JP2003033193A - ヒトシスタチンｅ - Google Patents
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Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 骨粗鬆症、腫瘍転移、細菌感染、ウイルス感
染、敗血性ショック、炎症、網膜過敏、カリエス、悪液
質、および筋肉るいそうの処置に利用するためのポリペ
プチドを得ることを課題とする。さらに、このポリペプ
チドのコード配列における変異、および宿主由来のサン
プル中のポリぺプチドの濃度の変化を検出するための診
断方法を開発することを課題とする。 【解決手段】 ヒトＣｙｓＥポリペプチド、およびこの
ようなポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）を同
定し、組換え技術によりこのようなポリペプチドを産生
する。
染、敗血性ショック、炎症、網膜過敏、カリエス、悪液
質、および筋肉るいそうの処置に利用するためのポリペ
プチドを得ることを課題とする。さらに、このポリペプ
チドのコード配列における変異、および宿主由来のサン
プル中のポリぺプチドの濃度の変化を検出するための診
断方法を開発することを課題とする。 【解決手段】 ヒトＣｙｓＥポリペプチド、およびこの
ようなポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）を同
定し、組換え技術によりこのようなポリペプチドを産生
する。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。より
詳細には、本発明のポリペプチドは、ヒトシスタチンＥ
として推定的に同定されており、本明細書中、以下でと
きどき「ＣｙｓＥ」と呼ばれる。本発明はまた、このよ
うなポリペプチドの作用を阻害することに関する。 【０００２】 【従来の技術】シスタチンのスーパーファミリーは、シ
ステインプロテイナーゼインヒビターの群を包含し、こ
れらはヒトの組織および体液に広く分布し、そしてそれ
らは強固でかつ可逆的な複合体を、カテプシンＢ、Ｈ、
Ｌ、およびＳのようなシステインプロテイナーゼと形成
する。シスタチンは、これらのプロテイナーゼが参加す
る正常または病理学的なプロセスの調節に関わっている
ことが最もあり得る。従って、シスタチンは、タンパク
質およびペプチドの細胞内および細胞外異化に影響を及
ぼし得（Ｂａｒｒｅｔ，Ａ．Ｊ．およびＫｉｒｃｈｋ
ｅ，Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，８０：
５３５−５６１（１９８１））、プロホルモン（Ｏｒｌ
ｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，５２：４９−７４（１９８３））およびプロ酵素
（Ｔａｕｇｎｅｒ，Ｒ．ら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，８３：１０３−１０８（１９８５））のタンパク
質分解的プロセシングを調節し得、悪性細胞（Ｓｌｏａ
ｎｅ，Ｂ．Ｆ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏ
ｌ．，１：１３７−１５２（１９９０））または微生物
（Ｂｊｏｒｃｋ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３３７：３８
５−３８６（１９８９）およびＢｊｏｒｃｋ，Ｌ．ら、
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６４：９４１−９４３（１９９
０））による正常細胞の侵入に対して保護し得、そして
関節リューマチにおける局所的な炎症性プロセス（Ｍｏ
ｒｔ，Ｊ．Ｓ．ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕ
ｍ．，２７：５０９−５１５（１９８４））および化膿
性の気管支拡張症（Ｂｕｔｔｌｅ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｓｃａ
ｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５０：
５０９−５１６（１９９０））を調節し得る。 【０００３】シスタチンのスーパーファミリーは、ファ
ミリーＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ（それぞれ、ステフィン
ファミリー、シスタチンファミリー、およびキニノーゲ
ンファミリーとも呼ばれる）に細区画されており、各々
が他方のファミリーのメンバーと構造的機構および生物
学的分布において異なるメンバーを有する（Ｂａｒｒｅ
ｔ，Ａ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２３６：３１
２（１９８６））。ファミリーＩシスタチンＡおよびＢ
は、単一の約１００アミノ酸残基のポリペプチド鎖から
なり、ジスルフィド架橋を有しない。ファミリーＩＩシ
スタチンは、約１２０鎖アミノ酸残基のポリぺプチド鎖
からなり、２つの鎖内ジスルフィド結合を有する。最後
に、ファミリーＩＩＩシスタチンであるキニノーゲン
は、３つのファミリーＩＩシスタチン様ドメインの存在
によって特徴づけられるような、高度の構造的な複雑さ
を示す。各々のドメインは、２つのジスルフィド架橋
を、ファミリーＩＩシスタチンに相同な位置に有する
（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｓｔｅｒｌ，Ｗ．ら、Ｔｒａｎｓｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１１：３３６−３３９（１９
８６））。ファミリーＩおよびＩＩシスタチンは、主に
細胞内、および分泌液中に存在する（Ａｂｒａｈａｍｓ
ｏｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：１
１２８２−１１２８９（１９８６））、これに対しキニ
ノーゲンは、血液プラズマに非常に濃縮されている（Ａ
ｄａｍ，Ａ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３１：４２３
−４２６（１９８５））。 【０００４】少なくとも１つのＩＩ型シスタチンで、シ
スタチンＣと命名されているものが、全ての組織中に発
現されているようである（Ａｂｒａｈａｍｓｏｎ，Ｍ．
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２６８：２８７−２９４
（１９９０））。これに対して、Ｓ−型のシスタチン
は、唾液中に優性に見出される（Ａｂｒａｈａｍｓｏ
ｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：１１
２８２−１１２８９（１９８６））。シスタチンおよび
派生的ペプチドは、抗菌活性および抗ウイルス活性を有
し（Ｂｊｏｒｃｋら、（１９８９，１９９０））、これ
はそれらが環境に直接曝露された上皮の表面を濡らして
いる分泌物中に存在することと一致する。シスタチンは
また、免疫応答を調節し得る。これは、マクロファージ
によるシスタチンプロテアーゼの放出を阻害することに
よって（Ｂｉｅｔｈ，Ｊ．，Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｉｎｈｉｂｉ
ｔｏｒｓ，Ｖ．Ｔｕｒｋ，編（Ｗａｌｔｅｒ Ｄｅ Ｇ
ｒｕｙｔｅｒ＆Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）６
９３−７０３頁（１９８６））、直接的に起こり得る
か、または走化性の応答および細胞のファゴサイトーシ
ス関連のレスピラトリーバーストを阻害することによっ
て（Ｌｅｕｎｇ−Ｔａｃｋら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
３７１：２５５−２５８（１９９０））、非直接的に起
こり得る。このデータは、ＩＩ型のシスタチンが、上皮
表面で種々の保護性の機能を行い得ることを示唆する。
ヒトＩＩ型シスタチン遺伝子ファミリーは、少なくとも
７つのメンバーからなる。 【０００５】遺伝性シスタチンＣアミロイド脈管障害
（ＨＣＣＡＡ）疾患は、シスタチンＣをコードする遺伝
子中の、Ｇｌｕ→Ｌｅｕ変異に関連する。これは、大脳
動脈におけるこの変異シスタチンＣから成るアミロイド
線維の沈着を導く。これは致命的な出血を引き起こすよ
うである（Ｇｈｉｓｏ，Ｊ．ら、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，８
３：２９７４−２９７８（１９８６））。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、骨粗鬆症、
腫瘍転移、細菌感染、ウイルス感染、敗血性ショック、
炎症、網膜過敏、カリエス、悪液質、および筋肉るいそ
うの処置に利用するためのポリペプチドを得ることを課
題とする。さらに、このポリペプチドのコード配列にお
ける変異、および宿主由来のサンプル中のポリぺプチド
の濃度の変化を検出するための診断方法を開発すること
を課題とする。 【０００７】 【課題を解決するための手段】１つの局面において、本
発明は、図１に示す配列のヌクレオチド１からヌクレオ
チド５７６からなるポリヌクレオチドに関する。 【０００８】好ましい実施形態において、本発明は、図
１に示す配列のヌクレオチド１４からヌクレオチド４５
９からなるポリヌクレオチドである。 【０００９】１つの局面において、本発明は、上記のＤ
ＮＡを含むベクターに関する。 【００１０】１つの局面において、本発明は、上記のベ
クターで遺伝子操作された宿主細胞に関する。 【００１１】１つの局面において、本発明は、ポリペプ
チドを産生するためのプロセスに関し、このプロセス
は、上記の宿主細胞から前記ＤＮＡによりコードされる
ポリペプチドを発現する工程を包含する。 【００１２】好ましい実施形態において、本発明は、上
記のベクターで細胞を遺伝子操作する工程を包含する、
ポリペプチドを発現し得る細胞を産生するためのプロセ
スである。 【００１３】１つの局面において、本発明は、以下から
なる群から選択されるメンバーを包含するポリペプチド
である：（ｉ）図１の推定アミノ酸配列を有するポリペ
プチドならびにそのフラグメント、アナログ、および誘
導体；および（ｉｉ）ＡＴＣＣ受託番号９７１０３のｃ
ＤＮＡによりコードされるポリペプチド、ならびに該ポ
リペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体。 【００１４】好ましい実施形態において、本発明は、上
記のポリペプチドのレセプターを活性化する化合物であ
る。 【００１５】好ましい実施形態において、本発明は、上
記のポリペプチドのレセプターを阻害する化合物であ
る。 【００１６】１つの局面において、本発明は、上記のポ
リぺプチドの治療有効量を患者に投与する工程を包含す
る、ＣｙｓＥの必要性を有する患者の処置のための方
法。 【００１７】好ましい実施形態において、本発明は、上
記ポリぺプチドをコードし、そして該ポリぺプチドをイ
ンビボで発現するＤＮＡを患者に提供することによっ
て、上記治療有効量のポリぺプチドが投与される方法で
ある。 【００１８】１つの局面において、本発明は、ＣｙｓＥ
ポリぺプチドを阻害する必要性を有する患者の処置方法
に関し、この方法は、上記の化合物の治療有効量を患者
に投与する工程を包含する。 【００１９】１つの局面において、本発明は、上記のポ
リぺプチドの過小発現に関連する疾患または疾患に対す
る感受性を診断するためのプロセスに関し、このプロセ
スは、該ポリぺプチドをコードする核酸配列中の変異を
決定する工程を包含する。 【００２０】１つの局面において、本発明は、診断プロ
セスに関し、このプロセスは、宿主由来のサンプルにお
ける請求項１２に記載のポリぺプチドの存在を分析する
工程を包含する。 【００２１】１つの局面において、本発明は、上記のポ
リペプチドに結合し、そして該ポリペプチドに対するレ
セプターを活性化する化合物を同定するための方法に関
し、この方法は、細胞表面上でこのポリペプチドに対す
るレセプターを発現する細胞と、スクリーニングされる
べき化合物とを、このレセプターへの結合を許容する条
件下で接触させる工程であって、このレセプターは、化
合物のこのレセプターへの結合に応答して検出可能なシ
グナルを提供し得る第２の成分と会合される、工程；お
よび、この化合物とこのレセプターとの相互作用から生
成されるシグナルの存在を検出することにより、この化
合物がこのレセプターに結合し、そしてこのレセプター
を活性化するか否かを決定する工程、を包含する方法で
ある。 【００２２】 【発明の実施の形態】本発明のポリぺプチドは、シスタ
チンＣとのアミノ酸配列の相同性の結果として、推定的
にＣｙｓＥとして同定された。この同定は、アミノ酸配
列の相同性の結果としてなされた。 【００２３】本発明の１つの局面によれば、新規の成熟
ポリペプチド、ならびにそれらの生物学的に活性で、か
つ診断または治療に有用なフラグメント、アナログおよ
び誘導体が提供される。本発明のポリペプチドはヒト起
源である。 【００２４】本発明の別の局面によれば、本発明のポリ
ペプチドをコードする単離された核酸分子が提供され、
この核酸分子は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノム
ＤＮＡ、ならびにアナログ、および生物学的に活性で、
かつ診断または治療に有用なそれらのフラグメントを含
む。 【００２５】本発明のなおさらなる局面によれば、本発
明のポリペプチドをコードするヒト核酸配列を含む組換
え原核生物宿主細胞および／または組換え真核生物宿主
細胞を、前記タンパク質の発現およびその後の前記タン
パク質の回収を促進する条件下で、培養する工程を包含
する組換え技術によってこのようなポリペプチドを産生
するためのプロセスが提供される。 【００２６】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなポリペプチド、またはこのようなポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを、治療的目的、例えば、
カテプシンを阻害するために、ならびに骨粗相症、腫瘍
の転移、ウイルス複製、炎症、化膿の気管支拡張症を妨
げるため、網膜を保護するため、白質脳症を妨げるた
め、カリエスを減少させるため、アレルギー反応を処置
するため、悪液質および筋るいそうを処置するため、な
らびにアミロイド症を妨げるため、ならびに抗菌剤とし
て利用するためのプロセスが提供される。 【００２７】本発明のなおさらなる局面によれば、本発
明のポリぺプチドをコードする核酸配列に特異的にハイ
ブリダイズするのに十分な長さの核酸分子を含む核酸プ
ローブもまた提供される。 【００２８】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなポリペプチドに対する抗体が提供される。 【００２９】本発明のなお別の局面によれば、本発明の
ポリペプチドをコードする核酸配列における変異に関連
する疾患または疾患に対する感受性を検出するための診
断的アッセイが提供される。 【００３０】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなポリペプチド、またはこのようなポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを、科学的研究、例えば、
ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造に関するイン
ビトロの目的のために利用するためのプロセスが提供さ
れる。 【００３１】本発明のこれらおよび他の局面は、本明細
書中の教示から当業者に明らかであるはずである。 【００３２】本発明の１つの局面によれば、図１の推定
アミノ酸配列（配列番号２）を有する成熟ポリペプチ
ド、および１９９５年３月２０日にＡＴＣＣ受託番号第
９７１０３号として寄託されたクローンのｃＤＮＡによ
りコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離され
た核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。 【００３３】本発明のポリヌクレオチドは、初代培養羊
膜細胞由来のｃＤＮＡライブラリーにおいて発見され
た。これは構造的にシスタチンＩＩスーパーファミリー
に関連する。これは、１４８アミノ酸残基（そのうち、
大体初めの２８アミノ酸残基が推定のリーダー配列であ
り、従って成熟タンパク質は１２０アミノ酸をふくむ）
のタンパク質をコードするオープンリーディングフレー
ムを含む。このタンパク質は、ヒトシスタチンＣに最も
高い程度の相同性を示し、１４７アミノ酸のストレッチ
にわたって３３．５６６％の同一性および５３．８４６
％の類似性を有する。 【００３４】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
態またはＤＮＡ（このＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮ
Ａ、および合成ＤＮＡを含む）の形態であり得る。ＤＮ
Ａは二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖の場合
には、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であ
り得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、
図１（配列番号１）に示すコード配列または寄託したク
ローンのコード配列と同一であり得るか、あるいはその
コード配列が、遺伝コードの重複または縮重の結果とし
て、図１（配列番号１）のＤＮＡまたは寄託したｃＤＮ
Ａと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配
列であり得る。 【００３５】図１（配列番号２）の成熟ポリペプチドま
たは寄託したｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドは、以下を含み得る
がこれらに限定されない：成熟ポリペプチドのコード配
列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列およびリーダー
配列または分泌配列あるいはプロタンパク質配列のよう
なさらなるコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列
（および必要に応じてさらなるコード配列）ならびに非
コード配列（例えば、イントロンあるいは成熟ポリペプ
チドのコード配列の５’および／または３’非コード配
列）。 【００３６】従って、用語「ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみ
を含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列
および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを
含む。 【００３７】本発明はさらに、図１（配列番号２）の推
定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託したク
ローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフ
ラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明
細書中上記のポリヌクレオチドの改変体に関する。ポリ
ヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然に存
在する対立遺伝子改変体またはポリヌクレオチドの天然
に存在しない改変体であり得る。 【００３８】従って、本発明は、図１（配列番号２）に
示すものと同じ成熟ポリペプチド、または寄託したクロ
ーンのｃＤＮＡによりコードされるものと同じ成熟ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにその
ようなポリヌクレオチドの改変体を含む。この改変体
は、図１（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託した
クローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの
フラグメント、誘導体またはアナログをコードする。こ
のようなヌクレオチド改変体は、欠失改変体、置換改変
体、および付加または挿入改変体を含む。 【００３９】本明細書中上記で示したように、ポリヌク
レオチドは、図１（配列番号１）に示すコード配列また
は寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立
遺伝子改変体であるコード配列を有し得る。当該分野で
公知なように、対立遺伝子改変体は、１つ以上のヌクレ
オチドの置換、欠失または付加を有し得るポリヌクレオ
チド配列の別の形態であり、これはコードされるポリペ
プチドの機能を実質的に変化させない。 【００４０】本発明はまた、成熟ポリぺプチドのコード
配列が、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌
を援助するポリヌクレオチド配列（例えば、細胞からの
ポリぺプチドの輸送を制御するための分泌配列として機
能するリーダー配列）と同一のリーディングフレームに
融合され得るポリヌクレオチドを包含する。リーダー配
列を有するこのポリぺプチドはプロタンパク質であり、
そしてこのポリぺプチドの成熟した形態を形成するため
に宿主細胞により切断されたリーダー配列を有し得る。
ポリヌクレオチドはまたプロタンパク質をコードし得、
これは成熟タンパク質にさらなる５’アミノ酸残基を有
する。プロ配列を有する成熟タンパク質は、プロタンパ
ク質であり、そしてタンパク質の不活性な形態である。
一旦プロ配列が切断されると、活性な成熟タンパク質が
残る。 【００４１】従って、例えば、本発明のポリヌクレオチ
ドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパ
ク質、あるいはプロ配列およびプレ配列（リーダー配
列）の両方を有するタンパク質をコードし得る。 【００４２】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にイン
フレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー
配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成
熟ポリペプチドの精製を提供する、ｐＱＥ−９ベクター
により供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。あ
るいは、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例え
ば、ＣＯＳ−７細胞）が使用される場合は、赤血球凝集
素（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグは、インフルエン
ザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応
する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ，３７：７６７
（１９８４））。 【００４３】用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を産生
することに関与するＤＮＡのセグメントを意味し；これ
は、コード領域の前および後（リーダーおよびトレイラ
ー（ｔｒａｉｌｅｒ））の領域ならびに個々のコードセ
グメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を
含む。 【００４４】全長ＣｙｓＥ遺伝子のフラグメントは、全
長ＣｙｓＥ遺伝子を単離するため、およびＣｙｓＥ遺伝
子に対する高い配列類似性または類似した生物学的活性
を有する他の遺伝子を単離するために、ｃＤＮＡライブ
ラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使用さ
れ得る。このタイプのプローブは、好ましくは、少なく
とも３０塩基を有し、そして例えば、５０塩基以上を有
し得る。プローブはまた、全長の転写物に対応するｃＤ
ＮＡクローンおよびゲノムクローン、または調節領域お
よびプロモーター領域、エキソン、ならびにイントロン
を含む完全ＣｙｓＥ遺伝子を含有するクローンを同定す
るために使用され得る。スクリーニングの例は、既知の
ＤＮＡ配列を使用し、オリゴヌクレオチドプローブを合
成することにより、ＣｙｓＥ遺伝子のコード領域を単離
することを含む。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列
を有する標識されたオリゴヌクレオチドは、ヒトｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ、またはｍＲＮＡのライブラリーをス
クリーニングして、ライブラリーのどのメンバーにプロ
ーブがハイブリダイズするかを決定するために使用され
る。本発明はさらに、配列間に少なくとも７０％、好ま
しくは少なくとも９０％、およびより好ましくは９５％
の同一性が存在する場合、本明細書中上記の配列にハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特
に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに
関する。本明細書中で用いられる用語「ストリンジェン
トな条件」は、ハイブリダイゼーションが、配列間に少
なくとも９５％、そして好ましくは少なくとも９７％の
同一性が存在する場合のみに生じることを意味する。好
ましい実施態様において、本明細書中上記のポリヌクレ
オチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１
（配列番号１）のｃＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡ（単
数または複数）によりコードされる成熟ポリペプチドと
実質的に同じ生物学的機能または活性のいずれかを保持
するポリペプチドをコードする。あるいは、このポリヌ
クレオチドは、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダ
イズし、本明細書中上記したように、それに対して同一
性を有し、そして活性を保持てもよいかまたはしなくて
もよい、少なくとも２０塩基、好ましくは３０塩基、そ
してより好ましくは少なくとも５０塩基を有し得る。例
えばそのようなポリヌクレオチドは、配列番号１のポリ
ヌクレオチドのためのプローブとして（例えば、このポ
リヌクレオチドの回収のためのプローブ、または診断用
プローブ）あるいはＰＣＲプライマーとして用いられ得
る。従って、本発明は、配列番号２のポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％、
好ましくは少なくとも９０％の同一性およびより好まし
くは９５％の同一性を有するポリヌクレオチドならびに
そのフラグメント（このフラグメントは、少なくとも３
０塩基および好ましくは少なくとも５０塩基を有する）
ならびにこのようなポリヌクレオチドによりコードされ
るポリペプチドに関する。 【００４５】本明細書中でいう寄託物（単数または複
数）は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関
するブダペスト条約の下に維持される。これらの寄託物
は、当業者に対する便宜として提供されるにすぎず、そ
して米国特許法第１１２条の下で寄託が必要とされるこ
とを認めたわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレ
オチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペ
プチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用
され、そして本明細書中の配列の任意の記載とのいかな
る対立の場合にも管理している。寄託物を製造し、使用
し、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、
そしてそのような実施許諾は本明細書によって与えられ
るわけではない。 【００４６】本発明はさらに、図１（配列番号２）の推
定アミノ酸配列を有するか、または寄託したｃＤＮＡに
よりコードされるアミノ酸配列を有するＣｙｓＥポリペ
プチド、ならびにそのようなポリペプチドのフラグメン
ト、アナログおよび誘導体に関する。 【００４７】用語「フラグメント」、「誘導体」、およ
び「アナログ」は、図１（配列番号２）のポリペプチド
または寄託したｃＤＮＡにコードされるポリペプチドを
いう場合、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物
学的機能または活性を保持するポリペプチドを意味す
る。従って、アナログは、活性な成熟ポリぺプチドを産
生するためのプロタンパク質部分の切断によって活性化
され得るプロタンパク質を含む。 【００４８】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドであ
り得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。 【００４９】図１（配列番号２）のポリペプチドまたは
寄託したｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフ
ラグメント、誘導体、またはアナログは、（ｉ）１つ以
上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基または非保存アミ
ノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、
そしてこのような置換されるアミノ酸残基は遺伝的コー
ドによりコードされ得るアミノ酸残基であってもよく、
またはそうでなくてもよいもの、あるいは（ｉｉ）１つ
以上のアミノ酸残基が置換基を含有するもの、あるいは
（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期
を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコー
ル）のような別の化合物と融合されているもの、あるい
は（ｉｖ）さらなるアミノ酸が、リーダー配列または分
泌配列、あるいは成熟ポリペプチドまたはプロタンパク
質配列の精製のために使用される配列のような、成熟ポ
リペプチドに融合されているものであり得る。このよう
なフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中
の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。 【００５０】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そし
て好ましくは均質に精製される。 【００５１】用語「単離された」は、物質がその本来の
環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）か
ら取り出されていることを意味する。例えば、生存する
動物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドま
たはポリペプチドは単離されていないが、天然の系にお
いて共存する物質の幾らかまたは全てから分離されてい
る同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離さ
れている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一
部であり得、そして／またはこのようなポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、かつ
そのようなベクターまたは組成物がその天然の環境の一
部ではない点で、なお単離されている状態であり得る。 【００５２】本発明のポリペプチドは、配列番号２のポ
リペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに少なくと
も７０％の類似性（好ましくは少なくとも７０％の同一
性）を配列番号２のポリペプチドに対して有し、そして
より好ましくは少なくとも９０％の類似性（より好まし
くは少なくとも９０％の同一性）を配列番号２のポリペ
プチドに対して有し、そしてなおより好ましくは少なく
とも９５％の類似性（なおより好ましくは少なくとも９
５％の同一性）を配列番号２のポリペプチドに対して有
するポリペプチドを含み、そしてまた一般に少なくとも
３０％のアミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０
アミノ酸を含むこのようなポリペプチドの部分を有する
このようなポリペプチドの部分を含む。 【００５３】当業者に公知なように、２つのポリペプチ
ド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配
列およびその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプ
チドの配列と比較することにより決定される。 【００５４】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分は、ペプチド合成により対応する全長ポリペプチ
ドを産生するために使用され得る。従って、このフラグ
メントは全長ポリペプチドを産生するための中間体とし
て使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメ
ントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合
成するために使用され得る。 【００５５】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
を含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作
される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリ
ペプチドの産生に関する。 【００５６】宿主細胞は、本発明のベクター（これは、
例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであ
り得る）を用いて遺伝子操作される（形質導入される
か、または形質転換されるか、またはトランスフェクト
される）。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス
粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主
細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選
択するか、またはＣｙｓＥ遺伝子を増幅するために適切
に改変した従来の栄養培地中において培養され得る。培
養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現のために選
択される宿主細胞に以前使用された条件であり、そして
当業者には明らかである。 【００５７】本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術
によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従
って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発
現するための種々の発現ベクターのいずれか１つに含ま
れ得る。このようなベクターは、染色体ＤＮＡ配列、非
染色体ＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を包含する。
このようなベクターは、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細
菌性プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；
酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組
み合わせに由来するベクター、ウイルスＤＮＡ（例え
ば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、およ
び仮性狂犬病）である。しかし、宿主において複製可能
で、かつ存続可能である限り、他の任意のベクターも使
用され得る。 【００５８】適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によりベ
クターに挿入され得る。一般に、ＤＮＡ配列は、当該分
野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部
位に挿入される。このような手順および他の手順は、当
業者の範囲内であると考えられる。 【００５９】発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ
の合成を指示する適切な発現制御配列（プロモーター）
に作動可能に連結される。このようなプロモーターの代
表的な例としては、以下が挙げられ得る：ＬＴＲまたは
ＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃまたはｔ
ｒｐ、λファージＰLプロモーター、および原核生物細
胞または真核生物細胞あるいはそれらのウイルス内で遺
伝子の発現を制御することが知られている他のプロモー
ター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソー
ム結合部位および転写ターミネーターを含有する。ベク
ターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有し
得る。 【００６０】さらに、発現ベクターは、好ましくは、形
質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例え
ば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクター
ゼまたはネオマイシン耐性、あるいは例えばＥ．ｃｏｌ
ｉにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐
性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有す
る。 【００６１】本明細書中上記のような適切なＤＮＡ配列
ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有
するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタン
パク質を発現させるために用いられ得る。 【００６２】適切な宿主の代表的な例としては、以下が
挙げられ得る：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細
胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏ
ｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９）；動物細胞（例えば、ＣＨ
Ｏ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫）；アデノウイル
ス；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の
教示から当業者の範囲内であると考えられる。 【００６３】さらに詳細には、本発明はまた、上記で広
範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含
する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクタ
ーまたはウイルスベクター）を包含し、このベクターの
中に、本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されて
いる。この実施態様の好ましい局面において、構築物は
さらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例え
ば、プロモーターを包含する）を含む。非常に多数の適
切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であ
り、そして市販されている。以下のベクターが例として
提供される。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ
−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅ
ｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐ
ＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；
ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−
３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）。真核性：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ
４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳ
ＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）。しかし、他の任意のプラスミドまたはベクタ
ーも、それらが宿主において複製可能で、かつ存続可能
である限り、使用され得る。 【００６４】プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の
遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、Ｐ
ＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特によく知られ
た細菌性プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、
Ｔ７、ｇｐｔ、λＰR、ＰLおよびｔｒｐを包含する。真
核生物プロモーターは、ＣＭＶ即時型、ＨＳＶチミジン
キナーゼ、初期ＳＶ４０および後期ＳＶ４０、レトロウ
イルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネインＩ
を包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択
は、十分に当業者のレベル内である。 【００６５】さらなる実施態様では、本発明は上記の構
築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真
核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生
物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿
主細胞は原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得
る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムト
ランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トラ
ンスフェクション、またはエレクトロポレーションによ
り達成され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，
Ｍ．，Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１
９８６））。 【００６６】宿主細胞中の構築物を用いて、従来の方法
で、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生し
得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプ
チド合成機により合成的に産生され得る。 【００６７】成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、
細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下
で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ
構築物に由来するＲＮＡを使用して、このようなタンパ
ク質を産生するために用いられ得る。原核生物宿主およ
び真核生物宿主で使用される適切なクローニングベクタ
ーおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）（この開示
は、本明細書中に参考として援用される）に記載されて
いる。 【００６８】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー
配列を挿入することにより増大される。エンハンサーは
ＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常は約１０〜約
３００ｂｐであり、これはプロモーターに作用してその
転写を増大させる。例として、複製起点のｂｐ１００〜
２７０の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロ
ウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の
後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイル
スエンハンサーが挙げられる。 【００６９】一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞
の形質転換を可能とする複製起点および選択マーカー
（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およ
びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）、なら
びに下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来
のプロモーターを含有する。このようなプロモーター
は、中でも解糖酵素（例えば、３−ホスホグリセリン酸
キナーゼ（ＰＧＫ））、α因子、酸性ホスファターゼ、
または熱ショックタンパク質などをコードするオペロン
に由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻
訳終結配列、ならびに好ましくは、翻訳タンパク質をペ
リプラズム腔または細胞外培地への分泌を指向し得るリ
ーダー配列と適切な相内で組立てられる。必要に応じ
て、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換
え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末
端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。 【００７０】細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能
的なプロモーターと作動可能な読み取り相で、適切な翻
訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に所望のタ
ンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を挿入することに
より構築される。ベクターは、１つ以上の表現型選択マ
ーカー、およびベクターの維持を確実にし、かつ所望さ
れる場合は宿主内での増幅を提供するための複製起点を
含有する。形質転換のために適切な原核生物宿主は、
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、なら
びにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種
々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用い
られ得る。 【００７１】代表的な、しかし限定しない例として、細
菌の使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニング
ベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝
的エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マ
ーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。このよう
な市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐ
ｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳ
Ａ）を含む。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分は、適
切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み
合わされる。 【００７２】適切な宿主株の形質転換および適切な細胞
密度までの宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモー
ターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘
導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養さ
れる。 【００７３】細胞は、代表的には遠心分離により回収さ
れ、物理的手段または化学的手段により破砕され、そし
て得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持され
る。 【００７４】タンパク質の発現において用いられる微生
物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破
砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方
法により破砕され得る。このような方法は当業者に周知
である。 【００７５】種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換
えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物
発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３：１
７５（１９８１）に記載されるサル腎臓線維芽細胞のＣ
ＯＳ−７株、および適合性のベクターを発現し得る他の
細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬ
ａ、およびＢＨＫ細胞株）が含まれる。哺乳動物発現ベ
クターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハ
ンサー、ならびに任意の必要なリボソーム結合部位、ポ
リアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプラ
イスアクセプター部位、転写終結配列、および５’フラ
ンキング非転写配列をまた含有する。ＳＶ４０スプライ
ス部位に由来するＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部
位は、必要な非転写遺伝的エレメントを提供するために
使用され得る。 【００７６】本発明のポリペプチドは、以下を含む方法
により組換え細胞培養物から回収され、そして精製され
得る：硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオ
ンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセル
ロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロ
キシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチン
クロマトグラフィー。必要に応じて、タンパク質の再折
りたたみ（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）工程が、成熟タンパク
質の配置を完全にするために使用され得る。最終的に、
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、最終的な
精製工程に用いられ得る。 【００７７】本発明のポリペプチドは、天然の精製され
た産物、または化学合成手順の産物であり得るか、ある
いは原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、培養物
中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細
胞）から組換え技術により産生され得る。組換え産生手
順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグリコシル化され
ないかもしれない。本発明のポリペプチドはまた、最初
のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。 【００７８】本発明のＣｙｓＥポリぺプチドは、ヒトカ
テプシン酵素、および結果としてのこれらカテプシンの
作用に関連する病態を阻害するために使用され得る。例
えば、ＣｙｓＥは、骨粗鬆症、ベヘット（Ｂｅｈｃｅ
ｔ）病、高カルシウム血症、骨軟化症、アレルギー性皮
膚疾患、アレルギー性鼻炎、およびアレルギー性紫班病
を処置するために使用され得る。 【００７９】カテプシンは、腫瘍の転移において重要な
役割を演じ、従って、ＣｙｓＥは腫瘍の転移を妨げるた
めに使用され得ることもまた考えられる。 【００８０】ＣｙｓＥポリぺプチドは、特定の細菌剤
（例えば、連鎖球菌）の増殖を停止するために、および
カリエスに寄与する酸の産生を減少させることにより虫
歯を減少させるために、抗菌剤として利用され得る。 【００８１】ＣｙｓＥポリぺプチドはまた、ウイルスに
よって引き起こされる感染を処置するために（例えば、
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の複製を阻止するため
に）、抗ウイルス剤として使用され得る。ＣｙｓＥポリ
ぺプチドはまた、網膜をシステインプロテイナーゼによ
る攻撃に対して保護するために使用され得る。 【００８２】本発明のＣｙｓＥポリぺプチドはまた、シ
ステインプロテイナーゼの作用を妨げることにより悪液
質および筋肉るいそうを処置するために使用され得る。 【００８３】ＣｙｓＥポリぺプチドはまた、（例えば、
慢性関節リウマチに関連する）炎症を改変するために、
および敗血性ショックを処置するために使用され得る。
ＣｙｓＥポリぺプチドはまた、化膿性の気管支拡張症を
処置するために使用され得る。 【００８４】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、ヒトの疾患に対する処置および診断の発見のた
めの試験薬および試験物質として使用され得る。 【００８５】本発明は、シスタチンＥポリぺプチドのレ
セプターの同定のための方法を提供する。レセプターを
コードする遺伝子は、当業者に公知の数多くの方法、例
えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティング
（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．，１（２），Ｃｈａｐｔｅｒ
５，（１９９１））によって同定され得る。好ましく
は、発現クローニングは、ここでポリアデニル化ＲＮＡ
を、シスタチンＥポリぺプチドに応答する細胞から調製
する場合に使用され、そしてこのＲＮＡから作製された
ｃＤＮＡライブラリーはプールに分割され、そしてＣＯ
Ｓ細胞またはシスタチンＥポリぺプチドに応答しない他
の細胞をトランスフェクトするために使用される。スラ
イドガラス上で培養されたトランスフェクトされた細胞
は、標識されたシスタチンＥポリぺプチドに曝される。
シスタチンＥポリぺプチドを、ヨー素化または部位特異
的タンパク質キナーゼの認識部位の封入を含む種々の手
段により標識し得る。固定化およびインキュベーション
の後、スライドをオートラジオグラフ分析に供する。陽
性のプールを同定し、そしてサブプールを調製し、そし
て反復サブプール化および再スクリーニングプロセスを
用いて再びトランスフェクトし、最終的に推定のレセプ
ターをコードする単一のクローンを生じる。レセプター
同定のための別のアプローチとして、標識されたリガン
ドを、細胞膜またはレセプター分子を発現する抽出調製
物と光親和的に結合し得る。架橋された材料をＰＡＧＥ
によって分解し、Ｘ線フィルムに曝す。リガンドレセプ
ターを含む標識された複合体を切り出し、ペプチドフラ
グメントに分解し、そしてタンパク質微量配列決定に供
し得る。微量配列決定から得られたアミノ酸配列を使用
して、縮重オリゴヌクレオチドプローブの対を設計し、
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして推定のレセ
プターをコードする遺伝子を同定する。 【００８６】本発明は、シスタチンＥレセプターに結合
する化合物を同定し、そしてそこからセカンドメッセン
ジャー応答を誘導するために、化合物をスクリーニング
する方法を提供する。一例として、シスタチンＥレセプ
ターを発現する哺乳動物細胞または膜調製物を、スクリ
ーンされるべき化合物の存在下でインキュベートする。
この化合物とレセプターの相互作用に続く既知のセカン
ドメッセンジャー系の応答が測定され、そしてシスタチ
ンＥによって誘導されたセカンドメッセンジャーの応答
と比較される。このようなセカンドメッセンジャー系に
は、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネ
ル、またはホスホイノシチド加水分解が含まれるが、こ
れらに限定されない。 【００８７】本発明のポリぺプチドおよびアゴニスト化
合物は、システインプロテイナーゼ活性を阻害する能力
についてアッセイされ得る。このアッセイは、パパイン
およびヒトカテプシンＢとシスタチンＥ複合体との解離
の平衡定数（Ｋi）を、１００Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液中に基質としての１０μＭ Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｎ
ＨＭｅｃを用いる連続的速度アッセイによって決定する
工程を包含する（Ｎｉｃｋｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．Ｈ．および
Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２
２３：２４５−２５３（１９８４））。この緩衝液は、
１ｍＭジチオスレイトールおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含
み、そしてパパインアッセイのためにｐＨ ６．５に、
そしてカテプシンＢアッセイのためにｐＨ６．０に調整
される。カテプシンＢは、使用前にアッセイ緩衝液中で
２０分間室温で予めインキュベートされる。アッセイに
おける酵素濃度は、０．０５〜０．２５ｎＭである。カ
テプシンＢアッセイで試されたシスタチンＥの最高濃度
は、１００ｎＭである。有益な阻害を与える（すなわち
インヒビターの添加後１時間以内に新たな定常状態を得
る）インヒビター濃度は、パパインアッセイにおいて２
０〜５０ｎＭである。３７℃における基質加水分解は、
Ｐａｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ＬＳ５０蛍光
光度計において、励起波長および発光波長がそれぞれ３
６０および４６０ｎｍにおいてモニターされた。アッセ
イ下でのＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨＭｅｃの加水分解の
Ｋm値は、基質によって誘導されるインヒビターの解離
について得られた見かけのＫi値を、以下の関係によっ
て補正するために用いられる：見かけのＫi＝Ｋi（１＋
［Ｓ］／Ｋm）。 【００８８】本発明のポリぺプチドおよびアゴニスト化
合物は、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ
得る。このような組成物は、治療的有効量のポリペプチ
ドまたはアゴニスト、および薬学的に受容可能なキャリ
アまたは賦形剤を含む。このようなキャリアとしては、
生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、
グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせ
が挙げられるが、これらに限定されない。処方は、投与
の様式に合わせるべきである。 【００８９】本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１
つまたはそれ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を
含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような
容器（単数または複数）に関して、薬剤または生物学的
製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関によ
り規定された形式の製品表示をし得、この製品表示は、
ヒトへの投与についての製造、使用、または販売におけ
る機関による認可を表す。さらに、本発明のポリぺプチ
ドまたはアゴニストは、他の治療化合物と併用して用い
られ得る。 【００９０】薬学的組成物は、例えば、経口、局所、静
脈内、腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮内経
路による便利な様式で投与され得る。薬学的組成物は、
特定の症状の処置および／または予防に有効な量で投与
される。一般に、それらは少なくとも約１０μｇ／ｋｇ
体重の量で投与され、そして多くの場合、それらは１日
に約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えない量で投与される。多く
の場合、投薬量は、１日に約１０μｇ／ｋｇ体重から約
１ｍｇ／ｋｇ体重であり、投与経路、症状などが考慮さ
れる。 【００９１】ＣｙｓＥポリぺプチドおよびポリペプチド
であるアゴニスト化合物は、本発明に従って、インビボ
でのこのようなポリペプチドの発現により用いられ得
る。これはしばしば「遺伝子治療」と呼ばれる。 【００９２】従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたは
ＲＮＡ）を用いてエキソビボで操作され得、次いで、操
作された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者
に提供される。このような方法は当該分野で周知であ
り、そして本明細書中の教示から明らかである。例え
ば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡ
を含有するレトロウイルスプラスミドベクターの使用に
より操作され得る。 【００９３】同様に、細胞は、インビボでのポリペプチ
ドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によ
りインビボで操作され得る。例えば、パッケージング細
胞は、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有
するレトロウイルスプラスミドベクターでトランスフェ
クトされ、その結果、パッケージング細胞はここで目的
の遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する。これら
のプロデューサー細胞は、インビボで細胞を操作するた
め、およびインビボでのポリペプチドの発現のために患
者に投与され得る。このような方法により本発明のポリ
ペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法
は、本発明の教示から当業者には明らかなはずである。 【００９４】本明細書中上記のレトロウイルスプラスミ
ドベクターが由来し得るレトロウイルスとしては、モロ
ニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス
肉腫ウイルスのようなレトロウイルス、ハーベイ肉腫ウ
イルス、ニワトリ白血症ウイルス、テナガザル白血病ウ
イルス、ヒト免疫不全症ウイルス、アデノウイルス、骨
髄増殖性肉腫ウイルス、および哺乳動物腫瘍ウイルスが
挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施態様
において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロ
ニーマウス白血病ウイルスに由来する。 【００９５】ベクターは、１つ以上のプロモーターを含
む。使用され得る適切なプロモーターとしては、Ｍｉｌ
ｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第７巻、第９
号、９８０−９９０（１９８９）に記載のレトロウイル
スＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびヒトサイトメ
ガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、または他の任意
のプロモーター（例えば、真核生物細胞プロモーター
（ヒストン、ｐｏｌ ＩＩＩ、およびβ−アクチンプロ
モーターを含むが、これらに限定されない））が挙げら
れるが、これらに限定されない。使用され得る他のウイ
ルスプロモーターとしては、アデノウイルスプロモータ
ー、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ
１９パルボウイルスプロモーターが挙げられるが、これ
らに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明
細書中に含まれる教示から当業者に明らかである。 【００９６】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得
る適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモ
ーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモータ
ー）；または異種プロモーター（例えば、サイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；ＲＳウイルス（Ｒ
ＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、Ｍ
ＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター）；
ヒートショックプロモーター；アルブミンプロモータ
ー；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモータ
ー；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター（例えば、
単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター）；レトロ
ウイルスＬＴＲ（本明細書上記に記載の改変レトロウイ
ルスＬＴＲを含む）；βアクチンプロモーター：および
ヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられるが、これら
に限定されない。プロモーターはまた、ポリペプチドを
コードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであり
得る。 【００９７】レトロウイルスプラスミドベクターは、パ
ッケージング細胞株に形質導入し、プロデューサー細胞
株を形成するために使用される。トランスフェクトされ
得るパッケージング細胞の例としては、Ｍｉｌｌｅｒ、
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、第１巻、５−
１４頁（１９９０）（その全体が参考として本明細書中
に援用される）に記載のＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−
２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９
−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８
６、ＧＰ−ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞株が挙げ
られるが、これらに限定されない。ベクターは、当該分
野で公知の任意の手段によりパッケージング細胞を形質
導入し得る。このような手段としては、エレクトロポレ
ーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ4沈澱が
挙げられるが、これらに限定されない。１つの代替とし
て、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソーム
にカプセル化され得るか、または脂質に結合され得、次
いで宿主に投与され得る。 【００９８】プロデューサー細胞株は、ポリペプチドを
コードする核酸配列（単数または複数）を含む感染性レ
トロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、このよ
うなレトロウイルスベクター粒子は、インビトロまたは
インビボのいずれかで、真核生物細胞を形質導入するた
めに使用され得る。形質導入された真核生物細胞は、ポ
リペプチドをコードする核酸配列（単数または複数）を
発現する。形質導入され得る真核生物細胞としては、胚
芽幹細胞、胚芽肉腫細胞ならびに造血幹細胞、肝細胞、
線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、お
よび気管支上皮細胞が挙げられるが、これらに限定され
ない。 【００９９】遺伝性のシスタチンＣアミロイド血管障害
疾患は、致命的な出血を引き起こし、そしてアルツハイ
マー病、ダウン症候群、パーキンソン病、ジメンチア
（ｄｉｍｅｎｔｉａ）に関連し、そして４０歳前の死を
導き得る。 【０１００】従って、本発明は、診断薬としてのＣｙｓ
Ｅ遺伝子の使用に関する。ＣｙｓＥの変異体の検出は、
ＣｙｓＥ遺伝子の変異から生じるＨＣＣＡＡに類似の疾
患の診断を可能にする。 【０１０１】ヒトＣｙｓＥ遺伝子における変異を有する
個体は、種々の技術によりＤＮＡレベルで検出され得
る。診断のための核酸は、患者の細胞（血液、尿、唾
液、組織バイオプシー、および剖検材料を含むが、これ
らに限定されない）より得られ得る。ゲノムＤＮＡは、
検出のために直接使用され得るか、または分析前にＰＣ
Ｒを用いることにより酵素的に増幅され得る（Ｓａｉｋ
ｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３２４：１６３−１６６（１９８
６））。ＲＮＡあるいはｃＤＮＡはまた、同じ目的のた
めに使用され得る。例として、ＣｙｓＥをコードする核
酸に相補的なＰＣＲプライマーが、ＣｙｓＥ変異を同定
および解析するために使用され得る。例えば、欠失およ
び挿入は、正常な遺伝子型との比較における増幅された
産物のサイズの変化により検出され得る。点変異は、放
射性標識されたＣｙｓＥ ＲＮＡまたは、あるいは、放
射性標識されたＣｙｓＥアンチセンスＤＮＡ配列に、増
幅されたＤＮＡをハイブリダイズさせることにより同定
され得る。完全に対合した配列は、ＲＮａｓｅＡ消化ま
たは融解温度の差により、誤対合した二本鎖と区別され
得る。 【０１０２】対照遺伝子と変異を有する遺伝子との間の
配列の相違は、直接ＤＮＡ配列決定法によって明らかに
され得る。さらに、クローン化されたＤＮＡセグメント
は、特定のＤＮＡセグメントを検出するためのプローブ
として用いられ得る。本方法の感度は、ＰＣＲと組み合
わされた場合、非常に増強される。例えば、配列決定プ
ライマーは、二本鎖ＰＣＲ産物、または改変されたＰＣ
Ｒによって作製された一本鎖テンプレート分子とともに
使用される。配列決定は、放射性標識ヌクレオチドを用
いる従来の手順または蛍光タグを用いる自動配列決定手
順によって実施される。 【０１０３】ＤＮＡ配列の差異に基づいた遺伝子試験
は、変性剤を含むかまたは含まないゲルにおけるＤＮＡ
フラグメントの電気泳動移動度における変化の検出によ
り達成され得る。小さな配列欠失および挿入は、高分解
能ゲル電気泳動によって視覚化され得る。異なる配列の
ＤＮＡフラグメントは、変性ホルムアミド勾配ゲルにお
いて区別され得る。ここでゲル中の異なるＤＮＡフラグ
メントの移動度は、それらの特異的融解温度または部分
的融解温度に従って異なる位置にゲル内で遅延される
（例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１
２４２（１９８５）を参照のこと）。 【０１０４】特定の位置での配列の変化はまた、ヌクレ
アーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅ保護およびＳ
１保護または化学的切断法（例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、
ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１（１９８
５）））により明らかにされ得る。 【０１０５】従って、特定のＤＮＡ配列の検出は、ハイ
ブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、化学的切断、直
接的なＤＮＡ配列決定、または制限酵素の使用（例え
ば、制限断片長多型（ＲＦＬＰ））およびゲノムＤＮＡ
のサザンブロッティングのような方法によって達成され
得る。 【０１０６】より慣習的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配
列決定に加えて、変異はまたインサイチュ分析により検
出され得る。 【０１０７】本発明の配列はまた、染色体の同定に有益
である。この配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置
を特異的に標的化し、そしてその位置にハイブリダイズ
し得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定す
る必要性がある。現在、染色体位置の標識化に利用可能
な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識
化試薬はほとんどない。本発明のＤＮＡの染色体へのマ
ッピングは、これらの配列と疾患に関連する遺伝子との
相関における重要な第１工程である。 【０１０８】簡潔に述べれば、配列は、ｃＤＮＡからＰ
ＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製す
ることにより染色体にマップされ得る。遺伝子の３’非
翻訳領域のコンピューター解析が、ゲノムＤＮＡ内で１
より多いエキソンにまたがらない、従って増幅プロセス
を複雑化するプライマーを迅速に選択するために使用さ
れる。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色
体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに
使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハ
イブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。 【０１０９】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅
速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
本発明と共に使用して、特定の染色体由来のフラグメン
トのパネルまたは類似の様式の大きなゲノムクローンの
プールを用いて、部分的局在性の決定（ｓｕｂｌｏｃａ
ｌｉｚａｔｉｏｎ）が達成され得る。染色体にマップす
るために同様に使用され得る他のマッピングストラテジ
ーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識化フ
ロー選別した（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体を用い
るプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡラ
イブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションに
よる前選択を包含する。 【０１１０】ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッド
への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳ
Ｈ）は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使
用され得る。この技術は、少なくとも５０または６０塩
基を有するｃＤＮＡを用いて使用され得る。この技術の
総説については、Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏ
ｍｏｓｏｍｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。 【０１１１】一旦配列が正確な染色体位置にマップされ
ると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝子地図の
データと相関させ得る。このようなデータは、例えば、
Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅ
ｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋ
ｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉ
ｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能であ
る）において見出される。次いで、同じ染色体領域にマ
ップされる遺伝子と疾患との間の関係が、連鎖解析（物
理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。 【０１１２】次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤ
ＮＡ配列またはゲノム配列における差異を決定する必要
がある。変異がいくつかまたは全ての罹患個体に観察さ
れるが、いずれの正常な個体には観察されない場合、こ
の変異は疾患の原因因子であるようである。 【０１１３】物理的マッピング技術および遺伝子マッピ
ング技術の現在の解像度では、疾患に関連する染色体領
域に正確に位置決めされたｃＤＮＡは、５０と５００と
の間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、
１メガベースのマッピング解像度、および２０ｋｂあた
り１遺伝子と仮定する）。 【０１１４】このポリペプチド、そのフラグメントまた
は他の誘導体、またはそれらのアナログ、あるいはそれ
らを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生させる
ための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例
えば、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体
であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体、お
よびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメント、または
Ｆａｂ発現ライブラリーの産物を包含する。当該分野で
公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメン
トの産生のために使用され得る。 【０１１５】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注
射により、または動物へのポリペプチドの投与により得
られることができる。この動物は、好ましくは非ヒトで
ある。次いで、このようにして得られた抗体は、ポリペ
プチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチド
のフラグメントのみをコードする配列でさえも、天然の
ポリペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用
され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチ
ドを発現する組織からポリペプチドを単離するために使
用され得る。 【０１１６】モノクローナル抗体の調製のために、細胞
株の連続培養により産生される抗体を提供する任意の技
術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術
（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎ
ａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技
術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，
１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７
２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するための
ＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，１９８５，Ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ
Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉ
ｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）が挙げられる。 【０１１７】単鎖抗体を産生するために記載された技術
（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の免疫
原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するため
に適合させ得る。また、トランスジェニックマウスが、
本発明の免疫原性のポリペプチド産物に対するヒト化抗
体を発現するために使用され得る。 【０１１８】 【実施例】本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記
載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定され
ないことが理解されるべきである。すべての部分または
量は、他に明記しない限り重量基準である。 【０１１９】以下の実施例の理解を容易にするために、
頻繁に出現する特定の方法および／または用語が記載さ
れる。 【０１２０】「プラスミド」は、小文字のｐの前および
／またはそれに続く大文字および／または数字を示すこ
とにより明示される。本明細書中の出発プラスミドは、
市販されており、制限無く公的に入手可能であるか、ま
たは公開された手順に従って入手可能なプラスミドから
構築され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価の
プラスミドが当該分野において公知であり、そして当業
者には明らかである。 【０１２１】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の特定の配
列でのみ作用する制限酵素でそのＤＮＡを触媒反応的に
切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制
限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、
補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使
用された。分析目的のためには、典型的には１μｇのプ
ラスミドまたはＤＮＡフラグメントが、約２単位の酵素
と共に約２０μｌの緩衝溶液中で使用される。プラスミ
ド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的のた
めには、代表的には５〜５０μｇのＤＮＡが、２０〜２
５０単位の酵素を用いてより大きな容量中で消化され
る。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量
は、製造者により特定される。３７℃で約１時間のイン
キュベーション時間が通常使用されるが、これは供給者
の説明書に従って変わり得る。消化後、反応物をポリア
クリルアミドゲル上で直接電気泳動して所望のフラグメ
ントを単離する。 【０１２２】切断フラグメントのサイズ分離は、Ｇｏｅ
ｄｄｅｌ，Ｄ．ら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，８：４０５７（１９８０）により記載された８％
ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。 【０１２３】「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ポリデ
オキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシ
ヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合
成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、
５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でＡＴＰ
と共にリン酸を添加しなければ、別のオリゴヌクレオチ
ドと連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸
化されていないフラグメントに連結する。 【０１２４】「連結」は、２つの二本鎖核酸フラグメン
トの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをい
う（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔら、前出、１４６頁）。他に
提供しなければ、連結は公知の緩衝液および条件を使用
して、ほぼ等モル量の連結されるべきＤＮＡフラグメン
ト０．５μｇあたり１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ
（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。 【０１２５】他に記載しない限り、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．
およびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ａ．，Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ，５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記載さ
れるように、形質転換を実施した。 【０１２６】（実施例１：可溶性ＣｙｓＥの細菌発現お
よび精製）ＣｙｓＥをコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ
受託番号９７１０３）を、プロセシングされたＣｙｓＥ
タンパク質（シグナルペプチド配列を除く）の５’配
列、ならびにＣｙｓＥ遺伝子の３’側のベクター配列に
対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて
最初に増幅する。ＣｙｓＥに対応するさらなるヌクレオ
チドを、それぞれ５’および３’配列に添加した。５’
オリゴヌクレオチドプライマーは、配列５’ ＣＧＣＣ
ＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＧ ３’（配列番号
３）を有し、これはＮｃｏＩ制限酵素部位、それに続く
プロセシングされたタンパク質の推定末端アミノ酸から
始まるＣｙｓＥコード配列を含む。３’配列、５’ Ｃ
ＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＡＡＡＧＴ
ＴＧＧＣ３’（配列番号４）は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に
相補的な配列を含み、そして続いてＣｙｓＥコード配列
を含む。制限酵素部位は、細菌性発現ベクターｐＱＥ−
９（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃ
Ａ，９１３１１）上の制限酵素部位に対応する。ｐＱＥ
−９は、抗生物質耐性（Ａｍｐr）、細菌の複製起点
（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ調節可能プロモーターオペレータ
ー（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈ
ｉｓタグ、および制限酵素部位をコードする。次いで、
ｐＱＥ−９をＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し
た。増幅した配列をｐＱＥ−９内に連結し、そしてヒス
チジンタグおよびＲＢＳをコードする配列とともにイン
フレームで挿入した。次いで、連結混合物を用いて、
Ｅ．ｃｏｌｉＭ１５／ｒｅｐ ４株（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉ
ｎｃ．）を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に記載の手順によ
り形質転換した。Ｍ１５／ｒｅｐ４はプラスミドｐＲＥ
Ｐ４の多数のコピーを含有する。これは、ｌａｃＩリプ
レッサーを発現し、そしてまたカナマイシン耐性（Ｋａ
ｎr）を付与する。形質転換体をＬＢプレート上で増殖
するそれらの能力により同定する。そしてアンピシリン
／カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドＤ
ＮＡを単離し、そして制限酵素分析により確認した。所
望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍ
ｌ）とＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）との両方を補充したＬ
Ｂ培地中の液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）増殖させた。Ｏ／
Ｎ培養物を用いて１：１００〜１：２５０の比で大規模
培養物に接種する。細胞を、６００の光学密度（Ｏ．
Ｄ．600）が０．４と０．６との間になるまで増殖させ
た。次いで、ＩＰＴＧ（「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオ
ガラクトピラノシド」）を加えて１ｍＭの最終濃度にし
た。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプレッサーを不活性化する
ことにより、Ｐ／Ｏの解放（ｃｌｅａｒ）を誘導して遺
伝子発現の増加を導く。細胞をさらに３〜４時間増殖さ
せた。次いで、細胞を遠心分離により収集した。細胞ペ
レットをカオトロピック薬剤６ＭグアニジンＨＣｌ中で
可溶化した。明澄化後、可溶化ＣｙｓＥを、６−Ｈｉｓ
タグを含有するタンパク質により強固に結合され得る条
件下で、ニッケル−キレートカラムにおけるクロマトグ
ラフィーによりこの溶液から精製した（Ｈｏｃｈｕｌ
ｉ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１
１：１７７−１８４（１９８４））。ＣｙｓＥを６Ｍグ
アニジンＨＣｌ（ｐＨ５．０）中でカラムから溶出し、
そして再生の目的で、３ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍ
Ｍリン酸ナトリウム、１０ｍＭグルタチオン（還元
型）、および２ｍＭグルタチオン（酸化型）に調整し
た。この溶液中での１２時間のインキュベーションの
後、タンパク質を１０ｍＭリン酸ナトリウムに対して透
析した。 【０１２７】（実施例２：バキュロウイルス発現系を用
いるＣｙｓＥのクローニングおよび発現）全長ＣｙｓＥ
タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ受託番号
第９７１０３号）を、この遺伝子の５’配列および３’
配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを
用いて増幅した：５’プライマーは、配列 【０１２８】 【化１】 （配列番号５）を有し、そしてＢａｍＨＩ制限酵素部位
（太字）と、それに続く真核生物細胞における翻訳の開
始に効率的なシグナル（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９４７−９５０（１９８
７））、およびこのＣｙｓＥ遺伝子の１８ヌクレオチド
（翻訳の開始コドン「ＡＴＧ」に下線を付する）を含有
する。 【０１２９】３’プライマーは、配列 【０１３０】 【化２】 （配列番号６）を有し、そして制限エンドヌクレアーゼ
ＢａｍＨＩの切断部位およびこのＣｙｓＥ遺伝子の３’
非翻訳配列に相補的なヌクレオチドを含む。増幅した配
列を、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」 ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を用
いて、１％アガロースゲルから単離した。次いで、この
フラグメントをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化
し、次いで再び１％アガロースゲルで精製した。このフ
ラグメントを、Ｆ２と呼ぶ。 【０１３１】ベクターｐＡ２（ｐＶＬ９４１ベクターの
改変体、下記）を、バキュロウイルス発現系を用いるＣ
ｙｓＥタンパク質の発現のために用いる（総説につい
て、Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．
Ｅ．１９８７，Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｆｏｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ
ａｎｄ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐ
ｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕ
ｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５を参照のこと）。こ
の発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆ
ｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強
力なポリヘドリンプロモーター、それに続く制限エンド
ヌクレアーゼＢａｍＨＩの認識部位を含む。シミアンウ
イルス（ＳＶ）４０のポリアデニル化部位を、効率的な
ポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスを容易
に選択するために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと、それに続
くポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルと同方
向に挿入する。ポリヘドリン配列を、コトランスフェク
トした野生型ウイルスＤＮＡの細胞媒介性相同組換えの
ためにウイルス配列に両端で隣接させる。多くの他のバ
キュロウイルスベクターが、ｐＡ２の代わりに用いられ
得る。例えば、ｐＲＧ１ ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４
１、およびｐＡｃＩＭ１である（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．
Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．、Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ，１７０：３１−３９）。 【０１３２】プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで消化
し、次いで当該分野で公知の手順により仔ウシ腸ホスフ
ァターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、ＤＮＡを、
市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１
Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を用いて、１
％アガロースゲルから単離した。このベクターＤＮＡを
Ｖ２と呼ぶ。 【０１３３】フラグメントＦ２および脱リン酸化したプ
ラスミドＶ２を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し
た。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を形質転換
し、そして酵素ＢａｍＨＩを用いて、ＣｙｓＥ遺伝子を
有するプラスミド（ｐＢａｃＣｙｓＥ）を含む細菌を同
定した。クローン化フラグメントの配列を、ＤＮＡ配列
決定により確認した。 【０１３４】５μｇのプラスミドｐＢａｃＣｙｓＥを、
リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒら Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３−
７４１７（１９８７））を用いて、１．０μｇの市販の
線状化したバキュロウイルス（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ
TM ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉ
ｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）とともにコト
ランスフェクトした。 【０１３５】１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウイルス
ＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃＣｙｓＥを、
５０μｌの無血清Ｇｒａｃｅ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ，ＭＤ）を含むマイクロタイタープレートの無菌ウェ
ル中で混合した。その後、１０μｌのリポフェクチンお
よび９０μｌのＧｒａｃｅ培地を添加し、混合し、そし
て室温にて１５分間インキュベートした。次いで、その
トランスフェクション混合物を、血清を含まないＧｒａ
ｃｅ培地１ｍｌを含有する３５ｍｍ組織培養プレート内
に播種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７
１１）に滴下して加えた。プレートを、新たに加えられ
た溶液を混合するために、前後に振動させた。次いでプ
レートを、２７℃で５時間インキュベートした。５時間
後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、
そして１０％ウシ胎児血清を補充した１ｍｌのＧｒａｃ
ｅ昆虫培地を添加した。プレートをインキュベーターに
戻し、そして２７℃で４日間培養を続けた。 【０１３６】４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅ
ｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）による記載と同様にプラ
ークアッセイを行った。改変法として、青く染色された
プラークの容易な単離を可能にする、「Ｂｌｕｅ Ｇａ
ｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガロース
ゲルを用いた。（「プラークアッセイ」の詳細な記述は
また、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇが配布する昆虫細胞培
養およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜１０
頁）においても見い出され得る）。 【０１３７】連続希釈の４日後、ウイルスを細胞に加
え、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペット
のチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒天
を、２００μｌのＧｒａｃｅ培地を含むエッペンドルフ
チューブ中で再懸濁した。寒天を、短かい遠心分離によ
り除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清
を、３５ｍｍディッシュに播種されたＳｆ９細胞に感染
させるために用いた。４日後、これらの培養ディッシュ
の上清を収集し、次いで４℃で保存した。 【０１３８】Ｓｆ９細胞を、１０％熱不活化ＦＢＳを補
充したＧｒａｃｅ培地中で増殖させた。細胞を、感染多
重度（ＭＯＩ）２で、組換えバキュロウイルスＶ−Ｃｙ
ｓＥで感染させた。６時間後、培地を除去し、そしてメ
チオニンおよびシステインを除いたＳＦ９００ ＩＩ培
地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）に置き換えた。４２時間
後、５μＣｉの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの35Ｓ
システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加した。細胞をさ
らに１６時間インキュベートし、その後細胞を遠心分離
により収集し、そして標識されたタンパク質をＳＤＳ−
ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより可視化し
た。 【０１３９】（実施例３：ＣＯＳ細胞中での組換えＣｙ
ｓＥの発現）プラスミド、ＣｙｓＥ ＨＡの発現を、ベ
クターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
から誘導する。ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐは以下を
含有する：１）ＳＶ４０複製起点、２）アンピシリン耐
性遺伝子、３）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、４）ポリリンカ
ー領域、ＳＶ４０イントロン、およびポリアデニル化部
位が続くＣＭＶプロモーター。ＣｙｓＥ前駆体全体およ
びその３’末端にインフレームで融合されたＨＡタグを
コードするＤＮＡフラグメントを、ベクターのポリリン
カー領域にクローン化した。それゆえ、組換えタンパク
質発現はＣＭＶプロモーター下に支配される。ＨＡタグ
は、先に記載された（Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ．Ｎｉｍａ
ｎ、Ｒ．Ｈｅｉｇｈｔｅｎ、Ａ Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、
Ｍ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、およびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ、１９
８４，Ｃｅｌｌ ３７，７６７）ようなインフルエンザ
赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する。
本発明者らの標的タンパク質へのＨＡタグの融合によ
り、ＨＡエピトープを認識する抗体を用いる組換えタン
パク質の容易な検出が可能になる。 【０１４０】プラスミド構築ストラテジーを以下に記載
する：ＣｙｓＥをコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ受託
番号第９７１０３号）を、以下の２つのプライマーを用
いてクローン化された最初のＥＳＴにおけるＰＣＲによ
り構築した：５’プライマー５’ ＧＣＧＣＧＧＡＴＣ
ＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＧＴＴＣＧ ３’（配列番号
７）は、ＢａｍＨＩ部位、それに続く開始コドンから始
まるＣｙｓＥコード配列の１２ヌクレオチドを含む；
３’配列、５’ＧＣＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴ
ＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＣＡＴ
ＣＴＧＣＡＣＡＡＡ ３’（配列番号８）は、ＸｂａＩ
部位、翻訳停止コドン、ＨＡタグ、およびＣｙｓＥコー
ド配列のヌクレオチド（停止コドンは含まない）に相補
的な配列を含む。それゆえ、ＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩ
部位、インフレームで融合したＨＡタグが続くＣｙｓＥ
コード配列、ＨＡタグに隣接する翻訳終結停止コドン、
およびＸｂａＩ部位を含む。ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメ
ントおよびベクター（ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ）を、Ｂａ
ｍＨＩおよびＸｂａＩ制限酵素を用いて消化し、そして
連結した。連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ株
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ，１１０９９Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅ
ｓ Ｒｏａｄ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ９２０３７よ
り入手可能）に形質転換し、形質転換培養物をアンピシ
リン培地プレートに播種し、そして耐性コロニーを選択
した。プラスミドＤＮＡを形質転換体から単離し、そし
て正しいフラグメントの存在を制限酵素分析で調べた。
組換えＣｙｓＥの発現のために、ＣＯＳ細胞をＤＥＡＥ
−ＤＥＸＴＲＡＮ法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒ
ｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））により発現ベクター
でトランスフェクトした。ＣｙｓＥ ＨＡタンパク質の
発現を、放射性標識および免疫沈降法により検出した
（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８８））。細胞を、トランスフ
ェクションの２日後、35Ｓ−システインで８時間標識し
た。次いで培養培地を回収し、そして細胞を界面活性剤
（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ
−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０．５
％ ＤＯＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５））で溶
解した（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、同上 ３７：７６７
（１９８４））。細胞溶解物および培養培地の両方を、
ＨＡ特異的モノクローナル抗体を用いて沈降させた。沈
降したタンパク質を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにお
いて分析した。 【０１４１】 【発明の効果】ヒトＣｙｓＥポリペプチド、およびこの
ようなポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）を同
定し、組換え技術によりこのようなポリペプチドを産生
し得る。このようなポリペプチドは、骨粗鬆症、腫瘍転
移、細菌感染、ウイルス感染、敗血性ショック、炎症、
網膜過敏、カリエス、悪液質、および筋肉るいそうの処
置に利用し得る。
ポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。より
詳細には、本発明のポリペプチドは、ヒトシスタチンＥ
として推定的に同定されており、本明細書中、以下でと
きどき「ＣｙｓＥ」と呼ばれる。本発明はまた、このよ
うなポリペプチドの作用を阻害することに関する。 【０００２】 【従来の技術】シスタチンのスーパーファミリーは、シ
ステインプロテイナーゼインヒビターの群を包含し、こ
れらはヒトの組織および体液に広く分布し、そしてそれ
らは強固でかつ可逆的な複合体を、カテプシンＢ、Ｈ、
Ｌ、およびＳのようなシステインプロテイナーゼと形成
する。シスタチンは、これらのプロテイナーゼが参加す
る正常または病理学的なプロセスの調節に関わっている
ことが最もあり得る。従って、シスタチンは、タンパク
質およびペプチドの細胞内および細胞外異化に影響を及
ぼし得（Ｂａｒｒｅｔ，Ａ．Ｊ．およびＫｉｒｃｈｋ
ｅ，Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，８０：
５３５−５６１（１９８１））、プロホルモン（Ｏｒｌ
ｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，５２：４９−７４（１９８３））およびプロ酵素
（Ｔａｕｇｎｅｒ，Ｒ．ら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，８３：１０３−１０８（１９８５））のタンパク
質分解的プロセシングを調節し得、悪性細胞（Ｓｌｏａ
ｎｅ，Ｂ．Ｆ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏ
ｌ．，１：１３７−１５２（１９９０））または微生物
（Ｂｊｏｒｃｋ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３３７：３８
５−３８６（１９８９）およびＢｊｏｒｃｋ，Ｌ．ら、
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６４：９４１−９４３（１９９
０））による正常細胞の侵入に対して保護し得、そして
関節リューマチにおける局所的な炎症性プロセス（Ｍｏ
ｒｔ，Ｊ．Ｓ．ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕ
ｍ．，２７：５０９−５１５（１９８４））および化膿
性の気管支拡張症（Ｂｕｔｔｌｅ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｓｃａ
ｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５０：
５０９−５１６（１９９０））を調節し得る。 【０００３】シスタチンのスーパーファミリーは、ファ
ミリーＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ（それぞれ、ステフィン
ファミリー、シスタチンファミリー、およびキニノーゲ
ンファミリーとも呼ばれる）に細区画されており、各々
が他方のファミリーのメンバーと構造的機構および生物
学的分布において異なるメンバーを有する（Ｂａｒｒｅ
ｔ，Ａ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２３６：３１
２（１９８６））。ファミリーＩシスタチンＡおよびＢ
は、単一の約１００アミノ酸残基のポリペプチド鎖から
なり、ジスルフィド架橋を有しない。ファミリーＩＩシ
スタチンは、約１２０鎖アミノ酸残基のポリぺプチド鎖
からなり、２つの鎖内ジスルフィド結合を有する。最後
に、ファミリーＩＩＩシスタチンであるキニノーゲン
は、３つのファミリーＩＩシスタチン様ドメインの存在
によって特徴づけられるような、高度の構造的な複雑さ
を示す。各々のドメインは、２つのジスルフィド架橋
を、ファミリーＩＩシスタチンに相同な位置に有する
（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｓｔｅｒｌ，Ｗ．ら、Ｔｒａｎｓｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１１：３３６−３３９（１９
８６））。ファミリーＩおよびＩＩシスタチンは、主に
細胞内、および分泌液中に存在する（Ａｂｒａｈａｍｓ
ｏｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：１
１２８２−１１２８９（１９８６））、これに対しキニ
ノーゲンは、血液プラズマに非常に濃縮されている（Ａ
ｄａｍ，Ａ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３１：４２３
−４２６（１９８５））。 【０００４】少なくとも１つのＩＩ型シスタチンで、シ
スタチンＣと命名されているものが、全ての組織中に発
現されているようである（Ａｂｒａｈａｍｓｏｎ，Ｍ．
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２６８：２８７−２９４
（１９９０））。これに対して、Ｓ−型のシスタチン
は、唾液中に優性に見出される（Ａｂｒａｈａｍｓｏ
ｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：１１
２８２−１１２８９（１９８６））。シスタチンおよび
派生的ペプチドは、抗菌活性および抗ウイルス活性を有
し（Ｂｊｏｒｃｋら、（１９８９，１９９０））、これ
はそれらが環境に直接曝露された上皮の表面を濡らして
いる分泌物中に存在することと一致する。シスタチンは
また、免疫応答を調節し得る。これは、マクロファージ
によるシスタチンプロテアーゼの放出を阻害することに
よって（Ｂｉｅｔｈ，Ｊ．，Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｉｎｈｉｂｉ
ｔｏｒｓ，Ｖ．Ｔｕｒｋ，編（Ｗａｌｔｅｒ Ｄｅ Ｇ
ｒｕｙｔｅｒ＆Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）６
９３−７０３頁（１９８６））、直接的に起こり得る
か、または走化性の応答および細胞のファゴサイトーシ
ス関連のレスピラトリーバーストを阻害することによっ
て（Ｌｅｕｎｇ−Ｔａｃｋら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
３７１：２５５−２５８（１９９０））、非直接的に起
こり得る。このデータは、ＩＩ型のシスタチンが、上皮
表面で種々の保護性の機能を行い得ることを示唆する。
ヒトＩＩ型シスタチン遺伝子ファミリーは、少なくとも
７つのメンバーからなる。 【０００５】遺伝性シスタチンＣアミロイド脈管障害
（ＨＣＣＡＡ）疾患は、シスタチンＣをコードする遺伝
子中の、Ｇｌｕ→Ｌｅｕ変異に関連する。これは、大脳
動脈におけるこの変異シスタチンＣから成るアミロイド
線維の沈着を導く。これは致命的な出血を引き起こすよ
うである（Ｇｈｉｓｏ，Ｊ．ら、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，８
３：２９７４−２９７８（１９８６））。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、骨粗鬆症、
腫瘍転移、細菌感染、ウイルス感染、敗血性ショック、
炎症、網膜過敏、カリエス、悪液質、および筋肉るいそ
うの処置に利用するためのポリペプチドを得ることを課
題とする。さらに、このポリペプチドのコード配列にお
ける変異、および宿主由来のサンプル中のポリぺプチド
の濃度の変化を検出するための診断方法を開発すること
を課題とする。 【０００７】 【課題を解決するための手段】１つの局面において、本
発明は、図１に示す配列のヌクレオチド１からヌクレオ
チド５７６からなるポリヌクレオチドに関する。 【０００８】好ましい実施形態において、本発明は、図
１に示す配列のヌクレオチド１４からヌクレオチド４５
９からなるポリヌクレオチドである。 【０００９】１つの局面において、本発明は、上記のＤ
ＮＡを含むベクターに関する。 【００１０】１つの局面において、本発明は、上記のベ
クターで遺伝子操作された宿主細胞に関する。 【００１１】１つの局面において、本発明は、ポリペプ
チドを産生するためのプロセスに関し、このプロセス
は、上記の宿主細胞から前記ＤＮＡによりコードされる
ポリペプチドを発現する工程を包含する。 【００１２】好ましい実施形態において、本発明は、上
記のベクターで細胞を遺伝子操作する工程を包含する、
ポリペプチドを発現し得る細胞を産生するためのプロセ
スである。 【００１３】１つの局面において、本発明は、以下から
なる群から選択されるメンバーを包含するポリペプチド
である：（ｉ）図１の推定アミノ酸配列を有するポリペ
プチドならびにそのフラグメント、アナログ、および誘
導体；および（ｉｉ）ＡＴＣＣ受託番号９７１０３のｃ
ＤＮＡによりコードされるポリペプチド、ならびに該ポ
リペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体。 【００１４】好ましい実施形態において、本発明は、上
記のポリペプチドのレセプターを活性化する化合物であ
る。 【００１５】好ましい実施形態において、本発明は、上
記のポリペプチドのレセプターを阻害する化合物であ
る。 【００１６】１つの局面において、本発明は、上記のポ
リぺプチドの治療有効量を患者に投与する工程を包含す
る、ＣｙｓＥの必要性を有する患者の処置のための方
法。 【００１７】好ましい実施形態において、本発明は、上
記ポリぺプチドをコードし、そして該ポリぺプチドをイ
ンビボで発現するＤＮＡを患者に提供することによっ
て、上記治療有効量のポリぺプチドが投与される方法で
ある。 【００１８】１つの局面において、本発明は、ＣｙｓＥ
ポリぺプチドを阻害する必要性を有する患者の処置方法
に関し、この方法は、上記の化合物の治療有効量を患者
に投与する工程を包含する。 【００１９】１つの局面において、本発明は、上記のポ
リぺプチドの過小発現に関連する疾患または疾患に対す
る感受性を診断するためのプロセスに関し、このプロセ
スは、該ポリぺプチドをコードする核酸配列中の変異を
決定する工程を包含する。 【００２０】１つの局面において、本発明は、診断プロ
セスに関し、このプロセスは、宿主由来のサンプルにお
ける請求項１２に記載のポリぺプチドの存在を分析する
工程を包含する。 【００２１】１つの局面において、本発明は、上記のポ
リペプチドに結合し、そして該ポリペプチドに対するレ
セプターを活性化する化合物を同定するための方法に関
し、この方法は、細胞表面上でこのポリペプチドに対す
るレセプターを発現する細胞と、スクリーニングされる
べき化合物とを、このレセプターへの結合を許容する条
件下で接触させる工程であって、このレセプターは、化
合物のこのレセプターへの結合に応答して検出可能なシ
グナルを提供し得る第２の成分と会合される、工程；お
よび、この化合物とこのレセプターとの相互作用から生
成されるシグナルの存在を検出することにより、この化
合物がこのレセプターに結合し、そしてこのレセプター
を活性化するか否かを決定する工程、を包含する方法で
ある。 【００２２】 【発明の実施の形態】本発明のポリぺプチドは、シスタ
チンＣとのアミノ酸配列の相同性の結果として、推定的
にＣｙｓＥとして同定された。この同定は、アミノ酸配
列の相同性の結果としてなされた。 【００２３】本発明の１つの局面によれば、新規の成熟
ポリペプチド、ならびにそれらの生物学的に活性で、か
つ診断または治療に有用なフラグメント、アナログおよ
び誘導体が提供される。本発明のポリペプチドはヒト起
源である。 【００２４】本発明の別の局面によれば、本発明のポリ
ペプチドをコードする単離された核酸分子が提供され、
この核酸分子は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノム
ＤＮＡ、ならびにアナログ、および生物学的に活性で、
かつ診断または治療に有用なそれらのフラグメントを含
む。 【００２５】本発明のなおさらなる局面によれば、本発
明のポリペプチドをコードするヒト核酸配列を含む組換
え原核生物宿主細胞および／または組換え真核生物宿主
細胞を、前記タンパク質の発現およびその後の前記タン
パク質の回収を促進する条件下で、培養する工程を包含
する組換え技術によってこのようなポリペプチドを産生
するためのプロセスが提供される。 【００２６】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなポリペプチド、またはこのようなポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを、治療的目的、例えば、
カテプシンを阻害するために、ならびに骨粗相症、腫瘍
の転移、ウイルス複製、炎症、化膿の気管支拡張症を妨
げるため、網膜を保護するため、白質脳症を妨げるた
め、カリエスを減少させるため、アレルギー反応を処置
するため、悪液質および筋るいそうを処置するため、な
らびにアミロイド症を妨げるため、ならびに抗菌剤とし
て利用するためのプロセスが提供される。 【００２７】本発明のなおさらなる局面によれば、本発
明のポリぺプチドをコードする核酸配列に特異的にハイ
ブリダイズするのに十分な長さの核酸分子を含む核酸プ
ローブもまた提供される。 【００２８】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなポリペプチドに対する抗体が提供される。 【００２９】本発明のなお別の局面によれば、本発明の
ポリペプチドをコードする核酸配列における変異に関連
する疾患または疾患に対する感受性を検出するための診
断的アッセイが提供される。 【００３０】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなポリペプチド、またはこのようなポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを、科学的研究、例えば、
ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造に関するイン
ビトロの目的のために利用するためのプロセスが提供さ
れる。 【００３１】本発明のこれらおよび他の局面は、本明細
書中の教示から当業者に明らかであるはずである。 【００３２】本発明の１つの局面によれば、図１の推定
アミノ酸配列（配列番号２）を有する成熟ポリペプチ
ド、および１９９５年３月２０日にＡＴＣＣ受託番号第
９７１０３号として寄託されたクローンのｃＤＮＡによ
りコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離され
た核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。 【００３３】本発明のポリヌクレオチドは、初代培養羊
膜細胞由来のｃＤＮＡライブラリーにおいて発見され
た。これは構造的にシスタチンＩＩスーパーファミリー
に関連する。これは、１４８アミノ酸残基（そのうち、
大体初めの２８アミノ酸残基が推定のリーダー配列であ
り、従って成熟タンパク質は１２０アミノ酸をふくむ）
のタンパク質をコードするオープンリーディングフレー
ムを含む。このタンパク質は、ヒトシスタチンＣに最も
高い程度の相同性を示し、１４７アミノ酸のストレッチ
にわたって３３．５６６％の同一性および５３．８４６
％の類似性を有する。 【００３４】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
態またはＤＮＡ（このＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮ
Ａ、および合成ＤＮＡを含む）の形態であり得る。ＤＮ
Ａは二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖の場合
には、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であ
り得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、
図１（配列番号１）に示すコード配列または寄託したク
ローンのコード配列と同一であり得るか、あるいはその
コード配列が、遺伝コードの重複または縮重の結果とし
て、図１（配列番号１）のＤＮＡまたは寄託したｃＤＮ
Ａと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配
列であり得る。 【００３５】図１（配列番号２）の成熟ポリペプチドま
たは寄託したｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドは、以下を含み得る
がこれらに限定されない：成熟ポリペプチドのコード配
列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列およびリーダー
配列または分泌配列あるいはプロタンパク質配列のよう
なさらなるコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列
（および必要に応じてさらなるコード配列）ならびに非
コード配列（例えば、イントロンあるいは成熟ポリペプ
チドのコード配列の５’および／または３’非コード配
列）。 【００３６】従って、用語「ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみ
を含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列
および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを
含む。 【００３７】本発明はさらに、図１（配列番号２）の推
定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託したク
ローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフ
ラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明
細書中上記のポリヌクレオチドの改変体に関する。ポリ
ヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然に存
在する対立遺伝子改変体またはポリヌクレオチドの天然
に存在しない改変体であり得る。 【００３８】従って、本発明は、図１（配列番号２）に
示すものと同じ成熟ポリペプチド、または寄託したクロ
ーンのｃＤＮＡによりコードされるものと同じ成熟ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにその
ようなポリヌクレオチドの改変体を含む。この改変体
は、図１（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託した
クローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの
フラグメント、誘導体またはアナログをコードする。こ
のようなヌクレオチド改変体は、欠失改変体、置換改変
体、および付加または挿入改変体を含む。 【００３９】本明細書中上記で示したように、ポリヌク
レオチドは、図１（配列番号１）に示すコード配列また
は寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立
遺伝子改変体であるコード配列を有し得る。当該分野で
公知なように、対立遺伝子改変体は、１つ以上のヌクレ
オチドの置換、欠失または付加を有し得るポリヌクレオ
チド配列の別の形態であり、これはコードされるポリペ
プチドの機能を実質的に変化させない。 【００４０】本発明はまた、成熟ポリぺプチドのコード
配列が、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌
を援助するポリヌクレオチド配列（例えば、細胞からの
ポリぺプチドの輸送を制御するための分泌配列として機
能するリーダー配列）と同一のリーディングフレームに
融合され得るポリヌクレオチドを包含する。リーダー配
列を有するこのポリぺプチドはプロタンパク質であり、
そしてこのポリぺプチドの成熟した形態を形成するため
に宿主細胞により切断されたリーダー配列を有し得る。
ポリヌクレオチドはまたプロタンパク質をコードし得、
これは成熟タンパク質にさらなる５’アミノ酸残基を有
する。プロ配列を有する成熟タンパク質は、プロタンパ
ク質であり、そしてタンパク質の不活性な形態である。
一旦プロ配列が切断されると、活性な成熟タンパク質が
残る。 【００４１】従って、例えば、本発明のポリヌクレオチ
ドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパ
ク質、あるいはプロ配列およびプレ配列（リーダー配
列）の両方を有するタンパク質をコードし得る。 【００４２】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にイン
フレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー
配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成
熟ポリペプチドの精製を提供する、ｐＱＥ−９ベクター
により供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。あ
るいは、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例え
ば、ＣＯＳ−７細胞）が使用される場合は、赤血球凝集
素（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグは、インフルエン
ザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応
する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ，３７：７６７
（１９８４））。 【００４３】用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を産生
することに関与するＤＮＡのセグメントを意味し；これ
は、コード領域の前および後（リーダーおよびトレイラ
ー（ｔｒａｉｌｅｒ））の領域ならびに個々のコードセ
グメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を
含む。 【００４４】全長ＣｙｓＥ遺伝子のフラグメントは、全
長ＣｙｓＥ遺伝子を単離するため、およびＣｙｓＥ遺伝
子に対する高い配列類似性または類似した生物学的活性
を有する他の遺伝子を単離するために、ｃＤＮＡライブ
ラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使用さ
れ得る。このタイプのプローブは、好ましくは、少なく
とも３０塩基を有し、そして例えば、５０塩基以上を有
し得る。プローブはまた、全長の転写物に対応するｃＤ
ＮＡクローンおよびゲノムクローン、または調節領域お
よびプロモーター領域、エキソン、ならびにイントロン
を含む完全ＣｙｓＥ遺伝子を含有するクローンを同定す
るために使用され得る。スクリーニングの例は、既知の
ＤＮＡ配列を使用し、オリゴヌクレオチドプローブを合
成することにより、ＣｙｓＥ遺伝子のコード領域を単離
することを含む。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列
を有する標識されたオリゴヌクレオチドは、ヒトｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ、またはｍＲＮＡのライブラリーをス
クリーニングして、ライブラリーのどのメンバーにプロ
ーブがハイブリダイズするかを決定するために使用され
る。本発明はさらに、配列間に少なくとも７０％、好ま
しくは少なくとも９０％、およびより好ましくは９５％
の同一性が存在する場合、本明細書中上記の配列にハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特
に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに
関する。本明細書中で用いられる用語「ストリンジェン
トな条件」は、ハイブリダイゼーションが、配列間に少
なくとも９５％、そして好ましくは少なくとも９７％の
同一性が存在する場合のみに生じることを意味する。好
ましい実施態様において、本明細書中上記のポリヌクレ
オチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１
（配列番号１）のｃＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡ（単
数または複数）によりコードされる成熟ポリペプチドと
実質的に同じ生物学的機能または活性のいずれかを保持
するポリペプチドをコードする。あるいは、このポリヌ
クレオチドは、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダ
イズし、本明細書中上記したように、それに対して同一
性を有し、そして活性を保持てもよいかまたはしなくて
もよい、少なくとも２０塩基、好ましくは３０塩基、そ
してより好ましくは少なくとも５０塩基を有し得る。例
えばそのようなポリヌクレオチドは、配列番号１のポリ
ヌクレオチドのためのプローブとして（例えば、このポ
リヌクレオチドの回収のためのプローブ、または診断用
プローブ）あるいはＰＣＲプライマーとして用いられ得
る。従って、本発明は、配列番号２のポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％、
好ましくは少なくとも９０％の同一性およびより好まし
くは９５％の同一性を有するポリヌクレオチドならびに
そのフラグメント（このフラグメントは、少なくとも３
０塩基および好ましくは少なくとも５０塩基を有する）
ならびにこのようなポリヌクレオチドによりコードされ
るポリペプチドに関する。 【００４５】本明細書中でいう寄託物（単数または複
数）は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関
するブダペスト条約の下に維持される。これらの寄託物
は、当業者に対する便宜として提供されるにすぎず、そ
して米国特許法第１１２条の下で寄託が必要とされるこ
とを認めたわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレ
オチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペ
プチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用
され、そして本明細書中の配列の任意の記載とのいかな
る対立の場合にも管理している。寄託物を製造し、使用
し、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、
そしてそのような実施許諾は本明細書によって与えられ
るわけではない。 【００４６】本発明はさらに、図１（配列番号２）の推
定アミノ酸配列を有するか、または寄託したｃＤＮＡに
よりコードされるアミノ酸配列を有するＣｙｓＥポリペ
プチド、ならびにそのようなポリペプチドのフラグメン
ト、アナログおよび誘導体に関する。 【００４７】用語「フラグメント」、「誘導体」、およ
び「アナログ」は、図１（配列番号２）のポリペプチド
または寄託したｃＤＮＡにコードされるポリペプチドを
いう場合、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物
学的機能または活性を保持するポリペプチドを意味す
る。従って、アナログは、活性な成熟ポリぺプチドを産
生するためのプロタンパク質部分の切断によって活性化
され得るプロタンパク質を含む。 【００４８】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドであ
り得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。 【００４９】図１（配列番号２）のポリペプチドまたは
寄託したｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフ
ラグメント、誘導体、またはアナログは、（ｉ）１つ以
上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基または非保存アミ
ノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、
そしてこのような置換されるアミノ酸残基は遺伝的コー
ドによりコードされ得るアミノ酸残基であってもよく、
またはそうでなくてもよいもの、あるいは（ｉｉ）１つ
以上のアミノ酸残基が置換基を含有するもの、あるいは
（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期
を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコー
ル）のような別の化合物と融合されているもの、あるい
は（ｉｖ）さらなるアミノ酸が、リーダー配列または分
泌配列、あるいは成熟ポリペプチドまたはプロタンパク
質配列の精製のために使用される配列のような、成熟ポ
リペプチドに融合されているものであり得る。このよう
なフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中
の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。 【００５０】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そし
て好ましくは均質に精製される。 【００５１】用語「単離された」は、物質がその本来の
環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）か
ら取り出されていることを意味する。例えば、生存する
動物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドま
たはポリペプチドは単離されていないが、天然の系にお
いて共存する物質の幾らかまたは全てから分離されてい
る同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離さ
れている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一
部であり得、そして／またはこのようなポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、かつ
そのようなベクターまたは組成物がその天然の環境の一
部ではない点で、なお単離されている状態であり得る。 【００５２】本発明のポリペプチドは、配列番号２のポ
リペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに少なくと
も７０％の類似性（好ましくは少なくとも７０％の同一
性）を配列番号２のポリペプチドに対して有し、そして
より好ましくは少なくとも９０％の類似性（より好まし
くは少なくとも９０％の同一性）を配列番号２のポリペ
プチドに対して有し、そしてなおより好ましくは少なく
とも９５％の類似性（なおより好ましくは少なくとも９
５％の同一性）を配列番号２のポリペプチドに対して有
するポリペプチドを含み、そしてまた一般に少なくとも
３０％のアミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０
アミノ酸を含むこのようなポリペプチドの部分を有する
このようなポリペプチドの部分を含む。 【００５３】当業者に公知なように、２つのポリペプチ
ド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配
列およびその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプ
チドの配列と比較することにより決定される。 【００５４】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分は、ペプチド合成により対応する全長ポリペプチ
ドを産生するために使用され得る。従って、このフラグ
メントは全長ポリペプチドを産生するための中間体とし
て使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメ
ントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合
成するために使用され得る。 【００５５】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
を含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作
される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリ
ペプチドの産生に関する。 【００５６】宿主細胞は、本発明のベクター（これは、
例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであ
り得る）を用いて遺伝子操作される（形質導入される
か、または形質転換されるか、またはトランスフェクト
される）。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス
粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主
細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選
択するか、またはＣｙｓＥ遺伝子を増幅するために適切
に改変した従来の栄養培地中において培養され得る。培
養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現のために選
択される宿主細胞に以前使用された条件であり、そして
当業者には明らかである。 【００５７】本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術
によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従
って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発
現するための種々の発現ベクターのいずれか１つに含ま
れ得る。このようなベクターは、染色体ＤＮＡ配列、非
染色体ＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を包含する。
このようなベクターは、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細
菌性プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；
酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組
み合わせに由来するベクター、ウイルスＤＮＡ（例え
ば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、およ
び仮性狂犬病）である。しかし、宿主において複製可能
で、かつ存続可能である限り、他の任意のベクターも使
用され得る。 【００５８】適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によりベ
クターに挿入され得る。一般に、ＤＮＡ配列は、当該分
野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部
位に挿入される。このような手順および他の手順は、当
業者の範囲内であると考えられる。 【００５９】発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ
の合成を指示する適切な発現制御配列（プロモーター）
に作動可能に連結される。このようなプロモーターの代
表的な例としては、以下が挙げられ得る：ＬＴＲまたは
ＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃまたはｔ
ｒｐ、λファージＰLプロモーター、および原核生物細
胞または真核生物細胞あるいはそれらのウイルス内で遺
伝子の発現を制御することが知られている他のプロモー
ター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソー
ム結合部位および転写ターミネーターを含有する。ベク
ターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有し
得る。 【００６０】さらに、発現ベクターは、好ましくは、形
質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例え
ば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクター
ゼまたはネオマイシン耐性、あるいは例えばＥ．ｃｏｌ
ｉにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐
性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有す
る。 【００６１】本明細書中上記のような適切なＤＮＡ配列
ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有
するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタン
パク質を発現させるために用いられ得る。 【００６２】適切な宿主の代表的な例としては、以下が
挙げられ得る：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細
胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏ
ｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９）；動物細胞（例えば、ＣＨ
Ｏ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫）；アデノウイル
ス；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の
教示から当業者の範囲内であると考えられる。 【００６３】さらに詳細には、本発明はまた、上記で広
範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含
する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクタ
ーまたはウイルスベクター）を包含し、このベクターの
中に、本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されて
いる。この実施態様の好ましい局面において、構築物は
さらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例え
ば、プロモーターを包含する）を含む。非常に多数の適
切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であ
り、そして市販されている。以下のベクターが例として
提供される。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ
−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅ
ｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐ
ＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；
ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−
３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）。真核性：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ
４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳ
ＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）。しかし、他の任意のプラスミドまたはベクタ
ーも、それらが宿主において複製可能で、かつ存続可能
である限り、使用され得る。 【００６４】プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の
遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、Ｐ
ＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特によく知られ
た細菌性プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、
Ｔ７、ｇｐｔ、λＰR、ＰLおよびｔｒｐを包含する。真
核生物プロモーターは、ＣＭＶ即時型、ＨＳＶチミジン
キナーゼ、初期ＳＶ４０および後期ＳＶ４０、レトロウ
イルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネインＩ
を包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択
は、十分に当業者のレベル内である。 【００６５】さらなる実施態様では、本発明は上記の構
築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真
核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生
物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿
主細胞は原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得
る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムト
ランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トラ
ンスフェクション、またはエレクトロポレーションによ
り達成され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，
Ｍ．，Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１
９８６））。 【００６６】宿主細胞中の構築物を用いて、従来の方法
で、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生し
得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプ
チド合成機により合成的に産生され得る。 【００６７】成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、
細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下
で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ
構築物に由来するＲＮＡを使用して、このようなタンパ
ク質を産生するために用いられ得る。原核生物宿主およ
び真核生物宿主で使用される適切なクローニングベクタ
ーおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）（この開示
は、本明細書中に参考として援用される）に記載されて
いる。 【００６８】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー
配列を挿入することにより増大される。エンハンサーは
ＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常は約１０〜約
３００ｂｐであり、これはプロモーターに作用してその
転写を増大させる。例として、複製起点のｂｐ１００〜
２７０の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロ
ウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の
後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイル
スエンハンサーが挙げられる。 【００６９】一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞
の形質転換を可能とする複製起点および選択マーカー
（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およ
びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）、なら
びに下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来
のプロモーターを含有する。このようなプロモーター
は、中でも解糖酵素（例えば、３−ホスホグリセリン酸
キナーゼ（ＰＧＫ））、α因子、酸性ホスファターゼ、
または熱ショックタンパク質などをコードするオペロン
に由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻
訳終結配列、ならびに好ましくは、翻訳タンパク質をペ
リプラズム腔または細胞外培地への分泌を指向し得るリ
ーダー配列と適切な相内で組立てられる。必要に応じ
て、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換
え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末
端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。 【００７０】細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能
的なプロモーターと作動可能な読み取り相で、適切な翻
訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に所望のタ
ンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を挿入することに
より構築される。ベクターは、１つ以上の表現型選択マ
ーカー、およびベクターの維持を確実にし、かつ所望さ
れる場合は宿主内での増幅を提供するための複製起点を
含有する。形質転換のために適切な原核生物宿主は、
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、なら
びにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種
々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用い
られ得る。 【００７１】代表的な、しかし限定しない例として、細
菌の使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニング
ベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝
的エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マ
ーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。このよう
な市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐ
ｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳ
Ａ）を含む。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分は、適
切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み
合わされる。 【００７２】適切な宿主株の形質転換および適切な細胞
密度までの宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモー
ターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘
導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養さ
れる。 【００７３】細胞は、代表的には遠心分離により回収さ
れ、物理的手段または化学的手段により破砕され、そし
て得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持され
る。 【００７４】タンパク質の発現において用いられる微生
物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破
砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方
法により破砕され得る。このような方法は当業者に周知
である。 【００７５】種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換
えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物
発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３：１
７５（１９８１）に記載されるサル腎臓線維芽細胞のＣ
ＯＳ−７株、および適合性のベクターを発現し得る他の
細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬ
ａ、およびＢＨＫ細胞株）が含まれる。哺乳動物発現ベ
クターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハ
ンサー、ならびに任意の必要なリボソーム結合部位、ポ
リアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプラ
イスアクセプター部位、転写終結配列、および５’フラ
ンキング非転写配列をまた含有する。ＳＶ４０スプライ
ス部位に由来するＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部
位は、必要な非転写遺伝的エレメントを提供するために
使用され得る。 【００７６】本発明のポリペプチドは、以下を含む方法
により組換え細胞培養物から回収され、そして精製され
得る：硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオ
ンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセル
ロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロ
キシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチン
クロマトグラフィー。必要に応じて、タンパク質の再折
りたたみ（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）工程が、成熟タンパク
質の配置を完全にするために使用され得る。最終的に、
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、最終的な
精製工程に用いられ得る。 【００７７】本発明のポリペプチドは、天然の精製され
た産物、または化学合成手順の産物であり得るか、ある
いは原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、培養物
中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細
胞）から組換え技術により産生され得る。組換え産生手
順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグリコシル化され
ないかもしれない。本発明のポリペプチドはまた、最初
のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。 【００７８】本発明のＣｙｓＥポリぺプチドは、ヒトカ
テプシン酵素、および結果としてのこれらカテプシンの
作用に関連する病態を阻害するために使用され得る。例
えば、ＣｙｓＥは、骨粗鬆症、ベヘット（Ｂｅｈｃｅ
ｔ）病、高カルシウム血症、骨軟化症、アレルギー性皮
膚疾患、アレルギー性鼻炎、およびアレルギー性紫班病
を処置するために使用され得る。 【００７９】カテプシンは、腫瘍の転移において重要な
役割を演じ、従って、ＣｙｓＥは腫瘍の転移を妨げるた
めに使用され得ることもまた考えられる。 【００８０】ＣｙｓＥポリぺプチドは、特定の細菌剤
（例えば、連鎖球菌）の増殖を停止するために、および
カリエスに寄与する酸の産生を減少させることにより虫
歯を減少させるために、抗菌剤として利用され得る。 【００８１】ＣｙｓＥポリぺプチドはまた、ウイルスに
よって引き起こされる感染を処置するために（例えば、
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の複製を阻止するため
に）、抗ウイルス剤として使用され得る。ＣｙｓＥポリ
ぺプチドはまた、網膜をシステインプロテイナーゼによ
る攻撃に対して保護するために使用され得る。 【００８２】本発明のＣｙｓＥポリぺプチドはまた、シ
ステインプロテイナーゼの作用を妨げることにより悪液
質および筋肉るいそうを処置するために使用され得る。 【００８３】ＣｙｓＥポリぺプチドはまた、（例えば、
慢性関節リウマチに関連する）炎症を改変するために、
および敗血性ショックを処置するために使用され得る。
ＣｙｓＥポリぺプチドはまた、化膿性の気管支拡張症を
処置するために使用され得る。 【００８４】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、ヒトの疾患に対する処置および診断の発見のた
めの試験薬および試験物質として使用され得る。 【００８５】本発明は、シスタチンＥポリぺプチドのレ
セプターの同定のための方法を提供する。レセプターを
コードする遺伝子は、当業者に公知の数多くの方法、例
えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティング
（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．，１（２），Ｃｈａｐｔｅｒ
５，（１９９１））によって同定され得る。好ましく
は、発現クローニングは、ここでポリアデニル化ＲＮＡ
を、シスタチンＥポリぺプチドに応答する細胞から調製
する場合に使用され、そしてこのＲＮＡから作製された
ｃＤＮＡライブラリーはプールに分割され、そしてＣＯ
Ｓ細胞またはシスタチンＥポリぺプチドに応答しない他
の細胞をトランスフェクトするために使用される。スラ
イドガラス上で培養されたトランスフェクトされた細胞
は、標識されたシスタチンＥポリぺプチドに曝される。
シスタチンＥポリぺプチドを、ヨー素化または部位特異
的タンパク質キナーゼの認識部位の封入を含む種々の手
段により標識し得る。固定化およびインキュベーション
の後、スライドをオートラジオグラフ分析に供する。陽
性のプールを同定し、そしてサブプールを調製し、そし
て反復サブプール化および再スクリーニングプロセスを
用いて再びトランスフェクトし、最終的に推定のレセプ
ターをコードする単一のクローンを生じる。レセプター
同定のための別のアプローチとして、標識されたリガン
ドを、細胞膜またはレセプター分子を発現する抽出調製
物と光親和的に結合し得る。架橋された材料をＰＡＧＥ
によって分解し、Ｘ線フィルムに曝す。リガンドレセプ
ターを含む標識された複合体を切り出し、ペプチドフラ
グメントに分解し、そしてタンパク質微量配列決定に供
し得る。微量配列決定から得られたアミノ酸配列を使用
して、縮重オリゴヌクレオチドプローブの対を設計し、
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして推定のレセ
プターをコードする遺伝子を同定する。 【００８６】本発明は、シスタチンＥレセプターに結合
する化合物を同定し、そしてそこからセカンドメッセン
ジャー応答を誘導するために、化合物をスクリーニング
する方法を提供する。一例として、シスタチンＥレセプ
ターを発現する哺乳動物細胞または膜調製物を、スクリ
ーンされるべき化合物の存在下でインキュベートする。
この化合物とレセプターの相互作用に続く既知のセカン
ドメッセンジャー系の応答が測定され、そしてシスタチ
ンＥによって誘導されたセカンドメッセンジャーの応答
と比較される。このようなセカンドメッセンジャー系に
は、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネ
ル、またはホスホイノシチド加水分解が含まれるが、こ
れらに限定されない。 【００８７】本発明のポリぺプチドおよびアゴニスト化
合物は、システインプロテイナーゼ活性を阻害する能力
についてアッセイされ得る。このアッセイは、パパイン
およびヒトカテプシンＢとシスタチンＥ複合体との解離
の平衡定数（Ｋi）を、１００Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液中に基質としての１０μＭ Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｎ
ＨＭｅｃを用いる連続的速度アッセイによって決定する
工程を包含する（Ｎｉｃｋｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．Ｈ．および
Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２
２３：２４５−２５３（１９８４））。この緩衝液は、
１ｍＭジチオスレイトールおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含
み、そしてパパインアッセイのためにｐＨ ６．５に、
そしてカテプシンＢアッセイのためにｐＨ６．０に調整
される。カテプシンＢは、使用前にアッセイ緩衝液中で
２０分間室温で予めインキュベートされる。アッセイに
おける酵素濃度は、０．０５〜０．２５ｎＭである。カ
テプシンＢアッセイで試されたシスタチンＥの最高濃度
は、１００ｎＭである。有益な阻害を与える（すなわち
インヒビターの添加後１時間以内に新たな定常状態を得
る）インヒビター濃度は、パパインアッセイにおいて２
０〜５０ｎＭである。３７℃における基質加水分解は、
Ｐａｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ＬＳ５０蛍光
光度計において、励起波長および発光波長がそれぞれ３
６０および４６０ｎｍにおいてモニターされた。アッセ
イ下でのＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨＭｅｃの加水分解の
Ｋm値は、基質によって誘導されるインヒビターの解離
について得られた見かけのＫi値を、以下の関係によっ
て補正するために用いられる：見かけのＫi＝Ｋi（１＋
［Ｓ］／Ｋm）。 【００８８】本発明のポリぺプチドおよびアゴニスト化
合物は、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ
得る。このような組成物は、治療的有効量のポリペプチ
ドまたはアゴニスト、および薬学的に受容可能なキャリ
アまたは賦形剤を含む。このようなキャリアとしては、
生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、
グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせ
が挙げられるが、これらに限定されない。処方は、投与
の様式に合わせるべきである。 【００８９】本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１
つまたはそれ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を
含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような
容器（単数または複数）に関して、薬剤または生物学的
製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関によ
り規定された形式の製品表示をし得、この製品表示は、
ヒトへの投与についての製造、使用、または販売におけ
る機関による認可を表す。さらに、本発明のポリぺプチ
ドまたはアゴニストは、他の治療化合物と併用して用い
られ得る。 【００９０】薬学的組成物は、例えば、経口、局所、静
脈内、腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮内経
路による便利な様式で投与され得る。薬学的組成物は、
特定の症状の処置および／または予防に有効な量で投与
される。一般に、それらは少なくとも約１０μｇ／ｋｇ
体重の量で投与され、そして多くの場合、それらは１日
に約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えない量で投与される。多く
の場合、投薬量は、１日に約１０μｇ／ｋｇ体重から約
１ｍｇ／ｋｇ体重であり、投与経路、症状などが考慮さ
れる。 【００９１】ＣｙｓＥポリぺプチドおよびポリペプチド
であるアゴニスト化合物は、本発明に従って、インビボ
でのこのようなポリペプチドの発現により用いられ得
る。これはしばしば「遺伝子治療」と呼ばれる。 【００９２】従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたは
ＲＮＡ）を用いてエキソビボで操作され得、次いで、操
作された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者
に提供される。このような方法は当該分野で周知であ
り、そして本明細書中の教示から明らかである。例え
ば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡ
を含有するレトロウイルスプラスミドベクターの使用に
より操作され得る。 【００９３】同様に、細胞は、インビボでのポリペプチ
ドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によ
りインビボで操作され得る。例えば、パッケージング細
胞は、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有
するレトロウイルスプラスミドベクターでトランスフェ
クトされ、その結果、パッケージング細胞はここで目的
の遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する。これら
のプロデューサー細胞は、インビボで細胞を操作するた
め、およびインビボでのポリペプチドの発現のために患
者に投与され得る。このような方法により本発明のポリ
ペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法
は、本発明の教示から当業者には明らかなはずである。 【００９４】本明細書中上記のレトロウイルスプラスミ
ドベクターが由来し得るレトロウイルスとしては、モロ
ニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス
肉腫ウイルスのようなレトロウイルス、ハーベイ肉腫ウ
イルス、ニワトリ白血症ウイルス、テナガザル白血病ウ
イルス、ヒト免疫不全症ウイルス、アデノウイルス、骨
髄増殖性肉腫ウイルス、および哺乳動物腫瘍ウイルスが
挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施態様
において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロ
ニーマウス白血病ウイルスに由来する。 【００９５】ベクターは、１つ以上のプロモーターを含
む。使用され得る適切なプロモーターとしては、Ｍｉｌ
ｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第７巻、第９
号、９８０−９９０（１９８９）に記載のレトロウイル
スＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびヒトサイトメ
ガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、または他の任意
のプロモーター（例えば、真核生物細胞プロモーター
（ヒストン、ｐｏｌ ＩＩＩ、およびβ−アクチンプロ
モーターを含むが、これらに限定されない））が挙げら
れるが、これらに限定されない。使用され得る他のウイ
ルスプロモーターとしては、アデノウイルスプロモータ
ー、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ
１９パルボウイルスプロモーターが挙げられるが、これ
らに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明
細書中に含まれる教示から当業者に明らかである。 【００９６】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得
る適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモ
ーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモータ
ー）；または異種プロモーター（例えば、サイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；ＲＳウイルス（Ｒ
ＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、Ｍ
ＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター）；
ヒートショックプロモーター；アルブミンプロモータ
ー；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモータ
ー；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター（例えば、
単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター）；レトロ
ウイルスＬＴＲ（本明細書上記に記載の改変レトロウイ
ルスＬＴＲを含む）；βアクチンプロモーター：および
ヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられるが、これら
に限定されない。プロモーターはまた、ポリペプチドを
コードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであり
得る。 【００９７】レトロウイルスプラスミドベクターは、パ
ッケージング細胞株に形質導入し、プロデューサー細胞
株を形成するために使用される。トランスフェクトされ
得るパッケージング細胞の例としては、Ｍｉｌｌｅｒ、
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、第１巻、５−
１４頁（１９９０）（その全体が参考として本明細書中
に援用される）に記載のＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−
２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９
−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８
６、ＧＰ−ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞株が挙げ
られるが、これらに限定されない。ベクターは、当該分
野で公知の任意の手段によりパッケージング細胞を形質
導入し得る。このような手段としては、エレクトロポレ
ーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ4沈澱が
挙げられるが、これらに限定されない。１つの代替とし
て、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソーム
にカプセル化され得るか、または脂質に結合され得、次
いで宿主に投与され得る。 【００９８】プロデューサー細胞株は、ポリペプチドを
コードする核酸配列（単数または複数）を含む感染性レ
トロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、このよ
うなレトロウイルスベクター粒子は、インビトロまたは
インビボのいずれかで、真核生物細胞を形質導入するた
めに使用され得る。形質導入された真核生物細胞は、ポ
リペプチドをコードする核酸配列（単数または複数）を
発現する。形質導入され得る真核生物細胞としては、胚
芽幹細胞、胚芽肉腫細胞ならびに造血幹細胞、肝細胞、
線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、お
よび気管支上皮細胞が挙げられるが、これらに限定され
ない。 【００９９】遺伝性のシスタチンＣアミロイド血管障害
疾患は、致命的な出血を引き起こし、そしてアルツハイ
マー病、ダウン症候群、パーキンソン病、ジメンチア
（ｄｉｍｅｎｔｉａ）に関連し、そして４０歳前の死を
導き得る。 【０１００】従って、本発明は、診断薬としてのＣｙｓ
Ｅ遺伝子の使用に関する。ＣｙｓＥの変異体の検出は、
ＣｙｓＥ遺伝子の変異から生じるＨＣＣＡＡに類似の疾
患の診断を可能にする。 【０１０１】ヒトＣｙｓＥ遺伝子における変異を有する
個体は、種々の技術によりＤＮＡレベルで検出され得
る。診断のための核酸は、患者の細胞（血液、尿、唾
液、組織バイオプシー、および剖検材料を含むが、これ
らに限定されない）より得られ得る。ゲノムＤＮＡは、
検出のために直接使用され得るか、または分析前にＰＣ
Ｒを用いることにより酵素的に増幅され得る（Ｓａｉｋ
ｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３２４：１６３−１６６（１９８
６））。ＲＮＡあるいはｃＤＮＡはまた、同じ目的のた
めに使用され得る。例として、ＣｙｓＥをコードする核
酸に相補的なＰＣＲプライマーが、ＣｙｓＥ変異を同定
および解析するために使用され得る。例えば、欠失およ
び挿入は、正常な遺伝子型との比較における増幅された
産物のサイズの変化により検出され得る。点変異は、放
射性標識されたＣｙｓＥ ＲＮＡまたは、あるいは、放
射性標識されたＣｙｓＥアンチセンスＤＮＡ配列に、増
幅されたＤＮＡをハイブリダイズさせることにより同定
され得る。完全に対合した配列は、ＲＮａｓｅＡ消化ま
たは融解温度の差により、誤対合した二本鎖と区別され
得る。 【０１０２】対照遺伝子と変異を有する遺伝子との間の
配列の相違は、直接ＤＮＡ配列決定法によって明らかに
され得る。さらに、クローン化されたＤＮＡセグメント
は、特定のＤＮＡセグメントを検出するためのプローブ
として用いられ得る。本方法の感度は、ＰＣＲと組み合
わされた場合、非常に増強される。例えば、配列決定プ
ライマーは、二本鎖ＰＣＲ産物、または改変されたＰＣ
Ｒによって作製された一本鎖テンプレート分子とともに
使用される。配列決定は、放射性標識ヌクレオチドを用
いる従来の手順または蛍光タグを用いる自動配列決定手
順によって実施される。 【０１０３】ＤＮＡ配列の差異に基づいた遺伝子試験
は、変性剤を含むかまたは含まないゲルにおけるＤＮＡ
フラグメントの電気泳動移動度における変化の検出によ
り達成され得る。小さな配列欠失および挿入は、高分解
能ゲル電気泳動によって視覚化され得る。異なる配列の
ＤＮＡフラグメントは、変性ホルムアミド勾配ゲルにお
いて区別され得る。ここでゲル中の異なるＤＮＡフラグ
メントの移動度は、それらの特異的融解温度または部分
的融解温度に従って異なる位置にゲル内で遅延される
（例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１
２４２（１９８５）を参照のこと）。 【０１０４】特定の位置での配列の変化はまた、ヌクレ
アーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅ保護およびＳ
１保護または化学的切断法（例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、
ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１（１９８
５）））により明らかにされ得る。 【０１０５】従って、特定のＤＮＡ配列の検出は、ハイ
ブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、化学的切断、直
接的なＤＮＡ配列決定、または制限酵素の使用（例え
ば、制限断片長多型（ＲＦＬＰ））およびゲノムＤＮＡ
のサザンブロッティングのような方法によって達成され
得る。 【０１０６】より慣習的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配
列決定に加えて、変異はまたインサイチュ分析により検
出され得る。 【０１０７】本発明の配列はまた、染色体の同定に有益
である。この配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置
を特異的に標的化し、そしてその位置にハイブリダイズ
し得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定す
る必要性がある。現在、染色体位置の標識化に利用可能
な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識
化試薬はほとんどない。本発明のＤＮＡの染色体へのマ
ッピングは、これらの配列と疾患に関連する遺伝子との
相関における重要な第１工程である。 【０１０８】簡潔に述べれば、配列は、ｃＤＮＡからＰ
ＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製す
ることにより染色体にマップされ得る。遺伝子の３’非
翻訳領域のコンピューター解析が、ゲノムＤＮＡ内で１
より多いエキソンにまたがらない、従って増幅プロセス
を複雑化するプライマーを迅速に選択するために使用さ
れる。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色
体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに
使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハ
イブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。 【０１０９】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅
速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
本発明と共に使用して、特定の染色体由来のフラグメン
トのパネルまたは類似の様式の大きなゲノムクローンの
プールを用いて、部分的局在性の決定（ｓｕｂｌｏｃａ
ｌｉｚａｔｉｏｎ）が達成され得る。染色体にマップす
るために同様に使用され得る他のマッピングストラテジ
ーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識化フ
ロー選別した（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体を用い
るプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡラ
イブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションに
よる前選択を包含する。 【０１１０】ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッド
への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳ
Ｈ）は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使
用され得る。この技術は、少なくとも５０または６０塩
基を有するｃＤＮＡを用いて使用され得る。この技術の
総説については、Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏ
ｍｏｓｏｍｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。 【０１１１】一旦配列が正確な染色体位置にマップされ
ると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝子地図の
データと相関させ得る。このようなデータは、例えば、
Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅ
ｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋ
ｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉ
ｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能であ
る）において見出される。次いで、同じ染色体領域にマ
ップされる遺伝子と疾患との間の関係が、連鎖解析（物
理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。 【０１１２】次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤ
ＮＡ配列またはゲノム配列における差異を決定する必要
がある。変異がいくつかまたは全ての罹患個体に観察さ
れるが、いずれの正常な個体には観察されない場合、こ
の変異は疾患の原因因子であるようである。 【０１１３】物理的マッピング技術および遺伝子マッピ
ング技術の現在の解像度では、疾患に関連する染色体領
域に正確に位置決めされたｃＤＮＡは、５０と５００と
の間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、
１メガベースのマッピング解像度、および２０ｋｂあた
り１遺伝子と仮定する）。 【０１１４】このポリペプチド、そのフラグメントまた
は他の誘導体、またはそれらのアナログ、あるいはそれ
らを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生させる
ための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例
えば、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体
であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体、お
よびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメント、または
Ｆａｂ発現ライブラリーの産物を包含する。当該分野で
公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメン
トの産生のために使用され得る。 【０１１５】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注
射により、または動物へのポリペプチドの投与により得
られることができる。この動物は、好ましくは非ヒトで
ある。次いで、このようにして得られた抗体は、ポリペ
プチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチド
のフラグメントのみをコードする配列でさえも、天然の
ポリペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用
され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチ
ドを発現する組織からポリペプチドを単離するために使
用され得る。 【０１１６】モノクローナル抗体の調製のために、細胞
株の連続培養により産生される抗体を提供する任意の技
術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術
（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎ
ａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技
術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，
１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７
２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するための
ＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，１９８５，Ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ
Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉ
ｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）が挙げられる。 【０１１７】単鎖抗体を産生するために記載された技術
（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の免疫
原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するため
に適合させ得る。また、トランスジェニックマウスが、
本発明の免疫原性のポリペプチド産物に対するヒト化抗
体を発現するために使用され得る。 【０１１８】 【実施例】本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記
載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定され
ないことが理解されるべきである。すべての部分または
量は、他に明記しない限り重量基準である。 【０１１９】以下の実施例の理解を容易にするために、
頻繁に出現する特定の方法および／または用語が記載さ
れる。 【０１２０】「プラスミド」は、小文字のｐの前および
／またはそれに続く大文字および／または数字を示すこ
とにより明示される。本明細書中の出発プラスミドは、
市販されており、制限無く公的に入手可能であるか、ま
たは公開された手順に従って入手可能なプラスミドから
構築され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価の
プラスミドが当該分野において公知であり、そして当業
者には明らかである。 【０１２１】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の特定の配
列でのみ作用する制限酵素でそのＤＮＡを触媒反応的に
切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制
限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、
補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使
用された。分析目的のためには、典型的には１μｇのプ
ラスミドまたはＤＮＡフラグメントが、約２単位の酵素
と共に約２０μｌの緩衝溶液中で使用される。プラスミ
ド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的のた
めには、代表的には５〜５０μｇのＤＮＡが、２０〜２
５０単位の酵素を用いてより大きな容量中で消化され
る。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量
は、製造者により特定される。３７℃で約１時間のイン
キュベーション時間が通常使用されるが、これは供給者
の説明書に従って変わり得る。消化後、反応物をポリア
クリルアミドゲル上で直接電気泳動して所望のフラグメ
ントを単離する。 【０１２２】切断フラグメントのサイズ分離は、Ｇｏｅ
ｄｄｅｌ，Ｄ．ら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，８：４０５７（１９８０）により記載された８％
ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。 【０１２３】「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ポリデ
オキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシ
ヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合
成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、
５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でＡＴＰ
と共にリン酸を添加しなければ、別のオリゴヌクレオチ
ドと連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸
化されていないフラグメントに連結する。 【０１２４】「連結」は、２つの二本鎖核酸フラグメン
トの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをい
う（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔら、前出、１４６頁）。他に
提供しなければ、連結は公知の緩衝液および条件を使用
して、ほぼ等モル量の連結されるべきＤＮＡフラグメン
ト０．５μｇあたり１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ
（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。 【０１２５】他に記載しない限り、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．
およびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ａ．，Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ，５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記載さ
れるように、形質転換を実施した。 【０１２６】（実施例１：可溶性ＣｙｓＥの細菌発現お
よび精製）ＣｙｓＥをコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ
受託番号９７１０３）を、プロセシングされたＣｙｓＥ
タンパク質（シグナルペプチド配列を除く）の５’配
列、ならびにＣｙｓＥ遺伝子の３’側のベクター配列に
対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて
最初に増幅する。ＣｙｓＥに対応するさらなるヌクレオ
チドを、それぞれ５’および３’配列に添加した。５’
オリゴヌクレオチドプライマーは、配列５’ ＣＧＣＣ
ＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＧ ３’（配列番号
３）を有し、これはＮｃｏＩ制限酵素部位、それに続く
プロセシングされたタンパク質の推定末端アミノ酸から
始まるＣｙｓＥコード配列を含む。３’配列、５’ Ｃ
ＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＡＡＡＧＴ
ＴＧＧＣ３’（配列番号４）は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に
相補的な配列を含み、そして続いてＣｙｓＥコード配列
を含む。制限酵素部位は、細菌性発現ベクターｐＱＥ−
９（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃ
Ａ，９１３１１）上の制限酵素部位に対応する。ｐＱＥ
−９は、抗生物質耐性（Ａｍｐr）、細菌の複製起点
（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ調節可能プロモーターオペレータ
ー（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈ
ｉｓタグ、および制限酵素部位をコードする。次いで、
ｐＱＥ−９をＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し
た。増幅した配列をｐＱＥ−９内に連結し、そしてヒス
チジンタグおよびＲＢＳをコードする配列とともにイン
フレームで挿入した。次いで、連結混合物を用いて、
Ｅ．ｃｏｌｉＭ１５／ｒｅｐ ４株（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉ
ｎｃ．）を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に記載の手順によ
り形質転換した。Ｍ１５／ｒｅｐ４はプラスミドｐＲＥ
Ｐ４の多数のコピーを含有する。これは、ｌａｃＩリプ
レッサーを発現し、そしてまたカナマイシン耐性（Ｋａ
ｎr）を付与する。形質転換体をＬＢプレート上で増殖
するそれらの能力により同定する。そしてアンピシリン
／カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドＤ
ＮＡを単離し、そして制限酵素分析により確認した。所
望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍ
ｌ）とＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）との両方を補充したＬ
Ｂ培地中の液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）増殖させた。Ｏ／
Ｎ培養物を用いて１：１００〜１：２５０の比で大規模
培養物に接種する。細胞を、６００の光学密度（Ｏ．
Ｄ．600）が０．４と０．６との間になるまで増殖させ
た。次いで、ＩＰＴＧ（「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオ
ガラクトピラノシド」）を加えて１ｍＭの最終濃度にし
た。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプレッサーを不活性化する
ことにより、Ｐ／Ｏの解放（ｃｌｅａｒ）を誘導して遺
伝子発現の増加を導く。細胞をさらに３〜４時間増殖さ
せた。次いで、細胞を遠心分離により収集した。細胞ペ
レットをカオトロピック薬剤６ＭグアニジンＨＣｌ中で
可溶化した。明澄化後、可溶化ＣｙｓＥを、６−Ｈｉｓ
タグを含有するタンパク質により強固に結合され得る条
件下で、ニッケル−キレートカラムにおけるクロマトグ
ラフィーによりこの溶液から精製した（Ｈｏｃｈｕｌ
ｉ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１
１：１７７−１８４（１９８４））。ＣｙｓＥを６Ｍグ
アニジンＨＣｌ（ｐＨ５．０）中でカラムから溶出し、
そして再生の目的で、３ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍ
Ｍリン酸ナトリウム、１０ｍＭグルタチオン（還元
型）、および２ｍＭグルタチオン（酸化型）に調整し
た。この溶液中での１２時間のインキュベーションの
後、タンパク質を１０ｍＭリン酸ナトリウムに対して透
析した。 【０１２７】（実施例２：バキュロウイルス発現系を用
いるＣｙｓＥのクローニングおよび発現）全長ＣｙｓＥ
タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ受託番号
第９７１０３号）を、この遺伝子の５’配列および３’
配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを
用いて増幅した：５’プライマーは、配列 【０１２８】 【化１】 （配列番号５）を有し、そしてＢａｍＨＩ制限酵素部位
（太字）と、それに続く真核生物細胞における翻訳の開
始に効率的なシグナル（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９４７−９５０（１９８
７））、およびこのＣｙｓＥ遺伝子の１８ヌクレオチド
（翻訳の開始コドン「ＡＴＧ」に下線を付する）を含有
する。 【０１２９】３’プライマーは、配列 【０１３０】 【化２】 （配列番号６）を有し、そして制限エンドヌクレアーゼ
ＢａｍＨＩの切断部位およびこのＣｙｓＥ遺伝子の３’
非翻訳配列に相補的なヌクレオチドを含む。増幅した配
列を、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」 ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を用
いて、１％アガロースゲルから単離した。次いで、この
フラグメントをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化
し、次いで再び１％アガロースゲルで精製した。このフ
ラグメントを、Ｆ２と呼ぶ。 【０１３１】ベクターｐＡ２（ｐＶＬ９４１ベクターの
改変体、下記）を、バキュロウイルス発現系を用いるＣ
ｙｓＥタンパク質の発現のために用いる（総説につい
て、Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．
Ｅ．１９８７，Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｆｏｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ
ａｎｄ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐ
ｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕ
ｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５を参照のこと）。こ
の発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆ
ｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強
力なポリヘドリンプロモーター、それに続く制限エンド
ヌクレアーゼＢａｍＨＩの認識部位を含む。シミアンウ
イルス（ＳＶ）４０のポリアデニル化部位を、効率的な
ポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスを容易
に選択するために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと、それに続
くポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルと同方
向に挿入する。ポリヘドリン配列を、コトランスフェク
トした野生型ウイルスＤＮＡの細胞媒介性相同組換えの
ためにウイルス配列に両端で隣接させる。多くの他のバ
キュロウイルスベクターが、ｐＡ２の代わりに用いられ
得る。例えば、ｐＲＧ１ ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４
１、およびｐＡｃＩＭ１である（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．
Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．、Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ，１７０：３１−３９）。 【０１３２】プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで消化
し、次いで当該分野で公知の手順により仔ウシ腸ホスフ
ァターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、ＤＮＡを、
市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１
Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を用いて、１
％アガロースゲルから単離した。このベクターＤＮＡを
Ｖ２と呼ぶ。 【０１３３】フラグメントＦ２および脱リン酸化したプ
ラスミドＶ２を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し
た。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を形質転換
し、そして酵素ＢａｍＨＩを用いて、ＣｙｓＥ遺伝子を
有するプラスミド（ｐＢａｃＣｙｓＥ）を含む細菌を同
定した。クローン化フラグメントの配列を、ＤＮＡ配列
決定により確認した。 【０１３４】５μｇのプラスミドｐＢａｃＣｙｓＥを、
リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒら Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３−
７４１７（１９８７））を用いて、１．０μｇの市販の
線状化したバキュロウイルス（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ
TM ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉ
ｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）とともにコト
ランスフェクトした。 【０１３５】１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウイルス
ＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃＣｙｓＥを、
５０μｌの無血清Ｇｒａｃｅ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ，ＭＤ）を含むマイクロタイタープレートの無菌ウェ
ル中で混合した。その後、１０μｌのリポフェクチンお
よび９０μｌのＧｒａｃｅ培地を添加し、混合し、そし
て室温にて１５分間インキュベートした。次いで、その
トランスフェクション混合物を、血清を含まないＧｒａ
ｃｅ培地１ｍｌを含有する３５ｍｍ組織培養プレート内
に播種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７
１１）に滴下して加えた。プレートを、新たに加えられ
た溶液を混合するために、前後に振動させた。次いでプ
レートを、２７℃で５時間インキュベートした。５時間
後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、
そして１０％ウシ胎児血清を補充した１ｍｌのＧｒａｃ
ｅ昆虫培地を添加した。プレートをインキュベーターに
戻し、そして２７℃で４日間培養を続けた。 【０１３６】４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅ
ｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）による記載と同様にプラ
ークアッセイを行った。改変法として、青く染色された
プラークの容易な単離を可能にする、「Ｂｌｕｅ Ｇａ
ｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガロース
ゲルを用いた。（「プラークアッセイ」の詳細な記述は
また、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇが配布する昆虫細胞培
養およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜１０
頁）においても見い出され得る）。 【０１３７】連続希釈の４日後、ウイルスを細胞に加
え、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペット
のチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒天
を、２００μｌのＧｒａｃｅ培地を含むエッペンドルフ
チューブ中で再懸濁した。寒天を、短かい遠心分離によ
り除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清
を、３５ｍｍディッシュに播種されたＳｆ９細胞に感染
させるために用いた。４日後、これらの培養ディッシュ
の上清を収集し、次いで４℃で保存した。 【０１３８】Ｓｆ９細胞を、１０％熱不活化ＦＢＳを補
充したＧｒａｃｅ培地中で増殖させた。細胞を、感染多
重度（ＭＯＩ）２で、組換えバキュロウイルスＶ−Ｃｙ
ｓＥで感染させた。６時間後、培地を除去し、そしてメ
チオニンおよびシステインを除いたＳＦ９００ ＩＩ培
地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）に置き換えた。４２時間
後、５μＣｉの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの35Ｓ
システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加した。細胞をさ
らに１６時間インキュベートし、その後細胞を遠心分離
により収集し、そして標識されたタンパク質をＳＤＳ−
ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより可視化し
た。 【０１３９】（実施例３：ＣＯＳ細胞中での組換えＣｙ
ｓＥの発現）プラスミド、ＣｙｓＥ ＨＡの発現を、ベ
クターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
から誘導する。ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐは以下を
含有する：１）ＳＶ４０複製起点、２）アンピシリン耐
性遺伝子、３）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、４）ポリリンカ
ー領域、ＳＶ４０イントロン、およびポリアデニル化部
位が続くＣＭＶプロモーター。ＣｙｓＥ前駆体全体およ
びその３’末端にインフレームで融合されたＨＡタグを
コードするＤＮＡフラグメントを、ベクターのポリリン
カー領域にクローン化した。それゆえ、組換えタンパク
質発現はＣＭＶプロモーター下に支配される。ＨＡタグ
は、先に記載された（Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ．Ｎｉｍａ
ｎ、Ｒ．Ｈｅｉｇｈｔｅｎ、Ａ Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、
Ｍ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、およびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ、１９
８４，Ｃｅｌｌ ３７，７６７）ようなインフルエンザ
赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する。
本発明者らの標的タンパク質へのＨＡタグの融合によ
り、ＨＡエピトープを認識する抗体を用いる組換えタン
パク質の容易な検出が可能になる。 【０１４０】プラスミド構築ストラテジーを以下に記載
する：ＣｙｓＥをコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ受託
番号第９７１０３号）を、以下の２つのプライマーを用
いてクローン化された最初のＥＳＴにおけるＰＣＲによ
り構築した：５’プライマー５’ ＧＣＧＣＧＧＡＴＣ
ＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＧＴＴＣＧ ３’（配列番号
７）は、ＢａｍＨＩ部位、それに続く開始コドンから始
まるＣｙｓＥコード配列の１２ヌクレオチドを含む；
３’配列、５’ＧＣＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴ
ＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＣＡＴ
ＣＴＧＣＡＣＡＡＡ ３’（配列番号８）は、ＸｂａＩ
部位、翻訳停止コドン、ＨＡタグ、およびＣｙｓＥコー
ド配列のヌクレオチド（停止コドンは含まない）に相補
的な配列を含む。それゆえ、ＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩ
部位、インフレームで融合したＨＡタグが続くＣｙｓＥ
コード配列、ＨＡタグに隣接する翻訳終結停止コドン、
およびＸｂａＩ部位を含む。ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメ
ントおよびベクター（ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ）を、Ｂａ
ｍＨＩおよびＸｂａＩ制限酵素を用いて消化し、そして
連結した。連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ株
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ，１１０９９Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅ
ｓ Ｒｏａｄ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ９２０３７よ
り入手可能）に形質転換し、形質転換培養物をアンピシ
リン培地プレートに播種し、そして耐性コロニーを選択
した。プラスミドＤＮＡを形質転換体から単離し、そし
て正しいフラグメントの存在を制限酵素分析で調べた。
組換えＣｙｓＥの発現のために、ＣＯＳ細胞をＤＥＡＥ
−ＤＥＸＴＲＡＮ法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒ
ｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））により発現ベクター
でトランスフェクトした。ＣｙｓＥ ＨＡタンパク質の
発現を、放射性標識および免疫沈降法により検出した
（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８８））。細胞を、トランスフ
ェクションの２日後、35Ｓ−システインで８時間標識し
た。次いで培養培地を回収し、そして細胞を界面活性剤
（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ
−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０．５
％ ＤＯＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５））で溶
解した（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、同上 ３７：７６７
（１９８４））。細胞溶解物および培養培地の両方を、
ＨＡ特異的モノクローナル抗体を用いて沈降させた。沈
降したタンパク質を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにお
いて分析した。 【０１４１】 【発明の効果】ヒトＣｙｓＥポリペプチド、およびこの
ようなポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）を同
定し、組換え技術によりこのようなポリペプチドを産生
し得る。このようなポリペプチドは、骨粗鬆症、腫瘍転
移、細菌感染、ウイルス感染、敗血性ショック、炎症、
網膜過敏、カリエス、悪液質、および筋肉るいそうの処
置に利用し得る。
【図面の簡単な説明】
以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして
請求の範囲により包含される本発明の範囲を限定するこ
とを意味しない。 【図１】図１は、本発明のポリぺプチドのｃＤＮＡ配
列、および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸
の標準１文字略語を使用する。配列決定を、３７３自動
ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。 【図２】図２は、本発明のポリぺプチド（上列）とヒト
シスタチンＣ（下列）との間のアミノ酸配列相同性を示
す。
請求の範囲により包含される本発明の範囲を限定するこ
とを意味しない。 【図１】図１は、本発明のポリぺプチドのｃＤＮＡ配
列、および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸
の標準１文字略語を使用する。配列決定を、３７３自動
ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。 【図２】図２は、本発明のポリぺプチド（上列）とヒト
シスタチンＣ（下列）との間のアミノ酸配列相同性を示
す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 21/00 Ａ６１Ｐ 29/00
27/02 31/04
29/00 31/12
31/04 35/04
31/12 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
35/04 Ａ６１Ｋ 37/02
(71)出願人 597018381
9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ,
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ
ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ
ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(72)発明者 ニ ジアン
アメリカ合衆国 メリーランド 20853,
ロックビル， マナーフィールド ロー
ド 5502
(72)発明者 ユウ グオ−リアン
アメリカ合衆国 メリーランド 20878,
ダーネスタウン， ストロー ベール
レーン 13524
(72)発明者 レイナー ジェンツ
アメリカ合衆国 メリーランド 20904,
シルバー スプリング， フェアランド
パーク ドライブ 13404
(72)発明者 クレイグ エイ． ローゼン
アメリカ合衆国 メリーランド 20882,
レイトンズビル， ローリング ヒル
ロード 22400
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA19 CA04 DA02
DA06 EA02 EA04 GA13 HA01
4C084 AA02 AA07 AA13 BA22 CA53
CA56 CA59 DC32 MA52 MA55
NA14 ZA331 ZA941 ZA961
ZA971 ZB111 ZB261 ZB331
ZB351
4C086 AA01 AA02 EA16 MA52 MA55
NA14 ZA33 ZA94 ZA96 ZA97
ZB11 ZB26 ZB33 ZB35
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 図１に示す配列のヌクレオチド１からヌ
クレオチド５７６からなる、請求項１に記載のポリヌク
レオチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002149817A JP2003033193A (ja) | 2002-05-23 | 2002-05-23 | ヒトシスタチンｅ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002149817A JP2003033193A (ja) | 2002-05-23 | 2002-05-23 | ヒトシスタチンｅ |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP09500362 Division |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003033193A true JP2003033193A (ja) | 2003-02-04 |
Family
ID=19194721
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002149817A Pending JP2003033193A (ja) | 2002-05-23 | 2002-05-23 | ヒトシスタチンｅ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003033193A (ja) |
-
2002
- 2002-05-23 JP JP2002149817A patent/JP2003033193A/ja active Pending
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