオチドで空隙を充填することによりブ
ラント末端を製造することもできる。 【０１６８】他方、例えば、末端デオキシヌクレオチジ
ルトランスフェラーゼを用いて所望のＤＮＡ配列および
切断されたベクター分子の端部に相補的ホモポリマー尾
部を添加するか、または制限切断部位を有する合成オリ
ゴヌクレオチド配列（リンカー）を添加し、そして次に
適当な酵素で切断することにより、粘着端を人工的に製
造することもできる。 【０１６９】本発明の範囲内で、キチナーゼ突然変異体
の構築において、使用されるキチナーゼクローンの種々
の部分は互いに連結される。この目的を達成し得るため
に、それらの部分は類似していなければならず、すなわ
ち、適当な制限切断部位は種々の配列中に導入されなれ
ばならない。それ故に、本発明の特定の実施態様におい
て、以下に示した制限切断部位が好ましくは使用され、
それらは全て同一粘着端を導く： BamHI 〔G/GATCC 〕 BclI 〔T/GATCA 〕 BglII 〔A/GATCT 〕 読み枠は、ＧＡＴがアスパラギン酸のコドンとして機能
するように各々の場合において選択されるのが好まし
い。 【０１７０】クローニングベクターおよび該ベクターで
形質転換された宿主細胞は、一般にベクターのコピー数
を増やすために使用される。増加したコピー数によっ
て、ハイブッド遺伝子構築物を有するベクターを単離す
ること、そして例えばキメラ遺伝子配列を植物細胞内に
挿入するために前記ベクターを使用することが可能とな
る。 【０１７１】その他の操作段階において、所望の遺伝子
産物をコードする構造遺伝子または制御機能を有する非
コードＤＮＡ配列、例えばアンチセンスＤＮＡを植物細
胞内に挿入し、そして場合によってはそれを植物ゲノム
内に組み込むために上記プラスミドを使用することがで
きる。 【０１７２】本発明はそれ故に、構造遺伝子またはその
他の望ましい遺伝子または遺伝子断片またはそれらのゲ
ノム内に含まれるその他の有用なＤＮＡ配列を含む受容
性植物細胞の作成にも関する。 【０１７３】キメラ遺伝子構築物の挿入は公知の遺伝子
導入方法を用いて植物プロトプラスト中で行われるのが
好ましい。 【０１７４】多くの非常に有効な方法が植物細胞中にＤ
ＮＡを導くために存在しており、該方法は遺伝子導入ベ
クターの使用または直接遺伝子導入方法に基づいてい
る。 【０１７５】一つの可能な方法は、例えば植物細胞をウ
イルスまたはアグロバクテリウムと接触させることから
なる。これは、感受性植物細胞を感染させるか、または
該植物細胞から誘導されたプロトプラストを共培養する
ことにより達成され得る。本発明の範囲内でカリフラワ
ーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）が植物内への本発明に
係るキメラ遺伝子構築物の挿入のためのベクターとして
使用されてもよい。ＣａＭＶの全ウイルスＤＮＡゲノム
が細菌親プラスミド内に組み込まれ、細菌中で増殖され
得る組換えＤＮＡ分子を形成する。クローニングが行わ
れた後、組換えプラスミドは制限酵素を用いて無作為に
または該組換えプラスミドのウイルス部分、例えばアフ
ィドによりウイルスの移動性をコードする遺伝子内の非
常に特異的な非必須部位で切断し、そしてハイブリッド
遺伝子構築物が切断部位中にクローン化される。 【０１７６】単一の特定の制限認識部位を有する小さい
オリゴヌクレオチド、いわゆるリンカーもまた組み込ま
れ得る。そのようにして変形された組換えプラスミドは
再びクローン化され、そしてハイブリッド遺伝子構築物
をたった一度出現する制限部位中にスプライシングさせ
ることによりさらに変形される。 【０１７７】組換えプラスミドの変形ウイルス部分は次
いで細菌の親プラスミドから切り出され、そして植物細
胞または全体の植物の接種のために使用される。 【０１７８】キメラ遺伝子構築物を細胞中に挿入するも
う一つの方法は、該遺伝子構築物を用いて形質転換され
たアグロバクテリウム・チュメファシエンスおよび／ま
たはアグロバクテリウム・リゾゲネスでの植物細胞の感
染を利用する。トランスジェニック植物細胞は次に当業
者には公知の適当な培養条件下で培養され、その結果そ
れらは苗条および根を形成し、そして全体の植物が最終
的に形成される。 【０１７９】植物材料を形質転換するもう一つの可能な
方法は、文献〔４８〕にニンジンの形質転換のために記
載されたように、アグロバクテリウム・リゾゲネスおよ
び形質転換されたアグロバクテリウム・チュメファシエ
ンスの両方を用いる混合感染からなる。混合比率は、ア
グロバクテリウム・リゾゲネスの形質転換に基づいて形
成された根コロニーが高比率のアグロバクテリウム・チ
ュメファシエンスＴｉプラスミドを含むようでなければ
ならない。このことは、例えば、アグロバクテリウム・
リゾゲネスおよびアグロバクテリウム・チュメファシエ
ンスを一緒に植物材料に公知方法により混合比率１：１
ないし１：１００で、好ましくは１：１０で適用するこ
とにより達成され得る。トランスジェニック植物は次に
当業者には公知の適当な培養条件下で培養され、その結
果それらは苗条および根を形成し、そして全体の植物が
最終的に形成される。２つのアグロバクテリウム種は、
形質転換されるべき植物材料の実際の接種直前に混合さ
れるのが有利である。 【０１８０】本発明に係るキメラ遺伝子構築物は、それ
故に、例えばアグロバクテリウム・チュメファシエンス
のＴｉプラスミドまたはアグロバクテリウム・リゾゲネ
スのＲｉプラスミドにより適当な植物細胞内に形質転換
され得る。ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドはアグ
ロバクテリウムによる感染を介して植物に導入され、そ
して適当な様式で植物ゲノム内に組み込まれる。 【０１８１】ＴｉプラスミドおよびＲｉプラスミドの両
方は形質転換された細胞の産生に必須である２つの領域
を有する。それらの領域の１つ、トランスファーＤＮＡ
（Ｔ−ＤＮＡ）領域は植物に導入され、そして腫瘍の誘
導を導く。その他の領域、毒性付与（ｖｉｒ）領域は、
腫瘍の維持のためでなく、腫瘍形成のためにだけ必要で
ある。トランスファーＤＮＡ領域の大きさは移動性を損
傷することなくキメラ遺伝子構築物の組み込みにより大
型化され得る。腫瘍誘導遺伝子を除去し、そして選択性
マーカーを組み込むことにより、変形されたＴｉプラス
ミドまたはＲｉプラスミドは適当な植物細胞内への本発
明に係る遺伝子構築物の導入のためのベクターとして使
用される得る。 【０１８２】ｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡ領域およびｖｉ
ｒ領域が同一アグロバクテリウム細胞内の同一ベクター
に存在するか、または異なるベクターに存在するかに関
係なく植物細胞のゲノムに、アグロバクテリウムのＴ−
ＤＮＡの導入を引き起こす。染色体上のｖｉｒ領域はま
た、ベクターから植物細胞へのＴ−ＤＮＡの移動を誘導
する。 【０１８３】それ故に本発明の範囲内で、植物細胞内に
アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ領域を導入するための
系が好ましく使用されるが、該系においてｖｉｒ領域お
よびＴ−ＤＮＡ領域は異なるベクターに位置している。
そのような系は「二元ベクター系」として知られてお
り、そしてＴ−ＤＮＡを含むベクターは「二元ベクタ
ー」と呼ばれる。 【０１８４】植物細胞内に形質転換され得、そして形質
転換された細胞の選択を可能にするあらゆるＴ−ＤＮＡ
含有ベクターは本発明の範囲内での使用に適している。 【０１８５】左側境界配列（ＬＢ）と右側境界配列（Ｒ
Ｂ）との間にクローン化された本発明に係るキメラ遺伝
子構築物を含み、そして大腸菌およびアグロバクテリウ
ム・チュメファシエンスの両方で安定に複製可能である
シャトルベクターが本発明の範囲内で特に好ましい。 【０１８６】新規に開発された形質転換技術を用いて、
アグロバクテリウムの天然の宿主植物でない植物種を試
験管内で形質転換することが可能となった。例えば、単
子葉植物、特に穀類の種および種々のグラス類はアグロ
バクテリウムの天然の宿主ではない。 【０１８７】単子葉類はアグロバクテリウムを用いて形
質転換され得ることが徐々に明らかになってきており、
その結果、現在利用可能である新規実験方式を用いて、
穀類およびグラス類の種もまた形質転換されやすい〔２
０〕。 【０１８８】アグロバクテリウムを用いるいわゆる葉デ
ィスク形質転換〔２７〕が本発明の範囲内で好ましい。
適当な標的植物からの滅菌葉ディスクを本発明に係るキ
メラ遺伝子構築物の一つを含有するアグロバクテリウム
細胞と培養し、そして次に適当な栄養培地中または該培
地上に移す。それ故に、本発明の範囲内では、寒天の添
加により固化され、そして慣用の植物生長調節剤、特に
α−ナフト酢酸、ピクロラム、２，４，５−トリクロロ
フェノキシ酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、イ
ンドール−３−酪酸、インドール−３−乳酸、インドー
ル−３−コハク酸、インドール−３−酢酸およびｐ−ク
ロロフェノキシ酢酸からなるオーキシンの群、カイネチ
ン、６−ベンジルアデニン、２−イソペンテニルアデニ
ンおよびゼアチンからなるサイトカイニンの群から選択
されるもの１種またはそれ以上で富化されたＬＳ培地が
特に適当である。オーキシンおよびサイトカイニンの好
ましい濃度は０．１ｍｇ／Ｌないし１０ｍｇ／Ｌの範囲
内である。 【０１８９】２０℃ないし４０℃、好ましくは２３℃な
いし３５℃、特に２５℃の温度および散光下で、数日
間、しかし好ましくは２ないし３日間の培養後、葉ディ
スクを苗条誘導のために適当な培地に移す。選択物質が
添加され、オーキシンを含有せずにサイトカイニンを含
むＬＳ培地が特に好ましい。培養物は光の中に保持さ
れ、適当な間隔で、しかし好ましくは１週間の間隔で新
鮮培地に移される。発生する未熟苗条が切り取られ、そ
して苗条を誘導する培地中でさらに培養されて根を形成
する。本発明の範囲内では、オーキシンまたはサイトカ
イニンを含有しないが、形質転換体の選択のための選択
物質を含有するＬＳ培地が特に好ましい。 【０１９０】アグロバクテリウム仲介形質転換の他に、
本発明の範囲内では、植物材料内に本発明に係る遺伝子
構築物を挿入するための直接形質転換法を用いることも
可能である。 【０１９１】例えば、ベクター内に包含された遺伝物質
は、純粋な物理的方法、例えば細く引き伸ばされたマイ
クロピペットを用いるマイクロインジェクション〔４
５〕または形質転換性ＤＮＡで被覆されているマイクロ
プロジェクタイル(microprojectile) での細胞の砲撃
〔７１〕により、植物細胞内に直接挿入され得る。 【０１９２】植物細胞内への遺伝物質の直接導入のその
他の可能な方法は、原形質膜を変性する操作、例えばポ
リエチレングリコール処理、熱ショック処理もしくはエ
レクトロポレーションまたはそれらの組合せ〔５９〕を
用いるプロトプラストの処理からなる。 【０１９３】エレクトロポレーション技術において、植
物プロトプラストはハイブリッド遺伝子構築物を含むプ
ラスミドと共に高電圧の電気パルスに晒される。これは
生体膜の透過性に可逆的増加をもたらし、そしてプラス
ミドの挿入を可能にする。エレクトロポレーションされ
た植物プロトプラストはそれらの細胞壁を新たに作り、
分化し、そしてカルス組織を形成する。形質転換された
植物細胞の選択は上記の表現型マーカーを用いて行われ
得る。 【０１９４】植物細胞への遺伝物質の直接導入のその他
の方法は、純粋に化学的な方法に基づき、形質転換が非
常に効率良くそして迅速に行われることを可能にするも
のであり、文献〔４４〕や〔１９〕に記載されている。 【０１９５】共形質転換を用いる直接遺伝子導入〔５
７〕もまた植物材料の形質転換に適当である。 【０１９６】共形質転換は植物ゲノム内への種々のＤＮ
Ａ分子（非選択性および選択性遺伝子）の同時取り込み
および組み込みに基づいており、そしてそれ故に非選択
性遺伝子で形質転換された細胞の検出を可能にする方法
である。 【０１９７】例として上に挙げた可能な形質転換法のリ
ストは完全であると主張するものでなく、そして本発明
の対象をなんら制限するものでもない。 【０１９８】それらのゲノム内に組み込まれたハイブリ
ッド遺伝子構築物を含む細胞クローンは通常の選択、ス
クリーニングおよび検出を用いて選択され、そしてトラ
ンスジェニック植物の再生のために使用される。 【０１９９】全体の植物を形成するために培養液中に保
持されたプロトプラストの再生は、例えば文献〔５０〕
に記載されている。 【０２００】再生方法は植物の種によって異なる。しか
しながら、一般的に、公知の培養培地の一つにおいてプ
ロトプラストが分化しそして細胞壁を形成するように刺
激される。特定の活性剤、例えばオーキシンおよびサイ
トカイニンとの処理により根または苗条を形成するよう
に誘導され得るカルス培養物が最終的に形成される。 【０２０１】そのようにして得られた小植物は土壌に移
され、そして通常の実生と同様にさらに栽培され得る。 【０２０２】効率的な再生は培地、遺伝子型およびこれ
までの培養歴に特に依存する。これらの３つの変数が適
当に制御される場合、再生は完全に再現および反復可能
である。 【０２０３】植物ゲノムの組み込み成分として上記のハ
イブリッド遺伝子構築物の植物細胞内で発現可能な構造
遺伝子を含む再生されたトランスジェニック植物は、好
ましくは滅菌苗条培養体の形態で、活発に増殖させるこ
とができる。 【０２０４】再生されたトランスジェニック植物の植物
ゲノム内への操作上の発現性遺伝子の安定な組み込み
は、組み込まれた遺伝子の有糸分裂安定性との関係によ
り、そして有糸分裂の間のメンデル形質としてのふるま
いに基づいて、さらにサザンブロット分析〔６６〕を用
いて変更される。 【０２０５】それ故に本発明の広い概念は、上記方法に
より形質転換され、そして発現可能な形態で本発明に係
る組換えＤＮＡを含むプロトプラスト、細胞、カルス、
組織、器官、種子、胚、花粉、胚珠、接合子および全体
の植物、特に全体の稔性植物からなる群から選択される
トランスジェニック植物材料ならびに該トランスジェニ
ック植物材料の製造方法を包含する。 【０２０６】植物液胞内に特異的に方向づけられる遺伝
子産物を含む形質転換された植物材料の作出方法は以下
の工程： （ａ）まず最初に、液胞内に特異的に方向づけるのに関
連するＤＮＡ配列を公知方法により、適当な供給源から
単離するか、または合成し、（ｂ）該ＤＮＡ配列をあら
ゆる所望の発現性ＤＮＡ配列の３'末端に操作可能な様
式で挿入し、（ｃ）生成した構築物を植物発現ベクター
中に植物内で活性な発現シグナルの制御下にクローニン
グし、そして（ｄ）該発現ベクターを植物材料内に公知
方法により形質転換し、そしてその中で発現ベクターを
発現させる、から実質的になる。 【０２０７】上記ＤＮＡがＮ末端シグナルペプチドを本
来コードする構造遺伝子でないならば、発現されるべき
ＤＮＡの５'末端領域に前記シグナルペプチドをコード
するＤＮＡ配列をさらに操作可能に挿入することは有利
である。 【０２０８】以下の工程： （ａ）上記タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離
し、（ｂ）特定の細胞区画への方向づけに関連するＣ末
端にある標的性配列を読み枠から除去し、（ｃ）上記の
変異させたＤＮＡ配列を適当な植物発現ベクター中にス
プライシングし、そして（ｄ）生成した構築物を植物材
料内に形質転換する、から実質的になる、細胞外空間に
特異的に筆される遺伝子産物を含む形質転換された植物
材料の作出方法もまた本発明は包含する。 【０２０９】本発明の範囲内で、プロトプラスト、細
胞、カルス、組織、器官、種子、胚、花粉、胚珠、接合
子および全体の植物、その他からなる群から選択される
植物材料から再生され得、そして本発明に係る組換えＤ
ＮＡ分子の一つを含む、それらの有性および無性の後代
を包含するトランスジェニック植物が好ましい。 【０２１０】野生型に比べ植物液胞および／または細胞
外空間内に著しく増加されたタンパク質含量を有する、
トランスジェニック植物ならびにその有性および無性の
後代が好ましい。 【０２１１】野生型に比べ植物液胞内に著しく増加され
たキチナーゼ含量を有する、トランスジェニック植物な
らびにその有性および無性の後代が特に好ましい。 【０２１２】野生型に比べ植物液胞内に著しく増加され
たグルカナーゼ含量を有する、トランスジェニック植物
ならびにその有性および無性の後代が特に好ましい。 【０２１３】「トランスジェニック植物の無性および／
または有性の後代」という本発明の範囲内で定義された
ような表現はそれ故に、公知方法、例えば細胞融合また
は突然変異選択により得られ、そして形質転換された出
発植物体の特徴的な特性を依然有するあらゆる突然変異
体および変種を含み、そして形質転換された植物材料を
用いて得られる全てのハイブリッド形成体および融合産
生物をも包含する。 【０２１４】本発明はまた、トランスジェニック植物の
増殖材料に関する。本発明の範囲内で、トランスジェニ
ック植物の増殖材料とは、生体内または試験管内で有性
的にまたは無性的に増殖され得るあらゆる植物材料であ
ると理解されるべきである。本発明の範囲内で特に好ま
しいとみなされるべきである植物増殖材料は、特にプロ
トプラスト、細胞、カルス、組織、器官、種子、胚、花
粉、胚珠および接合子、ならびにトランスジェニック植
物から得ることができるあらゆるその他の増殖材料であ
る。 【０２１５】本発明はまた植物の部分、例えば本発明の
方法を用いて予め形質転換され、それ故に少なくとも一
部はトランスジェニック細胞からなるトランスジェニッ
ク植物またはそれらの後代から生じる花、茎、果実、葉
および根にも関する。 【０２１６】本発明の方法は、全ての植物、特に被子植
物亜門および裸子植物亜門の体系的な群に属するものの
形質転換に適当である。裸子植物亜門の中では球果植物
綱の植物が特に興味深い。 【０２１７】被子植物亜門の中では落葉樹および灌木に
加えて、ナス科、ジュウジバナ科、キク科、ユリ科、ブ
ドウ科、アカザ科、マツカゼソウ科、アリアセアエ科、
ヒガンバナ科、アスパラガセアエ科、ラン科、ヤシ科、
アナナス科、アカネ科、ツバキ科、バショウ科、アオイ
科またはホモノ科、およびマメ目、および特にパピリオ
ナセアエ科の植物が特に興味深い。ナス科、ジュウジバ
ナ科およびホモノ科の代表種が好ましい。 【０２１８】本発明の範囲内の標的作物は、例えばフラ
ガリア(Fragaria)、ロータス(Lotus) 、メディケーゴ(M
edicago)、オノブリィキス(Onobrychis)、トリホリウム
(Trifolium) 、トリゴネラ(Trigonella)、ビグナ(Vign
a) 、シトラス(Citrus)、リナム(Linum) 、ゼラニウム
(Geranium)、マニホット(Manihot) 、ドーカス(Daucu
s)、アラビトプシス(Arabidopsis) 、ブラッシカ(Brass
ica)、ラファヌス(Raphanus)、シナピス(Sinapis) 、ア
トロパ(Atropa)、カプシカム(Capsicum)、ダチュラ(Dat
ura)、ハイオシアムス(Hyoscyamus)、リコペルシオン(L
ycopersion) 、ニコチアナ(Nicotiana) 、ソラヌム(Sol
anum) 、ペチュニア(Petunia) 、ジギタリス(Digitari
s) 、マジョラナ(Majorana)、シコリウム(Cichorium)
、ヘリアンタス(Helianthus)、ラクチュカ(Lactuca)
、ブロムス(Bromus)、ゴッシピウム(Gossypium) 、ア
スパラガス(Asparagus) 、アンチリヌム(Antirrhinum)
、ヘメロカリス(Hemerocallis)、ネメシア(Nemesia)
、ペラルゴニウム(Pelargonium) 、パニカム(Panicum)
、ペンニセタム(Pennisetum)、ラヌンクルス(Ranuncul
us)、セネシオ(Senecio) 、サルピグロッシス(Salpiglo
ssis)、ククミス(Cucumis) 、ブロワリナ(Browallia)
、グリシン(Glycine) 、ロリウム(Lolium)、ゼア(Zea)
、トリチカム(Triticum)、ソルガム(Sorghum) 、イポ
モエア(Ipomoea) 、パッシフローラ(Passiflola)、シク
ラメン(Cyclamen)、マルス(Malus) 、プルナス(Pruna
s)、ローザ(Rosa)、ルブス(Rubus) 、ポプラス(Populu
s) 、サンタラム(Santalum)、アリウム(Allium)、リリ
ウム(Lilium)、ナルシサス(Narcissus) 、アナナス(Ana
nas)、アラキス(Arachis) 、ファセオルス(Phaseolus)
およびピサム(Pisum)からなる群から選択されるものを
含む。 【０２１９】植物の試験管内培養の分野、特に植物再生
の分野における新しい発展によって、ホモノ科の代表種
でさえも、植物プロトプラストから出発して全体の植物
を再生することが今可能となった。ホモノ科での再生実
験の成功の例は、イネのプロトプラストに対して文献
〔７９〕に、トウモロコシのプロトプラストに対して文
献〔５１〕および〔６０〕に、ダクチリス・グロメラタ
のプロトプラストに対して文献〔２６〕に特に記載され
ている。 【０２２０】それ故に本発明の範囲内で、以下の植物：
ロリウム、ゼア、トリチカム、ソルガム、サッカラム(S
accharum) 、ブロムス、オリザエ(Oryzae)、アベナ(Ave
na)、ホルデウム(Hordeum) 、セカーレ(Secale)および
セタリア(Setaria) を使用することも可能である。 【０２２１】従って、本発明は好ましくは、プロトプラ
スト、細胞、カルス、組織、器官、種子、胚、花粉、胚
珠、接合子および全体の植物、その他からなる群から選
択される植物材料から再生され得、そして本発明に係る
組換えＤＮＡ分子の一つを含む、それらの有性および無
性の後代を包含するホモノ科の群からのトランスジェニ
ック植物に関する。 【０２２２】形質転換された植物細胞から得られた成熟
植物はそれ自体交雑され種子を生じる。種子のいくつか
は遺伝学の確立された法則に正確に従う比率でもって有
用で望ましい特性をコードする遺伝子を含有する。これ
らの種子はトランスジェニック植物の作出のために使用
され得る。 【０２２３】ホモ接合系は繰り返し自家受粉により、お
よび近交系の作出により得ることができる。これらの近
交系は順に雑種の発生のために使用され得る。この操作
において、上記外来遺伝子を含む近交系は繁殖のために
もう一つの近交系と交雑される。 【０２２４】 【実施例】本発明に関する一般的な説明をした後に、本
発明のよりよい理解のために次に実施例を記載するが、
これは説明のためだけのものであり、特記しない限り本
発明を制限するものではない。 【０２２５】以下に記載される本発明の特定の実施態様
において、本発明に係る標的性配列を持つ、およびそれ
を持たない塩基性キチナーゼ、および細胞外空間に本来
分泌されそしてＩ型またはII型キチナーゼと相同性がな
い非関連III 型キチナーゼ（キュウリキチナーゼ）がニ
コチアナ・シルベストリス(Nicotiana sylvestris)内に
発現され、そしてそれらの植物細胞内での位置が決定さ
れる。 【０２２６】液胞への標的指向局在のため、および細胞
外空間に特異的に後記タンパク質を原則的に送り出す可
能性のための、液胞内に本来存在するタンパク質のＣ末
端範囲の必要性は、タバコからの塩基性キチナーゼおよ
び塩基性グルカナーゼにより証明され得る。その末端に
向けて、液胞内に本来存在するタンパク質のＣ末端範囲
を形成する７または２２個のＣ末端アミノ酸は、除去さ
れるか、またはオリゴヌクレオチド仲介突然変異により
コード性配列内の適当な部位に適当な停止コドンを置く
ことにより不活性化される。これにより引き続いて細胞
空間内に送り出される突然変異グルカナーゼまたはキチ
ナーゼを生じる。 【０２２７】他方、本発明に係る標的性配列が結合タン
パク質を液胞内に特異的に方向づけ得ることを示すため
に、タバコからの塩基性キチナーゼのＣ末端配列はキュ
ウリの葉からの酸性キチナーゼに連結される。操作は以
下のとおりである：まず最初に、塩基性キチナーゼから
の５'非コード性配列およびその領域に同様に位置する
シグナルペプチドをコードする配列を成熟キュウリキチ
ナーゼをコードする配列に連結する。構築物の３'末端
は次にリンカー断片を介してタバコキチナーゼ遺伝子の
Ｃ末端範囲からの９個のアミノ酸をコードする配列に添
加される。上記構築物は次いで強力なＣａＭＶ３５Ｓプ
ロモーターの制御下におかれ、そしてアグロバクテリウ
ム・チュメファシエンス形質転換によりニコチアナ・シ
ルベストリス植物内に挿入される。 【０２２８】形質転換が行われたら、強いキチナーゼ発
現を示すトランスジェニック植物が選択され、そしてキ
チナーゼの位置を分析するために使用される。プロトプ
ラストが作成され、そしてホモジネート中およびプロト
プラスト中のキチナーゼの比活性が比較される。 【０２２９】細胞内キチナーゼの細胞下局在を決定する
ために、液胞がプロトプラストから分離される。 【０２３０】一般的な組換えＤＮＡ技術 本発明において用いられる組換えＤＮＡ技術の多くは当
業者にとって一般的なものであるので、それらが出現す
る度に記載するよりもむしろ通常用いられる技術に関し
てここで簡潔に記載しておく方がよい。別に特記したこ
とを除いて、これらの全ての操作は文献〔３４〕に記載
されている。 【０２３１】Ａ．制限エンドヌクレアーゼでの切断 反応バッチは典型的には、マサチューセッツ州ビバリー
のニュー・イングランド・バイオラブス(New England B
iolabs) により推奨される緩衝溶液中に約５０ないし５
００μｇ／ｍＬのＤＮＡを含む。制限エンドヌクレアー
ゼ２ないし５単位をＤＮＡ１μｇにつき添加し、そして
反応バッチを上記の会社により推奨される温度で１ない
し３時間保温する。６５℃で１０分間加熱するか、また
はフェノールでの抽出により反応を終結させ、エタノー
ルでＤＮＡを沈澱させる。この方法は文献〔３４〕の第
１０４ないし１０６頁にも記載されている。 【０２３２】Ｂ．ブラント末端を製造するためのＤＮＡ
のポリメラーゼでの処理 ＤＮＡ断片５０ないし５００μｇ／ｍＬを、製造会社ニ
ュー・イングランド・バイオラブスにより推奨される緩
衝液中の反応バッチに添加する。反応バッチは全４種の
デオキシヌクレオチド三リン酸を０．２mMの濃度で含有
する。反応は１５℃で３０分間の期間に起こり、次いで
６５℃で１０分間加熱することにより終結される。５'
突出末端を製造する制限エンドヌクレアーゼ例えばEcoR
I およびBamHI で切断することにより得られる断片のた
めには、ＤＮＡポリメラーゼの大断片またはクレノウ断
片が使用される。３'突出末端を製造するエンドヌクレ
アーゼ例えばPstII およびSacIにより製造される断片の
ためには、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが使用される。これ
らの２つの酵素の使用は文献〔３４〕の第１１３ないし
１２１頁に記載されている。 【０２３３】Ｃ．アガロースゲル電気泳動およびゲルか
らのＤＮＡ断片の精製 アガロースゲル電気泳動を文献〔３４〕の第１５０ない
し１６３頁に記載のように水平型装置で行う。使用され
る緩衝液はその中に記載されているトリス−ホウ酸塩緩
衝液である。ＤＮＡ断片は、電気泳動の間にゲルまたは
タンク緩衝液に存在するか、または電気泳動の後に添加
されるいずれかの０．５ｍｇ／ｍＬ臭化エチジウムを用
いて染色される。ＤＮＡを長波長の紫外線の照射により
視覚化する。断片をゲルから分離する場合には、使用さ
れるアガロースは低いゲル化温度のものであり、これは
ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル(Sigma Che
mical)から入手できる。電気泳動後、望ましい断片を削
り取り、プラスチック管内に入れ、６５℃で約１５分間
加熱し、次いでフェノールで３回抽出し、そしてエタノ
ールで２回沈澱させる。この操作は文献〔３４〕の第１
７０頁の記載とはわずかに異なっている。変法として、
ＤＮＡはジェネクリーン・キット(Geneclean kit)[米国
カリフォルニア州ラ・ホイアのバイオ１０１社(Bio 101
Inc.)] を用いてアガロースから単離され得る。 【０２３４】Ｄ．ＤＮＡ末端への合成リンカー断片の付
加 ＤＮＡ分子末端へ新規なエンドヌクレアーゼ切断部位を
添加することが望ましい場合、上の項に記載されている
ように、ブラント末端を製造するために、場合によって
はこの分子をまずＤＮＡポリメラーゼで処理する。この
断片約０．１ないし１．０μｇを、ニュー・イングラン
ド・バイオラブスから得られるホスホリル化リンカーＤ
ＮＡ約１０ｎｇに、同社のＴ４ＤＮＡリガーゼ２μＬお
よび同社により推奨される緩衝液中の１mMＡＴＰを含有
する２０ないし３０μＬ容量中で添加する。１５℃で一
晩保温後、６５℃で１０分間加熱することにより反応を
終結させる。反応バッチを次に、合成リンカー配列で切
断する制限エンドヌクレアーゼに適当な緩衝液中に約１
００μＬに希釈し、そしてこのエンドヌクレアーゼ約５
０ないし２００単位を添加する。混合物を適温で２ない
し６時間保温し、次に断片をアガロースゲル電気泳動に
供し、そして上記Ｃのように断片を精製する。精製した
断片は今では制限エンドヌクレアーゼでの切断により製
造された終端を有するであろう。これらの終端は通常粘
着性であり、その結果、精製断片は同じような粘着端を
有するその他の断片に容易に連結され得る。 【０２３５】Ｅ．ＤＮＡ断片からの５'末端ホスフェー
トの除去 プラスミドクローニング工程の間に、ベクタープラスミ
ドのホスファターゼでの処理はベクターの再環状化を減
少させる文献〔３４〕の第１３頁に記載されている。正
しい制限エンドヌクレアーゼでのＤＮＡの切断の後、ベ
ーリンガー−マンハイム(Boehringer-Mannheim) から得
られる子ウシ消化管のアルカリホスファターゼ１単位を
添加する。ＤＮＡを３７℃で１時間保温し、次にフェノ
ールで２回抽出し、そしてエタノールで沈澱させる。 【０２３６】Ｆ．ＤＮＡ断片の連結 相補的な粘着端を有する断片を互いに結合させる場合、
各々の断片約１００ｎｇは、ニュー・イングランド・バ
イオラブスからのＴ４ＤＮＡリガーゼ約０．２単位をこ
の会社により推奨される緩衝液中に含有する２０ないし
４０μＬの反応混合物中で保温される。保温は１５℃で
１ないし２０時間行われる。ブラント末端を有するＤＮ
Ａ断片が結合される場合、それらはＴ４ＤＮＡリガーゼ
の量を２ないし４単位に増加させる以外は上記と同様に
保温される。 【０２３７】Ｇ．ＤＮＡの大腸菌内への形質転換 大腸菌ＨＢ１０１株がほとんどの実験において使用され
る。文献〔３４〕の第２５０および２５１頁に記載され
ているように、塩化カルシウム法を用いてＤＮＡが大腸
菌内に導入される。 【０２３８】Ｈ．プラスミドのための大腸菌のスクリー
ニング 形質転換の後に、大腸菌の生成したコロニーは迅速プラ
スミド単離法により所望のプラスミドの存在が試験され
る。２種の慣用の方法は、文献〔３４〕の第３６６ない
し３６９頁に記載されている。 【０２３９】Ｉ．プラスミドＤＮＡの大規模な分離 大腸菌からプラスミドを大規模に分離する方法は文献
〔３４〕の第８８ないし９４頁に記載されている。 【０２４０】Ｊ．Ｍ１３ファージベクターにおけるクロ
ーニング 以下の記載においてファージＭ１３誘導体の二重鎖複製
体は決まりきった操作、例えば制限エンドヌクレアーゼ
での切断、連結その他のために用いられることが理解さ
れるべきである。特記しない限り、酵素はベーリンガー
・バイオラブス[Boehringer,Biolabs(BRL)] から入手で
きる。それらはことわらない限り製造会社の指示に従っ
て使用される。 【０２４１】Ｋ．サザンブロット分析 抽出したＤＮＡを最初に制限酵素で処理し、次いで０．
８％ないし１％のアガロースゲル中で電気泳動し、ニト
ロセルロース膜に移し〔６６〕、そして予めニック−ト
ランスレーションに供された検出されるべきＤＮＡ（Ｄ
ＮＡ比活性５×１０8 ないし１０×１０8 ｃ．ｐ．ｍ．
／μｇ）とハイブリッド形成させる。フィルターを各回
１時間３回６５℃で０．０３Ｍクエン酸ナトリウムと
０．３Ｍ塩化ナトリウムの水溶液を用いて洗浄する。ハ
イブリッド形成したＤＮＡはＸ線フィルムを２４ないし
４８時間黒化することにより可視化される。 【０２４２】Ｌ．ウエスタンブロット分析 ＳＤＳボリアクリルアミドゲル電気泳動の後、タンパク
質をニトロセルロースまたはナイロンフィルターに電気
泳動で移す。このフィルターを次にブロック剤（例えば
ＰＢＳ中の５％スキムミルク粉末；以下ミルク／ＰＢＳ
と記載する）で前処理する。フィルターを次に検出され
るべき化合物と反応する抗血清（今回の場合、ウサギ抗
タバコキチナーゼＩｇＧ）と数時間保温する。このよう
にして前処理したフィルターをミルク／ＰＢＳで数回洗
浄し、次いで酵素と結合している市販の第２の抗体〔例
えばパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体〔バイオラ
ッド(BIORAD)〕、ミルク／ＰＢＳ中に希釈１：２００
０〕と保温する。フィルターを再びＰＢＳ中で洗浄し、
次に製造会社（バイオラッド）の指示に従ってクロロナ
フトールおよび過酸化水素で染色する。さらに詳しい記
載は文献〔５４〕になされている。 【０２４３】Ｍ．ペプチドの生成、精製および自動的配
列決定のための一般的技術還元およびアルキル化 ：精製され、凍結乾燥されたタン
パク質を１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）および１０
ｍＭ ＥＤＴＡ含有の６Ｍ塩酸グアニジンに溶解させ
る。ジチオトレイトール（ＤＤＴ）を最終濃度２０ｍＭ
まで添加し、そして４−ビニルピリジンを最終濃度５０
ｍＭまで添加する。このバッチを次いで窒素雰囲気下で
１．５時間保温する。ピリジルエチル化された材料を次
にＨＰＬＣ〔アクアポアフェニルカラム（２．１×１０
ｃｍ，ブラウンリー）〕により脱塩する。カラムは０．
１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中のアセトニトリル：
イソプロパノール混合物（１：１）の５％から８０％に
及ぶリニアグラジエントで溶出される。臭化シアン分解およびピログルタミン酸アミノペプチダ
ーゼでの消化 ：臭化シアン分解は文献〔６５〕に従って
その場で(in situ) 行われる。ピログルタミン酸アミノ
ペプチダーゼ（ベーリンガー・マンハイム）での消化は
文献〔１〕に従って行われる。ＬｙｓＣ消化 ：タンパク質をエンドプロテイナーゼＬｙ
ｓＣ（ベーリンガー・マンハイム）で０．１Ｍトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中室温で２４時間にわたり消化す
る（酵素：基質＝１：１０の比率）。生成するペプチド
をＨＰＬＣ〔アクアポアＣ８カラム（１×２２ｃｍ，ブ
ラウンリー）〕により単離する。０．１％ＴＦＡ中のア
セトニトリル：イソプロパノール（１：１）のリニアグ
ラジエント（０％ないし６０％）を溶出液として使用す
る。トリプシン消化 ：タンパク質のトリプシン（クーパー）
での消化は０．１Ｍ塩化カルシウムを含む０．１Ｍ炭酸
水素アンモニウム（ｐＨ８．２）中３７℃の温度で行わ
れる（酵素：基質＝１：１００の比率）。保温時間は５
時間である。生成するペプチドをＨＰＬＣ（上記参照）
により分離する。この方法を変更して、消化は０．１Ｍ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中３７℃で酵素：基質＝
１：５０の比率を用いて行われてもよい。その場合、保
温時間は２４時間である。生成するペプチドをＨＰＬＣ
〔ヴィダックＣ１８カラム（２．１×１５０ｃｍ）〕に
より、０．１％ＴＦＡ中のアセトニトリル：イソプロパ
ノール（１：１）のリニアグラジエント（０％ないし６
０％）を用いて分離する。配列決定 ：自動化エドマン分解がアプライド・バイオシ
ステムズ４７０Ａガス相シーケンサーを用いて行われ
る。フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸の同
定はアプライド・バイオシステムズ１２９Ａ ＰＴＨ
アナライザーを用いて行われる。 【０２４４】かなり一般的な記載を説明するために、そ
して本発明のよりよい理解のために、特定の実施例を記
載するが、特記しない限り本発明はこれらに限定されな
い。同様のことが上記の例示にも当てはまる。 【０２４５】Ｉ．タバコからのｃＤＮＡおよびゲノム遺
伝子ライブラリィの作成 実施例１ ：植物材料 ニコチアナ・タバカムの園芸品種ハバナ４２５植物を温
室中で、または表面滅菌種子から出発して生長させる。
種子の表面滅菌は以下のように行われる：種子２０ない
し３０個を約２００μｍの孔径を有するふるいに通し、
そして市販の１０％漂白液（ＮａＯＣｌ）１０ｍＬ中で
保温する。次いで種子を滅菌蒸留水で繰り返しすすぐ。 【０２４６】以下の実施例において、文献〔１２〕に従
ってニコチアナ・タバカムの園芸品種ハバナ４２５植物
から分離され得る柔細胞髄組織（Ｎ）のクローン化系列
を用いることが好ましい。 【０２４７】実施例２：組織培養 リンスマイゼルおよびスクッグ〔３３〕（ＬＳ）による
塩およびチアミン−ＨＣｌ濃度を含有し、１０ｇ／Ｌの
寒天の添加により固化された基本培地上でタバコ組織を
培養する。その他の添加剤としてこの基本培地はｐＨ指
示剤例えばクロロフェノールレッド５ｍｇ／Ｌを含有す
る。このＬＳ基本培地を基にし、そして引き続く実施例
において使用されるその他の培地はその他の添加剤とし
て、例えばカイネチン（１．４μＭ）〔サイトカイニン
培地〕またはα−ナフチル酢酸（１０．７μＭ）〔オー
キシン培地〕またはカイネチンおよびα−ナフチル酢酸
の混合物〔オーキシン／サイトカイニン培地（培地
Ａ）〕を含有する。 【０２４８】選択培地ＢおよびＣはα−ナフチル酢酸を
含有しないが、その代わりにその物質により形質転換体
が大量の非形質転換細胞および組織から選択され得るよ
うな選択物質を含有する。これらの選択培地の正確な組
成はVII 項（培地）に示してある。 【０２４９】ニコチアナ・タバカムの園芸品種ハバナ４
２５植物から分離された貯蔵系列（２７５Ｎ）はオーキ
シン／サイトカイニン培地（１０ｍＬ）上で２１日間隔
で継代培養される。すなわち、それらは各回新しい培地
（１０ｍＬ）上に接種され、そして明所２５℃で培養さ
れる。 【０２５０】培養組織中に高レベルのキチナーゼの誘導
のために、組織はオーキシン／サイトカイニン培地から
無ホルモン基本培地上に接種される。植物組織の培養お
よびキチナーゼ誘導に関するその他の詳細は文献〔１
４〕に記載されている。 【０２５１】実施例３：タバコプロトプラストの作成 実施例１による２日令のタバコ細胞懸濁液１００ｍＬを
等量の２倍濃厚酵素溶液と混合する。該酵素溶液は以下
の成分： セルラーゼＲ．１０オノズカ（ヤクルト本社製） １０．０ ｇ／ｌ マセラーゼ〔カリフォルニア州ラ・ホイアのベーリング・ダイアグノスティク ス(Behring Diagnostics) 製のリゾプス種からのペクチナーゼ〕 ２．５ ｇ／ｌ ペクトリアーゼＹ−２３（盛進製薬社製） １．０ ｇ／Ｌ ＣａＮＯ3 ・４Ｈ2 Ｏ １．４５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ ｇ／Ｌ ＮＨ4 Ｈ2 ＰＯ4 ０．２３ｇ／Ｌ ＫＮＯ3 １．２ ｇ／Ｌ Ｄ−マンニトール（ｐＨ５．７０） ７３．０ ｇ／Ｌを含有す る。 【０２５２】上記酵素溶液を遠心分離し、そして０．２
ｍｍフィルターを通して滅菌する。タバコ懸濁培養液と
酵素溶液からなるバッチをロータリーシェーカー上（４
０ｒｐｍ）室温で５時間注意深くかきまぜる。特定の時
間間隔で、試料をこのバッチから採取し、そして顕微鏡
で分析する。細胞の約８０％が球形のプロトプラストに
変化するまで酵素消化を続ける。次に保温容器をシェー
カーから取り出す。細胞／プロトプラスト懸濁液を静置
し、そして細胞およびプロトプラストを含まない培地の
上半分をピペットで吸い上げて除き、それを廃棄する。
残部を５０ｍＬ遠心管に移し、臨床用遠心分離機（ＨＮ
−ＳII型，ＩＥＣ）内５００ｒｐｍで１０分間遠心分離
する。プロトプラスト含有ペレットはすすぎ溶液Ｉ（VI
I 項参照）中に再懸濁され、そして次に１０００ｒｐｍ
で１０分間再び遠心分離する。 【０２５３】プロトプラストを含有するバンドは遠心管
の上端部に位置する。プロトプラスト画分を集め、次に
すすぎ溶液Ｉで再びすすぐ。プロトプラストを遠心管に
戻し、そして次の使用のために必要となるまで氷中に保
存する。 【０２５４】実施例４：ｃＤＮＡ遺伝子ライブラリィの
構築 ｃＤＮＡ遺伝子ライブラリィは、ニコチアナ・タバカム
の園芸品種ハバナ４２５植物の柔細胞髄組織のクローン
化系列（実施例１参照）から得ることができるポリ
（Ａ）＋ＲＮＡから出発して作成される。タバコ組織
は、無ホルモンＬＳ基本培地上で組織を培養することに
より実施例２に記載したように高レベルのキチナーゼを
産生するように最初に刺激される。 【０２５５】４．１：全ＲＮＡの単離 全ＲＮＡの調製は文献〔３０〕に記載された方法に実質
的に従って行われる。 【０２５６】液体窒素で急速冷凍されたタバコ組織を乳
鉢中で最初に粗く粉末化し、次に適当なホモジナイザー
緩衝液中に入れる（組織１ｇあたり緩衝液２．５ｍ
Ｌ）。該緩衝液は（１）７．５６ＭグアニジンＨＣｌ、
０．７３Ｍメルカプトエタノール、１８．９ｍＭ酢酸ナ
トリウムｐＨ５．０、（２）４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、
０．１ＭトリスＨＣｌｐＨ７．８（１容量）＋８０％
（ｖ／ｖ）フェノール、０．１％（ｗ／ｖ）ヒドロキシ
キノリン、０．１ＭトリスＨＣｌｐＨ７．８（１容量）
または（３）文献〔３０〕に準拠したもののいずれかで
ある。等量のフェノールを添加した後、バッチを例えば
ポリトロンホモジナイゼーションでホモジナイズする。
半容量のクロロホルムを次に添加し、そしてエマルジョ
ンを約１５分間注意深く混合する。次に遠心分離（１０
４００ｇで１０分間）により様々な相に分け、水相を廃
棄する。この時点で所望するならば、さらに抽出段階を
加えることも可能であるが、これは例えば付加的なフェ
ノール／クロロホルム抽出またはフェノール：クロロホ
ルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）の混合
物での抽出２回の形態で行われる。抽出の次は沈澱工程
が行われる。これは０．３Ｍ酢酸ナトリウムおよびエタ
ノール２．５容量部の添加により行われる。沈澱物を遠
心分離（１０４００ｇで１５分間）により集め、そして
滅菌水２ｍＬ中に再懸濁させる。塩化リチウムを最終濃
度３Ｍに添加した後、全体のバッチを４℃で一晩保温す
る。沈澱を次に遠心分離により再び集め、そして形成さ
れたペレットを氷冷エタノールで洗浄する。ペレットを
次に乾燥させ、そして滅菌水５００μＬ中に再懸濁させ
る。この沈澱物中の全ＲＮＡの濃度は分光分析により決
定される。 【０２５７】上記方法の変法として、全ＲＮＡはカルス
組織から単離され得る。この場合もまた、上記の工程段
階が使用されるが、使用される出発材料は立方体（約３
ｍｍ）に切断されたカルス組織であり、これはホモジナ
イゼーション段階の前にまず液体窒素での急速冷凍を行
い、次に予め冷却された乳鉢中で微粉末に粉砕される。 【０２５８】４．２：ポリアデニル化ＲＮＡの単離 ポリ（Ａ）＋ＲＮＡはそれ自体公知の方法（例えば文献
〔４０〕参照）に従って、オリゴ−ｄ（Ｔ）セルロース
クロマトグラフィー〔米国マサチューセッツ州レキシン
トンのコラボラティブ・リサーチ(Collaborative Resea
rch)〕により単離される。 【０２５９】オリゴ−ｄ（Ｔ）セルロースを最初に２．
０ＭのＮａＣｌ２０容量中で１５分間洗浄し、次に滅菌
水中に懸濁し、そしてカラム（直径１．５ｃｍ，長さ２
０ｃｍ）中に充填する。カラムを次に緩衝液（４４０ｍ
ＭＮａＣｌ，０．９ｍＭ ＥＤＴＡ，９ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ，ｐＨ７．５；または０．５ＭのＮａＣｌ，１０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）で、溶出液のｐＨが
７．０ないし７．６になるまで洗浄する。４．０ｍＬの
容量中のＲＮＡ含量が０．６ｍｇないし６．０ｍｇのＲ
ＮＡ溶液を、最終濃度ＥＤＴＡが１ｍＭ、そしてピペラ
ジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）が１０ｍ
Ｍ、ｐＨ７．５に調整する。ＲＮＡを７０℃で５分間加
熱することにより変性させ、そして氷上で冷却する。全
体の溶液を次に４ＭのＮａＣｌ０．１容量部で０．３６
ＭのＮａＣｌの値に調整する。ＲＮＡ溶液をカラムに入
れ、そして非ポリアデニル化ＲＮＡ〔ポリ（Ａ）＋ＲＮ
Ａ〕を上記緩衝液で溶出させる。溶出液の吸光度は分光
光度計（日立１００−４０型）およびそれに連結された
Ｗ＋Ｗレコーダー〔スイス国バーゼルのサイエンティフ
ィック・インストルメンツ(Scientific Instruments)〕
により決定される。吸光度が基底状態に達したらすぐ
に、カラムに結合されているポリ（Ａ）＋ＲＮＡを１ｍ
ＭＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．５で溶出
させる。溶出液を０．５ｍＭＥＤＴＡおよび０．３Ｍ酢
酸ナトリウムｐＨ５．０の溶液中に導入し、そしてエタ
ノール２．５容量部の添加により沈澱させる。次に８３
０００×ｇ（３０ないし４５分）の遠心分離によりＲＮ
Ａを集め、窒素下で乾燥させ、そして１ｍＭＥＤＴＡ、
１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．５または水中に再懸濁
させる。 【０２６０】４．３：ｃＤＮＡクローンの構築および選
択 ５−２５％（ｗ／ｖ）ショ糖グラジエント（１ｍＭＥＤ
ＴＡ；１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）上での調
製超遠心分離（５７０００ｇで１７時間）によりポリ
（Ａ）＋ＲＮＡを個々の画分に分離する。キチナーゼに
対する情報を含有する画分は抗キチナーゼ抗体による試
験管内での翻訳の後に同定され得る。これらの画分を次
に一緒にし、そしてさらに仕上げのために使用する。 【０２６１】抗キチナーゼ抗体作成の操作は当業者には
公知であり、そして例えば文献〔６３〕および〔３９〕
に記載された方法に従って実施され得る。その方法にお
いて、完全フロイントのアジュバント中の精製キチナー
ゼ調製物を含む実質的なエマルジョンは３ヵ月令のメス
ウサギ（ニュージーランド白色ウサギ）に注射される。
さらに１週間後および２週間後そしてその後１ヵ月間隔
で注射を行う。血液は各注射の７ないし１０日後に採取
され、血清試料を−２０℃で保存する。免疫グロブリン
ＧはプロテインＡ−セファロースＣ１４Ｂカラム〔ファ
ルマシア(Pharmacia) 〕上のアフィニティクロマトグラ
フィーにより精製され、次いで凍結乾燥され、そして−
２０℃で保存される。 【０２６２】ポリ（Ａ）＋ＲＮＡマトリックスから出発
する二重鎖ＤＮＡの合成、ｐＢＲ３２２内での該二重鎖
ＤＮＡのクローニング、分別コロニーハイブリダイゼー
ションおよびプラスミドの分離は、文献〔３４〕の指示
および記載に実質的に従って行われる。 【０２６３】二重鎖ＤＮＡ約０．８μｇの合成のため
に、予め単離され、そしてキチナーゼｍＲＮＡで富化さ
れたポリ（Ａ）＋ＲＮＡ３μｇを逆転写酵素〔フロリダ
州サンペテルスブルクのライフ・サイエンセズ(Life Sc
iences) 〕およびＤＮＡポリメラーゼＩ（マサチューセ
ッツ州ビバリーのニュー・イングランド・バイオラブ
ス）と保温する。生成するｃＤＮＡをホモポリマーｄＣ
−ｄＧテーリングによりｐＢＲ３２２のPstI切断部位内
にスプライシングさせる。該テーリングはｃＤＮＡとベ
クターＤＮＡに相補的な粘着端を付与することを可能に
し、そして文献〔３４〕の２１７−２１９頁に記載され
ている。オリゴ−ｄＣ末端を有するPstI直線化ベクター
ｐＢＲ３２２は市販されている。 【０２６４】生成する組換えプラスミドは次にコンピテ
ント大腸菌ＤＨ１細胞の形質転換のために使用される。
プラスミド内でのクローニングは文献〔３４〕の２４２
−２４６頁および３９１頁に記載されている。 【０２６５】寒天プレート上の細菌コロニーの形態にあ
るこのようにして構築されたｃＤＮＡライブラリィはま
ず最初に放射活性標識ｃＤＮＡを用いる分別コロニーハ
イブリダイゼーションによりスクリーニングされる。 【０２６６】分別コロニーハイブリダイゼーションにお
いて、細菌コロニーの複製は寒天プレート上にフィルタ
ーを置き、次にそれらを再び注意深く取り除くことによ
り、ニトロセルロースフィルターで行われる。最初の寒
天プレートは陽性コロニーの後の同定のために保存され
る。細菌コロニーを付着しているフィルターを次に栄養
培地上に置き、そしてコロニーが約２ｍｍの大きさに成
長するまで放置する。フィルターを次に、細菌細胞の溶
解およびフィルター上の細菌ＤＮＡの変性および固定を
導く水酸化ナトリウム溶液で処理する。ｐＨを中和した
後、フィルターを繰り返し洗浄し、乾燥し、そして最後
に真空中８０℃の温度で「黒化」し、その結果ＤＮＡを
フィルターに共有結合させる。 【０２６７】フィルターを放射標識（非クローン化）ｃ
ＤＮＡプローブと連続して２回ハイブッド形成させる。
これらのｃＤＮＡプローブは、キチナーゼを産生するよ
うに予め誘導された（ホルモンを添加しない基本培地で
７日間の保温）タバコ組織からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡお
よび非誘導化タバコ組織からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（オ
ーキシン／サイトカイニン上で７日間の保温）である。
非誘導化組織からの対照ＤＮＡと反応するよりも、誘導
化組織からのｃＤＮＡとより強く反応する有望ｃＤＮＡ
クローンは文献〔４０〕および〔３９〕に記載された方
法に従う「ハイブリッド選択」翻訳法を用いるその他の
分析に供される。プラスミドＤＮＡを０．２Ｍないし
０．３ＭのＮａＯＨ、３ＭのＮａＣｌ中で１分間煮沸す
ることにより変性させ、そして氷上で冷却させる。ハイ
ブリダイゼーション反応はフィルターあたり２００μｇ
ないし２５０μｇの全ＲＮＡを用いて、スクエアＢＡ／
８５ニトロセルロースフィルター〔西ドイツ国ダッセル
のシュライヒャー・ウント・シューエル(Schleicher un
d Schuell)〕上で行われる。フィルター上でハイブッド
形成されたＲＮＡを溶出させ、エタノールで沈澱させ、
そして水１０μＬ中に溶解させ、試験管内翻訳（市販の
小麦麦芽抽出物を用いる）により分析される。放射標識
された生成物は所望のタンパク質に対する抗体と沈澱
し、そしてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り分析される。 【０２６８】４．４：ｃＤＮＡクローンｐＣＨＮ４８ ｃＤＮＡ遺伝子ライブラリィはコロニーまたはプラーク
ハイブリダイゼーションを用いて文献〔３４〕に従って
スクリーニングされる。ＤＮＡプローブとして、成熟タ
ンパク質をコードする全体のＤＮＡ配列を含むが完全な
Ｎ末端シグナルペプチド配列を欠いている文献〔６２〕
に記載されたｃＤＮＡクローンｐＣＨＮ５０が用いられ
ている。このようにして異なる長さを有する種々のクロ
ーンが得られる。これらのクローンの最長のものが選択
され、そしてヌクレオチド配列分析に供される。ｐＣＨ
Ｎ４８と記載されるこのクローンは１．１４ｋｂからな
り、そしてポリ（Ａ）末端に７個のアデノシン、３２９
個のアミノ酸からなるポリペプチドに相当する単一の大
きな読み枠（読み取り可能枠）長さ９８７ヌクレオチ
ド、および５'非翻訳領域からのヌクレオチドを有する
挿入物を有する。コード領域のＤＮＡ配列から誘導可能
なアミノ酸配列は、タバコからの公知キチナーゼの２０
個の最初のＮ末端アミノ酸に対する配列に一致する。 【０２６９】実施例５：ゲノム遺伝子ライブラリィの構
築 ５．１ ：染色体タバコＤＮＡの単離 プロトプラストの溶菌のために、氷冷プロトプラスト懸
濁液１００ｍＬを氷冷ＴＥＮＰ緩衝液（VII 項参照）４
００ｍＬと混合する。ＩＥＣ臨床用遠心分離機中２００
０ｒｐｍで１０分間遠心分離することによりこの溶菌物
から核を分離する。そのように得られるペレットを氷冷
ＴＥＮＰ緩衝液５００ｍＬ中に再懸濁し、そして上記の
ように再びペレット化する。次いでＣｓＣｌグラジエン
ト試験管８本を準備し、各試験管中のプロトプラスト懸
濁液約１２．５ｍＬを含む細胞ペレットを１０倍濃厚Ｔ
Ｅ緩衝液（VII 項参照）２６ｍＬに添加する。細胞核を
溶菌するために、２０％（ｗ／ｖ）ナトリウムラウリル
サルコシン溶液５ｍＬおよびＣｓＣｌ３２．２ｇおよび
臭化エチジウム溶液（ＥｔＢｒ；１０ｍｇ／ｍＬ）２．
８９ｍＬをバッチに添加する。全体のバッチをゆっくり
かきまぜ、ＣｓＣｌを溶解させる。 【０２７０】このようにして得られた溶菌物をポリアロ
マー試験管（ベックマンＶＴｉ５０，３９ｍＬ試験管）
に移し、そして４５０００ｒｐｍ および２０℃で１６
時間ＶＴｉ５０ローター〔ベックマン(Beckman) 〕中で
遠心分離する。紫外線で蛍光性であるバンドが１６ゲー
ジの針を付けた３ｍＬのシリンジによりグラジエントか
ら除去され、そして集められる。さらにＤＮＡの仕上げ
が上記のＣｓＣｌ／ＥｔＢｒ平衡遠心分離の反復により
行われる。蛍光性バンドが再び集められ、付着するＥｔ
Ｂｒが２０×ＳＳＣ（VII 項参照）で飽和されたイソプ
ロパノール（等量）を用いる６回の連続抽出段階で除去
される。ＤＮＡがグラジエント溶液から沈澱され、そし
て蒸留水２容量、３．０Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．
４）０．１容量およびエタノール２容量を連続的に添加
することにより上記のように精製される。フィラメント
状のＤＮＡをパスツールピペットにより溶液から巻き取
り、７０％エタノールで洗浄し、そしてさらに等量のク
ロロホルムで抽出する。３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．
４）０．１容量およびエタノール２．０容量を添加する
ことによりＤＮＡを沈澱させる。ＤＮＡフィラメントを
再び巻き取り、７０％エタノールで洗浄し、そして５分
間風乾する。これを次に全量７ｍＬのＴＥ緩衝液（VII
項参照）中に溶解し、そして次の使用まで４℃で保存す
る。 【０２７１】５．２：ゲノムλ遺伝子ライブラリィの構
築 予め単離されたタバコＤＮＡを制限酵素Sau3A で消化
し、ＳＷ４１ローター（ベックマン）内２００００ｒｐ
ｍでの１０％−４０％ショ糖グラジエントにより２０時
間分離する。グラジエントから得られる画分をゲル電気
泳動（ＴＢＥ緩衝液中０．５％のアガロースゲル）によ
り分析する。正しい大きさの断片を有する画分を貯め
る。３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）０．１容量およ
びエタノール２容量を用いてＤＮＡを沈澱させ、そして
BamHI 〔カリフォルニア州ラ・ホイアのストラタゲン(S
tratagen) 〕で消化されたホスファターゼ処理された１
ＥＭＢＬ３ＤＮＡと連結させる。連結反応は製造会社の
指示に従って行われ、１−ベクターＤＮＡ１μｇおよび
組み入れられるべきタバコＤＮＡ０．１μｇを含有する
５μＬの反応バッチが使用される。この連結反応から生
じるＤＮＡの１−ファージの頭部への組入れはストラタ
ゲンによるギガパック・プラス・キットを用い、製造会
社の指示に従って行われる。大腸菌ＣＥＳ２０１(Glove
r DM) の感染後に得られたファージは挿入されたＤＮＡ
１μｇあたり約２×１０6 ファージである。 【０２７２】５．３：遺伝子ライブラリィのスクリーニ
ングおよびゲノムクローンの分離 ゲノム遺伝子ライブラリィはコロニーまたはプラークハ
イブリダイゼーションを用いて文献〔３４〕に従ってス
クリーニングされる。文献〔６２〕に記載されたｃＤＮ
ＡクローンｐＣＨＮ５０および４．４．項で単離された
クローンｐＣＨＮ４８がＤＮＡプローブとして使用され
る。 【０２７３】この方法で得られる組換え体は精製され、
そしてサザンブロット分析を用いて部分的に特徴づけら
れる。これらのクローンの一つはｃＤＮＡプローブ分子
ｐＣＨＮ５０およびｐＣＨＮ４８との非常に強いハイブ
リダイゼーションシグナルを示し、そしてサザンブロッ
ト分析に従って完全なキチナーゼ遺伝子を含有するが、
さらに試験のために選択され、そして１−ＣＨＮ１７と
記載される。 【０２７４】実施例６：ゲノムタバコキチナーゼクロー
ン１−ＣＨＮ１７ ６．１ ：ＤＮＡ配列決定および配列分析 制限酵素HindIII での消化の後、完全なキチナーゼ遺伝
子を含有し、そしてタバコＤＮＡからの同様の大きさの
断片に関連する５．４ｋｂＤＮＡ断片が得られる。３８
５０bpからなり、そして全体のコード配列を含むこの断
片の一部を次に配列決定する。 【０２７５】制限断片を適当なクローニングベクター、
例えばＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９〔７４〕内
にクローン化し、ジデオキシヌクレオチド法〔５５〕に
より両方の開始部位の配列決定を行う。決定されたヌク
レオチドおよびアミノ酸配列はジェネティクス・コンピ
ューター・グループ・ソフトウエア〔１０〕を用いてコ
ンピュータによりさらに分析される。 【０２７６】遺伝子４８と命名されるタバコからの塩基
性キチナーゼ遺伝子の完全なＤＮＡ配列は配列番号：１
０に示されているとおりである。ｃＤＮＡクローンｐＣ
ＨＮ４８とｐＣＨＮ５０との配列比較は、遺伝子４８の
コード領域内に２か所の介在配列部位（イントロン）が
あることを明らかにしている。これらのイントロンの最
初のものは２７４ｂｐからなり、そしてグリシンをコー
ドするコドン１４８の第一ヌクレオチドと第二ヌクレオ
チドとの間に位置する。第二のイントロンは長さ２６９
ｂｐであり、ヒスチジンをコードするコドン１９９の第
二ヌクレオチドと第三ヌクレオチドとの間に位置する。
両方のイントロンは、公知のその他の公知植物および動
物イントロンと一致して、ドナーおよびアクセプター配
列（ＧＴＡＡＧＴＣおよびＡＣＡＧ）を有するコンセン
サススプライシング部位を有する。さらに、両方のイン
トロンは配列ＣＴ（Ｇ／Ａ）Ａ（Ｃ／Ｔ）、動物コンセ
ンサス配列（ＰｙＴＰｕＡＰｙ）と類似性を有する３'
境界からの３３ヌクレオチドを有する。これらのコンセ
ンサス配列は切除における投げなわ中間体の形成に関与
する。 【０２７７】遺伝子４８のエキソンのヌクレオチド配列
はクローンｐＣＨＮ４８のコード領域のＤＮＡ配列と同
一である。 【０２７８】実施例７：キュウリの葉からのｃＤＮＡ遺
伝子ライブラリィの生成 ７．１ ：キュウリキチナーゼの精製およびアミノ酸配列 病原体により誘導され得るキチナーゼタンパク質を文献
〔３８〕に記載された方法に従って感染させたキュウリ
の葉から単離する。次にペプチドを公知の方法によりこ
の同種タンパク質調製物から生成する。これらのペプチ
ド断片のアミノ酸配列を以下にまとめる：アミノ末端 Ala Gly Ile Ala Ile Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Asn Glu Gly Ser Leu Ala Ser Thr Cys Ala Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile Ala Phe LeuＬｙｓＣペプチド (Lys) Asn Phe Gly Gln Val Ile Leu Ser Ala Ala Pro Gln Cys Pro Ile Pro Asp Ala His Leu Asp Ala Ala Ile Lys (Lys) Thr Gly Leu Phe Asp Ser Val Trp Val Gln Phe Tyr Asn Asn Pro Pro Cys Met Phe Ala Asp Asn Ala Asp Asn Leu Leu Ser (Lys) Leu Tyr Met Gly Leu Pro Ala Ala Arg Glu Ala Ala Pro Ser Gly Gly Phe Ile Pro Ala Asp (Lys) Ala Ser Ser Asn Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Ser LysＣＮＢＲペプチド (Met) Phe Ala Asp Asn Ala Asp Asn Leu Leu Ser (Met) Gly Leu Pro Ala Ala Arg Glu Ala Ala Pro Ser Gly Gly Phe Ile Pro Ala Asp Val Leu Ile Ser Gln Val Leu Pro Thr Ileトリプシンペプチド Val Leu Leu Ser Ile Gly Gly Gly Ala Thr Gly Leu Phe Asp 不明 Val Leu Tyr Met Gly Leu Pro Ala Ala Ala Ser Ser Asn Tyr Gly Gly Val Ala Phe Asp Asn Gly Tyr 【０２７９】７．２：ＴＮＶ感染キュウリ葉からのｃＤ
ＮＡライブラリィの作成 キュウリの葉をタバコ壊死ウイルス（ＴＮＶ）に感染さ
せる。感染５日後、ＲＮＡを上記したように単離する
（実施例４．１参照）。 【０２８０】ポリアデニル化ＲＮＡ〔ポリ（Ａ）＋ＲＮ
Ａ〕を標準法（項４．２参照）により単離し、そしてｃ
ＤＮＡ遺伝子ライブラリィの作成のために使用する。こ
れは文献〔２１〕の方法に従ってλＺａｐクローニング
ベクター〔ストラタゲン(STRATAGEN) 〕中で実質的に作
成される。 【０２８１】７．３：キュウリキチナーゼをコードする
ｃＤＮＡクローンの単離 上で決定されたアミノ酸配列からの２つの領域がオリゴ
ヌクレオチドプローブの作成のために選択される。合成
されたオリゴヌクレオチドプローブは選択されたペプチ
ドをコードし得るｍＲＮＡの全ての可能な組合せをカバ
ーする： 約３０００００プラークが前もって構築されたｃＤＮＡ
ライブラリィからプレートにより得られる。これらのプ
ラークの２重コピーが32Ｐ標識オリゴヌクレオチド混合
物１（プローブ１）または２（プローブ２）で試験され
る。両方のプローブとで陽性の結果を与えるプラークが
単離される。プラークの単離および自動切断は製造会社
の推奨（ストラタジーン・ラムダ・ザップ・ラボラトリ
ー・マニュアル，米国サンジエゴのストラタゲン）に従
って行われる。 【０２８２】適当な陽性クローンは「ブルースクリプ
ト」プラスミド中にスプライシングされ、そしてｐＢＳ
ＣｕｃＣｈｔ５と表される。このｃＤＮＡクローンの配
列はジデオキシ配列決定法により決定され得る（配列番
号：１１参照）。 【０２８３】II. キチナーゼおよびグルカナーゼ突然変
異体の構築 II. １．キチナーゼ突然変異体実施例８ ：新規制限部位の導入 キチナーゼ突然変異体の構築において、使用されるキチ
ナーゼクローンの種々の部分は互いに連結される。この
目的を達成するために、それらの部分は類似していなけ
ればならず、すなわち、適当な制限切断部位は種々の配
列中に導入されなればならない。以下に示した制限切断
部位が使用され、それらは全て同一粘着端を導く： BamHI 〔G/GATCC 〕 BclI 〔T/GATCA 〕 BglII 〔A/GATCT 〕 読み枠は、ＧＡＴがアスパラギン酸のコドンとして機能
するように各々の場合において選択されるのが好まし
い。 【０２８４】実施例９：タバコキチナーゼ遺伝子の突然
変異体の構築 ゲノム性キチナーゼクローンＣＨＮ１７のサブクローン
化断片（その製造は項１２．２参照）であるｐＣＨＮ８
７からのEcoRI ／HindIII 挿入物をプラスミドｐＴＺ１
８Ｒ中にスプライシングすることによりｐＴＲＣＨ１が
得られる。プラスミドｐＴＺ１８Ｒはファルマシアから
市販されている。 【０２８５】全体のｃＤＮＡ配列を含むｃＤＮＡクロー
ンｐＣＨＮ４８（項４．４参照）の挿入物はPstIでの部
分消化により単離され、そしてプラスミドｐＵＣ８内に
クローン化される。そのように形成されたクローンはｐ
ＣＨＮ６と表される。 【０２８６】ｐＣＨＮ６からのPstI大断片をプラスミド
ｐＵＣ８内にクローン化し、ポリリンカー内にスプライ
シングされた挿入物の配向と相違する２つの異なるクロ
ーン（ｐＵＣＨ２およびｐＵＣＨ３）を形成する。 【０２８７】ｐＵＣＨ２からのEcoRI ／HindIII 断片を
次に単離し、そしてプラスミドｐＴＺ１８Ｕ内にスプラ
イシングする。プラスミドｐＴＵＣＨ２がこのようにし
て得られる。プラスミドｐＴＺ１８Ｕは同様にファルマ
シアから市販されている。 【０２８８】ｐＵＣＨ３からのEcoRI ／HindIII 断片を
同様に単離し、そしてプラスミドｐＴＺ１８Ｒ内にクロ
ーン化する。このようにして形成されたクローンはプラ
スミドｐＴＲＣＨ３と表される。 【０２８９】実施例１０：オリゴヌクレオチド仲介突然
変異誘発 オリゴヌクレオチド仲介突然変異誘発のために、以下の
オリゴヌクレオチドが当業者には公知である慣用の方法
により合成される： 【表１】 野生型と比較して変化しているヌクレオチドは下線を付
しボールド体で示している。制限切断部位は空白により
示されている。オリゴヌクレオチドＮｏ．８中の欠失は
Δにより示されている。オリゴヌクレオチドＮｏ．３お
よびＮｏ．８中の挿入はイタリック体で示されている。 【０２９０】１０．１：タバコキチナーゼクローンの突
然変異誘発 一本鎖プラスミドを作成するために、出発プラスミドを
大腸菌のｄａｍ- 株内に上記バクテリアをヘルパーファ
ージＭ１３ＫＯ７（ファルマシア）と一晩培養すること
により導入する。次いでこれらのプラスミドは酢酸アン
モニウムおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ６００
０）により培養上澄みから非常に容易に沈殿され得、そ
してフェノール／クロロホルムおよびクロロホルムで抽
出される。エタノールで再び沈殿させた後、単離された
ＤＮＡは実際の突然変異誘発のために使用される（突然
変異誘発あたり培養物約５ｍＬからのＤＮＡ）。 【０２９１】各オリゴヌクレオチド２００ｐｍｏｌを
０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2 、６ｍＭジニトロトレイトール（ＤＴＴ）、２
ｍＭＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ５単位
中、３７℃の温度で４５分間リン酸化する。反応は６０
℃で１０分間保温することにより停止させる。 【０２９２】一本鎖ＤＮＡをリン酸化オリゴヌクレオチ
ド２．５μＬおよび溶液Ａ〔０．２Ｍトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５），０．１Ｍ ＭｇＣｌ2 ，０．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ，１０ｍＭ ＤＴＴ〕１μＬと最終容量３０μＬ
で混合し、そして最初に８０℃で５分間、次に室温で２
０分間保温する。 【０２９３】以下の混合物１０μＬを次に各試験管に添
加する： Ｈ2 Ｏ １８．５μＬ 溶液Ｂ〔０．２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．１Ｍ ＭｇＣｌ2 ，０． １Ｍ ＤＴＴ〕 ２．０μＬ １０ｍＭ ＡＴＰ ２．０μＬ ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ各１０ｍＭ） ２．０μＬ クレノウ断片 １．０μＬ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ ０．５μＬ。 この混合物を３２℃の温度で３０分間保温し、次いで室
温でさらに２ないし１６時間保温する。 【０２９４】このバッチの４分の１を感応性大腸菌ｍｕ
ｔＳ細胞（修復−欠損株）内に形質転換する。これらの
細胞を２×Ｌまたは２×ＴＹ培地中３７℃で３ないし６
時間揺動する。プラスミドＤＮＡを次に当業者には公知
の微量調製法により単離する。単離されたＤＮＡを次
に、アンピシリン含有培地での平板培養により得られる
感応性大腸菌ＤＨ５ａ細胞内に形質転換する。突然変異
体は次に放射標識突然誘発性オリゴヌクレオチドを用い
るコロニーハイブリダイゼーションにより非常に容易に
同定され得る。さらに、全ての突然変異体は突然変異の
結果として切断部位を得るか、または失っているので、
制限分析が行われ得る。 【０２９５】１０．１．２．ｐＴＲＣＨ４ プラスミドｐＴＲＣＨ１をオリゴヌクレオチドＮｏ．１
で突然変異させる。この新規に形成されたプラスミドは
ｐＴＲＣＨ４と表される。この突然変異において、BclI
制限切断部位は成熟キチナーゼをコードするＤＮＡ配列
の第１コドンに導入され、コードされるアミノ酸はグル
タミン酸からアスパラギン酸に変化する（Ｇｌｕ１→Ａ
ｓｐ１）。 【０２９６】１０．１．３．ｐＴＲＣＨ６ プラスミドｐＴＲＣＨ３をオリゴヌクレオチドＮｏ．２
で突然変異させる。この新規に形成されたプラスミドは
ｐＴＲＣＨ６と表される。この突然変異において、成熟
キチナーゼをコードするＤＮＡ配列のコドン３００はグ
リシンコドンから停止コドンに変化し（Ｇｌｙ３００→
停止３００）、そしてHinfI 制限切断部位は同時に導入
される。 【０２９７】１０．１．３．ｐＴＵＣＨ６ 上記突然変異を含む、ｐＴＲＣＨ３のHindIII ／PvuII
断片およびｐＴＲＣＨ６のPvuII ／HindIII 断片を予め
HindIII ／EcoRI で切断したベクターｐＴＺ１８Ｕ内に
スプライシングする。プラスミドｐＴＵＣＨ６はこのよ
うにして得られる。 【０２９８】１０．１．５．ｐＴＵＣＨ７ プラスミドｐＴＵＣＨ２をオリゴヌクレオチドＮｏ．３
で突然変異させる。この新規に形成されたプラスミドは
ｐＴＵＣＨ７と表される。この突然変異において、BglI
I 制限切断部位は成熟キチナーゼをコードするＤＮＡ配
列のコドン２９５／２９６の領域に導入される。この制
限切断部位は上記のその他の突然変異体の場合とは異な
る読み枠に位置しており、Ｇがコドン２９７に挿入され
ている。適合読み枠はこのようにして再び得られる。 【０２９９】１０．１．６．ｐＴＵＣＨ８ プラスミドｐＴＵＣＨ２をオリゴヌクレオチドＮｏ．４
で突然変異させる。この新規に形成されたプラスミドは
ｐＴＵＣＨ８と表される。この突然変異において、成熟
キチナーゼをコードするＤＮＡ配列のコドン３０４はア
スパラギン酸コドンからアスパラギンコドンに変化する
（Ａｓｐ３０４→Ａｓｎ３０４）。これはTaqI切断部位
の損失を導く。 【０３００】１０．１．７．ｐＴＵＣＨ９ プラスミドｐＴＵＣＨ２をオリゴヌクレオチドＮｏ．５
で突然変異させる。この新規に形成されたプラスミドは
ｐＴＵＣＨ９と表される。この突然変異において、コド
ン３０４はアスパラギン酸コドンからアルギニンコドン
に変化し（Ａｓｐ３０４→Ａｒｇ３０４）、同様にTaqI
切断部位の損失を導く。 【０３０１】１０．１．８．ｐＴＵＣＨ１０ プラスミドｐＴＵＣＨ２をオリゴヌクレオチドＮｏ．６
で突然変異させる。この新規に形成されたプラスミドは
ｐＴＵＣＨ１０と表される。この突然変異において、コ
ドン２９９はアスパラギンコドンからリジンコドンに変
化し（Ａｓｎ２９９→Ｌｙｓ２９９）、そしてコドン３
００はグリシンコドンからアスパラギン酸コドンに変化
する（Ｇｌｙ３００→Ａｓｐ３００）。BglII 切断部位
が同時に導入される。 【０３０２】１０．２．キュウリキチナーゼクローンの
突然変異誘発 キュウリキチナーゼクローンの突然変異誘発は実施例１
１．１に記載した方法と同様に行われる。 【０３０３】キュウリキチナーゼｃＤＮＡクローンｐＢ
ＳＣｕｃＣｈｔ５（項７参照）からのEcoRI 挿入物をプ
ラスミドｐＴＺ１８Ｕ内にクローン化する。そのように
して得られたプラスミドをｐＴＵＣＵ２と表す。 【０３０４】１０．２．１．ｐＴＵＣＵ４ ｐＴＵＣＵ２をオリゴヌクレオチドＮｏ．７で突然変異
させる。この新規に形成されたプラスミドはｐＴＵＣＵ
４と表される。この突然変異において、BamHI制限切断
部位がシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の最後
のコドンに導入され、その結果として続くコドンが変化
し、アラニンの代わりにプロリンをコードする（Ａｌａ
１→Ｐｒｏ１）。 【０３０５】１０．２．２．ｐＴＵＣＵ５ ｐＴＵＣＵ２をオリゴヌクレオチドＮｏ．８で突然変異
させる。この新規に形成されたプラスミドはｐＴＵＣＵ
５と表される。この突然変異において、BclI制限切断部
位がキュウリキチナーゼの停止コドンの領域に導入され
る。結果として停止コドンがアスパラギン酸コドンに変
化する（停止２６８→Ａｓｐ２６８）。 【０３０６】１０．２．３．ｐＴＵＣＵ６ ｐＴＵＣＵ２をオリゴヌクレオチドＮｏ．９で突然変異
させる。この新規に形成されたプラスミドはｐＴＵＣＵ
６と表される。この突然変異において、XbaI制限切断部
位がｃＤＮＡ配列の３'非コード性配列の領域（クロー
ンｐＢＳＣｕｃＣｈｔ５のヌクレオチド９８１−９８６
の領域）に導入され、その結果としてベクターｐＧＹ１
内へのクローニングが可能になる。 【０３０７】II. ２．グルカナーゼ突然変異体実施例１１ ：ＰＣＲ仲介突然変異誘発 Ｃ末端範囲の最初のアミノ酸をコードする塩基トリプレ
ット（ＧＴＣ＝バリン）をＰＣＲ法により停止コドンＴ
ＧＡに変化させる。 【０３０８】ＰＣＲ突然変異誘発を行う方法は当業者に
は非常によく知られている。それらは例えば以下の文
献：〔７２〕，〔２９〕，および〔１１〕。さらに、相
当するＰＣＲキットはパーキン−エルマー・シータス
（米国コネチカット州ノーウォーク）やその他の会社か
ら市販されており、そして操作はその中の指示書に従っ
て行われ得る。 【０３０９】１１．１．ｐＣＩＢ１００５ＢΔＶＴＰの
構築 この構築は、米国メリーランド州ロックヴィレにあるア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣ
Ｃ）にＡＴＣＣ番号４０７７０の下に寄託されており、
その構築がＥＰ−Ａ０３９２２２５に詳細に記載されて
いるプラスミドｐＣＩＢ１００５Ｂから出発して行われ
る。 【０３１０】プラスミドｐＣＩＢ１００５ＢはＣａＭＶ
３５Ｓ発現ベクターにおいて、完全なＮ末端シグナル配
列および２２個のアミノ酸からなるＣ末端範囲を有する
タバコからの完全キメラ塩基性プレプロ−β−１，３−
グルカナーゼをコードする。下に記載される生成物であ
るプラスミドｐＣＩＢ１００５ＢΔＶＴＲは同様のグル
カナーゼをコードするが、２２個のアミノ酸からなるＣ
末端範囲が、成熟タンパク質をコードする配列の末端へ
の停止コドンの挿入により機能的に欠失されている。 【０３１１】以下のオリゴヌクレオチドがＰＣＲ増幅に
使用される： オリゴ１：５'−GGG ACA CAC GTG CAC CTT −３' オリゴ２：５'−CTG TCC CAA ACT CCA CCA GAT CAC CCA AAG TTG ATA TTA TAT T −３' オリゴ３：５'−AAT ATA ATA TCA ACT TTG GGT GAT CTG GTG GAG TTT GGG ACA G −３' オリゴ４：５'−GCC TCC CCT TCA TCG TCC −３' オリゴヌクレオチド１（オリゴ１）はXhoI切断部位の上
流に位置するグルカナーゼＤＮＡのコード性領域内の配
列に相当する。オリゴヌクレオチド３（オリゴ３）は挿
入される停止コドンおよびＣ末端範囲をコードする配列
の一部が続く成熟グルカナーゼタンパク質をコードする
配列の３'末端の領域にある領域を含む。オリゴヌクレ
オチド２（オリゴ２）はアンチセンス配向にある他はオ
リゴ３に相当する配列を有する。オリゴヌクレオチド４
（オリゴ４）はSacI切断部位の下流のｐＣＩＢ１００５
Ｂのｔｍｌ３'領域に位置する配列を含む。 【０３１２】３つのＰＣＲ反応が行われる： （１）プライマーとしてオリゴ１およびオリゴ２ならび
に鋳型としてｐＣＩＢ１００５Ｂを用いるＰＣＲ１； （２）プライマーとしてオリゴ２およびオリゴ４ならび
に鋳型としてｐＣＩＢ１００５Ｂを用いるＰＣＲ２； （３）プライマーとしてオリゴ１およびオリゴ４ならび
に鋳型としてＰＣＲ１およびＰＣＲ２反応の生成物を用
いるＰＣＲ３。ＰＣＲ３の最初の２つの工程は鋳型とだ
け行われ、そして次にプライマーだけが添加される。 【０３１３】ＰＣＲ３反応の生成物をSacIおよびXhoIで
消化し、そしてアガロースゲルにより分離される。７２
５ｂｐに相当するバンドをゲルから切出し、そして精製
する。 【０３１４】プラスミドｐＣＩＢ１００５Ｂを次に同様
にXhoIおよびSacIで消化し、そしてリガーゼ反応におけ
る消化および精製ＰＣＲ３断片に一晩連結させる。連結
混合物は感応性大腸菌ＤＨ５ａ細胞を形質転換するため
に使用される。プラスミドｐＣＩＢ１００５Ｂおよびｐ
ＣＩＢ１００５ＢΔＶＴＰを形質転換された細胞の一晩
培養物から単離し、そしてニコチアナ・プルムバギニホ
リア(Nicotiana plumbaginifolia) プロトプラストの引
き続く感染のために使用される。この方法で得られる構
築物の正確さは配列分析により確認される。 【０３１５】III.植物発現プラスミド内へのキチナーゼ
突然変異体の混入 実施例１２ ：プラスミドｐＳＣＨ１０の構築 プラスミドｐＳＣＨ１０は、ベクタープラスミドｐＧＹ
１中にスプライシングされた、ゲノムクローンＣＨＮ１
７ならびにｃＤＮＡクローンＣＨＮ４８からなる、タバ
コキチナーゼをコードする配列を含む。この配列の両側
にはＣａＭＶウイルスの３５Ｓプロモーターおよび終結
配列が位置している。この構築物はそれ故に野生型キチ
ナーゼ構築物である。それを以下に詳細に記載する。 【０３１６】１２．１：プラスミドｐＧＹ１の構築 プラスミドｐＧＹ１は文献〔４９〕に記載された植物発
現ベクターｐＤＨ５１から誘導される。プラスミドｐＧ
Ｙ１では出発プラスミドｐＤＨ５１のNcoI切断部位がXh
oI切断部位に置換されていた。 【０３１７】プラスミドｐＤＨ５１がNcoIで切断され、
そして突出末端がクレノウポリメラーゼを用いて充填さ
れる。このときブラントである末端はXhoIリンカー（Ｃ
ＣＴＣＧＡＧＧ）と連結される。１２．２ ：プラスミドｐＳＣＨ１０の構築 プラスミドｐＳＣＨ１０はキチナーゼをコードする配
列、５'の転写される非コード性配列（転写開始部位の
上流に位置するキチナーゼ遺伝子４８の２１塩基対）お
よび３１ｂｐの転写される非コード性配列を、ＣａＭＶ
３５Ｓ植物発現ベクターｐＧＹ１のBamHI/PstIクローニ
ング部位内にスプライシングされて含む。 【０３１８】ｐＳＣＨ１０の作成に必要な工程段階は以
下にさらに詳細に記載される： （１）キチナーゼ遺伝子４８を含むゲノムクローン１−
ＣＨＮ１７をHindIII で切断する。生成する５．６ｋｂ
のHindIII 断片を単離し、そしてプラスミドｐＵＣ８の
HindIII クローニング部位内にスプライシングし、プラ
スミドｐＣＨＮ６５を形成する。 （２）プラスミドｐＣＨＮ６５をEcoRI で切断し、キチ
ナーゼコード化領域の５'末端を含む生成する２．５ｋ
ｂ断片を同様にｐＵＣ８にクローン化する。生成するプ
ラスミドをｐＣＨＮ６８と記載する。 （３）プラスミドｐＣＨＮ６８をPstIで消化し、そして
０．５ｋｂPstI/ EcoRI断片を失って再び連結する（そ
れ自体に連結する）。生成するプラスミドをｐＣＨＮ７
４と記載する。 （４）遺伝子４８の転写の５'非コード領域をBamHI 切
断部位の後方にクローン化するために、プラスミドｐＣ
ＨＮ７４を最初にHphIで消化し、次にＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼの作用によりブラント末端を付与し、そして最後
にPstIで切断する。HphI/PstI 断片を単離し、そしてHi
ncII/ PstI〔７０〕で消化されたプラスミドｐＵＣ８内
にスプライシングし、ｐＣＨＮ８７を形成する。配列決
定の後、最後の工程段階の間に1/2 HincII切断部位の塩
基が失われたことをＤＮＡ配列に対する参照により見る
ことができる。 （５）ｐＣＨＮ８７をEcoRI およびHindIII で消化し、
そしてクローニングベクターｐＵＣ９〔７０〕内にスプ
ライシングする。生成するプラスミドはｐＣＨＮ８８と
記載される。 （６）タバコｃＤＮＡクローン４８（ｐＣＨＮ４８）の
１ｋｂPstI断片をプラスミドｐＵＣ８のPstIクローニン
グ部位内にスプライシングし、ｐＣＨＮ７８を形成す
る。 （７）プラスミドｐＣＨＮ７８のPstI挿入物を制限酵素
PstIでプラスミドを切断することにより外し、そしてｐ
ＣＨＮ８８のPstI部位にスプライシングし、結果として
キチナーゼをコードする完全なＤＮＡ配列を再構築す
る。生成するプラスミドはｐＣＨＮ８９と記載される。 （８）プラスミドｐＣＨＮ８９を次にBamHI で完全に消
化し、そしてPstIで部分的に消化する。生成する１．５
ｋｂ断片を、同様にBamHI およびPstIで予め切断された
植物発現ベクターｐＧＹ１内にクローン化し、ｐＳＣＨ
１０を形成する。このクローニング段階の結果として、
キチナーゼをコードするＤＮＡ配列はＣａＭＶプロモー
ターとＣａＭＶ終結配列との間に位置している。 【０３１９】実施例１３：植物発現プラスミドｐＳＣＨ
１０内へのキチナーゼ突然変異体の混入 １３．１ ：タバコキチナーゼ突然変異体の混入 プラスミドｐＳＣＨ１０のPstI断片を以下のPstI断片に
置換する： ｐＴＵＣＨ６のPstI断片 → ｐＳＣＭ３ ｐＴＵＣＨ７のPstI断片 → ｐＳＣＭ２５ ｐＴＵＣＨ８のPstI断片 → ｐＳＣＭ２２ ｐＴＵＣＨ９のPstI断片 → ｐＳＣＭ２３ ｐＴＵＣＨ１０のPstI断片 → ｐＳＣＭ２４ これらのプラスミドは今３'末端標的性配列を含み、以
下のヌクレオチド配列を有する： 【表２】野生型プラスミド（ｐＳＣＨ１０）と比較して変化して
いる（突然変異している）ヌクレオチドはボールド体で
示され、下線を付してある。 【０３２０】１３．２：キュウリキチナーゼ突然変異体
の混入 １３．２．１．プラスミドｐＳＣＵ１ プラスミドｐＳＣＭ１からのEcoRI ／BclI断片およびｐ
ＴＵＣＵ４からのBamHI ／EcoRI 断片を、前もってEcoR
I で切断したプラスミドｐＴＺ１８Ｕ内にクローン化す
る。プラスミドｐＴＵＣＵ７が形成される。 【０３２１】プラスミドｐＴＵＣＵ７からのEcoRI ／Ns
iI断片およびプラスミドｐＴＵＣＵ６からのNsiI／EcoR
I 断片を、前もってEcoRI で切断したプラスミドｐＴＺ
１８Ｕ内にクローン化する。プラスミドｐＴＵＣＵ１１
が形成される。 【０３２２】プラスミドｐＴＵＣＵ１１を次にBamHI お
よびXbaIで消化し、そしてBamHI ／XbaI断片を単離す
る。次いで前もってBamHI ／XbaIで切断したプラスミド
ｐＧＹ１内にスプライシングし、プラスミドｐＳＣＵ１
を形成する。 【０３２３】１３．２．２．プラスミドｐＳＣＵ３ プラスミドｐＴＵＣＵ７からのEcoRI ／NsiI断片および
ｐＴＵＣＵ５からのNsiII ／EcoRI 断片を、前もってEc
oRI で切断したプラスミドｐＴＺ１８Ｕ内にクローン化
する。このようにしてプラスミドｐＴＵＣＵ１０が得ら
れる。プラスミドｐＳＣＵ３がプラスミドｐＴＵＣＵ１
０のXhoI／BclI断片およびプラスミドｐＴＵＣＵ７のBg
lII ／PstI断片を、前もってXhoI／PstIで切断したプラ
スミドｐＧＹ１中にクローニングすることにより形成さ
れる。 【０３２４】１３．２．３．プラスミドｐＳＣＵ６ プラスミドｐＴＵＣＵ６が、ｐＴＵＣＵ１０からのXhoI
／BclI断片およびｐＴＵＣＨ１０からのBglII ／PstI断
片を、前もってXhoI／PstIで切断したプラスミドｐＧＹ
１中にクローニングすることにより得られる。 【０３２５】プラスミドｐＳＣＵ３およびｐＳＣＵ６は
今、対照のプラスミドｐＳＣＵ１と比較して、以下のヌ
クレオチド配列〔５'→３'〕を有する３'末端標的性配
列を含む： 【表３】 野生型と比較して変化している（突然変異している）ヌ
クレオチドはボールド体で示され、下線を付してある。
挿入により新たに導入されたヌクレオチドはイタリック
体で示してある。 【０３２６】実施例１４：ｐＳＣＭおよびｐＳＣＵ構築
物の二元植物ベクター内へのスプライシング １４．１ ：プラスミドｐＣＩＢ２００の構築 この二元ベクターの構築は、ＰＫ２〔２〕の誘導体であ
る文献〔５６〕に記載されたプラスミドｐＴＪＳ７５を
基にしており、該二元ベクターは広い宿主範囲を有し、
そしてテトラサイクリン耐性遺伝子を有する。このプラ
スミドを制限酵素NarIで切断し、そして次にNptI遺伝子
を有するｐＵＣ４Ｋ〔７０〕のAccI断片に連結される。
この方法で形成されたプラスミドｐＴＪＳ７５ｋａｎは
このときテトラサイクリン耐性遺伝子の他にNptI遺伝子
を含み、次に制限酵素SalIで消化される。 【０３２７】同時に、文献〔５３〕に記載されているプ
ラスミドｐＣＩＢ７をEcoRV で切断し、そしてアグロバ
クテリウム・チュメファシエンスのＴｉプラスミドから
の左側および右側のＴ−ＤＮＡ境界配列ならびにキメラ
Nos/NptII 遺伝子およびｐＵＣポリリンカー領域を含む
生成EcoRV 断片をXhoIリンカーと連結する。 【０３２８】生成する構築物は次にXhoIで消化され、そ
してプラスミドｐＴＪＳ７５ｋａｎのSalI切断部位にク
ローン化される。遺伝子地図が図１に示される生成する
プラスミドをｐＣＩＢ２００と記載する。 【０３２９】１４．２：ｐＣＩＢ２００内へのEcoRI 断
片のクローニング プラスミドｐＣＩＢ２００を最初にEcoRI で切断する。
次に以下のEcoRI 断片を切断されたｐＣＩＢ２００内に
クローン化する： ｐＳＣＨ１０のEcoRI 断片 → ｐＳＣＨ１２ ｐＳＣＭ３のEcoRI 断片 → ｐＳＣＭ１３ ｐＳＣＵ１のEcoRI 断片 → ｐＳＣＵ１１ ｐＳＣＵ３のEcoRI 断片 → ｐＳＣＵ１３ 【０３３０】IV. タバコプロトプラストでの形質転換 上記のプラスミドは「一時的発現系」を用いてニコチア
ナ・プルムバギニホリアのプロトプラストにおいて試験
管内で試験される。実施例１５ ：ニコチアナ・プルムバギニホリアのプロト
プラストの生成および培養 ニコチアナ・プルムバギニホリアのプロトプラストの生
成および培養はタバコに対して記載された操作〔項３参
照〕と同様に公知方法により行われる。詳細な記載は文
献〔６０〕または〔４４〕に見出されるであろう。 【０３３１】実施例１６：プロトプラストの形質転換 ニコチアナ・プルムバギニホリアのプロトプラストの形
質転換は文献〔４４〕に記載の方法に従って行われる。
上記の方法に従って生成されたプロトプラストを最後の
精製段階の後、以下の組成： マンニトール ０．４Ｍ ＣａＣｌ2 １４−３０ｍＭ ＭＥＳ ０．１％（ｗ／ｖ） を有する溶液中に懸濁する。プロトプラスト濃度は１．
６−２×１０6 ／ｍＬである。 【０３３２】このプロトプラスト懸濁液３ｍＬをまず１
５ｍＬの遠心管中で殺菌水性懸濁液の形態にあるプラス
ミドＤＮＡ５μｇと混合する〔４７〕。数分後、ポリエ
チレングリコール溶液〔０．４Ｍマンニトール，０．１
Ｍ Ｃａ（ＮＯ3 ）2 ，ｐＨ７．０中の４０％（ｗ／
ｖ）ＰＥＧ６０００〕０．３ｍＬを混合物に添加し、そ
してそのバッチを注意深く混合する。さらに数分後、Ｋ
３培地〔Z Pflanzenphysiol, 78:453-455(1976); Shill
ito 等(1981)〕４ｍｌを添加し、そして遠心管を２４時
間暗所において２５℃ないし２７℃で保温する。 【０３３３】プロトプラストのペレット形成性を改良す
るために、Ｗ５塩溶液〔４４〕（５．４ｍＬ）を次に添
加してもよい。次いでプロトプラストを低速遠心分離す
る（約６０−１００×ｇ）。上澄みの一部を引き続くキ
チナーゼ活性の分析のために分離し、そして残りを廃棄
する。分別されたプロトプラストを残りの培地中に再懸
濁し、そしてエッペンドルフチューブに移し、そこで容
量をおおよそ決定する。この懸濁液の一部をキチナーゼ
活性の分析およびウエスタンブロットのために使用す
る。 【０３３４】ニコチアナ・プルムバギニホリアのプロト
プラストのプラスミドｐＣＩＢ１００５ＢおよびｐＣＩ
Ｂ１００５ＢΔＶＴＰでの形質転換は文献〔１９〕によ
る変形された「ネグルチウ」の方法に従って行われ得
る。 【０３３５】Ｖ．形質転換およびトランスジェニック植
物の作出 実施例１７．１ ：アグロバクテリウム・チュメファシエ
ンスの二元ベクターでの形質転換 上の実施例１４に記載された二元ベクターを以下の方法
に従ってアグロバクテリウム・チュメファシエンスＬＢ
４４０４株内に形質転換する。アグロバクテリウム・チ
ュメファシエンスＬＢＡ４４０４株はＴ−ＤＮＡ領域を
欠いているが、完全なｖｉｒ領域を依然として有する欠
失Ｔｉプラスミドを含む〔２４〕。 【０３３６】アグロバクテリウム・チュメファシエンス
ＬＢ４４０４株をＭＧ／Ｌ培地〔ＶＩＩ項参照〕５ｍＬ
中の一晩培養液中３０℃の温度で培養する。ＭＧ／Ｌ培
地２５０ｍＬをこれらの５ｍＬの一晩培養液中に添加
し、そして全体のバッチを光学密度ＯＤ＝０．６（６０
０ｎｍ）が得られるまで十分に混合する。次いで細胞を
８０００×ｇでの遠心分離により集め、そしてＭＧ／Ｌ
培地５ｍＬ中に再懸濁する。この細胞懸濁液２００μＬ
をＭＧ／Ｌ培地中の二元プラスミドＤＮＡ０．２μｇな
いし１μｇと保温し、そしてゆっくり混合した後、バッ
チをすぐにドライアイス／エタノール浴中で急速冷凍す
る。５分後、試験管を３７℃の水浴中に置き、そこに５
分間放置する。ＭＧ／Ｌ培地２ｍＬを次に添加する。こ
の懸濁液を次に３０℃の水浴で２ないし３時間保温す
る。細胞を次に遠心分離により集める。細胞を少量のＭ
Ｇ／Ｌ培地に再懸濁し、次に選択培地（ゲンタマイシン
１００μｇ／ｍＬを含むＭＧ／Ｌプレート）上に置く。
最初のコロニーは３０℃で２ないし３日後に現れる。 【０３３７】実施例１７．２：アグロバクテリウム・チ
ュメファシエンスの二元ベクターでの形質転換 別の実施態様において、上の実施例１４に記載された二
元ベクターを、ｔｒａ機能を備えたプラスミドを有する
大腸菌ヘルパー株を用いて三親交雑法〔５２〕によりア
グロバクテリウム・チュメファシエンスＬＢＡ４４０４
株内に導入する。使用される大腸菌ヘルパー株は、例え
ば二元ベクターの導入に必要なｔｒａ機能を有するプラ
スミドｐＲＫ２０１３を含む大腸菌ＢＨＢ１０１１であ
ってよい。 【０３３８】アグロバクテリウム・チュメファシエンス
ＬＢＡ４４０４株はリファムピシン２０ｍｇ／Ｌおよび
ストレプトマイシン５００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地中２
８℃で一晩培養される。大腸菌ＢＨＢ１０１１および二
元ベクターを有する大腸菌株はカナマイシン２５ｍｇ／
Ｌを含むＬＢ培地中３７℃で一晩培養される。これらの
培養液各１ｍＬを８０００×ｇで遠心分離し、１ｍＬの
滅菌水または１０ｍＭＭｇＳＯ4 で洗浄し、再び遠心分
離し、そして１００μＬの水またはＭｇＳＯ4溶液中に
再懸濁する。ＬＢ固体培地を含むプレートを４区画に分
ける。これらの４区画のうちの３区画において２つの培
養液からなる３種の可能な組合せが混合されるように、
３つの細菌培養液の滴を前記区画に載せる。これらは対
照として作用する。しかしながら第４の区画では３つの
培養液全てが一緒に混合される。滴が乾燥した後、プレ
ートを２８℃で一晩保温する。次に試料を各区画から採
取し、そして水またはＭｇＳＯ4 溶液中に懸濁する。こ
れらの懸濁液の希釈物を調製し、そしてリファムピシン
２０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン５００ｍｇ／Ｌおよ
びカナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地にプレーテ
ィングし、そして約２８℃で２ないし３日培養する。高
希釈の三親ハイブリッド〔同様の希釈の対照ハイブリッ
ドでは何も増殖しない〕で増殖するコロニーは個々のコ
ロニーのプレーティングを繰り返すことにより依然とし
て存在し得る親細菌が除去される。 【０３３９】実施例１８：ニコチアナ・シルベストリス
およびニコチアナ・タバカムの葉ディスク形質転換 葉ディスク形質転換は文献〔２７〕に記載された方法に
従って実質的に行われる。アグロバクテリウム・チュメ
ファシエンスＬＢＡ４４０４株（ｐＳＣＨ１２；ｐＳＧ
Ｌ７）をリファムピシン２０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイ
シン５００ｍｇ／Ｌおよびカナマイシン２５ｍｇ／Ｌで
富化され、ｐＨ５．６に調整されたグルタミン酸塩培地
中２８℃で一晩培養する。約３．３×１０8 細胞を含有
するこの一晩培養液中で、ニコチアナ・シルベストリス
またはニコチアナ・タバカムの園芸品種ハバナ４２５の
滅菌葉ディスク（直径５ｍｍないし１０ｍｍ）が５分間
培養される。ディスクを次に培養液から除去し、滅菌ペ
ーパータオルで軽くたたいて乾燥させ、その後栄養培地
を含む直径１００ｍｍのペトリ皿に移す。 【０３４０】この栄養培地は、１％寒天（ＤＩＦＣＯ）
で固化され、そしてその他の添加剤としてｐＨ指示剤
（クロロフェノールレッド；５ｍｇ／Ｌ）および植物生
長剤カイネチン（０．３ｍｇ／Ｌ）およびα−ナフチル
酢酸（２ｍｇ／Ｌ）を含有する文献〔３３〕による基本
培地（３０ｍＬ）からなる。この寒天培地（培地Ａ）は
ニコチアナ・タバカムの園芸品種ハバナ４２５〔１２〕
の髄組織から誘導されたＳ２７５Ｎ細胞の２週令懸濁培
養液１ｍＬないし２ｍＬの層で覆われており、そしてロ
紙（Ｎｏ．１ホワットマンロ紙）で覆われている。上記
のように前処理した葉ディスクを次にロ紙上に載せる。 【０３４１】４８時間後、苗条誘導のために、同一組成
を有するがセフォタキシム３５０ｍｇ／Ｌおよびカナマ
イシン１００ｍｇ／Ｌを含有する選択培地（培地Ｂ）上
に載せ、２５℃および散光（８０ないし１００μアイン
シュタイン）中で外植片を培養する。共培養された対照
組織はカナマイシンを含まない同様の培地上に接種され
る。外植片は１週間間隔で新鮮な培地Ｂに移される。 【０３４２】４ないし８週の共培養後、外植片から発生
する未熟苗条を収穫し、そして５０ｍＬの容器中の培地
Ｃ（０．６％フィトアガーを含有する固体地）２５ｍＬ
上に移す。全体の組織を２４℃ないし２８℃の温度、８
０ないし１００μアインシュタインの光強度で培養す
る。１ないし２週間後苗条は根を形成する。 【０３４３】VI. トランスジェニック植物材料の分析 （Ａ）液胞局在の間接的証明実施例１９ ：形質転換されたプロトプラストの分析 形質転換されたプロトプラストの分析は項１７および２
０．３に詳細に記載された方法に従って行われる。 【０３４４】１９．１：キチナーゼ活性 表１の活性データからわかるように、対照プロトプラス
トは内因性キチナーゼ活性を有するけれども、わずかな
活性だけが上澄み中に示され得る。 【０３４５】これに対し、タバコキチナーゼの全ての構
築物はペレットおよび上澄みの両方に著しく高められた
全活性を示す。試験された全ての上澄み試料中のキチナ
ーゼ活性の全般的な増加は細胞の貯蔵系の過剰保持にお
そらく原因がある。しかしながら、著しい相違が見られ
る：構築物ｐＳＣＨ１０、ｐＳＣＭ２２、ｐＳＣＭ２３
およびｐＳＣＭ２４の場合、ペレット中のキチナーゼ活
性は対照のものに比べ３−４倍高い。しかしながら、ｐ
ＳＣＭ３の場合、ペレット中のキチナーゼ活性は３５％
だけ高められている。キュウリキチナーゼ構築物ｐＳＣ
Ｕ１、ｐＳＣＵ３およびｐＳＣＵ６の場合、ペレット中
のキチナーゼ活性は対照に比べて１０−２０％高いだけ
であるが、上澄み中の活性は７ないし８のファクターで
（ｐＳＣＵ３の場合は４のファクターで）高い。表１に
示された結果はウエスタンブロットの結果により確認さ
れる。キュウリキチナーゼ構築物に対するウエスタンブ
ロットデータは、例えば、ｐＳＣＵ１（野生型）の場合
にはごくわずかのキチナーゼが形質転換されたプロトプ
ラスト中に存在するだけであるのに対し、ｐＳＣＵ３お
よびｐＳＣＵ６で形質転換されたプロトプラストは非常
に高いキチナーゼ濃度を有することを明らかに示してい
る。 【０３４６】１９．２：グルカナーゼ活性 対照プロトプラストで得られた結果（表１０参照）は、
ニコチアナ・プルムバギニホリアからのβ−１，３−グ
ルカナーゼが細胞内に保持されることを示す。 【０３４７】匹敵する結果を無傷の構築物（ｐＣＩＢ１
００５Ｂ）で得ることができ、この場合、プロトプラス
ト抽出物中により強いシグナルが観察されるにすぎな
い。このことは、タバコグルカナーゼがプロトプラスト
中にも保持され、それ故に細胞の区画内に正確に方向づ
けられることを示す。 【０３４８】しかしなから、Ｃ末端範囲を欠失させる
か、不活性化させた構築物（ｐＣＩＢ１００５Ｂ６ＶＴ
Ｐ）が使用される場合、β−１，３−グルカナーゼが培
養培地中に分泌される。 【０３４９】実施例２０：形質転換された植物の分析 実施例１８に従って形質転換された植物体は以下の方法
により分析される。 【０３５０】２０．１：細胞内液（ＩＣＦ）の抽出 植物組織から細胞内液の抽出は、文献〔４６〕に記載さ
れた方法に従って行われ得る。この方法において再生さ
れたトランスジェニック植物の葉は最初に集められ、そ
して４ないし５ｃｍ2 の小片に切断され、そしてゆっく
りかきまぜながら大過剰の冷緩衝液（約４℃）に各々３
０秒間真空下で浸漬する。該緩衝液は以下の組成： ０．５Ｍショ糖を含むトリスＨＣｌ〔ｐＨ７．８〕 ２５．０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １０．０ｍＭ ＣａＣｌ2 １０．０ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ） ０．５ｍＭ ２−メルカプトエタノール ５．０ｍＭ を有することが有利である。 【０３５１】また、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．
５）を使用することも可能である。操作は室温で行われ
てもよい。 【０３５２】真空を解除すると緩衝液は葉を貫通する。
葉片を次に注意深く乾燥し、そして２０ｍＬのシリンジ
に移す。シリンジは遠心管内で懸濁され、そして低速
（約１０００×ｇ）および低温（４℃）で１０分間遠心
分離される。 【０３５３】２０．２：細胞内タンパク質画分の抽出 項２０．１に従って処理された葉片を次に同様の緩衝液
中でホモジナイズする。粗い粒子を遠心分離により除去
する。 【０３５４】２０．３：キチナーゼ活性の決定 ２つの抽出物中のタンパク質濃度はブラッドフォード法
に基づいたバイオラド・プロテイン・アッセイにより決
定される。該方法はタンパク質濃度に応じた染料の色変
化に基づいている。 【０３５５】キチナーゼ活性は放射標識（トリチウム
化）キチンを用いたバイオメトリックアッセイにより決
定され得る〔５〕。タバコキチナーゼ形質転換体に対す
る結果は表２に示されており、そしてキュウリキチナー
ゼ形質転換体に対する結果は表３に示されている。 【０３５６】要するに、プロトプラストおよび植物全体
で行われた形質転換実験の結果は、タバコからの塩基性
キチナーゼのＣ末端にある本発明に係るペプチド断片が
植物の液胞に特異的にキチナーゼを方向づけるのに関連
することを示す。さらに、ｐＳＣＭ２２、ｐＳＣＭ２３
およびｐＳＣＭ２４での結果は、Ｃ末端にあるアミノ酸
配列内のある種の変異が配列の標的性機能が結果として
消失することなしに許されることを示す。３'末端の標
的性配列が失われているならば（ｐＳＣＭ３；ｐＳＣＭ
１３）、そのときは液胞内に存在するキチナーゼの大部
分は細胞外空間に分泌される。 【０３５７】さらに、これらの結果に基づいて、本発明
に係るＤＮＡ配列が、自然に分泌されるキチナーゼタン
パク質が植物細胞、おそらくほとんどが液胞内に保持さ
れる異種遺伝子（キュウリキチナーゼ遺伝子；ｐＳＣＵ
３；ｐＳＣＵ６；ｐＳＣＵ１３）に操作可能に連結され
ている場合でも標的性シグナルとして作用することを示
すことも可能である。 【０３５８】（Ｂ）液胞局在の直接的証明実施例２１．１ ：プロトプラストの単離（文献〔４２〕
に準拠して） トランスジェニックニコチアナ・シルベストリス植物の
葉を１−１．５ｇの小片に切断し、そしてペトリ皿のＫ
３Ｍ浸透圧調整培地中に入れる。Ｋ３ＭはＫ３大量成分
の濃度の半分（すなわち、１リットルに対し、ＮａＨ2
ＰＯ4 ・Ｈ2 Ｏ７５ｍｇ、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ４５０
ｍｇ、ＫＮＯ3 １２５０ｍｇ、ＮＨ4 ＮＯ3 １２５ｍ
ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ６７ｍｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2
Ｏ１２５ｍｇ）およびマンニトール８４ｇ、ｐＨ５．６
を含有し、浸透圧は５００ｍＯｓｍに調整されている。
葉を次に細片に切断し、そして同じ浸透圧調整培地中で
１時間保温する。葉片は次に排水され、そして消化溶液
１０ｍＬ／皿中に入れる。消化溶液はＫ３Ｍ（酵素とと
もに浸透圧が再び５００ｍＯｓｍとなるようにマンニト
ール７５．６ｇを含む）中に０．４％マセロザイムＲ１
０（セルバ）および０．６％セルリシン（カルビオケ
ム）を含む。ペトリ皿をパラフィルムで密封し、そして
揺動せずに暗所２６℃で一晩保温する。消化を促進する
ために、葉片はまた２倍の酵素濃度で真空浸透され、そ
してわずかに揺動して（３０−４０ｒｐｍ）２−３時間
保温されてもよい。 【０３５９】プロトプラストを１００μｍフィルターに
通し、次いで半量の０．６Ｍショ糖ですすぐ。懸濁液を
１５ｍＬ遠心管に移し、Ｋ３Ｍ２ｍＬの層に覆い、そし
て１０００ｇで１０分間遠心分離する。プロトプラスト
を界面から吸引により除去し、Ｋ３Ｍで希釈し、そして
７００ｇで１０分間の遠心分離により除去する。遠心分
離により除去されたプロトプラストを次にＫ３Ｍ培地に
再懸濁する。 【０３６０】実施例２１．２：液胞の単離（文献〔８〕
に準拠して） ２０％フィコール含有のＫ３Ｍ培地（ｐＨ６．５）中に
プロトプラストを再懸濁する。そのうちの２．５ｍＬを
遠心管に移し、次いで以下の溶液の連続層で覆う：１５
％フィコール２ｍＬ，ＤＥＡＥデキストラン（ｐＨ６．
５）７ｍｇ；１０％フィコール２ｍＬ，硫酸デキストラ
ン（ｐＨ８．０）３ｍｇ；６％フィコール２ｍＬ，硫酸
デキストラン（ｐＨ８．５）３ｍｇ；０％フィコール
（ｐＨ８．０）約４ｍＬ（縁までいっぱいにする）。こ
の管を遠心ローター（ＳＷ４１．１４，コントロン）中
で最初に３５００ｒｐｍで１５分間、そして次に４００
００ｒｐｍで１０５分間遠心分離する。液胞を吸引によ
り０−６％フィコール界面から除去する。 【０３６１】マーカーは文献〔７〕に従って測定され
る。ヘキソースホスフェートイソメラーゼを測定するた
めに、測定を可能とするには、硫酸デキストランはＤＥ
ＡＥデキストランで沈殿されなければならない。ブラッ
ドファード法によるタンパク質の測定は、ポリ塩基がそ
の測定を妨害するので不可能である。表５の結果は液胞
マーカー酵素α−マンノシダーゼを１００％として標準
化された。 【０３６２】表４に示されたキチナーゼ比活性の比較は
表２の結果を裏づける。プラスミドｐＳＣＭ１３または
ｐＳＣＵ１１でそれぞれ形質転換された植物Ｍ１３．４
およびＵ１１．４．２の場合、キチナーゼの分泌がみら
れ、一方、プラスミドｐＳＣＨ１２またはｐＳＣＵ１３
でそれぞれ形質転換された植物Ｍ１０．４およびＵ１
３．１５の場合、細胞内局在が明らかに示されている。
ウエスタンブロットは、内因性ニコチアナ・シルベスト
リスキチナーゼが細胞内に存在し、そしてプロトプラス
トＭ１３．４の場合には主な残留活性に関連することを
裏付ける。 【０３６３】植物体Ｍ１０．７．４およびＵ１３．１５
からのプロトプラストを単離することは可能だった。種
々のマーカーの測定（表５）はＣ末端配列を有するキチ
ナーゼの液胞中の局在を裏付ける。この場合もまた、ウ
エスタンブロットはこの局在を裏付ける。内因性キチナ
ーゼは同様に液胞中に局在している。 【０３６４】１またはそれ以上の自家受粉植物の種子が
全ての系から得られた。キチナーゼ過産生および局在が
引き続く世代に受け継がれることを証明することがてき
た。 【０３６５】寄託 以下の菌株はブダペスト条約の要求に従って米国メリー
ランド州ロックヴィレにあるアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションに寄託された。 【表４】 【０３６６】培地および緩衝液 培地Ａ ＮＨ4 ＮＯ3 １６５０ｍｇ／Ｌ ＫＮＯ3 １９００ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ４４０ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ３７０ｍｇ／Ｌ ＫＨ2 ＰＯ4 １７０ｍｇ／Ｌ Ｎａ2 ＥＤＴＡ ３７．３ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２７．８ｍｇ／Ｌ Ｈ3 ＢＯ3 ６．２ｍｇ／Ｌ ＭｎＳＯ4 ・４Ｈ2 Ｏ ２２．３ｍｇ／Ｌ ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ８．６ｍｇ／Ｌ ＫＩ ０．８３ｍｇ／Ｌ Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ０．２５ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ ０．０２５ｍｇ／Ｌ ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ０．０２５ｍｇ／Ｌ ショ糖 ３０．０ｇ／Ｌ チアミンＨＣｌ ０．４００ｍｇ／Ｌ ミオイノシトール １００．０ｍｇ／Ｌ カイネチン ０．３ｍｇ／Ｌ α−ナフチル酢酸 ２．０ｍｇ／Ｌ クロロフェノールレッド ５．０ｍｇ／Ｌ 寒天 １０．０ｇ／Ｌ培地Ｂ 培地Ａと同じ組成であるが、α−ナフチル酢酸を含ま
ず、以下の追加の成分を含む。 セファタキシム ５００ｍｇ／Ｌ カナマイシン ７５ｍｇ／Ｌ培地Ｃ 培地Ｂと同じ組成であるが、カイネチンを含まない。アグロバクテリウム用のＭＧ／Ｌ培地 Ｌ−ブロス ５０％ マンニトール−グルタメート培地〔Holsters等(1978)〕 ５０％Ｋ３Ｍ浸透圧調整培地 〔５００ｍＯｓｍ；ｐＨ５．６〕 ＮａＨ2 ＰＯ4 ・Ｈ2 Ｏ ７５ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ４５０ｍｇ／Ｌ ＫＮＯ3 １２５０ｍｇ／Ｌ ＮＨ4 ＮＯ3 １２５ｍｇ／Ｌ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ６７ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １２５ｍｇ／Ｌ マンニトール ８４ｇ／ＬＷ５塩溶液 ＮａＣｌ １５４ｍＭ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ １２５ｍＭ ＫＣｌ ５ｍＭ ブドウ糖 ５ｍＭ ｐＨ５．６−６．０すすぎ溶液Ｉ ショ糖 １５４．０ｇ／Ｌ ＭＥＳ ０．５９ｇ／Ｌ ＫＮＯ3 ２５０．０ｍｇ／Ｌ ＮＨ4 ＮＯ3 ２５．０ｍｇ／Ｌ ＮａＨ2 ＰＯ4 ・Ｈ2 Ｏ １５．０ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ９０．０ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２５．０ｍｇ／Ｌ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 １３．４ｍｇ／ＬＴＥＮＰ緩衝液 トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０） １００ｍＭ ＥＤＴＡ １０ｍＭ ＮＰ−４０（シグマ・ケミカル） １％（ｖ／ｖ）ＴＢＥ緩衝液 トリス−ホウ酸塩 ８９ｍＭ ホウ酸 ８９ｍＭ ＥＤＴＡ ２ｍＭＴＥ緩衝液 トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０） １０ｍＭ ＥＤＴＡ １ｍＭＳＳＣ ＮａＣｌ １．５４ｍＭ クエン酸ナトリウム ０．１５４ｍＭ （ｐＨ７．０） 【０３６７】表 表１：ニコチアナ・プルムバギニホリアのプロトプラス
トにおける一時的発現後のキチナーゼ活性 【表５】 表２：トランスジェニック植物におけるタバコキチナー
ゼ活性 【表６】 表３：トランスジェニック植物におけるキュウリキチナ
ーゼ活性 【表７】表４：トランスジェニック植物のプロトプラストにおけ
るキチナーゼ活性 【表８】 表５：キチナーゼ過産生植物からの液胞調製物における
細胞内マーカーの局在 【表９】 ａ：酵素に対してｐｃａｔ，葉緑素に対してμｇ ｂ：α−マンノシダーゼ１００％に対して標準化された
値 表６：自家受粉されたトランスジェニック植物の第１世
代におけるカナマイシン耐性の分離（３ＫａｎＲ：１Ｋ
ａｎＳが期待される） 【表１０】表７：トランスジェニック植物の後代の分析（ＫａｎＲ
植物だけが試験された） ホモジナイズされた葉中の濃度 【表１１】 表８：トランスジェニック植物の後代の分析（ＫａｎＲ
植物だけが試験された） ホモジナイズされた葉中の濃度 【表１２】 キチナーゼ活性はタバコキチナーゼに対する免疫グロブ
リンの存在下で測定された。 表９：トランスジェニックＦ１植物におけるキュウリキ
チナーゼ活性 【表１３】表１０：ニコチアナ・プルムバギニホリアのプロトプラ
ストにおける35Ｓ標識された成熟β−１，３−グルカナ
ーゼの活性 【表１４】 【０３６８】参考文献一覧 【表１５】【表１６】【表１７】【配列表】 【０３６９】 配列番号：１ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸（および相当するアミノ酸） 配列の種類：遺伝コードの縮重に基づいて作成されたハイポセティカル配列 特性：液胞内への結合タンパク質分子の局在に関連するシグナルペプチドをコー ドする 配列 CGN/AGR TCN/AGW TTY GGN AAY GGN CTN/TTR TTR/CTN GTN GAY ACN ATG TAA Arg Ser Phe Gly Asn Gly Leu Leu Val Asp Thr Met End 【０３７０】 配列番号：２ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸（および相当するアミノ酸） 配列の種類：ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ 起源 生物名：ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum) 直接の起源 クローン名：ｐＣＨＮ４８ 特性：液胞内への結合タンパク質分子の局在に関連するシグナルペプチドをコー ドする 配列 AGG TCT TTT GGA AAT GGA CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA Arg Ser Phe Gly Asn Gly Leu Leu Val Asp Thr Met End 【０３７１】 配列番号：３ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸（および相当するアミノ酸） 配列の種類：ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ（オリゴヌクレオチド仲介突然変異誘発に より突然変異させた） 起源 生物名：ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum) 直接の起源 クローン名：ｐＣＨＮ４８ 特性：液胞内への結合タンパク質分子の局在に関連するシグナルペプチドをコー ドする 配列 AGG TCT TTT GGA AAA GAT CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA Arg Ser Phe Gly Lys Asp Leu Leu Val Asp Thr Met End 【０３７２】 配列番号：４ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸（および相当するアミノ酸） 配列の種類：ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ（オリゴヌクレオチド仲介突然変異誘発に より突然変異させた） 起源 生物名：ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum) 直接の起源 クローン名：ｐＣＨＮ４８ 特性：液胞内への結合タンパク質分子の局在に関連するシグナルペプチドをコー ドする 配列 AGG TCT TTT GGA AAT GGA CTT TTA GTC AAT ACT ATG TAA Arg Ser Phe Gly Asn Gly Leu Leu Val Asn Thr Met End 【０３７３】 配列番号：５ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸（および相当するアミノ酸） 配列の種類：ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ（オリゴヌクレオチド仲介突然変異誘発に より突然変異させた） 起源 生物名：ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum) 直接の起源 クローン名：ｐＣＨＮ４８ 特性：液胞内への結合タンパク質分子の局在に関連するシグナルペプチドをコー ドする 配列 AGG TCT TTT GGA AAT GGA CTT TTA GTC CGT ACT ATG TAA Arg Ser Phe Gly Asn Gly Leu Leu Val Arg Thr Met End 【０３７４】 配列番号：６ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸（および相当するアミノ酸） 配列の種類：ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ（オリゴヌクレオチド仲介突然変異誘発に より突然変異させた） 起源 生物名：ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum) 直接の起源 クローン名：ｐＣＨＮ４８ 特性：液胞内への結合タンパク質分子の局在に関連するシグナルペプチドをコー ドする 配列 A/T GAT CTT TTG GGA AAT GGA CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA Asp Leu Leu Gly Asn Gly Leu Leu Val Asp Thr Met End 【０３７５】配列番号：７ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸（および相当するアミノ酸） 配列の種類：ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ（オリゴヌクレオ
チド仲介突然変異誘発により突然変異させた） 起源 生物名：ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum) ／
キュウリ 直接の起源 クローン名：ｐＣＨＮ４８／ｐＢＳＣｕｃＣｈｔ５ 特性：液胞内への結合タンパク質分子の局在に関連する
シグナルペプチドをコードする 配列 ATC GGT GAT CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA Ile Gly Asp Leu Leu Val Asp Thr Met End 【０３７６】配列番号：８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸（および相当するアミノ酸） 配列の種類：ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ（配列番号：２に
示された配列の断片） 起源 生物名：ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum) 直接の起源 クローン名：ｐＣＨＮ４８ 特性：液胞内への結合タンパク質分子の局在に関連する
シグナルペプチドをコードする 配列 CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA Leu Leu Val Asp Thr Met End 【０３７７】配列番号：９ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸（および相当するアミノ酸） 配列の種類：ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ（配列番号：２に
示された配列の断片） 起源 生物名：ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum) 直接の起源 クローン名：ｐＣＨＮ４８ 特性：液胞内への結合タンパク質分子の局在に関連する
シグナルペプチドをコードする 配列 GGA CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA Gly Leu Leu Val Asp Thr Met End 【０３７８】配列番号：１０ 配列の長さ：３８５０ 配列の型：核酸（および相当するアミノ酸） 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ニコチアナ・タバカムの園芸品種ハバナ４２５
(Nicotiana tabacum L. c.v. Havana 425) 直接の起源 クローン名：ｌＣＨＮ１７（ｌファージ） 特性：塩基性キチナーゼ遺伝子 配列 【表１８】【表１９】 【表２０】 【表２１】【表２２】 【０３７９】配列番号：１１ 配列の長さ：１１０３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：ＴＮＶに感染したキュウリの葉 直接の起源 クローン名：ｐＢＳＣｕｃＣｈｔ５〔ＡＴＣＣ４０５２
８〕 特性：酸性キチナーゼ遺伝子 配列 【表２３】 【表２４】 【０３８０】 配列番号：１２ 配列の長さ：６９ 配列の型：核酸（および相当するアミノ酸） 配列の種類：ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ 起源 生物名：ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum) 直接の起源 クローン名：ｐＢＳ−Ｇｌｕｃ３９．１〔ＡＴＣＣ４０５２６；ＥＰ−Ａ０３ ３２１０４に記載〕 特性：液胞内への結合タンパク質分子の局在に関連するシグナルペプチドをコー ドする 配列 GTC TCT GGT GGA GTT TGG GAC AGT TCA GTT GAA ACT AAT GCT ACT GCT TCT CTC Val Ser Gly Gly Val Trp Asp Ser Ser Val Glu Thr Asn Ala Th Ala Ser Leu GTA AGT GAG ATG TGA Val Ser Glu Met End
【図面の簡単な説明】 【図１】フ゜ラスミト゛ｐＣＩＢ２００の遺伝子地図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 イエンーマルク ノイハウス スイス国 4054 バーゼル ゲッシエネン シュトラーセ 28 (72)発明者 ジョン ライアルズ アメリカ合衆国 ノースカロライナ 27713 ダーラム サンダーリング コー ト 14 Ｆターム(参考） 4B024 AA08 BA12 CA04 DA01 DA05 EA04 FA18 GA11 HA12

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 標的性配列を本来含み、そしてそれ故に
    植物液胞内に通常方向づけられる植物タンパク質を細胞
    外空間に送り出す方法であって、以下の工程： （ａ）上記タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離
    し、（ｂ）特定の細胞区画への方向づけに関連するＣ末
    端にある標的性配列を読み枠から除去し、（ｃ）上記の
    変異させたＤＮＡ配列を適当な植物発現ベクター中にス
    プライシングし、そして（ｄ）生成した構築物を植物宿
    主内に形質転換する、ことから実質的になる上記方法。
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TR (1) TR27970A (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007522824A (ja) * 2004-02-24 2007-08-16 プロタリクス リミテッド 細胞／組織培養デバイス、システム、および方法
WO2009004842A1 (ja) * 2007-07-03 2009-01-08 Idemitsu Kosan Co., Ltd. ブタ浮腫病ワクチン
US8227230B2 (en) 2003-04-27 2012-07-24 Protalix Ltd. Human lysosomal proteins from plant cell culture
US10364413B2 (en) 2007-05-07 2019-07-30 Protalix Ltd. Large scale disposable bioreactor

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0418695A1 (de) * 1989-09-13 1991-03-27 Ciba-Geigy Ag Regulatorische DNA-Sequenz
DE4004800C2 (de) * 1990-02-13 2000-12-21 Aventis Cropscience Gmbh Im Habitus und Ertrag veränderte transgene Pflanzen
US6020540A (en) * 1993-04-14 2000-02-01 Cornell Research Foundation, Inc. Gene encoding endochitinase
US6512166B1 (en) 1991-06-17 2003-01-28 Cornell Research Foundation, Inc. Combinations of fungal cell wall degrading enzyme and fungal cell membrane affecting compound
FR2748480B1 (fr) * 1996-05-09 1998-09-04 Biocem Plantes transgeniques exprimant la glycoproteine g de la rage, et glycoproteines ainsi obtenues
IL155588A0 (en) * 2003-04-27 2003-11-23 Metabogal Ltd Methods for expression of enzymatically active recombinant lysosomal enzymes in transgenic plant root cells and vectors used thereby
CA2335093A1 (en) * 1998-07-15 2000-01-27 The Horticulture And Food Research Institute Of New Zealand Limited Chimeric polypeptides allowing expression of plant-noxious proteins
US6534265B1 (en) * 1999-02-16 2003-03-18 New Mexico State University Technology Transfer Corporation Oryzacystatin-I applications and methods
DE60233395D1 (de) * 2001-04-18 2009-10-01 Valtion Teknillinen Die verwendung von abc transporter kodierenden genen zur stimulierung der herstellung von sekundärmetaboliten in biologischen zellen
US20030100945A1 (en) 2001-11-23 2003-05-29 Mindguard Ltd. Implantable intraluminal device and method of using same in treating aneurysms
US20100196345A1 (en) * 2003-04-27 2010-08-05 Protalix Production of high mannose proteins in plant culture
US9551003B2 (en) * 2006-09-13 2017-01-24 22Nd Century Limited, Llc Increasing levels of nicotinic alkaloids in plants
CA2749356A1 (en) * 2009-02-06 2010-09-12 Syngenta Participations Ag Modification of multidomain enzyme for expression in plants
JP6617694B2 (ja) * 2016-12-12 2019-12-11 株式会社豊田中央研究所 植物体におけるゲノムシャッフリングのためのポリペプチド及びその利用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3711776A1 (de) * 1987-04-08 1988-10-27 Huels Chemische Werke Ag Verwendung von n-polyhydroxyalkylfettsaeureamiden als verdickungsmittel fuer fluessige waessrige tensidsysteme
EP0351924A3 (en) * 1988-07-20 1991-04-03 Nickerson Seeds Limited Improvements relating to transgenic plants
CA1340685C (en) * 1988-07-29 1999-07-27 Frederick Meins Dna sequences encoding polypeptides having beta-1,3-glucanase activity
WO1990007001A1 (en) * 1988-12-16 1990-06-28 E.I. Du Pont De Nemours And Company Overexpression of chitinase in transgenic plants
ES2199931T3 (es) * 1989-03-24 2004-03-01 Syngenta Participations Ag Plantas transgenicas resistentes a enfermedades.
US5360726A (en) * 1989-09-12 1994-11-01 Board Of Trustees Operating Michigan State University Polypeptides enabling sorting of proteins to vacuoles in plants
EP0418695A1 (de) * 1989-09-13 1991-03-27 Ciba-Geigy Ag Regulatorische DNA-Sequenz
IL97020A (en) * 1990-01-30 2000-12-06 Mogen Int Recombinant polynucleotides comprising a chitinase gene and a glucanase gene
DE4004800C2 (de) * 1990-02-13 2000-12-21 Aventis Cropscience Gmbh Im Habitus und Ertrag veränderte transgene Pflanzen
JPH03246265A (ja) * 1990-02-22 1991-11-01 Kao Corp 脂肪酸アミドの製造方法
PH30997A (en) * 1990-03-12 1997-12-23 Ciba Geigy Antipathologenically effective compositions comprising lytic peptides and hydrolytic enzymes.
CA2064752A1 (en) * 1990-06-07 1991-12-12 Charles P. Woloshuk Antifungal preparations, process for making such preparations, process for obtaining plants with decreased susceptibility to fungi
FI941056L (fi) * 1991-09-06 1994-05-03 Procter & Gamble Kalsiumia ja polyhydroksirasvahappoamidia sisältäviä pesuainekoostumuksia

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8227230B2 (en) 2003-04-27 2012-07-24 Protalix Ltd. Human lysosomal proteins from plant cell culture
US8449876B2 (en) 2003-04-27 2013-05-28 Protalix Ltd. Human lysosomal proteins from plant cell culture
US8790641B2 (en) 2003-04-27 2014-07-29 Protalix Ltd. Production of high mannose proteins in plant culture and therapeutic uses thereof
US9220737B2 (en) 2003-04-27 2015-12-29 Protalix Ltd. Plant cell culture expressing human lysosomal proteins and uses thereof
JP2007522824A (ja) * 2004-02-24 2007-08-16 プロタリクス リミテッド 細胞／組織培養デバイス、システム、および方法
US10364413B2 (en) 2007-05-07 2019-07-30 Protalix Ltd. Large scale disposable bioreactor
WO2009004842A1 (ja) * 2007-07-03 2009-01-08 Idemitsu Kosan Co., Ltd. ブタ浮腫病ワクチン
JP5279089B2 (ja) * 2007-07-03 2013-09-04 出光興産株式会社 ブタ浮腫病ワクチン
US9080180B2 (en) 2007-07-03 2015-07-14 Idemitsu Kosan Co., Ltd. Transgenic plants expressing STX2EB protein for use as a pig edema disease vaccine

Also Published As

Publication number Publication date
HU911994D0 (en) 1991-12-30
AU653526B2 (en) 1994-10-06
NZ238533A (en) 1993-09-27
CA2044476A1 (en) 1991-12-16
PT97965B (pt) 2004-02-27
IE912039A1 (en) 1991-12-18
US6054637A (en) 2000-04-25
DE59109267D1 (de) 2005-04-07
JPH04229182A (ja) 1992-08-18
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