JP2003169668A - Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 エシェリヒア属細菌においてシステインデス
ルフヒドラーゼ活性を担う酵素及びその遺伝子を明らか
にし、同遺伝子をＬ−システイン生産菌の育種に利用
し、新たなＬ−システインの製造法を提供する。 【解決手段】 Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、シ
スタチオニン−β−リアーゼ活性、又はシスタチオニン
−β−リアーゼ活性及びトリプトファナーゼ活性が低下
又は欠失したエシェリヒア属細菌を培地で培養し、Ｌ−
システインを培地中に生成蓄積させ、該培地よりＬ−シ
ステインを採取することにより、Ｌ−システインを製造
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｌ−システインの
製造法に関し、詳しくはＬ−システインの製造に好適な
微生物、及びそれを用いたＬ−システインの製造法に関
する。Ｌ−システイン及びＬ−システインの誘導体は、
医薬品、化粧品及び食品分野で利用されている。

【０００２】

【従来の技術】従来、Ｌ−システインは、毛髪、角、羽
毛等のケラチン含有物質から抽出することにより、ある
いはＤＬ−２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸を前
駆体とする微生物酵素変換により得られている。また、
新規な酵素を用いた固定化酵素法によるＬ−システイン
の大量生産も計画されている。

【０００３】さらに、微生物を用いた発酵法によるＬ−
システインの生産も試みられている。例えば、本発明者
らは、Ｌ−システイン分解系が抑制され、かつ、Ｌ−シ
ステインによるフィードバック阻害が低減されたセリン
アセチルトランスフェラーゼ（serine acetyltransfera
se（EC 2.3.1.30）：以下、「SAT」ともいう）を保持す
るエシェリヒア属細菌を用いたＬ−システインの製造法
を開示している（特許文献１）。Ｌ−システイン分解系
を抑制する手段としては、細胞中のシステインデスルフ
ヒドラーゼ（以下、「CD」ともいう）活性を低下させる
ことが開示されている。同様に、Ｌ−システインによる
フィードバック阻害が低減された特定の変異を有するSA
TをコードするＤＮＡ配列により脱制御されたシステイ
ン物質代謝を有する微生物を用いた、Ｌ−システインの
製造法が知られている（特許文献２）。

【０００４】また、非特許文献１には、Ｌ−システイン
によるフィードバック阻害を受けないシロイヌナズナ由
来のSATアイソザイムをコードする遺伝子を導入したエ
シェリヒア・コリを用いたＬ−システインの製造法が開
示されている。

【０００５】一方、抗生物質又は微生物に毒性の物質を
細胞から直接放出するために好適である蛋白質をコード
する遺伝子を過剰発現する微生物を用いたＬ−システイ
ンの製造法が報告されている（特許文献３）。

【０００６】上記のように、SAT等のＬ−システイン生
合成酵素の活性の増強、及び、Ｌ−システイン排出系を
改変したＬ−システイン生産菌に関し、多くの研究がな
されている。それに対し、Ｌ−システイン分解系につい
ては、特にエシェリヒア属細菌においては、詳細な検討
がなされていない。

【０００７】エシェリヒア・コリにおいて多少なりとも
CD活性をもつ酵素として、シスタチオニン−β−リアー
ゼ（metC産物。以下、「CBL」ともいう）（非特許文献
２）、及びトリプトファナーゼ（tnaA産物。以下、「TN
ase」ともいう）（非特許文献３）が報告されている。
しかし、CBLはシスタチオニンをホモシステインに変換
する反応を、TNaseはトリプトファンを分解する反応を
それぞれ触媒する酵素であるとされており、実質的にＬ
−システイン分解系を担う酵素であるか否かについては
知られていなかった。また、特許文献１には、CD活性が
低下した変異株が記載されているが、CD活性を担う酵素
の本体に関しては報告されていない。

【０００８】

【特許文献１】特開平11-155571号

【特許文献２】特表2000-504926号

【特許文献３】特開平11-56381号

【非特許文献１】FEMS Microbiol. Lett., 179 (1999)
453-459

【非特許文献２】Chandra et. al., Biochemistry, 21
(1982) 3064-3069

【非特許文献３】Austin Newton et. al., J. Biol. Ch
em. 240 (1965) 1211-1218

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、CD活性を担
う酵素及びその遺伝子を明らかにし、同遺伝子をＬ−シ
ステイン生産菌の育種に利用し、新たなＬ−システイン
の製造法を提供することを課題とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意検討を行った結果、CBL及びTNaseがエ
シェリヒア・コリの主要なCD活性を担う酵素であること
を見出し、これらの酵素活性を低下又は消失させること
により、Ｌ−システイン生産能を向上させることができ
ることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわ
ち本発明は、以下のとおりである。

【００１１】（１）Ｌ−システイン生産能を有し、か
つ、シスタチオニン−β−リアーゼ活性が低下又は欠失
するように改変されたエシェリヒア属細菌。 （２）Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、シスシスタ
チオニン−β−リアーゼ活性及びトリプトファナーゼ活
性が低下又は欠失するように改変されたエシェリヒア属
細菌。 （３）シスタチオニン−β−リアーゼをコードする遺伝
子が破壊された(1)のエシェリヒア属細菌。 （４）シスシスタチオニン−β−リアーゼをコードする
遺伝子及びトリプトファナーゼをコードする遺伝子が破
壊された(2)のエシェリヒア属細菌。 （５）さらにＬ−システイン生合成系酵素活性が増強さ
れるように改変された(1)〜(4)のいずれかのエシェリヒ
ア属細菌。 （６）セリンアセチルトランスフェラーゼが増強される
ように改変された(5)のエシェリヒア属細菌。 （７）Ｌ−システインによるフィードバック阻害に非感
受性のセリンアセチルトランスフェラーゼを保持する
(6)のエシェリヒア属細菌。 （８）エシェリヒア・コリである(1)〜(7)のいずれかの
エシェリヒア属細菌。 （９）(1)〜(8)のいずれかのエシェリヒア属細菌を培地
で培養し、Ｌ−システインを培地中に生成蓄積させ、該
培地よりＬ−システインを採取する、Ｌ−システインの
製造法。 （１０）エシェリヒア属細菌のシスシスタチオニン−β
−リアーゼ活性もしくはトリプトファナーゼ活性、又は
これらの両方の活性を低下又は消失させることによっ
て、同細菌のＬ−システイン生産能を高めることを特徴
とする、Ｌ−システイン生産菌の製造方法。

【００１２】本発明においてＬ−システイン生産能と
は、本発明のエシェリヒア属細菌を培地に培養したとき
に、培地から回収することができる量のＬ−システイン
を培地中に蓄積する能力をいう。また、「Ｌ−システイ
ンによるフィードバック阻害に非感受性」とは、Ｌ−シ
ステインによるフィードバック阻害が低減又は解除され
た場合に加えて、元来フィードバック阻害を受けない場
合を含む。尚、本発明においてＬ−システインとは、特
記しない限り、還元型Ｌ−システインもしくはＬ−シス
チンまたはこれらの混合物を指す。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明のエシェリヒア属細菌の第
一の形態は、Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、CBL
活性が低下又は欠失するように改変されたエシェリヒア
属細菌である。本発明のエシェリヒア属細菌の第二の形
態は、Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、CBL活性及
びTNase活性が低下又は欠失するように改変されたエシ
ェリヒア属細菌である。また、本発明のエシェリヒア属
細菌は、前記第一の形態又は第二の形態において、さら
にＬ−システイン生合成系酵素活性が増強されるように
改変されたエシェリヒア属細菌である。このようなエシ
ェリヒア属細菌は、CBL活性、又はCBL活性及びTNase活
性が低下又は欠失したエシェリヒア属細菌において、Ｌ
−システイン生合成系酵素活性を増強することによって
得られる。また、Ｌ−システイン生合成系酵素活性を増
強したエシェリヒア属細菌において、CBL活性、又はCBL
活性及びTNase活性を低下又は欠失させることによって
も、本発明のエシェリヒア属細菌を取得することができ
る。

【００１４】＜１＞CBL活性又はTNase活性の低下又は消
失 エシェリヒア属細菌のCBL活性又はTNase活性を低下又は
消失させるには、例えば、エシェリヒア属細菌を紫外線
照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニ
ジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いら
れている変異剤によって処理し、CBL活性又はTNase活性
が低下した変異株を選択する方法が挙げられる。また、
CBL活性又はTNase活性が低下したエシェリヒア属細菌
は、変異処理の他に、遺伝子破壊によっても取得するこ
とができる。CBL活性又はTNase活性を確実に低下又は消
失させるためには、遺伝子破壊による方法が好ましい。
エシェリヒア・コリでは、CBLはmetC遺伝子、TNaseはtn
aA遺伝子によってそれぞれコードされている。

【００１５】エシェリヒア・コリのmetC遺伝子（GenBan
k accession M12858、Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A. 8
3, 867-871 (1986)）及びtnaA遺伝子（GenBank accessi
onK00032、J. Bacteriol. 147, 787-796 (1981)、J. Ba
cteriol. 151, 942-951 (1982)）の塩基配列は報告され
ており、それぞれの配列の基づいて合成したプライマー
を用い、エシェリヒア・コリ染色体ＤＮＡを鋳型とする
PCR（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. e
t al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、
各々の遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得することができ
る。また、CBLをコードする遺伝子の内部を欠失し、正
常に機能するCBLを産生しないように改変したmetC遺伝
子（欠失型metC遺伝子）、及びTNaseをコードする遺伝
子の内部を欠失し、正常に機能するTNaseを産生しない
ように改変したtnaA遺伝子（欠失型tnaA遺伝子）は、実
施例に示したプライマーを用いたPCRにより取得するこ
とができる。参考として、metC遺伝子の塩基配列及びコ
ードされるアミノ酸配列を、配列番号１０及び１１に示
す。また、tnaA遺伝子の塩基配列及びコードされるアミ
ノ酸配列を、配列番号１２及び１３に示す。

【００１６】以下に、CBLをコードする遺伝子を破壊す
る方法を説明するが、同様にしてTNaseをコードする遺
伝子を破壊することができる。CBLをコードする遺伝子
の内部を欠失し、正常に機能するCBLを産生しないよう
に改変したmetC遺伝子（欠失型metC遺伝子）を含むＤＮ
Ａでエシェリヒア属細菌を形質転換し、欠失型metC遺伝
子と染色体上のmetC遺伝子との間で組換えを起こさせる
ことにより、染色体上のmetC遺伝子を破壊することがで
きる。このような相同組換えを利用した遺伝子置換によ
る遺伝子破壊は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる
方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方
法などがある。

【００１７】欠失型metC遺伝子を、宿主染色体上のmetC
遺伝子と置換するには、例えば以下のようにすればよ
い。温度感受性複製起点と、欠失型metC遺伝子と、アン
ピシリン又はクロラムフェニコール等の薬剤に耐性を示
すマーカー遺伝子とをベクターに挿入して組換えＤＮＡ
を調製し、この組換えＤＮＡでエシェリヒア属細菌を形
質転換し、温度感受性複製起点が機能しない温度で形質
転換株を培養し、続いてこれを薬剤を含む培地で培養す
ることにより、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込ま
れた形質転換株が得られる。

【００１８】こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込ま
れた株は、染色体上にもともと存在するmetC遺伝子配列
との組換えを起こし、染色体metC遺伝子と欠失型metC遺
伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベ
クター部分、温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカ
ー）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。したがっ
て、この状態では正常なmetC遺伝子が優性であるので、
形質転換株は正常なmetCを発現する。

【００１９】次に、染色体ＤＮＡ上に欠失型metC遺伝子
のみを残すために、２個のmetC遺伝子の組換えにより１
コピーのmetC遺伝子を、ベクター部分（温度感受性複製
起点及び薬剤耐性マーカーを含む）とともに染色体ＤＮ
Ａから脱落させる。その際、正常なmetC遺伝子が染色体
ＤＮＡ上に残され、欠失型metC遺伝子が切り出される場
合と、反対に欠失型metC遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残さ
れ、正常なmetC遺伝子が切り出される場合がある。いず
れの場合も、温度感受性複製起点が機能する温度で培養
すれば、切り出されたＤＮＡはプラスミド状で細胞内に
保持される。次に、温度感受性複製起点が機能しない温
度で培養すると、プラスミド上のmetC遺伝子は、プラス
ミドとともに細胞から脱落する。そして、PCRまたはサ
ザンハイブリダイゼーション等により、染色体上に欠失
型metC遺伝子が残った株を選択することによって、metC
遺伝子が破壊された株を取得することができる。

【００２０】遺伝子破壊株又は変異株のCBL活性が低下
又は消失していることは、候補株の菌体抽出液につい
て、Guggenheim,S.の方法（Methods Enzymol., 17, 439
-442 (1971）の方法等によりCBL活性を測定し、親株のC
BL活性と比較することにより確認することができる。

【００２１】エシェリヒア・コリ用の温度感受性複製起
点を含むプラスミドとしては、例えばpMAN031（Yasued
a, H. et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 36, 211
(1991)）、pMAN997（WO 99/03988号）、及びpEL3（K.
A. Armstrong et. al., J. Mol. Biol. (1984) 175, 33
1-347）が挙げられる。

【００２２】上記と同様にして、tnaA遺伝子破壊株を取
得することができる。tnaA遺伝子破壊株又は変異株のTN
ase活性が低下又は消失していることは、候補株の菌体
抽出液について、Newton, W. A. らの方法（J. Biol. C
hem., 240, 1211-1218 (1965)）の方法等によりTNase活
性を測定し、親株のTNase活性と比較することにより確
認することができる。遺伝子破壊に用いる欠失型metC遺
伝子及び欠失型tnaA遺伝子は、目的とするエシェリヒア
属細菌の染色体ＤＮＡ上のmetC遺伝子及びtnaA遺伝子と
相同組換えを起こす程度の相同性を有していればよい。
このような相同性は、好ましくは７０％以上、より好ま
しくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上である。
また、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得
るＤＮＡ同士であれば、相同組換えは起こり得る。

【００２３】＜２＞SAT活性の増強 エシェリヒア属細菌細胞内のSAT活性の増強は、SATをコ
ードする遺伝子のコピー数を高めることによって達成さ
れる。例えば、SATをコードする遺伝子断片を、エシェ
リヒア属細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコ
ピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これ
を宿主エシェリヒア属細菌に導入して形質転換すればよ
い。

【００２４】SAT遺伝子は、エシェリヒア属細菌由来の
遺伝子および他の生物由来の遺伝子のいずれも使用する
ことができる。エシェリヒア・コリのSATをコードする
遺伝子として、cysEが野生株及びＬ−システイン分泌変
異株よりクローニングされ、塩基配列が明らかになって
いる（Denk, D. and Boeck, A., J. General Microbio
l., 133, 515-525 (1987)）。したがって、その塩基配
列に基づいて作製したプライマーを用いて、エシェリヒ
ア属細菌の染色体DNAを鋳型とするPCRによって、SAT遺
伝子を取得することができる（特開平11-155571号参
照）。他の生物のSATをコードする遺伝子も、同様にし
て取得され得る。参考として、配列番号１４及び１５
に、報告されている野生型cysEの塩基配列及びコードさ
れるSATのアミノ酸配列（Denk, D. and Bock, A., J. g
eneral Microbiol., 133, 515-525 (1987)）を示す。SA
T遺伝子としては、野生型SAT遺伝子の他に、アセチル−
ＣｏＡによるＬ−セリンの活性化を触媒する活性を実質
的に損なわないような１若しくは数個のアミノ酸残基の
置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列
を有するものであってもよい。ここで、「数個」とは、
アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種
類によっても異なるが、好ましくは２から５０個、より
好ましくは２から４０個、特に好ましくは２から３０個
である。

【００２５】上記のようなSATと実質的に同一のタンパ
ク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号１４の塩基
番号２２３〜１０４７からなる塩基配列又は同塩基配列
から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下
でハイブリダイズし、かつSATと同様の活性を有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。「ストリン
ジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッド
が形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条
件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であ
るが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば
５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイ
ズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイ
ズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼー
ションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１
％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤ
Ｓに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げら
れる。

【００２６】染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌
から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miu
ra, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工
学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、
１９９２年参照）等により調製することができる。

【００２７】PCR法により増幅されたSAT遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片をエシェリヒア属細菌に導入するには、通常の
タンパク質発現に用いられる種々のベクターを用いるこ
とができる。このようなベクターとしては、pUC19、pUC
18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pA
CYC184, pMW219等が挙げられる。

【００２８】SAT遺伝子を含む組換えベクターをエシェ
リヒア属細菌に導入するには、D.A.Morrisonの方法（Me
thods in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは受容菌
細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す
方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(197
0)）等、エシェリヒア属細菌の形質転換に通常用いられ
ている方法により行うことができる。

【００２９】SAT遺伝子のコピー数を高めることは、SAT
遺伝子をエシェリヒア属細菌の染色体DNA上に多コピー
存在させることによっても達成できる。エシェリヒア属
細菌の染色体DNA上にSAT遺伝子を多コピーで導入するに
は、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用
して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存
在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の
端部に存在するインバーテッド・リピートが利用でき
る。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されている
ように、SAT遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを
転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能
である。

【００３０】SAT活性の増強は、上記の遺伝子増幅によ
る以外に、染色体DNA上またはプラスミド上のSAT遺伝子
のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換す
ることによっても達成される（特開平1-215280号公報参
照）。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、tr
cプロモーター等が強力なプロモーターとして知られて
いる。発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラス
ミドを用いた遺伝子置換によっても行うことができる。

【００３１】また、国際公開WO00/18935に開示されてい
るように、SAT遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩
基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能
である。これらのプロモーター置換または改変によりSA
T遺伝子の発現が増強され、SAT活性が増強される。これ
ら発現調節配列の改変は、SAT遺伝子のコピー数を高め
ることと組み合わせてもよい。

【００３２】さらに、SAT遺伝子の発現に抑制機構が存
在する場合には、抑制が解除又は低減されるように、発
現調節配列又は抑制に関与する遺伝子を改変することに
よっても、SAT遺伝子の発現を増強することができる。

【００３３】エシェリヒア属細菌細胞内のSAT活性は、
Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減又は解
除されたSAT（以下、「変異型SAT」ともいう）をエシェ
リヒア属細菌に保持させることによっても、上昇させる
ことができる。変異型SATとしては、野生型SATの２５６
位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基をリジン残
基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基に置換する変
異、又は２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸
残基からＣ末端側の領域を欠失させる変異を有するSAT
が挙げられる。前記リジン残基及びロイシン残基以外の
アミノ酸残基としては、通常のタンパク質を構成するア
ミノ酸のうち、メチオニン残基、リジン残基及びロイシ
ン残基を除く１７種類のアミノ酸残基が挙げられる。よ
り具体的にはイソロイシン残基が挙げられる。野生型SA
T遺伝子に所望の変異を導入する方法としては、部位特
異的変異が挙げられる。変異型SAT遺伝子としては、エ
シェリヒア・コリの変異型SATをコードする変異型cysE
が知られている（WO 97/15673号国際公開パンフレッ
ト、特開平11-155571号参照）。２５６位のメチオニン
残基をグルタミン酸残基に置換した変異型SATをコード
する変異型cysEを含むプラスミドpCEM256Eを保持するエ
シェリヒア・コリJM39-8株（E. coli JM39-8(pCEM256
E)、プライベートナンバー：AJ13391）は、平成９年11
月20日より工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独
立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ
ー、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地
１中央第６）に、FERM P-16527の受託番号のもとで寄託
され、2002年７月８日にブダペスト条約に基づく国際寄
託に移管され、受託番号FERM BP-8112が付与されてい
る。

【００３４】また、シロイヌナズナのSATは、Ｌ−シス
テインによるフィードバック阻害を受けないことが知ら
れており、本発明に好適に用いることができる。シロイ
ヌナズナ由来のSAT遺伝子含有プラスミドとして、pEAS-
m（FEMS Microbiol. Lett.,179 (1999) 453-459）が知
られている。

【００３５】変異型SATとしては、上記のＬ−システイ
ンによるフィードバック阻害を低減する変異に加えて、
アセチル−ＣｏＡによるＬ−セリンの活性化を触媒する
活性を実質的に損なわないような１若しくは数個のアミ
ノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むア
ミノ酸配列を有するものであってもよい。そのような変
異を有するSATにおいては、２５６位のメチオニン残基
の位置が変わっている場合もあるが、そのような場合で
あっても、２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ
酸残基をリジン残基及びロイシン残基以外のアミノ酸残
基に置換することによって、Ｌ−システインによるフィ
ードバック阻害が低減した変異型SATが取得され得る。

【００３６】また、エシェリヒア属細菌に変異型SATを
保持させるには、細胞内のSAT遺伝子に、コードされるS
ATのＬ−システインによるフィードバック阻害が解除さ
れるような変異を導入することによって行うことができ
る。変異の導入は、紫外線照射またはN−メチル−N'−
ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸
等の通常の突然変異に用いられている変異剤による処理
によって行うことができる。

【００３７】＜３＞Ｌ−システインの生産 上記のようにして得られる本発明のエシェリヒア属細菌
を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−システインを
生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−システインを採取す
ることにより、Ｌ−システインを効率よく、かつ、安定
に製造することができる。尚、本発明の方法により製造
されるＬ−システインには、還元型のシステインに加え
てシスチンも含まれる場合があるが、本発明の製造法の
対象物にはシスチン又は還元型のシステイン及びシスチ
ンの混合物も含まれる。

【００３８】使用する培地としては、炭素源、窒素源、
イオウ源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分
を含有する通常の培地が挙げられる。炭素源としては、
グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜やでん
ぷんの加水分解物などの糖類、フマール酸、クエン酸、
コハク酸等の有機酸類を用いることができる。

【００３９】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガ
ス、アンモニア水等を用いることができる。

【００４０】イオウ源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、硫
化物、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩等の無機硫黄化合物が挙
げられる、有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１など
の要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが
望ましい。これらの他に、必要に応じてリン酸カリウ
ム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が
少量添加される。

【００４１】培養は好気的条件下で30〜90時間実施する
のがよく、培養温度は２５℃〜３７℃に、培養中ｐＨは
５〜８に制御することが好ましい。尚、ｐＨ調整には無
機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にア
ンモニアガス等を使用することができる。培養物からの
Ｌ−システインの採取は通常のイオン交換樹脂法、沈澱
法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施で
きる。

【００４２】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。

【００４３】＜１＞エシェリヒア・コリにおけるCD活性
を担う酵素の同定 （１）エシェリヒア・コリ菌体抽出液の電気泳動及びCD
活性染色 エシェリヒア・コリのSAT欠損株であるエシェリヒア・
コリJM39（F⁺ cysＥ51tfr-8）（Denk, D. and Bock,
A., J. Gene. Microbiol, 133, 515-525(1987)）、及
び、CD活性低下株JM39-8（特開平11-155571号）の細胞
抽出液を、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Na
tive-PAGE）に供し、CD活性染色を行い、CD活性の主体
について解析した。JM39-8株は、JM39株をＮＴＧ処理
し、Ｌ−システイン非資化性株として分離された変異株
である（特開平11-155571号）。

【００４４】各菌株を、0.3%のＬ−システイン添加、あ
るいは無添加のLB培地（トリプトン10g/L、Yeast Extra
ct 5g/L、NaCl 5g/L (pH7.0)）に植菌後、37℃、終夜培
養した。菌体を遠心集菌後0.85％NaClで洗浄し、得られ
た湿菌体を約3ml菌体破壊用Buffer（10mM Tris-HCl (pH
8.6)、10μM PLP、100μM DTT）に懸濁してCOSMOBIO社B
ioruptorで30分超音波菌体破壊を行った。12,000rpm、1
0分間遠心し、得られた上清を菌体抽出液とした。Prote
in Assay Kit (Bio-Rad社)を使用してタンパク濃度を定
量した。

【００４５】各菌体抽出液（各々30μgタンパク質）
を、2×Native-PAGE buffer（Glycine14.43g/L、Tris
3.0 g/L、pH8.6(HCl)）に懸濁し、定法に従い非変性ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（Native-PAGE）を実施
した。得られた電気泳動ゲルを用い、CD活性染色を実施
した。反応溶液（Tris・HCl 100mM、EDTA 10mM、PLP（Py
ridoxal-5-phosphate） 20μM、L-Cys 50mM、pH8.6に調
製後、100mlにフィルアップし、塩化ビスマス（BiCl₃)
を50mg加えた）に、ゲルの両端のレーンのみを切り出し
て浸し、室温で振盪してバンドが見えてくるまで放置し
たところ、主なバンドが２本検出された（図１Ａ）。な
お、ゲルの中央部のレーンは、アミノ酸配列決定に用い
た。JM39-8株では、上記の２つのバンドのうち、分子量
が大きい方のバンドが、JM39株に比べて弱かった。

【００４６】（２）CBLのCD活性を担う酵素としての同
定 エシェリヒア・コリにおいてCD活性をもつ酵素として、
CBL（metC産物)が報告されている（Chandra et. al., B
iochemistry, 21 (1982) 3064-3069）。上記バンドがCB
Lである可能性を検証するため、metC欠損株及びmetC遺
伝子をマルチコピープラスミドにて増幅したエシェリヒ
ア・コリを用いて、上記と同様な実験を実施した。

【００４７】metC欠損株EZ5（metC:Tn10Tet^s rpsL add-
uid-man uraA:Tn10）、及びmetCを搭載したプラスミドp
IP29（フランス・パスツール研究所のSaint-Girons博士
より供与された。Belfaiza et. al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. 83 (1986) 867-871参照）をEZ5に導入した菌株
を用いて、Native-PAGE、及びCD活性染色を実施した。
その結果、metC欠損株では、分子量の小さい方のバンド
が欠失しており、pIP29の導入によってそのバンドが大
きく増幅されることが判明した（図１Ｂ）。この結果よ
り、分子量の小さい方のバンドは、CBLであると結論付
けた。

【００４８】（３）TNaseのCD活性を担う酵素としての
同定 活性染色で認められた前記２本のバンドのうち分子量の
大きい方のバンドに相当するタンパク質の精製を行っ
た。電気泳動ゲルから、分子量の大きい方のバンドをゲ
ルより切り出し、定法により抽出、濃縮した。得られた
CD活性を持つ画分をについてSDS-ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（SDS-PAGE）を行い、染色は行わずに、PVDF
膜（Bio-Rad）にブロッティングを行った。転写が終わ
った膜を蒸留水で5分間洗浄し、0.025% CBB（クマシー
ブリリアントブルー）R-250を含む40%メタノールで5分
間染色した。脱色は50%メタノールで行い、確認した目
的酵素のバンドを切り取って、Protein Sequencer 476A
（Applied Biosystems 社）を用いた自動エドマン分解
法により、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。

【００４９】結果を配列番号１に示す。この配列を、若
干のCD活性を有することが報告されている（Austin New
ton et. al., J. Biol. Chem. 240 (1965) 1211-1218）
エシェリヒア・コリのTNaseのアミノ酸配列と比較した
ところ、１５残基中１４残基が一致した。配列番号１の
アミノ酸配列において１０位のメチオニンは、報告され
ているアミノ酸配列ではプロリンであった。この結果か
ら、分子量の大きい方のバンドは、TNaseである可能性
が高いと考えられた。また、この結果から、JM39-8株で
はTNaseの発現が低下していると推定された。

【００５０】＜２＞エシェリヒア・コリのtnaA欠損株及
びmetC欠損株の構築 上記のようにして、エシェリヒア・コリにおけるCD活性
を担う酵素としてCBL及びTNaseが同定されたので、それ
らの活性低下のＬ−システイン生産に対する効果を調べ
るために、CBLをコードする遺伝子metC又はTNaseをコー
ドする遺伝子tnaAの破壊株、及びこれらの両方の遺伝子
の破壊株を作製した（図２）。具体的には、以下のよう
にして行った。

【００５１】（１）tnaA欠損株の構築 エシェリヒア・コリJM109株の染色体DNAを鋳型に、配列
番号２及び３に示す塩基配列を有するプライマーと、配
列番号４及び５に示す塩基配列を有するプライマーとを
用いて、それぞれPCRを実施した。次に、各PCR産物をHi
ndIIIで切断した後ライゲーションした。この反応液を
鋳型として、配列番号２及び５に示す塩基配列を有する
プライマーを用いてPCRを実施し、約1.6kbの断片を得
た。この断片をBamHIにて消化し、温度感受性プラスミ
ドpEL3（K. A. Armstrong et. al.,J. Mol. Biol. (198
4) 175, 331-347）のBamHIサイトに組み込み、tnaA破壊
用プラスミドpEL3ΔtnaAを構築した。

【００５２】JM39株を、プラスミドpEL3ΔtnaAを用いて
形質転換し、30℃にてアンピシリン耐性を示すクローン
を得た。本クローンの培養液を適宜希釈してアンピシリ
ン添加LB寒天培地に塗布し、42℃にて一夜培養し、pEL3
ΔtnaAがJM39株染色体に組み込まれた株を得た。次い
で、本株をアンピシリン無添加LB培地にて37℃経代培養
し、アンピシリン感受性のクローンを分離した。分離ク
ローンについて、ゲノミックPCRによって染色体上のtna
A遺伝子周辺を解析し、野生型のtnaAは有しておらず、p
EL3ΔtnaA上にクローニングされた破壊型tnaA遺伝子の
みを有する株を選択した。こうして、JM39株由来のtnaA
遺伝子破壊株JM39ΔtnaAを得た。

【００５３】（２）metC欠損株の構築 エシェリヒア・コリJM109株の染色体DNAを鋳型に、配列
番号６及び７に示す塩基配列を有するプライマー、及び
配列番号８及び９に示す塩基配列を有するプライマーを
用いて、それぞれPCRを実施した。次に、各PCR産物をKp
nIで切断した後ライゲーションした。この反応液を鋳型
として、配列番号６及び９に示す塩基配列を有するプラ
イマーを用いてPCRを実施し、約1.4kbの断片を得た。こ
の断片をBamHIにて消化し、pEL3のBamHIサイトに組み込
み、metC破壊用プラスミドpEL3ΔmetCを構築した。

【００５４】JM39株又はJM39ΔtnaAを、プラスミドpEL3
ΔmetCを用いて形質転換し、30℃にてアンピシリン耐性
を示すクローンを得た。本クローンの培養液を適宜希釈
してアンピシリン添加LB寒天培地に塗布し、42℃にて一
夜培養し、pEL3ΔmetCがJM39株染色体に組み込まれた株
を得た。次いで、本株をアンピシリン無添加LB培地にて
37℃経代培養し、アンピシリン感受性のクローンを分離
した。分離クローンについて、ゲノミックPCRによって
染色体上のmetC遺伝子周辺を解析し、野生型のmetCは有
しておらず、pEL3ΔmetC上にクローニングされた破壊型
metC遺伝子のみを有する株を選択した。こうして、JM39
株由来のmetC遺伝子破壊株JM39ΔmetC、及びJM39ΔtnaA
株由来のmetC遺伝子破壊株JM39ΔtnaAΔmetCを得た。

【００５５】（３）遺伝子破壊の確認 次に、JM39ΔtnaA株及びJM39ΔmetC株について、電気泳
動及び活性染色によって、CD活性を有するバンドの有無
を調べた (図３)。その結果、tnaA破壊株では分子量の
大きな方のバンドが、metC破壊株では分子量の小さな方
のバンドが、tnaA/metC 両破壊株では両方のバンドが完
全に消失していた。

【００５６】＜３＞フィードバック阻害非感受性SAT遺
伝子の導入 上記で得られた各遺伝子破壊株に、シロイヌナズナ由来
のフィードバック阻害非感受性SAT遺伝子を導入した。

【００５７】シロイヌナズナ由来のSAT遺伝子含有プラ
スミドpEAS-m（FEMS Microbiol. Lett., 179 (1999) 45
3-459）を使用した。プラスミドpES-mは、特開平11-155
571号公報に記載されているE. coli由来cysE遺伝子の導
入に用いたプラスミドpCEをベースとして、E. coli由来
cysE遺伝子の代わりにシロイヌナズナ由来フィードバッ
ク阻害非感受性SAT遺伝子を挿入したものであり、以下
のような方法で構築可能である。まず、FEMS Microbio
l. Lett., 179 (1999) 453-459に記載された方法で、pC
EのcysE遺伝子の開始コドンの直前及び終止コドンの直
後にNcoIサイトを導入したプラスミドpCE(NcoI)を構築
する。このプラスミドのNcoI消化によってcysE遺伝子を
除去し、代わりにシロイヌナズナのSAT遺伝子にNcoIリ
ンカーを付加したものを導入する。シロイヌナズナのSA
T遺伝子はその構造が既知であり（Plant Molecular Bio
logy, 30, 1041-1049, 1996）、化学合成又はPCR等によ
って取得することができる。pEAS-mは、Plant Molecula
r Biology, 30, 1041-1049, 1996のFig.2に記載されて
いる塩基配列中189−1201位の配列の前後にNcoIサイト
を付加したDNA断片をpCEのNcoIサイトに導入して得られ
たものである。

【００５８】JM39、JM39ΔtnaA、JM39ΔmetC、及びJM39
ΔtnaAΔmetCを、上記プラスミドpEAS-mで形質転換し
た。得られた各形質転換株を、アンピシリン50mg/Lを含
むLBプレート培地で30℃、24時間培養した後、菌体１白
金耳を、アンピシリン50mg/Lを添加したC1培地（グルコ
ース 30g/L、NH₄Cl 10g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄・7H₂O 1
g/L、FeSO₄・7H₂O 10mg/L、MnCl₂・4H₂O 10mg/L、CaCO₃ 2
0g/L）20mlを入れた坂口フラスコに接種し、30℃で48時
間および72時間培養した。培養後の上清のＬ−システイ
ン含量をバイオアッセイで定量したところ、全ての破壊
株で野生株を上回り、tnaA及びmetCの破壊がＬ−システ
イン生産性の向上に効果のあることが確認された（図
４）。

【００５９】

【発明の効果】本発明により、エシェリヒア属細菌のＬ
−システイン生産性を向上させることができる。

【００６０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.） <120> Ｌ−システイン生産菌及びＬ−システインの製造法（L-Cysteine- Producing Bacterium and Method for Producing L-Cysteine） <130> P-B0293 <140> <141> 2002-09-18 <150> JP 2001-302008 <151> 2001-09-28 <160> 15 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Glu Asn Phe Lys His Leu Pro Glu Met Phe Arg Ile Arg Val 1 5 10 15 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 2 cgcggatcca agccgcattc tgactg 26 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 3 cccaagcttc tgactcgggc taacgca 27 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 4 cccaagcttg ccggtttcac tggcaa 26 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 5 ctatggatcc ttatagccac tctgtag 27 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 6 cgcggatcca acagagcttc tgcgatacc 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 7 cggggtacca ctagcatgaa tattcgcgg 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 8 cggggtacct accgcctata taaccagcc 29 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 9 aatatgagga tccgccagc 19 <210> 10 <211> 1880 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (499)..(1686) <400> 10 aagcttttgc taccaaaatc agcggcgata tcgttggcct ggtttaagga acgcgcttca 60 gccagcagtt gctgctcgcg cttaagggac gcttctgatt gaagaactct acgctcttac 120 tgaagaagat tgcccaggtg actacggagg ccaaaataag cccaatcatc acgcacttaa 180 cgacaatatc ggcgtgctga tacatacccc agacggaaag gtccgtctgc attaaattat 240 tacccactgt gtatctccag gacgcaagtc acaaaatctg cgcataataa tatcaaaacg 300 acgtcgaatt gatagtcgtt ctcattacta tttgcatact gccgtacctt tgctttcttt 360 tccttgcgtt tacgcagtaa aaaagtcacc agcacgccat ttgcgaaaat tttctgcttt 420 atgccaattc ttcaggatgc gcccgcgaat attcatgcta gtttagacat ccagacgtat 480 aaaaacagga atcccgac atg gcg gac aaa aag ctt gat act caa ctg gtg 531 Met Ala Asp Lys Lys Leu Asp Thr Gln Leu Val 1 5 10 aat gca gga cgc agc aaa aaa tac act ctc ggc gcg gta aat agc gtg 579 Asn Ala Gly Arg Ser Lys Lys Tyr Thr Leu Gly Ala Val Asn Ser Val 15 20 25 att cag cgc gct tct tcg ctg gtc ttt gac agt gta gaa gcc aaa aaa 627 Ile Gln Arg Ala Ser Ser Leu Val Phe Asp Ser Val Glu Ala Lys Lys 30 35 40 cac gcg aca cgt aat cgc gcc aat gga gag ttg ttc tat gga cgg cgc 675 His Ala Thr Arg Asn Arg Ala Asn Gly Glu Leu Phe Tyr Gly Arg Arg 45 50 55 gga acg tta acc cat ttc tcc tta caa caa gcg atg tgt gaa ctg gaa 723 Gly Thr Leu Thr His Phe Ser Leu Gln Gln Ala Met Cys Glu Leu Glu 60 65 70 75 ggt ggc gca ggc tgc gtg cta ttt ccc tgc ggg gcg gca gcg gtt gct 771 Gly Gly Ala Gly Cys Val Leu Phe Pro Cys Gly Ala Ala Ala Val Ala 80 85 90 aat tcc att ctt gct ttt atc gaa cag ggc gat cat gtg ttg atg acc 819 Asn Ser Ile Leu Ala Phe Ile Glu Gln Gly Asp His Val Leu Met Thr 95 100 105 aac acc gcc tat gaa ccg agt cag gat ttc tgt agc aaa atc ctc agc 867 Asn Thr Ala Tyr Glu Pro Ser Gln Asp Phe Cys Ser Lys Ile Leu Ser 110 115 120 aaa ctg ggc gta acg aca tca tgg ttt gat ccg ctg att ggt gcc gat 915 Lys Leu Gly Val Thr Thr Ser Trp Phe Asp Pro Leu Ile Gly Ala Asp 125 130 135 atc gtt aag cat ctg cag cca aac act aaa atc gtg ttt ctg gaa tcg 963 Ile Val Lys His Leu Gln Pro Asn Thr Lys Ile Val Phe Leu Glu Ser 140 145 150 155 cca ggc tcc atc acc atg gaa gtc cac gac gtt ccg gcg att gtt gcc 1011 Pro Gly Ser Ile Thr Met Glu Val His Asp Val Pro Ala Ile Val Ala 160 165 170 gcc gta cgc agt gtg gtg ccg gat gcc atc att atg atc gac aac acc 1059 Ala Val Arg Ser Val Val Pro Asp Ala Ile Ile Met Ile Asp Asn Thr 175 180 185 tgg gca gcc ggt gtg ctg ttt aag gcg ctg gat ttt ggc atc gat gtt 1107 Trp Ala Ala Gly Val Leu Phe Lys Ala Leu Asp Phe Gly Ile Asp Val 190 195 200 tct att caa gcc gcc acc aaa tat ctg gtt ggg cat tca gat gcg atg 1155 Ser Ile Gln Ala Ala Thr Lys Tyr Leu Val Gly His Ser Asp Ala Met 205 210 215 att ggc act gcc gtg tgc aat gcc cgt tgc tgg gag cag cta cgg gaa 1203 Ile Gly Thr Ala Val Cys Asn Ala Arg Cys Trp Glu Gln Leu Arg Glu 220 225 230 235 aat gcc tat ctg atg ggc cag atg gtc gat gcc gat acc gcc tat ata 1251 Asn Ala Tyr Leu Met Gly Gln Met Val Asp Ala Asp Thr Ala Tyr Ile 240 245 250 acc agc cgt ggc ctg cgc aca tta ggt gtg cgt ttg cgt caa cat cat 1299 Thr Ser Arg Gly Leu Arg Thr Leu Gly Val Arg Leu Arg Gln His His 255 260 265 gaa agc agt ctg aaa gtg gct gaa tgg ctg gca gaa cat ccg caa gtt 1347 Glu Ser Ser Leu Lys Val Ala Glu Trp Leu Ala Glu His Pro Gln Val 270 275 280 gcg cga gtt aac cac cct gct ctg cct ggc agt aaa ggt cac gaa ttc 1395 Ala Arg Val Asn His Pro Ala Leu Pro Gly Ser Lys Gly His Glu Phe 285 290 295 tgg aaa cga gac ttt aca ggc agc agc ggg cta ttt tcc ttt gtg ctt 1443 Trp Lys Arg Asp Phe Thr Gly Ser Ser Gly Leu Phe Ser Phe Val Leu 300 305 310 315 aag aaa aaa ctc aat aat gaa gag ctg gcg aac tat ctg gat aac ttc 1491 Lys Lys Lys Leu Asn Asn Glu Glu Leu Ala Asn Tyr Leu Asp Asn Phe 320 325 330 agt tta ttc agc atg gcc tac tcg tgg ggc ggg tat gaa tcg ttg atc 1539 Ser Leu Phe Ser Met Ala Tyr Ser Trp Gly Gly Tyr Glu Ser Leu Ile 335 340 345 ctg gca aat caa cca gaa cat atc gcc gcc att cgc cca caa ggc gag 1587 Leu Ala Asn Gln Pro Glu His Ile Ala Ala Ile Arg Pro Gln Gly Glu 350 355 360 atc gat ttt agc ggg acc ttg att cgc ctg cat att ggt ctg gaa gat 1635 Ile Asp Phe Ser Gly Thr Leu Ile Arg Leu His Ile Gly Leu Glu Asp 365 370 375 gtc gac gat ctg att gcc gat ctg gac gcc ggt ttt gcg cga att gta 1683 Val Asp Asp Leu Ile Ala Asp Leu Asp Ala Gly Phe Ala Arg Ile Val 380 385 390 395 taa cattgccact tttggacaat tttgcagaca ttttattgtg aaaagtctta 1736 aattgttgcg tccgggatca aggcgtcccg gacgattcag gagtacaata ggcagataaa 1796 ggcttaaacg ctgttccaca ggaaagtcca tggctgttat tcaagatatc atcgctgcgc 1856 tctggcaaca cgactttgcc gcgc 1880 <210> 11 <211> 395 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 11 Met Ala Asp Lys Lys Leu Asp Thr Gln Leu Val Asn Ala Gly Arg Ser 1 5 10 15 Lys Lys Tyr Thr Leu Gly Ala Val Asn Ser Val Ile Gln Arg Ala Ser 20 25 30 Ser Leu Val Phe Asp Ser Val Glu Ala Lys Lys His Ala Thr Arg Asn 35 40 45 Arg Ala Asn Gly Glu Leu Phe Tyr Gly Arg Arg Gly Thr Leu Thr His 50 55 60 Phe Ser Leu Gln Gln Ala Met Cys Glu Leu Glu Gly Gly Ala Gly Cys 65 70 75 80 Val Leu Phe Pro Cys Gly Ala Ala Ala Val Ala Asn Ser Ile Leu Ala 85 90 95 Phe Ile Glu Gln Gly Asp His Val Leu Met Thr Asn Thr Ala Tyr Glu 100 105 110 Pro Ser Gln Asp Phe Cys Ser Lys Ile Leu Ser Lys Leu Gly Val Thr 115 120 125 Thr Ser Trp Phe Asp Pro Leu Ile Gly Ala Asp Ile Val Lys His Leu 130 135 140 Gln Pro Asn Thr Lys Ile Val Phe Leu Glu Ser Pro Gly Ser Ile Thr 145 150 155 160 Met Glu Val His Asp Val Pro Ala Ile Val Ala Ala Val Arg Ser Val 165 170 175 Val Pro Asp Ala Ile Ile Met Ile Asp Asn Thr Trp Ala Ala Gly Val 180 185 190 Leu Phe Lys Ala Leu Asp Phe Gly Ile Asp Val Ser Ile Gln Ala Ala 195 200 205 Thr Lys Tyr Leu Val Gly His Ser Asp Ala Met Ile Gly Thr Ala Val 210 215 220 Cys Asn Ala Arg Cys Trp Glu Gln Leu Arg Glu Asn Ala Tyr Leu Met 225 230 235 240 Gly Gln Met Val Asp Ala Asp Thr Ala Tyr Ile Thr Ser Arg Gly Leu 245 250 255 Arg Thr Leu Gly Val Arg Leu Arg Gln His His Glu Ser Ser Leu Lys 260 265 270 Val Ala Glu Trp Leu Ala Glu His Pro Gln Val Ala Arg Val Asn His 275 280 285 Pro Ala Leu Pro Gly Ser Lys Gly His Glu Phe Trp Lys Arg Asp Phe 290 295 300 Thr Gly Ser Ser Gly Leu Phe Ser Phe Val Leu Lys Lys Lys Leu Asn 305 310 315 320 Asn Glu Glu Leu Ala Asn Tyr Leu Asp Asn Phe Ser Leu Phe Ser Met 325 330 335 Ala Tyr Ser Trp Gly Gly Tyr Glu Ser Leu Ile Leu Ala Asn Gln Pro 340 345 350 Glu His Ile Ala Ala Ile Arg Pro Gln Gly Glu Ile Asp Phe Ser Gly 355 360 365 Thr Leu Ile Arg Leu His Ile Gly Leu Glu Asp Val Asp Asp Leu Ile 370 375 380 Ala Asp Leu Asp Ala Gly Phe Ala Arg Ile Val 385 390 395 <210> 12 <211> 2083 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (539)..(1954) <400> 12 gtaaaccgcg catacagccg cattctgact gtcagatgcg cttcgcttca ttgttaccgc 60 tcctgttatt cctcaaccct ttttttaaac attaaaattc ttacgtaatt tataatcttt 120 aaaaaaagca tttaatattg ctccccgaac gattgtgatt cgattcacat ttaaacaatt 180 tcagaataga caaaaactct gagtgtaata atgtagcctc gtgtcttgcg aggataagtg 240 cattatgaat atcttacata tatgtgtgac ctcaaaatgg ttcaatattg acaacaaaat 300 tgtcgatcac cgcccttgat ttgcccttct gtagccatca ccagagccaa accgattgat 360 tcaatgtgtt ctatttgttt gctatatctt aattttgcct tttgcaaagg tcatctctcg 420 tttatttact tgttttagta aatgatggtg cttgcatata tatctggcga attaatcggt 480 atagcagatg taatattcac agggatcact gtaattaaaa taaatgaagg attatgta 538 atg gaa aac ttt aaa cat ctc cct gaa ccg ttc cgc att cgt gtt att 586 Met Glu Asn Phe Lys His Leu Pro Glu Pro Phe Arg Ile Arg Val Ile 1 5 10 15 gag cca gta aaa cgt acc act cgc gct tat cgt gaa gag gca att att 634 Glu Pro Val Lys Arg Thr Thr Arg Ala Tyr Arg Glu Glu Ala Ile Ile 20 25 30 aaa tcc ggt atg aac ccg ttc ctg ctg gat agc gaa gat gtt ttt atc 682 Lys Ser Gly Met Asn Pro Phe Leu Leu Asp Ser Glu Asp Val Phe Ile 35 40 45 gat tta ctg acc gac agc ggc acc ggg gcg gtg acg cag agc atg cag 730 Asp Leu Leu Thr Asp Ser Gly Thr Gly Ala Val Thr Gln Ser Met Gln 50 55 60 gct gcg atg atg cgc ggc gac gaa gcc tac agc ggc agt cgt agc tac 778 Ala Ala Met Met Arg Gly Asp Glu Ala Tyr Ser Gly Ser Arg Ser Tyr 65 70 75 80 tat gcg tta gcc gag tca gtg aaa aat atc ttc ggt tat caa tac acc 826 Tyr Ala Leu Ala Glu Ser Val Lys Asn Ile Phe Gly Tyr Gln Tyr Thr 85 90 95 att ccg act cac cag ggc cgt ggc gca gag caa atc tat att ccg gta 874 Ile Pro Thr His Gln Gly Arg Gly Ala Glu Gln Ile Tyr Ile Pro Val 100 105 110 ctg att aaa aaa cgc gag cag gaa aaa ggc ctg gat cgc agc aaa atg 922 Leu Ile Lys Lys Arg Glu Gln Glu Lys Gly Leu Asp Arg Ser Lys Met 115 120 125 gtg gcg ttc tct aac tat ttc ttt gat acc acg cag ggc cat agc cag 970 Val Ala Phe Ser Asn Tyr Phe Phe Asp Thr Thr Gln Gly His Ser Gln 130 135 140 atc aac ggc tgt acc gtg cgt aac gtc tat atc aaa gaa gcc ttc gat 1018 Ile Asn Gly Cys Thr Val Arg Asn Val Tyr Ile Lys Glu Ala Phe Asp 145 150 155 160 acg ggc gtg cgt tac gac ttt aaa ggc aac ttt gac ctt gag gga tta 1066 Thr Gly Val Arg Tyr Asp Phe Lys Gly Asn Phe Asp Leu Glu Gly Leu 165 170 175 gaa cgc ggt att gaa gaa gtt ggt ccg aat aac gtg ccg tat atc gtt 1114 Glu Arg Gly Ile Glu Glu Val Gly Pro Asn Asn Val Pro Tyr Ile Val 180 185 190 gca acc atc acc agt aac tct gca ggt ggt cag ccg gtt tca ctg gca 1162 Ala Thr Ile Thr Ser Asn Ser Ala Gly Gly Gln Pro Val Ser Leu Ala 195 200 205 aac tta aaa gcg atg tac agc atc gcg aag aaa tac gat att ccg gtg 1210 Asn Leu Lys Ala Met Tyr Ser Ile Ala Lys Lys Tyr Asp Ile Pro Val 210 215 220 gta atg gac tcc gcg cgc ttt gct gaa aac gcc tat ttc att aag cag 1258 Val Met Asp Ser Ala Arg Phe Ala Glu Asn Ala Tyr Phe Ile Lys Gln 225 230 235 240 cgt gaa gca gaa tac aaa gac tgg acc atc gag cag atc acc cgc gaa 1306 Arg Glu Ala Glu Tyr Lys Asp Trp Thr Ile Glu Gln Ile Thr Arg Glu 245 250 255 acc tac aaa tat gcc gat atg ctg gcg atg tcc gcc aag aaa gat gcg 1354 Thr Tyr Lys Tyr Ala Asp Met Leu Ala Met Ser Ala Lys Lys Asp Ala 260 265 270 atg gtg ccg atg ggc ggc ctg ctg tgc atg aaa gac gac agc ttc ttt 1402 Met Val Pro Met Gly Gly Leu Leu Cys Met Lys Asp Asp Ser Phe Phe 275 280 285 gat gtg tac acc gag tgc aga acc ctt tgc gtg gtg cag gaa ggc ttc 1450 Asp Val Tyr Thr Glu Cys Arg Thr Leu Cys Val Val Gln Glu Gly Phe 290 295 300 ccg aca tat ggc ggc cta gaa ggc ggc gcg atg gag cgt ctg gcg gta 1498 Pro Thr Tyr Gly Gly Leu Glu Gly Gly Ala Met Glu Arg Leu Ala Val 305 310 315 320 ggt ctg tat gac ggc atg aat ctc gac tgg ctg gct tat cgt atc gcg 1546 Gly Leu Tyr Asp Gly Met Asn Leu Asp Trp Leu Ala Tyr Arg Ile Ala 325 330 335 cag gta cag tat ctg gtc gat ggt ctg gaa gag att ggc gtt gtc tgc 1594 Gln Val Gln Tyr Leu Val Asp Gly Leu Glu Glu Ile Gly Val Val Cys 340 345 350 cag cag gcg ggc ggt cac gcg gca ttc gtt gat gcc ggt aaa ctg ttg 1642 Gln Gln Ala Gly Gly His Ala Ala Phe Val Asp Ala Gly Lys Leu Leu 355 360 365 ccg cat atc ccg gca gac cag ttc ccg gca aca ggc ctg gcc tgc gag 1690 Pro His Ile Pro Ala Asp Gln Phe Pro Ala Thr Gly Leu Ala Cys Glu 370 375 380 ctg tat aaa gtc gcc ggt atc cgt gcg gta gaa att ggc tct ttc ctg 1738 Leu Tyr Lys Val Ala Gly Ile Arg Ala Val Glu Ile Gly Ser Phe Leu 385 390 395 400 tta ggc cgc gat ccg aaa acc ggt aaa caa ctg cca tgc ccg gct gaa 1786 Leu Gly Arg Asp Pro Lys Thr Gly Lys Gln Leu Pro Cys Pro Ala Glu 405 410 415 ctg ctg cgt tta acc att ccg cgc gca aca tat act caa aca cat atg 1834 Leu Leu Arg Leu Thr Ile Pro Arg Ala Thr Tyr Thr Gln Thr His Met 420 425 430 gac ttc att att gaa gcc ttt aaa cat gtg aaa gag aac gcg gcg aat 1882 Asp Phe Ile Ile Glu Ala Phe Lys His Val Lys Glu Asn Ala Ala Asn 435 440 445 att aaa gga tta acc ttt acg tac gaa ccg aaa gta ttg cgt cac ttc 1930 Ile Lys Gly Leu Thr Phe Thr Tyr Glu Pro Lys Val Leu Arg His Phe 450 455 460 acc gca aaa ctt aaa gaa gtt taa ttaatactac agagtggcta taaggatgtt 1984 Thr Ala Lys Leu Lys Glu Val 465 470 agccactctc ttaccctaca tcctcaataa caaaaatagc cttcctctaa aggtggcatc 2044 atgactgttc aagctgaaaa aaagcactct gcattttgg 2083 <210> 13 <211> 471 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 13 Met Glu Asn Phe Lys His Leu Pro Glu Pro Phe Arg Ile Arg Val Ile 1 5 10 15 Glu Pro Val Lys Arg Thr Thr Arg Ala Tyr Arg Glu Glu Ala Ile Ile 20 25 30 Lys Ser Gly Met Asn Pro Phe Leu Leu Asp Ser Glu Asp Val Phe Ile 35 40 45 Asp Leu Leu Thr Asp Ser Gly Thr Gly Ala Val Thr Gln Ser Met Gln 50 55 60 Ala Ala Met Met Arg Gly Asp Glu Ala Tyr Ser Gly Ser Arg Ser Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Leu Ala Glu Ser Val Lys Asn Ile Phe Gly Tyr Gln Tyr Thr 85 90 95 Ile Pro Thr His Gln Gly Arg Gly Ala Glu Gln Ile Tyr Ile Pro Val 100 105 110 Leu Ile Lys Lys Arg Glu Gln Glu Lys Gly Leu Asp Arg Ser Lys Met 115 120 125 Val Ala Phe Ser Asn Tyr Phe Phe Asp Thr Thr Gln Gly His Ser Gln 130 135 140 Ile Asn Gly Cys Thr Val Arg Asn Val Tyr Ile Lys Glu Ala Phe Asp 145 150 155 160 Thr Gly Val Arg Tyr Asp Phe Lys Gly Asn Phe Asp Leu Glu Gly Leu 165 170 175 Glu Arg Gly Ile Glu Glu Val Gly Pro Asn Asn Val Pro Tyr Ile Val 180 185 190 Ala Thr Ile Thr Ser Asn Ser Ala Gly Gly Gln Pro Val Ser Leu Ala 195 200 205 Asn Leu Lys Ala Met Tyr Ser Ile Ala Lys Lys Tyr Asp Ile Pro Val 210 215 220 Val Met Asp Ser Ala Arg Phe Ala Glu Asn Ala Tyr Phe Ile Lys Gln 225 230 235 240 Arg Glu Ala Glu Tyr Lys Asp Trp Thr Ile Glu Gln Ile Thr Arg Glu 245 250 255 Thr Tyr Lys Tyr Ala Asp Met Leu Ala Met Ser Ala Lys Lys Asp Ala 260 265 270 Met Val Pro Met Gly Gly Leu Leu Cys Met Lys Asp Asp Ser Phe Phe 275 280 285 Asp Val Tyr Thr Glu Cys Arg Thr Leu Cys Val Val Gln Glu Gly Phe 290 295 300 Pro Thr Tyr Gly Gly Leu Glu Gly Gly Ala Met Glu Arg Leu Ala Val 305 310 315 320 Gly Leu Tyr Asp Gly Met Asn Leu Asp Trp Leu Ala Tyr Arg Ile Ala 325 330 335 Gln Val Gln Tyr Leu Val Asp Gly Leu Glu Glu Ile Gly Val Val Cys 340 345 350 Gln Gln Ala Gly Gly His Ala Ala Phe Val Asp Ala Gly Lys Leu Leu 355 360 365 Pro His Ile Pro Ala Asp Gln Phe Pro Ala Thr Gly Leu Ala Cys Glu 370 375 380 Leu Tyr Lys Val Ala Gly Ile Arg Ala Val Glu Ile Gly Ser Phe Leu 385 390 395 400 Leu Gly Arg Asp Pro Lys Thr Gly Lys Gln Leu Pro Cys Pro Ala Glu 405 410 415 Leu Leu Arg Leu Thr Ile Pro Arg Ala Thr Tyr Thr Gln Thr His Met 420 425 430 Asp Phe Ile Ile Glu Ala Phe Lys His Val Lys Glu Asn Ala Ala Asn 435 440 445 Ile Lys Gly Leu Thr Phe Thr Tyr Glu Pro Lys Val Leu Arg His Phe 450 455 460 Thr Ala Lys Leu Lys Glu Val 465 470 <210> 14 <211> 1134 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (223)..(1047) <400> 14 tccgcgaact ggcgcatcgc ttcggcgttg aaatgccaat aaccgaggaa atttatcaag 60 tattatattg cggaaaaaac gcgcgcgagg cagcattgac tttactaggt cgtgcacgca 120 aggacgagcg cagcagccac taaccccagg gaacctttgt taccgctatg acccggcccg 180 cgcagaacgg gccggtcatt atctcatcgt gtggagtaag ca atg tcg tgt gaa 234 Met Ser Cys Glu 1 gaa ctg gaa att gtc tgg aac aat att aaa gcc gaa gcc aga acg ctg 282 Glu Leu Glu Ile Val Trp Asn Asn Ile Lys Ala Glu Ala Arg Thr Leu 5 10 15 20 gcg gac tgt gag cca atg ctg gcc agt ttt tac cac gcg acg cta ctc 330 Ala Asp Cys Glu Pro Met Leu Ala Ser Phe Tyr His Ala Thr Leu Leu 25 30 35 aag cac gaa aac ctt ggc agt gca ctg agc tac atg ctg gcg aac aag 378 Lys His Glu Asn Leu Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Met Leu Ala Asn Lys 40 45 50 ctg tca tcg cca att atg cct gct att gct atc cgt gaa gtg gtg gaa 426 Leu Ser Ser Pro Ile Met Pro Ala Ile Ala Ile Arg Glu Val Val Glu 55 60 65 gaa gcc tac gcc gct gac ccg gaa atg atc gcc tct gcg gcc tgt gat 474 Glu Ala Tyr Ala Ala Asp Pro Glu Met Ile Ala Ser Ala Ala Cys Asp 70 75 80 att cag gcg gtg cgt acc cgc gac ccg gca gtc gat aaa tac tca acc 522 Ile Gln Ala Val Arg Thr Arg Asp Pro Ala Val Asp Lys Tyr Ser Thr 85 90 95 100 ccg ttg tta tac ctg aag ggt ttt cat gcc ttg cag gcc tat cgc atc 570 Pro Leu Leu Tyr Leu Lys Gly Phe His Ala Leu Gln Ala Tyr Arg Ile 105 110 115 ggt cac tgg ttg tgg aat cag ggg cgt cgc gca ctg gca atc ttt ctg 618 Gly His Trp Leu Trp Asn Gln Gly Arg Arg Ala Leu Ala Ile Phe Leu 120 125 130 caa aac cag gtt tct gtg acg ttc cag gtc gat att cac ccg gca gca 666 Gln Asn Gln Val Ser Val Thr Phe Gln Val Asp Ile His Pro Ala Ala 135 140 145 aaa att ggt cgc ggt atc atg ctt gac cac gcg aca ggc atc gtc gtt 714 Lys Ile Gly Arg Gly Ile Met Leu Asp His Ala Thr Gly Ile Val Val 150 155 160 ggt gaa acg gcg gtg att gaa aac gac gta tcg att ctg caa tct gtg 762 Gly Glu Thr Ala Val Ile Glu Asn Asp Val Ser Ile Leu Gln Ser Val 165 170 175 180 acg ctt ggc ggt acg ggt aaa tct ggt ggt gac cgt cac ccg aaa att 810 Thr Leu Gly Gly Thr Gly Lys Ser Gly Gly Asp Arg His Pro Lys Ile 185 190 195 cgt gaa ggt gtg atg att ggc gcg ggc gcg aaa atc ctc ggc aat att 858 Arg Glu Gly Val Met Ile Gly Ala Gly Ala Lys Ile Leu Gly Asn Ile 200 205 210 gaa gtt ggg cgc ggc gcg aag att ggc gca ggt tcc gtg gtg ctg caa 906 Glu Val Gly Arg Gly Ala Lys Ile Gly Ala Gly Ser Val Val Leu Gln 215 220 225 ccg gtg ccg ccg cat acc acc gcc gct ggc gtt ccg gct cgt att gtc 954 Pro Val Pro Pro His Thr Thr Ala Ala Gly Val Pro Ala Arg Ile Val 230 235 240 ggt aaa cca gac agc gat aag cca tca atg gat atg gac cag cat ttc 1002 Gly Lys Pro Asp Ser Asp Lys Pro Ser Met Asp Met Asp Gln His Phe 245 250 255 260 aac ggt att aac cat aca ttt gag tat ggg gat ggg atc taa tgt 1047 Asn Gly Ile Asn His Thr Phe Glu Tyr Gly Asp Gly Ile Cys 265 270 275 cctgtgatcg tgccggatgc gatgtaatca tctatccggc ctacagtaac taatctctca 1107 ataccgctcc cgatacccca actgtcg 1134 <210> 15 <211> 273 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 15 Met Ser Cys Glu Glu Leu Glu Ile Val Trp Asn Asn Ile Lys Ala Glu 1 5 10 15 Ala Arg Thr Leu Ala Asp Cys Glu Pro Met Leu Ala Ser Phe Tyr His 20 25 30 Ala Thr Leu Leu Lys His Glu Asn Leu Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Met 35 40 45 Leu Ala Asn Lys Leu Ser Ser Pro Ile Met Pro Ala Ile Ala Ile Arg 50 55 60 Glu Val Val Glu Glu Ala Tyr Ala Ala Asp Pro Glu Met Ile Ala Ser 65 70 75 80 Ala Ala Cys Asp Ile Gln Ala Val Arg Thr Arg Asp Pro Ala Val Asp 85 90 95 Lys Tyr Ser Thr Pro Leu Leu Tyr Leu Lys Gly Phe His Ala Leu Gln 100 105 110 Ala Tyr Arg Ile Gly His Trp Leu Trp Asn Gln Gly Arg Arg Ala Leu 115 120 125 Ala Ile Phe Leu Gln Asn Gln Val Ser Val Thr Phe Gln Val Asp Ile 130 135 140 His Pro Ala Ala Lys Ile Gly Arg Gly Ile Met Leu Asp His Ala Thr 145 150 155 160 Gly Ile Val Val Gly Glu Thr Ala Val Ile Glu Asn Asp Val Ser Ile 165 170 175 Leu Gln Ser Val Thr Leu Gly Gly Thr Gly Lys Ser Gly Gly Asp Arg 180 185 190 His Pro Lys Ile Arg Glu Gly Val Met Ile Gly Ala Gly Ala Lys Ile 195 200 205 Leu Gly Asn Ile Glu Val Gly Arg Gly Ala Lys Ile Gly Ala Gly Ser 210 215 220 Val Val Leu Gln Pro Val Pro Pro His Thr Thr Ala Ala Gly Val Pro 225 230 235 240 Ala Arg Ile Val Gly Lys Pro Asp Ser Asp Lys Pro Ser Met Asp Met 245 250 255 Asp Gln His Phe Asn Gly Ile Asn His Thr Phe Glu Tyr Gly Asp Gly 260 265 270 Ile

【図面の簡単な説明】

【図１】 エシェリヒア・コリ細胞抽出液Native-PAGE
のCD活性染色の結果を示す図。Ａ：SAT欠損株JM39、及
び、CD活性低下株JM39-8Ｂ：metC欠損株EZ5、及びmetC
を搭載したプラスミドpIP29を導入したEZ5

【図２】 エシェリヒア・コリのmetC破壊株、tnaA破壊
株、及びmetC/tnaA破壊株の構築過程を示す図。
「Ａ」、「Ｂ」は遺伝子の末端領域、「Ｘ」は欠失領域
を示す。

【図３】 metC破壊株、tnaA破壊株、及びmetC/tnaA破
壊株の遺伝子破壊を確認する電気泳動及びCD活性染色の
結果を示す写真。

【図４】 metC破壊株、tnaA破壊株、及びmetC/tnaA破
壊株のＬ−システイン生産性を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中森 茂 福井県吉田郡松岡町兼定島38−７ Ｂ− 103 Ｆターム(参考） 4B064 AE14 CA02 CA19 CC24 DA01 DA20 4B065 AA26X AA89Y AB01 AC14 BA02 BA23 BA25 CA17

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、シ
   スタチオニン−β−リアーゼ活性が低下又は欠失するよ
   うに改変されたエシェリヒア属細菌。
2. 【請求項２】 Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、シ
   スシスタチオニン−β−リアーゼ活性及びトリプトファ
   ナーゼ活性が低下又は欠失するように改変されたエシェ
   リヒア属細菌。
3. 【請求項３】 シスタチオニン−β−リアーゼをコード
   する遺伝子が破壊された請求項１記載のエシェリヒア属
   細菌。
4. 【請求項４】 シスシスタチオニン−β−リアーゼをコ
   ードする遺伝子及びトリプトファナーゼをコードする遺
   伝子が破壊された請求項２に記載のエシェリヒア属細
   菌。
5. 【請求項５】 さらにＬ−システイン生合成系酵素活性
   が増強されるように改変された請求項１〜４のいずれか
   一項に記載のエシェリヒア属細菌。
6. 【請求項６】 セリンアセチルトランスフェラーゼが増
   強されるように改変された請求項５記載のエシェリヒア
   属細菌。
7. 【請求項７】 Ｌ−システインによるフィードバック阻
   害に非感受性のセリンアセチルトランスフェラーゼを保
   持する請求項６記載のエシェリヒア属細菌。
8. 【請求項８】 エシェリヒア・コリである請求項１〜７
   のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌。
9. 【請求項９】 請求項１〜８のいずれか一項に記載のエ
   シェリヒア属細菌を培地で培養し、Ｌ−システインを培
   地中に生成蓄積させ、該培地よりＬ−システインを採取
   する、Ｌ−システインの製造法。
10. 【請求項１０】 エシェリヒア属細菌のシスシスタチオ
    ニン−β−リアーゼ活性もしくはトリプトファナーゼ活
    性、又はこれらの両方の活性を低下又は消失させること
    によって、同細菌のＬ−システイン生産能を高めること
    を特徴とする、エシェリヒア属細菌のＬ−システイン生
    産菌の製造方法。