JP2003038183A - ゲノムｄｎａ中のメチレーションサイトのメチル化検出用バイオチップ及びメチル化検出方法 - Google Patents
ゲノムｄｎａ中のメチレーションサイトのメチル化検出用バイオチップ及びメチル化検出方法Info
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- JP2003038183A JP2003038183A JP2001189686A JP2001189686A JP2003038183A JP 2003038183 A JP2003038183 A JP 2003038183A JP 2001189686 A JP2001189686 A JP 2001189686A JP 2001189686 A JP2001189686 A JP 2001189686A JP 2003038183 A JP2003038183 A JP 2003038183A
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- methylation
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- genomic dna
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ゲノム中のメチル化部位を網羅的に解析す
る。 【解決手段】 同じ認識部位を切断するメチル化感受性
制限酵素SmaIとメチル化非感受性制限酵素XmaIのうちSm
aIでゲノムDNA７００を消化し、SmaIで消化したゲノムD
NAをXmaIで消化する。両端がXmaIによる切断部であるDN
A断片７２０を特異的に増幅し、増幅したDNA断片を、対
応するプローブが基板上に固定されたバイオチップを用
いて検出する。
る。 【解決手段】 同じ認識部位を切断するメチル化感受性
制限酵素SmaIとメチル化非感受性制限酵素XmaIのうちSm
aIでゲノムDNA７００を消化し、SmaIで消化したゲノムD
NAをXmaIで消化する。両端がXmaIによる切断部であるDN
A断片７２０を特異的に増幅し、増幅したDNA断片を、対
応するプローブが基板上に固定されたバイオチップを用
いて検出する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ゲノムDNA中のメ
チレーションサイトにおけるメチル化の検出方法及びそ
の方法に用いるバイオチップに関する。
チレーションサイトにおけるメチル化の検出方法及びそ
の方法に用いるバイオチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】生体内に存在するゲノムはメチル化され
ることによって発現調整されるため、その異常により先
天疾患やがんが起ることが知られている。ゲノム中のあ
る特定部位の増幅及び解析方法はNikolai Lisisynらに
よって報告されており（Science 259, 946-951(199
3)）、これを元にある特定部位がメチル化されているか
どうかの解析方法がToshikazu Ushijimaらによって考案
・報告されている（Proceedings of the National Acad
emy of Sciences of the United States of America Vo
l.94, pp. 2284-2289, March 1997）。この方法は、メ
チル化感受性及び非感受性の制限酵素を用いてゲノムの
特定部分を切断し、その後特異的プライマーを用いて、
得られた切断断片を増幅して電気泳動などを行い、解析
する方法である。また、Minoru Toyotaらによっても、
メチル化感受性の制限酵素SmaIと非感受性の制限酵素Xm
aIを用い、付着末端を生成するXmaIに特異的なアダプタ
ーを用いて、ある特定部位がメチル化されているかどう
かの解析方法が報告されている（Cancer Research 59,
2307-2312(1999)）。
ることによって発現調整されるため、その異常により先
天疾患やがんが起ることが知られている。ゲノム中のあ
る特定部位の増幅及び解析方法はNikolai Lisisynらに
よって報告されており（Science 259, 946-951(199
3)）、これを元にある特定部位がメチル化されているか
どうかの解析方法がToshikazu Ushijimaらによって考案
・報告されている（Proceedings of the National Acad
emy of Sciences of the United States of America Vo
l.94, pp. 2284-2289, March 1997）。この方法は、メ
チル化感受性及び非感受性の制限酵素を用いてゲノムの
特定部分を切断し、その後特異的プライマーを用いて、
得られた切断断片を増幅して電気泳動などを行い、解析
する方法である。また、Minoru Toyotaらによっても、
メチル化感受性の制限酵素SmaIと非感受性の制限酵素Xm
aIを用い、付着末端を生成するXmaIに特異的なアダプタ
ーを用いて、ある特定部位がメチル化されているかどう
かの解析方法が報告されている（Cancer Research 59,
2307-2312(1999)）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、従来の検出方
法では、ゲノム中の特定のメチレーションサイトだけし
か対象にできず、一度にたくさんのメチレーションサイ
トのメチル化を検出することはできなかった。本発明
は、ゲノム中のメチレーションサイトのメチル化を網羅
的に解析する手段及び方法を提供することを目的とす
る。
法では、ゲノム中の特定のメチレーションサイトだけし
か対象にできず、一度にたくさんのメチレーションサイ
トのメチル化を検出することはできなかった。本発明
は、ゲノム中のメチレーションサイトのメチル化を網羅
的に解析する手段及び方法を提供することを目的とす
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、ゲノム中でメ
チル化されている部位を特異的に増幅する方法をバイオ
チップに応用することによって前記目的を達成する。上
述の問題点を解決するために、本発明では、ゲノムDNA
中で両端にメチル化部位をもつ断片を選択的に増幅し、
それをバイオチップやDNAチップ、核酸アレイ（以下、
これらを総称してバイオチップという）に用いることを
考案した。それによってメチル化部位の網羅的な解析を
可能にすることができる。
チル化されている部位を特異的に増幅する方法をバイオ
チップに応用することによって前記目的を達成する。上
述の問題点を解決するために、本発明では、ゲノムDNA
中で両端にメチル化部位をもつ断片を選択的に増幅し、
それをバイオチップやDNAチップ、核酸アレイ（以下、
これらを総称してバイオチップという）に用いることを
考案した。それによってメチル化部位の網羅的な解析を
可能にすることができる。
【０００５】本発明によるゲノムDNA中のメチレーショ
ンサイトのメチル化検出用バイオチップは、両端にメチ
レーションサイトをもつゲノムDNA断片の配列の少なく
とも一部を含む複数種類の塩基配列をそれぞれ基板上の
異なる位置に固定したことを特徴とする。
ンサイトのメチル化検出用バイオチップは、両端にメチ
レーションサイトをもつゲノムDNA断片の配列の少なく
とも一部を含む複数種類の塩基配列をそれぞれ基板上の
異なる位置に固定したことを特徴とする。
【０００６】本発明によるゲノムDNA中のメチレーショ
ンサイトのメチル化検出用バイオチップは、また、同じ
認識部位を有するメチル化感受性制限酵素とメチル化非
感受性制限酵素の前記認識部位で両端が切断されたDNA
断片の配列の少なくとも一部を含む複数種類の塩基配列
をそれぞれ基板上の異なる位置に固定したことを特徴と
する。
ンサイトのメチル化検出用バイオチップは、また、同じ
認識部位を有するメチル化感受性制限酵素とメチル化非
感受性制限酵素の前記認識部位で両端が切断されたDNA
断片の配列の少なくとも一部を含む複数種類の塩基配列
をそれぞれ基板上の異なる位置に固定したことを特徴と
する。
【０００７】本発明によるゲノムDNA中のメチレーショ
ンサイトにおけるメチル化の検出に用いるメチル化検出
用バイオチップの製造方法は、同じ認識部位を切断する
メチル化感受性制限酵素が存在するメチル化非感受性制
限酵素でゲノムDNAを消化するステップと、得られたDNA
断片をそれぞれ増幅するステップと、増幅したDNA断片
をそれぞれ基板上の異なる位置に固定するステップとを
含むことを特徴とする。
ンサイトにおけるメチル化の検出に用いるメチル化検出
用バイオチップの製造方法は、同じ認識部位を切断する
メチル化感受性制限酵素が存在するメチル化非感受性制
限酵素でゲノムDNAを消化するステップと、得られたDNA
断片をそれぞれ増幅するステップと、増幅したDNA断片
をそれぞれ基板上の異なる位置に固定するステップとを
含むことを特徴とする。
【０００８】本発明によるゲノムDNA中のメチル化され
たメチレーションサイトを検出する方法は、ゲノムDNA
中で２つのメチル化されている部位に挟まれた塩基配列
を特異的に増幅するステップと、両端がメチレーション
サイトであるゲノムDNA断片の配列の少なくとも一部を
含む複数種類の塩基配列がそれぞれ基板上の異なる位置
に固定されたバイオチップを用いて前記増幅された塩基
配列を検出するステップとを含むことを特徴とする。
たメチレーションサイトを検出する方法は、ゲノムDNA
中で２つのメチル化されている部位に挟まれた塩基配列
を特異的に増幅するステップと、両端がメチレーション
サイトであるゲノムDNA断片の配列の少なくとも一部を
含む複数種類の塩基配列がそれぞれ基板上の異なる位置
に固定されたバイオチップを用いて前記増幅された塩基
配列を検出するステップとを含むことを特徴とする。
【０００９】前記２つのメチル化されているメチレーシ
ョンサイトに挟まれた塩基配列を特異的に増幅するステ
ップは、同じ認識部位を切断するメチル化感受性制限酵
素とメチル化非感受性制限酵素、及びいずれかの制限酵
素に特異的なアダプターを用いることを特徴とする。ア
ダプターは2種のオリゴマーから成るものを用いること
ができる。2種のオリゴマーはリン酸化されていないの
が好ましい。また、2種のオリゴマーは数baseがアニー
リングする。
ョンサイトに挟まれた塩基配列を特異的に増幅するステ
ップは、同じ認識部位を切断するメチル化感受性制限酵
素とメチル化非感受性制限酵素、及びいずれかの制限酵
素に特異的なアダプターを用いることを特徴とする。ア
ダプターは2種のオリゴマーから成るものを用いること
ができる。2種のオリゴマーはリン酸化されていないの
が好ましい。また、2種のオリゴマーは数baseがアニー
リングする。
【００１０】本発明によるゲノムDNA中のメチル化され
たメチレーションサイトを検出する方法は、同じ認識部
位を切断するメチル化感受性制限酵素とメチル化非感受
性制限酵素のうちメチル化感受性制限酵素でゲノムDNA
を消化するステップと、前記メチル化感受性制限酵素で
消化したゲノムDNAを前記メチル化非感受性制限酵素で
消化するステップと、両端が前記メチル化非感受性制限
酵素による切断部であるDNA断片を特異的に増幅するス
テップと、前記増幅したDNA断片を、対応するプローブ
が基板上に固定されたバイオチップを用いて検出するス
テップとを含むことを特徴とする。
たメチレーションサイトを検出する方法は、同じ認識部
位を切断するメチル化感受性制限酵素とメチル化非感受
性制限酵素のうちメチル化感受性制限酵素でゲノムDNA
を消化するステップと、前記メチル化感受性制限酵素で
消化したゲノムDNAを前記メチル化非感受性制限酵素で
消化するステップと、両端が前記メチル化非感受性制限
酵素による切断部であるDNA断片を特異的に増幅するス
テップと、前記増幅したDNA断片を、対応するプローブ
が基板上に固定されたバイオチップを用いて検出するス
テップとを含むことを特徴とする。
【００１１】このとき、メチル化感受性制限酵素として
平滑末端を生ずる酵素を用い、メチル化非感受性制限酵
素として付着末端を生ずる酵素を用い、両端がメチル化
非感受性制限酵素による切断部であるDNA断片を特異的
に増幅するステップでは、メチル化非感受性制限酵素に
よって切断された付着末端に特異的に結合するアダプタ
ーを用い、当該アダプターに含まれるプライマー部分を
利用してＰＣＲを行うことができる。
平滑末端を生ずる酵素を用い、メチル化非感受性制限酵
素として付着末端を生ずる酵素を用い、両端がメチル化
非感受性制限酵素による切断部であるDNA断片を特異的
に増幅するステップでは、メチル化非感受性制限酵素に
よって切断された付着末端に特異的に結合するアダプタ
ーを用い、当該アダプターに含まれるプライマー部分を
利用してＰＣＲを行うことができる。
【００１２】また、メチル化感受性制限酵素とメチル化
非感受性制限酵素としていずれも付着末端を生ずる酵素
を用い、メチル化感受性制限酵素でゲノムDNAを消化し
たのち当該メチル化感受性制限酵素によって切断された
付着末端の一本鎖部分を伸長させて平滑末端とするステ
ップを含み、両端がメチル化非感受性制限酵素による切
断部であるDNA断片を特異的に増幅するステップでは、
メチル化非感受性制限酵素によって切断された付着末端
に特異的に結合するアダプターを用い、当該アダプター
に含まれるプライマー部分を利用してＰＣＲを行うこと
ができる。
非感受性制限酵素としていずれも付着末端を生ずる酵素
を用い、メチル化感受性制限酵素でゲノムDNAを消化し
たのち当該メチル化感受性制限酵素によって切断された
付着末端の一本鎖部分を伸長させて平滑末端とするステ
ップを含み、両端がメチル化非感受性制限酵素による切
断部であるDNA断片を特異的に増幅するステップでは、
メチル化非感受性制限酵素によって切断された付着末端
に特異的に結合するアダプターを用い、当該アダプター
に含まれるプライマー部分を利用してＰＣＲを行うこと
ができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下、図面を参照して本発明の実
施の形態を説明する。 （１）プローブ及びバイオチップの作製 図１により、バイオチップ用プローブ及びバイオチップ
の作成方法について説明する。バイオチップ用プローブ
は、ゲノムDNA１００をメチル化非感受性制限酵素XmaI
で消化（切断）することによって得る。ゲノムDNA１０
０のXmaI認識部位には非メチル化部位１０１やメチル化
部位１０２がある。メチル化非感受性制限酵素XmaIで消
化することにより、メチル化の有無に関係なく全てのXm
aI認識部位が切断される。XmaIの認識部位と切断様式を
図２に示した。この消化反応によってできるゲノム DNA
断片１１１〜１１４は付着末端１１５ になっている。
施の形態を説明する。 （１）プローブ及びバイオチップの作製 図１により、バイオチップ用プローブ及びバイオチップ
の作成方法について説明する。バイオチップ用プローブ
は、ゲノムDNA１００をメチル化非感受性制限酵素XmaI
で消化（切断）することによって得る。ゲノムDNA１０
０のXmaI認識部位には非メチル化部位１０１やメチル化
部位１０２がある。メチル化非感受性制限酵素XmaIで消
化することにより、メチル化の有無に関係なく全てのXm
aI認識部位が切断される。XmaIの認識部位と切断様式を
図２に示した。この消化反応によってできるゲノム DNA
断片１１１〜１１４は付着末端１１５ になっている。
【００１４】次に、XmaIによって切断されたゲノムDNA
断片１１１〜１１４の付着末端に対し、図３に示す配列
をもつXmaI特異的アダプターを連結反応させる。XmaI特
異的アダプターは、図４に示すように、オリゴヌクレオ
チドP1：5'-AGCACTCTCCAGCCTCTCCGAC-3'と（c）オリゴ
ヌクレオチドP2：5'-CCGGGTCGGTGA-3'をアニーリングし
て作成されたものである。言い換えると、XmaI特異的ア
ダプターは、１）XmaI切断断片に特異的に結合するもの
で、２）数ベースがアニーリングしている2本鎖から成
り、さらに３）アダプター同士で連結しないようにリン
酸化されていないものである。
断片１１１〜１１４の付着末端に対し、図３に示す配列
をもつXmaI特異的アダプターを連結反応させる。XmaI特
異的アダプターは、図４に示すように、オリゴヌクレオ
チドP1：5'-AGCACTCTCCAGCCTCTCCGAC-3'と（c）オリゴ
ヌクレオチドP2：5'-CCGGGTCGGTGA-3'をアニーリングし
て作成されたものである。言い換えると、XmaI特異的ア
ダプターは、１）XmaI切断断片に特異的に結合するもの
で、２）数ベースがアニーリングしている2本鎖から成
り、さらに３）アダプター同士で連結しないようにリン
酸化されていないものである。
【００１５】次に、図５を用いてXmaI特異的アダプター
の使用方法を説明する。ここで、５００はXmaIに切断さ
れたゲノム DNA、５１０はリン酸基、５２０はゲノムDN
AとアダプターのオリゴヌクレオチドP１部位の連結部
分、５３０はゲノムDNAとアダプターのオリゴヌクレオ
チドP2部位の連結部分を示している。
の使用方法を説明する。ここで、５００はXmaIに切断さ
れたゲノム DNA、５１０はリン酸基、５２０はゲノムDN
AとアダプターのオリゴヌクレオチドP１部位の連結部
分、５３０はゲノムDNAとアダプターのオリゴヌクレオ
チドP2部位の連結部分を示している。
【００１６】XmaIに切断されたゲノム DNA５００とXmaI
特異的アダプター５１１，５１２とを連結反応させ、Xm
aI特異的アダプターと連結したゲノム DNA５４０を72℃
で5分間インキュベートし、ゲノムDNA断片に結合したXm
aI特異的アダプターのオリゴヌクレオチドP2部をはず
す。オリゴヌクレオチドP2はリン酸化されていないた
め、アダプターのオリゴヌクレオチドP2部位は連結部分
５３０で化学的にゲノムDNAと連結できない上、12merと
短いので、この条件でオリゴヌクレオチドP2部はゲノム
DNAから外れる。一方、ゲノムDNAとアダプターのオリゴ
ヌクレオチドP１連結部分５２０はXmaIに切断されたゲ
ノムDNA５００のリン酸基５１０を利用することで、化
学的に連結しており、この処理でゲノムDNAから外れる
ことはない。この後、DNA複製反応を行い、オリゴヌク
レオチドP1部に相補的なDNAを複製する。こうして作成
されたオリゴヌクレオチドP1部を含むDNA断片５５０
は、ゲノムDNA中で、図2に示す配列で両端をはさまれた
部分に相当する。このオリゴヌクレオチドP1部を含むDN
A断片５５０は、オリゴヌクレオチドP1配列をプライマ
ーとして増幅することができる。
特異的アダプター５１１，５１２とを連結反応させ、Xm
aI特異的アダプターと連結したゲノム DNA５４０を72℃
で5分間インキュベートし、ゲノムDNA断片に結合したXm
aI特異的アダプターのオリゴヌクレオチドP2部をはず
す。オリゴヌクレオチドP2はリン酸化されていないた
め、アダプターのオリゴヌクレオチドP2部位は連結部分
５３０で化学的にゲノムDNAと連結できない上、12merと
短いので、この条件でオリゴヌクレオチドP2部はゲノム
DNAから外れる。一方、ゲノムDNAとアダプターのオリゴ
ヌクレオチドP１連結部分５２０はXmaIに切断されたゲ
ノムDNA５００のリン酸基５１０を利用することで、化
学的に連結しており、この処理でゲノムDNAから外れる
ことはない。この後、DNA複製反応を行い、オリゴヌク
レオチドP1部に相補的なDNAを複製する。こうして作成
されたオリゴヌクレオチドP1部を含むDNA断片５５０
は、ゲノムDNA中で、図2に示す配列で両端をはさまれた
部分に相当する。このオリゴヌクレオチドP1部を含むDN
A断片５５０は、オリゴヌクレオチドP1配列をプライマ
ーとして増幅することができる。
【００１７】図１に戻り、XmaIによって切断されたゲノ
ムDNA断片１１１〜１１４に対して同様な処理を経て作
成したオリゴヌクレオチドP1部を含むDNA断片１２１〜
１２４は、分離した上で、オリゴヌクレオチドP１をプ
ライマーとして各々ＰＣＲ増幅し、DNAチップのプロー
ブとする。図１では、プローブとなるゲノムDNA断片の
増幅をＰＣＲによって行ったが、XmaI断片をクローン化
することも可能である。図６を用いてクローン化の説明
を行う。
ムDNA断片１１１〜１１４に対して同様な処理を経て作
成したオリゴヌクレオチドP1部を含むDNA断片１２１〜
１２４は、分離した上で、オリゴヌクレオチドP１をプ
ライマーとして各々ＰＣＲ増幅し、DNAチップのプロー
ブとする。図１では、プローブとなるゲノムDNA断片の
増幅をＰＣＲによって行ったが、XmaI断片をクローン化
することも可能である。図６を用いてクローン化の説明
を行う。
【００１８】この場合には、ゲノムDNA６００を XmaIで
切断し、切断したゲノムDNA断片６１０を、XmaI制限酵
素サイトを持つベクター（例えばプラスミドを用いる場
合はｐUC18系などで、さらにできればカナマイシン耐性
を持つｐHSG298、クロラムフェニコール耐性を持つpHSG
396など、抗生物質耐性などをもち、次に示す培養段階
で形質転換した宿主と、そうでない宿主の選択がしやす
いものが望ましい）に組み込み、XmaI断片を含む組み換
え体６２０を作成した後、これを用いて宿主（たとえば
大腸菌DH５α）６３０などに導入する。この宿主６３０
を適当な選択培地６４０で培養し、生えてきたシングル
コロニー６４１をピックアップすると、各々異なるDNA
が組み込まれたベクターをもつ宿主を選択できたことに
なる。このときコロニーハイブリダイゼーションを行う
ことで特定のDNAをもつ宿主の選択もできる。
切断し、切断したゲノムDNA断片６１０を、XmaI制限酵
素サイトを持つベクター（例えばプラスミドを用いる場
合はｐUC18系などで、さらにできればカナマイシン耐性
を持つｐHSG298、クロラムフェニコール耐性を持つpHSG
396など、抗生物質耐性などをもち、次に示す培養段階
で形質転換した宿主と、そうでない宿主の選択がしやす
いものが望ましい）に組み込み、XmaI断片を含む組み換
え体６２０を作成した後、これを用いて宿主（たとえば
大腸菌DH５α）６３０などに導入する。この宿主６３０
を適当な選択培地６４０で培養し、生えてきたシングル
コロニー６４１をピックアップすると、各々異なるDNA
が組み込まれたベクターをもつ宿主を選択できたことに
なる。このときコロニーハイブリダイゼーションを行う
ことで特定のDNAをもつ宿主の選択もできる。
【００１９】以上の操作でXma I断片のクローンが得ら
れ、必要ならばサンプルのXmaI断片のライブラリを作成
することもできる。さらにPCRにはベクターのプライマ
ー６２５を用いると、簡単に繰り返しこのDNAを利用で
きる。このような方法で得られたDNA断片の一部分の塩
基配列を、シーケンサーなどで決定し、その配列を合成
し、これをプローブとして用いることもできる。
れ、必要ならばサンプルのXmaI断片のライブラリを作成
することもできる。さらにPCRにはベクターのプライマ
ー６２５を用いると、簡単に繰り返しこのDNAを利用で
きる。このような方法で得られたDNA断片の一部分の塩
基配列を、シーケンサーなどで決定し、その配列を合成
し、これをプローブとして用いることもできる。
【００２０】以上のような方法で得られたDNA又はDNAの
一部分の配列を合成したものを適当な溶媒に溶解し、プ
ローブとして基板上に固定してバイオチップを作製す
る。溶媒としては、例えば滅菌蒸留水、TE、SSCなどの
バッファー、セルロースなどのポリマー、DMSOなどの有
機溶媒もしくはこれらの混合物を用いることができる。
一部分の配列を合成したものを適当な溶媒に溶解し、プ
ローブとして基板上に固定してバイオチップを作製す
る。溶媒としては、例えば滅菌蒸留水、TE、SSCなどの
バッファー、セルロースなどのポリマー、DMSOなどの有
機溶媒もしくはこれらの混合物を用いることができる。
【００２１】バイオチップの作製に当たっては、図１に
示すように、このDNA溶液を、例えばバイオチップ用の
細いピン１３１でバイオチップの基板１３０となるメン
ブランやスライドグラス上にスポットする。基板１３０
はDNAが結合しやすいよう、例えばポリリシンやシラン
のコーティングが施されている。バイオチップの作製に
は市販のバイオチップ作製装置を用いることもできる。
スポットしたプローブDNAを適当な方法で基板１３０上
に固定した後、ターゲットとのハイブリダイゼーション
に用いる。
示すように、このDNA溶液を、例えばバイオチップ用の
細いピン１３１でバイオチップの基板１３０となるメン
ブランやスライドグラス上にスポットする。基板１３０
はDNAが結合しやすいよう、例えばポリリシンやシラン
のコーティングが施されている。バイオチップの作製に
は市販のバイオチップ作製装置を用いることもできる。
スポットしたプローブDNAを適当な方法で基板１３０上
に固定した後、ターゲットとのハイブリダイゼーション
に用いる。
【００２２】（２）試料（ターゲット）の調製
次に、上述のようにして作製されたバイオチップを用い
てメチル化部位を解析すべき、ゲノム試料の調製方法に
ついて説明する。ここでは同じ認識部位を切断するメチ
ル化感受性制限酵素と非感受性制限酵素にSmaIとXmaIを
用い、XmaIに特異的なアダプターを用いて、ゲノムDNA
の中でメチル化されているSmaI，XmaI認識部位にはさま
れた部分を増幅する方法について説明する。
てメチル化部位を解析すべき、ゲノム試料の調製方法に
ついて説明する。ここでは同じ認識部位を切断するメチ
ル化感受性制限酵素と非感受性制限酵素にSmaIとXmaIを
用い、XmaIに特異的なアダプターを用いて、ゲノムDNA
の中でメチル化されているSmaI，XmaI認識部位にはさま
れた部分を増幅する方法について説明する。
【００２３】図７は、ゲノムDNAに含まれているSmaI，X
maI認識部位のうちメチル化されているメチレーション
サイトに挟まれた部分を増幅する方法の説明図である。
SmaI及びXmaIで切断される非メチル化部位７０１や、Xm
aIで切断されるメチル化部位７０２を含むゲノム DNA７
００を、最初、メチル化感受性制限酵素SmaIで消化す
る。SmaIの認識部位と切断様式は図８に示す通りであ
り、この消化反応によってできるSmaI消化ゲノム DNA断
片７１０は平滑末端７１１になっている。次に、SmaIで
消化したSmaI消化済みゲノム DNA７１０をさらにメチル
化非感受性制限酵素XmaIで消化する。この消化反応によ
ってできるXmaI消化ゲノム DNA断片７２０は付着末端
７２１になっている。
maI認識部位のうちメチル化されているメチレーション
サイトに挟まれた部分を増幅する方法の説明図である。
SmaI及びXmaIで切断される非メチル化部位７０１や、Xm
aIで切断されるメチル化部位７０２を含むゲノム DNA７
００を、最初、メチル化感受性制限酵素SmaIで消化す
る。SmaIの認識部位と切断様式は図８に示す通りであ
り、この消化反応によってできるSmaI消化ゲノム DNA断
片７１０は平滑末端７１１になっている。次に、SmaIで
消化したSmaI消化済みゲノム DNA７１０をさらにメチル
化非感受性制限酵素XmaIで消化する。この消化反応によ
ってできるXmaI消化ゲノム DNA断片７２０は付着末端
７２１になっている。
【００２４】次に、XmaIに切断されたゲノムDNA断片の
付着末端７２１に対し、図３にて説明したXmaI特異的ア
ダプターを連結反応させる。このとき、このアダプター
はSmaIに切断されたゲノムDNA断片の平滑末端７１１に
は連結しない。この後、図１及び図５にて説明したよう
に、両端にXmaI特異的アダプターが連結したゲノム DNA
を72℃で5分間インキュベートし、ゲノムDNA断片に結合
したXmaI特異的アダプターのオリゴヌクレオチドP2部を
はずし、その部分を伸長させる。こうして作成されたオ
リゴヌクレオチドP1部を含むDNA断片７３１，７３２
は、ゲノムDNA７００中で、図2に示す配列で両端をはさ
まれ、かつその両端がいずれもメチル化されていた部分
に相当する。このオリゴヌクレオチドP1部を含むDNA断
片７３１，７３２は、オリゴヌクレオチドP1配列をプラ
イマーとして増幅することができ、増幅するときに蛍光
物質、例えばCy3やCy5でDNAを標識することでバイオチ
ップ用ターゲットとされる。標識方法には例えばランダ
ムプライミング等の方法が挙げられる。
付着末端７２１に対し、図３にて説明したXmaI特異的ア
ダプターを連結反応させる。このとき、このアダプター
はSmaIに切断されたゲノムDNA断片の平滑末端７１１に
は連結しない。この後、図１及び図５にて説明したよう
に、両端にXmaI特異的アダプターが連結したゲノム DNA
を72℃で5分間インキュベートし、ゲノムDNA断片に結合
したXmaI特異的アダプターのオリゴヌクレオチドP2部を
はずし、その部分を伸長させる。こうして作成されたオ
リゴヌクレオチドP1部を含むDNA断片７３１，７３２
は、ゲノムDNA７００中で、図2に示す配列で両端をはさ
まれ、かつその両端がいずれもメチル化されていた部分
に相当する。このオリゴヌクレオチドP1部を含むDNA断
片７３１，７３２は、オリゴヌクレオチドP1配列をプラ
イマーとして増幅することができ、増幅するときに蛍光
物質、例えばCy3やCy5でDNAを標識することでバイオチ
ップ用ターゲットとされる。標識方法には例えばランダ
ムプライミング等の方法が挙げられる。
【００２５】図９は、試料調製の際に用いる2種の酵素
として、どちらも付着末端を生ずるものを用いた場合の
説明図である。まず、ゲノムDNA９００を先にメチル化
感受性酵素で消化する。こうして得られるメチル化感受
性酵素消化ゲノムDNA９１０は付着末端９１１を有す
る。次に生じた付着末端９１１の一本鎖部分をクレノウ
フラグメントなどのDNAポリメラーゼを用いて伸長させ
て平滑末端９１２とする。
として、どちらも付着末端を生ずるものを用いた場合の
説明図である。まず、ゲノムDNA９００を先にメチル化
感受性酵素で消化する。こうして得られるメチル化感受
性酵素消化ゲノムDNA９１０は付着末端９１１を有す
る。次に生じた付着末端９１１の一本鎖部分をクレノウ
フラグメントなどのDNAポリメラーゼを用いて伸長させ
て平滑末端９１２とする。
【００２６】その後、もう一方のメチル化非感受性酵素
で消化すると、得られるメチル化非感受性酵素消化ゲノ
ムDNA９２０は付着末端９２１を有する。そこで、後者
のメチル化非感受性酵素に特異的なアダプターを連結さ
せ、図１及び図５で説明したのと同様の反応を行い、特
異的アダプターに含まれるプライマー部分を利用してPC
Rを行うと、PCR産物として両端がメチル化しているDNA
の断片を得ることができる。
で消化すると、得られるメチル化非感受性酵素消化ゲノ
ムDNA９２０は付着末端９２１を有する。そこで、後者
のメチル化非感受性酵素に特異的なアダプターを連結さ
せ、図１及び図５で説明したのと同様の反応を行い、特
異的アダプターに含まれるプライマー部分を利用してPC
Rを行うと、PCR産物として両端がメチル化しているDNA
の断片を得ることができる。
【００２７】以下に、本発明の方法によって行った、マ
ウスの新生児とES細胞のゲノムDNAのメチル化部位の検
出について説明する。図１０は、メチル化部位検出の手
順を示す概略説明図である。
ウスの新生児とES細胞のゲノムDNAのメチル化部位の検
出について説明する。図１０は、メチル化部位検出の手
順を示す概略説明図である。
【００２８】バイオチップ１０００には、ポリリシンコ
ート済みのガラスを基板とし、プローブDNAを10サンプ
ル×４回スポットしたものを用いた。バイオチップ１０
００にスポットした各DNAはマウス新生児のゲノムDNAを
XmaI断片化して増幅したもの、即ち上述のメチル化部位
を含むゲノムDNAのXmaI断片であり、メチル化、非メチ
ル化を調べることができる。
ート済みのガラスを基板とし、プローブDNAを10サンプ
ル×４回スポットしたものを用いた。バイオチップ１０
００にスポットした各DNAはマウス新生児のゲノムDNAを
XmaI断片化して増幅したもの、即ち上述のメチル化部位
を含むゲノムDNAのXmaI断片であり、メチル化、非メチ
ル化を調べることができる。
【００２９】マウスの新生児のゲノムDNA１０１０とES
細胞のゲノムDNA１０２０を、それぞれ別々にメチル化
感受性の制限酵素SmaIで消化する処理１１００、メチル
化非感受性の制限酵素XmaIで消化する処理１２００、Xm
aI特異的アダプターを連結させる処理１３００、標識付
けして増幅するＰＣＲ、標識反応１４００を行った。タ
ーゲットは図７に関して述べたランダムプライマー法を
用い、マウスの新生児のゲノムDNA１０１０をＣｙ3、ES
細胞のゲノムDNA１０２０をＣｙ5で標識した。ハイブリ
ダイゼーション１５００の後、バックグランドを落とす
ためにスライドグラスを洗浄して蛍光検出した。
細胞のゲノムDNA１０２０を、それぞれ別々にメチル化
感受性の制限酵素SmaIで消化する処理１１００、メチル
化非感受性の制限酵素XmaIで消化する処理１２００、Xm
aI特異的アダプターを連結させる処理１３００、標識付
けして増幅するＰＣＲ、標識反応１４００を行った。タ
ーゲットは図７に関して述べたランダムプライマー法を
用い、マウスの新生児のゲノムDNA１０１０をＣｙ3、ES
細胞のゲノムDNA１０２０をＣｙ5で標識した。ハイブリ
ダイゼーション１５００の後、バックグランドを落とす
ためにスライドグラスを洗浄して蛍光検出した。
【００３０】図１１の上段にマウスの新生児のゲノムDN
A由来蛍光強度（Cy３）、中段にES細胞のゲノムDNA由来
蛍光強度（Cy５）を示す。バイオチップ上でのプローブ
DNAの配置を図１１の下段に示した。蛍光が強いスポッ
トは白く見え、蛍光が弱くなると徐々に暗く表示されて
いる。
A由来蛍光強度（Cy３）、中段にES細胞のゲノムDNA由来
蛍光強度（Cy５）を示す。バイオチップ上でのプローブ
DNAの配置を図１１の下段に示した。蛍光が強いスポッ
トは白く見え、蛍光が弱くなると徐々に暗く表示されて
いる。
【００３１】この蛍光強度を数値化し、グラフ化したも
のを図１２に示したグラフの横軸はプローブDNAの番号
１〜10を、縦軸左側にCy３の蛍光強度に対するCy５の蛍
光強度の比＝Cy5／Cy3を示し、縦軸右側に分散図上での
各スポットの原点からの距離＝ [（Cy3蛍光強度）2＋
（Cy5蛍光強度）2]1/2を示している。10サンプル×４回
スポットしているうち、原点からの距離は１セットにつ
いて、Cy5/Cy3は4セットすべてについて表示している。
のを図１２に示したグラフの横軸はプローブDNAの番号
１〜10を、縦軸左側にCy３の蛍光強度に対するCy５の蛍
光強度の比＝Cy5／Cy3を示し、縦軸右側に分散図上での
各スポットの原点からの距離＝ [（Cy3蛍光強度）2＋
（Cy5蛍光強度）2]1/2を示している。10サンプル×４回
スポットしているうち、原点からの距離は１セットにつ
いて、Cy5/Cy3は4セットすべてについて表示している。
【００３２】図１２から、7番のDNAについて、Cy3の蛍
光強度がCy5の蛍光強度よりも2倍程度高いことが見て取
れる。これによってこのDNAはマウス新生児のゲノムDNA
の方がES細胞のゲノムDNAに比べて2倍程高くメチル化さ
れていることが分かった。また、これは従来法で得られ
た結果と同様であった。
光強度がCy5の蛍光強度よりも2倍程度高いことが見て取
れる。これによってこのDNAはマウス新生児のゲノムDNA
の方がES細胞のゲノムDNAに比べて2倍程高くメチル化さ
れていることが分かった。また、これは従来法で得られ
た結果と同様であった。
【００３３】
【発明の効果】本発明によると、ゲノム中のメチル化部
位を網羅的に解析することが可能になる。
位を網羅的に解析することが可能になる。
【図１】バイオチップ用プローブ及びバイオチップの作
成方法についての説明図。
成方法についての説明図。
【図２】XmaIの認識配列と切断様式を示す図。
【図３】XmaI特異的アダプターの配列を示す図。
【図４】XmaI特異的アダプターの作成方法を示す図。
【図５】XmaI特異的アダプターの使用方法を示す図。
【図６】バイオチップ用プローブの作成方法とそのクロ
ーン化の説明図。
ーン化の説明図。
【図７】ゲノムDNAの中でメチル化されている配列には
さまれた部分を増幅する方法の説明図。
さまれた部分を増幅する方法の説明図。
【図８】SmaIの認識配列と切断様式を示す図。
【図９】付着末端を生ずる制限酵素を用いたバイオチッ
プ用ターゲットの作成方法を示す図。
プ用ターゲットの作成方法を示す図。
【図１０】メチル化部位検出の手順を示す概略説明図。
【図１１】ハイブリダイゼーション蛍光検出画像とプロ
ーブDNAの配置を示す図。
ーブDNAの配置を示す図。
【図１２】蛍光強度を数値化してグラフ化した図。
１００…ゲノムDNA、１１１…非メチル化部位、１１２
…メチル化部位、１１１〜１１４…XmaIによって切断さ
れたゲノムDNA断片、１１５…付着末端、１３０…基
板、１３１…ピン、５００…XmaIに切断されたゲノム D
NA、５１０…リン酸基、５１１，５１２…XmaI特異的ア
ダプター、５５０…オリゴヌクレオチドP1部を含むDNA
断片、６００…ゲノムDNA、６１０…XmaIで切断したゲ
ノムDNA断片、６２０…XmaI断片を含む組み換え体、６
２５…ベクターのプライマー、６３０…宿主、６４０…
選択培地、６４１…シングルコロニー、７００…ゲノム
DNA、７０１…非メチル化部位、７０２…メチル化部
位、７１１…平滑末端、７２１…付着末端、９００…ゲ
ノムDNA、９１０…メチル化感受性酵素消化ゲノムDNA、
９１１…付着末端、９１２…平滑末端、９２０…メチル
化非感受性酵素消化ゲノムDNA、９２０…付着末端、９
３１，９３２…メチル化非感受性酵素に特異的なアダプ
ター、１０００…バイオチップ、１１００…メチル化感
受性制限酵素SmaIによる消化、１２００…メチル化非感
受性制限酵素XmaIによる消化、１３００…XmaI特異的ア
ダプター連結処理、１４００…ＰＣＲ・標識反応、１５
００…ハイブリダイゼーション
…メチル化部位、１１１〜１１４…XmaIによって切断さ
れたゲノムDNA断片、１１５…付着末端、１３０…基
板、１３１…ピン、５００…XmaIに切断されたゲノム D
NA、５１０…リン酸基、５１１，５１２…XmaI特異的ア
ダプター、５５０…オリゴヌクレオチドP1部を含むDNA
断片、６００…ゲノムDNA、６１０…XmaIで切断したゲ
ノムDNA断片、６２０…XmaI断片を含む組み換え体、６
２５…ベクターのプライマー、６３０…宿主、６４０…
選択培地、６４１…シングルコロニー、７００…ゲノム
DNA、７０１…非メチル化部位、７０２…メチル化部
位、７１１…平滑末端、７２１…付着末端、９００…ゲ
ノムDNA、９１０…メチル化感受性酵素消化ゲノムDNA、
９１１…付着末端、９１２…平滑末端、９２０…メチル
化非感受性酵素消化ゲノムDNA、９２０…付着末端、９
３１，９３２…メチル化非感受性酵素に特異的なアダプ
ター、１０００…バイオチップ、１１００…メチル化感
受性制限酵素SmaIによる消化、１２００…メチル化非感
受性制限酵素XmaIによる消化、１３００…XmaI特異的ア
ダプター連結処理、１４００…ＰＣＲ・標識反応、１５
００…ハイブリダイゼーション
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
37/00 １０２ Ｆ
(72)発明者 畑田 出穂
群馬県前橋市下小出町２−51−25 サンパ
レス前橋801
(72)発明者 辻本 敦美
神奈川県横浜市保土ヶ谷区神戸町134番地
横浜ビジネスパーク イーストタワー14
階 株式会社ディーエヌエイチップ研究所
内
(72)発明者 加藤 あずさ
神奈川県横浜市保土ヶ谷区神戸町134番地
横浜ビジネスパーク イーストタワー14
階 株式会社ディーエヌエイチップ研究所
内
(72)発明者 百合野 以子
神奈川県横浜市保土ヶ谷区神戸町134番地
横浜ビジネスパーク イーストタワー14
階 株式会社ディーエヌエイチップ研究所
内
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA09 HA09 HA12
HA20
4B029 AA07 AA23 BB20 CC03 CC08
FA15
4B063 QA01 QA13 QQ42 QR14 QR32
QR56 QR62 QR84 QS25 QS34
Claims (11)
- 【請求項１】 両端にメチレーションサイトをもつゲノ
ムDNA断片の配列の少なくとも一部を含む複数種類の塩
基配列をそれぞれ基板上の異なる位置に固定したことを
特徴とするゲノムDNA中のメチレーションサイトのメチ
ル化検出用バイオチップ。 - 【請求項２】 同じ認識部位を有するメチル化感受性制
限酵素とメチル化非感受性制限酵素の前記認識部位で両
端が切断されたDNA断片の配列の少なくとも一部を含む
複数種類の塩基配列をそれぞれ基板上の異なる位置に固
定したことを特徴とするゲノムDNA中のメチレーション
サイトのメチル化検出用バイオチップ。 - 【請求項３】 ゲノムDNA中のメチレーションサイトに
おけるメチル化の検出に用いるメチル化検出用バイオチ
ップの製造方法であって、 同じ認識部位を切断するメチル化感受性制限酵素が存在
するメチル化非感受性制限酵素でゲノムDNAを消化する
ステップと、 得られたDNA断片をそれぞれ増幅するステップと、 増幅したDNA断片をそれぞれ基板上の異なる位置に固定
するステップとを含むことを特徴とするメチル化検出用
バイオチップの製造方法。 - 【請求項４】 ゲノムDNA中のメチル化されたメチレー
ションサイトを検出する方法において、 ゲノムDNA中で２つのメチル化されている部位に挟まれ
た塩基配列を特異的に増幅するステップと、 両端がメチレーションサイトであるゲノムDNA断片の配
列の少なくとも一部を含む複数種類の塩基配列がそれぞ
れ基板上の異なる位置に固定されたバイオチップを用い
て前記増幅された塩基配列を検出するステップとを含む
ことを特徴とする方法。 - 【請求項５】 請求項４記載の方法において、前記２つ
のメチル化されているメチレーションサイトに挟まれた
塩基配列を特異的に増幅するステップは、同じ認識部位
を切断するメチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性
制限酵素、及びいずれかの制限酵素に特異的なアダプタ
ーを用いることを特徴とする方法。 - 【請求項６】 請求項５記載の方法において、前記アダ
プターは2種のオリゴマーから成ることを特徴とする方
法。 - 【請求項７】 請求項６記載の方法において、前記2種
のオリゴマーはリン酸化されていないことを特徴とする
方法。 - 【請求項８】 請求項６記載の方法において、前記2種
のオリゴマーは数baseがアニーリングすることを特徴と
する方法。 - 【請求項９】 ゲノムDNA中のメチル化されたメチレー
ションサイトを検出する方法において、 同じ認識部位を切断するメチル化感受性制限酵素とメチ
ル化非感受性制限酵素のうちメチル化感受性制限酵素で
ゲノムDNAを消化するステップと、 前記メチル化感受性制限酵素で消化したゲノムDNAを前
記メチル化非感受性制限酵素で消化するステップと、 両端が前記メチル化非感受性制限酵素による切断部であ
るDNA断片を特異的に増幅するステップと、 前記増幅したDNA断片を、対応するプローブが基板上に
固定されたバイオチップを用いて検出するステップとを
含むことを特徴とする方法。 - 【請求項１０】 請求項９記載の方法において、前記メ
チル化感受性制限酵素は平滑末端を生ずる酵素であり、
前記メチル化非感受性制限酵素は付着末端を生ずる酵素
であり、前記両端が前記メチル化非感受性制限酵素によ
る切断部であるDNA断片を特異的に増幅するステップで
は、前記メチル化非感受性制限酵素によって切断された
付着末端に特異的に結合するアダプターを用い、当該ア
ダプターに含まれるプライマー部分を利用してＰＣＲを
行うことを特徴とする方法。 - 【請求項１１】 請求項９記載の方法において、前記メ
チル化感受性制限酵素と前記メチル化非感受性制限酵素
はいずれも付着末端を生ずる酵素であり、前記メチル化
感受性制限酵素でゲノムDNAを消化したのち当該メチル
化感受性制限酵素によって切断された付着末端の一本鎖
部分を伸長させて平滑末端とするステップを含み、前記
両端が前記メチル化非感受性制限酵素による切断部であ
るDNA断片を特異的に増幅するステップでは、前記メチ
ル化非感受性制限酵素によって切断された付着末端に特
異的に結合するアダプターを用い、当該アダプターに含
まれるプライマー部分を利用してＰＣＲを行うことを特
徴とする方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001189686A JP2003038183A (ja) | 2001-06-22 | 2001-06-22 | ゲノムｄｎａ中のメチレーションサイトのメチル化検出用バイオチップ及びメチル化検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001189686A JP2003038183A (ja) | 2001-06-22 | 2001-06-22 | ゲノムｄｎａ中のメチレーションサイトのメチル化検出用バイオチップ及びメチル化検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003038183A true JP2003038183A (ja) | 2003-02-12 |
Family
ID=19028575
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001189686A Withdrawn JP2003038183A (ja) | 2001-06-22 | 2001-06-22 | ゲノムｄｎａ中のメチレーションサイトのメチル化検出用バイオチップ及びメチル化検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003038183A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005080565A1 (ja) | 2004-02-20 | 2005-09-01 | Japan Science And Technology Agency | Ｄｎａメチル化分析用ｄｎａアレイ及びその製造方法並びにｄｎａメチル化分析方法 |
| JP2007508017A (ja) * | 2003-10-08 | 2007-04-05 | ザ トラスティーズ オブ ボストン ユニバーシティ | 染色体異常の出生前診断のための方法 |
| JP2012513197A (ja) * | 2008-12-23 | 2012-06-14 | コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ | 無再発生存を予測するためのメチル化バイオマーカー |
| JP2014223089A (ja) * | 2008-04-25 | 2014-12-04 | 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター | Ｄｎａメチル化分析方法 |
-
2001
- 2001-06-22 JP JP2001189686A patent/JP2003038183A/ja not_active Withdrawn
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007508017A (ja) * | 2003-10-08 | 2007-04-05 | ザ トラスティーズ オブ ボストン ユニバーシティ | 染色体異常の出生前診断のための方法 |
| JP2011147451A (ja) * | 2003-10-08 | 2011-08-04 | Trustees Of Boston Univ | 染色体異常の出生前診断のための方法 |
| WO2005080565A1 (ja) | 2004-02-20 | 2005-09-01 | Japan Science And Technology Agency | Ｄｎａメチル化分析用ｄｎａアレイ及びその製造方法並びにｄｎａメチル化分析方法 |
| JPWO2005080565A1 (ja) * | 2004-02-20 | 2007-10-25 | 独立行政法人科学技術振興機構 | Ｄｎａメチル化分析用ｄｎａアレイ及びその製造方法並びにｄｎａメチル化分析方法 |
| JP4688792B2 (ja) * | 2004-02-20 | 2011-05-25 | 独立行政法人科学技術振興機構 | Ｄｎａメチル化分析用ｄｎａアレイ及びその製造方法並びにｄｎａメチル化分析方法 |
| JP2014223089A (ja) * | 2008-04-25 | 2014-12-04 | 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター | Ｄｎａメチル化分析方法 |
| JP2012513197A (ja) * | 2008-12-23 | 2012-06-14 | コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ | 無再発生存を予測するためのメチル化バイオマーカー |
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